JP2003502035A

JP2003502035A - 水性媒体中でのリン脂質の酵素的製造

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Publication number: JP2003502035A
Application number: JP2001503628A
Authority: JP
Inventors: バレンホルツ，イエシエツケル; アムセレム，シモン
Original assignee: YISSUM RESEARCH DEVELOPMENT COMPANY PF THE HEBREW UNIVERSITY OP JERUSALEM
Current assignee: YISSUM RESEARCH DEVELOPMENT COMPANY PF THE HEBREW UNIVERSITY OP JERUSALEM
Priority date: 1999-06-15
Filing date: 2000-06-15
Publication date: 2003-01-21
Also published as: DE60017563D1; ATE287448T1; EP1190041B1; HK1044168A1; AU780828B2; DE60017563T2; IL147077A0; AU5422800A; EP1190041A1; CA2376604A1; WO2000077183A1

Abstract

(57)【要約】洗剤および有機溶媒の非存在下で水性リポソーム懸濁物中に存在するリン脂質の、ホスホリパーゼに触媒されるエステル交換反応もしくは加水分解の実施方法を記述する。水／固体粒子界面を使用する該方法は、とりわけ固体粒子が小さな粒子径を有するシリカゲルでありかつ反応する脂質の重量の最低４倍のレベルで存在する場合に高い転化を生じる。該反応は、多様な異なって置換されたリン脂質、ならびにジアシルグリセロールおよびセラミドの製造に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、リン脂質のホスホリパーゼに触媒されるエステル交換反応もしくは
加水分解の実施方法に関する。該反応は、多様なさまざまに置換されたリン脂質
、ならびにジアシルグリセロールおよびセラミドの製造に有用である。該方法は
、水／固体粒子界面を使用し、高転化を生じ、そして有機溶媒、洗剤もしくは界
面活性剤の使用を必要としない。

【０００２】

【表１】

【０００３】（発明の背景）ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、ＣおよびＤは、下に具体的に説明されるとおり、
ジアシルリン脂質中の結合を酵素的に切断する：

【０００４】

【化１】

【０００５】これらの酵素は、広範なリン脂質、スフィンゴ脂質および中性脂質の合成的製
造、ならびにとりわけより豊富な供給源材料からの新たな、天然に存在しない
、もしくは豊富でない脂質の製造で有用と判明している。同様に、基質としてス
フィンゴミエリンを使用するＣおよびＤ型のホスホリパーゼ（スフィンゴミエリ
ンホスホジエステラーゼ）、ならびに基質として糖脂質を使用する多様なグリコ
シダーゼを、セラミドおよび他の脂質を製造するのに利用することができる。

【０００６】とりわけ、ホスホリパーゼＤは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）を、ホスファ
チジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のようなより
少なく普遍的な脂質に転化するのに使用されてきた。該反応は出発原料すなわち
ＰＣと、グリセロールもしくはセリンのようなヒドロキシルを含有する試薬との
間のエステル交換反応（ホスファチジル交換反応（ｔｒａｎｓｐｈｏｓｐｈａｔ
ｉｄｙｌａｔｉｏｎ）ともまた称される）である。該酵素は、それが化学量論的
量以上の水の存在下でエステル交換された生成物を産生させることが可能である
ため、この点に関してとりわけ有用である（Ｓｅｒｖｉ）。脂質基質は水溶性で
なく、また、脂質が水性のリポソーム分散物の形態で酵素に提示される場合に、
酵素活性は通常乏しいため、有機溶媒もしくは洗剤が典型的に必要とされる。慣
習的なこの反応方法は、一般に、水（その中で酵素が可溶性である）および有機
溶媒（その中で脂質が可溶性である）を含有する二相系を使用し、酵素反応は水
と有機溶媒との間の界面で発生する。

【０００７】洗剤もしくは有機溶媒の使用は大スケールの反応において問題があり、また、
多くの製薬学的および食物製品の製造で禁止されることができる。加えて、若干
の量の加水分解産物（ホスファチジン酸（ＰＡ））がこうした反応で典型的に形
成され、そしてエステル交換反応の生成物への転化の増大方法が探索される。

【０００８】（発明の要約）本発明は、一局面において、リン脂質もしくは糖脂質の酵素に触媒されるエス
テル交換反応もしくは加水分解の実施方法を包含する。該方法は、脂質、および
ヒドロキシルを含有する試薬のリポソーム懸濁物を含有する水性媒体に酵素を溶
解すること、シリカゲルを媒体に添加すること、ならびに生じる混合物を攪拌す
ることを含んで成る。数種の酵素については、Ｃａ⁺²、Ｚｎ⁺²もしくはＭｇ⁺²の
ような二価金属陽イオンが反応に必要とされる。酵素は、好ましくは、ホスホリ
パーゼＡ１、Ａ２、ＣもしくはＤのようなホスホリパーゼ、またはスフィンゴミ
エリンホスホジエステラーゼである。好ましい一態様において、ホスホリパーゼ
はホスホリパーゼＤである。

【０００９】該方法は、ホスファチジルコリンのような天然に存在するリン脂質混合物を構
成するリン脂質の反応、もしくは組織から単離されたリン脂質、例えば脳のリン
脂質抽出物にとりわけ有用である。ヒドロキシルを含有する試薬は、加水分解反
応の場合に水であることができ；好ましい態様においては、試薬は、グリセロー
ル、セリン、イノシトール、もしくはヒドロキシで終端されるＰＥＧ（ポリエチ
レングリコール）のようなアルコールもしくはアルコール誘導体である。例えば
セリンの場合にヒドロキシルを含有する試薬の立体化学を変動させることにより
、多様な立体化学の合成リン脂質を製造することができる。

【００１０】該反応において、シリカゲルは、最低４：１のシリカゲル／脂質の比を与える
、重量で脂質の量の最低４倍である量、およびより好ましくは最低１０：１のシ
リカゲル／脂質の比を与える、重量で脂質の量の最低１０倍である量で好ましく
添加される。シリカゲルは、好ましくは２５μｍより大きくない、そしてより好
ましくは１５μｍより大きくない平均粒子径を有する。

【００１１】さらなる好ましい態様において、媒体中のホスホリパーゼの濃度は最低３ｍｇ
／ｍｌ、そしてより好ましくは最低７ｍｇ／ｍｌである。酵素がホスホリパーゼ
Ｄである場合、媒体中のカルシウムイオンの濃度は、好ましくは５〜１００ｍＭ
の範囲にある。

【００１２】本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、本発明の以下の詳述された記述
においてより完全に明らかにされるであろう。

【００１３】（発明の詳細な記述）Ｉ．定義下の用語は、別の方法で示されない限り、以下の意味を有する。

【００１４】「リン脂質」は、１もしくは２個の疎水性アシル鎖および１個のリン酸を含有
する極性の頭部基を有する両親媒性脂質を指す。脂質は、極性の頭部基に、アミ
ン、酸、エステル、アルデヒドもしくはアルコールのような化学的に反応性の基
を含有することができる。合成のリン脂質は分子の多様な部分で結合された発色
団もしくは蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）もまた有することができる。

【００１５】炭化水素鎖は、典型的には長さが約２〜２６、および好ましくは約１４〜２２
個の炭素原子の間であり、そして普遍的には変動する程度の不飽和を有する。炭
化水素鎖は、分枝または他の修飾、例えばシクロプロピルもしくはシクロヘキシ
ル基を包含することができる。

【００１６】リン脂質の代表的な例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエ
タノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシト
ール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびスフィンゴミエリン
（Ｎ−アシルスフィンゴシルホスホコリン、スフィンゴ脂質）である。スフィン
ゴ脂質の主鎖はグリセロールよりはむしろスフィンゴシン由来である。スフィン
ゴミエリンにおいては、スフィンゴシンのアミノ基がアミド結合を介して脂肪酸
鎖に連結され、そして一級ヒドロキシル基がホスホリルコリンにエステル化され
る。

【００１７】異常な型のリン脂質は古細菌（ある型の細菌）の膜で見出される。これらの生
物体の細胞膜は脂肪酸よりはむしろフィタニル脂質から構成される。フィタニル
（３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデシル）脂質は、エステルよりはむ
しろエーテル結合によりグリセロールに結合されて脂質を形成する。

【００１８】特定の脂質の名称は、特定のアシル基、例えばジミリストイルホスファチジル
コリン（ＤＭＰＣ）もしくはＮ−パルミトイルスフィンゴミエリンを包含する。
天然に存在する脂質混合物は普遍的であり、そしてこれらはダイズレシチンもし
くは卵レシチンのようなレシチンを包含し、これらは多様なアシル鎖を有するホ
スファチジルコリンの混合物である。こうした混合物、ならびに部分的に精製さ
れた組織抽出物を本反応で使用することができる。

【００１９】「ホスホリパーゼ」は、リン脂質中のエステル結合を（加水分解もしくはエス
テル交換反応により）切断する酵素である。２つの一般的な型は、グリセロール
に基づくリン脂質から脂肪酸を遊離する脂肪族エステラーゼ（型Ａ１、Ａ２およ
びＢ）、ならびにリン酸エステル結合を切断するホスホジエステラーゼ（型Ｃお
よびＤ）である。スフィンゴミエリナーゼ（スフィンゴミエリンホスホジエステ
ラーゼ）は、多くの細菌の酵素でそうであるようにグリセロリン脂質に作用する
ホスホリパーゼに類似もしくは同一であることができるか、または、それらは真
核生物の酵素でそうであるようにスフィンゴ脂質に特異的であることができる。
本明細書で使用されるところのＣおよびＤ型のホスホリパーゼという範疇は、ス
フィンゴミエリンホスホジエステラーゼを包含する。

【００２０】「シリカゲル」は、コロイド状の高度に吸着性の形態の二酸化ケイ素もしくは
その塩（ケイ酸塩）を指す。本明細書で使用されるところの該用語は、クロマト
グラフィーに使用される商業的シリカゲル（好ましくはＴＬＣ等級）を包含し、
これらはケイ酸（ＳｉＯ₂・ｎＨ₂Ｏ）もしくはケイ酸マグネシウム（例えばフロ
リジル［Ｆｌｏｒｉｓｉｌ］（商標））のような塩を含むことができる。

【００２１】「アルコール誘導体」は有機アルコール（ＲＯＨ、ここでＲはアリール、アル
キルもしくはシクロアルキル、および好ましくはアルキルもしくはシクロアルキ
ルである）であり、ここで、基Ｒは、例えばヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、
アルキルアミノ、カルボン酸、カルボン酸エステル、ケト、アルデヒド、ニトロ
、シアノ、イミノ、チオ、アルキルチオ、スルホン酸もしくはエステル、または
リン酸もしくはエステルから選択される基でさらに置換することができる。好ま
しいアルコール誘導体はアルコールで置換されたアミノ酸、グリコールおよび糖
を包含する。約３００ないし４０，０００の範囲の分子量を有するポリエチレン
オキシドのようなヒドロキシで終端されるポリアルキレンオキシドもまた好まし
い。一般に、好ましい化合物は最低５％（ｗ：ｗ）の水溶解性を有するが；しか
しながら、より少なく可溶性のアルコールもしくはアルコール誘導体もまた使用
することができる。ＩＩ．固体粒子界面を使用するホスホリパーゼに触媒される反応ある型の固体粒子は、粒子に吸着する脂質と、大部分は水相中に留まる酵素と
の間の界面を提供することにより、ホスホリパーゼとのリン脂質の反応を促進す
ることができる。固体界面はまた、酵素を活性化するようにも作用することがで
きる。酵素の固定、および粒子表面上での一緒の基質の結合は、ホスホリパーゼ
のコンホメーションの変化および活性化された状態へのその転化をもたらすこと
が可能である。

【００２２】本方法の一例として、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）の対応するホスファチ
ジルグリセロール（ＰＧ）へのホスホリパーゼＤに触媒される転化を、慣習的に
使用される（ジエチルエーテルのような）有機溶媒の代わりに多様な固体の吸着
剤を使用して水性媒体中で実施した。小スケール反応の一般的手順は以下のとお
りである。

【００２３】試薬は、５０〜２００ｍＭＣａＣｌ₂を含有する酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）
、約２５〜７５容積％の濃度のグリセロール、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）
およびホスホリパーゼＤを包含する。酵素は商業的に得ることができるか、もし
くは実施例１に記述されるとおり製造することができる。基質（ＰＣ）は、約５
ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは多重膜小胞（ＭＬＶ）としてグリセロール−酢
酸緩衝液中に分散させる。ＭＬＶは、より慣習的な方法すなわち乾燥脂質膜の水
和、またはエーテルもしくはフレオン［Ｆｒｅｏｎ］（商標）のような溶媒中で
高脂質濃度を使用する逆蒸発（ＲＥＶ）により、調製することができる。この技
術においては、小胞を形成する脂質の非水性溶液を、より小容積の水性媒体を用
いて分散させて、油中水エマルションを形成する。脂質溶媒の除去後、生じるゲ
ルをリポソームに転化する。

【００２４】リポソーム分散物にホスホリパーゼＤを添加し、そして全部の酵素が溶液中に
あるまで混合物をボルテックス攪拌する。室温で固体の吸着剤を添加することに
より反応を開始し、そして振とうを直ちに開始する。

【００２５】一手順においては、約１：１：１（クロロホルム：メタノール：水）の最終溶
媒比を生じるようにクロロホルムおよびメタノールを添加することにより、反応
を終了させる。層を例えば遠心分離により分離し、そしてリン脂質を下のクロロ
ホルム層から単離する。生成物は、クロロホルム：アセトン：メタノール：酢酸
：水（６：８：２：２：１）の溶媒系を使用するアンラッチ（Ｕｎｌａｔｃｈ）
のケイ酸ガラスプレート上での調製的ＴＬＣクロマトグラフィーにより分離する
ことができる。

【００２６】あるいは、クロロホルムのような溶媒の使用が回避されるべきである、食物も
しくは薬物中で使用されるべき生成物の製造のためには、酸性もしくは中性のい
ずれかの条件下でヘキサン、ヘプタン、エタノール／ヘキサンもしくはエタノー
ル／ヘプタン混合物を使用して、脂質を反応混合物から抽出することができる。
所望の場合は、水層中に分配することができるＥＤＴＡのようなキレート剤によ
り、生成物の脂質からＣａ⁺²イオンを除去することができる。

【００２７】ＴＬＣ、次いでリン含量分析により、屈折率もしくは光散乱検出器を使用する
ことにより、または実施例２に記述されるとおり放射活性的に標識されたグリセ
ロールの使用により、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）への転化のレベルを
測定する。アミン脂質生成物は、ピクリルスルホネート（ＴＮＢＳ）との反応に
より比色的にアッセイすることもまたできる。

【００２８】脂質１ｍｇあたり約７０ｍｇの吸着剤の比で多様な固体の吸着剤を使用する反
応の結果を表１に示す。該表は、グリセロールおよびセリンとのＰＣの反応にお
けるそれぞれＰＧおよびＰＳへの転化を示す。試験された吸着剤のなかでシリカ
ゲルが最も有効であったことが明らかである。

【００２９】

【表２】

【００３０】さらなる実験において、多様な型および粒子径のシリカゲルおよび他の吸着剤
を、ＰＣのＰＧへの酵素的転化におけるそれらの活性について試験した。各反応
系は、２５％（容積）グリセロールおよび５０ｍＭＣａＣｌ₂を含有する酢酸
緩衝液（ｐＨ５．６０）０．５ｍｌ中に分散された１０ｍｇのＰＣを含有した。
キャベツホスホリパーゼＤ（０．５ｍｇ、ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
））を添加し、そして０．２グラムの吸着剤を添加することにより反応を開始し
た。混合物を室温で３０分間振とうした。

【００３１】結果を表２に示す。この表から見ることができるとおり、最良の転化は、ＴＬ
Ｃ等級のケイ酸（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、フィラデルフィア州フィラデルフィア
、およびカマグ（Ｃａｍａｇ）、スイス・ムテンツから）（ＰＧへの５０〜６０
％の転化）、ならびにバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（カリフォルニア州リッ
チモンド）からのＴＬＣケイ酸マグネシウム（５０％の転化）で得られた。

【００３２】ケイ酸の粒子径と転化との間の相関が見出され、より小さい粒子径がより多い
収量を生じた。この連続での最良の結果は、シリカゲル６０ＨおよびＨＲ、ＴＬ
Ｃ等級（メルク（Ｍｅｒｃｋ））で得られ、これは最も細かい粒子を有する（粒
子径分布５〜２０μｍ、平均粒子径１０〜１２μｍ）。バイオラッド（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ）（カリフォルニア州リッチモンド）からのＴＬＣ等級のケイ酸マグネシ
ウムもまた良好な転化を生じた（粒子径分布２〜４４μｍ）。カラムクロマトグ
ラフィーで使用されるずっとより大きな粒子径のケイ酸マグネシウムはわずか２
０％の転化を生じた（表２中のフロリジル［Ｆｌｏｒｉｓｉｌ］（商標）の記載
事項）。従って、本明細書に記述される反応での使用に好ましいシリカゲル（ケ
イ酸もしくはケイ酸マグネシウム）の平均粒子径は、２５μｍ未満、および好ま
しくは１５μｍ未満であるとみられる。

【００３３】酸化アルミニウム吸着剤（中性、酸性もしくは塩基性アルミナ）を用いては、
非常に低い転化が達成された（５〜１５％のＰＧ）。バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ）からのバイオビーズ［Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ］（商標）ＳＭ−２、もしくは
シグマ（Ｓｉｇｍａ）からのケレックス［Ｃｈｅｌｅｘ］（商標）（キレート樹
脂）のような吸着剤材料を使用した場合、転化は得られなかった。

【００３４】

【表３】

【００３５】所定の量の酵素について、ホスファチジル交換反応のパーセンテージが、表３
に示されるとおり、１ミリグラムのリン脂質あたりのシリカゲルの量とともに増
大したこともまた見出された。

【００３６】

【表４】

【００３７】シリカゲルの量を変動させることの影響を、下述される５００ｍｇスケールの
反応でさらに検討した。再度、転化は、シリカゲル：脂質の比の増大とともに増
大した。転化はおよそ１０：１の比で安定に達したようであった（表４）が；し
かしながら、試験された最後の２つの比（９／１および１１／１）の間の差異は
実質的でない。５および２５というシリカ／ＰＣ比で２０ｇスケールでもまた反
応を実施し；得られた転化はそれぞれ４０％および６０％であった。

【００３８】これらの結果に基づけば、収率は一般にシリカゲル／脂質の比とともに増大す
るようである。従って、最低４／１、およびより好ましくは最低１０／１という
比が好ましい。表４に示されるようないくつかの場合においては、転化が安定に
達したようであったが、しかし、シリカゲル／脂質の比を増大させることの悪影
響はいずれの場合においても観察されなかった。

【００３９】

【表５】

【００４０】ＩＩ．転化に対する他の反応変数の影響代表的な卵ＰＣ→ＰＧ反応に対する他のパラメータの影響もまた研究した。こ
れらの変数は、酵素濃度、グリセロール濃度、ｐＨ、Ｃａ⁺²濃度、リポソームの
大きさ、試薬添加の順序、脂質組成、抗酸化剤の存在、酵素の供給源および調製
法、ならびに酵素調製物のできてからの時間を包含した。

【００４１】これらの研究における反応の大部分は、５００ｍｇないし５ｇの脂質を使用す
るより大きなスケールで実施した。中間スケールの反応には以下の手順を使用し
た。卵ホスファチジルコリン（５００ｍｇ）をクロロホルムに溶解し、これをそ
の後Ｎ₂流により蒸発させた。５０％グリセロール（ｖ／ｖ）およびＣａＣｌ₂（
１００ｍＭ）を含有する１０ｍｌの酢酸緩衝液（４０ｍＭ、ｐＨ５．６）中に乾
燥された脂質を分散した。全部の脂質がリポソーム分散物中に取り込まれるまで
室温でラブライン（ＬａｂＬｉｎｅ）マルチリスト（ｍｕｌｔｉｗｒｉｓｔ
）振とう機（速度設定＝７）を使用する懸濁物の活発な振とうにより、多重膜小
胞（ＭＬＶ）を形成させた。あるいは、ＭＬＶは上述されたとおり逆蒸発（ＲＥ
Ｖ）により調製することができる。

【００４２】ホスホリパーゼＤ（凍結乾燥された粉末、５０ｍｇ）をリポソーム分散物に添
加し、そして全部の酵素が溶液中にあるまで混合物をボルテックス攪拌した。室
温でケイ酸（３グラム、キーゼルゲル［Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ］（商標）６０メ
ルク（Ｍｅｒｃｋ））を添加することにより反応を開始し、そして直ちに振とう
を開始した。クロロホルムおよびメタノールを添加して１：１：１のクロロホル
ム：メタノール：水の最終的な溶媒比を与えることにより反応を終了させた。ボ
ルテックス攪拌した後に二相が生じ、そして１０００ｇでの遠心分離により分離
した。クロロホルム：アセトン：メタノール：酢酸：水（６：８：２：２：１）
の溶媒系を使用するアナルテック（Ａｎａｌｔｅｃｈ）のケイ酸ガラスプレート
上での調製的ＴＬＣクロマトグラフィーにより、リン脂質を下のクロロホルム層
から単離した。Ａ．酵素濃度表５は変動する酵素濃度の影響を示す。これらの条件下での至適の濃度は約７
ｍｇ／ｍｌであった。ほぼこの濃度でＰＧ形成の平坦部が得られた。

【００４３】

【表６】

【００４４】Ｂ．グリセロール濃度グリセロール濃度の影響を表６に示す。生成物すなわちＰＧは、より低いグリ
セロール濃度でより多量かつより大きな速度で形成された（表ＶＩ）。高いグリ
セロール濃度はインキュベーション媒体の粘度を増大させ、従ってＰＧ形成の速
度を低下させること、もしくは、グリセロールがシリカゲルを被覆することが可
能である。しかしながら、予期しないことではなく、より高いグリセロール濃度
でより少ない加水分解物（ＰＡ）が形成された。

【００４５】

【表７】

【００４６】Ｃ．Ｃａ⁺²濃度；ｐＨ表７中のデータに基づけば、これらの条件下でのホスホリパーゼＤに触媒され
るホスファチジル交換反応の至適のＣａ⁺²濃度は約５０〜１００ｍＭであるよう
であった。しかしながら、若干の調製物が５ｍＭもしくはなおより低いＣａ⁺²濃
度で十分に作用した。他のホスホリパーゼは、Ｍｇ⁺²（Ｃ型スフィンゴミエリナ
ーゼについて）もしくはＺｎ⁺²のような異なるイオンを必要とすることができ、
また、いくつかはイオンの要求を有しなかった。

【００４７】

【表８】

【００４８】トリス緩衝液（ｐＨ８．５）および酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）を使用して類似
のＰＧ転化が得られた。しかしながら、いくぶんより少ないＰＡがｐＨ８．５で
形成された（表８）。

【００４９】

【表９】

【００５０】Ｄ．酵素の供給源実施例１で記述されるとおりキャベツから社内で調製された、異なるバッチの
ホスホリパーゼＤの酵素活性を、多様な商業的供給源からのホスホリパーゼＤの
活性と比較した。ベーリンガーカンパニー（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＣｏ．）
（インジアナ州インジアナポリス）からのキャベツホスホリパーゼＤは、社内の
調製物、およびシグマカンパニー（ＳｉｇｍａＣｏ．）（ミズーリ州セント
ルイス）から得られたホスホリパーゼより顕著に優れた活性を示し、酵素の量の
わずか１／５でＰＣからのＰＧの類似の収率を生じた（ＰＣ／酵素＝２５：１）
。ホスファチジン酸（ＰＡ）は全部の酵素で形成された（総リン脂質に関して５
〜１５％）。

【００５１】ベーリンガーカンパニー（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＣｏ．）からの商業的ホ
スホリパーゼＤの優れた酵素活性のゆえに、ＡｌｌｇｙｅｒとＷｅｌｌｓにより
記述された手順に従い、社内のキャベツホスホリパーゼＤ調製物の付加的精製を
実施した。しかしながら、社内のホスホリパーゼのホスファチジル交換反応特異
的な活性の増大は得られなかった。Ｅ．酵素調製物のできてからの時間：転移酵素／加水分解酵素活性ホスホリパーゼＤの転移酵素活性はその加水分解酵素活性より少なく安定であ
ることが一般に観察される。従って、該酵素の転移酵素／加水分解酵素活性の比
はその調製後に時間とともに減少する傾向がある。転移酵素／加水分解酵素活性
のこの変動が、酵素の一調製物から別のものへの再現不可能性の起源であった。
二相のエーテル／水系を使用する著者らにより実施された反応において、サヴォ
イキャベツからのホスホリパーゼＤは、−２０℃での貯蔵に際してさえ１ヶ月あ
たり最低２０％、および溶液中４℃で保存された場合はずっとより多く、その転
移酵素活性を喪失した。

【００５２】 −７０℃もしくは−２０℃のいずれかで保存されたキャベツからのホスホリパ
ーゼＤの数種の古い調製物（２〜５年）のホスファチジル交換反応活性は、上の
二相の水／エーテル系中では無視できるもしくは存在しないことが見出された一
方、加水分解酵素活性は十分に維持された。しかしながら、これらの調製物の全
部は水／シリカゲル系中でＰＣをＰＧに転化することが可能であった。４℃で水
性溶液中で保存したホスホリパーゼＤ調製物で類似の結果が得られた。これらは
エーテル／水二相系中で全く不活性であったが、しかし、シリカゲルを用いてそ
れらの完全な活性を保持し、８０％以上のＰＣからＰＧへの転化を生じた。

【００５３】慣習的なエーテル／水二相系中での該酵素の転移酵素活性は時間とともに減少
するため、典型的には該酵素を段階的に反応に添加する。しかしながら、水／シ
リカゲル系においては、該酵素は反応中ずっと安定であるようであり、また、Ｐ
Ｇ形成に対する影響を伴わず、段階的にもしくは全部一度にのいずれかで添加す
ることができる。Ｆ．吸着剤上での脂質の直接吸着の影響リポソーム懸濁物の形成は、大スケールの生産にとって時間のかかる工程であ
る可能性がある。従って、シリカ粉末上にクロロホルム溶液から脂質を直接吸着
させることによるこの段階を除外する可能性を検査した。この目的のため、ＰＣ
の２個の１０ｍｇサンプルを丸底フラスコ中で４ｍｌのＣＨＣｌ₃に溶解し、そ
して２個の量のシリカゲル６０Ｈ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））（それぞれ０．１お
よび１．０グラム）を添加した。減圧下でクロロホルムを蒸発させた。乾燥粉末
に酢酸緩衝液、グリセロール、ＣａＣｌ₂および酵素を添加し、そして反応を本
質的に上述されたとおり実施した。ケイ酸マグネシウムを使用して該手順を反復
した。

【００５４】反応を終了させた後に採取されたサンプルのＴＬＣクロマトグラムは、いずれ
の場合でもＰＧの産生を示さず、この反応方法が実行可能でないことを示し、ま
た、反応するリン脂質はホスファチジル交換反応が起こるために緩衝液中に分散
されなければならないことを示唆した。Ｇ．他の因子：吸着剤の活性化／不活性化；リポソームの大きさ、抗酸化剤これらの因子は上述された反応における転化に対する影響をほとんどもしくは
全く有しないことが見出された。吸着剤の活性化／不活性化の影響を試験するた
めに、反応において最良の結果を生じた２つの型の吸着剤、すなわちケイ酸６０
Ｈ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））およびケイ酸マグネシウム（フロリジル［Ｆｌｏｒ
ｉｓｉｌ］（商標））（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に熱活性化（脱水）
および不活性化（水和）を受けさせた。活性化は、吸着剤を１００℃で一夜加熱
することにより、また、不活性化は２００ｍｇの吸着剤粉末に０．２ｍｌの水を
均一に添加することにより実施した。これらの処理された吸着剤で得られた転化
を処理されない吸着剤と比較した（実施例３）。ＴＬＣクロマトグラムは、試験
された全部の系において、５０〜６０％のＰＧ産生の範囲の類似の転化を示した
。従って、吸着剤の脱水もしくは水和は転化に影響を及ぼさず、従って反応前に
吸着剤の前処理の必要性が存在しないと結論することができる。

【００５５】酵素への基質の曝露により転化が制限されるかもしれないという仮定に基づき
、ＭＬＶ（直径およそ１．５μｍ）およびＳＵＶ（直径２０〜４０ｎｍ）を使用
して、ホスファチジル交換反応の効率に対するリポソームの大きさの影響を検査
した。実施例４に記述されるとおり、リポソーム分散物を形成させそして反応を
実施した。双方の系で約４０％のＰＧ産生が観察され、基質の利用可能性は小胞
の大きさにより制限されないことを示した。

【００５６】抗酸化剤の使用により、多不飽和アシル鎖を有するリン脂質の過酸化を阻害す
ることができる。抗酸化剤ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）の存在は、エ
ステル交換反応におけるシリカゲルで活性化されたホスホリパーゼＤの活性に影
響を及ぼさなかったことが見出された。該抗酸化剤は、反応の間に脂質過酸化に
対する優れた保護を提供し、高品質のＰＧの製造を可能にした。ＩＩＩ．さらなるスケールアップ５グラムスケールでの反応（新鮮卵から調製された卵ＰＣを使用する）は、５
００ｍｇスケールでのものに類似の結果を生じた。その後、アサヒカンパニー
（ＡｓａｈｉＣｏ．）（日本）からの商業的リン脂質を使用して、スケールを
２０グラムに増大させた。上の節ＩＩに記述される好ましい条件を使用し、しか
し４．０というシリカゲル／レシチンの比までシリカゲルの量を低下させて、４
時間の反応後におよそ７０％のＰＣのＰＧへの転化を得た。転化の大部分は第一
の時間の間に起こった。ＰＡのレベルは非常に低かった（＜５％）。

【００５７】該反応は、パイロットプラントの反応器を使用して工業的スケール条件下でも
また試験した。実施例５に記述されるとおり、エルサレムのヘブライ大学応用科
学部のカサリ応用化学研究所（ＣａｓａｌｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｐ
ｐｌｉｅｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＳｃ
ｉｅｎｃｅｓ，ＴｈｅＨｅｂｒｅｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のミニパイロッ
トプラント装置で、１００グラムスケールの工程を実施した。ＰＧ転化は、室温
で４０％、また、３５℃で５０％であった。室温で約７％のＰＡが産生された一
方、３５℃ではより高レベルのＰＡ（１５％）が観察された。ＩＶ．脂質基質の変動飽和リン脂質は、脂質過酸化に対するそれらのより高い抵抗性により、ある種
のドラッグデリバリーシステムに、不飽和リン脂質よりもより適することができ
る。部分的に水素化された（ＰＨ）卵ＰＣは、卵ＰＣを置き換えるための潜在的
候補である。従って、飽和脂質、ジパルミトイルＰＣ（ＤＰＰＣ；アヴァンティ
ポーラーリピッズ（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ）、アラバマ
州バーミンガム）および部分的に水素化された（ＰＨ）ＰＣ（ヨウ素価３０；ア
サヒケミカル（ＡｓａｈｉＣｈｅｍｉｃａｌ）、日本）を用いて、ＰＣのＰ
Ｇへのホスファチジル交換反応を試験した。反応は実施例６に記述されるとおり
実施した。ＤＰＰＣの反応のＴＬＣは、ＤＰＰＧへの５０％転化を示し、かつ、
痕跡のＰＡは示さなかった。７７％のＰＨ−卵ＰＧの収率がＰＨ−ＰＣから得ら
れ、痕跡のＰＡ（＜５％）のみが検出された。

【００５８】これらの反応、ならびに付加的な基質およびヒドロキシルを含有する試薬の結
果を表９に要約する。該反応は、多様な試薬、および組織抽出物を包含する基質
について良好な転化を生じる。脳リン脂質抽出物のホスファチジルセリンの濃縮
（表９の６列目）をより詳細に実施例７に記述する。

【００５９】

【表１０】

【００６０】Ｖ．他のリン脂質の反応二相の水／シリカゲル法を、卵ＰＣの選択的加水分解における他のホスホリパ
ーゼ（ＣおよびＡ２）の反応に使用した。反応は、メルク（Ｍｅｒｃｋ）シリカ
ゲル、７０〜２３０メッシュを使用して１０ｇスケールで行った。他の条件およ
び転化（室温で４時間後）を表１０に示す。類似の条件下でのホスホリパーゼＣ
との反応を、スフィンゴミエリンからセラミドを調製するのにもまた使用した（
データは示されない）。

【００６１】

【表１１】

【００６２】実施例以下の実施例は具体的に説明するが、しかし本発明をいかなる方法でも制限す
ることを意図していない。

【００６３】実施例１．キャベツからのホスホリパーゼＤの単離Ａ．標準的調製法ホスホリパーゼＤは、Ｙａｎｇの手順に従ってサヴォイキャベツから調製した
。新鮮なサヴォイキャベツの淡緑色の葉４２５０ｋｇをワーリング（Ｗａｒｉｎ
ｇ）ブレンダー中で蒸留水を用いて均質化することにより、最初に粗抽出物を調
製した。ガーゼを通して濾過することにより繊維素材を除去した。その後、最終
的容量のキャベツ汁（３７５０リットル）を５００ｇで４℃で５分間遠心分離し
た。抽出物を５５℃に加熱し、この温度で５分間維持し、そしてその後急速に冷
却した。同一条件下での遠心分離により嵩高い沈殿物を除去し、そして廃棄した
。

【００６４】２容積のアセトンを−１５℃で上清に添加し、そして混合物を直ちに振とうし
かつ４℃で一夜保存した。アセトンを蒸発させ、そして水性懸濁物を遠心分離し
た。上清を廃棄し、そして沈殿物を１５０ミリトールの真空下で一夜凍結乾燥し
た。淡緑色粉末として得られた酵素（５．２ｇ）を、必要とされるまで−７０℃
で凍結されて保存した。

【００６５】キャベツ葉の均質化に使用された水の量を減少させることにより酵素粉末の収
量を向上させることができたことが後に見出された。改変された手順は、キャベ
ツ１キログラムあたり２．６ｇの凍結乾燥されたタンパク質を生じた。Ｂ．単純化された調製法上の方法の低速遠心分離段階（４℃で５００ｇ×１５分）を高速遠心分離（４
℃で１５０００ｇ×１５分）で置き換えることにより、上清をさらなる精製なし
で酵素調製物として使用することができたことが見出された。高速遠心分離は、
微粒子および繊維性物質を含まない再現可能な酵素調製物を生じる。Ｂｌｉｇｈ
とＤｙｅｒの方法を使用すれば、キャベツの残余の脂質は抽出物中で検出されな
かった。連続フロー遠心分離（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｆｌｏｗｃｅｎｔｒｉ
ｆｕｇａｔｉｏｎ）を使用することにより、遠心分離段階を工業的必要性に合致
するようさらに至適化することができた。この粗新鮮酵素を使用して、上述され
た実験条件を使用してキャベツ重量あたりのタンパク質重量の類似の同等物で、
ＰＣのＰＧへの類似の転化を得た。

【００６６】実施例２．転化の測定クロロホルム：メタノール：水の１：１：１混合物とともにボルテックス攪拌
すること、および相を分離させることにより、インキュベーション混合物から脂
質を抽出する。上の水性−メタノール性層は全部の水溶性試薬を含有する一方、
下のクロロホルム層は脂質（例えば、ＰＣ、ＰＧおよびホスファチジン酸（ＰＡ
））を含有する。下層のアリコートを、ＴＬＣのためのガラスプレート上のアナ
ルテック（Ａｎａｌｔｅｃｈ）のケイ酸薄層上に負荷する。クロロホルム：アセ
トン：メタノール：酢酸：水（６：８：２：２：１ｖ／ｖ）の溶媒系を使用し
てリン脂質を分離する（図１）。個々のスポットを、リンを含まない試験管中に
掻き取り、そしてＢａｒｔｌｅｔの手順に基づき過塩素酸を使用してリン含量を
測定する（例えば、Ｂａｒｅｎｈｏｌｚら、１９９３を参照されたい）。

【００６７】この研究の経過の間に、放射活性の水溶性試薬の使用に基づく、転化を評価す
るための一代替アッセイを開発した。例えば、トリチウム化されたグリセロール
もしくはセリンを使用する；すなわち、³Ｈ−グリセロール（もしくはセリン）
＋ＰＣ→³Ｈ−ＰＧ（もしくは³Ｈ−ＰＳ）＋コリン（＋ＰＡ）。グリセロールも
しくはセリンは、作業の間にクロロホルム：メタノール：水（８：４：３もしく
は１：１：１）の二相溶媒系中で上のメタノール／水層中に分配し；全部の脂質
はクロロホルムの下層に分配する。クロロホルム層のシンチレーション計数によ
り³Ｈ−ＰＧもしくは³Ｈ−ＰＳを測定する。

【００６８】このアッセイを多様な条件下で試験し、そして薄層クロマトグラフィーより単
純かつずっとより迅速であることが判明した。しかしながら、それはＰＡ（所望
されない生成物）のレベルを決定しない。

【００６９】アミンリン脂質（すなわちＰＳもしくはＰＥ）の測定に適する分光測光的方法
は、黄色のトリニトロフェニル誘導体（すなわちＴＮＰ−ＰＳ）を形成するトリ
ニトロベンゼンスルホネート（ＴＮＢＳ）とのアミンリン脂質の反応を利用する
。この生成物を、クロロホルムの濃縮された下層中で分光測光的に（Ｂａｒｅｎ
ｈｏｌｚら、１９９３）もしくはＴＬＣにより（Ａｍｓｅｌｅｍら、１９９３）
測定する。

【００７０】実施例３．活性化されたもしくは不活性化された吸着剤を使用するＰＣのＰＧ
への転化卵ＰＣ（１０ｍｇ）を、５０ｍＭＣａＣｌ₂および５０％（容積）グリセロ
ールを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）０．５ｍｌに分散した。キャ
ベツホスホリパーゼＤ（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））を添加し（０
．５ｍｇ）、そして活性化もしくは不活性化された、２００ｍｇのケイ酸もしく
はケイ酸マグネシウムを通常の粉末として添加することにより反応を開始した。
反応混合物を室温で３０分間振とうした。０．５ｍｌの蒸留水および２ｍｌのＣ
ＨＣｌ₃：メタノール混合物（１：１）を添加することにより反応を終了させた
。遠心分離後、脂質を下層から抽出した。

【００７１】実施例４．ＳＵＶおよびＭＬＶ中でのＰＣの反応反応は５グラム（ＰＣ）スケールで実施した。脂質を１００ｍｌのＣＨＣｌ₃
に溶解した。直径５ｍｍのガラスビーズ（１００グラム）を添加して、乾燥され
た脂質薄膜の表面積を増大させかつ水性溶液中の脂質のより良好な分散を確実に
した。有機溶媒をフラッシュエバポレーターにより除去した。その後、５０％グ
リセロールを含有する５０ｍｌの酢酸緩衝液を添加し、そして均質なリポソーム
分散物が得られるまでラップライン（Ｌａｐ−ｌｉｎｅ）マルチリスト振とう機
で該混合物を振とうすることにより、ＭＬＶを形成させた。ＳＵＶは、プローブ
超音波処理装置（３５０熱系、ウルトラソニックインク（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉ
ｃＩｎｃ．））を使用してＭＬＶを５分間超音波処理することにより、これら
のＭＬＶから調製した。同時に、６００グラムのキャベツを２５０ｍｌの酢酸緩
衝液とともにワーリング（Ｗａｒｉｎｇ）ブレンダー中で均質化し、ガーゼを通
して濾過し、そして４℃で１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。この新
鮮粗上清５０ｍＬを２５グラムのグリセロールと混合し、そしてＭＬＶおよびＳ
ＵＶに添加した。２５グラムのシリカゲル６０Ｈを添加することにより反応を開
始し、混合物をマルチリスト振とう機中で室温で一夜振とうした。

【００７２】実施例５．ＰＣのＰＧへの大スケール転化薄脂質薄膜手順（ｔｈｉｎｌｉｐｉｄｆｉｌｍｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に
よりＭＬＶを調製した。アサヒカンパニー（ＡｓａｈｉＣｏ．）（日本）か
らの卵ホスファチジルコリン（１００グラム）を、１リットル丸底フラスコ中で
５００ｍｌのＣＨＣｌ₃に溶解した。抗酸化剤ＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトル
エン）を１／１０００のモル比で添加した。ガラスビーズ（４００グラム）を添
加し、そして有機溶媒を乾固まで蒸発させた。５０％グリセロールおよび０．１
ＭＣａＣｌ₂を含有する酢酸緩衝液（ｐＨ５．６、１リットル）を添加し、そ
してマルチリスト振とう機の助けを借りての該混合物の１時間の活発な振とうに
よりＭＬＶを形成させた。調製された最終的容量のＭＬＶを２個の０．５リット
ルの部分に分割した。各部分に２５０ｍｌの付加的な酢酸緩衝液を添加し、そし
て該混合物を１．５リットル容量の２個の小型反応器（ｍｉｎｉｒｅａｃｔｏｒ
）に導入した。５０％グリセロールの最終濃度を生じるようにグリセロールで１
：１に希釈された新鮮粗キャベツホスホリパーゼＤ汁（２５０ｍｌ）を各小型反
応器に添加した。２個の反応器中の温度はそれぞれ室温（２０℃）および３５±
５℃であった。シリカゲル６０Ｈ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））（２５０ｇ）を各反
応器に添加した。機械的振とうを用いる反応器中での試薬の混合。反応は窒素雰
囲気下で実施した。２０時間の反応後に、振とうを停止し、そして各反応器の底
部から１ｍｌのサンプルを採取した。１ｍｌのＤＤＷおよび２ｍｌの１：１ク
ロロホルム：メタノールを添加することにより各サンプルを抽出した。遠心分離
により層を分離し、そしてＣＨＣｌ₃：アセトン：酢酸：Ｈ₂Ｏ（６：８：２：２
：１）で展開するＴＬＣにより下層のアリコートを分析した。スポットを掻き取
りかつ抽出し、そしてＢａｒｔｌｅｔｔの手順によりリン脂質含量を測定した。

【００７３】実施例６．飽和および部分的に水素化された脂質の反応５０％グリセロールおよび１００ｍＭＣａＣｌ₂を含有する１０ｍｌ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．６）中の１０ｍｇのＤＰＰＣを使用して、５５℃（Ｔ_mの１０℃
上）でＭＬＶを調製した。社内で調製された１０ｍＬのホスホリパーゼＤ溶液を
５グラムのグリセロールと混合し、そしてＤＰＰＣ−ＭＬＶに添加した。２．５
グラムのシリカゲル６０Ｈを添加することにより反応を開始し、そして該混合物
を室温で１時間振とうした。

【００７４】ＰＨ−卵ＰＣ脂質（５グラム）を、１００グラムのガラスビーズ（直径５ｍｍ
）上でクロロホルム溶液から乾燥した。酢酸緩衝液（４５０ｍｌ、上述されたと
おりグリセロールおよびＣａＣｌ₂を含有する）を添加し、そして該混合物をラ
ブライン（Ｌａｂ−ｌｉｎｅ）マルチリスト振とう機を用いて１時間活発に振と
うすることによりＭＬＶを形成させた。その後、５ｍｌの酢酸緩衝液に溶解され
た２０ｍｇのキャベツホスホリパーゼＤ（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
））の溶液を添加した。１２５ｇのシリカゲル６０Ｈ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））
を添加することにより反応を開始し、混合物を室温で一夜振とうした。

【００７５】実施例７：脳リン脂質抽出物のホスファチジルセリンの濃縮１５モル％のＰＳ、４３モル％のＰＣおよび３４モル％のＰＥを含有するウシ
脳リン脂質抽出物を使用した。実施例５に記述されたとおりに、該抽出物からＭ
ＬＶを調製した。Ｌ−セリン（粉末）を飽和に近いレベルでリポソーム分散物に
添加した。新鮮粗キャベツ汁（実施例１の単純化された手順）を酵素の供給源と
して使用した。反応は実施例５に記述されたとおりに実施した。上述されたＴＮ
ＢＳ法およびＴＬＣ法による分析は、ＰＳのレベルが出発原料中の１５モル％か
ら最終生成物中の５１モル％まで増大したことを示した。

【００７６】Ｄ，Ｌ−セリンを使用する類似の反応は、最終生成物中で４９モル％のホスフ
ァチジルセリンを生じた。

【００７７】本発明は特定の方法および態様に関して記述した一方、多様な改変が本発明か
ら離れることなくなされることができることが真価をみとめられよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者アムセレム，シモンイスラエル・76551レホボト・ミリアムミズラヒストリート10 Ｆターム(参考） 4B064 AE63 CA21 CA50 CB02 CB04 CD02 CD06 CD15 DA01 DA10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ｉ）リン脂質のリポソーム懸濁物、（ｉｉ）水、アルコー
ルもしくはアルコール誘導体から選択されるヒドロキシルを含有する試薬、およ
び（ｉｉｉ）酵素により必要とされる場合は二価金属陽イオン、を含有する水性
媒体に酵素を溶解すること、シリカゲルを前記媒体に添加すること、ならびに生じる混合物を攪拌すること、
を含んで成る、前記リン脂質の前記酵素に触媒されるエステル交換反応もしくは
加水分解の実施方法。
【請求項２】酵素が、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホ
リパーゼＣ、ホスホリパーゼＤおよびスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ
より成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】酵素が、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣおよびホス
ホリパーゼＤより成る群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】酵素がホスホリパーゼＤである、請求項３記載の方法。
【請求項５】二価金属陽イオンが約５〜１００ｍＭの濃度のカルシウムイ
オンである、請求項４記載の方法。
【請求項６】ヒドロキシルを含有する試薬がアルコールもしくはアルコー
ル誘導体である、請求項１記載の方法。
【請求項７】ヒドロキシルを含有する試薬が、グリセロール、セリンおよ
びイノシトールより成る群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】ヒドロキシルを含有する試薬が、約３００と４０，０００と
の間の分子量を有する、ヒドロキシで終端されるポリエチレングリコールである
、請求項６記載の方法。
【請求項９】シリカゲルが、重量でリン脂質の量の最低４倍である量で添
加される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】シリカゲルが、重量でリン脂質の量の最低１０倍である量
で添加される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】シリカゲルが、２５μｍより大きくない平均粒子径を有す
る、請求項１記載の方法。
【請求項１２】シリカゲルが、１５μｍより大きくない平均粒子径を有す
る、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】ホスホリパーゼが最低３ｍｇ／ｍｌの濃度で前記媒体中に
存在する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】ホスホリパーゼが最低７ｍｇ／ｍｌの濃度で前記媒体中に
存在する、請求項１３記載の方法。