JP2003254977A - Measurement method and instrument therefor - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、化学物質の測定方
法およびその装置に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a chemical substance measuring method and apparatus.
【０００２】[0002]
【従来の技術】溶液中に溶解している化学物質の検出方
法として、電気化学反応に伴う電流を検出する方法が広
く使用されている。比較的低い電位を印加することによ
り、被検出物が酸化または還元して電極との間で電子の
伝達が起こることを利用したものである。2. Description of the Related Art As a method of detecting a chemical substance dissolved in a solution, a method of detecting an electric current associated with an electrochemical reaction is widely used. This is based on the fact that when a relatively low potential is applied, the substance to be detected is oxidized or reduced and electrons are transferred to and from the electrode.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】電気化学反応を用いた
方法では、測定できる被検出物は電気的に活性なものに
限られるため、尿中のホルモン等の電位変化に対して安
定な物質は測定できない。また、被検出物以外にも、電
気化学的に活性な物質が共存する際には、それらが影響
してしまうために、正確な測定ができないことが課題で
あった。In the method using the electrochemical reaction, the measurable substances to be detected are limited to those that are electrically active. Therefore, substances that are stable against potential changes such as hormones in urine are not I can't measure. Further, when an electrochemically active substance coexists in addition to the substance to be detected, these substances affect the substance, which makes it impossible to perform accurate measurement.
【０００４】本発明は、前記従来の課題を解決するもの
で、電気化学的に不活性な被検出物である抗原の測定
を、電気応答として取り出すことで可能とし、さらに、
感度、精度、簡便性、迅速性を併せ持つ測定方法法およ
び測定装置を提供することを目的とする。The present invention solves the above-mentioned conventional problems and enables the measurement of an antigen, which is an electrochemically inactive substance to be detected, as an electrical response.
It is an object of the present invention to provide a measuring method and a measuring device which have sensitivity, accuracy, simplicity and speediness.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の測定方法およびその装置は、被測定物質で
ある抗原と、電子伝達物質で標識した標識抗原との置換
反応により、遊離した標識抗原の電子伝達物質により電
気応答を検出するものである。In order to achieve the above-mentioned object, a measuring method and an apparatus therefor according to the present invention provide a method of freeing an antigen as a substance to be measured by a substitution reaction with a labeled antigen labeled with an electron transfer substance. The electrical response is detected by the electron carrier of the labeled antigen.
【０００６】これにより、電子伝達物質が電極表面の脂
質薄膜に吸着し、被測定液中の電極活性物質との電荷の
授受を電極へと伝えるメディエータとして作用するた
め、電流が流れ、これを検出できるのである。電流値
は、メディエータとなる電子活性物質を有している標識
抗原の数に比例し、また、標識抗原の数は被測定液中の
抗原と比例することから、電流値の測定により、被測定
液中の抗原の数または濃度を測定できる。As a result, the electron transfer substance is adsorbed on the lipid thin film on the surface of the electrode and acts as a mediator that transfers the transfer of the charge to and from the electrode active substance in the solution to be measured to the electrode, so that an electric current flows and is detected. You can do it. The current value is proportional to the number of labeled antigens having an electron active substance as a mediator, and the number of labeled antigens is proportional to the antigens in the solution to be measured. The number or concentration of the antigen in the liquid can be measured.
【０００７】[0007]
【発明の実施の形態】請求項１に記載の発明は、不溶化
抗体と、この不溶化抗体に抗原抗体反応により結合した
電子伝達物質で標識した標識抗原と、電極活性物質を有
し、被測定液中の抗原との接触により、抗原と標識抗原
の置換反応により遊離する標識抗原を、電極表面に形成
した脂質薄膜に吸着させ、標識抗原の電子伝達物質と、
電極活性物質の電荷の授受を電流によって検出し被測定
液中の抗原の測定方法としたことにより、被測定液中の
抗原の数および濃度を、標識抗原の電子伝達物質と、電
子活性物質の電荷の授受による電流値を介して検出する
ことができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The invention according to claim 1 has an insolubilized antibody, a labeled antigen labeled with an electron transfer substance bound to the insolubilized antibody by an antigen-antibody reaction, and an electrode active substance, Upon contact with the antigen in the labeled antigen, the labeled antigen liberated by the substitution reaction between the antigen and the labeled antigen is adsorbed on the lipid thin film formed on the electrode surface, and the electron carrier of the labeled antigen is
The number and concentration of the antigens in the solution to be measured are determined by measuring the number of the antigens in the solution to be measured and the electron transfer substance of the labeled antigen and the electron active substance by measuring the transfer of the charge of the electrode active substance by the electric current and measuring the antigen in the liquid to be measured. It can be detected through the current value due to the transfer of charges.
【０００８】請求項２に記載の発明は、電子伝達物質
が、脂質薄膜と疎水性相互作用により吸着する請求項１
に記載の測定方法としたことにより、電子伝達物質が脂
質薄膜表面に吸着し、被測定液中の電極活性物質との電
荷の授受を電極へと伝えることができる。According to a second aspect of the present invention, the electron transfer substance is adsorbed to the lipid thin film by hydrophobic interaction.
According to the measuring method described in (1), the electron transfer substance is adsorbed on the surface of the lipid thin film, and the transfer of the charge to and from the electrode active substance in the liquid to be measured can be transmitted to the electrode.
【０００９】請求項３に記載の発明は、電子伝達物質
が、遷移金属錯体を有する請求項１に記載の測定方法と
したことにより、錯体中での金属は、配位子に配位結合
しており、電気的活性が高く、容易に金属イオンとなり
得ることができるため、メディエータとして機能し易
い。According to the invention described in claim 3, the electron transfer substance has a transition metal complex. Therefore, the metal in the complex is coordinate-bonded to the ligand. Since it has high electrical activity and can easily become a metal ion, it easily functions as a mediator.
【００１０】請求項４に記載の発明は、遷移金属錯体
が、メタロセン、ポルフィリン錯体、フタロシアニン錯
体の少なくとも１つである請求項３に記載の測定方法と
したことにより、電気的に可逆な酸化還元反応を起こす
ため、電位走査を繰り返して行うことができ、また、メ
タロセンのビスシクロペンタジエン、ポルフィリン、フ
タロシアニンは芳香族化合物であり、疎水性を有するの
で、電極表面の脂質薄膜に疎水性相互作用により吸着で
きる。また、ポルフィリン、フタロシアニンの比較的平
面的な構造は、表面への吸着に有効に働く。According to a fourth aspect of the present invention, the transition metal complex is at least one of a metallocene, a porphyrin complex and a phthalocyanine complex. Since the reaction occurs, potential scanning can be repeated, and the metallocenes biscyclopentadiene, porphyrin, and phthalocyanine are aromatic compounds and have a hydrophobic property. Can be adsorbed. Further, the relatively planar structure of porphyrin and phthalocyanine works effectively for adsorption on the surface.
【００１１】請求項５に記載の発明は、被測定液中に電
極活性物質を溶解する請求項１に記載の測定方法とした
ことにより、電気応答性を持たせるために必要な電極活
性物質を測定環境中に添加することができ、この電極活
性物質との電荷の授受を、電子伝達物質が行い、さらに
電極へと伝えるのである。According to the fifth aspect of the present invention, the electrode active substance necessary for imparting electric response is obtained by using the measuring method according to the first aspect in which the electrode active substance is dissolved in the liquid to be measured. It can be added to the measurement environment, and the electron transfer material transfers and receives charges to and from the electrode active material, and further transfers to the electrode.
【００１２】請求項６に記載の発明は、電極活性物質
が、金属イオンを含む電解質である請求項１に記載の測
定方法としたことにより、電極活性物質が被測定液に容
易に溶解することができ、所定の電圧の印可により、金
属イオンの酸化還元反応が起き、それにともない電荷の
出し入れが発生する。この電子を電子伝達物質が授受
し、電極へと伝えるので電流が流れるのである。According to the invention described in claim 6, the electrode active substance is an electrolyte containing a metal ion, so that the electrode active substance is easily dissolved in the liquid to be measured. When a predetermined voltage is applied, a redox reaction of the metal ion occurs, and the charge is taken in and out accordingly. The electron transfer material transfers and receives the electrons to the electrodes, so that a current flows.
【００１３】請求項７に記載の発明は、脂質薄膜が、単
分子膜あるいは重層膜である請求項１に記載の測定方法
としたことにより、ｎｍオーダーの非常に薄い膜である
ため、表面に吸着した電子伝達物質が電極への電荷を伝
えやすく、結果として高感度、高精度を実現できる。ま
た、膜厚の管理もし易いため、高感度を安定して提供で
きる。According to the invention described in claim 7, since the lipid thin film is a monomolecular film or a multilayer film, it is a very thin film of nm order. The adsorbed electron transfer substance easily transfers the charge to the electrode, and as a result, high sensitivity and high accuracy can be realized. Further, since the film thickness can be easily controlled, high sensitivity can be stably provided.
【００１４】請求項８に記載の発明は、脂質薄膜が、イ
オウ原子を介して電極の金属材料と結合する請求項１に
記載の測定方法としたことにより、絶縁性を有する緻密
な脂質薄膜を容易に作成でき、電子伝達物質から電荷の
授受以外の電気応答を防ぎ、高感度を安定して提供でき
る。The invention according to claim 8 provides a dense lipid thin film having an insulating property by the measuring method according to claim 1, wherein the lipid thin film is bonded to the metal material of the electrode through a sulfur atom. It can be easily prepared, and it can provide an electric response other than the transfer of electric charges from the electron transfer substance and stably provide high sensitivity.
【００１５】請求項９に記載の発明は、不溶化抗体と、
この不溶化抗体に抗原抗体反応により結合した電子伝達
物質で標識した標識抗原と、電極活性物質と、作用極と
対極の一対の電極と、前記作用極の表面に形成した脂質
薄膜とを有し、被測定液中には標識抗原を置換反応によ
り遊離させ脂質薄膜に吸着させる抗原を有し、標識抗原
の電子伝達物質と電極活性物質の電荷の授受を電流によ
って検出し被測定液中の抗原を測定する検出手段を備え
た測定装置としたことにより、遊離した標識抗原が作用
極表面の脂質薄膜に吸着し、被測定液中の電極活性物質
との電荷の授受を電極へと伝えるメディエータとして作
用するため、電流が流れこれを検出できるのである。さ
らに、作用極表面の脂質薄膜により、絶縁性を有するこ
とができるので、電子伝達物質から電荷の授受以外の電
気応答を防ぐことができ、より高精度の測定を行うこと
ができる。The invention according to claim 9 is an insolubilized antibody,
A labeled antigen labeled with an electron transfer substance bound to the insolubilized antibody by an antigen-antibody reaction, an electrode active substance, a pair of electrodes of a working electrode and a counter electrode, and a lipid thin film formed on the surface of the working electrode, The solution to be measured has an antigen that is released by the substitution reaction and adsorbed to the lipid thin film, and the transfer of the charge between the electron transfer substance of the labeled antigen and the electrode active substance is detected by the current to detect the antigen in the solution to be measured. By using a measuring device equipped with a detection means for measuring, the released labeled antigen is adsorbed on the lipid thin film on the surface of the working electrode, and acts as a mediator that transfers the transfer of charge to and from the electrode active substance in the solution to be measured to the electrode. Therefore, a current flows and can be detected. Furthermore, since the lipid thin film on the surface of the working electrode can have an insulating property, it is possible to prevent an electrical response other than the transfer of charges from the electron transfer substance, and it is possible to perform a more accurate measurement.
【００１６】請求項１０に記載の発明は、電子伝達物質
が、遷移金属錯体を有する請求項２に記載の測定装置と
したことにより、錯体中での金属は、配位子に配位結合
しており、電気的活性が高く、容易に金属イオンとなり
得ることができるため、メディエータとして機能し易
い。According to the tenth aspect of the invention, the electron transfer substance is the measuring device according to the second aspect having a transition metal complex, whereby the metal in the complex is coordinate-bonded to the ligand. Since it has high electrical activity and can easily become a metal ion, it easily functions as a mediator.
【００１７】請求項１１に記載の発明は、電極活性物質
が、金属イオンを含む電解質である請求項２に記載の測
定装置としたことにより、電極活性物質が被測定液に容
易に溶解することができ、所定の電圧の印可により、金
属イオンの酸化還元反応が起き、それにともない電荷の
出し入れが発生する。この電子を電子伝達物質が授受
し、電極へと伝えるので電流が流れるのである。According to the eleventh aspect of the present invention, the electrode active substance is an electrolyte containing a metal ion, so that the electrode active substance is easily dissolved in the liquid to be measured. When a predetermined voltage is applied, a redox reaction of the metal ion occurs, and the charge is taken in and out accordingly. The electron transfer material transfers and receives the electrons to the electrodes, so that a current flows.
【００１８】[0018]
【実施例】（実施例１）本発明の実施例１における測定
方法およびその装置について図１を基に説明する。EXAMPLES Example 1 A measuring method and an apparatus therefor in Example 1 of the present invention will be described with reference to FIG.
【００１９】図において、１は電極である作用極で、そ
の表面上に脂質２の分子からなる脂質単分子膜である脂
質薄膜３が形成されている。４は作用極１とともに電極
を構成する対極である。作用極１と対極４の両電極の間
は、本実施例の中では、被測定液に相当する電解質水溶
液９（以下、被測定液と称する）で満たされている。こ
の被測定液９は本測定系から見れば外来物である。電解
質濃度は、体液あるいは尿程度の塩濃度を想定してい
る。In the figure, reference numeral 1 is a working electrode which is an electrode, and a lipid thin film 3 which is a lipid monomolecular film composed of molecules of lipid 2 is formed on the surface thereof. Reference numeral 4 is a counter electrode that constitutes an electrode together with the working electrode 1. A space between the working electrode 1 and the counter electrode 4 is filled with an electrolyte aqueous solution 9 (hereinafter, referred to as a measured liquid) corresponding to the measured liquid in this embodiment. This measured liquid 9 is an alien substance when viewed from the present measurement system. The electrolyte concentration is assumed to be a body fluid or urine salt concentration.
【００２０】５は被測定液９中に溶解し拡散している電
極活性物質、６は被測定液９中の標識抗原であり、図示
されていない被測定物の抗原との置換反応により、図示
されていない不溶化抗体から遊離し、脂質薄膜３の表面
に吸着する。標識抗原６は、抗原７に標識化合物（マー
カー）として、電子伝達物質８が結合しており、この電
子伝達物質８が電極活性物質５と電荷を授受し、作用極
１へ伝えるメディエータとして働くのである。Reference numeral 5 denotes an electrode active substance which is dissolved and diffused in the liquid to be measured 9, and 6 is a labeled antigen in the liquid to be measured 9, which is shown by a substitution reaction with the antigen of the not-shown substance to be measured. It is released from the insolubilized antibody that has not been formed and is adsorbed on the surface of the lipid thin film 3. The labeled antigen 6 has an electron transfer substance 8 bound to the antigen 7 as a labeling compound (marker), and this electron transfer substance 8 acts as a mediator that exchanges charges with the electrode active substance 5 and transfers it to the working electrode 1. is there.
【００２１】本実施例の脂質薄膜３である脂質単分子膜
は、面積１平方センチメートルのもとで１０の８乗オー
ム程度の高い抵抗を有し、絶縁性を付与している。作用
極１に脂質薄膜３がなく、絶縁性を付与していない場合
には、被測定液９中に存在する電極活性物質５により、
作用極１への電荷の移動が起ってしまうが、本実施例の
様に、作用極１に脂質薄膜３を形成して絶縁性を付与し
た場合には、電極活性物質５による作用極１への電荷の
移動は起きない。脂質薄膜３の表面に電子伝達物質８が
吸着すると電子伝達物質８がメディエータとして働くた
めに、作用極１へ電荷が移動、または作用極１から電荷
が移動するのである。The lipid monolayer, which is the lipid thin film 3 of this embodiment, has a high resistance of about 10 8 ohms under an area of 1 square centimeter and imparts an insulating property. When the working electrode 1 does not have the lipid thin film 3 and is not provided with the insulating property, the electrode active substance 5 present in the measured liquid 9 causes
Although the charge transfer to the working electrode 1 occurs, when the lipid thin film 3 is formed on the working electrode 1 to provide the insulating property as in the present embodiment, the working electrode 1 by the electrode active substance 5 is used. No charge transfer to. When the electron transfer substance 8 is adsorbed on the surface of the lipid thin film 3, the electron transfer substance 8 acts as a mediator, so that the charge moves to or from the working electrode 1.
【００２２】電荷の移動について、電子伝達物質８にフ
ェロセン、電極活性物質５に過塩素酸鉄（III）を用い
て説明する。フェロセンは以下の様な反応により、Ｆｅ
3+の還元に対してのメディエータとして機能する。The transfer of charges will be described using ferrocene as the electron transfer substance 8 and iron (III) perchlorate as the electrode active substance 5. Ferrocene is converted into Fe by the following reaction.
Functions as a mediator for 3+ reduction.
【００２３】図示されていない外部電源により、Ｆｅ2+
／Ｆｅ3+の酸化還元電位以下の電圧を印可すると（化
１）と（化２）の反応が繰り返されて、大きな電流が流
れることとなる。なお、化学式中、省略のためフェロセ
ンはＦｃとし、フェロセンが酸化されたカチオンであ
る、フェロセニウムカチオンをＦｃ+と示した。Fe 2+ is supplied by an external power source (not shown).
When a voltage lower than the redox potential of / Fe 3+ is applied, the reactions of (Chemical formula 1) and (Chemical formula 2) are repeated, and a large current flows. In the chemical formula, ferrocene is represented by Fc for the sake of omission, and the ferrocenium cation, which is a cation obtained by oxidizing ferrocene, is represented by Fc + .
【００２４】(化１)
Ｆｃ+＋ｅ-→Ｆｃ
（化２）
Ｆｃ＋Ｆｅ3+→Ｆｃ+＋Ｆｅ2+
もし、作用極１に脂質薄膜３がなく、未修飾の電極であ
れば、（化３）のようなＦｅ3+の還元による電流が流れ
てしまい、標識抗原６に起因する電気応答を正確に測定
できない。脂質薄膜３が作用極１上に存在することによ
り、脂質薄膜３が、作用極１とＦｅ3+との間の直接の電
子移動を遮断するため、標識抗原６に起因する電気応答
のみを測定できるのである。(Formula 1) Fc + + e − → Fc (Formula 2) Fc + Fe 3+ → Fc + + Fe 2+ If the working electrode 1 does not have the lipid thin film 3 and is an unmodified electrode, (Formula 3) As described above, a current flows due to reduction of Fe 3+ , and the electrical response due to the labeled antigen 6 cannot be accurately measured. Since the lipid thin film 3 is present on the working electrode 1, the lipid thin film 3 blocks direct electron transfer between the working electrode 1 and Fe 3+ , so that only the electrical response caused by the labeled antigen 6 is measured. You can do it.
【００２５】（化３）
Ｆｅ3+→Ｆｅ2+＋ｅ-
また、電位走査を複数回繰り返し、得られた信号（電流
値）を積算し、検出値の増幅を行うことにより、高感度
の検出が可能となる。この電流検出は、図示していない
が検出手段により適宜検出することができるものであ
り、前記測定方法を搭載した測定装置を提供することが
できる。(Chemical Formula 3) Fe 3+ → Fe 2+ + e − In addition, the potential scanning is repeated a plurality of times, the obtained signals (current values) are integrated, and the detected values are amplified to achieve highly sensitive detection. Is possible. This current detection can be appropriately detected by a detection means (not shown), and it is possible to provide a measuring device equipped with the above-mentioned measuring method.
【００２６】（実施例２）本発明の実施例２について図
２、図３を基に説明する。(Embodiment 2) A second embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.
【００２７】図２において、作用極１は筒状の対極４内
に先端を挿入したもので、図１における作用極１、対極
４と同じである。２２は筒状の対極４の内部に粒状の不
溶化抗体を充填した不溶化抗体層、２４は電極活性物質
を充填した電極活性物質層である。２１は作用極１と反
対側の被測定液入り口であって、抗原を含む被測定液９
は、ここより不溶化抗体層２２および電極活性物質層２
４を毛細管現象により通過し、作用極１の先端に達し、
作用極１と接触する。In FIG. 2, the working electrode 1 has a tip inserted into a cylindrical counter electrode 4, and is the same as the working electrode 1 and the counter electrode 4 in FIG. Reference numeral 22 is an insolubilized antibody layer in which a granular insolubilized antibody is filled inside the cylindrical counter electrode 4, and 24 is an electrode active substance layer in which an electrode active substance is filled. Reference numeral 21 denotes an inlet of the measured liquid on the side opposite to the working electrode 1, which is a measured liquid 9 containing an antigen.
Is the insolubilized antibody layer 22 and the electrode active substance layer 2 from here.
4 by capillary action, reaching the tip of the working electrode 1,
Contact with the working electrode 1.
【００２８】図３は被測定液の移動とともに測定原理を
示したもので、３１は被測定液９中の抗原で、本実施例
における被測定物にあたる。被測定液９の電解質濃度
は、体液あるいは尿程度の塩濃度を想定している。被測
定液９は毛細管現象により不溶化抗体層２２に入る。こ
こには、不溶化抗体基材３３の表面に、抗原３１に対応
する抗体３２が結合して合わせて不溶化抗体３４を形成
しており、さらに、被測定物である抗原３１と同一の抗
原７を電子伝達物質８で修飾した標識抗原６が抗原抗体
反応によりあらかじめ不溶化抗体３４に結合している。FIG. 3 shows the principle of measurement along with the movement of the solution to be measured. Reference numeral 31 is the antigen in the solution 9 to be measured, which corresponds to the object to be measured in this embodiment. The electrolyte concentration of the measured liquid 9 is assumed to be a salt concentration of body fluid or urine. The liquid 9 to be measured enters the insolubilized antibody layer 22 by the capillary phenomenon. Here, an antibody 32 corresponding to the antigen 31 is bound to the surface of the insolubilized antibody base material 33 to form an insolubilized antibody 34, and the same antigen 7 as the antigen 31 to be measured is further added. The labeled antigen 6 modified with the electron transfer substance 8 is bound to the insolubilized antibody 34 in advance by the antigen-antibody reaction.
【００２９】抗原３１と、標識抗原６の抗原７部は同一
物質であり、不溶化抗体３４に対しては同等の結合力を
持つ。そのため、不溶化抗体層２２に流入した抗原３１
は、不溶化抗体３４と結合した標識抗原６と置換反応を
行い、標識抗原６が遊離する。遊離した標識抗原６は、
被測定液９の移動にともない作用極１に達する。この
際、不溶化抗体層２２を通過した被測定液９は、次に電
極活性物質層２４に入るが、ここで電極活性物質５は被
測定液９中に溶解して拡散する。よって作用極１と対極
４は標識抗原６および電極活性物質５を含む被測定液９
を介して接続されることとなる。The antigen 31 and the antigen 7 part of the labeled antigen 6 are the same substance, and have the same binding force to the insolubilized antibody 34. Therefore, the antigen 31 that has flowed into the insolubilized antibody layer 22
Undergoes a substitution reaction with the labeled antigen 6 bound to the insolubilized antibody 34, and the labeled antigen 6 is released. The released labeled antigen 6 is
The working electrode 1 is reached as the liquid 9 to be measured moves. At this time, the liquid to be measured 9 that has passed through the insolubilized antibody layer 22 next enters the electrode active substance layer 24, where the electrode active substance 5 is dissolved and diffused in the liquid to be measured 9. Therefore, the working electrode 1 and the counter electrode 4 are the measured liquid 9 containing the labeled antigen 6 and the electrode active substance 5.
Will be connected via.
【００３０】この状態の両電極１、４間に、電圧を印可
することにより、電極活性物質５および電子伝達物質８
の酸化還元反応に伴う、電子の授受が起こり、それによ
り両電極２３間に電流が流れ、これを検出手段により検
出するのである。By applying a voltage between the electrodes 1 and 4 in this state, the electrode active substance 5 and the electron transfer substance 8
Electrons are exchanged with the oxidation-reduction reaction, and a current flows between both electrodes 23, which is detected by the detection means.
【００３１】（実施例３）本発明の実施例３における電
子伝達物質の実施例について図４を基に説明する。(Embodiment 3) An embodiment of the electron transfer material in Embodiment 3 of the present invention will be described with reference to FIG.
【００３２】図において、４１は卵胞ホルモンの１種で
あるエストラジオールの残基、４２はグルクロン酸残基
であり、両者を合わせエストラジオールグルクロン酸抱
合体の残基を形成している。エストラジオールグルクロ
ン酸抱合体は卵抱ホルモンの尿中***型であり、尿を被
測定液として卵抱ホルモンを測定する場合の抗原（図３
における３１）あるいは被測定物である。４３はフェロ
セン残基であり、標識（マーカー）である電子伝達物質
（図３における８）の一例である。４４と４５は抗原と
電子伝達物質とをつなぐ架橋剤残基であり、架橋剤残基
４４の原料は無水メルカプトこはく酸、架橋剤残基４５
の原料は２価架橋剤であるサクシニミディルプロピオニ
ックマレイミドである。In the figure, 41 is a residue of estradiol, which is one type of estrogen, and 42 is a glucuronic acid residue, which together form the residue of an estradiol glucuronic acid conjugate. The estradiol glucuronide conjugate is a urinary excretion type of ovulatory hormone, and an antigen when ovarian hormone is measured using urine as a test solution (Fig. 3
31) or the object to be measured. 43 is a ferrocene residue, which is an example of an electron transfer substance (8 in FIG. 3) that is a label (marker). 44 and 45 are crosslinker residues that connect the antigen and the electron mediator, and the raw material of the crosslinker residue 44 is mercaptosuccinic anhydride and the crosslinker residue 45.
The raw material is succinimidyl propionic maleimide, which is a divalent cross-linking agent.
【００３３】フェロセン残基４３は、メタロセンの１種
であり、鉄原子を中心として２個の正五角形構造の炭素
平面環（シクロペンタジエニル環）が互いに平衡し、か
つ鉄原子が対称の中心となるようなサンドイッチ構造と
なっている。それぞれのシクロペンタジエニル環には、
６個のπ電子が所属して芳香族形の電子構造となり、こ
の環と鉄原子が配位結合により結合されている、単純な
一電子酸化還元反応を示し、フェロセンの状態または、
フェロセニウムカチオンの状態をとる。シクロペンタジ
エニル環の疎水性により、アルコール、エーテル、ベン
ゼンなどの有機溶剤に可溶で、水には不溶である。その
ため、被測定液である水溶液から移動し、脂質薄膜に表
面に吸着し易い。The ferrocene residue 43 is one kind of metallocene, and two carbon pentacycles (cyclopentadienyl rings) having a regular pentagonal structure centering on an iron atom are in equilibrium with each other and the iron atom is a symmetric center. It has a sandwich structure. For each cyclopentadienyl ring,
An aromatic electronic structure in which 6 π-electrons belong to each other, and a simple one-electron redox reaction in which this ring and an iron atom are bonded by a coordination bond is shown, and the state of ferrocene or
Takes the state of ferrocenium cation. Due to the hydrophobic nature of the cyclopentadienyl ring, it is soluble in organic solvents such as alcohols, ethers and benzene, but insoluble in water. Therefore, it easily moves from the solution to be measured and is adsorbed on the surface of the lipid thin film.
【００３４】本実施例では、メタロセンとして、フェロ
センを用い例示したが、チタノセン、バナジノセン、ク
ロモセン、マンガノセン、フェロセン、コバルトセン、
ニッケロセン、モリブデノセン、ルテノセン、ロジノセ
ン、ルテトセン、タンタロセン、タングステノセン、オ
スミノセン、イリジノセンであっても同様の効果を示
す。Although ferrocene was used as the metallocene in this example, titanocene, vanadinocene, chromocene, manganocene, ferrocene, cobaltocene,
Even nickelocene, molybdenocene, ruthenocene, rosinocene, lutetocene, tantalocene, tungstenocene, osminocene, and iridinocene show similar effects.
【００３５】また、親水基の修飾を受けていないポルフ
ィリン錯体であっても同様の電子伝達効果を示す。ポル
フィリン錯体はその内部に金属陽イオンを取り込みアミ
ンとの間に配位結合を形成した金属錯体を形成する。ポ
ルフィリン環の平面的な構造は、脂質薄膜表面への吸着
に有効である。Further, even a porphyrin complex which is not modified with a hydrophilic group exhibits a similar electron transfer effect. The porphyrin complex incorporates a metal cation therein to form a metal complex having a coordination bond with an amine. The planar structure of the porphyrin ring is effective for adsorption on the lipid thin film surface.
【００３６】ポルフィリンと類似の構造を持ち、ポルフ
ィリンと同様のイオン伝導性を与える物質にフタロシア
ニンについても同様の電子伝達効果を示す。Phthalocyanine, which has a structure similar to that of porphyrin and gives ionic conductivity similar to that of porphyrin, also shows a similar electron transfer effect.
【００３７】なお、実施例１、２では、図４の構造は外
部で合成して測定系に持ち込むものであり、実施例３で
は不溶化抗体に抗原抗体反応によって結合した標識抗原
として用いるものである。In Examples 1 and 2, the structure of FIG. 4 is synthesized externally and brought into a measurement system, and in Example 3, it is used as a labeled antigen bound to an insolubilized antibody by an antigen-antibody reaction. .
【００３８】（実施例４）本発明の実施例４における電
極活性物質について説明する。電極活性物質５は、金属
イオンを含む電解質からなり、被測定液である水溶液に
溶解して、金属イオンと陰イオンに解離する。所定の電
圧の印可により、金属イオンの酸化還元反応が起き、そ
れにともない電荷の出し入れが発生する。この電子を電
子伝達体が授受し、電極へと伝えるので電流が流れるの
である。(Embodiment 4) An electrode active material in Embodiment 4 of the present invention will be described. The electrode active substance 5 is composed of an electrolyte containing metal ions, is dissolved in an aqueous solution as a liquid to be measured, and dissociates into metal ions and anions. By applying a predetermined voltage, a redox reaction of metal ions occurs, and accordingly charges are taken in and out. This electron is transferred by the electron carrier and transmitted to the electrode, so that a current flows.
【００３９】金属イオンを含む電解質としては、金属錯
塩や、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の金属塩があげられ
る。金属錯塩としては、ジシアノ銀（I）酸塩、ジチオ
スルファト銀（I）酸塩、ジアンミン銀（I）塩、ヘキサ
シアノ鉄（III）酸塩があげられる。また、金属塩とし
ては、塩化亜鉛、塩化コバルト（II）、塩化銅（II）、
塩化ニッケル（II）、塩化マンガン（II）等の塩酸塩
や、硫酸銅（II）、硫酸鉄（II）、硫酸マンガン（I
I）、硫酸ニッケル（II）等の硫酸塩や、硝酸亜鉛、硝
酸銀、硝酸コバルト（II）、硝酸銅（II）、硝酸鉄（I
I）等の硝酸塩があげられる。Examples of the electrolyte containing metal ions include metal complex salts and metal salts such as hydrochlorides, sulfates and nitrates. Examples of the metal complex salt include dicyanosilver (I) salt, dithiosulfato silver (I) salt, diammine silver (I) salt, and hexacyanoferrate (III) salt. Further, as the metal salt, zinc chloride, cobalt (II) chloride, copper (II) chloride,
Hydrochlorides such as nickel (II) chloride and manganese (II) chloride, copper (II) sulfate, iron (II) sulfate, manganese sulfate (I
I), sulfates such as nickel (II) sulfate, zinc nitrate, silver nitrate, cobalt (II) nitrate, copper (II) nitrate, iron nitrate (I
I) and other nitrates.
【００４０】（実施例５）本発明の実施例５における脂
質薄膜について図５を基に説明する。Example 5 A lipid thin film in Example 5 of the present invention will be described with reference to FIG.
【００４１】図において、作用極１は金属銅の電極であ
り、この電極の銅表面を覆って脂質薄膜３である単分子
膜が形成されている。本実施例における脂質分子の原料
は６−アミノ−ヘキサンチオールである。脂質分子と銅
とは、イオウ原子５３を介して結合する。５４はアルキ
ル鎖であって、この層は疎水性で脂質薄膜３の高抵抗の
主体である。本実施例の単分子膜は、脂質薄膜としては
究極の薄さを持ち、かつ均一な厚みをもつので、安定し
た高感度が得られる。アルキル鎖長の影響は、鎖長が長
くなるほど、絶縁性が上がる。５５は末端の修飾基であ
るアミノ基である。In the figure, the working electrode 1 is an electrode of metallic copper, and a monomolecular film which is a lipid thin film 3 is formed so as to cover the copper surface of this electrode. The raw material of the lipid molecule in this example is 6-amino-hexanethiol. The lipid molecule and copper are bonded via the sulfur atom 53. 54 is an alkyl chain, and this layer is hydrophobic and is the main constituent of the lipid thin film 3 with high resistance. The monomolecular film of the present example has the ultimate thinness as a lipid thin film and has a uniform thickness, so that stable high sensitivity can be obtained. The influence of the alkyl chain length is that the insulating property increases as the chain length increases. 55 is an amino group which is a terminal modifying group.
【００４２】また、カルボン酸基のように、末端のアミ
ノ基５５と化学結合するような置換基をもつアルキルを
反応させて、２重の脂質膜としても良い。この２分子膜
の脂質薄膜は、単分子膜と同様に均一であり、単分子膜
に次いで感度が高く、単分子膜以上に絶縁耐性が高いも
のである。Also, an alkyl having a substituent such as a carboxylic acid group that chemically bonds to the terminal amino group 55 may be reacted to form a double lipid membrane. The lipid thin film of the bilayer is uniform like the monolayer, has the second highest sensitivity after the monolayer, and has a higher insulation resistance than the monolayer.
【００４３】また、末端修飾基がメチル基である単分子
膜であっても、長鎖のハイドロカーボンをもつカルボン
酸（これは高級脂肪酸とよばれる）あるいは長鎖のハイ
ドロカーボンを持つ１から４級アミンを水中で作用させ
ると、長鎖のハイドロカーボンが単分子層に向けて配向
し、カルボキシル基あるいはアミン基が水に向けて配向
し、容易に２重層の脂質膜が得られる。Further, even in the case of a monomolecular film in which the terminal modifying group is a methyl group, a carboxylic acid having a long chain hydrocarbon (this is called a higher fatty acid) or 1 to 4 having a long chain hydrocarbon. When a primary amine is allowed to act in water, long-chain hydrocarbons are oriented toward the monomolecular layer, and carboxyl groups or amine groups are oriented toward water, so that a bilayer lipid membrane can be easily obtained.
【００４４】また、２分子膜などの重層膜はＬＢ膜（ラ
ングミュア・ブロジェット膜）を電極上に作成すること
によってもできる。A multilayer film such as a bimolecular film can be formed by forming an LB film (Langmuir-Blodgett film) on the electrode.
【００４５】（実施例６）本発明の実施例６における脂
質薄膜について、さらに図５をもとに説明する。Example 6 A lipid thin film according to Example 6 of the present invention will be further described with reference to FIG.
【００４６】図中、イオウ原子５３は、その原料であっ
た６−アミノヘキサンチオールではチオール基として存
在していたものである。チオール基は銀、銅、鉄、タン
グステンなどの多くの金属に作用して容易に結合する。
その結合が、図中のイオウ原子５３を介しての電極金属
との結合である。このように、アルキルチオールは金属
電極１上に容易に脂質単分子膜を形成することができ
る。そのようにしてできた単分子膜は自己組織化単分子
膜と呼ばれる。本実施例は、これを応用したものであっ
て、容易に均質高感度な作用極を作成することができ
る。In the figure, the sulfur atom 53 was present as a thiol group in the starting material, 6-aminohexanethiol. The thiol group acts on many metals such as silver, copper, iron and tungsten, and easily bonds to them.
The bond is a bond with the electrode metal via the sulfur atom 53 in the figure. Thus, the alkyl thiol can easily form a lipid monolayer on the metal electrode 1. The monolayer thus formed is called a self-assembled monolayer. This embodiment is an application of this, and it is possible to easily create a homogeneous and highly sensitive working electrode.
【００４７】同様の自己組織化単分子膜を生成するもの
に、トリアジン環に２つのチオール基を導入したトリア
ジチオール基を有する長鎖のアルキルが知られる。この
場合も、トリアジチオールのチオール基が金属との結合
を行い、単純なチオール基のみの結合と同様な、均一で
高感度の脂質薄膜３を有する作用極１ができる。A long-chain alkyl having a triadhithiol group in which two thiol groups are introduced into a triazine ring is known to produce a similar self-assembled monolayer. Also in this case, the thiol group of triadithiol binds to the metal, and the working electrode 1 having the uniform and highly sensitive lipid thin film 3 is formed, which is similar to the simple binding of only the thiol group.
【００４８】（実施例７）本発明の実施例７における抗
体について図６を基に説明する。(Example 7) The antibody in Example 7 of the present invention will be described with reference to FIG.
【００４９】図中、６１は本実施例では不溶化基材とし
て選んだポリスチレンビーズである。ポリスチレンはア
ルキル主鎖にフェニル基６２の側鎖が結合した分子構造
を有する。このポリスチレンに臭素分子を作用させる
と、フェニル基６２の水素が臭素原子と置換した臭素化
ポリスチレンが得られる。この臭素化ポリスチレンは活
性であって、抗体などのタンパクと反応してフェニル基
６２を介した架橋結合ができる。６３は被測定物である
抗原に対応する抗体である。In the figure, 61 is a polystyrene bead selected as the insolubilizing base material in this embodiment. Polystyrene has a molecular structure in which a side chain of a phenyl group 62 is bonded to an alkyl main chain. When a bromine molecule is allowed to act on this polystyrene, brominated polystyrene in which the hydrogen of the phenyl group 62 is replaced with a bromine atom is obtained. This brominated polystyrene is active and can react with proteins such as antibodies to form cross-links through the phenyl group 62. 63 is an antibody corresponding to the antigen to be measured.
【００５０】図２に示す不溶化抗体層２２は、このよう
にして得た不溶化抗体を筒状の対極４に充填したもので
ある。また、例示の方法以外にも、不溶化の方法は多種
類あり、また、その形状もビーズ以外に多種類のものが
知られ、これらはなんら限定されるものではない。The insolubilized antibody layer 22 shown in FIG. 2 is obtained by filling the tubular counter electrode 4 with the insolubilized antibody thus obtained. In addition to the exemplified method, there are various types of insolubilization methods, and there are various types of shapes other than beads, and these are not limited at all.
【００５１】以上、実施例１〜７について説明したが、
これらはいずれも測定方法としてはもちろんのこと、そ
の装置としても採用できるものである。そしてまた、各
実施例を適宜組み合わせて本発明の測定方法およびその
装置を構成することもできることは言うまでもない。The first to seventh embodiments have been described above.
Any of these can be adopted not only as a measuring method but also as an apparatus thereof. Further, it goes without saying that the measuring method and the apparatus thereof of the present invention can be configured by appropriately combining the respective examples.
【００５２】[0052]
【発明の効果】以上のように、本発明の測定方法および
その装置は、電気化学的に不活性な被検出物である抗原
の測定を、電気応答として取り出すことができ、さら
に、感度、精度、簡便性、迅速性を併せ持つものであ
る。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, the measuring method and the apparatus thereof of the present invention can take out the measurement of an antigen, which is an electrochemically inactive substance to be detected, as an electric response, and further, can improve the sensitivity and the accuracy. It has both simplicity and speed.
【図１】本発明の実施例１における測定方法およびその
装置の構成図FIG. 1 is a configuration diagram of a measuring method and an apparatus therefor according to a first embodiment of the present invention.
【図２】本発明の実施例２における測定方法およびその
装置の全体構成図FIG. 2 is an overall configuration diagram of a measuring method and its apparatus according to a second embodiment of the present invention.
【図３】同測定方法およびその装置の測定原理を示す図FIG. 3 is a diagram showing a measurement principle of the measurement method and the apparatus.
【図４】本発明の実施例３における電子伝達物質の構成
図FIG. 4 is a structural diagram of an electron mediator in Example 3 of the present invention.
【図５】本発明の実施例５、６における脂質薄膜の構造
図FIG. 5 is a structural diagram of lipid thin films in Examples 5 and 6 of the present invention.
【図６】本発明の実施例７における不溶化抗体の構造図FIG. 6 is a structural diagram of an insolubilized antibody in Example 7 of the present invention.
１ 作用極 ３ 脂質薄膜 ４ 対極 ５ 電極活性物質 ６ 標識抗原 ７ 抗原 ８ 電子伝達物質 ９ 電解質水溶液（被測定液） ２２ 不溶化抗体層 ２４ 電極活性物質層 ３３ 不溶化基材 ３４ 不溶化抗体 ４１ エストラジオール残基 ４２ グルクロン酸残基 ４３ フェロセン残基 ５３ イオウ原子 ５４ アルキル鎖 ５５ アミノ基 ６１ ポリスチレンビーズ ６２ フェニル基 ６３ 抗体 1 Working pole 3 lipid thin film 4 opposite poles 5 Electrode active substance 6 labeled antigen 7 antigen 8 electron mediators 9 Electrolyte solution (solution to be measured) 22 Insolubilized antibody layer 24 Electrode active material layer 33 Insolubilized base material 34 Insolubilized antibody 41 Estradiol residue 42 Glucuronic acid residue 43 ferrocene residue 53 Sulfur atom 54 alkyl chain 55 amino group 61 Polystyrene beads 62 phenyl group 63 antibody
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 宮地 寿明 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電器 産業株式会社内 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (72) Inventor Toshiaki Miyaji 1006 Kadoma, Kadoma-shi, Osaka Matsushita Electric Sangyo Co., Ltd.
Claims (11)
体反応により結合した電子伝達物質で標識した標識抗原
と、電極活性物質を有し、被測定液中の抗原との接触に
より、抗原と標識抗原の置換反応により遊離する標識抗
原を、電極表面に形成した脂質薄膜に吸着させ、標識抗
原の電子伝達物質と、電極活性物質の電荷の授受を電流
によって検出し被測定液中の抗原の測定方法。1. An insolubilized antibody, a labeled antigen labeled with an electron transfer substance bound to the insolubilized antibody by an antigen-antibody reaction, and an electrode active substance, which are labeled with the antigen by contact with the antigen in the liquid to be measured. The labeled antigen released by the substitution reaction of the antigen is adsorbed on the lipid thin film formed on the electrode surface, and the transfer of the charge of the electron carrier of the labeled antigen and the charge of the electrode active substance is detected by the electric current to measure the antigen in the measured solution. Method.
作用により吸着する請求項１に記載の測定方法。2. The measuring method according to claim 1, wherein the electron transfer substance is adsorbed to the lipid thin film by hydrophobic interaction.
請求項１に記載の測定方法。3. The measuring method according to claim 1, wherein the electron transfer substance has a transition metal complex.
リン錯体、フタロシアニン錯体の少なくとも１つである
請求項３に記載の測定方法。4. The measuring method according to claim 3, wherein the transition metal complex is at least one of a metallocene, a porphyrin complex and a phthalocyanine complex.
質を内蔵する請求項１に記載の測定方法。5. The measuring method according to claim 1, wherein an electrode active substance that dissolves and diffuses in the liquid to be measured is incorporated.
質である請求項１に記載の測定方法。6. The measuring method according to claim 1, wherein the electrode active substance is an electrolyte containing metal ions.
ある請求項１に記載の測定方法。7. The measuring method according to claim 1, wherein the lipid thin film is a monomolecular film or a multilayer film.
金属材料と結合する請求項１に記載の測定方法。8. The measuring method according to claim 1, wherein the lipid thin film is bonded to the metallic material of the electrode through a sulfur atom.
体反応により結合した電子伝達物質で標識した標識抗原
と、電極活性物質と、作用極と対極の一対の電極と、前
記作用極の表面に形成した脂質薄膜とを有し、被測定液
中には標識抗原を置換反応により遊離させ脂質薄膜に吸
着させる抗原を有し、標識抗原の電子伝達物質と電極活
性物質の電荷の授受を電流によって検出し被測定液中の
抗原を測定する検出手段を備えた測定装置。9. An insolubilized antibody, a labeled antigen labeled with an electron transfer substance bound to the insolubilized antibody by an antigen-antibody reaction, an electrode active substance, a pair of electrodes of a working electrode and a counter electrode, and a surface of the working electrode. It has a lipid thin film formed, and has an antigen that is released in the liquid to be measured by a substitution reaction and adsorbed to the lipid thin film, and the transfer of the charge of the electron carrier of the labeled antigen and the electrode active substance is exchanged by the electric current. A measuring device comprising a detecting means for detecting and measuring an antigen in a liquid to be measured.
る請求項９に記載の測定装置。10. The measuring device according to claim 9, wherein the electron transfer substance comprises a transition metal complex.
解質である請求項９に記載の測定装置。11. The measuring device according to claim 9, wherein the electrode active substance is an electrolyte containing metal ions.
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