JP2003310246A - 青果物の発酵処理方法及び青果物の発酵に適した微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 リンゴの搾り粕等の比較的グルコース等の発
酵源が少ない青果物であっても、発酵法によってエタノ
ールや酢酸を効率よく製造することができるようにす
る。 【解決手段】 青果物としてのリンゴの搾り粕に微生物
を作用させて発酵させるもので、（１）流動状の青果物
のグルコースを増加させる前処理工程と、（２）流動状
の青果物にカンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓ
ｈｅｈａｔａｅ）の性質を有する変異株からなる微生物
を接種してエタノールを得るエタノール発酵工程と、
（３）酢酸菌を接種して酢酸を得る酢酸発酵工程とを備
えた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、青果物に微生物を
作用させて発酵させる青果物の発酵処理方法及びこれに
適した微生物に係り、特に、発酵によりエタノールを製
造できるようにした青果物の発酵処理方法及び青果物の
発酵に適した微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、青果物に微生物を作用させて発酵
させる青果物の発酵処理方法として、例えば、エタノー
ルを得るエタノール発酵の場合で説明すると、これに適
したエタノール発酵はサッカロマイセス・セルビシエを
用いた方法が知られており、発酵条件を整えて、最高で
２０％ものエタノールを生成できる。ところで、近年、
廃棄物の有効利用を図る研究が盛んに行なわれており、
例えば、青果物としてのリンゴの搾り粕についても、そ
の研究が行なわれている。このような背景から、本願発
明者等は、リンゴの搾り粕を発酵処理して、エタノール
や酢酸を製造する技術を研究してきている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
サッカロマイセス・セルビシエを用いた方法によれば、
エタノール発酵の原料としての糖類はグルコース、ガラ
クトース等に限定されるために、リンゴの搾り粕におい
てはグルコース等の発酵源が少なく、このようなリンゴ
の搾り粕等を原料とする場合には、酵素処理等の複雑な
処理工程を必要とする。リンゴ酒等の製造法、すなわ
ち、果糖等を多く含んでいるリンゴなどを原材料として
無調整でエタノールを生成する方法にはＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉと醸造用のＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを混醸するような
方法（特公平３−７３５５号公報等参照）はあるが、リ
ンゴの搾り粕には発酵源である単糖類、二糖類が極めて
少なく、その利用が難しい。

【０００４】また、サッカロマイセス・セルビシエ以外
の微生物を用いることも考えられるが、リンゴの搾り粕
等の原材料から、効率的にエタノールを生成するための
条件設定等が難しく、特に、増殖期に５％を越えるエタ
ノールを含む培養液に耐性を示すような微生物の菌株を
作出することが困難な状況であった。

【０００５】本発明は、上記の問題点に鑑みてなされた
もので、リンゴの搾り粕等の比較的グルコース等の発酵
源が少ない青果物であっても、発酵法によってエタノー
ルや酢酸を効率よく製造することのできる青果物の発酵
処理方法及び青果物の発酵に適した微生物を提供するこ
とを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本願発明者等は、リンゴ
の搾り粕等の青果物からエタノールや酢酸を製造するた
めに、重要な工程の一つであるエタノール発酵工程にエ
タノール生成能が高い性質を有する微生物の研究を行な
い、微生物として、カンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉ
ｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）に着目した。即ち、上記課題
を解決するための本発明の技術的手段は、青果物に微生
物を作用させて発酵させる青果物の発酵処理方法におい
て、流動状の青果物にカンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）の性質を有する微生物を接
種してエタノールを得るエタノール発酵工程を備えた構
成としている。

【０００７】そして、必要に応じ、上記エタノール発酵
工程後に、酢酸菌を接種して酢酸を得る酢酸発酵工程を
備えた構成としている。また、必要に応じ、上記青果物
として、リンゴの搾り粕を用いた構成としている。

【０００８】特に、必要に応じ、上記微生物は、経済産
業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所の特許
生物寄託センターに、寄託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−１８８
２９」として寄託されたカンジダ・シャハタエ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）の変異株（変種株）であ
るカンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａ
ｔａｅ）ＨＹＯ−５０３株である構成としている。

【０００９】詳しくは、微生物として、カンジダ・シャ
ハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）ＨＹＯ−
５０３株を開発し、特に、リンゴの搾り粕等の比較的グ
ルコース等の発酵源が少ない青果物に有効になるよう
に、前処理工程として熱処理や酵素処理を行ない、前処
理工程で得られた原料に上記の菌株を接種し、最適条件
下で制御したエタノール発酵工程を行ない、次いで、酢
酸菌を接種して酢酸発酵工程を行なう方法を発明した。

【００１０】バイオマス材料であるリンゴの搾り粕等か
ら発酵によって酢酸を製造するには、エタノール発酵工
程の効率化は非常に重要である。本発明では、Ｃａｎｄ
ｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ ＩＡＭ １２９５３菌株を
親株として、紫外線（ＵＶ）にて変異処理を行ない、
５．０％エタノールを含んだポテトデキストロース寒天
培地で、増殖する菌株多数を得た。そのうちポテトデキ
ストロース寒天培地で最もエタノール変換率の高い変異
株ＨＹＯ−５０３株を得た。このＨＹＯ−５０３株を
５．０％エタノールポテトデキストロース寒天培地１０
ｍＬに１％の割合で接種し、３０℃で５日間の静置培養
した。

【００１１】この操作を繰り返して行ない、５．０％エ
タノールを含む液体培地で順化した後に、さらに高濃度
のエタノールに耐えて、かつ早期に増殖する菌株を得る
ために、５．２５％エタノールを含む液体培地にて７日
間の間隔で、培養を繰り返して行ない順化して、５．２
５％のエタノールに耐性で、リンゴの搾り粕から効率的
なエタノール生成能を持つ変異株ＨＹＯ−５０３株を得
た。得られた変異株は、５．２５％エタノール非含有液
体培地にて数度植継した後でも、５．２５％エタノール
耐性が良好に保存され、かつリンゴの搾り粕からのエタ
ノール生成能が保持された。以上の操作にて、本発明の
５．２５％エタノール耐性株ＨＹＯ−５０３株が得られ
た。

【００１２】本発明のＨＹＯ−５０３株の細菌学的性質
を調べた結果を以下に示す。ポテトデキストロース寒天
培地（ＤＩＦＣＯ）で、２５℃、３日間培養して本菌株
の形態を観察した。本菌株は２．０〜２．７ｍｍの円
形、白色コロニーを形成し、不規則の桿状や棒状の菌形
を示す。菌の大きさは１．５〜３．５×３．０〜６．５
μｍである。親株のコロニーの大きさは２．５〜３．０
ｍｍで、本菌株のコロニーはやや小さいが、他の性状は
Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ ＩＡＭ １２９５
３と同一であった。ポテトデキストロース液体培地にお
ける培養では、菌体は白濁沈殿し、菌膜やリングを形成
しなかった。

【００１３】本発明の菌株の生理学的性状を明らかにす
るため、クレーガー ファン リー（Ｎ．Ｊ．Ｗ．Ｋｒ
ｅｇｅｒ−ｖａｎ Ｒｉｊ）編のザ イースト ア タ
キソノミック スタディー 第３版（Ｔｈｅ Ｙｅａｓ
ｔｓ ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ，３ｒｄ
ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ ｅｎｌａｒｇｅｄ ｅｄｉｔ
ｉｏｎ）の記述に従って、カンジダ・シャハタエの炭素
源の資化性を調べた（後述の実験例参照）。

【００１４】上述の菌形、コロニーの形態、菌の増殖
性、及び、資化性の結果より、コロニーの大きさを除き
本発明の菌株はＣａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ Ｉ
ＡＭ１２９５３と同様の性質を示したことから、本菌株
はＣａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ ＩＡＭ １２９
５３と同じくカンジダ・シャハタエ（ＣａｎｄｉｄａＳ
ｈｅｈａｔａｅ）に属するものである。従って、本発明
の菌株はカンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈ
ｅｈａｔａｅ）と同定されたのでカンジダ・シャハタエ
（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）ＨＹＯ−５０３
株と命名した。

【００１５】即ち、カンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉ
ｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）ＨＹＯ−５０３株は、エタノ
ール耐性が高い点で親株より優れている。エタノール耐
性と言うことは、次に記述することから重要な性質であ
る。それはカンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓ
ｈｅｈａｔａｅ）はエタノールを生産する菌であるが、
一定量のエタノールを生産すると、自分で生産したエタ
ノールで死滅する。このような性質はカンジダ・シャハ
タエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）の特有の性
質でなく、一般の酒を作る菌にもあてはまるし、その他
の性質（エタノールだけでなく何でも、有機酸、抗生物
質等）でもその菌で生産するものは一定量以上になると
死滅することから、その生産を中止する場合がほとんど
である。そのようなことから、エタノールの収量（生産
性）を向上させるには、エタノール濃度が高くても増殖
の出来るような（耐性）性質を持った菌株が必要であ
る。この点、カンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ
Ｓｈｅｈａｔａｅ）ＨＹＯ−５０３株は、エタノール耐
性が高く、優れているのである。

【００１６】そして、必要に応じ、上記エタノール発酵
工程で、接種菌量を、１×１０⁴ ／ｍＬ〜１×１０⁶ ／
ｍＬにし、培養温度を２０℃〜４０℃にした構成として
いる。望ましくは、２０℃〜３７℃である。発酵時間が
短く接種後のエタノールの生成効率が極めて良い。好ま
しくは、接種菌量は、１．０±０．５×１０⁵ ／ｍＬで
ある。また、培養温度は ３０℃±５．０℃である。ま
た、必要に応じ、上記エタノール発酵工程で、嫌気性培
養を行なう構成としている。エタノール生成の早期化及
び大量化が図られる。

【００１７】更に、必要に応じ、上記エタノール発酵工
程前に、流動状の青果物のグルコースを増加させる前処
理工程を備えた構成としている。エタノールの生成効率
が向上させられる。この場合、必要に応じ、上記前処理
工程を、水を加えて流動状にした青果物を加熱処理する
加熱処理工程と、グルコースを増加させる酵素を添加し
て酵素処理する酵素処理工程と、ｐＨを５≦ｐＨ≦８の
範囲に調整するｐＨ調整工程とを備えて構成している。
ｐＨは、好ましくは、ｐＨ＝７．０±０．５である。よ
り確実にエタノールの生成効率が向上させられる。

【００１８】また、上記課題を解決するための本発明の
青果物の発酵に適した微生物は、上述したように、経済
産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所の特
許生物寄託センターに、寄託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−１８
８２９」として寄託されたカンジダ・シャハタエ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）の変異株であるカンジ
ダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）
ＨＹＯ−５０３株である構成としている。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下添付図面に基づいて本発明の
実施の形態に係る青果物の発酵処理方法及び青果物の発
酵に適した微生物を説明する。実施の形態では、青果物
としてリンゴの搾り粕を用いた。リンゴの搾り粕は、市
販のリンゴジュースを製造した搾汁残渣で、リンゴジュ
ース製造工場等から得られる。また、微生物としては、
上述したように、経済産業省産業技術総合研究所生命工
学工業技術研究所の特許生物寄託センターに、寄託番号
「ＦＥＲＭ Ｐ−１８８２９」として寄託されたカンジ
ダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）
の変異株であるカンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ
Ｓｈｅｈａｔａｅ）ＨＹＯ−５０３株を用いた。

【００２０】本発明の実施の形態に係る青果物の発酵処
理方法は、酢酸を製造するための処理方法であり、その
基本的構成は、図１に示すように、（１）前処理工程，
（２）エタノール発酵工程，（３）酢酸発酵工程，
（４）酢酸回収工程を備えてなる。前処理工程（１）
は、（１−１）加熱処理工程，（１−２）酵素処理工
程，（１−３）ｐＨ調整工程からなる。以下各工程につ
いて説明する。

【００２１】（１）前処理工程 （１−１）加熱処理工程 リンゴの搾り粕５．０Ｋｇを用い、２倍量の水を加えて
流動状にし、１００℃で３０分煮沸した。

【００２２】（１−２）酵素処理工程 グルコースを増加させる酵素を、リンゴの搾り粕１００
ｇ当たり５００ｍｇ添加して酵素処理する。酵素として
は、繊維素分解酵素（セルラーゼＡ「アマノ」３（天野
エンザイム株式会社）等、市販の適宜のものを用いる。
例えば、２００ｒｐｍの速度で攪拌機を用いて４０℃で
２４時間処理し、酵素処理におけるグルコースの生成量
を、例えば、２８２０ｍｇ／Ｌとする。尚、この処理の
後、酵素不活処理を行なって良い。例えば、酵素の不活
化のために１２０℃、１０分間の処理を行なう等であ
る。

【００２３】（１−３）ｐＨ調整工程 ｐＨの調整は重炭酸ナトリウムを用いた。ｐＨは５．０
〜８．０、好ましくは、７．０±０．５にした。

【００２４】（２）エタノール発酵工程 カンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔ
ａｅ）ＨＹＯ−５０３株の接種菌量を５×１０⁴ ／ｍＬ
〜１×１０⁵ ／ｍＬにし、例えば、１×１０⁵／ｍＬと
してこれを接種するとともに、培養温度を２０℃〜３７
℃にし、例えば、３０℃にして、当該菌接種後５日間は
静置培養（１日１回攪拌）し、その後、即ち菌接種後６
日目から培養槽内に炭酸ガスを吹き込みながら１３日間
嫌気性培養を行なった。これにより、エタノールが２
１．３２ｇ／Ｌ生成された。

【００２５】（３）酢酸発酵工程 次に、酢酸発酵を行なうための酢酸菌を、その接種量が
１×１０⁶ ／ｍＬになるように調整して接種し、常時エ
アレーションをして、温度は２５℃で１４日間、発酵処
理をした。

【００２６】（４）酢酸回収工程 連続遠心機を使用して、酢酸を回収した。酢酸が、２
０．５３ｇ／Ｌ生成された。最も酢酸の生成量が高い結
果を得た。

【００２７】

【実験例】次に、本発明に係る微生物に係る実験例、及
び、本発明に係る青果物の発酵処理方法の最適条件を導
き出すための実験例を示す。 （実験例１）先ず、本発明の菌株の生理学的性状を明ら
かにするため、クレーガー ファンリー（Ｎ．Ｊ．Ｗ．
Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ Ｒｉｊ）編のザ イースト ア
タキソノミック スタディー 第３版（Ｔｈｅ Ｙｅａ
ｓｔｓ ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ，３ｒｄ
ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ ｅｎｌａｒｇｅｄｅｄｉｔ
ｉｏｎ）の記述に従って、カンジダ・シャハタエの炭素
源の資化性を調べた。その結果を図２（表１）に示す。
表１の結果より、本発明の菌株はＣａｎｄｉｄａ Ｓｈ
ｅｈａｔａｅ ＩＡＭ１２９５３と同様の性質を示し、
本菌株はＣａｎｄｉｄａ ＳｈｅｈａｔａｅＩＡＭ １
２９５３と同じくカンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）に属するものであることが分か
る。

【００２８】（実験例２）得られたカンジダ・シャハタ
エ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）ＨＹＯ−５０
３株（以下「変異株」という）のエタノール生成能はカ
ンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａ
ｅ）の親株（以下「親株」という）より優れていること
を調べるため、親株であるＩＡＭ１２９５３株及び変異
株を４％グルコース加ポテトデキストロース液体培地に
て培養して、それぞれのエタノールの生成能と菌の増殖
性及びグルコース消費量を測定して比較試験を行なっ
た。２００ｍＬの液体培地を５００ｍＬの三角フラスコ
に入れ、これに供試菌株を１×１０⁵ ｃｅｌｌ／ｍＬと
なるように接種した。これを３０℃で静置培養を行な
い、経時的に変化を調べた。エタノール濃度量は酵素法
（Ｆ−キット エタノール、ロッシュ・ダイアグノステ
ィックス社）で、菌量を計測するための培養はポテトデ
キストロース寒天培地を用い、グルコースの測定は酵素
法（Ｆ−キットグルコース／果糖、ロッシュ・ダイアグ
ノスティックス社）で行なった。その結果を図３（表
２）に示す。

【００２９】表２より、変異株は親株よりも菌の増殖が
４８時間早く静止期に達し、エタノール生成量も、親株
と比較して５日間も早く、最高値１８．５ｇ／Ｌを示し
た。これはグルコースの消費量から見ても変異株はエタ
ノール生成能が優れていることを説明できる。一般にグ
ルコース１モルから２モルのエタノールを生成できるこ
とからも明らかに当該変異株の優位性が説明できる。

【００３０】（実験例３）カンジダ・シャハタエ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）のエタノール耐性試験
を行なった。実験は、３００ｍＬのフラスコを４個を用
意して、Ｎｏ．１とＮｏ．２のフラスコには５．０％エ
タノール加ポテトデキストロース液体培地を１００ｍＬ
を入れ、Ｎｏ．３とＮｏ．４のフラスコにはポテトデキ
ストロース液体培地のみを１００ｍＬ入れた。Ｎｏ．１
とＮｏ．４のフラスコにはカンジダ・シャハタエ（Ｃａ
ｎｄｉｄａＳｈｅｈａｔａｅ）ＨＹＯ−５０３株を２．
０×１０³ ／ｍＬ接種、Ｎｏ．２とＮｏ．３フラスコに
は親株を４．６×１０³ ／ｍＬを接種して、各試験は静
置培養で培養温度は３０℃で行なった。各フラスコの菌
数を接種後１６日間観察した。ポテトデキストロース寒
天培地を用いた混釈放法で行ない、そのコロニー数を算
定して求めた。結果を図４のグラフに示す。

【００３１】この結果より、変異株が５．０％エタノー
ル加ポテトデキストロース液体培地で増殖し、通常の培
地（ポテトデキストロース液体培地）では、親株と同様
に増殖することを証明した。すなわち、図４に示すよう
に、親株は５．０％エタノール加ポテトデキストロース
液体培地で７日目で死滅（生菌がない）すること。しか
し、変異株は、同様の培地で通常の培地（エタノール非
添加ポテトデキストロース液体培地）での増殖よりは対
数増殖期が遅くなるが、増殖可能である（５．０％エタ
ノールに耐性である）。また、変異株は通常の培地での
増殖性は親株と同様、若しくはピーク時の菌数は多く認
められた。従って、本菌はエタノールの生産性が高いこ
とが推測され、その生産性が良いことが証明される。

【００３２】（実験例４）次に、本発明の菌株を用いた
場合におけるリンゴの搾り粕からエタノールを効率的に
生成する工程の最適条件を明らかにするために、リンゴ
の搾り粕の発酵前の前処理工程（１）について、（１−
１）加熱処理、（１−２）酵素処理、（１−３）至適ｐ
Ｈについて実験した。次いで、エタノール発酵工程
（２）について、（２−１）接種菌量と培養温度、及び
（２−２）培養雰囲気（好気性、嫌気性）について実験
した。以下の実験例に供試したリンゴの搾り粕は、市販
のリンゴジュースを製造した搾汁残渣で、リンゴジュー
ス製造工場から得たものを使用した。以下の実験例は全
て本原材料を使用した。その成分分析表を図５（表３）
に示す。

【００３３】（１）リンゴの搾り粕の発酵前の調整 （１−１）加熱処理 １０００ｍＬの三角フラスコにリンゴの搾り粕２００ｇ
と水４００ｍＬを入れたもの各４種類を用意し、Ｎｏ．
１のフラスコは熱処理なし、Ｎｏ．２は５０℃、１０
分、Ｎｏ．３は煮沸、３０分間、Ｎｏ．４は１２０℃、
１０分間の各処理を行ない、変異株をポテトデキストロ
ース液体培地で前培養して菌数を１×１０ ⁴ ／ｍＬに調
製して接種し、各種のフラスコにおけるエタノール生成
量を観察した。その結果を図６（表４）に示す。

【００３４】表４の結果より、リンゴの搾り粕を加熱し
ない場合及び５０℃で、１０分間処理では極めてエタノ
ール生成量は０．２〜４．２０ｇ／Ｌと少なく、煮沸、
３０分以上の処理で、良好なエタノール生成量を得た。
その中でも省エネルギーと処理の安定を考慮すれば、煮
沸、３０分間が適当である。

【００３５】（１−２）酵素処理 １０００ｍＬのフラスコにリンゴの搾り粕２００ｇと水
４００ｍＬを入れたものを３種類（各Ａ〜Ｄ）準備し
て、各煮沸、３０分間の熱処理を行ない、リンゴの搾り
粕１００ｇ当たり、１−２−Ａのフラスコにはセルラー
ゼＡ「アマノ」３（天野エンザイム株式会社）を５００
ｍｇ、１−２−ＢにはセルラーゼＡ５００ｍｇとセルラ
ーゼＴ「アマノ」９０（天野エンザイム株式会社）５０
０ｍｇ、１−２−ＣにはセルラーゼＡ ５００ｍｇ、セ
ルラーゼＴ ５００ｍｇとヘミセルラーゼ（天野エンザ
イム株式会社） ５００ｍｇ、を各フラスコに入れた。
１−２−Ｄは酵素処理なしである。２００ｒｐｍの速度
で攪拌機を用いて４０℃で７２時間処理した。各酵素処
理におけるグルコースの生成量の変化を図７に示す。

【００３６】図７の結果より、リンゴの搾り粕の酵素処
理はいずれの試験のフラスコともにグルコース濃度が各
酵素処理の２４時間から４８時間で、グルコース量定常
期になり、酵素処理は２４時間処理が経済的である。

【００３７】次に、上記の酵素処理の結果を踏まえて、
リンゴの搾り粕からエタノールの生成量を調べた。リン
ゴの搾り粕から２００ｇを４００ｍＬの水を入れ、各酵
素処理を２４時間処理行ない、各酵素の不活化のために
１２０℃、１０分間の処理を行なって、冷却後に重炭酸
ナトリウムでｐＨ７．０に調整し、変異株を各フラスコ
に１×１０⁵ ／ｍＬ接種し、３０℃で培養を行ない、エ
タノール生成量を測定した。その結果を図８に示す。

【００３８】各酵素処理において、エタノールの生成量
は１３日目から１６日目に１３．６４〜１５．２９ｇ／
Ｌと最大を示した。酵素の価格及びエタノール生成日数
から考慮すれば、エタノール生成に最も経済的な酵素処
理法は、エタノールの最大量１５．２９ｇ／Ｌを示した
セルラーゼＡのみの処理法で良好なるエタノール発酵工
程を得た。

【００３９】（１−３）ｐＨの調整 １０００ｍＬのフラスコにリンゴの搾り粕２００ｇと水
４００ｍＬを入れたものを４種類（各Ｎｏ．１〜Ｎｏ．
５）準備し、ｐＨの調整は重炭酸ナトリウムを用いた。
Ｎｏ．１は無調整、Ｎｏ．２はｐＨ５．０、Ｎｏ．３は
ｐＨ７．０、Ｎｏ．４はｐＨ８．０に各調整して、変異
株を各フラスコに１×１０⁴ ／ｍＬ接種し、エタノール
生成量を測定した。その結果を図９に示す。

【００４０】ｐＨ５．０〜ｐＨ７．０で菌の増殖も安定
的に行なうことができて、エタノール生成量も良好であ
った。

【００４１】（２）エタノール発酵工程について （２−１）接種菌量と培養温度 １０００ｍＬのフラスコにリンゴの搾り粕２００ｇと水
４００ｍＬを入れたものを９種類（各Ｎｏ．１〜Ｎｏ．
９）準備して、１５分間煮沸した後に、セルラーゼＡで
２４時間の酵素処理して、ｐＨを７．０に調整した。そ
して、各フラスコについて次の条件下でエタノール生成
量を測定した。その結果を図１０に示す。Ｎｏ．１のフ
ラスコには菌数を１×１０³ ／ｍＬ、培養温度１０℃、
Ｎｏ．２には１×１０³ ／ｍＬ、培養温度２０℃、Ｎ
ｏ．３には１×１０³ ／ｍＬ、培養温度３０℃、Ｎｏ．
４には１×１０⁴ ／ｍＬ、培養温度１０℃、Ｎｏ．５に
は１×１０⁴ ／ｍＬ、培養温度２０℃、Ｎｏ．６には１
×１０⁴ ／ｍＬ、培養温度３０℃、Ｎｏ．７には１×１
０⁵ ／ｍＬ、培養温度１０℃、Ｎｏ．８には１×１０⁵
／ｍＬ、培養温度２０℃、Ｎｏ．９には１×１０⁵ ／ｍ
Ｌ、培養温度３０℃、

【００４２】図１０より、接種菌量はエタノール生成時
間と生成量から見ると、接種菌量は１×１０⁵ ／ｍＬ
で、培養温度が３０℃の時が、発酵時間が短く、接種後
１０日目で２倍から３倍のエタノール生成量を示し、接
種菌量は１×１０⁵ ／ｍＬが最適である。

【００４３】（２−２）エタノール発酵の好気性培養と
嫌気性培養の影響 ２０００ｍＬ培養槽を備え、炭酸ガス、エアレーショ
ン、窒素ガス、ｐＨ，温度を制御できるジャーファンメ
ンター装置（東京理化機器株式会社）を用いて、リンゴ
の搾り粕４００ｇと水８００ｍＬを入れ、１２０℃で１
５分間の減菌を兼ねた加熱処理を行ない、ｐＨ７．０に
調整後に、培養温度２５℃に設定して菌量を１×１０⁵
／ｍＬになるように接種し、菌株接種後５日目まで、エ
アレーションし、その後に直ちに炭酸ガスの吹き込みを
行ないながら培養し、菌数とエタノール生成量を観察し
た。対象として、エアレーション及び炭酸ガスの吹き込
みのない実験も同様に行なった。その結果を図１１に示
す。

【００４４】菌の増殖性にはエアレーションの効果はな
いが、炭酸ガスの吹き込みはエタノール生成量の早期化
及び最大量を示す日数の短縮に効果を示した。

【００４５】（実験例５）次に、リンゴの搾り粕から変
異株を用いたエタノール生成工程を経て、酢酸を製造す
る実験例について記述する。ジャーファンメンター装置
（東京理化機器株式会社）に、リンゴの搾り粕４００ｇ
に水８００ｍＬを加え、セルラーゼＡ「アマノ」３（天
野エンザイム株式会社）を１０４０ｍｇ添加して、４０
℃、２４時間攪拌後に、変異株を１×１０⁵／ｍＬ接種
した。エタノール発酵温度は３０℃で行なった。次に酢
酸発酵を行なうため、酢酸菌の接種量１×１０⁶ ／ｍＬ
になるように調整し、変異株を接種後１３日目に接種し
た。酢酸量の測定は酵素法（Ｆキット酢酸 ロッシュ・
ダイアグノスティックス社）で行なった。酢酸発酵は常
時エアレーションをして、温度は２５℃で実施した。そ
の成績を図１２に示す。

【００４６】効率的な酢酸発酵を行なうための酢酸菌の
接種時期を１３日目に実施すれば、最も酢酸の生成が高
い結果を得た。すなわち、まだ、グルコース量が少し残
っている時期が酢酸菌の増殖を促進し、接種時期として
良好である。

【００４７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の青果物の
発酵処理方法によれば、流動状の青果物にカンジダ・シ
ャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）の性質
を有する微生物を接種してエタノールを得るエタノール
発酵工程を備えたので、リンゴの搾り粕等の比較的グル
コース等の発酵源が少ない青果物であっても、発酵法に
よってエタノールを効率よく製造することができるよう
になる。また、エタノール発酵工程後に、酢酸菌を接種
して酢酸を得る酢酸発酵工程を備えた場合には、酢酸を
効率よく製造することができるようになる。更に、青果
物として、リンゴの搾り粕を用いた場合には、比較的グ
ルコース等の発酵源が少ないリンゴの搾り粕において、
発酵法によってエタノールや酢酸を効率よく製造するこ
とができるようになるとともに、廃棄物の有効利用を図
ることができ、極めて有用になる。

【００４８】そして、微生物として、カンジダ・シャハ
タエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）ＨＹＯ−５
０３株を用いた場合には、エタノール濃度が高くても増
殖の出来る耐性を持ち、即ち、エタノール耐性が高く、
優れているので、エタノールの収量（生産性）を一層向
上させることができる。

【００４９】また、エタノール発酵工程で、接種菌量
を、１×１０⁴ ／ｍＬ〜１×１０⁶ ／ｍＬにし、培養温
度を２０℃〜４０℃、望ましくは２０℃〜３７℃にした
場合には、発酵時間が短く接種後のエタノールの生成効
率を向上させることができる。更に、エタノール発酵工
程で、嫌気性培養を行なう場合には、エタノール生成の
早期化及び大量化を図ることができる。

【００５０】更にまた、エタノール発酵工程前に、流動
状の青果物のグルコースを増加させる前処理工程を備え
た場合には、より一層エタノールの生成効率を向上させ
ることができる。また、前処理工程を、水を加えて流動
状にした青果物を加熱処理する加熱処理工程と、グルコ
ースを増加させる酵素を添加して酵素処理する酵素処理
工程と、ｐＨを５≦ｐＨ≦８の範囲に調整するｐＨ調整
工程とを備えて構成した場合には、より確実にエタノー
ルの生成効率を向上させることができる。

【００５１】そして、本発明の変異株であるカンジダ・
シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）ＨＹ
Ｏ−５０３株によれば、エタノール耐性が高く親株より
も優れているので、リンゴの搾り粕等の比較的グルコー
ス等の発酵源が少ない青果物のエタノール発酵や酢酸の
製造に用いて、エタノールの収量（生産性）を向上させ
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施の形態に係る青果物の発酵処理方
法を示す工程図である。

【図２】本発明の実験例に係り、本発明の変異株及び親
株の資化性を示す表図である。

【図３】本発明の実験例に係り、変異株及び親株の菌の
増殖とグルコース及びエタノール生成量を比較して示す
表図である。

【図４】本発明の実験例に係り、変異株及び親株のエタ
ノール耐性試験の結果を示すグラフ図である。

【図５】本発明の実験例に係り、使用したリンゴの搾り
粕の性状を示す表図である。

【図６】本発明の実験例に係り、加熱処理とエタノール
生成量の関係を示す表図である。

【図７】本発明の実験例に係り、酵素処理におけるグル
コース生成量を示すグラフ図である。

【図８】本発明の実験例に係り、酵素処理とエタノール
生成量の関係を示すグラフ図である。

【図９】本発明の実験例に係り、ｐＨ調整とエタノール
生成量の関係を示すグラフ図である。

【図１０】本発明の実験例に係り、接種菌量と培養温度
及びエタノール生成量の関係を示すグラフ図である。

【図１１】本発明の実験例に係り、培養ガスの制御によ
るエタノール生成量を示すグラフ図である。

【図１２】本発明の実験例に係り、リンゴの搾り粕から
の酢酸の生成量の経時変化を示すグラフ図である。

【符号の説明】

（１） 前処理工程 （１−１） 加熱処理工程 （１−２） 酵素処理工程 （１−３） ｐＨ調整工程 （２） エタノール発酵工程 （３） 酢酸発酵工程 （４） 酢酸回収工程

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 7/54 Ｃ１２Ｒ 1:72） (72)発明者 花松 憲光 青森県青森市第二問屋町４丁目11番６号 青森県産業技術開発センター内 (72)発明者 櫛引 正剛 青森県青森市第二問屋町４丁目11番６号 青森県産業技術開発センター内 (72)発明者 山口 信哉 青森県青森市第二問屋町４丁目11番６号 青森県産業技術開発センター内 (72)発明者 小田桐 英夫 青森県南津軽郡平賀町大字館山字前田85番 地２ 株式会社ジョイ・ワールド・パシフ ィック内 (72)発明者 山端 真弓 青森県南津軽郡平賀町大字館山字前田85番 地２ 株式会社ジョイ・ワールド・パシフ ィック内 (72)発明者 金 芳晴 東京都多摩市鶴牧２丁目23番３ 株式会社 新国土開発研究所内 Ｆターム(参考） 4B064 AC03 AD04 CA06 DA16 4B065 AA73X AC11 BA17 BB15 BB40 CA06 CA10 CA55

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 青果物に微生物を作用させて発酵させる
   青果物の発酵処理方法において、 流動状の青果物にカンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄ
   ａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）の性質を有する微生物を接種し
   てエタノールを得るエタノール発酵工程を備えたことを
   特徴とする青果物の発酵処理方法。
2. 【請求項２】 上記エタノール発酵工程後に、酢酸菌を
   接種して酢酸を得る酢酸発酵工程を備えたことを特徴と
   する請求項１記載の青果物の発酵処理方法。
3. 【請求項３】 上記青果物として、リンゴの搾り粕を用
   いたことを特徴とする請求項１または２記載の青果物の
   発酵処理方法。
4. 【請求項４】 上記微生物は、経済産業省産業技術総合
   研究所生命工学工業技術研究所の特許生物寄託センター
   に、寄託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−１８８２９」として寄託
   されたカンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅ
   ｈａｔａｅ）の変異株であるカンジダ・シャハタエ（Ｃ
   ａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）ＨＹＯ−５０３株で
   あることを特徴とする請求項１，２または３記載の青果
   物の発酵処理方法。
5. 【請求項５】 上記エタノール発酵工程で、接種菌量
   を、１×１０⁴ ／ｍＬ〜１×１０⁶ ／ｍＬにし、培養温
   度を２０℃〜４０℃にしたことを特徴とする請求項４記
   載の青果物の発酵処理方法。
6. 【請求項６】 上記エタノール発酵工程で、嫌気性培養
   を行なうことを特徴とする請求項４または５記載の青果
   物の発酵処理方法。
7. 【請求項７】 上記エタノール発酵工程前に、流動状の
   青果物のグルコースを増加させる前処理工程を備えたこ
   とを特徴とする請求項４，５または６記載の青果物の発
   酵処理方法。
8. 【請求項８】 上記前処理工程を、水を加えて流動状に
   した青果物を加熱処理する加熱処理工程と、グルコース
   を増加させる酵素を添加して酵素処理する酵素処理工程
   と、ｐＨを５≦ｐＨ≦８の範囲に調整するｐＨ調整工程
   とを備えて構成したことを特徴とする請求項７記載の青
   果物の発酵処理方法。
9. 【請求項９】 経済産業省産業技術総合研究所生命工学
   工業技術研究所の特許生物寄託センターに、寄託番号
   「ＦＥＲＭ Ｐ−１８８２９」として寄託されたカンジ
   ダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ Ｓｈｅｈａｔａｅ）
   の変異株であるカンジダ・シャハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ
   Ｓｈｅｈａｔａｅ）ＨＹＯ−５０３株であることを特
   徴とする微生物。