JP2003500422A

JP2003500422A - Osteonectin-based toxic gene therapy to treat calcified tumors and tissues

Info

Publication number: JP2003500422A
Application number: JP2000620801A
Authority: JP
Inventors: チュン，レランド，ダブリュ．，ケイ．; シェ，チア−リン; コーネマン，ケネス，エス．; イェン，ファン
Original assignee: ユニバーシティーオブヴァージニアパテントファウンデーション
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-05-25
Publication date: 2003-01-07
Also published as: EP1182929A1; CA2374141A1; EP1182929A4; AU5291800A; WO2000072679A1; IL146794A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、石灰化の可能性がある腫瘍細胞および組織細胞内における発現を指令するプロモーター、エンハンサーおよび他の調節エレメントに関する。特に、OSN調節領域を含んでなる発現ベクター、宿主細胞、およびトランスジェニック動物が提供される。 (57) [Summary] The present invention relates to promoters, enhancers and other regulatory elements that direct expression in potentially calcified tumor and tissue cells. In particular, expression vectors, host cells, and transgenic animals comprising an OSN regulatory region are provided.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】本出願は、1999年5月28日に出願された米国仮特許出願第60/136,440号に対し
て35 U.S.C. §119の下、優先権を主張し、この結果として、その全体において
参照により組み入れる。This application claims priority to US Provisional Patent Application No. 60 / 136,440 filed May 28, 1999 under 35 USC § 119, and as a result, is referenced in its entirety. Incorporated by.

【０００２】1. 発明の概要本発明は、石灰化の可能性がある腫瘍細胞および組織細胞内で発現を指令する
プロモーター、エンハンサー、および他の調節エレメントに関する。特に、本発
明は、オステオネクチン（「OSN」）の発現を制御する、5'調節領域由来のヌク
レオチド配列およびその転写活性断片を含んでなる組成物に関する。具体的には
、OSN調節領域が、異種コード配列の発現を制御し、内因性OSNコード配列もしく
は病理学的過程の阻害物質を過剰発現し、または石灰化の可能性がある腫瘍細胞
および組織細胞において石灰化関連疾患に重要であると考えられている特定の遺
伝子の発現をノックアウトし得る、発現ベクター、宿主細胞およびトランスジェ
ニック動物を提供する。また本発明は、石灰化の可能性がある腫瘍細胞および組
織細胞に関連する障害のアゴニストおよびアンタゴニストについての候補分子を
スクリーニングするための該ベクター、細胞および動物の使用方法に関する。 1. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to promoters, enhancers, and other regulatory elements that direct expression in potentially calcified tumor and tissue cells. In particular, the invention relates to compositions comprising nucleotide sequences from the 5'regulatory region and transcriptionally active fragments thereof that control the expression of osteonectin ("OSN"). Specifically, tumor cells and tissue cells in which the OSN regulatory region controls the expression of heterologous coding sequences, overexpresses endogenous OSN coding sequences or inhibitors of pathological processes, or has the potential to calcify. Expression vectors, host cells and transgenic animals capable of knocking out the expression of certain genes thought to be important in calcification-related diseases in. The present invention also relates to methods of using the vectors, cells and animals to screen candidate molecules for agonists and antagonists of potentially calcified tumor and tissue cell-related disorders.

【０００３】本発明は、さらに石灰化の可能性がある腫瘍細胞および組織細胞内での化合物
の発現をモジュレートする組成物および方法に関する。またさらに本発明は、石
灰化の可能性がある腫瘍細胞および組織細胞内で発現をモジュレートする化合物
のスクリーニングに関する。また治療的処置用のスクリーニングアッセイによっ
て同定される分子および化合物の使用方法を提供する。本発明は、さらに石灰化
の可能性がある腫瘍細胞および組織細胞に関連する、腫瘍ならびに他の疾患およ
び障害の治療方法に関する。The invention further relates to compositions and methods that modulate the expression of compounds in potentially calcified tumor cells and tissue cells. Still further, the invention relates to screening for compounds that modulate expression in potentially calcified tumor cells and tissue cells. Also provided are methods of using the molecules and compounds identified by the screening assays for therapeutic treatment. The invention further relates to methods of treating tumors and other diseases and disorders associated with potentially calcified tumor cells and tissue cells.

【０００４】2. 発明の背景 2.1 遺伝子治療体細胞遺伝子治療は、核酸（典型的には、DNAの形態）を投与し、治療目的で
標的細胞の遺伝子レパートリーを改変するというストラテジーである。実験的遺
伝子治療における研究は、比較的新しい分野であるが、主要な進歩がここ10年間
で成された（Arai, Y.ら, 1997, Orthopaedic Research Society, 22: 341)。体
細胞遺伝子治療がヒトの疾患を治療する可能性は、主に最近の2つの技術的進歩
により、多数の科学者の想像力を引きつけた。第1に、今日多数のウイルスおよ
び非ウイルス遺伝子治療ベクターが存在し、これらは実験動物においてin vivo
で遺伝子を効率的に導入され、さらに発現することができる。第2に、ヒトゲノ
ムプロジェクトへの支援が高まることで、非常に近い将来には、ヒトゲノムを含
めた約80,000遺伝子の同定と配列決定が可能となるであろう。 2. Background of the Invention 2.1 Gene Therapy Somatic gene therapy is the strategy of administering a nucleic acid, typically in the form of DNA, to modify the genetic repertoire of a target cell for therapeutic purposes. Although research in experimental gene therapy is a relatively new area, major advances have been made over the last decade (Arai, Y. et al., 1997, Orthopaedic Research Society, 22: 341). The potential of somatic gene therapy to treat human diseases has attracted the imagination of many scientists, mainly due to two recent technological advances. First, there are numerous viral and non-viral gene therapy vectors today, which
The gene can be efficiently introduced and further expressed. Second, the increased support for the Human Genome Project will enable the identification and sequencing of approximately 80,000 genes, including the human genome, in the very near future.

【０００５】遺伝子治療は、元々、機能的に活性な治療遺伝子を標的細胞に送達するための
遺伝性欠陥修正用の特定遺伝子置換治療として考えられていた。体細胞遺伝子治
療に対する最初の努力の成果は、ex vivo遺伝子治療と呼ばれる、遺伝子を組織
に導入するという間接的手段によるものであった。この手段においては、例えば
標的細胞は身体から取り出され、組換え遺伝子を担持するベクターを用いてトラ
ンスフェクトまたは感染させ、身体に再度移植する（「自己由来細胞導入」）。
種々のトランスフェクション技術が、現在利用可能であり、それらを用いてin v
itroでDNAを細胞に導入する。トランスフェクション技術には、リン酸カルシウ
ム-DNA沈殿法、DEAE-デキストラントランスフェクション法、エレクトロポレー
ション法、リポソーム介在DNA導入法、または組換えウイルスベクターを用いた
形質導入法が含まれる。かかるex vivo治療プロトコールには、上皮細胞（米国
特許第4,868,116号; MorganおよびMulligan WO87/00201; Morganら, 1987, Scie
nce 237: 1476-1479; MorganおよびMulligan, 米国特許第4,980,286号)、内皮細
胞(WO89/05345)、肝細胞(WO89/07136; Wolffら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84: 3344-3348; Ledleyら, 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 5335-5339;
WilsonおよびMulligan, WO89/07136; Wilsonら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci
. 87: 8437-8441)、線維芽細胞(Palmerら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84: 1055-1059; Ansonら, 1987, Mol. Biol. Med. 4: 11-20; Rosenbergら, 198
8, Science 242: 1575-1578; Naughton & Naughton, 米国特許第4,963,489号)、
リンパ球(Andersonら, 米国特許第5,399,346号; Blaese, R.M.ら, 1995, Scienc
e 270: 475-480)、および造血幹細胞（Lim, B.ら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 86: 8892-8896; Andersonら, 米国特許第5,399,346号)を含めた種々の異
なる細胞型にDNAを導入することが考えられている。Gene therapy was originally thought of as a specific gene replacement therapy for the correction of hereditary defects to deliver functionally active therapeutic genes to target cells. The initial efforts of somatic gene therapy have resulted from the indirect means of introducing genes into tissues, called ex vivo gene therapy. In this procedure, for example, the target cells are removed from the body, transfected or infected with a vector carrying the recombinant gene and reimplanted into the body ("autologous cell transfer").
Various transfection techniques are currently available and can be used to
Introduce DNA into cells by itro. Transfection techniques include calcium phosphate-DNA precipitation, DEAE-dextran transfection, electroporation, liposome-mediated DNA transfer, or transduction using recombinant viral vectors. Such ex vivo treatment protocols include epithelial cell (US Pat. No. 4,868,116; Morgan and Mulligan WO87 / 00201; Morgan et al., 1987, Scie.
nce 237: 1476-1479; Morgan and Mulligan, U.S. Pat.No. 4,980,286), endothelial cells (WO89 / 05345), hepatocytes (WO89 / 07136; Wolff et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84: 3344-3348; Ledley et al., 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 5335-5339;
Wilson and Mulligan, WO 89/07136; Wilson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci
87: 8437-8441), fibroblasts (Palmer et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
84: 1055-1059; Anson et al., 1987, Mol. Biol. Med. 4: 11-20; Rosenberg et al., 198.
8, Science 242: 1575-1578; Naughton & Naughton, U.S. Pat.No. 4,963,489),
Lymphocytes (Anderson et al., U.S. Pat.No. 5,399,346; Blaese, RM et al., 1995, Scienc
e 270: 475-480), and hematopoietic stem cells (Lim, B. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sc.
i. USA 86: 8892-8896; Anderson et al., U.S. Pat. No. 5,399,346), to introduce DNA into a variety of different cell types.

【０００６】直接的in vivo遺伝子導入が、最近、リポソーム（Ledleyら, 1987, J. Pediat
rics 110:1)またはウイルスエンベロープ受容体タンパク質を含有するプロテオ
リポソーム（Nicolauら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1068)に捕
捉されたDNA、およびポリリジン-糖タンパク質担体複合体に結合されたDNAの製
剤を用いて試みられた。さらに、「遺伝子銃(gene guns)」が、細胞への遺伝子
送達に用いられた（オーストラリア特許第9068389号)。むき出しの(naked)DNA、
またはリポソームに結合したDNAを液体の担体溶液中に製剤化し、間質に注射す
ることでDNAを細胞に導入することができるとさえ考えられている（Felgner, WO
90/11092)。Direct in vivo gene transfer has recently been demonstrated by liposomes (Ledley et al., 1987, J. Pediat.
rics 110: 1) or DNA entrapped in proteoliposomes containing the virus envelope receptor protein (Nicolau et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1068) and polylysine-glycoprotein carrier complex. An attempt was made with a formulation of ligated DNA. In addition, "gene guns" have been used for gene delivery to cells (Australian Patent 9068389). Naked DNA,
It is even believed that DNA bound to liposomes can be formulated in a liquid carrier solution and injected into the interstitium to introduce the DNA into the cells (Felgner, WO
90/11092).

【０００７】遺伝子治療技術を利用した多数の臨床試験が、嚢胞性繊維症および癌のような
多様な疾患に対して進行中である。この治療方法が医療を劇的に改善するという
見通しは、広く支持されているが、しかしながらこの技術を臨床現場において効
率よく用いることができるまでには、越える必要がある多くのハードルが未だ存
在する。Numerous clinical trials utilizing gene therapy technology are in progress for a variety of diseases such as cystic fibrosis and cancer. The prospect of this treatment method dramatically improving medical care is widely supported, however, there are still many hurdles that need to be overcome before this technique can be used effectively in the clinical setting. .

【０００８】おそらく、現在発明されている遺伝子治療（ex vivoもしくはin vivoであろう
と）に関する最も大きい問題の一つとしては、標的遺伝子の発現を制御する能力
がないこと、および有益な治療効果を達成するために必要である細胞型に標的遺
伝子の発現を制限する能力がないことである。Perhaps one of the biggest problems with presently invented gene therapy (whether ex vivo or in vivo) is the inability to control the expression of target genes and the beneficial therapeutic effects. The inability to limit the expression of the target gene to the cell type needed to achieve it.

【０００９】組織特異的プロモーターを使用して、治療的毒性遺伝子を腫瘍細胞に送達およ
び発現させる概念は十分に理解されている。この方法は、ベクター（ウイルス、
リポソームなど）による遺伝子送達の結果として、正常細胞ならびに癌細胞に感
染した場合に、隣接する正常細胞における治療的遺伝子の毒性効果を低減する。
例としては、ヘパトーマ細胞を標的としたα-フェトプロテインプロモーターの
使用（Koryamaら, 1991, Cell Struct. Punct., 16: 503-510)、胃癌に対する癌
胎児性抗原（CEA)プロモーターの使用（Tanakaら, 1996, Cancer Research, 46:
1341-1345)、メラノーマ細胞を殺すためのチロシナーゼプロモーターの使用(Vi
leら, 1994, Cancer Research, 54: 6228-6234)、神経膠腫細胞を標的とした脳
に対する骨形成タンパク質プロモーターの使用(Shimizu, K., 1994, Nipson Rin
sbo, 52: 3053-3058)、ならびに骨癌および前立腺癌を殺すためのオステオカル
シンプロモーターの使用(Ko, S.ら, 1996, Cancer Research, 56: 4614-4619; G
ardenerら, 1998, Gene Therapy and Molecular Biology, 2: 41-58)が挙げられ
る。組織および腫瘍限定的プロモーターの使用による遺伝子治療などの分子治療
的ストラテジーが使用される頻度は、増大している。遺伝子治療法の重要な構成
要素には、i) 適当な組織特異的もしくは腫瘍限定的プロモーター（これらは、
幾つかの例において、ホルモン、ビタミン、抗生物質、薬剤、または重金属によ
って誘導可能であり得る）の選択、ii) 治療的（もしくは毒性）遺伝子の選択、
iii) 適当なベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム
など）が含まれる。正常宿主組織を免れさせながら、適当な腫瘍組織を標的とす
るために重要なのは、選択されたプロモーターを使用する組織のみに対して治療
的遺伝子を方向づけさせることができるプロモーターである。The concept of delivering and expressing therapeutic toxic genes in tumor cells using tissue-specific promoters is well understood. This method uses vectors (viruses,
As a result of gene delivery by liposomes, etc., the toxic effect of the therapeutic gene on adjacent normal cells is reduced when infected with normal cells as well as cancer cells.
Examples include the use of the α-fetoprotein promoter targeting hepatoma cells (Koryama et al., 1991, Cell Struct. Punct., 16: 503-510), the use of the carcinoembryonic antigen (CEA) promoter for gastric cancer (Tanaka et al. , 1996, Cancer Research, 46:
1341-1345), using a tyrosinase promoter to kill melanoma cells (Vi
le et al., 1994, Cancer Research, 54: 6228-6234), Use of osteogenic protein promoters for brain targeting glioma cells (Shimizu, K., 1994, Nipson Rin
sbo, 52: 3053-3058), and the use of the osteocalcin promoter to kill bone and prostate cancer (Ko, S. et al., 1996, Cancer Research, 56: 4614-4619; G.
ardener et al., 1998, Gene Therapy and Molecular Biology, 2: 41-58). The frequency of use of molecular therapeutic strategies such as gene therapy by the use of tissue and tumor restricted promoters is increasing. Important components of gene therapy include: i) appropriate tissue-specific or tumor-restricted promoters (these are
In some cases it may be inducible by hormones, vitamins, antibiotics, drugs, or heavy metals), ii) selection of therapeutic (or toxic) genes,
iii) Including appropriate vectors (eg, retrovirus, adenovirus, liposomes, etc.). Important for targeting appropriate tumor tissue while escaping normal host tissue is a promoter that can direct the therapeutic gene only to those tissues that use the selected promoter.

【００１０】2.2 石灰化の可能性がある腫瘍細胞および組織細胞内での組織特異的発現転移した乳癌、骨肉腫および前立腺癌のような骨指向性（osteotropic)腫瘍の
治療は、重要な挑戦である。これらとは表面上関連のない疾患であっても、疾患
の進行中に、これらの癌の形成において過剰発現され得る遺伝子の分子分析を通
じて結びつく。 2.2 Tissue-Specific Expression in Potentially Calcified Tumor Cells and Tissue Cells Treatment of osteotropic tumors such as metastasized breast cancer, osteosarcoma and prostate cancer poses a significant challenge. is there. Even these seemingly unrelated diseases are linked during the progression of the disease through molecular analysis of genes that can be overexpressed in the formation of these cancers.

【００１１】骨格に転移する性質を有するヒト前立腺癌細胞を評価する場合、これらの細胞
が大量の非コラーゲン性骨マトリックスタンパク質（例えば、オステオポンチン
（OPN)(Thalman GNら, 1997, Principles of Practice of Genitourinary Oncol
ogy, 409-416)、オステオカルシン(OC)(Curatolo Cら, 1992, European Urology
, 1: 105-107)およびBSP(Withold W.ら, 1997, Clinical Chemistry, 85-91)を
合成し分泌する能力を有するということは、驚くべき知見であった。When assessing human prostate cancer cells that have the property of metastasizing to the skeleton, these cells are associated with a large amount of non-collagen bone matrix proteins such as osteopontin (OPN) (Thalman GN et al., 1997, Principles of Practice of Genitourinary. Oncol
ogy, 409-416), osteocalcin (OC) (Curatolo C et al., 1992, European Urology
, 1: 105-107) and BSP (Withold W. et al., 1997, Clinical Chemistry, 85-91) was a surprising finding.

【００１２】 OSN(また、BM-40(basement membrane-40)；SPARC(secreted protein acidic a
nd rich in cysteine)としても知られている）は、種を通じて高度に保存されて
いる43kDaのタンパク質である。このタンパク質は、幾つかの胎児組織および成
人組織、ならびに広範囲のヒト癌によって合成され、分泌される。この遺伝子は
、ヒト染色体5q31-33に局在する。OSN遺伝子の大きさは26.5kbであり、9個のイ
ントロンによって分離された10個のエキソンを有する。OSNプロモーターは、以
前にクローニングされており、TATAもしくはCAATボックスを有しないことが見出
された。ヒトOSNプロモーターには2個のGGAボックスが存在し、マウスOSNプロモ
ーターには3個のGGAボックスが存在する。これらは、転写開始に重要である。1
つの主要な転写開始部位と1つのマイナーな転写開始部位が存在し、その結果と
して2.2および3.0kbのmRNAの転写が生じる。OSNプロモーターのエキソン1は、翻
訳されない。さらにエキソン1には同定された反復CCTGエレメントが存在する。
これはAP-2転写因子の結合に重要である。大きなイントロン1(>10kb)は、多数の
調節モチーフ（レチン酸、c-AMP、ヒートショックタンパク質、金属イオン、お
よび成長ホルモンを含む）を含有する。OSN (also BM-40 (basement membrane-40); SPARC (secreted protein acidic a
(also known as nd rich in cysteine)) is a 43 kDa protein that is highly conserved across species. This protein is synthesized and secreted by some fetal and adult tissues, and a wide range of human cancers. This gene is located on human chromosome 5q31-33. The size of the OSN gene is 26.5 kb, with 10 exons separated by 9 introns. The OSN promoter has been previously cloned and was found to have no TATA or CAAT boxes. The human OSN promoter has two GGA boxes and the mouse OSN promoter has three GGA boxes. These are important for transcription initiation. 1
There is one major transcription start site and one minor transcription start site, resulting in transcription of 2.2 and 3.0 kb mRNAs. Exon 1 of the OSN promoter is not translated. In addition, exon 1 has an identified repetitive CCTG element.
This is important for the binding of AP-2 transcription factor. Large intron 1 (> 10 kb) contains numerous regulatory motifs, including retinoic acid, c-AMP, heat shock proteins, metal ions, and growth hormone.

【００１３】 OSNは、腫瘍浸潤および転移に関与する。OSNと腫瘍の相互作用を通じて、腫瘍
細胞は活性化され、タンパク質分解酵素を分泌し、基底膜を分解することができ
る。OSN-腫瘍相互作用の結果として、細胞接着の崩壊、細胞増殖のモジュレーシ
ョンが生じ、透過性が増強し、細胞移動および走化性が増大する（Nature Med.
3: 144, 1997)。他の研究において、OSNの過剰発現が極めて浸潤性の悪性腫瘍（
乳癌、卵巣癌、大腸癌、扁平上皮(squamous)癌、子宮内膜癌、腎癌、肝細胞癌、
胆嚢癌、肺癌および前立腺癌の悪性腫瘍が含まれる）において見出されたことを
示している。さらに、幾つかの肉腫（例えば、悪性線維組織肉腫（fibrohistosa
rcoma）、軟骨肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、骨肉腫）、骨巨細胞腫、神経内分
泌腫瘍（例えば、カルチノイド）、および肺小細胞癌、神経膠腫、B細胞リンパ
腫、精上皮腫、およびメラノーマは、またOSNを過剰発現する。多くの状況にお
いて、前立腺癌を含めて、OSN過剰発現は乳癌、大腸癌、およびミエローマの新
生物形成の進行に相関する。さらに、アンチセンスRNAストラテジーによるOSN発
現の抑制は、ヒトメラノーマ細胞の腫瘍形成を阻害することが報告されている（
Nature Med. 3: 17 1, 1997)。OSN is involved in tumor invasion and metastasis. Through the interaction of OSNs with tumors, tumor cells can be activated, secreting proteolytic enzymes and degrading basement membranes. OSN-tumor interactions result in disruption of cell adhesion, modulation of cell proliferation, enhanced permeability and increased cell migration and chemotaxis (Nature Med.
3: 144, 1997). In another study, OSN overexpression resulted in highly invasive malignancies (
Breast cancer, ovarian cancer, colon cancer, squamous cancer, endometrial cancer, renal cancer, hepatocellular carcinoma,
Gall bladder cancer, lung cancer and prostate cancer malignancies are included). In addition, some sarcomas (eg, malignant fibrous tissue sarcoma (fibrohistosa)
rcoma), chondrosarcoma, hemangiosarcoma, hemangioendothelioma, osteosarcoma), giant cell tumor of bone, neuroendocrine tumor (eg, carcinoid), and small cell lung cancer, glioma, B-cell lymphoma, seminoma, and Melanoma also overexpresses OSN. In many situations, including prostate cancer, OSN overexpression correlates with the progression of breast, colon, and myeloma neoplasia. Furthermore, suppression of OSN expression by antisense RNA strategy has been reported to inhibit tumorigenesis of human melanoma cells (
Nature Med. 3: 17 1, 1997).

【００１４】3. 発明の概要本明細書に開示される発明は、骨指向性特異的遺伝子転写のためのモデルを提
供する。本発明は、部分的には、石灰化の可能性がある腫瘍（例えば、限定され
るものではないが局所性または播種性の骨肉腫、肺癌、大腸癌、黒色腫、甲状腺
癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、胃癌、卵巣癌、とりわけ、限定されるものではない
が乳癌および前立腺癌が挙げられる）を治療、処置および／または改善するため
の新規な治療薬の同定に基づいている。具体的には、本発明は上記の骨指向性腫
瘍の転移部位および適用可能な場合には転移環境下の支持性骨間質を標的とする
。さらに、本発明はまた、石灰化が起こる良性前立腺過形成(BPH)または動脈硬
化状態のような良性状態にも適用できる可能性のある治療薬に関する。 3. SUMMARY OF THE INVENTION The invention disclosed herein provides a model for osteotropic specific gene transcription. The present invention is directed, in part, to potentially calcified tumors, such as, but not limited to, local or disseminated osteosarcoma, lung cancer, colon cancer, melanoma, thyroid cancer, brain tumors, multiple tumors. Based on the identification of new therapeutic agents for the treatment, treatment and / or amelioration of primary myeloma, gastric cancer, ovarian cancer, including but not limited to breast cancer and prostate cancer. Specifically, the present invention targets the metastatic sites of the above-mentioned osteotrophic tumors and, where applicable, the supporting bone stroma in a metastatic environment. Furthermore, the present invention also relates to therapeutic agents with potential application in benign conditions such as benign prostatic hyperplasia (BPH) or arteriosclerotic conditions where calcification occurs.

【００１５】オステオネクチン(「OSN」)プロモーターは、骨指向性腫瘍中で高活性を有す
る新規な配列であり、腫瘍および組織を限定して、選択された治療用遺伝子の作
用を、この骨指向性腫瘍に向ける強力なツールとして使用することができる。今
までのところ、最もよく研究された治療用遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ(HSVTKまたはTK)遺伝子である。単純ヘルペスウイルス-TKは、プロ
ドラッグACV (または関連薬物)を、***細胞に対して細胞傷害性を呈するリン酸
化された形態に変換する(Moolten, F.L., 1996, Cancer Research, 46: 5276-52
81)。好結果を得るのに重要なのは、隣接する非形質導入細胞に細胞傷害性を付
与する「バイスタンダー」効果である。すなわち、この効果を用いると、in viv
oにおいてすべての腫瘍細胞への送達およびその細胞の自殺遺伝子の発現を行う
ことなく、効果的に腫瘍細胞を死滅させることができる。この方法は、動物モデ
ルにおいて多くの充実性腫瘍の退縮を引き起こすのに有効であることが最近実証
された(Tong, X. W.ら, 1998, Anticancer Research, 18: 713-718)。最近の文
献では、選択された腫瘍特異的プロモーターおよび治療用(毒性)遺伝子を送達す
るためのベクターは、特定の発現カセットを含有する組換えアデノウイルスであ
るかまたはリポソーム製剤もしくはレトロウイルス製剤であることが多い。注射
、皮下送達、腹腔内送達、腫瘍内送達、病巣内送達、静脈内送達、骨内送達、吸
入または移動局所的灌流（loco-regionally by perfusion)による送達を含めて
、ベクターを送達する多くの方法を実施することができる。有効な遺伝子治療の
中核をなすのは、腫瘍特異的プロモーターの選択である。The osteonectin (“OSN”) promoter is a novel sequence with high activity in osteotrophic tumors that limits the action of selected therapeutic genes in tumors and tissues to target this bone-directed gene. It can be used as a powerful tool to target sex tumors. To date, the best studied therapeutic gene is the herpes simplex virus thymidine kinase (HSVTK or TK) gene. Herpes simplex virus-TK converts the prodrug ACV (or related drugs) into a phosphorylated form that is cytotoxic to dividing cells (Moolten, FL, 1996, Cancer Research, 46: 5276-52.
81). Important for success is the "bystander" effect, which confers cytotoxicity to adjacent non-transduced cells. That is, using this effect, in vivo
In o, tumor cells can be effectively killed without delivery to all tumor cells and expression of their suicide gene. This method has recently been demonstrated to be effective in causing regression of many solid tumors in animal models (Tong, XW et al., 1998, Anticancer Research, 18: 713-718). In the recent literature, vectors for delivery of selected tumor-specific promoters and therapeutic (toxic) genes are recombinant adenoviruses containing specific expression cassettes or liposomal or retroviral formulations. Often. Many vectors for delivery, including injection, subcutaneous delivery, intraperitoneal delivery, intratumoral delivery, intralesional delivery, intravenous delivery, intraosseous delivery, delivery by inhalation or loco-regionally by perfusion The method can be carried out. Central to effective gene therapy is the selection of tumor-specific promoters.

【００１６】従来の放射線療法、外科手術、または化学療法で再発前立腺癌(または他の骨
指向性腫瘍)の患者をこれまでに治療したときの応答率はよくないので、単独で
適用できるかまたは現用の理学療法もしくは他の新規な理学療法と組み合わせて
適用できる新しい治療方法を開発することが重要である。本発明は、治療用また
は毒性の遺伝子の発現を腫瘍および組織特異的に駆動する新規な治療用遺伝子の
同定法を大きく進歩させるものである。より詳細には、本発明は、特に、in vit
roでは培養された骨指向性細胞において、およびin vivoではトランスジェニッ
ク動物において、骨指向性特異的発現を指令するOSNプロモーターを含む新規な
治療用遺伝子を同定する方法を初めて提供する。Previously treated patients with recurrent prostate cancer (or other osteotrophic tumors) with conventional radiation therapy, surgery, or chemotherapy have poor response rates and can be applied alone or It is important to develop new therapeutic methods that can be applied in combination with current physical therapy or other novel physical therapies. The present invention represents a major advance in the identification of novel therapeutic genes that drive tumor or tissue-specific expression of therapeutic or toxic genes. More particularly, the present invention is particularly directed to in vit
For the first time, we provide a method to identify a novel therapeutic gene containing the OSN promoter that directs osteotropic specific expression in cultured osteotropic cells in ro and in transgenic animals in vivo.

【００１７】本発明は、治療用または毒性の遺伝子、例えば、原発部位または転移部位のい
ずれかで石灰化する能力を呈する様々なヒト腫瘍またはヒト良性組織に組換えア
デノウイルス(Ad)のようなベクターにより送達される単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ(TK)の遺伝子、の発現を駆動するOSNプロモーターを含んでなる新
規な治療用組成物を提供する。この効果は、特に、前立腺腫瘍および骨肉腫で顕
著に現れるが、任意の骨指向性攻撃性転移性腫瘍、例えば、局所性または播種性
の骨肉腫、肺癌、大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、胃癌、卵
巣癌、とりわけ、限定されるものではないが乳癌および前立腺癌の場合にも現れ
る。石灰化する能力、したがってOSNを発現する能力を有する非腫瘍細胞もまた
、本発明の組換えレポーターまたは治療用遺伝子を高レベルで発現させることが
できる。The present invention provides therapeutic or toxic genes, such as recombinant adenovirus (Ad) to various human tumors or human benign tissues that exhibit the ability to calcify at either the primary or metastatic site. Provided is a novel therapeutic composition comprising an OSN promoter driving the expression of a vector-delivered herpes simplex virus thymidine kinase (TK) gene. This effect is particularly pronounced in prostate tumors and osteosarcoma, but any osteotrophic aggressive metastatic tumor, such as localized or disseminated osteosarcoma, lung cancer, colon cancer, melanoma, thyroid cancer, It also appears in cases of brain tumors, multiple myeloma, gastric cancer, ovarian cancer, but not limited to breast cancer and prostate cancer. Non-tumor cells that have the ability to calcify, and thus express OSN, can also express high levels of the recombinant reporter or therapeutic gene of the invention.

【００１８】本発明はまた、最も一般的にはアシクロビル(ACV)であるプロドラッグと組み
合わせて組換えアデノウイルスAd-OSN-TKの投与を上記の経路で行うことにより
、OSNプロモーターを使用しうる骨肉腫もしくは前立腺癌または他の骨指向性腫
瘍を治療する方法を提供するが、OSNプロモーター駆動型治療法は、特定のベク
ターまたは治療用遺伝子に限定されるものではない。実際に考えられることとし
て、多くの形態のベクターまたは毒性遺伝子を生成させて、この新規なOSNプロ
モーター駆動型ストラテジーと組み合わせることにより、所望の抗腫瘍効果を得
ることができる。OSNプロモーター発現のレベルおよび組織特異性に基づいて、
組換えベクターおよび毒性もしくは治療用の遺伝子と組み合わせた場合、in vit
roおよびin vivoの両方において局所性および骨転移性沈着物として増殖する、
限定されるものではないが、肺癌、大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性
骨髄腫、および乳癌を含めて、前立腺癌および骨肉腫または他の骨指向性腫瘍が
本発明により効果的に取り除かれるであろう。The present invention may also use the OSN promoter by administering the recombinant adenovirus Ad-OSN-TK in combination with a prodrug, which is most commonly acyclovir (ACV), by the above route. Provided are methods of treating osteosarcoma or prostate cancer or other osteotrophic tumors, although OSN promoter driven therapies are not limited to a particular vector or therapeutic gene. In fact, many forms of vector or virulence gene can be generated and combined with this novel OSN promoter driven strategy to achieve the desired anti-tumor effect. Based on the level of OSN promoter expression and tissue specificity,
In vit when combined with recombinant vectors and toxic or therapeutic genes
Proliferates as local and bone metastatic deposits both ro and in vivo,
Prostate cancer and osteosarcoma or other osteotrophic tumors are effective according to the invention, including but not limited to lung cancer, colon cancer, melanoma, thyroid cancer, brain tumors, multiple myeloma, and breast cancer. Will be removed.

【００１９】本発明は、骨指向性の細胞および組織の中で発現をモジュレートする化合物を
スクリーニングするための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、ヒト
OSNプロモーターに由来するヌクレオチドおよびその転写的に活性な断片、なら
びにそのようなヌクレオチドに高ストリンジェント条件下でハイブリダイズして
骨指向性特異的遺伝子の発現を制御する核酸を含んでなる組成物を提供する。特
に、ルシフェラーゼなどの異種レポーター遺伝子に機能的に連結されたOSNプロ
モーターおよび転写的に活性なその断片を含んでなる発現ベクターと、そのよう
なベクターを含んでなる宿主細胞およびトランスジェニック動物とを提供する。
本発明はまた、骨指向性関連障害に対するアゴニストおよびアンタゴニストの候
補分子をスクリーニングするために、そのようなベクター、細胞および動物を使
用する方法を提供する。また、治療処置用にスクリーニングアッセイにより同定
された分子および化合物の使用方法を提供する。The present invention provides compositions and methods for screening for compounds that modulate expression in osteotrophic cells and tissues. In particular, the invention is
A composition comprising a nucleotide derived from the OSN promoter and a transcriptionally active fragment thereof, and a nucleic acid that hybridizes to such a nucleotide under high stringent conditions to control the expression of a bone tropism-specific gene. provide. In particular, an expression vector comprising an OSN promoter operably linked to a heterologous reporter gene such as luciferase and a transcriptionally active fragment thereof, and host cells and transgenic animals comprising such a vector are provided. To do.
The invention also provides methods of using such vectors, cells and animals to screen candidate molecules for agonists and antagonists for osteotrophic-related disorders. Also provided are methods of using the molecules and compounds identified by the screening assays for therapeutic treatment.

【００２０】例えば、限定されるものではないが、レポーター遺伝子を含む組成物は、OSN
プロモーターに機能的に連結される。OSN駆動型レポーター遺伝子は、動物中で
トランスジーンとして発現される。トランスジェニック動物およびそのようなト
ランスジェニック動物の骨指向性細胞に由来する細胞は、骨指向性関連障害をモ
ジュレートするのに有用な候補化合物をスクリーニングするために使用すること
ができる。特定の理論になんら束縛されるものではないが、そのような化合物は
、おそらく、転写因子のようなトランス作用性因子、プロモーターやエンハンサ
ーのようなシス作用性因子の機能に影響を及ぼすだけでなく、骨指向性関連障害
に関与する転写後、翻訳時または翻訳後の化合物のいずれのクラスの機能にも影
響を及ぼす可能性がある。したがって、それらは、そのような障害（例えば、限
定されるものではないが局所性または播種性の骨肉腫、肺癌、大腸癌、黒色腫、
甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、胃癌、卵巣癌、とりわけ、限定されるもので
はないが乳癌および前立腺癌が挙げられる）、および石灰化が起こるBPHまたは
動脈硬化状態のような良性状態を治療するための有望な候補化合物である。本発
明の化合物はさらに、老化や退行の過程で生じた損傷を修復すべく、重要な増殖
および分化に関連した遺伝子、例えば、増殖因子、増殖因子受容体、骨形態形成
タンパク質などに対する遺伝子を発現させるために使用することができる。For example, but not limited to, a composition containing a reporter gene is
Functionally linked to the promoter. The OSN driven reporter gene is expressed as a transgene in animals. Transgenic animals and cells derived from the osteotrophic cells of such transgenic animals can be used to screen candidate compounds useful for modulating osteotrophic associated disorders. Without being bound to any particular theory, such compounds probably not only affect the function of trans-acting factors such as transcription factors, cis-acting factors such as promoters and enhancers, , Can affect the function of either class of post-transcriptional, co-translational or post-translational compounds involved in osteotropism-related disorders. Thus, they are useful for treating such disorders, such as, but not limited to, localized or disseminated osteosarcoma, lung cancer, colon cancer, melanoma,
Treats benign conditions such as thyroid cancer, brain tumors, multiple myeloma, gastric cancer, ovarian cancer, including but not limited to breast cancer and prostate cancer), and BPH or atherosclerotic conditions where calcification occurs. It is a promising candidate compound for The compounds of the present invention further express important growth and differentiation-related genes, such as genes for growth factors, growth factor receptors, bone morphogenetic proteins, etc., in order to repair damage caused by aging and regression. Can be used to

【００２１】一実施形態において、本発明は、骨指向性細胞内および組織内で遺伝子の特異
的発現をモジュレートする化合物を高スループットでスクリーニングする方法を
提供する。本発明のこの態様では、骨指向性組織に由来する細胞をトランスジェ
ニック動物から取り出し、in vitroで培養する。レポーター遺伝子の発現を用い
て、骨指向性特異的遺伝子の活性をモニターする。特定の実施形態では、ルシフ
ェラーゼがレポーター遺伝子である。さらに、この方法により同定された化合物
が正常動物において骨指向性関連障害に及ぼす影響を試験することができる。In one embodiment, the invention provides a method for high throughput screening of compounds that modulate the specific expression of genes in osteotropic cells and tissues. In this aspect of the invention, cells derived from osteotrophic tissue are removed from the transgenic animal and cultured in vitro. Expression of the reporter gene is used to monitor the activity of osteotropism-specific genes. In certain embodiments, luciferase is the reporter gene. In addition, the effects of compounds identified by this method on osteotropism-related disorders in normal animals can be tested.

【００２２】他の実施形態において、候補薬物の作用機構を試験して、骨指向性関連障害に
及ぼすそれらの影響を調べるためのin vivoスクリーニングを行うべく、本発明
のトランスジェニック動物モデルを使用することができる。特に、骨指向性関連
障害（例えば、限定されるものではないが局所性または播種性の骨肉腫、肺癌、
大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、胃癌、卵巣癌、とりわけ、
限定されるものではないが乳癌および前立腺癌が挙げられる）、ならびに石灰化
が起こるBPHまたは動脈硬化状態のような良性状態に及ぼす薬物の影響をアッセ
イすることができる。In another embodiment, the transgenic animal models of the invention are used to test the mechanism of action of candidate drugs and to perform an in vivo screen to determine their effects on osteotrophic-related disorders. be able to. In particular, bone-orientation-related disorders such as, but not limited to, local or disseminated osteosarcoma, lung cancer,
Colorectal cancer, melanoma, thyroid cancer, brain tumor, multiple myeloma, gastric cancer, ovarian cancer, among others,
The effects of the drug on benign conditions such as BPH or arteriosclerotic conditions where calcification occurs can be assayed.

【００２３】他の実施形態において、骨指向性関連障害を治療および／または予防するため
の遺伝子治療法を提供する。毒性または治療用の分子の骨指向性特異的発現を駆
動するために、OSNプロモーター配列を使用し、それを骨指向性細胞に導入する
。この方法には、毒性または治療用の分子をコードする核酸に機能的に連結され
たOSNプロモーター配列を骨指向性細胞に導入することが含まれる。一実施形態
において、本発明は、毒性または治療用の分子をコードする核酸に機能的に連結
されたOSNプロモーター配列を骨指向性細胞に導入して、骨指向性関連障害の発
症を遅延および／または防止することを含んでなる予防的遺伝子治療法を提供す
る。特定の実施形態において、本発明は、癌または他の増殖性障害（例えば、限
定されるものではないが局所性または播種性の骨肉腫、肺癌、大腸癌、黒色腫、
甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、胃癌、卵巣癌、とりわけ、限定されるもので
はないが乳癌および前立腺癌が挙げられる）を治療するための遺伝子治療法を提
供する。特に患者の骨指向性腫瘍細胞において1種以上のタンパク質の発現を指
令するように、OSNプロモーター配列を使用する。このほか、本発明に使用され
るプロモーターの組織特異性に起因して、治療用および／または毒性の薬剤は、
注射のように直接適用により投与した場合だけでなく、静脈内投与、動脈内投与
、腫瘍内投与、灌流、経口投与などを介して全身的に生体に適用した場合にも有
効である。なぜなら、遺伝子発現が、特定の細胞および組織タイプに限定および
局在化されると考えられるからである。さらに、本発明の治療用および／または
毒性の薬剤の多くは多面発現的効果を呈するので、多くの有害な副作用を防止す
るために、特異的に標的化された細胞中だけで治療用および／または毒性の薬剤
を発現させることが不可欠である。[0023] In another embodiment, a gene therapy method for treating and / or preventing a bone tropism-related disorder is provided. To drive osteotropic specific expression of toxic or therapeutic molecules, the OSN promoter sequence is used to introduce it into osteotropic cells. This method involves introducing into the osteotrophic cell an OSN promoter sequence operably linked to a nucleic acid encoding a toxic or therapeutic molecule. In one embodiment, the invention introduces an OSN promoter sequence operably linked to a nucleic acid encoding a toxic or therapeutic molecule into osteotrophic cells to delay the onset of osteotrophic-related disorders and / or Alternatively, there is provided a prophylactic gene therapy method comprising preventing. In certain embodiments, the invention provides a cancer or other proliferative disorder, such as, but not limited to, local or disseminated osteosarcoma, lung cancer, colon cancer, melanoma,
Gene therapy methods for treating thyroid cancer, brain tumors, multiple myeloma, gastric cancer, ovarian cancer, including but not limited to breast cancer and prostate cancer. The OSN promoter sequence is used to direct expression of one or more proteins, particularly in osteotropic tumor cells of the patient. In addition, due to the tissue specificity of the promoter used in the present invention, therapeutic and / or toxic agents are
It is effective not only when it is administered by direct application such as injection, but also when it is systemically applied to a living body through intravenous administration, intraarterial administration, intratumoral administration, perfusion, oral administration and the like. This is because gene expression is thought to be restricted and localized to specific cell and tissue types. In addition, many of the therapeutic and / or toxic agents of the present invention exhibit pleiotropic effects, which prevent therapeutic and / or therapeutic effects only in specifically targeted cells to prevent many adverse side effects. Or it is essential to develop a toxic drug.

【００２４】組織特異的プロモーターのほかに、本発明には、誘導性プロモーターを用いた
ベクターが包含される。誘導性プロモーターには、患者の臨床状態に応じて、そ
れを作動させたり停止させたりできるという利点がある。したがって、誘導性プ
ロモーターの制御下で治療用トランスジーンを安定に細胞にトランスフェクトす
れば、各人の全寿命にわたりその発現を制御することが可能である。In addition to the tissue-specific promoter, the present invention includes a vector using an inducible promoter. Inducible promoters have the advantage that they can be activated or deactivated depending on the clinical condition of the patient. Thus, stable transfection of cells with a therapeutic transgene under the control of an inducible promoter can control its expression over the entire lifespan of each individual.

【００２５】本発明はさらに、OSNプロモーター配列をモジュレートする新規な転写因子を
スクリーニングする方法を提供する。この方法により同定されたそのような新規
な転写因子は、骨指向性関連障害を治療するための標的として使用することがで
きる。The present invention further provides a method of screening for novel transcription factors that modulate the OSN promoter sequence. Such novel transcription factors identified by this method can be used as targets for treating osteotrophic related disorders.

【００２６】3.1 定義 TK = チミジンキナーゼ; OC = オステオカルシン; OSN = オステオネクチン; AcV = アシクロビル; FBS = ウシ胎児血清; Beta-gal. = β-ガラクトシダーゼ; CMV = サイトメガロウイルス; ROS 17/2.7 = ラット骨芽細胞骨肉腫; MG 63 = ヒト骨肉腫; NIH 3T3 = マウス胚繊維芽細胞; P69 = いずれの腫瘍原性または転移性も有しないヒト「正常」前立腺細胞型; LNCaP = ヒトアンドロゲン依存性前立腺癌; C4-2 = ヒトアンドロゲン非依存性高度腫瘍原性/転移性前立腺癌; PC-3M = ヒトアンドロゲン非依存性高度転移性前立腺癌; ArCaP = ヒトアンドロゲン非依存性前立腺癌; Saos-2 = ヒト骨肉腫; SF/PF = 血清不含、フェノール不含； Dl = マウス胚多分化骨髄細胞; Lovo = ヒト大腸癌; MCF-7 = ヒト乳癌; U-97 = ジオブラストーママルチフォームタイプ(gioblastoma multiform type)
のヒト脳癌; A547 = ヒト肺癌; DMEM = ダルベッコ改変イーグル培地; T培地 = 前立腺癌細胞最適増殖培地; RLU = 相対ルシフェラーゼユニット; 4, 図の説明以下の図面は本明細書の一部を構成し、本発明の特定の態様をさらに説明する
ために含まれる。本発明は、本明細書に示された特定の実施形態の詳細な説明と
組み合わせて、これらの図面の１以上を参照することにより、さらによく理解さ
れよう（詳細は「図面の簡単な説明」の欄に記載)。 3.1 Definitions TK = Thymidine Kinase; OC = Osteocalcin; OSN = Osteonectin; AcV = Acyclovir; FBS = Fetal Bovine Serum; Beta-gal. = Β-Galactosidase; CMV = Cytomegalovirus; ROS 17 / 2.7 = Rat Osteoblast osteosarcoma; MG 63 = human osteosarcoma; NIH 3T3 = mouse embryonic fibroblasts; P69 = human "normal" prostate cell type without any tumorigenic or metastatic disease; LNCaP = human androgen-dependent prostate Cancer; C4-2 = Human androgen-independent advanced tumorigenic / metastatic prostate cancer; PC-3M = Human androgen-independent advanced metastatic prostate cancer; ArCaP = Human androgen-independent prostate cancer; Saos-2 = Human osteosarcoma; SF / PF = serum-free, phenol-free; Dl = mouse embryonic differentiated bone marrow cells; Lovo = human colon cancer; MCF-7 = human breast cancer; U-97 = geoblastoma multiform type (gioblastoma) multiform type)
Human brain cancer; A547 = human lung cancer; DMEM = Dulbecco's modified Eagle medium; T medium = prostate cancer cell optimal growth medium; RLU = relative luciferase unit; 4, figure legends The following figures form part of this specification. However, it is included to further describe certain aspects of the invention. The present invention will be better understood by reference to one or more of these drawings in combination with the detailed description of specific embodiments presented herein (details are "a brief description of the drawings"). Column)).

【００２７】5. 詳細な説明本発明は、骨指向性細胞内で発現を指令するプロモーター、エンハンサーおよ
び他の調節エレメントであって、OSNの発現を制御する5'調節領域由来のヌクレ
オチド配列、および転写に関して活性なその断片を含むものを提供する。具体的
に提供されるのは、発現ベクター、宿主細胞、およびトランスジェニック動物で
あって、OSN調節領域は、異種コード配列の発現を制御する能力、または内因性O
SN遺伝子もしくは病理学的過程のインヒビターを過剰発現する能力、または石灰
化の可能性がある腫瘍および組織細胞中における石灰化関連疾患に関して重要で
あると考えられる特定遺伝子の発現をノックアウトする能力を有する。 5. Detailed Description The present invention relates to promoters, enhancers and other regulatory elements that direct expression in osteotrophic cells, the nucleotide sequences from the 5 ′ regulatory region controlling expression of OSN, and Those that include the fragment that is transcriptionally active are provided. Specifically provided are expression vectors, host cells, and transgenic animals, wherein the OSN regulatory regions have the ability to control the expression of heterologous coding sequences, or endogenous O2.
Ability to overexpress the SN gene or inhibitors of pathological processes, or to knock out the expression of certain genes that may be important for calcification-related diseases in potentially calcified tumors and tissue cells ..

【００２８】本発明はまた、それらのベクター、細胞および動物を、石灰化の可能性がある
腫瘍および組織細胞に影響を及ぼす障害のアゴニストおよびアンタゴニストに関
して、候補分子をスクリーニングするために用いる方法を提供する。別の実施形
態において本発明は、石灰化の可能性がある腫瘍および組織細胞内で化合物の発
現をモジュレートするための、また石灰化の可能性がある腫瘍および組織細胞内
での発現をモジュレートする化合物をスクリーニングするための組成物および方
法を提供する。そして、治療的処置のためのスクリーニングアッセイで同定され
た分子および化合物の使用方法もまた提供する。The invention also provides methods of using those vectors, cells and animals to screen candidate molecules for agonists and antagonists of disorders affecting potentially calcifying tumor and tissue cells. To do. In another embodiment, the invention provides for modulating the expression of a compound in potentially calcified tumor and tissue cells and also for modulating the expression in potentially calcified tumor and tissue cells. Compositions and methods for screening rate compounds are provided. And, methods of using the molecules and compounds identified in the screening assays for therapeutic treatment are also provided.

【００２９】本発明はさらに、石灰化の可能性がある腫瘍ならびに他の疾患および障害を、
治療および/または改善するための方法を提供する。これらの腫瘍、疾患、障害
の例として、限定するものではないが、限局性または散在性の骨肉腫、肺、大腸
、黒色種、甲状腺、脳、多発性骨髄腫、乳癌および前立腺癌が挙げられる。本発
明は具体的には、上記の骨指向性腫瘍の転移部位、また可能な場合には、転移環
境でそれらを支持する骨支質を標的とする。さらに本発明は、良性前立腺過形成
(BPH)などの良性の症状に、または石灰化が生じる動脈硬化症状に適用し得る治
療薬を提供する。The present invention further provides for tumors and other diseases and disorders that are potentially calcified,
Methods for treating and / or improving are provided. Examples of these tumors, diseases and disorders include, but are not limited to, localized or disseminated osteosarcoma, lung, colon, melanoma, thyroid, brain, multiple myeloma, breast cancer and prostate cancer. . The present invention specifically targets the metastatic sites of the osteotrophic tumors described above and, where possible, the bone stroma that support them in the metastatic environment. The present invention further provides benign prostatic hyperplasia.
(EN) A therapeutic agent applicable to benign symptoms such as (BPH) or arteriosclerotic symptoms caused by calcification.

【００３０】本発明は、部分的に、ベクター(すなわちウイルスベクター)中に含まれる、毒
性および/または治療用コード配列をコードするヌクレオチド配列を、これらの
ヌクレオチド配列の組織特異的発現を可能とするプロモーターの使用により、細
胞および組織特異的な様式で投与し得るという発見に基づいている。さらに、本
発明のベクターはこれらのプロモーターを毒性および/または治療的コード配列
の発現を制御するために利用するので、本発明のベクターは直接適用して投与さ
れた場合のみならず、全身的に投与された場合にも有効な治療薬である。なぜな
ら毒性および/または治療的コード配列は、特異的に標的とされた細胞内、すな
わち石灰化する可能性がある腫瘍および組織細胞においてのみ特異的に発現する
からである。The present invention allows, in part, the nucleotide sequences contained in a vector (ie, a viral vector) that encode toxic and / or therapeutic coding sequences to allow tissue-specific expression of these nucleotide sequences. It is based on the finding that the use of promoters allows administration in a cell and tissue specific manner. Furthermore, since the vectors of the present invention utilize these promoters to control the expression of toxic and / or therapeutic coding sequences, the vectors of the present invention can be systemically administered, not only when administered directly. It is also an effective therapeutic drug when administered. This is because the toxic and / or therapeutic coding sequences are specifically expressed only in specifically targeted cells, ie in tumor and tissue cells that are capable of calcification.

【００３１】この特徴を利用して、本発明の方法は、治療薬をコードする１種以上のDNA分
子を、治療薬が必要である部位へ効率的に送達するように設計されている。本発
明の方法は、翻訳産物(すなわち治療用タンパク質)または転写産物(すなわちア
ンチセンスまたはリボザイム)をコードするDNAを含むベクターを、哺乳動物宿主
内の翻訳産物が必要な部位へ投与することに関する。治療薬の必要な細胞に一旦
ベクターが感染すると、目的のコード配列、すなわちチミジンキナーゼが発現さ
れ、それにより毒性および/または治療薬、タンパク質またはRNAの量が増幅され
る。Utilizing this feature, the method of the present invention is designed to efficiently deliver one or more DNA molecules encoding a therapeutic agent to the site where the therapeutic agent is needed. The methods of the invention relate to administering a vector containing DNA encoding a translation product (ie, a therapeutic protein) or transcript (ie, an antisense or ribozyme) to a site in a mammalian host where the translation product is required. Once the vector infects cells in need of a therapeutic agent, the coding sequence of interest, thymidine kinase, is expressed, thereby amplifying the amount of toxic and / or therapeutic agent, protein or RNA.

【００３２】本発明はまた、骨指向性関連障害の治療および/または改善に使用する、DNA含
有ベクターを含んでなる医薬組成物にも関する。これらの障害の例としては、限
定するものではないが、限局性または散在性骨肉腫、肺、大腸、黒色種、甲状腺
、脳、多発性骨髄腫、乳癌および前立腺癌、および石灰化が生じる、良性前立腺
過形成(BPH)などの良性症状、または動脈硬化症状が挙げられる。本発明の組成
物は一般に、目的の治療用タンパク質、すなわち、チミジンキナーゼ、増殖因子
などをコードするDNAを含有するベクターを含む生体適合性材料を含んでなる。
生体適合性組成物とは、哺乳動物宿主に投与された場合に、アレルギー、副作用
または他の不都合な反応を引き起こさない形状にあるものである。The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a DNA-containing vector for use in the treatment and / or amelioration of osteotropism-related disorders. Examples of these disorders include, but are not limited to, localized or disseminated osteosarcoma, lung, colon, melanoma, thyroid, brain, multiple myeloma, breast and prostate cancer, and calcification. Examples include benign symptoms such as benign prostatic hyperplasia (BPH), or arteriosclerotic symptoms. The composition of the invention generally comprises a biocompatible material comprising a vector containing a DNA encoding a therapeutic protein of interest, ie thymidine kinase, growth factors and the like.
A biocompatible composition is in a form that does not cause allergies, side effects or other adverse reactions when administered to a mammalian host.

【００３３】本発明は、骨指向性疾患を治療および/または改善するための、現在の組換え
タンパク質治療に特異的に関連する欠点を克服するものである。第１に、直接的
遺伝子トランスファーは、トランスフェクトした細胞に、(a)治療用タンパク質
を生理学的な量で作成させ、組織特異的かつコンテクスト特異的な様式で修飾さ
せ、そして(b)そのタンパク質を好適な状況で好適な細胞表面シグナル伝達受容
体へ送達するための合理的な方法である。このような分子の外因性送達に関して
は、重大な投薬および送達に関する問題が予想される。第２に、投与の繰り返し
は、たとえそれが可能な場合も、本発明の方法に関しては必要ではない。なぜな
ら、誘導性プロモーターを含む種々のプロモーターを使用して、目的の治療用タ
ンパク質の発現レベルを制御できるからである。さらに、トランスフェクトした
DNAの組み込みを、長期間にわたる組換えタンパク質発現と関連づけることがで
きる。The present invention overcomes the deficiencies specifically associated with current recombinant protein therapies for treating and / or ameliorating osteotrophic disorders. First, direct gene transfer causes the transfected cells to (a) make the therapeutic protein in physiological amounts, modify it in a tissue-specific and context-specific manner, and (b) Is a rational method for delivering L. to a suitable cell surface signaling receptor in a suitable situation. Significant dosing and delivery problems are anticipated with respect to exogenous delivery of such molecules. Secondly, repeated dosing is not necessary for the method of the invention, even if it is possible. This is because various promoters including inducible promoters can be used to control the expression level of the therapeutic protein of interest. In addition, transfected
DNA integration can be associated with long-term recombinant protein expression.

【００３４】以下の第5.1節および第5.2節において、異種コード配列の発現がOSN調節領域
によって制御される、OSN調節領域のヌクレオチド配列、および発現ベクター、
宿主細胞およびトランスジェニック動物を詳細に記載する。第5.3節では、この
ようなポリヌクレオチド(すなわちOSN遺伝子の調節領域)および融合タンパク質
産物の使用方法、OSN遺伝子の調節領域と相互作用する化合物のスクリーニング
方法を記述する。この節では、OSN調節領域に結合するかまたはその活性をモジ
ュレートする、小分子、化合物、組換えタンパク質、ペプチド、核酸、抗体など
のスクリーニングための、in vivoおよびin vitroアッセイを記述する。第5.4節
では、本発明の組成物、薬剤送達または遺伝子治療のために同定されたアゴニス
トまたはアンタゴニストの使用方法を記述する。最後に、第5.5節では、そのよ
うな組成物、アゴニストおよびアンタゴニストを使用し、骨指向性関連障害をモ
ジュレートする医薬組成物を記載する。種々の骨指向性関連障害を治療するため
の方法および組成物が提供されており、これらの障害の例としては、限定するも
のではないが、限局性または散在性骨肉腫、肺、大腸、黒色種、甲状腺、脳、多
発性骨髄腫、乳癌および前立腺癌、および石灰化が生じる、限定するものではな
いが、良性前立腺過形成(BPH)などの良性症状、および動脈硬化症状が挙げられ
る。In Sections 5.1 and 5.2 below, a nucleotide sequence of the OSN regulatory region, wherein expression of the heterologous coding sequence is controlled by the OSN regulatory region, and an expression vector,
The host cells and transgenic animals are described in detail. Section 5.3 describes methods for using such polynucleotides (ie, the regulatory region of the OSN gene) and fusion protein products, and screening for compounds that interact with the regulatory region of the OSN gene. This section describes in vivo and in vitro assays for screening small molecules, compounds, recombinant proteins, peptides, nucleic acids, antibodies, etc. that bind to or modulate the activity of OSN regulatory regions. Section 5.4 describes methods of using the identified agonists or antagonists for the compositions, drug delivery or gene therapy of the present invention. Finally, Section 5.5 describes pharmaceutical compositions that use such compositions, agonists and antagonists, to modulate osteotrophic-related disorders. Methods and compositions are provided for treating various osteotrophic-related disorders, examples of which include, but are not limited to, localized or disseminated osteosarcoma, lung, colon, black. Species, thyroid, brain, multiple myeloma, breast and prostate cancer, and calcifications occur, including, but not limited to, benign conditions such as benign prostatic hyperplasia (BPH), and atherosclerotic conditions.

【００３５】5.1 本発明のポリヌクレオチドおよび核酸本発明は、OSN遺伝子の5'調節領域、および転写に関して活性なその断片を含
むポリヌクレオチド配列を包含する。特に、本発明により、OSN遺伝子内に位置
した約2.3 kb、1.5 kb、1.1 kb、0.6および0.2 kbの配列を含むポリヌクレオチ
ドが提供される。具体的には、ポリヌクレオチドは図１に示したOSN配列の-1409
bp〜+904 bp,-1409 bp〜+73 bp、-120 bp〜+904 bpおよび-120 bp〜+73 bp、お
よび図１１に示したOSN配列の-522 bp〜+39、-522 bp〜+62および-522 bp〜+73
を含む。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、長さが5000、4000、30
00、2000、1000であってよく、好ましくは約500 bpである。 5.1 Polynucleotides and Nucleic Acids of the Invention The invention encompasses polynucleotide sequences that include the 5'regulatory region of the OSN gene and transcriptionally active fragments thereof. In particular, the invention provides a polynucleotide comprising sequences of about 2.3 kb, 1.5 kb, 1.1 kb, 0.6 and 0.2 kb located within the OSN gene. Specifically, the polynucleotide is -1409 of the OSN sequence shown in FIG.
bp to +904 bp, -1409 bp to +73 bp, -120 bp to +904 bp and -120 bp to +73 bp, and -522 bp to +39, -522 bp of the OSN sequence shown in Fig. 11. +62 and -522 bp to +73
including. In various embodiments, the polynucleotide has a length of 5000, 4000, 30.
It may be 00, 2000, 1000, preferably about 500 bp.

【００３６】本発明はさらに、OSN調節領域のプローブ、プライマーおよび断片を提供する
。The invention further provides probes, primers and fragments of the OSN regulatory region.

【００３７】ある実施形態においては、OSN遺伝子配列の少なくとも８ヌクレオチド(すなわち
ハイブリダイズ可能な部分)をからなる精製した核酸が提供される。別の実施形
態においては、核酸分子は、OSN配列の少なくとも20(連続)ヌクレオチド、25ヌ
クレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、200ヌクレオチド、500、1000
、2000、3000、4000または5000ヌクレオチドからなる。当業者によく知られた方
法を用いて、これらの配列を、単離した状態でもベクターに含まれた状態でも構
築できる。これらの方法には、例えば、in vitro組換えDNA手法、合成手法およ
びin vivo遺伝的組換え手法が含まれる。例えば、Sambrookら、1989、前掲およ
びAusabelら、1989、前掲に記載の手法を参照されたい。また例えば、「オリゴ
ヌクレオチド合成」(Oligonucleotide Synthesis), 1984, Gait M. J.編、IRL P
ress, Oxfordに記載の手法も参照されたい。同書は参照によりその全文を本願明
細書に組み入れる。In one embodiment, a purified nucleic acid consisting of at least 8 nucleotides (ie, the hybridizable portion) of the OSN gene sequence is provided. In another embodiment, the nucleic acid molecule is at least 20 (consecutive) nucleotides, 25 nucleotides, 50 nucleotides, 100 nucleotides, 200 nucleotides, 500, 1000 of the OSN sequence.
, 2000, 3000, 4000 or 5000 nucleotides. These sequences can be constructed, either isolated or contained in a vector, using methods well known to those of skill in the art. These methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques and in vivo genetic recombination techniques. See, for example, the procedures described in Sambrook et al., 1989, supra and Ausabel et al., 1989, supra. Also, for example, “Oligonucleotide Synthesis”, 1984, edited by Gait MJ, IRL P
See also the method described in ress, Oxford. The same document is hereby incorporated by reference in its entirety.

【００３８】別の実施形態では、核酸は、20、25、35、200又は500ヌクレオチド長より短い
。核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよい。本発明はまた、前記配列にハイブリダイ
ズする核酸又は該配列に相補的な核酸を包含する。特定の態様において、OSN遺
伝子の少なくとも10、20、25、50、100、200、500ヌクレオチド又はその全調節
領域と相補的な配列を含む核酸を提供する。In another embodiment, the nucleic acid is less than 20, 25, 35, 200 or 500 nucleotides in length. The nucleic acid may be single-stranded or double-stranded. The present invention also includes nucleic acids that hybridize to or are complementary to the sequences. In a particular embodiment, a nucleic acid comprising a sequence complementary to at least 10, 20, 25, 50, 100, 200, 500 nucleotides of the OSN gene or the entire regulatory region thereof is provided.

【００３９】本発明によって提供されるプローブ、プライマー及びOSN調節領域の断片は、
研究者によって、様々な目的に使用されうる。これらは、サザンブロットゲルの
分子量マーカーとして；染色体を同定するため又は関連する遺伝子の位置をマッ
ピングするための染色体マーカー又はタグ（標識されている場合）として；患者
における内因性DNA配列と比較して潜在的遺伝子障害を同定するため；ハイブリ
ダイズさせて新規の関連するDNA配列を発見するためのプローブとして；遺伝的
フィンガープリンティングのためのPCRプライマーを得るための情報源として；
及び、その他の新規ポリヌクレオチドを発見する過程において公知の配列を「差
し引きする（subtract-out）」ためのプローブとして使用できる。上記に挙げた
用途を実施する方法は、当業者に公知である。そのような方法を開示する参考文
献として、限定するものではないが、「分子クローニング：実験室マニュアル(M
olecular Cloning: A Laboratory Manual)」(第2版 Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch及びT. Maniatis編、1989)ならびに
「酵素学の方法：分子クローニング技術への招待(Methods in Enzymology: Guid
e to Molecular Cloning Techniques)」(Academic Press, Berger, S. L.及びA.
R. Kimmel 編、1987)が挙げられる。The probes, primers and fragments of the OSN regulatory region provided by the present invention include:
It can be used by researchers for a variety of purposes. These are as molecular weight markers on Southern blot gels; as chromosomal markers or tags (if labeled) for identifying chromosomes or mapping the location of related genes; compared to endogenous DNA sequences in patients. To identify potential genetic disorders; as a probe for hybridizing to discover new related DNA sequences; as a source for obtaining PCR primers for genetic fingerprinting;
And can be used as a probe to "subtract-out" a known sequence in the process of discovering other novel polynucleotides. Methods for carrying out the uses listed above are known to those skilled in the art. References disclosing such methods include, but are not limited to, "Molecular Cloning: Laboratory Manual (M
`` Ocular Cloning: A Laboratory Manual) '' (2nd edition Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Sambrook, J., EF Fritsch and T. Maniatis, 1989) and “Methods in Enzymology: Guid.
e to Molecular Cloning Techniques) '' (Academic Press, Berger, SL and A.
R. Kimmel, 1987).

【００４０】本発明のヌクレオチド配列はまた、図１に示したヌクレオチド配列に対し、少
なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又はそれ以上のヌクレオチド
配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び/又はその転写活性のある断片（石
灰化する可能性を有する腫瘍細胞及び組織細胞内において特異的に発現を指令す
ることができるもの）を含む。The nucleotide sequence of the present invention also comprises at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or more nucleotides relative to the nucleotide sequence shown in FIG. A nucleotide sequence having sequence identity, and / or a transcriptionally active fragment thereof capable of specifically directing expression in potentially calcifying tumor cells and tissue cells.

【００４１】２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一性の％を測定するためには、配列を
、最適な比較目的のためにアラインさせる（例えば、第２のアミノ酸又は核酸配
列との最適なアライメントのために第１のアミノ酸又は核酸配列の配列内にギャ
ップを導入してもよい）。そうして、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド
位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、
第２の配列内の対応する位置のものと同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドによ
って占められているときは、該分子はその位置において同一である。２つの配列
間における同一性の％は、該配列に共通の同一位置の数の関数である（すなわち
、同一性％＝同一の重複する位置の数/位置の総数×100）。一実施形態において
、２つの配列は同一の長さである。２つの配列間の同一性％の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて達成する
こともできる。２つの配列を比較するために使用される数学的アルゴリズムの好
ましい、非限定的な例は、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87: 2264-2268に記載のアルゴリズム、Karlin及びAltschul (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877に記載の改変型アルゴリズムである。この
ようなアルゴリズムは、Altschul,ら、(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のNB
LAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、NBL
ASTプログラム（スコア= 100、ワード長 = 12）を用いて実施でき、本発明の核
酸分子に相同的ヌクレオチド配列が得られる。BLASTタンパク質検索は、XBLAST
プログラム（スコア= 50、ワード長= 3）を用いて実施でき、本発明のタンパク
質分子に相同的なアミノ酸配列が得られる。比較の目的でギャップアライメント
を得るため、Altschulら、(1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載のG
apped BLASTを利用できる。あるいは、PSI-Blastを使用して反復検索を実施し、
分子間の遠位関係を検出することができる(Id)。BLAST、Gapped BLAST及びPSI-B
lastプログラムを使用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ
ー（例えば、XBLAST及びNBLAST）を使用できる（http://www. ncbi. nlm. nih.
gov参照）。配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの、好ましい非限定的
な別の例は、Myers及びMiller, (1988) CABIOS 4: 11-17のアルゴリズムである
。このようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの
一部であるALIGNプログラム (version 2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列
を比較するためにALIGNプログラムを使用する場合は、PAM120重量残基表（weigh
t residue table）、ギャップ長ペナルティ12及びギャップペナルティ4を使用で
きる。別の実施形態では、NA_MULTIPLE_ALIGNMENT 1.0プログラム（GapWeight 5
、及びGapLengthWeight １を使用）を用いてアライメントが得られる。To determine the percent identity of two amino acid sequences or two nucleic acids, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (eg, optimal alignment with a second amino acid or nucleic acid sequence). A gap may be introduced within the sequence of the first amino acid or nucleic acid sequence for The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. The position in the first array is
When occupied by the same amino acid residue or nucleotide as that of the corresponding position in the second sequence, the molecules are identical at that position. The percent identity between two sequences is a function of the number of identical positions common to the sequences (ie,% identity = number of identical overlapping positions / total number of positions × 100). In one embodiment, the two sequences are the same length. Determination of percent identity between two sequences can also be accomplished using a mathematical algorithm. A preferred, non-limiting example of a mathematical algorithm used to compare two sequences is Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87: Algorithm described in 2264-2268, Karlin and Altschul (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Such an algorithm is described in Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, NB.
Incorporated in the LAST and XBLAST programs. BLAST nucleotide search is NBL
It can be carried out using the AST program (score = 100, word length = 12) and gives nucleotide sequences homologous to the nucleic acid molecules of the invention. BLAST protein search is XBLAST
It can be carried out using a program (score = 50, word length = 3), and an amino acid sequence homologous to the protein molecule of the present invention is obtained. To obtain gap alignments for comparison purposes, G as described in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.
Apped BLAST can be used. Alternatively, perform an iterated search using PSI-Blast,
It is possible to detect distant relationships between molecules (Id). BLAST, Gapped BLAST and PSI-B
When using the last program, the default parameters of each program (eg, XBLAST and NBLAST) can be used (http: //www.ncbi.nlm.nih.nih.
See gov). Another preferred non-limiting example of a mathematical algorithm used for sequence comparison is the algorithm of Myers and Miller, (1988) CABIOS 4: 11-17. Such algorithms are incorporated into the ALIGN program (version 2.0), which is part of the GCG sequence alignment software package. When using the ALIGN program to compare amino acid sequences, the PAM120 weight residue table (weigh
t residue table), gap length penalty 12 and gap penalty 4 can be used. In another embodiment, the NA_MULTIPLE_ALIGNMENT 1.0 program (GapWeight 5
, And GapLengthWeight 1) is used to obtain the alignment.

【００４２】２つの配列間における同一性％は、上記と同様の技術を用いて、ギャップあり
又は無しで、決定できる。同一性％の計算においては、典型的には、正確なマッ
チのみを計数する。The percent identity between two sequences can be determined using similar techniques to those described above, with or without gaps. In calculating percent identity, typically only exact matches are counted.

【００４３】本発明はまた、 (a) 前記のOSN調節配列、及び/又はその相補体（すなわち、アンチセンス）の
任意のものを含むDNAベクター； (b) レポーター遺伝子などの異種遺伝子に機能しうる形で連結された前記OSN
調節エレメント配列のうち任意のものを含むDNA発現ベクター；及び (c) 前記OSN調節エレメントが宿主細胞内で異種遺伝子の発現を指令するよう
に、異種遺伝子に機能しうる形で連結された該OSN調節エレメント配列のうち任
意のものを含む遺伝子操作された宿主細胞；を包含する。The present invention also includes (a) a DNA vector containing any of the above OSN regulatory sequences and / or its complement (ie, antisense); (b) a heterologous gene such as a reporter gene. The OSNs connected in a loose manner
A DNA expression vector containing any of the regulatory element sequences; and (c) the OSN operably linked to a heterologous gene such that the OSN regulatory element directs the expression of the heterologous gene in a host cell. A genetically engineered host cell containing any of the regulatory element sequences.

【００４４】本発明の範囲にはまた、この調節領域の種々の転写活性のある断片が包含され
る。本発明の、図１に示した配列の「転写活性のある」又は「転写機能的な」断
片は、組換え細胞宿主内で、組換えポリペプチド又は組換えポリヌクレオチドを
発現するための調節領域として機能的な前記ポリヌクレオチドの断片を含むポリ
ヌクレオチドをいう。本発明の目的に対し、核酸又はポリヌクレオチドは、該調
節ポリヌクレオチド転写情報を含むヌクレオチド配列を含有し、このような配列
が所望のポリペプチド又は所望のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配
列に機能しうる形で連結している場合、組換えポリペプチド又は組換えポリヌク
レオチドを発現するための調節領域として「転写活性」がある。The scope of the present invention also includes various transcriptionally active fragments of this regulatory region. A "transcriptionally active" or "transcriptionally functional" fragment of the sequence shown in Figure 1 of the present invention is a regulatory region for expressing a recombinant polypeptide or polynucleotide in a recombinant cell host. A polynucleotide containing a fragment of the above-mentioned polynucleotide functional as. For purposes of this invention, a nucleic acid or polynucleotide contains a nucleotide sequence that contains the regulatory polynucleotide transcriptional information, such a sequence being capable of functioning with the desired polypeptide or the nucleotide sequence encoding the desired polynucleotide. When linked in form, there is "transcriptional activity" as a regulatory region for expressing the recombinant polypeptide or recombinant polynucleotide.

【００４５】特に、本発明のOSN調節領域の転写活性のある断片は、OSN調節配列に機能しう
る形で連結され、石灰化する可能性のある腫瘍及び組織細胞にトランスフェクト
された際に、レポーター遺伝子などの異種遺伝子の転写を促進するのに十分な長
さのその断片を包含する。典型的には、調節領域は、コード配列のすぐ５’側に
配置され、コード配列に機能しうる形で連結される。本明細書で使用する場合、
用語「機能しうる形で連結された」とは、転写開始に必要な転写作動因子（転写
因子、ポリメラーゼサブユニット及びアクセサリータンパク質など）がこの領域
に集合でき、レポーター遺伝子のRNAポリメラーゼによる転写の開始を可能にす
るように、調節配列をレポーター遺伝子のすぐ5’側（上流）に配置することを
いう。In particular, the transcriptionally active fragment of the OSN regulatory region of the invention, when operably linked to OSN regulatory sequences and transfected into tumor and tissue cells with the potential for calcification, It includes fragments thereof of sufficient length to promote transcription of heterologous genes such as reporter genes. Typically, the regulatory region is located immediately 5'to the coding sequence and is operably linked to the coding sequence. As used herein,
The term "operably linked" means that transcriptional factors necessary for the initiation of transcription (such as transcription factors, polymerase subunits and accessory proteins) can assemble in this region, and the initiation of transcription by the reporter gene RNA polymerase. The regulatory sequence is placed immediately 5 '(upstream) of the reporter gene so that

【００４６】一実施形態では、選択したポリヌクレオチド配列はさらに、OSN遺伝子又は異
種遺伝子のいずれかに由来するその他のヌクレオチド配列を含みうる。別の実施
形態では、複数のコピーのプロモーター配列又はその断片は、互いに連結されて
いてもよい。例えば、プロモーター配列又はその断片を、プロモーター配列又は
その別の断片の別のコピーに、ヘッド−テイル、ヘッド−ヘッド、又はテイル−
テイルの方向で連結してもよい。別の実施形態では、垂直方向特異的エンハンサ
ーは、OSN調節配列又はその断片に機能しうる形で連結でき、これを使用してOSN
調節配列を含む構築物からの転写を増強することができる。In one embodiment, the selected polynucleotide sequence may further include other nucleotide sequences derived from either the OSN gene or a heterologous gene. In another embodiment, multiple copies of the promoter sequence or fragments thereof may be linked together. For example, a promoter sequence or fragment thereof may be attached to another copy of the promoter sequence or another fragment thereof in a head-tail, head-head, or tail-
You may connect in the direction of a tail. In another embodiment, the vertical specific enhancer can be operably linked to an OSN regulatory sequence or fragment thereof and used to
Transcription from constructs containing regulatory sequences can be enhanced.

【００４７】また、このヌクレオチド配列を、その転写活性に実質的な影響を及ぼすことな
く改変することも、本発明の範囲に包含される。このような改変には、付加、欠
失及び置換が含まれる。さらに、ストリンジェントな条件下で図１に示した配列
の相補体に選択的にハイブリダイズし、石灰化する可能性のある腫瘍及び組織細
胞内でコード配列の発現を特異的に活性化することができる、任意のヌクレオチ
ド配列も、本発明に包含される。典型的な中程度にストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件は、以下のようなものである：DNAを含むフィルターのプレ
ハイブリダイゼーションを8時間から一晩かけて、バッファー（6X SSC、50 mM T
ris-HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSA、及び500
μg/ml 変性サケ***DNAからなる）中で、65℃にて実施する。フィルターは、1
00 μg/mlの変性サケ***DNA及び5〜20 X l 0⁶ cpm の³²P-標識プローブを含む
プレハイブリダイゼーション混合物中、65℃にて48時間かけてハイブリダイズさ
せる。フィルターの洗浄は、2X SSC、0.01% PVP、0.01% Ficoll及び0.01% BSAを
含む溶液中で、37℃にて１時間かけて実施する。この後、オートラジオグラフィ
ーの前に0.1X SSC中で、50℃にて45分間洗浄する。また、高度のストリンジェン
トな条件の例は、以下の通りである：例えば、 0.5 M NaHPO₄、7% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1 mM EDTA中で65℃にて、フ
ィルター結合DNAにハイブリダイズさせ、0.1xSSC/0.1% SDS中で68℃にて洗浄す
る(Ausubel F. M.ら編、1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.
I, Green Publishing Associates, Inc.,及びJohn Wiley & sons, Inc., New Y
ork, at p. 2.10.3)。使用しうる高ストリンジェンシーの別の条件は、当技術分
野で公知である。一般に、長さが14〜70ヌクレオチドの間のプローブについては
、融解温度（TM）は以下の式を用いて計算する： Tm (℃) =81.5+16.6 (log [一価のカチオン(モル濃度)]) +0.41 (% G+C)- (500/
N) ［式中、Nはプローブの長さである］。ハイブリダイゼーションをホルムアミ
ドを含む溶液中で実施する場合、融解温度は次の式を用いて計算する： Tm (℃) =81.5+16.6 (log [一価のカチオン(モル濃度)]) +0.41 (% G+C)- (0. 6
1% ホルムアミド)- (500/N)［式中、Nはプローブの長さである］。一般的に、ハ
イブリダイゼーションは、Tmから約20〜25℃低い温度（DNA-DNAハイブリッドの
場合）、又は10〜15℃低い温度で（RNA-DNAハイブリッドの場合）実施する。It is also within the scope of the present invention to modify this nucleotide sequence without substantially affecting its transcriptional activity. Such modifications include additions, deletions and substitutions. Further, under stringent conditions, it selectively hybridizes to the complement of the sequence shown in FIG. 1 and specifically activates the expression of the coding sequence in tumor and tissue cells that may be calcified. Any nucleotide sequence capable of being included in the present invention. Typical moderately stringent hybridization conditions are as follows: prehybridization of filters containing DNA for 8 hours to overnight in buffer (6X SSC, 50 mM T
ris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, and 500
μg / ml denatured salmon sperm DNA) at 65 ° C. Filter is 1
00 [mu] g / ml denatured salmon sperm DNA and the prehybridization mixture containing ³² P- labeled probe 5~20 X l 0 ⁶ cpm of hybridized 48 hours at 65 ° C.. Washing of filters is carried out in a solution containing 2X SSC, 0.01% PVP, 0.01% Ficoll and 0.01% BSA at 37 ° C for 1 hour. This is followed by a wash in 0.1X SSC at 50 ° C for 45 minutes before autoradiography. Examples of highly stringent conditions are also as follows: for example, hybridize to filter bound DNA in 0.5 M NaHPO ₄ , 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1 mM EDTA at 65 ° C. And wash at 68 ° C. in 0.1 × SSC / 0.1% SDS (Ausubel FM et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.
I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & sons, Inc., New Y
ork, at p. 2.10.3). Other conditions of high stringency that may be used are known in the art. Generally, for probes between 14 and 70 nucleotides in length, the melting temperature (TM) is calculated using the following formula: Tm (° C) = 81.5 + 16.6 (log [monovalent cation (molar concentration) ]) +0.41 (% G + C)-(500 /
N) [where N is the length of the probe]. When hybridization is performed in a solution containing formamide, the melting temperature is calculated using the following formula: Tm (° C) = 81.5 + 16.6 (log [monovalent cation (molar concentration)]) +0.41 (% G + C)-(0.6
1% formamide)-(500 / N), where N is the length of the probe. Generally, hybridization is performed at about 20-25 ° C below the Tm (for DNA-DNA hybrids) or 10-15 ° C below (for RNA-DNA hybrids).

【００４８】 OSN調節領域、又はその転写機能的な断片は、好ましくは、哺乳動物生物体由
来のものである。核酸ハイブリダイゼーションによるスクリ−ニング法により、
種々の生物に由来する遺伝子配列を単離することが可能である。本明細書で開示
した単離されたポリヌクレオチド配列、又はその断片を標識して、これを使用す
ることにより、目的の生物に由来する好適な細胞又は組織（例えば、石灰化組織
）から得られるmRNAから構築されたcDNAライブラリーをスクリ−ニングできる。
使用するハイブリダイゼーション条件は、cDNAライブラリーが、標識した配列が
由来する生物と異なるタイプの生物に由来する場合、低度のストリンジェンシー
とすべきである。低度のストリンジェンシー条件は、当業者には公知であり、そ
のライブラリー及び標識配列が由来する所定の生物に応じて相違することになる
。このような条件に関する手引きとして、例えば、Sambrookら、1989、「分子ク
ローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」(
第2版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch
及びT. Maniatis編、1989)ならびにAusabelら、1989、「分子生物学の最新プロト
コール(Current Protocols in Molecular Biology)」(Green Publishing Associa
tes及びWiley Interscience, N. Y.)を参照されたい（これらは、参照によりそ
の全体を本明細書に組み入れるものとする）。さらに、哺乳動物OSN調節領域相
同体は、例えば、ウシ又はその他のヒト以外の核酸から、本明細書に開示したOS
N調節領域のヌクレオチド配列に基づき設計された２つのプライマープールを用
いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を実施することにより単離できる。この
反応の鋳型は、例えば、ウシ又はその他のヒト以外細胞系、又はOSN遺伝子を発
現することが知られている組織から調製されたmRNAの逆転写によって得られたcD
NAでもよい。このような条件に関する手引き書として、例えば、Innisら、(編)
1995, PCR Strategies, Academic Press Inc., San Diego;及びErlich (編) 199
2, PCR Technology, Oxford University Press, New Yorkを参照されたい（これ
らは、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする）。The OSN regulatory region, or transcriptionally functional fragment thereof, is preferably derived from a mammalian organism. By the screening method by nucleic acid hybridization,
It is possible to isolate gene sequences from different organisms. The isolated polynucleotide sequences disclosed herein, or fragments thereof, are labeled and used to obtain from suitable cells or tissues derived from the organism of interest (eg, calcified tissue). A cDNA library constructed from mRNA can be screened.
The hybridization conditions used should be of low stringency if the cDNA library is from a different type of organism than the one from which the labeled sequence was derived. Low stringency conditions are well known to those of skill in the art and will vary depending on the particular organism from which the library and labeled sequences are derived. For guidance on such conditions, see, for example, Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (
Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., EF Fritsch
And T. Maniatis, 1989) and Ausabel et al., 1989, "Current Protocols in Molecular Biology" (Green Publishing Associa
tes and Wiley Interscience, NY), which are hereby incorporated by reference in their entirety. In addition, mammalian OSN regulatory region homologues can be derived from, for example, bovine or other non-human nucleic acids by the OS disclosed herein.
It can be isolated by performing polymerase chain reaction (PCR) amplification with two primer pools designed based on the nucleotide sequence of the N regulatory region. The template for this reaction is, for example, the cD obtained by reverse transcription of mRNA prepared from bovine or other nonhuman cell lines, or tissues known to express the OSN gene.
NA is also acceptable. As a guide for such conditions, for example, Innis et al., (Ed.)
1995, PCR Strategies, Academic Press Inc., San Diego; and Erlich (eds.) 199
2, PCR Technology, Oxford University Press, New York, which are hereby incorporated by reference in their entirety.

【００４９】 OSN遺伝子の5’非コード領域内のプロモーター配列は、エキソヌクレアーゼII
I又は好適な制限エンドヌクレアーゼによる消化などの慣用の技術を用いて、ネ
スト化5’及び/又は3’欠失を構築することによって、さらに規定できる。得ら
れた欠失断片を、プロモーターレポーターベクターに挿入して、その欠失がプロ
モーター活性を減ずるか又は消失させるかどうかを判定することができる。これ
については、例えば、Colesら、(Hum. Mol. Genet., 7: 791-800,1998)などによ
り記載されている。この方法により、プロモーターの境界を決定できる。所望に
より、部位特異的突然変異誘発又はリンカースキャンを用い、プロモーター内の
潜在的な転写因子結合部位を、個々に又は組み合わせて消失させることにより、
プロモーター中の潜在的な個々の調節部位を同定することができる。このような
突然変異の転写レベルでの影響は、プロモーターレポーターベクター中のクロー
ニング部位に突然変異を挿入することにより、判定できる。このようなタイプの
アッセイは、当業者に公知である (WO 97/17359、US 5,374,544、EP 582 796、U
S 5,698,389、US 5,643,746、US 5,502,176及びUS 5,266,488)。The promoter sequence within the 5'non-coding region of the OSN gene is exonuclease II
It can be further defined by constructing the nested 5'and / or 3'deletion using conventional techniques such as digestion with I or a suitable restriction endonuclease. The resulting deletion fragment can be inserted into a promoter reporter vector to determine if the deletion reduces or eliminates promoter activity. This is described, for example, by Coles et al. (Hum. Mol. Genet., 7: 791-800, 1998). By this method, the boundaries of the promoter can be determined. If desired, by using site-directed mutagenesis or linker scanning to eliminate potential transcription factor binding sites within the promoter, either individually or in combination,
Potential individual regulatory sites in the promoter can be identified. The effect of such mutations at the transcriptional level can be determined by inserting the mutation into the cloning site in the promoter reporter vector. Assays of this type are known to the person skilled in the art (WO 97/17359, US 5,374,544, EP 582 796, U).
S 5,698,389, US 5,643,746, US 5,502,176 and US 5,266,488).

【００５０】 OSN調節領域及びその転写機能性のある断片、並びにOSN調節領域及びその断片
を同定するために利用される本明細書に記載の断片及びプローブは、当技術分野
で公知の技術を用いて、組換えDNA技術によって作製できる。当業者に公知の方
法を使用して、これらの配列を、単離された形態で又は発現ベクターに含まれた
形態で、構築することができる。このような方法としては、例えば、in vitro組
換えDNA法、合成法及びin vivo遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Sambrookら
、1989,前掲、及びAusabelら、1989, 前掲に記載の方法を参照されたい。また、
「オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」、1984, Gait M. J.
編、IRL Press, Oxfordに記載の方法も参照されたい。これらは参照によりその
全体を本明細書に組み入れるものとする。OSN regulatory regions and transcriptionally functional fragments thereof, as well as the fragments and probes described herein utilized to identify OSN regulatory regions and fragments thereof, use techniques known in the art. And can be produced by recombinant DNA technology. These sequences can be constructed in isolated form or contained in an expression vector using methods known to those of skill in the art. Examples of such a method include in vitro recombinant DNA method, synthetic method and in vivo gene recombination. See, for example, the methods described in Sambrook et al., 1989, supra, and Ausabel et al., 1989, supra. Also,
"Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait MJ
See also the method described in the volume, IRL Press, Oxford. These are incorporated herein by reference in their entirety.

【００５１】調節配列における改変は、当業者に公知の様々な化学的及び酵素的方法を用い
て作製できる。例えば、制限部位によって規定される配列領域は、欠失させるこ
とができる。オリゴヌクレオチド指定的突然変異誘発を使用して、配列を限定し
て改変することができ、及び/又は配列内の特定の領域に制限部位を導入するこ
とができる。さらに、欠失突然変異体は、Bal31、ExoIII又はS1ヌクレアーゼな
どのDNAヌクレアーゼを用いて作製できる。DNAとヌクレアーゼとをインキュべー
とする時間を増加させることにより、調節配列中の欠失を次第に大きくすること
ができる(例えば、Ausubelら、1989、前掲を参照されたい)。Modifications in regulatory sequences can be made using various chemical and enzymatic methods known to those of skill in the art. For example, the sequence region defined by the restriction sites can be deleted. Oligonucleotide-directed mutagenesis can be used to modify sequences in a limited manner and / or introduce restriction sites at specific regions within the sequences. In addition, deletion mutants can be made with DNA nucleases such as Bal31, ExoIII or S1 nucleases. Increasing the time of incubation of DNA and nucleases can lead to progressively larger deletions in regulatory sequences (see, eg, Ausubel et al., 1989, supra).

【００５２】改変配列は、好適な宿主細胞において異種コード配列を発現を指令する能力に
ついて評価する。さらなる使用のために組換え発現ベクターに組み込まれた、コ
ード配列の発現を指令する能力を保持する任意の改変型調節配列は、本発明の範
囲に包含される。The modified sequences are evaluated for their ability to direct expression of a heterologous coding sequence in a suitable host cell. Any modified regulatory sequence which retains the ability to direct the expression of the coding sequence incorporated into a recombinant expression vector for further use is included within the scope of the invention.

【００５３】5.2 骨指向性特異的プロモーター活性の解析 OSN調節領域は、選択的組織および細胞型に対する特異性を示し、つまり、骨
指向性細胞における遺伝子発現を誘導する。したがって、本発明の調節領域およ
び転写活性のある該領域の断片を用いて骨指向性細胞特異的に異種コード配列の
発現を誘導することができる。本発明は、標的コード配列の組織特異的発現を達
成するためのOSN調節領域の使用を提供する。OSN調節領域の活性および特異性は
さらに、OSNプロモーターを含有するように遺伝子操作された種々の細胞、組織
および細胞系内でのOSNプロモーターに機能的に連結した検出可能なポリヌクレ
オチドの発現レベルをモニタリングすることにより、評価することができる。以
下に記述するように、この検出可能なポリヌクレオチドは所定のオリゴヌクレオ
チドプローブと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであってもよく、
または検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。 5.2 Analysis of Osteotropic- Specific Promoter Activity The OSN regulatory region exhibits specificity for selective tissues and cell types, that is, it induces gene expression in osteotropic cells. Therefore, the regulatory region of the present invention and a fragment of the region having transcriptional activity can be used to induce the expression of a heterologous coding sequence in an osteotropic cell-specific manner. The present invention provides the use of OSN regulatory regions to achieve tissue-specific expression of target coding sequences. The activity and specificity of the OSN regulatory region further determines the expression level of a detectable polynucleotide operably linked to the OSN promoter in various cells, tissues and cell lines genetically engineered to contain the OSN promoter. It can be evaluated by monitoring. As described below, the detectable polynucleotide may be a polynucleotide that specifically hybridizes to a given oligonucleotide probe,
Alternatively, it may be a polynucleotide encoding a detectable protein.

【００５４】5.2.1 OSNプロモーター駆動性レポーター構築物本発明の調節ポリヌクレオチドはコード配列またはレポーター遺伝子を所望の
宿主細胞または宿主生物体内で発現させるために用いられる組換え発現ベクター
の一部とすることが有利であろう。本発明のOSN調節領域および転写活性のある
該領域の断片を用いて異種コード配列の発現を指令することができる。特に、本
発明は哺乳動物OSN調節領域を包含する。本発明においては、転写活性のあるOSN
調節領域の断片とは、該断片が機能的に連結しているレポーターコード配列の転
写を促進するのに十分な長さを有する上記領域の断片を包含する。 5.2.1 OSN Promoter-Driven Reporter Constructs The regulatory polynucleotides of the invention will be part of a recombinant expression vector used to express a coding sequence or reporter gene in a desired host cell or host organism. Would be advantageous. The OSN regulatory regions of the invention and fragments of transcriptionally active regions can be used to direct the expression of heterologous coding sequences. In particular, the invention includes mammalian OSN regulatory regions. In the present invention, a transcriptionally active OSN
A fragment of the regulatory region includes a fragment of the above region having a length sufficient to promote transcription of the reporter coding sequence to which the fragment is operably linked.

【００５５】当業者に公知のさまざまなレポーター遺伝子配列を用いることができる。該レ
ポーター遺伝子配列には、グリーン蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タンパク質
、酵素(例えば、CAT、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ)または抗原マーカ
ーなどが含まれるが、これらに限定されない。便宜的に、光学定量的および蛍光
定量的なアッセイにより解析される酵素的レポーターおよび光放射性レポーター
が、本発明のスクリーニングアッセイには好ましい。A variety of reporter gene sequences known to those of skill in the art can be used. The reporter gene sequence includes, but is not limited to, fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP), enzymes (eg, CAT, β-galactosidase, luciferase) or antigen markers. For convenience, enzymatic and light emitting reporters analyzed by optical and fluorometric assays are preferred for the screening assays of the invention.

【００５６】ある実施形態では、例えば生物発光、化学発光または蛍光タンパク質を光放射
性レポーターとして本発明に用いることができる。光放射性レポーターの種類は
、基質または補因子を必要としないものであるが、オワンクラゲ(Victoria aequ
oria)の野生型グリーン蛍光タンパク質(GFP)(Chalfieら、1994、Science 263:80
2-805)および改変型GFP(Heimら、1995、Nature 373:663-4; 国際公開WO96/23810
)が含まれるが、これらに限定されない。この種のレポーター遺伝子の転写およ
び翻訳により、試験する細胞内で蛍光タンパク質が蓄積され、それを蛍光計また
はフローサイトメーターにより、例えば当業者に公知の方法で測定することがで
きる(Lackowicz、1983、「蛍光分光解析の原理」(Principles of Fluorescence
Spectroscopy), Plenum Press、New Yorkなどを参照のこと)。In certain embodiments, for example, bioluminescent, chemiluminescent or fluorescent proteins can be used in the present invention as light emitting reporters. A type of light-emitting reporter, which does not require a substrate or cofactor,
oria) wild type green fluorescent protein (GFP) (Chalfie et al., 1994, Science 263: 80).
2-805) and modified GFP (Heim et al., 1995, Nature 373: 663-4; International Publication WO96 / 23810.
), But is not limited to these. Transcription and translation of this type of reporter gene results in the accumulation of fluorescent protein in the cells being tested, which can be measured by fluorometers or flow cytometers, for example by methods known to those skilled in the art (Lackowicz, 1983, `` Principles of Fluorescence ''
Spectroscopy), Plenum Press, New York, etc.).

【００５７】利用できる他の種のレポーター遺伝子としては、光を放射するために補因子を
必要とする酵素があり、限定する意味ではないが、ウミシイタケ(Renilla)のル
シフェラーゼが挙げられる。他の起源のルシフェラーゼもまた当業者には公知で
あり、ビブリオ・ハーベイ(Viborio harveyi)の細菌性ルシフェラーゼ(LuxAB遺
伝子産物)(Karp、1989、Biochim. Biophys. Acta.1007:84-90; Stewartら、1992
、J. Gen. Microbiol, 138: 1289-1300)およびホタルのホチヌス・ピラリス(Pho
tinus pyralis)(De Wetら、1987、Mol. Cell. Biol. 7: 725-737)が挙げられる
が、これらに限定はされない。これらは、光の生成によりアッセイすることがで
きる(Miyamotoら、1987、J. Bacteriol. 169:247-253; Loessnerら、1996、Envi
ron. Microbiol. 62:1133-1140; ならびにSchultzおよびYarus、1990、J. Bacte
riol. 172: 595-602)。Other species of reporter genes that can be used include, but are not limited to, enzymes that require cofactors to emit light, including Renilla luciferase. Luciferases of other origins are also known to those of skill in the art and include Viborio harveyi bacterial luciferase (LuxAB gene product) (Karp, 1989, Biochim. Biophys. Acta. 1007: 84-90; Stewart et al. , 1992
, J. Gen. Microbiol, 138: 1289-1300) and Firefly's Hotinus Pylaris (Pho
tinus pyralis) (De Wet et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 725-737), but are not limited thereto. These can be assayed by the production of light (Miyamoto et al., 1987, J. Bacteriol. 169: 247-253; Loessner et al., 1996, Envi.
ron. Microbiol. 62: 1133-1140; and Schultz and Yarus, 1990, J. Bacte.
riol. 172: 595-602).

【００５８】光学定量分析を用いて解析できるレポーター遺伝子には、β-ガラクトシダー
ゼ(Nolanら、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2603-07)、β-グルクロニ
ダーゼ(Robertsら、1989、Curr. Genet. 15:177-180)、ルシフェラーゼ(Miyamot
oら、1987、J. Bacteriol. 169: 247-253)またはβ-ラクタマーゼが挙げられる
が、これらに限定はされない。ある実施形態では、レポーター遺伝子配列はLacZ
遺伝子産物であるβ-ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。
この酵素は非常に安定であり、かつ広範な特異性を有しているため、種々の組織
化学的、発色または蛍光基質の使用を可能とする。係る基質としては、例えば、
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-β-D-ガラクトシド(X-gal)、ラクトース2,3,5
,-トリフェニル-2H-テトラゾリウム(ラクトース-テトラゾリウム)およびフルオ
ロセインガラクトピラノシド(Nolanら、1988、前掲を参照のこと)が挙げられる
が、これらに限定されない。Reporter genes that can be analyzed using optical quantitative analysis include β-galactosidase (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2603-07), β-glucuronidase (Roberts et al., 1989, Curr. Genet. 15: 177-180), luciferase (Miyamot
o., 1987, J. Bacteriol. 169: 247-253) or β-lactamase, but is not limited thereto. In certain embodiments, the reporter gene sequence is LacZ.
It contains a nucleotide sequence that encodes the gene product β-galactosidase.
This enzyme is very stable and has a wide range of specificities, allowing the use of various histochemical, chromogenic or fluorescent substrates. As such a substrate, for example,
5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside (X-gal), lactose 2,3,5
Examples include, but are not limited to, -triphenyl-2H-tetrazolium (lactose-tetrazolium) and fluorescein galactopyranoside (see Nolan et al., 1988, supra).

【００５９】他の実施形態では、大腸菌(E.coli)のβ-グルクロニダーゼ遺伝子(GUS)の産物
をレポーター遺伝子として用いることができる(Robertsら、1989、Curr. Genet.
15: 177-180)。GUS活性は、さまざまな組織化学的および蛍光基質(例えば、X-
グルクロニド(Xgluc)および4-メチルウンベリフェリルグルクロニド)により検出
可能である。In another embodiment, the product of the E. coli β-glucuronidase gene (GUS) can be used as a reporter gene (Roberts et al., 1989, Curr. Genet.
15: 177-180). GUS activity is measured by a variety of histochemical and fluorescent substrates (e.g., X-
It can be detected by glucuronide (Xgluc) and 4-methylumbelliferyl glucuronide).

【００６０】従来の光学的応答を呈する上記のようなレポーター遺伝子配列に加えて、他の
レポーター遺伝子配列(例えば、選択可能レポーター遺伝子配列等)を慣例的に用
いることができる。例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
(CAT)のコード配列を用いることができ、それにより、クロラムフェニコール耐
性細胞の増殖のOSN調節領域依存的な発現がもたらされる。CATの使用および選択
可能レポーター遺伝子の利点は当技術分野では公知である(Eikmannsら、1991、G
ene 102: 93-98)。他の選択可能レポーター遺伝子配列もまた使用できる。これ
には、ゼオシン(zeocin)耐性(Hegedusら、1998、Gene 207: 241-249)またはカナ
マイシン耐性(FriedrichおよびSoriano、1991、Genes. Dev. 5: 1513-1523)を付
与するポリペプチドをコードする遺伝子配列が含まれるが、これらに限定しない
。In addition to the reporter gene sequences described above that exhibit a conventional optical response, other reporter gene sequences (eg, selectable reporter gene sequences, etc.) can be routinely used. For example, chloramphenicol acetyltransferase
The coding sequence for (CAT) can be used, which results in OSN regulatory region-dependent expression of proliferation of chloramphenicol resistant cells. The use of CAT and the advantages of selectable reporter genes are known in the art (Eikmanns et al., 1991, G.
ene 102: 93-98). Other selectable reporter gene sequences can also be used. It encodes a polypeptide conferring zeocin resistance (Hegedus et al., 1998, Gene 207: 241-249) or kanamycin resistance (Friedrich and Soriano, 1991, Genes. Dev. 5: 1513-1523). Includes, but is not limited to, gene sequences.

【００６１】毒性遺伝子産物、潜在的毒性遺伝子産物および抗細胞増殖性または増殖抑制性
遺伝子産物などの他のコード配列を用いることもできる。他の実施形態では、検
出可能なレポーターポリヌクレオチドは所定のオリゴヌクレオチドプローブと特
異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドでもよく、またはOSNポリペプチド
もしくはその断片またはそれらの変異体を含む検出可能なタンパク質をコードす
るポリヌクレオチドでもよい。この種のアッセイは、当業者には公知である(米
国特許第5,502,176号および同第5,266,488号)。Other coding sequences may also be used, such as toxic gene products, potentially toxic gene products and anti-cell proliferative or antiproliferative gene products. In other embodiments, the detectable reporter polynucleotide may be a polynucleotide that specifically hybridizes to a given oligonucleotide probe, or encodes a detectable protein comprising an OSN polypeptide or fragment thereof or variants thereof. The polynucleotide may be Assays of this kind are known to those skilled in the art (US Pat. Nos. 5,502,176 and 5,266,488).

【００６２】 OSNプロモーター駆動性レポーター構築物は標準的組換えDNA技法に従って構築
することができる(例えば、「酵素学における方法」(Methods in Enzymology),
1987, 154巻、Academic Press; Sambrookら、1989、「分子クローニング-実験室
マニュアル」(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring
Harbor Press, New York; およびAusubelら、「分子生物学における最新のプロ
トコル」(Current Protocols in Molecular Biology)、Greene Publishing Asso
ciates and Wiley Interscience、New Yorkなどを参照のこと。これらはいずれ
も全文を参照として本明細書に組込むものとする)。OSN promoter-driven reporter constructs can be constructed according to standard recombinant DNA techniques (eg, “Methods in Enzymology,”
1987, Volume 154, Academic Press; Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", 2nd Edition, Cold Spring.
Harbor Press, New York; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Asso.
See ciates and Wiley Interscience, New York and more. All of which are incorporated herein by reference in their entirety).

【００６３】プロモーター活性をアッセイする方法は当技術分野で公知である(例えば、Sam
brookら、Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Labor
atory, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照のこと)。利用できる典型的な方法
の一例には、レポーター遺伝子を含有する組換えベクターおよび図１に記載のOS
N配列由来のゲノム配列が含まれる。簡単に説明すると、レポーター遺伝子 (例
えば、グリーン蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼまたは
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)の発現が、生物学的に活性
なポリヌクレオチド断片の制御下にある場合には検出される。その遺伝子の第1
エキソンの上流に位置するゲノム配列を、任意の適切なプロモーターレポーター
ベクターにクローニングすることができる。例えば、種々の市販のベクターを遺
伝子操作して哺乳動物宿主細胞での発現のために本発明のOSN調節領域を挿入す
ることができる。このようなベクターの非限定的な例としては、pSEAPBasic、pS
EAP-エンハンサー、pβgal-Basic、pβgal-エンハンサーまたはpEGFP-1プロモー
ターレポーターベクター(Clontech, Palo Alto, CA)またはpGL2-basicもしくはp
GL3-basicプロモーター不含ルシフェラーゼレポーター遺伝子ベクター(Promega,
Madison, WI)などが挙げられる。これらの各プロモーターレポーターベクター
は、簡便にアッセイできるタンパク質(例えば、分泌性アルカリホスファターゼ
、グリーン蛍光タンパク質、ルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼ)をコー
ドするレポーター遺伝子の上流の位置にマルチクローニング部位を有している。
OSN遺伝子の調節配列をレポーター遺伝子の上流にあるクローニング部位に両方
向で挿入して、適切な宿主細胞に導入する。レポータータンパク質のレベルをア
ッセイし、クローニング部位にインサートを含まないベクターで得られたレベル
と比較する。対照のベクターに対してインサートを含有するベクターで発現の上
昇が認められると、インサート内にプロモーターが存在することが示される。Methods for assaying promoter activity are known in the art (eg Sam
brook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labor.
atory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). One example of a typical method that can be used is a recombinant vector containing a reporter gene and the OS described in FIG.
The genomic sequence derived from the N sequence is included. Briefly, expression of a reporter gene (eg, green fluorescent protein, luciferase, β-galactosidase or chloramphenicol acetyltransferase) is detected when it is under the control of a biologically active polynucleotide fragment. It First of that gene
The genomic sequence located upstream of the exon can be cloned into any suitable promoter reporter vector. For example, various commercially available vectors can be genetically engineered to insert the OSN regulatory regions of the invention for expression in mammalian host cells. Non-limiting examples of such vectors include pSEAPBasic, pS
EAP-Enhancer, pβgal-Basic, pβgal-Enhancer or pEGFP-1 Promoter Reporter Vector (Clontech, Palo Alto, CA) or pGL2-basic or p
GL3-basic promoter-free luciferase reporter gene vector (Promega,
Madison, WI) and the like. Each of these promoter reporter vectors has a multicloning site upstream of the reporter gene that encodes a protein (eg, secretory alkaline phosphatase, green fluorescent protein, luciferase or β-galactosidase) that can be conveniently assayed.
The regulatory sequences of the OSN gene are inserted into the cloning site upstream of the reporter gene in both directions and introduced into a suitable host cell. The level of reporter protein is assayed and compared to the level obtained with the vector without insert at the cloning site. Increased expression in the vector containing the insert relative to the control vector indicates the presence of the promoter in the insert.

【００６４】 OSN調節領域を含む発現ベクターは、選択マーカーをコードする遺伝子をさら
に含有してもよい。さまざまな選択系を用いることができ、単純ヘルペスウイル
スのチミジンキナーゼ(Wiglerら、1997、Cell 11: 223)、ヒポキサンチン-グア
ニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(SzybalskaおよびSzybalski、1962、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026)およびアデニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ(Lowyら、1980、Cell 22: 817)の遺伝子(それぞれ、tk^-、hgprt^-、aprt ^- 細胞で用いる)が挙げられるが、これらに限定されない。また、メトトレキセー
トに対する耐性を付与するdhfr (Wiglerら、1980、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77: 1527、O'haraら、1980、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527)、ミコフ
ェノール酸に対する耐性を付与するgpt(MulliganおよびBerg、1981、Proc. Natl
Acad. Sci. USA 78: 2072)、アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するne
o(Colberre-Gerapinら、1981、J. Mol. Biol. 150: 1)およびハイグロマイシン
に対する耐性を付与するhygro(Santerreら、1984、Gene 30: 147)の遺伝子につ
いての選択に基づくような代謝拮抗物質耐性を用いることもできる。他の選択可
能な遺伝子には、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるよう
にするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにする
hisD(HartmanおよびMulligan、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047)、
オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である2-(ジフルオロメチル)-DL-オルニチ
ンとDFMO(McConlogue L.、1987、「分子生物学の最新のニュース」(Current Com
munications in Molecular Biology)中、Cold Spring Harbor laboratory編)に
対する耐性を付与するODC(オルニチンデカルボキシラーゼ)、およびグルタミン
合成酵素(Bebbingtonら、1992、Biotech 10: 169)が挙げられる。[0064] Expression vectors containing the OSN regulatory region will additionally carry a gene encoding a selectable marker.
May be contained in. Various selection systems can be used, herpes simplex virus
Thymidine kinase (Wigler et al., 1997, Cell 11: 223), hypoxanthine-gua.
Nin phosphoribosyl transferase (Szybalska and Szybalski, 1962, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) and adenine phosphoribosyl transfer.
Gene (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) (tk, respectively)^-, Hgprt^-, Aprt ^- Used in cells), but is not limited thereto. Also, methotrex
Resistance to dhfr (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77: 1527, O'hara et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527), Mikoff.
Gpt conferring resistance to enolic acid (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl
Acad. Sci. USA 78: 2072), conferring resistance to the aminoglycoside G-418 ne
o (Colberre-Gerapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1) and hygromycin.
To the gene of hygro (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147) that confers resistance to
Antimetabolite resistance, such as that based on choice, can also be used. Other choices available
A competent gene allows cells to use indole instead of tryptophan.
TrpB, which allows cells to utilize histinol instead of histidine
hisD (Hartman and Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047),
2- (difluoromethyl) -DL-ornithi, an ornithine decarboxylase inhibitor
And DFMO (McConlogue L., 1987, "The Latest News in Molecular Biology" (Current Com
munications in Molecular Biology) in Cold Spring Harbor laboratory)
ODC (ornithine decarboxylase) that confers resistance to glutamine
Synthetic enzymes (Bebbington et al., 1992, Biotech 10: 169).

【００６５】5.2.2 転写活性のある調節性断片の特性解析 OSN調節領域またはその断片を含む融合構築物を転写活性についてアッセイす
ることができる。プロモーター解析における第1段階として、研究対象とする骨
指向性特異的遺伝子の転写開始点(+1の位置)を、標準的方法(Sambrookら、1989
、「分子クローニング：実験室マニュアル」(Molecular Cloning: A Laboratory
Manual), Cold Spring Harbor、Cold Spring Harbor Press)に従ってプライマ
ー伸長アッセイおよび/またはRNaseプロテクションアッセイを用いて決定しなけ
ればならない。+1の位置の上流のDNA配列は、一般に、遺伝子調節を担っている
プロモーター領域であると考えられる。しかし、イントロン内の配列を含む下流
の配列もまた、遺伝子調節に関与している可能性がある。プロモーター活性の試
験を始める際には、-3kb〜+3kbまでの領域（この場合、+1は転写開始点である）
をレポーター遺伝子コード領域の上流にクローニングするとよい。また、調節領
域の5'末端および/または3'末端切断型を含有する２種以上のさらなるレポータ
ー遺伝子構築物を用いて、骨指向性特異的発現を担っている領域の同定に役立て
ることができる。レポーター遺伝子の種類は、用途に基づいて選択される。 5.2.2 Characterization of Transcriptionally Active Regulatory Fragments Fusion constructs containing OSN regulatory regions or fragments thereof can be assayed for transcriptional activity. As a first step in the promoter analysis, the transcription start point (+1 position) of the bone-directed specific gene to be studied was determined by standard methods (Sambrook et al., 1989).
, "Molecular Cloning: A Laboratory"
Manual), Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Press) and must be determined using a primer extension assay and / or an RNase protection assay. The DNA sequence upstream of the +1 position is generally considered to be the promoter region responsible for gene regulation. However, downstream sequences, including sequences within introns, may also be involved in gene regulation. When starting the test for promoter activity, the region from -3kb to + 3kb (in this case, +1 is the transcription start point)
May be cloned upstream of the reporter gene coding region. Also, two or more additional reporter gene constructs containing 5'and / or 3'truncated versions of the regulatory region can be used to help identify the regions responsible for osteotropic specific expression. The type of reporter gene is selected based on the application.

【００６６】好ましい実施形態では、GFPレポーター遺伝子構築物を用いる。グリーン蛍光
タンパク質(GFP)をレポーターとして適用することは、骨指向性特異的遺伝子プ
ロモーターの研究に極めて有用である。レポーターとしてGFPを用いることの主
な利点は、石灰化の可能性のある新たに単離された腫瘍細胞および組織細胞にお
いて、基質を必要とすることなくGFPを検出できるということにある。In a preferred embodiment, a GFP reporter gene construct is used. Applying green fluorescent protein (GFP) as a reporter is extremely useful for the study of bone-directed specific gene promoters. The main advantage of using GFP as a reporter is that GFP can be detected in newly isolated tumor cells and tissue cells with potential for calcification without the need for a substrate.

【００６７】本発明の他の実施形態では、LacZレポーター構築物を用いる。LacZ遺伝子産物
であるβ-ガラクトシダーゼは、極めて安定であり、広範な特異性を有している
ため、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-β-D-ガラクトシド(X-gal)、ラクトー
ス2,3,5,-トリフェニル-2H-テトラゾリウム(ラクトース-テトラゾリウム)および
フルオロセインガラクトピラノシドなど(これらに限定はされない)の種々の組織
化学的、発色または蛍光基質の使用を可能とする(Nolanら、1988、前掲を参照の
こと)。In another embodiment of the invention, a LacZ reporter construct is used. The LacZ gene product β-galactosidase is extremely stable and has a wide range of specificities, so 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside (X-gal), lactose Allows the use of various histochemical, chromogenic or fluorescent substrates such as (but not limited to) 2,3,5, -triphenyl-2H-tetrazolium (lactose-tetrazolium) and fluoresceingalactopyranoside (See Nolan et al., 1988, supra).

【００６８】トランスジェニックマウスにおけるプロモーター解析には、哺乳動物細胞内で
の発現用に予め最適化されているGFPが好ましい。プロモーター不含クローニン
グベクターpEGFP1(Clontech, Palo Alto, CA)は、蛍光がより明るくなるように
、また哺乳動物細胞中の発現が増大するように最適化されている野生型GFPの赤
色シフト型変異体をコードする(Cormackら、1996、Gene 173: 33; Haasら、1996
、Curr. Biol. 6: 315)。さらに、この増強型GFP(EGFP)の最大励起ピークは488n
mにあるため、450〜500nmで放射するフルオロセインイソチオシアネート(FITC)
用の光学フィルター等の汎用のフィルターのセットを用いてGFPの蛍光を可視化
することができる。pEGFP1は、トランスジェニックマウスでのプロモーター解析
用のレポーターベクターとして有用であることが判明している(Okabeら、1997、
FEBS Lett. 407:313)。他の実施形態では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の
上流にOSN調節領域を有するトランスジーンを含有するトランスジェニックマウ
スを用いる。For promoter analysis in transgenic mice, GFP pre-optimized for expression in mammalian cells is preferred. The promoterless cloning vector pEGFP1 (Clontech, Palo Alto, CA) is a red-shifted mutant of wild-type GFP that has been optimized for brighter fluorescence and increased expression in mammalian cells. (Cormack et al., 1996, Gene 173: 33; Haas et al., 1996.
, Curr. Biol. 6: 315). Furthermore, the maximum excitation peak of this enhanced GFP (EGFP) is 488n.
Fluorescein isothiocyanate (FITC) that emits at 450-500 nm because it is in m
The fluorescence of GFP can be visualized by using a set of general-purpose filters such as an optical filter for GFP. pEGFP1 has been found to be useful as a reporter vector for promoter analysis in transgenic mice (Okabe et al., 1997,
FEBS Lett. 407: 313). In another embodiment, transgenic mice containing a transgene with an OSN regulatory region upstream of the luciferase reporter gene are used.

【００６９】推定上のプロモーター断片（通常、プロモーター領域を含む8〜10kbのゲノムD
NAを含んだ親ファージクローンに由来するもの）は、当技術分野で公知の方法を
用いてクローニングするために調製することができる。一実施形態においては、
例えばプロモーター断片を、ルシフェラーゼレポーターベクターのマルチクロー
ニングサイト中にクローニングする。一実施形態においては、制限エンドヌクレ
アーゼを用いてレポーターベクター中に挿入すべき調節領域断片を切り出す。し
かしながら、この方法の実施可能性は、調節断片中の適切な制限エンドヌクレア
ーゼ部位が利用可能かどうかに依存する。好適な実施形態においては、必要とさ
れるプロモーター断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR；Saikiら, 1988, Scienc
e 239:487）により、制限エンドヌクレアーゼ切断に適した部位を有するオリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。制限切断に必要な配列は、増幅すべ
き調節断片が隣接する前方向および逆方向プライマーの5'末端に含まれる。PCR
増幅後、PCR産物の制限消化により適切な末端を生成する。いずれかの方法によ
り生成されたプロモーター断片を、次に、標準的なクローニング手法（Sambrook
ら, 1989, 上掲）に従ってレポーターベクターのマルチクローニングサイト中に
連結する。この構築物中のPCRにより生成したプロモーター断片のDNA配列は、ト
ランスジェニック動物を作製する前に確認する方がよい。得られたレポーター遺
伝子構築物は、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム、例えばGFP
またはルシフェラーゼcDNAの上流に位置するように推定上のプロモーター断片を
含むことになる。Putative promoter fragment (generally 8-10 kb of genome D containing the promoter region)
Derived from parental phage clones containing NA) can be prepared for cloning using methods known in the art. In one embodiment,
For example, the promoter fragment is cloned into the multiple cloning site of the luciferase reporter vector. In one embodiment, restriction endonucleases are used to excise the regulatory region fragment to be inserted into the reporter vector. However, the feasibility of this method depends on the availability of appropriate restriction endonuclease sites in the regulatory fragment. In a preferred embodiment, the required promoter fragment is polymerase chain reaction (PCR; Saiki et al., 1988, Scienc
e 239: 487) with an oligonucleotide primer having a site suitable for restriction endonuclease cleavage. The sequences required for restriction cleavage are included at the 5'end of the forward and reverse primers flanked by the regulatory fragments to be amplified. PCR
After amplification, appropriate ends are generated by restriction digestion of the PCR product. The promoter fragment generated by either method was then cloned using standard cloning techniques (Sambrook
Et al., 1989, supra) and ligated into the multiple cloning site of the reporter vector. The DNA sequence of the PCR-generated promoter fragment in this construct should be confirmed before producing transgenic animals. The resulting reporter gene construct has an open reading frame for the reporter gene, such as GFP.
Alternatively, it will contain a putative promoter fragment located upstream of the luciferase cDNA.

【００７０】好適な実施形態においては、以下のプロトコールが用いられる。50〜100 pgの
レポーター遺伝子構築物を、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、
トランスジーン断片を切り出す。その制限エンドヌクレアーゼ切断産物を、0.5
μg/mlのエチジウムブロマイドおよびTAEバッファー（1×TAE：0.04M Tris-酢酸
, 0.001M EDTA, pH 8.0）を含有する１％(w/v)アガロースゲル中で5〜6 V/cmに
て分離する。UVトランスイルミネーターを用い、好ましくはDNAにニックが入る
のを低減するために長波長のUVランプを使用して、トランスジーンバンドを大き
さにより特定し、必要とされるバンドを含むゲル片を注意深く切り出す。そのゲ
ル薄片と１mlの0.5×TAEバッファーとを、１mM EDTA, pH 8.0中で10分間煮沸し
た透析バッグに入れ（Sambrookら, 1989, 上掲）、その端を閉じる。ゲル片を含
有するその透析バッグを0.5×TAEバッファーを含む水平型ゲル電気泳動チャンバ
ー中に沈め、5〜6 V/cmにて45分間電気泳動する。泳動を停止する前に、電気泳
動チャンバーにおける電流を１分間逆方向にして、透析チューブの壁に付着した
DNAを解離させる。透析バッグから電気溶出したDNAを含むTAEバッファーを新し
いエッペンドルフチューブ中に集める。上記ゲル片をUVトランスイルミネーター
上で観察して、該DNAが完全に電気溶出したことを確認することができる。In a preferred embodiment, the following protocol is used. Digest 50-100 pg of reporter gene construct with appropriate restriction endonucleases
Cut out transgene fragments. The restriction endonuclease cleavage product was
μg / ml ethidium bromide and TAE buffer (1 x TAE: 0.04M Tris-acetate
, 1% (w / v) agarose gel containing 0.001M EDTA, pH 8.0) at 5-6 V / cm. Using a UV transilluminator, preferably a long wavelength UV lamp to reduce nicking of the DNA, size the transgene band to determine the gel fragment containing the required band. Cut out carefully. The gel slice and 1 ml of 0.5 × TAE buffer are placed in a dialysis bag boiled for 10 minutes in 1 mM EDTA, pH 8.0 (Sambrook et al., 1989, supra) and the ends are closed. The dialysis bag containing the gel pieces is submerged in a horizontal gel electrophoresis chamber containing 0.5 × TAE buffer and electrophoresed at 5-6 V / cm for 45 minutes. Before stopping the run, the current in the electrophoresis chamber was reversed for 1 minute to attach to the wall of the dialysis tube.
Dissociate DNA. Collect TAE buffer containing DNA electroeluted from the dialysis bag into a new Eppendorf tube. The gel piece can be observed on a UV transilluminator to confirm that the DNA is completely electroeluted.

【００７１】電気溶出したDNAサンプルを、Elutip D カラムを通してさらに精製する。該カ
ラムのマトリックスを高塩濃度バッファー（1.0M NaCl, 20mM Tris.Cl, 1.0mM E
DTA, pH 7.5）1〜2 mlで予備洗浄し、続いて低塩濃度バッファー（0.2M NaCl, 2
0mM Tris.Cl, 1.0mM EDTA, pH 7.5）5 mlで洗浄する。逆流を避けるために、5 m
lシリンジを用いて溶液をElutip D カラムにアプライする。電気溶出したDNAを
含む溶液は、ゆっくりとローディングする。該カラムを低塩濃度バッファー2〜3
mlで洗浄し、DNAを高塩濃度バッファー0.4 mlで溶出させる。二倍量の95％冷エ
タノールを添加して、DNAを沈殿させる。DNAを微量遠心分離機にて14,000gで10
分間遠心分離することにより回収し、DNAペレットを壊さないように注意深くア
ルコールを取り除く。該ペレットを、70％(v/v)エタノールで２回以上洗浄し、
乾燥させる。残留した塩およびエタノールは発生中の胚にとって致命的であるこ
とから、この洗浄および乾燥工程は重要である。DNAをインジェクション用バッ
ファー（10mM TM, 0.1mM EDTA, pH 7.5をMilli-Q品質の水で調製したもの）中に
再懸濁する。精製したトランスジーンDNA断片の濃度は、分光光度計を用いてA₂₆ ₀ （50μg/mlのDNAに対してはA₂₆₀＝1）にて光学密度を測定することにより決定
する。この手法により調製されたDNAは、マウス受精卵中へのマイクロインジェ
クションに適している。The electroeluted DNA sample is further purified through an Elutip D column. The matrix of the column was loaded with a high salt buffer (1.0 M NaCl, 20 mM Tris.Cl, 1.0 mM E
Pre-wash with 1-2 ml DTA, pH 7.5) followed by low salt buffer (0.2 M NaCl, 2
Wash with 5 ml of 0 mM Tris.Cl, 1.0 mM EDTA, pH 7.5). 5 m to avoid backflow
l Apply the solution to the Elutip D column using a syringe. The solution containing electroeluted DNA is slowly loaded. Load the column with low salt buffer 2-3
Wash with ml and elute the DNA with 0.4 ml of high salt buffer. Precipitate the DNA by adding 2 volumes of cold 95% ethanol. DNA in a microcentrifuge at 14,000 g for 10
Harvest by centrifuging for minutes and carefully remove alcohol to avoid breaking the DNA pellet. Washing the pellet with 70% (v / v) ethanol more than once,
dry. This washing and drying step is important as residual salts and ethanol are lethal to the developing embryo. The DNA is resuspended in injection buffer (10 mM ™, 0.1 mM EDTA, pH 7.5 prepared with Milli-Q quality water). The concentration of the purified transgene DNA fragment (for the 50 [mu] g / ml of _{_{DNA A 260 = 1) A 26}} 0 using a spectrophotometer to determine by measuring the optical density at. The DNA prepared by this method is suitable for microinjection into mouse fertilized eggs.

【００７２】5.2.3 トランスジェニックマウスを用いた骨指向性特異的プロモーター解析哺乳動物OSN調節領域は、特に石灰化を起こし得る腫瘍および組織細胞中で、
とりわけトランスジェニック動物において同種遺伝子または異種遺伝子であるレ
ポーターコード配列の発現を誘導するために、用いることができる。限定するも
のではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、
ヒツジ、および非ヒト霊長類（例えばヒヒ、モンキー、およびチンパンジー）を
含む任意の動物種を用いて、トランスジェニック動物を作製することができる。
本明細書中で用いられる用語「トランスジェニック」とは、異種由来のOSN遺伝
子配列を発現する非ヒト動物（例えばヒトOSN配列を発現するマウス）だけでな
く、内在性（すなわち同種）OSN配列を過剰発現するように遺伝子操作された動
物または遺伝子操作して特定配列をノックアウトした動物を言う。 5.2.3 Bone Orientation-Specific Promoter Analysis Using Transgenic Mice The mammalian OSN regulatory region is specifically found in tumor and tissue cells that can undergo calcification,
It can be used, inter alia, to induce the expression of a reporter coding sequence which is a homologous gene or a heterologous gene in transgenic animals. Without limitation, mouse, rat, rabbit, guinea pig, pig, minipig, goat,
Any animal species can be used to produce transgenic animals, including sheep and non-human primates (eg, baboons, monkeys, and chimpanzees).
As used herein, the term "transgenic" refers to non-human animals expressing OSN gene sequences of heterologous origin (eg, mice expressing human OSN sequences) as well as endogenous (ie, cognate) OSN sequences. It refers to an animal that has been genetically engineered to overexpress or that has been genetically engineered to knock out a particular sequence.

【００７３】一実施形態においては、本発明は、レポーター遺伝子（OSN調節領域の制御下
にある治療用および／もしくは毒性のコード配列）またはその転写活性を有する
断片等のトランスジーンをその全ての細胞中に保持するトランスジェニック動物
、ならびにその全ての細胞ではなく一部の細胞にトランスジーンを保持する動物
（すなわちモザイク動物）を提供する。該トランスジーンは、単体トランスジー
ンとして、または例えば頭部-頭部直列体もしくは頭部-尾部直列体等のコンカテ
マーの状態で、組み込んでもよい。該トランスジーンはまた、例えばLaskoら（1
992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236）の教示に従って、特定の細胞
型に選択的に導入し活性化することができる。トランスジーンを対応する内在性
遺伝子の染色体部位に組み込むことが求められる場合には、遺伝子ターゲティン
グが好適である。簡潔に説明すると、そのような技術を用いようとする場合、内
在性遺伝子に相同な、ある程度のヌクレオチド配列を含むベクターを、該ヌクレ
オチド配列を染色体上の配列との相同組換えにより内在性遺伝子のヌクレオチド
配列中に組み込んでその機能を破壊するという目的に適うように、設計する。In one embodiment, the invention provides a transgene, such as a reporter gene (a therapeutic and / or toxic coding sequence under the control of the OSN regulatory region) or a transcriptionally active fragment thereof, in all cells thereof. Provided are transgenic animals harbored therein, as well as animals harboring the transgene in some but not all cells thereof (ie, mosaic animals). The transgene may be incorporated as a simple transgene or in the form of a concatemer, eg head-head tandem or head-tail tandem. The transgene is also described, for example, in Lasko et al. (1
992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236) and can be selectively introduced and activated in specific cell types. Gene targeting is preferred when it is desired to integrate the transgene into the chromosomal site of the corresponding endogenous gene. Briefly, in order to use such a technique, a vector containing a certain nucleotide sequence homologous to the endogenous gene is prepared by homologous recombination of the nucleotide sequence with a sequence on the chromosome. Designed to serve the purpose of incorporating into the nucleotide sequence and disrupting its function.

【００７４】当技術分野で公知の任意の技術を用いて、OSN調節領域の制御下となるようト
ランスジーンを動物に導入し、トランスジェニック動物の創始系列を作製するこ
とができる。そのような技術としては、限定するものではないが、前核へのマイ
クロインジェクション（HoppeおよびWagner, 1989, 米国特許第4,873,191号）、
静止期に誘導された胚、胎児、または成体の培養細胞に由来する核の、核除去卵
母細胞への核移入（Campbellら, 1996, Nature 380:64-66、Wilmutら, Nature 3
85:810-813）、生殖系列へのレトロウイルス遺伝子導入（Van der Puttenら, 19
85, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152）、胚性幹細胞における遺伝子
ターゲティング（Thompsonら, 1989, Cell 65:313-321）、胚へのエレクトロポ
レーション（Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 31:1803-1814）、および***媒介遺
伝子導入（Lavitranoら, 1989, Cell 57:717-723；Gordon, 1989, Transgenic A
nimals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229を参照）が挙げられる。Any technique known in the art can be used to introduce a transgene into an animal under the control of the OSN regulatory region to produce a founder line of transgenic animals. Such techniques include, but are not limited to, microinjection into the pronucleus (Hoppe and Wagner, 1989, US Pat. No. 4,873,191),
Nuclear transfer of nuclei from stationary phase-induced embryonic, fetal, or adult cultured cells into denuclearized oocytes (Campbell et al., 1996, Nature 380: 64-66; Wilmut et al., Nature 3
85: 810-813), retroviral gene transfer into the germ line (Van der Putten et al., 19
85, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148-6152), gene targeting in embryonic stem cells (Thompson et al., 1989, Cell 65: 313-321), electroporation into embryos (Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 31: 1803-1814), and sperm-mediated gene transfer (Lavitrano et al., 1989, Cell 57: 717-723; Gordon, 1989, Transgenic A.
nimals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229).

【００７５】例えば、受精卵のマイクロインジェクション用には、調節領域、レポーター遺
伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む直鎖状DNA断片（トランスジーン）
を、レポーター遺伝子構築物から切り出す。このトランスジーンを当技術分野で
公知の方法により、例えば電気溶出法により、ゲル精製することができる。ゲル
断片の電気溶出に続いて、Elutip D カラムを通すことにより微量な夾雑物をさ
らに除去する（SchleicherおよびSchuell, Dassel, Germany）。For example, for microinjection of fertilized eggs, a linear DNA fragment (transgene) containing a regulatory region, a reporter gene, and a polyadenylation signal
Is excised from the reporter gene construct. The transgene can be gel purified by methods known in the art, for example by electroelution. Following electroelution of the gel fragment, further trace contaminants are removed by passage through an Elutip D column (Schleicher and Schuell, Dassel, Germany).

【００７６】好適な実施形態においては、精製したトランスジーン断片を、B6 CBA雌から得
られた受精卵の雄性前核中へと標準法（Hogan, 1986,「マウス胚の操作(Manipul
ating the Mouse Embryo), 実験室マニュアル(A Laboratory Manual.)」Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）によってマイクロイ
ンジェクションする。マウスは、いくつかの胚段階で一時的に、または創始系列
を確立することにより発生経過中および成体動物におけるトランスジーンの発現
をより詳細に解析できるようにして、解析する。トランスジーンの存在は、胎盤
（一時的の場合）または切り取り尾（創始系列の場合）から精製したゲノムDNA
を用いるPCRにより、Vemetら, Methods Enzymol. 1993;225:434-451の方法に従
って分析する。好ましくはこのPCR反応は、0.2mM dNTPs、2mM MgCl₂、600μMの
各プライマー、および2.5単位のTaqポリメラーゼ（Promega, Madison, WI）を添
加した1×反応バッファー中にゲノムDNAを１μg含む、100μl容量にて行う。PCR
の30サイクルの各々は、94℃で１分の変性、54℃で１分のアニーリング、および
72℃で１分の伸長からなる。次いで創始マウスをC57B1パートナーと交配し、ト
ランスジェニックマウスF₁系列を作製する。In a preferred embodiment, the purified transgene fragment is introduced into the male pronucleus of fertilized eggs obtained from B6 CBA females by standard methods (Hogan, 1986, "Manipul Manipul Manipul.
ating the Mouse Embryo), A Laboratory Manual.
Ring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Mice are analyzed transiently at some embryonic stages, or by establishing a founder lineage, allowing the transgene expression during development and in adult animals to be analyzed in more detail. Presence of the transgene is the genomic DNA purified from placenta (if transient) or excised tail (if founder)
By PCR according to the method of Vemet et al., Methods Enzymol. 1993; 225: 434-451. Preferably, this PCR reaction comprises 1 μg of genomic DNA in 1 × reaction buffer supplemented with 0.2 mM dNTPs, 2 mM MgCl ₂ , 600 μM of each primer, and 2.5 units of Taq polymerase (Promega, Madison, WI), 100 μl volume. Will be done at. PCR
Each of the 30 cycles of denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 54 ° C for 1 minute, and
It consists of a 1 minute extension at 72 ° C. The founder mouse is then mated with a C57B1 partner to generate the transgenic mouse F ₁ line.

【００７７】5.3 スクリーニングアッセイ石灰化を起こし得る腫瘍および組織細胞の異常な機能および／または増殖を妨
げる化合物は、骨指向性に関連した疾患、例えば限定するものではないが、限局
性もしくは播種性の骨肉種、肺癌、大腸癌、黒色腫、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性
骨髄腫、乳癌、および前立腺癌、ならびに良性前立腺肥大(BPH)または動脈硬化
症状等の良性の病態において石灰化が生ずる異常部分を標的化した治療を提供し
得る。そのような化合物は、骨指向性に関連した疾患の発症または進行を妨げる
ために用いることができる。プロモーター活性を刺激または抑制する化合物もま
た、骨指向性に関連した疾患の症状を軽減するために用いることができる。 5.3 Screening Assays Compounds that interfere with aberrant functioning and / or proliferation of tumor and tissue cells that are capable of calcification are associated with diseases associated with osteotropism, such as, but not limited to, localized or disseminated. Abnormal areas where calcification occurs in osteosarcoma, lung cancer, colon cancer, melanoma, thyroid cancer, brain tumor, multiple myeloma, breast cancer, and prostate cancer, and benign conditions such as benign prostatic hyperplasia (BPH) or arteriosclerosis Targeting therapies may be provided. Such compounds can be used to prevent the onset or progression of diseases associated with osteotropism. Compounds that stimulate or suppress promoter activity can also be used to reduce symptoms of diseases associated with osteotropism.

【００７８】 OSN調節領域もしくはその断片を機能し得る形でレポーター遺伝子に連結して
含む、遺伝子操作した細胞、細胞株、および／またはトランスジェニック動物は
、OSN調節領域活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングするための系とし
て使用することができる。そのようなトランスジェニックマウスは、骨指向性に
関連した疾患の進行を抑制する治療薬および／または毒性薬剤を目標として定め
ることにより該疾患を治療する新しい方法を開発する上で用いられ得る、in viv
o（またはin vitroで使用する一次細胞もしくは細胞株の供給源として使用可能
である）実験モデルを提供する。Genetically engineered cells, cell lines, and / or transgenic animals containing an OSN regulatory region or fragment thereof operably linked to a reporter gene are screened for agents that modulate OSN regulatory region activity. Can be used as a system for Such transgenic mice can be used in developing new methods of treating diseases by targeting therapeutic and / or toxic agents that suppress the progression of diseases associated with osteotropism. viv
o Provide an experimental model (or can be used as a source of primary cells or cell lines for in vitro use).

【００７９】本発明は、OSN調節領域の活性をモジュレートする化合物を同定するために計
画されるスクリーニングアッセイを包含する。本発明は、in vitroアッセイおよ
び細胞に基づくアッセイだけでなくトランスジェニック動物におけるin vivoア
ッセイも包含する。本明細書中に後述するとおり、被験化合物としては、限定す
るものではないが、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、小有機化合物
もしくは小無機化合物、抗体等が挙げられる。The present invention includes screening assays designed to identify compounds that modulate the activity of the OSN regulatory region. The invention encompasses in vitro assays in cell-based as well as in vitro assays in transgenic animals. As described later in this specification, test compounds include, but are not limited to, oligonucleotides, peptides, proteins, small organic compounds or small inorganic compounds, antibodies and the like.

【００８０】化合物の例としては、限定するものではないが、例えば可溶性ペプチド等のペ
プチド（限定するものではないが、Igテール型融合ペプチドおよびランダムペプ
チドライブラリーのメンバーが挙げられる。例えばLamら, 1991, Nature 354:82
-84、Houghtenら, 1991, Nature 354:84-86を参照のこと）、ならびにコンビナ
トリアルケミストリーによって得られる分子ライブラリーであって、D-および／
もしくはL-配位アミノ酸、ホスホペプチド（限定するものではないが、ランダム
もしくは部分的に縮重した指向性ホスホペプチドライブラリーのメンバーが挙げ
られる。例えばSongyangら, 1993, Cell 72:767-778）、抗体（限定するもので
はないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメ
ラ、もしくは一本鎖の抗体、およびFAb、F(ab')₂、およびFAb発現ライブラリー
断片、ならびにそれらのエピトープ結合性断片が挙げられる）、および有機小分
子もしくは無機小分子が挙げられる。Examples of compounds include, but are not limited to, peptides such as, but not limited to, soluble peptides (including but not limited to Ig tail fusion peptides and members of random peptide libraries. See, eg, Lam et al. 1991, Nature 354: 82
-84, Houghten et al., 1991, Nature 354: 84-86), and a molecular library obtained by combinatorial chemistry comprising D- and / or
Alternatively, L-coordinating amino acids, phosphopeptides (including but not limited to members of a directed or partially degenerate phosphopeptide library, eg Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778). , Antibodies (including, but not limited to, polyclonal, monoclonal, humanized, anti-idiotype, chimeric or single chain antibodies, and FAb, F (ab ') ₂ and FAb expression library fragments, and their fragments. Epitope-binding fragments), and small organic or inorganic molecules.

【００８１】前記化合物はさらに、化合物、特に薬剤または薬剤の部類もしくは群のメンバ
ーであって骨指向性に関連した疾患の症状を軽減することが知られているものを
含み得る。The compound may further comprise a compound, in particular a drug or a member of a class or group of drugs known to reduce the symptoms of diseases associated with osteotropism.

【００８２】そのような化合物としては、限定するものではないが、抗鬱剤（例えばリチウ
ム塩、カルバマゼピン、バルプロ酸、リゼルグ酸ジエチルアミド(LSD)、p-クロ
ロフェニルアラニン、p-プロピルドプアセトアミドジチオカルバメート誘導体（
例えばFLA 63））；抗不安剤（例えばジアゼパム）；モノアミンオキシダーゼ(M
AO)阻害剤（例えばイプロニアジド、クロルジリン、フェネルジン、およびイソ
カルボキサジド）；生体アミン取り込み遮断剤（例えば、デシプラミン、イミプ
ラミン、アミトリプチリン等の三環系抗鬱剤）；セロトニン再取り込み阻害剤（
例えばフルオキセチン）；抗精神病薬として例えばフェノチアジン誘導体（例え
ばクロルプロマジン（ソラジン）およびトリフルオプロマジン）、ブチロフェノ
ン（例えばハロペリドール(Haldol)）、チオキサンテン誘導体（例えばクロルプ
ロチキセン）、およびジベンゾジアゼピン（例えばクロザピン）；ベンゾジアゼ
ピン；ドーパミン作用性アゴニストおよびアンタゴニスト（例えばL-DOPA、コカ
イン、アンフェタミン、α-メチル-チロシン、レセルピン、テトラベナジン、ベ
ンゾトロピン、パルジリン）；ノルアドレナリン作用性アゴニストおよびアンタ
ゴニスト（例えばクロニジン、フェノキシベンザミン、フェントラミン、トロポ
ロン）；ニトロ血管拡張剤（例えばニトログリセリン、ニトロプルシド、および
NO合成酵素）；ならびに増殖因子（例えばVEGF、FGF、アンギオポエチン、およ
びエンドスタチン）の群が挙げられる。Such compounds include, but are not limited to, antidepressants (eg, lithium salts, carbamazepine, valproic acid, lysergic acid diethylamide (LSD), p-chlorophenylalanine, p-propyldopacetamide dithiocarbamate derivatives). (
FLA 63)); anxiolytics (eg diazepam); monoamine oxidase (M
AO) inhibitors (eg iproniazide, clorgyline, phenelzine, and isocarboxazid); biogenic amine uptake blockers (eg tricyclic antidepressants such as desipramine, imipramine, amitriptyline); serotonin reuptake inhibitors (
For example, fluoxetine); antipsychotics such as phenothiazine derivatives (eg chlorpromazine (solazine) and trifluopromazine), butyrophenone (eg haloperidol (Haldol)), thioxanthene derivatives (eg chlorprothixene), and dibenzodiazepines (eg clozapine). Benzodiazepines; dopaminergic agonists and antagonists (eg L-DOPA, ***e, amphetamine, α-methyl-tyrosine, reserpine, tetrabenazine, benzotropine, pargyline); noradrenergic agonists and antagonists (eg clonidine, phenoxybenzamine, phentolamine) , Tropolone); nitrovasodilators (eg nitroglycerin, nitroprusside, and
NO synthase); and the group of growth factors such as VEGF, FGF, angiopoietin, and endostatin.

【００８３】ある好適な実施形態においては、哺乳動物のOSN調節領域を機能し得る形で異
種遺伝子に連結して含む、遺伝子操作した細胞、細胞株、または、生殖細胞およ
び／もしくは体細胞の一次培養物を用いて、配列特異的DNA-タンパク質相互作用
を抑制できる化合物をスクリーニングするためのアッセイ系を開発することがで
きる。このような方法は、OSN調節領域またはその転写活性を有する断片の制御
下にある遺伝子を発現する細胞に化合物を接触させ、該遺伝子の発現レベルまた
は遺伝子産物の活性レベルを測定し、さらに、そのレベルを該化合物の不在下で
該細胞により示される遺伝子発現もしくは遺伝子産物活性レベルと比較すること
を含み、それによって、該化合物の存在下で得られるレベルと不在下で得られる
レベルとに差がある場合には、哺乳動物のOSN調節領域の発現をモジュレートす
ることができる化合物が同定されたこととなる。遺伝子発現レベルの変化は、当
業者には公知の数多くの任意の方法により、例えばレポーター遺伝子活性に対す
るアッセイ、mRNA転写物に対する細胞溶解物のアッセイ（例えば、ノーザン解析
）によるか、または細胞により発現された遺伝子産物をアッセイするための当技
術分野で公知の他の方法を用いることにより、測定され得る。In certain preferred embodiments, a genetically engineered cell, cell line, or primary germ cell and / or somatic cell comprising a mammalian OSN regulatory region operably linked to a heterologous gene. The culture can be used to develop an assay system for screening compounds that can suppress sequence-specific DNA-protein interactions. Such a method involves contacting a compound with a cell expressing a gene under the control of an OSN regulatory region or a fragment having a transcription activity thereof, measuring the expression level of the gene or the activity level of the gene product, and further Comparing the level to the level of gene expression or gene product activity exhibited by the cell in the absence of the compound, whereby the difference between the level obtained in the presence of the compound and the level obtained in the absence thereof is In some cases, compounds have been identified that are capable of modulating the expression of mammalian OSN regulatory regions. Changes in gene expression levels can be expressed by any of a number of methods known to those of skill in the art, such as by assaying for reporter gene activity, assaying cell lysates for mRNA transcripts (eg, Northern analysis), or by cells. Can be measured by using other methods known in the art for assaying gene products.

【００８４】別の実施形態において、マイクロダイセクション(microdissection)およびト
ランスイルミネーション(transillumination)を使用してもよい。これらの技法
は、OSN調節領域駆動レポーター遺伝子を含むトランスジェニック動物における
骨指向性細胞に対する推定薬物の影響をモニタリングするための迅速なアッセイ
を提供する。本実施形態において、試験薬は任意の様々な方法によりトランスジ
ェニック動物に送達される。試験薬の導入方法には、経口、皮内、筋肉内、腹腔
内、静脈内、皮下、鼻腔内および乱刺法(scarification)（例えば分枝針を用い
て、皮膚上層を引っ掻くこと）、または任意の他の標準的な薬物送達経路が含ま
れる。このような試験化合物の骨指向性細胞に対する影響を、骨芽細胞のマイク
ロダイセクション(microdissection)およびトランスイルミネーション(transill
umination)により分析してもよい。上記化合物の存在下で観察または測定される
レポーター遺伝子発現レベルが、不存在下で得られるレベルと異なれば、哺乳動
物OSN調節領域の発現をモジュレートしうる化合物と同定した。In another embodiment, microdissection and transillumination may be used. These techniques provide a rapid assay for monitoring the effect of putative drugs on osteotrophic cells in transgenic animals containing OSN regulatory region-driven reporter genes. In this embodiment, the test drug is delivered to the transgenic animal by any of a variety of methods. The test drug can be introduced by oral, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal and scarification (for example, using a branch needle to scratch the upper skin layer), or Any other standard drug delivery route is included. The effect of such test compounds on osteotrophic cells has been reported in microdissection and transillumination of osteoblasts.
umination). Compounds that were capable of modulating the expression of mammalian OSN regulatory regions were identified if the level of reporter gene expression observed or measured in the presence of the above compounds differed from the level obtained in the absence.

【００８５】本発明のさまざまな実施形態において、骨指向性に関連した疾患のモジュレー
ターのスクリーニングに使用しうる化合物には、ペプチド、小分子（両者、天然
のおよび／または合成の（例えば、小分子またはペプチドのライブラリー））、
細胞結合性または可溶性分子、有機非タンパク質分子、および組換え分子であっ
て、OSN調節領域結合能力を有することにより、医薬品のための候補となりうる
ものが含まれる。In various embodiments of the invention, compounds that can be used to screen for modulators of diseases associated with bone tropism include peptides, small molecules (both natural and / or synthetic (eg, small molecules). Or a peptide library)),
Included are cell-binding or soluble molecules, organic non-protein molecules, and recombinant molecules that have the ability to bind the OSN regulatory region, thus making them candidates for pharmaceuticals.

【００８６】あるいは、上記タンパク質および化合物には、in vivoにおいてOSN調節領域配
列と相互作用する内因性の細胞成分が含まれる。細胞溶解物または組織ホモジネ
ートを、OSN調節領域またはそれらの断片と結合するタンパク質または他の成分
についてスクリーニングしてもよい。このような内因性の成分は、医薬的におよ
び治療的に関与する新しいターゲットを提供しうる。Alternatively, the proteins and compounds include endogenous cellular components that interact with OSN regulatory region sequences in vivo. Cell lysates or tissue homogenates may be screened for proteins or other components that bind to the OSN regulatory region or fragments thereof. Such endogenous components may provide new targets of pharmaceutical and therapeutic interest.

【００８７】ある実施形態においては、ライブラリーをスクリーニングしてもよい。使用し
うる多数のライブラリーが当該技術分野で知られており、例えば、ペプチドライ
ブラリー、化学的合成ライブラリー、組換えライブラリー（例えば、ファージデ
ィスプレイライブラリー）、およびin vitro翻訳系ライブラリーがある。本発明
のある実施形態においては、ペプチドライブラリーを用いてOSN関連レポーター
発現のアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングしてもよい。多様性ラ
イブラリー（例えば、ランダムペプチドライブラリー、またはコンビナトリアル
ペプチドライブラリー、または非ペプチドライブラリー）をOSN調節領域活性を
特異的にモジュレートする分子についてスクリーニングしてもよい。固相支持体
に結合されたアミノ酸の全ての可能な組み合わせからなるランダムペプチドライ
ブラリーを用いて、OSN調節領域活性を活性化または阻害しうるペプチドを同定
してもよい(Lam, K.S.ら, 1991, Nature 354: 82-84)。ペプチドライブラリーの
スクリーニングは、OSN調節領域の発現を刺激または阻害する医薬品を発見する
という点で、治療的価値を有しうる。In some embodiments, the library may be screened. Numerous libraries that can be used are known in the art, including peptide libraries, chemically synthesized libraries, recombinant libraries (eg, phage display libraries), and in vitro translation-based libraries. is there. In certain embodiments of the invention, peptide libraries may be used to screen for agonists or antagonists of OSN-related reporter expression. Diversity libraries (eg, random peptide libraries, or combinatorial peptide libraries, or non-peptide libraries) may be screened for molecules that specifically modulate OSN regulatory region activity. A random peptide library consisting of all possible combinations of amino acids bound to a solid support may be used to identify peptides that can activate or inhibit OSN regulatory region activity (Lam, KS et al., 1991). , Nature 354: 82-84). Screening of peptide libraries may have therapeutic value in discovering drugs that stimulate or inhibit the expression of OSN regulatory regions.

【００８８】化学的合成ライブラリーの例は以下に記載されている：Fodorら, 1991, Scien
ce 251: 767-773; Houghtenら, 1991, Nature 354: 84-86; Lamら, 1991, Natur
e 354: 82-84; Medynski, 1994, Bio Technology 12: 709-710; Gallopら, 1994
, J.Medicinal Chemistry 37(9): 1233-1251; Ohlmeyerら, 1993, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 10922-10926; Erbら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91: 11422-11426; Houghtenら, 1992, Biotechniques 13: 412; Jayawickremeら
, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1614-1618; Salomonら, 1993, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 11708-11712; PCT公開番号WO93/20242;ならびにBre
nnerおよびLerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5381-5383。Examples of chemically synthesized libraries are described below: Fodor et al., 1991, Scien.
ce 251: 767-773; Houghten et al., 1991, Nature 354: 84-86; Lam et al., 1991, Natur.
e 354: 82-84; Medynski, 1994, Bio Technology 12: 709-710; Gallop et al., 1994.
, J. Medicinal Chemistry 37 (9): 1233-1251; Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 10922-10926; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91: 11422-11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13: 412; Jayawickreme et al.
, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1614-1618; Salomon et al., 1993, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 11708-11712; PCT Publication No. WO93 / 20242; and Bre.
nner and Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5381-5383.

【００８９】ファージディスプレイライブラリーの例は以下に記載されている：Scottおよ
びSmith, 1990, Science 249: 386-390; Devlinら, 1990, Science 249: 404-40
6; Christianら, 1992, J. Mol. Biol. 227: 711-718; Lenstra, 1992, J. Immu
nol. Meth. 152: 149-157; Kayら, 1993, Gene 128: 59-65; およびPCT公開番号
WO94/18318(1994年8月18日付)。Examples of phage display libraries are described below: Scott and Smith, 1990, Science 249: 386-390; Devlin et al., 1990, Science 249: 404-40.
6; Christian et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 711-718; Lenstra, 1992, J. Immu.
nol. Meth. 152: 149-157; Kay et al., 1993, Gene 128: 59-65; and PCT Publication Number.
WO94 / 18318 (August 18, 1994).

【００９０】非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば
、Buninら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4708-4712参照）を適応し
てもよい。ペプチドライブラリー(Simonら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 9367-9371)を使用してもよい。使用しうるライブラリーの別な例として、
ペプチド中のアミド官能基が過メチル化され、化学的に転換されたコンビナトリ
アルライブラリーを形成しているものが、Ostreshら(1994, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91: 11138-11142)に記載されている。As an example of a non-peptide library, a benzodiazepine library (see eg Bunin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4708-4712) may be adapted. Peptide library (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 9367-9371). As another example of a library that can be used,
Those in which the amide functional group in the peptide is permethylated to form a chemically transformed combinatorial library are described by Ostresh et al. (1994, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91: 11138-11142).

【００９１】このようなin vitroスクリーニングアッセイの特定の実施形態を以下に記載す
る。OSN調節領域レポーターベクターを用いてトランスジェニックマウスを作製
し、これよりOSN調節領域レポーターベクターを含む生殖細胞の一次培養を確立
する。ウェルあたり約10,000個の細胞を、細胞系に適した培養液を用いて96ウェ
ルのプレートに最終容量100μlでプレートする。OSN調節領域の候補阻害物質を
細胞に添加する。OSN調節領域の阻害物質の影響は、OSN調節領域に駆動されるレ
ポーター遺伝子の応答を調べることにより測定することができる。本アッセイは
、レポーター遺伝子活性を減少（または増加）するけれども細胞毒性はない96ウ
ェルフォーマットを用いれば、化合物ライブラリーを評価するためのハイスルー
プットスクリーニングモードで容易に準備できる。6時間のインキュベーション
後、100μl DMEM培地＋2.5％ウシ胎児血清(FBS)を1.25％最終血清濃度となるよ
うに上記細胞に添加し、合計24時間（さらに18時間）インキュベートする。24時
間経った時点で、プレートをPBSで洗浄し、ブロットを乾燥し、-80℃で凍結する
。翌日、プレートを解凍し、レポーター活性の存在について分析する。Specific embodiments of such in vitro screening assays are described below. Transgenic mice are generated using the OSN regulatory region reporter vector, from which primary culture of germ cells containing the OSN regulatory region reporter vector is established. Approximately 10,000 cells per well are plated in 96 well plates in a final volume of 100 μl using culture medium appropriate for the cell line. A candidate inhibitor of the OSN regulatory region is added to the cells. The effects of inhibitors of the OSN regulatory region can be measured by examining the response of the reporter gene driven by the OSN regulatory region. The assay can be readily set up in a high-throughput screening mode to evaluate compound libraries using a 96-well format that reduces (or increases) reporter gene activity but is not cytotoxic. After 6 hours of incubation, 100 μl DMEM medium + 2.5% fetal bovine serum (FBS) is added to the cells to a final serum concentration of 1.25% and incubated for a total of 24 hours (18 more hours). At 24 hours, plates are washed with PBS, blots are dried and frozen at -80 ° C. The next day, the plates are thawed and analyzed for the presence of reporter activity.

【００９２】 In vivoスクリーニングアッセイの好ましい実施例において、トランスジェニ
ックマウス由来の腫瘍細胞または石灰化の可能性を有する組織細胞を、正常また
は他の所望の表現型を示すマウスへ移植してもよい(Brinsterら, 1994, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 91: 11298-302; Ogawaら, 1997, Int. J. Dev. Biol. 41:
111-12)。次いで、このようなマウスを用いて化合物および他の様々な因子の骨
指向性に関連した疾患に対する影響を試験してもよい。上記の化合物および薬剤
に加えて、このようなマウスを用いて、他の方法を使用して試験することが困難
な因子または条件（例えば、食餌の影響、体内pH、温度等）をアッセイしてもよ
い。In a preferred embodiment of the in vivo screening assay, tumor cells or tissue cells with the potential for calcification from transgenic mice may be transplanted into mice exhibiting a normal or other desired phenotype ( Brinster et al., 1994, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 91: 11298-302; Ogawa et al., 1997, Int. J. Dev. Biol. 41:
111-12). Such mice may then be used to test the effects of compounds and various other factors on diseases associated with osteotropism. In addition to the compounds and agents described above, such mice can be used to assay for factors or conditions that are difficult to test using other methods (eg, dietary effects, body pH, temperature, etc.). Good.

【００９３】一旦OSN調節領域活性を阻害または促進する化合物が同定したならば、次に、
化合物が骨指向性に関連した疾患の症状を緩和および／または予防する薬物とし
て作用する能力を示すかどうかを調べるため、動物に基づくアッセイで試験して
もよい。骨指向性に関連した疾患としては、限定するものではないが、局所性ま
たは播種性骨肉腫、肺癌、結腸癌、メラノーマ、甲状腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄
腫、乳癌および前立腺癌、ならびに良性前立腺過形成(BPH)または石灰化が生じ
る動脈硬化症状が挙げられる。Once a compound that inhibits or promotes OSN regulatory region activity is identified, then
The compounds may be tested in animal-based assays to see if they exhibit the ability to act as drugs to alleviate and / or prevent the symptoms of diseases associated with osteotropism. Diseases associated with bone tropism include, but are not limited to, localized or disseminated osteosarcoma, lung cancer, colon cancer, melanoma, thyroid cancer, brain tumors, multiple myeloma, breast and prostate cancer, and benign prostate. These include arteriosclerotic conditions that result in hyperplasia (BPH) or calcification.

【００９４】本発明のアッセイは初めにスモールスケールで（すなわち試験管中で）最適化
し、次いでハイスループットアッセイのためにスケールアップしてもよい。本発
明のスクリーニングアッセイは、in vitroすなわち試験管中で、精製成分または
細胞溶解物を使用して実施してもよい。また本発明のスクリーニングアッセイは
、培養中および動物モデル中のインタクトな細胞で行なってもよい。本発明によ
れば、本明細書中に記載したように、in vitroでOSN調節領域の活性をモジュレ
ートすることを示す試験化合物がin vivoで同様の効果を有するかどうかを調べ
るために、また該試験化合物の骨指向性疾患に対する効果を調べるために、培養
細胞および動物モデルにおいてin vivoでさらにアッセイすることができる。The assays of the invention may be first optimized on a small scale (ie in vitro) and then scaled up for high throughput assays. The screening assays of the invention may be carried out in vitro, ie in vitro, using purified components or cell lysates. The screening assay of the present invention may also be performed on intact cells in culture and in animal models. According to the present invention, as described herein, to determine whether a test compound showing in vitro modulation of the activity of the OSN regulatory region has a similar effect in vivo, and In order to examine the effect of the test compound on osteotrophic disease, it can be further assayed in vivo in cultured cells and animal models.

【００９５】5.4 OSN調節領域ヌクレオチドの治療用途のための組成および方法 OSN調節領域、またはそれらの転写的に活性な断片を用いて、骨指向性特有の
様式で、OSNまたはOSN調節領域と結合する非相同遺伝子のレベルまたは発現を変
化させることにより緩和されうる疾患、症状または障害を治療および／または予
防しうる。このような治療方法を本明細書中に記載する。 5.4 Compositions and Methods for Therapeutic Uses of OSN Regulatory Nucleotides The OSN regulatory regions, or transcriptionally active fragments thereof, are used to bind OSNs or OSN regulatory regions in an osteotropic specific manner. Altering the level or expression of a heterologous gene may treat and / or prevent a disease, condition or disorder that may be alleviated. Such treatment methods are described herein.

【００９６】上記OSN調節領域を用いて、遺伝子治療プロトコールにおいて組織特異的発現
を達成しうる。そのような細胞が腫瘍細胞の場合、OSN調節領域による細胞毒性
産物の誘導を、OSN発現に必要とされるトランス作用性因子を含む石灰化の可能
性を有する腫瘍細胞を特異的に標的とする癌遺伝子治療という形態で使用しても
よい。このように、OSN調節領域は、石灰化の可能性を有する腫瘍細胞が関与す
る癌への遺伝子治療アプローチのための送達経路として機能しうる。さらに、ア
ンチセンス、アンチジーン(antigene)またはアプタメリック(aptameric)オリゴ
ヌクレオチドを本明細書中に記載する発現構築物を用いて細胞へ送達しうる。リ
ボザイムまたは一本鎖RNAもまた細胞内で発現し、対象の標的遺伝子の発現を阻
害する。これらのアンチセンス分子またはリボザイム分子に対する標的遺伝子は
、細胞の維持に必須な遺伝子産物をコードする遺伝子である必要がある。The OSN regulatory regions can be used to achieve tissue-specific expression in gene therapy protocols. When such cells are tumor cells, the induction of cytotoxic products by the OSN regulatory region specifically targets tumor cells with the potential for calcification, including trans-acting factors required for OSN expression. It may be used in the form of cancer gene therapy. Thus, the OSN regulatory region may serve as a delivery route for gene therapy approaches to cancer involving tumor cells with potential for calcification. In addition, antisense, antigene or aptameric oligonucleotides can be delivered to cells using the expression constructs described herein. Ribozymes or single-stranded RNAs are also expressed intracellularly and inhibit the expression of target genes of interest. The target gene for these antisense or ribozyme molecules must be the gene encoding the gene product essential for cell maintenance.

【００９７】本発明のOSN調節領域、およびそれらの転写的に活性な断片は、多種多様な目
的のために使用しうる（例えば、OSN遺伝子発現をダウンレギュレートするため
、あるいは、非相同性コード配列の骨指向性特異的発現を獲得するため）。The OSN regulatory regions of the invention, and transcriptionally active fragments thereof, may be used for a wide variety of purposes (eg, for down-regulating OSN gene expression, or for heterologous coding To obtain osteotropic specific expression of the sequence).

【００９８】ある実施形態において、例えば、内因性OSN調節領域は、OSN遺伝子の発現を特
異的にダウンレギュレートする標的としうる。例えば、調節領域に相補的なオリ
ゴヌクレオチドを設計し、細胞へ送達してもよい。このようなオリゴヌクレオチ
ドは調節配列とアニーリングし、転写活性を妨害しうる。あるいは、調節配列、
またはそれらの一部を、転写因子の結合に対して競合する飽和濃度で細胞に送達
しうる。遺伝子治療方法の一般的レビューとしては以下を参照されたい：Goldsp
ielら, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; WuおよびWu, 1991, Biotherapy
3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mul
ligan, 1993, Science 260:926-932; ならびにMorganおよびAnderson, 1993, An
n. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11:155-215。使用しうる当
該技術分野で一般的に知られている組換えDNA技法が、Ausbelら(編), 1993, Cur
rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; およびKriege
r, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Pre
ss, NY.に記載されている。In certain embodiments, for example, the endogenous OSN regulatory region can be a target that specifically downregulates expression of the OSN gene. For example, oligonucleotides complementary to regulatory regions may be designed and delivered to cells. Such oligonucleotides can anneal to regulatory sequences and interfere with transcriptional activity. Or a regulatory sequence,
Alternatively, some of them may be delivered to cells at saturating concentrations that compete for binding of transcription factors. For a general review of gene therapy methods, see Goldsp
iel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy.
3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mul.
ligan, 1993, Science 260: 926-932; and Morgan and Anderson, 1993, An.
n. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 11: 155-215. Recombinant DNA techniques commonly known in the art that can be used are described in Ausbel et al. (Eds.), 1993, Cur.
rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; and Kriege
r, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Pre
ss, NY.

【００９９】別の実施形態において、骨指向性に関連した疾患を緩和するための遺伝子治療
方法を提供する。OSN調節領域配列を骨指向性細胞中へ導入し、薬物または毒物
の骨指向性特異的発現を駆動させるために使用する。該方法は、薬物遺伝子また
は毒物遺伝子と機能的に関連するOSN調節領域を骨指向性細胞中へ導入すること
を含む。In another embodiment, a gene therapy method for alleviating a disease associated with bone tropism is provided. The OSN regulatory region sequences are introduced into osteotropic cells and used to drive osteotropic specific expression of drugs or toxins. The method comprises introducing into the osteotrophic cell an OSN regulatory region functionally associated with the drug or toxic gene.

【０１００】さらに別の実施形態において、本発明は癌または他の増殖性疾患の治療のため
の遺伝子治療方法を提供する。OSN調節領域を用いて、患者の骨指向性腫瘍細胞
に特異的な1以上のタンパク質を発現させる。このようなタンパク質としては、
例えば、腫瘍抑制遺伝子、チミジンキナーゼ（アシクロビルと組み合わせて使用
する）、細胞死に関与する毒物またはタンパク質（例えば、アポトーシス経路に
関与するタンパク質）が挙げられる。In yet another embodiment, the invention provides a gene therapy method for the treatment of cancer or other proliferative disorders. The OSN regulatory region is used to express one or more proteins specific for a patient's osteotropic tumor cells. Such proteins include:
Examples include tumor suppressor genes, thymidine kinase (used in combination with acyclovir), toxins or proteins involved in cell death (eg proteins involved in the apoptotic pathway).

【０１０１】ある実施形態において、本発明は、毒物遺伝子治療に有用であるOSNプロモー
ターを含む治療薬を提供する。この方法には真核細胞用送達ベクターおよび毒物
遺伝子が含まれる。好ましい実施形態において、ベクターはアデノウイルス(Ad)
であり、遺伝子はチミジンキナーゼ(TK)である。したがって、治療薬は式Ad-OSN
-TKで表されるが、実際には本明細書中に含まれる新規概念は非相同性コード配
列の骨指向性特異的発現の駆動力としてのOSNプロモーターである。In certain embodiments, the invention provides therapeutic agents that include an OSN promoter that are useful in toxic gene therapy. The method includes delivery vectors for eukaryotic cells and toxic genes. In a preferred embodiment, the vector is adenovirus (Ad).
And the gene is thymidine kinase (TK). Therefore, the therapeutic drug has the formula Ad-OSN
-Represented by TK, the novel concept contained herein is actually the OSN promoter as a driving force for the bone-directed specific expression of heterologous coding sequences.

【０１０２】対象の翻訳産物または転写産物をコードするDNAは、本発明のベクターを調製
するために、ラージスケールでのDNA複製を提供する様々なベクター系に組み込
むことができる。これらのベクターは、骨指向性細胞に取り込まれるDNA配列の
転写および／または翻訳を指令するために必要な成分を含むように設計しうる。DNA encoding a translation or transcript of interest can be incorporated into a variety of vector systems that provide DNA replication on a large scale for preparing the vectors of the invention. These vectors can be designed to contain the components necessary to direct the transcription and / or translation of DNA sequences that are taken up by osteotrophic cells.

【０１０３】使用しうるベクターとしては、限定するものではないが、組換えバクテリオフ
ァージDNA、組換えプラスミドDNAまたは組換えコスミドDNAが挙げられる。例え
ば、pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119およびM13 mpシリーズのベクターが使用
できる。バクテリオファージベクターとしては、λgt10、λgt11、λ18-23、λZ
AP/RおよびEMBLシリーズのバクテリオファージベクターが挙げられる。利用しう
るコスミドベクターとしては、制限するものではないが、pJB8、pCV 103、pCV 1
07、pCV 108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16およ
びシャロミド(charomid)9シリーズのベクターが挙げられる。また、SP6ベクター
のような、RNAのin vitroにおける転写を可能にするベクターを用いて、ウイル
スベクターに組み込みうる大量のRNAを産生させることもできる。Vectors that may be used include, but are not limited to, recombinant bacteriophage DNA, recombinant plasmid DNA or recombinant cosmid DNA. For example, pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 and M13 mp series vectors can be used. Bacteriophage vectors include λgt10, λgt11, λ18-23, λZ
Examples include AP / R and EMBL series bacteriophage vectors. Available cosmid vectors include, but are not limited to, pJB8, pCV 103, pCV 1
07, pCV 108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 and charomid 9 series vectors. In addition, a vector that allows transcription of RNA in vitro, such as the SP6 vector, can also be used to produce a large amount of RNA that can be incorporated into a viral vector.

【０１０４】あるいは、組換え複製型コンピテントまたは非コンピテントウイルスベクター
としては、限定するものではないが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはウシパピローマウ
イルスなどのウイルス由来のベクター用いてもよい。組み込み型ベクターを用い
てもよいが、何世代にもわたり娘細胞に遺伝子産物を遺伝しない非組み込み系が
非疾患関連の修復および再生には好ましい。このように、該遺伝子産物が修復プ
ロセスの間に発現し、該遺伝子が子孫の世代で希薄になるにつれて、発現される
遺伝子産物の量が減少する。Alternatively, recombinant replication-competent or non-competent viral vectors include, but are not limited to, viral origins such as herpesvirus, retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, adeno-associated virus, or bovine papillomavirus. Vector may be used. Although integrative vectors may be used, non-integrative systems that do not inherit the gene product into daughter cells for generations are preferred for non-disease related repair and regeneration. Thus, as the gene product is expressed during the repair process and the gene is diluted in the progeny generation, the amount of expressed gene product decreases.

【０１０５】治療的遺伝子発現を駆動する組織特異的プロモーターを使用すれば、ウイルス
介在型の遺伝子送達が正常細胞の感染を生じる場合に、隣接する正常細胞に対す
る治療遺伝子の毒性効果をさらに低減しうる。このことは、限られた特定の数の
細胞型で導入遺伝子の発現を維持しながら、全身投与を利用して体全体に治療用
ベクターを送達しうる疾患の場合に特に重要となる。さらに、多くの骨増殖因子
（例えば、TGF-β）は多形質発現効果を有することから、増殖因子遺伝子が全細
胞で発現されると多くの有害な副作用を生じる可能性がある。The use of tissue-specific promoters to drive therapeutic gene expression may further reduce the toxic effect of the therapeutic gene on adjacent normal cells when virus-mediated gene delivery results in infection of the normal cells. . This is especially important in the case of diseases in which systemic administration can be used to deliver therapeutic vectors throughout the body while maintaining transgene expression in a limited and specific number of cell types. Moreover, since many bone growth factors (eg TGF-β) have a pleiotropic effect, expression of growth factor genes in whole cells can lead to many deleterious side effects.

【０１０６】いくつかの事例において、プロモーターエレメントは、構成または誘導プロモ
ーターとすることができ、適切な条件下にて用いることによって、目的の遺伝子
の高レベルのまたは調節された発現を導くことが可能である。構成プロモーター
の制御下における遺伝子発現は、遺伝子発現を誘導する特定の基質の存在を必要
とせず、細胞増殖の全ての条件において起こるものである。対照的に、誘導プロ
モーターにより制御される遺伝子発現は、誘導剤の存在または不在に対して応答
するものである。例えば、細胞を、治療薬により誘導されるトランスジーンを用
いて安定にトランスフェクトした場合には、その発現は、個体の生存期間にわた
って制御される可能性がある。実際、OSNプロモーターは、糖質コルチコイドお
よびアスコルビン酸により誘導されるものである。In some cases, the promoter element can be a constitutive or inducible promoter, and when used under appropriate conditions, can direct high level or regulated expression of the gene of interest. Is. Gene expression under the control of constitutive promoters does not require the presence of specific substrates to induce gene expression and occurs under all conditions of cell growth. In contrast, gene expression controlled by an inducible promoter is responsive to the presence or absence of an inducing agent. For example, if cells are stably transfected with a therapeutic-induced transgene, their expression may be regulated over the life of the individual. In fact, the OSN promoter is one driven by glucocorticoids and ascorbic acid.

【０１０７】特定の開始シグナルもまた、挿入されたタンパク質のコード配列の十分な翻訳
に必要である。これらのシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接配列が含
まれる。開始コドンおよび隣接配列を含むコード配列全体を適切な発現ベクター
に挿入する場合には、さらに他の翻訳制御シグナルは必要とされないことが多い
。しかしながら、コード配列の一部のみを挿入する場合には、ATG開始コドンを
含む外因性翻訳制御シグナルを挿入する必要がある。更に、開始コドンは、挿入
物全体が翻訳されるように、タンパク質のコード配列のリーディングフレームと
同じ読み枠で（in phase）存在する必要がある。これらの外因性翻訳制御シグナ
ルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源のものであってよい
。発現の効率および制御は、転写アテニュエーション配列、エンハンサーエレメ
ントなどの挿入により増強されうる。Specific initiation signals are also required for full translation of the inserted protein coding sequence. These signals include the ATG initiation codon and adjacent sequences. No other translational control signals are often required when the entire coding sequence, including the start codon and flanking sequences, is inserted into an appropriate expression vector. However, if only part of the coding sequence is inserted, it is necessary to insert an exogenous translational control signal containing the ATG start codon. In addition, the initiation codon must be in phase with the reading frame of the protein coding sequence so that the entire insert is translated. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of various origins, both natural and synthetic. The efficiency and control of expression can be enhanced by the insertion of transcriptional attenuation sequences, enhancer elements and the like.

【０１０８】本発明の他の実施形態において、骨指向性腫瘍の治療方法が提供されるが、該
方法には、治療薬をその腫瘍に送達することが含まれる。該治療薬は、OSNプロ
モーターにより駆動される毒性チミジンキナーゼ（Tk）を含有する組換えアデノ
ウイルスベクター（Ad）を含むものである。本発明のさらなる態様において、適
切なプロドラッグ、例えば限定するものではないが、アシクロビル（Acv）を付
加させたTkの発現の調節方法が提供される。In another embodiment of the present invention, there is provided a method of treating an osteotrophic tumor, which method comprises delivering a therapeutic agent to the tumor. The therapeutic agent comprises a recombinant adenovirus vector (Ad) containing a toxic thymidine kinase (Tk) driven by the OSN promoter. In a further aspect of the invention there is provided a method of modulating the expression of Tk with the addition of a suitable prodrug, such as but not limited to acyclovir (Acv).

【０１０９】プロモーター駆動型毒性遺伝子治療を含有する治療薬は、適切なプロドラッグ
の存在下にて、骨肉腫腫瘍および前立腺癌腫瘍、それらの転移、ならびに他の多
くの骨指向性腫瘍、例えば限定するものではないが、大腸、脳、肺、***、多発
性骨髄腫、甲状腺および黒色腫に投与しうる。本発明の治療薬の発明は、Ad-OSN
-TK、またはOSNプロモーター駆動型活性を含有する他のベクターを含むものであ
り、これは骨指向性のターゲット癌に提供されて、骨組織と結合した際に、骨様
および骨ホーミング能を獲得し、骨芽細胞または骨溶解性の表現型を引き出すこ
とになる。Therapeutic agents containing promoter-driven toxic gene therapies include osteosarcoma and prostate cancer tumors, their metastases, and many other osteotrophic tumors in the presence of appropriate prodrugs, including, but not limited to, Although not, it may be given to large intestine, brain, lung, breast, multiple myeloma, thyroid and melanoma. The invention of the therapeutic agent of the present invention is Ad-OSN.
-Contains TK, or another vector containing OSN promoter-driven activity, that is targeted to bone-directed cancers to gain bone-like and bone homing ability when bound to bone tissue And elicit an osteoblastic or osteolytic phenotype.

【０１１０】さらに他の実施形態において、OSN調節領域は、骨修復を促進する種々の因子
、例えば細胞外、細胞表面および細胞内のRNAおよびタンパク質をコードするも
のでありうる。これらの治療用構築物は、特に、加齢および特定の変性状態に有
用でありうる。細胞外タンパク質の例としては、増殖因子、サイトカイン、治療
用タンパク質、ホルモンおよびホルモンのペプチド断片、サイトカイン阻害剤、
ペプチド増殖および分化因子、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロ
ン、コロニー刺激因子ならびに血管形成因子が挙げられる。上記タンパク質の例
としては、限定するものではないが、TGF-β分子のスーパーファミリー（例えば
５種のTGF-βイソフォームおよび骨形成タンパク質（BMP））、潜在的TGF-β結
合タンパク質（LTBP）；角質細胞増殖因子（KGF）；肝細胞増殖因子（HGF）；血
小板由来増殖因子（PDGF）；インスリン様増殖因子（IGF）；塩基性繊維芽細胞
増殖因子（FGF-1、FGF-2など）；血管内皮増殖因子（VEGF）；第VIII因子および
第IX因子；エリスロポエチン（EPO）；組織プラスミノーゲンアクチベーター（T
PA）；ならびにアクチビンおよびインヒビンが挙げられる。本発明の実施におい
て使用可能なホルモンとしては、例えば成長ホルモン（GH）および副甲状腺ホル
モン（PTH）が挙げられる。また、細胞外タンパク質の例としては、コラーゲン
、ラミニンおよびフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質が挙げ
られる。細胞表面タンパク質の例としては、細胞接着分子ファミリー（例えば、
インテグリン、セレクチン、Igファミリーメンバー（N-CAMおよびLlなど）、カ
ドヘリン）；サイトカインシグナル伝達受容体（I型およびII型TGF-β受容体、F
GF受容体など）、ならびに非シグナル伝達共受容体（βグリカンおよびシンデカ
ンなど）が挙げられる。細胞内RNAおよびタンパク質の例としては、シグナル伝
達キナーゼ、細胞骨格タンパク質（タリンおよびビンキュリンなど）、サイトカ
イン結合タンパク質（潜在的TGF-β結合タンパク質ファミリーなど）ならびに核
トランス作用性タンパク質（転写因子および増強因子など）のファミリーが挙げ
られる。In yet another embodiment, the OSN regulatory region may encode various factors that promote bone repair, such as extracellular, cell surface and intracellular RNAs and proteins. These therapeutic constructs may be particularly useful for aging and certain degenerative conditions. Examples of extracellular proteins include growth factors, cytokines, therapeutic proteins, hormones and peptide fragments of hormones, cytokine inhibitors,
Included are peptide growth and differentiation factors, interleukins, chemokines, interferons, colony stimulating factors and angiogenic factors. Examples of such proteins include, but are not limited to, the superfamily of TGF-β molecules (eg, 5 TGF-β isoforms and bone morphogenetic protein (BMP)), potential TGF-β binding protein (LTBP). Keratinocyte growth factor (KGF); hepatocyte growth factor (HGF); platelet-derived growth factor (PDGF); insulin-like growth factor (IGF); basic fibroblast growth factor (FGF-1, FGF-2, etc.) Vascular endothelial growth factor (VEGF); factor VIII and factor IX; erythropoietin (EPO); tissue plasminogen activator (T
PA); and activin and inhibin. Hormones that can be used in the practice of the invention include, for example, growth hormone (GH) and parathyroid hormone (PTH). In addition, examples of extracellular proteins include extracellular matrix proteins such as collagen, laminin and fibronectin. Examples of cell surface proteins include the family of cell adhesion molecules (eg,
Integrins, selectins, Ig family members (such as N-CAM and Ll), cadherins); cytokine signaling receptors (type I and type II TGF-β receptors, F
GF receptors), as well as non-signaling co-receptors (such as β-glycans and syndecans). Examples of intracellular RNAs and proteins include signal transduction kinases, cytoskeletal proteins (such as talin and vinculin), cytokine binding proteins (such as the potential TGF-β binding protein family) and nuclear trans-acting proteins (transcription factors and enhancers). Etc.) family.

【０１１１】上記方法には、骨合成および／または修復を促進する治療用化合物をコードす
る核酸と機能しうる形で結合させたOSN調節領域配列を導入することが含まれる
。OSNプロモーターの組織特異性によって、目的の骨指向性細胞において該治療
用化合物が特異的に発現されることになる。治療用遺伝子の発現を駆動するため
のOSNプロモーターの使用によって、ウイルスが媒介する遺伝子送達が正常細胞
の感染を引き起こす場合に、治療用遺伝子が近辺の正常細胞に与える毒性作用を
更に低減させうる。以上のことは、全身投与を利用して治療用ベクターを体全体
にわたって送達するが、トランスジーンの発現を限定したかつ特定の数の細胞タ
イプに維持しようとする疾患では特に重要でありうる。更に、多くの治療用増殖
因子（TGF-βなど）は多形質発現性作用を有するため、増殖因子の遺伝子を全て
の細胞で発現させた場合には、おそらく数多くの有害な副作用を示すことになる
。The methods include introducing an OSN regulatory region sequence operably linked to a nucleic acid encoding a therapeutic compound that promotes bone synthesis and / or repair. The tissue specificity of the OSN promoter will result in specific expression of the therapeutic compound in the osteotropic cells of interest. The use of the OSN promoter to drive the expression of the therapeutic gene may further reduce the toxic effects of the therapeutic gene on nearby normal cells when virus-mediated gene delivery causes infection of normal cells. The above may be particularly important in diseases in which systemic administration is utilized to deliver the therapeutic vector throughout the body, but where transgene expression is limited and the number of cell types is sought to be maintained. In addition, many therapeutic growth factors (such as TGF-β) have a pleiotropic effect, and when expressed in all cells the growth factor gene is likely to show many adverse side effects. Become.

【０１１２】さらに他の実施形態において、OSN調節領域は、免疫モジュレート機能を有す
る種々の遺伝子をコードするものでありうる。例えば、該遺伝子としては、サイ
トカイン（インターロイキン１〜15が含まれるが、特に、例えばIL2、IL12、γ-
インターフェロン、腫瘍壊死因子、GMCSFなど）をコードするもの、ならびに／
または他の遺伝子、例えばWO 88/00971（CSIRO, Australian National Universi
ty：Ramshawら）およびWO 94/16716（Virogenetics Corp：Paolettiら）の明細
書に記載される遺伝子などをコードするものでありうる。In yet another embodiment, the OSN regulatory region may encode various genes with immune modulatory function. For example, the gene includes cytokines (interleukins 1 to 15, but especially IL2, IL12, γ-
Interferon, tumor necrosis factor, GMCSF, etc., and /
Or other genes such as WO 88/00971 (CSIRO, Australian National Universi
ty: Ramshaw et al.) and WO 94/16716 (Virogenetics Corp: Paoletti et al.).

【０１１３】また、以下に示す遺伝子を、本発明のOSN調節領域がコードしてもよい。すな
わち、インターフェロンα、βまたはγ；腫瘍壊死因子；顆粒球-マクロファー
ジコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロフ
ァージコロニー刺激因子（N-CSF）、ケモカイン（例えば、好中球活性化タンパ
ク質（NAP）、マクロファージ走化性因子および活性化因子（MCAF）、RANTES、
マクロファージ炎症性ペプチドであるMIP-lαおよびMIP-lβなど、補体成分およ
びそれらの受容体、補助分子（例えば、87.1、87.2、ICAM-1.2もしくは3など）
またはサイトカイン受容体の遺伝子。１種以上の免疫調節性タンパク質をコード
するヌクレオチド配列を挿入する場合には、１種以上のサイトカインを含むもの
であってもよいし、またはサイトカインと補助分子（１種もしくは複数）の組み
合わせで存在させてもよい。The genes shown below may be encoded by the OSN regulatory region of the present invention. Interferon α, β or γ; tumor necrosis factor; granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor (N-CSF), chemokine (eg , Neutrophil activating protein (NAP), macrophage chemotactic and activating factor (MCAF), RANTES,
Complement components and their receptors, auxiliary molecules such as macrophage inflammatory peptides MIP-lα and MIP-lβ (eg 87.1, 87.2, ICAM-1.2 or 3 etc.)
Or a gene for a cytokine receptor. Where one or more immunomodulatory protein-encoding nucleotide sequences are inserted, it may contain one or more cytokines or be present in combination with cytokines and accessory molecules (one or more). You may let me.

【０１１４】5.4.1 調節性アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん手法別の実施形態においては、公知のアンチセンス、遺伝子「ノックアウト」、リ
ボザイムおよび／または三重らせん法と組み合わせてOSN調節領域を用いて骨指
向性特異的遺伝子発現をモジュレートすることにより予防、遅延またはレスキュ
ー可能な、石灰化の可能性がある腫瘍および組織細胞を含む症状、障害または疾
患の種類を説明する。このような分子は、損なわれていない活性、または適切で
あれば、変異型骨指向性遺伝子の活性をモジュレートし、低下させ、または阻害
するように設計することができる。このような分子を生成および使用するための
技術は当業者に周知である。 5.4.1 Regulatory Antisense, Ribozymes and Triple Helix Techniques In another embodiment, bone fragments using OSN regulatory regions in combination with known antisense, gene “knockouts”, ribozymes and / or triple helix techniques. We describe the types of conditions, disorders or diseases involving potentially calcifying tumors and tissue cells that can be prevented, delayed or rescued by modulating directional specific gene expression. Such molecules can be designed to modulate, diminish or inhibit the activity of intact or, if appropriate, mutant osteotrophic genes. Techniques for producing and using such molecules are well known to those of skill in the art.

【０１１５】アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的化mRNAにハイブリダイズしてタンパク
質翻訳を妨げることによりmRNAの翻訳を直接ブロックするように作用する。アン
チセンス手法は、mRNA配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの設計を含むもの
である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的mRNA配列転写産物に結合し
、翻訳を妨げる。完全な相補性は、好ましいものではあるが、必要ではない。Antisense RNA and DNA molecules act to directly block translation of mRNA by hybridizing to targeted mRNA and interfering with protein translation. The antisense approach involves the design of oligonucleotides that are complementary to the mRNA sequence. Antisense oligonucleotides bind to complementary mRNA sequence transcripts and prevent translation. Perfect complementarity, although preferred, is not required.

【０１１６】 RNAの一部に「相補的」である配列は、本明細書で用いる場合、RNAとハイブリ
ダイズして安定な二本鎖を形成することができる十分な相補性を有する配列を意
味する。二本鎖アンチセンス核酸の場合には、その二本鎖DNAの一本鎖を試験し
てもよいし、または三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力
は、そのアンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両者により異なりうる。
一般には、ハイブリダイズする核酸が長くなるほど、依然として安定な二本鎖（
または場合によっては三重鎖）を形成するRNAとの塩基ミスマッチが多く含まれ
うる。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な手
順を用いることにより、ミスマッチの寛容され得る程度を確認することができる
。A sequence that is “complementary” to a portion of RNA, as used herein, means a sequence that has sufficient complementarity to hybridize with RNA to form a stable duplex. To do. In the case of double-stranded antisense nucleic acids, the single strand of the double-stranded DNA may be tested or triplex formation may be assayed. The ability to hybridize may depend on both the degree of complementarity and the length of the antisense nucleic acid.
Generally, the longer the hybridizing nucleic acid, the more stable double-stranded (
Alternatively, there may be many base mismatches with RNA forming a triplex). One of ordinary skill in the art can ascertain the acceptable degree of mismatch by using standard procedures to determine the melting temperature of hybridized complexes.

【０１１７】一実施形態においては、目的の配列の非コード領域に相補的なオリゴヌクレオ
チドをアンチセンス手法において用いることにより、内在性mRNAの翻訳を阻害し
うる。アンチセンス核酸は、長さが少なくとも6ヌクレオチドである必要があり
、好ましくは、長さが6〜約50ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである
。特定の態様においては、このオリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチド
、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチドまたは少なくとも50ヌ
クレオチドである。In one embodiment, oligonucleotides complementary to the non-coding regions of the sequence of interest may be used in the antisense procedure to inhibit translation of endogenous mRNA. Antisense nucleic acids should be at least 6 nucleotides in length, and are preferably oligonucleotides ranging in length from 6 to about 50 nucleotides. In particular embodiments, the oligonucleotide is at least 10 nucleotides, at least 17 nucleotides, at least 25 nucleotides or at least 50 nucleotides.

【０１１８】ターゲット配列の選択に関わりなく、まずin vitro試験を行って配列の発現を
阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量化することが好ましい。
これらの試験は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子阻害と非特異的生物
学的作用とを区別する対照を用いることが好ましい。加えて、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを用いて得られた結果を対照オリゴヌクレオチドを用いて得られ
た結果と比較することも考えられる。対照オリゴヌクレオチドが試験オリゴヌク
レオチドとほぼ同じ長さのものであり、かつオリゴヌクレオチドの核酸がターゲ
ット配列への特異的ハイブリダイゼーションを防止する必要があるにすぎないア
ンチセンス配列とは異なることが好ましい。Regardless of the choice of target sequence, it is preferable to first perform an in vitro test to quantify the ability of the antisense oligonucleotide to inhibit expression of the sequence.
These tests preferably use controls that distinguish between antisense gene inhibition of oligonucleotides and non-specific biological effects. In addition, it is also possible to compare the results obtained with the antisense oligonucleotides with the results obtained with the control oligonucleotides. It is preferred that the control oligonucleotide is about the same length as the test oligonucleotide and that the nucleic acid of the oligonucleotide is different from the antisense sequence which only needs to prevent specific hybridization to the target sequence.

【０１１９】上記オリゴヌクレオチドは、DNAもしくはRNA、またはキメラ混合物であっても
よいし、あるいはそれらの誘導体または修飾体であってもよく、一本鎖であって
もよいし二本鎖であってもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、例えばその分
子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善するため、塩基部分、糖部分また
はリン酸骨格が修飾されていてもよい。上記オリゴヌクレオチドは、他の付随基
、例えばペプチド（例えば、in vivoで宿主細胞受容体をターゲティングするた
めのもの）、または細胞膜（例えば、Letsingerら、1989, Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 86:6553-6556；Lemaitreら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
84:648-652；1988年12月15日公開のPCT公開WO88／09810を参照）もしくは血液
−脳関門（例えば、1988年4月25日公開のPCT公開WO89／10134を参照）を通過す
る輸送を促進する薬剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤（例えば、Krolら、
1988, BioTechniques 6:958-976を参照）または挿入剤（例えば、Zon, 1988, Ph
arm. Res. 5:539-549を参照）を含んでいてもよい。上記目的のため、オリゴヌ
クレオチドは、他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋
剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤等にコンジュゲートさせてもよ
い。The above-mentioned oligonucleotide may be DNA or RNA, or a chimeric mixture, or may be a derivative or modified product thereof, single-stranded or double-stranded. Good. These oligonucleotides may be modified at the base moiety, sugar moiety or phosphate backbone in order to improve, for example, the stability of the molecule, hybridization and the like. The oligonucleotides may be conjugated to other ancillary groups, such as peptides (eg, for targeting host cell receptors in vivo), or cell membranes (eg, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. S).
ci. USA 86: 6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
84: 648-652; see PCT publication WO88 / 09810 published December 15, 1988) or blood-brain barrier (see eg PCT publication WO89 / 10134 published April 25, 1988). An agent that promotes a hybridization-induced cleavage agent (eg, Krol et al.,
1988, BioTechniques 6: 958-976) or intercalating agents (eg Zon, 1988, Ph.
arm. Res. 5: 539-549)). For the above purposes, the oligonucleotides may be conjugated to other molecules such as peptides, hybridization-triggered cross-linking agents, transport agents, hybridization-triggered cleavage agents and the like.

【０１２０】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾塩基部分を含んで
いてもよく、該修飾塩基部分としては、例えば限定されるものではないが、5-フ
ルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒ
ポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメ
チル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキ
シメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルクエオ
シン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイ
ノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチ
ルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルア
ミノメチルウラシル、5-メトキシアミノエチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシ
ルクエオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、
2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイ
ブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-
チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル
-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオ
ウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および
2,6-ジアミノプリンを含む群より選択されるものが挙げられる。Antisense oligonucleotides may include at least one modified base moiety, such as, but not limited to, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chloro. Uracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, β- D-galactosyleosin, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine , N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxy Minoechiru 2-thiouracil, beta-D-mannosyltransferase silk eosin, 5'-methoxy carboxymethyl uracil, 5-methoxy uracil,
2-Methylthio-N6-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid (v), wibutoxosine, pseudouracil, queosin, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-
Thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil
-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid (v), 5-methyl-2-thiouracil, 3- (3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, (acp3) w, and
Examples include those selected from the group containing 2,6-diaminopurine.

【０１２１】また、限定されるものではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラ
ビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群よ
り選択される少なくとも1つの修飾糖部分を含んでいてもよい。Also, without limitation, antisense oligonucleotides may include at least one modified sugar moiety selected from the group comprising arabinose, 2-fluoroarabinose, xylulose and hexose.

【０１２２】さらに別の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロア
ミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエ
ステルおよびホルムアセタール、またはそれらの類似体からなる群より選択され
る少なくとも1つの修飾リン酸骨格を含むものである。In yet another embodiment, the antisense oligonucleotides are phosphorothioates, phosphorodithioates, phosphoramidothioates, phosphoramidates, phosphorodiamidates, methylphosphonates, alkylphosphotriesters and formacetals. , Or at least one modified phosphate skeleton selected from the group consisting of analogs thereof.

【０１２３】さらに別の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的RN
Aと特定の二本鎖ハイブリッドを形成するものであり、該ハイブリッドにおいて
は、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖が互いに平行に伸びる（Gautierら、1
987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641）。このオリゴヌクレオチドは2’-O-メチ
ルリボヌクレオチド（Inoueら、1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148）または
キメラRNA−DNA類似体（Inoueら、1987, FEBS Lett. 215:327-330）である。In yet another embodiment, the antisense oligonucleotide is an α-anomeric oligonucleotide. The α-anomeric oligonucleotide has a complementary RN
It forms a specific double-stranded hybrid with A, in which the strands extend parallel to each other as opposed to the normal β-unit (Gautier et al., 1
987, Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641). This oligonucleotide is either a 2'-O-methyl ribonucleotide (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148) or a chimeric RNA-DNA analog (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330). ).

【０１２４】本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の標準的な方法、例えば、
自動DNAシンセサイザー（例えば、Biosearch、Applied Biosystems等から市販さ
れているもの）を用いることによって合成することができる。例として、ホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチドはSteinらの方法（1988, Nucl. Acids Res. 16
:3209）によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチド
は制御化細孔ガラスポリマー支持体（Sarinら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 85:7448-7451）等を用いることによって調製することができる。Oligonucleotides of the invention may be prepared by standard methods known in the art, eg
It can be synthesized by using an automatic DNA synthesizer (for example, commercially available from Biosearch, Applied Biosystems, etc.). As an example, phosphorothioate oligonucleotides are described by Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16
: 3209) and methylphosphonate oligonucleotides can be synthesized using a controlled pore glass polymer support (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85: 7448-7451) and the like.

【０１２５】骨指向性特異的コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用可
能であるが、転写された未翻訳の領域に相補的なものが最も好ましい。Although antisense nucleotides complementary to the bone-directed specific coding region sequence can be used, those complementary to the transcribed untranslated region are most preferred.

【０１２６】アンチセンス分子は、in vivoで骨指向性配列を発現する細胞に送達されねば
ならない。アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に送達するための幾つかの方法が開
発されており、例えば、アンチセンス分子は、組織部位に直接注入してもよいし
、あるいは、目的の細胞を標的とするように設計された改変アンチセンス分子（
例えば、標的細胞の表面に発現された受容体または抗原に特異的に結合するペプ
チドまたは抗体に連結したアンチセンス）を全身投与してもよい。Antisense molecules must be delivered in vivo to cells expressing bone-directing sequences. Several methods have been developed to deliver antisense DNA or RNA to cells, for example, the antisense molecule may be injected directly into the tissue site or may be targeted to the cell of interest. A modified antisense molecule designed to (
For example, antisense linked to a peptide or antibody that specifically binds to a receptor or antigen expressed on the surface of target cells) may be administered systemically.

【０１２７】内因性mRNAの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成する
ための好ましい方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なpol IIIまた
はpol IIプロモーターの調節下に置かれている組換えDNA構築物を利用するもの
である。患者において標的細胞をトランスフェクトするためにそのような構築物
を使用すれば、内因性の配列転写産物と相補的塩基対を形成する一本鎖RNAの十
分な量の転写が起こり、それによりmRNAの翻訳を抑制する。例えば、ベクターを
導入し、例えばそれが細胞により取り込まれてアンチセンスRNAの転写を指令す
るようにすることができる。そのようなベクターは、それが転写されて目的のア
ンチセンスRNAを産生できるならば、エピソーム性のままであってもよいし、染
色体に組み込まれてもよい。そのようなベクターは、当技術分野で標準的な組換
えDNAテクノロジー法により構築できる。ベクターは、哺乳動物細胞内での複製
および発現に用いられるプラスミド、ウイルス性のもの、または当技術分野で公
知の他のものとすることができる。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は
、哺乳動物（好ましくはヒト細胞）において作用することが当技術分野で知られ
ているどのようなプロモーターによるものであってもよい。そのようなプロモー
ターは、誘導的であっても構成的であってもよい。そのようなプロモーターとし
ては、SV40初期プロモーター領域（BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290:
304-310）、ラウス肉腫ウイルスの3’側の長い末端反復配列中に含まれるプロモ
ーター（Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペス・チミジンキナーゼ
プロモーター（Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445
）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42
）などが挙げられるが、それらに限定されない。いずれのタイプのプラスミド、
コスミド、YACまたはウイルスベクターも、組織部位に直接導入可能な組換えDNA
構築物を調製するのに使用できる。あるいはまた、目的の組織を選択的に感染さ
せるウイルスベクターを使用してもよく、その場合、投与は別の経路（例えば全
身的）により達成できる。A preferred method for achieving intracellular concentrations of antisense sufficient to suppress translation of endogenous mRNA is to place the antisense oligonucleotide under the control of a strong pol III or pol II promoter. Existing recombinant DNA constructs. The use of such a construct to transfect target cells in a patient results in the transcription of a sufficient amount of single-stranded RNA that forms complementary base pairs with the endogenous sequence transcript, thereby reducing the mRNA Suppress translation. For example, the vector can be introduced such that it is taken up by the cell and directs transcription of the antisense RNA. Such a vector may remain episomal or become chromosomally integrated, as long as it can be transcribed to produce the antisense RNA of interest. Such vectors can be constructed by recombinant DNA technology methods standard in the art. The vector can be a plasmid used for replication and expression in mammalian cells, viral, or others known in the art. Expression of the antisense RNA-encoding sequence may be by any promoter known in the art to act in mammals, preferably human cells. Such promoters may be inducible or constitutive. Such promoters include the SV40 early promoter region (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:
304-310), a promoter contained in the 3'long terminal repeat of Rous sarcoma virus (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl). . Acad. Sci. USA 78: 1441-1445
), The regulatory sequence of the metallothionein gene (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42).
) And the like, but are not limited thereto. Either type of plasmid,
Recombinant DNA that can directly introduce cosmid, YAC or viral vectors into tissue sites
It can be used to prepare the construct. Alternatively, viral vectors may be used that selectively infect the tissue of interest, in which case administration can be accomplished by another route, such as systemic.

【０１２８】標的遺伝子mRNA転写産物を触媒的に分解するように設計されたリボザイム分子
もまた、標的遺伝子mRNAの翻訳、ひいては標的遺伝子産物の発現を抑制するのに
使用可能である。（例えば、1990年10月４日に公表されたPCT国際公報WO90/1136
4；Sarverら, 1990, Science 247, 1222-1225を参照のこと。）リボザイムは、RNAの特異的分解を触媒できる酵素活性を持つRNA分子である。
（概説については、Rossi, 1994, Current Biology 4:469-471を参照されたい。
）リボザイムの作用機構は、リボザイム分子の相補的な標的RNAへの配列特異的
ハイブリダイゼーション、それに続くヌクレオチド内分解性（endonucleolytic
）の分解事象を含む。リボザイム分子の組成は、標的遺伝子mRNAに相補的な１つ
以上の配列を含んでいなければならず、且つ、mRNAの分解に関与する公知の触媒
活性を持つ配列を含んでいなければばならない。この配列については、例えば米
国特許第5,093,246号（参照によりその全体を本明細書に組み入れる）を参照さ
れたい。Ribozyme molecules designed to catalytically degrade target gene mRNA transcripts can also be used to suppress translation of target gene mRNA and thus expression of the target gene product. (For example, PCT International Publication WO 90/1136 published on October 4, 1990.
4; Sarver et al., 1990, Science 247, 1222-1225. ) Ribozymes are RNA molecules with enzymatic activity that can catalyze the specific degradation of RNA.
(See Rossi, 1994, Current Biology 4: 469-471 for a review.
) The mechanism of ribozyme action is sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA, followed by endonucleolytic degradation.
) Decomposition event is included. The composition of ribozyme molecules must include one or more sequences that are complementary to the target gene mRNA and must include sequences with known catalytic activity involved in the degradation of mRNA. See, eg, US Pat. No. 5,093,246 (incorporated herein by reference in its entirety) for this sequence.

【０１２９】標的遺伝子mRNAを破壊するために、mRNAを部位特異的認識配列において分解す
るリボザイムが使用できるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。
ハンマーヘッド型リボザイムは、mRNAを、標的のmRNAと相補的塩基対を形成する
隣接領域により指定された位置で分解する。ただ１つの要件は、標的mRNAが次の
２塩基からなる配列を含むことである：5’-UG-3’。ハンマーヘッド型リボザイ
ムの構築および作製は当技術分野で公知であり、Myers, 1995, Molecular Biolo
gy and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Ne
w York（特に833頁の図４を参照のこと）ならびにHaseloffおよびGerlach, 1988
, Nature, 334:585-591（引用によりその全体を本明細書に組み入れる）に更に
十分に記載されている。To destroy the target gene mRNA, a ribozyme that decomposes the mRNA at a site-specific recognition sequence can be used, but a hammerhead ribozyme is preferably used.
Hammerhead ribozymes cleave mRNAs at positions dictated by flanking regions that form complementary base pairs with the target mRNA. The only requirement is that the target mRNA contains a sequence consisting of the following two bases: 5'-UG-3 '. The construction and production of hammerhead ribozymes is known in the art and can be found in Myers, 1995, Molecular Biolo
gy and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Ne
w York (see especially Figure 4 on page 833) and Haseloff and Gerlach, 1988.
, Nature, 334: 585-591, which is incorporated herein by reference in its entirety.

【０１３０】好ましくは、リボザイムは、分解認識部位が標的遺伝子mRNAの5’末端の近傍
に位置するように、つまり、効率を増大させ且つ機能性でないmRNA転写産物の細
胞内蓄積を最小限に抑えるように作製される。Preferably, the ribozyme is such that the degradation recognition site is located near the 5'end of the target gene mRNA, thus increasing efficiency and minimizing intracellular accumulation of non-functional mRNA transcripts. Is made as.

【０１３１】本発明のリボザイムはまた、テトラヒメナ（Tetrahymena thermophila）内に
天然に存在するもの（IVSまたはL-19 IVS RNAとして知られている）や、Thomas
Cechおよび共同研究者により広範に記載されているもの（Zaugら, 1984, Scienc
e, 224:574-578；ZaugおよびCech, 1986, Science, 231:470-475；Zaugら, 1986
, Nature, 324:429-433；University Patents Inc.による公表済みの国際特許公
報WO88/04300；BeenおよびCech, 1986, Cell, 47:207-216）などのRNAエンドリ
ボヌクレアーゼも含む（以下、「Cech型リボザイム」と呼ぶ）。Cech型リボザイ
ムは、標的RNA配列とハイブリダイズする８塩基対からなる活性部位を含み、そ
のハイブリダイゼーションの後で該標的RNAの分解が起こる。本発明は、標的遺
伝子中に存在する８塩基対からなる活性部位配列を標的とするCech型リボザイム
を包含する。The ribozymes of the invention also include those naturally occurring in Tetrahymena thermophila (known as IVS or L-19 IVS RNA) and Thomas.
Widely described by Cech and coworkers (Zaug et al., 1984, Scienc
e, 224: 574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug et al., 1986.
, Nature, 324: 429-433; published international patent publication WO88 / 04300 by University Patents Inc .; Been and Cech, 1986, Cell, 47: 207-216). Type ribozyme "). The Cech-type ribozyme contains an active site consisting of 8 base pairs that hybridizes with the target RNA sequence, and the target RNA is degraded after the hybridization. The present invention includes a Cech-type ribozyme targeting an active site sequence consisting of 8 base pairs existing in a target gene.

【０１３２】アンチセンス法の場合と同様に、リボザイムは、（例えば安定性やターゲッテ
ィングなどを向上させるための）改変オリゴヌクレオチドから構成されてもよく
、in vivoで標的遺伝子を発現する細胞に送達されねばならない。好ましい送達
方法は、強力な構成的pol IIIもしくはpol IIプロモーターの調節下でリボザイ
ムを「コードする」DNA構築物を用い、トランスフェクトした細胞が十分な量の
該リボザイムを産生して内因性の標的遺伝子メッセージを破壊し且つ翻訳を阻止
するようにすることを含む。リボザイムは、アンチセンス分子とは違って触媒活
性を持つので、効率のために必要とされる細胞内濃度はより低いものである。As with the antisense method, ribozymes may be composed of modified oligonucleotides (eg, to improve stability, targeting, etc.) and delivered to cells expressing the target gene in vivo. I have to. A preferred method of delivery uses a DNA construct that "encodes" the ribozyme under the control of the strong constitutive pol III or pol II promoter, so that the transfected cells produce sufficient quantities of the ribozyme to produce the endogenous target gene. It involves destroying the message and blocking translation. Ribozymes, unlike antisense molecules, are catalytically active, so lower intracellular concentrations are required for efficiency.

【０１３３】内因性標的遺伝子の発現は、標的相同組換え（targeted homologous recombin
ation）を用いて該標的遺伝子またはそのプロモーターを不活性化または「ノッ
クアウト」することによっても低減できる（例えば、Smithiesら, 1985, Nature
, 317:230-234；ThomasおよびCapecchi, 1987, Cell 51:503-512；Thompsonら,
1989, Cell 5:313-321を参照；それらの各々は参照によりその全体を本明細書に
組み入れる）。例えば、内因性の標的遺伝子に相同なDNA（該標的遺伝子のコー
ド領域か調節領域のいずれか）が隣接している突然変異型の非機能性標的遺伝子
（または完全に無関係なDNA配列）を選択マーカーおよび／もしくはネガティブ
選択マーカーと共にまたはそれらなしで用いて、該標的遺伝子をin vivoで発現
する細胞をトランスフェクトすることができる。該DNA構築物を標的相同組換え
により挿入することにより、該標的遺伝子が不活性化される。そのような方法は
、特に農学分野において適し、その場合、ES（胚性幹）細胞への改変を用いて、
不活性な標的遺伝子を含む動物子孫が作製できる（例えば、ThomasおよびCapecc
hi, 1987およびThompson, 1989,前掲を参照のこと）。しかし、この方法はヒト
における使用に適合させることができ、但しその場合、組換えDNA構築物は直接
投与されるか、適当なウイルスベクターを用いてin vivoで必要とされる部位に
ターゲッティングされる。Expression of the endogenous target gene is controlled by targeted homologous recombination.
ation) to inactivate or “knock out” the target gene or its promoter (eg, Smithies et al., 1985, Nature).
, 317: 230-234; Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512; Thompson et al.
1989, Cell 5: 313-321; each of which is incorporated herein by reference in its entirety). For example, select a mutant non-functional target gene (or a completely unrelated DNA sequence) flanked by DNA homologous to an endogenous target gene (either the coding region or regulatory region of the target gene) Markers and / or with or without negative selectable markers can be used to transfect cells expressing the target gene in vivo. The target gene is inactivated by inserting the DNA construct by targeted homologous recombination. Such a method is particularly suitable in the field of agriculture, in which case modification with ES (embryonic stem) cells is used,
Animal progeny containing inactive target genes can be generated (eg, Thomas and Capecc
hi, 1987 and Thompson, 1989, supra). However, this method can be adapted for use in humans, where the recombinant DNA construct is either directly administered or targeted to the required site in vivo with a suitable viral vector.

【０１３４】あるいはまた、内因性標的遺伝子の発現は、該標的遺伝子の調節領域（すなわ
ち、標的遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキ
シリボヌクレオチド配列を標的として、体内の標的細胞における該標的遺伝子の
転写を抑制する三重らせん構造を形成することにより低減してもよい。（概略的
には、Helene. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-584；Heleneら, 1992,
Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:27-36；ならびにMaher, 1992, Bioassays 14(12):8
07-815を参照されたい。）転写抑制のための三重らせん形成において用いられる核酸分子は、一本鎖であ
り、且つデオキシヌクレオチドから構成されるものでなければならない。これら
のオリゴヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン（Hoogsteen）型塩基対
合則による三重らせん形成を促進するように設計されなければならず、このため
には、通常、二重らせんの一方の鎖にプリンまたはピリミジンのかなり大きなス
トレッチが存在することが必要である。核酸は、ピリミジンベースのものであっ
てもよく、この場合、得られる三重らせんの３本の結合鎖を横切ってTATおよびC
GC^＋トリプレットが生じる。ピリミジンに富む分子には、その鎖と平行に並んで
いる二重らせんの一方の鎖のプリンに富む領域に対する塩基相補性が備わってい
る。更に、プリンに富んでいる（例えばＧ残基のストレッチを含んでいる）核酸
分子を選んでもよい。これらの分子は、ＧＣ対に富むDNA二重らせんと三重らせ
んを形成し、そこにおいて、プリン残基の大部分は、標的とする二重らせんの一
方の鎖に位置して、三重らせんの３本の鎖を横切ってＧＧＣトリプレットを生じ
る。Alternatively, the expression of the endogenous target gene may be controlled by targeting a deoxyribonucleotide sequence complementary to the regulatory region of the target gene (ie, the promoter and / or enhancer of the target gene) to the target cell in the body. It may be reduced by forming a triple helix structure that represses gene transcription. (Schematically, Helene. 1991, Anticancer Drug Des., 6 (6): 569-584; Helene et al., 1992,
Ann. NY Acad. Sci., 660: 27-36; and Maher, 1992, Bioassays 14 (12): 8.
See 07-815. The nucleic acid molecule used in triple helix formation for transcriptional repression must be single-stranded and composed of deoxynucleotides. The base composition of these oligonucleotides must be designed to promote triple-helix formation by Hoogsteen-type base pairing rules, which usually results in one strand of the double helix. It is necessary that there be a fairly large stretch of purines or pyrimidines. The nucleic acid may be pyrimidine-based, in which case the TAT and C are crossed across the three binding strands of the resulting triple helix.
GC ⁺ triplets occur. Pyrimidine-rich molecules have base complementarity to the purine-rich region of one strand of the double helix that is parallel to the strand. In addition, nucleic acid molecules rich in purines (eg, containing stretches of G residues) may be selected. These molecules form triple helices with the GC pair-rich DNA double helix, where most of the purine residues are located on one strand of the target double helix, and the triple helix of the triple helix. A GGC triplet is generated across the strand.

【０１３５】あるいはまた、三重らせん形成の標的とされ得る可能性のある配列は、いわゆ
る「スイッチバック（折り返し）」型核酸分子を作製することにより増やすこと
ができる。スイッチバック型分子は、それらがまず二重らせんの一方の鎖と塩基
対合し次にもう一方の鎖と塩基対合するように、5’−3’と3’−5’が交互に並
ぶ様に合成して、プリンもしくはピリミジンのかなり大きなストレッチが二重ら
せんの一方の鎖に存在しなくても済むようにする。Alternatively, the potential sequences that can be targeted for triple helix formation can be increased by creating a so-called "switchback" nucleic acid molecule. Switchback-type molecules are interleaved with 5'-3 'and 3'-5', such that they first base pair with one strand of the double helix and then with the other. Synthesized in such a way that a fairly large stretch of purines or pyrimidines need not be present on one strand of the double helix.

【０１３６】本明細書で記載するアンチセンス、リボザイムおよび／または三重らせん分子
を利用して突然変異型遺伝子発現を抑制する場合、おそらく、該方法は、正常な
標的遺伝子の対立遺伝子により生じるmRNAの転写（三重らせんの場合）および／
または翻訳（アンチセンス、リボザイムの場合）をそのように効率的に低減また
は抑制でき、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度は正常な表現型に必要な濃度
よりも低い可能性が生じることがある。したがって、そうした場合、実質的に正
常な標的遺伝子の活性レベルが確実に維持されるようにするためには、正常な標
的遺伝子の活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードし発現する核酸分子を、
例えば後記のセクション5.4.2に記載されているような遺伝子治療方法により、
利用されているアンチセンス、リボザイムまたは三重らせん処理に影響される配
列を含まない細胞に導入すればよい。あるいはまた、標的遺伝子が細胞外タンパ
ク質をコードする場合、必要な標的遺伝子の活性レベルを維持するために、正常
な標的遺伝子タンパク質を同時投与することが好ましいこともある。When utilizing the antisense, ribozyme and / or triple helix molecules described herein to suppress mutant gene expression, presumably the method is for the mRNA generated by an allele of a normal target gene. Transcription (for triple helix) and /
Or translation (in the case of antisense, ribozymes) can be so efficiently reduced or suppressed, and the concentration of normal target gene product present may be lower than that required for a normal phenotype. . Therefore, in such a case, in order to ensure that the activity level of the substantially normal target gene is maintained, a nucleic acid molecule that encodes and expresses a target gene polypeptide exhibiting the activity of the normal target gene is
For example, by the gene therapy method as described in Section 5.4.2 below,
It may be introduced into cells that do not contain the sequence that is affected by the antisense, ribozyme, or triple helix treatment that is used. Alternatively, where the target gene encodes an extracellular protein, it may be preferable to co-administer a normal target gene protein to maintain the required level of target gene activity.

【０１３７】本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイムならびに三重らせん分子は、
上記で述べたように、DNAおよびRNA分子の合成用として当技術分野で公知のいず
れの方法によっても調製できる。これらの方法としては、当技術分野で公知のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成す
るための技法、例えば固相ホスホラミド化学合成が挙げられる。あるいはまた、
RNA分子は、アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のin vitroおよびin vivo
転写により作製することが可能である。そのようなDNA配列は、T7またはSP6ポリ
メラーゼプロモーターなどの適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込む多
種多様なベクターに組み込まれ得る。あるいはまた、使用するプロモーターよっ
ては、アンチセンスRNAを構成的または誘導的に合成するアンチセンスcDNA構築
物を細胞系に安定に導入してもよい。Antisense RNA and DNA, ribozymes and triple helix molecules of the present invention include
As mentioned above, it can be prepared by any method known in the art for the synthesis of DNA and RNA molecules. These methods include techniques known in the art for chemically synthesizing oligodeoxyribonucleotides and oligoribonucleotides, such as solid phase phosphoramide chemical synthesis. Alternatively,
RNA molecules are the in vitro and in vivo sequences of DNA sequences that encode antisense RNA molecules.
It can be produced by transfer. Such DNA sequences may be incorporated into a wide variety of vectors that incorporate suitable RNA polymerase promoters such as the T7 or SP6 polymerase promoters. Alternatively, depending on the promoter used, antisense cDNA constructs that synthesize antisense RNA constitutively or inducibly may be introduced stably into cell lines.

【０１３８】5.4.2 遺伝子置換治療上記で記載した本発明の核酸配列は、組換え核酸配列を細胞に移送し、該配列
をレシピエント細胞内で発現させるのに利用できる。そのような技法は、例えば
、細胞のマーキングにおいて、または石灰化の可能性がある腫瘍もしくは組織細
胞が関与する障害の治療に使用可能である。そのような治療は、遺伝子置換治療
（gene replacement therapy）の形態とし得る。具体的に述べると、正常な遺伝
子または該遺伝子の正常な遺伝子機能を示す遺伝子産物の生成を指令する部分の
１コピー以上を、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス
およびレトロウイルスのベクターなど（しかしそれらに限定されない）のベクタ
ーや、リポソームなどのDNAを細胞に導入する他の粒子を用いて、患者の適切な
細胞に挿入すればよい。 5.4.2 Gene Replacement Therapy The nucleic acid sequences of the invention described above can be used to transfer recombinant nucleic acid sequences into cells and express the sequences in recipient cells. Such techniques can be used, for example, in the marking of cells, or in the treatment of disorders involving potentially calcified tumors or tissue cells. Such treatment may be in the form of gene replacement therapy. Specifically, one or more copies of a part of the gene that directs the production of a normal gene or a gene product showing a normal gene function of the gene is used as a vector for adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, retrovirus, etc. ( However, the present invention is not limited to these) and other particles such as liposomes that introduce DNA into cells may be used to insert into appropriate cells of the patient.

【０１３９】哺乳動物細胞における発現のための遺伝子導入方法は、当技術分野で公知であ
る。一般に、そのような遺伝子治療の場合、核酸は、異種コード配列に機能しう
る形で連結されたOSN調節領域を発現する標的細胞またはトランスジェニックマ
ウスに、in vivoで直接投与される。これは、当技術分野で公知のいずれの方法
によっても達成でき、かかる方法としては、例えば該核酸を適当な核酸発現ベク
ターの部分として構築し、それを投与して細胞内のものになるようにすること、
欠損もしくは弱毒化レトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクターを用い
て感染させること（米国特許第4,980,286号を参照）、むき出しのDNAを直接注入
すること、ミクロ粒子の打込み（microparticle bombardment）を用いること（
例えば、遺伝子銃;Biolistic, Dupont）、脂質または細胞表面受容体またはトラ
ンスフェクト剤で被覆すること、リポソーム、ミクロ粒子もしくはマイクロカプ
セルに封入すること、核に侵入することが判っているペプチドに該核酸を結合さ
せて投与すること、あるいは該核酸を受容体仲介性エンドサイトーシスを受けや
すいリガンドに結合させて投与すること（例えばWuおよびWu, 1987, J. Biol. C
hem. 262:4429-4432を参照）（これは該受容体を特異的に発現する細胞型をター
ゲティングするのに使用可能である）が挙げられる。別の実施形態では、核酸−
リガンド複合体を形成することができ、そこにおいて、該リガンドは、エンドソ
ームを破壊するために融合誘導性ウイルスペプチドを含んで、該核酸がリソソー
ム性の分解を受けないようにしている。更に別の実施形態では、特定の受容体を
ターゲッティングすることにより、該核酸が、細胞特異的な取込みおよび発現の
ためにin vivoでターゲッティングできる（例えば、1992年４月16日付けのPCT公
報WO92/06180；1992年12月23日付けのWO92/22635；1992年11月26日付けのWO92/2
0316；1993年７月22日付けのWO93/14188；1993年10月14日付けのWO93/20221を参
照のこと）。あるいはまた、核酸は、細胞内に導入し、発現のために相同組換え
により宿主細胞DNA内に取り込ませることが可能である（KollerおよびSmithies,
1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstraら, 1989, Nature
342:435-438）。Gene transfer methods for expression in mammalian cells are known in the art. Generally, for such gene therapy, the nucleic acid is directly administered in vivo to a target cell or transgenic mouse that expresses an OSN regulatory region operably linked to a heterologous coding sequence. This can be accomplished by any method known in the art, such as constructing the nucleic acid as part of a suitable nucleic acid expression vector and administering it so that it is intracellular. What to do,
Infecting with defective or attenuated retroviral vectors or other viral vectors (see US Pat. No. 4,980,286), direct injection of naked DNA, using microparticle bombardment (
For example, gene gun; Biolistic, Dupont), coating with lipids or cell surface receptors or transfecting agents, encapsulation in liposomes, microparticles or microcapsules, peptides known to enter the nucleus into the nucleic acid Or bound to a ligand susceptible to receptor-mediated endocytosis (eg, Wu and Wu, 1987, J. Biol. C).
hem. 262: 4429-4432), which can be used to target cell types that specifically express the receptor. In another embodiment, the nucleic acid-
A ligand complex can be formed, in which the ligand contains a fusogenic viral peptide to disrupt endosomes, preventing the nucleic acid from undergoing lysosomal degradation. In yet another embodiment, by targeting specific receptors, the nucleic acid can be targeted in vivo for cell-specific uptake and expression (eg, PCT Publication WO92, Apr. 16, 1992). / 06180; WO92 / 22635 dated December 23, 1992; WO92 / 2 dated November 26, 1992
0316; WO93 / 14188 dated July 22, 1993; WO93 / 20221 dated October 14, 1993). Alternatively, the nucleic acid can be introduced intracellularly and incorporated into host cell DNA for homologous recombination for expression (Koller and Smithies,
1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature.
342: 435-438).

【０１４０】１つの実施形態において、送達方法は、例えばそのような遺伝子配列を、該遺
伝子配列を発現させようとする細胞の部位に定位送達することによる直接投与を
含む。In one embodiment, the delivery method comprises direct administration, such as by stereotactically delivering such a gene sequence to the site of a cell in which it is desired to be expressed.

【０１４１】遺伝子発現および／または遺伝子産物の活性の全体的レベルを増大させるのに
利用可能な別の方法としては、上記で述べたように、標的相同組換え法を用いて
、異種DNA調節エレメントを挿入して挿入調節エレメントが当該の内因性遺伝子
に機能しうる形で連結されるようにすることにより、細胞または微生物における
内因性遺伝子の発現特性を変えることが挙げられる。したがって、標的相同組換
えは、「転写上サイレントである」（すなわち、通常は発現されないか、通常は
非常に低レベルでしか発現されない）内因性遺伝子の転写を活性化するために、
あるいは通常発現される内因性遺伝子の発現を増強するために用いることができ
る。Another method available to increase the overall level of gene expression and / or activity of a gene product is the use of targeted homologous recombination techniques, as described above, to heterologous DNA regulatory elements. To insert an operably linked insertion regulatory element into the endogenous gene of interest, thereby altering the expression characteristics of the endogenous gene in a cell or microorganism. Thus, targeted homologous recombination is in order to activate the transcription of an endogenous gene that is “transcriptionally silent” (ie, not normally expressed or normally expressed at very low levels).
Alternatively, it can be used to enhance expression of a normally expressed endogenous gene.

【０１４２】更に、標的遺伝子の発現および／または遺伝子産物の活性の全体的レベルは、
適切な標的遺伝子発現細胞（好ましくは自己由来の細胞）を、骨指向性に関連し
た障害の症状を改善するのに十分な位置で、且つかかる改善に十分な数で患者に
導入することにより増大させることができる。そのような細胞は組換え細胞でも
非組換え細胞のいずれでもよい。In addition, the overall level of target gene expression and / or gene product activity is
Proliferation by introducing appropriate target gene-expressing cells (preferably autologous cells) into a patient at a location sufficient to ameliorate the symptoms of disorders associated with osteotropism and in a sufficient number to effect such amelioration Can be made. Such cells may be recombinant cells or non-recombinant cells.

【０１４３】投与しようとする細胞が自己由来の細胞でない場合、それらは、導入した細胞
に対する宿主の免疫応答が起こるのを抑制する公知の方法を用いて投与できる。
例えば、該細胞は、成分が隣接する細胞外環境と交換されるようにはするが、導
入された細胞が宿主の免疫系により認識されないようにする封入形態で導入して
もよい。If the cells to be administered are not autologous, they can be administered using known methods that suppress the host immune response to the introduced cells.
For example, the cells may be introduced in encapsulated form, which allows the components to be exchanged with the adjacent extracellular environment, but which prevents the introduced cells from being recognized by the host's immune system.

【０１４４】更に、OSN調節領域の活性をモジュレートできる化合物、例えば上記のような
方法により同定されるものなどを、当業者に公知である標準的な技法を用いて投
与してもよい。In addition, compounds capable of modulating the activity of the OSN regulatory region, such as those identified by the methods described above, may be administered using standard techniques known to those of skill in the art.

【０１４５】5.5 医薬製剤および投与方法 OSN調節領域の活性または遺伝子産物の活性を改変させることが判明した化合
物は、患者に治療上有効な用量で投与して、石灰化している可能性がある腫瘍ま
たは組織細胞が関与する障害を治療または改善することができる。治療上有効と
は、そのような障害の症状の改善をもたらすのに十分な該化合物の量をいう。 5.5 Pharmaceutical Formulations and Methods of Administration Compounds found to modify OSN regulatory region activity or gene product activity are administered to patients in therapeutically effective doses to potentially calcified tumors. Alternatively, disorders involving tissue cells can be treated or ameliorated. Therapeutically effective refers to the amount of the compound sufficient to result in amelioration of symptoms of such disorders.

【０１４６】5.5.1 有効な用量そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えばLD₅₀（集団の50％に対す
る致死用量）およびED₅₀（集団の50％における治療上有効な用量）を測定するた
めの細胞培養または実験動物における標準的な製剤学的手順により測定できる。
有害作用と治療作用との用量比が治療指数であり、それはLD₅₀／ED₅₀の比として
表わすことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。有害な副作用を
示す化合物を用いることも可能であるが、未感染細胞に対する可能性のある損傷
を最低限に抑え、それにより副作用を低減するために、そのような化合物を罹患
組織の部位にターゲッティングする送達系を設計するよう注意を払わねばならな
い。 5.5.1 Effective Dose Toxicity and therapeutic efficacy of such compounds is measured, for example, by the LD ₅₀ (lethal dose to 50% of the population) and ED ₅₀ (therapeutically effective dose in 50% of the population). It can be measured by standard pharmaceutical procedures in cell culture or laboratory animals to
The dose ratio between adverse and therapeutic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ratio LD ₅₀ / ED ₅₀ . Compounds that exhibit large therapeutic indices are preferred. Although it is possible to use compounds that exhibit deleterious side effects, targeting such compounds to sites of diseased tissue in order to minimize potential damage to uninfected cells and thereby reduce side effects. Care must be taken to design a delivery system that does.

【０１４７】細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用の
ためのある範囲の投与量を処方するのに用いることができる。そのような化合物
の投与量は、好ましくは、毒性が殆どまたは全くない、ED₅₀を含むある循環濃度
範囲内である。投与量は、用いる剤形や利用する投与経路に応じて、この範囲内
で様々に変えることができる。本発明の方法において用いられるいずれの化合物
についても、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから見積もることが
できる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において測定したIC₅₀（すなわ
ち、症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範
囲を達成するように処方されればよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な
用量をより正確に決定するのに用いることができる。血漿中レベルは、例えば高
速液体クロマトグラフィーにより測定できる。The data obtained from cell culture assays and animal studies can be used in formulating a range of dosage for use in humans. The dosage of such compounds lies preferably within a range of circulating concentrations that include the ED ₅₀ with little or no toxicity. The dose can be variously changed within this range depending on the dosage form to be used and the administration route to be used. For any compound used in the method of the invention, the therapeutically effective dose can be estimated initially from cell culture assays. Doses may be formulated in animal models to achieve a circulating plasma concentration range that includes the IC ₅₀ (ie, the concentration of test compound that achieves half maximal inhibition of symptoms) measured in cell culture. Such information can be used to more accurately determine useful doses in humans. Levels in plasma can be measured, for example, by high performance liquid chromatography.

【０１４８】5.5.2 製剤および使用本発明に従って使用するための医薬組成物は、１種以上の生理学上許容される
担体または賦形剤を用いて慣用の方法で製剤化できる。 5.5.2 Formulation and Use Pharmaceutical compositions for use in accordance with the present invention can be formulated in a conventional manner with one or more physiologically acceptable carriers or excipients.

【０１４９】したがって、該化合物ならびにそれらの生理学上許容される塩および溶媒和化
合物は、吸入もしくはガス注入（insufflation）（口または鼻のいずれかを経由
する）による投与用、または経口、口腔内（buccal）、非経口もしくは直腸投与
用に製剤化できる。Thus, the compounds and their physiologically acceptable salts and solvates are for administration by inhalation or insufflation (either via the mouth or nose) or orally, buccally ( buccal), parenteral or rectal administration.

【０１５０】経口投与の場合、該医薬組成物は、例えば、慣用の手段により、結合剤［例え
ば、予備ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロ
キシプロピルメチルセルロース］、充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロースま
たはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タ
ルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、馬鈴薯デンプンまたはデンプングリコー
ル酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの製
薬上許容される賦形剤を用いて調製される錠剤またはカプセル剤の形態を取り得
る。錠剤は、当技術分野で公知の方法によりコーティングされていてもよい。経
口投与用の液体製剤は、例えば液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態を取っても
よいし、使用前に水または他の適切な溶媒で構成するための乾燥製品としてもよ
い。そのような液体製剤は、慣用の手段により、懸濁化剤（例えば、ソルビトー
ルシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシ
チンまたはアラビアゴム）、非水性溶媒（例えばアーモンド油、油性エステル、
エチルアルコールまたは分留植物性油）および保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安
息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの製薬上許容される添加
剤を用いて調製できる。該製剤はまた、適宜に、緩衝塩、矯味矯臭剤、着色剤お
よび甘味剤を含んでもよい。For oral administration, the pharmaceutical composition may be provided, for example, by conventional means with a binder [eg pregelatinized corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropylmethylcellulose], a filler (eg lactose, microcrystalline cellulose). Or a pharmaceutical agent such as calcium hydrogen phosphate), a lubricant (for example, magnesium stearate, talc or silica), a disintegrant (for example, potato starch or sodium starch glycolate), or a wetting agent (for example, sodium lauryl sulfate). It may take the form of tablets or capsules prepared with an acceptable excipient. The tablets may be coated by methods known in the art. Liquid preparations for oral administration may take the form of, for example, solutions, syrups or suspensions, or they may be a dry product for constitution with water or other suitable vehicle before use. Such liquid preparations may be formulated by conventional means with suspending agents (eg sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats), emulsifiers (eg lecithin or acacia), non-aqueous solvents (eg almond oil, oily). ester,
It can be prepared with pharmaceutically acceptable additives such as ethyl alcohol or fractionated vegetable oils) and preservatives (eg methyl or propyl p-hydroxybenzoate or sorbic acid). The formulations may also optionally contain buffer salts, flavoring agents, coloring agents and sweetening agents.

【０１５１】経口投与用の製剤は、活性化合物の制御放出をもたらすのに適するように処方
してもよい。Formulations for oral administration may be formulated to give controlled release of the active compound.

【０１５２】口腔内投与の場合、該組成物は、慣用の方法で処方された錠剤またはロゼンジ
の形態を取ることができる。For buccal administration, the composition may take the form of tablets or lozenges formulated in conventional manner.

【０１５３】吸入による投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は、加圧パック
または噴霧器からのエアゾールスプレー提示の形態で簡便に送達され、この場合
、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテト
ラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスなどの適切な噴射剤を用い
る。加圧エアゾールの場合、投与単位は、ある一定量を送達するためのバルブを
備えることにより決定できる。吸入またはガス注入において使用するための、該
化合物と適切な粉末基剤（例えば乳糖またはデンプン）との粉末混合物を含むカ
プセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製のもの）を処方してもよい。For administration by inhalation, the compounds for use according to the invention are conveniently delivered in the form of an aerosol spray presentation from pressurized packs or nebulizers, in which case eg dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichloro. Use a suitable propellant such as tetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. In the case of a pressurized aerosol the dosage unit can be determined by providing a valve to deliver a metered amount. Capsules and cartridges (eg of gelatin) containing a powder mixture of the compound and a suitable powder base (eg lactose or starch) for use in inhalation or insufflation may be formulated.

【０１５４】該化合物は、注射による（例えば、ボーラス注射や連続輸液による）非経口投
与用に処方できる。注射用の製剤は、例えばアンプルやマルチドース容器中での
単位剤形としてもよく、この場合、保存剤が添加される。該組成物は、油性また
は水性溶媒中で調製した懸濁剤、液剤または乳濁剤の形態を取ってもよいし、懸
濁剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤（formulatory agents）を含
んでもよい。あるいはまた、活性成分は、使用前に、例えば無菌の発熱物質不含
水などの適切な溶媒で構成するための粉末形態としてもよい。The compound may be formulated for parenteral administration by injection (eg, by bolus injection or continuous infusion). Formulations for injection may be in unit dosage form, eg in ampoules or in multi-dose containers, in which case preservatives are added. The compositions may take the form of suspensions, solutions or emulsions prepared in oily or aqueous solvents, or formulation agents such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents. ) May be included. Alternatively, the active ingredient may be in powder form for constitution with a suitable solvent, eg, sterile pyrogen-free water, before use.

【０１５５】また、該化合物は、例えばココア脂や他のグリセライドなどの慣用の坐剤用基
剤を含む、坐剤や停留性浣腸剤などの直腸用組成物に処方してもよい。The compounds may also be formulated in rectal compositions such as suppositories and retention enemas, including conventional suppository bases such as cocoa butter and other glycerides.

【０１５６】特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を治療が必要な領域に局所的に投与
することが望ましい場合がある。これは、例えば（限定しようとするものではな
いが）手術中の局所的輸液、例えば手術後に創傷用包帯と併用した局所的適用、
注射、カテーテル、坐剤、または移植片により達成でき、該移植片は多孔質性、
非多孔質性、またはゼラチン状の物質のものであり、例えばシラスティック（si
alastic）膜などの膜や繊維が挙げられる。１つの実施形態では、投与は、悪性
腫瘍または新生物形成もしくは前新生物形成組織の部位（または前方部位）への
直接の注射によるものとし得る。In certain embodiments, it may be desirable to administer the pharmaceutical compositions of the invention locally to the area in need of treatment. This is for example (but not intended to be limiting) local infusion during surgery, eg topical application in combination with a wound dressing after surgery,
Can be achieved by injection, catheter, suppository, or implant, which is porous,
Non-porous or gelatinous substances, such as silastic (si
alastic) membranes and fibers such as membranes. In one embodiment, administration may be by direct injection at the site (or anterior site) of the malignant tumor or neoplastic or preneoplastic tissue.

【０１５７】局所適用の場合、該化合物は、目的とする活性に基づいて、有効投与量が送達
されるように担体と組み合せることができる。For topical application, the compound may be combined with a carrier so as to deliver an effective dosage based on the desired activity.

【０１５８】これまで記載した製剤以外に、該化合物は、デポー製剤としても処方できる。
そのような長期作用性の製剤は、（例えば皮下または筋肉内の）埋め込みにより
、あるいは筋肉内注射により投与可能である。したがって、例えば、該化合物は
、適切な重合体性もしくは疎水性の物質と共に（例えば、許容される油中での乳
濁液として）、またはイオン交換樹脂と共に、あるいは僅かに可溶性の誘導体（
例えば僅かに可溶性の塩）として処方できる。In addition to the formulations described previously, the compounds may also be formulated as a depot preparation.
Such long acting formulations may be administered by implantation (for example subcutaneously or intramuscularly) or by intramuscular injection. Thus, for example, the compound may be combined with a suitable polymeric or hydrophobic material (eg, as an emulsion in an acceptable oil), or with an ion exchange resin, or a slightly soluble derivative (eg,
For example, it can be formulated as a slightly soluble salt).

【０１５９】該組成物は、それが望まれる場合には、活性成分を含む１以上の単位剤形を含
み得るパック内またはディスペンサー装置内に提供してもよい。このパックは、
金属箔もしくはプラスチック箔を含んでなる、例えば、ブリスターパックなどで
あってよい。このパックまたはディスペンサー装置には、投与のついての説明書
が同封されていてもよい。The composition, if desired, may be presented in a pack or dispenser device which may contain one or more unit dosage forms containing the active ingredient. This pack is
It may be, for example, a blister pack or the like comprising a metal foil or a plastic foil. The pack or dispenser device may be accompanied by instructions for administration.

【０１６０】６実施例：OSNプロモーター欠失構築物の構築 6.1 材料および方法 6.1.1 細胞および細胞培養物 LNCaP、C4-2、C4-2B、PC3、PC3M、P69、DU145、MG、MG63、9069E、ROSおよびW
H細胞を、５％FBSを加えたＴ培地中で維持した。トランスフェクション用として
、細胞をフェノールレッド不含無血清RPMI1640（Gibco BRL, MD）中で増殖させ
た。293細胞系はMicrobix Biosystems Inc.（Toronto, Ontario, Canada）から
購入し、10％ウシ胎児血清およびグルタミンを加えた最少イーグル培地（MEM）
（Gibco BRL）中で維持した。 6 Example: Construction of OSN promoter deletion constructs 6.1 Materials and methods 6.1.1 Cells and cell cultures LNCaP, C4-2, C4-2B, PC3, PC3M, P69, DU145, MG, MG63, 9069E, ROS and W
H cells were maintained in T medium supplemented with 5% FBS. For transfection, cells were grown in serum red RPMI1640 without phenol red (Gibco BRL, MD). The 293 cell line was purchased from Microbix Biosystems Inc. (Toronto, Ontario, Canada) and minimal Eagle Medium (MEM) supplemented with 10% fetal bovine serum and glutamine.
(Gibco BRL).

【０１６１】6.1.2 OSNプロモーター／ルシフェラーゼ構築物の構築全てのプロモーターは、TOPO TAクローニングシステム（Invitrogene, CA）に
より作製し、続いてポリリンカー内の適切な制限部位を用いて消化して、ホタル
・ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域を含むベクターpGL3-basic（Promega）に
挿入できるようにした。OSN2.3、OSN1.5、OSN1.1およびOSN0.2プロモーター構築
物は、図１に示すプライマー配列P1、P2、P3およびP4を用いて調製した。−522
から始まる追加のOSNプロモーター欠失構築物を調製した。これらの構築物は、G
GAボックス１と２との間のスペーサーの欠失も含んでおり、OSN配列の−522〜＋
39、−522〜＋62および−522〜＋73を含んでいる（図１および11を参照）。OSN
配列の−522から始まるこれらの構築物を作製するために、以下のプライマーを
利用してPCRを行った：522-N：（5’ACTAGTAGCAGCTTGTCTTGTC3’）、spdel-C（5
’CTTCTCCCCTGTCTCTGTCTT3’）：ならびに、hON-522I、hON-522EおよびhON-Hafn
erを構築するためにそれぞれ下流プライマー：イントロン-C：(5’TACCTCAGTGGC
AGGCAGGCAG3’)、エキソン-C：（5’CAGGCAGGCAGGCGGCAG3’）およびハフナー-C
：（5’GCGCGCTCTCCGGGCAGTCTG3’）と組み合せたspdel-N：（5’AAGACAGAGACAG
GGGAGAAG3’）；ならびに、鋳型としてDU145細胞から単離したゲノムDNA。PCRに
より作製したDNA断片を含む全ての構築物は、シーケンシングにより確認した。 6.1.2 Construction of OSN Promoter / Luciferase Constructs All promoters were generated by the TOPO TA cloning system (Invitrogene, CA), followed by digestion with the appropriate restriction sites within the polylinker to produce the firefly It was made possible to insert into the vector pGL3-basic (Promega) containing the coding region of the luciferase gene. The OSN2.3, OSN1.5, OSN1.1 and OSN0.2 promoter constructs were prepared using the primer sequences P1, P2, P3 and P4 shown in FIG. −522
Additional OSN promoter deletion constructs were prepared starting with. These constructs are G
It also contains a deletion of the spacer between GA boxes 1 and 2 and the OSN sequence from -522 to +.
39, -522 to +62 and -522 to +73 (see Figures 1 and 11). OSN
PCR was performed using the following primers to generate these constructs starting at -522 of the sequence: 522-N: (5'ACTAGTAGCAGCTTGTCTTGTC3 '), spdel-C (5
'CTTCTCCCCTGTCTCTGTCTT3'): and hON-522I, hON-522E and hON-Hafn
downstream primer: intron-C: (5'TACCTCAGTGGC
AGGCAGGCAG3 '), Exon-C: (5'CAGGCAGGCAGGCGGCAG3') and Hafner-C
: Spdel-N in combination with (5'GCGCGCTCTCCGGGCAGTCTG3 '): (5'AAGACAGAGACAG
GGGAGAAG3 '); and genomic DNA isolated from DU145 cells as a template. All constructs containing DNA fragments generated by PCR were confirmed by sequencing.

【０１６２】6.2 結果 P1、P2、P3およびP4と命名した４組のプライマーセット（プライマーの配列お
よび位置については図１を参照）を調製した。図１は、OSN調節領域の−1409か
ら＋904までを示す。また図１には、GGAボックス-1、GGAボックス-2、およびエ
キソン１とイントロン１との間の境界も示してある。同様に、図11は、GGAボッ
クス1と２との間のスペーサが欠落しているヒト・オステオネクチンプロモータ
ー配列の−522から＋62までを示す。ヒト前立腺癌細胞系DU-145から抽出したゲ
ノムDNAを鋳型として用いて、PCR反応を行った。このPCR産物をサブクローニン
グし、配列決定した。P1プライマーとP4プライマーからは2.3kbのOSNプロモータ
ー断片（OSN-2.3）が生じた。P2プライマーとP4プライマーからは1.1kbのプロモ
ーター断片（OSN-1.1）を生じたが、P2とP3からは200bpのプロモーター断片（OS
N-0.2）が生じた。最後に、P3プライマーとP4プライマーからは、1.5kbのプロモ
ーター断片（OSN-1.5）が生じた。これらのPCR産物を配列決定して、それらを同
定した。図２は、OSNプロモーター仲介ルシフェラーゼプラスミドを構築するの
に用いた方法の概略図である。図７は、種々の欠失構築物を作製するのに用いた
OSN配列の概略図である。 6.2 Results Four primer sets designated P1, P2, P3 and P4 (see Figure 1 for primer sequences and positions) were prepared. Figure 1 shows the OSN regulatory region from -1409 to +904. Also shown in FIG. 1 are the GGA box-1, GGA box-2, and the boundary between exon 1 and intron 1. Similarly, FIG. 11 shows the human osteonectin promoter sequences −522 to +62 lacking the spacer between GGA boxes 1 and 2. PCR reaction was performed using genomic DNA extracted from human prostate cancer cell line DU-145 as template. The PCR product was subcloned and sequenced. A 2.3 kb OSN promoter fragment (OSN-2.3) was generated from the P1 and P4 primers. A 1.1 kb promoter fragment (OSN-1.1) was generated from P2 and P4 primers, but a 200 bp promoter fragment (OSN-1.1) from P2 and P3.
N-0.2) occurred. Finally, the P3 and P4 primers yielded a 1.5 kb promoter fragment (OSN-1.5). These PCR products were sequenced to identify them. FIG. 2 is a schematic of the method used to construct the OSN promoter-mediated luciferase plasmid. Figure 7 was used to generate various deletion constructs
It is the schematic of the OSN arrangement | sequence.

【０１６３】７実施例：OSNプロモーター活性 7.1 材料および方法 7.1.1 一過性DNAトランスフェクション ROS、LNCaP、C4-2およびC4-2B細胞は、トランスフェクションの２日前に、６
ウェルプレートに3.3×10⁵個／ウェルで接種した。PC3、PC3M、DU145、MG63、90
69EおよびWH細胞は、トランスフェクションの１日前に、６ウェルプレートに２
×10⁵個／ウェルでプレートした。プラスミドDNAは、DOTAP試薬により供給元の
プロトコール（Boehringer Mannheim, IN）に従って細胞に導入した。簡単に説
明すると、培地を１mlの無血清フェノールレッド不含RPMI1640培地と交換し、細
胞を、３μgのDNAおよび10μlのDOTAPを含有するDOTAP-DNA混合物と共に６時間
インキュベートした。次に、培地を通常の増殖培地と交換した。トランスフェク
ション効率についての内部対照として、細胞をレポーター遺伝子β-ガラクトシ
ダーゼをコードするベクターpCMV-β-galと共に５：１のモル比で共トランスフ
ェクトした。 7 Example: OSN Promoter Activity 7.1 Materials and Methods 7.1.1 Transient DNA Transfection ROS, LNCaP, C4-2 and C4-2B cells were treated 6 days 2 days prior to transfection.
The well plate was inoculated with 3.3 × 10 ⁵ cells / well. PC3, PC3M, DU145, MG63, 90
69E and WH cells were plated in 6-well plates one day before transfection.
Plated at 10 ⁵ cells / well. Plasmid DNA was introduced into cells with DOTAP reagent according to the supplier's protocol (Boehringer Mannheim, IN). Briefly, the medium was replaced with 1 ml RPMI1640 medium without serum red and the cells were incubated with a DOTAP-DNA mixture containing 3 μg DNA and 10 μl DOTAP for 6 hours. The medium was then replaced with normal growth medium. As an internal control for transfection efficiency, cells were co-transfected with the vector pCMV-β-gal encoding the reporter gene β-galactosidase at a 5: 1 molar ratio.

【０１６４】7.1.2 ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼアッセイトランスフェクションの48時間後に細胞を回収し、Promega（Madison, USA）
から購入したルシフェラーゼレポーター遺伝子システムに従って300μlの１×溶
解緩衝液に再懸濁した。細胞溶解物を数秒間ボルテックス処理し、３分間遠心分
離した。ルシフェラーゼ活性アッセイについては、20μlの上清を100μlのルシ
フェラーゼ基質（Promega, WI）と混合し、ルミノメーター（Monolight 2010, A
nalytical luminescence Laboratory, MD）によりルシフェラーゼ活性を測定し
た。β-gal活性アッセイについては、100μlの上清を同容量の２×β-gal基質（
Promega, WI）と混合し、次に37℃で15〜30分間インキュベートした。β-gal活
性は、マイクロプレートリーダーにより405nmの波長にて測定した。ルシフェラ
ーゼ活性は、β-ガラクトシダーゼ活性に対して算出した。基準対照としては、
基本的なプロモーターベクターpGL3-TATAを用いた。各構築物について、少なく
とも３回の独立したトランスフェクションを２連で実施した。 7.1.2 Luciferase and β-Galactosidase Assays Cells were harvested 48 hours post-transfection and Promega (Madison, USA).
Resuspended in 300 μl of 1 × lysis buffer according to the luciferase reporter gene system purchased from The cell lysate was vortexed for a few seconds and centrifuged for 3 minutes. For the luciferase activity assay, mix 20 μl of supernatant with 100 μl of luciferase substrate (Promega, WI) and mix with a luminometer (Monolight 2010, A).
Luciferase activity was measured by the Nalytical luminescence Laboratory, MD. For the β-gal activity assay, 100 μl of supernatant was added to an equal volume of 2 × β-gal substrate (
Promega, WI) and then incubated at 37 ° C for 15-30 minutes. β-gal activity was measured with a microplate reader at a wavelength of 405 nm. Luciferase activity was calculated relative to β-galactosidase activity. As a reference control,
The basic promoter vector pGL3-TATA was used. At least 3 independent transfections were performed in duplicate for each construct.

【０１６５】7.2 結果 OSN-プロモーター欠失構築物の活性は、ポジティブ対照となる骨芽細胞MG（MG
-63）を用いて、前立腺のヒト上皮細胞系（LNCaP、C4-2、C4-2B、PC-3、P69）お
よび前立腺以外のヒト上皮細胞系（WH、MG）の両者において分析した（図３）。
更に、相対的ルシフェラーゼ活性を確認するためのポジティブ対照としてヒトOC
プロモーター（3.9kb）仲介ルシフェラーゼ構築物の活性を用いた。図３から、O
SN-0.2、OSN-1.1およびOSN-2.3と比較した場合に、OSN-1.5が最も高い活性を発
現したことが示される。OSN-1.5プロモーターにより仲介される高いルシフェラ
ーゼ活性は、ウエスタンブロットにより分析したOSNタンパク質発現の定常状態
レベルと相関すると考えられた（図４）。これらの結果から、Hafnerら, Matrix
Bio. 14:733, 1995により得られた先の知見が更に展開されたことになり、細胞
特異的活性はGGAボックス１内には含まれていなかった（OSNプロモーター中での
GGAボックスの位置については図１を参照されたい）。図８には、WH、PC3および
MG63を含む種々の癌細胞系において、hONHafnerおよびhON522Iと比較した場合に
、hON522Eが最も高いRLA（相対的ルシフェラーゼ活性）を有することが示されて
いる。図９には更に、各種の前立腺細胞系におけるhON522E活性の比較が示され
ており、PC3M細胞が最も高い活性を有している。 7.2 Results The activity of the OSN-promoter deletion construct was compared to the osteoblast MG (MG
-63) was used to analyze both human prostate epithelial cell lines (LNCaP, C4-2, C4-2B, PC-3, P69) and non-prostate human epithelial cell lines (WH, MG) (Fig. 3).
In addition, human OC was used as a positive control to confirm relative luciferase activity.
The activity of the promoter (3.9 kb) mediated luciferase construct was used. From Figure 3, O
It is shown that OSN-1.5 expressed the highest activity when compared to SN-0.2, OSN-1.1 and OSN-2.3. The high luciferase activity mediated by the OSN-1.5 promoter was thought to correlate with steady-state levels of OSN protein expression analyzed by Western blot (Figure 4). From these results, Hafner et al., Matrix
The previous findings obtained by Bio. 14: 733, 1995 were further developed, and cell-specific activity was not contained within GGA box 1 (in the OSN promoter).
See Figure 1 for the location of the GGA box). In Figure 8, WH, PC3 and
It has been shown that hON522E has the highest RLA (relative luciferase activity) when compared to hONHafner and hON522I in various cancer cell lines including MG63. FIG. 9 further shows a comparison of hON522E activity in various prostate cell lines, with PC3M cells having the highest activity.

【０１６６】本発明の新規な態様は、イントロン１を取り除いた際、およびOSNプロモータ
ーをGGAボックス１からエキソン１全体を含むように伸長することにより、細胞
型に特異的な様式でのOSNの発現が見られたことである（図１）。これらのデー
タから、OSNプロモーター内に存在する抑制性cisエレメント（例えばイントロン
１）は、OSNプロモーター活性および組織特異性を確認するのに用い得る特異性
を増大させるために取り除くことでき、且つ治療向上のために癌および骨疾患に
適用できることが実証される。A novel aspect of the present invention is the expression of OSN in a cell-type specific manner upon removal of intron 1 and by extending the OSN promoter from GGA box 1 to include the entire exon 1. Was observed (Fig. 1). From these data, repressive cis elements present in the OSN promoter (eg intron 1) can be removed to increase OSN promoter activity and specificity that can be used to confirm tissue specificity, and improve treatment. It is demonstrated to be applicable to cancer and bone diseases.

【０１６７】８実施例：種々の細胞系および前立腺癌組織におけるOSN mRNAの測定 8.1 材料および方法 8.1.1 ヒトオステオネクチン発現のRT-PCR分析細胞系および前立腺癌組織から、RNAzol B試薬（TEL-Test, INC, TX）を用い
て製造業者の説明書に従ってRNAを抽出した。１μgの全RNAを用いて、ランダム
プライマー（Perkin Elmer）およびMMLV逆転写酵素（Gibco BRL）を用いて全量2
0μlとして、第１鎖のcDNAを合成した。この反応は、42℃で１時間行った。この
RT反応物2.5μlを、ヒトオステオネクチン特異的プライマー（5’TCCACCACCCTGT
TGCTGT3’、センス；および5’CTCCAGGCGCTTCTCATT3’、アンチセンス）または
グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）特異的プライマ
ー（5’ACCACAGTCCATGCCATCA3’、センス；5’TCCACCACCCTGTTGCTGT3’、アンチ
センス）の各対25ngを含むように調整し、追加の緩衝液を添加して全容量を25μ
lにした。次に、PCRを、オステオネクチンの発現を検出するために50サイクル（
94℃、30秒；55℃、30秒；72℃、１分）、内部対照としてのGAPDHの発現を検出
するために25サイクル行った。最後に、増幅した産物を1.5％アガロースゲルで
分離した。 8 Example: Measurement of OSN mRNA in various cell lines and prostate cancer tissues 8.1 Materials and methods 8.1.1 RT-PCR analysis of human osteonectin expression From cell lines and prostate cancer tissues RNAzol B reagent (TEL- RNA was extracted using Test, INC, TX) according to the manufacturer's instructions. 1 μg of total RNA was used for a total of 2 using random primers (Perkin Elmer) and MMLV reverse transcriptase (Gibco BRL).
First strand cDNA was synthesized with 0 μl. The reaction was carried out at 42 ° C for 1 hour. this
2.5 μl of the RT reaction was added to the human osteonectin-specific primer (5'TCCACCACCCTGT
TGCTGT3 ', sense; and 5'CTCCAGGCGCTTCTCATT3', antisense) or glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) -specific primer (5'ACCACAGTCCATGCCATCA3 ', sense; 5'TCCACCACCCTGTTGCTGT3', antisense) for each 25ng Adjust to contain and add additional buffer to bring total volume to 25 μ
set to l. Next, PCR was performed for 50 cycles (to detect the expression of osteonectin.
94 ° C., 30 seconds; 55 ° C., 30 seconds; 72 ° C., 1 minute), 25 cycles were performed to detect the expression of GAPDH as an internal control. Finally, the amplified products were separated on a 1.5% agarose gel.

【０１６８】8.2 結果図５に、LNCaP、C4-2、C4-2B、DU145、PC3、PC3MおよびMG63を含む種々の前立
腺癌細胞系におけるOSN発現を示す。また、内部対照としてGAPDH発現もモニター
した。図６には、原発性前立腺癌組織におけるOSN発現を示す。検出可能なOSN m
RNAが明らかになったサンプルは、レーン１、２および５〜７である。ここでも
また、図５の場合と同様に、内部対照としてGAPDH発現をモニターした。 8.2 Results FIG. 5 shows OSN expression in various prostate cancer cell lines including LNCaP, C4-2, C4-2B, DU145, PC3, PC3M and MG63. GAPDH expression was also monitored as an internal control. FIG. 6 shows OSN expression in primary prostate cancer tissue. Detectable OSN m
The RNA revealed samples are lanes 1, 2 and 5-7. Again, GAPDH expression was monitored as an internal control, as in FIG.

【０１６９】９実施例：Ad-522E-TKを用いたin vitro細胞障害性アッセイ 9.1 材料および方法 9.1.1 組換えAd-522E-TKの構築および生産 Ad-522E-TKアデノウイルス（５型）を標準的なプロトコールに従って構築し大
量生産した。簡単に説明すると、発現カセットをAd5アデノウイルスシャトルベ
クターpΔElsp1BのE1A欠失領域に挿入することにより、ヒト・オステオネクチン
プロモーターと単純ヘルペスウイルスTK遺伝子とを含むプラスミドp522E-TKを構
築した。複製欠損組換えAd522E-TKアデノウイルスは、293細胞中で、標準的なリ
ン酸カルシウム沈降法を用いて、これらの細胞を発現シャトルプラスミドおよび
環状Adゲノムプラスミド（pJM17）の両者と共トランスフェクトすることにより
作製した。簡単に説明すると、低次継代（40未満）の293細胞を60mm径のシャー
レに接種して、使用時に約70〜80％コンフルエントになるようにした。20μgの
シャトルプラスミドDNAおよび40μｌのAdゲノムプラスミドを、10μlの２mg/ml
サケ***キャリアDNAを含むHEBS（21mM HEPES、0.137M NaCl、５mM KCl、0.7mM
Na₂HPO₄、5.5mMグルコース、pH 7.1）２ml中で、試験管をタッピングすることに
より混合し、次に穏やかに攪拌しながら100μlの2.5M CaCl₂をゆっくり滴下した
。室温で15〜30分にわたってDNA沈殿物を形成させた。次に、このDNA懸濁液0.5m
lを、増殖培地を取り除かずに細胞の各シャーレに添加した。一夜培養した後、
増殖培地を10mlの上層物（MEM＋0.5％アガロース）と交換した。アガロースが固
化したら、細胞を37℃で最長10〜12日間インキュベートして、プラークを形成さ
せた。GrahamおよびPrevecの方法（Molecular Biotechnology 3:207, 1995）に
従ってプラークを精製することにより、Ad-522E-TKウイルスを得た。プラークを
拾い、トランスフェクト培養物から単離し、293細胞を感染させた。感染の36〜4
8時間後に細胞を回収し、ペレット化し、PBSに再懸濁し、溶解させた。細胞溶解
物中のウイルスをCsCl₂勾配遠心分離により精製した。透析した後、濃化したウ
イルスを、DNAの光学的密度測定により求めた粒子数により評価し、実験まで−8
0℃で保存した。 9 Example: In vitro cytotoxicity assay using Ad-522E-TK 9.1 Materials and methods 9.1.1 Construction and production of recombinant Ad-522E-TK Ad-522E-TK adenovirus (type 5) Was constructed according to standard protocols and was mass produced. Briefly, a plasmid p522E-TK containing the human osteonectin promoter and herpes simplex virus TK gene was constructed by inserting the expression cassette into the E1A deletion region of the Ad5 adenovirus shuttle vector pΔElsp1B. The replication-defective recombinant Ad522E-TK adenovirus was expressed in 293 cells by cotransfecting these cells with both the expression shuttle plasmid and the circular Ad genomic plasmid (pJM17) using standard calcium phosphate precipitation methods. It was made. Briefly, low passage (less than 40) 293 cells were inoculated into 60 mm diameter Petri dishes to be about 70-80% confluent in use. 20 μg of shuttle plasmid DNA and 40 μl of Ad genomic plasmid were added to 10 μl of 2 mg / ml.
HEBS containing salmon sperm carrier DNA (21mM HEPES, 0.137M NaCl, 5mM KCl, 0.7mM
The tubes were mixed by tapping in ₂ ml of Na ₂ HPO ₄ , 5.5 mM glucose, pH 7.1), then 100 μl of 2.5 M CaCl ₂ was slowly added drop-wise with gentle stirring. A DNA precipitate was formed at room temperature for 15-30 minutes. Then 0.5m of this DNA suspension
l was added to each dish of cells without removing the growth medium. After culturing overnight,
Growth medium was replaced with 10 ml of supernatant (MEM + 0.5% agarose). Once the agarose solidified, cells were incubated at 37 ° C for up to 10-12 days to allow plaque formation. Ad-522E-TK virus was obtained by purifying plaques according to the method of Graham and Prevec (Molecular Biotechnology 3: 207, 1995). Plaques were picked, isolated from transfected cultures and infected 293 cells. 36 to 4 of infection
After 8 hours, cells were harvested, pelleted, resuspended in PBS and lysed. Virus in cell lysates was purified by CsCl ₂ gradient centrifugation. After dialysis, the concentrated virus was evaluated by the number of particles obtained by optical density measurement of DNA,
Stored at 0 ° C.

【０１７０】9.1.2 Ad-522E-TKおよびGCVで誘導したin vitroの細胞障害性 PC3M細胞およびMG63細胞を、24ウェルプレートに２×10⁴個／ウェルの密度で
接種した。24時間後、細胞をPBSまたはm.o.iが増大しているAd-522E-TKを１mlの
増殖培地に加えたもので感染させた。一夜感染させた後、ウイルスを取り除き、
細胞を０または10μg/mlのGCVを含有する新しい培地中で更に５日間インキュベ
ートした。２連のプレートを固定し、クリスタルバイオレットで染色した。 9.1.2 Ad-522E-TK and GCV-induced in vitro cytotoxic PC3M cells and MG63 cells were seeded in 24-well plates at a density of 2 × 10 ⁴ cells / well. Twenty-four hours later, cells were infected with PBS or Ad-522E-TK with increasing moi added to 1 ml of growth medium. After infecting overnight, remove the virus,
Cells were incubated for an additional 5 days in fresh medium containing 0 or 10 μg / ml GCV. Duplicate plates were fixed and stained with crystal violet.

【０１７１】9.2 結果図10Aには、ウイルスおよびGCVを用いたPC3M細胞ならびにGCVを用いなかった
該細胞が増殖しなかったことが示されている。同様に、図10Bには、MG-63細胞系
を用いた結果が示されている。PC3Mを用いた場合の結果と同様に、ウイルスとGC
Vとで処理した細胞は、対照群の細胞（GCVなし）ほど増殖しなかった。 9.2 Results FIG. 10A shows that PC3M cells with virus and GCV and cells without GCV did not grow. Similarly, FIG. 10B shows the results using the MG-63 cell line. Similar to the results with PC3M, virus and GC
Cells treated with V did not grow as well as cells in the control group (no GCV).

【０１７２】10 実施例: In vivoにおける腫瘍増殖の抑制 10.1 材料および方法 10.1.1 組換えAd-522E-TKのin vivo分析 5〜6週齢の雄の胸腺欠損nu/nuマウス(Harlan Co., TX)の両側の脇腹に、5×10 ⁵ 個のPC3M細胞を含む50μl PBSを皮下接種した。腫瘍が触知可能になったときに
(直径3〜4mm)、動物をランダムに次の4つの実験グループに割り当てた。グルー
プ1: PBS処理、グループ2: GCVのみ、グループ3: Ad-522E-TK＋PBS、およびグル
ープ4: Ad-522E-TK＋GCV。8、11および14日目に、Ad-522E-TK (2×10⁹ pfu)を含
むPBS-10%グリセロール50μlを腫瘍内に注射した。2週間にわたり40mg/kg体重の
用量で100μlのGCVを腹腔内注射により毎日投与した。ノギスを用いて二次元腫
瘍測定を毎週少なくとも1回行い、回転楕円体の単純な式(l×w²×0.5236)を用い
て腫瘍体積を計算した。Ko, S.C.ら, Hum. Gene Ther., 7: 1683-1691, 1996。[0172]10 Example: In vivo inhibition of tumor growth 10.1 Materials and methods 10.1.1 In vivo analysis of recombinant Ad-522E-TK 5-6 week old male athymic nu / nu mice (Harlan Co., TX) were flanked with 5 x 10 ^Five 50 μl PBS containing PC3M cells were subcutaneously inoculated. When the tumor becomes palpable
(3-4 mm in diameter), animals were randomly assigned to the following 4 experimental groups. glue
Group 1: PBS treatment, Group 2: GCV only, Group 3: Ad-522E-TK + PBS, and group
Group 4: Ad-522E-TK + GCV. On days 8, 11 and 14, Ad-522E-TK (2 × 10⁹ pfu)
50 μl of PBS-10% glycerol was injected intratumorally. 40 mg / kg body weight over 2 weeks
A dose of 100 μl GCV was administered daily by intraperitoneal injection. Two-dimensional tumor using calipers
The ulcer measurement is performed at least once a week and the simple spheroidal formula (l × w²X 0.5236)
Tumor volume was calculated by Ko, S.C. et al., Hum. Gene Ther., 7: 1683-1691, 1996.

【０１７３】10.2 結果図12に示されているデータから分かるように、ウイルス＋プロドラッグで治療
したグループは21日間の実験期間にわたり最小の腫瘍増殖を示し、一方、3つの
対照グループは腫瘍増殖がかなり大きかった。したがって、Ad-522E-TKウイルス
ベクターは、in vivoにおいて、石灰化の可能性がある腫瘍を改善および／また
は治療するのに有効であることがこのデータから分かる。 10.2 Results As can be seen from the data shown in Figure 12, the virus + prodrug treated group showed minimal tumor growth over the 21 day experimental period, while the three control groups showed no tumor growth. It was quite big. Thus, the data show that the Ad-522E-TK viral vector is effective in ameliorating and / or treating potentially calcifying tumors in vivo.

【０１７４】10.3 考察予想外なことに、OSNプロモーター駆動型遺伝子は、感受性骨指向性腫瘍およ
び骨芽細胞系列の細胞に感染させた場合、例えば、骨肉腫(ROS、MG63、Saos-2)
、前立腺癌(LNCaP、C4-2、C4-2B4 PC-3 PC3M、Du-145、ARCaP)、結腸癌(Lovo)、
肺癌(A547)、脳癌(U-87)、および乳癌(MCF-7)に感染させた場合、非常に高レベ
ルのレポーター遺伝子を発現することが本発明により示される。したがって、公
知の送達ベクターと組み合わせると、例えば、限定されるものではないがAd-OSN
-TKと組み合わせると、選択された毒性または治療性の遺伝子が高レベルで効率
よく発現されることが同様に期待される。さらに、本発明から分かるように、Ad
-OSN-TK系と組み合わせてGCVのような好適なプロドラッグを添加すると、上記の
骨指向性腫瘍およびそれらに関連した骨芽細胞支持間質の死滅性、抑制性および
細胞傷害性が影響を受けるであろう。OSNは、主として、無機質化能を有する十
分に分化した骨芽細胞または組織または腫瘍で発現され、しかも本発明から明ら
かなように、OSNプロモーターは、レポーター遺伝子、治療用遺伝子または毒性
遺伝子のいずれかの選択された遺伝子の効率的な発現を駆動することができるの
で、予想外なことに、OSNプロモーター構築物を用いると、周囲の正常組織また
は非骨芽系列もしくは非破骨系列の細胞に著しい損傷を与えることなく、特定の
骨指向性腫瘍(骨肉腫、前立腺癌など)の増殖を抑制することのでき、さらに、全
身的に適用した場合、腫瘍増殖に対して依然として所望の破壊効果を示しつつ、
不適切な組織の破壊を防止することが可能である本質的に腫瘍特異的な治療を行
えることが本発明から教示される。さらに、OSNプロモーター駆動型治療用遺伝
子治療は、サイトメガロウイルス(CMV)のような一般的なプロモーターやラウス
肉腫ウイルス(RSV)の末端反復配列プロモーターにより治療用遺伝子発現が駆動
される骨指向性腫瘍の従来の遺伝子治療よりも優れている。なぜなら、一般的な
プロモーターは特異的標的腫瘍を識別することができないため、正常細胞中での
毒性遺伝子の発現により非選択組織に不適切な損傷を引き起こしうるからである
。 10.3 DISCUSSION Unexpectedly, OSN promoter-driven genes, when infected with susceptible osteotropic tumors and cells of the osteoblast lineage, eg, osteosarcoma (ROS, MG63, Saos-2).
, Prostate cancer (LNCaP, C4-2, C4-2B4 PC-3 PC3M, Du-145, ARCaP), colon cancer (Lovo),
The present invention shows that when infected with lung cancer (A547), brain cancer (U-87), and breast cancer (MCF-7), very high levels of reporter gene are expressed. Thus, in combination with known delivery vectors, for example, but not limited to Ad-OSN.
In combination with -TK, high levels of efficient expression of selected toxic or therapeutic genes are likewise expected. Further, as can be seen from the present invention, Ad
-The addition of suitable prodrugs such as GCV in combination with the -OSN-TK system has the effect of killing, suppressing and cytotoxicity of the above osteotropic tumors and their associated osteoblast supporting stroma. Will receive. OSN is primarily expressed in well-differentiated osteoblasts or tissues or tumors that have the ability to mineralize, and as is apparent from the present invention, the OSN promoter can be either a reporter gene, a therapeutic gene or a toxic gene. Unexpectedly, the OSN promoter construct was used to drive the efficient expression of selected genes in cells of the plant, resulting in significant damage to surrounding normal tissues or cells of non-osteoblastic or non-osteoclastic lineage. It is possible to suppress the growth of specific osteotrophic tumors (osteosarcoma, prostate cancer, etc.) without further administration, and furthermore, when applied systemically, it still shows the desired destructive effect on tumor growth. ,
It is taught by the present invention that an essentially tumor-specific treatment can be performed that is capable of preventing inappropriate tissue destruction. Furthermore, OSN promoter-driven therapeutic gene therapy is a bone-directed tumor in which therapeutic gene expression is driven by a general promoter such as cytomegalovirus (CMV) or the terminal repeat sequence promoter of Rous sarcoma virus (RSV). Better than traditional gene therapy. Because common promoters cannot discriminate specific target tumors, expression of toxic genes in normal cells can cause inappropriate damage to non-selected tissues.

【０１７５】先に述べたように、OSNプロモーター駆動型遺伝子治療の1つの治療用途では、
骨格に転移する能力を有する癌を標的にする。骨への悪性細胞補充の1つの機構
によると、骨芽細胞は、前立腺癌や乳癌のような骨指向性腫瘍の増殖、接着、お
よび移行を刺激することのできる産物を合成および分泌する可能性があり、した
がって、外来性腫瘍上皮(癌)と支持性骨間質との相互の関係により、腫瘍増殖を
促進するのに適した環境(土壌)が提供される。また、前立腺腫瘍細胞または胸部
腫瘍細胞の増殖および移行は、それ自体、骨転移部位で骨芽細胞または破骨細胞
の増殖を刺激して罹患した患者の骨格中で骨芽性(例えば、前立腺癌)または破骨
性(例えば、乳癌)の表現型を優先的に誘導するパラクリン増殖因子を分泌する可
能性がある。腫瘍細胞の増殖は周囲の間質と密接な関係があり、特定の腫瘍(前
立腺癌、骨肉腫、乳癌など)と骨間質(骨芽細胞または破骨細胞)との相互作用が
存在するので、腫瘍、それが転移した腫瘍および支持間質を標的とするOSNプロ
モーターベースの遺伝子治療を開発することにより、それらの腫瘍を患った患者
に新しい特異性の高い遺伝子治療様式がもたらされることになる。実際に、OSN
発現は、他の真正骨芽細胞特異的遺伝子によるオルテオカルシン発現よりもさら
に顕著である。最も一般的にはAd-OSN-TKの形態で行われるOSN駆動型毒性遺伝子
治療は、次のような様々な治療上の意味をもつ。a) OSNプロモーター駆動型遺伝
子治療（Ad−OSN−TK）は、骨肉腫や前立腺癌に対する毒性化合物の発現に影響
を及ぼすとともに、特定の骨指向性腫瘍の骨転移沈着物の生存を維持するのに必
要となりうる骨芽細胞を根絶させる。さらに、この治療により、正常骨芽細胞の
増殖はいくらか阻止される恐れがあるが、OSNの発現は非常に特異的であるので
このことは問題にならず、多種多様な組織において毒性化合物の発現により宿主
が過度に害を受けることはないはずである。b) OSNプロモーター駆動型遺伝子を
適用すると、多くの石灰化した腫瘍において治療用標的遺伝子を高レベルで発現
することができ、これらの腫瘍の一次病巣および周囲の支持間質に関連したその
転移沈着物を根絶させる理にかなった方法の選択が可能になる。c) 適切なビヒ
クルと組み合わせたOSNプロモーター駆動型遺伝子治療は、腫瘍の苦痛を低減さ
せたり、様々な罹患しやすい骨指向性のヒトまたは真核生物の腫瘍に関連した局
所性および転移性の沈着の発生を低減させたりするために、従来の化学療法、外
科手術または放射線療法と組み合わせて使用することができる。d) OSNプロモー
ター駆動型療法で腫瘍細胞を死滅させた後に残存する骨芽細胞および腫瘍細胞に
対して、長期間持続する抗腫瘍免疫性を設定することが可能である。e) OSNプロ
モーター駆動型構築物は、BPHまたは動脈硬化症のような良性疾患を治療するた
めの治療用遺伝子の送達および発現に使用することが可能であるとともに、老化
や退行の過程で生じた損傷を修復すべく、重要な増殖および分化に関連した遺伝
子、例えば、増殖因子、増殖因子受容体、骨形態形成タンパク質などに対する遺
伝子の発現に使用することも可能である。f) OSNプロモーター駆動型治療は、特
定の適用用途に合わせて増強された所望の効果を発揮させる種々の化合物により
モジュレートすることができる。As mentioned above, one therapeutic application of OSN promoter driven gene therapy is:
Target cancers that have the ability to metastasize to the skeleton. Osteoblasts may synthesize and secrete products that can stimulate growth, adhesion, and migration of osteotropic tumors such as prostate and breast cancer, according to one mechanism of malignant cell recruitment to bone. Thus, the interrelationship between foreign tumor epithelium (cancer) and supporting bone stroma provides a suitable environment (soil) for promoting tumor growth. In addition, the proliferation and migration of prostate or breast tumor cells themselves stimulate osteoblast or osteoclast proliferation at the site of bone metastasis to induce osteoblastic (e.g., prostate cancer) in the affected patient's skeleton. ) Or paracrine growth factors that preferentially induce an osteoclast (eg breast cancer) phenotype. The growth of tumor cells is closely related to the surrounding stroma, and there is an interaction between certain tumors (prostate cancer, osteosarcoma, breast cancer, etc.) and bone stroma (osteoblasts or osteoclasts). , OSN promoter-based gene therapy targeting tumors, their metastasized tumors and supporting stroma will provide patients with these tumors with new and highly specific gene therapy modalities . In fact, OSN
Expression is even more pronounced than that of orteocalcin expression by other osteoblast-specific genes. OSN-driven toxic gene therapy, most commonly in the form of Ad-OSN-TK, has a variety of therapeutic implications: a) OSN promoter-driven gene therapy (Ad-OSN-TK) affects the expression of toxic compounds against osteosarcoma and prostate cancer and maintains the survival of bone metastatic deposits of certain osteotropic tumors. Eradicate osteoblasts that may be needed for Moreover, although this treatment may inhibit some of the proliferation of normal osteoblasts, this is not a problem because the expression of OSNs is very specific and the expression of toxic compounds in a wide variety of tissues. Should not unduly harm the host. b) Application of the OSN promoter-driven gene allows high level expression of therapeutic target genes in many calcified tumors and their metastatic deposition associated with the primary foci of these tumors and the surrounding supporting stroma. Allows you to choose a reasonable method of eradicating things. c) OSN promoter-driven gene therapy in combination with an appropriate vehicle reduces tumor distress and local and metastatic deposition associated with a variety of susceptible osteotropic human or eukaryotic tumors. Can be used in combination with conventional chemotherapy, surgery or radiation therapy to reduce the incidence of d) It is possible to establish a long-lasting antitumor immunity to osteoblasts and tumor cells that remain after the tumor cells are killed by OSN promoter-driven therapy. e) OSN promoter-driven constructs can be used for delivery and expression of therapeutic genes to treat benign diseases such as BPH or arteriosclerosis, as well as damage caused by aging and regression processes. It can also be used for the expression of genes related to important growth and differentiation, such as growth factors, growth factor receptors, bone morphogenetic proteins, etc. f) OSN promoter driven therapy can be modulated by a variety of compounds that exert an enhanced desired effect for a particular application.

【０１７６】前立腺癌は、主に、骨格に転移する。本発明から分かるように、OSNは、多種
多様な前立腺癌細胞中で高度に発現され、しかも選択されたレポーター遺伝子の
発現を効率よく駆動することができるうえに、このプロモーターおよび遺伝子送
達ビヒクルと組み合わせて毒性および／または治療用の遺伝子を駆動することが
できる。この発現には、骨芽性前立腺癌細胞での発現および破骨性前立腺癌細胞
での発現の両方が含まれる。同様に、本発明はまた、他の腫瘍にも、例えば、限
定されるものではないがメラノーマ、甲状腺癌、胃癌、卵巣癌、骨肉腫、大腸癌
、肺癌、乳癌、および脳腫瘍にも有用であろう。Prostate cancer primarily metastasizes to the skeleton. As can be seen from the present invention, OSNs are highly expressed in a wide variety of prostate cancer cells and can efficiently drive the expression of selected reporter genes, and in combination with this promoter and gene delivery vehicle. Can drive toxic and / or therapeutic genes. This expression includes both expression in osteoblastic prostate cancer cells and expression in osteoclastic prostate cancer cells. Similarly, the invention is also useful for other tumors, including, but not limited to, melanoma, thyroid cancer, gastric cancer, ovarian cancer, osteosarcoma, colon cancer, lung cancer, breast cancer, and brain tumors. Let's do it.

【０１７７】したがって、適切な送達ベクターおよび治療用(または毒性)遺伝子に連結され
たOSNプロモーターを含んでなる新規な治療薬、例えば、限定されるものではな
いがAd-OSN-TKを作製することが考えられる。この新規な組換え系は、治療効果
を効率的に発現し、骨芽細胞系列の細胞ならびに多種多様な腫瘍または石灰化能
を獲得した他の感受性良性組織の死滅を選択的に標的化および誘導するであろう
。Thus, to make novel therapeutic agents, including but not limited to Ad-OSN-TK, comprising an OSN promoter linked to a suitable delivery vector and a therapeutic (or toxic) gene. Can be considered. This novel recombinant system efficiently expresses therapeutic effects and selectively targets and induces the death of osteoblast lineage cells and a wide variety of tumors or other sensitive benign tissues that have acquired calcification potential. Will do.

【０１７８】さらに、新しい組換え治療薬、例えば、限定されるものではないがAd-OSN-TK
が、骨肉腫または前立腺癌を患った患者だけでなく、肺癌、乳癌、甲状腺癌、骨
髄腫、メラノーマ、大腸癌、脳癌、胃癌、卵巣癌および他の石灰化腫瘍または感
受性良性組織を有する患者にも利用可能となるであろう。In addition, new recombinant therapeutic agents, such as but not limited to Ad-OSN-TK.
Patients with lung cancer, breast cancer, thyroid cancer, myeloma, melanoma, colon cancer, brain cancer, gastric cancer, ovarian cancer and other calcified tumors or benign tissues, as well as patients with osteosarcoma or prostate cancer Will also be available.

【０１７９】上記のTk遺伝子の代わりに他の毒素または治療用遺伝子をOSNプロモーター駆
動型治療に使用することも可能である。これらの遺伝子としては、シトシンデア
ミナーゼに対する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、環状調節タンパク質、例えば、種々
のサイトカイン、増殖または分化因子などに対する遺伝子が挙げられる。これら
はすべて、上記のTk遺伝子の代わりにOSNプロモーターに連結させることができ
る。このほか、所望の治療応答を効果的に誘導するために、他のベクター送達系
を作製してOSNプロモーターと組み合わせることもできる。Other toxins or therapeutic genes can be used in the OSN promoter driven therapy in place of the above Tk genes. These genes include genes for cytosine deaminase, tumor suppressor genes, cyclic regulatory proteins such as genes for various cytokines, growth or differentiation factors and the like. All of these can be linked to the OSN promoter instead of the Tk gene described above. In addition, other vector delivery systems can be created and combined with the OSN promoter to effectively induce the desired therapeutic response.

【０１８０】本明細書に記載および特許請求されている発明は、本明細書に開示されている
特定の実施形態により範囲が限定されるものではない。いかなる等価な実施形態
も、本発明の範囲内に包含されるものとみなされる。実際、本明細書に記載およ
び特許請求されている態様のほかに、以上の説明から、本発明の種々の変更態様
が当業者には自明なものとなるであろう。そのような変更態様もまた、添付の特
許請求の範囲に含まれるものとする。The invention described and claimed herein is not limited in scope by the particular embodiments disclosed herein. Any equivalent embodiments are considered to be within the scope of this invention. Indeed, various modifications of the invention in addition to those described and claimed herein will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description. Such modifications are also intended to fall within the scope of the appended claims.

【０１８１】本明細書に記載の刊行物、特許および特許出願はいずれも、各刊行物、特許ま
たは特許出願がそれぞれ、具体的かつ個別的に記載されて参照により組み入れら
れた場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられるものとする。All publications, patents and patent applications mentioned herein are to the same extent as if each publication, patent or patent application was specifically and individually described and incorporated by reference. , Are hereby incorporated by reference.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 -1409〜+904までのOSN調節領域配列。[Figure 1] OSN regulatory region sequences from -1409 to +904.

【図２】 OSN欠失構築物を構築するために用いたストラテジーの模式図。[Fig. 2] Schematic representation of the strategy used to construct the OSN deletion construct.

【図３】前立腺細胞系および非前立腺細胞系におけるOSN欠失構築物のプロモーター活
性。FIG. 3. Promoter activity of OSN deletion constructs in prostate and non-prostate cell lines.

【図４】種々の前立腺細胞系および非前立腺細胞系におけるOSNタンパク質発現を明ら
かにするウエスタンブロット。FIG. 4. Western blot demonstrating OSN protein expression in various prostate and non-prostate cell lines.

【図５】種々の前立腺癌細胞系におけるOSN発現(ON)を明らかにするノーザンブロット
。FIG. 5: Northern blots revealing OSN expression (ON) in various prostate cancer cell lines.

【図６】種々の前立腺癌組織におけるOSN発現(ON)を明らかにするノーザンブロット。[Figure 6] Northern blot revealing OSN expression (ON) in various prostate cancer tissues.

【図７】 2.3kb ヒトオステオネクチン遺伝子プロモーターの模式図。[Figure 7] 2.3kb Schematic diagram of human osteonectin gene promoter.

【図８】種々の癌細胞系におけるOSN欠失構築物のプロモーター活性。[Figure 8] Promoter activity of OSN deletion constructs in various cancer cell lines.

【図９】種々の癌細胞系におけるOSNプロモーター活性の比較。[Figure 9] Comparison of OSN promoter activity in various cancer cell lines.

【図１０】 AD-522E-TKを用いるIn Vitroでの細胞傷害性アッセイ。図10AはPC3M細胞を用
いたアッセイを示す。図10BはMG63細胞を用いたアッセイを示す。FIG. 10. In vitro cytotoxicity assay with AD-522E-TK. FIG. 10A shows the assay using PC3M cells. FIG. 10B shows the assay using MG63 cells.

【図１１】 -522〜+62までのOSN調節領域配列。FIG. 11 OSN regulatory region sequences from -522 to +62.

【図１２】 AD-522E-TKを注射された無胸腺症マウスにおけるPC3M皮下腫瘍増殖。[Fig. 12] PC3M subcutaneous tumor growth in athymic mice injected with AD-522E-TK.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｐ 19/00 ４Ｃ０８７ 38/22 35/00 38/43 43/00 １０５Ａ６１Ｐ 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/66 35/00 1/68 ＺＮＡＡ 43/00 １０５Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/66 33/50 Ｚ 1/68 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/48 Ｇ０１Ｎ 33/15 37/02 33/50 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者コーネマン，ケネス，エス．アメリカ合州国 22902 ヴァージニア州シャーロッツビル，ウィローレイクドライブ 1465 (72)発明者イェン，ファンアメリカ合州国 22903 ヴァージニア州シャーロッツビル，マウンテンウッドロード 771−エイＦターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 FB02 FB07 4B063 QA01 QQ02 QQ08 QQ22 QR58 QS28 QX02 4C076 AA19 BB01 BB11 BB13 BB14 CC09 CC26 CC27 FF16 FF63 4C084 AA13 AA24 BA03 CA62 DA01 DA12 DA21 DA45 DB01 MA02 MA24 MA52 MA66 NA14 ZA962 ZB212 ZB262 4C086 AA01 AA02 CB07 EA16 MA03 MA04 MA24 MA52 MA65 MA66 NA14 ZA96 ZB21 ZB26 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 MA02 MA24 MA52 MA65 MA66 NA14 ZA96 ZB21 ZB26 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) A61K 38/00 A61P 19/00 4C087 38/22 35/00 38/43 43/00 105 A61P 19/00 C12Q 1/66 35/00 1/68 ZNAA 43/00 105 G01N 33/15 Z C12Q 1/66 33/50 Z 1/68 ZNA A61K 37/48 G01N 33/15 37/02 33/50 37/24 (81 ) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG) , ZW), EA ( M, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP , KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Corneman, Kenneth, S.S. United States 22902 Willow Lake Drive, Charlottesville, Virginia 1465 (72) Inventor Yan, Fan United States 22903 Mountain Wood Road, Charlottesville, Virginia 771-AF Term (Reference) 2G045 AA40 DA12 DA13 FB02 FB07 4B063 QA01 QQ02 QQ08 QQ22 QR58 QS28 QX02 4C076 AA19 BB01 BB11 BB13 BB14 CC09 CC26 CC27 FF16 FF63 4C084 AA13 AA24 BA03 CA62 DA01 DA12 DA21 DA45 DB01 MA02 MA24 MA52 MA66 MA21 NA21 MA21 MA26 MA21 NA21 ZA16 MA14 NA16 ZA962 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 MA02 MA24 MA52 MA65 MA66 NA14 ZA96 ZB21 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】[Claims]

【請求項１】 OSNプロモーターと、送達ベクターと、毒性の、治療用のお
よび／または異種のコード配列とを含んでなる治療薬。1. A therapeutic agent comprising an OSN promoter, a delivery vector and a toxic, therapeutic and / or heterologous coding sequence.

【請求項２】プロドラッグをさらに含んでなる、請求項１に記載の治療薬
。2. The therapeutic agent according to claim 1, further comprising a prodrug.

【請求項３】前記プロドラッグが、アシクロビル(「ACV」)およびガンシ
クロビル(「GCV」)からなる群より選択される、請求項２に記載の治療薬。3. The therapeutic agent according to claim 2, wherein the prodrug is selected from the group consisting of acyclovir (“ACV”) and ganciclovir (“GCV”).

【請求項４】前記OSNプロモーターが、図１に示されるヌクレオチド-1409
〜+73を含む、請求項１に記載の治療薬。4. The OSN promoter is nucleotide-1409 shown in FIG.
The therapeutic agent according to claim 1, which comprises ˜ + 73.

【請求項５】前記OSNプロモーターが、図11に示されるヌクレオチド-522
〜+62を含む、請求項１に記載の治療薬。5. The OSN promoter is nucleotide-522 shown in FIG.
The therapeutic agent according to claim 1, which comprises-+ 62.

【請求項６】前記送達ベクターがウイルスベクターからなる、請求項１に
記載の治療薬。6. The therapeutic agent according to claim 1, wherein the delivery vector comprises a viral vector.

【請求項７】前記ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項６に
記載の治療薬。7. The therapeutic agent according to claim 6, wherein the viral vector is an adenovirus.

【請求項８】前記送達ベクターがリポソームからなる、請求項１に記載の
治療薬。8. The therapeutic agent according to claim 1, wherein the delivery vector comprises a liposome.

【請求項９】前記毒性コード配列が、チミジンキナーゼおよびシトシンデ
アミナーゼのコード配列からなる群より選択される、請求項１に記載の治療薬。9. The therapeutic agent according to claim 1, wherein the toxic coding sequence is selected from the group consisting of thymidine kinase and cytosine deaminase coding sequences.

【請求項１０】前記治療用コード配列が、増殖因子、サイトカイン、治療
用タンパク質、ホルモンおよびホルモンのペプチド断片、サイトカインのインヒ
ビター、ペプチド増殖および分化因子、インターロイキン、ケモカイン、インタ
ーフェロン、コロニー刺激因子および血管形成因子のコード配列からなる群より
選択される、請求項１に記載の治療薬。10. The therapeutic coding sequence comprises growth factors, cytokines, therapeutic proteins, hormones and peptide fragments of hormones, inhibitors of cytokines, peptide growth and differentiation factors, interleukins, chemokines, interferons, colony stimulating factors and blood vessels. The therapeutic agent according to claim 1, which is selected from the group consisting of a coding sequence of a forming factor.

【請求項１１】前記異種コード配列がレポーター遺伝子である、請求項１
に記載の治療薬。11. The heterologous coding sequence is a reporter gene.
The remedy described in.

【請求項１２】前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項１
１に記載の治療薬。12. The reporter gene is luciferase.
The therapeutic agent according to 1.

【請求項１３】骨指向性特異的遺伝子発現をモジュレートしうる試験化合
物を同定する方法であって、 (a) OSN調節領域またはその転写的に活性な断片の制御下にあるレポーター遺
伝子の発現レベルを該試験化合物の存在下および不在下で測定し、該試験化合物の存在下で得られたレベルがその不在下で得られたレベルと異な
っているときに、骨指向性特異的遺伝子発現をモジュレートする化合物が同定さ
れるようにした、上記方法。13. A method for identifying a test compound capable of modulating bone tropism specific gene expression, comprising: (a) expression of a reporter gene under the control of an OSN regulatory region or transcriptionally active fragment thereof. Levels were measured in the presence and absence of the test compound, and bone tropism-specific gene expression was determined when the level obtained in the presence of the test compound was different from the level obtained in the absence. The above method wherein a modulating compound is identified.

【請求項１４】前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項１
３に記載の方法。14. The reporter gene is luciferase.
The method according to 3.

【請求項１５】請求項１３に記載の方法により同定された試験化合物を含
んでなる医薬組成物。15. A pharmaceutical composition comprising a test compound identified by the method of claim 13.

【請求項１６】毒性および／または治療用の分子を送達する方法であって
、該毒性および／または治療用の分子をコードする異種核酸に機能的に連結され
たOSN調節領域配列またはその転写的に活性な断片を含むベクターを、被験者の
骨指向性細胞に導入することを含んでなる、上記方法。16. A method of delivering a toxic and / or therapeutic molecule, comprising an OSN regulatory region sequence operably linked to a heterologous nucleic acid encoding said toxic and / or therapeutic molecule or a transcriptional thereof. The method as described above, which comprises introducing a vector containing an active fragment of Escherichia coli into bone-tropic cells of a subject.

【請求項１７】骨指向性に関連した疾患または障害を治療および／または
改善する方法であって、該疾患または障害を治療および／または改善しうる遺伝
子産物を生じる異種核酸に機能的に連結されたOSN調節領域配列またはその転写
的に活性な断片を含むベクターを、被験者の骨指向性細胞に導入することを含ん
でなる、上記方法。17. A method of treating and / or ameliorating a disease or disorder associated with bone tropism, which is operably linked to a heterologous nucleic acid that produces a gene product capable of treating and / or ameliorating the disease or disorder. The above method, which comprises introducing a vector containing the OSN regulatory region sequence or a transcriptionally active fragment thereof into a bone-tropic cell of a subject.

【請求項１８】骨指向性に関連した癌または他の増殖性障害を治療および
／または改善する方法であって、被験者の該癌または他の増殖性障害の細胞に、
OSN調節領域配列またはその転写的に活性な断片と、送達ベクターと、該細胞を
死滅させうる遺伝子産物を生じる毒性、治療用および／または異種のコード配列
とを含むベクターを導入することを含んでなる、上記方法。18. A method of treating and / or ameliorating a cancer or other proliferative disorder associated with bone tropism, the method comprising:
Introducing a vector comprising an OSN regulatory region sequence or transcriptionally active fragment thereof, a delivery vector and a toxic, therapeutic and / or heterologous coding sequence which results in a gene product capable of killing the cell. The above method.

【請求項１９】前記癌または他の増殖性障害が、骨肉腫、前立腺癌、乳癌
、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、胃癌、卵巣癌、甲状腺癌、黒色腫、ま
たは石灰化の可能性がある他の疾患または障害からなる群より選択される、請求
項１８に記載の方法。19. The cancer or other proliferative disorder is osteosarcoma, prostate cancer, breast cancer, colon cancer, lung cancer, brain tumor, multiple myeloma, gastric cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, melanoma, or calcification. 19. The method of claim 18, selected from the group consisting of other potential diseases or disorders.

【請求項２０】プロドラッグを導入することをさらに含んでなる、請求項
１８に記載の方法。20. The method of claim 18, further comprising introducing a prodrug.

【請求項２１】前記プロドラッグが、ACVおよびGCVからなる群より選択さ
れる、請求項２０に記載の方法。21. The method of claim 20, wherein the prodrug is selected from the group consisting of ACV and GCV.

【請求項２２】前記導入が、直接適用による投与、または静脈内投与、動
脈内投与、腫瘍内投与、灌流もしくは経口投与による全身的適用による投与を含
む、請求項２０に記載の方法。22. The method of claim 20, wherein said introducing comprises administration by direct application, or administration by systemic application by intravenous, intraarterial, intratumoral, perfusion or oral administration.

【請求項２３】前記OSNプロモーターが、図１に示されるヌクレオチド-14
09〜+73を含む、請求項１８に記載の方法。23. The OSN promoter is nucleotide-14 shown in FIG.
19. The method of claim 18, comprising 09- + 73.

【請求項２４】前記OSNプロモーターが、図11に示されるヌクレオチド-52
2〜+62を含む、請求項１８に記載の方法。24. The OSN promoter is nucleotide-52 shown in FIG.
19. The method of claim 18, comprising 2 to +62.

【請求項２５】前記OSN調節領域配列が、図１に示されるヌクレオチド-14
09〜+73の相補体に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチ
ド配列を含む、請求項２３に記載の方法。25. The OSN regulatory region sequence is nucleotide-14 shown in FIG.
24. The method of claim 23, which comprises a nucleotide sequence that hybridizes to the complement of 09 to +73 under high stringency conditions.

【請求項２６】前記OSN調節領域配列が、図11に示されるヌクレオチド-52
2〜+62の相補体に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド
配列を含む、請求項２４に記載の方法。26. The OSN regulatory region sequence is nucleotide-52 shown in FIG.
25. The method of claim 24, comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the complement of 2 to +62 under high stringency conditions.

【請求項２７】骨指向性に関連した障害の発生を予防または遅延する方法
であって、該障害の発生を予防または遅延しうる治療用分子をコードする異種核
酸に機能的に連結されたOSN調節領域配列またはその転写的に活性な断片を含む
ベクターを、被験者の骨指向性細胞に導入することを含んでなる、上記方法。27. A method of preventing or delaying the onset of a disorder associated with osteotropism, wherein the OSN is operably linked to a heterologous nucleic acid encoding a therapeutic molecule capable of preventing or delaying the onset of the disorder. The above method, which comprises introducing a vector containing a regulatory region sequence or a transcriptionally active fragment thereof into an osteotropic cell of a subject.

【請求項２８】骨修復を促進する方法であって、骨修復を必要とする領域
にポリヌクレオチドを投与することを含んでなり、該ポリヌクレオチドが、OSN
調節領域配列またはその転写的に活性な断片と、送達ベクターと、該骨修復を促
進しうる遺伝子産物を生じる治療用コード配列とを含む、上記方法。28. A method of promoting bone repair, comprising administering a polynucleotide to a region in need of bone repair, wherein the polynucleotide is OSN.
The above method comprising a regulatory region sequence or a transcriptionally active fragment thereof, a delivery vector, and a therapeutic coding sequence that results in a gene product capable of promoting bone repair.

【請求項２９】前記治療用コード配列が、増殖因子、サイトカイン、治療
用タンパク質、ホルモンおよびホルモンのペプチド断片、サイトカインのインヒ
ビター、ペプチド増殖および分化因子、インターロイキン、ケモカイン、インタ
ーフェロン、コロニー刺激因子および血管形成因子のコード配列からなる群より
選択される、請求項２８に記載の方法。29. The therapeutic coding sequence comprises growth factors, cytokines, therapeutic proteins, hormones and peptide fragments of hormones, inhibitors of cytokines, peptide growth and differentiation factors, interleukins, chemokines, interferons, colony stimulating factors and blood vessels. 29. The method of claim 28, selected from the group consisting of a coding sequence for a forming factor.

【請求項３０】免疫機能をモジュレートする方法であって、免疫機能のモ
ジュレーションを必要とする領域にポリヌクレオチドを投与することを含んでな
り、該ポリヌクレオチドが、OSN調節領域配列またはその転写的に活性な断片と
、送達ベクターと、免疫機能をモジュレートしうる遺伝子産物を生じる治療用コ
ード配列とを含む、上記方法。30. A method of modulating immune function comprising administering a polynucleotide to a region in need of modulation of immune function, said polynucleotide comprising the OSN regulatory region sequence or a transcriptional transcription thereof. A method as described above comprising an active fragment, a delivery vector, and a therapeutic coding sequence that results in a gene product capable of modulating immune function.

【請求項３１】前記治療用コード配列が、インターフェロンα、βまたは
γ、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コ
ロニー刺激因子(G-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、ケモカイン
、例えば好中球活性化タンパク質NAP、マクロファージ走化活性化因子MCAF、RAN
TES、マクロファージ炎症性ペプチドMIP-1aおよびMIP-1b、補体成分およびそれ
らの受容体、アクセサリー分子、例えばB7.1、B7.2、ICAM-1.2または3、および
サイトカイン受容体のコード配列からなる群より選択される、請求項３０に記載
の方法。31. The therapeutic coding sequence comprises interferon α, β or γ, tumor necrosis factor, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor. (M-CSF), chemokines such as neutrophil activating protein NAP, macrophage chemotactic activator MCAF, RAN
Consists of TES, macrophage inflammatory peptides MIP-1a and MIP-1b, complement components and their receptors, accessory molecules such as B7.1, B7.2, ICAM-1.2 or 3, and coding sequences for cytokine receptors 31. The method of claim 30, selected from the group.