JP2003334081A - Gene, enzyme, method for producing enzyme, and method for producing chitin oligosaccharide - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for efficiently producing at least chitin oligosaccharide by decomposing β-poly-N-acetyl-D-glucosamine in chitin or chitin-based material. <P>SOLUTION: Disclosed are a β-N-acetylglucosaminidase gene having a specific base sequence, a gene having an equal function to the gene, a β-N- acetylglucosaminidase having an amino acid sequence encoded by these genes, an enzyme having an equal function to the enzyme, a method for producing these enzymes by culturing Clostridium paraputrificum M strain or a recombinant obtained by introducing the genes and obtaining the enzymes from the culture preparation, and a method for producing at least the chitin oligosaccharide by acting these enzymes on the chitin or the chitin-based material. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、絶対嫌気性菌クロ
ストリジウム・パラプトリフィカム（ Clostridium pa
raputrificum） M株に由来する新規なβ−Ｎ−アセチル
グルコサミニダーゼ遺伝子、この遺伝子によりコードさ
れる新規なβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、この
酵素の製造方法、この酵素を用いるキチンオリゴ糖の製
造方法等に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention is, strictly anaerobic bacteria Clostridium para Putri Fi cam (Clostridium pa
raputrificum ) novel β-N-acetylglucosaminidase gene derived from M strain, novel β-N-acetylglucosaminidase encoded by this gene, method for producing this enzyme, method for producing chitin oligosaccharide using this enzyme, etc. .

【０００２】[0002]

【従来の技術】キチンは、例えばカニ、エビ、ロブスタ
ーの殻、あるいは昆虫の羽の構成成分等として自然界に
多く存在し、セルロースと並んで重要な糖資源である。2. Description of the Related Art Chitin is present in nature in large amounts as a constituent of crab, shrimp, lobster shells, insect wings, etc., and is an important sugar resource along with cellulose.

【０００３】本件出願人は、我が国におけるカニ、エ
ビ、ロブスター等の消費量の伸びに伴う膨大な量のキチ
ン含有廃棄物問題の解決に資するため、特願２００１−
９５００８号の特許出願において、クロストリジウム・
パラプトリフィカム由来の新規ヒドロゲナーゼを利用し
てキチン含有廃棄物を分解処理し、クリーンエネルギー
たる水素を製造する方法を既に提案している。The applicant of the present invention contributes to the solution of the enormous amount of chitin-containing waste associated with the increase in consumption of crab, shrimp, lobster, etc. in Japan, and therefore, Japanese Patent Application No. 2001-2001.
In the patent application of 95008, Clostridium
We have already proposed a method for producing hydrogen, which is clean energy, by decomposing chitin-containing wastes using a novel hydrogenase derived from paraputrificum.

【０００４】ところで、キチン即ちβ−ポリ−Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンは生体内に存在する糖脂質ある
いは糖タンパク質の構成成分でもあり、これを加水分解
することにより生じるキチンオリゴ糖については、例え
ば抗ガン作用等の有用な生理活性が知られている（特公
昭５９−２７８２６号公報）。単糖であるＮ−アセチル
−Ｄ−グルコサミンについても、良質な甘味を持つ水溶
性かつ安定な物質であり、しかも皮膚組織中のヒアルロ
ン酸量を増やす効果もあって、健康食品用又は医薬用の
素材として有用性が認められる。By the way, chitin, that is, β-poly-N-acetyl-D-glucosamine, is also a constituent component of glycolipids or glycoproteins existing in the living body, and chitin oligosaccharides produced by hydrolyzing this are described in, for example, Useful physiological activities such as anti-cancer action are known (Japanese Patent Publication No. 59-27826). N-acetyl-D-glucosamine, which is a monosaccharide, is also a water-soluble and stable substance having a high-quality sweetness, and also has an effect of increasing the amount of hyaluronic acid in skin tissue. Useful as a material.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】従ってキチンオリゴ糖
は医薬品あるいは高機能食品等の有効成分として重要な
物質であり、単糖（キチンモノマー）も一定の有用性が
ある。このような観点においては、キチン質（キチンを
含有する食材廃棄物等）を廃棄物として処理するより
も、これを少なくともキチンオリゴ糖を回収するため
の、場合によっては単糖も併せて回収するための、有用
な原料又は資材として利用することが、より好ましい。Therefore, chitin oligosaccharide is an important substance as an active ingredient of medicines or highly functional foods, and monosaccharide (chitin monomer) has a certain usefulness. From such a viewpoint, rather than treating chitin (such as food waste containing chitin) as a waste, it is necessary to collect at least a chitin oligosaccharide, and in some cases, a monosaccharide as well. More preferably, it is used as a useful raw material or material.

【０００６】しかしながら、従来、キチン又はキチン質
から効率的にキチンオリゴ糖等を製造する方法は確立さ
れていない。例えばキチンを酸処理等により化学的に加
水分解する場合には、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
と共に、脱アセチル化されたＤ−グルコサミンが生成
し、この両者の分離のために煩雑な工程を付加する必要
がある。又、特公平５−３３０３７号公報等にはキチン
の酵素的分解方法が開示されているが、キチンがもとも
と水に難溶性で、しかも難分解性である点もあって、そ
の分解効率は必ずしも良好とは言えない。However, conventionally, a method for efficiently producing chitin oligosaccharide or the like from chitin or chitin has not been established. For example, when chitin is chemically hydrolyzed by acid treatment or the like, deacetylated D-glucosamine is produced together with N-acetyl-D-glucosamine, and a complicated step is added to separate the two. There is a need to. Further, Japanese Patent Publication No. 5-33037 discloses a method for enzymatically decomposing chitin. However, chitin is originally poorly soluble in water, and moreover, it is difficult to decompose, so that the decomposition efficiency is not always required. Not good.

【０００７】そこで本発明は、キチン又はキチン質原料
中のβ−ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを分解
して、少なくともキチンオリゴ糖を効率的に製造する手
段を提供することを、解決すべき課題とする。Therefore, the present invention provides a means for degrading β-poly-N-acetyl-D-glucosamine in chitin or a chitinous material to efficiently produce at least chitin oligosaccharide. It should be an issue.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】（第１発明の構成）上記
課題を解決するための本願第１発明（請求項１に記載の
発明）の構成は、配列表の配列番号１に示す塩基配列を
有する、遺伝子である。(Structure of the First Invention) The structure of the first invention of the present application (the invention of claim 1) for solving the above-mentioned problems is the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing. Is a gene.

【０００９】（第２発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第２発明（請求項２に記載の発明）の構成は、
配列表の配列番号１に示す塩基配列又はこれと相補的な
塩基配列を有するDNA に対してストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする塩基配列を有し、β−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼ遺伝子として機能する、遺伝子
である。(Configuration of Second Invention) The configuration of the second invention of the present application (the invention according to claim 2) for solving the above-mentioned problems is as follows.
It has a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing or a nucleotide sequence complementary thereto, and functions as a β-N-acetylglucosaminidase gene, It is a gene.

【００１０】（第３発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第３発明（請求項３に記載の発明）の構成は、
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、酵素
である。(Configuration of Third Invention) The configuration of the third invention of the present application (the invention according to claim 3) for solving the above-mentioned problems is as follows.
It is an enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

【００１１】（第４発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第４発明（請求項４に記載の発明）の構成は、
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において５個以
下のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列
を有し、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとして機
能する、酵素である。(Configuration of Fourth Invention) The configuration of a fourth invention of the present application (an invention according to claim 4) for solving the above-mentioned problems is as follows.
It is an enzyme having an amino acid sequence in which 5 or less amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, and which functions as β-N-acetylglucosaminidase.

【００１２】（第５発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第５発明（請求項５に記載の発明）の構成は、
第２発明に係る遺伝子によりコードされるアミノ酸配列
を有するものである、酵素である。(Structure of Fifth Invention) The structure of a fifth invention of the present application (an invention according to claim 5) for solving the above-mentioned problems is as follows.
An enzyme having an amino acid sequence encoded by the gene according to the second invention.

【００１３】（第６発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第６発明（請求項６に記載の発明）の構成は、
第１発明又は第２発明に係る遺伝子を含む、組換え核酸
である。(Structure of Sixth Invention) The structure of a sixth invention of the present application (an invention according to claim 6) for solving the above-mentioned problems is as follows.
It is a recombinant nucleic acid containing the gene according to the first invention or the second invention.

【００１４】（第７発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第７発明（請求項７に記載の発明）の構成は、
第６発明に係る組換え核酸を導入した宿主である、組換
え体である。(Structure of Seventh Invention) The structure of a seventh invention of the present application (an invention according to claim 7) for solving the above-mentioned problems is as follows.
A recombinant, which is a host into which the recombinant nucleic acid according to the sixth invention has been introduced.

【００１５】（第８発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第８発明（請求項８に記載の発明）の構成は、
クロストリジウム・パラプトリフィカム（C. paraputr
ificum）、クロストリジウム・パラプトリフィカム M株
又は第７発明に係る組換え体を培養し、その培養物から
第３発明〜第５発明のいずれかに係る酵素を取得する、
酵素の製造方法である。(Structure of Eighth Invention) The structure of an eighth invention of the present application (an invention according to claim 8) for solving the above problems is as follows.
C. paraputr
ificum ), a Clostridium paraptophycum M strain or the recombinant according to the seventh invention, and the enzyme according to any of the third to fifth inventions is obtained from the culture.
It is a method for producing an enzyme.

【００１６】（第９発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第９発明（請求項９に記載の発明）の構成は、
第３発明〜第５発明のいずれかに係る酵素をキチン又は
キチン質に作用させ、少なくともキチンオリゴ糖を生産
する、キチンオリゴ糖の製造方法である。(Structure of Ninth Invention) The structure of a ninth invention of the present application (an invention according to claim 9) for solving the above-mentioned problems is as follows.
A method for producing a chitin oligosaccharide, which comprises reacting the enzyme according to any one of the third invention to the fifth invention with chitin or chitin to produce at least a chitin oligosaccharide.

【００１７】ここに「キチンオリゴ糖」とは、キチン即
ちβ−ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを加水分
解して得られるオリゴマーであって、単糖であるＮ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミンがβ−１，４結合によって２
〜１０単位、より好ましくは、水溶性の点から、２〜６
単位結合したオリゴ糖を言う。The "chitin oligosaccharide" is an oligomer obtained by hydrolyzing chitin, that is, β-poly-N-acetyl-D-glucosamine, and is a monosaccharide N-acetyl-D-glucosamine. 2 by β-1,4 bond
-10 units, more preferably 2-6 from the viewpoint of water solubility.
A unit-linked oligosaccharide.

【００１８】[0018]

【発明の作用・効果】（第１発明の作用・効果）第１発
明の遺伝子は、絶対嫌気性菌クロストリジウム・パラプ
トリフィカム M株に由来する新規なβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ遺伝子である。第１発明によって、キ
チン質原料等を分解してβ−Ｎ−アセチルグルコサミン
の単糖及び／又はオリゴ糖を特異的かつ効率的に生産し
得るβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードする
遺伝子が提供される。Action / Effect of the Invention (Action / Effect of the First Invention) The gene of the first invention is a novel β-N-acetylglucosaminidase gene derived from the absolutely anaerobic bacterium Clostridium paraptophycum M strain. The first invention provides a gene encoding β-N-acetylglucosaminidase capable of specifically and efficiently producing a β-N-acetylglucosamine monosaccharide and / or oligosaccharide by decomposing a chitinous material or the like. It

【００１９】（第２発明の作用・効果）第２発明の遺伝
子に対しても、上記第１発明の遺伝子と同等の作用・効
果を期待することができる。(Operation / Effect of Second Invention) With respect to the gene of the second invention, the same operation / effect as the gene of the first invention can be expected.

【００２０】（第３発明の作用・効果）第３発明の酵素
は、優れたβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性を
示し、例えばカニ、エビ、ロブスターの殻等のキチン質
（即ち、ポリβ−Ｎ−アセチルグルコサミン）から、医
薬品あるいは高機能食品等の成分として有用であるキチ
ンオリゴ糖や、一定の有用性あるＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンを効率的に製造することができる。(Action and Effect of the Third Invention) The enzyme of the third invention exhibits an excellent β-N-acetylglucosaminidase activity, for example, chitin (ie, poly β-N) of crab, shrimp and lobster shells. -Acetylglucosamine), it is possible to efficiently produce chitin oligosaccharides which are useful as a component of medicines or highly functional foods, and N-acetyl-D-glucosamine having a certain usefulness.

【００２１】（第４発明の作用・効果）第４発明の酵素
に対しても、上記第３発明の酵素と同等の作用・効果を
期待することができる。(Operation / Effect of Fourth Invention) With respect to the enzyme of the fourth invention, the same operation / effect as the enzyme of the third invention can be expected.

【００２２】（第５発明の作用・効果）第５発明の酵素
に対しても、上記第３発明の酵素と同等の作用・効果を
期待することができる。(Operation / Effect of Fifth Invention) With respect to the enzyme of the fifth invention, the same operation / effect as the enzyme of the third invention can be expected.

【００２３】（第６発明の作用・効果）第６発明の組換
え核酸によって、クロストリジウム・パラプトリフィカ
ム M株に比較して更に好適な宿主にβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ遺伝子を導入することができる。「更
に好適な宿主」としては、例えばβ−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼの生産能力のより高い宿主、酵素生産手
段としての維持や管理がより容易な宿主、等を例示する
ことができる。(Operation and Effect of Sixth Invention) With the recombinant nucleic acid of the sixth invention, it is possible to introduce the β-N-acetylglucosaminidase gene into a more suitable host as compared to the M. strain of Clostridium paraptophycum. it can. Examples of the “more suitable host” include a host having a higher β-N-acetylglucosaminidase production capacity, a host that is easier to maintain and manage as an enzyme production means, and the like.

【００２４】（第７発明の作用・効果）第７発明によっ
て、クロストリジウム・パラプトリフィカム M株に比較
して、β−ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを単
糖やオリゴ糖に生分解する活性が更に高い組換え体や、
産業上有利なその他の各種の特性を備えた組換え体を提
供することができる。(Operation / Effect of Seventh Invention) According to the seventh invention, β-poly-N-acetyl-D-glucosamine is biodegraded into monosaccharides and oligosaccharides, as compared with the Clostridium paraptophycum M strain. Which has a higher activity of
A recombinant having various other industrially advantageous properties can be provided.

【００２５】（第８発明の作用・効果）第８発明によっ
て、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの有利な製造
方法が提供される。(Operation and Effect of Eighth Invention) The eighth invention provides an advantageous method for producing β-N-acetylglucosaminidase.

【００２６】（第９発明の作用・効果）第９発明によっ
て、キチン又はキチン質から少なくともキチンオリゴ糖
を効率的に生産でき、望む場合には単糖であるＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンをも効率的に生産できる製造方
法が提供される。(Operation / Effect of Ninth Invention) According to the ninth invention, at least chitin oligosaccharide can be efficiently produced from chitin or chitin, and if desired, monosaccharide N-acetyl-D-glucosamine is also produced. A manufacturing method that can be efficiently produced is provided.

【００２７】この方法による場合、脱アセチル化された
Ｄ−グルコサミンが生成しないので、上記キチンオリゴ
糖や単糖とＤ−グルコサミンとの分離のために煩雑な工
程を付加する必要がない。According to this method, since deacetylated D-glucosamine is not produced, it is not necessary to add a complicated step for separating the chitin oligosaccharide or monosaccharide from D-glucosamine.

【００２８】[0028]

【発明の実施の形態】次に、第１発明〜第９発明の実施
の形態について説明する。以下において単に「本発明」
と言うときは第１発明〜第９発明を一括して指してい
る。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Next, embodiments of the first to ninth inventions will be described. In the following, simply "the present invention"
When referring to, the first to ninth inventions are collectively referred to.

【００２９】〔遺伝子〕本発明に係る遺伝子は、β−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子として機能する。[Gene] The gene according to the present invention is β-N
-Functions as the acetylglucosaminidase gene.

【００３０】本発明において「遺伝子」とは、特定され
た塩基配列を有する限りにおいて、DNA 及びRNA を包含
するポリヌクレオチドを意味し、例えば染色体DNA 、mR
NA、cDNA、PCR フラグメント等をいずれも包含する。
又、１本鎖、２本鎖及び３本鎖のポリヌクレオチドをい
ずれも包含する。更に「塩基配列を有する」とは、ポリ
ヌクレオチドが特定された塩基配列のみからなる場合
と、特定された塩基配列を一部に含む場合とを含む。特
定された塩基配列を一部に含むポリヌクレオチドとして
は、特定された塩基配列の他に、機能的に無意味な塩基
配列部分、あるいはプロモーター領域等の制御配列、あ
るいはリンカー配列等を介して連結又は融合された他の
任意の構造遺伝子、等を含むポリヌクレオチドが例示さ
れる。In the present invention, the "gene" means a polynucleotide including DNA and RNA, as long as it has a specified base sequence, and includes, for example, chromosomal DNA and mR.
NA, cDNA, PCR fragments, etc. are included.
It also includes all single-stranded, double-stranded and triple-stranded polynucleotides. Further, “having a base sequence” includes a case where the polynucleotide is composed of only the specified base sequence and a case where the polynucleotide partially includes the specified base sequence. As a polynucleotide containing a part of the specified base sequence, in addition to the specified base sequence, a functionally meaningless base sequence part, or a control sequence such as a promoter region, or a linker sequence is linked. Alternatively, a polynucleotide containing any other fused structural gene or the like is exemplified.

【００３１】本発明に係る遺伝子の特に好適な例は、配
列表の配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子であ
る。この遺伝子は、本願発明者が絶対嫌気性細菌クロス
トリジウム・パラプトリフィカム（C. paraputrificu
m）M 株からクローニングしたものである。C. paraput
rificum M株は、三重県津市上浜町の三重大学構内の土
壌から分離されたものであり、FERM P-16390として経済
産業省・工業技術院生命工学工業技術研究所へ特許寄託
されている。C. paraputrificum M株以外のC. parapu
trificum細菌からも、後述の実施例に示す場合と同様の
手順によって、同一又は同等の遺伝子を取得できる蓋然
性が高い。A particularly preferred example of the gene according to the present invention is the gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. This gene has been identified by the inventor of the present invention as an obligate anaerobic bacterium, C. paraputrificu ( C. paraputrificu).
m ) cloned from M strain. C. paraput
The rificum M strain was isolated from the soil of the campus of Mie University in Kamehama- cho, Tsu City, Mie Prefecture, and has been patented as FERM P-16390 at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of Economy, Trade and Industry. Other than C. paraputrificum M Ltd. C. parapu
It is highly probable that the same or equivalent gene can be obtained from trificum bacteria by the same procedure as shown in the below-mentioned Examples.

【００３２】本発明に係る遺伝子の他の好適な例は、配
列表の配列番号１に示す塩基配列又はこれと相補的な塩
基配列を有するDNA に対してストリンジェントな条件下
でハイブリダイズする塩基配列を有し、β−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ遺伝子として機能する遺伝子であ
る。Another preferred example of the gene according to the present invention is a base that hybridizes under stringent conditions to a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing or a base sequence complementary thereto. It is a gene having a sequence and functioning as a β-N-acetylglucosaminidase gene.

【００３３】ここに「ストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズする」とは、以下の条件下で一方のDNA に対
して他方のDNA がハイブリダイズできることを言う。即
ち、フィルターに固定化された一方のDNA に対して、0.
7 〜1Mの NaCl の存在下、所定温度（Ｘ°Ｃ）下で他方
のDNA のハイブリダイゼーションを行った後、0.1 〜２
倍濃度のSSC 溶液（１倍濃度のSSC 溶液の組成は、150m
M 塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる）
を用いてＸ°Ｃの条件下でフィルターを洗浄した場合
に、他方のDNA を同定できることを言う。そして「Ｘ°
Ｃ」とは、少なくとも50°Ｃ以上であり、より好ましく
は60°Ｃ以上であり、更に好ましくは65°Ｃ以上であ
る。The term "hybridize under stringent conditions" means that one DNA can hybridize with the other DNA under the following conditions. That is, for one DNA immobilized on the filter, 0.
After hybridization of the other DNA at a predetermined temperature (X ° C) in the presence of 7 to 1 M NaCl, 0.1 to 2
Double-concentration SSC solution (The composition of 1-fold SSC solution is 150m
Consisting of M sodium chloride and 15 mM sodium citrate)
It means that the other DNA can be identified when the filter is washed under the conditions of X ° C. And "X °
"C" is at least 50 ° C or higher, more preferably 60 ° C or higher, and further preferably 65 ° C or higher.

【００３４】〔酵素〕本発明に係る酵素は、β−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼである。β−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼとは、キチン即ちβ−ポリ−Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンを分解して、Ｎ−アセチル−Ｄ
−グルコサミンの単糖やオリゴ糖を特異的に生成する酵
素を言い、キチンの脱アセチル化は起こさないものであ
る。[Enzyme] The enzyme according to the present invention is β-N-acetylglucosaminidase. β-N-acetylglucosaminidase is a substance that decomposes chitin, that is, β-poly-N-acetyl-D-glucosamine, to give N-acetyl-D.
-An enzyme that specifically produces glucosamine monosaccharides and oligosaccharides, and does not cause deacetylation of chitin.

【００３５】本発明に係る酵素は、糖質加水分解酵素の
ファミリー3 に属する（http://afmb.cnrs-mrs.fr/￣pe
dro/CAZY/ghf＿3.html）新規な酵素であり、キチンを基
質としてその非還元末端からモノマー（Ｎ−アセチル−
Ｄ−グルコサミン）単位で分解し、理論的な最終分解産
物はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンであるが、実際の
通常の分解過程では、モノマーとオリゴマー（キチンオ
リゴ糖、即ちＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがβ−
１，４結合したオリゴ糖）とを生成する。The enzyme according to the present invention belongs to family 3 of carbohydrate hydrolases (http://afmb.cnrs-mrs.fr/￣pe.
dro / CAZY / ghf_3.html) is a novel enzyme that uses chitin as a substrate to convert monomers (N-acetyl-
D-Glucosamine) units are decomposed, and the theoretical final decomposition product is N-acetyl-D-glucosamine, but in the actual normal decomposition process, monomers and oligomers (chitin oligosaccharides, that is, N-acetyl-D- Glucosamine is β-
1,4 linked oligosaccharides).

【００３６】本発明に係る酵素の特に好適な例は、配列
表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有する酵素であ
る。この酵素は、C. paraputrificum M株からクローニ
ングした前記遺伝子によってコードされるものである。
C. paraputrificum M株以外のC. paraputrificum細菌
からも、同一又は同等の遺伝子によってコードされた同
一又は同等の酵素を取得できる蓋然性が高い。A particularly preferred example of the enzyme according to the present invention is an enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. This enzyme is encoded by the gene cloned from the C. paraputrificum M strain.
It is highly probable that the same or equivalent enzyme encoded by the same or equivalent gene can be obtained from C. paraputrificum bacteria other than C. paraputrificum M strain.

【００３７】本発明に係る酵素の他の好適な例は、配列
表の配列番号１に示すアミノ酸配列において５個以下の
アミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有
し、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとして機能す
る酵素である。Another preferred example of the enzyme according to the present invention has an amino acid sequence in which 5 or less amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and β-N An enzyme that functions as an acetylglucosaminidase.

【００３８】ここに、置換、欠失又は付加される５個以
下のアミノ酸は、その全部が配列表の配列番号１に示す
アミノ酸配列において互いに隣接するアミノ酸であり得
る。あるいは、上記５個以下のアミノ酸は、その一部が
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において互いに
隣接するアミノ酸であり得る。あるいは、上記５個以下
のアミノ酸は、そのいずれもが配列表の配列番号１に示
すアミノ酸配列において互いに隣接しない位置にあるア
ミノ酸であり得る。The 5 or less amino acids to be substituted, deleted or added may all be amino acids adjacent to each other in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing. Alternatively, the 5 or less amino acids may be amino acids, some of which are adjacent to each other in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing. Alternatively, the 5 or less amino acids may be amino acids at positions that are not adjacent to each other in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.

【００３９】本発明に係る酵素の他の好適な例は、配列
表の配列番号１に示す塩基配列又はこれと相補的な塩基
配列のDNA に対してストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズする塩基配列を有し、β−Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼ遺伝子として機能する遺伝子によってコー
ドされる酵素である。Another preferred example of the enzyme according to the present invention is a nucleotide sequence which hybridizes under stringent conditions to a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing or a nucleotide sequence complementary thereto. And is an enzyme encoded by a gene that functions as a β-N-acetylglucosaminidase gene.

【００４０】〔組換え核酸〕本発明に係る組換え核酸
は、本発明に係る上記各種の遺伝子のいずれかを含むも
のである。[Recombinant Nucleic Acid] The recombinant nucleic acid according to the present invention contains any of the above-mentioned various genes according to the present invention.

【００４１】ここに「組換え核酸」とは、任意の宿主生
物又は宿主細胞の形質転換あるいは組換えを行うために
準備された各種態様のポリヌクレオチドを言い、例えば
DNAの相同組換えによって宿主に導入するためのPCR フ
ラグメント等も含むが、より好ましくは宿主との適合性
を考慮した適宜な組換え用ベクターであり、更に好まし
くは遺伝子の発現を強化する手段（プロモーター等）を
伴う組換え用ベクターである。As used herein, the term "recombinant nucleic acid" refers to polynucleotides of various embodiments prepared for transformation or recombination of any host organism or host cell.
It also includes a PCR fragment for introduction into a host by homologous recombination of DNA, but more preferably an appropriate recombination vector in consideration of compatibility with the host, and further preferably means for enhancing gene expression ( It is a vector for recombination with a promoter etc.).

【００４２】組換え用ベクターには、例えばプロモータ
ー領域、ターミネーター領域等の他、抗生物質耐性遺伝
子等の選抜用の各種マーカー遺伝子等を含ませることが
できる。組換え用ベクターの種類あるいは構成は限定さ
れないが、好ましい具体例として、大腸菌で機能するｐ
ＵＣ１８、ｐＵＣ１９等を挙げることができる。大腸菌
とC. paraputrificum間のシャトルベクターであるｐ
ＪＩＲ７５１，ｐＪＩＲ７５０，ｐＪＩＲ４１８等も用
いることができる。The recombination vector can contain, for example, a promoter region, a terminator region and the like, as well as various marker genes for selection of antibiotic resistance genes and the like. The type or composition of the recombination vector is not limited, but a preferred specific example is p that functions in E. coli.
UC18, pUC19, etc. can be mentioned. A shuttle vector between E. coli and C. paraputrificum p
JIR751, pJIR750, pJIR418 and the like can also be used.

【００４３】〔組換え体〕本発明に係る組換え体は、適
宜に選ばれた宿主生物又は宿主細胞に対して上記いずれ
かの組換え核酸を導入したものである。宿主生物又は宿
主細胞の種類は、ヒトを除いて限定されない。[Recombinant] The recombinant according to the present invention is obtained by introducing any one of the above recombinant nucleic acids into an appropriately selected host organism or host cell. The type of host organism or host cell is not limited except humans.

【００４４】宿主としては、特に細菌が好ましい。細菌
としては、それぞれに好適なベクターを用いると言う前
提で、基本的には絶対嫌気性細菌、通性嫌気性細菌、好
気性細菌のいずれもが利用できる。絶対嫌気性細菌とし
ては、 Clostridium acetobutylicum、 Clostridium
perfringens 等を、通性嫌気性細菌としては、大腸菌等
を、好気性細菌としては、Bacillus subtilis等を、そ
れぞれ好ましく例示できる。遺伝子の起源微生物である
C. paraputrificumや、特にC. paraputrificum M株自
体も、もちろん宿主たり得る。As the host, bacteria are particularly preferable. As the bacterium, basically, absolutely anaerobic bacterium, facultative anaerobic bacterium, and aerobic bacterium can be used on the assumption that a suitable vector is used for each bacterium. Absolutely anaerobic bacteria include Clostridium acetobutylicum , Clostridium
Perfringens and the like can be preferably exemplified as Escherichia coli and the like as facultative anaerobic bacteria, and Bacillus subtilis and the like as aerobic bacteria. It is the microorganism of origin of the gene
The C. paraputrificum, and in particular the C. paraputrificum M strain itself, can of course also be the host.

【００４５】本発明に係る組換え体の作製、即ち本発明
に係る組換え核酸の宿主への導入に当たり、公知の各種
の遺伝子導入法、例えばカルシウム処理法、遺伝子注入
（トランスフェクション）法、パーティクルガン法、エ
レクトロポレーション法等を任意に利用することができ
る。In preparing the recombinant of the present invention, that is, in introducing the recombinant nucleic acid of the present invention into a host, various known gene introduction methods such as calcium treatment method, gene injection (transfection) method, particles The Gunn method, the electroporation method and the like can be arbitrarily used.

【００４６】〔酵素の製造方法〕本発明に係る酵素の製
造方法は、C. paraputrificum、C. paraputrificum M
株又は本発明に係る上記いずれかの組換え体を培養し、
その培養物から本発明に係る上記いずれかの酵素を取得
する方法である。この方法において、培地の種類又は組
成、培養条件等は任意に設計することができ、特段に限
定されない。[Method for Producing Enzyme] The method for producing the enzyme according to the present invention includes C. paraputrificum , C. paraputrificum M
Culturing a strain or any of the above recombinants according to the present invention,
A method for obtaining any of the above enzymes according to the present invention from the culture. In this method, the type or composition of the medium, the culture conditions, etc. can be arbitrarily designed and are not particularly limited.

【００４７】酵素を取得するに当たり、酵素についての
周知又は公知の任意の分離・精製手段を採用して酵素を
精製することができるし、酵素をラフに分離しただけの
粗酵素剤として取得することもできるし、更には培養物
をそのまま酵素含有剤として取得することもできる。In obtaining the enzyme, it is possible to purify the enzyme by using any known or known means for separating and purifying the enzyme, or to obtain the enzyme as a crude enzyme agent only roughly separated. Alternatively, the culture can be directly obtained as an enzyme-containing agent.

【００４８】〔キチンオリゴ糖の製造方法〕本発明に係
るキチンオリゴ糖の製造方法は、本発明に係る上記いず
れかの酵素をキチン又はキチン質に作用させ、少なくと
もキチンオリゴ糖を生産する方法である。この方法にお
いて、生産されたキチンオリゴ糖のみを回収しても良い
し、キチンオリゴ糖と同時に生産されるキチンの単糖即
ちＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンをも回収しても良
い。[Method for producing chitin oligosaccharide] The method for producing chitin oligosaccharide according to the present invention is a method for producing at least chitin oligosaccharide by allowing any one of the above enzymes according to the present invention to act on chitin or chitin. is there. In this method, only the produced chitin oligosaccharide may be recovered, or the chitin monosaccharide produced simultaneously with the chitin oligosaccharide, that is, N-acetyl-D-glucosamine may be recovered.

【００４９】この製造方法により得られるキチンオリゴ
糖の種類は限定されないが、ジ−Ｎ−アセチルキトビオ
ース、トリ−Ｎ−アセチルキトビオース、テトラ−Ｎ−
アセチルキトビオース、ペンタ−Ｎ−アセチルキトビオ
ース、ヘキサ−Ｎ−アセチルキトビオース等を好ましく
例示することができる。Although the kind of chitin oligosaccharide obtained by this production method is not limited, di-N-acetylchitobiose, tri-N-acetylchitobiose, tetra-N-
Preferable examples are acetyl chitobiose, penta-N-acetyl chitobiose, hexa-N-acetyl chitobiose and the like.

【００５０】「キチン」とは前記のようにβ−ポリ−Ｎ
−アセチル−Ｄ−グルコサミンであり、「キチン質」と
はキチンを含む原料、資材又は廃材を言う。キチン質と
して、例えばカニ、エビ又はロブスターの殻を含む原
料、資材又は廃材を好ましく利用できる。その他、昆虫
の羽、真菌類の細胞壁等のあらゆるキチン含有の原料、
資材又は廃材を利用することができる。“Chitin” means β-poly-N as described above.
-Acetyl-D-glucosamine, and "chitin" means a raw material, material or waste material containing chitin. As the chitin, for example, raw materials, materials or waste materials containing crab, shrimp or lobster shells can be preferably used. In addition, all chitin-containing raw materials such as insect wings and fungal cell walls,
Materials or waste materials can be used.

【００５１】[0051]

【実施例】以下の実施例において、基本的な遺伝子操作
は、T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, "Mole
cular cloning"(1982)に従って行った。EXAMPLES In the following examples, the basic genetic engineering was performed by T. Maniatis, EF Fritsch, J. Sambrook, "Mole.
cular cloning "(1982).

【００５２】〔実施例１：染色体DNA の調製およびライ
ブラリーの作製〕炭素源をグルコースとして、GS改変培
地を調製した。このGS改変培地100ml にて、C. parapu
trificum M株（以下、単に「 M株」と言う）を一晩37°
Ｃで培養させた。[Example 1: Preparation of chromosomal DNA and preparation of library] Glucose was used as a carbon source to prepare a GS modified medium. In 100 ml of this GS modified medium, C. parapu
trificum M strain (hereinafter simply referred to as "M strain") 37 ° overnight
Cultured in C.

【００５３】培養後の菌体を遠心分離(2,000×g 、5
分) し、その菌体をグルコース−リゾチーム溶液4ml で
懸濁させた後、10％(W/V)SDS( ラウリル硫酸ナトリウ
ム) 溶液8mlを加えて穏やかに混ぜた。その後、Sigma
社製のプロテイナーゼ K 10mg を加え、55°Ｃで15分間
反応させた後、2 倍量の99.5％冷エタノール24mlを加え
てDNAを沈澱させ、TE溶液6ml に溶解させた。The cultured cells were centrifuged (2,000 xg, 5
After suspending the cells in 4 ml of glucose-lysozyme solution, 8 ml of 10% (W / V) SDS (sodium lauryl sulfate) solution was added and gently mixed. Then Sigma
After adding 10 mg of Proteinase K manufactured by the company and reacting at 55 ° C. for 15 minutes, 24 ml of double cold 99.5% ethanol was added to precipitate the DNA, which was dissolved in 6 ml of TE solution.

【００５４】この溶解液を冷蔵庫で静置した後、フェノ
ール抽出〔フェノール-Tris-HCl pH8.0(0.1 ％オキシン
含有) 〕、及びクロロホルム抽出〔クロロホルム−イソ
アミルアルコール(24:1)〕を行い、2 倍量の99.5％冷エ
タノール12mlを加えてから、染色体DNA をガラス棒で巻
取り、TE溶液1ml に溶解させた。After leaving this solution still in the refrigerator, phenol extraction [phenol-Tris-HCl pH8.0 (containing 0.1% oxine)] and chloroform extraction [chloroform-isoamyl alcohol (24: 1)] were carried out, After adding 2 ml of cold 99.5% cold ethanol (12 ml), the chromosomal DNA was wound with a glass rod and dissolved in 1 ml of TE solution.

【００５５】こうして得られた M株の染色体 DNA 100μ
g を用いて、制限酵素Eco RIによる部分分解を37°Ｃで
行い、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(ア
マシャムファルマシア バイオテク製) を用いて、1000
0 から20000 塩基対に相当するDNA 断片を回収した。100 μl of the chromosomal DNA of the M strain thus obtained
Partial digestion with the restriction enzyme Eco RI was performed at 37 ° C using g, and the GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) was used.
A DNA fragment corresponding to 0 to 20000 base pairs was recovered.

【００５６】シャロミド（ニッポンジーン製；アンピシ
リン耐性）1 μg をEco RIにて完全分解し、染色体DNA
部分分解物（上記DNA 断片）をライゲーションキット v
er2.( 宝酒造製) を用いて連結させた（以下、この操作
を単に「ライゲーション」と言う）。ライゲーションさ
せた溶液をGigapack III Gold Packaging Extract(Stra
tagene製) によりファージにパッケージングさせた。こ
れを大腸菌 DH5αに感染させることにより、 M株の遺伝
子ライブラリーを作製することができた。1 μg of Charomide (Nippon Gene; ampicillin resistance) was completely digested with Eco RI to obtain chromosomal DNA.
Ligation Kit v Partially degraded product (DNA fragment above)
er2. (manufactured by Takara Shuzo) was used for ligation (hereinafter, this operation is simply referred to as “ligation”). The ligated solution was added to the Gigapack III Gold Packaging Extract (Stra
It was packaged in phages by using Tagene). By infecting this with Escherichia coli DH5α, a gene library of M strain could be prepared.

【００５７】大腸菌 DH5a の形質転換株（組換え体）
は、50μg/ml（終濃度）のアンピシリンを含むLB寒天培
地〔Sigma 社; BROTH EZMix 20.6gおよび水1L（液体培
地）、寒天培地の場合は寒天を1.5 ％となるように添
加〕で37度にて20時間培養することにより、アンピシリ
ン耐性を有する大腸菌として得られた。ライゲーショ
ン、パッケージング、及び大腸菌 DH5αへの感染は、メ
ーカーが推奨する方法に従った。Transformed strain of Escherichia coli DH5a (recombinant)
Is LB agar medium containing 50 μg / ml (final concentration) of ampicillin [Sigma; BROTH EZMix 20.6 g and water 1 L (liquid medium), agar medium is added so that agar content becomes 1.5%]. After culturing for 20 hours in E. coli, E. coli having ampicillin resistance was obtained. Ligation, packaging, and infection with E. coli DH5α followed the method recommended by the manufacturer.

【００５８】〔実施例２：組換え大腸菌の選抜〕実施例
１で得られた組換え体から、β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼを生産する大腸菌を選抜する方法として、プ
レートアッセイを用いた。任意の組換え体が生育してい
る寒天培地を、展開槽にてクロロホルム蒸気で曝すこと
により、大腸菌の細胞壁を破壊した。これに、4-メチル
ウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド[4-MU-(GlcNAc)] を終濃度が1mM となるよう、0.7 ％
寒天溶液に添加し、重層した。[Example 2: Selection of recombinant Escherichia coli] As a method for selecting Escherichia coli producing β-N-acetylglucosaminidase from the recombinant obtained in Example 1, a plate assay was used. The cell wall of Escherichia coli was destroyed by exposing the agar medium on which any recombinant was growing to chloroform vapor in a developing tank. To this, 0.7% of 4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide [4-MU- (GlcNAc)] was added so that the final concentration was 1 mM.
It was added to the agar solution and overlaid.

【００５９】寒天が固まった後、37°Ｃの恒温機で5 分
間酵素反応させると、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼを生産していた大腸菌のコロニー周辺が紫外線照射
により青く光るので、これを選抜することができる。こ
の方法により、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺
伝子が導入された組換え大腸菌を得た。After the agar has solidified, an enzyme reaction is carried out for 5 minutes in a thermostat at 37 ° C. The colonies of E. coli which produced β-N-acetylglucosaminidase shine blue due to the irradiation of ultraviolet rays, so this is selected. be able to. By this method, recombinant Escherichia coli into which the β-N-acetylglucosaminidase gene was introduced was obtained.

【００６０】又、このβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼ遺伝子（以下、「nagA」とも言う）が存在するプラ
スミドを、QIA prep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を用い
て抽出し、得られたプラスミドをpC2 と命名した。図１
に、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子とその
付近の制限酵素地図を示す。A plasmid containing the β-N-acetylglucosaminidase gene (hereinafter, also referred to as "nagA") was extracted using a QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), and the obtained plasmid was named pC2. did. Figure 1
The β-N-acetylglucosaminidase gene and a restriction enzyme map in the vicinity thereof are shown in FIG.

【００６１】〔実施例３：遺伝子及び調節遺伝子領域の
同定〕pC2 の塩基配列をLI-COR社のDNA シークエンサー
モデル4000L を用いて解析した。シークエンス反応
は、Thermo sequenase cycle sequencing kit(USB 社)
を用いた。この結果、挿入断片約 14000塩基対中のSph
I −Eco T22I断片( 図１における断片 pNAG102) 2715塩
基対に、新規なβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺
伝子及び調節遺伝子が存在することが同定された。この
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子は、 1239
塩基対からなり、アミノ酸413 をコードし、推定分子量
45531 であった。遺伝子の塩基配列と、コードされる新
規なβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのアミノ酸配
列とを、配列番号１に示す。[Example 3: Identification of genes and regulatory gene regions] The base sequence of pC2 was analyzed using a DNA sequencer model 4000L manufactured by LI-COR. Sequencing reaction: Thermo sequenase cycle sequencing kit (USB)
Was used. This resulted in an Sph in the insert of approximately 14,000 base pairs.
A novel β-N-acetylglucosaminidase gene and regulatory gene were identified to be present at 2715 base pairs of the I-Eco T22I fragment (fragment pNAG102 in FIG. 1). This β-N-acetylglucosaminidase gene is 1239
It consists of base pairs, encodes amino acid 413, and has an estimated molecular weight.
It was 45531. The nucleotide sequence of the gene and the encoded amino acid sequence of the novel β-N-acetylglucosaminidase are shown in SEQ ID NO: 1.

【００６２】〔実施例４：酵素の発現及び精製〕本発明
に係るβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（以下、単
に「本酵素」とも言う）の性質を調べるため、大腸菌に
てこの酵素を発現させ精製する目的で、まずプラスミド
を構築した。ベクターとしてpQE-30T を用いた。[Example 4: Expression and purification of enzyme] In order to investigate the properties of β-N-acetylglucosaminidase (hereinafter, also simply referred to as "the enzyme") according to the present invention, this enzyme was expressed in E. coli and purified. For this purpose, a plasmid was first constructed. PQE-30T was used as a vector.

【００６３】pQE-30T は、 pQE30（QIAGEN）を改良した
ものである。 pQE30は、目的タンパク質のN 末端アミノ
酸に6 個の連続したヒスチジン残基を付加させ（ヒスチ
ジンタグ）、これと高い親和性を有するNi-NTA( ニッケ
ルニトリロ三酢酸) カラムによりタンパク質の精製を容
易にするものである。そして、pQE-30T は、pQE-30のBa
mHI 制限酵素部位にプロテアーゼ（トロンビン）認識配
列（Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser ）をコードする塩基配列
を挿入したベクターである〔 Mursheda ら、Biosci. Bi
otechnol. Biochem. 65, pp41-47. (2001)〕。これによ
り、Ni-NTAカラム精製後のタンパク質に付加されている
ヒスチジンタグの除去が可能である。PQE-30T is an improved version of pQE30 (QIAGEN). pQE30 adds 6 consecutive histidine residues to the N-terminal amino acid of the target protein (histidine tag), and the Ni-NTA (nickel nitrilotriacetic acid) column, which has a high affinity for this, facilitates protein purification. To do. And pQE-30T is Ba of pQE-30
A vector in which a nucleotide sequence encoding a protease (thrombin) recognition sequence (Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser) is inserted into the mHI restriction enzyme site [Mursheda et al., Biosci. Bi.
otechnol. Biochem. 65, pp41-47. (2001)]. As a result, it is possible to remove the histidine tag added to the protein after the Ni-NTA column purification.

【００６４】又、本酵素は、大腸菌内で機能するシグナ
ルペプチド（酵素活性には関与しない領域）をN 末端側
に有していることが推定されたことから、大腸菌で切断
される可能性があった。このため、本酵素のシグナルペ
プチド部分と推定されるN 末端側23アミノ酸を除去した
タンパク質を発現させる必要があった。従って、N 末端
側から24番目のアミノ酸であるスレオニンから、413 番
目のリジンまでをコードする塩基配列を増幅できるプラ
イマーをデザインした。Since the enzyme was presumed to have a signal peptide (a region not involved in enzyme activity) that functions in E. coli at the N-terminal side, it may be cleaved in E. coli. there were. Therefore, it was necessary to express a protein in which 23 amino acids at the N-terminal side, which are presumed to be the signal peptide portion of this enzyme, were removed. Therefore, we designed a primer that can amplify the nucleotide sequence encoding the 24th amino acid from the N-terminal side, threonine, to the 413th lysine.

【００６５】なお、フォワードプライマーとしては、Ba
mHI 制限酵素部位が挿入された配列表の配列番号２に示
す塩基配列からなるプライマーを用い、リバースプライ
マーとしては、終始コドンの下流にSalI制限酵素部位が
挿入された配列表の配列番号３に示す塩基配列からなる
プライマーを用いた。PCR による目的遺伝子断片の増幅
は、LA-Taqポリメラーゼ(TAKARA)を用いて行った。鋳型
DNA としてプラスミドpC2 を用いた。As the forward primer, Ba
A primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing with the inserted mHI restriction enzyme site was used. As the reverse primer, shown in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing with the SalI restriction enzyme site inserted downstream of the stop codon. A primer consisting of a nucleotide sequence was used. Amplification of the target gene fragment by PCR was performed using LA-Taq polymerase (TAKARA). template
The plasmid pC2 was used as DNA.

【００６６】PCR の反応液の組成は次の通りである。即
ち、LA-Taqポリメラーゼ緩衝液 5μl 、dNTP mix 5μl
、 LA-Taq ポリメラーゼ0.5 μl 、フォワードプライ
マー10pmol、リバースプライマー10pmol、全量50μl に
なるように滅菌水で調整した。PCR 反応は、95°Ｃで5
分放置した後、95°Ｃで30秒：58°Ｃで30秒：72°Ｃで
2 分を1 サイクルとして、30サイクル繰り返した。最後
に72°Ｃで5 分放置した後、4 °Ｃに冷却した。The composition of the PCR reaction solution is as follows. That is, 5 μl of LA-Taq polymerase buffer, 5 μl of dNTP mix
, LA-Taq polymerase 0.5 μl, forward primer 10 pmol, reverse primer 10 pmol, and a total volume of 50 μl was adjusted with sterile water. PCR reaction at 95 ° C for 5
30 minutes at 95 ° C: 58 ° C, 30 seconds: 72 ° C
Repeating 30 minutes with 2 minutes as one cycle. Finally, it was left at 72 ° C for 5 minutes and then cooled to 4 ° C.

【００６７】反応液をQIA quick PCR Purification Kit
(QIAGEN)を用いてPCR 産物を精製し、BamHI およびSalI
にて制限酵素消化し、同じくBamHI およびSalIにて制限
酵素消化したpQE30 にライゲーションキット ver2.( 宝
酒造製) を用いて連結し、プラスミドpQE-NAG1を得た。
このプラスミドを用いて大腸菌M15 株(QIAGEN)を常法に
従い形質転換し、50μg/ml（終濃度）のアンピシリンを
含むLB寒天培地でコロニーを形成したものを選択した。The reaction solution was added to the QIA quick PCR Purification Kit.
The PCR product was purified using (QIAGEN), BamHI and SalI
Was ligated with ligation kit ver2. (Manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) to pQE30 digested with the restriction enzyme with and digested with BamHI and SalI to obtain plasmid pQE-NAG1.
Escherichia coli M15 strain (QIAGEN) was transformed with this plasmid according to a conventional method, and colonies were formed on LB agar medium containing 50 μg / ml (final concentration) of ampicillin, and selected.

【００６８】タンパク質の精製はHi Trap chelating HP
カラム〔 (アマシャムファルマシアバイオテク（株）〕
を用い、メーカーが推奨する方法に従って精製した。得
られた精製画分を、50 mM Tris-HCl buffer (pH8.0) で
一晩透析を行い、トロンビン〔ナカライテスク（株）〕
をタンパク質1mg あたり10 unit 添加し、20°Ｃで一晩
反応させて、目的タンパク質とヒスチジンタグを切断し
た。Protein purification is performed by Hi Trap chelating HP
Column [(Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.]
Was used according to the method recommended by the manufacturer. The obtained purified fraction was dialyzed against 50 mM Tris-HCl buffer (pH8.0) overnight, and thrombin was added [Nacalai Tesque, Inc.].
Was added at 10 units per 1 mg of protein and reacted overnight at 20 ° C. to cleave the target protein and histidine tag.

【００６９】反応後の本酵素はヒスチジンタグを有さな
いので、再度Hi Trap chelating HPカラムに供して、カ
ラムに結合しないタンパク質を回収し、次に同緩衝液に
て平衡化したイオン交換クロマトグラフィー MonoQ〔ア
マシャムファルマシアバイオテク（株）〕に通した。カ
ラムを同緩衝液にて洗浄し、次いで25mlの 0M 〜1.0M食
塩の直線濃度勾配で本酵素を溶離した。精製した本酵素
の分子量は、SDS-PAGE上で約43000 であった。図２に、
本酵素のSDS-PAGEと活性染色を示す。図２におけるレー
ンＭはマーカー、レーン１は本酵素のSDS-PAGE、レーン
２は本酵素の活性染色である。Since the present enzyme after the reaction does not have a histidine tag, it was subjected to a Hi Trap chelating HP column again to recover the protein that did not bind to the column, and then ion exchange chromatography equilibrated with the same buffer solution. It passed MonoQ [Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.]. The column was washed with the same buffer, and then the enzyme was eluted with 25 ml of a linear concentration gradient of 0 M to 1.0 M sodium chloride. The molecular weight of the purified enzyme was about 43000 on SDS-PAGE. In Figure 2,
The SDS-PAGE and activity staining of this enzyme are shown. In FIG. 2, lane M is a marker, lane 1 is SDS-PAGE of this enzyme, and lane 2 is activity staining of this enzyme.

【００７０】〔実施例５：本酵素の性質〕本発明に係る
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの性質を調べるた
め、以下の3 種の基質に対する活性を評価した。 4- メチルウンベリフェリル -N-アセチル- β-D- グ
ルコサミニド〔 4-MU- (GlcNAc) ; Sigma 社〕 4- メチルウンベリフェリル- β-D -N-N' -ジアセチ
ルキトビオシド〔 4-MU-(GlcNAc)２ ; Sigma社〕 4- メチルウンベリフェリル- β-D -N-N' - N ''-ト
リアセチルキトトリオシド〔4-MU- (GlcNAc)３ ; Sigm
a 社〕。[Example 5: Properties of the present enzyme] In order to investigate the properties of β-N-acetylglucosaminidase according to the present invention, the activity against the following three types of substrates was evaluated. 4-Methylumbelliferyl-N-Acetyl-β-D-Glucosaminide 〔4-MU- (GlcNAc) ； Sigma Co.） 4-Methylumbelliferyl-β-D-NN'-Diacetylchitobioside 〔4-MU -(GlcNAc) 2; Sigma] 4-methylumbelliferyl-β-D-NN'-N ''-triacetylchitotrioside [4-MU- (GlcNAc) 3; Sigm
Company a].

【００７１】上記の3 種の基質は、N , N '-ジメチルホ
ルムアミドに対してそれぞれ 10mMになるように溶解さ
せたものを用いた。反応液の組成としては、10mMリン酸
緩衝液（pH7.0 ）490 μl に、5 μl の本酵素液と、5
μl の各基質（終濃度0.1mM）を添加したものとし、37
°Ｃで10分間反応させた。そして反応後遊離してくる4-
メチルウンベリフェロンを蛍光光度計で測定した（励起
355nm 、蛍光465nm ）。The above three kinds of substrates were used after being dissolved in N, N'-dimethylformamide so as to have a concentration of 10 mM each. The composition of the reaction solution was as follows: 490 μl of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0), 5 μl of this enzyme solution, and
37 μl of each substrate (final concentration 0.1 mM) was added.
The reaction was performed at ° C for 10 minutes. And after the reaction 4-
Methylumbelliferone was measured with a fluorometer (excitation
355nm, fluorescence 465nm).

【００７２】本酵素は4-MU- (GlcNAc)に対して45.0 U/m
g の活性を示した。4-MU-(GlcNAc)２に対しては0.88 U/
mg の活性を示した。4-MU- (GlcNAc)３ に対しては0.0
6 U/mgの活性を示した。それぞれの基質に対するKm、Vm
axを表１に示す。This enzyme was 45.0 U / m with respect to 4-MU- (GlcNAc).
The activity of g was shown. 0.88 U / for 4-MU- (GlcNAc) 2
It showed the activity of mg. 0.0 for 4-MU- (GlcNAc) 3
It showed an activity of 6 U / mg. Km, Vm for each substrate
Table 1 shows ax.

【００７３】[0073]

【表１】 次にキトオリゴ糖に対する本酵素の活性を調べた。キト
オリゴ糖としては、ジ−Ｎ−アセチルキトビオース、ト
リ−Ｎ−アセチルキトビオース、テトラ−Ｎ−アセチル
キトビオース、ペンタ−Ｎ−アセチルキトビオース、ヘ
キサ−Ｎ−アセチルキトビオース（すべて生化学工業
（株））を用い、コントロールとしてＮ−アセチル−Ｄ
−グルコサミン（ナカライテスク）を用いた。[Table 1] Next, the activity of this enzyme for chitooligosaccharide was examined. Examples of chitooligosaccharides include di-N-acetylchitobiose, tri-N-acetylchitobiose, tetra-N-acetylchitobiose, penta-N-acetylchitobiose, hexa-N-acetylchitobiose ( All were manufactured by Seikagaku Corporation, and N-acetyl-D was used as a control.
-Glucosamine (Nacalai Tesque) was used.

【００７４】10 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.0)
に対して各キトオリゴ糖が0.4 モルになるように添加
し、これらの100 mlに対し本酵素を添加して、37°Ｃで
6 時間反応させた。そしてその反応産物を薄層クロマト
グラフィーで調べた。10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)
Each chitooligosaccharide was added to 0.4 mol to 100 ml, and this enzyme was added to 100 ml of these at 37 ° C.
Allowed to react for 6 hours. The reaction product was then examined by thin layer chromatography.

【００７５】シリカゲルプレート(Kieselgel 60 、Merc
k 社) に反応産物をキャピラリーを用いてスポットし、
n-ブタノール：メタノール：28％アンモニア水：水＝
５：４：２：１の溶媒を用いて展開槽内で展開した。2
時間展開したのち、ジフェニルアミン−アニリン−リン
酸試薬 (0.4 g ジフェニルアミン, 0.4 mlアニリン, 3m
l 85 ％リン酸, 20 ml アセトン) をプレートにスプレ
ーして、80°Ｃで20分加熱させ、現れたスポットを確認
した。その結果を図３に示す。Silica gel plate (Kieselgel 60, Merc
(K company), spot the reaction product using a capillary,
n-butanol: methanol: 28% ammonia water: water =
It was developed in a developing tank using a solvent of 5: 4: 2: 1. 2
After time development, diphenylamine-aniline-phosphate reagent (0.4 g diphenylamine, 0.4 ml aniline, 3 m
85% phosphoric acid, 20 ml acetone) was sprayed on the plate and heated at 80 ° C for 20 minutes, and spots appeared were confirmed. The result is shown in FIG.

【００７６】図３において、C1はＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンを、C2はジ−Ｎ−アセチルキトビオースを、
C3はトリ−Ｎ−アセチルキトビオースを、C4はテトラ−
Ｎ−アセチルキトビオースを、C5はペンタ−Ｎ−アセチ
ルキトビオースを、それぞれ示す。又、レーン St は標
準マーカーをスポットしたものである。レーン R1 はＮ
−アセチル−Ｄ−グルコサミンを基質にしたときの反応
産物をスポットしたもの、レーン R2 はジ−Ｎ−アセチ
ルキトビオースを基質にしたときの反応産物をスポット
したもの、レーン R3 はトリ−Ｎ−アセチルキトビオー
スを基質にしたときの反応産物をスポットしたもの、レ
ーン R4 はテトラ−Ｎ−アセチルキトビオースを基質に
したときの反応産物をスポットしたもの、レーン R5 は
ペンタ−Ｎ−アセチルキトビオースを基質にしたときの
反応産物をスポットしたもの、レーン R6 はヘキサ−Ｎ
−アセチルキトビオースを基質にしたときの反応産物を
スポットしたものである。In FIG. 3, C1 is N-acetyl-D-glucosamine, C2 is di-N-acetylchitobiose,
C3 is tri-N-acetylchitobiose, C4 is tetra-
N-acetylchitobiose and C5 represent penta-N-acetylchitobiose, respectively. Lane St is a spotted standard marker. Lane R1 is N
-Acetyl-D-glucosamine was used as a substrate for spotting the reaction product, lane R2 was spotting the reaction product for using di-N-acetylchitobiose as a substrate, and lane R3 was for tri-N-. The reaction product when acetyl chitobiose was used as the substrate was spotted, lane R4 was the reaction product when tetra-N-acetyl chitobiose was used as the substrate, and lane R5 was the penta-N-acetyl chitose. The reaction product spotted with tobiose as a substrate, lane R6 is hexa-N
-Spotted reaction products using acetylchitobiose as a substrate.

【００７７】更に、ボールミル処理したキチン粉末を基
質として用いて、同様に本酵素の活性を調べた結果、反
応産物としてＮ- アセチル−Ｄ−グルコサミンの生成が
確認された。その結果を図４に示す。Furthermore, the activity of this enzyme was examined in the same manner using the ball milled chitin powder as a substrate, and it was confirmed that N-acetyl-D-glucosamine was produced as a reaction product. The result is shown in FIG.

【００７８】図４において、C1〜C5は図３の場合と同じ
意味であり、レーン St は標準マーカーをスポットした
ものである。レーン B1 はボールミル処理したキチンの
みをスポットしたものであり、レーン B2 はボールミル
処理したキチンを基質にしたときの反応産物をスポット
したものである。In FIG. 4, C1 to C5 have the same meanings as in the case of FIG. 3, and the lane St is spotted with a standard marker. Lane B1 shows spots of only ball milled chitin, and Lane B2 shows spots of reaction products obtained by using ball milled chitin as a substrate.

【００７９】以上の結果から、キチンに本酵素を作用さ
せた場合の最終産物はＮ- アセチル−Ｄ−グルコサミン
であり、又、本酵素はキチンあるいはキチンオリゴ糖を
末端側から単糖単位で切断することが分かる。なお、本
酵素 5μg でボールミル処理したキチン粉末を30時間反
応させることにより、0.3ng のＮ- アセチル−Ｄ−グル
コサミンが得られる。From the above results, the final product when this enzyme is allowed to act on chitin is N-acetyl-D-glucosamine, and this enzyme cleaves chitin or chitin oligosaccharide from the terminal side in monosaccharide units. I know what to do. By reacting chitin powder ball-milled with 5 μg of this enzyme for 30 hours, 0.3 ng of N-acetyl-D-glucosamine can be obtained.

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Japan Science and Technology Corporation <110> Mie University <120> 遺伝子、酵素、酵素の製造方法、キチンオリゴ糖の製造方法 <130> POK-02-002 <160> 1 <210> 1 <211> 1239 <212> DNA <213> Clostridium paraputrificum <400> 1 atg aga aaa tta tta att tca gca gct ctt act ctt aca atg att ggt 48 Met Arg Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Leu Thr Leu Thr Met Ile Gly 1 5 10 15 gga gtt aca gct agt tcg gct act att tta aca ggg aaa aat gaa agt 96 Gly Val Thr Ala Ser Ser Ala Thr Ile Leu Thr Gly Lys Asn Glu Ser 20 25 30 att aac aaa aaa gta gaa gat aaa ata agt aca atg aca tta gaa gag 144 Ile Asn Lys Lys Val Glu Asp Lys Ile Ser Thr Met Thr Leu Glu Glu 35 40 45 aaa gta gga caa atg atg ttc tac gga gtt aat ggg acg aat gta gat 192 Lys Val Gly Gln Met Met Phe Tyr Gly Val Asn Gly Thr Asn Val Asp 50 55 60 gat aaa gta gta aat tta ttt gaa gat caa cat gca gga ggc att att 240 Asp Lys Val Val Asn Leu Phe Glu Asp Gln His Ala Gly Gly Ile Ile 65 70 75 80 tta tat ggt cat aga aac ttt tgg gga agt agt tta gat aat aat gtt 288 Leu Tyr Gly His Arg Asn Phe Trp Gly Ser Ser Leu Asp Asn Asn Val 85 90 95 aag tat gta aat tca att aaa aaa gct aac aga caa aat agt gat ata 336 Lys Tyr Val Asn Ser Ile Lys Lys Ala Asn Arg Gln Asn Ser Asp Ile 100 105 110 cct tta ttt att ggg ttt gat gaa gaa gga gga agt atg tca caa ttg 384 Pro Leu Phe Ile Gly Phe Asp Glu Glu Gly Gly Ser Met Ser Gln Leu 115 120 125 cct cag gag tta atg aga aca cct tct aaa gga gag tta gga aat aca 432 Pro Gln Glu Leu Met Arg Thr Pro Ser Lys Gly Glu Leu Gly Asn Thr 130 135 140 aat gat tca agt tta gca act gga ata gga gct ggt act gct aaa aaa 480 Asn Asp Ser Ser Leu Ala Thr Gly Ile Gly Ala Gly Thr Ala Lys Lys 145 150 155 160 tta aag cta tta gga ata aat acg gat ttt ggt act gtt tta gat att 528 Leu Lys Leu Leu Gly Ile Asn Thr Asp Phe Gly Thr Val Leu Asp Ile 165 170 175 aat act aat aaa aat aat cca att ata ggg gta aga tct tat ggc tca 576 Asn Thr Asn Lys Asn Asn Pro Ile Ile Gly Val Arg Ser Tyr Gly Ser 180 185 190 aca aag gaa aag gta aca gag ttt ggt att aat gaa cta aaa gca ata 624 Thr Lys Glu Lys Val Thr Glu Phe Gly Ile Asn Glu Leu Lys Ala Ile 195 200 205 caa aat gaa ggg gta atc cca aca gta aaa cat ttt ccg gga cat gga 672 Gln Asn Glu Gly Val Ile Pro Thr Val Lys His Phe Pro Gly His Gly 210 215 220 gat acg gag gtg gat tct cat tta ggg cta cca tca ttg aat cat gat 720 Asp Thr Glu Val Asp Ser His Leu Gly Leu Pro Ser Leu Asn His Asp 225 230 235 240 tta aat aga tta aaa agt aca gaa ctt gtt cct ttt caa act gcc ata 768 Leu Asn Arg Leu Lys Ser Thr Glu Leu Val Pro Phe Gln Thr Ala Ile 245 250 255 aat aat gga gta gac atg gta atg aca gca cat att atg ctt cca caa 816 Asn Asn Gly Val Asp Met Val Met Thr Ala His Ile Met Leu Pro Gln 260 265 270 att gat aaa gag tac cca gca act atg tct aaa aag ata cta aca gac 864 Ile Asp Lys Glu Tyr Pro Ala Thr Met Ser Lys Lys Ile Leu Thr Asp 275 280 285 ttg tta cgt gat gaa atg ggt tat aaa gga gtt att att act gat gat 912 Leu Leu Arg Asp Glu Met Gly Tyr Lys Gly Val Ile Ile Thr Asp Asp 290 295 300 ctt gaa atg caa gct ata agt aag aac tgg gat tta gga gaa gct gca 960 Leu Glu Met Gln Ala Ile Ser Lys Asn Trp Asp Leu Gly Glu Ala Ala 305 310 315 320 ata aaa tca gtt gag gca ggt gca gat att tta tta gtt tgc cat aca 1008 Ile Lys Ser Val Glu Ala Gly Ala Asp Ile Leu Leu Val Cys His Thr 325 330 335 ata gaa aat caa caa aaa gta tat aat gct gta gtt caa gga gtt aat 1056 Ile Glu Asn Gln Gln Lys Val Tyr Asn Ala Val Val Gln Gly Val Asn 340 345 350 gat gga aag att gat gaa aat agg ata gat gaa agt gtt aga aga att 1104 Asp Gly Lys Ile Asp Glu Asn Arg Ile Asp Glu Ser Val Arg Arg Ile 355 360 365 tta aga tta aaa tat caa tat aaa ctt tct gac aag gca aat aat cct 1152 Leu Arg Leu Lys Tyr Gln Tyr Lys Leu Ser Asp Lys Ala Asn Asn Pro 370 375 380 act caa gat gat ata aat aat gta aat ggc ttc ata tat gaa agc ata 1200 Thr Gln Asp Asp Ile Asn Asn Val Asn Gly Phe Ile Tyr Glu Ser Ile 385 390 395 400 caa aag tat aat tct aaa gta gtt gaa gca atg tat aaa 1239 Gln Lys Tyr Asn Ser Lys Val Val Glu Ala Met Tyr Lys 405 410 414 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ggatccacta ttttaacagg gaaaaatg 28 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gtcgacctat ttatacattg cttcaactac 30[Sequence list]                   SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <110> Mie University <120> Gene, enzyme, method for producing enzyme, method for producing chitin oligosaccharide <130> POK-02-002 <160> 1 <210> 1 <211> 1239 <212> DNA <213> Clostridium paraputrificum <400> 1 atg aga aaa tta tta att tca gca gct ctt act ctt aca atg att ggt 48 Met Arg Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Leu Thr Leu Thr Met Ile Gly  1 5 10 15 gga gtt aca gct agt tcg gct act att tta aca ggg aaa aat gaa agt 96 Gly Val Thr Ala Ser Ser Ala Thr Ile Leu Thr Gly Lys Asn Glu Ser              20 25 30 att aac aaa aaa gta gaa gat aaa ata agt aca atg aca tta gaa gag 144 Ile Asn Lys Lys Val Glu Asp Lys Ile Ser Thr Met Thr Leu Glu Glu          35 40 45 aaa gta gga caa atg atg ttc tac gga gtt aat ggg acg aat gta gat 192 Lys Val Gly Gln Met Met Phe Tyr Gly Val Asn Gly Thr Asn Val Asp      50 55 60 gat aaa gta gta aat tta ttt gaa gat caa cat gca gga ggc att att 240 Asp Lys Val Val Asn Leu Phe Glu Asp Gln His Ala Gly Gly Ile Ile  65 70 75 80 tta tat ggt cat aga aac ttt tgg gga agt agt tta gat aat aat gtt 288 Leu Tyr Gly His Arg Asn Phe Trp Gly Ser Ser Leu Asp Asn Asn Val                  85 90 95 aag tat gta aat tca att aaa aaa gct aac aga caa aat agt gat ata 336 Lys Tyr Val Asn Ser Ile Lys Lys Ala Asn Arg Gln Asn Ser Asp Ile             100 105 110 cct tta ttt att ggg ttt gat gaa gaa gga gga agt atg tca caa ttg 384 Pro Leu Phe Ile Gly Phe Asp Glu Glu Gly Gly Ser Met Ser Gln Leu         115 120 125 cct cag gag tta atg aga aca cct tct aaa gga gag tta gga aat aca 432 Pro Gln Glu Leu Met Arg Thr Pro Ser Lys Gly Glu Leu Gly Asn Thr     130 135 140 aat gat tca agt tta gca act gga ata gga gct ggt act gct aaa aaa 480 Asn Asp Ser Ser Leu Ala Thr Gly Ile Gly Ala Gly Thr Ala Lys Lys 145 150 155 160 tta aag cta tta gga ata aat acg gat ttt ggt act gtt tta gat att 528 Leu Lys Leu Leu Gly Ile Asn Thr Asp Phe Gly Thr Val Leu Asp Ile                 165 170 175 aat act aat aaa aat aat cca att ata ggg gta aga tct tat ggc tca 576 Asn Thr Asn Lys Asn Asn Pro Ile Ile Gly Val Arg Ser Tyr Gly Ser             180 185 190 aca aag gaa aag gta aca gag ttt ggt att aat gaa cta aaa gca ata 624 Thr Lys Glu Lys Val Thr Glu Phe Gly Ile Asn Glu Leu Lys Ala Ile         195 200 205 caa aat gaa ggg gta atc cca aca gta aaa cat ttt ccg gga cat gga 672 Gln Asn Glu Gly Val Ile Pro Thr Val Lys His Phe Pro Gly His Gly     210 215 220 gat acg gag gtg gat tct cat tta ggg cta cca tca ttg aat cat gat 720 Asp Thr Glu Val Asp Ser His Leu Gly Leu Pro Ser Leu Asn His Asp 225 230 235 240 tta aat aga tta aaa agt aca gaa ctt gtt cct ttt caa act gcc ata 768 Leu Asn Arg Leu Lys Ser Thr Glu Leu Val Pro Phe Gln Thr Ala Ile                 245 250 255 aat aat gga gta gac atg gta atg aca gca cat att atg ctt cca caa 816 Asn Asn Gly Val Asp Met Val Met Thr Ala His Ile Met Leu Pro Gln             260 265 270 att gat aaa gag tac cca gca act atg tct aaa aag ata cta aca gac 864 Ile Asp Lys Glu Tyr Pro Ala Thr Met Ser Lys Lys Ile Leu Thr Asp         275 280 285 ttg tta cgt gat gaa atg ggt tat aaa gga gtt att att act gat gat 912 Leu Leu Arg Asp Glu Met Gly Tyr Lys Gly Val Ile Ile Thr Asp Asp     290 295 300 ctt gaa atg caa gct ata agt aag aac tgg gat tta gga gaa gct gca 960 Leu Glu Met Gln Ala Ile Ser Lys Asn Trp Asp Leu Gly Glu Ala Ala 305 310 315 320 ata aaa tca gtt gag gca ggt gca gat att tta tta gtt tgc cat aca 1008 Ile Lys Ser Val Glu Ala Gly Ala Asp Ile Leu Leu Val Cys His Thr                 325 330 335 ata gaa aat caa caa aaa gta tat aat gct gta gtt caa gga gtt aat 1056 Ile Glu Asn Gln Gln Lys Val Tyr Asn Ala Val Val Gln Gly Val Asn             340 345 350 gat gga aag att gat gaa aat agg ata gat gaa agt gtt aga aga att 1104 Asp Gly Lys Ile Asp Glu Asn Arg Ile Asp Glu Ser Val Arg Arg Ile         355 360 365 tta aga tta aaa tat caa tat aaa ctt tct gac aag gca aat aat cct 1152 Leu Arg Leu Lys Tyr Gln Tyr Lys Leu Ser Asp Lys Ala Asn Asn Pro     370 375 380 act caa gat gat ata aat aat gta aat ggc ttc ata tat gaa agc ata 1200 Thr Gln Asp Asp Ile Asn Asn Val Asn Gly Phe Ile Tyr Glu Ser Ile 385 390 395 400 caa aag tat aat tct aaa gta gtt gaa gca atg tat aaa 1239 Gln Lys Tyr Asn Ser Lys Val Val Glu Ala Met Tyr Lys                 405 410 414 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ggatccacta ttttaacagg gaaaaatg 28 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gtcgacctat ttatacattg cttcaactac 30

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明に係る遺伝子とその付近の制限酵素地図
である。FIG. 1 is a restriction map of the gene of the present invention and its vicinity.

【図２】本酵素のSDS-PAGEと活性染色を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing SDS-PAGE and activity staining of this enzyme.

【図３】実施例に係る反応産物の薄層クロマトグラフィ
ーを示す図である。FIG. 3 is a diagram showing thin layer chromatography of a reaction product according to an example.

【図４】実施例に係る反応産物の薄層クロマトグラフィ
ーを示す図である。FIG. 4 is a diagram showing thin layer chromatography of a reaction product according to an example.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ０８Ｂ 37/08 Ａ Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ０８Ｂ 37/08 5/00 Ａ (72)発明者 木村 哲哉 三重県鈴鹿市白子駅前11−18 ロイヤルハ イツ白子駅402 (72)発明者 森本 兼司 三重県津市栗真町屋町1625−39 Ｍハイツ 2103号 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 AA17 BA80 CA01 CA02 GA11 HA20 4B050 CC03 DD02 EE10 LL05 4B064 AF04 CA21 CB07 CC24 CD19 DA01 DA10 DA16 4B065 AA23Y AB01 AC14 BA01 BB18 CA21 CA31 CA41 CA44 CA54 4C090 AA03 AA04 BA46 CA43 DA23 DA27 DA40 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) C12N 9/24 C08B 37/08 A C12P 19/04 C12N 15/00 ZNAA // C08B 37/08 5/00 A (72) Inventor Tetsuya Kimura 11-18, Shiroko Station, Suzuka-shi, Mie Royal Heights Shirako Station 402 (72) Inventor, Kenji Morimoto 1625-39, Kurimamachiyacho, Tsu-shi, Mie M Heights 2103 F Term (reference) 4B024 AA01 AA05 AA17 BA80 CA01 CA02 GA11 HA20 4B050 CC03 DD02 EE10 LL05 4B064 AF04 CA21 CB07 CC24 CD19 DA01 DA10 DA16 4B065 AA23Y AB01 AC14 BA01 BB18 CA21 CA31 CA41 CA44 CA54 4C090 AA03 AA04 BA46 CA43 DA23 DA23 DA23 DA27

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列表の配列番号１に示す塩基配列を有
することを特徴とする遺伝子。1. A gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. 【請求項２】 配列表の配列番号１に示す塩基配列又は
これと相補的な塩基配列を有するDNA に対してストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有
し、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子として
機能することを特徴とする遺伝子。2. A β-N-acetylglucosaminidase having a base sequence which hybridizes to a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing or a base sequence complementary thereto under stringent conditions. A gene characterized by functioning as a gene. 【請求項３】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
を有することを特徴とする酵素。3. An enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. 【請求項４】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
において５個以下のアミノ酸が置換、欠失又は付加され
たアミノ酸配列を有し、β−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼとして機能することを特徴とする酵素。4. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing has an amino acid sequence in which 5 or less amino acids are substituted, deleted or added, and functions as β-N-acetylglucosaminidase. enzyme. 【請求項５】 請求項２に記載の遺伝子によりコードさ
れるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする
酵素。5. An enzyme having an amino acid sequence encoded by the gene according to claim 2. 【請求項６】 請求項１又は請求項２に記載の遺伝子を
含むことを特徴とする組換え核酸。6. A recombinant nucleic acid comprising the gene according to claim 1 or 2. 【請求項７】 請求項６に記載の組換え核酸を導入した
宿主であることを特徴とする組換え体。7. A recombinant, which is a host into which the recombinant nucleic acid according to claim 6 has been introduced. 【請求項８】 クロストリジウム・パラプトリフィカム
（ Clostridium paraputrificum）、クロストリジウム
・パラプトリフィカム M株又は請求項７に記載の組換え
体を培養し、その培養物から請求項３〜請求項５のいず
れかに記載の酵素を取得することを特徴とする酵素の製
造方法。8. Clostridium paraputrificum , Clostridium paraputrificum M strain, or the recombinant of claim 7, is cultured, and the culture thereof is used to remove the strain of claim 3 to claim 5. A method for producing an enzyme, comprising obtaining the enzyme according to any one of the claims. 【請求項９】 請求項３〜請求項５のいずれかに記載の
酵素をキチン又はキチン質に作用させ、少なくともキチ
ンオリゴ糖を生産することを特徴とするキチンオリゴ糖
の製造方法。9. A method for producing a chitin oligosaccharide, which comprises reacting chitin or chitin with the enzyme according to claim 3 to produce at least a chitin oligosaccharide.