JP2003279567A

JP2003279567A - スクリーニング方法

Info

Publication number: JP2003279567A
Application number: JP2003003301A
Authority: JP
Inventors: Masakuni Noda; 昌邦野田; Takanori Matsuo; 孝徳松尾; Hiroko Tsuge; 裕子柘植
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-01-10
Filing date: 2003-01-09
Publication date: 2003-10-02

Abstract

(57)【要約】【課題】腎疾患などの予防・治療薬をスクリーニングす
るための方法を提供する。【解決手段】配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質またはその塩を用いることを特徴とする、該タンパ
ク質またはその塩が関連する疾患の予防・治療物質のス
クリーニング方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、腎疾患などの予防
・治療薬をスクリーニングするための方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】配列番号：1で表されるアミノ酸配列を
含有するタンパク質としては、Early Growth Response
−1（本明細書中、Ｅｇｒ−1と略記することがある）が
知られている。Ｅｇｒ−1は、虚血により活性化され、
炎症、凝固および血管透過性の重要なレギュレーターの
発現を誘導する転写因子である（Nature Medicine, vo
l.6, No.12, p.1355）。これまでに、Ｅｇｒ−1を用い
て、Ｅｇｒ−1が関連する疾患の予防・治療薬をスクリ
ーニングする方法についての報告は見当たっていない。
なお、現在、腎疾患の治療薬としては、アンジオテンシ
ン変換酵素阻害剤などが用いられているが、本薬剤は、
腎血行動態に影響を及ぼすために、高度の腎機能低下患
者に用いることはできない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】優れた効果を有し、か
つ、副作用のない腎疾患などの予防・治療薬、およびこ
のような予防・治療薬をスクリーニングすることの可能
な方法が求められている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、腎疾患モデ
ル動物において腎Ｅｇｒ−1の発現が顕著に増加してい
ることを初めて見出し、さらに、腎疾患モデル動物にお
ける腎Ｅｇｒ−1の発現を抑制することによって、腎疾
患の治療効果が得られることを初めて見出した。本発明
者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた
結果、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、１）配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また
はその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質また
はその塩が関連する疾患の予防・治療物質のスクリーニ
ング方法；２）配列番号：1で表されるアミノ酸配列を含有するタ
ンパク質またはその塩を用いることを特徴とする、該タ
ンパク質またはその塩が関連する疾患の予防・治療物質
のスクリーニング方法；３）タンパク質が配列番号：2で表されるアミノ酸配列
を有する前記１）記載のスクリーニング方法；４）疾患が腎疾患である前記１）記載のスクリーニング
方法；５）腎疾患がＥｇｒ−1依存性腎疾患である前記４）記
載のスクリーニング方法；６）腎疾患が糖尿病性腎症である前記４）記載のスクリ
ーニング方法；７）配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また
はその塩を産生する能力を有する細胞を培養した場合
と、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また
はその塩を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存
在下に培養した場合との、配列番号：1で表されるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するタンパク質またはその塩の生産量を比較すること
を特徴とする、前記１）記載のスクリーニング方法；８）試験化合物の存在下および非存在下において、配列
番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩
の活性を比較することを特徴とする、前記１）記載のス
クリーニング方法；９）活性が、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質またはその塩が結合し得るポリヌクレオチドに対す
る結合活性である前記８）記載のスクリーニング方法；１０）活性が、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質またはその塩による転写制御の支配下にある遺伝
子の発現制御活性である前記８）記載のスクリーニング
方法；１１）配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質ま
たはその塩を産生する能力を有する細胞を培養した場合
と、該細胞を試験化合物の存在下に培養した場合との、
該タンパク質またはその塩の生産量および該タンパク質
またはその塩が結合し得るポリヌクレオチドに対する結
合活性を、該ポリヌクレオチドおよび該タンパク質また
はその塩に対する抗体を用いて測定・比較することを特
徴とする、前記１）記載のスクリーニング方法；１２）前記１）記載のスクリーニング方法によって得ら
れた化合物またはその塩；１３）前記１）記載のスクリーニング方法によって得ら
れた化合物またはその塩を含有してなる、配列番号：1
で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩が関連す
る疾患の予防・治療薬；１４）配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質ま
たはその塩をコードする塩基配列またはその部分配列を
含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、
配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはそ
の塩が関連する疾患の予防・治療物質のスクリーニング
方法；１５）配列番号：1で表されるアミノ酸配列を含有する
タンパク質またはその塩をコードする塩基配列またはそ
の部分配列を含有するポリヌクレオチドを用いることを
特徴とする、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質またはその塩が関連する疾患の予防・治療物質のス
クリーニング方法；１６）ポリヌクレオチドが配列番号：3または配列番
号：4で表される塩基配列またはその部分配列を含有す
る前記１４）記載のスクリーニング方法；１７）疾患が腎疾患である前記１４）記載のスクリーニ
ング方法；１８）腎疾患がＥｇｒ−1依存性腎疾患である前記１
７）記載のスクリーニング方法；１９）腎疾患が糖尿病性腎症である前記１７）記載のス
クリーニング方法；２０）配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質ま
たはその塩を産生する能力を有する細胞を培養した場合
と、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また
はその塩を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存
在下に培養した場合との、配列番号：1で表されるアミ
ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するタンパク質またはその塩をコードするＲＮＡの量
を比較することを特徴とする、前記１４）記載のスクリ
ーニング方法；２１）前記１４）記載のスクリーニング方法によって得
られた化合物またはその塩；２２）前記１４）記載のスクリーニング方法によって得
られた化合物またはその塩を含有してなる、配列番号：
1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の
アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩が関連
する疾患の予防・治療薬；２３）配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質ま
たはその塩に対する抗体；２４）前記２３）記載の抗体を含有してなる、配列番
号：1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同
一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩が
関連する疾患の予防・治療薬；２５）配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を
コードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその部分
配列を有するポリヌクレオチドを含有してなる、配列番
号：1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同
一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩が
関連する疾患の予防・治療薬；２６）前記２３）記載の抗体を含有してなる、配列番
号：1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同
一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩が
関連する疾患の診断薬；２７）配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を
コードする塩基配列またはその部分配列を有するポリヌ
クレオチドを含有してなる、配列番号：1で表されるア
ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するタンパク質またはその塩が関連する疾患の診断
薬；２８）配列番号：５または配列番号：６で表される塩基
配列を有するポリヌクレオチドを含有することを特徴と
する、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一また
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質ま
たはその塩が関連する疾患の予防・治療薬；２９）疾患が腎疾患である前記２８）記載の予防・治療
薬；３０）腎疾患がＥｇｒ−1依存性腎疾患である前記２
９）記載の予防・治療薬；３１）腎疾患が糖尿病性腎症である前記２９）記載の予
防・治療薬；３２）Ｅｇｒ−1抑制薬を含有してなる糖尿病性腎症の
予防・治療薬；３３）Ｅｇｒ−1抑制薬が腎Ｅｇｒ−1抑制薬である前記
３２）記載の予防・治療薬；３４）哺乳動物にＥｇｒ−1抑制薬を投与することを特
徴とする、該哺乳動物における糖尿病性腎症の予防また
は治療方法；３５）Ｅｇｒ−1抑制薬が腎Ｅｇｒ−1抑制薬である前記
３４）記載の方法；３６）糖尿病性腎症の予防・治療薬を製造するための、
Ｅｇｒ−1抑制薬の使用；３７）Ｅｇｒ−1抑制薬が腎Ｅｇｒ−1抑制薬である前記
３６）記載の使用；などに関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明において、配列番号：１で
表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア
ミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタン
パク質と略記することがある）は、温血動物（例えば、
ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）の
細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細
胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲ
ルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細
胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪
細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細
胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基
球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨
細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは
間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしく
はガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあら
ゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃
核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延
髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生
殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、
消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、
顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、
骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってよ
く、合成タンパク質であってもよい。

【０００７】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６
０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、特に好まし
くは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上の相同
性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：
１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配
列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列
番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配
列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有する
タンパク質などが好ましい。

【０００８】実質的に同質の活性としては、例えば、線
維化関連遺伝子、細胞周期関連遺伝子、および血栓関連
遺伝子の転写制御活性などが挙げられる。実質的に同質
とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、また
は薬理学的に）同質であることを示す。したがって、転
写制御活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好まし
くは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）
であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパ
ク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。線
維化関連遺伝子としては、例えば、platelet-derived g
rowth factor-A chain（PDGF-A chain）、platelet-der
ived growth factor-B chain（PDGF-B chain）、basic
fibroblast growth factor（bFGF）、fibroblast growt
h factor 2（FGF2）、tumor growth factor-β1（TGF-
β1）、tumor necrosis factor-α(TNF-α)、intercell
ular adhesion molecule 1(ICAM-1)、vascular endothe
lial cell growth factor (VEGF)、PDGF β receptor
(PDGF β R)、insulin-like growth factor-1 receptor
(IGF-1 R)、fibronectin、α2（1）collagenなどが挙
げられる。細胞周期関連遺伝子としては、例えばp53な
どが挙げられる。血栓関連遺伝子としては、例えば、pl
asminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)、tissue fa
ctor (TF)、metalloproteinaseなどが挙げられる。転写
制御活性の測定は、公知の方法、例えばShi-Fang Yanら
の方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95巻、8298-8303
頁、1998年）またはそれに準じる方法に従って測定する
ことができる。

【０００９】また、本発明のタンパク質としては、例え
ば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１また
は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは
１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）の
アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表
されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、
１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好
ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ
酸配列、配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましく
は１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）
のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、配列番号：１
で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好まし
くは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さ
らに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミ
ノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み
合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわ
ゆるムテインも含まれる。上記のようにアミノ酸配列が
挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失
または置換の位置は特に限定されない。本発明のタンパ
ク質は、好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列を有するタンパク質、すなわちＥｇｒ−1である。

【００１０】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめ
とする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル
基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ⁻）、
アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）
の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとし
ては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプ
ロピル、ｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基；例え
ば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シ
クロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなど
のＣ_６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチ
ルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基；α−ナフチル
メチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１− _２アルキル基などの
Ｃ_７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基な
どが用いられる。本発明のタンパク質がＣ末端以外にカ
ルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している
場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化され
ているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合
のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル
などが用いられる。さらに、本発明のタンパク質には、
Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ
基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ
_１−６アルカノイルなどのＣ_１−６アシル基など）で保
護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端
のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子
内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−Ｓ
Ｈ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニ
ジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、ア
セチル基などのＣ_１−６アルカノイル基などのＣ_１−６
アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が
結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質な
ども含まれる。

【００１１】本発明のタンパク質の塩としては、生理学
的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、
アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理
学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩と
しては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化
水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢
酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハ
ク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、
メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが
用いられる。本発明のタンパク質またはその塩は、前述
した温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク
質の精製方法によって製造することができる。具体的に
は、温血動物の組織または細胞をホモジナイズし、可溶
画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィーなどのクロマトグラフィーで分離精製すること
によって、本発明のタンパク質またはその塩を製造する
ことができる。

【００１２】本発明のタンパク質またはその塩は、公知
のペプチド合成法にしたがって製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法の
いずれであってもよい。本発明のタンパク質を構成し得
る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合
し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的とするタンパク質を製造することができ
る。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、
例えば、以下の〜に記載された方法にしたがって行
われる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)
（1975年）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合
成、広川書店このようにして得られたタンパク質は、公知の精製法に
より精製単離することができる。ここで、精製法として
は、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィ
ー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合
わせなどが挙げられる。上記方法で得られるタンパク質
が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるい
はそれに準じる方法によって適当な塩に変換することが
できるし、逆にタンパク質が塩として得られた場合に
は、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によっ
て遊離体または他の塩に変換することができる。

【００１３】本発明のタンパク質またはその塩は、通
常、市販のタンパク質合成用樹脂を用いて合成される。
このような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、
ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、ア
ミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコー
ル樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ
樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミ
ドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，
４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノ
キシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆ
ｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などが挙げられ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の
配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で
縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出
すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で
分子内ジスルフィド結合形成反応を行って、目的のタン
パク質を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合においては、タンパク質合
成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる
が、特に、カルボジイミド類が好ましい。カルボジイミ
ド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカル
ボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノ
プロリル）カルボジイミドなどが用いられる。保護アミ
ノ酸の縮合は、例えば活性化試薬およびラセミ化抑制添
加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護ア
ミノ酸を直接樹脂に添加するか、あらかじめ保護アミノ
酸を対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯ
ＯＢｔエステルとして活性化した後に樹脂に添加するこ
とによって行われる。

【００１４】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒は、タンパク質縮合反応に使用しうること
が知られている溶媒から適宜選択される。例えば、Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトア
ミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類；塩化メ
チレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類；ト
リフルオロエタノールなどのアルコール類；ジメチルス
ルホキシドなどのスルホキシド類；ピリジンなどのアミ
ン類；ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類；アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類；酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類；あるい
はこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度
は、タンパク質縮合反応に使用されることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体
は、通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン
反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には、
保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すこと
により十分な縮合を行なうことができる。縮合反応を繰
り返しても縮合が不十分な場合には、無水酢酸またはア
セチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル
化することによって、十分な縮合を行なうことができ
る。

【００１５】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護方法ならびに保護基、およびその保護基の脱離方法、
反応に関与する官能基の活性化方法などは、公知の基ま
たは公知の手段から適宜選択しうる。原料アミノ酸のア
ミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペ
ンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニ
ル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−
Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフ
ルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフ
ェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、
Ｆｍｏｃなどが挙げられる。原料アミノ酸のカルボキシ
ル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペ
ンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオク
チル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは
環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例
えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステ
ル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジ
ルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシル
エステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、
ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラ
ジド化などによって保護することができる。セリンの水
酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって
保護することができる。エステル化に適する基として
は、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ_１−６）アルカ
ノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオ
キシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸か
ら誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に
適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロ
ピラニル基、ｔ−ブチル基などが挙げられる。チロシン
のフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚ
ｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、
ｔ−ブチルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾー
ルの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−
２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、
ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍ
ｏｃなどが用いられる。

【００１６】保護基の除去（脱離）方法としては、例え
ば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下で
の水素気流中での接触還元；無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理；ジイ
ソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジ
ン、ピペラジンなどによる塩基処理；液体アンモニア中
ナトリウムによる還元などが挙げられる。上記酸処理に
よる脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行
なわれる。酸処理においては、例えば、アニソール、フ
ェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレ
ゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオー
ル、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕
捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾ
ール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル
基は、チオフェノール処理により除去される。トリプト
ファンのインドール保護基として用いられるホルミル基
は、１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオ
ールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸
化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処
理によっても除去される。

【００１７】原料アミノ酸のカルボキシル基の活性化さ
れたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジ
ド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロ
フェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，
４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パ
ラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエ
ステル〕などが用いられる。原料アミノ酸のアミノ基の
活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸ア
ミドが用いられる。

【００１８】タンパク質のアミド体は、公知の方法にし
たがい、該タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸のα−
カルボキシル基をアミド化することによって製造するこ
とができる。タンパク質のエステル体は、例えば、該タ
ンパク質のカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル
基を所望のアルコール類と縮合することによって製造す
ることができる。

【００１９】さらに、本発明のタンパク質またはその塩
は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する
形質転換体を培養し、得られる培養物から本発明のタン
パク質またはその塩を分離精製することによって製造す
ることもできる。本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが
挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織
よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを
用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase ChainRe
action（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増
幅することもできる。本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３または配列番
号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配
列番号：３または配列番号：４で表される塩基配列とハ
イストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基
配列を含有し、前記した配列番号：１で表されるアミノ
酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性
（例、線維化関連遺伝子、細胞周期関連遺伝子、および
血栓関連遺伝子の転写制御活性など）を有するタンパク
質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。配列番号：３
または配列番号：４で表される塩基配列とハイストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとして
は、例えば、配列番号：３または配列番号：４で表され
る塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、
さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０
％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは
約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮ
Ａなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体
公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J.
Sambrook etal., Cold Spring Harbor Lab. Press, 198
9）に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイ
ゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って
行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ま
しくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうこ
とができる。ハイストリンジェントな条件とは、例え
ば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約
１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは
約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が
約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。配列番
号：１で表されるアミノ酸配列（好ましくは、配列番
号：２で表されるアミノ酸配列）を含有するタンパク質
をコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号：３または
配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなど
である。

【００２０】本発明のタンパク質を完全にコードするＤ
ＮＡは、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一
部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法に
よって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込
んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域
をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標
識したものとハイブリダイゼーションすることによって
クローニングすることができる。ハイブリダイゼーショ
ンは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecula
r Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring H
arbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行
なうことができる。また、市販のライブラリーを使用す
る場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに
添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうこと
ができる。ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例え
ば、Mutan^TM-super Express Km（宝酒造（株））、Muta
n^TM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gap
pedduplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそ
れらに準じる方法に従って変換することができる。クロ
ーン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは、目的に
よりそのまま、または所望により制限酵素で消化する
か、リンカーを付加した後に、使用することができる。
該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡ
ＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとして
のＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。こ
れらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成
ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。

【００２１】前記した発現ベクターは、例えば、本発明
のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ
断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中
のプロモーターの下流に連結することにより製造するこ
とができる。発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラ
スミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１
２，ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵ
Ｂ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミ
ド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）；λファージなどの
バクテリオファージ；レトロウイルス，ワクシニアウイ
ルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス；ｐＡ１−
１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐ
ｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。プロモーターと
しては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプ
ロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿
主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４
０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイト
メガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモー
ターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモータ
ー、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。宿主がエシェ
リヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプ
ロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Ｌプロモータ
ー、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ま
しい。宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモ
ーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター
などが好ましい。宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロ
モーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、
ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞で
ある場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモー
ターなどが好ましい。

【００２２】発現ベクターとしては、上記の他に、所望
によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ
付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン
（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを
含有しているものを用いることができる。選択マーカー
としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈ
ｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート
（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａ
ｍｐ^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝
子（以下、Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイ
ニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含
まない培地によって選択することもできる。また、必要
に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタン
パク質のＮ端末側に付加してもよい。宿主がエシェリヒ
ア属菌である場合、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグ
ナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、α−
アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配
列などが；宿主が酵母である場合、ＭＦα・シグナル配
列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが；宿主が動物細胞で
ある場合、インシュリン・シグナル配列、α−インター
フェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列など
がそれぞれ用いられる。

【００２３】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを
含有する形質転換体は、公知の方法にしたがい、該ＤＮ
Ａを含有する発現ベクターで、宿主を形質転換すること
によって製造することができる。ここで、発現ベクター
としては、前記したものが挙げられる。宿主としては、
例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫
細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア
属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌク
イレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Resear
ch），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of
Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７
８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６０
０〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０
(１９５４)〕などが用いられる。バチルス属菌として
は、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtili
s）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８
３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７
(１９８４)〕などが用いられる。酵母としては、例え
ば、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１
Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセ
スポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１
９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキアパストリス（Pich
ia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。

【００２４】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodopte
ra frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの
中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHig
h Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigm
ena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢ
ｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞
（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられ
る。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC C
RL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン
・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用い
られる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用
いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，
５９２(１９８５)〕。動物細胞としては、例えば、サル
細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細
胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子
欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ
（ｄｈｆｒ⁻）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡ
ｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒ
トＦＬ細胞などが用いられる。

【００２５】形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方
法にしたがって実施することができる。エシェリヒア属
菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，
２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７
(１９８２)などに記載の方法に従って形質転換すること
ができる。バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ G
eneral Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)など
に記載の方法に従って形質転換することができる。酵母
は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth
ods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１
９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエ
スエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９
２９(１９７８)などに記載の方法に従って形質転換する
ことができる。昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ
／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)な
どに記載の方法に従って形質転換することができる。動
物細胞は、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プ
ロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発
行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１
９７３)に記載の方法に従って形質転換することができ
る。

【００２６】形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、
公知の方法にしたがって実施することができる。例え
ば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である
形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地とし
ては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の
生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有するこ
とが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グル
コース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒
素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、
コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキ
ス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物
質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン
酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ
挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン
類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨ
は、好ましくは約５〜８である。宿主がエシェリヒア属
菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例
えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー
（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イ
ン・モレキュラー・ジェネティックス（Journalof Expe
riments in Molecular Genetics），４３１−４３３，C
old Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕
が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働か
せるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のよ
うな薬剤を培地に添加してもよい。宿主がエシェリヒア
属菌である形質転換体の培養は、通常約１５〜４３℃
で、約３〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹
拌を行ってもよい。宿主がバチルス属菌である形質転換
体の培養は、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行
なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。宿
主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地として
は、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地
〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），
７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を
含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕な
どが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８で
ある。培養は、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２
時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行っても
よい。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培
養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Med
ium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(19
62)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加
えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは
約６．２〜６．４である。培養は、通常約２７℃で、約
３〜５日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行っ
てもよい。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する
場合の培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２
巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー
（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（The Journal of the Ame
rican Medical Association）１９９巻，５１９(１９６
７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding of the Society for the Biological Med
icine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。
培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通
常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行なわれる。
必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。以上のように
して、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発
明のタンパク質を製造することができる。

【００２７】前記形質転換体を培養して得られる培養物
から本発明のタンパク質を自体公知の方法にしたがって
分離精製することができる。例えば、本発明のタンパク
質を培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物か
ら公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液
に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解
などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離
やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適
宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなど
の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面
活性剤を含んでいてもよい。また、核画分から本発明の
タンパク質を抽出する場合は、上記の遠心分離またはろ
過により得られる沈殿を例えば高張液等で処理し、遠心
分離して上清を回収することにより、核タンパク質の粗
抽出液を得る方法などが用いられる。培養物中にタンパ
ク質が分泌される場合には、培養物から、公知の方法で
培養上清を集める方法が用いられる。このようにして得
られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク
質の精製は、自体公知の方法にしたがって分離精製する
ことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈
澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過
法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方
法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利
用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの
特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いら
れる。これらの方法は、適宜組み合わせることもでき
る。

【００２８】かくして得られるタンパク質が遊離体とし
て得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準
じる方法によって、該遊離体を塩に変換することがで
き、タンパク質が塩として得られた場合には、自体公知
の方法あるいはそれに準じる方法により、該塩を遊離体
または他の塩に変換することができる。なお、形質転換
体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当
な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を
加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもでき
る。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キ
モトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテ
インキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かく
して得られる本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を
用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッテ
ィングなどにより確認することができる。

【００２９】本発明のタンパク質が関連する疾患として
は、正常時と比較した場合に、本発明のタンパク質の量
が増加あるいは減少している疾患が挙げられる。ここ
で、「正常時と比較した場合に、本発明のタンパク質の
量が増加している疾患」としては、例えば腎疾患（例え
ば、糖尿病性腎症；慢性糸球体腎炎；IgA腎症；腎移植
後の慢性拒絶；腎癌；腹膜透析時の腹膜硬化症）；循環
器疾患（例えば、動脈硬化症；心筋梗塞；心不全；心筋
症；PTCAおよびステント留置後の血管再狭窄；心・血管
移植後の慢性拒絶；血栓症）；脳血管障害（例えば、脳
梗塞）；肺疾患（例えば、肺線維症、慢性閉塞性肺症候
群、肺癌）；肝疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝癌）；
消化管疾患（例えば、大腸炎、胃癌、大腸癌）；性腺疾
患（例えば、前立腺癌）；膠原病（例えば、強皮症、全
身性エリテマトーデス）；リウマチ性疾患（例えば、慢
性関節リウマチ）；骨疾患（例えば、骨粗鬆症）などが
挙げられる。「正常時と比較した場合に、本発明のタン
パク質の量が減少している疾患」としては、例えば消化
管疾患（例えば、胃潰瘍、十二指腸潰瘍）；皮膚疾患
（例えば、火傷、術後の創傷）などが挙げられる。本発
明のタンパク質が関連する疾患としては、「正常時と比
較した場合に、本発明のタンパク質の量が増加している
疾患」が好ましい。また、本発明のタンパク質が関連す
る疾患としては、生体内におけるＥｇｒ−1の量に依存
して発症する、Ｅｇｒ−1依存性疾患が好ましい。本発
明のタンパク質が関連する疾患は、好ましくは腎疾患で
あり、さらに好ましくはＥｇｒ−1依存性腎疾患であ
る。とりわけ、腎Ｅｇｒ−1依存性腎疾患が好ましい。

【００３０】本発明は、本発明のタンパク質を用いるこ
とを特徴とする、該タンパク質が関連する疾患の予防・
治療物質のスクリーニング方法に関する。本発明のスク
リーニング方法は、例えば、 1）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を
培養した場合と、本発明のタンパク質を産生する能力を
有する細胞を試験化合物の存在下に培養した場合とで、
本発明のタンパク質の生産量を比較すること； 2）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を
培養した場合と、本発明のタンパク質を産生する能力を
有する細胞を試験化合物の存在下に培養した場合とで、
本発明のタンパク質の活性を比較すること； 3）試験化合物が共存する場合と共存しない場合とで、
本発明のタンパク質の活性を比較すること；などによっ
て行われる。本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞は、該
タンパク質を産生する能力を有する細胞である限り特に
限定されないが、酸化ストレスや増殖因子（以下、包括
的に「Ｅｇｒ−１発現誘導因子」という場合がある）処
理などの各種刺激に応じて本発明のタンパク質（好まし
くはEgr-1）の産生が誘導されるものが好ましい。本発
明のタンパク質を産生する能力を有する細胞は、前記し
た「本発明のタンパク質をコードするDNAを含有する形
質転換体」であってもよい。本発明のタンパク質を産生
する能力を有する細胞の好適な例としては、哺乳動物
（好ましくは、ヒト、ラット、マウスなど）の腎臓から
単離された細胞などが挙げられる。これらの細胞は不死
化されたものであってもよい。本発明のタンパク質を産
生する能力を有する細胞の培養は、前記した形質転換体
と同様にして行われる。試験化合物としては、例えばペ
プチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽
出液などが挙げられる。本発明のタンパク質は、公知の
方法、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体を用い
て、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそ
れに準じる方法に従って定量することができる。

【００３１】本発明のタンパク質に対する抗体は、本発
明のタンパク質を認識し得る抗体であれば、モノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体の何れであってもよ
い。また、該抗体は、抗体分子そのものであってもよい
し、抗体分子のＦ(ａｂ')_２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ
画分であってもよい。また、抗体は標識されていてもよ
い。抗体の標識に用いられる標識剤としては、例えば、
放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用い
られる。放射性同位元素としては、例えば、
〔^１２ ^５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕な
どが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きな
ものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−
グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキ
シダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光
物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッ
センイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質と
しては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシ
フェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体
あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系
を用いることもできる。

【００３２】本発明のタンパク質を定量する際、定量さ
れるタンパク質は、細胞内に含まれるものまたは細胞外
に分泌されたもののいずれであってもよく、さらに両者
の合計であってもよい。また、細胞内に含まれる本発明
のタンパク質を定量する場合、細胞を適当な固定液ある
いは膜透過促進剤処理した後に行うことが好ましい。ま
た、細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波または凍結融
解などによって細胞を破壊した後、破砕液中のタンパク
質を定量することもできる。必要により、破砕液中のタ
ンパク質を分離精製した後に、タンパク質の定量を行っ
てもよい。

【００３３】本発明のスクリーニング方法において用い
られる本発明のタンパク質の活性としては、例えば転写
制御活性などが挙げられる。具体的には、例えば「本発
明のタンパク質が結合し得るポリヌクレオチドに対する
結合活性」、「本発明のタンパク質による転写制御の支
配下にある遺伝子の発現制御活性」などが挙げられる。
該ポリヌクレオチドとしては、例えば、後述の配列番
号：５または配列番号：６で表される塩基配列を含有す
るポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号：５または
配列番号：６で表される塩基配列を有するポリヌクレオ
チド）が挙げられる。上記結合活性は、公知の方法、例
えばShi-Fang Yanらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 95巻、8298-8303頁、1998年）またはそれに準じる方
法に従ってゲルシフトアッセイ法（electrophoretic mo
bility shift assay）を用いて測定することができる。
あるいは、上記の本発明のタンパク質が結合し得るポリ
ヌクレオチドを適当な固相（例、マイクロタイタープレ
ートなど）上に固定化し（例えば、ビオチン標識した該
ポリヌクレオチドを（ストレプト）アビジンを固定化し
た固相と接触させる等）、本発明のタンパク質（または
それを含有する画分）および本発明のタンパク質に対す
る標識化抗体（あるいは本発明のタンパク質に対する抗
体および該抗体に対する標識化二次抗体）を固相に添加
して反応させ、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準
じる方法に従って該固相に結合した本発明のタンパク質
を定量することによっても測定することができる。ここ
で、本発明のタンパク質が本発明のタンパク質を産生す
る能力を有する細胞を培養して得られた培養物より提供
される場合、該細胞における本発明のタンパク質の生産
量も同時に測定することができる。また、細胞は、必要
に応じてＥｇｒ−１発現誘導因子の刺激下で培養するこ
とができる。「本発明のタンパク質による転写制御の支
配下にある遺伝子」としては、前記「実質的に同質の活
性」として例示した線維化関連遺伝子、細胞周期関連遺
伝子および血栓関連遺伝子が挙げられる。これらの遺伝
子の発現制御活性は、実施例に記載の方法に準じて、該
遺伝子をコードするDNA配列から適当なプライマーを作
成し、RT-PCRを行って該遺伝子の転写産物量を測定する
ことにより測定できる。また、上記発現制御活性は、公
知の方法、例えばShi-Fang Yanらの方法（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95巻、8298-8303頁、1998年）またはそ
れに準じる方法に従って、該遺伝子をコードするDNAの
塩基配列を含むポリヌクレオチドを標識して作成したプ
ローブを用いたノザンブロッティング法により測定でき
る。また、上記発現制御活性は、公知の方法、例えばSh
i-Fang Yanらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95
巻、8298-8303頁、1998年）またはそれに準じる方法に
従って、「本発明のタンパク質による転写制御の支配下
にある遺伝子」をコードするDNA上において配列番号：
５または配列番号：６で表される塩基配列を含む転写調
節領域と適当なレポーター遺伝子を連結したベクターを
作成し、該ベクターを適当な細胞に導入して、レポータ
ー遺伝子がコードするタンパク質の発現を確認すること
によっても測定できる。

【００３４】上記スクリーニング方法によって、本発明
のタンパク質が関連する疾患の予防・治療物質、すなわ
ち、本発明のタンパク質の産生を調節（促進または阻
害）させる化合物、あるいは本発明のタンパク質の活性
を調節（促進または阻害）する化合物をスクリーニング
することができる。例えば、本発明のタンパク質の量を
約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは
約５０％以上増大させる試験化合物を、本発明のタンパ
ク質の産生を促進する化合物として；本発明のタンパク
質の量を約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好
ましくは約５０％以上減少させる試験化合物を本発明の
タンパク質の産生を阻害する化合物として、それぞれ選
択することができる。例えば、本発明のタンパク質の活
性を約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好まし
くは約５０％以上増大させる試験化合物を、本発明のタ
ンパク質の活性を促進する化合物として；本発明のタン
パク質の活性を約２０％以上、好ましくは３０％以上、
より好ましくは約５０％以上減少させる試験化合物を本
発明のタンパク質の活性を阻害する化合物として、それ
ぞれ選択することができる。

【００３５】尚、上記スクリーニング方法において、試
験化合物の存在下と非存在下における本発明のタンパク
質の産生量を比較する代わりに、本発明のタンパク質ま
たはその塩が関連する疾患に罹患している疑いのある動
物由来の細胞その他の被検体と正常対照動物由来のそれ
とにおける本発明のタンパク質の量を定量・比較するこ
とによって、被検体中における該タンパク質の量の増加
または減少が確認された場合、被検体が本発明のタンパ
ク質が関連する疾患に罹患しているか、または被検体が
該疾患に罹患する可能性が高いと診断することができ
る。さらに、同様に本発明のタンパク質の活性を測定・
比較することによって、被検体中における該タンパク質
の活性の増大または減少が確認された場合、被検体が本
発明のタンパク質が関連する疾患に罹患しているか、ま
たは被検体が該疾患に罹患する可能性が高いと診断する
ことができる。

【００３６】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる本発明のタンパク質が関連する疾患の予防・治療物
質は、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成
化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組
織抽出液、血漿などのいずれであってもよい。これらは
塩を形成していてもよく、該塩の具体例としては、前記
した本発明のタンパク質の塩と同様のものが挙げられ
る。

【００３７】本発明のスクリーニング方法により得られ
る「本発明のタンパク質が関連する疾患の予防・治療物
質」（化合物）は、必要により薬理学的に許容し得る担
体とともに混合して医薬組成物とした後に、本発明のタ
ンパク質が関連する疾患の予防・治療薬として用いるこ
とができる。ここで、薬理学的に許容される担体として
は、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物
質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合
剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁
化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合され
る。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘
味剤などの製剤添加物を用いることもできる。

【００３８】賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、
Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化
デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒ
ドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ースナトリウム、アラビアゴム、デキストリン、プルラ
ン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケ
イ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。滑沢剤
の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステ
アリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙
げられる。結合剤の好適な例としては、α化デンプン、
ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、
カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニト
ール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロ
キシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。崩
壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カル
ボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
カルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキ
シメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換
度ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。溶
剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リン
ゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチ
レングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ
油、綿実油などが挙げられる。溶解補助剤の好適な例と
しては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコー
ル、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジ
ル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロー
ル、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸
ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムな
どが挙げられる。懸濁化剤の好適な例としては、ステア
リルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、
ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザル
コニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリ
セリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロー
スナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセ
ルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート
類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられ
る。等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グ
リセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブド
ウ糖などが挙げられる。緩衝剤の好適な例としては、リ
ン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液など
が挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、ベンジル
アルコールなどが挙げられる。防腐剤の好適な例として
は、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノー
ル、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒ
ドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤の好
適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙
げられる。着色剤の好適な例としては、水溶性食用ター
ル色素（例、食用赤色２号および３号、食用黄色４号お
よび５号、食用青色１号および２号などの食用色素、水
不溶性レーキ色素（例、前記水溶性食用タール色素のア
ルミニウム塩など）、天然色素（例、β−カロチン、ク
ロロフィル、ベンガラなど）などが挙げられる。甘味剤
の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチル
リチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどが
挙げられる。

【００３９】前記医薬組成物の剤形としては、例えば錠
剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを
含む）、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤など
の経口剤；および注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射
剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、
経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など）、坐剤（例、直
腸坐剤、膣坐剤など）、ペレット、点滴剤、徐放性製剤
（例、徐放性マイクロカプセルなど）等の非経口剤が挙
げられ、これらはそれぞれ経口的あるいは非経口的に安
全に投与できる。医薬組成物は、製剤技術分野において
慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製
造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法に
ついて詳述する。医薬組成物中の本発明のスクリーニン
グ方法により得られる化合物の含量は、剤形、該化合物
の投与量などにより異なるが、例えば約０．１ないし１
００重量％である。

【００４０】例えば、経口剤は、有効成分に、賦形剤
（例、乳糖，白糖，デンプン，Ｄ−マンニトールな
ど）、崩壊剤（例、カルボキシメチルセルロースカルシ
ウムなど）、結合剤（例、α化デンプン，アラビアゴ
ム，カルボキシメチルセルロース，ヒドロキシプロピル
セルロース，ポリビニルピロリドンなど）または滑沢剤
（例、タルク，ステアリン酸マグネシウム，ポリエチレ
ングリコール６０００など）などを添加して圧縮成形
し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるい
は持続性を目的として、コーティング基剤を用いて自体
公知の方法でコーティングすることにより製造される。

【００４１】該コーティング基剤としては、例えば糖衣
基剤、水溶性フィルムコーティング基剤、腸溶性フィル
ムコーティング基剤、徐放性フィルムコーティング基剤
などが挙げられる。糖衣基剤としては、白糖が用いら
れ、さらに、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン、
アラビアゴム、プルラン、カルナバロウなどから選ばれ
る１種または２種以上を併用してもよい。水溶性フィル
ムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、
ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチル
セルロースなどのセルロース系高分子；ポリビニルアセ
タールジエチルアミノアセテート、アミノアルキルメタ
アクリレートコポリマーＥ〔オイドラギットＥ（商品
名）、ロームファルマ社〕、ポリビニルピロリドンなど
の合成高分子；プルランなどの多糖類などが挙げられ
る。腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えば
ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシ
ネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタ
ル酸セルロースなどのセルロース系高分子；メタアクリ
ル酸コポリマーＬ〔オイドラギットＬ（商品名）、ロー
ムファルマ社〕、メタアクリル酸コポリマーＬＤ〔オイ
ドラギットＬ−３０Ｄ５５（商品名）、ロームファルマ
社〕、メタアクリル酸コポリマーＳ〔オイドラギットＳ
（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高
分子；セラックなどの天然物などが挙げられる。徐放性
フィルムコーティング基剤としては、例えばエチルセル
ロースなどのセルロース系高分子；アミノアルキルメタ
アクリレートコポリマーＲＳ〔オイドラギットＲＳ（商
品名）、ロームファルマ社〕、アクリル酸エチル・メタ
アクリル酸メチル共重合体懸濁液〔オイドラギットＮＥ
（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高
分子などが挙げられる。上記したコーティング基剤は、
その２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。ま
た、コーティングの際に、例えば酸化チタン、三二酸化
鉄等のような遮光剤を用いてもよい。

【００４２】注射剤は、有効成分を分散剤（例、ポリソ
ルベート８０，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０な
ど，ポリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロ
ース，アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例、メチ
ルパラベン，プロピルパラベン，ベンジルアルコール，
クロロブタノール，フェノールなど）、等張化剤（例、
塩化ナトリウム，グリセリン，Ｄ−マンニトール，Ｄ−
ソルビトール，ブドウ糖など）などと共に水性溶剤
（例、蒸留水，生理的食塩水，リンゲル液等）あるいは
油性溶剤（例、オリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロ
コシ油などの植物油、プロピレングリコール等）などに
溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。こ
の際、所望により溶解補助剤（例、サリチル酸ナトリウ
ム，酢酸ナトリウム等）、安定剤（例、ヒト血清アルブ
ミン等）、無痛化剤（例、ベンジルアルコール等）等の
添加物を用いてもよい。注射液は、通常、適当なアンプ
ルに充填される。

【００４３】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マ
ウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネ
コ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的に
または非経口的に投与することができる。本発明のタン
パク質が関連する疾患の予防・治療薬の投与量は、対象
疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例え
ば、腎疾患に罹患している成人患者（体重６０ｋｇ）に
おいては、一日あたり、有効成分である本発明のスクリ
ーニング方法により得られる化合物として、約０.１な
いし１００ｍｇ、好ましくは約１．０ないし５０ｍｇ、
より好ましくは約１．０ないし２０ｍｇである。

【００４４】本発明のタンパク質に対する抗体は、該タ
ンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血
清の製造法に従って製造することができる。本発明のタ
ンパク質に対するモノクローナル抗体またはポリクロー
ナル抗体は、例えば以下のようにして製造することがで
きる。〔モノクローナル抗体の作製〕（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製本発明のタンパク質を、温血動物に対して、投与により
抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈
剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高める
ため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイント
アジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎
に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温
血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモ
ット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物（ま
た、哺乳動物以外でニワトリ等）が挙げられるが、マウ
スおよびラットが好ましく用いられる。例えば、抗原で
免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認めら
れた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓または
リンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同
種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることによ
り、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製する
ことができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後
記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗
体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なう
ことができる。融合操作は、既知の方法、例えば、ケー
ラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、25
6、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促
進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましく
はＰＥＧが用いられる。

【００４５】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は、１：１〜２０：１程度であ
り、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６００
０）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０
℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、タン
パク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相
（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を
添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グ
ロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場
合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）または
プロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗
体を検出する方法；抗免疫グロブリン抗体またはプロテ
インＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添
加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加
え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方
法；などによりスクリーニングすることができる。モノ
クローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じ
る方法に従って行なうことができる。モノクローナル抗
体の選別は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテ
リン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうこ
とができる。モノクローナル抗体の選別および育種用培
地は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのよう
な培地を用いても良い。このような培地としては、例え
ば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清
を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血
清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハ
イブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水
製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、
通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時
間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間で
ある。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。このように
して得られたモノクローナル抗体は、自体公知の方法、
例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、ア
ルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交
換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲル
ろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプ
ロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、
結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って分
離精製することができる。

【００４６】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のタ
ンパク質に対するポリクローナル抗体は、自体公知の方
法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原
（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋
白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の
製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物か
ら本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、
抗体の分離精製を行なうことにより製造することができ
る。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキ
ャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の
種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリ
アーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率
良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させ
てもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイロ
グロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対
し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプ
リングさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャ
リアーのカプリングには、種々の縮合剤、例えばグルタ
ルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステ
ル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エス
テル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対
して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、
希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を
高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロ
イントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約
２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれ
る。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温
血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取する
ことができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定
は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定で
きる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノク
ローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離
精製法に従って行なうことができる。

【００４７】本発明のタンパク質に対する抗体は、本発
明のタンパク質またはその塩と結合してこれを不活性化
（中和）することができるので、本発明のタンパク質が
関連する疾患の予防・治療薬として用いることもでき
る。該予防・治療薬は、本発明のタンパク質に対する抗
体そのものであってもよいが、該抗体を薬理学的に許容
し得る担体とともに混合して得られる医薬組成物である
ことが好ましい。ここで、薬理学的に許容される担体と
しては、前記した「本発明のタンパク質が関連する疾患
の予防・治療物質」の場合と同様のものが挙げられる。
該医薬組成物は、前記した「本発明のタンパク質が関連
する疾患の予防・治療物質」の場合と同様にして製造す
ることができる。このようにして得られる製剤は、安全
で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒ
ト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウ
マ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経
口的にまたは非経口的に投与することができる。本発明
のタンパク質が関連する疾患の予防・治療薬の投与量
は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なる
が、例えば、腎疾患に罹患している成人患者（体重６０
ｋｇ）においては、一日あたり、有効成分である本発明
のタンパク質に対する抗体として、約０.１ないし１０
０ｍｇ、好ましくは約１．０ないし５０ｍｇ、より好ま
しくは約１．０ないし２０ｍｇである。

【００４８】本発明のタンパク質は、例えば腎疾患
（例、糖尿病性腎症）などで発現が増加するため、腎疾
患における早期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の
予測のためのマーカーとして有用である。よって、本発
明のタンパク質に対する抗体は、本発明のタンパク質が
関連する疾患の診断薬として用いることもできる。すな
わち、本発明は、（ｉ）本発明の抗体と、被検液および
標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応さ
せ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質
の割合を測定することにより被検液中の本発明のタンパ
ク質またはその塩を定量することを特徴とする、該タン
パク質またはその塩が関連する疾患の診断方法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および
標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的
に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定す
ることにより被検液中の本発明のタンパク質またはその
塩を定量することを特徴とする、該タンパク質またはそ
の塩が関連する疾患の診断方法を提供する。

【００４９】上記（ii）の定量においては、一方の抗体
が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体である場
合、他方の抗体が本発明のタンパク質の他の部分、例え
ばＣ端部を認識する抗体であることが望ましい。また、
本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体を用い
て該タンパク質の定量を行うことができるほか、組織染
色等による検出を行なうこともできる。これらの目的に
は、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子
のＦ(ａｂ')_２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いて
もよい。

【００５０】本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質
またはその塩の定量は、特に制限されるべきものではな
く、被測定液中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは
抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により
検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製
した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測
定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合
法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に
用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイ
ッチ法を用いるのが特に好ましい。

【００５１】標識物質を用いる測定法に用いられる標識
剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物
質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素として
は、例えば、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、
〔^１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定
で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラク
トシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファ
ターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが
用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカ
ミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いら
れる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノ
ール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−（ストレプト）アビジン系を用いることもでき
る。

【００５２】抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、
物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質を不溶
化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法で
もよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セ
ルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアク
リルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等
があげられる。

【００５３】サンドイッチ法においては不溶化した本発
明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反
応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗
体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤
の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパ
ク質またはその塩の量を定量することができる。１次反
応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。

【００５４】上記サンドイッチ法による本発明のタンパ
ク質またはその塩の測定法においては、１次反応と２次
反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発
明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好まし
く用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用
いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体
が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次
反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例え
ばＮ端部を認識する抗体が用いられる。

【００５５】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、お
よび、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるい
は、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリ
ック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の
標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離
するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。こ
れら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用す
るにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とさ
れない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に
当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質
の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段
の詳細については、総説、成書などを参照することがで
きる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」
（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイ
ムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治
ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医
学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Me
thods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochemical Techniq
ues(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniq
ues(Part B))、同書 Vol. 74(Immunochemical Techniq
ues(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochemical Techniq
ues(Part D : Selected Immunoassays))、同書 Vol. 9
2(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal An
tibodies and General Immunoassay Methods))、同書
Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybrid
oma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、
アカデミックプレス社発行)などを参照することができ
る。以上のようにして、本発明の抗体を用いることによ
って、本発明のタンパク質またはその塩を感度良く定量
することができる。

【００５６】本発明の抗体を用いる上記の定量法におい
て、被検動物の生検サンプル（例、腎細胞など）を被検
体とし、該検体中の本発明のタンパク質またはその塩の
濃度を定量することによって、該タンパク質の発現過多
または減少が検出された場合は、例えば、腎疾患などの
本発明のタンパク質またはその塩が関連する疾患に罹患
しているか、将来罹患する可能性が高いと診断すること
ができる。

【００５７】本発明は、さらに本発明のタンパク質をコ
ードする塩基配列またはその部分配列を含有するポリヌ
クレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチドと略記す
ることがある）を用いることを特徴とする、本発明のタ
ンパク質が関連する疾患の予防・治療物質のスクリーニ
ング方法に関する。本発明のポリヌクレオチドは、本発
明のタンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ、好ましくはＤＮＡ）またはその部分配列を含有す
るものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌ
クレオチドとしては、本発明のタンパク質をコードする
ＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡが挙げられ、これらは二本
鎖または一本鎖のいずれであってもよい。二本鎖の場合
は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡ
のハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖
（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖
（すなわち、非コード鎖）であってもよい。なお、本発
明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、前記した
ものが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは遊離体
であっても塩であってもよく、またアミド体やエステル
体であってもよい。該塩としては、本発明のタンパク質
の塩と同様のものが挙げられ、アミド体やエステル体と
しては、末端リン酸基がアミド化もいくはエステル化さ
れたものが挙げられる。

【００５８】本発明のポリヌクレオチドを用いるスクリ
ーニング方法は、例えば、本発明のタンパク質を産生す
る能力を有する細胞を培養した場合と、本発明のタンパ
ク質を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下
に培養した場合とで、本発明のタンパク質をコードする
ＲＮＡの量を比較すること；などによって行われる。こ
こで、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細
胞、該細胞の培養方法、および試験化合物としては、前
記した本発明のタンパク質を用いるスクリーニング方法
と同様のものが挙げられる。本発明のタンパク質をコー
ドするＲＮＡは、公知の方法、例えば、モレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook
et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記
載の方法またはそれに準じる方法にしたがって定量する
ことができる。例えば、該ＲＮＡは、公知の方法、例え
ば、プローブとして配列番号：3または配列番号：4で表
される塩基配列、あるいはそれらの一部を含有する核酸
を用いるノーザンハイブリダイゼーション；プライマー
として配列番号：3または配列番号：4で表される塩基配
列の一部を含有する核酸を用いるＰＣＲ法またはそれに
準じる方法；などにしたがって定量することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡ（好ま
しくはｍＲＮＡ）の量を約２０％以上、好ましくは３０
％以上、より好ましくは約５０％以上増大させる試験化
合物を、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの発現
を促進する化合物として；本発明のタンパク質をコード
するＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の量を約２０％以
上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以
上減少させる試験化合物を、本発明のタンパク質をコー
ドするＲＮＡの発現を阻害する化合物として選択するこ
とができる。

【００５９】本発明のポリヌクレオチドを用いるスクリ
ーニング方法により得られる本発明のタンパク質が関連
する疾患の予防・治療物質は、ペプチド、タンパク、非
ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出
液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などのいずれで
あってもよい。これらは塩を形成していてもよく、該塩
の具体例としては、前記した本発明のタンパク質の塩と
同様のものが挙げられる。該スクリーニング方法により
得られる本発明のタンパク質が関連する疾患の予防・治
療物質は、必要により薬理学的に許容し得る担体ととも
に混合して医薬組成物とした後に、本発明のタンパク質
が関連する疾患の予防・治療薬として用いることができ
る。ここで、薬理学的に許容される担体としては、本発
明のタンパク質を用いるスクリーニング方法により得ら
れる本発明のタンパク質が関連する疾患の予防・治療物
質の場合と同様のものが挙げられる。該医薬組成物は、
本発明のタンパク質を用いるスクリーニング方法により
得られる本発明のタンパク質が関連する疾患の予防・治
療物質の場合と同様にして製造することができる。この
ようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、
例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウ
サギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、
チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に
投与することができる。本発明のタンパク質が関連する
疾患の予防・治療薬の投与量は、対象疾患、投与対象、
投与ルートなどにより異なるが、例えば、腎疾患に罹患
している成人患者（体重６０ｋｇ）においては、一日あ
たり、有効成分である本発明のスクリーニング方法によ
り得られる化合物として、約０.１ないし１００ｍｇ、
好ましくは約１．０ないし５０ｍｇ、より好ましくは約
１．０ないし２０ｍｇである。

【００６０】本発明のタンパク質が関連する疾患の予防
・治療物質は、該タンパク質をコードする遺伝子のプロ
モーター活性を検出することによってスクリーニングす
ることもできる。本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａがレポーター遺伝子で置換された細胞あるいは非ヒト
哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のタンパク質
をコードする遺伝子のプロモーターの支配下に存在する
ので、試験化合物での処理あるいはその投与後に、レポ
ーター遺伝子がコードする物質の発現を確認することに
より、該プロモーターの活性を検出することができる。
また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の転写調
節領域とレポーター遺伝子が連結されてできたベクター
を有する細胞および非ヒト哺乳動物においても該プロモ
ーターの活性を検出できる。ここで、レポーター遺伝子
としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃ
Ｚ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフ
ェラーゼ遺伝子などが挙げられる。例えば、本発明のタ
ンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換してい
る場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、
本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが
発現する。したがって、例えば、５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇ
ａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬
を用いる染色により、簡便に本発明のタンパク質の発現
状態を確認することができる。具体的には、細胞あるい
は組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸
緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む
染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１
時間反応させた後、組織標本を１ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢ
Ｓ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ
反応を停止させ、呈色を観察することにより、細胞ある
いは組織における本発明のタンパク質の発現状態を確認
することができる。また、常法に従い、ｌａｃＺをコー
ドするｍＲＮＡを検出してもよい。本発明のタンパク質
をコードする遺伝子のプロモーター活性を促進または阻
害する化合物は、該タンパク質の発現、および該タンパ
ク質の活性を調節するため、本発明のタンパク質が関連
する疾患の予防・治療薬として有用である。

【００６１】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの
アンチセンスヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドとハイブリダイズして該タン
パク質への翻訳を阻害するので、本発明のスクリーニン
グ方法により得られる化合物と同様に、本発明のタンパ
ク質が関連する疾患の予防・治療薬として有用である。
ここで、アンチセンスヌクレオチドとしては、本発明の
タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列に相補的な、
または実質的に相補的な塩基配列、あるいはその部分配
列を有し、該ＤＮＡの発現抑制作用を有するものであれ
ばよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。本発明のタ
ンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列に実質的に相補
的な塩基配列としては、例えば、該ＤＮＡの塩基配列に
相補的な塩基配列（すなわち、本発明のタンパク質をコ
ードするＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩
基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より
好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上
の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本
発明のタンパク質をコードするＤＮＡの相補鎖の全塩基
配列うち、該タンパク質のＮ末端部位をコードする部分
の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）
の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、よ
り好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以
上の相同性を有するアンチセンスヌクレオチドが好まし
い。具体的には、配列番号：３または配列番号：４で表
わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的
な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一
部分を有するアンチセンスヌクレオチド；好ましくは、
配列番号：３または配列番号：４で表わされる塩基配列
を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列、また
はその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド；など
が挙げられる。アンチセンスヌクレオチドの構成塩基数
は本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
特異的にハイブリダイズして該タンパク質への翻訳を阻
害し得る限り特に制限はないが、通常、１０〜４０個程
度、好ましくは１５〜３０個程度である。ヌクレアーゼ
などの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセ
ンスヌクレオチドを構成する各ヌクレオチドのりん酸残
基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、
メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学
修飾りん酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌク
レオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチ
ル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、
塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたも
のであってもよく、配列番号：２で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいず
れのものでもよい。これらのアンチセンスヌクレオチド
は、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することが
できる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのアン
チセンスヌクレオチドは、低毒性であり、生体内におけ
る本発明のタンパク質または該タンパク質をコードする
ＤＮＡの機能（例、チロキシン脱５’−ヨード化酵素活
性）を抑制することができるので、例えば、本発明のタ
ンパク質が関連する疾患の予防・治療薬として使用する
ことができる。該アンチセンスヌクレオチドは、本発明
のタンパク質を用いるスクリーニング方法により得られ
る本発明のタンパク質が関連する疾患の予防・治療物質
の場合と同様にして、製剤化し、哺乳動物（例えば、ヒ
ト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウ
マ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経
口的にまたは非経口的に投与することができる。また、
アンチセンスヌクレオチドは、例えばレトロウイルスベ
クター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソ
シエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに
挿入した後に投与することもできる。アンチセンスヌク
レオチドは、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよう
なカテーテルによって投与してもよく、エアロゾル化
後、吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
該アンチセンスヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投
与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、腎疾
患に罹患している成人患者（体重６０ｋｇ）において
は、一日あたり、約０.１ないし１００ｍｇ、好ましく
は約１．０ないし５０ｍｇ、より好ましくは約１．０な
いし２０ｍｇである。さらに、本発明のタンパク質をコ
ードするＤＮＡのアンチセンスヌクレオチドは、組織や
細胞における該ＤＮＡの存在やその発現状況を調べるた
めの診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用する
こともできる。上記アンチセンスポリヌクレオチドと同
様に、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を
含有する二重鎖ＲＮＡ、本発明のタンパク質をコードす
るＲＮＡの一部を含有するリボザイムなども、本発明の
タンパク質または該タンパク質をコードするＤＮＡの機
能を抑制することができるので、例えば、腎疾患の予防
・治療剤などとして使用することができる。ここで、二
重鎖ＲＮＡは、公知の方法、例えばNature, 411巻, 494
頁, 2001年に記載の方法に準じて、本発明のポリヌクレ
オチドの配列を基に設計して製造することができる。リ
ボザイムは、公知の方法、例えばTRENDS in Molecular
Medicine, 7巻, 221頁, 2001年に記載の方法に準じて、
本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造す
ることができる。例えば、本発明のタンパク質をコード
するＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することに
よって、所望のリボザイムを製造することができる。本
発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、
公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ
上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられ
る。上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを本発明のタ
ンパク質が関連する疾患の予防・治療薬として使用する
場合、前記したアンチセンスポリヌクレオチドと同様に
して製剤化し、投与することができる。

【００６２】本発明のポリヌクレオチドは、例えば、プ
ローブとして使用することにより、哺乳動物（例えば、
ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、
ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーな
ど）における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡま
たはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することがで
きるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突
然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの
増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用で
ある。本発明のポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子
診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼー
ションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomic
s），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロ
シージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceeding
s of the National Academy of Sciences of the Unite
d States of America），第８６巻，２７６６〜２７７
０頁（１９８９年））などにより実施することができ
る。例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発
現過多または減少が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ
法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例え
ば、腎疾患などの本発明のタンパク質が関連する疾患に
罹患しているか、将来罹患する可能性が高いと診断する
ことができる。

【００６３】本発明は、さらに、配列番号：５または配
列番号：６で表される塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドを含有することを特徴とする、本発明のタンパク質が
関連する疾患の予防・治療薬に関する。ここで、配列番
号：５または配列番号：６で表される塩基配列を有する
ポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質が結合するＤ
ＮＡに対するデコイヌクレオチドである。該ポリヌクレ
オチドは、自体公知の方法にしたがって製造することが
できる。該ポリヌクレオチドは、低毒性であり、生体内
における本発明のタンパク質または該タンパク質をコー
ドするＤＮＡの機能（例、線維化関連遺伝子、細胞周期
関連遺伝子、および血栓関連遺伝子の転写制御活性）を
抑制することができるので、本発明のタンパク質が関連
する疾患の予防・治療薬として使用することができる。
配列番号：５または配列番号：６で表される塩基配列を
有するポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質を用い
るスクリーニング方法により得られる本発明のタンパク
質が関連する疾患の予防・治療物質の場合と同様にし
て、製剤化し、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラッ
ト、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、
サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経
口的に投与することができる。また、該ポリヌクレオチ
ドは、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルス
ベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベ
クターなどの適当なベクターに挿入した後に投与するこ
ともできる。該ポリヌクレオチドは、遺伝子銃やハイド
ロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与して
もよく、エアロゾル化後、吸入剤として気管内に局所投
与することもできる。本発明のタンパク質が関連する疾
患の予防・治療薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投
与ルートなどにより異なるが、例えば、腎疾患に罹患し
ている成人患者（体重６０ｋｇ）においては、一日あた
り、有効成分である配列番号：５または配列番号：６で
表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとして、約
０.１ないし１００ｍｇ、好ましくは約１．０ないし５
０ｍｇ、より好ましくは約１．０ないし２０ｍｇであ
る。

【００６４】本発明は、さらに、Ｅｇｒ−1抑制薬を含
有してなる糖尿病性腎症の予防・治療薬に関する。Ｅｇ
ｒ−1抑制薬としては、生体内において、Ｅｇｒ−1の産
生もしくは発現；またはＥｇｒ−1の活性を抑制しうる
物質であれば、特に限定されず、ペプチド、タンパク、
非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽
出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などのいずれ
であってもよい。これらは塩を形成していてもよく、該
塩の具体例としては、前記した本発明のタンパク質の塩
と同様のものが挙げられる。Ｅｇｒ−1抑制薬は、好ま
しくは、腎臓において、Ｅｇｒ−1の産生もしくは発
現；またはＥｇｒ−1の活性を抑制しうる物質、すなわ
ち、腎Ｅｇｒ−1抑制薬である。Ｅｇｒ−1抑制薬は、生
体内において、線維化関連遺伝子、細胞周期関連遺伝
子、血栓関連遺伝子などの因子の産生もしくは発現；ま
たはこれらの因子の活性を抑制しうる物質であってもよ
い。ここで、線維化関連遺伝子、細胞周期関連遺伝子お
よび血栓関連遺伝子としては、前記「実質的に同質の活
性」として例示したものが挙げられる。糖尿病性腎症の
予防・治療薬は、Ｅｇｒ−1抑制薬を用いて、本発明の
タンパク質が関連する疾患の予防・治療物質の場合と同
様にして製剤化することができる。本発明の糖尿病性腎
症の予防・治療薬は、安全で低毒性であるので、例え
ば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チ
ンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投
与することができる。本発明の糖尿病性腎症の予防・治
療薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなど
により異なるが、例えば、成人患者（体重６０ｋｇ）に
おいては、一日あたり、有効成分であるＥｇｒ−1抑制
薬として、約０.１ないし１００ｍｇ、好ましくは約
１．０ないし５０ｍｇ、より好ましくは約１．０ないし
２０ｍｇである。

【００６５】本明細書において、塩基やアミノ酸などを
略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission
on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場
合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシンＲＮＡ：リボ核酸ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ：アデノシン三リン酸ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウムＧｌｙ：グリシンＡｌａ：アラニンＶａｌ：バリンＬｅｕ：ロイシンＩｌｅ：イソロイシンＳｅｒ：セリンＴｈｒ：スレオニンＣｙｓ：システインＭｅｔ：メチオニンＧｌｕ：グルタミン酸Ａｓｐ：アスパラギン酸Ｌｙｓ：リジンＡｒｇ：アルギニンＨｉｓ：ヒスチジンＰｈｅ：フェニルアラニンＴｙｒ：チロシンＴｒｐ：トリプトファンＰｒｏ：プロリンＡｓｎ：アスパラギンＧｌｎ：グルタミンｐＧｌｕ：ピログルタミン酸Ｓｅｃ：セレノシステイン（selenocystein
e）

【００６６】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。〔配列番号：１〕ヒト、マウスおよびラット間で保存さ
れているＥｇｒ−1のアミノ酸配列の部分配列を示す。〔配列番号：２〕ヒトＥｇｒ−1のアミノ酸配列を示
す。〔配列番号：３〕配列番号：２で表されるアミノ酸配列
を有するヒトＥｇｒ−1をコードするＤＮＡの塩基配列
を示す。〔配列番号：４〕配列番号：２で表されるアミノ酸配列
を有するヒトＥｇｒ−1をコードするＤＮＡの塩基配列
を示す。〔配列番号：５〕Ｅｇｒ−1のデコイヌクレオチドの塩
基配列を示す。〔配列番号：６〕Ｅｇｒ−1のデコイヌクレオチドの塩
基配列を示す。〔配列番号：７〕Ｅｇｒ−1アンチセンスオリゴヌクレ
オチドの塩基配列を示す。〔配列番号：８〕Ｅｇｒ−1 ｃＤＮＡを増幅するための
プライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：９〕Ｅｇｒ−1 ｃＤＮＡを増幅するための
プライマーの塩基配列を示す。〔配列番号：１０〕Ｅｇｒ−1に結合し得る二本鎖ＤＮ
Ａのセンス鎖の塩基配列を示す。〔配列番号：１１〕Ｅｇｒ−1に結合し得ない二本鎖Ｄ
ＮＡのセンス鎖の塩基配列を示す。

【００６７】

【実施例】以下において、実施例および実験例により本
発明をより具体的にするが、本発明はこれらに限定され
るものではない。

【００６８】実験例１ Wistar fattyラットの腎臓におけるearly growth respo
nse-1(Egr-1)mRNA発現の増加 13、22及び40週齢の、インスリン非依存性糖尿病(NIDD
M)を呈し糖尿病性腎症(DN)を自然発症する雄性Wistar f
attyラット（武田ラビックス）と、その正常対照ラット
である同週齢の雄性Wistar leanラット（武田ラビック
ス）を用いて、24時間蓄尿及び尾静脈採血を行い、尿中
アルブミン***量、血漿中グルコース濃度及び血漿中イ
ンスリン濃度を測定した。尿中アルブミン***量はA/G
Bテストワコー(和光純薬) を用いて測定し、血漿中グル
コース濃度は、シンクロンCX5デルタ(Beckman Coulter)
を用いて測定した。インスリン濃度は、RIA法（塩野義
製薬）により測定した。各5匹のラットより腎臓を採取
して-80℃で保存後、腎臓を破砕してtotal RNAを抽出し
た。既報のmRNA配列をもとにプライマー及び蛍光プロー
ブを作製し、ABI PRISM 7700(Applied Biosystems)を用
いてリアルタイム定量RT-PCR法により各種mRNA発現量を
測定した。結果を［表1］及び［表2］に示す。Wistar f
attyラットは、13週齢よりNIDDMを呈し、22週齢よりDN
を発症して尿中アルブミン***量が増加した。22週齢以
降にEgr-1 mRNA発現量の増加が認められ、40週齢でTran
sforming growth factor-β1(TGF-β1)及びfibronectin
mRNA発現量の増加が認められた。［表1］尿中アルブミン***量、血漿中グルコース濃度及び血漿中インスリン濃度 Wistar lean ラット Wistar fatty ラット 13週齢 22週齢 40週齢 13週齢 22週齢 40週齢尿中アルブミン 5.1 4.0 10.4 6.7 55.7 182.0***量 (mg/day) 血漿中グルコース 138.9 137.1 134.3 319.2 402.9 319.4濃度(mg/dl) 血漿中インスリン 123.0 125.6 158.7 1091.9 1019.2 1674.4濃度(μUnits/ml) (n=5, Mean) ［表2］Wistar fattyラットの腎臓における Egr-1、TGF-β1及び fibronectinの mRNA発現量（各週齢のWistar lean ラットの腎臓における発現量を1とした時の相対値）週齢 13週齢 22週齢 40週齢 Egr-1 1.1 2.2 2.4 TGF-β1 1.1 1.0 1.7Fibronectin 1.2 1.0 2.1 (n=5, Mean)

【００６９】実験例２ Zucker fattyラットの腎臓におけるearly growth respo
nse-1 (Egr-1) mRNA発現の変化高インスリン血症を呈し、腎障害を自然発症する雄性Zu
cker fattyラット（ZFラット、18週齢、日本チャールズ
リバー）に、0.5%メチルセルロース100cPに懸濁したカ
ンデサルタンシレキセチル（angiotensin II type1受
容体拮抗薬）を9週間、一日一回連日経口投与した。対
照群及び正常対照群である同週齢の雄性Zucker leanラ
ット（ZLラット、日本チャールズリバー）には0.5%メチ
ルセルロース100cP（Vehicle）を一日一回連日経口投与
した。投与8週後に24時間蓄尿を行い、A/G Bテストワコ
ー（和光純薬）を用いて尿中アルブミン***量を測定し
た。投与9週後に腎臓を採取し、-80℃で保存後、腎臓を
破砕してtotal RNAを抽出した。既報のmRNA配列をもと
にプライマー及び蛍光プローブを作製し、ABI PRISM770
0（Applied Biosystems）を用いてリアルタイム定量RT-
PCR法により各種mRNA発現量を測定した。結果を［表3］
及び［表4］に示す。尿中アルブミン***量が増加して
いるZucker fattyラットの腎臓においてはEgr-1 mRNA発
現量が増加し、Transforming growth factor-β1（TGF-
β1）、platelet-derived growth factor-B（PDGF-
B）、fibronectin及びα1(I) collagenの各mRNA発現の
増加も認められた。さらに、カンデサルタンシレキセ
チル投与により尿中アルブミン***量の増加が抑制され
た場合には、上記のいずれのmRNA発現量増加も抑制され
た。［表3］尿中アルブミン***量、血中グルコース濃度及び血中インスリン濃度 ZLラット ZFラット ZFラット Vehicle Vehicle カンデサルタンシレキセチル尿中アルブミン 48.5 401.5 61.7***量 (mg/day) （n=8-9, Mean）［表4］Zucker fattyラットの腎臓におけるEgr-1、TGF-β1、PDGF-B、fibronect in及びα1(I) collagenのmRNA発現量（ZLラットの腎臓における発現量を１とした時の相対値） ZFラット ZFラット Vehicle カンデサルタン Egr-1 2.9 1.3 TGF-β1 2.1 1.2 PDGF-B 1.5 1.0 Fibronectin 2.1 1.1α1(I) collagen 2.3 1.6 （n=8-9, Mean）

【００７０】実験例３ラット腎糸球体メサンギウム細胞におけるearly growth
response-1(Egr-1) mRNA発現の増加 4週齢の雄性Sprague-Dawleyラット（SDラット、日本ク
レア）より単離培養した腎糸球体メサンギウム細胞(pas
sege 7)を、20% ウシ胎児血清(FCS)を含むDMEM培地で4
日間培養後、0.2% ウシ血清アルブミンを含むDMEMにて3
日間培養した。培養後の細胞に、FCS(20 %)またはangio
tensin II(AII)(10^-6M)を添加し、37℃で30分間反応さ
せた。AII type１受容体拮抗薬カンデサルタンは、FCS
またはAII刺激5分前に最終濃度が10^-5Mになるよう培地
に添加した。FCSまたはAII刺激30分後、totalRNAを抽出
した。既報のmRNA配列をもとにプライマーと蛍光プロー
ブを作製し、ABI PRISM 7700(Applied Biosystems)を用
いてリアルタイム定量RT-PCR法によりEgr-1 mRNA発現量
を測定した。結果を［表5］及び［表6］に示す。Egr-1
mRNA発現量はFCS刺激30分後に著明に増加し、カンデサ
ルタンにより部分的に抑制された。また、AII刺激30分
後にはEgr-1 mRNA発現量の軽度の増加が認められ、カン
デサルタンにより大部分が抑制された。［表5］FCS刺激によるEgr-1 mRNA発現の増加及びカンデ
サルタンの抑制作用（刺激前の発現量を1とした時の相
対値）［表6］AII刺激によるEgr-1 mRNA発現の増加及びカンデ
サルタンの抑制作用（刺激前の発現量を1とした時の相
対値）

【００７１】実験例４自然発症高コレステロール血症ラットの腎臓におけるea
rly growth response-1(Egr-1) mRNA発現の増加腎障害を自然発症する雄性の自然発症高コレステロール
血症ラット（SHCラット、11週齢、武田ラビックス）及
び正常対照群である同週齢の雄性Sprague-Dawleyラット
（SDラット、日本クレア）を用いて、24時間蓄尿及び尾
静脈採血を行い、尿中アルブミン***量及び血漿中総コ
レステロール濃度を測定した。尿中アルブミン***量は
A/G Bテストワコー（和光純薬）を用いて測定し、血漿
中総コレステロール濃度はシンクロンCX5デルタ（Beckm
an Coulter）を用いて測定した。12週齢の時点でラット
から腎臓を採取し、-80℃で保存後、腎臓を破砕してtot
al RNAを抽出した。既報のmRNA配列をもとにプライマー
及び蛍光プローブを作製し、ABI PRISM7700（Applied B
iosystems）を用いてリアルタイム定量RT-PCR法によりE
gr-1 mRNA発現量を測定した。12週齢のSHCラット及びSD
ラットの尿中アルブミン***量はそれぞれ179.2及び9.2
（mg/day, Mean (n=5)）であり、血漿中コレステロール
濃度はそれぞれ92.4及び43.5（mg/dl, Mean (n=5)）で
あり、いずれのパラメータもSHCラットにおいて高値で
あった。この時のSHCラットの腎臓におけるEgr-1 mRNA
発現量は、SDラットの腎臓における発現量と比較して、
3.8倍（Mean (n=5)）に増加していた。

【００７２】実験例５ヒト胎児腎由来 HEK-293細胞におけるearly growth res
ponse(Egr)-1過剰発現による腎線維化関連遺伝子の発現
誘導ヒト胎児腎由来 HEK-293細胞(CRL-1573、ATCC、passege
40)を、10% ウシ胎児血清を含むDMEM培地で1日培養
後、Polyfect(QIAGEN) 20μl/3.5 cm dish を用いてヒ
トEgr-1発現プラスミドを 2μg/dishの濃度で細胞に導
入した。なお、Egr-1発現プラスミドはpBK-CMVベクター
(STRATAGENE)にヒトEgr-1のコーディング領域のcDNAを
組み込んだプラスミドを用いた。コントロールの細胞に
はEgr-1プラスミド作製に使用したpBK-CMVベクターのみ
を導入した。導入24時間後に細胞を回収してタンパク質
及びtotal RNAを抽出した。Egr-1タンパク質の発現は、
SDS-PAGEを行った後、Egr-1特異的抗体(Anti-Egr-1(C-1
9), SantaCruz)を用いてWestern blottingを行い、化学
発光法(PIERCE)によりバンドを検出した。検出したバン
ドの輝度積算値をCS Analyzer 1.00a(ATTO)により算出
した。また、腎線維化関連遺伝子のmRNA発現量は、既報
のmRNA配列をもとにプライマーと蛍光プローブを作製
し、ABI PRISM 7700(Applied Biosystems)を用いて定量
的RT-PCR法により測定した。結果を［表7］に示す。Egr
-1発現プラスミド導入により、Egr-1 タンパク質発現が
増加し、また、tissue factor、fibronectin、intercel
lular adhesion molecule(ICAM)-1 mRNA の腎線維化関
連遺伝子の発現が増加した。［表7］Egr-1プラスミド導入によるEgr-1 蛋白の発現増
加及び、腎線維化関連遺伝子の発現増加（コントロール
の発現量を1とした時の相対値）

【００７３】実施例１ラット腎糸球体メサンギウム細胞におけるearly growth
response-1(Egr-1) antisense oligodeoxynucleotide
（AS-ODN）の作用の検討 4週齢の雄性SDラットより単離培養した腎糸球体メサン
ギウム細胞(passege 4-5)を、20% ウシ胎児血清を含むD
MEM培地でサブコンフルエントになるまで3-4日間培養
後、0.2% ウシ血清アルブミンを含むDMEMに交換してser
um starvationを行った。Serum starvation 開始48時間
後に Egr-1 AS-ODN（配列番号：７）またはControl-ODN
(AS-ODNとサイズおよび各塩基数をマッチさせたscrambl
ed ODN，いずれもBIOGNOSTIK社に合成依頼)を20μMの濃
度で培地中に添加し24時間 CO₂インキュベーター中で静
置後、basic fibroblast growth factor(bFGF)(3 ng/m
l)で刺激し、37℃で1-2時間反応した。bFGF刺激1時間後
の細胞よりタンパク質を抽出し、bFGF刺激2時間後の細
胞よりtotal RNAを抽出した。Egr-1タンパク質の発現
は、SDS-PAGEを行った後、Egr-1特異的抗体(Anti-Egr-1
(C-19), SantaCruz)を用いてWestern blottingを行い、
化学発光法(PIERCE)によりバンドを検出した。検出した
バンドの輝度積算値をCS Analyzer 1.00a(ATTO)により
算出した。また、tissue factorの mRNA 発現量は、既
報のmRNA配列をもとにプライマーと蛍光プローブを作製
し、ABI PRISM 7700(Applied Biosystems)を用いて定量
的RT-PCR法により測定した。結果を［表8］に示す。bFG
F刺激1時間後にEgr-1タンパク質発現は5.1倍に増加し、
この増加はEgr-1 AS-ODN 処置により抑制された。Contr
ol-ODN処置では抑制作用は全く認められなかった。ま
た、bFGF刺激2時間にtissue factor mRNAが2.5倍に増加
したが、この増加は、Egr-1 AS-ODN処置によりほぼ完全
に抑制された。Control-ODN処置群では抑制作用は認め
られなかった。なお、Egr-1 AS-ODNの導入による細胞傷
害性は認められなかった。［表8］Egr-1 AS-ODN導入による、bFGF刺激後のEgr-1 タンパク質の発現及びtis sue factor mRNAの発現に対する作用（コントロールの発現量を1とした時の相対値）刺激 Control bFGF (3 ng/ml) 処置 vehicle vehicle AS-ODN Control-ODN Egr-1 タンパク質 1.0 5.1 2.0 7.0 Tissue factor mRNA 1.0 2.5 1.1 4.6 （n=2-3, Mean）

【００７４】実施例２ DNA結合活性を利用したEgr-1
タンパク質の定量 Egr-1結合配列をもつ合成DNAと抗Egr-1抗体を組み合わ
せて、マイクロプレートでEgr-1タンパク質量を定量す
る系を設定した。 (1) Egr-1発現用プラスミドの構築と動物細胞での発現ヒトEgr-1 cDNAを得るため、ヒト脂肪組織由来のcDNA
（Clontech社）を鋳型とし、合成DNA（配列番号８およ
び９）をプライマーとして用いたpolymerase chain rea
ctionを行なった。増幅されたcDNAの末端部分を制限酵
素EcoRIとPstIで切断し、EcoRIとPstIで切断したプラス
ミドpcDNA3.1(+)（Invitrogen社）にクローニングし、
塩基配列を確認した。培養シャーレ（FALCON社3003）
に、10% FCSと100μg/mlのカナマイシンを含むDMEMを培
地として、ヒト由来培養細胞HEK293を2x10⁶個ずつ播
き、翌日、上記のEgr-1発現用プラスミド20μgとLipofe
ctamine2000（Invitrogen社）を用いて細胞に遺伝子を
導入した。48時間後に培地を除き、PBSで洗った後、0.5
mlの溶解液〔25mM Tris-HCl (pH7.4)、0.4M NaCl、100
μM EDTA、1mM DTT、1% TritonX-100を含む水溶液に1/1
00量のProtease inhibitor cocktail(SIGMA社、P8340)
を加えたもの〕を加えて細胞を溶解させ、サンプルチュ
ーブに回収した。氷上で5分間静置した後、ボルテック
スミキサーで10秒間攪拌し、12000xg、4℃で5分間遠心
して上清を得た。これを標準サンプルとして用いた。同
様に、ベクターであるpcDNA3.1(+)の遺伝子導入も行な
い、得られた細胞溶解液を対照として用いた。

【００７５】(2) Egr-1の検出 5’末端をビオチン標識した、Egr-1結合配列を含む合成
DNA（配列番号１０）を、その相補鎖の合成DNAと二重鎖
を形成させた（相補鎖はビオチン化されていない）。ま
た、Egr-1が結合できなくなる塩基置換を導入した合成D
NA（配列番号１１）についても二重鎖を形成させ、対照
として用いた。これらを、PBSで４倍に希釈したBlock A
ce（1mM EDTAを含む）（雪印乳業製、大日本製薬より購
入）で終濃度50nMに希釈し、100μlずつ、ストレプトア
ビジンが固相化された96穴プレート(IWAKI)に加えた。
室温で30分静置した後、溶液を吸引除去し、PBSで４倍
に希釈したBlock Ace（1mM EDTAを含む）を300μlずつ
加えて室温で３時間静置した。溶液を除去し、300μlの
PBSで3回洗浄し、測定用緩衝液〔50mM Tris-HCl(pH7.
4)、100mM NaCl、10% Block Ace、200μM ZnSO_4、250μ
M DTT、10μg/ml poly dI-dC（Amersham社）、0.05% Tr
itonX-100〕で50倍に希釈した標準サンプルあるいは対
照サンプル（上記(1)で調製）を100μlずつ各穴に加え
た。室温で40分間静置した後、300μlの洗浄液（2ｍM i
midazole-buffered saline、0.02% Tween 20、200μM Z
nSO₄）で３回洗い、poly dI-dCを含まない測定用緩衝液
で500倍に希釈した抗Egr-1抗体（ウサギ、ポリクローナ
ル抗体、SANTA CRUZ社、sc-189）を各穴に100μlずつ添
加して、４℃で５時間静置した。300μl の洗浄液で３
回洗い、poly dI-dCを含まない測定用緩衝液で2000倍に
希釈した抗rabbit IgG抗体（HRP標識、Cell Signaling
社）を各穴に100μlずつ添加して、４℃で一晩静置し
た。300μlの洗浄液で6回洗い、TMB溶液（DAKO社）を10
0μlずつ加えて発色させた後、2規定の硫酸を100μl加
えて反応を停止させ、吸光度計（TECAN社、スペクトラ
レインボー）を用いて450nmでの吸光度を測定した。Egr
-1が結合できる配列の合成DNAを固定したプレートで、E
gr-1 cDNAを導入した細胞の溶解液を用いた場合の吸光
度は0.751であった。同じサンプルを非結合配列のDNAを
固定したプレートで測定した場合の吸光度は0.016、DNA
を固定していないプレートでは0.005であった。Egr-1 c
DNAを導入していない細胞の溶解液を用いて、結合配列
のDNAを固定したプレートで測定を行った場合の値は0.0
05であった。

【００７６】

【発明の効果】本発明のスクリーニング法によれば、優
れた効果を有し、かつ、副作用のない腎疾患などの予防
・治療薬をスクリーニングすることができる。

【００７７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Screening Method <130> B03007 <150> JP 2002-003769 <151> 2002-01-10 <160> 11 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Partial amino acid sequence of Egr-1 protein which is conserved between human, mouse and rat. <400> 1 Tyr Gln Ser Gln Leu Ile Lys Pro Ser Arg Met Arg Lys Tyr Pro Asn 1 5 10 15 Arg Pro Ser Lys Thr Pro Pro His Glu Arg Pro Tyr Ala Cys Pro Val 20 25 30 Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His 35 40 45 Ile Arg Ile His Thr Gly Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met 50 55 60 Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Thr Thr His Ile Arg Thr His 65 70 75 80 Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala 85 90 95 Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His Thr Lys Ile His Leu Arg Gln Lys 100 105 110 Asp Lys Lys Ala Asp Lys Ser Val Val Ala Ser 115 120 <210> 2 <211> 543 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ala Ala Lys Ala Glu Met Gln Leu Met Ser Pro Leu Gln Ile 1 5 10 15 Ser Asp Pro Phe Gly Ser Phe Pro His Ser Pro Thr Met Asp Asn Tyr 20 25 30 Pro Lys Leu Glu Glu Met Met Leu Leu Ser Asn Gly Ala Pro Gln Phe 35 40 45 Leu Gly Ala Ala Gly Ala Pro Glu Gly Ser Gly Ser Asn Ser Ser Ser 50 55 60 Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ser 65 70 75 80 Ser Ser Ser Ser Thr Phe Asn Pro Gln Ala Asp Thr Gly Glu Gln Pro 85 90 95 Tyr Glu His Leu Thr Ala Glu Ser Phe Pro Asp Ile Ser Leu Asn Asn 100 105 110 Glu Lys Val Leu Val Glu Thr Ser Tyr Pro Ser Gln Thr Thr Arg Leu 115 120 125 Pro Pro Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Phe Ser Leu Glu Pro Ala Pro Asn 130 135 140 Ser Gly Asn Thr Leu Trp Pro Glu Pro Leu Phe Ser Leu Val Ser Gly 145 150 155 160 Leu Val Ser Met Thr Asn Pro Pro Ala Ser Ser Ser Ser Ala Pro Ser 165 170 175 Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ala Ser Gln Ser Pro Pro Leu Ser Cys 180 185 190 Ala Val Pro Ser Asn Asp Ser Ser Pro Ile Tyr Ser Ala Ala Pro Thr 195 200 205 Phe Pro Thr Pro Asn Thr Asp Ile Phe Pro Glu Pro Gln Ser Gln Ala 210 215 220 Phe Pro Gly Ser Ala Gly Thr Ala Leu Gln Tyr Pro Pro Pro Ala Tyr 225 230 235 240 Pro Ala Ala Lys Gly Gly Phe Gln Val Pro Met Ile Pro Asp Tyr Leu 245 250 255 Phe Pro Gln Gln Gln Gly Asp Leu Gly Leu Gly Thr Pro Asp Gln Lys 260 265 270 Pro Phe Gln Gly Leu Glu Ser Arg Thr Gln Gln Pro Ser Leu Thr Pro 275 280 285 Leu Ser Thr Ile Lys Ala Phe Ala Thr Gln Ser Gly Ser Gln Asp Leu 290 295 300 Lys Ala Leu Asn Thr Ser Tyr Gln Ser Gln Leu Ile Lys Pro Ser Arg 305 310 315 320 Met Arg Lys Tyr Pro Asn Arg Pro Ser Lys Thr Pro Pro His Glu Arg 325 330 335 Pro Tyr Ala Cys Pro Val Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser Arg Ser 340 345 350 Asp Glu Leu Thr Arg His Ile Arg Ile His Thr Gly Gln Lys Pro Phe 355 360 365 Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Thr 370 375 380 Thr His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile 385 390 395 400 Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His Thr Lys 405 410 415 Ile His Leu Arg Gln Lys Asp Lys Lys Ala Asp Lys Ser Val Val Ala 420 425 430 Ser Ser Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ser Tyr Pro Ser Pro Val Ala Thr 435 440 445 Ser Tyr Pro Ser Pro Val Thr Thr Ser Tyr Pro Ser Pro Ala Thr Thr 450 455 460 Ser Tyr Pro Ser Pro Val Pro Thr Ser Phe Ser Ser Pro Gly Ser Ser 465 470 475 480 Thr Tyr Pro Ser Pro Val His Ser Gly Phe Pro Ser Pro Ser Val Ala 485 490 495 Thr Thr Tyr Ser Ser Val Pro Pro Ala Phe Pro Ala Gln Val Ser Ser 500 505 510 Phe Pro Ser Ser Ala Val Thr Asn Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly Leu 515 520 525 Ser Asp Met Thr Ala Thr Phe Ser Pro Arg Thr Ile Glu Ile Cys 530 535 540 <210> 3 <211> 1629 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1629) <223> <400> 3 atg gcc gcg gcc aag gcc gag atg cag ctg atg tcc ccg ctg cag atc 48 Met Ala Ala Ala Lys Ala Glu Met Gln Leu Met Ser Pro Leu Gln Ile 1 5 10 15 tct gac ccg ttc gga tcc ttt cct cac tcg ccc acc atg gac aac tac 96 Ser Asp Pro Phe Gly Ser Phe Pro His Ser Pro Thr Met Asp Asn Tyr 20 25 30 cct aag ctg gag gag atg atg ctg ctg agc aac ggg gct ccc cag ttc 144 Pro Lys Leu Glu Glu Met Met Leu Leu Ser Asn Gly Ala Pro Gln Phe 35 40 45 ctc ggc gcc gcc ggg gcc cca gag ggc agc ggc agc aac agc agc agc 192 Leu Gly Ala Ala Gly Ala Pro Glu Gly Ser Gly Ser Asn Ser Ser Ser 50 55 60 agc agc agc ggg ggc ggt gga ggc ggc ggg ggc ggc agc aac agc agc 240 Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ser 65 70 75 80 agc agc agc agc acc ttc aac cct cag gcg gac acg ggc gag cag ccc 288 Ser Ser Ser Ser Thr Phe Asn Pro Gln Ala Asp Thr Gly Glu Gln Pro 85 90 95 tac gag cac ctg acc gca gag tct ttt cct gac atc tct ctg aac aac 336 Tyr Glu His Leu Thr Ala Glu Ser Phe Pro Asp Ile Ser Leu Asn Asn 100 105 110 gag aag gtg ctg gtg gag acc agt tac ccc agc caa acc act cga ctg 384 Glu Lys Val Leu Val Glu Thr Ser Tyr Pro Ser Gln Thr Thr Arg Leu 115 120 125 ccc ccc atc acc tat act ggc cgc ttt tcc ctg gag cct gca ccc aac 432 Pro Pro Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Phe Ser Leu Glu Pro Ala Pro Asn 130 135 140 agt ggc aac acc ttg tgg ccc gag ccc ctc ttc agc ttg gtc agt ggc 480 Ser Gly Asn Thr Leu Trp Pro Glu Pro Leu Phe Ser Leu Val Ser Gly 145 150 155 160 cta gtg agc atg acc aac cca ccg gcc tcc tcg tcc tca gca cca tct 528 Leu Val Ser Met Thr Asn Pro Pro Ala Ser Ser Ser Ser Ala Pro Ser 165 170 175 cca gcg gcc tcc tcc gcc tcc gcc tcc cag agc cca ccc ctg agc tgc 576 Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ala Ser Gln Ser Pro Pro Leu Ser Cys 180 185 190 gca gtg cca tcc aac gac agc agt ccc att tac tca gcg gca ccc acc 624 Ala Val Pro Ser Asn Asp Ser Ser Pro Ile Tyr Ser Ala Ala Pro Thr 195 200 205 ttc ccc acg ccg aac act gac att ttc cct gag cca caa agc cag gcc 672 Phe Pro Thr Pro Asn Thr Asp Ile Phe Pro Glu Pro Gln Ser Gln Ala 210 215 220 ttc ccg ggc tcg gca ggg aca gcg ctc cag tac ccg cct cct gcc tac 720 Phe Pro Gly Ser Ala Gly Thr Ala Leu Gln Tyr Pro Pro Pro Ala Tyr 225 230 235 240 cct gcc gcc aag ggt ggc ttc cag gtt ccc atg atc ccc gac tac ctg 768 Pro Ala Ala Lys Gly Gly Phe Gln Val Pro Met Ile Pro Asp Tyr Leu 245 250 255 ttt cca cag cag cag ggg gat ctg ggc ctg ggc acc cca gac cag aag 816 Phe Pro Gln Gln Gln Gly Asp Leu Gly Leu Gly Thr Pro Asp Gln Lys 260 265 270 ccc ttc cag ggc ctg gag agc cgc acc cag cag cct tcg cta acc cct 864 Pro Phe Gln Gly Leu Glu Ser Arg Thr Gln Gln Pro Ser Leu Thr Pro 275 280 285 ctg tct act att aag gcc ttt gcc act cag tcg ggc tcc cag gac ctg 912 Leu Ser Thr Ile Lys Ala Phe Ala Thr Gln Ser Gly Ser Gln Asp Leu 290 295 300 aag gcc ctc aat acc agc tac cag tcc cag ctc atc aaa ccc agc cgc 960 Lys Ala Leu Asn Thr Ser Tyr Gln Ser Gln Leu Ile Lys Pro Ser Arg 305 310 315 320 atg cgc aag tat ccc aac cgg ccc agc aag acg ccc ccc cac gaa cgc 1008 Met Arg Lys Tyr Pro Asn Arg Pro Ser Lys Thr Pro Pro His Glu Arg 325 330 335 cct tac gct tgc cca gtg gag tcc tgt gat cgc cgc ttc tcc cgc tcc 1056 Pro Tyr Ala Cys Pro Val Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser Arg Ser 340 345 350 gac gag ctc acc cgc cac atc cgc atc cac aca ggc cag aag ccc ttc 1104 Asp Glu Leu Thr Arg His Ile Arg Ile His Thr Gly Gln Lys Pro Phe 355 360 365 cag tgc cgc atc tgc atg cgc aac ttc agc cgc agc gac cac ctc acc 1152 Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Thr 370 375 380 acc cac atc cgc acc cac aca ggc gaa aag ccc ttc gcc tgc gac atc 1200 Thr His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile 385 390 395 400 tgt gga aga aag ttt gcc agg agc gat gaa cgc aag agg cat acc aag 1248 Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His Thr Lys 405 410 415 atc cac ttg cgg cag aag gac aag aaa gca gac aaa agt gtt gtg gcc 1296 Ile His Leu Arg Gln Lys Asp Lys Lys Ala Asp Lys Ser Val Val Ala 420 425 430 tct tcg gcc acc tcc tct ctc tct tcc tac ccg tcc ccg gtt gct acc 1344 Ser Ser Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ser Tyr Pro Ser Pro Val Ala Thr 435 440 445 tct tac ccg tcc ccg gtt act acc tct tat cca tcc ccg gcc acc acc 1392 Ser Tyr Pro Ser Pro Val Thr Thr Ser Tyr Pro Ser Pro Ala Thr Thr 450 455 460 tca tac cca tcc cct gtg ccc acc tcc ttc tcc tct ccc ggc tcc tcg 1440 Ser Tyr Pro Ser Pro Val Pro Thr Ser Phe Ser Ser Pro Gly Ser Ser 465 470 475 480 acc tac cca tcc cct gtg cac agt ggc ttc ccc tcc ccg tcg gtg gcc 1488 Thr Tyr Pro Ser Pro Val His Ser Gly Phe Pro Ser Pro Ser Val Ala 485 490 495 acc acg tac tcc tct gtt ccc cct gct ttc ccg gcc cag gtc agc agc 1536 Thr Thr Tyr Ser Ser Val Pro Pro Ala Phe Pro Ala Gln Val Ser Ser 500 505 510 ttc cct tcc tca gct gtc acc aac tcc ttc agc gcc tcc aca ggg ctt 1584 Phe Pro Ser Ser Ala Val Thr Asn Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly Leu 515 520 525 tcg gac atg aca gca acc ttt tct ccc agg aca att gaa att tgc 1629 Ser Asp Met Thr Ala Thr Phe Ser Pro Arg Thr Ile Glu Ile Cys 530 535 540 <210> 4 <211> 1629 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1629) <223> <400> 4 atg gcc gcg gcc aag gcc gag atg cag ctg atg tcc ccg ctg cag atc 48 Met Ala Ala Ala Lys Ala Glu Met Gln Leu Met Ser Pro Leu Gln Ile 1 5 10 15 tct gac ccg ttc gga tcc ttt cct cac tcg ccc acc atg gac aac tac 96 Ser Asp Pro Phe Gly Ser Phe Pro His Ser Pro Thr Met Asp Asn Tyr 20 25 30 cct aag ctg gag gag atg atg ctg ctg agc aac ggg gct ccc cag ttc 144 Pro Lys Leu Glu Glu Met Met Leu Leu Ser Asn Gly Ala Pro Gln Phe 35 40 45 ctc ggc gcc gcc ggg gcc cca gag ggc agc ggc agc aac agc agc agc 192 Leu Gly Ala Ala Gly Ala Pro Glu Gly Ser Gly Ser Asn Ser Ser Ser 50 55 60 agc agc agc ggg ggc ggt gga ggc ggc ggg ggc ggc agc aac agc agc 240 Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser Ser 65 70 75 80 agc agc agc agc acc ttc aac cct cag gcg gac acg ggc gag cag ccc 288 Ser Ser Ser Ser Thr Phe Asn Pro Gln Ala Asp Thr Gly Glu Gln Pro 85 90 95 tac gag cac ctg acc gca gag tct ttt cct gac atc tct ctg aac aac 336 Tyr Glu His Leu Thr Ala Glu Ser Phe Pro Asp Ile Ser Leu Asn Asn 100 105 110 gag aag gtg ctg gtg gag acc agt tac ccc agc caa acc act cga ctg 384 Glu Lys Val Leu Val Glu Thr Ser Tyr Pro Ser Gln Thr Thr Arg Leu 115 120 125 ccc ccc atc acc tat act ggc cgc ttt tcc ctg gag cct gca ccc aac 432 Pro Pro Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Phe Ser Leu Glu Pro Ala Pro Asn 130 135 140 agt ggc aac acc ttg tgg ccc gag ccc ctc ttc agc ttg gtc agt ggc 480 Ser Gly Asn Thr Leu Trp Pro Glu Pro Leu Phe Ser Leu Val Ser Gly 145 150 155 160 cta gtg agc atg acc aac cca ccg gcc tcc tcg tcc tca gca cca tct 528 Leu Val Ser Met Thr Asn Pro Pro Ala Ser Ser Ser Ser Ala Pro Ser 165 170 175 cca gcg gcc tcc tcc gcc tcc gcc tcc cag agc cca ccc ctg agc tgc 576 Pro Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ala Ser Gln Ser Pro Pro Leu Ser Cys 180 185 190 gca gtg cca tcc aac gac agc agt ccc att tac tca gcg gca ccc acc 624 Ala Val Pro Ser Asn Asp Ser Ser Pro Ile Tyr Ser Ala Ala Pro Thr 195 200 205 ttc ccc acg ccg aac act gac att ttc cct gag cca caa agc cag gcc 672 Phe Pro Thr Pro Asn Thr Asp Ile Phe Pro Glu Pro Gln Ser Gln Ala 210 215 220 ttc ccg ggc tcg gca ggg aca gcg ctc cag tac ccg cct cct gcc tac 720 Phe Pro Gly Ser Ala Gly Thr Ala Leu Gln Tyr Pro Pro Pro Ala Tyr 225 230 235 240 cct gcc gcc aag ggt ggc ttc cag gtt ccc atg atc ccc gac tac ctg 768 Pro Ala Ala Lys Gly Gly Phe Gln Val Pro Met Ile Pro Asp Tyr Leu 245 250 255 ttt cca cag cag cag ggg gat ctg ggc ctg ggc acc cca gac cag aag 816 Phe Pro Gln Gln Gln Gly Asp Leu Gly Leu Gly Thr Pro Asp Gln Lys 260 265 270 ccc ttc cag ggc ctg gag agc cgc acc cag cag cct tcg cta acc cct 864 Pro Phe Gln Gly Leu Glu Ser Arg Thr Gln Gln Pro Ser Leu Thr Pro 275 280 285 ctg tct act att aag gcc ttt gcc act cag tcg ggc tcc cag gac ctg 912 Leu Ser Thr Ile Lys Ala Phe Ala Thr Gln Ser Gly Ser Gln Asp Leu 290 295 300 aag gcc ctc aat acc agc tac cag tcc cag ctc atc aaa ccc agc cgc 960 Lys Ala Leu Asn Thr Ser Tyr Gln Ser Gln Leu Ile Lys Pro Ser Arg 305 310 315 320 atg cgc aag tac ccc aac cgg ccc agc aag acg ccc ccc cac gaa cgc 1008 Met Arg Lys Tyr Pro Asn Arg Pro Ser Lys Thr Pro Pro His Glu Arg 325 330 335 cct tac gct tgc cca gtg gag tcc tgt gat cgc cgc ttc tcc cgc tcc 1056 Pro Tyr Ala Cys Pro Val Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser Arg Ser 340 345 350 gac gag ctc acc cgc cac atc cgc atc cac aca ggc cag aag ccc ttc 1104 Asp Glu Leu Thr Arg His Ile Arg Ile His Thr Gly Gln Lys Pro Phe 355 360 365 cag tgc cgc atc tgc atg cgc aac ttc agc cgc agc gac cac ctc acc 1152 Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Thr 370 375 380 acc cac atc cgc acc cac aca ggc gaa aag ccc ttc gcc tgc gac atc 1200 Thr His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile 385 390 395 400 tgt gga aga aag ttt gcc agg agc gat gaa cgc aag agg cat acc aag 1248 Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Arg Lys Arg His Thr Lys 405 410 415 atc cac ttg cgg cag aag gac aag aaa gca gac aaa agt gtt gtg gcc 1296 Ile His Leu Arg Gln Lys Asp Lys Lys Ala Asp Lys Ser Val Val Ala 420 425 430 tct tcg gcc acc tcc tct ctc tct tcc tac ccg tcc ccg gtt gct acc 1344 Ser Ser Ala Thr Ser Ser Leu Ser Ser Tyr Pro Ser Pro Val Ala Thr 435 440 445 tct tac ccg tcc ccg gtt act acc tct tat cca tcc ccg gcc acc acc 1392 Ser Tyr Pro Ser Pro Val Thr Thr Ser Tyr Pro Ser Pro Ala Thr Thr 450 455 460 tca tac cca tcc cct gtg ccc acc tcc ttc tcc tct ccc ggc tcc tcg 1440 Ser Tyr Pro Ser Pro Val Pro Thr Ser Phe Ser Ser Pro Gly Ser Ser 465 470 475 480 acc tac cca tcc cct gtg cac agt ggc ttc ccc tcc ccg tcg gtg gcc 1488 Thr Tyr Pro Ser Pro Val His Ser Gly Phe Pro Ser Pro Ser Val Ala 485 490 495 acc acg tac tcc tct gtt ccc cct gct ttc ccg gcc cag gtc agc agc 1536 Thr Thr Tyr Ser Ser Val Pro Pro Ala Phe Pro Ala Gln Val Ser Ser 500 505 510 ttc cct tcc tca gct gtc acc aac tcc ttc agc gcc tcc aca ggg ctt 1584 Phe Pro Ser Ser Ala Val Thr Asn Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly Leu 515 520 525 tcg gac atg aca gca acc ttt tct ccc agg aca att gaa att tgc 1629 Ser Asp Met Thr Ala Thr Phe Ser Pro Arg Thr Ile Glu Ile Cys 530 535 540 <210> 5 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Oligonucleotide designed to act as decoy for Egr-1. <400> 5 gcgtgggcg 9 <210> 6 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Oligonucleotide designed to act as decoy for Egr-1. <400> 6 gcgggggcg 9 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Oligonucleotide designed to act as antisense DNA for Egr-1 mRNA. <400> 7 gcggggtgca ggggcacact 20 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Oligonucleotide designed to act as primer for amplifying Egr-1 cDNA. <400> 8 ccgaattcag tgttccccgc gccccgcatg 30 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Oligonucleotide designed to act as primer for amplifying Egr-1 cDNA. <400> 9 ggctcgagaa cctccatctg acctaagag 29 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Oligonucleotide designed to act as sense strand of double-stranded DNA capable of binding with Egr-1. <400> 10 tgactcgccc tcgcccccgc gccggg 26 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Oligonucleotide designed to act as sense strand of double-stranded DNA incapable of binding with Egr-1. <400> 11 tgactcgccc tcgacccagc gccggg 26

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ４Ｈ０４５Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 13/12 13/12 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/53 33/53 ＤＭ 33/566 33/566 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＦターム(参考） 2G045 AA35 AA40 BA11 BB50 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA12 DA02 EA04 HA11 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ42 QQ53 QQ79 QR48 QR51 QR77 QS33 QS36 QX02 4C084 AA02 AA07 AA13 AA14 AA17 BA02 BA08 BA23 BA35 BA44 CA53 CA56 CA59 NA13 NA14 ZA812 ZC022 ZC352 4C085 AA13 AA14 BB11 CC01 CC02 CC04 CC05 CC12 CC17 CC21 CC23 EE01 HH13 JJ01 KA03 KA26 KB82 LL20 4H045 AA11 AA30 CA40 DA75 EA20 EA50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質またはその塩を用いることを特徴とする、該タンパ
ク質またはその塩が関連する疾患の予防・治療物質のス
クリーニング方法。
【請求項２】配列番号：1で表されるアミノ酸配列を含
有するタンパク質またはその塩を用いることを特徴とす
る、該タンパク質またはその塩が関連する疾患の予防・
治療物質のスクリーニング方法。
【請求項３】タンパク質が配列番号：2で表されるアミ
ノ酸配列を有する請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】疾患が腎疾患である請求項１記載のスクリ
ーニング方法。
【請求項５】腎疾患がＥｇｒ−1依存性腎疾患である請
求項４記載のスクリーニング方法。
【請求項６】腎疾患が糖尿病性腎症である請求項４記載
のスクリーニング方法。
【請求項７】配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質またはその塩を産生する能力を有する細胞を培養し
た場合と、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一
または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク
質またはその塩を産生する能力を有する細胞を試験化合
物の存在下に培養した場合との、配列番号：1で表され
るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配
列を含有するタンパク質またはその塩の生産量を比較す
ることを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方
法。
【請求項８】試験化合物の存在下および非存在下におい
て、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また
はその塩の活性を比較することを特徴とする、請求項１
記載のスクリーニング方法。
【請求項９】活性が、配列番号：1で表されるアミノ酸
配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
るタンパク質またはその塩が結合し得るポリヌクレオチ
ドに対する結合活性である請求項８記載のスクリーニン
グ方法。
【請求項１０】活性が、配列番号：1で表されるアミノ
酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有
するタンパク質またはその塩による転写制御の支配下に
ある遺伝子の発現制御活性である請求項８記載のスクリ
ーニング方法。
【請求項１１】配列番号：1で表されるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質またはその塩を産生する能力を有する細胞を培養
した場合と、該細胞を試験化合物の存在下に培養した場
合との、該タンパク質またはその塩の生産量および該タ
ンパク質またはその塩が結合し得るポリヌクレオチドに
対する結合活性を、該ポリヌクレオチドおよび該タンパ
ク質またはその塩に対する抗体を用いて測定・比較する
ことを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方
法。
【請求項１２】請求項１記載のスクリーニング方法によ
って得られた化合物またはその塩。
【請求項１３】請求項１記載のスクリーニング方法によ
って得られた化合物またはその塩を含有してなる、配列
番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩
が関連する疾患の予防・治療薬。
【請求項１４】配列番号：1で表されるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質またはその塩をコードする塩基配列またはその部
分配列を含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴
とする、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一ま
たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質
またはその塩が関連する疾患の予防・治療物質のスクリ
ーニング方法。
【請求項１５】配列番号：1で表されるアミノ酸配列を
含有するタンパク質またはその塩をコードする塩基配列
またはその部分配列を含有するポリヌクレオチドを用い
ることを特徴とする、配列番号：1で表されるアミノ酸
配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
るタンパク質またはその塩が関連する疾患の予防・治療
物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】ポリヌクレオチドが配列番号：3または
配列番号：4で表される塩基配列またはその部分配列を
含有する請求項１４記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】疾患が腎疾患である請求項１４記載のス
クリーニング方法。
【請求項１８】腎疾患がＥｇｒ−1依存性腎疾患である
請求項１７記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】腎疾患が糖尿病性腎症である請求項１７
記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】配列番号：1で表されるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質またはその塩を産生する能力を有する細胞を培養
した場合と、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同
一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質またはその塩を産生する能力を有する細胞を試験化
合物の存在下に培養した場合との、配列番号：1で表さ
れるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するタンパク質またはその塩をコードするＲ
ＮＡの量を比較することを特徴とする、請求項１４記載
のスクリーニング方法。
【請求項２１】請求項１４記載のスクリーニング方法に
よって得られた化合物またはその塩。
【請求項２２】請求項１４記載のスクリーニング方法に
よって得られた化合物またはその塩を含有してなる、配
列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその
塩が関連する疾患の予防・治療薬。
【請求項２３】配列番号：1で表されるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質またはその塩に対する抗体。
【請求項２４】請求項２３記載の抗体を含有してなる、
配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはそ
の塩が関連する疾患の予防・治療薬。
【請求項２５】配列番号：1で表されるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列または
その部分配列を有するポリヌクレオチドを含有してな
る、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または
実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質また
はその塩が関連する疾患の予防・治療薬。
【請求項２６】請求項２３記載の抗体を含有してなる、
配列番号：1で表されるアミノ酸配列と同一または実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはそ
の塩が関連する疾患の診断薬。
【請求項２７】配列番号：1で表されるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質をコードする塩基配列またはその部分配列を有す
るポリヌクレオチドを含有してなる、配列番号：1で表
されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ
酸配列を含有するタンパク質またはその塩が関連する疾
患の診断薬。
【請求項２８】配列番号：５または配列番号：６で表さ
れる塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有すること
を特徴とする、配列番号：1で表されるアミノ酸配列と
同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン
パク質またはその塩が関連する疾患の予防・治療薬。
【請求項２９】疾患が腎疾患である請求項２８記載の予
防・治療薬。
【請求項３０】腎疾患がＥｇｒ−1依存性腎疾患である
請求項２９記載の予防・治療薬。
【請求項３１】腎疾患が糖尿病性腎症である請求項２９
記載の予防・治療薬。
【請求項３２】Ｅｇｒ−1抑制薬を含有してなる糖尿病
性腎症の予防・治療薬。
【請求項３３】Ｅｇｒ−1抑制薬が腎Ｅｇｒ−1抑制薬で
ある請求項３２記載の予防・治療薬。
【請求項３４】哺乳動物にＥｇｒ−1抑制薬を投与する
ことを特徴とする、該哺乳動物における糖尿病性腎症の
予防または治療方法。
【請求項３５】Ｅｇｒ−1抑制薬が腎Ｅｇｒ−1抑制薬で
ある請求項３４記載の方法。
【請求項３６】糖尿病性腎症の予防・治療薬を製造する
ための、Ｅｇｒ−1抑制薬の使用。
【請求項３７】Ｅｇｒ−1抑制薬が腎Ｅｇｒ−1抑制薬で
ある請求項３６記載の使用。