JP2003284556A

JP2003284556A - 金属捕捉能タンパク質を発現する遺伝子

Info

Publication number: JP2003284556A
Application number: JP33022699A
Authority: JP
Inventors: Atsuo Tanaka; 渥夫田中; Atsumi Ueda; 充美植田
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2003-10-07
Also published as: WO2001038517A1

Abstract

(57)【要約】【課題】金属捕捉能タンパク質を発現する遺伝子の提
供。【解決手段】分泌シグナルペプチド、金属捕捉能を有
するポリペプチド及び細胞表層局在タンパク質をそれぞ
れコードするDNAを含む融合遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞表層に金属を
捕捉することができるタンパク質を発現することができ
る遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクター
を含む形質転換体、及び該形質転換体の用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】工場などから発生する産業廃液中には、
生態系に対し有毒な重金属が含まれており、そのまま排
水すると環境汚染をもたらすため、河川等に排出する前
にこれを除去することが必要である。その一方、これら
の産業廃液中には、多くの有用な重金属も含まれている
場合もあるため、廃棄せずに資源の有効利用することが
可能である。

【０００３】従来より、微生物、藻類の中には、特定の
重金属を蓄積する能力を有するものが存在するため、こ
れを利用して廃液中の重金属を回収することも試みら
れ、植物バイオマス、カビ、クロレラなどを用いた方法
が提案されている（特開平11-221460号公報、特開平9-1
08568号公報及び特開平6-238162号公報）。

【０００４】しかしながら、これらの微生物に吸着され
た重金属は、回収の際に容易に沈降しないため、回収が
困難であり必ずしも満足できるものではない。しかも、
微生物細胞内部に重金属が取り込まれると、通常は微生
物自身に対し毒性となるため、重金属の高濃度存在下で
は生育できない。従って、高濃度重金属溶液に対しては
上記微生物で処理することができない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、細胞表層に
金属を捕捉することができるタンパク質を発現すること
ができる遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベ
クターを含む形質転換体、及び該形質転換体の用途を提
供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、金属捕捉能を有す
るポリペプチドをコードするDNAを含む融合遺伝子を構
築し、これを宿主に導入して金属捕捉能を有する宿主を
作製することに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、分泌シグナルペプチ
ド、金属捕捉能を有するポリペプチド及び細胞表層局在
タンパク質をそれぞれコードするDNAを含む融合遺伝子
である。分泌シグナルペプチド（例えば配列番号２で表
されるアミノ酸配列を含むもの）をコードするDNAとし
ては配列番号１で表される塩基配列を含むものが挙げら
れ、金属捕捉能を有するポリペプチド（例えば配列番号
４で表されるアミノ酸配列を含むもの）をコードするDN
Aとしては配列番号３で表される塩基配列を含むものが
挙げられ、細胞表層局在タンパク質（例えば配列番号６
で表されるアミノ酸配列を含むもの）をコードするDNA
としては配列番号５で表される塩基配列を含むものが挙
げられる。具体的には、上記融合遺伝子として配列番号
７で表される塩基配列を含むものが挙げられる。

【０００８】さらに、本発明は、上記遺伝子を含有する
組換えベクターである。さらに、本発明は、上記組換え
ベクターを含む形質転換体である。形質転換体として
は、形質転換酵母、形質転換動物細胞、形質転換植物細
胞、形質転換粘菌又は形質転換昆虫細胞が挙げられる。
さらに、本発明は、上記形質転換体を含む環境浄化剤又
は金属回収剤である。

【０００９】さらに、本発明は、上記形質転換体が充填
されたカラム又は該カラムを含む環境浄化装置である。
さらに、本発明は、金属により汚染された環境物質に、
上記形質転換体を添加することを特徴とする環境浄化方
法、又は金属により汚染された環境物質を、上記カラム
若しくは装置で処理することを特徴とする環境浄化方法
である。

【００１０】さらに、本発明は、金属により汚染された
環境物質に上記形質転換体を添加し、添加後の形質転換
体をキレート剤で処理することを特徴とする金属の回収
方法である。上記環境物質としては、例えば海水若しく
は淡水、廃水、排ガス又は土壌が挙げられ、キレート剤
としてはエチレンジアミンテトラ酢酸が挙げられる。以
下、本発明を詳細に説明する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の融合遺伝子は、分泌シグ
ナルペプチド、金属捕捉能を有するポリペプチド、細胞
表層局在タンパク質をそれぞれコードするDNAを含むも
のであり、金属捕捉能を有するポリペプチドを細胞表層
に発現し得る遺伝子である。

【００１２】本発明者は、細胞表層、すなわち細胞膜や
細胞壁に着目して、これらの領域に輸送局在化するタン
パク質のアドレスとなる情報の利用（細胞表層工学）を
考えた。細胞表層工学（Cell Surface Engineering）と
は、細胞表層に輸送局在化されるタンパク質の分子情報
を活用して、外来タンパク質を細胞膜の外側や細胞壁に
ターゲッティングさせ、細胞表層へ新機能を付与する操
作を意味する（図１）。

【００１３】本発明は、細胞表層にタンパク質を輸送さ
せる分泌シグナル配列、金属捕捉能を有するポリペプチ
ド（金属捕捉能タンパク質ともいう）及び細胞表層局在
タンパク質を同一の遺伝子上にコードする融合遺伝子を
構築し（図２）、該融合遺伝子を宿主に発現させること
により、宿主の細胞表層に金属捕捉機能を付与すること
としたものである（図１）。

【００１４】１．本発明の融合遺伝子の構築 (1)分泌シグナルペプチド分泌シグナルペプチド（分泌シグナル又は分泌シグナル
配列ともいう）は、一般に細胞外（ペリプラズムも含
む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）のN-
末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含
むペプチドであり、通常、分泌性タンパク質が細胞内か
ら細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去され
る。

【００１５】本発明においては、金属捕捉能タンパク質
を酵母の細胞外に移動及び発現させることができる分泌
シグナルであれば、特に限定されるものではない。例え
ば、分泌シグナル配列としては、α-ファクター前駆体
のプレプロリーダー配列（配列番号２）、酵母のα-又
はａ-アグルチニンのシグナル配列、グルコアミラーゼ
の分泌シグナル等が挙げられる。なお、金属捕捉能タン
パク質の活性を保持する限り、分泌シグナルの一部また
は全部が金属捕捉能タンパク質のN-末端に残ってもよ
い。本発明においては、α-ファクター前駆体のプレプ
ロリーダー配列をコードするDNA（配列番号１）が好ま
しい。該DNAは、酵母のデータベースから入手した配列
をもとにしてプライマーを設計し、酵母ゲノムDNAを鋳
型とするPCRで増幅することによって調製される。

【００１６】(2)金属捕捉能を有するポリペプチド本発明において、金属捕捉能とは、ポリペプチド自身が
金属分子を吸着又は捕獲させる機能を意味する。捕捉と
は、化学的結合（共有結合、イオン結合等）によるもの
及び物理的吸着によるもののいずれをも意味する。この
ような機能を有するペプチド配列は (His)_6nで表される
ものが挙げられる。ここで、nは特に限定されるもので
はなく任意に設定することができる。n=１（すなわち6
個のHis）でも十分である。Hisは、「CAT」又は「CAC」
によりコードされるため、いずれかのコドンを選択して
DNA配列を任意に設計し合成することができる。その
際、ベクターとの連結が可能となるように、適当な制限
酵素部位を有する配列を設計しておくことが好ましい。
なお、合成は、通常の化学合成により行われる。

【００１７】 (3)細胞表層局在タンパク質細胞表層局在タンパク質は、本発明の融合遺伝子を導入
する宿主の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタ
ンパク質をいう。細胞表層局在タンパク質としては、フ
ロキュリン、アグルチニン、リポプロテイン等のタンパ
ク質のほか、CWPと呼ばれるタンパク質群が挙げられる
が、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）で最も機能解析が進んでいる凝集性細胞間
接着分子であるアグルチニンが好ましい。アグルチニン
は、細胞同士が接合するときに誘導発現するものであ
る。このタンパク質にはα接合型細胞で発現するα-ア
グルチニン及びa接合型細胞で発現するa-アグルチニン
が知られており、いずれも細胞壁に結合して活性部位が
細胞の最外層から突き出ている。そして、この２つの分
子を介して細胞間接着が起こる。

【００１８】α-アグルチニンは、AGα1遺伝子にコード
されるタンパク質であり、a-アグルチニンは、AGA1遺伝
子にコードされるコア部分とAGA2遺伝子にコードされる
小サブユニットとがジスルフィド結合を介して連結した
複合体タンパク質である。

【００１９】α-アグルチニンと、a-アグルチニンのコ
ア部分とは、それぞれともにGPI（グリコシルフォスフ
ァチジルイノシトール）アンカー付着シグナル配列と呼
ばれる疎水性領域が、アグルチニンを構成するアミノ酸
配列のC末端側に含まれている（図３）。GPIアンカーシ
グナル配列とは、GPIアンカーによって認識される配列
（通常、細胞表層局在タンパク質のC末端又はその近傍
に位置する配列）であり、その認識によりGPIアンカー
シグナル配列が切断されて、細胞表層局在タンパク質は
GPIアンカーと結合する。

【００２０】本発明において、細胞表層局在タンパク質
をコードするDNAとしては、好ましくは酵母の細胞表面
に提示されるタンパク質（例えばα-又はａ-アグルチニ
ン）をコードするDNA（主に、C末端側半分の領域をコー
ドするDNA）が挙げられる。好適には、650個のアミノ酸
配列を有するα-アグルチニンのアミノ酸配列のうち、
第331番目から第650番目までのアミノ酸（図３、配列番
号６）、すなわちC末端から320アミノ酸の配列をコード
するDNA（配列番号５）が用いられる。この320個のアミ
ノ酸配列中には４個所の糖鎖結合部位が存在する。そし
て、細胞表層局在タンパク質とGPIアンカーとの結合
が、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ
C（PI-PLC）と呼ばれる酵素により切断された後に、α-
アグルチニンの糖鎖やグリカン（PI-PLCによって切断さ
れた後の付着したまま残されたGPIアンカー断片内に存
在する）と、細胞壁を構成する多糖類とが共有結合する
ことにより、α-アグルチニンのC末端配列部分が細胞壁
と結合して保持される。

【００２１】従って、上記320アミノ酸領域をコードす
るDNAは本発明において特に有用である。上記320個のア
ミノ酸をコードするDNA（配列番号５）は、酵母のデー
タベースをもとに作成したプライマーを用いて酵母ゲノ
ムを鋳型とするPCRで増幅することにより得た断片を含
むプラスミドpYE322から得ることができる。但し、上記
DNAには、3'側の非翻訳領域が連結されていてもよい。

【００２２】(4)DNAの連結上記分泌シグナルペプチドをコードするDNA、金属捕捉
能を有するポリペプチドをコードするDNA及び細胞表層
局在タンパク質をコードするDNAをそれぞれリガーゼで
処理して、融合遺伝子を作製する。あるいは、後述の通
り（「２．組換えベクターの作製」の項を参照）、上記
各DNAを1つのプラスミドに順次連結する方法を採用して
もよい。

【００２３】(5)塩基配列の決定上記のようにして構築された融合遺伝子の塩基配列の決
定は、マキサム-ギルバートの化学修飾法、又はジデオ
キシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うこと
ができる。但し、通常は自動塩基配列決定機を用いて配
列決定が行われる。例えば、Perkin Elmer社製の蛍光ダ
イデオキシターミネーターを含有するPRISMシークエン
シングキット等を使って反応を行い、Applied Biosyste
m 社製のオートシークエンサー（モデルABI 373)等で塩
基配列を決定する。

【００２４】配列番号７に本発明の融合遺伝子の塩基配
列を例示する。但し、本発明の融合遺伝子は、上記分泌
シグナルペプチド、金属捕捉能を有するポリペプチド及
び細胞表層局在タンパク質をコードする限り、配列番号
7に示す塩基配列に限定されるものではない。

【００２５】一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定する
と、その後は化学合成によって、又は構築された遺伝子
を鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有す
るDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせること
によって、本発明の遺伝子を得ることができる。さら
に、部位特異的変異誘発等によって上記タンパク質又は
ペプチドをコードする修飾されたDNA、例えば同一のア
ミノ酸をコードする別のコドン（縮重コドン）に改変さ
れたDNAを合成することもできる。

【００２６】なお、遺伝子に変異を導入するには、Kunk
el法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ず
る方法を採用することができる。例えば部位特異的突然
変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant
-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用い
て、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesi
s シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。

【００２７】２．組換えベクターの作製本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で
複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラ
スミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。

【００２８】プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプ
ラスミド（例えばpBR322, pBR325,pUC118, pUC119, pUC
18, pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB11
0,pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばpYE22m、pYG
A2270、YEp13, YEp24, YCp50等)などが挙げられ、ファ
ージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EM
BL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられ
る。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスな
どの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイル
スベクター、さらにTiプラスミド等を用いることもでき
る。

【００２９】ベクターに本発明の遺伝子を挿入するに
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採
用される。

【００３０】但し、このような出発材料のプラスミドを
適当な制限酵素で処理し、得られる制限酵素部位に、別
のプラスミドから得られたシグナル配列をコードするDN
A、金属結合能ポリペプチドをコードするDNA、及び細胞
表層タンパク質をコードするDNAを順次連結して組換え
ベクターを作製することもできる。このような操作を行
う場合は、出発プラスミドとして、例えばpYE22m、pYGA
2270等が挙げられる。

【００３１】本発明の融合遺伝子は、その遺伝子の機能
が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要
である。そこで、本発明のベクターには、オペレータ
ー、プロモーター、ターミネーター、本発明の融合遺伝
子のほか、所望によりシスエレメント、スプライシング
シグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソ
ーム結合配列（SD配列）などを含有するものを連結する
ことができる。例えば、GAPDH（グリセルアルデヒド3’
-リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター及び／又はGAP
DHターミネーター等をベクターに連結することができ
る。なお、選択マーカーとしては、例えば酵母選択マー
カー（例えばTRP、LEU2等）、大腸菌の選択マーカー
（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝
子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子）が挙
げられる。

【００３２】本発明においては、プラスミドpYGA2270又
はpYE2mのGAPDHプロモーターとGAPDHターミネーターの
配列との間に、分泌シグナル配列をコードするDNA、金
属捕捉能を有するポリペプチドをコードするDNA、及び
α-アグルチニンのC末端から320アミノ酸をコードするD
NAを挿入することにより本発明の組換えベクターを得る
ことができる。

【００３３】３．形質転換体の作製本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、本
発明の融合遺伝子が発現し得るように宿主中に導入する
ことにより得ることができる。ここで、宿主としては、
本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定され
るものではない。例えば、大腸菌(Escherichia coli）
等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillu
s subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ
(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細
菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharom
yces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schiz
osaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細胞、
CHO細胞等の動物細胞が挙げられ、Sf9等の昆虫細胞が挙
げられ、Physarum polycephalum等の粘菌が挙げられ、
さらに植物細胞が挙げられる。なお、本発明では、凝集
性の酵母を宿主として用いることも可能である。凝集性
の酵母としては、サッカロミセス・ジアスタティクス
（Saccharomyces diastaticus） ATCC60715、同ATCC607
12、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cere
visiae）IFO1953、同CG1945、同HF7Cが挙げられる。
「凝集性」とは、液体中に浮遊又は分散して存在する酵
母等が、集合して塊（集合体）を作る性質を意味する。

【００３４】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。但し、本発明において細菌を宿主とする場
合は、細胞表層局在タンパク質としてリポプロテイン等
を使用することが好ましい。

【００３５】大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・
コリ(Escherichia coli) DH5α、Y1090などが挙げら
れ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bac
illus subtilis)などが挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。

【００３６】プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現
できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrp
プロモーター、lacプロモーター、P_Lプロモーター、P_R
プロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロ
モーターが用いられる。tacプロモーターなどのよう
に、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよ
い。

【００３７】細菌への組換えベクターの導入方法は、細
菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるもので
はない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen,
S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110
(1972))、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

【００３８】酵母を宿主とする場合は、プロモーターは
酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例え
ばGAPDHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモ
ーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα
1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、
GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター
等を用いることができる。

【００３９】酵母への組換えベクターの導入方法は、酵
母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例え
ばエレクトロポレーション法(Becker, D.M. et al.：Me
thods. Enzymol., 194： 182(1990))、スフェロプラス
ト法(Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., US
A, 75： 1929(1978))、酢酸リチウム法(Itoh, H.：J.Ba
cteriol., 153：163(1983))等が挙げられる。

【００４０】動物細胞（原生動物細胞を含む。以下同
じ。）を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細
胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。プロモ
ーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LT
Rプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、また、
ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等
を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方
法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸
カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。

【００４１】昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞な
どが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方
法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクシ
ョン法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。

【００４２】粘菌を宿主とする場合は、Physarum polyc
ephalumなどが用いられる。粘菌への組換えベクターの
導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法な
どが挙げられる。宿主が植物である場合は、形質転換植
物は以下のようにして得ることができる。

【００４３】本発明において形質転換の対象となる植物
は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、
種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、
維管束、柵状組織、海綿状組織等)又は植物培養細胞の
いずれをも意味するものである。形質転換に用いられる
植物としては特に限定されるものではなく、例えばアカ
ザ科、ナス科、イネ科、マメ科、バラ科、キク科、ユリ
科、ナデシコ科、ウリ科、ヒルガオ科、アブラナ科等に
属する植物が挙げられる。その他、らんそう、クロレラ
等を宿主として使用することができる。

【００４４】上記組換えベクターは、通常の形質転換方
法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン
法、PEG法、エレクトロポレーション法等によって植物
中に導入することができる。

【００４５】例えばアグロバクテリウム法を用いる場合
は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテ
リウム、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエン
ス(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404株に導入し、
この株をリーフディスク法（内宮博文著,植物遺伝子操
作マニュアル,1990,27-31pp,講談社サイエンティフィッ
ク,東京）等に従って宿主の無菌培養葉片に感染させ、
形質転換植物を得ることができる。

【００４６】また、パーティクルガン法を用いる場合
は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用し
てもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロト
プラストを調製して使用してもよい。このように調製し
た試料を遺伝子導入装置（例えばPDS-1000(BIO-RAD社)
等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又
は試料により異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧
力、4〜12cm程度の距離で行う。

【００４７】植物培養細胞を宿主として用いる場合は、
形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エ
レクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。形質
転換の結果得られるカルス、腫瘍組織、シュート、毛状
根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に
用いることが可能であり、また従来知られている植物組
織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシ
ン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチ
レン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再
生させることができる。

【００４８】遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認
は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザ
ンハイブリダイゼーション法等により行うことができ
る。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プ
ライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミド
を調製するために使用した条件と同様の条件で行うこと
ができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル
電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピ
ラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green
液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとし
て検出することにより、形質転換されたことを確認する
ことができる。また、予め蛍光色素等により標識したプ
ライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出すること
もできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産
物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確
認する方法も採用することができる。

【００４９】遺伝子は、プラスミドの形態で導入しても
よく、宿主の遺伝子に挿入することにより導入してもよ
く、宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り
込まれてもよい。上記形質転換体を、プロモーターを活
性化させる条件で培養又は栽培すると、その細胞表層に
金属捕捉能タンパク質が発現される。なお、金属捕捉能
タンパク質が細胞表層に固定されていることの確認は、
該タンパク質に対する抗体及びFITC標識抗体を用いる免
疫抗体法で行うことができる。

【００５０】４．本発明の形質転換体を充填したカラ
ム、及び該カラムを含む装置本発明の形質転換体は、連続反応又は回分式培養におい
て繰り返し使用できる点で担体に固定化されていること
が好ましい。「担体」とは、本発明の形質転換体（例え
ば形質転換酵母）を固定化することができる物質を意味
し、好ましくは、水又は特定の溶媒に対して不溶性の物
質を意味する。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウ
レタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリル
アミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコ
ンフォーム、セルロース多孔質体等の発泡体又は樹脂が
挙げられる。担体は、形質転換体の増殖及び活性の維持
に有利である点、及び死滅した細胞を速やかに脱離させ
る点で、多孔質の担体が好ましい。多孔質体の開口部の
大きさは細胞によって異なるが、多孔質内に入り込んで
増殖できる大きさが適当であり、50μm〜1,000μmが好
ましい。但し、これらの大きさに限定されるものではな
い。また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効
率等を考慮すると、球状又は立方体状が好ましく、大き
さは、球状の場合は直径が2mm〜50mm、立方体状の場合
は2mm〜50mm角が好ましい。

【００５１】「固定化」とは、形質転換体が遊離の状態
ではなく、担体に結合若しくは付着し、又は担体内部に
取り込まれた状態等をいう。形質転換体の固定化には、
例えば、担体結合法、架橋法及び包括法等の公知の方法
を適用することができる。凝集性の酵母の固定化には、
担体結合法が最適である。担体結合法としては、イオン
交換性の樹脂に吸着させる化学的吸着法又は物理的吸着
法が挙げられる。

【００５２】形質転換の宿主として凝集性酵母を用いる
と、該酵母は、担体に固定化されているにもかかわらず
増殖可能であり、活性が低下すると自然に脱落していく
性質を有している。このため、担体に結合した酵母は、
生菌数がほぼ一定に保たれ、活性が高いという特徴を有
する。従って、上記酵母の担体への結合は物理的吸着が
最も好ましい。凝集性又は接着性の細胞と前記多孔質の
担体とを混合して培養することにより、細胞は多孔質体
の開口部に入りこみ、担体に付着する。

【００５３】このようにして得られる固定化された形質
転換体（特に酵母が好ましい）を、担体に付着した状態
のまま浮遊状態で培養するか、あるいはカラムに充填し
て、いわゆるバイオリアクターとして用いることができ
る。カラムとしては、例えば通常のゲルろ過、イオン交
換クロマトグラフィー等に使用されているものと同様の
ものを用いることができる。また、上記カラムを、ポン
プ、回収容器、金属検出計などと組み合わせて、金属回
収用装置として使用することができる。

【００５４】５．環境浄化剤及び金属の回収剤本発明の形質転換体は、その細胞表層に金属を捕捉（吸
着）することができるため、環境浄化剤又は金属の回収
剤として使用することができる。本発明の形質転換体に
より吸着しうる重金属としては、例えば銅、コバルト、
ニッケル、カドミウム、マンガン、ガリウム、亜鉛、
金、水銀、ウランなどが挙げられるが、これらに限定さ
れるものではなく、その他のレアメタルも回収の対象と
なる。

【００５５】(1) 海水、淡水又は廃水からの回収上記金属が含まれる海水若しくは淡水（河川、池、湖）
又は廃水（生活廃水、厨房廃水、工場廃水等）に、本発
明の形質転換体を添加する。金属との反応は、固定化さ
れた形質転換体をカラムにつめ、あるいは、攪拌槽にい
れて、連続的又は回分的に行われる。

【００５６】回分式の処理法本発明の形質転換体の添加量は、金属の濃度により適宜
定めることができ、特に限定されるものではないが、10
0μMの金属濃度あたり、菌体乾燥重量で５〜６g/L、好
ましくは5.5g/L程度である。この際、重金属含有水溶液
は、塩分濃度10〜100mM、pH7〜8に調節することが好ま
しい。なお、廃水の温度は、20〜40℃、好ましくは25〜
35℃である。形質転換体を添加した後、20〜60分インキ
ュベートして金属を吸着させる。

【００５７】連続式の処理法本発明の回収剤を用いて重金属含有水溶液から重金属を
分離、回収するには、この金属回収剤を例えばカラムに
充てんし、あらかじめpH７〜８程度に調整した重金属含
有水溶液を通過させることができる。

【００５８】上記処理により、水溶液中の重金属は
形質転換体に吸着され、分離、除去される。次に、この
ように重金属を吸着した形質転換体から重金属を回収す
るため、化学処理を行う。化学処理剤としては、金属キ
レート剤、例えば5mMエチレンジアミンテトラ酢酸（EDT
A）等が挙げられる。

【００５９】金属捕捉能の測定反応終了後、遠心分離器による分離操作および蒸留操作
や晶析操作等により分離され、金属が単離されるため、
反応の経時変化を例えばHPLCなどでモニターすることに
より金属捕捉能を測定する。本発明において連続的に又
はバッチで繰り返し培養しても、活性が低下した又は死
滅した細胞はカラムから脱離していくので、活性が落ち
ることはなく、有効に利用することができる。

【００６０】(2) 排ガスからの回収本発明において金属を回収する排ガスとしては特に限定
されるものではない。例えば、工場から出されるガス等
が挙げられる。工場から出されるガスは、煙突から排出
する前のガスを集ガス機で回収する。そして、得られた
回収ガスを本発明のカラム又は装置に通過させる処理を
行う。

【００６１】(3)土壌中からの回収回分式又は連続式金属を土壌から回収するには、金属を含む土壌を水など
に懸濁したのち遠心し、その上清を採取する。その後
は、上記回分式又は連続式を適用して金属を回収する。

【００６２】植物体からの回収本発明においては、植物体に再生された形質転換体を用
いて土壌中の金属を回収することができる。すなわち、
金属が含まれる土壌に形質転換植物体を植えて栽培する
と、植物の根が土壌中の金属を吸収し、植物体中の細胞
に金属が捕捉されることとなる。捕捉された後は、植物
体をすりつぶして細胞懸濁液とし、上記化学処理を適用
して金属を回収する。

【００６３】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。〔実施例1〕ヒスチジンポリペプチドを細胞表層に直接
提示・発現させるための遺伝子構築本発明の融合遺伝子の構築は、以下の通り行った（図
４）。

【００６４】市販のプラスミドpRS406(4381bp)（STRATA
GENE社製：Sikorski, R.S. and P.Hieter, 1989, Genet
ics 122:19-27）をBamHIとXhoIで切断した後、4330bpの
DNA断片をアガロース電気泳動にかけて溶出した。次
に、ヒスチジンポリペプチド(His)₆をコードするDNAを
導入するために、以下の配列を有する2つの合成プライ
マー（HIS03及びHIS04；図５）をアニールさせて、上記
電気泳動溶出したDNA断片と連結し、プラスミドpRS406-
H(4349bp)を得た。 HIS03： 5' gatcccatcaccatcaccatcac 3'（配列番号
８） HIS04： 3' ggtagtggtagtggtagtgagct 5'（配列番号
９）

【００６５】α-ファクターの前駆体のプレプロリーダ
ー配列のDNA断片（MFα1-ss）を市販のpUC19に組み込ん
だプラスミドpUC19-α（Inokuchi,K. et al., 1987, Mo
l. Cell. Biol. 7: 3185-3193）を鋳型にして、以下の
２つのプライマーを用いてPCRを行い、MFα1-ss、すな
わち酵母S.cerevisiaeのαファクターの前駆体のプレプ
ロリーダー配列のDNA断片を増幅した。 5' gatttctagaatgagatttccttcaatttt 3'（配列番号10）（下線部はXbaI認識部位） 5' ccaagcggatcctcttcttttatccaaagataccccttc 3'（配
列番号12）（下線部はBamHI認識部位）

【００６６】PCRは、以下の反応組成液により、94℃,40
秒／48℃,40秒／72℃,40秒の反応を1サイクルとしてこ
れを25サイクル行った。

【００６７】pRS406-HをBamHI及びXbaIで切断してアガ
ロース電気泳動を行い、溶出されたDNA断片（4337bp）
を、上記増幅したプレプロリーダー配列のDNA断片(264b
p)と連結してpRS406HM(4601bp)を作製した。

【００６８】次に、α-アグルチニンのC末端側の320個
のアミノ酸をコードするDNAと、446塩基からなるα-ア
グルチニンの3'-非翻訳領域を含むDNA断片を得るため
に、プラスミドpYE22（Murai,T. et al., 1997, Appl.
Environ. Microbiol. 63: 1362-1366）からXhoIとKpnI
の2つの制限酵素で処理してXhoI-KpnI断片を切り出し、
この断片を、pRS406-HをXhoI及びKpnI で処理したXhoI-
KpnI断片(4586bp)と連結してpRS406-AHM(5999bp)を作製
した。最後に、プラスミドpYE22m（Sawai-Hatanaka, H.
et al., 1995, Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1221-
1228）からSacII及びXbaIを用いて切り出したS.cerevis
iaeのグリセルアルデヒド-3'-リン酸デヒドロゲナーゼ
（GAPDH）のプロモーターDNA断片を、pRS406-AHMからSa
cIIとXbaIを用いて切り出したDNA断片と連結して、ヒス
チジンポリペプチド（His)₆を細胞表層に直接提示・発
現するためのプラスミドpGPMH6(7068bp)を作製した（図
６）。

【００６９】このプラスミドに組み込まれた融合遺伝
子、すなわち酵母S.cerevisiaeのα-ファクターの前駆
体のプレプロリーダー配列、ヒスチジンポリペプチド
（His)₆をコードするDNA配列、並びにα-アグルチニン
のC末端側の320個のアミノ酸をコードするDNA及び446塩
基からなる3'-非翻訳領域のDNA配列により構成される融
合遺伝子の塩基配列を配列番号７に示す。このベクター
を酵母に導入すると、酵母細胞表層にヒスチジンポリペ
プチド（His)₆を容易に発現提示することが可能であ
る。

【００７０】〔実施例２〕細胞表層にヒスチジンポリペ
プチド（His)₆を発現提示する酵母の作製酵母表面で安定にヒスチジンポリペプチド（His)₆を発
現提示させるために、プラスミドpGPMH6を、栄養選択マ
ーカー遺伝子内に１箇所存在する制限酵素ApaIで切断し
て直鎖状にした。得られたDNA断片を、酢酸リチウム法
で酵母(S.cerevisiae MT8-1)に導入し、相同組換えによ
り染色体DNAに組み込んだ。続いて酵母をトリプトファ
ン、ヒスチジン、アデニン及びロイシンを含むSD-U寒天
培地で培養し、生育してきた酵母を選択した。この酵母
は、pGPMH6の遺伝子を有しており、S.cerevisiae MT8-1
(pGPMH6)と名付けた。得られた酵母をYPD液体培地で30
℃で24時間培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離
し、１次抗体としてRGS(HIS)₄抗体を、2次抗体としてFI
TCラベルした抗IgG抗体を用いて蛍光染色し、蛍光顕微
鏡で観察した。

【００７１】その結果、形質転換酵母S.cerevisiae MT8
-1(pGPMH6)の菌体にはFITCの蛍光が見られたが、対照と
して用いたS.cerevisiae MT8-1には蛍光は認められなか
った。これにより、形質転換された酵母の細胞表層でヒ
スチジンポリペプチド（His) ₆が提示・発現しているこ
とが確かめられた。

【００７２】〔実施例３〕細胞の機能評価 (1) 重金属捕捉能の測定形質転換酵母をYPD培地10ml中、30℃で24時間前培養
し、その前培養液の一部（1ml）をさらに新鮮YPD培地10
0mlに添加し、30℃で24時間本培養した。この菌体をO.
D.（Optical density）が10となるまで培養し、20mlの
培養液を分取した後遠心を行って菌体を集めた。

【００７３】この集めた菌体に100μMの各重金属溶液10
mlを加えてよく懸濁した後、30℃、220rpmで2時間振盪
した。遠心して菌体と上清に分離し、さらに菌体を10ml
の脱イオン水で洗浄し、遠心分離により洗浄水と菌体に
分離した。前記上清と洗浄水を集めて、ICP-AES (Induc
tively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscop
y)を用いて金属イオン濃度を求め、上清及び洗浄水中に
存在する金属イオン量を指標として菌体に捕捉された金
属イオン量を算出した。一方、菌体を5mMのEDTA(pH8.0)
10mlで懸濁し（氷上で15分）、遠心分離により上清を
得、この上清について、前記と同様にして金属イオン濃
度を求め、菌体に捕捉された金属イオン量を測定した。

【００７４】硝酸銅、硫酸銅、塩化銅溶液に対する酵母
の捕捉能を測定した結果、対照株（6 nmol/g dry cel
l）に比べて有意の捕捉能を示し、最大14-16nmol/g dry
cellの値を得た。この値は、大腸菌で報告されている
値（Sousa, C. et al., 1998,J. Bacteriol., 180: 228
0-2284）と比べて約2倍の捕捉能を示した。また、銅、
ニッケル、カドミウムイオンについて調べた結果、硝酸
銅、硫酸銅及び塩化銅の捕捉能と同様の捕捉能（最大14
-16nmol/g dry cell）を得た。これらの値は酵母の培養
培地のpHに影響を受けるが、培地に50mM HEPES(pH7.8)
を添加することでその影響を防ぐことが可能である。ま
た、酵母の細胞表層から回収された金属イオンの量と前
記上清及び洗浄水から算出された金属イオンの量とがほ
ぼ同程度であったことから、細胞表層からの金属イオン
の回収は、菌体のEDTA(pH8.0)処理により可能であるこ
とが分かった。

【００７５】(2) 重金属耐性能の獲得本発明の金属捕捉能を有する酵母と対照酵母について、
各種濃度の重金属（CuSO₄）存在下での生存率を測定し
た。すなわち、各培養時間ごとにサンプルを採取して、
OD₆₀₀の増加を測定した。その結果、対照酵母では2mMの
銅イオン濃度で死滅するのに対し、本発明の酵母（ヒス
チジンポリペプチドを細胞表層に提示するもの）は、2m
M以上でも生育することができた。しかも、4mMという高
濃度の金属イオン存在下でも生育することが可能であっ
た。

【００７６】

【発明の効果】本発明により、細胞表層に金属を捕捉す
ることができるタンパク質を発現することができる遺伝
子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターを含む
形質転換体が提供される。本発明の形質転換体は重金属
を捕捉することができるため、環境浄化剤及び金属回収
剤として有用である。

【００７７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOYOTA MOTOR CORPORATION <120> Fusion gene expressing a protein capable of capturing a metal <130> P99-0606 <140> <141> <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 264 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(264) <400> 1 atg aga ttt cct tca att ttt act gca gtt tta ttc gca gca tcc tcc 48 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 gca tta gct gct cca gtc aac act aca aca gaa gat gaa acg gca caa 96 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 att ccg gct gaa gct gtc atc ggt tac tta gat tta gaa ggg gat ttc 144 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 gat gtt gct gtt ttg cca ttt tcc aac agc aca aat aac ggg tta ttg 192 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 ttt ata aat act act att gcc agc att gct gct aaa gaa gaa ggg gta 240 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 tct ttg gat aaa aga aga gga tcc 264 Ser Leu Asp Lys Arg Arg Gly Ser 85 <210> 2 <211> 88 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Asp Lys Arg Arg Gly Ser 85 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 catcaccatc accatcac 18 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptides <400> 4 His His His His His His 1 5 <210> 5 <211> 960 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(960) <400> 5 tcg agc gcc aaa agc tct ttt atc tca acc act act act gat tta aca 48 Ser Ser Ala Lys Ser Ser Phe Ile Ser Thr Thr Thr Thr Asp Leu Thr 1 5 10 15 agt ata aac act agt gcg tat tcc act gga tcc att tcc aca gta gaa 96 Ser Ile Asn Thr Ser Ala Tyr Ser Thr Gly Ser Ile Ser Thr Val Glu 20 25 30 aca ggc aat cga act aca tca gaa gtg atc agt cat gtg gtg act acc 144 Thr Gly Asn Arg Thr Thr Ser Glu Val Ile Ser His Val Val Thr Thr 35 40 45 agc aca aaa ctg tct cca act gct act acc agc ctg aca att gca caa 192 Ser Thr Lys Leu Ser Pro Thr Ala Thr Thr Ser Leu Thr Ile Ala Gln 50 55 60 acc agt atc tat tct act gac tca aat atc aca gta gga aca gat att 240 Thr Ser Ile Tyr Ser Thr Asp Ser Asn Ile Thr Val Gly Thr Asp Ile 65 70 75 80 cac acc aca tca gaa gtg att agt gat gtg gaa acc att agc aga gaa 288 His Thr Thr Ser Glu Val Ile Ser Asp Val Glu Thr Ile Ser Arg Glu 85 90 95 aca gct tcg acc gtt gta gcc gct cca acc tca aca act gga tgg aca 336 Thr Ala Ser Thr Val Val Ala Ala Pro Thr Ser Thr Thr Gly Trp Thr 100 105 110 ggc gct atg aat act tac atc ccg caa ttt aca tcc tct tct ttc gca 384 Gly Ala Met Asn Thr Tyr Ile Pro Gln Phe Thr Ser Ser Ser Phe Ala 115 120 125 aca atc aac agc aca cca ata atc tct tca tca gca gta ttt gaa acc 432 Thr Ile Asn Ser Thr Pro Ile Ile Ser Ser Ser Ala Val Phe Glu Thr 130 135 140 tca gat gct tca att gtc aat gtg cac act gaa aat atc acg aat act 480 Ser Asp Ala Ser Ile Val Asn Val His Thr Glu Asn Ile Thr Asn Thr 145 150 155 160 gct gct gtt cca tct gaa gag ccc act ttt gta aat gcc acg aga aac 528 Ala Ala Val Pro Ser Glu Glu Pro Thr Phe Val Asn Ala Thr Arg Asn 165 170 175 tcc tta aat tcc ttc tgc agc agc aaa cag cca tcc agt ccc tca tct 576 Ser Leu Asn Ser Phe Cys Ser Ser Lys Gln Pro Ser Ser Pro Ser Ser 180 185 190 tat acg tct tcc cca ctc gta tcg tcc ctc tcc gta agc aaa aca tta 624 Tyr Thr Ser Ser Pro Leu Val Ser Ser Leu Ser Val Ser Lys Thr Leu 195 200 205 cta agc acc agt ttt acg cct tct gtg cca aca tct aat aca tat atc 672 Leu Ser Thr Ser Phe Thr Pro Ser Val Pro Thr Ser Asn Thr Tyr Ile 210 215 220 aaa acg gaa aat acg ggt tac ttt gag cac acg gct ttg aca aca tct 720 Lys Thr Glu Asn Thr Gly Tyr Phe Glu His Thr Ala Leu Thr Thr Ser 225 230 235 240 tca gtt ggc ctt aat tct ttt agt gaa aca gca ctc tca tct cag gga 768 Ser Val Gly Leu Asn Ser Phe Ser Glu Thr Ala Leu Ser Ser Gln Gly 245 250 255 acg aaa att gac acc ttt tta gtg tca tcc ttg atc gca tat cct tct 816 Thr Lys Ile Asp Thr Phe Leu Val Ser Ser Leu Ile Ala Tyr Pro Ser 260 265 270 tct gca tca gga agc caa ttg tcc ggt atc caa cag aat ttc aca tca 864 Ser Ala Ser Gly Ser Gln Leu Ser Gly Ile Gln Gln Asn Phe Thr Ser 275 280 285 act tct ctc atg att tca acc tat gaa ggt aaa gcg tct ata ttt ttc 912 Thr Ser Leu Met Ile Ser Thr Tyr Glu Gly Lys Ala Ser Ile Phe Phe 290 295 300 tca gct gag ctc ggt tcg atc att ttt ctg ctt ttg tcg tac ctg cta 960 Ser Ala Glu Leu Gly Ser Ile Ile Phe Leu Leu Leu Ser Tyr Leu Leu 305 310 315 320 <210> 6 <211> 320 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 Ser Ser Ala Lys Ser Ser Phe Ile Ser Thr Thr Thr Thr Asp Leu Thr 1 5 10 15 Ser Ile Asn Thr Ser Ala Tyr Ser Thr Gly Ser Ile Ser Thr Val Glu 20 25 30 Thr Gly Asn Arg Thr Thr Ser Glu Val Ile Ser His Val Val Thr Thr 35 40 45 Ser Thr Lys Leu Ser Pro Thr Ala Thr Thr Ser Leu Thr Ile Ala Gln 50 55 60 Thr Ser Ile Tyr Ser Thr Asp Ser Asn Ile Thr Val Gly Thr Asp Ile 65 70 75 80 His Thr Thr Ser Glu Val Ile Ser Asp Val Glu Thr Ile Ser Arg Glu 85 90 95 Thr Ala Ser Thr Val Val Ala Ala Pro Thr Ser Thr Thr Gly Trp Thr 100 105 110 Gly Ala Met Asn Thr Tyr Ile Pro Gln Phe Thr Ser Ser Ser Phe Ala 115 120 125 Thr Ile Asn Ser Thr Pro Ile Ile Ser Ser Ser Ala Val Phe Glu Thr 130 135 140 Ser Asp Ala Ser Ile Val Asn Val His Thr Glu Asn Ile Thr Asn Thr 145 150 155 160 Ala Ala Val Pro Ser Glu Glu Pro Thr Phe Val Asn Ala Thr Arg Asn 165 170 175 Ser Leu Asn Ser Phe Cys Ser Ser Lys Gln Pro Ser Ser Pro Ser Ser 180 185 190 Tyr Thr Ser Ser Pro Leu Val Ser Ser Leu Ser Val Ser Lys Thr Leu 195 200 205 Leu Ser Thr Ser Phe Thr Pro Ser Val Pro Thr Ser Asn Thr Tyr Ile 210 215 220 Lys Thr Glu Asn Thr Gly Tyr Phe Glu His Thr Ala Leu Thr Thr Ser 225 230 235 240 Ser Val Gly Leu Asn Ser Phe Ser Glu Thr Ala Leu Ser Ser Gln Gly 245 250 255 Thr Lys Ile Asp Thr Phe Leu Val Ser Ser Leu Ile Ala Tyr Pro Ser 260 265 270 Ser Ala Ser Gly Ser Gln Leu Ser Gly Ile Gln Gln Asn Phe Thr Ser 275 280 285 Thr Ser Leu Met Ile Ser Thr Tyr Glu Gly Lys Ala Ser Ile Phe Phe 290 295 300 Ser Ala Glu Leu Gly Ser Ile Ile Phe Leu Leu Leu Ser Tyr Leu Leu 305 310 315 320 <210> 7 <211> 1700 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tacttagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tctttggata aaagaagagg atcccatcac catcaccatc actcgagcgc caaaagctct 300 tttatctcaa ccactactac tgatttaaca agtataaaca ctagtgcgta ttccactgga 360 tccatttcca cagtagaaac aggcaatcga actacatcag aagtgatcag tcatgtggtg 420 actaccagca caaaactgtc tccaactgct actaccagcc tgacaattgc acaaaccagt 480 atctattcta ctgactcaaa tatcacagta ggaacagata ttcacaccac atcagaagtg 540 attagtgatg tggaaaccat tagcagagaa acagcttcga ccgttgtagc cgctccaacc 600 tcaacaactg gatggacagg cgctatgaat acttacatcc cgcaatttac atcctcttct 660 ttcgcaacaa tcaacagcac accaataatc tcttcatcag cagtatttga aacctcagat 720 gcttcaattg tcaatgtgca cactgaaaat atcacgaata ctgctgctgt tccatctgaa 780 gagcccactt ttgtaaatgc cacgagaaac tccttaaatt ccttctgcag cagcaaacag 840 ccatccagtc cctcatctta tacgtcttcc ccactcgtat cgtccctctc cgtaagcaaa 900 acattactaa gcaccagttt tacgccttct gtgccaacat ctaatacata tatcaaaacg 960 gaaaatacgg gttactttga gcacacggct ttgacaacat cttcagttgg ccttaattct 1020 tttagtgaaa cagcactctc atctcaggga acgaaaattg acaccttttt agtgtcatcc 1080 ttgatcgcat atccttcttc tgcatcagga agccaattgt ccggtatcca acagaatttc 1140 acatcaactt ctctcatgat ttcaacctat gaaggtaaag cgtctatatt tttctcagct 1200 gagctcggtt cgatcatttt tctgcttttg tcgtacctgc tattctaaaa cgggtactgt 1260 acagttagta cattgagtcg aaatatacga aattattgtt cataattttc atcctggctc 1320 tttttttctt caaccatagt taaatggaca gttcatatct taaactctaa taatactttt 1380 ctagttctta tccttttccg tctcaccgca gattttatca tagtattaaa tttatatttt 1440 gttcgtaaaa agaaaaattt gtgagcgtta ccgctcgttt cattacccga aggctgtttc 1500 agtagaccac tgattaagta agtagatgaa aaaatttcat caccatgaaa gagttcgatg 1560 agagctactt tttcaaatgc ttaacagcta accgccattc aataatgtta cgttctcttc 1620 attctgcggc tacgttatct aacaagaggt tttactctct catatctcat tcaaatagaa 1680 agaacataat caaaggtacc 1700 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 gatcccatca ccatcaccat cac 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 9 tcgagtgatg gtgatggtga tgg 23 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 10 gatttctaga atgagatttc cttcaatttt 30 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 11 ccaagcggat cctcttcttt tatccaaaga taccccttc 39

【００７８】

【配列表フリーテキスト】配列番号３：合成DNA 配列番号４：合成ペプチド配列番号８：合成DNA 配列番号９：合成DNA 配列番号10：合成DNA 配列番号11：合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】金属捕捉能を付与した細胞のモデル図である。

【図２】本発明の遺伝子の構築図である。

【図３】α-アグルチニンの分子構造を示す図である。

【図４】本発明の組換えベクターの構築プロセスを示す
図である。

【図５】ヒスチジンポリペプチド（His)₆をコードするD
NAを合成するためのプライマーを示す図である。

【図６】プラスミドpGPMH6を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０２Ｆ 3/34 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ４Ｈ０４５Ｃ０７Ｋ 14/395 Ｂ０１Ｄ 53/34 ＺＣ０９Ｋ 3/00 １０８１３６ＺＣ１２Ｎ 1/15 Ｂ０９Ｂ 3/00 ＺＡＢＥ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣＦターム(参考） 4B024 AA17 BA21 CA04 CA07 DA12 EA04 GA11 GA19 HA01 HA15 4B065 AA72X AA80X AA80Y AA88X AA90X AB01 AC14 BA03 BD05 CA24 CA54 4D002 AA28 BA04 BA17 CA07 DA59 DA70 HA01 HA02 4D004 AA41 AB03 CA12 CA13 CA17 CA18 CA34 CA35 CA47 CB02 CC07 CC08 CC15 4D040 CC01 CC05 CC09 CC11 DD03 DD07 DD20 4H045 AA10 AA30 CA15 DA01 EA61 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】分泌シグナルペプチド、金属捕捉能を有
するポリペプチド及び細胞表層局在タンパク質をそれぞ
れコードするDNAを含む融合遺伝子。
【請求項２】分泌シグナルペプチドが配列番号２で表
されるアミノ酸配列を含むものである請求項1記載の融
合遺伝子。
【請求項３】分泌シグナルペプチドをコードするDNA
が配列番号１で表される塩基配列を含むものである請求
項1又は２記載の融合遺伝子。
【請求項４】金属捕捉能を有するポリペプチドが配列
番号４で表されるアミノ酸配列を含むものである請求項
1記載の融合遺伝子。
【請求項５】金属捕捉能を有するポリペプチドをコー
ドするDNAが配列番号３で表される塩基配列を含むもの
である請求項1又は４記載の融合遺伝子。
【請求項６】細胞表層局在タンパク質が配列番号６で
表されるアミノ酸配列を含むものである請求項1記載の
融合遺伝子。
【請求項７】細胞表層局在タンパク質をコードするDN
Aが配列番号５で表される塩基配列を含むものである請
求項1又は６記載の融合遺伝子。
【請求項８】配列番号７で表される塩基配列を含む、
細胞表層に金属捕捉能タンパク質を発現することができ
る融合遺伝子。
【請求項９】請求項１〜８のいずれか1項に記載の遺
伝子を含有する組換えベクター。
【請求項１０】請求項９記載の組換えベクターを含む
形質転換体。
【請求項１１】形質転換体が形質転換酵母、形質転換
動物細胞、形質転換植物細胞、形質転換粘菌又は形質転
換昆虫細胞である請求項10記載の形質転換体。
【請求項１２】請求項10又は11記載の形質転換体を含
む環境浄化剤。
【請求項１３】請求項10又は11記載の形質転換体を含
む金属回収剤。
【請求項１４】請求項10又は11記載の形質転換体が充
填されたカラム。
【請求項１５】請求項14記載のカラムを含む環境浄化
装置。
【請求項１６】金属により汚染された環境物質に、請
求項10又は11記載の形質転換体を添加することを特徴と
する環境浄化方法。
【請求項１７】金属により汚染された環境物質を、請
求項14記載のカラム又は請求項15記載の装置で処理する
ことを特徴とする環境浄化方法。
【請求項１８】環境物質が海水若しくは淡水、廃水、
排ガス又は土壌である請求項16又は17記載の環境浄化方
法。
【請求項１９】金属により汚染された環境物質に請求
項10又は11記載の形質転換体を添加し、添加後の形質転
換体をキレート剤で処理することを特徴とする金属の回
収方法。
【請求項２０】環境物質が海水若しくは淡水、廃水、
排ガス又は土壌である請求項19記載の回収方法。
【請求項２１】キレート剤がエチレンジアミンテトラ
酢酸である請求項19又は20記載の回収方法。