JP2003252905A - Crosslinked hyaluronic acid - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な架橋ヒアル
ロン酸に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel crosslinked hyaluronic acid.
【0002】[0002]
【従来の技術】ヒアルロン酸は、N−アセチル−D−グ
ルコサミンとD−グルクロン酸が交互にβ−1,4結合
とβ−1,3結合で結合した、二糖単位から形成された
直鎖状の高分子多糖である。ヒアルロン酸は哺乳動物の
結合組織に分布するほか、ニワトリのとさか、連鎖球菌
の夾膜などにも存在が知られている。ニワトリのとさ
か、臍帯等が抽出材料として用いられているほか、連鎖
球菌の培養物からも精製物が調製されている。BACKGROUND OF THE INVENTION Hyaluronic acid is a straight chain formed from disaccharide units in which N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid are alternately linked by β-1,4 bond and β-1,3 bond. It is a high molecular weight polysaccharide. Hyaluronic acid is distributed in the connective tissues of mammals, and is also known to be present in chicken bones, streptococcal capsules, and the like. In addition to chicken umbilical cords and umbilical cords used as extraction materials, purified products have also been prepared from streptococcal cultures.
【0003】ヒアルロン酸は、分子量について多分散性
であるが、種及び臓器特異性をもたず、生体に移植また
は注入した場合であっても優れた生体適合性を示すこと
が知られている。さらに、新しい物性を有するヒアルロ
ン酸誘導体を得るために、多種多様な化学修飾、化学架
橋が提案されている。ヒアルロン酸の化学修飾、化学架
橋によってヒアルロン酸の水溶性を制御する技術が多く
報告されており、3次元架橋によるヒアルロン酸ゲルの
形成も知られている。Hyaluronic acid is polydisperse in molecular weight, but has no species and organ specificity, and is known to exhibit excellent biocompatibility even when transplanted or injected into a living body. . Furthermore, in order to obtain a hyaluronic acid derivative having new physical properties, a wide variety of chemical modifications and chemical crosslinking have been proposed. Many techniques for controlling the water solubility of hyaluronic acid by chemical modification and chemical crosslinking of hyaluronic acid have been reported, and formation of hyaluronic acid gel by three-dimensional crosslinking is also known.
【0004】これらの代表的なものとしては、ジビニル
スルホン、ビスエポキシド類、ホルムアルデヒド等の二
官能性試薬を架橋剤に使用して、得られた高膨潤性の架
橋ヒアルロン酸ゲルを挙げることができる(米国特許第
4,582,865号明細書、特公平6−37575号
公報、特開平7−97401号公報、特開昭60−13
0601号公報参照)。Typical of these are highly swelling crosslinked hyaluronic acid gels obtained by using a bifunctional reagent such as divinylsulfone, bisepoxides and formaldehyde as a crosslinking agent. (U.S. Pat. No. 4,582,865, JP-B-6-37575, JP-A-7-97401, JP-A-60-13
0601).
【0005】また、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモ
ニウム塩がジメチルスルフォキシド等の有機溶媒に溶解
する特徴を利用したヒアルロン酸の化学的修飾方法が開
示されている(特開平3−105003号)。Also disclosed is a method for chemically modifying hyaluronic acid, which utilizes the feature that the tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid is soluble in an organic solvent such as dimethylsulfoxide (Japanese Patent Laid-Open No. 3-105003).
【0006】また、共有結合を形成する化学的試薬を使
用しない方法として、ヒアルロン酸とアミノ基あるいは
イミノ基を有する高分子化合物とを、ヒアルロン酸のカ
ルボキシル基と高分子化合物のアミノ基あるいはイミノ
基をイオン複合体として結合させてヒアルロン酸高分子
複合体を調製する方法が開示されている(特開平6−7
3103号公報参照)。Further, as a method which does not use a chemical reagent for forming a covalent bond, hyaluronic acid and a polymer compound having an amino group or an imino group are used, and a carboxyl group of hyaluronic acid and an amino group or an imino group of the polymer compound are used. Is disclosed as a ionic complex to prepare a hyaluronic acid polymer complex (JP-A-6-7).
3103).
【0007】二官能性試薬を使用してヒアルロン酸を架
橋する場合、ヒアルロン酸水溶液が低濃度であるため、
架橋効率は著しく低くなる。つまり二官能性試薬のひと
つの反応性基がヒアルロン酸と反応し、もうひとつの反
応性基が未反応のまま残留してしまう。二官能性試薬の
両方の反応性基がヒアルロン酸と反応して架橋が形成さ
れる効率は低くなる。最終的にヒアルロン酸の構造単位
に対する置換度が高い架橋物が得られる。このような架
橋ヒアルロン酸では、ヒアルロン酸の分子構造が持って
いる本来の性質が著しく減じるばかりではなく、化学的
反応性物質の結合量が多くなるため、毒性や生体不適合
性等の危険性を本質的に抱え込まざるをえなくなる。When cross-linking hyaluronic acid using a bifunctional reagent, the hyaluronic acid aqueous solution has a low concentration,
The cross-linking efficiency is significantly reduced. That is, one reactive group of the bifunctional reagent reacts with hyaluronic acid, and the other reactive group remains unreacted. Both reactive groups of the bifunctional reagent are less efficient at reacting with hyaluronic acid to form crosslinks. Finally, a crosslinked product having a high degree of substitution with the structural unit of hyaluronic acid can be obtained. Such cross-linked hyaluronic acid not only significantly reduces the original properties of the molecular structure of hyaluronic acid, but also increases the amount of chemically reactive substances bound to it, thus increasing the risk of toxicity and biocompatibility. In essence, you have to hold it.
【0008】二官能性試薬による架橋ブリッジを介さず
に架橋ヒアルロン酸を得る方法も提案されている。ヒア
ルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩をジメチルスル
フォキシド中で、トリエチルアミンとヨウ化2−クロロ
−1−メチルピリジニウムを加え反応させ、ヒアルロン
酸のカルボキシル基と水酸基間でエステル結合を形成さ
せる方法も開示されている(欧州特許0341745A
1)。この方法では、ヒアルロン酸のカルボキシル基を
活性化剤と反応させ活性化エステル中間体を形成し、活
性化エステル中間体が無水環境下でヒアルロン酸の水酸
基と反応し、二官能性試薬による架橋ブリッジを介さな
い内部エステルが形成するとしている。しかし、ヒアル
ロン酸を構成する2糖単位の4種類の水酸基と、ラクト
ン結合を含めてどのような構造のエステル結合が形成さ
れるか明示されていない。A method for obtaining crosslinked hyaluronic acid without going through a crosslinking bridge with a bifunctional reagent has also been proposed. Also disclosed is a method of reacting a tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid in dimethylsulfoxide with triethylamine and 2-chloro-1-methylpyridinium iodide and reacting to form an ester bond between the carboxyl group and the hydroxyl group of hyaluronic acid. (European Patent 0341745A
1). In this method, the carboxyl group of hyaluronic acid is reacted with an activator to form an activated ester intermediate, and the activated ester intermediate reacts with a hydroxyl group of hyaluronic acid in an anhydrous environment to form a bridge bridge by a bifunctional reagent. It is said that an internal ester that does not go through is formed. However, it is not clear what structure the ester bond including the lactone bond is formed with the four types of hydroxyl groups of the disaccharide unit constituting hyaluronic acid.
【0009】ヒアルロン酸のカルボキシル基を利用して
エステル結合によって架橋したヒアルロン酸架橋物の生
分解性が良好なことが知られている。活性化試薬として
二または多官能性エポキシドを使用し、ヒアルロン酸の
カルボキシル基とエポキシ基を反応させてエステル結合
を形成する。二官能性試薬による架橋ブリッジを介した
エステル結合による架橋ヒアルロン酸が得られる。この
方法で得られた架橋ヒアルロン酸のリン酸緩衝生理的食
塩水中での分解性が良好なこと、すなわちこのエステル
結合の加水分解性が良好なことが開示されている(特公
平7−116242公報、特表紹3−503551公報
参照)。It is known that a biodegradable product of a hyaluronic acid crosslinked product which is crosslinked by an ester bond using a carboxyl group of hyaluronic acid is good. Using a di- or polyfunctional epoxide as the activating reagent, the carboxyl group of hyaluronic acid is reacted with the epoxy group to form an ester bond. Cross-linked hyaluronic acid is obtained by ester linkage via a cross-linking bridge with a bifunctional reagent. It is disclosed that the crosslinkable hyaluronic acid obtained by this method has good degradability in phosphate buffered saline, that is, the hydrolyzability of this ester bond is good (Japanese Patent Publication No. 7-116242). , See Special Publication 3-503551).
【0010】[0010]
【発明が解決しようとする課題】ヒアルロン酸自体が本
来持っている優れた生体適合性の特徴を最大限生かすた
めに、ヒアルロン酸の構造単位に対する置換度が最小限
で、すなわち架橋効率が高く、生体適合性医用材料とし
て使用可能な安定性を有している、品質管理可能な分子
構造が制御されている架橋ヒアルロン酸は未だ開発され
ていない。DISCLOSURE OF THE INVENTION In order to maximize the excellent biocompatibility inherent in hyaluronic acid itself, the degree of substitution of hyaluronic acid with respect to the structural unit is minimized, that is, the crosslinking efficiency is high, A cross-linked hyaluronic acid having a controlled quality-controllable molecular structure and having stability that can be used as a biocompatible medical material has not yet been developed.
【0011】本発明者らは、上記目的を達成するため
に、ヒアルロン酸自体の物理化学的性質を鋭意検討して
きた。その結果、新規な(1)ヒアルロン酸のカルボキ
シル基と水酸基にエステル結合によって架橋している架
橋ヒアルロン酸、特に(2)ヒアルロン酸のカルボキシ
ル基が同一のヒアルロン酸分子のN−アセチル−D−グ
ルコサミン単位の6位の1級水酸基に、及び/又は別の
ヒアルロン酸分子のN−アセチル−D−グルコサミン単
位の6位の1級水酸基にエステル結合によって架橋して
いる架橋ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸自体が本来持っ
ている優れた生体適合性の特徴を最大限生かすことので
きる架橋効率が高い、生体適合性医用材料として使用可
能な安定性を有している、品質管理可能な分子構造が制
御されている架橋ヒアルロン酸であることを見出した。The present inventors have extensively studied the physicochemical properties of hyaluronic acid itself in order to achieve the above object. As a result, a novel (1) cross-linked hyaluronic acid which is cross-linked with a carboxyl group and a hydroxyl group of hyaluronic acid by an ester bond, particularly (2) N-acetyl-D-glucosamine of a hyaluronic acid molecule having the same carboxyl group of hyaluronic acid. The crosslinked hyaluronic acid which is crosslinked to the primary hydroxyl group at the 6-position of the unit and / or to the primary hydroxyl group at the 6-position of the N-acetyl-D-glucosamine unit of another hyaluronic acid molecule by an ester bond is hyaluronic acid itself. It has a high cross-linking efficiency that maximizes the excellent biocompatibility characteristics that are inherently possessed, has stability that can be used as a biocompatible medical material, and has a controlled quality controllable molecular structure. It was found to be crosslinked hyaluronic acid.
【0012】また、従来法による改質ヒアルロン酸は、
幾多の努力にもかかわらず化学的反応性物質を用いるた
め、新たな改質による毒性や生体不適合性等の危険性を
本質的に抱え込まざるをえないという課題があった。Further, the modified hyaluronic acid prepared by the conventional method is
Since a chemically reactive substance is used in spite of many efforts, there is a problem that the danger such as toxicity and biocompatibility due to new modification must be inherently held.
【0013】例えば、化学的修飾・架橋、及び金属塩等
を用いるイオン的方法による、ヒアルロン酸誘導体は、
たとえ生体内の貯留性等を改善できても、改質されたヒ
アルロン酸は架橋物質や金属等を共有結合やイオン結合
でヒアルロン酸の分子中に内包するため、もはや天然ヒ
アルロン酸と構造が異なり、その生理作用や生体適合
性、毒性を含む安全性が本質的にヒアルロン酸と同等で
あるとは言い難く、さらにこれら架橋剤等の残留毒性
や、生体内に於ける分解産物に含まれる架橋剤の安全性
の問題を完全に回避することは難しかった。For example, a hyaluronic acid derivative obtained by an ionic method using chemical modification / crosslinking and a metal salt is
Even if the storability in the living body can be improved, the modified hyaluronic acid has a structure different from that of natural hyaluronic acid because it encapsulates a cross-linking substance or metal in the molecule of hyaluronic acid by covalent bond or ionic bond. However, it cannot be said that the physiological effects, biocompatibility, and safety including toxicity are essentially equivalent to those of hyaluronic acid, and further, the residual toxicity of these cross-linking agents and the cross-linking contained in the degradation products in vivo. It was difficult to completely avoid the problem of drug safety.
【0014】二官能性試薬等の架橋剤を使用しないで、
ヒアルロン酸に架橋構造を導入する方法として、ヒアル
ロン酸自体が有する官能基、つまりカルボキシル基、水
酸基、アセトアミド基を直接結合させる方法がある。こ
の方法で得られる架橋構造はエステル結合とアミド結合
である。分子間エステル結合で形成した架橋構造は、生
体内において加水分解してヒアルロン酸自体の構造に戻
るため、生体適合性の面で有利である。Without using a crosslinking agent such as a bifunctional reagent,
As a method of introducing a crosslinked structure into hyaluronic acid, there is a method of directly bonding a functional group of hyaluronic acid itself, that is, a carboxyl group, a hydroxyl group or an acetamide group. The crosslinked structure obtained by this method is an ester bond and an amide bond. The crosslinked structure formed by the intermolecular ester bond is advantageous in terms of biocompatibility because it is hydrolyzed in vivo to return to the structure of hyaluronic acid itself.
【0015】ヒアルロン酸を構成する二糖単位に存在す
る官能基は、N−アセチル−D−グルコサミンのアセト
アミド基、C−4に結合した2級水酸基とC−6に結合
した1級水酸基、D−グルクロン酸のカルボキシル基、
C−2に結合した2級水酸基とC−3に結合した2級水
酸基である。エステル結合は1種類のカルボキシル基と
4種類の水酸基間で形成することができる。糖環に直接
結合した2級水酸基とカルボキシル基間のエステル結合
は、糖環に直接結合していない1級水酸基間のエステル
結合に比べて不安定である。The functional group existing in the disaccharide unit constituting hyaluronic acid is an acetamide group of N-acetyl-D-glucosamine, a secondary hydroxyl group bonded to C-4 and a primary hydroxyl group bonded to C-6, D -The carboxyl group of glucuronic acid,
A secondary hydroxyl group bonded to C-2 and a secondary hydroxyl group bonded to C-3. The ester bond can be formed between one kind of carboxyl group and four kinds of hydroxyl groups. The ester bond between the secondary hydroxyl group directly bonded to the sugar ring and the carboxyl group is more unstable than the ester bond between the primary hydroxyl groups not directly bonded to the sugar ring.
【0016】加水分解等に対して不安定な分子間エステ
ル結合によって架橋した架橋ヒアルロン酸は、最終製品
である医用材料の貯蔵安定性が乏しく、実用上の大きな
障害となる。また安定性の異なる4種類の分子間エステ
ル結合が混在していることは、品質管理上に致命的な問
題を生起し、実用上の大きな障害となる。Crosslinked hyaluronic acid, which is crosslinked by an intermolecular ester bond which is unstable to hydrolysis and the like, has a poor storage stability of the final product, a medical material, which is a serious obstacle to practical use. In addition, the mixture of four kinds of intermolecular ester bonds having different stability causes a fatal problem in quality control and becomes a major obstacle in practical use.
【0017】本発明者らは、本発明で得られた架橋ヒア
ルロン酸が医用材料として理想的な生体適合性を有し、
しかも生体適合性医用材料として使用可能な安定性と、
品質管理可能に分子構造が制御されていることを見出
し、本発明を完成させるに至った。The present inventors have found that the crosslinked hyaluronic acid obtained in the present invention has ideal biocompatibility as a medical material,
Moreover, the stability that can be used as a biocompatible medical material,
The inventors have found that the molecular structure is controlled so that quality control is possible, and completed the present invention.
【0018】[0018]
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、(1)
ヒアルロン酸のカルボキシル基が同一のヒアルロン酸分
子の水酸基に、及び/又は別のヒアルロン酸分子の水酸
基にエステル結合によって架橋していることを特徴とす
る架橋ヒアルロン酸、(2)ヒアルロン酸のカルボキシ
ル基が同一のヒアルロン酸分子のN−アセチル−D−グ
ルコサミン単位の6位の1級水酸基に、及び/又は別の
ヒアルロン酸分子のN−アセチル−D−グルコサミン単
位の6位の1級水酸基にエステル結合によって架橋して
いることを特徴とする(1)記載の架橋ヒアルロン酸で
ある。Means for Solving the Problems That is, the present invention provides (1)
Crosslinked hyaluronic acid, wherein the carboxyl group of hyaluronic acid is crosslinked to the hydroxyl group of the same hyaluronic acid molecule and / or to the hydroxyl group of another hyaluronic acid molecule by an ester bond, (2) carboxyl group of hyaluronic acid Is an ester at the 6-position primary hydroxyl group of the N-acetyl-D-glucosamine unit of the same hyaluronic acid molecule, and / or at a 6-position primary hydroxyl group of the N-acetyl-D-glucosamine unit of another hyaluronic acid molecule. The crosslinked hyaluronic acid according to (1), which is crosslinked by a bond.
【0019】[0019]
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出
したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源
を問うことなく使用できる。発酵法で使用する菌株は自
然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロ
ン酸生産能を有する微生物、又は特開昭63−1233
92号公報に記載したストレプトコッカス・エクイFM
−100(微工研菌寄第9027号) 、特開平2−2346
89号公報に記載したストレプトコッカス・エクイFM
−300(微工研菌寄第2319号) のような高収率で安定
にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変
異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention will be described in detail below.
The hyaluronic acid used in the present invention can be used regardless of its origin, whether it is extracted from animal tissue or produced by a fermentation method. The strain used in the fermentation method is a microorganism having hyaluronic acid-producing ability such as Streptococcus sp. Isolated from nature, or JP-A-63-1233.
Streptococcus equi FM described in Japanese Patent No. 92
-100 (Microtechnology Research Institute, No. 9027), JP-A-2-2346
Streptococcus equi FM described in Japanese Patent No. 89
A mutant strain capable of stably producing hyaluronic acid in a high yield, such as -300 (Ministry of Industrial Science and Technology No. 2319) is desirable. What is cultivated and purified using the above mutant strain is used.
【0020】本発明でいう架橋ヒアルロン酸は、ヒアル
ロン酸が架橋構造を保持し、溶媒に可溶性であれば、原
料となるヒアルロン酸よりも分子量が増大している。分
子量は一般的にGPCを使って測定することができる
が、架橋構造を保持している、すなわち分岐構造を有し
ているヒアルロン酸の分子量はGPC−MALLS(多
角度光散乱)を用いて測定する方が正確である。原料と
して使用するヒアルロン酸の分子量と架橋度を制御する
ことにより、溶媒に対して不溶性の架橋ヒアルロン酸も
得られる。The crosslinked hyaluronic acid referred to in the present invention has a molecular weight higher than that of the starting hyaluronic acid if the hyaluronic acid retains the crosslinked structure and is soluble in the solvent. The molecular weight can be generally measured using GPC, but the molecular weight of hyaluronic acid that retains a crosslinked structure, that is, has a branched structure, is measured using GPC-MALLS (multi-angle light scattering). It is more accurate to do. By controlling the molecular weight and the degree of crosslinking of hyaluronic acid used as a raw material, a crosslinked hyaluronic acid insoluble in a solvent can also be obtained.
【0021】本発明でいう架橋ヒアルロン酸の架橋度、
すなわち導入する分子間エステル結合量は、架橋ヒアル
ロン酸の使用目的や要求特性に合わせて任意に制御する
ことができる。エステル結合量は、ヒアルロン酸中のカ
ルボキシル基の全数に対する割合として定義できる。関
節注入剤等ではヒアルロン酸は水溶液として使用され
る。ヒアルロン酸水溶液の粘弾性特性を改善する目的で
水溶性の架橋ヒアルロン酸を調製する場合、原料として
使用するヒアルロン酸の分子量にも左右されるが、導入
する分子間エステル結合量は0.5%未満が好ましい。The degree of crosslinking of the crosslinked hyaluronic acid referred to in the present invention,
That is, the amount of intermolecular ester bond to be introduced can be arbitrarily controlled according to the purpose of use and required characteristics of the crosslinked hyaluronic acid. The ester bond amount can be defined as a ratio to the total number of carboxyl groups in hyaluronic acid. Hyaluronic acid is used as an aqueous solution in joint injections and the like. When preparing a water-soluble crosslinked hyaluronic acid for the purpose of improving the viscoelastic properties of an aqueous hyaluronic acid solution, the intermolecular ester bond content to be introduced is 0.5%, although it depends on the molecular weight of the hyaluronic acid used as a raw material. Less than is preferred.
【0022】溶媒に不溶性の架橋ヒアルロン酸の場合、
原料として使用するヒアルロン酸の分子量にも左右され
るが、導入する分子間エステル結合量は1%未満が好ま
しい。導入する分子間エステル結合量が1%以上では、
不十分な膨潤特性の架橋ヒアルロン酸となり、ヒアルロ
ン酸本来の特性が発現し難くなる。In the case of solvent-insoluble crosslinked hyaluronic acid,
Although it depends on the molecular weight of hyaluronic acid used as a raw material, the amount of intermolecular ester bond to be introduced is preferably less than 1%. When the amount of intermolecular ester bond to be introduced is 1% or more,
It becomes a cross-linked hyaluronic acid with insufficient swelling properties, and it becomes difficult to express the original properties of hyaluronic acid.
【0023】本発明でいう架橋ヒアルロン酸の分子構造
はNMRを使って確かめることができる。ヒアルロン酸
自体の分子構造はNMRを使って、その末端基まで含め
て詳しく解析されている(Carbohydr.Res.Vol245,p113-
128,1993、Macromolecules Vol29,p2894-2902,1996)。
ヒアルロン酸の修飾や架橋によってヒアルロン酸の構造
が改変された場合、スペクトル上の新規のピークを、多
次元NMR等の各種手法を用いて帰属し、構造を決定す
ることができる。構造が改変された割合が小さく、その
検出が難しい場合、酵素分解等の分子構造に対する認識
性の大きい分解反応を利用して、検出目的の構造を濃縮
してから解析することもできる。The molecular structure of the crosslinked hyaluronic acid referred to in the present invention can be confirmed by using NMR. The molecular structure of hyaluronic acid itself has been analyzed in detail using NMR, including its terminal groups (Carbohydr.Res.Vol245, p113-
128, 1993, Macromolecules Vol29, p2894-2902, 1996).
When the structure of hyaluronic acid is modified by modification or crosslinking of hyaluronic acid, a new peak on the spectrum can be assigned using various techniques such as multidimensional NMR to determine the structure. When the ratio of the modified structure is small and its detection is difficult, it is also possible to concentrate the structure to be detected and then analyze it by utilizing a decomposition reaction having a high recognition property for the molecular structure such as enzymatic decomposition.
【0024】ヒアルロン酸を分解する酵素は、放線菌由
来ヒアルロニダーゼや羊睾丸由来ヒアルロンダーゼ等多
種類存在する。ヒアルロン酸の主鎖の分解部位が使用す
る酵素の種類によって異なることが知られている。羊睾
丸由来ヒアルロンダーゼで分解したヒアルロン酸オリゴ
糖では、生成する末端基の構造まで含めて構造が解析さ
れている。ヒアルロン酸の酵素分解では、分解条件によ
ってトランスグリコシレーションが起こることが知られ
ている。トランスグリコシレーションを避けるために、
ヒアルロン酸水溶液のpHを低く調製する必要がある(T
he Journal Biological Chemistry.Vol. 270 ,p3741-37
47,1995)。There are various types of enzymes that decompose hyaluronic acid, such as hyaluronidase derived from actinomycetes and hyaluronidase derived from ovine testicles. It is known that the decomposition site of the main chain of hyaluronic acid varies depending on the type of enzyme used. The structure of hyaluronic acid oligosaccharides digested with ovine testicular hyaluronidase has been analyzed, including the structure of the resulting terminal groups. It is known that in the enzymatic degradation of hyaluronic acid, transglycosylation occurs depending on the degradation conditions. To avoid transglycosylation,
It is necessary to adjust the pH of the hyaluronic acid aqueous solution to a low level (T
he Journal Biological Chemistry.Vol. 270, p3741-37
47, 1995).
【0025】本発明でいう架橋ヒアルロン酸はラクトン
結合を含まない。ラクトン結合はエステル結合の一種で
ある。ラクトン結合は閉環によるひずみを持ったエステ
ル結合であり、赤外線吸収スペクトルで観測されるカル
ボニルの伸縮振動が、ひずみを持たないエステル結合に
比べて高波数側へシフトしていることが知られている。
本発明でいう架橋ヒアルロン酸では、ひずみを持ったエ
ステル結合は、赤外線吸収スペクトルで観測されない。The crosslinked hyaluronic acid referred to in the present invention does not contain a lactone bond. The lactone bond is a kind of ester bond. The lactone bond is an ester bond with strain due to ring closure, and it is known that the stretching vibration of carbonyl observed in the infrared absorption spectrum is shifted to a higher wave number side than the ester bond without strain. .
In the crosslinked hyaluronic acid referred to in the present invention, strained ester bonds are not observed in the infrared absorption spectrum.
【0026】本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物
組織抽出又は発酵法で得られた高分子精製品でも、更に
加水分解処理等をして得た低分子量のものでも同様に好
ましく使用できる。なお、本発明にいうヒアルロン酸
は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウ
ム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。The hyaluronic acid used in the present invention can be similarly preferably used as a polymer purified product obtained by animal tissue extraction or fermentation, or a low molecular weight product obtained by further hydrolyzing. The hyaluronic acid referred to in the present invention is used under the concept of including its alkali metal salts, for example, sodium, potassium and lithium salts.
【0027】本発明に用いられるヒアルロン酸の水溶液
は、ヒアルロン酸の粉末と水を混合し、撹拌して得られ
る。The aqueous solution of hyaluronic acid used in the present invention is obtained by mixing hyaluronic acid powder and water and stirring the mixture.
【0028】本発明では、温和な反応条件でエステル化
することにより、エステル化反応の選択性を向上させて
いる。ヨウ化2−クロロ−1−メチルピリジニウム等の
活性化剤を使用した活性化エステル中間体は反応性が強
いため、ヒアルロン酸を構成する2糖単位の4種類の水
酸基に対する反応の選択性がない。よって、ひずみを持
ったエステル結合まで形成されてしまう。In the present invention, the esterification reaction selectivity is improved by esterification under mild reaction conditions. Since the activated ester intermediate using an activator such as 2-chloro-1-methylpyridinium iodide has high reactivity, it has no selectivity for the reaction with respect to four kinds of hydroxyl groups of the disaccharide unit constituting hyaluronic acid. . Therefore, even a strained ester bond is formed.
【0029】温和な反応条件でエステル化することによ
り、エステル化反応以外の副反応を抑制することができ
る。ヒアルロン酸は容易に主鎖切断反応によって低分子
量化する。加水分解による主鎖切断反応は、中性と比較
して酸性やアルカリ性で著しく促進される。ラジカル分
解によって、主鎖切断が著しく促進されることも知られ
ている。加熱によってこれらの反応は更に促進される。
副反応による低分子量化は結果的に架橋効率の低下を引
き起こす。By esterifying under mild reaction conditions, side reactions other than the esterification reaction can be suppressed. Hyaluronic acid is easily reduced in molecular weight by a main chain cleavage reaction. The main chain cleavage reaction due to hydrolysis is significantly promoted by acidity or alkalinity as compared with neutrality. It is also known that the main chain cleavage is significantly promoted by radical decomposition. These reactions are further promoted by heating.
The lowering of the molecular weight due to the side reaction results in a decrease in the crosslinking efficiency.
【0030】本発明では、ヒアルロン酸水溶液を酸性に
調整し、解離しているカルボキシル基を酸型に変換して
架橋ヒアルロン酸を得る。ヒアルロン酸水溶液を酸性に
調製し加熱する方法が、低分子量ヒアルロン酸の調製方
法として開示されている。(特開平1−266102公
報参照)ヒアルロン酸水溶液を酸性で加熱すると、N−
アセチル−D−グルコサミン単位の脱アセチル化反応も
起こることが記載されている。In the present invention, the aqueous solution of hyaluronic acid is adjusted to be acidic, and the dissociated carboxyl groups are converted to the acid form to obtain crosslinked hyaluronic acid. A method of preparing an aqueous solution of hyaluronic acid to be acidic and heating it is disclosed as a method of preparing low molecular weight hyaluronic acid. (See Japanese Patent Laid-Open No. 1-266102) When an aqueous solution of hyaluronic acid is heated under acid, N-
It is described that a deacetylation reaction of the acetyl-D-glucosamine unit also occurs.
【0031】分子間エステル化反応による架橋形成と競
争する、酸加水分解による低分子量化を抑制するために
は、反応温度を低くすることが必要になる。架橋形成を
優先させる反応温度としては、室温以下が好ましく、更
に好ましい反応温度は10℃以下である。It is necessary to lower the reaction temperature in order to suppress lowering of the molecular weight due to acid hydrolysis, which competes with cross-linking formation due to intermolecular esterification reaction. The reaction temperature for preferentially forming crosslinks is preferably room temperature or lower, and more preferably 10 ° C or lower.
【0032】分子間エステル化反応を促進するために
は、ヒアルロン酸濃度を高くする必要がある。脱水縮合
によるエステル化反応が平衡反応であることからも、反
応系中に存在する水の量を減ずるため、ヒアルロン酸濃
度を高くする必要がある。ヒアルロン酸濃度は5質量%
以上が好ましく、更に好ましくは10質量%以上であ
る。In order to accelerate the intermolecular esterification reaction, it is necessary to increase the concentration of hyaluronic acid. Since the esterification reaction by dehydration condensation is an equilibrium reaction, it is necessary to increase the concentration of hyaluronic acid in order to reduce the amount of water present in the reaction system. Hyaluronic acid concentration is 5% by mass
The above is preferable, and more preferably 10% by mass or more.
【0033】反応系に脱水縮合反応を触媒する物質を添
加することは、分子間エステル化反応を促進するために
重要である。脱水縮合反応を促進する触媒としては、酸
性触媒が一般的であり、硫酸、塩酸や芳香族スルホン酸
誘導体等が使用できる。Addition of a substance which catalyzes the dehydration condensation reaction to the reaction system is important for promoting the intermolecular esterification reaction. An acidic catalyst is generally used as a catalyst for promoting the dehydration condensation reaction, and sulfuric acid, hydrochloric acid, an aromatic sulfonic acid derivative or the like can be used.
【0034】架橋度は、反応温度、ヒアルロン酸濃度、
添加する脱水縮合触媒の種類及び量と共に、反応時間で
制御できる。The degree of crosslinking depends on the reaction temperature, hyaluronic acid concentration,
The reaction time can be controlled together with the type and amount of the dehydration condensation catalyst to be added.
【0035】得られた架橋ヒアルロン酸は、ヒアルロン
酸の酸加水分解を避けるために、酸性に調整するために
用いた酸等の成分を除く必要がある。酸等の成分を除く
ためには、通常は水性溶媒による洗浄もしくは透析を行
う。架橋ヒアルロン酸の機能を損なわないものであれば
特に制限はないが、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩
衝液等が用いられるが、好ましくは、生理食塩水、リン
酸緩衝液等が用いられる。The cross-linked hyaluronic acid thus obtained must be free of components such as the acid used for adjusting the acidity in order to avoid acid hydrolysis of hyaluronic acid. In order to remove components such as acids, washing with an aqueous solvent or dialysis is usually performed. There is no particular limitation as long as it does not impair the function of the cross-linked hyaluronic acid. For example, water, physiological saline, phosphate buffer, etc. are used, but physiological saline, phosphate buffer, etc. are preferably used. To be
【0036】洗浄された架橋ヒアルロン酸に酸型のカル
ボキシル基が残っている場合には、ヒアルロン酸の酸加
水分解を避けるために、ナトリウム型等に塩化する必要
がある。水酸化ナトリウム水溶液で架橋ヒアルロン酸水
溶液のpHを7に調製するか、架橋ヒアルロン酸を生理
的食塩水やリン酸緩衝生理的食塩水に浸漬することで塩
化することができる。When acid-type carboxyl groups remain in the washed crosslinked hyaluronic acid, it is necessary to salify into sodium-type or the like in order to avoid acid hydrolysis of hyaluronic acid. The crosslinked hyaluronic acid aqueous solution can be salified by adjusting the pH of the crosslinked hyaluronic acid aqueous solution to 7 with an aqueous sodium hydroxide solution or by immersing the crosslinked hyaluronic acid in physiological saline or phosphate buffered physiological saline.
【0037】この洗浄、塩化された架橋ヒアルロン酸
は、その使用目的に応じて、溶液状、溶媒中に浸漬した
状態、溶媒を含ませた湿潤状態、風乾、減圧乾燥あるい
は凍結乾燥等の処理を経た乾燥状態で医用材料として供
される。The washed and chlorinated cross-linked hyaluronic acid may be subjected to treatments such as a solution state, a state immersed in a solvent, a wet state containing a solvent, air drying, reduced pressure drying or freeze drying depending on the purpose of use. It is used as a medical material in a dried state.
【0038】医用材料として用いるためには、生体適合
性が高いことが必須であり、一般的に細胞毒性がないこ
とを証明する必要がある。本発明の架橋ヒアルロン酸
は、これらの条件を十分に満たすものであり、生体分解
性医用材料としてまたヒアルロン酸が用いられる分野で
あれば特に制限なく使用することができる。例えば、癒
着防止材、関節注入剤、軟質組織注入剤、代用硝子体、
化粧料、診断・治療に用いる医療器具・医療用具等の生
物医学的製品又は医薬組成物への使用が挙げられる。For use as a medical material, high biocompatibility is essential, and it is generally necessary to prove that there is no cytotoxicity. The crosslinked hyaluronic acid of the present invention satisfies these conditions sufficiently, and can be used without particular limitation as long as it is a field in which hyaluronic acid is used as a biodegradable medical material. For example, anti-adhesion material, joint injection, soft tissue injection, vitreous substitute,
Examples include use in cosmetics, biomedical products such as medical instruments and medical devices used for diagnosis and treatment, or pharmaceutical compositions.
【0039】架橋ヒアルロン酸及びその成形加工品は、
単一形態での使用は当然ながら、異なる架橋ヒアルロン
酸の形態との混合又は併用、更にヒアルロン酸溶液との
混合又は併用による組合せ処方により効果の増強が期待
できる。Cross-linked hyaluronic acid and its molded products are
As a matter of course, the use in a single form can be expected to enhance the effect by mixing or combining with different forms of cross-linked hyaluronic acid, and further combining them by mixing or combining with a hyaluronic acid solution.
【0040】医用材料として用いるために、ヒアルロン
酸と同様に生体適合性に優れる材料、例えば、コンドロ
イチン硫酸、カルボキシメチルセルロース等を架橋ヒア
ルロン酸に添加することができる。これらの材料を架橋
ヒアルロン酸を形成させる反応中で、混合、複合化する
こともできるものであり、何ら制限されないものであ
る。また、架橋ヒアルロン酸に、薬学的又は生理学的に
活性な物質を添加して、これらを含有する架橋ヒアルロ
ン酸を調製させることもできるものであり、何ら制限さ
れないものである。For use as a medical material, a material as biocompatible as hyaluronic acid, such as chondroitin sulfate, carboxymethyl cellulose, etc., can be added to the crosslinked hyaluronic acid. These materials can be mixed and compounded in the reaction for forming crosslinked hyaluronic acid, and are not limited in any way. Moreover, a pharmaceutically or physiologically active substance can be added to the crosslinked hyaluronic acid to prepare a crosslinked hyaluronic acid containing these substances, and there is no limitation.
【0041】[0041]
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
する。なお、本発明はこれにより限定されるものではな
い。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. The present invention is not limited to this.
【0042】実施例1
分子量が2.8×104 ダルトンのヒアルロン酸ナトリ
ウムを蒸留水に溶解し、6.0質量%のヒアルロン酸の
水溶液を調整した。調整されたヒアルロン酸の水溶液の
pHは、6.0であった。この水溶液のpHを、1N塩
酸でpH1.2に調整した。ヒアルロン酸の酸性水溶液
50mlを−20℃に設定した冷凍庫に入れた。150
日間凍結した後、25℃で解凍した。その結果、架橋ヒ
アルロン酸が得られた。架橋ヒアルロン酸の酸性水溶液
を0.2NのNaOH水溶液でpH7.0に中和した。
中和したヒアルロン酸水溶液を凍結乾燥し、架橋ヒアル
ロン酸を回収した。分子量は8.7×104であった。Example 1 Sodium hyaluronate having a molecular weight of 2.8 × 10 4 daltons was dissolved in distilled water to prepare a 6.0 mass% aqueous solution of hyaluronic acid. The pH of the adjusted aqueous solution of hyaluronic acid was 6.0. The pH of this aqueous solution was adjusted to pH 1.2 with 1N hydrochloric acid. 50 ml of an acidic aqueous solution of hyaluronic acid was placed in a freezer set at -20 ° C. 150
After freezing for a day, it was thawed at 25 ° C. As a result, crosslinked hyaluronic acid was obtained. An acidic aqueous solution of crosslinked hyaluronic acid was neutralized to pH 7.0 with 0.2N aqueous NaOH solution.
The neutralized hyaluronic acid aqueous solution was freeze-dried to recover crosslinked hyaluronic acid. The molecular weight was 8.7 × 10 4 .
【0043】実施例2
分子量が2.0×106ダルトンのヒアルロン酸ナトリ
ウムを蒸留水に溶解し、1.0質量%のヒアルロン酸の
水溶液を調整した。調整されたヒアルロン酸の水溶液の
pHは、6.0であった。この水溶液のpHを、1N硝
酸でpH1.5に調整した。ヒアルロン酸の酸性水溶液
50mlを凍結乾燥した。得られた乾燥体を冷蔵庫に一
晩放置した。溶媒に不溶化した架橋ヒアルロン酸が得ら
れていた。得られた架橋ヒアルロン酸を蒸留水で水洗
し、続いて生理的食塩水に50mM濃度でリン酸緩衝成
分を加えてpH7に調整したリン酸緩衝生理的食塩水に
浸漬、洗浄し、続いて蒸留水で洗浄した。乾燥して架橋
ヒアルロン酸を回収した。Example 2 Sodium hyaluronate having a molecular weight of 2.0 × 10 6 dalton was dissolved in distilled water to prepare a 1.0 mass% aqueous solution of hyaluronic acid. The pH of the adjusted aqueous solution of hyaluronic acid was 6.0. The pH of this aqueous solution was adjusted to pH 1.5 with 1N nitric acid. 50 ml of an acidic aqueous solution of hyaluronic acid was freeze-dried. The obtained dried product was left in the refrigerator overnight. A crosslinked hyaluronic acid insolubilized in the solvent was obtained. The obtained crosslinked hyaluronic acid was washed with distilled water, and then immersed in phosphate buffered physiological saline adjusted to pH 7 by adding a phosphate buffer component at a concentration of 50 mM to physiological saline, washed, and then distilled. It was washed with water. The dried crosslinked hyaluronic acid was recovered.
【0044】実施例3
実施例1で得られた架橋ヒアルロン酸と原料として使用
したヒアルロン酸ナトリウムのH1−NMRとC13−N
MRを測定した。NMRの測定は日本電子社製JNMα
−500を使用して行った。測定溶媒は0.15MのN
aClと20mMのリン酸緩衝成分(pD=6.5)を
溶解した重水を使用した。Example 3 H 1 -NMR and C 13 -N of the crosslinked hyaluronic acid obtained in Example 1 and sodium hyaluronate used as a raw material
The MR was measured. NMR measurement is JNMα manufactured by JEOL Ltd.
Performed using -500. The measuring solvent is 0.15M N
Heavy water in which aCl and a 20 mM phosphate buffer component (pD = 6.5) were dissolved was used.
【0045】架橋ヒアルロン酸のH1−NMRとC13−
NMRのスペクトルは、原料として使用したヒアルロン
酸ナトリウムのスペクトルと完全に一致した。すなわち
架橋ヒアルロン酸の架橋点の構造と架橋ヒアルロン酸を
調製する反応中の副反応に起因する構造変化は検出され
ていない。ヒアルロン酸を対象とするNMR測定の検出
感度は、ヒアルロン酸の2糖構造単位に対して約1モル
%である。架橋ヒアルロン酸に存在する微量の架橋点の
構造を検出するため、架橋点を濃縮する必要がある。H 1 -NMR and C 13 -of crosslinked hyaluronic acid
The NMR spectrum was completely in agreement with the spectrum of sodium hyaluronate used as a raw material. That is, the structure change at the cross-linking point of cross-linked hyaluronic acid and the structure change due to side reaction during the reaction for preparing cross-linked hyaluronic acid have not been detected. The detection sensitivity of NMR measurement for hyaluronic acid is about 1 mol% based on the disaccharide structural unit of hyaluronic acid. In order to detect the structure of a trace amount of cross-linking points existing in cross-linked hyaluronic acid, it is necessary to concentrate the cross-linking points.
【0046】実施例4
架橋ヒアルロン酸の酵素分解
実施例1で得られた架橋ヒアルロン酸2.0gを0.1
M酢酸緩衝液(pH5.0、NaCl0.15M)40
mlに溶解した。この溶液を無菌的に0.2μmのメン
ブランフィルターでろ過した。ヒアルロニダーゼ(シグ
マ、タイプ5、約3000単位/mg)80mgを0.
1M酢酸緩衝液に溶解し、無菌的に加えた。40℃で4
0時間攪拌後、冷却し、酵素分解物溶液を得た。Example 4 Enzymatic Degradation of Crosslinked Hyaluronic Acid 2.0 g of the crosslinked hyaluronic acid obtained in Example 1 was added to 0.1 g.
M acetate buffer (pH 5.0, NaCl 0.15M) 40
Dissolved in ml. The solution was aseptically filtered through a 0.2 μm membrane filter. Hyaluronidase (Sigma, type 5, about 3000 units / mg) 80 mg
It was dissolved in 1M acetate buffer and added aseptically. 4 at 40 ° C
After stirring for 0 hour, the mixture was cooled to obtain an enzyme-decomposed product solution.
【0047】比較例1
ヒアルロン酸の酵素分解
分子量が2.8×104 ダルトンのヒアルロン酸ナトリ
ウムを0.2gを0.1M酢酸緩衝液(pH5.0、N
aCl0.15M)4mlに溶解した。この溶液を無菌
的に0.2μmのメンブランフィルターでろ過した。ヒ
アルロニダーゼ(シグマ、タイプ5、約3000単位/
mg)8mgを0.1M酢酸緩衝液に溶解し、無菌的に
加えた。40℃で40時間攪拌後、冷却し、酵素分解物
溶液を得た。Comparative Example 1 0.2 g of sodium hyaluronate having a molecular weight of 2.8 × 10 4 daltons for enzymatic decomposition of hyaluronic acid was added to 0.1 M acetate buffer (pH 5.0, N).
aCl 0.15M) 4 ml. The solution was aseptically filtered through a 0.2 μm membrane filter. Hyaluronidase (Sigma, Type 5, about 3000 units /
8 mg) was dissolved in 0.1 M acetate buffer and added aseptically. After stirring at 40 ° C. for 40 hours, the mixture was cooled to obtain an enzymatic decomposition product solution.
【0048】実施例5
架橋ヒアルロン酸の加水分解
実施例1で得られた架橋ヒアルロン酸25mgを0.1
M酢酸緩衝液(pH5.0、NaCl0.15M)0.
5mlに溶解した。この溶液に酵素を添加せず、40℃
で40時間放置し、冷却した。この溶液中の架橋ヒアル
ロン酸の分子量は8.4×104であった。すなわち、
架橋ヒアルロン酸の加水分解は、実施例4の酵素分解条
件下ではほとんど起こらないことがわかる。Example 5 Hydrolysis of Crosslinked Hyaluronic Acid 25 mg of the crosslinked hyaluronic acid obtained in Example 1
M acetate buffer (pH 5.0, NaCl 0.15M)
It was dissolved in 5 ml. No enzyme was added to this solution at 40 ° C.
It was left for 40 hours and cooled. The molecular weight of crosslinked hyaluronic acid in this solution was 8.4 × 10 4 . That is,
It can be seen that the hydrolysis of crosslinked hyaluronic acid hardly occurs under the enzymatic degradation conditions of Example 4.
【0049】実施例6
酵素分解物の分子サイズ測定
実施例4と比較例1で得られた酵素分解物の分子サイズ
は、GPCを使って測定した。GPCカラムとして昭和
電工社製SB802.5HQを1本使用し、示差屈折率
検出器として日本分光社製830−RIを使用して、溶
媒硝酸ナトリウムの0.2M水溶液、測定温度40℃、
流速0.6ml/分で測定した。測定結果を図1に示
す。Example 6 Measurement of Molecular Size of Enzymatic Degradation Product The molecular size of the enzymatic degradation product obtained in Example 4 and Comparative Example 1 was measured using GPC. Using one SB802.5HQ manufactured by Showa Denko KK as a GPC column, and using 830-RI manufactured by JASCO Corporation as a differential refractive index detector, a 0.2M aqueous solution of sodium nitrate as a solvent, a measurement temperature of 40 ° C.,
The flow rate was measured at 0.6 ml / min. The measurement results are shown in FIG.
【0050】図1の結果から、ヒアルロン酸の酵素分解
物では6糖、4糖、2糖単位のオリゴ糖の混合物が生成
しているのに対して、架橋ヒアルロン酸の酵素分解物で
は6糖単位よりも分子サイズの大きいオリゴ糖が存在し
ていることがわかる。架橋ヒアルロン酸の架橋点の立体
的構造は、直鎖構造を有するヒアルロン酸の立体的構造
と異なるため、ヒアルロニダーゼによる分解が6糖単位
以下の分子サイズまで進行しない。From the results shown in FIG. 1, a mixture of hexasaccharides, tetrasaccharides and oligosaccharides having two saccharide units was produced in the enzymatic degradation product of hyaluronic acid, whereas a mixture of hexasaccharides in the enzymatic degradation product of crosslinked hyaluronic acid was produced. It can be seen that oligosaccharides having a larger molecular size than the unit are present. Since the three-dimensional structure of the cross-linking point of cross-linked hyaluronic acid is different from the three-dimensional structure of hyaluronic acid having a linear structure, decomposition by hyaluronidase does not proceed to a molecular size of 6 sugar units or less.
【0051】実施例7
架橋ヒアルロン酸由来の分子サイズの大きいオリゴ糖の
精製
実施例4で得られた酵素分解物溶液を0.2μmメンブ
ランフィルターで濾過した。この溶液約40mlに、塩
化ナトリウム1.2gを加え、更にエタノール約150
mlを攪拌下で滴下した。得られた析出物をろ別し、硝
酸ナトリウムの0.2M水溶液30mlに溶解した。不
溶化したヒアルロニダーゼをろ別し、溶液を回収した。
GPCカラムとして昭和電工社製SB2002.5HQ
を1本使用し、日本分析工業社製LC−908を使用し
て、溶媒硝酸ナトリウムの0.5M水溶液、室温、流速
2.0ml/分、サンプル注入量1mlで分取精製し
た。分取GPCクロマトグラムを図2に示す。19.0
〜20.5分を分子サイズの大きいオリゴ糖として分取
した。分取溶液は0.2μmメンブランフィルターでろ
過した。分取溶液に対して、5倍容積のエタノールを加
えて、分子サイズの大きいオリゴ糖を析出させた。析出
物を重水に溶解し、凍結乾燥して回収した。Example 7 Purification of crosslinked hyaluronic acid-derived oligosaccharides having a large molecular size The enzyme hydrolyzate solution obtained in Example 4 was filtered through a 0.2 μm membrane filter. To about 40 ml of this solution, 1.2 g of sodium chloride was added, and further about 150
ml was added dropwise with stirring. The resulting precipitate was filtered off and dissolved in 30 ml of a 0.2 M aqueous solution of sodium nitrate. The insolubilized hyaluronidase was filtered off and the solution was recovered.
Showa Denko SB2002.5HQ as a GPC column
Was used and LC-908 manufactured by Nippon Analytical Industry Co., Ltd. was used to perform preparative purification with a 0.5 M aqueous solution of sodium nitrate as a solvent, room temperature, a flow rate of 2.0 ml / min, and a sample injection amount of 1 ml. The preparative GPC chromatogram is shown in FIG. 19.0
About 20.5 minutes was collected as an oligosaccharide having a large molecular size. The preparative solution was filtered with a 0.2 μm membrane filter. To the fractionated solution, 5 volumes of ethanol were added to precipitate oligosaccharides having a large molecular size. The precipitate was dissolved in heavy water, freeze-dried and collected.
【0052】比較例2
ヒアルロン酸オリゴ糖の精製
実施例7で分取GPCクロマトグラムの23.0〜2
3.5分をヒアルロン酸オリゴ糖として分取した。分取
溶液は0.2μmメンブランフィルターでろ過した。分
取溶液に対して、5倍容積のエタノールを加えて、ヒア
ルロン酸オリゴ糖を析出させた。析出物を重水に溶解
し、凍結乾燥して回収した。Comparative Example 2 Purification of Hyaluronic Acid Oligosaccharides 23.0-2 of the preparative GPC chromatogram in Example 7.
3.5 minutes was collected as a hyaluronic acid oligosaccharide. The preparative solution was filtered with a 0.2 μm membrane filter. Hyaluronic acid oligosaccharides were precipitated by adding 5 volumes of ethanol to the preparative solution. The precipitate was dissolved in heavy water, freeze-dried and collected.
【0053】実施例8
架橋点成分のNMR測定
実施例7で回収した分子サイズの大きいオリゴ糖と比較
例2で回収したヒアルロン酸オリゴ糖を、実施例2で使
用した溶媒に溶解してNMRの測定を行った。化学シフ
トはTSPを基準物質とした。測定結果を図3及び図4
に示す。すなわち、分子サイズの大きいオリゴ糖のC13
−NMRスペクトルを図3に、ヒアルロン酸オリゴ糖の
C13−NMRスペクトルを図4に示した。Example 8 NMR Measurement of Crosslinking Point Component The oligosaccharide having a large molecular size recovered in Example 7 and the hyaluronic acid oligosaccharide recovered in Comparative Example 2 were dissolved in the solvent used in Example 2 and analyzed by NMR. The measurement was performed. The chemical shift was based on TSP. The measurement results are shown in FIG. 3 and FIG.
Shown in. That is, C 13 of an oligosaccharide having a large molecular size
The -NMR spectrum in FIG. 3, showing the C 13 -NMR spectrum of hyaluronic acid oligosaccharide in FIG.
【0054】図3と図4のC13−NMRスペクトルの結
果から、分子サイズの大きいオリゴ糖ではヒアルロン酸
オリゴ糖に見られない小強度のピークが多数存在してい
る。ここで主ピークから大きくシフトしているピークは
171ppmと67ppmのピークである。この両者の
ピークは、ヒアルロン酸のD−グルクロン酸単位のカル
ボキシル基とN−アセチル−D−グルコサミン単位の1
級水酸基間のエステル結合の形成により主ピークからシ
フトし、それぞれエステル結合したD−グルクロン酸単
位のC−6とN−アセチル−D−グルコサミン単位のC
−6に帰属される。171ppmと67ppm以外の小
強度のピークは、エステル結合の導入に伴う遠隔効果に
より主ピークから分離したピークである。すなわち、本
発明の架橋ヒアルロン酸はヒアルロン酸のD−グルクロ
ン酸単位のカルボキシル基とN−アセチル−D−グルコ
サミン単位の1級水酸基間の選択的なエステル結合の形
成により架橋していることがわかる。図4のC13−NM
Rスペクトルの結果は、Carbohydr. Res. Vol245,p113-
128,1993記載のヒアルロン酸オリゴ糖のC13−NMRス
ペクトルと一致している。From the results of the C 13 -NMR spectra of FIGS. 3 and 4, there are many small intensity peaks which are not found in hyaluronic acid oligosaccharides in oligosaccharides having a large molecular size. Here, peaks that are largely shifted from the main peak are peaks of 171 ppm and 67 ppm. The peaks of both of these peaks are the carboxyl group of the D-glucuronic acid unit of hyaluronic acid and 1 of the N-acetyl-D-glucosamine unit.
C-6 of the D-glucuronic acid unit and C of the N-acetyl-D-glucosamine unit shifted from the main peak due to the formation of an ester bond between the primary hydroxyl groups, respectively.
-6. The small intensity peaks other than 171 ppm and 67 ppm are peaks separated from the main peak by the remote effect accompanying the introduction of the ester bond. That is, it is understood that the crosslinked hyaluronic acid of the present invention is crosslinked by the formation of a selective ester bond between the carboxyl group of the D-glucuronic acid unit of hyaluronic acid and the primary hydroxyl group of the N-acetyl-D-glucosamine unit. . C 13 -NM in FIG.
The result of R spectrum is Carbohydr. Res. Vol245, p113-
This is in agreement with the C 13 -NMR spectrum of the hyaluronic acid oligosaccharide described in 128,1993.
【0055】実施例9
実施例2で得られた架橋ヒアルロン酸を実施例2記載の
リン酸緩衝生理的食塩水に入れ、室温で2日間放置し、
十分膨潤させた。膨潤した架橋ヒアルロン酸を蒸留水で
洗浄し、実施例4記載の溶媒50mlに膨潤させた。ア
ジ化ナトリウムを10mg加えた。実施例4記載のヒア
ルロニダーゼ30mgを加え、40℃で40時間攪拌
後、冷却し、酵素分解物溶液を得た。この溶液から実施
例7と同じ方法で分子サイズの大きいオリゴ糖を回収
し、実施例8と同様にC13−NMRを測定した。図3と
同じパターンのスペクトルが得られた。すなわち、実施
例2で得られた架橋ヒアルロン酸もヒアルロン酸のD−
グルクロン酸単位のカルボキシル基とD−N−アセチル
グルコサミン単位の1級水酸基間の選択的なエステル結
合の形成により架橋していることがわかる。Example 9 The crosslinked hyaluronic acid obtained in Example 2 was placed in the phosphate buffered saline described in Example 2 and allowed to stand at room temperature for 2 days,
Allowed to swell sufficiently. The swollen crosslinked hyaluronic acid was washed with distilled water and swollen with 50 ml of the solvent described in Example 4. 10 mg of sodium azide was added. 30 mg of hyaluronidase described in Example 4 was added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 40 hours and then cooled to obtain a solution of an enzymatic decomposition product. Oligosaccharides having a large molecular size were recovered from this solution by the same method as in Example 7, and C 13 -NMR was measured in the same manner as in Example 8. The spectrum of the same pattern as FIG. 3 was obtained. That is, the cross-linked hyaluronic acid obtained in Example 2 was also D- of hyaluronic acid.
It can be seen that cross-linking occurs due to the formation of a selective ester bond between the carboxyl group of the glucuronic acid unit and the primary hydroxyl group of the DN-acetylglucosamine unit.
【0056】[0056]
【発明の効果】以上、本発明によって得られた架橋ヒア
ルロン酸は、ヒアルロン酸の分子構造の改変に起因する
生体適合性への悪影響が避けられ、実用可能な安定性と
品質管理上の優位性を有するため、生体適合性材料分野
に有用である。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, the crosslinked hyaluronic acid obtained according to the present invention avoids adverse effects on biocompatibility due to modification of the molecular structure of hyaluronic acid, and has practical stability and superior quality control. Therefore, it is useful in the field of biocompatible materials.
【図1】実施例4記載の架橋ヒアルロン酸の酵素分解物
と比較例1記載のヒアルロン酸の酵素分解物のGPCク
ロマトグラムである。FIG. 1 is a GPC chromatogram of the enzymatic degradation product of crosslinked hyaluronic acid described in Example 4 and the enzymatic degradation product of hyaluronic acid described in Comparative Example 1.
【図2】実施例4記載の架橋ヒアルロン酸の酵素分解物
の分取GPCクロマトグラムである。FIG. 2 is a preparative GPC chromatogram of the enzymatic degradation product of crosslinked hyaluronic acid described in Example 4.
【図3】実施例7で回収した分子サイズの大きいオリゴ
糖のC13−NMRスペクトルである。FIG. 3 is a C 13 -NMR spectrum of the oligosaccharide having a large molecular size recovered in Example 7.
【図4】比較例2で回収したヒアルロン酸オリゴ糖のC
13−NMRスペクトルである。FIG. 4 C of hyaluronic acid oligosaccharide recovered in Comparative Example 2
It is a 13- NMR spectrum.
1 実施例4記載の架橋ヒアルロン酸の酵素分解物のG
PCクロマトグラム
2 比較例1記載のヒアルロン酸の酵素分解物のGPC
クロマトグラム1 G of the enzymatic degradation product of crosslinked hyaluronic acid described in Example 4
PC chromatogram 2 GPC of the enzymatic degradation product of hyaluronic acid described in Comparative Example 1.
Chromatogram
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Fターム(参考) 4C081 AB05 AB11 AB22 BA03 BA12 BA13 BA16 BB01 BB05 BB06 BB07 CC05 CD082 DC03 EA05 EA12 4C090 AA02 BA67 BB05 BB18 BB22 BB53 BB94 BD04 BD10 BD18 BD36 BD37 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page F-term (reference) 4C081 AB05 AB11 AB22 BA03 BA12 BA13 BA16 BB01 BB05 BB06 BB07 CC05 CD082 DC03 EA05 EA12 4C090 AA02 BA67 BB05 BB18 BB22 BB53 BB94 BD04 BD10 BD18 BD36 BD37
Claims (2)
ヒアルロン酸分子の水酸基に、及び/又は別のヒアルロ
ン酸分子の水酸基にエステル結合によって架橋している
ことを特徴とする架橋ヒアルロン酸。1. A crosslinked hyaluronic acid characterized in that a carboxyl group of hyaluronic acid is crosslinked to a hydroxyl group of the same hyaluronic acid molecule and / or to a hydroxyl group of another hyaluronic acid molecule by an ester bond.
ヒアルロン酸分子のN−アセチル−D−グルコサミン単
位の6位の1級水酸基に、及び/又は別のヒアルロン酸
分子のN−アセチル−D−グルコサミン単位の6位の1
級水酸基にエステル結合によって架橋していることを特
徴とする請求項1記載の架橋ヒアルロン酸。2. A carboxyl group of hyaluronic acid is a primary hydroxyl group at the 6-position of an N-acetyl-D-glucosamine unit of the same hyaluronic acid molecule, and / or an N-acetyl-D-glucosamine of another hyaluronic acid molecule. 6th place of unit
The crosslinked hyaluronic acid according to claim 1, wherein the primary hydroxyl group is crosslinked by an ester bond.
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