JP2003265190A - Method and kit for quantifying nucleic acid - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for quantifying a nucleic acid, and to provide a kit therefor. <P>SOLUTION: A standard article to be used for preparing a calibration curve for quantifying a specific target nucleic acid in a sample consists of a polynucleotide obtained by chemical synthesis. A method and a kit for quantifying the nucleic acid using the article, and methods of diagnosing specific diseases using the article, are also provided, respectively. This standard article has advantages of being afforded with a targeted exact sequence by a simple method compared to those consisting of polynucleotides obtained by conventional biosynthesis, of being safe to the environment because of no biological contamination, and of reducing factors inhibiting highly accurate quantification. <P>COPYRIGHT: (C)2003,JPO

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【従来の技術】本発明は、試料中の特定の標的核酸を定
量するために用いられる検量線を作成するために用いら
れる標準品、それを用いた核酸の定量方法及び定量キッ
トなどに関する。また、本発明は、その核酸の定量方法
または定量キットを用いた特定疾患の診断方法、及びそ
の特定された遺伝子ＤＮＡまたはその遺伝子産物を含む
医薬品にも関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a standard product used for preparing a calibration curve used for quantifying a specific target nucleic acid in a sample, a nucleic acid quantification method and a quantification kit using the standard product. The present invention also relates to a method for diagnosing a specific disease using the nucleic acid quantification method or quantification kit, and a pharmaceutical containing the specified gene DNA or gene product.

【０００２】ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法
は、微量の標的核酸を指数的に増幅した後に検出するこ
とができるので、遺伝子の発現解析、疾患の診断、遺伝
子組換え食品の検査、自然食品における組換え遺伝子の
混入の判定などの分野において幅広く用いられている。
ＰＣＲ法については、例えば、米国特許第４，６８３，
１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第４，９６
５，１８８号などに詳しく記載されている。一般的なＰ
ＣＲ法では、標的核酸を含み得る試料と、標的核酸に対
応する一対のオリゴヌクレオチドプライマー、反応基質
（デオキシヌクレオチド三リン酸）、ＤＮＡポリメラー
ゼなどを含む増幅試薬とを反応させ、標的核酸を指数的
に増幅させることにより、微量に含まれる標的核酸の検
出を容易にする。また、ＰＣＲ法において特定のｍＲＮ
Ａを精度よく定量する方法として、蛍光プローブを用い
るＴａｑＭａｎ法等が知られている。例えば、特許公開
第２００１−２０４４８３号公報には、ｈＴＥＲＴ ｍ
ＲＮＡを定量するＴａｑＭａｎ法が開示されている。Since the PCR (polymerase chain reaction) method can detect a trace amount of target nucleic acid after exponentially amplifying it, gene expression analysis, diagnosis of disease, examination of genetically modified food, combination in natural food It is widely used in the field of determining the contamination of replacement genes.
Regarding the PCR method, for example, US Pat.
195, 4,683,202 and 4,96.
5,188, etc. General P
In the CR method, a sample that may contain a target nucleic acid is reacted with an amplification reagent containing a pair of oligonucleotide primers corresponding to the target nucleic acid, a reaction substrate (deoxynucleotide triphosphate), a DNA polymerase, etc. to exponentially target the target nucleic acid. The target nucleic acid contained in a trace amount can be easily detected by amplifying the target nucleic acid. Moreover, in the PCR method, a specific mRN
As a method for accurately quantifying A, the TaqMan method using a fluorescent probe is known. For example, Japanese Patent Laid-Open Publication No. 2001-204483 discloses hTERT m.
A TaqMan method for quantifying RNA is disclosed.

【０００３】一方、微量に含まれる標的核酸の定量の精
度をあげるために、内部標準を用いた技術が開発されて
おり、例えば、特開平１１−１２３０９５号公報に開示
されている。この公報には、内部標準となるＤＮＡ配列
を含有するプラスミドを、増幅試薬中に存在させ、この
プラスミドが産生するｃＲＮＡを内部標準として用いる
標的核酸の定量方法が記載されている。On the other hand, a technique using an internal standard has been developed in order to improve the accuracy of quantification of a target nucleic acid contained in a trace amount, and is disclosed in, for example, Japanese Patent Laid-Open No. 11-123095. This publication describes a method for quantifying a target nucleic acid in which a plasmid containing a DNA sequence serving as an internal standard is present in an amplification reagent and cRNA produced by this plasmid is used as an internal standard.

【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号[Patent Document 1] US Pat. No. 4,683,195

【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号[Patent Document 2] US Pat. No. 4,683,202

【特許文献３】米国特許第４，９６５，１８８号[Patent Document 3] US Pat. No. 4,965,188

【特許文献４】特許公開第２００１−２０４４８３号公
報[Patent Document 4] Japanese Patent Laid-Open No. 2001-204483

【特許文献５】特開平１１−１２３０９５号公報[Patent Document 5] Japanese Patent Laid-Open No. 11-123095

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】上記方法によれば、内
部標準を用いない方法と比較してより正確に標的核酸を
定量することができる。しかしながら、この方法では、
内部標準となるＲＮＡがプラスミドから反応容器内で得
られるので、試薬の保存状態、反応条件、その他の要因
によっては、必ずしも一定量のＲＮＡが産生されるとは
限らない。また従来の酵素あるいは生物により合成され
た標準品はその調製が煩雑でありしばしば困難である場
合が存在する。従来の方法で標準品を調製するには、配
列情報を基にして目的とする生物種の細胞、臓器、ウイ
ルスなどからゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡもしくはｍＲ
ＮＡを抽出しそこから目的とする遺伝子の断片もしくは
その情報を有するＤＮＡもしくはＲＮＡを酵素的もしく
は生物的に合成する必要がある。また、材料となる生物
種には入手困難なものや強い病原性を持つものなども含
まれる。さらに、標準品の調製が生物から抽出された酵
素類もしくは生物そのものを用いるため標準品に高精度
の定量を阻害する生物学的コンタミネーションがおこる
ことも考えられる。したがって、上記のような不都合が
なく、簡便な方法で得られ、生物学的コンタミネーショ
ンのない標準品、及びそれを用いて標的核酸を高精度に
定量できる方法があれば、疾患遺伝子の特定、特定疾患
の診断、その疾患の治療等の分野で有用である。According to the above method, the target nucleic acid can be quantified more accurately than the method using no internal standard. However, with this method,
Since RNA serving as an internal standard is obtained from the plasmid in the reaction vessel, a certain amount of RNA is not always produced depending on the storage condition of the reagent, reaction conditions, and other factors. In addition, there are cases where conventional standard products synthesized by enzymes or organisms are complicated and often difficult to prepare. In order to prepare a standard product by a conventional method, genomic DNA or RNA or mR is obtained from cells, organs, viruses, etc. of the target species based on the sequence information.
It is necessary to extract NA and enzymatically or biologically synthesize a fragment of the desired gene or a DNA or RNA having the information from the NA. In addition, the biological species used as materials include those that are difficult to obtain and those that have strong pathogenicity. Furthermore, since the standard product is prepared using the enzymes extracted from the living organism or the living organism itself, it is conceivable that biological contamination may occur in the standard product, which inhibits highly accurate quantification. Therefore, without the above-mentioned inconvenience, obtained by a simple method, a standard product without biological contamination, and if there is a method for quantifying a target nucleic acid with high accuracy, identification of a disease gene, It is useful in the fields of diagnosis of specific diseases, treatment of such diseases, and the like.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、以下
に示す、標準品、核酸の定量方法、核酸の定量キット、
特定疾患の診断方法などを提供する。 （１）化学合成によって得られる合成ポリヌクレオチド
を含む、試料中の特定の標的核酸を定量または検出する
際に用いられる標準品、（２）前記合成ポリヌクレオチ
ドがＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらの修飾物である前記
（１）記載の標準品、（３）前記合成ポリヌクレオチド
がＲＮＡまたはＤＮＡである前記（１）記載の標準品、
（４）前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡのときにセン
ス鎖、あるいはＤＮＡのときにアンチセンス鎖である前
記（３）記載の標準品、（５）前記合成ポリヌクレオチ
ドが標的核酸の一部を合成したものであって、ヌクレオ
チドの数が６０〜２００個である上記（１）記載の標準
品、（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の標準
品を含む核酸定量キット、（７）前記（１）〜（５）の
いずれかに記載の標準品と少なくとも１対のプライマー
対を含む核酸定量キット、（８）さらに蛍光プローブま
たはリン酸化プローブを含んでなる前記（７）記載のキ
ット、（９）さらにＤＮＡポリメラーゼを含んでなる前
記（８）記載のキット、（１０）さらに逆転写酵素を含
む前記（９）記載のキット、（１１）複数の標的核酸を
定量するための核酸定量キットであって、複数の反応場
所を有する反応器具の各反応場所に、標的核酸に対応す
るプライマー対を含む増幅試薬を充填し、その標的核酸
に対応するプライマー対を充填していない反応場所に前
記（１）〜（５）のいずれかに記載の標準品とその標準
品に対応するプライマー対を含む増幅試薬を充填してな
る核酸定量キット、（１２）前記複数の標的核酸が特定
疾患に関与するＤＮＡまたはｍＲＮＡであり、その特定
疾患を診断するために用いられる前記（１１）記載の核
酸定量キット、（１３）前記複数の標的核酸が遺伝子組
換え食品に含有される組換えＤＮＡであり、食品中の組
換えＤＮＡを検知するために用いられる前記（１１）記
載の核酸定量キット、（１４）試料中の特定の標的核酸
を定量する方法であって、試料に標的核酸に対応する少
なくとも一対のプライマー対をそれぞれ含む増幅試薬を
加え、標準品としての化学合成ポリヌクレオチドにその
合成ポリヌクレオチドに対応するプライマー対を含む増
幅試薬を加えて、それぞれ増幅反応を行い、増幅された
標準品の量と増幅された標的核酸の量を測定し、これら
の情報に基づいて増幅前の標的核酸の量を計算する核酸
の定量方法、（１５）前記合成ポリヌクレオチドがＲＮ
Ａ、ＤＮＡ又はそれらの修飾物である前記（１４）記載
の方法、（１６）前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡで
ある前記（１４）記載の方法、（１７）前記合成ポリヌ
クレオチドがセンス鎖である前記（１６）記載の方法、
（１８）前記合成ポリヌクレオチドが標的核酸の一部を
合成したものであって、ヌクレオチドの数が６０〜２０
０個である前記（１４）〜（１７）記載の方法、（１
９）前記試料がヒトまたはその他の動物由来のｍＲＮＡ
試料である前記（１４）〜（１８）記載の方法、（２
０）前記増幅試薬がさらに蛍光プローブまたはリン酸化
プローブを含んでなる前記（１９）記載の方法、（２
１）前記増幅試薬がさらにＤＮＡポリメラーゼを含んで
なる前記（２０）記載の方法、（２２）前記増幅試薬が
さらに逆転写酵素を含む前記（２１）記載の方法、（２
３）（１）標的核酸に対応する少なくとも一対のプライ
マー対をそれぞれ含む増幅試薬に含まれる蛍光プローブ
またはリン酸化プローブのプローブ部分が、標的核酸の
うち該プライマー対に挟まれる領域の核酸からなるプロ
ーブであり、（２）合成ポリヌクレオチドに対応するプ
ライマー対を含む増幅試薬に含まれる蛍光プローブまた
はリン酸化プローブのプローブ部分が、合成ポリヌクレ
オチドのうち該プライマー対に挟まれる領域の核酸から
なるプローブである前記（２０）〜（２２）記載の方
法、（２４）ＤＮＡポリメラーゼによって蛍光プローブ
またはリン酸化プローブから遊離される蛍光物質の蛍光
強度またはリン酸基の量を指標として、増幅された標準
品の量と増幅された標的核酸の量を測定する前記（２
３）記載の方法、（２５）前記（１１）記載のキット又
は前記（１４）の方法を用いてＳＮＰの解析を行う方
法、（２６）前記（１２）記載のキット又は前記（１
４）の方法を用いて特定疾患を診断する方法、（２７）
前記（１３）記載のキット又は前記（１４）の方法を用
いて食品中に遺伝子組換えＤＮＡが含まれているか否か
を判定する方法、および（２８）前記（１２）記載のキ
ット又は前記（２６）記載の方法によって特定される、
ある細胞や組織において特徴的に発現が亢進または減少
している遺伝子ＤＮＡもしくはその遺伝子産物、又はそ
の遺伝子産物に対するアゴニスト、アンタゴニストもし
くは抗体を含んでなる医薬。Means for Solving the Problems That is, the present invention provides a standard product, a nucleic acid quantification method, a nucleic acid quantification kit,
A method for diagnosing a specific disease is provided. (1) A standard product including a synthetic polynucleotide obtained by chemical synthesis, which is used when quantifying or detecting a specific target nucleic acid in a sample, (2) the synthetic polynucleotide is RNA, DNA or a modified product thereof. (3) The standard product according to (1), wherein the synthetic polynucleotide is RNA or DNA.
(4) The standard product according to (3), wherein the synthetic polynucleotide is a sense strand when it is RNA, or an antisense strand when it is DNA, (5) the synthetic polynucleotide synthesized a part of the target nucleic acid. Wherein the number of nucleotides is 60 to 200, the standard product according to (1) above, (6) the nucleic acid quantification kit containing the standard product according to any one of (1) to (5) above, 7) A nucleic acid quantification kit comprising the standard product according to any one of the above (1) to (5) and at least one primer pair, (8) The above (7), further comprising a fluorescent probe or a phosphorylated probe. (9) The kit according to (8), further comprising a DNA polymerase, (10) the kit according to (9), further comprising reverse transcriptase, (11) for quantifying a plurality of target nucleic acids Nuclear A quantification kit, wherein each reaction location of a reaction instrument having a plurality of reaction locations is filled with an amplification reagent containing a primer pair corresponding to a target nucleic acid, and a reaction location not filled with a primer pair corresponding to the target nucleic acid (12) A nucleic acid quantification kit obtained by filling an amplification reagent containing the standard product according to any one of (1) to (5) above and a primer pair corresponding to the standard product, (12) the plurality of target nucleic acids being a specific disease Or a recombinant DNA contained in a genetically modified food in which the plurality of target nucleic acids are contained in a genetically modified food. A method for quantifying a specific target nucleic acid in a sample according to (11), which is used for detecting recombinant DNA in food, and (14) a method for quantifying a specific target nucleic acid in a sample. Amplification reagents containing at least one pair of primers corresponding to nucleic acids are added, and amplification reagents containing a pair of primers corresponding to the synthetic polynucleotide are added to a chemically synthesized polynucleotide as a standard product, and amplification reactions are carried out to perform amplification. (15) A method for quantifying a nucleic acid, which comprises measuring the amount of a standard product and the amount of an amplified target nucleic acid, and calculating the amount of the target nucleic acid before amplification based on these information.
A, the method described in (14) above, which is DNA or a modified product thereof, (16) the method described in (14) above, wherein the synthetic polynucleotide is RNA, and (17) the method wherein the synthetic polynucleotide is a sense strand. (16) The method described in
(18) The synthetic polynucleotide is a product of a part of a target nucleic acid synthesized, wherein the number of nucleotides is 60 to 20.
The method according to (14) to (17), wherein the number is 0, (1
9) The sample is mRNA derived from human or other animal
The method according to (14) to (18), which is a sample, (2
0) The method according to (19) above, wherein the amplification reagent further comprises a fluorescent probe or a phosphorylated probe.
1) The method described in (20) above, wherein the amplification reagent further comprises a DNA polymerase, (22) The method described in (21) above, wherein the amplification reagent further comprises a reverse transcriptase.
3) (1) A probe in which the probe portion of a fluorescent probe or phosphorylation probe contained in an amplification reagent containing at least one pair of primer pairs corresponding to a target nucleic acid is a nucleic acid in a region sandwiched between the primer pairs in the target nucleic acid. And (2) the probe part of the fluorescent probe or phosphorylated probe contained in the amplification reagent containing the primer pair corresponding to the synthetic polynucleotide is a probe consisting of the nucleic acid in the region sandwiched between the primer pair in the synthetic polynucleotide. (24) The method according to the above (20) to (22), (24) using the fluorescence intensity or the amount of phosphate group of the fluorescent substance released from the fluorescent probe or phosphorylated probe by DNA polymerase as an index, And the amount of the amplified target nucleic acid (2)
3) The method described in (25), the kit described in (11) above or the method of performing SNP analysis using the method described in (14), (26) The kit described in (12) above or (1) above.
A method of diagnosing a specific disease using the method of 4), (27)
(13) The method according to (13) or the method according to (14) for determining whether or not genetically modified DNA is contained in a food, and (28) the kit according to (12) or ( 26) specified by the method described above,
A medicament comprising a gene DNA whose expression is characteristically increased or decreased in a cell or tissue or a gene product thereof, or an agonist, an antagonist or an antibody against the gene product.

【０００６】以下、本発明について詳細に説明する。The present invention will be described in detail below.

【発明の実施の形態】（標準品）まず、本発明の標準品
は、試料中の特定の標的核酸を定量又は検出する際に用
いられる標準品であって、化学合成によって得られる合
成ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。ここで、
「標準品」とは、標的核酸を増幅し、得られた増幅生成
物の量から、増幅前の標的核酸の量を計算する際に用い
られる検量線を作成するため、あるいはＳＮＰなどの特
定の核酸配列を検出する際に用いられる標準品のことを
いう。検量線の作成、増幅前の標的核酸の計算方法など
については後述する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION (Standard Product) First, the standard product of the present invention is a standard product used when quantifying or detecting a specific target nucleic acid in a sample, and is a synthetic polynucleotide obtained by chemical synthesis. It is characterized by including. here,
The “standard product” means to amplify a target nucleic acid and to prepare a calibration curve used when calculating the amount of the target nucleic acid before amplification from the amount of the obtained amplification product, or a specific standard such as SNP. It refers to a standard product used for detecting a nucleic acid sequence. The preparation of the calibration curve, the method of calculating the target nucleic acid before amplification, etc. will be described later.

【０００７】本発明で用いる標準品は、合成ポリヌクレ
オチドであり、好ましくは、化学合成によって得られた
１本鎖もしくは２本鎖ＲＮＡ、１本鎖もしくは２本鎖Ｄ
ＮＡ又はそれらの修飾物である。ここで、「修飾物」と
は、一部が化学修飾されたものをいい、例えば、（１）
プリン環および／またはピリミジン環が化学修飾された
もの（例えば、メチル化されたプリンおよびピリミジン
環、アシル化されたプリンおよびピリミジン環などを有
するもの）、あるいはその他の複素環を含むもの、
（２）糖部分が化学修飾されたもの（例えば、１個以上
の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されてい
たり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換さ
れているもの）、（３）ビオチン化されたもの、（４）
ＦＩＴＣ化されたもの、（５）ジゴキシゲニンで修飾さ
れたもの、（６）リン酸化されたもの、（７）ペルオキ
シダーゼで修飾されたもの、（８）アルカリホスファタ
ーゼで修飾されたもの、（９）ルシフェラーゼで修飾さ
れたものなどが挙げられる。化学合成によれば、単一の
化学構造を有する目的ポリヌクレオチドを必要な量だけ
確実に得ることができるので、本発明では化学合成ポリ
ヌクレオチドが使用される。本発明の標準品は、好まし
くは、化学合成によって得られた１本鎖ＲＮＡであり、
より好ましくは化学合成によって得られたセンス鎖であ
る。また、化学合成による一本鎖ＤＮＡを用いる際は好
ましくはアンチセンス鎖を用いるのがよい。２本鎖よ
り、１本鎖のほうが、被定量物に近い状態のものを標準
とすることができるので、定量の精度が向上するからで
ある。The standard used in the present invention is a synthetic polynucleotide, preferably single-stranded or double-stranded RNA, single-stranded or double-stranded D obtained by chemical synthesis.
NA or a modified product thereof. Here, the "modified product" refers to a product partially chemically modified, for example, (1)
Those having a chemically modified purine ring and / or pyrimidine ring (for example, having a methylated purine and pyrimidine ring, an acylated purine and pyrimidine ring, etc.), or other heterocycles,
(2) Those in which the sugar moiety is chemically modified (for example, one or more hydroxyl groups are substituted with halogen, an aliphatic group or the like, or converted into a functional group such as ether or amine), ( 3) Biotinylated, (4)
FITC-modified, (5) digoxigenin-modified, (6) phosphorylated, (7) peroxidase-modified, (8) alkaline phosphatase-modified, (9) luciferase And the like. Since the target polynucleotide having a single chemical structure can be reliably obtained in a required amount by the chemical synthesis, the chemically synthesized polynucleotide is used in the present invention. The standard of the present invention is preferably single-stranded RNA obtained by chemical synthesis,
More preferably, it is the sense strand obtained by chemical synthesis. When using single-stranded DNA by chemical synthesis, it is preferable to use an antisense strand. This is because the single strand can be used as a standard in a state closer to the substance to be quantified than in the double strand, so that the quantification accuracy is improved.

【０００８】本発明の合成ポリヌクレオチドとしては、
標的核酸またはその一部の塩基配列と同一の塩基配列を
有する合成ポリヌクレオチドであり、従来の生合成によ
って得られる標準品と同様の配列を有するものを用いる
ことができる。このような標準品としては、18Ｓリボソ
ームＲＮＡ（18S Ribosomal RNA）、酸性リボソームタ
ンパク質（Acidic Ribosomal Protein）、ベータアクチ
ン（β-actin）、サイクロフィリン（Cyclophilin）、
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Gl
yceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、ホスフォ
グリセロキナーゼ（Phosphoglycerokinase）、ベータ２
−ミクログロブリン（β2-Microglobulin）、ベータ−
グルクロニダーゼ（β-Glucuronidase）、ヒボキサンチ
ンリボシルトランスフェラーゼ（Hypoxanthine Ribosyl
Transferase）、転写因子ＩＩＤ（Transcription Fact
or IID）／ＴＡＴＡ結合因子（TATA Binding Facto
r）、トランスフェリンレセプター（Transferrin Recep
tor）等が挙げられる。当業者であれば、公知の配列に
基づき、化学合成によって本発明の標準品であるポリヌ
クレオチドを合成することは容易である。公知のポリヌ
クレオチドの合成方法として、例えば、ホスホアミダイ
ド法、Ｈ−ホスフェート法等が知られている。ホスホア
ミダイド法については、例えば、Wu,T.,Ogilvie,K.K.,
and Pon,R.T.(1989). Prevention of chain cleavage i
n the chemical synthesis of 2'-O-silylated oligori
bonucleotides.Nucl. Acids Res. 17, 3501-3517； St
awinski,J.,Stromberg,R.,Thelin,M., and Westman,E..
(1988)； Studies on the t-butyldimethyl-silyl gro
up as 2'-O-protection in oligoribonucleotide synth
esis via the H-phosphonate approach.Nucl. Acids Re
s. 16, 9285-9288； Scaringe,SA.A.,Franklyn,C., an
d Usman,N. (1990). Chemical synthesis of biologica
lly active oligoribinucleotides using b-cyanoethyl
protected ribonucleoside phosphoramidites.Nucl. A
cids Res. 18, 5433-5441； Chaix,C.,Molko,D. and T
eoule,R. (1989). The use of labile base protecting
groups in oligoribonucleotide synthesis.Tetrahedr
on Lett. 30, 71-74； Gasparutto,D.,Livache,T.,Bazi
n,H.,Duplaa,A.M.,Guy,A.,Khorlin,A.,Molko,D.,Roget,
A.,and Teoule,R. (1992)；Chemical synthesis of a b
iologically active natural tRNA with its minor bas
es. Nucleic Acids Res. 20, 5159-5166； Vinayak,R.,
Anderson,P.McCollum,C., and Hampel,A. (1992). Chem
ical synthesis ofRNA using fast oligonucleotide de
protection chemistry.Tetrahedron Lett.31, 7269-727
2などの文献に記載されている。また、Ｈ-ホスフェート
法については、例えば、Garegg,P.J., Regberg,T., Sta
winski,J. and Stromberg,R. (1985). Formation of in
ternucleotidic bonds via phosphonate intermediate
s. Chem. Scripta 25, 280-282； Garegg,P.J., Regber
g,T., Stawinski,J. and Stromberg,R. (1986). Nucleo
side hydrogenphosphonates in oligonucleotide synth
esis. Chem. Scripta 26, 59-62； Garegg,P.J., Lidh,
I.,Regberg,T., Stawinski,J. and Stromberg,R. (198
6)； Nucleoside H-phosphonates.III.Chemicalsynthes
is of oligodeoxyribonucleotides by the hydrogenpho
sphonateapproach. Tetrahedron Lett. 27, 4051-405
4； Froehler,B.C., Ng,P.G., andMatteucci,M.D. (198
6). Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phospho
nate intermediates. Nucleic Acids Res. 14, 5399-54
07； Froehler,B.C., and Matteucci,M.D. (1986). Nuc
leoside H-phosphonates : Valuable intermediatesin
the synthesis of oligonucleotides. Tetrahedron Let
t. 27, 469-472などに記載されている。なお、本発明で
用いる合成ポリヌクレオチドは、増幅効率を考慮すると
短いもののほうが好ましく、例えば、６０〜１５０me
r、より好ましくは、６０〜１００merのサイズを有す
る。本発明で用いる合成ポリヌクレオチドのヌクレオチ
ドの数は特に限定されないが、通常６０〜２００個、好
ましくは６０〜１００個である。The synthetic polynucleotide of the present invention includes:
A synthetic polynucleotide having the same base sequence as the target nucleic acid or a part of its base sequence, and having the same sequence as a standard product obtained by conventional biosynthesis can be used. Such standard products include 18S ribosomal RNA, acidic ribosomal protein, beta-actin, cyclophilin,
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Gl
yceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), phosphoglycerokinase (Phosphoglycerokinase), beta 2
-Microglobulin, beta-
Glucuronidase, Hypoxanthine Ribosyl
Transferase), transcription factor IID (Transcription Fact)
or IID) / TATA Binding Facto
r), Transferrin receptor
tor) and the like. Those skilled in the art can easily synthesize the standard polynucleotide of the present invention by chemical synthesis based on the known sequence. Known methods for synthesizing polynucleotides include, for example, the phosphoamidide method and the H-phosphate method. For the phosphoamidide method, for example, Wu, T., Ogilvie, KK,
and Pon, RT (1989). Prevention of chain cleavage i
n the chemical synthesis of 2'-O-silylated oligori
bonucleotides. Nucl. Acids Res. 17, 3501-3517; St
awinski, J., Stromberg, R., Thelin, M., and Westman, E ..
(1988); Studies on the t-butyldimethyl-silyl gro
up as 2'-O-protection in oligoribonucleotide synth
esis via the H-phosphonate approach.Nucl. Acids Re
s. 16, 9285-9288; Scaringe, SA.A., Franklyn, C., an
d Usman, N. (1990). Chemical synthesis of biologica
lly active oligoribinucleotides using b-cyanoethyl
protected ribonucleoside phosphoramidites.Nucl. A
cids Res. 18, 5433-5441; Chaix, C., Molko, D. and T
eoule, R. (1989) .The use of labile base protecting
groups in oligoribonucleotide synthesis.Tetrahedr
on Lett. 30, 71-74; Gasparutto, D., Livache, T., Bazi
n, H., Duplaa, AM, Guy, A., Khorlin, A., Molko, D., Roget,
A., and Teoule, R. (1992); Chemical synthesis of ab
iologically active natural tRNA with its minor bas
es. Nucleic Acids Res. 20, 5159-5166; Vinayak, R.,
Anderson, P. McCollum, C., and Hampel, A. (1992). Chem
ical synthesis of RNA using fast oligonucleotide de
protection chemistry.Tetrahedron Lett. 31, 7269-727
2, etc. The H-phosphate method is described in, for example, Garegg, PJ, Regberg, T., Sta.
winski, J. and Stromberg, R. (1985). Formation of in
ternucleotidic bonds via phosphonate intermediate
s. Chem. Scripta 25, 280-282; Garegg, PJ, Regber
g, T., Stawinski, J. and Stromberg, R. (1986). Nucleo
side hydrogen phosphonates in oligonucleotide synth
esis. Chem. Scripta 26, 59-62; Garegg, PJ, Lidh,
I., Regberg, T., Stawinski, J. and Stromberg, R. (198
6); Nucleoside H-phosphonates.III.Chemicalsynthes
is of oligodeoxyribonucleotides by the hydrogenpho
sphonateapproach. Tetrahedron Lett. 27, 4051-405
4; Froehler, BC, Ng, PG, and Matteucci, MD (198
6). Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phospho
nate intermediates. Nucleic Acids Res. 14, 5399-54
07 ； Froehler, BC, and Matteucci, MD (1986). Nuc
leoside H-phosphonates: Valuable intermediatesin
the synthesis of oligonucleotides. Tetrahedron Let
t. 27, 469-472, etc. The synthetic polynucleotide used in the present invention is preferably short in consideration of amplification efficiency, and for example, 60 to 150 me.
r, more preferably 60-100 mer in size. The number of nucleotides of the synthetic polynucleotide used in the present invention is not particularly limited, but is usually 60 to 200, preferably 60 to 100.

【０００９】（核酸定量キット）本発明において用いら
れる核酸定量キットは、上記標準品としての合成ポリヌ
クレオチドを含むものであり、さらには標的核酸に対応
する少なくとも一対のプライマー対、標的核酸に対応す
るプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液等を含んでい
てもよい。これらのキットは、必要に応じて、例えば、
プライマー伸長生成物の合成を触媒する薬剤、基質のヌ
クレオシド三リン酸塩、標識に使用する手段（例えば、
標識がビオチンならば、アビジン−酵素抱合体及び酵素
の基質及び色素原）、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーショ
ン反応に適した緩衝液などを含むことができる。(Nucleic Acid Quantification Kit) The nucleic acid quantification kit used in the present invention contains the synthetic polynucleotide as the standard product, and further corresponds to at least a pair of primer pairs corresponding to the target nucleic acid and the target nucleic acid. It may contain a probe, a DNA polymerase, a buffer solution and the like. These kits, if necessary, for example,
Agents that catalyze the synthesis of primer extension products, substrate nucleoside triphosphates, means used for labeling (eg,
If the label is biotin, it may include avidin-enzyme conjugate and enzyme substrate and chromogen), a buffer suitable for PCR or hybridization reaction, and the like.

【００１０】ここで、本発明において用いられる「標的
核酸に対応するプライマー対」とは、標的遺伝子の配列
（又は標的ｍＲＮＡをコードする遺伝子配列）のエクソ
ン領域の一方の鎖に相補的又は実質的に相補的である第
１のプライマーおよび該標的遺伝子配列のエクソン領域
の他方の鎖に相補的又は実質的に相補的である第２のプ
ライマーから成るプライマーの一対をいう。この第１の
プライマーと第２のプライマーに挟まれるエクソン部分
が増幅される。The term "primer pair corresponding to a target nucleic acid" as used in the present invention means a sequence complementary to or substantially one strand of the exon region of the target gene sequence (or the gene sequence encoding the target mRNA). And a second primer that is complementary or substantially complementary to the other strand of the exon region of the target gene sequence. The exon portion sandwiched between the first primer and the second primer is amplified.

【００１１】本発明においては、これらのプライマー対
を少なくとも１対以上使って、標的核酸の増幅を行う。In the present invention, the target nucleic acid is amplified by using at least one pair of these primer pairs.

【００１２】標的核酸を増幅させるためのプライマー対
または標準品を増幅させるためのプライマー対は、その
標的核酸の配列に基づいて当業者であれば容易に設計す
ることができる（例えば、Genome Res. 1996 Oct;6(1
0):986-94参照）。A primer pair for amplifying a target nucleic acid or a primer pair for amplifying a standard product can be easily designed by those skilled in the art based on the sequence of the target nucleic acid (for example, Genome Res. 1996 Oct; 6 (1
0): 986-94).

【００１３】例えば、標的核酸として、ｈＭＯＲ１ ｃ
ＤＮＡが選択される場合は、ｈＭＯＲ１ ｃＤＮＡ（配
列番号１）の１１２９〜１２１０位の相補配列のものを
化学合成して標準品とすることができる。この場合は、
上流プライマーとして5′-CCTTGGTTACAATCCCAGAAACTAC-
3′（配列番号：２）を、下流プライマーとして5′-AGG
CAGCTGTTTGTGTAACCTAGA-3′（配列番号：３）を用いる
ことができる。For example, as the target nucleic acid, hMOR1 c
When a DNA is selected, a hMOR1 cDNA (SEQ ID NO: 1) having a complementary sequence at positions 1129 to 1210 can be chemically synthesized and used as a standard product. in this case,
5'-CCTTGGTTACAATCCCAGAAACTAC- as upstream primer
3 '(SEQ ID NO: 2) is used as 5'-AGG as a downstream primer
CAGCTGTTTGTGTAACCTAGA-3 '(SEQ ID NO: 3) can be used.

【００１４】本発明において用いられる標的核酸に対応
するプローブまたは標準品である合成ポリヌクレオチド
に対応するプローブは、標的配列に応じて当業者に容易
に設計できる（例えば、Genome Res. 1996 Oct;6(10):9
86-94参照）。例えば、標的核酸に対応するプローブ
は、標的核酸のうち第１プライマーと第２プライマーに
挟まれる領域の核酸からなるプローブである。合成ポリ
ヌクレオチドに対応するプライマーは、合成ポリヌクレ
オチドのうち第１プライマーと第２プライマーに挟まれ
る領域の核酸からなるプローブである。本発明において
用いられる適当なオリゴヌクレオチドプローブは、好ま
しくは約１５〜約５０ヌクレオチドの長さを有し、より
好ましくは約２５〜約３５ヌクレオチドの長さを有す
る。オリゴヌクレオチドプローブは、生化学的、免疫化
学的、又は化学的な手段によって検出可能な化学物質等
を組込むことによって標識することができる。有用な標
識としては、³²Ｐ等の放射性同位元素、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネート等の蛍光物質、
ルミノール、ルシフェリン等の発光物質、β−ガラクト
シダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ等の酵素、ビオチン、および抗体等があげられる。な
かでも、蛍光物質で標識された蛍光プローブ、³²Ｐで標
識されたリン酸化プローブなどが好ましく用いられる。The probe corresponding to the target nucleic acid used in the present invention or the probe corresponding to the standard synthetic polynucleotide can be easily designed by those skilled in the art according to the target sequence (eg, Genome Res. 1996 Oct; 6). (10): 9
See 86-94). For example, the probe corresponding to the target nucleic acid is a probe composed of the nucleic acid in the region between the first primer and the second primer in the target nucleic acid. The primer corresponding to the synthetic polynucleotide is a probe composed of the nucleic acid in the region between the first primer and the second primer in the synthetic polynucleotide. Suitable oligonucleotide probes for use in the present invention preferably have a length of about 15 to about 50 nucleotides, more preferably about 25 to about 35 nucleotides. The oligonucleotide probe can be labeled by incorporating a chemical substance or the like that can be detected by biochemical, immunochemical, or chemical means. Useful labels include radioactive isotopes such as ³² P, fluorescent substances such as fluorescamine and fluorescein isothiocyanate,
Examples thereof include luminescent substances such as luminol and luciferin, enzymes such as β-galactosidase, peroxidase and alkaline phosphatase, biotin, and antibodies. Among them, a fluorescent probe labeled with a fluorescent substance and a phosphorylated probe labeled with ³² P are preferably used.

【００１５】本発明において用いられるＤＮＡポリメラ
ーゼとしては、逆転写活性および５'→３'エキソヌクレ
アーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例え
ば、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。The DNA polymerase used in the present invention includes a thermostable DNA polymerase having reverse transcription activity and 5 '→ 3' exonuclease activity, such as Tth DNA polymerase.

【００１６】本発明においては、公知のあるいは市販さ
れている緩衝液が用いられる（例えば、PEBiosystems社
製緩衝液；Genome Res. 1996 Oct;6(10):986-94参
照）。In the present invention, a known or commercially available buffer is used (see, for example, PE Biosystems buffer; Genome Res. 1996 Oct; 6 (10): 986-94).

【００１７】なお、定量キットに含まれる各種試薬など
の量は、試料の量、標的核酸の種類などに応じて適宜決
定される。The amounts of various reagents and the like contained in the quantitative kit are appropriately determined depending on the amount of sample, the type of target nucleic acid and the like.

【００１８】本発明のより好ましい態様によれば、複数
の標的核酸を定量するための核酸定量キットであって、
複数の各反応場所、好ましくは複数の反応場所を有する
反応器具の各反応場所に、標的核酸に対応するプライマ
ー対をそれぞれ含む各増幅試薬を充填し、その標的核酸
に対応するプライマー対を充填していない反応場所に前
記請求項１〜４のいずれかに記載の標準品とその標準品
に対応するプライマー対を含む増幅試薬を充填してなる
核酸定量キットが提供される。この定量キットを用いる
ことにより、一度の操作で、試料中の複数の標的核酸の
有無およびその量を検出することができる。複数の反応
場所とは、２つ以上の反応場所であれば特に限定されば
いが、通常２〜数万個、好ましくは２〜１０００個、よ
り好ましくは１０〜８００個、さらに好ましくは１０〜
３００個の反応場所である。According to a more preferred embodiment of the present invention, there is provided a nucleic acid quantification kit for quantifying a plurality of target nucleic acids,
A plurality of reaction sites, preferably each reaction site of a reaction instrument having a plurality of reaction sites, is filled with each amplification reagent containing a primer pair corresponding to the target nucleic acid, and the primer pair corresponding to the target nucleic acid is packed. There is provided a nucleic acid quantification kit in which an amplification reagent containing the standard product according to any one of claims 1 to 4 and a primer pair corresponding to the standard product is filled in an unreacted reaction place. By using this quantification kit, the presence or absence and the amount of a plurality of target nucleic acids in a sample can be detected by a single operation. The plurality of reaction places are not particularly limited as long as they are two or more reaction places, but are usually 2 to tens of thousands, preferably 2 to 1000, more preferably 10 to 800, and further preferably 10 to 10.
300 reaction sites.

【００１９】この態様では、複数の反応場所を有する反
応器具が用いられ、標的核酸を含み得る試料および一連
の既知濃度に設定された合成ヌクレオチドからなる標準
品と各増幅試薬とのそれぞれの反応は、各反応場所で行
われる。標準品の濃度はいずれでもよいが10¹コピーか
ら10⁷コピー程度が各容器に入っていることが好まし
い。各増幅試薬は、標的核酸またはその合成ポリヌクレ
オチドを増幅することができるプライマー対をそれぞれ
含む。ここで用いられる反応器具は、試料と各増幅試薬
とを一度に反応させることができるように、２つ以上の
反応場所を有している限り、反応器具の構成及び構造は
限定されない。好ましくは、本発明において用いられる
反応器具として、例えば、複数の穴を有するプレート、
複数のスライドグラスを備えてなる反応器具、複数の試
験管を備えてなる反応器具などが挙げられる。実験スペ
ース、操作性等を考慮した場合は、複数の穴を有するプ
レートを好ましく用いることができる。これらのプレー
トは、使用する増幅試薬の数によって決められるが、市
販されている９６穴または３８４穴プレートが好ましく
用いられる。しかし、増幅試薬の数に応じて所望の数の
反応場所を設けた反応器具を使うことができる。In this embodiment, a reaction instrument having a plurality of reaction sites is used, and each reaction between each amplification reagent and a sample containing a target nucleic acid and a series of synthetic nucleotides set to known concentrations is performed. , At each reaction site. The concentration of the standard product may be any, but it is preferable that about 10 ¹ to 10 ⁷ copies are contained in each container. Each amplification reagent includes a primer pair capable of amplifying the target nucleic acid or its synthetic polynucleotide. The configuration and structure of the reaction instrument used here is not limited as long as it has two or more reaction sites so that the sample and each amplification reagent can be reacted at one time. Preferably, as the reaction instrument used in the present invention, for example, a plate having a plurality of holes,
Examples include a reaction instrument including a plurality of slide glasses and a reaction instrument including a plurality of test tubes. In consideration of experimental space, operability, etc., a plate having a plurality of holes can be preferably used. These plates are determined by the number of amplification reagents used, but commercially available 96-well or 384-well plates are preferably used. However, it is possible to use a reaction device provided with a desired number of reaction sites depending on the number of amplification reagents.

【００２０】増幅試薬の数は、標的核酸の数に応じて調
整されるので、特に限定されないが、例えば、１０〜８
００種類の増幅試薬および標的に応じた合成オリゴヌク
レオチドからなる標準品を含んでなる定量キットが提供
される。本発明の他の態様によれば、１０〜３００種類
の増幅試薬および標的に応じた合成オリゴヌクレオチド
からなる標準品を含んでなる定量キットが提供される。
増幅試薬の数が多い場合は、異なるセットの増幅試薬を
複数枚のプレート（例えば、２〜１０枚のプレート）に
分けてセットしておき、定量反応を複数回に分けて行う
こともできる。The number of amplification reagents is adjusted according to the number of target nucleic acids and is not particularly limited.
A quantification kit is provided which comprises a standard consisting of 00 kinds of amplification reagents and synthetic oligonucleotides depending on the target. According to another aspect of the present invention, there is provided a quantification kit comprising 10 to 300 kinds of amplification reagents and a standard product comprising a synthetic oligonucleotide depending on a target.
When the number of amplification reagents is large, different sets of amplification reagents can be set separately on a plurality of plates (for example, 2 to 10 plates), and the quantitative reaction can be performed in a plurality of times.

【００２１】（核酸の定量方法）次に、本発明の核酸定
量方法について説明する。本発明の核酸を定量する方法
においては、試料に標的核酸に対応する一対のプライマ
ー対とをそれぞれ含む増幅試薬を加え、標準品としての
化学合成ポリヌクレオチドにその合成ポリヌクレオチド
に対応する一対のプライマー対を含む増幅試薬を加え
て、それぞれ増幅反応を行い、増幅された標準品の量と
増幅された標的核酸の量を測定し、これらの情報に基づ
いて増幅前の標的核酸の量を計算する。(Nucleic acid quantification method) Next, the nucleic acid quantification method of the present invention will be described. In the method for quantifying a nucleic acid of the present invention, an amplification reagent containing a pair of primer pairs corresponding to a target nucleic acid is added to a sample, and a pair of primers corresponding to the synthetic polynucleotide is added to a chemically synthesized polynucleotide as a standard product. Amplification reagents containing pairs are added, and each amplification reaction is performed, the amount of standard product amplified and the amount of target nucleic acid amplified are measured, and the amount of target nucleic acid before amplification is calculated based on this information. .

【００２２】[試料及び標的核酸]まず、本発明において
対象となる試料は、標的となる核酸を含み得る試料であ
ればよく、特に限定されない。本発明の対象となる試料
は、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラ
ット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）の組織あるいはその培養細胞株から採取
したｍＲＮＡ試料である。このような組織として、例え
ば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、
海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小
脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒
質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、
甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管
（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下
腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎
盤、子宮、骨、関節、骨格筋などが挙げられる。このよ
うなｍＲＮＡ試料を用いて、その試料中に含まれる標的
ｍＲＮＡを定量することによって、ｍＲＮＡ試料を採取
した部位における標的遺伝子の発現レベルを解析するこ
とができる。[Sample and Target Nucleic Acid] First, the target sample in the present invention is not particularly limited as long as it is a sample that can contain a target nucleic acid. The sample of the present invention is, for example, mRNA collected from a tissue of human or other mammals (eg, rat, mouse, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc.) or a cultured cell line thereof. It is a sample. As such a tissue, for example, the brain, each part of the brain (eg, olfactory bulb, squamous nucleus, basal sphere,
Hippocampus, thalamus, hypothalamus, subthalamic nucleus, cerebral cortex, medulla oblongata, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, Kidneys, liver, gonads,
Thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cells, prostate, testis, testis, ovary, The placenta, uterus, bones, joints, skeletal muscles and the like can be mentioned. By using such an mRNA sample and quantifying the target mRNA contained in the sample, the expression level of the target gene at the site where the mRNA sample was collected can be analyzed.

【００２３】また、ある特定の疾患を罹患している患者
由来のｍＲＮＡ試料を用いれば、その疾患に関与してい
る遺伝子（例えば、ＧＰＣＲ遺伝子）の特定が容易とな
る。特に、複数の遺伝子が関与しているといわれる癌な
どの多遺伝子関与疾患に関与するＧタンパク質共役型レ
セプター、チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオン
チャンネル遺伝子を特定する場合は、本発明によれば、
各遺伝子の発現レベルを一度の定量操作で調べることが
できるので、関与遺伝子・タンパク質の特定が容易とな
る。Further, by using an mRNA sample derived from a patient suffering from a particular disease, it becomes easy to identify a gene involved in the disease (eg, GPCR gene). In particular, in the case of identifying a G protein-coupled receptor, a tyrosine phosphatase-type receptor, or an ion channel gene involved in a multigene-related disease such as cancer that is said to involve a plurality of genes, according to the present invention,
Since the expression level of each gene can be examined by a single quantitative operation, the involved genes / proteins can be easily identified.

【００２４】本発明においては、上述したとおり、本発
明の合成ポリヌクレオチドを試料中の特定の標的核酸の
定量・検出用標準品として用いることにより、（１）複
数の遺伝子個々の発現量をまとめて定量解析することに
より、ある細胞または組織においてその発現が特徴的に
亢進または減少している遺伝子を同定したり、（２）特
定の遺伝子ファミリーに属する複数の遺伝子の発現解析
をまとめて行うことにより、その遺伝子ファミリーの中
で、ある細胞または組織においてその発現が特徴的に亢
進または減少している遺伝子を、その発現量の絶対値を
算出することで同定することができる。複数の遺伝子と
は、２個以上の遺伝子を意味し、上限は実施可能な限
り、特に限定されないが、通常２〜数万個、好ましくは
２〜１０００個、より好ましくは１０〜８００個、さら
に好ましくは１０〜３００個の遺伝子である。ここで、
「遺伝子の発現が特徴的に亢進または減少している」と
は、正常細胞または組織における遺伝子の発現と比較し
て、生理学的有意さがみられる程度に大量にまたは少量
に発現していることをいう。本発明において標的とする
遺伝子ファミリーは、特に限定されないが、例えば、Ｇ
タンパク質共役型レセプター遺伝子ファミリー、チロシ
ンリン酸化酵素型レセプター遺伝子ファミリー、イオン
チャネル遺伝子ファミリー、または転写因子、トランス
ポーター、プロテインキナーゼ、プロテインフォスファ
ターゼ、プロテアーゼ、ヒートショックプロテイン、Ａ
ＴＰａｓｅもしくはＤＮＡ結合プロテインのいずれかに
関連する遺伝子ファミリーなどから選択される。遺伝子
発現量の定量または遺伝子発現量の絶対値の算出は、後
述する標的ｍＲＮＡの定量法に従って行うことが出来
る。In the present invention, as described above, by using the synthetic polynucleotide of the present invention as a standard product for quantification / detection of a specific target nucleic acid in a sample, (1) the expression levels of a plurality of genes are summarized. To identify genes whose expression is characteristically increased or decreased in a certain cell or tissue, and (2) collectively analyze the expression of multiple genes belonging to a specific gene family. Thus, a gene whose expression is characteristically increased or decreased in a certain cell or tissue can be identified in the gene family by calculating the absolute value of the expression amount. A plurality of genes means two or more genes, and the upper limit is not particularly limited as long as it is practicable, but is usually 2 to tens of thousands, preferably 2 to 1000, more preferably 10 to 800, and It is preferably 10 to 300 genes. here,
"The expression of a gene is characteristically up-regulated or decreased" means that the gene is expressed in a large amount or in a small amount so as to have physiological significance as compared with the expression of the gene in normal cells or tissues. . The gene family targeted in the present invention is not particularly limited, but for example, G
Protein coupled receptor gene family, tyrosine phosphatase type receptor gene family, ion channel gene family, or transcription factor, transporter, protein kinase, protein phosphatase, protease, heat shock protein, A
It is selected from the gene family related to either TPase or DNA binding protein. The quantification of the gene expression amount or the calculation of the absolute value of the gene expression amount can be performed according to the method for quantifying the target mRNA described later.

【００２５】また、本発明によれば、遺伝子組換え食品
に含有されるＤＮＡを標的核酸とすることによって、遺
伝子組換え食品の検査、または遺伝子組換え技術を使用
せずに得られた自然食品に、組換え遺伝子が混入してい
るか否かの判定を行うことができる。なお、公知の遺伝
子組換え食品としては、大豆、ジャガイモ、トウモロコ
シ、トマト、パパイヤなどが知られている。そして、そ
の組換え遺伝子、これを検出するためのプライマー対、
一般的定量方法なども公知であり、例えば、「ＪＡＳ分
析試験ハンドブック 遺伝子組換え食品検査・分析マニ
ュアル 定量的ＰＣＲ編」、平成１３年４月、東京農林
水産消費技術センター発行などに記載されている。例え
ば、トウモロコシＣＢ３５１検出用として、５'―CCT T
CG CAA GAC CCT TCC TCT ATA―３'（配列番号：５）と
５'―GTA GCT GTC GGT GTA GTC CTC GT―３'（配列番
号：６）からなるプライマー対が知られている。また、
パパイヤ５５−１検出用として、５'−TTA CGG CGA GTT
CTG TTA GG−３'（配列番号：７）と５'−CAT GTG CCT
GAG AAA TAG GC―３'（配列番号：８）からなるプライ
マー対が知られている。また、ジャガイモNew Leaf Y検
出用として、５'−AAA AGA GCTGTC CTG ACA GC−３'
（配列番号：９）と５'−TCC TCC TGC ATC AAT TGT GT
−３'（配列番号：１０）からなるプライマー対が知ら
れている。Further, according to the present invention, by using the DNA contained in the genetically modified food as the target nucleic acid, the natural food obtained without using the inspection of the genetically modified food or the gene recombination technique. It is possible to determine whether or not the recombinant gene is mixed. As known genetically modified foods, soybean, potato, corn, tomato, papaya and the like are known. And the recombinant gene, a primer pair for detecting this,
General quantification methods are also known, and are described in, for example, “JAS analysis test handbook, genetically modified food inspection / analysis manual, quantitative PCR”, April 2001, published by Tokyo Agriculture, Forestry and Fisheries Consumption Technology Center. . For example, for detecting corn CB351, 5'-CCT T
A primer pair consisting of CG CAA GAC CCT TCC TCT ATA-3 '(SEQ ID NO: 5) and 5'-GTA GCT GTC GGT GTA GTC CTC GT-3' (SEQ ID NO: 6) is known. Also,
5'-TTA CGG CGA GTT for detecting papaya 55-1
CTG TTA GG-3 '(SEQ ID NO: 7) and 5'-CAT GTG CCT
A primer pair consisting of GAG AAA TAG GC-3 '(SEQ ID NO: 8) is known. In addition, 5'-AAA AGA GCTGTC CTG ACA GC-3 'for detecting potato New Leaf Y
(SEQ ID NO: 9) and 5'-TCC TCC TGC ATC AAT TGT GT
A primer pair consisting of -3 '(SEQ ID NO: 10) is known.

【００２６】本発明のほかの態様によれば、標的核酸
は、Ｇタンパク質共役型レセプター、チロシンリン酸化
酵素型レセプター、イオンチャネルなどをコードする遺
伝子ＤＮＡ又はそのｍＲＮＡである。この場合、標的Ｇ
タンパク質共役型レセプター、チロシンリン酸化酵素型
レセプター、イオンチャンネルなどのファミリーに属す
る遺伝子のｍＲＮＡに対応するプライマー対を含んでな
る各増幅試薬とｍＲＮＡ試料とを、反応器具の各反応場
所において接触させることにより、増幅反応させ、ｍＲ
ＮＡ増幅生成物を定量することによって、そのｍＲＮＡ
試料中に含まれていたＧタンパク質共役型レセプター、
チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオンチャンネル
などのファミリーに属する遺伝子の発現量を測定するこ
とができる。According to another aspect of the present invention, the target nucleic acid is a gene DNA encoding a G protein-coupled receptor, a tyrosine phosphatase type receptor, an ion channel or the like, or its mRNA. In this case, the target G
Contacting each amplification reagent comprising a primer pair corresponding to mRNA of a gene belonging to the family of protein-coupled receptor, tyrosine phosphatase receptor, ion channel, etc. with an mRNA sample at each reaction site of a reaction instrument Amplification reaction by
By quantifying the NA amplification product, its mRNA
A G protein-coupled receptor contained in the sample,
It is possible to measure the expression level of genes belonging to the family of tyrosine phosphatase type receptors, ion channels and the like.

【００２７】本発明の他の態様によれば、全ての公知の
Ｇタンパク質共役型レセプター、チロシンリン酸化酵素
型レセプター、イオンチャンネルなどのファミリーに属
する遺伝子のｍＲＮＡに対応するプライマー対を全て準
備し、そのプライマー対をそれぞれ含む増幅試薬を各反
応場所にセットしておけば、一度の定量作業で、ｍＲＮ
Ａ試料中において、どのＧタンパク質共役型レセプタ
ー、チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオンチャン
ネルなどのファミリーに属する遺伝子のｍＲＮＡがどの
程度産生していたかを知ることができる。勿論、必要に
応じて、異なるセットの増幅試薬を複数枚のプレートに
分けてセットしておき、定量反応を複数回に分けて行う
こともできる。According to another aspect of the present invention, all known primer pairs corresponding to mRNAs of genes belonging to the family of known G protein-coupled receptors, tyrosine phosphatase receptors, ion channels and the like are prepared, If amplification reagents containing each of the primer pairs are set at each reaction location, mRN
It is possible to know which G protein-coupled receptor, tyrosine phosphatase-type receptor, ion channel, etc. mRNA of a gene belonging to the family was produced in the A sample. Of course, if necessary, different sets of amplification reagents can be set separately on a plurality of plates, and the quantitative reaction can be performed in a plurality of times.

【００２８】本発明の他の態様によれば、ある一群のＧ
タンパク質共役型レセプター、チロシンリン酸化酵素型
レセプター、またはイオンチャネルのファミリーに属す
る遺伝子のｍＲＮＡに対応する一群のプライマー対を用
いることにより、一度の定量操作で、その一群のＧタン
パク質共役型レセプター、チロシンリン酸化酵素型レセ
プター、またはイオンチャネルなどのファミリーに属す
る遺伝子のなかで高発現しているＧタンパク質共役型レ
セプター、チロシンリン酸化酵素型レセプター、または
イオンチャネルなどのファミリーに属する遺伝子を特定
することができる。なお、現在、Ｇタンパク質共役型レ
セプター（または遺伝子）として次のものが公知であ
る。 （１）アセチルコリンレセプター： M₁; M₂; M₃; M₄;
M₅ （２）アデノシンレセプター： A₁; A_2A; A_2B; A₃ （３）アドレノセプター（Adrenoceptors）： α1A;
α1B; α1D; α2A; α2B;α2C; β1; β2; β3 （４）アンギオテンシンレセプター： AT1; AT2 （５）ボンベシン（Bombesin）レセプター： BB1; BB
2; bb3 （６）ブラジキニンレセプター： B₁; B₂ （７）カルシトニン・アイニリン・ＣＧＲＰ及びアドレ
ノメヅリン（adrenomedullin）レセプター： （８）カンナビノイドレセプター： CB1;CB2 （９）ケモカインレセプター： CCR1; CCR2; CCR3; CC
R4; CCR5; CCR6; CCR7;CCR8; CCR9; CCR10; CXCR1; CXC
R2; CXCR3; CXCR4; CXCR5; CX₃CR1; XCR1; （１０）ケニオタクチックペプチド（Cheniotactic）レ
セプター： C3a; C5a; fMLP （１１）コレシストキニン及びガストリン（Cholecysto
kinin and gastrin）レセプター： CCK₁; CCK₂ （１２）コーチコトロピン放出因子（Corticotropin-re
leasing factor）レセプター： CRF₁; CRF₂ （１３）ドーパミンレセプター： D1; D2; D3; D4; D5 （１４）エンドセリンレセプター： ET_A; ET_B （１５）ガラニンレセプター（Galanin receptors）：
GAL1; GAL2; GAL3 （１６）グルタメートレセプター： mglu₁; mglu₂; mg
lu₃; mglu₄; mglu₅; mglu₆; mglu₇; mglu₈ （１７）グリコプロテインホルモン（Glycoprotein hor
mone）レセプター： FSH; LSH; TSH （１８）ヒスタミンレセプター： H₁; H₂; H₃; H₄ （１９）５−ＨＴレセプター： 5-HT_1A; 5-HT_1B; 5-HT
_1D; 5-ht_1B; 5-ht_1F;5-HT_2A; 5-HT_2F; 5-HT_2C; 5-HT₃;
5-HT₄; 5-ht_5A; 5-ht_5B; 5-HT₆; 5-HT₇ （２０）ロイコトリエンレセプター： BLT; CysLT₁; C
ysLT₂ （２１）リソフォスフォリピッド（Lysophospholipid）
レセプター： edg1; edg2; edg3; edg4 （２２）メラノコーリン（Melanocorlin）レセプター：
MC₁; MC₂; MC₃; MC₄; MC ₅ （２３）メラトニンレセプター： MT₁; MT₂; MT₃ （２４）ニューロペプチドYレセプター： Y₁; Y₂; Y₄;
Y₅; Y₆ （２５）ニューロテンション（Neurotension）レセプタ
ー： NTS1; NTS2 （２６）オピオイド： DOP; KOP; MOP; NOP （２７）P2Y レセプター： P2Y₁; P2Y₂; P2Y₄; P2Y₆;
P2Y₁₁; P2Y₁₂ （２８）パーオキシソームプロリフェレータ（Peroxiso
me proliferator）活性化レセプター： PPAR-α; PPAR
-β; PPAR-γ （２９）プロスタノイド（Prostanoid）レセプター：
DP; FP; IP; TP; EP₁; EP₂; EP₃; EP₄ （３０）プロテアーゼ活性化（Protease-activated）レ
セプター： PAR1; PAR2; PAR3; PAR4 （３１）ソマトスタチン（Somatotatin）レセプター：
sst₁; sst₂; sst₃; sst ₄; sst₅ （３２）タチキニン（Tachykinin）レセプター： NK₁;
NK₂; NK₃ （３３）チロトロピン放出ホルモン（Thyrotropin-rele
asing hormone）レセプター： TRH₁; TRH₂ （３４）ウロテンシン-II（Urotensin-II）レセプタ
ー： （３５）バソアクティブインテスティナルペプチド（Va
soactive intestinal peptide）及びピチュイタリアデ
ニレートサイクラーゼ活性ペプチド（pituitary adenyl
ate cyclase activating peptide）レセプター： VPAC
₁; VPAC₂; PAC₁ （３６）バソプレシン（Vasopressin）及び オキシトシ
ン（oxytocin）レセプター： V_1a; V_1b; V₂; OT また、現在、チロシンリン酸化酵素型レセプター、イオ
ンチャンネル遺伝子などのファミリーに属する遺伝子と
して、次のものが公知である。 （３７）イオンチャネル： Na⁺チャネル（タイプI; タ
イプII/タイプIIA; タイプIII; SCL11/NaG; PN1; NaCh
6; NaDRG; SkM1/μ1, SkM2）、K⁺チャネル（Kv; EAG; K
QT; IRK; ROMK; GIRK; K_ATP等）、Ca²⁺チャネル（α1G;
α1E; α1S: α1C; α1D; α1B; α1A; IP3; リアノジ
ンレセプターなど）、Cl^-チャネル（GABA_A;GABA_C; グリ
シンレセプター；C1C0; C1C1; CFTRなど）、非選択性カ
チオンチャネル（nAChR; 5-HT₃; NMDA; AMPA; P_2XATP;
CNGなど）など （３８）チロシンリン酸化酵素レセプター：インスリン
レセプター；EGFレセプターなどAccording to another aspect of the invention, a group of G
Protein-coupled receptor, tyrosine phosphatase type
Belongs to the family of receptors or ion channels
Use a group of primer pairs corresponding to the mRNA of the gene
By doing so, a group of G tanks can be
Protein-coupled receptor, tyrosine phosphatase-type receptor
Family, such as
G protein-coupled gene that is highly expressed among the genes
Scepter, tyrosine phosphatase receptor, or
Identify genes belonging to families such as ion channels
can do. Currently, G protein-coupled
The following are known as scepters (or genes)
It (1) Acetylcholine receptor: M₁; M₂; M₃; M_Four;
M_Five (2) Adenosine receptor: A₁; A_2A; A_2B; A₃ (3) Adrenoceptors: α1A;
α1B; α1D; α2A; α2B; α2C; β1; β2; β3 (4) Angiotensin receptor: AT1; AT2 (5) Bombesin receptor: BB1; BB
2; bb3 (6) Bradykinin receptor: B₁; B₂ (7) Calcitonin, Ainiline, CGRP and adre
Adrenomedullin receptor: (8) Cannabinoid receptors: CB1; CB2 (9) Chemokine receptors: CCR1; CCR2; CCR3; CC
R4; CCR5; CCR6; CCR7; CCR8; CCR9; CCR10; CXCR1; CXC
R2; CXCR3; CXCR4; CXCR5; CX₃CR1; XCR1; (10) Keniotactic peptide
Scepter: C3a; C5a; fMLP (11) Cholecystokinin and gastrin (Cholecysto
kinin and gastrin) Receptor: CCK₁; CCK₂ (12) Corticotropin-releasing factor
leasing factor) Receptor: CRF₁; CRF₂ (13) Dopamine receptors: D1; D2; D3; D4; D5 (14) Endothelin receptor: ET_AET_B (15) Galanin receptors:
  GAL1; GAL2; GAL3 (16) Glutamate receptor: mglu₁; mglu₂; mg
lu₃; mglu_Four; mglu_Five; mglu₆; mglu₇; mglu₈ (17) Glycoprotein hor
mone) Receptor: FSH; LSH; TSH (18) Histamine receptor: H₁; H₂; H₃; H_Four (19) 5-HT receptor: 5-HT_1A5-HT_1B5-HT
_1D; 5-ht_1B; 5-ht_1F; 5-HT_2A5-HT_2F5-HT_2C5-HT₃;
5-HT_Four; 5-ht_5A; 5-ht_5B5-HT₆5-HT₇ (20) Leukotriene receptor: BLT; CysLT₁; C
ysLT₂ (21) Lysophospholipid
Receptors: edg1; edg2; edg3; edg4 (22) Melanocorlin receptor:
MC₁; MC₂; MC₃; MC_Four; MC _Five (23) Melatonin receptor: MT₁; MT₂; MT₃ (24) Neuropeptide Y receptor: Y₁; Y₂; Y_Four;
 Y_Five; Y₆ (25) Neurorotension receptor
-: NTS1; NTS2 (26) Opioid: DOP; KOP; MOP; NOP (27) P2Y receptor: P2Y₁; P2Y₂; P2Y_Four; P2Y₆;
P2Y₁₁; P2Y₁₂ (28) Peroxisome proreflator (Peroxiso
me proliferator) activation receptor: PPAR-α; PPAR
-β; PPAR-γ (29) Prostanoid receptor:
DP; FP; IP; TP; EP₁EP₂EP₃EP_Four (30) Protease-activated
Scepter: PAR1; PAR2; PAR3; PAR4 (31) Somatotatin receptor:
  sst₁sst₂sst₃sst _Foursst_Five (32) Tachykinin receptor: NK₁;
 NK₂; NK₃ (33) Thyrotropin-rele
asing hormone) receptor: TRH₁; TRH₂ (34) Urotensin-II receptor
-: (35) Vasoactive intestinal peptide (Va
soactive intestinal peptide) and Picchu Italy
Nilate cyclase active peptide (pituitary adenylate
ate cyclase activating peptide) receptor: VPAC
₁; VPAC₂PAC₁ (36) Vasopressin and Oxytocin
Oxytocin receptor: V_1a; V_1b; V₂OT Currently, tyrosine phosphatase receptor
And genes belonging to the family such as
Then, the following are known. (37) Ion channel: Na⁺Channel (Type I;
Type II / Type IIA; Type III; SCL11 / NaG; PN1; NaCh
6; NaDRG; SkM1 / μ1, SkM2), K⁺Channel (Kv; EAG; K
QT; IRK; ROMK; GIRK; K_ATPEtc.), Ca²⁺Channel (α1G;
 α1E; α1S: α1C; α1D; α1B; α1A; IP3; Ryanoji
Receptor), Cl^-Channel (GABA_A; GABA_C; Green
Synreceptor; C1C0; C1C1; CFTR, etc.), non-selective
Thion channel (nAChR; 5-HT₃; NMDA; AMPA; P_2XATP;
CNG etc.) etc. (38) Tyrosine phosphatase: insulin
Receptor; EGF receptor, etc.

【００２９】本発明において用いられる核酸の定量方法
は、ヒトＧＰＣＲの機能解析、ＳＮＰ解析、遺伝子組換
え食品の判定以外にも種々の用途に用いることができ
る。例えば、判明している疾患遺伝子が産生するｍＲＮ
Ａを検出するプライマー対を含んでなる複数の増幅試薬
のセットを用いることにより、特定疾患の診断をするこ
とができる。本発明によれば、各遺伝子の発現レベルを
正確に測定することができるので、公知の方法と比較し
て、より正確な診断ができるという利点がある。The nucleic acid quantification method used in the present invention can be used for various purposes other than the functional analysis of human GPCR, SNP analysis and determination of genetically modified foods. For example, mRN produced by a known disease gene
A specific disease can be diagnosed by using a set of a plurality of amplification reagents containing a primer pair for detecting A. According to the present invention, since the expression level of each gene can be accurately measured, there is an advantage that more accurate diagnosis can be performed as compared with known methods.

【００３０】[核酸の増幅]本発明の定量方法において、
試料中に含まれ得る標的核酸は、その標的核酸を増幅さ
せるためのプライマー対を含む増幅試薬を用いて増幅さ
れる。本発明の好ましい態様によれば、標的核酸の増幅
は公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行わ
れる（米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８
３，２０２号；第４，９６５，１８８号など参照）。ｍ
ＲＮＡを標的とする場合、その標的ｍＲＮＡの増幅は、
最初に、例えばウィルスの逆転写酵素を用いて、標的ｍ
ＲＮＡを逆転写し、生じたｃＤＮＡを増幅することによ
って行うことができる。さらに好ましい態様において、
ｍＲＮＡの増幅は、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ）を用いて行われる（米国特許第５，３１
０，６５２号；第５，３２２，７７０号；第５，５６
１，０５８号；第５，６４１，８６４号；５，６９３，
５１７号等参照）。[Amplification of Nucleic Acid] In the quantification method of the present invention,
The target nucleic acid that may be included in the sample is amplified using an amplification reagent that includes a primer pair for amplifying the target nucleic acid. According to a preferred embodiment of the present invention, the amplification of the target nucleic acid is carried out using the known polymerase chain reaction (PCR) (US Pat. Nos. 4,683,195; 4,68).
No. 3,202; No. 4,965,188). m
When targeting RNA, amplification of the target mRNA is
First, target m using, for example, viral reverse transcriptase.
This can be done by reverse transcribing RNA and amplifying the resulting cDNA. In a further preferred embodiment,
Reverse transcription-polymerase chain reaction (R
T-PCR) (US Pat. No. 5,31).
No. 0,652; No. 5,322,770; No. 5,56
No. 1,058; No. 5,641,864; 5,693.
517, etc.).

【００３１】なお、本発明においては、前記ポリメラー
ゼ連鎖反応以外にも種々のｍＲＮＡ増幅法が用いられ
る。そのような増幅法として、例えば、鎖置換アッセイ
法（米国特許第５，４５５，１６６号など参照）、転写
に基づく増幅法（ＴＡＳ）（米国特許第５，４３７，９
９０号；第５，４０９，８１８号；第５，３９９，４９
１号等参照）、自立配列複製法（３ＳＲ）(ＷＯ９２／
０８８００等参照)などが挙げられる。これらの増幅反
応の反応条件は、使用する試薬の種類等に応じて、当業
者によって容易に設定することができる。In the present invention, various mRNA amplification methods other than the polymerase chain reaction are used. Such amplification methods include, for example, strand displacement assay (see US Pat. No. 5,455,166), transcription-based amplification (TAS) (US Pat. No. 5,437,9).
90; No. 5,409,818; No. 5,399,49
No. 1, etc.), self-supporting sequence replication method (3SR) (WO92 /
08800 etc.) and the like. The reaction conditions of these amplification reactions can be easily set by those skilled in the art according to the type of reagents used and the like.

【００３２】[標的核酸の定量]次に、本発明の定量方法
においては、核酸増幅生成物の生成量を定量する。増幅
生成物の定量は、好ましくはプローブを使用する方法に
よって行われる。好ましい態様によれば、蛍光物質によ
り標識したプローブを用いた方法によって行われる。[Quantification of Target Nucleic Acid] Next, in the quantification method of the present invention, the amount of nucleic acid amplification product produced is quantified. Quantification of the amplification product is preferably carried out by a probe-based method. According to a preferred embodiment, it is carried out by a method using a probe labeled with a fluorescent substance.

【００３３】本発明のより好ましい態様によれば、標的
ｍＲＮＡの定量は「ＴａｑＭａｎ法」又は「５’ヌクレ
アーゼアッセイ法」を用いて行われる（Proc. Natl. Ac
ad.Sci. USA、第88巻、第7276-7280頁（1991年）; 米国
特許第５，２１０，０１５号；第５，４８７，９７２
号；第５，８０４，３７５号など参照）。しかし、必要
に応じて、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ法、ハイブリダイゼ
ーション法などを用いることもできる。ＴａｑＭａｎア
ッセイ法において、５’末端を標識したプローブが用い
られる。また、このプローブは、プローブがＤＮＡ合成
のためのプライマーとして働くことを防ぐために３’末
端が修飾される。この修飾として、リン酸基、蛍光物質
等の末端への付加があげられる。標的ｍＲＮＡの増幅
は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ
ポリメラーゼ、例えばＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを用
いて行われる。前記プライマーの下流の標的ｍＲＮＡに
ハイブリダイズするプローブは、増幅反応の間、ＤＮＡ
ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によ
って分解される。新規に標的領域が増幅されるたびに、
プローブが分解され、プローブに修飾されていた標識物
質（例、リン酸基、蛍光物質）が遊離される。この遊離
される標識物質を定量することにより、標的ｍＲＮＡ量
が間接的に測定される。According to a more preferred embodiment of the present invention, the quantification of the target mRNA is carried out using the "TaqMan method" or the "5 'nuclease assay method" (Proc. Natl. Ac.
ad.Sci. USA, Vol. 88, 7276-7280 (1991); US Pat. No. 5,210,015; 5,487,972.
No. 5,804,375). However, if necessary, the SYBER Green method, the hybridization method and the like can be used. In the TaqMan assay, a 5'-end labeled probe is used. In addition, this probe is modified at the 3'end to prevent the probe from acting as a primer for DNA synthesis. Examples of this modification include addition of a phosphate group or a fluorescent substance to the end. Amplification of the target mRNA is a DNA having 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity.
It is performed using a polymerase such as Tth DNA polymerase. The probe that hybridizes to the target mRNA downstream of the primer is DNA during the amplification reaction.
It is degraded by the 5 '→ 3' exonuclease activity of the polymerase. Each time a new target region is amplified,
The probe is decomposed, and the labeling substance (eg, phosphate group, fluorescent substance) modified by the probe is released. By quantifying the released labeling substance, the amount of target mRNA is indirectly measured.

【００３４】遊離される標識物質を定量的に検出するた
めには公知の方法が用いられる。好ましい方法におい
て、前記プローブは、２つの蛍光物質で５’および３’
末端が標識され、このうちの一方が、他方の物質の蛍光
を消光することができる。このプローブは鋳型ＤＮＡに
ハイブリダイズしている間は２つの蛍光物質の相互作用
により蛍光が消光されているが、ＤＮＡポリメラーゼが
有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解さ
れることにより蛍光を発するようになる。増幅反応の進
行に伴い蛍光が増大し、この蛍光の増大がモニターされ
る。A known method is used for quantitatively detecting the released labeling substance. In a preferred method, the probe is two fluorophores 5 ′ and 3 ′.
The ends are labeled, one of which is capable of quenching the fluorescence of the other substance. The fluorescence of this probe is quenched by the interaction of two fluorescent substances while it hybridizes to the template DNA, but it emits fluorescence by being decomposed by the 5 '→ 3' exonuclease activity of DNA polymerase. Like Fluorescence increases with the progress of the amplification reaction, and this increase in fluorescence is monitored.

【００３５】［検量線の作成及び増幅前の標的核酸量の
計算］本発明では、予め知られている量の標準品である
合成ポリヌクレオチドを提供するので、これを増幅させ
て作成した「検量線」に基づいて標的核酸を含む試料の
定量を行う。[Preparation of Calibration Curve and Calculation of Target Nucleic Acid Amount Before Amplification] The present invention provides a synthetic polynucleotide which is a standard product in a known amount in advance. The sample containing the target nucleic acid is quantified based on the "line".

【００３６】検量線の作成については、例えば、特開平
１１−１２３０９５号公報に記載されている。すなわ
ち、検量線は、ポリメラーゼ連鎖反応において作られる
標準品としてのポリオリゴヌクレオチドの量を、増幅前
に存在する種々の既知量のＲＮＡに対してプロットする
ことによって作成される。高い精度を確保するために、
増幅反応混合物の希釈度を段階的に変えた希釈系列を用
いて増幅反応を行って検量線を作成する。この検量線は
所定の増幅サイクル数に対して増幅される内部標準品及
び標的核酸の量をプロットすることによって作成され
る。増幅前の標的核酸の量は、増幅される標的核酸の量
を上記検量線と比較することによって求められる。つま
り、標準品と標的核酸の一連の希釈系列を別の反応場所
において同様の条件で増幅せしめ、そしてこの反応を増
幅の指数期において停止させ、増幅前にこの試料中に存
在している標的核酸の量を、標準品を用いて作成される
検量線に対して外挿せしめることによって決定する。The preparation of the calibration curve is described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-123095. That is, the calibration curve is prepared by plotting the amount of the standard polyoligonucleotide produced in the polymerase chain reaction against various known amounts of RNA present before amplification. To ensure high accuracy,
The amplification reaction is performed using a dilution series in which the dilution degree of the amplification reaction mixture is changed stepwise to create a calibration curve. This calibration curve is created by plotting the amounts of internal standard and target nucleic acid to be amplified with respect to a predetermined number of amplification cycles. The amount of target nucleic acid before amplification is determined by comparing the amount of target nucleic acid to be amplified with the above calibration curve. That is, a series of dilutions of the standard and target nucleic acid are amplified in different reaction locations under similar conditions, and the reaction is stopped in the exponential phase of amplification, and the target nucleic acid present in this sample prior to amplification. Is determined by extrapolation to a calibration curve made with standards.

【００３７】（疾患の診断方法およびその疾患を治療す
る医薬）次に、本発明の上記（２３）による方法によれ
ば、患者から採取したｍＲＮＡ試料を用いて遺伝子発現
解析を行い、特定疾患関連遺伝子の特徴的発現を検知す
ることによってその患者が罹患している疾患を診断する
ことができる。本発明によれば、特定疾患関連遺伝子フ
ァミリー（特に、特定疾患関連ＧＰＣＲ遺伝子ファミリ
ー）に属する遺伝子の発現をまとめて解析することによ
り、複数の特定疾患関連遺伝子のなかで、どの遺伝子の
発現が特徴的であるかを一度の操作で特定することがで
きる。したがって、このようにして特定された遺伝子の
遺伝子産物に対するアゴニスト、アンタゴニストもしく
は抗体、またはその遺伝子産物をコードするＤＮＡを含
む医薬は、その診断対象の患者に対して特に有効であ
る。本発明においては、複数の異常発現遺伝子を特定す
ることができ、かつその遺伝子の発現レベルまでをも正
確に定量することができる。したがって、その患者に適
当な処方として、複数のアゴニスト、アンタゴニストま
たは抗体を選択し、その処方量についても、疾患関連遺
伝子の発現レベルに応じて調製することができる。すな
わち、本発明によれば、その患者のみに処方される、い
わゆるテーラーメード医薬の調製が可能となる。(Diagnosis Method for Diseases and Medicine for Treating the Diseases) Next, according to the method according to the above (23) of the present invention, gene expression analysis is carried out using an mRNA sample collected from a patient, and specific disease-related By detecting the characteristic expression of the gene, the disease affecting the patient can be diagnosed. According to the present invention, by collectively analyzing the expression of genes belonging to a specific disease-related gene family (in particular, a specific disease-related GPCR gene family), which gene among a plurality of specific disease-related genes is characterized by its expression. It is possible to specify whether it is the target with a single operation. Therefore, a medicament containing an agonist, an antagonist or an antibody against the gene product of the gene thus identified, or a DNA containing the gene product is particularly effective for the patient to be diagnosed. In the present invention, a plurality of abnormally expressed genes can be identified, and even the expression level of the genes can be accurately quantified. Therefore, a plurality of agonists, antagonists or antibodies can be selected as a suitable formulation for the patient, and the amount of the formulation can be adjusted according to the expression level of the disease-related gene. That is, according to the present invention, it is possible to prepare a so-called tailor-made medicine that is prescribed only to the patient.

【００３８】より詳細に述べると、例えば、生体内にお
いてあるレセプタータンパク質が減少しているためにリ
ガンドの生理作用が期待できない（該レセプタータンパ
ク質の欠乏症）患者がいる場合に、そのレセプタータ
ンパク質を該患者に投与し該レセプタータンパク質の量
を補充したり、（イ）本発明のレセプタータンパク質
をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることに
よって、あるいは（ロ）対象となる細胞に本発明のレセ
プタータンパク質をコードするＤＮＡを挿入し発現させ
た後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、
患者の体内におけるレセプタータンパク質の量を増加さ
せ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。More specifically, for example, when there is a patient in whom a physiological action of a ligand cannot be expected (a deficiency of the receptor protein) due to a decrease in a certain receptor protein in the living body, the receptor protein is used for the patient. Is administered to the patient to supplement the amount of the receptor protein, (a) the DNA encoding the receptor protein of the present invention is administered to and expressed in the patient, or (b) the receptor protein of the present invention in a target cell. By inserting and expressing the DNA encoding the gene, and transplanting the cells into the patient,
The amount of the receptor protein in the patient's body can be increased and the action of the ligand can be sufficiently exerted.

【００３９】本発明の医薬は、特定された遺伝子が関与
する疾患の予防または治療に有効であり、例えば、中枢
疾患(例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害な
ど)、内分泌疾患(例えば、高血圧症、性腺機能異常、甲
状腺機能異常、下垂体機能異常など)、代謝疾患(例え
ば、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など)、癌（例え
ば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、
乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）などの予防また
は治療に有用である。本発明で特定された遺伝子の遺伝
子産物（例えば、レセプタータンパク質）、それに対す
るアゴニスト、アンタゴニストもしくはその抗体、また
はその遺伝子をコードするＤＮＡを上記予防または治療
剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化する
ことができる。The medicament of the present invention is effective in the prevention or treatment of diseases associated with the specified gene, for example, central diseases (eg Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.), endocrine diseases (eg hypertension). Disease, gonadal dysfunction, thyroid dysfunction, pituitary dysfunction, etc.), metabolic disease (for example, diabetes, dyslipidemia, hyperlipidemia, etc.), cancer (for example, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, Gastric cancer, bladder cancer,
It is useful for the prevention or treatment of breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.). When the gene product (for example, receptor protein) of the gene specified in the present invention, its agonist, antagonist or its antibody, or the DNA encoding the gene is used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent, it is formulated according to a conventional method. can do.

【００４０】一方、ＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略
記する場合がある）を上記予防・治療剤として使用する
場合は、そのＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシ
エーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿
入した後、常套手段に従って実施することができる。そ
のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補
助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよ
うなカテーテルによって投与できる。On the other hand, when DNA (hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention) is used as the preventive / therapeutic agent, the DNA may be used alone or in a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus. After insertion into a suitable vector such as a vector, it can be carried out by a conventional method. The DNA can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting ingestion by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.

【００４１】例えば、本発明で用いられる医薬は、必
要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、本発明の医薬を、生理学的に認め
られる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐
剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤
実施に要求される単位用量形態で混和することによって
製造することができる。これら製剤における有効成分量
は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするも
のである。For example, the drug used in the present invention may be orally administered as tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like, optionally coated with sugar, or water or other pharmaceutically acceptable. It can be used parenterally in the form of an injectable solution such as a sterile solution with a liquid or a suspension. For example, the drug of the present invention is used together with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. in a unit dose form generally required for drug formulation. It can be produced by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dose within the indicated range can be obtained.

【００４２】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０^TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。Examples of additives that can be mixed with tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin and alginic acid. Puffing agents such as and the like, lubricants such as magnesium stearate, sweetening agents such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, red oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as fat may be included in addition to materials of the above type. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practices such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, it may be used in combination with alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, Polysorbate 80 ^™ , HCO-50). As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.

【００４３】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやその他の哺乳
動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与するこ
とができる。The above-mentioned prophylactic / therapeutic agents are, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers ( For example, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg,
(Benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidant, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. The preparation thus obtained is safe and has low toxicity. can do.

【００４４】本発明の医薬の投与量は、投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投
与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）
においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好
ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０
〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１
回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などに
よっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例え
ば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき
約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０
ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静
脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場
合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することがで
きる。本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与
の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）に
おいては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ま
しくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜
２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回
投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによ
っても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、
癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍ
ｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈
注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合
も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができ
る。The dose of the drug of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like, but in the case of oral administration, it is generally, for example, a cancer patient (60 kg).
In the above, about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 mg per day.
~ 20 mg. Part 1 when administered parenterally
Although the dose may vary depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., for example, in the form of injection, for example, in a cancer patient (60 kg), about 0.01 to 30 mg per day, Preferably about 0.1-20
It is convenient to administer about mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose converted per 60 kg can be administered. The dose of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like, but in the case of oral administration, it is generally about 0 per day in a cancer patient (as 60 kg). 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to
It is 20 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but usually in the form of an injection, for example,
In a cancer patient (as 60 kg), about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 m
It is convenient to administer about g, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose converted per 60 kg can be administered.

【００４５】（略号の表示）本明細書において、塩基、
アミノ酸、化合物等を略号で表示する場合、IUPAC-IUB
Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づき表示を行い、
その例を以下に記載する。またアミノ酸が光学異性体を
取りうる場合、特に明示しなければＬ体を表す。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 ａまたはＡ ：アデニン ｔまたはＴ ：チミン ｇまたはＧ ：グアニン ｃまたはＣ ：シトシン ｕまたはＵ ：ウラシル ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸(Indication of abbreviation) In the present specification, a base,
When displaying abbreviations for amino acids, compounds, etc., IUPAC-IUB
Display based on abbreviations by Commission on Biochemical Nomenclature or abbreviations commonly used in the relevant field,
An example will be described below. In addition, when an amino acid can take an optical isomer, it represents the L-form unless otherwise specified. DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid a or A: adenine t or T: thymine g or G: guanine c or C: cytosine u or U: uracil RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate Acid dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate dCTP: deoxycytidine triphosphate ATP: adenosine triphosphate Gly: glycine Ala: alanine Val: valine Leu: leucine Ile: isoleucine Ser: serine Thr: threonine. : Cystein Met: Methionine Glu: Glutamic acid Asp: Aspartic acid Lys: Lysine Arg: Arginine His: Histidine Phe: Phenylalanine Tyr: Tyro Down Trp: tryptophan Pro: proline Asn: asparagine Gln: glutamine pGlu: pyroglutamic acid

【００４６】本明細書の配列表記載の配列は以下のとお
りである。 ［配列番号：１］ｈＭＯＲ１の塩基配列を表す。 ［配列番号：２］実施例１で用いた上流プライマーＮ−
９１７Ｆの塩基配列を表す。 ［配列番号：３］実施例１で用いた下流プライマーＮ−
９９８Ｒの塩基配列を表す。 ［配列番号：４］実施例１で用いたプローブＮ−９４５
Ｔの塩基配列を表す。 ［配列番号：５］トウモロコシＣＢ３５１検出用プライ
マーの塩基配列を表す。 ［配列番号：６］トウモロコシＣＢ３５１検出用プライ
マーの塩基配列を表す。 ［配列番号：７］パパイヤ５５−１検出用プライマーの
塩基配列を表す。 ［配列番号：８］パパイヤ５５−１検出用プライマーの
塩基配列を表す。 ［配列番号：９］ジャガイモNew Leaf Y検出用プライマ
ーの塩基配列を表す。 ［配列番号：１０］ジャガイモNew Leaf Y検出用プライ
マーの塩基配列を表す。The sequences described in the sequence listing in the present specification are as follows. [SEQ ID NO: 1] This shows the base sequence of hMOR1. [SEQ ID NO: 2] Upstream primer N- used in Example 1
This shows the base sequence of 917F. [SEQ ID NO: 3] Downstream primer N- used in Example 1
This shows the base sequence of 998R. [SEQ ID NO: 4] Probe N-945 used in Example 1
The base sequence of T is shown. [SEQ ID NO: 5] This shows the base sequence of the maize CB351 detection primer. [SEQ ID NO: 6] This shows the base sequence of the primer for detecting corn CB351. [SEQ ID NO: 7] This shows the base sequence of the primer for detecting papaya 55-1. [SEQ ID NO: 8] This shows the base sequence of the primer for detecting papaya 55-1. [SEQ ID NO: 9] This shows the base sequence of the primer for detecting potato New Leaf Y. [SEQ ID NO: 10] This shows the base sequence of the primer for detecting potato New Leaf Y.

【００４７】[0047]

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではな
い。 実施例１ （１）ｈＭＯＲ１部分配列の化学合成ＤＮＡによる検量
線の作成 この例は、ＴａｑＭａｎ法における、ｈＭＯＲ１ ｃＤ
ＮＡ（配列番号１：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号
Ｌ２５１１９）部分配列の化学合成ＤＮＡを用いた検
量線の作成を記載する。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are not intended to limit the scope of the present invention. Example 1 (1) Preparation of calibration curve by chemically synthesizing hMOR1 partial sequence This example shows hMOR1 cD in TaqMan method.
The preparation of a calibration curve using a chemically synthesized DNA of the partial sequence of NA (SEQ ID NO: 1 GenBank Accession No. L25119) is described.

【００４８】（２）試料 増幅は、ｈＭＯＲ１ ｃＤＮＡ部分配列の化学合成ＤＮ
Ａ（ｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ）の連続希釈溶液を用いて行っ
た。本件のｈＭＯＲ１ＣＯＭの配列は、ｈＭＯＲ１ ｃ
ＤＮＡ（配列番号１）内１１２９−１２１０位の相補配
列に相当し、β−シアノエチルホスホアミダイド固相合
成法（化学合成法）にて合成後、アンモニアクリーベー
ジ処理を行い、ポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動に
よる精製を行った。(2) Sample amplification was carried out by chemically synthesizing the hMOR1 cDNA partial sequence DN
It was carried out using a serially diluted solution of A (hMOR1T / M). The sequence of hMOR1COM in this case is hMOR1 c
It corresponds to the complementary sequence at positions 1129-1210 in DNA (SEQ ID NO: 1), and is synthesized by β-cyanoethylphosphoamidide solid-phase synthesis method (chemical synthesis method), then subjected to ammonia cleavage treatment, and polyacrylamide-denatured gel electrophoresis. Purification by electrophoresis was performed.

【００４９】（３）増幅プライマー及び検出プローブ ｈＭＯＲ１ ｃＤＮＡ部分配列の領域の増幅は、5′-CCT
TGGTTACAATCCCAGAAACTAC-3′（配列番号：２）の配列を
有する上流プライマーＮ−９１７Ｆを、5′-AGGCAGCTGT
TTGTGTAACCTAGA-3′（配列番号：３）の配列を有する下
流プライマーＮ−９９８Ｒとを一対のプライマー対とし
て用いて行った。前記の上流プライマー、Ｎ−９１７Ｆ
は、ｈＭＯＲ１ ｃＤＮＡ（配列番号：１）内の１１２
９−１１５３位の相補配列にハイブリダイズする。前記
の下流プライマー、Ｎ−９９８Ｒは、ｈＭＯＲ１ ｃＤ
ＮＡ（配列番号：１）内の１１８７−１２１０位の配列
にハイブリダイズする。これらのプライマーは一緒に、
完全長のｈＭＯＲ１ ｃＤＮＡ配列の一部を含む、８２
塩基対の生成物の増幅を触媒する。(3) Amplification primer and detection probe Amplification of the region of the hMOR1 cDNA partial sequence was carried out using 5'-CCT.
The upstream primer N-917F having the sequence of TGGTTACAATCCCAGAAACTAC-3 '(SEQ ID NO: 2) was added to 5'-AGGCAGCTGT.
It was carried out using a downstream primer N-998R having the sequence of TTGTGTAACCTAGA-3 '(SEQ ID NO: 3) as a pair of primers. The above upstream primer, N-917F
Is 112 in the hMOR1 cDNA (SEQ ID NO: 1)
It hybridizes to the complementary sequence at positions 9-1153. The downstream primer, N-998R, was hMOR1 cD.
It hybridizes to the sequence at positions 1187-1210 in NA (SEQ ID NO: 1). These primers together,
82, containing a portion of the full length hMOR1 cDNA sequence
It catalyzes the amplification of base-paired products.

【００５０】検出は、5′-CCAGACTGTTTCTTGGCACTTCTGCA
TTG-3′（配列番号：４）を有するＮ−９４５Ｔをプロ
ーブとして用いて行った。このプローブは、ｈＭＯＲ１
ｃＤＮＡ（配列番号：１）内の１１５７−１１８５位
の相補配列にハイブリダイズする。前記のＴａｑＭａｎ
形式での検出を可能にするために、前記プローブは、
５’端にフルオレセイン型の蛍光色素（ＦＡＭ：リポー
ター）３’端にローダミン型の蛍光色素（ＴＡＭＲＡ：
クェンチャー）を標識した。標識したプローブは、ハイ
ブリダイズしない状態の場合には、蛍光共鳴エネルギー
の移動現象により、リポーターの蛍光は抑制される。Ｄ
ＮＡポリメラーゼによる前記プローブの伸長を、増幅の
間防ぐために、前記プローブの３’末端はリン酸ブロッ
クで合成した。Detection was carried out using 5'-CCAGACTGTTTCTTGGCACTTCTGCA
N-945T having TTG-3 '(SEQ ID NO: 4) was used as a probe. This probe is hMOR1
It hybridizes to the complementary sequence at positions 1157-1185 in the cDNA (SEQ ID NO: 1). The above TaqMan
In order to allow detection in the form, the probe is
Fluorescein type fluorescent dye (FAM: reporter) at the 5'end Rhodamine type fluorescent dye (TAMRA: at the 3'end
Quencher) is labeled. When the labeled probe is not hybridized, the fluorescence of the reporter is suppressed by the phenomenon of transfer of fluorescence resonance energy. D
The 3'end of the probe was synthesized with a phosphate block in order to prevent extension of the probe by NA polymerase during amplification.

【００５１】（４）増幅 各々のＰＣＲ増幅は、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅ
ｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ＭＩＸ（アプライド
バイオシステムズジャパン株式会社）を用いて、２０μ
ｌの合計反応液量で行った。最終試薬濃度を以下の様に
した：試料遺伝子、１× ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉ
ｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭＩＸ（Ａｍｐｌ
ｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ、ＡｍｐＥｒａｓｅ（商標）Ｕｒａｃｉｌ−Ｎ−ｇ
ｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）、ＲＯＸなどを含
む。）、９００ｎＭ 各プライマー、２００ｎＭ プロー
ブ。(4) Amplification Each PCR amplification was carried out by using TaqMan (trademark) Unified.
20μ using rsal PCR Master MIX (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.)
The total reaction volume was 1 l. Final reagent concentrations were as follows: sample gene, 1 × TaqMan ™ Uni.
versal PCR MasterMIX (Ampl
iTaq Gold ™ DNA Polymer
se, AmpErase ™ Uracil-N-g
It includes lycosylase (UNG), ROX and the like. ), 900 nM each primer, 200 nM probe.

【００５２】増幅反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ（商標）
７９００ＨＴ配列検出システム（アプライドバイオシス
テムズジャパン株式会社）で行い、使用した温度周期の
プロファイルを以下に示す。サーマルサイクリングの時
間及び温度ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ反応のインキュベ
ーション： ５０℃で２分間、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏ
ｌｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの活性化：９５℃
で１０分間、変性・アニール／伸長： ４０サイクル：
９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。The amplification reaction was performed using ABI PRIZM ™.
A 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) was used, and the temperature cycle profile used is shown below. Thermal Cycling Time and Temperature AmpErase UNG Reaction Incubation: 50 ° C. for 2 minutes, AmpliTaq Go
Activation of ld DNA Polymerase: 95 ° C
Denaturation / annealing / extension for 10 minutes at 40 cycles:
95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 1 minute.

【００５３】（５）定量的ＴａｑＭａｎ解析 ＴａｑＭａｎ反応において、増幅の間に、前記ＤＮＡポ
リメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によ
り、前記標的配列にハイブリダイズするプローブは５’
末端から加水分解される。その結果、リポーター蛍光色
素は遊離し、蛍光強度が増加する。増幅生成物の蓄積
は、反応液の、リポーター蛍光色素の蛍光強度の増加を
測定することによって、測定した。また、同時に、反応
液の、実験誤差補正用の蛍光リファレンス（蛍光色素：
ＲＯＸ）の蛍光強度も測定した。各々の増幅サイクルの
間、前記リポーター蛍光色素、及びリファレンス蛍光色
素は、その最大の励起に近い波長の光で励起し、そして
前記リポーター蛍光色素、及びリファレンス蛍光色の発
光は、その発光の最大付近で測定される。これらの周波
数は、ＡＢＩＰＲＩＺＭ（商標）７９００ＨＴ配列検出
システムであらかじめ決定され、別の検出機器を使用し
たならば、適当な周波数を選択すべきである。(5) Quantitative TaqMan analysis In the TaqMan reaction, the probe hybridized to the target sequence was 5'due to the 5'-3 'exonuclease activity of the DNA polymerase during amplification.
It is hydrolyzed from the end. As a result, the reporter fluorescent dye is released and the fluorescence intensity is increased. Accumulation of amplification product was measured by measuring the increase in fluorescence intensity of the reporter fluorochrome in the reaction. At the same time, a fluorescent reference (fluorescent dye:
The fluorescence intensity of ROX) was also measured. During each amplification cycle, the reporter fluorescent dye, and the reference fluorescent dye are excited with light at a wavelength close to their maximum excitation, and the reporter fluorescent dye, and the emission of the reference fluorescent color are near the maximum of their emission. Measured at. These frequencies are pre-determined on the ABI PRIZM ™ 7900HT Sequence Detection System, and if alternative detection equipment is used, the appropriate frequencies should be selected.

【００５４】蛍光測定値は、７９００ＨＴ ＳＤＳソフ
トウェア（アプライドバイオシステムズジャパン株式会
社）により解析した。まず、リポーター蛍光色素の蛍光
強度をリファレンス蛍光色素の蛍光強度で標準化し、標
準化リポーターシグナル（Ｒｎ）を算出した。更に、Ｒ
ｎから、ＰＣＲ初期サイクルのサイクルの間で比較的一
定なＲｎの平均値（ベースライン）を差し引いた値をΔ
Rnとした。サイクル数に対してΔＲｎをプロットした増
幅曲線上で、増幅産物の指数関数的増幅に相当する蛍光
シグナル（ΔＲｎ）の増加を解析アルゴリズムが初めて
検出したサイクル数をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ
（Ｃ_T）とした。具体的には、このＣ_Tを決定するため
に、増幅産物の指数関数的増幅に至っていないと考えら
れるＰＣＲ初期サイクル（３−１５サイクル）をベース
ラインとして、このサイクル内の平均ΔＲｎの標準偏差
を計算した。次にこの標準偏差を１０倍した値をＴｈｒ
ｅｓｈｏｌｄと定義し、各増幅曲線上でこのＴｈｒｅｓ
ｈｏｌｄの値に相当するサイクル数をＣ_Tとした。前記
の増幅産物の指数関数的増幅期の間、Ｃ_Tは、最初の標
的コピー数の対数に比例する。後期のサイクルにおける
増幅生成物の蓄積は、反応を阻害し、そしてついには反
応のプラトーをもたらす。The fluorescence measurement value was analyzed by 7900HT SDS software (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.). First, the fluorescence intensity of the reporter fluorescent dye was standardized by the fluorescence intensity of the reference fluorescent dye, and the standardized reporter signal (Rn) was calculated. Furthermore, R
The value obtained by subtracting the average value (baseline) of Rn, which is relatively constant during the initial PCR cycle, from Δ
Rn. On the amplification curve in which ΔRn was plotted against the cycle number, the cycle number at which the analysis algorithm first detected the increase in the fluorescence signal (ΔRn) corresponding to the exponential amplification of the amplification product was determined as the Threshold cycle.
(C _T ). Specifically, in order to determine this C _T , the standard deviation of the average ΔRn in this cycle was set with the initial PCR cycle (3-15 cycles), which is considered not to have reached exponential amplification of the amplification product, as the baseline. Was calculated. Next, the value obtained by multiplying this standard deviation by 10 is Thr
It is defined as "eshold", and this Thres is defined on each amplification curve.
The number of cycles corresponding to the value of hold was defined as C _T. During the exponential amplification phase of the amplification product, C _T is proportional to the logarithm of the original target copy number. Accumulation of amplification product in late cycles inhibits the reaction and eventually results in a plateau of the reaction.

【００５５】（６）結果 各試料で得たＣ_T値を、以下に示す。各Ｃ_T値は、４回の
反応から得た平均値を表わす。 試料 Ｃ_T 値 １０⁷ コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ １６．３ １０⁶ コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ １９．２ １０⁵ コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ ２２．５ １０⁴ コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ ２６．０ １０³ コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ ２９．２ １０² コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ ３２．９ ０ コピーのｈＭＯＲ１Ｔ／Ｍ ４０．０以上(6) Results The C _T values obtained for each sample are shown below. Each C _T value represents the average value obtained from 4 reactions. Sample C _T value 10 ⁷ copies hMOR1T / M 16.3 10 ⁶ copies hMOR1T / M 19.2 10 ⁵ copies hMOR1T / M 22.5 10 ⁴ copies hMOR1T / M 26.0 10 ³ copies hMOR1T / M 29.2 10 ² copies of hMOR1T / M 32.9 0 Copy hMOR1T / M 40.0 or higher

【００５６】検量線は、既知量のｈＭＯＲ１ＣＯＭの鋳
型（標準サンプル）の増幅から得た、Ｃ_T値から導い
た。具体的には標準サンプルの初期既知量（対数値）に
対してＣ_Tをプロットし、検量線を作成した。近似曲線
にはＣ_T＝（Ｌｏｇ［ＤＮＡ］_T−Ｌｏｇ［ＤＮＡ］₀）
／Ｌｏｇ（１＋ｅ）（ここで、［ＤＮＡ］₀は標的テン
プレートの初期濃度であり、［ＤＮＡ］_Tは、Ｃ_Tサイク
ル時の増幅産物の濃度であり、ｅは、平均増幅効率であ
り、そしてＬｏｇ（Ｘ）は、Ｘが１０の底を表す対数で
ある）の一次方程式を用い、７９００ＨＴ ＳＤＳソフ
トウェアにより、パラメーターを定めた。前記の試料か
ら得たＣ_T値から、以下の検量線を得た： Ｃ_T＝３９．３４−３．３３１×Ｌｏｇ［ＤＮＡ］₀ 相関係数 Ｒ２＝０．９９９ 平均増幅効率 ｅ＝９９．６％The calibration curve was derived from the C _T values obtained from amplification of a known amount of hMOR1COM template (standard sample). Specifically, C _T was plotted against the initial known amount (logarithmic value) of the standard sample to create a calibration curve. The approximated curve is C _T = (Log [DNA] _T- Log [DNA] ₀ ).
/ Log (1 + e) (where [DNA] ₀ is the initial concentration of the target template, [DNA] _T is the concentration of the amplification product during the C _T cycle, e is the average amplification efficiency, and (Log (X) is the logarithm where X is the base of 10) and was parameterized by the 7900HT SDS software. The following calibration curve was obtained from the C _T values obtained from the above samples: C _T = 39.34-3.331 × Log [DNA] ₀ correlation coefficient R2 = 0.999 Average amplification efficiency e = 99. 6%

【００５７】実施例２ （１）ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡ合成 前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞をプレコンフルエ
ントになるまで培養した。細胞を０．２５％トリプシン
−１ｍＭ ＥＤＴＡ（Invitrogen社）ではがし細胞数を
測定した後、RNeasy mini KIT（QIAGEN社）のマニュア
ルに従って全ＲＮＡを抽出精製した。抽出したＲＮＡは
SuperScript II（Invitrogen社）のマニュアルに従って
first strand cDNAを合成し、エタノール沈殿後下記の
ように溶解して用いた。合成したｃＤＮＡは１０ｍｇ／
ｍｌ ＲＮＡ相当になるようにＴＥに溶解した後、５０
μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡを含むＴＥに５ｎｇ／μｌに
なるように希釈した。希釈したｃＤＮＡ溶液５μｌ（２
５ｎｇのＲＮＡに相当）を１種類のＧＰＣＲのｍＲＮＡ
の定量の測定用試料とした。Example 2 (1) RNA extraction and cDNA synthesis Prostate cancer cells LNCaP-FGC cells were cultured until they became preconfluent. The cells were stripped with 0.25% trypsin-1 mM EDTA (Invitrogen), the number of cells was measured, and total RNA was extracted and purified according to the manual of RNeasy mini KIT (QIAGEN). The extracted RNA is
According to the SuperScript II (Invitrogen) manual
First strand cDNA was synthesized, precipitated with ethanol, and then dissolved as described below. Synthesized cDNA is 10 mg /
Dissolve in TE so that it becomes equivalent to ml RNA, then
It was diluted to 5 ng / μl in TE containing μg / ml yeast tRNA. 5 μl of diluted cDNA solution (2
(Corresponding to 5 ng of RNA) is the mRNA of one type of GPCR
Was used as a measurement sample.

【００５８】（２）化学合成標準品を用いたＧＰＣＲ
ｍＲＮＡの定量 既知のＧＰＣＲ １６０種類の配列を基に、ソフトウエ
アPrimer Express（商標）（アプライドバイオシステム
ズジャパン株式会社）を用いてプライマーおよびプロー
ブを設計した。また、プライマーにはさまれた塩基配列
を持つ（−）鎖のＤＮＡを化学合成した。化学合成した
ＤＮＡを５０μｇ／ｍｌのyeast tRNAを含むＴＥに１０
⁶コピー／５μｌになるように希釈した後、１０倍づつ
１０²コピー／５μｌになるまで希釈系列を作成した。
１種類のＧＰＣＲのｍＲＮＡの測定は、これらの化学合
成品による希釈系列５種と前述した測定サンプル１種の
５μｌずつを各２点分注して行った。増幅反応試薬は、
TaqMan(商標) Universal PCRMaster Mix（アプライドバ
イオシステムズジャパン株式会社）および、前述のよう
に設計したTaqMan(商標) Probe Kit（アプライドバイオ
システムズジャパン株式会社）を用い、１５μｌの液量
に調製したのち、前述の標準品および測定試料の入った
各ウェルに加えた。各プライマー、プローブの最終濃度
はマニュアルに従った。TaqMan(商標) PCRは、ABI PRIS
M(商標)7900HT配列検出システム（アプライドバイオシ
ステムズジャパン株式会社）で行い、使用した温度周期
はTaqMan(商標) Universal PCR Master Mix（アプライ
ドバイオシステムズジャパン株式会社）のマニュアルに
従った。増幅生成物の定量的TaqMan解析は、7900HT SDS
ソフトウェア（アプライドバイオシステムズジャパン株
式会社）を用いて行った。上記の条件を用いて３８４ウ
ェルプレート１枚で３２種類のＧＰＣＲの定量的測定を
行い、５枚の３８４ウェルプレートを用いることにより
前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞の発現する前述
した１６０種類全てのＧＰＣＲの正確な定量が可能であ
った。(2) GPCR using a chemically synthesized standard product
Quantification of mRNA Based on 160 kinds of known GPCR sequences, primers and probes were designed using software Primer Express (trademark) (Applied Biosystems Japan Ltd.). In addition, a (-)-strand DNA having a base sequence sandwiched between the primers was chemically synthesized. 10% of chemically synthesized DNA was added to TE containing 50 μg / ml of yeast tRNA.
After diluting to ⁶ copies / 5 μl, a dilution series was prepared by 10 times until 10 ² copies / 5 μl.
The measurement of mRNA of one type of GPCR was performed by dispensing 5 μl each of 5 types of dilution series of these chemically synthesized products and 1 type of the above-mentioned measurement sample, and 2 points each. The amplification reaction reagent is
TaqMan (trademark) Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) and TaqMan (trademark) Probe Kit (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) designed as described above were used to prepare a volume of 15 μl. Was added to each well containing the standard and the measurement sample. The final concentration of each primer and probe was according to the manual. TaqMan ™ PCR is ABI PRIS
M (TM) 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.) was used, and the temperature cycle used was according to the manual of TaqMan (TM) Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.). Quantitative TaqMan analysis of amplification products is performed using the 7900HT SDS
It was performed using software (Applied Biosystems Japan Co., Ltd.). Quantitative measurement of 32 kinds of GPCR was performed on one 384-well plate using the above-mentioned conditions, and by using 5 384-well plates, all of the above-mentioned 160 kinds of prostate cancer cell line LNCaP-FGC expressed. Accurate quantification of GPCR was possible.

【００５９】[0059]

【発明の効果】本発明の標準品は、化学合成によって得
られる合成ポリヌクレオチドであり、従来の生合成によ
って得られるポリヌクレオチドからなる標準品と比較し
て、簡便な方法で目的とする配列のものを正確に得るこ
とができるという利点がある。また、本発明の標準品
は、生物学的コンタミネーションがないので、環境に対
して安全であり、また高精度の定量を阻害する要因を少
なくできるという利点がある。また、本発明の定量方法
及び定量キットによれば、標準品として１本鎖のポリヌ
クレオチドを用いた場合は、被定量物に近い状態のもの
を標準とすることができるので、より高精度の定量が可
能となる。Industrial Applicability The standard product of the present invention is a synthetic polynucleotide obtained by chemical synthesis, and has a simpler method than the standard product consisting of a polynucleotide obtained by conventional biosynthesis. The advantage is that you can get things exactly. Further, since the standard product of the present invention has no biological contamination, it is advantageous in that it is safe for the environment and that the factors that hinder highly accurate quantification can be reduced. Further, according to the quantification method and the quantification kit of the present invention, when a single-stranded polynucleotide is used as a standard product, the one in a state close to that of the substance to be quantified can be used as a standard, so that a higher precision Quantification is possible.

【００６０】また、本発明の他の態様に係る定量方法及
び定量キットによれば、多種類の標的核酸を含み得る試
料について、多種類の標的核酸の有無及びその量を一度
の処理で高感度で検出することができる。したがって、
本発明によれば、標的遺伝子の発現解析を高感度で迅速
に行うことができるシステムを提供することができる。
さらに、本発明の定量方法および定量キットを用いるこ
とによって、特定疾患の診断、遺伝子組換え食品の検査
または自然食品中の遺伝子組換えＤＮＡの混入の判定な
どを高精度で行うことができる。Further, according to the quantification method and the quantification kit according to another aspect of the present invention, the presence or absence of the multiple types of target nucleic acids and the amount of the multiple types of target nucleic acids can be highly sensitive in a single treatment. Can be detected with. Therefore,
According to the present invention, it is possible to provide a system capable of performing expression analysis of a target gene with high sensitivity and speed.
Furthermore, by using the quantification method and the quantification kit of the present invention, it is possible to perform diagnosis of specific diseases, inspection of genetically modified foods, determination of contamination of genetically modified DNAs in natural foods with high accuracy.

【００６１】[0061]

【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Quantification Method and Quantification Kit of Nucleic Acids <130> P02-0156 <150> JP 2001-400280 <151> 2001-12-28 <160> 10 <210> 1 <211> 2162 <212> DNA <213> Human <220> <221> <223> (2063), (2091) <224> <400> 1 ggaattccgg ctataggcag aggagaatgt cagatgctca gctcggtccc ctccgcctga 60 cgctcctctc tgtctcagcc aggactggtt tctgtaagaa acagcaggag ctgtggcagc 120 ggcgaaagga agcggctgag gcgcttggaa cccgaaaagt ctcggtgctc ctggctacct 180 cgcacagcgg tgcccgcccg gccgtcagta ccatggacag cagcgctgcc cccacgaacg 240 ccagcaattg cactgatgcc ttggcgtact caagttgctc cccagcaccc agccccggtt 300 cctgggtcaa cttgtcccac ttagatggca acctgtccga cccatgcggt ccgaaccgca 360 ccaacctggg cgggagagac agcctgtgcc ctccgaccgg cagtccctcc atgatcacgg 420 ccatcacgat catggccctc tactccatcg tgtgcgtggt ggggctcttc ggaaacttcc 480 tggtcatgta tgtgattgtc agatacacca agatgaagac tgccaccaac atctacattt 540 tcaaccttgc tctggcagat gccttagcca ccagtaccct gcccttccag agtgtgaatt 600 acctaatggg aacatggcca tttggaacca tcctttgcaa gatagtgatc tccatagatt 660 actataacat gttcaccagc atattcaccc tctgcaccat gagtgttgat cgatacattg 720 cagtctgcca ccctgtcaag gccttagatt tccgtactcc ccgaaatgcc aaaattatca 780 atgtctgcaa ctggatcctc tcttcagcca ttggtcttcc tgtaatgttc atggctacaa 840 caaaatacag gcaaggttcc atagattgta cactaacatt ctctcatcca acctggtact 900 gggaaaacct cgtgaagatc tgtgttttca tcttcgcctt cattatgcca gtgctcatca 960 ttaccgtgtg ctatggactg atgatcttgc gcctcaagag tgtccgcatg ctctctggct 1020 ccaaagaaaa ggacaggaat cttcgaagga tcaccaggat ggtgctggtg gtggtggctg 1080 tgttcatcgt ctgctggact cccattcaca tttacgtcat cattaaagcc ttggttacaa 1140 tcccagaaac tacgttccag actgtttctt ggcacttctg cattgctcta ggttacacaa 1200 acagctgcct caacccagtc ctttatgcat ttctggatga aaacttcaaa cgatgcttca 1260 gagagttctg tatcccaacc tcttccaaca ttgagcaaca aaactccact cgaattcgtc 1320 agaacactag agaccacccc tccacggcca atacagtgga tagaactaat catcagctag 1380 aaaatctgga agcagaaact gctccgttgc cctaacaggg tctcatgcca ttccgacctt 1440 caccaagctt agaagccacc atgtatgtgg aagcaggttg cttcaagaat gtgtaggagg 1500 ctctaattct ctaggaaagt gcctactttt aggtcatcca acctctttcc tctctggcca 1560 ctctgctctg cacattagag ggacagccaa aagtaagtgg agcatttgga aggaaaggaa 1620 tataccacac cgaggagtcc agtttgtgca agacacccag tggaaccaaa acccatcgtg 1680 gtatgtgaat tgaagtcatc ataaaaggtg acccttctgt ctgtaagatt ttattttcaa 1740 gcaaatattt atgacctcaa caaagaagaa ccatcttttg ttaagttcac cgtagtaaca 1800 cataaagtaa atgctacctc tgatcaaagc accttgaatg gaaggtccga gtctttttag 1860 tgtttttgca agggaatgaa tccattattc tattttagac ttttaacttc aacttaaaat 1920 tagcatctgg ctaaggcatc attttcacct ccatttcttg gttttgtatt gtttaaaaaa 1980 aataacatct ctttcatcta gctccataat tgcaagggaa gagattagca tgaaaggtaa 2040 tctgaaacac agtcatgtgt canctgtaga aaggttgatt ctcatgcact ncaaatactt 2100 ccaaagagtc atcatggggg atttttcatt cttaggcttt cagtggtttg ttcctggaat 2160 tc 2162 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N917F <400> 2 ccttggttac aatcccagaa actac 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N-998R <400> 3 aggcagctgt ttgtgtaacc taga 24 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_binding <223> Probe N-945T, labeled 5'-terminal with FAM and 3'-terminal with TA MRA <400> 4 ccagactgtt tcttggcact tctgcattg 29 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ccttcgcaag acccttcctc tata 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gtagctgtcg gtgtagtcct cgt 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ttacggcgag ttctgttagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 catgtgcctg agaaataggc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 aaaagagctg tcctgacagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 tcctcctgca tcaattgtgt 20 [Sequence list]                          [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Quantification Method and Quantification Kit of Nucleic Acids <130> P02-0156 <150> JP 2001-400280 <151> 2001-12-28 <160> 10 <210> 1 <211> 2162 <212> DNA <213> Human <220> <221> <223> (2063), (2091) <224> <400> 1 ggaattccgg ctataggcag aggagaatgt cagatgctca gctcggtccc ctccgcctga 60 cgctcctctc tgtctcagcc aggactggtt tctgtaagaa acagcaggag ctgtggcagc 120 ggcgaaagga agcggctgag gcgcttggaa cccgaaaagt ctcggtgctc ctggctacct 180 cgcacagcgg tgcccgcccg gccgtcagta ccatggacag cagcgctgcc cccacgaacg 240 ccagcaattg cactgatgcc ttggcgtact caagttgctc cccagcaccc agccccggtt 300 cctgggtcaa cttgtcccac ttagatggca acctgtccga cccatgcggt ccgaaccgca 360 ccaacctggg cgggagagac agcctgtgcc ctccgaccgg cagtccctcc atgatcacgg 420 ccatcacgat catggccctc tactccatcg tgtgcgtggt ggggctcttc ggaaacttcc 480 tggtcatgta tgtgattgtc agatacacca agatgaagac tgccaccaac atctacattt 540 tcaaccttgc tctggcagat gccttagcca ccagtaccct gcccttccag agtgtgaatt 600 acctaatggg aacatggcca tttggaacca tcctttgcaa gatagtgatc tccatagatt 660 actataacat gttcaccagc atattcaccc tctgcaccat gagtgttgat cgatacattg 720 cagtctgcca ccctgtcaag gccttagatt tccgtactcc ccgaaatgcc aaaattatca 780 atgtctgcaa ctggatcctc tcttcagcca ttggtcttcc tgtaatgttc atggctacaa 840 caaaatacag gcaaggttcc atagattgta cactaacatt ctctcatcca acctggtact 900 gggaaaacct cgtgaagatc tgtgttttca tcttcgcctt cattatgcca gtgctcatca 960 ttaccgtgtg ctatggactg atgatcttgc gcctcaagag tgtccgcatg ctctctggct 1020 ccaaagaaaa ggacaggaat cttcgaagga tcaccaggat ggtgctggtg gtggtggctg 1080 tgttcatcgt ctgctggact cccattcaca tttacgtcat cattaaagcc ttggttacaa 1140 tcccagaaac tacgttccag actgtttctt ggcacttctg cattgctcta ggttacacaa 1200 acagctgcct caacccagtc ctttatgcat ttctggatga aaacttcaaa cgatgcttca 1260 gagagttctg tatcccaacc tcttccaaca ttgagcaaca aaactccact cgaattcgtc 1320 agaacactag agaccacccc tccacggcca atacagtgga tagaactaat catcagctag 1380 aaaatctgga agcagaaact gctccgttgc cctaacaggg tctcatgcca ttccgacctt 1440 caccaagctt agaagccacc atgtatgtgg aagcaggttg cttcaagaat gtgtaggagg 1500 ctctaattct ctaggaaagt gcctactttt aggtcatcca acctctttcc tctctggcca 1560 ctctgctctg cacattagag ggacagccaa aagtaagtgg agcatttgga aggaaaggaa 1620 tataccacac cgaggagtcc agtttgtgca agacacccag tggaaccaaa acccatcgtg 1680 gtatgtgaat tgaagtcatc ataaaaggtg acccttctgt ctgtaagatt ttattttcaa 1740 gcaaatattt atgacctcaa caaagaagaa ccatcttttg ttaagttcac cgtagtaaca 1800 cataaagtaa atgctacctc tgatcaaagc accttgaatg gaaggtccga gtctttttag 1860 tgtttttgca agggaatgaa tccattattc tattttagac ttttaacttc aacttaaaat 1920 tagcatctgg ctaaggcatc attttcacct ccatttcttg gttttgtatt gtttaaaaaa 1980 aataacatct ctttcatcta gctccataat tgcaagggaa gagattagca tgaaaggtaa 2040 tctgaaacac agtcatgtgt canctgtaga aaggttgatt ctcatgcact ncaaatactt 2100 ccaaagagtc atcatggggg atttttcatt cttaggcttt cagtggtttg ttcctggaat 2160 tc 2162 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N917F <400> 2 ccttggttac aatcccagaa actac 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N-998R <400> 3 aggcagctgt ttgtgtaacc taga 24 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_binding <223> Probe N-945T, labeled 5'-terminal with FAM and 3'-terminal with TA MRA <400> 4 ccagactgtt tcttggcact tctgcattg 29 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ccttcgcaag acccttcctc tata 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gtagctgtcg gtgtagtcct cgt 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ttacggcgag ttctgttagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 catgtgcctg agaaataggc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 aaaagagctg tcctgacagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 tcctcctgca tcaattgtgt 20 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA20 AA25 AA40 BA11 CB17 CB20 CB30 DA12 DA13 DA14 DA77 FB02 FB07 4B024 AA01 AA11 CA09 CA12 HA20 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ42 QQ53 QR08 QR32 QR35 QR56 QR62 QS25 QS36 QX01 QX02    ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    F term (reference) 2G045 AA20 AA25 AA40 BA11 CB17                       CB20 CB30 DA12 DA13 DA14                       DA77 FB02 FB07                 4B024 AA01 AA11 CA09 CA12 HA20                 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ42 QQ53                       QR08 QR32 QR35 QR56 QR62                       QS25 QS36 QX01 QX02

Claims (28)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 化学合成によって得られる合成ポリヌク
レオチドを含む、試料中の特定の標的核酸を定量または
検出する際に用いられる標準品。1. A standard product used for quantifying or detecting a specific target nucleic acid in a sample, which comprises a synthetic polynucleotide obtained by chemical synthesis. 【請求項２】 前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ又はそれらの修飾物である請求項１記載の標準品。2. The synthetic polynucleotide is RNA, D
The standard product according to claim 1, which is NA or a modified product thereof. 【請求項３】 前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡまた
はＤＮＡである請求項１記載の標準品。3. The standard product according to claim 1, wherein the synthetic polynucleotide is RNA or DNA. 【請求項４】 前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡのと
きにセンス鎖、あるいはＤＮＡのときにアンチセンス鎖
である請求項３記載の標準品。4. The standard product according to claim 3, wherein the synthetic polynucleotide has a sense strand when it is RNA and an antisense strand when it is DNA. 【請求項５】 前記合成ポリヌクレオチドが標的核酸の
一部を合成したものであって、ヌクレオチドの数が６０
〜２００個である請求項１記載の標準品。5. The synthetic polynucleotide is a part of a target nucleic acid synthesized and has 60 nucleotides.
The standard product according to claim 1, which is about 200 pieces. 【請求項６】 前記請求項１〜５のいずれかに記載の標
準品を含む核酸定量キット。6. A nucleic acid quantification kit containing the standard product according to any one of claims 1 to 5. 【請求項７】 前記請求項１〜５のいずれかに記載の標
準品と少なくとも１対のプライマー対を含む核酸定量キ
ット。7. A nucleic acid quantification kit comprising the standard product according to any one of claims 1 to 5 and at least one pair of primers. 【請求項８】 さらに蛍光プローブまたはリン酸化プロ
ーブを含んでなる請求項７記載のキット。8. The kit according to claim 7, further comprising a fluorescent probe or a phosphorylated probe. 【請求項９】 さらにＤＮＡポリメラーゼを含んでなる
請求項８記載のキット。9. The kit according to claim 8, further comprising a DNA polymerase. 【請求項１０】 さらに逆転写酵素を含む請求項９記載
のキット。10. The kit according to claim 9, which further comprises a reverse transcriptase. 【請求項１１】 複数の標的核酸を定量するための核酸
定量キットであって、複数の反応場所を有する反応器具
の各反応場所に、標的核酸に対応するプライマー対を含
む増幅試薬を充填し、その標的核酸に対応するプライマ
ー対を充填していない反応場所に前記請求項１〜５のい
ずれかに記載の標準品とその標準品に対応するプライマ
ー対を含む増幅試薬を充填してなる核酸定量キット。11. A nucleic acid quantification kit for quantifying a plurality of target nucleic acids, wherein each reaction location of a reaction instrument having a plurality of reaction locations is filled with an amplification reagent containing a primer pair corresponding to the target nucleic acid, Nucleic acid quantification obtained by filling the reaction site not filled with the primer pair corresponding to the target nucleic acid with the standard product according to any one of claims 1 to 5 and an amplification reagent containing the primer pair corresponding to the standard product. kit. 【請求項１２】 前記複数の標的核酸が特定疾患に関与
するＤＮＡまたはｍＲＮＡであり、その特定疾患を診断
するために用いられる請求項１１記載の核酸定量キッ
ト。12. The nucleic acid quantification kit according to claim 11, wherein the plurality of target nucleic acids are DNAs or mRNAs involved in a specific disease and used for diagnosing the specific disease. 【請求項１３】 前記複数の標的核酸が遺伝子組換え食
品に含有される組換えＤＮＡであり、食品中の組換えＤ
ＮＡを検知するために用いられる請求項１１記載の核酸
定量キット。13. The recombinant DNA in the food, wherein the plurality of target nucleic acids are recombinant DNA contained in a genetically modified food.
The nucleic acid quantification kit according to claim 11, which is used for detecting NA. 【請求項１４】 試料中の特定の標的核酸を定量する方
法であって、試料に標的核酸に対応する少なくとも一対
のプライマー対をそれぞれ含む増幅試薬を加え、標準品
としての化学合成ポリヌクレオチドにその合成ポリヌク
レオチドに対応するプライマー対を含む増幅試薬を加え
て、それぞれ増幅反応を行い、増幅された標準品の量と
増幅された標的核酸の量を測定し、これらの情報に基づ
いて増幅前の標的核酸の量を計算する核酸の定量方法。14. A method for quantifying a specific target nucleic acid in a sample, comprising adding an amplification reagent containing at least one pair of primer pairs corresponding to the target nucleic acid to the sample, and adding the amplification reagent to a chemically synthesized polynucleotide as a standard product. An amplification reagent containing a pair of primers corresponding to the synthetic polynucleotide is added, and each amplification reaction is performed, and the amount of the standard product amplified and the amount of the target nucleic acid amplified are measured. A method for quantifying a nucleic acid for calculating the amount of a target nucleic acid. 【請求項１５】 前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡ、
ＤＮＡ又はそれらの修飾物である請求項１４記載の方
法。15. The synthetic polynucleotide is RNA,
The method according to claim 14, which is DNA or a modified product thereof. 【請求項１６】 前記合成ポリヌクレオチドがＲＮＡで
ある請求項１４記載の方法。16. The method of claim 14, wherein the synthetic polynucleotide is RNA. 【請求項１７】 前記合成ポリヌクレオチドがセンス鎖
である請求項１６記載の方法。17. The method of claim 16, wherein the synthetic polynucleotide is the sense strand. 【請求項１８】 前記合成ポリヌクレオチドが標的核酸
の一部を合成したものであって、ヌクレオチドの数が６
０〜２００個である請求項１４〜１７記載の方法。18. The synthetic polynucleotide is a product of a part of a target nucleic acid, wherein the number of nucleotides is 6
The method according to claim 14, wherein the number is 0 to 200. 【請求項１９】 前記試料がヒトまたはその他の動物由
来のｍＲＮＡ試料である請求項１４〜１８記載の方法。19. The method according to claim 14, wherein the sample is an mRNA sample derived from humans or other animals. 【請求項２０】 前記増幅試薬がさらに蛍光プローブま
たはリン酸化プローブを含んでなる請求項１９記載の方
法。20. The method of claim 19, wherein the amplification reagent further comprises a fluorescent probe or a phosphorylated probe. 【請求項２１】 前記増幅試薬がさらにＤＮＡポリメラ
ーゼを含んでなる請求項２０記載の方法。21. The method of claim 20, wherein the amplification reagent further comprises a DNA polymerase. 【請求項２２】 前記増幅試薬がさらに逆転写酵素を含
む請求項２１記載の方法。22. The method of claim 21, wherein the amplification reagent further comprises reverse transcriptase. 【請求項２３】 （１）標的核酸に対応する少なくとも
一対のプライマー対をそれぞれ含む増幅試薬に含まれる
蛍光プローブまたはリン酸化プローブのプローブ部分
が、標的核酸のうち該プライマー対に挟まれる領域の核
酸からなるプローブであり、（２）合成ポリヌクレオチ
ドに対応するプライマー対を含む増幅試薬に含まれる蛍
光プローブまたはリン酸化プローブのプローブ部分が、
合成ポリヌクレオチドのうち該プライマー対に挟まれる
領域の核酸からなるプローブである請求項２０〜２２記
載の方法。23. (1) A nucleic acid in a region of a target nucleic acid, in which a probe portion of a fluorescent probe or a phosphorylation probe contained in an amplification reagent containing at least one pair of primers corresponding to the target nucleic acid is located between the primer pairs. (2) the probe portion of the fluorescent probe or phosphorylated probe contained in the amplification reagent containing the primer pair corresponding to (2) the synthetic polynucleotide,
23. The method according to claim 20, which is a probe consisting of a nucleic acid in a region sandwiched between the primer pairs in the synthetic polynucleotide. 【請求項２４】 ＤＮＡポリメラーゼによって蛍光プロ
ーブまたはリン酸化プローブから遊離される蛍光物質の
蛍光強度またはリン酸基の量を指標として、増幅された
標準品の量と増幅された標的核酸の量を測定する請求項
２３記載の方法。24. The amount of the amplified standard product and the amount of the amplified target nucleic acid are measured using the fluorescence intensity of the fluorescent substance or the amount of the phosphate group released from the fluorescent probe or the phosphorylated probe by the DNA polymerase as an index. 24. The method according to claim 23. 【請求項２５】 前記請求項１１記載のキット又は前記
請求項１４の方法を用いてＳＮＰの解析を行う方法。25. A method for analyzing SNP using the kit according to claim 11 or the method according to claim 14. 【請求項２６】 前記請求項１２記載のキット又は前記
請求項１４の方法を用いて特定疾患を診断する方法。26. A method for diagnosing a specific disease using the kit according to claim 12 or the method according to claim 14. 【請求項２７】 前記請求項１３記載のキット又は前記
請求項１４の方法を用いて食品中に遺伝子組換えＤＮＡ
が含まれているか否かを判定する方法。27. Recombinant DNA in food using the kit according to claim 13 or the method according to claim 14.
A method to determine whether or not is included. 【請求項２８】 前記請求項１２記載のキット又は前記
請求項２６記載の方法によって特定される、ある細胞や
組織において特徴的に発現が亢進または減少している遺
伝子ＤＮＡもしくはその遺伝子産物、又はその遺伝子産
物に対するアゴニスト、アンタゴニストもしくは抗体を
含んでなる医薬。28. A gene DNA or its gene product whose expression is characteristically increased or decreased in a cell or tissue, which is specified by the kit according to claim 12 or the method according to claim 26, or A medicament comprising an agonist, an antagonist or an antibody against a gene product.