JP2003245076A - New protein and dna encoding the same - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な神経伝達物
質作動性チャネルタンパク質、該タンパク質をコードす
るＤＮＡ、該タンパク質の活性を促進または阻害する化
合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得
られる化合物などを提供する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel neurotransmitter agonist channel protein, a DNA encoding the protein, a screening method for a compound that promotes or inhibits the activity of the protein, a compound obtained by the screening method, and the like. I will provide a.
【０００２】[0002]
【従来の技術】神経伝達物質作動性チャネルのファミリ
ーにはセロトニン３型（５−ＨＴ３）受容体、ニコチン
性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）、ＧＡＢＡ−Ａ
受容体、ＧＡＢＡ−Ｃ受容体、グリシン受容体、グルタ
ミン酸受容体などが含まれる。これらの多くはＮ末とＣ
末が細胞外に存在する４回膜貫通型タンパク質が５量体
を形成するもので、シナプスにおいて神経伝達物質によ
り作動するイオンチャネルとして知られる。５−ＨＴ３
受容体は、７つのファミリー（５−ＨＴ１〜５−ＨＴ
７）からなるセロトニン（５−ＨＴ）の受容体の一種
で、５−ＨＴ３受容体はリガンド作動性チャネルである
が、その他の５−ＨＴ受容体はＧタンパク共有型受容体
である。５−ＨＴ３受容体は、現在までに、２種のサブ
ユニット５−ＨＴ３Ａ受容体（Mol. Pharmacol. 、第48
巻、407頁、1995年）と５−ＨＴ３Ｂ受容体がクローニ
ングされている（Nature、第397巻、359頁、1999年）。
５−ＨＴ３受容体は、リガンド作動性の非選択的カチオ
ンチャネルであり、生理的条件下では一過性の膜の脱分
極を引き起こす。５−ＨＴ３受容体遮断薬であるグラニ
セトロンは嘔吐中枢を抑制することから、シスプラチン
などの抗癌剤による悪心、嘔吐の抑制に用いられる。ま
た、薬理学的解析から５−ＨＴ３受容体が白血球上に存
在することが知られていることや（Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A.、第85巻、4557頁、1988年）、５−ＨＴ３
受容体が免疫細胞の増殖の制御に関わること（Biochem.
J.、第344巻、199頁、1999年）などから、５−ＨＴ３
受容体は神経伝達のみならず免疫系の制御にも関与して
いると考えられている。ニコチン性アセチルコリン受容
体（nAChR）は、ニコチン受容体とも呼ばれるもので、
これまでに９種類のサブユニットの存在が知られている
（Prog. Neurobiol.、第61巻、75頁、2000年）。神経筋
接合部に存在する筋肉型と自律神経節や中枢神経に存在
する神経型は薬理学的性質が異なっており、これはサブ
ユニット構成の違いに起因する（Annu. Rev. Pharmaco
l. Toxicol.、第40巻、431頁、2000年）。ニコチン性ア
セチルコリン受容体はニコチン依存症、アルツハイマー
病、パーキンソン症候群、精神***病などの重要な薬剤
ターゲットに成り得ると考えられている。また、活性化
リンパ球においてアセチルコリンの合成や分泌が増加す
ること、リンパ球にはニコチン性アセチルコリン受容体
が発現しており、ニコチン性アゴニストの刺激によりリ
ンパ球で細胞内カルシウムの上昇がみられること（Phar
macology & Therapeutics、第86巻、29頁、2000年）な
どから、ニコチン性アセチルコリン受容体は免疫系の制
御にも関与していると考えられている。BACKGROUND OF THE INVENTION The family of neurotransmitter-operated channels includes serotonin type 3 (5-HT3) receptor, nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), GABA-A.
Receptors, GABA-C receptors, glycine receptors, glutamate receptors and the like are included. Most of these are N-end and C
A four-transmembrane protein whose end is located extracellularly forms a pentamer, and is known as an ion channel operated by a neurotransmitter at a synapse. 5-HT3
Receptors are of seven families (5-HT1-5-HT
It is a kind of serotonin (5-HT) receptor consisting of 7). The 5-HT3 receptor is a ligand-gated channel, while the other 5-HT receptors are G protein shared receptors. To date, the 5-HT3 receptor has been classified into two subunits, the 5-HT3A receptor (Mol. Pharmacol., No. 48).
, 407, 1995) and the 5-HT3B receptor have been cloned (Nature, 397, 359, 1999).
The 5-HT3 receptor is a ligand-gated, non-selective cation channel that causes transient membrane depolarization under physiological conditions. Granisetron, which is a 5-HT3 receptor blocker, suppresses the vomiting center, and is therefore used for suppressing nausea and vomiting by anticancer agents such as cisplatin. Further, it is known from the pharmacological analysis that the 5-HT3 receptor exists on leukocytes, and (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Vol. 85, p. 4557, 1988), 5-HT3
Receptors are involved in the control of immune cell proliferation (Biochem.
J., Vol. 344, p. 199, 1999), etc., 5-HT3
Receptors are thought to be involved in not only neurotransmission but also regulation of the immune system. Nicotinic acetylcholine receptor (nAChR), also called nicotine receptor,
The existence of nine types of subunits is known so far (Prog. Neurobiol., Vol. 61, p. 75, 2000). The muscular type at the neuromuscular junction and the neuronal type at the autonomic ganglion and the central nerve have different pharmacological properties, which is due to the difference in subunit composition (Annu. Rev. Pharmaco
l. Toxicol., 40, 431, 2000). The nicotinic acetylcholine receptor is considered to be an important drug target for nicotine addiction, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia and the like. In addition, acetylcholine synthesis and secretion are increased in activated lymphocytes, and nicotinic acetylcholine receptors are expressed in lymphocytes, and intracellular calcium elevation is observed in lymphocytes upon stimulation with nicotinic agonists. (Phar
It is believed that nicotinic acetylcholine receptors are also involved in the control of the immune system, based on macology & Therapeutics, Vol. 86, p. 29, 2000).
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】神経伝達物質作動性チ
ャネルは、神経伝達に重要な役割を果たしている。さら
に免疫細胞で発現し免疫系の制御にも関わるものもある
と考えられている。神経伝達物質作動性チャネルのサブ
ユニットが会合してチャネルを形成する詳しいメカニズ
ムや、その活性化によるイオン透過が各組織においてシ
グナル伝達に結びつく詳しいメカニズムは不明である。
類似の神経伝達物質作動性チャネルの中から、厳密に単
一のチャネルに選択性を持つアゴニスト・アンタゴニス
トの創生が、そのチャネルの性質を解明するのに役立つ
とともに、各種疾患の治療に結びつくと考えられる。Neurotransmitter-acting channels play an important role in neurotransmission. Furthermore, it is considered that there are some that are expressed in immune cells and are involved in regulation of the immune system. The detailed mechanism by which the subunits of neurotransmitter-operated channels associate to form a channel, and the detailed mechanism by which ion permeation resulting from its activation leads to signal transduction in each tissue, are unknown.
The creation of agonists / antagonists that are strictly selective to a single channel among similar neurotransmitter-acting channels will help elucidate the properties of that channel and lead to the treatment of various diseases. Conceivable.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規神経伝
達物質作動性チャネルタンパク質を見出した。該タンパ
ク質はアミノ酸レベルで、神経伝達物質作動性チャネル
タンパク質のひとつであるヒト５−ＨＴ３Ａ受容体と約
２０％の相同性を示し、４回膜貫通型の構造を有してお
り、神経伝達物質作動性チャネルタンパク質（例、５−
ＨＴの受容体）として機能し得るものである。該タンパ
ク質を抑制する方法としては、例えば、リガンドと該タ
ンパク質との結合を阻害したり、該タンパク質による神
経伝達物質作動性チャネル活性を阻害したり、該タンパ
ク質の転写を抑制して発現レベルを低下させることが考
えられる。該タンパク質を賦活化する方法としては、例
えば、該タンパク質による神経伝達物質作動性チャネル
活性を促進したり、該タンパク質のプロモーターを活性
化したり、ｍＲＮＡを安定化することで発現レベルを亢
進することが考えられる。本発明者らは、これらの知見
に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成す
るに至った。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found a novel neurotransmitter-acting channel protein. At the amino acid level, the protein shows about 20% homology with human 5-HT3A receptor, which is one of neurotransmitter-acting channel proteins, and has a four-transmembrane structure. Agonist channel proteins (eg 5-
It can function as an HT receptor). Examples of the method for suppressing the protein include, for example, inhibiting the binding between a ligand and the protein, inhibiting the neurotransmitter agonist channel activity of the protein, or suppressing the transcription of the protein to reduce the expression level. It is possible to make it. As a method for activating the protein, for example, it is possible to enhance the expression level by promoting the neurotransmitter-operated channel activity of the protein, activating the promoter of the protein, or stabilizing the mRNA. Conceivable. The present inventors have completed the present invention as a result of further studies based on these findings.
【０００５】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有す
る上記（１）記載のタンパク質またはその塩、（３）上
記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその
塩、（４）上記（１）記載のタンパク質または上記
（３）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含有するポリヌクレオチド、（５）ＤＮＡである上
記（４）記載のポリヌクレオチド、（６）配列番号：２
で表わされる塩基配列を含有する上記（５）記載のＤＮ
Ａ、（７）上記（５）記載のＤＮＡを含有する組換えベ
クター、（８）上記（７）記載の組換えベクターで形質
転換された形質転換体、（９）上記（８）記載の形質転
換体を培養し、上記（１）記載のタンパク質または上記
（３）記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とする上記（１）記載のタンパク質
もしくは上記（３）記載の部分ペプチドまたはその塩の
製造法、（１０）上記（１）記載のタンパク質もしくは
上記（３）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有して
なる医薬、（１１）上記（５）記載のＤＮＡを含有して
なる医薬、（１２）上記（１）記載のタンパク質もしく
は上記（３）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する
抗体、（１３）上記（１）記載のタンパク質もしくは上
記（３）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いること
を特徴とする、上記（１）記載のタンパク質もしくは上
記（３）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進
または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方
法、（１４）上記（１）記載のタンパク質もしくは上記
（３）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してな
る、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（３）記
載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害
する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１５）上記（１３）記載のスクリーニング方法または
上記（１４）記載のスクリーニング用キットを用いて得
られる、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記
（３）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩、（１６）上記（１
５）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１７）上記（４）記載のポリヌクレオチドを用いるこ
とを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の
発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ
ーニング方法、（１８）上記（４）記載のポリヌクレオ
チドを含有してなる、上記（１）記載のタンパク質遺伝
子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング用キット、（１９）上記（１７）記載のス
クリーニング方法または上記（１８）記載のスクリーニ
ング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタン
パク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物または
その塩、（２０）上記（１９）記載の化合物またはその
塩を含有してなる医薬、（２１）上記（１２）記載の抗
体を含有してなる診断薬、（２２）上記（１２）記載の
抗体を含有してなる医薬、（２３）上記（１２）記載の
抗体を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパ
ク質の定量方法、（２４）上記（２３）記載の定量方法
を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質
の機能が関連する疾患の診断法、（２５）上記（１２）
記載の抗体を用いることを特徴とする、上記（１）記載
のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物または
その塩のスクリーニング方法、（２６）上記（１２）記
載の抗体を含有してなる、上記（１）記載のタンパク質
の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスク
リーニング用キット、（２７）上記（２５）記載のスク
リーニング方法または上記（２６）記載のスクリーニン
グ用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパ
ク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、
（２８）上記（２７）記載の化合物またはその塩を含有
してなる医薬、（２９）中枢神経疾患、消化器疾患、肝
臓疾患、循環器疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレ
ルギー疾患、胸腺疾患、脾臓疾患、免疫不全若しくは癌
の予防・（及び／又は）治療剤、臓器移植後の拒絶反応
抑制剤、または抗癌剤治療による副作用の抑制剤である
上記（１０）、（１１）、（１６）、（２０）、（２
２）または（２８）記載の医薬、（３０）哺乳動物に対
して、上記（１５）、（１９）または（２７）記載の化
合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする
中枢神経疾患、消化器疾患、肝臓疾患、循環器疾患、炎
症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、胸腺疾患、
脾臓疾患、免疫不全若しくは癌の予防・（及び／又は）
治療方法、臓器移植後の拒絶反応抑制方法、または抗癌
剤治療による副作用の抑制方法、（３１）中枢神経疾
患、消化器疾患、肝臓疾患、循環器疾患、炎症性疾患、
自己免疫疾患、アレルギー疾患、胸腺疾患、脾臓疾患、
免疫不全若しくは癌の予防・治療剤、臓器移植後の拒絶
反応抑制剤、または抗癌剤治療による副作用の抑制剤を
製造するための上記（１５）、（１９）または（２７）
記載の化合物またはその塩の使用などを提供する。さら
に、本発明は、（３２）外来性の、上記（１）記載のタ
ンパク質をコードするＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有
する非ヒト哺乳動物、（３３）非ヒト哺乳動物がゲッ歯
動物である上記（３２）記載の非ヒト哺乳動物、（３
４）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（３
３）記載の非ヒト哺乳動物。（３５）上記（１）記載の
タンパク質をコードするＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ
発現不全非ヒト哺乳動物、（３６）非ヒト哺乳動物がゲ
ッ歯動物である上記（３５）記載の非ヒト哺乳動物、
（３７）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記
（３５）記載の非ヒト哺乳動物、（３８）上記（５）記
載のＤＮＡを含有してなる診断薬などを提供するThat is, the present invention provides (1) SEQ ID NO: 1.
A protein or its salt containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by
(2) The protein or salt thereof described in (1) above, which contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (3) The partial peptide or salt thereof of the protein described in (1) above, (4) (1) above. A polynucleotide containing a polynucleotide encoding the protein described above or the partial peptide described in (3) above, (5) the polynucleotide described above in (4) which is DNA, (6) SEQ ID NO: 2
The DN according to (5) above, which contains the base sequence represented by
A, (7) a recombinant vector containing the DNA according to (5) above, (8) a transformant transformed with the recombinant vector according to (7) above, (9) a trait according to (8) above. The transformant is cultured to produce and accumulate the protein described in (1) above or the partial peptide described in (3) above, and this is collected, or the protein described in (1) above or (3) above. (10) A protein comprising the protein according to (1) above, or the partial peptide according to (3) above or a salt thereof, and (11) the DNA according to (5) above. (12) An antibody against the protein according to (1) above, the partial peptide according to (3) above, or a salt thereof, (13) the protein according to (1) above, or the part according to (3) above. A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the protein according to (1) above, the partial peptide according to (3) above or a salt thereof, characterized by using a peptide or salt thereof, (14) above The activity of the protein according to (1) above, or the partial peptide according to (3) above or a salt thereof, which comprises the protein according to (1) or a partial peptide according to (3) above or a salt thereof, is promoted or inhibited. A kit for screening a compound or a salt thereof,
(15) Promoting the activity of the protein according to (1), the partial peptide according to (3), or a salt thereof obtained by using the screening method according to (13) above or the screening kit according to (14) above. Or a compound that inhibits or a salt thereof, (16) above (1)
5) A pharmaceutical comprising the compound or the salt thereof according to
(17) A method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of the protein gene according to (1) above, which comprises using the polynucleotide according to (4) above, (18) above (4) above A kit for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of the protein gene according to (1) above, which comprises the polynucleotide according to (1), (19) the screening method according to (17) above or (18) above. A compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein gene according to (1), which is obtained by using the screening kit according to (1), or (20) a medicament comprising the compound according to (19) or a salt thereof, (21) A diagnostic agent comprising the antibody according to (12) above, (22) Not containing the antibody according to (12) above. Medicine, (23) The method for quantifying protein according to (1) above, which comprises using the antibody according to (12) above, (24) the method for quantifying protein according to (23) above, 1) A method for diagnosing a disease associated with the function of the protein described in (25) above (12)
The method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein according to (1) above, which comprises using the antibody according to (1) above, and (26) comprising the antibody according to (12) above (1) A kit for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of a protein, (27) the above-mentioned screening method obtained by using the screening method described in (25) above or the screening kit described in (26) above, (1) A compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein according to
(28) A medicament comprising the compound according to (27) or a salt thereof, (29) central nervous system disease, digestive system disease, liver disease, circulatory system disease, inflammatory disease, autoimmune disease, allergic disease, thymus. The above-mentioned (10), (11), (16) which is a preventive and / or therapeutic agent for diseases, spleen diseases, immunodeficiency or cancer, an inhibitory agent for rejection after organ transplantation, or an inhibitory agent for side effects due to anticancer drug treatment. ), (20), (2
Central nerve characterized by administering an effective amount of the compound according to (15), (19) or (27) or a salt thereof to the pharmaceutical according to 2) or (28) or (30) a mammal. Diseases, digestive diseases, liver diseases, cardiovascular diseases, inflammatory diseases, autoimmune diseases, allergic diseases, thymus diseases,
Prevention of spleen disease, immunodeficiency or cancer (and / or)
(31) Central nervous system disease, digestive system disease, liver disease, circulatory system disease, inflammatory disease, treatment method, method for suppressing rejection after organ transplantation, or method for suppressing side effect by anticancer drug treatment
Autoimmune disease, allergic disease, thymus disease, spleen disease,
The above-mentioned (15), (19) or (27) for producing a prophylactic / therapeutic agent for immunodeficiency or cancer, an inhibitory agent for rejection after organ transplantation, or an inhibitory agent for side effects due to anticancer agent treatment.
The use of the described compound or a salt thereof is provided. Further, the present invention provides (32) an exogenous non-human mammal having a DNA encoding the protein according to (1) above or a mutant DNA thereof, and (33) the non-human mammal is a rodent. 32) The non-human mammal described in (3)
4) The above-mentioned (3) in which the rodent is a mouse or rat
3) The non-human mammal described above. (35) DNA in which the DNA encoding the protein according to (1) above is inactivated
Expression-deficient non-human mammal, (36) The non-human mammal according to (35) above, wherein the non-human mammal is a rodent.
(37) A non-human mammal according to (35) above, wherein the rodent is a mouse or rat, (38) a diagnostic agent comprising the DNA according to (5) above, and the like.
【０００６】[0006]
【発明の実施の形態】本発明で用いられる配列番号：１
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタ
ンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称する
こともある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモッ
ト、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツ
ジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細
胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メ
サンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮
細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊
維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファ
ージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細
胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜
細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細
胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆
細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの
細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位
（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下
部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵
臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血
管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾
丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来す
るタンパク質であってもよく、合成タンパク質であって
もよい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION SEQ ID NO: 1 used in the present invention
A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by (hereinafter sometimes referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention) is a human or warm-blooded animal (for example, Guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) cells (eg, hepatocytes, splenocytes, nerve cells, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermis) Cell, epithelial cell, goblet cell, endothelial cell, smooth muscle cell, fibroblast, fiber cell, muscle cell, adipocyte, immune cell (eg, macrophage, T cell, B cell, natural killer cell, mast cell, neutrophil Sphere, basophil, eosinophil, monocyte), megakaryocyte, synovial cell, chondrocyte, osteocyte, osteoblast, osteoclast, mammary cell, hepatocyte or stroma Cells, or their precursor cells, stem cells or cancer cells) or any tissue in which these cells are present, such as the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, thalamus) Lower part, cerebral cortex, medulla oblongata, cerebellum), spinal cord, pituitary gland, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel It may be a protein derived from heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle or the like, or may be a synthetic protein.
【０００７】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列と約３０％以上、好ましくは約５
０％以上、より好ましくは約７０％以上、特に好ましく
は約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上の相同性
を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：１
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列
を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタン
パク質などが好ましい。実質的に同質の活性としては、
例えば、神経伝達物質作動性チャネル活性などが挙げら
れる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に
（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であること
を示す。したがって、神経伝達物質作動性チャネル活性
が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．
１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であること
が好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子
量などの量的要素は異なっていてもよい。神経伝達物質
作動性チャネル活性などの活性の測定は、公知の方法に
準じて行うことができ、例えば、J. Biol. Chem. 275
巻, 5620-5625頁, 2000年に記載の方法またはそれに準
じる方法に従って測定することができる。The amino acid sequence which is substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 30% or more, preferably about 5% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
Examples thereof include amino acid sequences having a homology of 0% or more, more preferably about 70% or more, particularly preferably about 80% or more, and most preferably about 90% or more. SEQ ID NO: 1
As the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by, for example, containing the amino acid sequence substantially the same amino acid sequence represented by the above-mentioned SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: A protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by 1 is preferable. Substantially equivalent activity includes:
For example, neurotransmitter agonist channel activity and the like can be mentioned. The term “substantially the same” means that those properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) the same. Therefore, the activity of the neurotransmitter channel is equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.
It is preferably 1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different. The activity such as neurotransmitter agonist channel activity can be measured according to a known method, for example, J. Biol. Chem. 275.
Volume, pages 5620-5625, 2000, or a method analogous thereto or a similar method.
【０００８】また、本発明で用いられるタンパク質とし
ては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列
中の１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ま
しくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程
度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個
程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数
（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以
上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個
程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５
０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜
１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミ
ノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表され
るアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２００
個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜
１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは
１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好
ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミ
ノ酸配列、配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の
１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましく
は１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好
ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、
好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜
５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ
酸配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を
含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれ
る。上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換
されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、
とくに限定されない。The protein used in the present invention is, for example, 1 or 2 or more (eg, about 1 to 200, preferably about 1 to 150, preferably about 1 to 150 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Is an amino acid sequence in which about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10 and more preferably several (1 to 5) amino acids are deleted. ,
1 or 2 or more (for example, about 1 to 200, preferably about 1 to 150, preferably about 1 to 100, preferably 1 to 5 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
About 0, preferably about 1 to 30, preferably 1
About 10 amino acids, more preferably several (1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or more (for example, 1 to 200).
About 1, preferably about 1 to 150, preferably 1 to
About 100, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10 and more preferably several (1 to 5) amino acid sequences, SEQ ID NO: 1 or 2 or more (for example, about 1 to 200, preferably about 1 to 150, preferably about 1 to 100, preferably 1 to 50, preferably 1 in the amino acid sequence represented by 1: ~ 30 pieces,
Preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to
Also included are so-called muteins such as proteins containing an amino acid sequence in which 5) amino acids are substituted with other amino acids, or an amino acid sequence combining them. When the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, the position of the insertion, deletion or substitution is
There is no particular limitation.
【０００９】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめ
とする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカ
ルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−Ｃ
ＯＯ-）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−Ｃ
ＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにお
けるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピ
ル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル
基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ
3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチ
ルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネ
チルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナ
フチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基な
どのＣ7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基な
どが用いられる。本発明で用いられるタンパク質がＣ末
端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を
有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエス
テル化されているものも本発明で用いられるタンパク質
に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記
したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発
明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基
（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、
ホルミル基、アセチル基などのＣ 1-6アルカノイルなど
のＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内
で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログ
ルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置
換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール
基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基
（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカ
ノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されている
もの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質な
どの複合タンパク質なども含まれる。本発明で用いられ
るタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１
で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来のタンパク
質などがあげられる。The protein in the present specification is a peptide
According to the convention of the mark, the left end is the N-terminal (amino terminal), the right end
Is the C terminal (carboxyl terminal). SEQ ID NO: 1
Including proteins containing the represented amino acid sequences
The protein used in the present invention has a C-terminal
Ruboxyl group (-COOH), carboxylate (-C
OO-), Amide (-CONH2) Or ester (-C
OOR). To the ester here
Examples of R include, for example, methyl, ethyl, n-propy
C such as toluene, isopropyl and n-butyl1-6Alkyl
Groups, eg C, such as cyclopentyl, cyclohexyl, etc.
3-8Cycloalkyl groups such as phenyl, α-naphthyl
C such as le6-12Aryl groups such as benzyl, phenene
Phenyl-C such as chill1-2Alkyl group or α-na
Α-Naphthyl-C such as futylmethyl1-2Alkyl group
Which C7-14Aralkyl group, pivaloyloxymethyl group
Which is used. The protein used in the present invention is C-terminal
Carboxyl group (or carboxylate) other than the end
If so, the carboxyl groups are amidated or
Proteins that are telylated are also used in the present invention
include. Examples of the ester in this case include those described above.
C-terminal ester and the like are used. Furthermore, this
The protein used in Ming has N-terminal amino acid residues
The amino group of (eg, a methionine residue) is a protecting group (eg,
C such as formyl group and acetyl group 1-6Alkanoyl, etc.
C1-6Protected by an acyl group, etc., in vivo
The N-terminal glutamine residue produced by cleavage with
Oxidized lutamin, a position on the side chain of an amino acid in the molecule
Substituents (eg, -OH, -SH, amino group, imidazole
Groups, indole groups, guanidino groups, etc.) are suitable protecting groups
(For example, C such as formyl group and acetyl group.1-6Arca
C such as noyl group1-6Protected by an acyl group)
Or a so-called glycoprotein in which sugar chains are bound
Any complex protein etc. are included. Used in the present invention
Specific examples of the protein include, for example, SEQ ID NO: 1
A human-derived protein containing the amino acid sequence represented by
The quality can be improved.
【００１０】本発明で用いられるタンパク質の部分ペプ
チドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質
の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明
で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであ
ればいずれのものでもよい。例えば、本発明で用いられ
るタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０
個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０
個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは
２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用
いられる。また、本発明で用いられる部分ペプチドは、
そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、
１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）の
アミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１また
は２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好まし
くは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）
個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に
１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より
好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜
５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸
配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程
度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程
度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよ
い。本発明の部分ペプチドとしては、配列番号：１で表
されるアミノ酸配列において、例えば第２４番目〜第２
３０番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげら
れる。なかでも、好ましくは第１００番目〜第１２０番
目、第２１０番目〜第２３０番目、第３９１番目〜第４
１１番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげら
れる。The partial peptide of the protein used in the present invention is a partial peptide of the above-mentioned protein used in the present invention, and preferably has the same properties as the above-mentioned protein used in the present invention. Any one will do. For example, at least 20 of the constituent amino acid sequences of the protein used in the present invention
Or more, preferably 50 or more, more preferably 70
Peptides having an amino acid sequence of 1 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 or more are used. The partial peptide used in the present invention is
1 or 2 or more in the amino acid sequence (preferably,
1 to 10 amino acids, more preferably several (1 to 5) amino acids are deleted, or 1 or 2 or more (preferably 1 to 20 amino acids, more preferably 1 to 2 amino acids are included in the amino acid sequence. About 10 pieces, more preferably a number (1 to 5)
1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10 and even more preferably a number (1 to 2) amino acids added to the amino acid sequence.
5) amino acids are inserted, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, still more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence are inserted. It may be substituted with another amino acid. The partial peptide of the present invention includes, for example, the 24th position to the 2nd position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
Examples thereof include a peptide having the 30th amino acid sequence. Among them, preferably the 100th to 120th, the 210th to 230th, and the 391st to 4th.
Examples include a peptide having the 11th amino acid sequence.
【００１１】また、本発明で用いられる部分ペプチドは
Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカル
ボキシレート（−ＣＯＯ-）であるが、前記した本発明
で用いられるタンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−
ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であっても
よい。さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、
前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末
端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を
有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニ
ン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ
端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピロ
グルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の
置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは
糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチド
なども含まれる。本発明で用いられる部分ペプチドは抗
体作成のための抗原としても用いることができる。たと
えば、後述する本発明の抗体を調製する目的には、配列
番号：１で表されるアミノ酸配列において配列番号：１
で表されるアミノ酸配列において、例えば第２４番目〜
第２３０番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあ
げられる。なかでも、好ましくは第１００番目〜第１２
０番目、第２１０番目〜第２３０番目、第３９１番目〜
第４１１番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあ
げられる。[0011] In the partial peptide, the C-terminus used in the present invention is usually in the carboxyl (-COOH) or carboxylate (-COO -) is a, as a protein used in the present invention described above, C-terminal amide (-
CONH 2) or an ester (-COOR). Furthermore, the partial peptides used in the present invention include
Similar to the above-mentioned protein used in the present invention, those having a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, and the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is a protecting group. What is protected, N
Glutamine residue produced by cleavage at the end side in vivo is pyroglutamine-oxidized, substituent on the side chain of amino acid in the molecule is protected by an appropriate protecting group, or so-called sugar to which sugar chain is bound Complex peptides such as peptides are also included. The partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for antibody production. For example, for the purpose of preparing the antibody of the present invention described later, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1
In the amino acid sequence represented by, for example, the 24th position to
Examples thereof include a peptide having the 230th amino acid sequence. Among them, preferably the 100th to 12th
0th, 210th-230th, 391st-
Examples include a peptide having the 411st amino acid sequence.
【００１２】本発明で用いられるタンパク質または部分
ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、
無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などと
の塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加
塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明で用い
られるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその
塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公
知のタンパク質の精製方法によって製造することもでき
るし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転
換体を培養することによっても製造することができる。
また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもで
きる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場
合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズし
た後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロ
マトグラフィーを組み合わせることにより精製単離する
ことができる。The salts of the protein or partial peptide used in the present invention include physiologically acceptable acids (eg,
A salt with an inorganic acid, an organic acid) or a base (eg, an alkali metal salt) is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid),
Alternatively, organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid,
Fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid,
Malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like salts are used. The protein or its partial peptide or its salt used in the present invention can be produced from the cells or tissues of humans or warm-blooded animals described above by a known method for purifying a protein, or a protein containing a DNA encoding the protein. It can also be produced by culturing the transformant.
It can also be produced according to the peptide synthesis method described below. When producing from human or mammalian tissues or cells, after homogenizing human or mammalian tissues or cells, extraction is performed with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated by combining
【００１３】本発明で用いられるタンパク質もしくは部
分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成に
は、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることがで
きる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル
樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセ
トアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチ
ル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフ
ェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを
挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミ
ノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的と
するタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従
い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパ
ク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基
を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結
合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペ
プチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した保
護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用で
きる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カ
ルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、Ｄ
ＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−
エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボ
ジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラ
セミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）と
ともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対
称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔ
エステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行な
った後に樹脂に添加することができる。For the synthesis of the protein or partial peptide used in the present invention, its salt, or its amide, a commercially available resin for protein synthesis can be used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin,
PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4-
Examples thereof include (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin and 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target protein. At the end of the reaction, the protein or partial peptide is cleaved from the resin, at the same time various protecting groups are removed, and then an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or amide of them. To do. Regarding the condensation of the above-mentioned protected amino acids, various activation reagents that can be used for protein synthesis can be used, but carbodiimides are particularly preferable. As carbodiimides, D
CC, N, N'-diisopropylcarbodiimide, N-
Ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, a protected amino acid is directly added to the resin together with a racemization-inhibiting additive (eg, HOBt, HOOBt), or a symmetrical acid anhydride or HOBt ester or HOOBt is added.
It can be added to the resin after previously performing activation of the protected amino acid as an ester.
【００１４】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより
十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても
十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセ
チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化
することによって、後の反応に影響を与えないようにす
ることができる。The solvent used for activation of the protected amino acid and condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol,
Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from the range known to be applicable to protein bond-forming reactions, and is usually appropriately selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained by repeating the reaction, it is possible to acetylate the unreacted amino acid with acetic anhydride or acetylimidazole so that the subsequent reaction is not affected.
【００１５】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソ
ボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキ
シカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキ
シカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホ
ルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニル
ホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。カル
ボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、
メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シク
ロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロ
オクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もし
くは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化
（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエス
テル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベン
ジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシ
ルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド
化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒ
ドラジド化などによって保護することができる。セリン
の水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によ
って保護することができる。このエステル化に適する基
としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル
化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。チロシンの
フェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚ
ｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、
ｔ−ブチルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾー
ルの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−
２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、
ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍ
ｏｃなどが用いられる。Examples of the protective group for the amino group of the raw material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, Trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl oil, Fmoc and the like are used. The carboxyl group is, for example, alkyl esterified (for example,
Linear, branched or cyclic alkyl esterification such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl and the like, aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazideation, t-butoxycarbonylhydrazideation, tritylhydrazideation, etc. You can The hydroxyl group of serine can be protected by, for example, esterification or etherification. Suitable groups for this esterification include, for example, lower (C 1-6 ) alkanoyl groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group. Used. Moreover, examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group. Examples of the protective group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bz
1, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z,
t-Butyl or the like is used. Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos and 4-methoxy-
2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP,
Benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fm
oc or the like is used.
【００１６】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ
−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温
度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソ
ール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、
パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタン
ジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなリ
ガンド作動性カチオン捕捉剤の添加が有効である。ま
た、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる
２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理によ
り除去され、トリプトファンのインドール保護基として
用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオー
ル、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理に
よる脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモ
ニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。The activated carboxyl group of the raw material includes, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinide, N
-Hydroxyphthalimide, ester with HOBt)]
Are used. As the activated amino group of the raw material, for example, the corresponding phosphoric acid amide is used. Examples of the method for removing (eliminating) the protecting group include Pd
-Catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as black or Pd-carbon, or acid with anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid, or a mixture thereof. Treatment, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and reduction with sodium in liquid ammonia are also used. The elimination reaction by the acid treatment is generally carried out at a temperature of about -20 ° C to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol,
The addition of ligand-acting cation scavengers such as para-cresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol is effective. Further, the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane group. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
【００１７】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質または部分ペプチドの
アミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カル
ボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化し
て保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖
を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端の
α−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部
分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除
去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これ
らのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶
媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同
様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペ
プチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を
除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ること
ができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各
種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥する
ことで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得
ることができる。タンパク質またはペプチドのエステル
体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−
カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸
エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド
体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエ
ステル体を得ることができる。Protection of a functional group which should not be involved in the reaction of the starting material, removal of the protective group and removal of the protective group, activation of the functional group involved in the reaction and the like can be appropriately selected from known groups or known means. . As another method for obtaining an amide form of a protein or partial peptide, for example, first, the α-carboxyl group of the carboxy-terminal amino acid is amidated and protected, and then the peptide (protein) chain is added to the amino group side up to the desired chain length. After the extension, a protein or partial peptide in which only the N-terminal α-amino protecting group of the peptide chain is removed and a protein or partial peptide in which only the C-terminal carboxyl protecting group is removed are produced. The protein or peptide is condensed in a mixed solvent as described above. The details of the condensation reaction are the same as above. After purifying the protected protein or peptide obtained by condensation, all protecting groups can be removed by the above method to obtain the desired crude protein or peptide. The crude protein or peptide can be purified by utilizing various known purification means, and the main fraction can be lyophilized to obtain the amide of the desired protein or peptide. To obtain an ester form of a protein or peptide, for example, α- of the carboxy terminal amino acid is used.
After condensing the carboxyl group with a desired alcohol to form an amino acid ester, the desired protein or peptide ester can be obtained in the same manner as the protein or peptide amide.
【００１８】本発明で用いられる部分ペプチドまたはそ
れらの塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるい
は本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼ
で切断することによって製造することができる。ペプチ
ドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法
のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられ
る部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミ
ノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する
場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製
造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離と
しては、例えば、以下の（a）〜（e）に記載された方法
が挙げられる。
（a）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・
シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publi
shers, New York (1966年)
（b）SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Pepti
de), Academic Press, New York (1965年)
（c）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善
(株) （1975年）
（d）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 １、
タンパク質の化学ＩＶ、205、(1977年)
（e）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチ
ド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペ
プチドを精製単離することができる。上記方法で得られ
る部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法ある
いはそれに準じる方法によって適当な塩に変換すること
ができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法ある
いはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変
換することができる。The partial peptide used in the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptidase. The peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method. That is, the target peptide can be produced by condensing the partial peptide or amino acid that can form the partial peptide used in the present invention with the residual portion and removing the protective group when the product has a protective group. it can. Examples of known condensation methods and removal of protective groups include the methods described in (a) to (e) below. (A) M. Bodanszky and MA Ondetti, peptides
Synthesis (Peptide Synthesis), Interscience Publi
shers, New York (1966) (b) Schroeder and Luebke, The Pepti
de), Academic Press, New York (1965) (c) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen
(1975) (d) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory for Biochemistry 1,
Protein Chemistry IV, 205, (1977) (e) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Pharmaceuticals, Volume 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten Also, after the reaction, ordinary purification methods such as solvent extraction / distillation / The partial peptide used in the present invention can be purified and isolated by combining column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when a partial peptide is obtained, a known method or a method similar thereto is used. It can be converted into the educt or other salt by the method.
【００１９】本発明で用いられるタンパク質をコードす
るポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いら
れるタンパク質をコードする塩基配列を含有するもので
あればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡ
である。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
ライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前
記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成Ｄ
ＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクタ
ーは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、フ
ァージミドなどいずれであってもよい。また、前記した
細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製
したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymera
se Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）
によって増幅することもできる。本発明で用いられるタ
ンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配
列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェント
な条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明
で用いられるタンパク質と実質的に同質の性質を有する
タンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでも
よい。The polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any polynucleotide containing the nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention. Preferably DNA
Is. As DNA, genomic DNA, genomic DNA
Library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, synthetic D
Any of NA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, reverse Transcriptase Polymera can be directly prepared by using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
se Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method)
Can also be amplified by. The DNA encoding the protein used in the present invention is, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a hybrid with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringent conditions. Any DNA may be used as long as it has a soybean base sequence and encodes a protein having substantially the same properties as the protein used in the present invention.
【００２０】配列番号：２で表される塩基配列とハイス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列と
約３０％以上、好ましくは約５０％以上、さらに好まし
くは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、特に
好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上
の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用い
られる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるい
はそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニ
ング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法
などに従って行なうことができる。また、市販のライブ
ラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法
に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイス
トリンジェントな条件に従って行なうことができる。ハ
イストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃
度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭ
で、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃
の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温
度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体的には、
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表さ
れる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。DNA capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringent conditions
Is, for example, about 30% or more, preferably about 50% or more, further preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, particularly preferably about 80% with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. As described above, most preferably, a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more is used. Hybridization can be carried out by a known method or a method analogous thereto, for example, Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) and the like. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions. The high stringent condition is, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM.
And the temperature is about 50-70 ° C, preferably about 60-65 ° C.
The conditions of are shown. Particularly, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable. More specifically,
As the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used.
【００２１】本発明で用いられる部分ペプチドをコード
するＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられる部分
ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであれば
いかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲ
ノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃ
ＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリ
ー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。本発明で用いられる
部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配
列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡの一部分
を有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配
列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
る塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同
質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部
分を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２で
表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前
記と同意義を示す。ハイブリダイゼーションの方法およ
びハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用
いられる。The DNA encoding the partial peptide used in the present invention may be any DNA as long as it contains the nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention. In addition, genomic DNA, genomic DNA library, c derived from the cells / tissues described above
It may be DNA, a cDNA library derived from the cells / tissues described above, or synthetic DNA. The DNA encoding the partial peptide used in the present invention includes, for example, a DNA having a part of the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and high stringency. A DNA containing a base sequence that hybridizes under various conditions and containing a part of a DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention is used. The DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 has the same meaning as described above. The same hybridization method and high stringent conditions as described above are used.
【００２２】本発明で用いられるタンパク質、部分ペプ
チド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニング
および発現の説明においては、これらを単に本発明のタ
ンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤ
ＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク
質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプ
ライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または
適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク
質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしく
は合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼ
ーションによって選別することができる。ハイブリダイ
ゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニ
ング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法
などに従って行なうことができる。また、市販のライブ
ラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法
に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換
は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、MutanTM-superExp
ress Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））
等を用いて、ODA-LAPCR法やGapped duplex法やKunkel法
等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行
なうことができる。クローン化されたタンパク質をコー
ドするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により
制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用
することができる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開
始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側には翻
訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有
していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コ
ドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加する
こともできる。本発明のタンパク質の発現ベクターは、
例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ
から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ
断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連
結することにより製造することができる。D which completely encodes the protein or partial peptide used in the present invention (hereinafter, in the description of cloning and expression of the DNA encoding them, these are sometimes simply referred to as the protein of the present invention)
As a means for cloning NA, a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention is used for amplification by the PCR method, or DNA incorporated into an appropriate vector is used as a part of the protein of the present invention. Alternatively, it can be selected by hybridization with a DNA fragment coding for the entire region or one labeled with a synthetic DNA. The hybridization method is, for example, Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) and the like. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. The conversion of the nucleotide sequence of DNA can be performed by PCR or a known kit such as Mutan ™ -superExp.
ress Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo)
Etc., etc., and the known methods such as the ODA-LAPCR method, the Gapped duplex method, the Kunkel method, and the like or a method similar thereto can be used. The DNA encoding the cloned protein can be used as it is, or if desired after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker, depending on the purpose. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5′-terminal side and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3′-terminal side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adaptor. The protein expression vector of the present invention is
For example, (a) DNA encoding the protein of the present invention
A desired DNA fragment is cut out from the
It can be produced by ligating the fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector.
【００２３】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ
（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、
ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主が
バチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、Ｓ
ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主
が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプ
ロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター
などが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘ
ドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好まし
い。As a vector, a plasmid derived from E. coli (eg pBR322, pBR325, pUC12, pBR322
UC13), a Bacillus subtilis-derived plasmid (eg, pUB11)
0, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), bacteriophages such as λ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc.
A1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RS
V, pcDNAI / Neo, etc. are used. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, L promoter
TR promoter, CMV promoter, HSV-TK
Examples include promoters. Of these, CMV
It is preferable to use (cytomegalovirus) promoter, SRα promoter and the like. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the trp promoter, the lac promoter, the recA promoter, the λPL promoter,
lpp promoter, T7 promoter, etc., when the host is a Bacillus genus, SPO1 promoter, S
When the host is yeast such as PO2 promoter and penP promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
【００２４】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイ
ニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含
まない培地によっても選択できる。また、必要に応じ
て、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質
のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である
場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル
配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−ア
ミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列
などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配
列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞であ
る場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インタ
ーフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列な
どがそれぞれ利用できる。このようにして構築された本
発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクタ
ーを用いて、形質転換体を製造することができる。In addition to the above, the expression vector may optionally contain an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) and the like. Can be used. Examples of selection markers include dihydrofolate reductase (hereinafter, dhfr).
The gene [methotrexate (M
TX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter referred to as Amp
r ), neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo r , G418 resistance) and the like. In particular, when the dhfr gene is used as a selection marker using Chinese hamster cells lacking the dhfr gene, the target gene can also be selected by a thymidine-free medium. In addition, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention, if necessary. When the host is Escherichia, the PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, etc., when the host is Bacillus, the α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc., the host is yeast. In some cases, MFα · signal sequence, SUC2 · signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. can be used, respectively. Using the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed, transformants can be produced.
【００２５】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli）Ｋ１
２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０
巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・
アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９
巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecul
ar Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ
１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネテ
ィックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕な
どが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチ
ルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４
〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１
〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of
Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用
いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccha
romyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３
６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１
などが用いられる。As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used. Specific examples of Escherichia bacteria include:
For example, Escherichia coli K1
2. DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA], 60
Vol. 160 (1968)], JM103 [Nukuirekku.
Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9
Vol., 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology (Journal of Molecul
ar Biology)], 120, 517 (1978)], HB
101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] and the like are used. Examples of the genus Bacillus include, for example, Bacillus subtilis MI114.
[Gene, 24, 255 (1983)], 207-21
[Journal of Biochemistry
Biochemistry), Vol. 95, 87 (1984)] and the like. Examples of yeast include Saccharomyces
Saccharomyces cerevisiae AH22, A
H22R -, NA87-11A, DKD-5D , 20B
-12, Schizosaccharomyces pombe (Schizosaccha
romyces pombe) NCYC1913, NCYC203
6. Pichia pastoris KM71
Are used.
【００２６】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In V
ivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換する
には、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９
巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１
０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことが
できる。Examples of insect cells include virus A
In the case of cNPV, larvae of the night-thief moth (Spodop
tera frugiperda cell; Sf cell), Trichoplusia ni
MG1 cells from the midgut of the mouse, H from the eggs of Trichoplusia ni
igh FiveTM cells, cells from Mamestra brassicae or
Cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, the silkworm-derived cell line (Bombyx mor
i N cells; BmN cells) and the like are used. Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf
21 cells (above Vaughn, JL et al., In Vivo
ivo), 13, 213-217, (1977)) is used. Examples of insects include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315, 592 (198).
5)]. Animal cells include, for example, monkey cells COS-
7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter, abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter, CHO (dhf
r -) cell), mouse L cells, mouse AtT-2
0, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells and the like are used. For transforming Escherichia, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69.
Volume, 2110 (1972) and Gene, Volume 17, 1
07 (1982) and the like.
【００２７】バチルス属菌を形質転換するには、例え
ば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，
１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうこと
ができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７
８）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆
虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ
／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）
などに記載の方法に従って行なうことができる。動物細
胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細
胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）
（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，
４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことがで
きる。このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡ
を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を
得ることができる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス
属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される
培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質
転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が
含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコー
ス、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源と
しては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーン
スチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大
豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無
機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素
ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。ま
た、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加
してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。For transforming Bacillus, for example, Molecular & General Genetics, 168,
111 (1979) and the like. For transforming yeast, for example, Methods in Enzymolog
y), 194, 182-187 (1991), Procedures of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Na).
tl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (197).
It can be performed according to the method described in 8). For transforming insect cells or insects, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988))
And the like. To transform animal cells, see, eg, Cell Engineering Supplement 8, New Cell Engineering Experimental Protocol. 263-267 (1995)
(Published by Shujunsha), Virology, Volume 52,
456 (1973). In this way, the DNA encoding the protein
It is possible to obtain a transformant transformed with an expression vector containing When the host is culturing a transformant that is a bacterium of the genus Escherichia, a bacterium of the genus Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, and among them, a carbon source necessary for the growth of the transformant, A nitrogen source, an inorganic substance, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch and sucrose, and examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal and potato extract. Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factor and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
【００２８】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０
５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培
地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。
培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は
通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要
に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆
虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grac
e's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Natur
e）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の
添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨ
は約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通
常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や
撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養
する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛
血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２
２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジ
ー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・
メディカル・アソシエーション（The Journal of the A
merican Medical Association）１９９巻，５１９(１９
６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding ofthe Society for the Biological Medi
cine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃
〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気
や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞
内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せ
しめることができる。As a medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics (Journa
l of Experiments in Molecular Genetics), 431-
433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York1
972] is preferable. If necessary, a drug such as 3β-indolylacrylic acid can be added to the promoter so as to work efficiently. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When the host is a bacterium of the genus Bacillus, the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and aeration and stirring can be added if necessary. When culturing a transformant whose host is yeast, examples of the medium include Burkholder's minimum medium [Bostian, KL
Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 450.
5 (1980)] or SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Procedures of the
National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. US
A), 81, 5330 (1984)].
The pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Culturing is usually carried out at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added if necessary. When culturing a transformant whose host is an insect cell or an insect, the medium is Grac
e's Insect Medium (Grace, TCC, Nature (Natur
e), 195, 788 (1962)) to which appropriate additives such as immobilized 10% bovine serum have been added. PH of medium
Is preferably adjusted to about 6.2-6.4. Culturing is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added if necessary. When culturing a transformant whose host is an animal cell, the medium is, for example, MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 12
Volume 2, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, Volume 8, 396 (1959)], RPMI
1640 medium [Journal of the American
Medical Association (The Journal of the A
merican Medical Association) 199, 519 (19
67)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medi
cine), 73, 1 (1950)] and the like. p
H is preferably about 6-8. Culture is usually about 30 ℃
Perform at about -40 ° C for about 15-60 hours, adding aeration and agitation as needed. As described above, the protein of the present invention can be produced inside the transformant, inside the cell membrane or outside the cell.
【００２９】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ
る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変
性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含ま
れていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場
合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と
上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られ
た培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の
精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行な
うことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法
などが用いられる。The protein of the present invention can be separated and purified from the culture described above, for example, by the following method. When the protein of the present invention is extracted from cultured bacterial cells or cells, after the culture, the bacterial cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer solution, and then subjected to ultrasonic waves, lysozyme and / or freeze-thawing. After destroying the bacterial cells or cells by the method, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is appropriately used. The buffer solution may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™ . When the protein is secreted into the culture medium, after the culture is completed, the cells or cells are separated from the supernatant by a known method, and the supernatant is collected. The protein contained in the thus obtained culture supernatant or the extract can be purified by appropriately combining known separation / purification methods. Known separation and purification methods for these are mainly methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The difference in charge, the difference in charge such as ion exchange chromatography, the method using specific affinity such as affinity chromatography, and the difference in hydrophobicity such as reversed-phase high performance liquid chromatography A method utilizing a difference in isoelectric points such as a method and an isoelectric focusing method is used.
【００３０】かくして得られるタンパク質が遊離体で得
られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法
によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場
合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊
離体または他の塩に変換することができる。なお、組換
え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適
当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾
を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもで
きる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キ
モトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテ
インキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かく
して生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を
用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッテ
ィングなどにより測定することができる。When the protein thus obtained is obtained as a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, a known method or an analogous method thereto. Depending on the method, it can be converted into the educt or other salt. In addition, the protein produced by the recombinant can be optionally modified or the polypeptide can be partially removed by acting an appropriate protein-modifying enzyme before or after the purification. Examples of the protein-modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like. The presence of the thus-produced protein of the present invention can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody, Western blotting, or the like.
【００３１】本発明で用いられるタンパク質もしくは部
分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用い
られるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を
認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体の何れであってもよい。本発明で用いられ
るタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以
下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタン
パク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明
のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血
清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免
疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種ま
たは異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することが
できる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標
識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結
合した標識剤の活性を測定することにより行なうことが
できる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミ
ルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1
975)〕に従い実施することができる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが
用いられる。The antibody against the protein or partial peptide or salt thereof used in the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it is an antibody capable of recognizing the protein or partial peptide or salt thereof used in the present invention. Good. Antibodies against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention (hereinafter, these may be simply referred to as the protein of the present invention in the description of the antibody) are known by using the protein of the present invention as an antigen. It can be produced according to the method for producing an antibody or antiserum. [Preparation of Monoclonal Antibody] (a) Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Cell The protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible by itself, or together with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total. Examples of warm-blooded animals used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used. When preparing monoclonal antibody-producing cells, warm-blooded animals immunized with the antigen, for example, individuals with antibody titers are selected from mice, and spleens or lymph nodes are collected 2 to 5 days after the final immunization. A monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing the resulting antibody-producing cells with myeloma cells of the same or different species. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation is a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1
975)]. Examples of the fusion accelerator include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
【００３２】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、
ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）
が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベート
することにより効率よく細胞融合を実施できる。モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を
直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する
方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着
させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性
物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げら
れる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれ
に準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加
した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および
育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるもの
ならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２
０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧ
ＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドー
マ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。Examples of myeloma cells include NS-1,
Examples include myeloma cells of warm-blooded animals such as P3U1, SP2 / 0 and AP-1, but P3U1 is preferably used. The preferred ratio of the number of antibody-producing cells (spleen cells) to the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1,
PEG (preferably PEG1000-PEG6000)
Is added at a concentration of about 10 to 80%, and 20 to 40 ° C.,
Cell fusion can be efficiently performed by preferably incubating at 30 to 37 ° C. for 1 to 10 minutes. Although various methods can be used for screening a monoclonal antibody-producing hybridoma, for example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is directly or adsorbed with a carrier, and then a radioactive substance or Anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme (when the cells used for cell fusion are mice, anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A
And detecting the monoclonal antibody bound to the solid phase, adding the hybridoma culture supernatant to the solid phase adsorbing the anti-immunoglobulin antibody or protein A, adding the protein labeled with a radioactive substance or enzyme, Examples include a method of detecting a monoclonal antibody bound to a phase. Selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method similar thereto. Normal HAT
(Hypoxanthine, aminopterin, thymidine) can be added to the medium for animal cells. As the medium for selection and breeding, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. For example, 1-2
RP containing 0%, preferably 10-20% fetal bovine serum
MI 1640 medium, G containing 1-10% fetal bovine serum
IT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. Cultivation time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Culturing can usually be performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the above antibody titer measurement in antiserum.
【００３３】（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例え
ば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコ
ール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体
（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過
法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテ
インＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合
を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なう
ことができる。(B) Purification of Monoclonal Antibody Monoclonal antibody can be separated and purified by a known method, for example, a method for separating and purifying immunoglobulin [eg salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric focusing method, electrophoresis method, Adsorption / desorption method using ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G to collect only antibody and dissociate the binding Specific Purification Method to Obtain]].
【００３４】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タン
パク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質と
の複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法
と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発
明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の
分離精製を行なうことにより製造することができる。温
血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア
ー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類お
よびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに
架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くで
きれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよ
いが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブ
リン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約
０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせ
る方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカ
プリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、
グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性
エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活
性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動
物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは
担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産
生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完
全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、
通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行な
われる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測
定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモ
ノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの
分離精製法に従って行なうことができる。[Preparation of Polyclonal Antibody] The polyclonal antibody of the present invention can be manufactured by publicly known methods or modifications thereof. For example, an immune antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as in the above-mentioned method for producing a monoclonal antibody, and the immunized animal contains an antibody against the protein of the present invention. It can be produced by collecting the substance and separating and purifying the antibody. Regarding the complex of the immunizing antigen and the carrier protein used for immunizing warm-blooded animals, the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are such that the antibody is effective against the hapten immunized by crosslinking with the carrier. If possible, any kind may be cross-linked in any ratio, but, for example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin, etc. in a weight ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 1 hapten. A method of coupling at a rate of 5 is used. Further, various condensing agents can be used for coupling the hapten and the carrier,
Glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, active ester reagent containing thiol group, dithiopyridyl group, etc. are used. The condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibodies can be produced, by itself or together with a carrier and a diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is
Usually, it is performed once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total. The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., of the warm-blooded animal immunized by the above method, preferably from the blood. The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-mentioned antibody titer in the antiserum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
【００３５】本発明で用いられるタンパク質または部分
ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、アンチセンスヌク
レオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明の
ＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、
または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有す
るアンチセンスヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡ
の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配
列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る
作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスヌク
レオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ま
しい。本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列と
は、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すな
わち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは
部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以
上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９
５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。
特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発
明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配
列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖
と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好まし
くは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同
性を有するアンチセンスヌクレオチドが好適である。具
体的には、配列番号：２で表わされる塩基配列を有する
ＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的
な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌ
クレオチド、好ましくは例えば、配列番号：２で表わさ
れる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配
列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチ
ドなどが挙げられる。アンチセンスヌクレオチドは通
常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の
塩基から構成される。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素
による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成す
る各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例
えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホス
ホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換され
ていてもよい。これらのアンチセンスヌクレオチドは、
公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができ
る。本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製
または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリ
ヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決
定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報
に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド
（核酸）は、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイ
ブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能
を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク
質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質
遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明の
タンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリ
ヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと
特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオ
チドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝
子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気な
どの治療または診断に有用である。用語「対応する」と
は、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸
の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であるこ
とを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペ
プチド（タンパク質）との間で「対応する」とは、ヌク
レオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導され
る指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸を通常
指している。タンパク質遺伝子の５'端ヘアピンルー
プ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領
域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領
域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端
パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好
ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子
内の如何なる領域も対象として選択しうる。目的核酸
と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオ
チドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることがで
きるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」で
あるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオ
チドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポ
リヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌク
レオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシ
ドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは
非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例え
ば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸
ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマ
ー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出される
ような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置を
もつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それ
らは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一
本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドである
ことができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非
修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加
されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるも
の、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個
以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分
子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合
（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、
ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、
電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つも
の、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・
インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポ
リ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライド
など）などの側鎖基を有しているもの、インターカレー
ト化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つ
もの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ
金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、ア
ルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの
（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。
ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核
酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみ
でなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつような
ものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化さ
れたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンお
よびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むもので
あってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾された
ヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例え
ば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで
置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官
能基に変換されていてよい。Complementary to the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein or partial peptide used in the present invention (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as the DNA of the present invention in the description of antisense nucleotides),
Alternatively, the antisense nucleotide having a substantially complementary nucleotide sequence or a part thereof may be the DNA of the present invention.
Any antisense nucleotide as long as it has a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of or a part thereof and has an action of suppressing the expression of the DNA. Good, but antisense DNA is preferred. The term “substantially complementary nucleotide sequence to the DNA of the present invention” refers to, for example, a total nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of a nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, a complementary strand of the DNA of the present invention) and about 70 nucleotides. % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 9% or more.
Examples include base sequences having a homology of 5% or more.
In particular, of the total base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention, about 70% or more with the complementary strand of the base sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention (for example, the base sequence near the start codon). Antisense nucleotides having a homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more are suitable. Specifically, an antisense nucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a part thereof, preferably, for example, SEQ ID NO: : Antisense nucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of the DNA having the base sequence represented by: 2, or a part thereof. The antisense nucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases. In order to prevent degradation by a hydrolase such as nuclease, the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide constituting the antisense DNA is changed to, for example, a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate, methylphosphonate, or phosphorodithionate. It may be substituted. These antisense nucleotides
It can be produced using a known DNA synthesizer or the like. According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is cloned or determined based on the nucleotide sequence information of the DNA encoding the protein. Can be designed and synthesized. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with RNA of the protein gene of the present invention, can inhibit the synthesis or function of the RNA, or can interact with the protein-related RNA of the present invention. The expression of the protein gene of the present invention can be regulated / controlled. The polynucleotide complementary to the selected sequence of the protein-related RNA of the present invention and the polynucleotide capable of specifically hybridizing with the protein-related RNA of the present invention can be used as a protein gene of the present invention in vivo and in vitro. It is useful for regulating / controlling the expression of erythrocyte, and for treating or diagnosing diseases and the like. The term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. “Corresponding” between a nucleotide, a nucleotide sequence or a nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to an amino acid of a peptide (protein) in a command derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5′-end hairpin loop of protein gene, 5′-end 6-base pair repeat, 5′-end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3′-end untranslated region, 3 ′ The end palindromic region and the 3 ′ end hairpin loop can be selected as the preferred target region, but any region within the protein gene can be selected as the target. It can be said that the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region, and the relationship between the polynucleotide capable of hybridizing with the target region are “antisense”. Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polynucleotides containing D-ribose, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, Alternatively, other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special linkages, provided that such polymers are found in DNA or RNA. Containing a nucleotide having a configuration that allows pairing of bases and attachment of bases) and the like. They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, even DNA: RNA hybrids, and also unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), even known Modified, for example, labeled in the art, capped, methylated, one or more natural nucleotides substituted with an analogue, intramolecular nucleotide Modified ones, eg uncharged bonds (eg methylphosphonates, phosphotriesters,
Those with phosphoramidates, carbamates, etc.,
Those having a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), such as a protein (nuclease, nuclease
Inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides, etc.) having side chain groups, intercalating compounds (eg, acridine, psoralen, etc.) What has, a chelate compound (eg, metal, radioactive metal, boron, oxidizing metal, etc.), an alkylating agent, a modified bond (eg, α anomer type) Nucleic acid, etc.).
As used herein, the term "nucleoside", "nucleotide" and "nucleic acid" may include those having not only purine and pyrimidine bases but also other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. The modified nucleotide and the modified nucleotide may also have a modified sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are substituted with halogen, an aliphatic group or the like, or a functional group such as ether or amine is added. It may have been converted.
【００３６】本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド
（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸
（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例と
しては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そ
してポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミ
ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定さ
れるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のよ
うな方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内で
のアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセ
ンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス
鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし
毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなも
のにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られてお
り、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vo
l. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Cr
ooke et al. ed., Antisense Research and Applicatio
ns, CRC Press, 1993 などに開示がある。本発明のアン
チセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、
塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロス
フェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療
により適用されたり、付加された形態で与えられること
ができうる。こうして付加形態で用いられるものとして
は、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジ
ンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高め
たり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例え
ば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水
性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質として
は、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリ
ルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こ
うしたものは、核酸の３'端あるいは５'端に付着させる
ことができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介し
て付着させることができうる。その他の基としては、核
酸の３'端あるいは５'端に特異的に配置されたキャップ
用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌク
レアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられ
る。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレング
リコール、テトラエチレングリコールなどのグリコール
をはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙
げられるが、それに限定されるものではない。アンチセ
ンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の
生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタン
パク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることが
できる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用でき
る。The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphate derivatives of nucleic acids, and those resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, it makes the antisense nucleic acid more stable in the cell, increases the cell permeability of the antisense nucleic acid, has a greater affinity for the target sense strand, and if it is toxic, Make sense nucleic acid less toxic. Many such modifications are known in the art, for example J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vo.
l. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; ST Cr
ooke et al. ed., Antisense Research and Applicatio
ns, CRC Press, 1993 etc. The antisense nucleic acid of the present invention has an altered or modified sugar,
It may contain a base or a bond, and may be provided in a special form such as liposome, microsphere, applied by gene therapy, or provided in an added form. Thus, as an additive form, polycationic substances such as polylysine that act to neutralize the charge of the phosphate group, lipids that enhance the interaction with cell membranes and increase the uptake of nucleic acids ( Examples thereof include hydrophobic ones such as phospholipids and cholesterol). Preferred lipids to add include cholesterol and its derivatives (eg cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3'-end or 5'-end of the nucleic acid, and can be attached via a base, a sugar, or an intramolecular nucleoside bond. Examples of the other group include a capping group specifically arranged at the 3'-end or the 5'-end of a nucleic acid, which is for preventing decomposition by nucleases such as exonuclease and RNase. Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl group-protecting groups known in the art including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol. The inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention. The nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
【００３７】以下に、本発明のタンパク質もしくは部分
ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略
記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペ
プチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略
記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分
ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗
体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのア
ンチセンスヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンス
ヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明す
る。本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしく
はその塩を含有する医薬は、例えば、神経伝達物質作動
性チャネル活性を抑制することで、例えば、中枢神経疾
患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神
***病、記憶障害、頭痛、うつ病、薬物依存症など）、
消化器疾患（例、潰瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸
症候群など）、肝臓疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循
環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群な
ど）、炎症性疾患（例、慢性閉塞性肺疾患など）、自己
免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化
症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病、慢
性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレ
ルギー疾患（例、気管支喘息、花粉症、アレルギー性鼻
炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎な
ど）、胸腺疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症など）、
免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常
にともなう免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎
臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃
癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌など）
などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤、抗
癌剤治療による副作用の抑制剤などとして使用すること
ができる。一方、本発明のタンパク質の活性を促進する
化合物もしくはその塩を含有する医薬は、例えば、神経
伝達物質作動性チャネル活性を促進することで、例え
ば、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソ
ン症候群、精神***病、記憶障害、頭痛、うつ病、薬物
依存症など）、消化器疾患（例、潰瘍、大腸炎、クロー
ン病、過敏性腸症候群など）、肝臓疾患（例、肝炎、肝
硬変など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延
長症候群など）、炎症性疾患（例、慢性閉塞性肺疾患な
ど）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、
多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性
糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスな
ど）、アレルギー疾患（例、気管支喘息、花粉症、アレ
ルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性
皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症
など）、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または
胸腺異常にともなう免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、
肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺
癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌
など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制
剤、抗癌剤治療による副作用の抑制剤などとして使用す
ることができる。Hereinafter, the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter referred to as the DNA of the present invention and Abbreviated), an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention), and an antisense nucleotide of the DNA of the present invention (hereinafter referred to as the anti-nucleotide of the present invention). (Sometimes abbreviated as “sense nucleotide”). The drug containing a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention can be used, for example, by suppressing neurotransmitter agonist channel activity, and thus, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia). Disease, memory impairment, headache, depression, drug addiction, etc.),
Digestive diseases (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), Liver diseases (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), Cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, QT prolongation syndrome, etc.), inflammatory Diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), Allergic diseases (eg, bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymus diseases, spleen diseases (eg, hypersplenism, etc.),
Immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, immune deficiency associated with spleen dysfunction or thymus abnormality), cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder) Cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.)
It can be used as a prophylactic / therapeutic agent, a rejection inhibitor after organ transplantation, a side effect inhibitor due to anticancer drug treatment, and the like. On the other hand, a medicament containing a compound or a salt thereof that promotes the activity of the protein of the present invention, for example, by promoting neurotransmitter agonist channel activity, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, Schizophrenia, memory disorders, headache, depression, drug dependence, etc., digestive disorders (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver diseases (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), Cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, etc.), inflammatory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, etc.), autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis,
Multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic diseases (eg, bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease , Spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, white blood cell abnormalities, immunodeficiency associated with splenic or thymic abnormalities), cancer (eg, pancreatic cancer,
Lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), etc., rejection after organ transplantation It can be used as a reaction inhibitor, an inhibitor of side effects due to anticancer drug treatment, and the like.
【００３８】〔１〕本発明のタンパク質が関与する各種
疾病の治療・予防剤
本発明のタンパク質は、神経伝達物質作動性チャネル活
性を有し、神経伝達物質によるシグナル伝達に重要な役
割を果たしている。したがって、本発明のタンパク質を
コードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合
あるいは本発明のタンパク質の発現量が減少している場
合には、例えば、中枢神経疾患（例、アルツハイマー
病、パーキンソン症候群、精神***病、記憶障害、頭
痛、うつ病、薬物依存症など）、消化器疾患（例、潰
瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群など）、肝臓
疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循環器疾患（例、心不
全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、炎症性疾患（例、
慢性閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾患（例、重症筋無
力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候
群、インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リウマチ、全身
性エリテマトーデスなど）、アレルギー疾患（例、気管
支喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー
ショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾
患（例、脾機能亢進症など）、免疫不全（例、白血球異
常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全な
ど）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細
胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮
頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などの種々の疾患が発症
する。したがって、本発明のタンパク質および本発明の
ＤＮＡは、例えば、中枢神経疾患（例、アルツハイマー
病、パーキンソン症候群、精神***病、記憶障害、頭
痛、うつ病、薬物依存症など）、消化器疾患（例、潰
瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群など）、肝臓
疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循環器疾患（例、心不
全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、炎症性疾患（例、
慢性閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾患（例、重症筋無
力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候
群、インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リウマチ、全身
性エリテマトーデスなど）、アレルギー疾患（例、気管
支喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー
ショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾
患（例、脾機能亢進症など）、免疫不全（例、白血球異
常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全な
ど）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細
胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮
頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などの予防・治療剤、臓
器移植後の拒絶反応抑制剤、抗癌剤治療による副作用の
抑制剤などの医薬として使用することができる。例え
ば、生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは
欠損しているために、神経伝達物質作動性チャネル活性
が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合
に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で
本発明のタンパク質を発現させることによって、（ロ）
細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質を
発現させた後に、該細胞を患者に移植することによっ
て、または（ハ）本発明のタンパク質を該患者に投与す
ることなどによって、該患者における本発明のタンパク
質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることがで
きる。本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用
する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベ
クター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソ
シエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに
挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に
投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのまま
で、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に
認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロ
ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与でき
る。本発明のタンパク質を上記の治療・予防剤として使
用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以
上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９
％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。[1] Remedies for Preventing and Preventing Various Diseases Involved by the Protein of the Present Invention The protein of the present invention has neurotransmitter-acting channel activity and plays an important role in signal transduction by the neurotransmitter. . Therefore, when the DNA encoding the protein of the present invention is abnormal or defective, or when the expression level of the protein of the present invention is decreased, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease) Syndrome, schizophrenia, memory disorder, headache, depression, drug dependence, etc., digestive system diseases (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver disease (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.) ), Cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, etc.), inflammatory disease (eg,
Chronic obstructive pulmonary disease, etc., autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic disease (eg , Bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease, spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, splenic or thymic abnormality) Immunodeficiency associated with cancer, cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer) Various diseases such as Therefore, the protein of the present invention and the DNA of the present invention can be used for, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorders, headache, depression, drug addiction, etc.), gastrointestinal diseases (eg, , Ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver disease (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, QT prolongation syndrome, etc.), inflammatory disease (eg,
Chronic obstructive pulmonary disease, etc., autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic disease (eg , Bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease, spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, splenic or thymic abnormality) Immunodeficiency associated with cancer, cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer) And the like), a suppressive agent for rejection after organ transplantation, a suppressive agent for side effects due to anticancer drug treatment, etc. For example, when there is a patient whose neurotransmitter-operated channel activity is not sufficiently or normally exerted due to a decrease or deficiency of the protein of the present invention in vivo, (a) the DNA of the present invention By administering to a patient and expressing the protein of the present invention in vivo, (b)
By inserting the DNA of the present invention into cells and expressing the protein of the present invention, transplanting the cells into a patient, or (c) administering the protein of the present invention to the patient The role of the protein of the present invention can be exerted sufficiently or normally. When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, the DNA is inserted alone or in an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and then, according to a conventional method, It can be administered to humans or warm-blooded animals. The DNA of the present invention can be administered as it is, or can be formulated with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting intake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. When the protein of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it is at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, further preferably 99%.
It is preferable to use the one that has been purified to not less than%.
【００３９】本発明のタンパク質等は、例えば、必要に
応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、
マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水も
しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶
液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用
できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認
められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安
定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に
要求される単位用量形態で混和することによって製造す
ることができる。これら製剤における有効成分量は指示
された範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加
剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラ
ガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロー
スのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギ
ン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような
甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのよ
うな香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセル
である場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のよう
な液状担体を含有することができる。注射のための無菌
組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻
油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解また
は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ
とができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアル
コール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポ
リソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用し
てもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油な
どが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベ
ンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤
（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液な
ど）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当
なアンプルに充填される。本発明のＤＮＡが挿入された
ベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に
使用される。The protein and the like of the present invention include, for example, tablets, capsules, elixirs, and sugar-coated as necessary.
It can be used orally as a microcapsule or the like, or parenterally in the form of an injectable solution such as a sterile solution or suspension with water or another pharmaceutically acceptable liquid. For example, the protein or the like of the present invention is admixed with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc. in a unit dosage form generally required for drug formulation implementation. It can be manufactured by The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dose within the indicated range can be obtained. Additives that can be mixed with tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Puffing agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, red oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as fat may be included in addition to materials of the above type. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practices such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. Examples of the aqueous solution for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and a suitable solubilizing agent. For example, it may be used in combination with alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactant (eg, Polysorbate 80 ™ , HCO-50, etc.). Examples of the oily liquid include sesame oil, soybean oil and the like, which may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. In addition, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), Preservatives (eg,
(Benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidant, etc. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. The vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated as in the above, and is usually used parenterally.
【００４０】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラ
ット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーな
ど）に対して投与することができる。本発明のタンパク
質等の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなど
により差異はあるが、例えば、自己免疫疾患の治療目的
で本発明のタンパク質等を経口投与する場合、一般的に
成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該タン
パク質等を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質等
の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異な
るが、例えば、自己免疫疾患の治療目的で本発明のタン
パク質等を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に
投与する場合、一日につき該タンパク質等を約０．０１
〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、
より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射す
ることにより投与するのが好都合である。他の動物の場
合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することがで
きる。The preparation thus obtained is safe and has low toxicity. Dog, monkey, chimpanzee, etc.). The dose of the protein or the like of the present invention varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, etc. (As 60 kg), about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the protein or the like per day.
Administer. When administered parenterally, the single dose of the protein or the like varies depending on the administration subject, target disease, etc. When administered (as a body weight of 60 kg), the amount of the protein etc. is about 0.01 per day.
~ 30 mg, preferably about 0.1-20 mg,
More preferably, about 0.1 to 10 mg is conveniently administered by injection into the affected area. In the case of other animals, the dose converted per 60 kg can be administered.
【００４１】〔２〕疾病に対する医薬候補化合物のスク
リーニング
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を促
進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング
のための試薬として有用である。本発明は、１）本発明
のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパ
ク質の活性（例えば、神経伝達物質作動性チャネル活性
など）を促進または阻害する化合物またはその塩（以
下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）の
スクリーニング方法を提供する。より具体的には、例え
ば、（２）（ｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を
有する細胞の神経伝達物質作動性チャネル活性と（ii）
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験
化合物の混合物の神経伝達物質作動性チャネル活性の比
較を行なうことを特徴とする促進剤または阻害剤のスク
リーニング方法を提供する。具体的には、上記スクリー
ニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ii）の場合
において、神経伝達物質作動性チャネル活性をパッチ・
クランプ法で測定し、神経伝達物質作動性チャネル活性
の指標として比較することを特徴とするものである。[2] Screening of drug candidate compounds against diseases The protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or its salt that promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention. The present invention includes 1) a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention (for example, neurotransmitter agonist channel activity), which is characterized in that the protein of the present invention is used (hereinafter, each is a promoter). , May be abbreviated as an inhibitor)). More specifically, for example, (2) (i) neurotransmitter channel activity of cells having the ability to produce the protein of the present invention and (ii)
Provided is a method for screening a promoter or an inhibitor, which comprises comparing the neurotransmitter agonist channel activity of a mixture of cells having the ability to produce the protein of the present invention and a test compound. Specifically, in the above-mentioned screening method, for example, in the cases of (i) and (ii), the patch
It is characterized in that it is measured by the clamp method and compared as an index of neurotransmitter agonist channel activity.
【００４２】試験化合物としては、例えば、ペプチド、
タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙
げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。上記のスクリーニン
グ方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する
能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファー
に浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０
（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほ
う酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の神経伝達
物質作動性チャネル活性を阻害しないバッファーであれ
ばいずれでもよい。本発明のタンパク質を産生する能力
を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタン
パク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転
換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主として
は、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用い
られる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で
培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上
に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。Examples of test compounds include peptides,
Examples include proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds. Good. To carry out the above-mentioned screening method, cells capable of producing the protein of the present invention are suspended in a buffer suitable for screening and prepared. The pH of the buffer is about 4-10.
Any buffer (preferably pH about 6 to 8) such as a phosphate buffer or a borate buffer may be used as long as it does not inhibit the neurotransmitter agonist channel activity of the protein of the invention. As the cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention is used. Animal cells such as CHO cells are preferably used as the host. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed on the cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
【００４３】本発明のタンパク質の神経伝達物質作動性
チャネル活性は、公知の方法、例えば、J. Biol. Chem.
275巻, 5620-5625頁, 2000年に記載の方法あるいはそ
れに準じる方法に従って測定することができる。例え
ば、上記（ii）の場合における神経伝達物質作動性チャ
ネル活性を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以
上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以
上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を促
進する化合物またはその塩として選択することができ
る。また、例えば、上記（ii）の場合における神経伝達
物質作動性チャネル活性を、上記（ｉ）の場合に比べ
て、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好まし
くは約５０％以上阻害（または抑制）する試験化合物を
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその
塩として選択することができる。また、本発明のタンパ
ク質遺伝子のプロモーター下流に分泌型アルカリホスフ
ァターゼ、ルシフェラーゼなどの遺伝子を挿入し、上記
の各種細胞に発現させ、該細胞に上記試験化合物を接触
させた場合における酵素活性を賦活化または阻害する化
合物またはその塩を探索することによって本発明のタン
パク質の発現を促進または抑制（すなわち、本発明のタ
ンパク質の活性を促進または阻害）する化合物またはそ
の塩をスクリーニングすることができる。The neurotransmitter channel activity of the protein of the present invention can be determined by known methods, for example, J. Biol. Chem.
Volume 275, pages 5620-5625, 2000, or a method analogous thereto can be used for measurement. For example, a test compound that promotes the neurotransmitter-gated channel activity in the case of (ii) above by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the case of (i) above. Can be selected as a compound or its salt that promotes the activity of the protein of the present invention. In addition, for example, the neurotransmitter agonist channel activity in the case of (ii) above is inhibited by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared with the case of (i) above ( Alternatively, a test compound to be suppressed can be selected as a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof. In addition, a gene for secretory alkaline phosphatase, luciferase or the like is inserted downstream of the promoter of the protein gene of the present invention, expressed in the various cells described above, and the enzyme activity is activated when the test compound is contacted with the cells or By searching for a compound or a salt thereof that inhibits, a compound or a salt thereof that promotes or suppresses the expression of the protein of the present invention (that is, promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention) can be screened.
【００４４】本発明のタンパク質をコードするポリヌク
レオチドは、本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのた
めの試薬として有用である。本発明は、（３）本発明の
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いること
を特徴とする本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進
剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方
法を提供し、より具体的には、例えば、（４）（iii）
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養
した場合と（iv）本発明のタンパク質を産生する能力を
有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比
較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリ
ーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法にお
いては、例えば、（iii）と（iv）の場合における、本
発明のタンパク質遺伝子の発現量（具体的には、本発明
のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲ
ＮＡ量）を測定して、比較する。試験化合物としては、
例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動
物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化
合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタ
ンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニング
に適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーに
は、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリ
ン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタ
ンパク質の神経伝達物質作動性チャネル活性を阻害しな
いバッファーであればいずれでもよい。本発明のタンパ
ク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前
述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有す
るベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用い
られる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物
細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例
えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタ
ンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく
用いられる。本発明のタンパク質量の測定は、公知の方
法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用い
て、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウ
ェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準
じる方法に従い測定することができる。本発明のタンパ
ク質遺伝子の発現量は、公知の方法、例えば、ノーザン
ブロッティングやReverse transcription-polymerase c
hain reaction（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ
解析システム（ＡＢＩ社製、TaqMan polymerase chainr
eaction）などの方法あるいはそれに準じる方法にした
がって測定することができる。例えば、上記（iv）の場
合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、上記
（iii）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３
０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化
合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合
物またはその塩として選択することができる。例えば、
上記（iv）の場合における本発明のタンパク質遺伝子の
発現量を、上記（iii）の場合に比べて、約２０％以
上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以
上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発
現を阻害する化合物またはその塩として選択することが
できる。さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質
の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスク
リーニングのための試薬として有用である。The polynucleotide encoding the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or its salt that promotes or inhibits the expression of the protein gene of the present invention. The present invention uses (3) a polynucleotide encoding the protein of the present invention, which promotes or inhibits the expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof (hereinafter, abbreviated as promoter and inhibitor, respectively). In some cases, more specifically, for example, (4) (iii)
Promotion characterized by performing a comparison between the case of culturing cells having the ability to produce the protein of the present invention and (iv) the case of culturing a mixture of cells having the ability to produce the protein of the present invention and a test compound A method for screening an agent or an inhibitor is provided. In the above screening method, for example, in the cases of (iii) and (iv), the expression level of the protein gene of the present invention (specifically, the amount of the protein of the present invention or the mR encoding the protein)
NA amount) is measured and compared. As a test compound,
For example, peptides, proteins, non-peptidic compounds,
Examples thereof include synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. These compounds may be novel compounds or known compounds.
To carry out the above-mentioned screening method, cells capable of producing the protein of the present invention are suspended in a buffer suitable for screening and prepared. The buffer may be any buffer that does not inhibit the neurotransmitter agonist channel activity of the protein of the present invention, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably a pH of about 6 to 8). Good. As the cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention is used. Animal cells such as CHO cells are preferably used as the host. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed on the cell membrane by culturing by the method described above is preferably used. The amount of the protein of the present invention can be measured by a known method, for example, by using an antibody that recognizes the protein of the present invention, the protein present in a cell extract or the like is subjected to a method such as Western analysis or ELISA, or a method similar thereto. It can be measured according to the method. The expression level of the protein gene of the present invention can be determined by known methods such as Northern blotting and Reverse transcription-polymerase c.
hain reaction (RT-PCR), real-time PCR
Analysis system (ABI, TaqMan polymerase chainr
eaction) or the like or a method similar thereto. For example, the expression level of the protein gene of the present invention in the case of (iv) above is about 20% or more, preferably 3% as compared with the case of (iii) above.
A test compound that promotes 0% or more, more preferably about 50% or more, can be selected as a compound that promotes the expression of the protein gene of the present invention or a salt thereof. For example,
A test compound that inhibits the expression level of the protein gene of the present invention in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably by 30% or more, more preferably by about 50% or more, as compared with the case of the above (iii). The compound or its salt that inhibits the expression of the protein gene of the present invention can be selected. Furthermore, the antibody of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or its salt that promotes or inhibits the expression of the protein of the present invention.
【００４５】本発明は、（５）本発明の抗体を用いるこ
とを特徴とする本発明のタンパク質の発現を促進または
阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、
阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を
提供し、より具体的には、例えば、（６）（v）本発明
のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場
合と（vi）本発明のタンパク質を産生する能力を有する
細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行
うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニン
グ方法を提供する。上記スクリーニング方法において
は、例えば、（v）と（vi）の場合における、本発明の
タンパク質の発現量（具体的には、本発明のタンパク質
量）を抗体を用いて測定（例、本発明のタンパク質の発
現を検出、本発明のタンパク質の発現量を定量等）し
て、比較する。試験化合物としては、例えば、ペプチ
ド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発
酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液な
どが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であっても
よいし、公知の化合物であってもよい。上記のスクリー
ニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生
する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッフ
ァーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜
１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファ
ー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の神
経伝達物質作動性チャネル活性を阻害しないバッファー
であればいずれでもよい。本発明のタンパク質を産生す
る能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明
のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで
形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主
としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好まし
く用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の
方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細
胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、
本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出
液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解
析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に
従い測定することができる。例えば、上記（vi）の場合
における本発明のタンパク質の発現量を、上記（v）の
場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、
より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発
明のタンパク質の発現を促進する化合物またはその塩と
して選択することができる。例えば、上記（vi）の場合
における本発明のタンパク質の発現量を、上記（v）の
場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、
より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発
明のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩と
して選択することができる。The present invention provides (5) a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of the protein of the present invention, which comprises using the antibody of the present invention (hereinafter, a promoter,
(May be abbreviated as inhibitor)), more specifically, for example, (6) (v) when cells having the ability to produce the protein of the present invention are cultured and (vi) Provided is a method for screening a promoter or an inhibitor, which comprises performing comparison between cells having the ability to produce the protein of the invention and a mixture of test compounds. In the above screening method, for example, in the cases of (v) and (vi), the expression level of the protein of the present invention (specifically, the protein amount of the present invention) is measured using an antibody (eg, The expression of the protein is detected, the expression level of the protein of the present invention is quantified, etc.) and compared. Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts and the like, and these compounds may be novel compounds. It may be a known compound. To carry out the above-mentioned screening method, cells capable of producing the protein of the present invention are suspended in a buffer suitable for screening and prepared. The buffer has a pH of about 4 to
Any buffer that does not inhibit the neurotransmitter agonist channel activity of the protein of the present invention may be used, such as a phosphate buffer or a borate buffer having a pH of 10 (preferably about pH 6 to 8). As the cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention is used. Animal cells such as CHO cells are preferably used as the host. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed on the cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
The protein amount of the present invention can be measured by a known method, for example,
Using the antibody that recognizes the protein of the present invention, the protein present in a cell extract or the like can be measured according to a method such as Western analysis or an ELISA method or a method similar thereto. For example, the expression level of the protein of the present invention in the case of (vi) is about 20% or more, preferably 30% or more, as compared with the case of (v).
More preferably, a test compound that promotes about 50% or more can be selected as a compound that promotes the expression of the protein of the present invention or a salt thereof. For example, the expression level of the protein of the present invention in the case of (vi) is about 20% or more, preferably 30% or more, as compared with the case of (v).
More preferably, a test compound that inhibits by about 50% or more can be selected as a compound that inhibits the expression of the protein of the present invention or a salt thereof.
【００４６】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたは
その塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは
部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するも
のである。本発明のスクリーニング方法またはスクリー
ニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから
選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク
質の活性（例、神経伝達物質作動性チャネル活性など）
を促進または阻害する化合物またはその塩である。該化
合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と
同様のものが用いられる。本発明のタンパク質の活性を
促進する化合物またはその塩は、例えば、中枢神経疾患
（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分
裂病、記憶障害、頭痛、うつ病、薬物依存症など）、消
化器疾患（例、潰瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸症
候群など）、肝臓疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循環
器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、
炎症性疾患（例、慢性閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾
患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シ
ェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節
リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー
疾患（例、気管支喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、ア
ナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸
腺疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症など）、免疫不全
（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともな
う免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝
臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱
癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などの予
防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤、抗癌剤治療
による副作用の抑制剤などの医薬として有用である。ま
た、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物または
その塩は、例えば、中枢神経疾患（例、アルツハイマー
病、パーキンソン症候群、精神***病、記憶障害、頭
痛、うつ病、薬物依存症など）、消化器疾患（例、潰
瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群など）、肝臓
疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循環器疾患（例、心不
全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、炎症性疾患（例、
慢性閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾患（例、重症筋無
力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候
群、インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リウマチ、全身
性エリテマトーデスなど）、アレルギー疾患（例、気管
支喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー
ショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾
患（例、脾機能亢進症など）、免疫不全（例、白血球異
常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全な
ど）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細
胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮
頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などの予防・治療剤、臓
器移植後の拒絶反応抑制剤、抗癌剤治療による副作用の
抑制剤などの医薬として有用である。本発明のタンパク
質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩は、例え
ば、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソ
ン症候群、精神***病、記憶障害、頭痛、うつ病、薬物
依存症など）、消化器疾患（例、潰瘍、大腸炎、クロー
ン病、過敏性腸症候群など）、肝臓疾患（例、肝炎、肝
硬変など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延
長症候群など）、炎症性疾患（例、慢性閉塞性肺疾患な
ど）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、
多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性
糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスな
ど）、アレルギー疾患（例、気管支喘息、花粉症、アレ
ルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性
皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症
など）、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または
胸腺異常にともなう免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、
肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺
癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌
など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制
剤、抗癌剤治療による副作用の抑制剤などの医薬として
有用である。また、本発明のタンパク質遺伝子の発現を
阻害する化合物またはその塩は、例えば、中枢神経疾患
（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分
裂病、記憶障害、頭痛、うつ病、薬物依存症など）、消
化器疾患（例、潰瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸症
候群など）、肝臓疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循環
器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、
炎症性疾患（例、慢性閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾
患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シ
ェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節
リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー
疾患（例、気管支喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、ア
ナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸
腺疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症など）、免疫不全
（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともな
う免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝
臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱
癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などの予
防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤、抗癌剤治療
による副作用の抑制剤などの医薬として有用である。本
発明のタンパク質の発現を促進する化合物またはその塩
は、例えば、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パ
ーキンソン症候群、精神***病、記憶障害、頭痛、うつ
病、薬物依存症など）、消化器疾患（例、潰瘍、大腸
炎、クローン病、過敏性腸症候群など）、肝臓疾患
（例、肝炎、肝硬変など）、循環器疾患（例、心不全、
不整脈、ＱＴ延長症候群など）、炎症性疾患（例、慢性
閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力
症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、
インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性エ
リテマトーデスなど）、アレルギー疾患（例、気管支喘
息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショ
ック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾患
（例、脾機能亢進症など）、免疫不全（例、白血球異
常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全な
ど）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細
胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮
頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などの予防・治療剤、臓
器移植後の拒絶反応抑制剤、抗癌剤治療による副作用の
抑制剤などの医薬として有用である。また、本発明のタ
ンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩は、例え
ば、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソ
ン症候群、精神***病、記憶障害、頭痛、うつ病、薬物
依存症など）、消化器疾患（例、潰瘍、大腸炎、クロー
ン病、過敏性腸症候群など）、肝臓疾患（例、肝炎、肝
硬変など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延
長症候群など）、炎症性疾患（例、慢性閉塞性肺疾患な
ど）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、
多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性
糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスな
ど）、アレルギー疾患（例、気管支喘息、花粉症、アレ
ルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性
皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症
など）、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または
胸腺異常にともなう免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、
肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺
癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌
など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制
剤、抗癌剤治療による副作用の抑制剤などの医薬として
有用である。The screening kit of the present invention contains the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide used in the present invention. The compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a test compound described above, for example, a peptide, a protein, a non-peptide compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, a plant extract. , A compound selected from animal tissue extract, plasma and the like, or a salt thereof, and the activity of the protein of the present invention (eg, neurotransmitter agonist channel activity)
Is a compound or a salt thereof that promotes or inhibits As the salt of the compound, those similar to the salts of the protein of the present invention described above are used. The compound or a salt thereof that promotes the activity of the protein of the present invention is, for example, a central nervous system disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorder, headache, depression, drug addiction, etc.), digestive system disease (Eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver disease (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, etc.),
Inflammatory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc. ), Allergic disease (eg, bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease, spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, Spleen dysfunction or immunodeficiency due to thymic abnormalities), cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer) , Colon cancer, rectal cancer, etc.), agents for preventing rejection after organ transplantation, agents for suppressing side effects due to anticancer drug treatment, and the like. In addition, compounds or salts thereof that inhibit the activity of the protein of the present invention are, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorders, headache, depression, drug addiction, etc.), digestion Diseases (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver diseases (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, QT prolongation syndrome, etc.), inflammatory diseases (Eg,
Chronic obstructive pulmonary disease, etc., autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic disease (eg , Bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymus disease, spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, splenic or thymic abnormality) Immunodeficiency associated with cancer, cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer) , Etc., etc., a preventive / therapeutic agent, a rejection inhibitor after organ transplantation, a side effect inhibitor due to anticancer drug treatment, and the like. The compound or its salt that promotes the expression of the protein gene of the present invention is, for example, a central nervous system disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorder, headache, depression, drug dependence, etc.), digestive system. Diseases (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), Liver diseases (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), Cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, QT prolongation syndrome, etc.), inflammatory diseases ( Eg, chronic obstructive pulmonary disease), autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis,
Multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic diseases (eg, bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease , Spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, white blood cell abnormalities, immunodeficiency associated with splenic or thymic abnormalities), cancer (eg, pancreatic cancer,
Lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), etc., rejection after organ transplantation It is useful as a drug such as a reaction inhibitor and an inhibitor of side effects caused by anticancer drug treatment. In addition, compounds or salts thereof that inhibit the expression of the protein gene of the present invention, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorders, headache, depression, drug dependence, etc.), Digestive disorders (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver disorders (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), cardiovascular disorders (eg, heart failure, arrhythmia, prolongation of QT, etc.),
Inflammatory diseases (eg, chronic obstructive pulmonary disease, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc. ), Allergic disease (eg, bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease, spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, Spleen dysfunction or immunodeficiency due to thymic abnormalities), cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer) , Colon cancer, rectal cancer, etc.), agents for preventing rejection after organ transplantation, agents for suppressing side effects due to anticancer drug treatment, and the like. The compound or its salt that promotes the expression of the protein of the present invention is, for example, a central nervous system disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorder, headache, depression, drug addiction, etc.), digestive system disease (Eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver disease (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), cardiovascular disease (eg, heart failure,
Arrhythmia, long QT syndrome, etc., inflammatory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, etc.), autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, etc.)
Insulin-resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc., allergic disease (eg, bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymus disease, spleen disease (eg, splenic function) Hypersensitivity, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, splenic insufficiency or thymic abnormality, etc.), cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate) Cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), a preventive / therapeutic agent, a rejection inhibitor after organ transplantation, a side effect inhibitor by an anticancer agent treatment, etc. is there. In addition, the compound or its salt that inhibits the expression of the protein of the present invention is, for example, a central nervous system disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorder, headache, depression, drug dependence, etc.), digestion Diseases (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver diseases (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, QT prolongation syndrome, etc.), inflammatory diseases (Eg, chronic obstructive pulmonary disease, etc.), autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis,
Multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic diseases (eg, bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease , Spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, white blood cell abnormalities, immunodeficiency associated with splenic or thymic abnormalities), cancer (eg, pancreatic cancer,
Lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), etc., rejection after organ transplantation It is useful as a drug such as a reaction inhibitor and an inhibitor of side effects caused by anticancer drug treatment.
【００４７】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に
従って製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセ
ル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶
液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして
得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒト
または温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チ
ンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投
与することができる。該化合物またはその塩の投与量
は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどに
より差異はあるが、例えば、自己免疫疾患治療の目的で
本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその
塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇと
して）においては、一日につき該化合物またはその塩を
約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経
口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投
与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例
えば、自己免疫疾患治療の目的で本発明のタンパク質の
活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常
成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につ
き該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、
好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約
０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好
都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに
換算した量を投与することができる。When the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be formulated according to a conventional method. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like can be used. Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, humans or warm-blooded animals (for example, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.) ) Orally or parenterally. The dose of the compound or its salt varies depending on its action, target disease, administration subject, administration route, etc., but for example, the compound or its salt that promotes the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating autoimmune diseases. When administered orally, generally, in an adult human (60 kg body weight), the compound or its salt is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 m per day.
g, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease and the like, but for example, a compound that promotes the activity of the protein of the present invention for the purpose of treating autoimmune disease. Alternatively, when the salt is administered in the form of an injection to an adult (body weight is 60 kg), the compound or the salt is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg per day.
It is convenient to administer about 0.1 to 20 mg, preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. Also in the case of other animals, the dose converted per 60 kg of body weight can be administered.
【００４８】〔３〕本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはその塩の定量
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識す
ることができるので、被検液中の本発明のタンパク質の
定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使
用することができる。すなわち、本発明は、（ｉ）本発
明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパ
ク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化さ
れた本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴と
する被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および
標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的
に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定
することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の
定量法を提供する。上記（ii）の定量法においては、一
方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体
で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応す
る抗体であることが望ましい。[3] Quantification of protein of the present invention, partial peptide or salt thereof Since the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, It can be used for quantification, especially by sandwich immunoassay. That is, the present invention provides (i) a ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody by competitively reacting the antibody of the present invention with a test solution and the labeled protein of the present invention. A method for quantifying the protein of the present invention in a test liquid, which comprises measuring (ii) the test liquid and the antibody of the present invention insolubilized on a carrier and another antibody of the present invention labeled The present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, which comprises reacting at the same time or successively and measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier. In the quantification method of (ii) above, it is desirable that one antibody recognizes the N-terminal portion of the protein of the present invention and the other antibody reacts with the C-terminal portion of the protein of the present invention.
【００４９】また、本発明のタンパク質に対するモノク
ローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称
する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を
行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともで
きる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いても
よく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2 、Ｆａｂ'、あるい
はＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本
発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきもの
ではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質
量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の
量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知
量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算
出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよ
い。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリッ
ク法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感
度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるの
が特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる
標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素とし
ては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14
Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活
性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダ
ーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用い
られる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられ
る。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノー
ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−アビジン系を用いることもできる。In addition to quantifying the protein of the present invention using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), detection by tissue staining or the like can also be performed. . For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used. The method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may include an antibody, an antigen or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (for example, the amount of protein) in the liquid to be measured. Any measuring method may be used as long as it is a method of detecting the amount by chemical or physical means and calculating it from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competitive method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but from the viewpoint of sensitivity and specificity, the sandwich method described later is particularly preferably used. As the labeling agent used in the measuring method using the labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, etc. are used. Examples of radioisotopes include, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14
C] or the like is used. As the above-mentioned enzyme, those having a stable and large specific activity are preferable, and for example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, etc. are used. As the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, the biotin-avidin system can be used for binding the antibody or the antigen to the labeling agent.
【００５０】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵
素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用
いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキス
トラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ある
いはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては
不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応
させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化
担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の
本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反
応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定
法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明
のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合す
る部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわ
ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例え
ば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質
のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体
は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗
体が用いられる。For the insolubilization of the antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond which is usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide and silicon, and glass. In the sandwich method, a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (first reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction), and then on the insolubilized carrier. The amount of the protein of the present invention in the test liquid can be quantified by measuring the activity of the labeling agent. The primary reaction and the secondary reaction may be carried out in the reverse order, may be carried out simultaneously, or may be carried out at different times. The labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above. In addition, in the immunoassay method by the sandwich method,
The antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies may be used for the purpose of improving the measurement sensitivity. In the method for measuring the protein of the present invention by the sandwich method of the present invention, the monoclonal antibodies of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction are preferably antibodies having different binding sites for the protein of the present invention. That is, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal portion of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody used in the primary reaction. An antibody that recognizes an N-terminal other than the C-terminal is used.
【００５１】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ
／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、
前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量
を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈
降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用する
レーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measuring system other than the sandwich method, for example, a competitive method, an immunometric method or nephrometry. In the competitive method, the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen is reacted.
(F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated (B
/ F separation), the labeled amount of either B or F is measured to quantify the amount of antigen in the test liquid. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, and B / F separation is performed using polyethylene glycol,
A liquid phase method using a second antibody or the like against the antibody, and using a solid phase antibody as the first antibody, or
The first antibody is soluble and the second antibody is a solid-phased antibody. In the immunometric method, the antigen in the test liquid and the solid-phased antigen are competitively reacted with a fixed amount of the labeled antibody and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test liquid is separated. After reacting with an excess amount of the labeled antibody and then adding the immobilized antigen to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the labeled amount of either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test liquid. In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of the antigen-antibody reaction in the gel or in the solution is measured. Even when the amount of antigen in the test liquid is small and only a small amount of precipitate can be obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
【００５２】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一
般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる。例えば、入江 寛編「ラジオイム
ノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編
「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochem
ical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochem
ical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochem
ical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明の抗体を用い
ることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量す
ることができる。さらには、本発明の抗体を用いて本発
明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明
のタンパク質の濃度の減少が検出された場合、例えば、
中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症
候群、精神***病、記憶障害、頭痛、うつ病、薬物依存
症など）、消化器疾患（例、潰瘍、大腸炎、クローン
病、過敏性腸症候群など）、肝臓疾患（例、肝炎、肝硬
変など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長
症候群など）、炎症性疾患（例、慢性閉塞性肺疾患な
ど）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、
多発性硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性
糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスな
ど）、アレルギー疾患（例、気管支喘息、花粉症、アレ
ルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性
皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症
など）、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または
胸腺異常にともなう免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、
肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺
癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌
など）など、臓器移植後の拒絶反応、抗癌剤治療による
副作用などが発症している可能性が高いと診断すること
ができる。反対に、例えば、本発明のタンパク質の濃度
の上昇が検出された場合、例えば、中枢神経疾患（例、
アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神***病、
記憶障害、頭痛、うつ病、薬物依存症など）、消化器疾
患（例、潰瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群な
ど）、肝臓疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循環器疾患
（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、炎症性
疾患（例、慢性閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾患
（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェ
ーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リ
ウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー疾
患（例、気管支喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナ
フィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺
疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症など）、免疫不全
（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともな
う免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝
臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱
癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などであ
る、または、臓器移植後の拒絶反応、抗癌剤治療による
副作用などが発症している可能性が高いと診断すること
が出来る。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被
検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために
使用することができる。また、本発明のタンパク質を精
製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分
画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における
本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用する
ことができる。In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, it is not necessary to set special conditions, operations and the like. The protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical consideration to those skilled in the art to the ordinary conditions and operating methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like. For example, Hiroshi Irie "Radioimmunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie "Radioimmunoassay" (Kodansha, published in 1979), Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Showa) 1993), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (second edition) (Medical Shoin, published in 1982), Eiji Ishikawa, et al. "Enzyme Immunoassay" (3rd edition) (Medicine Shoin, Showa) 1987), "Methods in ENZYMOLOGY" Vol. 70 (Immunochem
ical Techniques (Part A)), ibid Vol. 73 (Immunochem
ical Techniques (Part B)), ibid Vol. 74 (Immunochem
ical Techniques (Part C)), ibid Vol. 84 (Immunochem
ical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)),
Ibid Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s)), ibid Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part
I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s)) (above, published by Academic Press). As described above, the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention. Furthermore, when a decrease in the concentration of the protein of the present invention is detected by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, for example,
Central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorders, headache, depression, drug addiction, etc.), digestive system diseases (eg, ulcers, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.) , Liver disease (eg, hepatitis, cirrhosis), cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, etc.), inflammatory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, etc.), autoimmune disease (eg, severe muscle) Asthenia, glomerulonephritis,
Multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic diseases (eg, bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease , Spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, white blood cell abnormalities, immunodeficiency associated with splenic or thymic abnormalities), cancer (eg, pancreatic cancer,
Lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc., rejection after organ transplantation, anti-cancer drug treatment It can be diagnosed that side effects are likely to occur. On the contrary, for example, when an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected, for example, a central nervous system disease (eg,
Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia,
Memory disorders, headache, depression, drug addiction, etc., digestive disorders (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver disorders (eg, hepatitis, cirrhosis), cardiovascular disorders (eg Eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, etc., inflammatory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, etc.), autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin) Resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc., allergic disease (eg, bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease, spleen disease (eg, hypersplenism) Disease, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, splenic dysfunction or immunodeficiency associated with thymic abnormality), cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, egg) Cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), or rejection after organ transplantation, side effects due to anticancer drug treatment, etc. may occur. It can be diagnosed as high. Further, the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as body fluid or tissue. In addition, for preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction during purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in a test cell, etc. Can be used.
【００５３】〔４〕遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードす
るＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出す
ることができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡ
の損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたは
ｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤と
して有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子
診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーショ
ンやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），
第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of t
heNational Academy of Sciences of the United State
s of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１
９８９年））などにより実施することができる。例え
ば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現増加が
検出された場合、例えば中枢神経疾患（例、アルツハイ
マー病、パーキンソン症候群、精神***病、記憶障害、
頭痛、うつ病、薬物依存症など）、消化器疾患（例、潰
瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群など）、肝臓
疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循環器疾患（例、心不
全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、炎症性疾患（例、
慢性閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾患（例、重症筋無
力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候
群、インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リウマチ、全身
性エリテマトーデスなど）、アレルギー疾患（例、気管
支喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー
ショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾
患（例、脾機能亢進症など）、免疫不全（例、白血球異
常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全な
ど）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細
胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮
頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などである、または、臓
器移植後の拒絶反応、抗癌剤治療による副作用などが発
症している可能性が高いと診断することが出来る。反対
に、発現低下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法に
よりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、中
枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候
群、精神***病、記憶障害、頭痛、うつ病、薬物依存症
など）、消化器疾患（例、潰瘍、大腸炎、クローン病、
過敏性腸症候群など）、肝臓疾患（例、肝炎、肝硬変な
ど）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候
群など）、炎症性疾患（例、慢性閉塞性肺疾患など）、
自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性
硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿
病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスな
ど）、アレルギー疾患（例、気管支喘息、花粉症、アレ
ルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性
皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症
など）、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または
胸腺異常にともなう免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、
肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺
癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌
など）などである、または臓器移植後の拒絶反応、抗癌
剤治療による副作用などが発症している可能性が高いと
診断することができる。[4] Gene Diagnostic Agent The DNA of the present invention can be used as a probe, for example, to prepare human or warm-blooded animals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow,
Since it is possible to detect an abnormality (gene abnormality) of the DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide in horses, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc., for example, the DNA or mRNA can be detected.
It is useful as a gene diagnostic agent for damage, mutation or decrease in expression, increase in DNA or mRNA, or excessive expression. The above-mentioned gene diagnosis using the DNA of the present invention is carried out, for example, by known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics,
Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of USA.
heNational Academy of Sciences of the United State
s of America, 86, 2766-2770 (1
989)) and the like. For example, when an increased expression is detected by Northern hybridization, for example, a central nervous system disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorder,
Headache, depression, drug addiction, etc., digestive system diseases (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver disease (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), cardiovascular disease (eg, heart failure) , Arrhythmias, long QT syndrome, etc., inflammatory diseases (eg,
Chronic obstructive pulmonary disease, etc., autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic disease (eg , Bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease, spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, splenic or thymic abnormality) Immunodeficiency associated with cancer, cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer) Etc.), or the possibility that a rejection reaction after organ transplantation, a side effect due to anticancer drug treatment, or the like is likely to occur. On the contrary, when decreased expression is detected or when a DNA mutation is detected by the PCR-SSCP method, for example, a central nervous system disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorder, headache, Depression, drug addiction, etc., digestive disorders (eg, ulcers, colitis, Crohn's disease,
Irritable bowel syndrome etc.), liver disease (eg hepatitis, cirrhosis etc.), cardiovascular disease (eg heart failure, arrhythmia, QT prolongation syndrome etc.), inflammatory disease (eg chronic obstructive pulmonary disease etc.),
Autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic diseases (eg, bronchial asthma, hay fever, allergies) Rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc., thymic disease, spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, immune deficiency associated with splenic or thymic abnormalities), cancer (Eg pancreatic cancer,
Lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.) or rejection after organ transplantation, It can be diagnosed that there is a high possibility that side effects and the like due to treatment with an anti-cancer agent have developed.
【００５４】〔５〕アンチセンスヌクレオチドを含有す
る医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができる本発明のアンチセンスヌクレオチド
は低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質ま
たは本発明のＤＮＡの機能（例、神経伝達物質作動性チ
ャネル活性）を抑制することができるので、例えば、中
枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候
群、精神***病、記憶障害、頭痛、うつ病、薬物依存症
など）、消化器疾患（例、潰瘍、大腸炎、クローン病、
過敏性腸症候群など）、肝臓疾患（例、肝炎、肝硬変な
ど）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候
群など）、炎症性疾患（例、慢性閉塞性肺疾患など）、
自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性
硬化症、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿
病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスな
ど）、アレルギー疾患（例、気管支喘息、花粉症、アレ
ルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性
皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症
など）、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または
胸腺異常にともなう免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、
肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺
癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌
など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制
剤、抗癌剤治療による副作用の抑制剤などとして使用す
ることができる。上記アンチセンスヌクレオチドを上記
の治療・予防剤として使用する場合、公知の方法に従っ
て製剤化し、投与することができる。例えば、該アンチ
センスヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスヌク
レオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデ
ノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッド
ウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、
常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、
ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）
に対して経口的または非経口的に投与することができ
る。該アンチセンスヌクレオチドは、そのままで、ある
いは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められ
る担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテ
ーテルのようなカテーテルによって投与できる。該アン
チセンスヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対
象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、自己
免疫疾患の治療の目的で本発明のアンチセンスヌクレオ
チドを関節に局所投与する場合、一般的に成人（体重６
０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスヌクレ
オチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。さらに、該ア
ンチセンスヌクレオチドは、組織や細胞における本発明
のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オ
リゴヌクレオチドプローブとして使用することもでき
る。[5] Pharmaceutical Agent Containing Antisense Nucleotide The antisense nucleotide of the present invention capable of binding to the DNA of the present invention in a complementary manner and suppressing the expression of the DNA has low toxicity, and thus can be used in vivo. Since the function of the protein of the invention or the DNA of the present invention (eg, neurotransmitter channel activity) can be suppressed, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorders, Headache, depression, drug addiction, etc., digestive disorders (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease,
Irritable bowel syndrome etc.), liver disease (eg hepatitis, cirrhosis etc.), cardiovascular disease (eg heart failure, arrhythmia, QT prolongation syndrome etc.), inflammatory disease (eg chronic obstructive pulmonary disease etc.),
Autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic diseases (eg, bronchial asthma, hay fever, allergies) Rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc., thymic disease, spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, immune deficiency associated with splenic or thymic abnormalities), cancer (Eg pancreatic cancer,
Lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), etc., rejection after organ transplantation It can be used as a reaction inhibitor, an inhibitor of side effects due to anticancer drug treatment, and the like. When the above antisense nucleotide is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be formulated and administered according to a known method. For example, when using the antisense nucleotide, after inserting the antisense nucleotide alone or in a suitable vector such as retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector,
Humans or mammals (eg, rat,
Rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc.)
Can be administered orally or parenterally. The antisense nucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting ingestion, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Although the dose of the antisense nucleotide varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc., for example, when the antisense nucleotide of the present invention is locally administered to a joint for the purpose of treating autoimmune disease, it is generally Adult (weight 6
0 kg), about 0.1 to 100 mg of the antisense nucleotide is administered per day. Furthermore, the antisense nucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for investigating the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
【００５５】さらに、本発明は、
本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部とそれ
に相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡ、
前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、
本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有
するリボザイム、
前記リボザイムを含有してなる医薬、
前記リボザイムをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含有
する発現ベクターなども提供する。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、二重鎖Ｒ
ＮＡ、リボザイムなども、本発明のＤＮＡから転写され
るＲＮＡを破壊またはその機能を抑制することができ、
生体内における本発明で用いられるタンパク質または本
発明で用いられるＤＮＡの機能を抑制することができる
ので、例えば、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、
パーキンソン症候群、精神***病、記憶障害、頭痛、う
つ病、薬物依存症など）、消化器疾患（例、潰瘍、大腸
炎、クローン病、過敏性腸症候群など）、肝臓疾患
（例、肝炎、肝硬変など）、循環器疾患（例、心不全、
不整脈、ＱＴ延長症候群など）、炎症性疾患（例、慢性
閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力
症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、
インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性エ
リテマトーデスなど）、アレルギー疾患（例、気管支喘
息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショ
ック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾患
（例、脾機能亢進症など）、免疫不全（例、白血球異
常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全な
ど）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細
胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮
頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などの予防・治療剤、臓
器移植後の拒絶反応抑制剤、抗癌剤治療による副作用の
抑制剤などとして使用することができる。二重鎖ＲＮＡ
は、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）
に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計
して製造することができる。リボザイムは、公知の方法
（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 20
01年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基
に設計して製造することができる。例えば、公知のリボ
ザイムの配列の一部を本発明のタンパク質をコードする
ＲＮＡの一部に置換することによって製造することがで
きる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部と
しては、公知のリボザイムによって切断され得るコンセ
ンサス配列ＮＵＸ（式中、Ｎはすべての塩基を、ＸはＧ
以外の塩基を示す）の近傍の配列などが挙げられる。上
記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤
として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと
同様にして製剤化し、投与することができる。また、前
記の発現ベクターは、公知の遺伝子治療法などと同様
に用い、上記予防・治療剤として使用する。Furthermore, the present invention provides a double-stranded RNA containing a part of RNA encoding the protein of the present invention and RNA complementary thereto, a medicament comprising said double-stranded RNA, protein of the present invention There is also provided a ribozyme containing a part of RNA encoding ribozyme, a drug containing the ribozyme, an expression vector containing a gene (DNA) encoding the ribozyme, and the like. Like the above antisense polynucleotide, the double-stranded R
NA, ribozyme and the like can also destroy RNA transcribed from the DNA of the present invention or suppress its function,
Since the function of the protein used in the present invention or the DNA used in the present invention can be suppressed in vivo, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease,
Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory loss, headache, depression, drug dependence, etc., digestive system diseases (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver disease (eg, hepatitis, cirrhosis) Etc.), cardiovascular disease (eg, heart failure,
Arrhythmia, long QT syndrome, etc., inflammatory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, etc.), autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, etc.)
Insulin-resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc., allergic disease (eg, bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymus disease, spleen disease (eg, splenic function) Hypersensitivity, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, splenic insufficiency or thymic abnormality, etc.), cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate) Cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), etc., use as a preventive agent for rejection after organ transplantation, suppressive agent for side effects due to anticancer drug treatment, etc. it can. Double-stranded RNA
Is a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001)
According to the above, it can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention. Ribozymes can be prepared by known methods (eg, TRENDS in Molecular Medicine, 7: 221, 20).
2001), and can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention. For example, it can be produced by substituting a part of the known ribozyme sequence with a part of RNA encoding the protein of the present invention. As a part of RNA encoding the protein of the present invention, a consensus sequence NUX (wherein N is all bases, X is G
Sequences other than (indicating bases other than) are listed. When the above-mentioned double-stranded RNA or ribozyme is used as the above-mentioned preventive / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide. The expression vector is used in the same manner as a known gene therapy method and the like, and used as the preventive / therapeutic agent.
【００５６】〔６〕本発明のＤＮＡを有する動物の作出
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤ
ＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）または
その変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する
場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。すな
わち、本発明は、（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはそ
の変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、（２）非ヒト哺
乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記
（２）記載の動物、および（４）本発明の外来性ＤＮＡ
またはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現
しうる組換えベクターなどを提供する。本発明の外来性
ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物
（以下、本発明のＤＮＡ導入動物と略記する）は、未受
精卵、受精卵、***およびその始原細胞を含む胚芽細胞
などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生にお
ける胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受
精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸
カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝
集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン
法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤ
ＮＡを導入することによって作出することができる。ま
た、該ＤＮＡ導入方法により、体細胞、生体の臓器、組
織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを導入
し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さ
らに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法
により融合させることにより本発明のＤＮＡ導入動物を
作出することもできる。非ヒト哺乳動物としては、例え
ば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、
モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いら
れる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体
発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容
易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系とし
て、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系と
して、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系
統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット
（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける
「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒ
トなどがあげられる。[6] Production of Animal Having DNA of the Present Invention The present invention provides D encoding an exogenous protein of the present invention.
Provided is a non-human mammal having NA (hereinafter abbreviated as exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (may be abbreviated as exogenous mutant DNA of the present invention). That is, the present invention provides (1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof, (2) the animal according to (1) above, wherein the non-human mammal is a rodent, (3) The animal according to the above (2), wherein the rodent is a mouse or rat, and (4) the exogenous DNA of the present invention
Alternatively, a recombinant vector containing the mutant DNA and capable of being expressed in mammals is provided. A non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (hereinafter, abbreviated as the DNA-introduced animal of the present invention) is used for embryo cells such as unfertilized eggs, fertilized eggs, sperms and their progenitor cells. Preferably, at the stage of embryogenesis in development of non-human mammals (more preferably at the stage of single cells or fertilized egg cells and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, agglutination method, Target D by microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc.
It can be created by introducing NA. In addition, by the method of introducing DNA, the target exogenous DNA of the present invention can be introduced into somatic cells, organs of living organisms, tissue cells and the like and used for cell culture, tissue culture and the like. It is also possible to produce the DNA-introduced animal of the present invention by fusing the above-mentioned embryo cells with a known cell fusion method. Examples of non-human mammals include cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat,
Guinea pigs, hamsters, mice, rats, etc. are used. Among them, rodents that have relatively short ontogeny and biological cycle from the viewpoint of creating animal model systems and are easy to reproduce, especially mice (for example, C57BL / 6 strain, DBA2 strain as pure strains) As the system, B6C3F 1 system, BDF 1 system, B6D2F 1 system, BALB / c system, ICR system, etc.) or rat (eg, Wistar, SD, etc.) and the like are preferable.
Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
【００５７】本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動
物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん
哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩
基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、
具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換など
が生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含
まれる。該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパ
ク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発
明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ
るＤＮＡなどが用いられる。本発明の外来性ＤＮＡは、
対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物
由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物
に導入するにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現さ
せうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラ
クトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発
明のヒトＤＮＡを導入する場合、これと相同性が高い本
発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、
イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス
など）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの
下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンスト
ラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、
例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションする
ことによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ導入哺
乳動物を作出することができる。The exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but the DNA of the present invention once isolated and extracted from mammals.
The mutant DNA of the present invention is a DNA having a mutation (eg, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention,
Specifically, DNA in which a base is added, deleted, or replaced with another base is used, and abnormal DNA is also included. The abnormal DNA means a DNA that expresses the abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used. The exogenous DNA of the present invention is
It may be derived from mammals of the same or different species from the target animal. When the DNA of the present invention is introduced into a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct in which the DNA is linked downstream of a promoter that can be expressed in animal cells. For example, when the human DNA of the present invention is introduced, various mammals having the DNA of the present invention having high homology therewith (for example, rabbit,
Fertilized eggs of a target mammal, to which the DNA construct (eg, vector) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing DNA derived from dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.,
For example, a DNA-introduced mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced by microinjection into fertilized mouse eggs.
【００５８】本発明のタンパク質の発現ベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリ
オファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィ
ルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなど
の動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由
来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由
来のプラスミドなどが好ましく用いられる。上記のＤＮ
Ａ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、
ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイル
ス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイ
ルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモ
ーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、
モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の
プロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、
ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、
エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸
性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、
血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ
１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭ
Ｐ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロ
フィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房
ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナー
ゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウム
アデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓ
ｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩ
およびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビタ
ー、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レ
ニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダ
ーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−
１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシ
ン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロ
ブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（Ｖ
ＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビ
ン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケ
ファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用
いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサ
イトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖
延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよ
びニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物において目的とす
るｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネター
と呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウ
イルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を
用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳ
Ｖ４０ターミネターなどが用いられる。The expression vector of the protein of the present invention includes Escherichia coli-derived plasmid, Bacillus subtilis-derived plasmid, yeast-derived plasmid, bacteriophage such as λ phage, retrovirus such as Moloney leukemia virus, vaccinia virus or baculovirus. The animal viruses and the like are used. Of these, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, and the like are preferably used. DN above
Examples of the promoter that regulates A expression include:
DNA promoters derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.), various mammals (human, rabbit, dog, cat,
Promoters derived from guinea pig, hamster, rat, mouse, etc., such as albumin, insulin II,
Uroplakin II, elastase, erythropoietin,
Endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, glutathione S-transferase,
Platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K
14, collagen type I and II, cyclic AM
P-dependent protein kinase βI subunit, dystrophin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (generally abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 phosphatase (Na, K-ATPas)
e), neurofilament light chain, metallothionein I
And IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), polypeptide chain elongation factor 1α (EF-
1α), β actin, α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, H chain variable region (V
NP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α-actin, preproenkephalin A, vasopressin, and other promoters. Of these, a cytomegalovirus promoter, a human polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, a human and chicken β actin promoter, which can be highly expressed systemically, are preferable.
It is preferable that the vector has a sequence (generally called a terminator) that terminates transcription of a target mRNA in a DNA-introduced mammal. For example, sequences of DNAs derived from viruses and various mammals are used. And preferably S of simian virus
V40 terminator or the like is used.
【００５９】その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに
高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナ
ル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部
などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域
と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結する
ことも目的により可能である。正常な本発明のタンパク
質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウ
サギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、
マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細
胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリ
ーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または
肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公
知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得
することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記
の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻
訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作
製することができる。該翻訳領域は導入動物において発
現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモー
ターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結
させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することがで
きる。受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの
導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべて
に存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物
の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在する
ことは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および
体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持すること
を意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種
の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本
発明の外来性ＤＮＡを有する。本発明の外来性正常ＤＮ
Ａを導入した非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮ
Ａを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物
として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。受
精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、
対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存
在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚
芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在する
ことは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細
胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを
意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の
動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明
の外来性ＤＮＡを過剰に有する。導入ＤＮＡを相同染色
体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄
の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを
過剰に有するように繁殖継代することができる。In addition, for the purpose of further highly expressing the desired foreign DNA, the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are provided 5'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region. Alternatively, it may be linked to the 3'downstream of the translation region depending on the purpose. The normal translation region of the protein of the present invention includes human or various mammals (for example, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat,
Known as all or part of genomic DNA from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA derived from mice etc.) and various commercially available genomic DNA libraries, or from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived RNA It is possible to obtain the complementary DNA prepared by the above method as a raw material. In addition, an exogenous abnormal DNA can be produced by mutating a translation region of a normal polypeptide obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method. The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in an introduced animal by a conventional DNA engineering method in which it is linked to the downstream of the above promoter and, if desired, the upstream of the transcription termination site. The introduction of the foreign DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the introduction of DNA means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal cells and somatic cells. means. The offspring of this type of animal that inherits the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. Exogenous normal DN of the present invention
The non-human mammals into which A has been introduced are exogenous DN by mating.
After confirming that A is stably retained, the DNA-carrying animal can be subcultured in a normal breeding environment. The introduction of the foreign DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is
It is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the producing animal after the introduction of the DNA means that all the progeny of the producing animal have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal cells and somatic cells. Means The offspring of this type of animal that inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in excess in all of their germ cells and somatic cells. By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be passaged so that the DNA has an excess.
【００６０】本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動
物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内
在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に
本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあ
り、その病態モデル動物として利用することができる。
例えば、本発明の正常ＤＮＡ導入動物を用いて、本発明
のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関
連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療
方法の検討を行なうことが可能である。また、本発明の
外来性正常ＤＮＡを導入した哺乳動物は、遊離した本発
明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明の
タンパク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニ
ング試験にも利用可能である。一方、本発明の外来性異
常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性
ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動
物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組
み込んで原科として用いることができる。プロモーター
とのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法
によって作製することができる。受精卵細胞段階におけ
る本発明の異常ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細
胞および体細胞の全てに存在するように確保される。Ｄ
ＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常
ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚
芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有す
ることを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだ
この種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全
てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染
色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌
雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡ
を有するように繁殖継代することができる。In the non-human mammal having the normal DNA of the present invention, the normal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is finally obtained by promoting the function of the endogenous normal DNA. It may develop hyperactivity and can be used as a model animal for its pathological condition.
For example, using the normal DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of hyperfunction of the protein of the present invention and diseases related to the protein of the present invention, and to investigate treatment methods for these diseases. It is possible. In addition, since the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been introduced has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used for screening tests for therapeutic agents for diseases related to the protein of the present invention. . On the other hand, the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured as a DNA-carrying animal in a normal breeding environment after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating.
Furthermore, the foreign DNA of interest can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a protozoa. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. The introduction of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal cells and somatic cells of the target mammal. D
The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the producing animal after NA transfer means that all the progeny of the producing animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal cells and somatic cells. The offspring of this type of animal that inherits the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA in both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all the offspring can obtain the DNA.
Can be passaged for breeding.
【００６１】本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動
物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内
在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に
本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることが
あり、その病態モデル動物として利用することができ
る。例えば、本発明の異常ＤＮＡ導入動物を用いて、本
発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解
明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能
である。また、具体的な利用可能性としては、本発明の
異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不
活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正
常タンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を
解明するモデルとなる。また、本発明の外来異常ＤＮＡ
を導入した哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の
増加症状を有することから、本発明のタンパク質または
その機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング
試験にも利用可能である。また、上記２種類の本発明の
ＤＮＡ導入動物のその他の利用可能性として、例えば、
組織培養のための細胞源としての使用、
本発明のＤＮＡ導入動物の組織中のＤＮＡもしくはＲ
ＮＡを直接分析する、またはＤＮＡにより発現されたポ
リペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパ
ク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質
との関連性についての解析、
ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織から
の細胞の機能の研究、
上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および
本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作
製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタ
ンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタ
ンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることがで
き、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの
各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新し
い治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患
の研究および治療に貢献することができる。また、本発
明のＤＮＡ導入動物から各臓器を取り出し、細切後、ト
リプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤ
ＮＡ導入細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系
統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタン
パク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは
増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機
構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発
明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究
材料となる。さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用い
て、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、
本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行
なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、
有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供す
ることが可能となる。また、本発明のＤＮＡ導入動物ま
たは本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発
明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、
開発することが可能である。In the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention, the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is finally obtained by inhibiting the function of the endogenous normal DNA. It may become inactive refractory and can be used as a model animal for its pathological condition. For example, using the abnormal DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention and to examine the treatment method for this disease. In addition, as a specific applicability, the animal with high expression of the abnormal DNA of the present invention shows the functional inhibition (dominant negative action) of the normal protein by the abnormal protein of the present invention in the functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. It becomes a model to elucidate. In addition, the foreign abnormal DNA of the present invention
Since the mammals into which the protein of the present invention has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used in a therapeutic drug screening test for the protein of the present invention or its functionally inactive refractory disease. Further, other applications of the above-mentioned two kinds of DNA-introduced animals of the present invention include, for example, use as a cell source for tissue culture, DNA or R in tissues of the DNA-introduced animals of the present invention.
Analysis of the association with a protein that is specifically expressed or activated by the protein of the present invention by directly analyzing NA or analyzing a polypeptide tissue expressed by DNA; Culturing by standard tissue culture techniques and using them to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture, screening for agents that enhance cell function by using the cells described above, and It is conceivable to isolate and purify the mutant protein and produce its antibody. Furthermore, by using the DNA-introduced animal of the present invention, it is possible to investigate clinical symptoms of diseases related to the protein of the present invention, including functionally inactive refractory diseases of the protein of the present invention, and More detailed pathological findings in each organ of a disease model associated with thyroid gland can be obtained, which can contribute to the development of new treatment methods and further to the study and treatment of secondary diseases caused by the disease. In addition, each organ was taken out from the DNA-introduced animal of the present invention, and after being minced, D released by a protease such as trypsin was released.
It is possible to obtain NA-introduced cells, culture the cells, or systematize the cultured cells. Furthermore, it is possible to investigate the specification of the protein-producing cell of the present invention, its relation to apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them, and to investigate their abnormalities. It becomes an effective research material for Furthermore, using the DNA-introduced animal of the present invention, a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention is included.
In order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, using the above-mentioned test method and quantification method,
It is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic drug for the disease. Further, using the DNA-introduced animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, a method for treating DNA for diseases associated with the protein of the present invention is examined,
It is possible to develop.
【００６２】〔７〕ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳
動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳
動物を提供する。すなわち、本発明は、（１）本発明の
ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不
活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、（３）ネオマ
イシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、（４）非
ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹
細胞、（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載
の胚幹細胞、（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該
ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、（７）該ＤＮＡがレポ
ーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポー
ター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制
御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記
載の非ヒト哺乳動物、（９）ゲッ歯動物がマウスである
上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および（１０）上記
（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター
遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮ
Ａに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合
物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発
明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞と
は、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的
に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制する
か、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパ
ク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが
実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以
下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）
非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記す
る）をいう。非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のも
のが用いられる。[7] Knockout Animal The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated, and a DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention. That is, the present invention provides (1) a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated,
(2) The embryonic stem cell according to (1) above, which is inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and (3) above, wherein the DNA is neomycin resistant. Embryo stem cells of (4), the non-human mammal is a rodent, the embryo stem cell of (1) above, (5) the rodent is a mouse of (4) above, (6) the present invention Non-human mammal deficient in expression of DNA, wherein (7) the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene is The non-human mammal according to (6) above, which can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention,
(8) The non-human mammal according to (6) above, wherein the non-human mammal is a rodent, (9) the non-human mammal according to (8) above, wherein the rodent is a mouse, and (10) above. The DN of the present invention, which comprises administering a test compound to the animal described in (7) and detecting the expression of a reporter gene.
Provided is a method for screening a compound or its salt that promotes or inhibits the promoter activity for A. The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated means that the expression ability of the DNA is suppressed by artificially mutating the DNA of the present invention which the non-human mammal has. Due to the substantial loss of the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA has substantially no ability to express the protein of the present invention (hereinafter, this may be referred to as the knockout DNA of the present invention. )
Non-human mammalian embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells). As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
【００６３】本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方
法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ
配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換
させることによって行なうことができる。これらの変異
により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プ
ロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することによ
り本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。本発
明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞
（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明
のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例として
は、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明
のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐
性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬
剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝
子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊する
か、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転
写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シ
グナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなく
することによって、結果的に遺伝子を破壊するように構
築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッテ
ィングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法に
より該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞につい
て本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプ
ローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるい
はターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッ
ティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の
近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法によ
り解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別するこ
とにより得ることができる。As a method for artificially mutating the DNA of the present invention, for example, the DNA is prepared by a genetic engineering method.
It can be carried out by deleting a part or all of the sequence or inserting or substituting another DNA. Due to these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the reading frame of the codon or disrupting the function of the promoter or exon. Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA inactivated ES cell of the present invention or the knockout ES cell of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention contained in a non-human mammal is isolated, and its exon portion has a neomycin resistance gene, a drug resistance gene represented by a hygromycin resistance gene, lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). Transferase gene) or a reporter gene typified by destroying the function of the exon, or insert a DNA sequence that terminates the transcription of the gene in the intron portion between the exons (for example, polyA addition signal), By making it impossible to synthesize complete mRNA, A DNA chain having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter, abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination method, and the obtained ES cell is used in the present invention. Hybridization analysis using a DNA sequence on or near the target DNA as a probe, or by a PCR method using a DNA sequence on the targeting vector and a DNA sequence in the near region other than the DNA of the present invention used for preparing the targeting vector as primers. Then, it can be obtained by selecting the knockout ES cells of the present invention.
【００６４】また、相同組換え法等により本発明のＤＮ
Ａを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述
のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知
のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したもので
もよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般
的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学
的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で
免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するな
どの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ
／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善
したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２との
Ｆ1）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。Ｂ
ＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫である
という利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持
つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマ
ウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバックク
ロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウス
に代えることが可能である点で有利に用い得る。また、
ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の
胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚
盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期
胚を取得することができる。また、雌雄いずれのＥＳ細
胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列
キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の
手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行
なうことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法として
は、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の
遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげる
ことができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析
をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対し
て、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むの
で、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを
雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の
選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削
減できる。The DN of the present invention can also be obtained by the homologous recombination method or the like.
As the original ES cells for inactivating A, those already established as described above may be used, or those newly established according to the known method of Evans and Kaufman. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used. However, since the immunological background is not clear, an alternative pure line immunological genetic background is used. For the purpose of obtaining ES cells whose
/ 6 egg collection number of lack of usable like even better DBA / 2 and BDF 1 mice improved by crossing (C57BL / 6 and F 1 and DBA / 2) which were established by using a. B
The DF 1 mouse has a large number of eggs and has the advantage that the eggs are strong, and since it has a C57BL / 6 mouse as a background, the ES cells obtained using this can be used when a pathological model mouse is produced. , C57BL / 6 mice can be advantageously used in that their genetic background can be changed to that of C57BL / 6 mice. Also,
When ES cells are established, blastocysts on the 3.5th day after fertilization are generally used. In addition to this, by culturing 8-cell stage embryos and culturing them up to the blastocysts, many initial stages can be efficiently performed. The embryo can be obtained. Either male or female ES cells may be used, but male ES cells are usually more convenient for producing a germ line chimera. In addition, it is desirable to distinguish males and females as soon as possible in order to reduce troublesome culturing. As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex determining region on the Y chromosome by the PCR method can be mentioned. Using this method, conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture It is possible to perform the primary selection of ES cells in the early stage by discriminating males and females, and the early selection of male cells can significantly reduce the labor required in the initial stage of culture.
【００６５】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により
行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常
数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の
関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウト
した後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ
＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ま
しい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その
増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス
培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気また
は５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で
培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、ト
リプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリ
プシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１
％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化
し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法な
どがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行
なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細
胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが
望まれる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至
るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで
浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの
種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M.
J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第
292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）
第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschmanら、ジャー
ナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメ
ンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本
発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発
現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質
の細胞生物学的検討において有用である。本発明のＤＮ
Ａ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公
知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較する
ことにより、正常動物と区別することが可能である。該
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられ
る。The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes of ES cells obtained is preferably 100% of the normal number, but if it is difficult due to physical manipulations during establishment, after knocking out the gene of ES cells, normal cells (for example, in mice, The number is 2n
= 40 cells). The embryonic stem cell line thus obtained usually has a very good proliferative property, but since it is easy to lose the ability to develop ontogeny, it is necessary to carefully subculture. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast in the presence of LIF (1-10000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% It is cultured by a method such as culturing at about 37 ° C. in carbon dioxide gas, 90% air), and at the time of passage, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA, Preferably about 0.1
% Trypsin / 1 mM EDTA) treatment to obtain single cells and seeding on newly prepared feeder cells. Such passage is usually carried out every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and to discard the cultured cells when morphologically abnormal cells are found. ES cells are differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by performing monolayer culture until reaching a high density or suspension culture until forming a cell clump under appropriate conditions. It is possible to make (M.
J. Evans and MH Kaufman, Nature No.
Volume 292, 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA)
78, p. 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embiology and Experimental Morphology, vol. 87, p. 27, 1985], obtained by differentiating the ES cells of the present invention. The DNA expression-deficient cells of the present invention thus obtained are useful for in vitro cell biological studies of the protein of the present invention. DN of the present invention
A non-human mammal deficient in A expression can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level. As the non-human mammal, the same ones as described above are used.
【００６６】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティン
グベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入
し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤ
ＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えに
より、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の
本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることに
より、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができ
る。本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発
明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブと
したサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッ
ティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティング
ベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の
近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法に
よる解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明
のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、そ
の細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動
物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠
させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された
動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変
異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成さ
れるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部
が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキ
メラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体
群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤ
ＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コート
カラーの判定等により選別することにより得られる。こ
のようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク
質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質の
ヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本
発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができ
る。卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマ
イクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入すること
によりターゲッティングベクターを染色体内に導入した
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、
これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、
遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のある
ものを選択することにより得られる。このようにして本
発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配に
より得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされて
いることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なう
ことができる。さらに、生殖系列の取得および保持につ
いても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの
保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化Ｄ
ＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取
得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に
対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような
状態で飼育することにより効率的に得ることができる。
ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該
不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイ
ゴート動物を繁殖継代する。本発明のＤＮＡが不活性化
された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現
不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用であ
る。また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、
本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性
を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活
性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これら
の疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be obtained by, for example, introducing the targeting vector prepared as described above into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and introducing the targeting vector D of the present invention.
It is possible to knock out the DNA of the present invention by performing homologous recombination in which the DNA sequence in which NA is inactivated replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination. it can. The cells in which the DNA of the present invention has been knocked out are the DNA sequences on the Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the mouse-derived cells of the present invention used for the targeting vector. It can be determined by an analysis by the PCR method using a DNA sequence in a neighboring region other than DNA as a primer. When a non-human mammal embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is cloned at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage. It is injected into an animal embryo or blastocyst, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention. When a part of the germ cells of the chimeric animal has the mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from the population obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual. D of the present invention added
It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the NA locus, for example, by determining the coat color. The individual thus obtained is usually an individual deficient in hetero expression of the protein of the present invention, and heterologous individuals deficient in hetero expression of the protein of the present invention are bred to homozygous expression of the protein of the present invention from their offspring. Defective individuals can be obtained. When using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into its chromosome by injecting a DNA solution into the egg cell nucleus by a microinjection method can be obtained,
Compared to these transgenic non-human mammals,
It can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination. In this way, an individual whose DNA of the present invention has been knocked out can be passaged in a normal breeding environment after confirming that the DNA of the animal individual obtained by mating is also knocked out. Furthermore, the acquisition and maintenance of the germ line may be carried out according to the conventional method. That is, by crossing male and female animals carrying the inactivated DNA, the inactivated D
A homozygous animal having NA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by raising the mother animal in such a state that there are 1 normal individual and 1 homozygous animal.
By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred. The non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is very useful in producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention. Further, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention,
Since it lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, it can serve as a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. It is useful for examination.
【００６７】〔７ａ〕本発明のＤＮＡの欠損や損傷など
に起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物
のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤ
ＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予
防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることが
できる。すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全
非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を
観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠
損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を
有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供
する。該スクリーニング方法において用いられる本発明
のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様
のものがあげられる。試験化合物としては、例えば、ペ
プチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽
出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合
物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。具
体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、
試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動
物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として
試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例え
ば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症
状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択すること
ができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試
験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができ
る。[7a] Method for screening compound having therapeutic / prophylactic effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention The DNA expression-deficient non-human mammal of the present invention is D
It can be used for screening a compound having a therapeutic / preventive effect on diseases caused by NA deficiency or damage. That is, the present invention results from a defect or damage of the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and observing and measuring the change in the animal. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / prophylactic effect against diseases. Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include the same ones as described above. Examples of test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc., and these compounds are novel compounds. Or a known compound may be used. Specifically, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is
The therapeutic / prophylactic effect of the test compound can be tested by using the change in each organ, tissue, disease symptom, etc. of the animal treated with the test compound as compared with a control animal which is not treated.
As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection, etc. are used, and it can be appropriately selected depending on the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. Further, the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
【００６８】例えば、慢性関節リウマチに対して予防・
治療効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本
発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投
与し、該動物の関節の腫れの体積などを経時的に測定し
たり、エックス線、MRI、組織学的手法などにより関節
破壊の程度を経時的に評価する。該スクリーニング方法
を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選
ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷
などによって引き起こされる疾患に対して予防・治療効
果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・
治療剤などの医薬として使用することができる。さら
に、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導され
る化合物も同様に用いることができる。For example, for the prevention of rheumatoid arthritis,
When screening a compound having a therapeutic effect, a test compound is administered to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention, the volume of swelling of joints of the animal is measured over time, x-ray, MRI, histology The degree of joint destruction is evaluated over time using a statistical method. The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds and has a prophylactic / therapeutic effect on a disease caused by a deficiency or damage of the protein of the present invention. Safe and low toxicity prevention
It can be used as a medicine such as a therapeutic agent. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
【００６９】該スクリーニング方法で得られた化合物は
塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理
学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基
（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とり
わけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様
な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン
酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸
（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレ
イン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸
など）との塩などが用いられる。該スクリーニング方法
で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記
した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製
造することができる。このようにして得られる製剤は、
安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の
哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルな
ど）に対して投与することができる。該化合物またはそ
の塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなど
により差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する
場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の慢性関節
リウマチの患者においては、一日につき該化合物を約
０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、
より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的
に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、
対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を
注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の慢性関節リ
ウマチの患者に投与する場合、一日につき該化合物を約
０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍ
ｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈
注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合
も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができ
る。The compound obtained by the screening method may form a salt. As the salt of the compound, a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid, etc.) or base (eg, salt) is used. A salt with an alkali metal or the like) is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), or organic acids (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.) and the like salts are used. The drug containing the compound or its salt obtained by the screening method can be manufactured in the same manner as the drug containing the protein of the present invention. The formulation thus obtained is
Since it is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans or other mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.) . The dose of the compound or its salt varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the compound is orally administered, an adult (as a body weight of 60 kg) rheumatoid arthritis patient is generally used. In about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg of the compound,
More preferably, about 1.0 to 20 mg is administered. When administered parenterally, the single dose of the compound is the subject of administration,
While depending on the target disease and the like, for example, when the compound is administered in the form of an injection to an adult (60 kg) patient with rheumatoid arthritis, the compound is preferably added in an amount of about 0.01 to 30 mg per day, preferably Is about 0.1 to 20 m
It is convenient to administer about g, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose converted per 60 kg can be administered.
【００７０】〔７ｂ〕本発明のＤＮＡに対するプロモー
ターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニン
グ方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、
試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出す
ることを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ーの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法
において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物とし
ては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物
の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入す
ることにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発
明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる
ものが用いられる。試験化合物としては、前記と同様の
ものがあげられる。レポーター遺伝子としては、前記と
同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子
またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。[7b] Method for Screening Compound for Promoting or Inhibiting Promoter Activity for DNA of the Present Invention The present invention provides a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention,
Provided is a method for screening a compound or its salt that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound and detecting the expression of a reporter gene. In the above screening method, the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention, among the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention, the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used. Examples of the test compound include the same ones as described above. As the reporter gene, the same ones as described above are used, and the β-galactosidase gene (lacZ), the soluble alkaline phosphatase gene, the luciferase gene and the like are preferable.
【００７１】本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換
された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レ
ポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーター
の支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードす
る物質の発現をトレースすることにより、プロモーター
の活性を検出することができる。例えば、本発明のタン
パク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している
場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本
発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発
現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）
のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用い
て染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動
物生体内における発現状態を観察することができる。具
体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組
織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝
生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色
液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間
反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶
液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応
を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従
い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物または
その塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であ
り、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進ま
たは阻害する化合物である。In the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is substituted with the reporter gene, the reporter gene exists under the control of the promoter for the DNA of the present invention. The activity of the promoter can be detected by tracing the expression. For example, a part of the DNA region encoding the protein of the present invention is a β derived from Escherichia coli.
-When it is replaced with the galactosidase gene (lacZ), β-galactosidase is originally expressed in the tissue in which the protein of the present invention is expressed instead of the protein of the present invention. Thus, for example, 5-bromo-4-chloro-3
-Indolyl-β-galactopyranoside (X-gal)
The expression state of the protein of the present invention in an animal body can be easily observed by staining with a reagent that serves as a substrate for β-galactosidase. Specifically, the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or around 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour, the tissue sample may be washed with a 1 mM EDTA / PBS solution to stop the β-galactosidase reaction and observe the coloration. In addition, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
The compound or its salt obtained by using the above screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
【００７２】該スクリーニング方法で得られた化合物は
塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理
学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有
機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に
許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、
例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、
硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタン
スルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用
いられる。本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を
促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の
発現を促進し、該タンパク質の機能を促進することがで
きるので、例えば、中枢神経疾患（例、アルツハイマー
病、パーキンソン症候群、精神***病、記憶障害、頭
痛、うつ病、薬物依存症など）、消化器疾患（例、潰
瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群など）、肝臓
疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循環器疾患（例、心不
全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、炎症性疾患（例、
慢性閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾患（例、重症筋無
力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候
群、インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リウマチ、全身
性エリテマトーデスなど）、アレルギー疾患（例、気管
支喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー
ショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾
患（例、脾機能亢進症など）、免疫不全（例、白血球異
常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全な
ど）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細
胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮
頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などの予防・治療剤、臓
器移植後の拒絶反応抑制剤、抗癌剤治療による副作用の
抑制剤などの医薬として有用である。The compound obtained by the screening method may form a salt. As the salt of the compound, a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid etc.) or base (eg, organic acid etc.) is used. ) And the like are used, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable. For such salt,
For example, inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid,
Sulfates) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid,
Tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.) and the like are used. The compound or a salt thereof that promotes the promoter activity for the DNA of the present invention can promote the expression of the protein of the present invention and the function of the protein. Syndrome, schizophrenia, memory disorder, headache, depression, drug dependence, etc., digestive system diseases (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver diseases (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.) ), Cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, etc.), inflammatory disease (eg,
Chronic obstructive pulmonary disease, etc., autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic disease (eg , Bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymus disease, spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, splenic or thymic abnormality) Immunodeficiency associated with cancer, cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer) , Etc., etc., a preventive / therapeutic agent, a rejection inhibitor after organ transplantation, a side effect inhibitor due to anticancer drug treatment, and the like.
【００７３】また、本発明のＤＮＡに対するプロモータ
ー活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタン
パク質の発現を阻害し、該タンパク質の機能を阻害する
ことができるので、例えば中枢神経疾患（例、アルツハ
イマー病、パーキンソン症候群、精神***病、記憶障
害、頭痛、うつ病、薬物依存症など）、消化器疾患
（例、潰瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群な
ど）、肝臓疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循環器疾患
（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、炎症性
疾患（例、慢性閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾患
（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェ
ーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リ
ウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー疾
患（例、気管支喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナ
フィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺
疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症など）、免疫不全
（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともな
う免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝
臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱
癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などの予
防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤、抗癌剤治療
による副作用の抑制剤などの医薬として有用である。さ
らに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導さ
れる化合物も同様に用いることができる。該スクリーニ
ング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬
は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有す
る医薬と同様にして製造することができる。このように
して得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例え
ば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マ
ウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウ
マ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することがで
きる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投
与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化
合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ
として）の慢性関節リウマチ患者においては、一日につ
き該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．
０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与
する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与
量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例え
ば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進す
る化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の
慢性関節リウマチ患者に投与する場合、一日につき該化
合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１
〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程
度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動
物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与するこ
とができる。Further, the compound or its salt that inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention can inhibit the expression of the protein of the present invention and the function of the protein, and therefore, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorders, headache, depression, drug addiction, etc., digestive disorders (eg, ulcers, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver disorders (eg, Hepatitis, cirrhosis, etc., cardiovascular disease (eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, etc.), inflammatory disease (eg, chronic obstructive pulmonary disease, etc.), autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis) , Multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc., allergic diseases (eg, bronchial asthma, hay fever, Allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease, spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, white blood cell abnormalities, immunodeficiency associated with splenic or thymic abnormalities, etc.), Prevention and treatment of cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.) It is useful as a drug, a drug for suppressing rejection after organ transplantation, a drug for suppressing side effects caused by anticancer drug treatment, and the like. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well. The drug containing the compound or its salt obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or its salt. Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, humans or other mammals (for example, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.) ). The dose of the compound or a salt thereof may vary depending on the target disease, the administration subject, the administration route, etc.
When the compound which promotes the promoter activity for the DNA of the present invention is orally administered, it is generally adult (body weight 60 kg
As a patient with rheumatoid arthritis), the compound is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.
The dosage is 0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., but for example, a compound that promotes the promoter activity for the DNA of the present invention in the form of an injection is usually used in adults ( When administered to patients with rheumatoid arthritis (as 60 kg), the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1
It is convenient to administer about -20 mg, more preferably about 0.1-10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose converted per 60 kg can be administered.
【００７４】一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプ
ロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、
一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の慢性関節リウマ
チ患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１
００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好まし
くは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する
場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患な
どによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対す
るプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通
常成人（６０ｋｇとして）の慢性関節リウマチ患者に投
与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍ
ｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ま
しくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与す
るのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当た
りに換算した量を投与することができる。このように、
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤ
ＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する
化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有
用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患
の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献する
ことができる。また、本発明のタンパク質のプロモータ
ー領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタ
ンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細
胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子
導入動物）を作出すれば、特異的にそのポリペプチドを
合成させ、その生体での作用を検討することも可能とな
る。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺
伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立す
れば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力
を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合
物の探索系として使用できる。On the other hand, for example, when a compound which inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention is orally administered,
Generally, in an adult (as a body weight of 60 kg) patient with rheumatoid arthritis, about 0.1 to 1 of the compound is administered per day.
00 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease and the like, but, for example, a compound that inhibits the promoter activity against the DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection ( When administered to patients with rheumatoid arthritis (as 60 kg), the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 m per day.
It is convenient to administer about g, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose converted per 60 kg can be administered. in this way,
The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is the D of the present invention.
It is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for NA, and greatly contributes to the investigation of the cause of various diseases caused by defective DNA expression of the present invention or the development of a preventive / therapeutic drug. You can In addition, by using a DNA containing a promoter region of the protein of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof, and this is injected into an egg cell of an animal to obtain a so-called transgenic animal (transgenic animal). Once created, it is possible to specifically synthesize the polypeptide and study its action in the living body. Further, by binding an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line capable of expressing this, a low molecular weight compound having an action of specifically promoting or suppressing the production ability of the protein of the present invention itself in the body. Can be used as a search system for.
【００７５】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸In the present specification and the drawings, when an abbreviation is used for a base or amino acid, IUPAC-IUB is used.
It is based on the abbreviations by the Commission on Biochemical Nomenclature or the abbreviations commonly used in this field, and examples are given below. When amino acids may have optical isomers, the L form is shown unless otherwise specified. DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine tri Phosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate Gly: Glycine Ala: Alanine Val: Valine Leu: Leucine Ile: Isoleucine Ser: Serine Thr: Cysteine Met: Cysteine Met : Methionine Glu: Glutamic acid Asp: Aspartic acid Lys: Lysine Arg: Arginine His: Histidine Phe: Phenylalanine T r: tyrosine Trp: tryptophan Pro: proline Asn: asparagine Gln: glutamine pGlu: pyroglutamic acid
【００７６】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Cl2-Bzl ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミドFurther, substituents, protecting groups and reagents commonly used in the present specification are represented by the following symbols. Me: methyl group Et: ethyl group Bu: butyl group Ph: phenyl group TC: thiazolidine -4 (R) - carboxamide group Tos: p-toluenesulfonyl CHO: formyl Bzl: benzyl Cl 2 -Bzl: 2,6-dichlorobenzyl Bom: Benzyloxymethyl Z: Benzyloxycarbonyl Cl-Z: 2-Chlorobenzyloxycarbonyl Br-Z: 2-Bromobenzyloxycarbonyl Boc: t-Butoxycarbonyl DNP: Dinitrophenyl Trt: Trityl Bum: t-Butoxymethyl Fmoc. : N-9-fluorenylmethoxycarbonyl HOBt: 1-hydroxybenztriazole HOOBt: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine HONB: 1-hydroxy-5-no Bornene-2,3-dicarboximide DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
【００７７】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。
〔配列番号：１〕ヒトＴＣＨ０６５タンパク質のアミノ
酸配列を示す。
〔配列番号：２〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列
を含有するＴＣＨ０６５タンパク質をコードするＤＮＡ
の塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕実施例１で用いられたプライマーＡ７
の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕実施例１で用いられたプライマーＢ５
の塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕実施例１で用いられたプライマーＡ６
の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕実施例１で用いられたプライマーＳＰ
６の塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕実施例１で用いられたプライマーＴ７
の塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕実施例１で用いられたプライマーＡ２
の塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕実施例１で用いられたプライマーＢ２
の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕実施例１で用いられたプライマーＦ
１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕実施例１で用いられたプライマーＦ
２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕実施例１で用いられたプライマーＲ
１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕実施例１で取得したヒトＴＣＨ０６
５全長遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕実施例２で用いられたプライマーＡ
８の塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕実施例２で用いられたプライマーＢ
８の塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕実施例２で用いられたＴａｑＭａｎ
プローブＴ１の塩基配列を示す。The sequence numbers in the sequence listing in the present specification show the following sequences. [SEQ ID NO: 1] This shows the amino acid sequence of human TCH065 protein. [SEQ ID NO: 2] DNA encoding TCH065 protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
The base sequence of is shown. [SEQ ID NO: 3] Primer A7 used in Example 1
The base sequence of is shown. [SEQ ID NO: 4] Primer B5 used in Example 1
The base sequence of is shown. [SEQ ID NO: 5] Primer A6 used in Example 1
The base sequence of is shown. [SEQ ID NO: 6] Primer SP used in Example 1
6 shows the base sequence of 6. [SEQ ID NO: 7] Primer T7 used in Example 1
The base sequence of is shown. [SEQ ID NO: 8] Primer A2 used in Example 1
The base sequence of is shown. [SEQ ID NO: 9] Primer B2 used in Example 1
The base sequence of is shown. [SEQ ID NO: 10] Primer F used in Example 1
1 shows the base sequence of 1. [SEQ ID NO: 11] Primer F used in Example 1
2 shows the base sequence of 2. [SEQ ID NO: 12] Primer R used in Example 1
1 shows the base sequence of 1. [SEQ ID NO: 13] Human TCH06 obtained in Example 1
5 shows the nucleotide sequence of cDNA containing the full-length gene. [SEQ ID NO: 14] Primer A used in Example 2
8 shows the base sequence of 8. [SEQ ID NO: 15] Primer B used in Example 2
8 shows the base sequence of 8. [SEQ ID NO: 16] TaqMan used in Example 2
The base sequence of probe T1 is shown.
【００７８】後述の実施例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＴＯＰ１０／ｐＣ
Ｒ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＣＨ０６５は、２００２年１月
２３日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術
総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−７８６２として、２００２年１月１０日から大
阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番
号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
に受託番号ＩＦＯ １６７４３として寄託されている。The transformant Escherichia coli TOP10 / pC obtained in Example 1 described later.
R-BluntII-TCH065 will be available from January 23, 2002 at 1-1, Higashi 1-1-chome, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Central No. 6
Deposit number FERM at the Japan Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Postal code 3058566)
As BP-7862, from 10th January 2002, Fermentation Research Institute (IFO), 2-1785, 13-honhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka (zip code 532-8686)
Deposited under accession number IFO 16743.
【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキ
ュラー・クローニング(Molecular cloning)に記載され
ている方法に従った。
実施例１
ヒトＴＣＨ０６５遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
２種のプライマーＤＮＡ、プライマーＡ７（配列番号：
３）およびプライマーＢ５（配列番号：４）を用いて、
ヒト胸腺Marathon-Ready cDNA（クロンテック社製）に
対して、まず、Advantage 2 DNA Polymerase（クロンテ
ック社製）により、以下の条件(1)〜(5)で一次ＰＣＲを
行った。
(1)９４℃３分間
(2)９４℃５秒間−７２℃３分間を５サイクル
(3)９４℃５秒間−７０℃３分間を５サイクル
(4)９４℃５秒間−６８℃３分間を５サイクル
(5)７０℃１０分間
さらに、この一次ＰＣＲの産物を鋳型として、プライマ
ーＡ６（配列番号：５）とプライマーＢ５（配列番号：
４）を用いて、Pyrobest DNA polymerase（宝酒造社
製）により以下の条件(6)〜(10)でｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ
を行った。
(6)９４℃２分間
(7)９４℃５秒間−７２℃４分間を５サイクル
(8)９４℃５秒間−７０℃４分間を５サイクル
(9)９４℃５秒間−６８℃４分間を２５サイクル
(10)７２℃１０分間
得られた増幅産物をZero Blunt TOPO Cloning kit（イ
ンビトロジェン社製）を用いてクローニングし、プラス
ミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＣＨ０６５を得た。こ
れをプライマーＤＮＡ〔プライマーＳＰ６（配列番号：
６）、プライマーＴ７（配列番号：７）、プライマーＡ
２（配列番号：８）、プライマーＢ２（配列番号：
９）、プライマーＦ１（配列番号：１０）、プライマー
Ｆ２（配列番号：１１）、プライマーＲ１（配列番号：
１２）〕およびBigDye Terminator CycleSequencing Ki
t（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を
行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡ
シークエンサーABI PRISM 3100 DNAアナライザ（アプラ
イドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結
果、取得したプラスミドは１４２９個の塩基配列を有し
ていた（配列番号：１３）。該ｃＤＮＡ断片には４１１
個のアミノ酸配列（配列番号：１）がコードされており
（配列番号：２）、該アミノ酸配列を含有するタンパク
質を、ヒトＴＣＨ０６５タンパク質と命名した。該ｃＤ
ＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＴＯＰ１０／ｐＣ
Ｒ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＣＨ０６５と命名した。Ｂｌａ
ｓｔ Ｐ〔ヌクレイック アシッド リサーチ（Nucleic
Acids Res.）第２５巻、３３８９頁、１９９７年〕を
用いてＯＷＬに対してホモロジー検索を行ったところ、
該ｃＤＮＡは５−ＨＴ３受容体またはニコチン性アセチ
ルコリン受容体に属する新規遺伝子であることが判明し
た（図１および図２）。ヒトで報告されている５−ＨＴ
３受容体である５−ＨＴ３Ａ受容体（Mol. Pharmaco
l.、第48巻、407頁、1995年）とはアミノ酸レベルで２
０％、５−ＨＴ３Ｂ受容体（Nature、第397巻、359頁、
1999年）とはアミノ酸レベルで１７%の相同性を示し、
ヒトで報告されているニコチン性アセチルコリン受容体
の一種であるｎＡＣｈＲα７受容体（FEBS Lett.、第40
0巻、309頁、1997年）とはアミノ酸レベルで１７％の相
同性を示し、該タンパク質は４回膜貫通型の構造を有す
ると推測された。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are not intended to limit the scope of the present invention. The gene manipulation method using Escherichia coli followed the method described in Molecular Cloning. Example 1 Cloning of human TCH065 gene cDNA Two kinds of primer DNA, primer A7 (SEQ ID NO:
3) and primer B5 (SEQ ID NO: 4),
Human thymus Marathon-Ready cDNA (manufactured by Clontech) was first subjected to primary PCR using Advantage 2 DNA Polymerase (manufactured by Clontech) under the following conditions (1) to (5). (1) 94 ° C 3 minutes (2) 94 ° C 5 seconds -72 ° C 3 minutes 5 cycles (3) 94 ° C 5 seconds -70 ° C 3 minutes 5 cycles (4) 94 ° C 5 seconds -68 ° C 3 minutes 5 cycles (5) 70 ° C. for 10 minutes Further, using the product of this primary PCR as a template, primer A6 (SEQ ID NO: 5) and primer B5 (SEQ ID NO:
4) and nested PCR with Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) under the following conditions (6) to (10).
I went. (6) 94 ° C 2 minutes (7) 94 ° C 5 seconds -72 ° C 4 minutes 5 cycles (8) 94 ° C 5 seconds -70 ° C 4 minutes 5 cycles (9) 94 ° C 5 seconds -68 ° C 4 minutes 25 cycles (10) 72 ° C for 10 minutes, the obtained amplification product was cloned using Zero Blunt TOPO Cloning kit (manufactured by Invitrogen) to obtain plasmid pCR-BluntII-TCH065. This is used as a primer DNA [primer SP6 (SEQ ID NO:
6), primer T7 (SEQ ID NO: 7), primer A
2 (SEQ ID NO: 8), primer B2 (SEQ ID NO:
9), primer F1 (SEQ ID NO: 10), primer F2 (SEQ ID NO: 11), primer R1 (SEQ ID NO :)
12)] and Big Dye Terminator CycleSequencing Ki
The reaction is carried out using t (manufactured by Applied Biosystems), and the nucleotide sequence of the inserted cDNA fragment is DNA.
It was determined using a sequencer ABI PRISM 3100 DNA Analyzer (manufactured by Applied Biosystems). As a result, the obtained plasmid had a nucleotide sequence of 1429 nucleotides (SEQ ID NO: 13). 411 for the cDNA fragment
An amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) was encoded (SEQ ID NO: 2), and the protein containing the amino acid sequence was designated as human TCH065 protein. The cd
The transformant having the plasmid containing the NA fragment was prepared by using Escherichia coli TOP10 / pC.
It was named R-BluntII-TCH065. Bla
st P [Nucleic Acid Research (Nucleic
Acids Res.) Vol. 25, p. 3389, 1997], and a homology search for OWL was performed.
The cDNA was found to be a novel gene belonging to the 5-HT3 receptor or the nicotinic acetylcholine receptor (Figs. 1 and 2). 5-HT reported in humans
5-HT3A receptor (Mol. Pharmaco
l., Vol. 48, p. 407, 1995) is 2 at the amino acid level.
0%, 5-HT3B receptor (Nature, Vol. 397, p. 359,
1999) shows 17% homology at the amino acid level,
NAChRα7 receptor, which is one of the nicotinic acetylcholine receptors reported in humans (FEBS Lett., No. 40)
0, p. 309, 1997) shows 17% homology at the amino acid level, and the protein was presumed to have a four-transmembrane structure.
【００７９】実施例２
ヒトＴＣＨ０６５遺伝子産物の組織分布の解析
ヒトＴＣＨ０６５の配列から設計した、２種のプライマ
ーＤＮＡ、プライマーＡ８（配列番号：１４）およびプ
ライマーＢ８（配列番号：１５）と、ＴａｑＭａｎプロ
ーブＴ１（配列番号：１６）を用いて、ヒトの各組織の
ｃＤＮＡにおけるヒトＴＣＨ０６５の発現量をＴａｑＭ
ａｎ ＰＣＲにより測定した。反応は、TaqMan Universa
l PCR Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製）
を用いて、ABI PRISM 7900 sequence detection system
（アプライドバイオシステムズ社製）にて最初５０℃２
分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５
秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル
繰り返し、同時に検出を行った。測定に用いたヒトの各
組織のｃＤＮＡを〔表１〕に示す。Example 2 Analysis of Tissue Distribution of Human TCH065 Gene Product Two kinds of primer DNAs designed from the sequence of human TCH065, primer A8 (SEQ ID NO: 14) and primer B8 (SEQ ID NO: 15), and TaqMan probe Using T1 (SEQ ID NO: 16), the expression level of human TCH065 in the cDNA of each human tissue was measured using TaqM.
It was measured by an PCR. The reaction is TaqMan Universa
l PCR Master Mix (manufactured by Applied Biosystems)
Using the ABI PRISM 7900 sequence detection system
(Applied Biosystems) at 50 ℃ 2
For another 10 minutes at 95 ° C, then at 15 ° C for 15 minutes
Second, 40 cycles were repeated with 1 minute at 60 ° C. as one reaction cycle, and detection was performed simultaneously. The cDNA of each human tissue used for the measurement is shown in [Table 1].
【表１】
結果を図３、図４および図５に示す。ヒトＴＣＨ０６５
遺伝子産物（ｍＲＮＡ）は、Human MTC panel Ｉおよび
MTCpanel IIにおいては、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、精
巣、卵巣でわずかな発現が見られ、心臓、脳、胸腺で若
干の発現が見られ、小腸、大腸、白血球で強い発現が見
られた。Human digestive system MTC panelにおいて
は、食道でわずかな発現が見られ、胃から直腸まですべ
ての部位で強い発現が見られた（回腸で特に強い発現が
見られた）。また、肝臓でも発現が見られた。Human bl
ood fractions MTC panelにおいては、いずれの休止状
態の白血球でも強い発現が見られた。CD4+ T細胞では活
性化に伴う顕著な発現の上昇が見られた。単核球、CD8+
T細胞、CD19+細胞では活性化により発現の減少が見ら
れた。Human fetal MTC panelにおいては、胎児心臓で
わずかな発現が見られ、胎児脳、胎児肺、胎児肝臓、胎
児腎臓、胎児骨格筋、胎児脾臓で若干の発現が見られ、
胎児胸腺で強い発現が見られた。Human tumor MTC pane
lにおいては、肺癌、結腸癌、前立腺癌で若干の発現が
見られた。Human immune system MTC panelにおいては
脾臓、扁桃、骨髄で若干の発現が見られ、リンパ節、胸
腺、胎児肝臓で強い発現が見られ、末梢血白血球で特に
強い発現が見られた。[Table 1] The results are shown in FIGS. 3, 4 and 5. Human TCH065
The gene product (mRNA) is Human MTC panel I and
In MTCpanel II, slight expression was observed in the liver, kidney, pancreas, spleen, testis, and ovary, some expression was observed in the heart, brain, and thymus, and strong expression was observed in the small intestine, large intestine, and leukocytes. In the Human digestive system MTC panel, slight expression was observed in the esophagus and strong expression was observed in all sites from the stomach to the rectum (especially strong expression was observed in the ileum). Expression was also found in the liver. Human bl
In the ood fractions MTC panel, strong expression was observed in all leukocytes in the resting state. In CD4 + T cells, a marked increase in expression was observed with activation. Mononuclear cells, CD8 +
Decrease in expression was observed in T cells and CD19 + cells upon activation. In Human fetal MTC panel, slight expression was observed in fetal heart, and slight expression was observed in fetal brain, fetal lung, fetal liver, fetal kidney, fetal skeletal muscle, fetal spleen,
Strong expression was seen in fetal thymus. Human tumor MTC pane
In l, some expression was observed in lung cancer, colon cancer, and prostate cancer. In the human immune system MTC panel, some expression was observed in spleen, tonsil and bone marrow, strong expression in lymph node, thymus and fetal liver, and particularly strong expression in peripheral blood leukocytes.
【００８０】[0080]
【発明の効果】本発明のタンパク質、ポリヌクレオチド
および抗体などは、例えば中枢神経疾患（例、アルツハ
イマー病、パーキンソン症候群、精神***病、記憶障
害、頭痛、うつ病、薬物依存症など）、消化器疾患
（例、潰瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群な
ど）、肝臓疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循環器疾患
（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、炎症性
疾患（例、慢性閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾患
（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェ
ーグレン症候群、インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リ
ウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー疾
患（例、気管支喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナ
フィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺
疾患、脾臓疾患（例、脾機能亢進症など）、免疫不全
（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともな
う免疫不全など）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝
臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱
癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌など）など、臓
器移植後の拒絶反応、抗癌剤治療による副作用などの診
断マーカー等として有用である。該タンパク質、ポリヌ
クレオチドまたは抗体などを用いるスクリーニング法に
より得られる該タンパク質の活性を促進または阻害する
化合物は、該タンパク質遺伝子の発現を促進または阻害
する化合物、該タンパク質の発現を促進または阻害する
化合物などは、例えば、中枢神経疾患（例、アルツハイ
マー病、パーキンソン症候群、精神***病、記憶障害、
頭痛、うつ病、薬物依存症など）、消化器疾患（例、潰
瘍、大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群など）、肝臓
疾患（例、肝炎、肝硬変など）、循環器疾患（例、心不
全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、炎症性疾患（例、
慢性閉塞性肺疾患など）、自己免疫疾患（例、重症筋無
力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候
群、インスリン抵抗性糖尿病、慢性関節リウマチ、全身
性エリテマトーデスなど）、アレルギー疾患（例、気管
支喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー
ショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、脾臓疾
患（例、脾機能亢進症など）、免疫不全（例、白血球異
常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全な
ど）、癌（例、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細
胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮
頸部癌、結腸癌、直腸癌など）などの予防・治療剤、臓
器移植後の拒絶反応抑制剤、抗癌剤治療による副作用の
抑制剤などとして使用することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The proteins, polynucleotides and antibodies of the present invention can be used in, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorders, headache, depression, drug dependence, etc.), digestive organs. Diseases (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), Liver diseases (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), Cardiovascular diseases (eg, heart failure, arrhythmia, QT prolongation syndrome, etc.), inflammatory diseases ( (Eg, chronic obstructive pulmonary disease), autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus), allergic disease (Eg, bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymus disease, spleen disease (eg, hypersplenism) Disease, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, immunodeficiency associated with spleen dysfunction or thymus abnormality), cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer) , Gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), and is useful as a diagnostic marker for rejection after organ transplantation, side effects due to anticancer drug treatment, and the like. The compound that promotes or inhibits the activity of the protein obtained by the screening method using the protein, polynucleotide or antibody is a compound that promotes or inhibits the expression of the protein gene, a compound that promotes or inhibits the expression of the protein, etc. Are, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, schizophrenia, memory disorders,
Headache, depression, drug addiction, etc., digestive system diseases (eg, ulcer, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome, etc.), liver disease (eg, hepatitis, cirrhosis, etc.), cardiovascular disease (eg, heart failure) , Arrhythmias, long QT syndrome, etc., inflammatory diseases (eg,
Chronic obstructive pulmonary disease, etc., autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), allergic disease (eg , Bronchial asthma, hay fever, allergic rhinitis, anaphylactic shock, atopic dermatitis, etc.), thymic disease, spleen disease (eg, hypersplenism, etc.), immunodeficiency (eg, leukocyte abnormality, splenic or thymic abnormality) Immunodeficiency associated with cancer, cancer (eg, pancreatic cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer) And the like), a rejection inhibitor after organ transplantation, a side effect inhibitor due to anticancer drug treatment, and the like.
【００８１】[0081]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemicals Industries, Ltd. <120> Novel Protein and its DNA <130> P02-0001 <150> JP 2001-022505 <151> 2001-01-30 <150> JP 2001-390239 <151> 2001-12-21 <160> 16 <210> 1 <211> 411 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Ala Leu Trp Ser Leu Leu His Leu Thr Phe Leu Gly Phe Ser Ile 1 5 10 15 Thr Leu Leu Leu Val His Gly Gln Gly Phe Gln Gly Thr Ala Ala Ile 20 25 30 Trp Pro Ser Leu Phe Asn Val Asn Leu Ser Lys Lys Val Gln Glu Ser 35 40 45 Ile Gln Ile Pro Asn Asn Gly Ser Ala Pro Leu Leu Val Asp Val Arg 50 55 60 Val Phe Val Ser Asn Val Phe Asn Val Asp Ile Leu Arg Tyr Thr Met 65 70 75 80 Ser Ser Met Leu Leu Leu Arg Leu Ser Trp Leu Asp Thr Arg Leu Ala 85 90 95 Trp Asn Thr Ser Ala His Pro Arg His Ala Ile Thr Leu Pro Trp Glu 100 105 110 Ser Leu Trp Thr Pro Arg Leu Thr Ile Leu Glu Ala Leu Trp Val Asp 115 120 125 Trp Arg Asp Gln Ser Pro Gln Ala Arg Val Asp Gln Asp Gly His Val 130 135 140 Lys Leu Asn Leu Ala Leu Thr Thr Glu Thr Asn Cys Asn Phe Glu Leu 145 150 155 160 Leu His Phe Pro Arg Asp His Ser Asn Cys Ser Leu Ser Phe Tyr Ala 165 170 175 Leu Ser Asn Thr Ala Met Glu Leu Glu Phe Gln Ala His Val Val Asn 180 185 190 Glu Ile Val Ser Val Lys Arg Glu Tyr Val Val Tyr Asp Leu Lys Thr 195 200 205 Gln Val Pro Pro Gln Gln Leu Val Pro Cys Phe Gln Val Thr Leu Arg 210 215 220 Leu Lys Asn Thr Ala Leu Lys Ser Ile Ile Ala Leu Leu Val Pro Ala 225 230 235 240 Glu Ala Leu Leu Leu Ala Asp Val Cys Gly Gly Leu Leu Pro Leu Arg 245 250 255 Ala Ile Glu Arg Ile Gly Tyr Lys Val Thr Leu Leu Leu Ser Tyr Leu 260 265 270 Val Leu His Ser Ser Leu Val Gln Ala Leu Pro Ser Ser Ser Ser Cys 275 280 285 Asn Pro Leu Leu Ile Tyr Tyr Phe Thr Ile Leu Leu Leu Leu Leu Phe 290 295 300 Leu Ser Thr Ile Glu Thr Val Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Arg Gly 305 310 315 320 Asn Leu Gly Ala Lys Ser Gly Pro Ser Pro Ala Pro Arg Gly Glu Gln 325 330 335 Arg Glu His Gly Asn Pro Gly Pro His Pro Ala Glu Glu Pro Ser Arg 340 345 350 Gly Val Lys Gly Ser Gln Arg Ser Trp Pro Glu Thr Ala Asp Arg Ile 355 360 365 Phe Phe Leu Val Tyr Val Val Gly Val Leu Cys Thr Gln Phe Val Phe 370 375 380 Ala Gly Ile Trp Met Trp Ala Ala Cys Lys Ser Asp Ala Ala Pro Gly 385 390 395 400 Glu Ala Ala Pro His Gly Arg Arg Pro Arg Leu 405 410 <210> 2 <211> 1233 <212> DNA <213> Human <400> 2 atggccctat ggtccctgct ccatctcacc ttcctggggt tcagcattac cttgctgttg 60 gtccacgggc agggcttcca agggacagca gccatctggc catccctctt caacgtcaac 120 ttgtccaaga aggttcagga aagcatccag atcccgaaca atgggagtgc gcccctgctc 180 gtggatgtgc gggtgtttgt ctccaacgtg tttaatgtgg acatcctgcg atacacaatg 240 tcctccatgc tgctgcttag gctgtcctgg ctggacactc gcctggcctg gaacactagt 300 gcacacccgc ggcacgccat cacgctgccc tgggagtctc tctggacacc aaggctcacc 360 atcctggagg cgctctgggt ggactggagg gaccagagcc cccaggctcg agtagaccag 420 gacggccacg tgaagctcaa cctggccctc accacggaga ccaactgcaa ctttgagctc 480 ctccacttcc cccgggacca cagcaactgc agcctcagct tctacgctct cagcaacacg 540 gcgatggagt tagagttcca ggcccacgtg gtgaacgaga ttgtgagtgt caagagggaa 600 tacgtagttt atgatctgaa gacccaagtc ccaccccagc agctggtgcc ctgcttccag 660 gtgacgctga ggctgaagaa cacggcgctc aagtccatca tcgctctctt ggtgcctgca 720 gaggcactgc tgttggctga cgtgtgcggg gggttgctgc ccctccgggc cattgagcgc 780 ataggctaca aggtgacatt gctgctgagt tacctcgtcc tccactcctc cctggtgcag 840 gccctgccca gctcctcctc ctgcaaccca ctgctcattt actacttcac catcctgctg 900 ctgctgctct tcctcagcac catagagact gtgctgctgg ctgggctgct ggcccggggc 960 aaccttgggg ccaagagcgg ccccagccca gccccgagag gggaacagcg agagcacggc 1020 aacccagggc ctcatcctgc tgaagagccc tccagaggag taaaggggtc acagagaagc 1080 tggcctgaga ctgctgaccg catcttcttc ctcgtgtatg tggttggggt gctgtgcacc 1140 caattcgtct ttgcaggaat ctggatgtgg gcagcgtgca agtctgacgc agcccctgga 1200 gaggctgcac cccatggcag gcggcctaga ctg 1233 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 caagtgcacg gccccaaagt cctt 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ggtggcttaa tccagaggcc ctgtca 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gcagctgcct ctggctaatt gctcag 26 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 atttaggtga cactatag 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aatacgactc actataggg 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ctggaacact agtgcacacc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gtaaatgagc agtgggttgc 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 acacggcgct caagtccatc a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 accgcatctt cttcctcgtg t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 cgtgggcctg gaactctaac t 21 <210> 13 <211> 1429 <212> DNA <213> Human <400> 13 gcagctgcct ctggctaatt gctcagctgc cagagaagtg actggaatag aggttgtagc 60 ttaggcaccg ctgctccctc cagtccctcc gtgcagccga tgatggccct atggtccctg 120 ctccatctca ccttcctggg gttcagcatt accttgctgt tggtccacgg gcagggcttc 180 caagggacag cagccatctg gccatccctc ttcaacgtca acttgtccaa gaaggttcag 240 gaaagcatcc agatcccgaa caatgggagt gcgcccctgc tcgtggatgt gcgggtgttt 300 gtctccaacg tgtttaatgt ggacatcctg cgatacacaa tgtcctccat gctgctgctt 360 aggctgtcct ggctggacac tcgcctggcc tggaacacta gtgcacaccc gcggcacgcc 420 atcacgctgc cctgggagtc tctctggaca ccaaggctca ccatcctgga ggcgctctgg 480 gtggactgga gggaccagag cccccaggct cgagtagacc aggacggcca cgtgaagctc 540 aacctggccc tcaccacgga gaccaactgc aactttgagc tcctccactt cccccgggac 600 cacagcaact gcagcctcag cttctacgct ctcagcaaca cggcgatgga gttagagttc 660 caggcccacg tggtgaacga gattgtgagt gtcaagaggg aatacgtagt ttatgatctg 720 aagacccaag tcccacccca gcagctggtg ccctgcttcc aggtgacgct gaggctgaag 780 aacacggcgc tcaagtccat catcgctctc ttggtgcctg cagaggcact gctgttggct 840 gacgtgtgcg gggggttgct gcccctccgg gccattgagc gcataggcta caaggtgaca 900 ttgctgctga gttacctcgt cctccactcc tccctggtgc aggccctgcc cagctcctcc 960 tcctgcaacc cactgctcat ttactacttc accatcctgc tgctgctgct cttcctcagc 1020 accatagaga ctgtgctgct ggctgggctg ctggcccggg gcaaccttgg ggccaagagc 1080 ggccccagcc cagccccgag aggggaacag cgagagcacg gcaacccagg gcctcatcct 1140 gctgaagagc cctccagagg agtaaagggg tcacagagaa gctggcctga gactgctgac 1200 cgcatcttct tcctcgtgta tgtggttggg gtgctgtgca cccaattcgt ctttgcagga 1260 atctggatgt gggcagcgtg caagtctgac gcagcccctg gagaggctgc accccatggc 1320 aggcggccta gactgtaaag gggcagggcc tgggctgcac accttaggat gaagtttgct 1380 ttcccatggc tgggggcggg ccatgacagg gcctctggat taagccacc 1429 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 tccctcttca acgtcaactt gtc 23 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 acaaacaccc gcacatcca 19 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 16 caggaaagca tccagatccc gaacaat 27[Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemicals Industries, Ltd. <120> Novel Protein and its DNA <130> P02-0001 <150> JP 2001-022505 <151> 2001-01-30 <150> JP 2001-390239 <151> 2001-12-21 <160> 16 <210> 1 <211> 411 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Ala Leu Trp Ser Leu Leu His Leu Thr Phe Leu Gly Phe Ser Ile 1 5 10 15 Thr Leu Leu Leu Val His Gly Gln Gly Phe Gln Gly Thr Ala Ala Ile 20 25 30 Trp Pro Ser Leu Phe Asn Val Asn Leu Ser Lys Lys Val Gln Glu Ser 35 40 45 Ile Gln Ile Pro Asn Asn Gly Ser Ala Pro Leu Leu Val Asp Val Arg 50 55 60 Val Phe Val Ser Asn Val Phe Asn Val Asp Ile Leu Arg Tyr Thr Met 65 70 75 80 Ser Ser Met Leu Leu Leu Arg Leu Ser Trp Leu Asp Thr Arg Leu Ala 85 90 95 Trp Asn Thr Ser Ala His Pro Arg His Ala Ile Thr Leu Pro Trp Glu 100 105 110 Ser Leu Trp Thr Pro Arg Leu Thr Ile Leu Glu Ala Leu Trp Val Asp 115 120 125 Trp Arg Asp Gln Ser Pro Gln Ala Arg Val Asp Gln Asp Gly His Val 130 135 140 Lys Leu Asn Leu Ala Leu Thr Thr Glu Thr Asn Cys Asn Phe Glu Leu 145 150 155 160 Leu His Phe Pro Arg Asp His Ser Asn Cys Ser Leu Ser Phe Tyr Ala 165 170 175 Leu Ser Asn Thr Ala Met Glu Leu Glu Phe Gln Ala His Val Val Asn 180 185 190 Glu Ile Val Ser Val Lys Arg Glu Tyr Val Val Tyr Asp Leu Lys Thr 195 200 205 Gln Val Pro Pro Gln Gln Leu Val Pro Cys Phe Gln Val Thr Leu Arg 210 215 220 Leu Lys Asn Thr Ala Leu Lys Ser Ile Ile Ala Leu Leu Val Pro Ala 225 230 235 240 Glu Ala Leu Leu Leu Ala Asp Val Cys Gly Gly Leu Leu Pro Leu Arg 245 250 255 Ala Ile Glu Arg Ile Gly Tyr Lys Val Thr Leu Leu Leu Ser Tyr Leu 260 265 270 Val Leu His Ser Ser Leu Val Gln Ala Leu Pro Ser Ser Ser Ser Cys 275 280 285 Asn Pro Leu Leu Ile Tyr Tyr Phe Thr Ile Leu Leu Leu Leu Leu Phe 290 295 300 Leu Ser Thr Ile Glu Thr Val Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Arg Gly 305 310 315 320 Asn Leu Gly Ala Lys Ser Gly Pro Ser Pro Ala Pro Arg Gly Glu Gln 325 330 335 Arg Glu His Gly Asn Pro Gly Pro His Pro Ala Glu Glu Pro Ser Arg 340 345 350 Gly Val Lys Gly Ser Gln Arg Ser Trp Pro Glu Thr Ala Asp Arg Ile 355 360 365 Phe Phe Leu Val Tyr Val Val Gly Val Leu Cys Thr Gln Phe Val Phe 370 375 380 Ala Gly Ile Trp Met Trp Ala Ala Cys Lys Ser Asp Ala Ala Pro Gly 385 390 395 400 Glu Ala Ala Pro His Gly Arg Arg Pro Arg Leu 405 410 <210> 2 <211> 1233 <212> DNA <213> Human <400> 2 atggccctat ggtccctgct ccatctcacc ttcctggggt tcagcattac cttgctgttg 60 gtccacgggc agggcttcca agggacagca gccatctggc catccctctt caacgtcaac 120 ttgtccaaga aggttcagga aagcatccag atcccgaaca atgggagtgc gcccctgctc 180 gtggatgtgc gggtgtttgt ctccaacgtg tttaatgtgg acatcctgcg atacacaatg 240 tcctccatgc tgctgcttag gctgtcctgg ctggacactc gcctggcctg gaacactagt 300 gcacacccgc ggcacgccat cacgctgccc tgggagtctc tctggacacc aaggctcacc 360 atcctggagg cgctctgggt ggactggagg gaccagagcc cccaggctcg agtagaccag 420 gacggccacg tgaagctcaa cctggccctc accacggaga ccaactgcaa ctttgagctc 480 ctccacttcc cccgggacca cagcaactgc agcctcagct tctacgctct cagcaacacg 540 gcgatggagt tagagttcca ggcccacgtg gtgaacgaga ttgtgagtgt caagagggaa 600 tacgtagttt atgatctgaa gacccaagtc ccaccccagc agctggtgcc ctgcttccag 660 gtgacgctga ggctgaagaa cacggcgctc aagtccatca tcgctctctt ggtgcctgca 720 gaggcactgc tgttggctga cgtgtgcggg gggttgctgc ccctccgggc cattgagcgc 780 ataggctaca aggtgacatt gctgctgagt tacctcgtcc tccactcctc cctggtgcag 840 gccctgccca gctcctcctc ctgcaaccca ctgctcattt actacttcac catcctgctg 900 ctgctgctct tcctcagcac catagagact gtgctgctgg ctgggctgct ggcccggggc 960 aaccttgggg ccaagagcgg ccccagccca gccccgagag gggaacagcg agagcacggc 1020 aacccagggc ctcatcctgc tgaagagccc tccagaggag taaaggggtc acagagaagc 1080 tggcctgaga ctgctgaccg catcttcttc ctcgtgtatg tggttggggt gctgtgcacc 1140 caattcgtct ttgcaggaat ctggatgtgg gcagcgtgca agtctgacgc agcccctgga 1200 gaggctgcac cccatggcag gcggcctaga ctg 1233 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 caagtgcacg gccccaaagt cctt 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ggtggcttaa tccagaggcc ctgtca 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gcagctgcct ctggctaatt gctcag 26 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 atttaggtga cactatag 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aatacgactc actataggg 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ctggaacact agtgcacacc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gtaaatgagc agtgggttgc 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 acacggcgct caagtccatc a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 accgcatctt cttcctcgtg t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 cgtgggcctg gaactctaac t 21 <210> 13 <211> 1429 <212> DNA <213> Human <400> 13 gcagctgcct ctggctaatt gctcagctgc cagagaagtg actggaatag aggttgtagc 60 ttaggcaccg ctgctccctc cagtccctcc gtgcagccga tgatggccct atggtccctg 120 ctccatctca ccttcctggg gttcagcatt accttgctgt tggtccacgg gcagggcttc 180 caagggacag cagccatctg gccatccctc ttcaacgtca acttgtccaa gaaggttcag 240 gaaagcatcc agatcccgaa caatgggagt gcgcccctgc tcgtggatgt gcgggtgttt 300 gtctccaacg tgtttaatgt ggacatcctg cgatacacaa tgtcctccat gctgctgctt 360 aggctgtcct ggctggacac tcgcctggcc tggaacacta gtgcacaccc gcggcacgcc 420 atcacgctgc cctgggagtc tctctggaca ccaaggctca ccatcctgga ggcgctctgg 480 gtggactgga gggaccagag cccccaggct cgagtagacc aggacggcca cgtgaagctc 540 aacctggccc tcaccacgga gaccaactgc aactttgagc tcctccactt cccccgggac 600 cacagcaact gcagcctcag cttctacgct ctcagcaaca cggcgatgga gttagagttc 660 caggcccacg tggtgaacga gattgtgagt gtcaagaggg aatacgtagt ttatgatctg 720 aagacccaag tcccacccca gcagctggtg ccctgcttcc aggtgacgct gaggctgaag 780 aacacggcgc tcaagtccat catcgctctc ttggtgcctg cagaggcact gctgttggct 840 gacgtgtgcg gggggttgct gcccctccgg gccattgagc gcataggcta caaggtgaca 900 ttgctgctga gttacctcgt cctccactcc tccctggtgc aggccctgcc cagctcctcc 960 tcctgcaacc cactgctcat ttactacttc accatcctgc tgctgctgct cttcctcagc 1020 accatagaga ctgtgctgct ggctgggctg ctggcccggg gcaaccttgg ggccaagagc 1080 ggccccagcc cagccccgag aggggaacag cgagagcacg gcaacccagg gcctcatcct 1140 gctgaagagc cctccagagg agtaaagggg tcacagagaa gctggcctga gactgctgac 1200 cgcatcttct tcctcgtgta tgtggttggg gtgctgtgca cccaattcgt ctttgcagga 1260 atctggatgt gggcagcgtg caagtctgac gcagcccctg gagaggctgc accccatggc 1320 aggcggccta gactgtaaag gggcagggcc tgggctgcac accttaggat gaagtttgct 1380 ttcccatggc tgggggcggg ccatgacagg gcctctggat taagccacc 1429 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 tccctcttca acgtcaactt gtc 23 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 acaaacaccc gcacatcca 19 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 16 caggaaagca tccagatccc gaacaat 27
【図１】ヒトＴＣＨ０６５、ｎＡＣｈＲ α７受容体お
よび５−ＨＴ３受容体（５−ＨＴ３Ａおよび５−ＨＴ３
Ｂ）のアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、TCH0
65はヒトＴＣＨ０６５のアミノ酸配列を、nAChR alpha7
はｎＡＣｈＲα７受容体のアミノ酸配列を、5-HT3Aは５
−ＨＴ３Ａ受容体のアミノ酸配列を、5-HT3Bは５−ＨＴ
３Ｂ受容体のアミノ酸配列を、Ｓはシグナル配列を、Ｍ
１〜Ｍ４は膜貫通領域を示す。□は、ヒトＴＣＨ０６５
に一致するアミノ酸を示す。（図２へ続く）FIG. 1: Human TCH065, nAChR α7 and 5-HT3 receptors (5-HT3A and 5-HT3
It is a figure showing the comparison of the amino acid sequence of B). In the figure, TCH0
65 is the amino acid sequence of human TCH065, nAChR alpha7
Is the amino acid sequence of nAChRα7 receptor and 5-HT3A is 5
-HT3A receptor amino acid sequence, 5-HT3B is 5-HT
3B receptor amino acid sequence, S a signal sequence, M
1 to M4 represent transmembrane regions. □ is human TCH065
The amino acid corresponding to is shown. (Continued to Figure 2)
【図２】ヒトＴＣＨ０６５、ニコチン性アセチルコリン
受容体および５−ＨＴ３受容体（５−ＨＴ３Ａおよび５
−ＨＴ３Ｂ）のアミノ酸配列の比較を表す図である。図
中、TCH065はヒトＴＣＨ０６５のアミノ酸配列を、nACh
R alpha7はニコチン性アセチルコリン受容体のアミノ酸
配列を、5-HT3Aは５−ＨＴ３Ａ受容体のアミノ酸配列
を、5-HT3Bは５−ＨＴ３Ｂ受容体のアミノ酸配列を、Ｓ
はシグナル配列を、Ｍ１〜Ｍ４は膜貫通領域を示す。□
は、ヒトＴＣＨ０６５に一致するアミノ酸を示す。（図
１の続き）FIG. 2. Human TCH065, nicotinic acetylcholine receptor and 5-HT3 receptor (5-HT3A and 5
FIG. 4 is a diagram showing a comparison of amino acid sequences of (HT3B). In the figure, TCH065 is the amino acid sequence of human TCH065
R alpha7 is the amino acid sequence of nicotinic acetylcholine receptor, 5-HT3A is the amino acid sequence of 5-HT3A receptor, 5-HT3B is the amino acid sequence of 5-HT3B receptor, S
Indicates a signal sequence, and M1 to M4 indicate transmembrane regions. □
Indicates an amino acid corresponding to human TCH065. (Continued from Figure 1)
【図３】ヒトＴＣＨ０６５遺伝子産物の各組織における
発現量を表す図である。ヒトの各組織ｃＤＮＡ（Ｈｕｍ
ａｎ ＭＴＣ ｐａｎｅｌ ＩおよびＭＴＣ ｐａｎｅｌ
ＩＩおよびｈｕｍａｎ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅ
ｍ ＭＴＣ ｐａｎｅｌ：クロンテック社製）におけるヒ
トＴＣＨ０６５の発現量をＴａｑＭａｎＰＣＲにより測
定した結果を示す。発現量はｃＤＮＡ溶液１μｌ当たり
のコピー数で表した。FIG. 3 is a diagram showing the expression level of human TCH065 gene product in each tissue. Human tissue cDNA (Hum
an MTC panel I and MTC panel
II and human digestive system
(m MTC panel: manufactured by Clontech) shows the results of measuring the expression level of human TCH065 by TaqMan PCR. The expression level was represented by the copy number per 1 μl of the cDNA solution.
【図４】ヒトＴＣＨ０６５遺伝子産物の各組織における
発現量を表す図である。ヒトの各組織ｃＤＮＡ（Ｈｕｍ
ａｎ ｂｌｏｏｄ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ＭＴＣｐａｎｅ
ｌおよびｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ＭＴＣ ｐａｎｅｌ：
クロンテック社製）におけるヒトＴＣＨ０６５の発現量
をＴａｑＭａｎ ＰＣＲにより測定した結果を示す。発
現量はｃＤＮＡ溶液１μｌ当たりのコピー数で表した。FIG. 4 is a diagram showing the expression level of human TCH065 gene product in each tissue. Human tissue cDNA (Hum
an blood fractions MTCpane
l and human fatal MTC panel:
The result of having measured the expression level of human TCH065 in Clontech) by TaqMan PCR is shown. The expression level was represented by the copy number per 1 μl of the cDNA solution.
【図５】ヒトＴＣＨ０６５遺伝子産物の各組織における
発現量を表す図である。ヒトの各組織ｃＤＮＡ（Ｈｕｍ
ａｎ ｔｕｍｏｒ ＭＴＣ ｐａｎｅｌおよびｈｕｍａｎ
ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ＭＴＣ ｐａｎｅｌ：クロ
ンテック社製）におけるヒトＴＣＨ０６５の発現量をＴ
ａｑＭａｎ ＰＣＲにより測定した結果を示す。発現量
はｃＤＮＡ溶液１μｌ当たりのコピー数で表した。FIG. 5 shows the expression level of human TCH065 gene product in each tissue. Human tissue cDNA (Hum
an tumor MTC panel and human
The expression level of human TCH065 in the immuno system MTC panel (manufactured by Clontech)
The result measured by aqMan PCR is shown. The expression level was represented by the copy number per 1 μl of the cDNA solution.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 1/16 ４Ｃ０８４ 1/16 3/10 ４Ｃ０８５ 3/10 9/00 ４Ｈ０４５ 9/00 9/04 9/04 9/06 9/06 11/02 11/02 11/06 11/06 13/12 13/12 17/00 17/00 19/02 19/02 21/04 21/04 25/00 25/00 25/16 25/16 25/18 25/18 25/24 25/24 25/28 25/28 29/00 29/00 １０１ １０１ 31/18 31/18 35/00 35/00 37/00 37/00 37/06 37/06 37/08 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA09 CA12 HA14 HA17 4B063 QA08 QA18 QA19 QQ08 QQ43 QQ53 QQ79 QR32 QR36 QR48 QR55 QR62 QR77 QS25 QS34 4B064 AG20 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA93Y AB01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 NA14 ZA012 ZA022 ZA122 ZA152 ZA162 ZA182 ZA342 ZA362 ZA382 ZA592 ZA662 ZA682 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZB052 ZB072 ZB082 ZB112 ZB132 ZB152 ZB262 ZC352 4C085 AA13 AA14 BB11 DD62 DD63 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) A61P 1/04 A61P 1/16 4C084 1/16 3/10 4C085 3/10 9/00 4H045 9/00 9 / 04 9/04 9/06 9/06 11/02 11/02 11/06 11/06 13/12 13/12 17/00 17/00 19/02 19/02 21/04 21/04 25/00 25/00 25/16 25/16 25/18 25/18 25/24 25/24 25/28 25/28 29/00 29/00 101 101 31/18 31/18 35/00 35/00 37/00 37/00 37/06 37/06 37/08 37/08 C07K 14/705 C07K 14/705 16/28 16/28 C12N 1/15 C12N 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 C12P 21/02 C 5/10 C12Q 1/02 C12P 21/02 G01N 33/15 Z C12Q 1/02 33/50 Z G01N 33/15 33/53 D 33/50 M 33/53 33/566 C12N 15/00 ZNAA 33/566 5/00 AF term (reference) 2G045 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB0 2 FB03 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA09 CA12 HA14 HA17 4B063 QA08 QA18 QA19 QQ08 QQ43 QQ53 QQ79 QR32 QR36 QR48 QR55 QR62 QR77 QS25 QS34 4B064 AG20 CA19 CC24 DA01 DA14 4A0 CAA CAA CAY ZA382 ZA592 ZA662 ZA682 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZB052 ZB072 ZB082 ZB112 ZB132 ZB152 ZB262 ZC352 4C085 AA13 AA14 BB11 DD62 DD63 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA20 CA40 DA40 DA40 FA20 CA40 DA40
Claims (31)
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
タンパク質またはその塩。1. A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof.
を含有する請求項１記載のタンパク質またはその塩。2. The protein according to claim 1, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof.
ドまたはその塩。3. A partial peptide of the protein according to claim 1 or a salt thereof.
３記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含有するポリヌクレオチド。4. A polynucleotide containing a polynucleotide encoding the protein according to claim 1 or the partial peptide according to claim 3.
オチド。5. The polynucleotide according to claim 4, which is DNA.
有する請求項５記載のＤＮＡ。6. The DNA according to claim 5, which contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
ベクター。7. A recombinant vector containing the DNA according to claim 5.
換された形質転換体。8. A transformant transformed with the recombinant vector according to claim 7.
求項１記載のタンパク質または請求項３記載の部分ペプ
チドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する請求項１記載のタンパク質もしくは請求項３記載の
部分ペプチドまたはその塩の製造法。9. The method according to claim 1, wherein the transformant according to claim 8 is cultured, the protein according to claim 1 or the partial peptide according to claim 3 is produced and accumulated, and this is collected. A method for producing the protein according to claim 3 or the partial peptide according to claim 3 or a salt thereof.
求項３記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる
医薬。10. A medicine comprising the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 3, or a salt thereof.
医薬。11. A medicine comprising the DNA according to claim 5.
求項３記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。12. An antibody against the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 3, or a salt thereof.
求項３記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを
特徴とする、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項
３記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または
阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。13. The activity of the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 3, or the salt thereof, which comprises using the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 3, or a salt thereof. A method for screening a compound or its salt that promotes or inhibits.
求項３記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してな
る、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項３記載の
部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する
化合物またはその塩のスクリーニング用キット。14. The activity of the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 3, or the partial peptide or salt thereof, which comprises the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 3, or a salt thereof, or A kit for screening a compound that inhibits or a salt thereof.
または請求項１４記載のスクリーニング用キットを用い
て得られる、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項
３記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または
阻害する化合物またはその塩。15. The activity of the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 3, or a salt thereof obtained by using the screening method according to claim 13 or the screening kit according to claim 14 is promoted or inhibited. Or a salt thereof.
を含有してなる医薬。16. A medicine comprising the compound according to claim 15 or a salt thereof.
いることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質遺伝
子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング方法。17. A method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of the protein gene according to claim 1, which comprises using the polynucleotide according to claim 4.
有してなる、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を
促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン
グ用キット。18. A kit for screening a compound or a salt thereof, which comprises the polynucleotide according to claim 4 and promotes or inhibits the expression of the protein gene according to claim 1.
または請求項１８記載のスクリーニング用キットを用い
て得られる、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を
促進または阻害する化合物またはその塩。19. A compound or a salt thereof, which is obtained by using the screening method according to claim 17 or the screening kit according to claim 18, which promotes or inhibits the expression of the protein gene according to claim 1.
を含有してなる医薬。20. A medicine comprising the compound according to claim 19 or a salt thereof.
診断薬。21. A diagnostic agent comprising the antibody according to claim 12.
医薬。22. A medicine comprising the antibody according to claim 12.
特徴とする請求項１記載のタンパク質の定量方法。23. The protein quantification method according to claim 1, wherein the antibody according to claim 12 is used.
とを特徴とする請求項１記載のタンパク質の機能が関連
する疾患の診断法。24. A method for diagnosing a disease associated with the function of the protein according to claim 1, wherein the quantification method according to claim 23 is used.
特徴とする、請求項１記載のタンパク質の発現を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方
法。25. A method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the expression of the protein according to claim 1, which comprises using the antibody according to claim 12.
る、請求項１記載のタンパク質の発現を促進または阻害
する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。26. A screening kit for a compound or its salt that promotes or inhibits the expression of the protein according to claim 1, which comprises the antibody according to claim 12.
または請求項２６記載のスクリーニング用キットを用い
て得られる、請求項１記載のタンパク質の発現を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩。27. A compound or a salt thereof, which is obtained by using the screening method according to claim 25 or the screening kit according to claim 26, which promotes or inhibits the expression of the protein according to claim 1.
を含有してなる医薬。28. A pharmaceutical comprising the compound according to claim 27 or a salt thereof.
患、循環器疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギ
ー疾患、胸腺疾患、脾臓疾患、免疫不全若しくは癌の予
防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤、または抗癌
剤治療による副作用の抑制剤である請求項１０、請求項
１１、請求項１６、請求項２０、請求項２２または請求
項２８記載の医薬。29. A preventive / therapeutic agent for central nervous system disease, digestive system disease, liver disease, cardiovascular disease, inflammatory disease, autoimmune disease, allergic disease, thymus disease, spleen disease, immunodeficiency or cancer, and after organ transplantation. 29. The medicament according to claim 10, claim 11, claim 16, claim 20, claim 22 or claim 28, which is a rejection inhibitor or a side effect inhibitor due to anticancer drug treatment.
項１９または請求項２７記載の化合物またはその塩の有
効量を投与することを特徴とする中枢神経疾患、消化器
疾患、肝臓疾患、循環器疾患、炎症性疾患、自己免疫疾
患、アレルギー疾患、胸腺疾患、脾臓疾患、免疫不全若
しくは癌の予防・治療方法、臓器移植後の拒絶反応抑制
方法、または抗癌剤治療による副作用の抑制方法。30. A central nervous system disease, digestive system disease, liver disease, which comprises administering an effective amount of the compound according to claim 15, 19 or 27 or a salt thereof to a mammal. A method for preventing / treating cardiovascular disease, inflammatory disease, autoimmune disease, allergic disease, thymus disease, spleen disease, immunodeficiency or cancer, method for suppressing rejection after organ transplantation, or method for suppressing side effects by anticancer drug treatment.
患、循環器疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギ
ー疾患、胸腺疾患、脾臓疾患、免疫不全若しくは癌の予
防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤、または抗癌
剤治療による副作用の抑制剤を製造するための請求項１
５、請求項１９または請求項２７記載の化合物またはそ
の塩の使用。31. A preventive / therapeutic agent for central nervous system disease, digestive system disease, liver disease, cardiovascular disease, inflammatory disease, autoimmune disease, allergic disease, thymus disease, spleen disease, immunodeficiency or cancer, and after organ transplantation. 1. A method for producing an agent for suppressing a rejection reaction or an agent for suppressing a side effect caused by treatment with an anticancer agent.
5, Use of the compound according to claim 19 or claim 27 or a salt thereof.
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- 2002-01-29 JP JP2002019703A patent/JP2003245076A/en not_active Withdrawn
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