JP2003210196A - LIQUID FOR MEASURING alpha-AMYLASE ACTIVITY - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a liquid for measuring α-amylase activity with which the activity of the α-amylase having the optimum pH in the acidic side is measured in high sensitivity. <P>SOLUTION: This liquid for measuring the α-amylase activity contains thiourea or N-methylthiourea. <P>COPYRIGHT: (C)2003,JPO

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、αアミラーゼ活性
測定用液、並びにそれを用いたαアミラーゼ活性の測定
方法に関する。より詳細には、本発明は、チオ尿素また
はＮ−メチルチオ尿素を含むαアミラーゼ活性測定用
液、並びにそれを用いたαアミラーゼ活性の測定方法に
関する。本発明のαアミラーゼ活性測定用液及びαアミ
ラーゼ活性の測定方法は、農作物の品質管理などに有用
である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a liquid for measuring α-amylase activity and a method for measuring α-amylase activity using the same. More specifically, the present invention relates to a liquid for measuring α-amylase activity containing thiourea or N-methylthiourea, and a method for measuring α-amylase activity using the same. The liquid for measuring α-amylase activity and the method for measuring α-amylase activity of the present invention are useful for quality control of agricultural products.

【０００２】[0002]

【従来の技術】小麦に存在するアミラーゼには、αアミ
ラーゼとβアミラーゼがあり、小麦中の澱粉を基質とし
てデキストリンやマルトースを生成する。小麦を製粉
し、これにより得られた小麦粉でパンを製造する際、小
麦粉の品質は製パン時の生地の粘弾性を指標にして評価
されるが、この粘弾性は小麦粉のもつアミラーゼ活性に
大きく依存する。2. Description of the Related Art Amylase existing in wheat includes α-amylase and β-amylase, and produces dextrin and maltose using starch in wheat as a substrate. When wheat is milled and bread is produced from the wheat flour thus obtained, the quality of the flour is evaluated using the viscoelasticity of the dough at the time of baking as an index, and this viscoelasticity greatly affects the amylase activity of the flour. Dependent.

【０００３】通常の小麦ではβアミラーゼが発現してい
るが、発芽時に近い小麦ではαアミラーゼが発現する。
製粉の際、発芽時に近い小麦が原料として混入した場
合、これにより得られた小麦粉で製パンを行うと、生地
の粘度が低下し、この小麦粉の品質は劣化する。従っ
て、製粉を行う際に、原料として使用するアミラーゼ活
性を把握することが重要である。Β-amylase is expressed in normal wheat, but α-amylase is expressed in wheat close to germination.
When wheat near the time of germination is mixed as a raw material during flour milling, the bread obtained from the resulting flour reduces the viscosity of the dough and deteriorates the quality of this flour. Therefore, it is important to understand the amylase activity used as a raw material when milling.

【０００４】αアミラーゼ活性は、ｐ−ニトロフェノー
ル（ＰＮＰ）を標識したオリゴ糖基質と共役酵素である
αグルコシダーゼを用いて、ＰＮＰ生成速度を指標にし
て測定するのが一般的である。しかしながら、このＰＮ
Ｐのε（モル吸光係数）はｐＨ依存性であり、ｐＨ９以
上ではεは最大であるが、ｐＨの低下に伴い、εも低下
する。実際、ｐＨ８でのεを１００とすると、ｐＨ６．
５でのεは約３５と約１／３になる。従って、至適ｐＨ
が酸性側にあるαアミラーゼ活性測定においては、感度
低下が問題となっている。[0004] The α-amylase activity is generally measured by using an oligosaccharide substrate labeled with p-nitrophenol (PNP) and α-glucosidase which is a coupling enzyme, using the PNP production rate as an index. However, this PN
The ε (molar extinction coefficient) of P is pH-dependent, and ε is maximum at pH 9 or higher, but ε also decreases as the pH decreases. In fact, if ε at pH 8 is 100, then pH 6.
Ε at 5 becomes about 35 and about 1/3. Therefore, the optimum pH
In the measurement of α-amylase activity where is on the acidic side, the decrease in sensitivity poses a problem.

【０００５】特に、穀物由来のαアミラーゼは至適ｐＨ
が５〜６であるため、活性測定においては、感度の向上
が重要な課題である。活性測定における感度の向上を図
るために、εのｐＨ依存性が比較的低いクロロニトロフ
ェノール（ＣＮＰ）を標識したオリゴ糖基質が開発され
ているが、穀物由来のα−アミラーゼではＰＮＰ基質の
場合と比較して、ＣＮＰ基質では高い感度が得られな
い。ｐＨ５〜６においては、ε（ＣＮＰ）＞ε（ＰＮ
Ｐ）であることから、穀物由来のα−アミラーゼは、Ｐ
ＮＰ標識オリゴ糖基質に比べ、ＣＮＰ標識オリゴ糖基質
には作用しにくいことが考えられる。Particularly, α-amylase derived from cereals has an optimum pH.
Therefore, improvement of sensitivity is an important issue in activity measurement. In order to improve the sensitivity in activity measurement, an oligosaccharide substrate labeled with chloronitrophenol (CNP), which has a relatively low pH dependence of ε, has been developed. In comparison with CNP substrate, high sensitivity is not obtained. At pH 5 to 6, ε (CNP)> ε (PN
Therefore, the α-amylase derived from cereal is P
It is considered that the CNP-labeled oligosaccharide substrate is less likely to act than the NP-labeled oligosaccharide substrate.

【０００６】そのため現在では、ＰＮＰ標識オリゴ糖基
質を用いて、ＰＮＰ標識オリゴ糖基質を用いて、至適ｐ
ＨであるｐＨ＝５．４において反応を行わせ、反応停止
液としてアルカリを添加し、反応を停止させるととも
に、生成ＰＮＰのεを高めることを行っている。しかし
ながら、この方法では、終点法であるため、基質ブラン
クを別途測定して、その差から、実質上のＰＮＰ生成速
度を求めている。この方法では、一つのαアミラーゼ活
性を測定するために２回の測定を行なう必要があるた
め、操作が煩雑であるという問題点がある。[0006] Therefore, at present, using a PNP-labeled oligosaccharide substrate and a PNP-labeled oligosaccharide substrate, the optimum p
The reaction is carried out at pH = 5.4, which is H, an alkali is added as a reaction stopping solution to stop the reaction, and the ε of PNP produced is increased. However, since this method is an end point method, the substrate blank is separately measured, and the substantial PNP generation rate is determined from the difference. This method has a problem that the operation is complicated because it is necessary to perform the measurement twice in order to measure one α-amylase activity.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明は、至適ｐＨが酸性側にあるαアミラ
ーゼの活性を高感度で測定することが可能なαアミラー
ゼ活性測定用液を提供することを解決すべき課題とし
た。本発明はまた、至適ｐＨが酸性側にあるαアミラー
ゼの活性を高感度で測定することが可能なαアミラーゼ
活性の測定方法を提供することを解決すべき課題とし
た。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above-mentioned problems of the prior art. That is, the present invention has made it a problem to be solved to provide an α-amylase activity measurement liquid capable of highly sensitively measuring the activity of α-amylase having an optimum pH on the acidic side. Another object of the present invention is to provide an α-amylase activity measuring method capable of highly sensitively measuring the activity of α-amylase having an optimum pH on the acidic side.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、チオ尿素またはＮ−
メチルチオ尿素を含むαアミラーゼ活性測定用液を用い
てαアミラーゼ活性を測定した場合、至適ｐＨが酸性側
にあるαアミラーゼの活性を高感度に測定できることを
見出し、本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies for solving the above problems, the present inventors have found that thiourea or N-
When α-amylase activity was measured using a liquid for measuring α-amylase activity containing methylthiourea, it was found that the activity of α-amylase having an optimum pH on the acidic side can be measured with high sensitivity, and the present invention has been completed. .

【０００９】即ち、本発明によれば、チオ尿素またはＮ
−メチルチオ尿素を含む、αアミラーゼ活性測定用液が
提供される。好ましくは、本発明のαアミラーゼ活性測
定用液は、１００ｍＭ以上のチオ尿素またはＮ−メチル
チオ尿素を含む。好ましくは、本発明のαアミラーゼ活
性測定用液は、１００ｍＭから１０００ｍＭのチオ尿素
またはＮ−メチルチオ尿素を含む。好ましくは、αアミ
ラーゼは、穀物由来のαアミラーゼであり、特に好まし
くは、αアミラーゼは、麦類由来のαアミラーゼであ
る。That is, according to the present invention, thiourea or N
A liquid for measuring α-amylase activity containing methylthiourea is provided. Preferably, the liquid for measuring α-amylase activity of the present invention contains 100 mM or more of thiourea or N-methylthiourea. Preferably, the liquid for measuring α-amylase activity of the present invention contains 100 mM to 1000 mM of thiourea or N-methylthiourea. Preferably, the α-amylase is a grain-derived α-amylase, and particularly preferably, the α-amylase is a wheat-derived α-amylase.

【００１０】本発明の別の側面によれば、上記した本発
明のαアミラーゼ活性測定用液を用いる、αアミラーゼ
活性の測定方法が提供される。好ましくは、本発明のα
アミラーゼ活性の測定方法は、ｐ−ニトロフェノールで
標識したオリゴ糖基質およびαグルコシダーゼを含む分
析要素に、αアミラーゼを含有する本発明のαアミラー
ゼ活性測定用液を適用し、ｐ−ニトロフェノールの生成
速度を測定することを含む。According to another aspect of the present invention, there is provided a method for measuring α-amylase activity using the above-mentioned liquid for measuring α-amylase activity of the present invention. Preferably, the α of the present invention
The method for measuring amylase activity is to apply the liquid for measuring α-amylase activity of the present invention containing α-amylase to an analytical element containing an oligosaccharide substrate labeled with p-nitrophenol and α-glucosidase to produce p-nitrophenol. Includes measuring speed.

【００１１】[0011]

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様及び実施
方法について詳細に説明する。本発明のαアミラーゼ活
性測定用液は、チオ尿素またはＮ−メチルチオ尿素を含
むことを特徴とする。本発明のαアミラーゼ活性測定用
液を用いてαアミラーゼ活性を測定する場合には、先
ず、αアミラーゼを含有し、かつチオ尿素またはＮ−メ
チルチオ尿素を含む本発明のαアミラーゼ活性測定用液
を調製する。そして、このαアミラーゼ活性測定用液
を、ｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）を標識したオリゴ
糖基質と共役酵素であるαグルコシダーゼとを含む分析
要素に適用し、生成するＰＮＰの生成速度を測定するこ
とにより、αアミラーゼ活性を測定することができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Embodiments and methods for carrying out the present invention will be described in detail below. The liquid for measuring α-amylase activity of the present invention is characterized by containing thiourea or N-methylthiourea. When measuring the α-amylase activity using the liquid for measuring α-amylase activity of the present invention, first, the liquid for measuring α-amylase activity of the present invention containing α-amylase and containing thiourea or N-methylthiourea is used. Prepare. Then, the liquid for measuring α-amylase activity is applied to an analytical element containing an oligosaccharide substrate labeled with p-nitrophenol (PNP) and α-glucosidase which is a coupling enzyme, and the production rate of PNP produced is measured. Thus, α-amylase activity can be measured.

【００１２】本発明では、測定対象であるαアミラーゼ
を含むαアミラーゼ活性測定用液にチオ尿素またはＮ−
メチルチオ尿素を含めることにより、至適ｐＨが酸性側
にあるαアミラーゼの活性を高感度で測定することが可
能になることが判明した。チオ尿素またはＮ−メチルチ
オ尿素の濃度は、αアミラーゼの活性を高感度で測定で
きるように適宜設定することができるが、好ましくは、
１００ｍＭ以上のチオ尿素またはＮ−メチルチオ尿素を
含むことが好ましい。チオ尿素またはＮ−メチルチオ尿
素の濃度の上限値は特には限定されないが、一般的には
１０００ｍＭ程度である。In the present invention, the liquid for measuring α-amylase activity containing α-amylase to be measured is thiourea or N-
It was found that the inclusion of methylthiourea enables highly sensitive measurement of the activity of α-amylase having an optimum pH on the acidic side. The concentration of thiourea or N-methylthiourea can be appropriately set so that the activity of α-amylase can be measured with high sensitivity, but preferably,
It is preferable to contain 100 mM or more of thiourea or N-methylthiourea. The upper limit of the concentration of thiourea or N-methylthiourea is not particularly limited, but is generally about 1000 mM.

【００１３】チオ尿素の濃度の好ましい範囲としては、
１００ｍＭから１０００ｍＭ、より好ましくは１００か
ら８００ｍＭ、さらに好ましくは２００から８００ｍ
Ｍ、さらに好ましくは３００から８００ｍＭ、さらに好
ましくは４００から８００ｍＭ、特に好ましくは６００
から８００ｍＭである。The preferred range of thiourea concentration is as follows:
100 mM to 1000 mM, more preferably 100 to 800 mM, still more preferably 200 to 800 m
M, more preferably 300 to 800 mM, further preferably 400 to 800 mM, particularly preferably 600.
To 800 mM.

【００１４】Ｎ−メチルチオ尿素の濃度の好ましい範囲
としては、１００ｍＭから１０００ｍＭ、より好ましく
は１００から８００ｍＭ、さらに好ましくは２００から
８００ｍＭ、特に好ましくは３００から６００ｍＭであ
る。なお、本発明のαアミラーゼ活性測定用液には、チ
オ尿素またはＮ−メチルチオ尿素の他に、塩類としてＮ
ａＣｌおよびＣａＣｌ₂を含めることが好ましい。これ
らの塩類を添加することにより、αアミラーゼの安定化
と、活性測定の際の感度向上を図ることが可能になる。The preferred concentration range of N-methylthiourea is 100 mM to 1000 mM, more preferably 100 to 800 mM, further preferably 200 to 800 mM, and particularly preferably 300 to 600 mM. The liquid for measuring α-amylase activity of the present invention contains thiourea or N-methylthiourea as well as N as a salt.
It is preferred to include aCl and CaCl ₂ . By adding these salts, it becomes possible to stabilize α-amylase and improve the sensitivity during activity measurement.

【００１５】本発明のαアミラーゼ活性測定用液は、特
に、至適ｐＨが酸性側にあるαアミラーゼを測定するの
に適している。このようなαアミラーゼとしては、穀物
由来のαアミラーゼ（例えば、小麦や大麦などの麦類由
来のαアミラーゼ）などが挙げられる。The liquid for measuring α-amylase activity of the present invention is particularly suitable for measuring α-amylase having an optimum pH on the acidic side. Examples of such α-amylase include α-amylase derived from cereals (for example, α-amylase derived from wheat such as wheat and barley).

【００１６】本発明によれば、αアミラーゼ活性測定用
液を用いる、αアミラーゼ活性の測定方法が提供され
る。具体的には、ｐ−ニトロフェノールで標識したオリ
ゴ糖基質およびαグルコシダーゼを含む分析要素に、α
アミラーゼを含有する本発明のαアミラーゼ活性測定用
液を適用し、ｐ−ニトロフェノールの生成速度を測定す
ることによりαアミラーゼ活性を測定することができ
る。According to the present invention, there is provided a method for measuring α-amylase activity using a liquid for measuring α-amylase activity. Specifically, an analytical element containing an oligosaccharide substrate labeled with p-nitrophenol and an α-glucosidase is mixed with α
The α-amylase activity can be measured by applying the liquid for measuring α-amylase activity of the present invention containing amylase and measuring the production rate of p-nitrophenol.

【００１７】上記の測定方法で用いる分析要素として
は、乾式分析要素を用いてもよい。本発明で用いること
ができる乾式分析要素としては、支持体上に、少なくと
も、ｐ−ニトロフェノールで標識したオリゴ糖基質を含
む層と、αグルコシダーゼを含む層（以下、これらを試
薬層と称する場合がある）とを含む分析要素が挙げられ
る。あるいは、ｐ−ニトロフェノールで標識したオリゴ
糖基質とαグルコシダーゼとは同一の試薬層に含まれて
いてもよい。さらに、支持体と上記した試薬層との間に
は所望により、吸水層などを設けることもできる。As the analytical element used in the above measuring method, a dry analytical element may be used. Examples of the dry analytical element that can be used in the present invention include, on a support, at least a layer containing an oligosaccharide substrate labeled with p-nitrophenol and a layer containing α-glucosidase (hereinafter, referred to as a reagent layer). There are) and analysis elements including. Alternatively, the oligosaccharide substrate labeled with p-nitrophenol and the α-glucosidase may be contained in the same reagent layer. Further, if desired, a water absorbing layer or the like can be provided between the support and the above-mentioned reagent layer.

【００１８】本発明で用いることができる支持体として
は、光不透過性（不透明）、光半透過性（半透明）、光
透過性（透明）のいずれのものも用いることができる
が、一般的には光透過性で水不透過性の支持体が好まし
い。光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいの
ものはポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンなど
である。親水性層を強固に接着させるために、下塗り層
を設けたり、親水化処理を施したものを用いることが好
ましい。As the support which can be used in the present invention, any one of light opaque (opaque), light semi-transparent (semi-transparent) and light transmissive (transparent) can be used. From the standpoint of view, a light-permeable and water-impermeable support is preferred. Preferred materials for the light-transmitting water-impermeable support are polyethylene terephthalate, polystyrene and the like. In order to firmly adhere the hydrophilic layer, it is preferable to use an undercoat layer provided or subjected to a hydrophilic treatment.

【００１９】試薬層は、ｐ−ニトロフェノールで標識し
たオリゴ糖基質と、αグルコシダーゼとを含む。上述の
通り、これらの成分は同一の層に含めてもよいし、異な
る層として含めてもよい。試薬層の水浸透性を確保する
ためには、多孔性媒体からなる多孔性層とするか、親水
性ポリマーバインダーからなる層とするのが好ましい。
これら水浸透性層のうち、親水性ポリマーバインダーか
らなる連続層とするのが好ましい。The reagent layer contains an oligosaccharide substrate labeled with p-nitrophenol and α-glucosidase. As described above, these components may be included in the same layer or different layers. In order to ensure the water permeability of the reagent layer, it is preferable to use a porous layer made of a porous medium or a layer made of a hydrophilic polymer binder.
Of these water permeable layers, it is preferable to use a continuous layer made of a hydrophilic polymer binder.

【００２０】試薬層として多孔性層を用いる場合、その
多孔性媒体は繊維質であってもよいし、非繊維質であっ
てもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、
織物布地（例えば平織布地）、編物布地（例えばトリコ
ット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができ
る。非繊維質材料としては、特開昭４９−５３８８８等
に記載の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルタ
ー、特開昭４９−５３８８８、特開昭５５−９０８５９
（対応米国特許４，２５８，００１）、特開昭５８−７
０１６３（対応米国特許４，４８６，５３７）等に記載
の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有粒状構
造物層等のいずれでもよい。特開昭６１−４９５９（対
応欧州公開ＥＰ０１６６３６５Ａ）、特開昭６２−１１
６２５８、特開昭６２−１３８７５６（対応欧州公開Ｅ
Ｐ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５７（対
応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１
３８７５８（対応欧州公開ＥＰ０２２６４６５Ａ）等に
記載の部分接着された複数の多孔性層の積層物も好適で
ある。When a porous layer is used as the reagent layer, the porous medium may be fibrous or non-fibrous. Examples of the fibrous material include filter paper, non-woven fabric,
Woven fabrics (eg plain woven fabrics), knitted fabrics (eg tricot knitted fabrics), glass fiber filter paper and the like can be used. As the non-fibrous material, a membrane filter made of cellulose acetate or the like described in JP-A-49-53888 or the like, JP-A-49-53888, or JP-A-55-90859.
(Corresponding US Pat. No. 4,258,001), JP-A-58-7
Any of the continuous void-containing granular structure layers made of inorganic or organic fine particles described in 0163 (corresponding US Pat. No. 4,486,537) may be used. JP 61-4959A (corresponding European publication EP0166365A), JP 62-11
6258, JP-A-62-138756 (corresponding European publication E
P0226465A), JP-A-62-138757 (corresponding European publication EP 0226465A), JP-A-62-1.
Laminates of a plurality of partially bonded porous layers, such as those described in 38758 (corresponding European publication EP 0226465A), are also suitable.

【００２１】多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例
した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する
展開層であってもよい。展開層としては、これらのうち
織物布地、編物布地などが好ましい。織物布地などは特
開昭５７−６６３５９号に記載されたようなグロー放電
処理をしてもよい。展開層には、展開面積、展開速度等
を調節するため、特開昭６０−２２２７７０（対応：Ｅ
Ｐ０１６２３０１Ａ）、特開昭６３−２１９３９７（対
応***特許公開ＤＥ３７１７９１３Ａ）、特開昭６３−
１１２９９９（対応：ＤＥ３７１７９１３Ａ）、特開昭
６２−１８２６５２ （対応：ＤＥ３７１７９１３Ａ）
に記載したような親水性高分子あるいは界面活性剤を含
有させてもよい。The porous layer may be a spreading layer having a so-called metering action, which spreads the liquid in an area approximately proportional to the amount of the liquid supplied. Of these, woven fabric, knitted fabric and the like are preferable as the spreading layer. Textile fabrics and the like may be subjected to glow discharge treatment as described in JP-A-57-66359. In order to control the spreading area, the spreading speed, etc., the spreading layer is disclosed in JP-A-60-222770 (corresponding: E
P0162301A), JP-A-63-219397 (corresponding West German patent publication DE 3717913A), JP-A-63-
112999 (correspondence: DE3717913A), JP-A-62-182652 (correspondence: DE3717913A)
The hydrophilic polymer or the surfactant as described in 1. may be contained.

【００２２】例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等
に本発明の試薬を予め含浸又は塗布した後、支持体上に
設けた他の水浸透性層の上に、特開昭55-164356 号のよ
うな方法で接着させるのも有用な方法である。For example, after pre-impregnating or coating the reagent of the present invention on a paper, cloth, a porous membrane made of a polymer or the like, another water-permeable layer provided on a support is used, and then the method disclosed in JP-A-55- Bonding by a method such as 164356 is also a useful method.

【００２３】こうして作られる試薬層の厚さは特に制限
されないが、塗布層として設ける場合には、１μｍ〜50
μｍ程度、好ましくは2 μｍ〜30μｍの範囲が適当であ
る。ラミネートによる積層など、塗布以外の方法による
場合、厚さは数十μｍから数百μｍの範囲で大きく変化
し得る。The thickness of the reagent layer thus prepared is not particularly limited, but when it is provided as a coating layer, it ranges from 1 μm to 50 μm.
A range of about μm, preferably 2 μm to 30 μm is suitable. In the case of a method other than coating, such as laminating by laminating, the thickness can greatly change in the range of several tens μm to several hundreds μm.

【００２４】親水性ポリマーバインダーからなる水浸透
性層で試薬層を構成する場合、使用できる親水性ポリマ
ーとしては、例えば、以下のものがある。ゼラチン及び
これらの誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロー
ス誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガ
ロース、アルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合
体、メタアクリルアミド共重合体、アクリルアミド又は
メタアクリルアミドと各種ビニル性モニマーとの共重合
体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナ
トリウム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重
合体などである。When the reagent layer is composed of a water-permeable layer composed of a hydrophilic polymer binder, examples of hydrophilic polymers that can be used include the following. Gelatin and derivatives thereof (eg phthalated gelatin), cellulose derivatives (eg hydroxyethyl cellulose), agarose, sodium alginate, acrylamide copolymers, methacrylamide copolymers, acrylamide or copolymers of methacrylamide with various vinylic monmers. , Polyhydroxyethyl methacrylate, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium polyacrylate, copolymers of acrylic acid with various vinylic monomers, and the like.

【００２５】親水性ポリマーバインダーで構成される試
薬層は、特公昭５３−２１６７７号（対応米国特許３，
９９２，１５８）、特開昭５５−１６４３５６号（対応
米国特許４，２９２，２７２）、特開昭５４−１０１３
９８号（対応米国特許４，１３２，５２８）、特開昭６
１−２９２０６３号（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａ
ｃｔｓ，１０６：２１０５６７ｙ）等の明細書に記載の
方法に従って、基質その他の試薬組成物と親水性ポリマ
ーを含む水溶液又は水分散液を支持体又は検出層等の他
の層の上に塗布し乾燥することにより設けることができ
る。A reagent layer composed of a hydrophilic polymer binder is disclosed in Japanese Patent Publication No. 53-21677 (corresponding to US Pat.
992,158), JP-A-55-164356 (corresponding US Pat. No. 4,292,272), JP-A-54-1013.
No. 98 (corresponding US Pat. No. 4,132,528), JP-A-6
No. 1-292063 (Chemical Abstra
cts, 106 : 210567y) and the like, an aqueous solution or aqueous dispersion containing a substrate or other reagent composition and a hydrophilic polymer is applied onto a support or another layer such as a detection layer and dried. Can be provided.

【００２６】親水性ポリマーをバインダーとする試薬層
の乾燥時厚さは約２μm 〜約５０μm 、好ましくは約４
μm〜約３０μmの範囲、被覆量では約２g/m²〜約５０g/
m²、好ましくは約４g/m²〜約３０g/m²の範囲である。The dry thickness of the reagent layer containing a hydrophilic polymer as a binder is about 2 μm to about 50 μm, preferably about 4 μm.
The range of μm to about 30 μm, the coating amount is about 2 g / m ² to about 50 g /
m ² , preferably in the range of about 4 g / m ² to about 30 g / m ² .

【００２７】試薬層には、ｐ−ニトロフェノールで標識
したオリゴ糖基質およびαグルコシダーゼ以外に、塗布
特性、拡散性化合物の拡散性、反応性、保存性等の諸性
能の向上を目的として、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤組成
物、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるいは無機
物からなる各種添加剤を加えることができる。試薬層に
含有させることができる緩衝剤の例としては、日本化学
会編「化学便覧 基礎編」（東京、丸善（株）、1966年
発行）1312-1320 頁、R.M.C.Dawson et al編、「Data f
or Biochemical Research」第２版(Oxford at the Clar
endon Press,1969年発行) 476-508 頁、「Biochemistr
y」 5,467-477頁 (1966年) 、Analytical Biochemistr
y」 104,300-310 頁 (1980年) に記載のｐＨ緩衝剤系が
ある。ｐＨ緩衝剤の具体例として硼酸塩を含む緩衝剤；
クエン酸又はクエン酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む
緩衝剤；ビシン(Bicine)を含む緩衝剤；HEPES を含む緩
衝剤；MES を含む緩衝剤などのグッド緩衝剤等がある。In addition to the oligosaccharide substrate labeled with p-nitrophenol and α-glucosidase, the reagent layer has an interface for the purpose of improving various properties such as coating properties, diffusibility of diffusible compounds, reactivity, and storability. An activator, a pH buffer composition, a fine powder, an antioxidant, and various additives made of organic or inorganic substances can be added. Examples of buffers that can be contained in the reagent layer include “Chemical Handbook Basic Edition” edited by The Chemical Society of Japan (Tokyo, Maruzen Co., Ltd., 1966), 1312-1320, RMCDawson et al, “Data f.
or Biochemical Research "Second Edition (Oxford at the Clar
(Endon Press, published in 1969) pp. 476-508, `` Biochemistr
y '' 5 , pp. 467-477 (1966), Analytical Biochemistr
y ” 104 , 300-310 (1980). A buffer containing borate as a specific example of the pH buffer;
Examples include buffers containing citric acid or citrate; buffers containing glycine; buffers containing Bicine; buffers containing HEPES; Good buffers such as buffers containing MES.

【００２８】本発明で用いることができる乾式分析要素
は、例えば、特開昭４９−５３８８８号（対応米国特許
３，９９２，１５８）、特開昭５１−４０１９１号（対
応米国特許４，０４２，３３５）、及び特開昭５５−１
６４３５６号（対応米国特許４，２９２，２７２）、特
開昭６１−４９５９（対応ＥＰＣ公開特許０１６６３６
５Ａ）などの各明細書に記載の方法に準じて調製するこ
とができる。The dry analytical element which can be used in the present invention is, for example, JP-A-49-53888 (corresponding US Pat. No. 3,992,158) or JP-A-51-40191 (corresponding US Pat. 335), and JP-A-55-1.
No. 64356 (corresponding U.S. Pat. No. 4,292,272), Japanese Patent Laid-Open No. 61-4959 (corresponding EPC published patent 016636)
It can be prepared according to the method described in each specification such as 5A).

【００２９】本発明で用いることができる分析要素は一
辺約10mmから約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形
等の小片に裁断し、特公昭５７−２８３３１（対応米国
特許４，１６９，７５１）、実開昭５６−１４２４５４
（対応米国特許４，３８７，９９０）、特開昭５７−６
３４５２、実開昭５８−３２３５０、特表昭５８−５０
１１４４（対応国際公開ＷＯ８３／００３９１）等に記
載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いる
ことが、製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で
好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセッ
トまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片を開口の
あるカードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断
した小片をそのまま用いることなどもできる。The analytical element which can be used in the present invention is cut into a small piece such as a square having a side of about 10 mm to about 30 mm or a circle of about the same size, and is disclosed in Japanese Examined Patent Publication No. 57-28331 (corresponding to US Pat. Actual exploitation Sho 56-142454
(Corresponding US Pat. No. 4,387,990), JP-A-57-6
3452, Actual Development Sho 58-32350, Special Table Sho 58-50
It is preferable to use it as a chemical analysis slide by accommodating it in a slide frame described in 1144 (corresponding international publication WO83 / 00391) from the viewpoints of production, packaging, transportation, storage, measurement operation and the like. Depending on the purpose of use, the tape may be stored in a cassette or a magazine in the form of a long tape, or the pieces may be attached or stored on a card having an opening, or the cut pieces may be used as they are.

【００３０】本発明の分析方法を用いることにより、液
体試料中の被検物であるαアミラーゼ活性を測定するこ
とができる。例えば約２μL〜約30μL、好ましくは４μ
L〜15μL の範囲の試料（αアミラーゼを含む本発明の
αアミラーゼ活性測定用液）を試薬層に点着する。点着
した分析要素を約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度
で、好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の温度で１
〜１０分間インキュベーションする。分析要素内の発色
又は変色を測定することによりαアミラーゼ活性を測定
することができる。点着する液体試料の量、インキュベ
ーション時間及び温度を一定にすることにより定量分析
を高精度に実施することもできる。以下の実施例により
本発明をより具体的に説明するが、以下の実施例は本発
明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定す
るものではない。By using the analysis method of the present invention, the α-amylase activity which is the test substance in the liquid sample can be measured. For example, about 2 μL to about 30 μL, preferably 4 μL
A sample in the range of L to 15 μL (the liquid for measuring α-amylase activity of the present invention containing α-amylase) is spotted on the reagent layer. Apply the spotted analytical element at a constant temperature in the range of about 20 ° C. to about 45 ° C., preferably at a temperature in the range of about 30 ° C. to about 40 ° C.
Incubate for 10 minutes. The α-amylase activity can be measured by measuring the color development or discoloration in the analytical element. Quantitative analysis can be performed with high accuracy by keeping the amount of the liquid sample spotted, the incubation time and the temperature constant. The present invention will be described more specifically by the following examples, but the following examples are for illustrating the present invention and not for limiting the scope of the present invention.

【００３１】[0031]

【実施例】実施例１：αアミラーゼ活性測定用の乾式分
析要素の作製 ゼラチンで下塗りした１８０μｍのポリエチレンテレフ
タレート無色透明平滑フィルムに下記組成の水溶液（ｐ
Ｈ＝６．５）を、乾燥後の厚さが１４μｍになるように
塗布し、乾燥した。 ゼラチン １４．０ｇ／ｍ² ＨＥＰＥＳ ０．７ ｇ／ｍ² 界面活性剤 ０．５ ｇ／ｍ² ここで、界面活性剤は、ポリオキシ（２−ヒドロキシ）
プロピレンノニルフェニルエーテル（Surfactant 10G、
オーリン社製）を用いた。ＨＥＰＥＳは、Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸を示
す。EXAMPLES Example 1 Preparation of Dry Analytical Element for Measuring α-Amylase Activity A 180 μm polyethylene terephthalate colorless transparent smooth film undercoated with gelatin was mixed with an aqueous solution (p
H = 6.5) was applied so that the thickness after drying would be 14 μm, and dried. Gelatin 14.0 g / m ² HEPES 0.7 g / m ² Surfactant 0.5 g / m ² Here, the surfactant is polyoxy (2-hydroxy).
Propylene nonyl phenyl ether (Surfactant 10G,
Aurin Co.) was used. HEPES indicates N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid.

【００３２】次に、上記フィルム上に約３０ｇ／ｍ²の
供給量で水を全面に供給して湿潤させた後、５０デニー
ル相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を３６ゲー
ジ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積
層し、乾燥させた。上記の布地上に下記組成の水溶液
（ｐＨ６．５）を塗布、乾燥した。Next, water was supplied to the entire surface of the film at a supply rate of about 30 g / m ² to wet it, and then a tricot knitted fabric made of 36 gauge knitted polyethylene terephthalate spun yarn equivalent to 50 denier was lightly pressed. The layers were laminated with each other and dried. An aqueous solution (pH 6.5) having the following composition was applied to the above cloth and dried.

【００３３】 ポリビニルピロリドン ４．４ｇ／ｍ² ＨＥＰＥＳ ６．４ｇ／ｍ² ＢＧ７−ＰＮＰ ２．７ｇ／ｍ² 界面活性剤 １．７ｇ／ｍ² ここで、ＢＧ７−ＰＮＰは、４，６−エチリデン−４−
ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシドを示す。Polyvinylpyrrolidone 4.4 g / m ² HEPES 6.4 g / m ² BG7-PNP 2.7 g / m ² Surfactant 1.7 g / m ² Here, BG7-PNP is 4,6-ethylidene- 4-
1 shows nitrophenyl-α-D-maltoheptaoside.

【００３４】さらに、下記組成の水溶液（ｐＨ＝６．
５）を塗布、乾燥し、一体型多層分析要素を作製した。 ポリビニルピロリドン ３．９ｇ／ｍ² ＨＥＰＥＳ １．７ｇ／ｍ² αグルコシダーゼ １２０．０ＫＵ／ｍ² 界面活性剤 ２．０ｇ／ｍ² 上記の一体型多層分析要素を１２ｍｍ×１３ｍｍ四方の
チップに切断し、スライド枠（特開昭５７−６３４５２
号公報に記載）に収めて、αアミラーゼ分析用乾式分析
要素を作製した。Further, an aqueous solution having the following composition (pH = 6.
5) was applied and dried to prepare an integrated multilayer analytical element. Polyvinylpyrrolidone 3.9 g / m ² HEPES 1.7 g / m ² α-glucosidase 120.0 KU / m ² Surfactant 2.0 g / m ^{2 The} above integrated multilayer analytical element was cut into a 12 mm × 13 mm square chip, Slide frame (JP-A-57-63452)
(Described in Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2004-242242), a dry analytical element for α-amylase analysis was prepared.

【００３５】実施例２：チオ尿素濃度とαアミラーゼ活
性の関係 （試料の調製）０．５％ＢＳＡ（Bovine Serum Albumi
n）、８５．６ｍＭのＮａＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ₂
及び４００Ｕ／Ｌのαアミラーゼ（Barley Malt由来）
を含む液に、チオ尿素を０、１００、２００、３００、
４００、６００、又は８００ｍＭとなるように添加し
た。Example 2: Relationship between thiourea concentration and α-amylase activity (preparation of sample) 0.5% BSA (Bovine Serum Albumi)
n), 85.6 mM NaCl, 1.8 mM CaCl ₂
And 400 U / L α-amylase (from Barley Malt)
Thiourea in a liquid containing 0, 100, 200, 300,
It was added to 400, 600, or 800 mM.

【００３６】（測定）実施例１で作製した乾式分析要素
に、上記試料を１０μｌ点着し、３７℃でインキュベー
ション後、２．５分と５．０分の反射ＯＤの差をΔＯＤ
ｔとした。測定結果を表１に示す。表１の右欄の値は、
チオ尿素を添加しない場合の感度ΔＯＤｔを１００とし
た場合の相対値を示す。(Measurement) 10 μl of the above sample was spotted on the dry analytical element prepared in Example 1, and after incubation at 37 ° C., the difference in reflection OD between 2.5 minutes and 5.0 minutes was calculated by ΔOD.
t. The measurement results are shown in Table 1. The values in the right column of Table 1 are
The relative value when the sensitivity ΔODt when thiourea is not added is 100 is shown.

【００３７】[0037]

【表１】表１：チオ尿素濃度と感度（ΔＯＤｔ）チオ尿素の濃度 ΔＯＤｔ ％ ０ ０．０１９１ １００ １００ ０．０２５１ １３２ ２００ ０．０２６６ １３９ ３００ ０．０２８０ １４６ ４００ ０．０２９２ １５３ ６００ ０．０３０４ １５９８００ ０．０３０３ １５９ [Table 1] Table 1: Thiourea concentration and sensitivity (ΔODt) Thiourea concentration ΔODt% 0 0.0191 100 100 0.0251 132 200 200 0.0266 139 300 0.0280 146 400 0.0292 153 600 0.0304 159 800 0.0303 159

【００３８】表１の結果より、チオ尿素の添加によりα
アミラーゼ活性測定の感度が向上することが分かる。特
に、６００ｍＭまたは８００ｍＭのチオ尿素の添加によ
りαアミラーゼ活性測定の感度は約１．６倍に向上し
た。From the results shown in Table 1, the addition of thiourea causes α
It can be seen that the sensitivity of amylase activity measurement is improved. In particular, the addition of 600 mM or 800 mM thiourea improved the sensitivity of α-amylase activity measurement by about 1.6 times.

【００３９】実施例３：Ｎ−メチルチオ尿素濃度とαア
ミラーゼ活性の関係 （試料の調製）０．５％ＢＳＡ（Bovine Serum Albumi
n）、８５．６ｍＭのＮａＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ₂
及び４００Ｕ／Ｌのαアミラーゼ（Barley Malt由来）
を含む液に、Ｎ−メチルチオ尿素を０、１００、２０
０、３００、４００、６００、又は８００ｍＭとなるよ
うに添加した。Example 3: Relationship between N-methylthiourea concentration and α-amylase activity (preparation of sample) 0.5% BSA (Bovine Serum Albumi)
n), 85.6 mM NaCl, 1.8 mM CaCl ₂
And 400 U / L α-amylase (from Barley Malt)
N-methylthiourea was added to the liquid containing 0, 100, 20
It was added at 0, 300, 400, 600, or 800 mM.

【００４０】（測定）実施例１で作製した乾式分析要素
に、上記試料を１０μｌ点着し、３７℃でインキュベー
ション後、２．５分と５．０分の反射ＯＤの差をΔＯＤ
ｔとした。測定結果を表２に示す。表２の右欄の値は、
Ｎ−メチルチオ尿素を添加しない場合の感度ΔＯＤｔを
１００とした場合の相対値を示す。(Measurement) 10 μl of the above sample was spot-coated on the dry analytical element prepared in Example 1, and after incubation at 37 ° C., the difference in reflection OD between 2.5 minutes and 5.0 minutes was calculated by ΔOD.
t. The measurement results are shown in Table 2. The values in the right column of Table 2 are
The relative value when the sensitivity ΔODt in the case where N-methylthiourea is not added is 100 is shown.

【００４１】[0041]

【表２】表２：Ｎ−メチルチオ尿素濃度と感度（ΔＯＤ
ｔ）Ｎ−メチルチオ尿素の濃度 ΔＯＤｔ ％ ０ ０．０２２７ １００ １００ ０．０２４１ １０６ ２００ ０．０２５８ １１４ ３００ ０．０２６７ １１８ ４００ ０．０２６４ １１６ ６００ ０．０２６５ １１７８００ ０．０２５１ １１１ [Table 2] Table 2: N-methylthiourea concentration and sensitivity (ΔOD
t) N-Methylthiourea concentration ΔODt% 0 0.0227 100 100 0.0241 106 200 0.0258 114 300 300 0.0267 118 400 0.0264 116 600 0.0265 117 117 800 0.0251 111

【００４２】表２の結果より、Ｎ−メチルチオ尿素の添
加によりαアミラーゼ活性測定の感度が向上することが
分かる。特に、３００ｍＭのチオ尿素の添加によりαア
ミラーゼ活性測定の感度は約１．２倍に向上した。From the results in Table 2, it can be seen that the addition of N-methylthiourea improves the sensitivity of α-amylase activity measurement. In particular, the addition of 300 mM thiourea improved the sensitivity of α-amylase activity measurement about 1.2 times.

【００４３】[0043]

【発明の効果】本発明のαアミラーゼ活性測定用液を用
いることにより、至適ｐＨが酸性側にあるαアミラーゼ
の活性を高感度で測定することが可能になる。By using the liquid for measuring α-amylase activity of the present invention, it becomes possible to measure the activity of α-amylase having an optimum pH on the acidic side with high sensitivity.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G042 AA04 BD19 CB03 DA08 DA10 FA02 FA07 FA11 FA17 FA20 FB07 FC03 GA01 GA04 HA07 2G054 AA02 AB03 CA28 EA06 EB01 GA03 GB01 GE00 4B063 QA01 QQ35 QQ61 QR41 QR57 QX01    ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    F term (reference) 2G042 AA04 BD19 CB03 DA08 DA10                       FA02 FA07 FA11 FA17 FA20                       FB07 FC03 GA01 GA04 HA07                 2G054 AA02 AB03 CA28 EA06 EB01                       GA03 GB01 GE00                 4B063 QA01 QQ35 QQ61 QR41 QR57                       QX01

Claims (7)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 チオ尿素またはＮ−メチルチオ尿素を含
む、αアミラーゼ活性測定用液。1. A liquid for measuring α-amylase activity, which comprises thiourea or N-methylthiourea. 【請求項２】 １００ｍＭ以上のチオ尿素またはＮ−メ
チルチオ尿素を含む、請求項１に記載のαアミラーゼ活
性測定用液。2. The liquid for measuring α-amylase activity according to claim 1, which contains 100 mM or more of thiourea or N-methylthiourea. 【請求項３】 １００ｍＭから１０００ｍＭのチオ尿素
またはＮ−メチルチオ尿素を含む、請求項１または２に
記載のαアミラーゼ活性測定用液。3. The liquid for measuring α-amylase activity according to claim 1, which contains 100 mM to 1000 mM thiourea or N-methylthiourea. 【請求項４】 αアミラーゼが穀物由来のαアミラーゼ
である、請求項１から３の何れかに記載のαアミラーゼ
活性測定用液。4. The α-amylase activity measurement liquid according to claim 1, wherein the α-amylase is a grain-derived α-amylase. 【請求項５】 αアミラーゼが麦類由来のαアミラーゼ
である、請求項１から４の何れかに記載のαアミラーゼ
活性測定用液。5. The liquid for measuring α-amylase activity according to claim 1, wherein the α-amylase is a wheat-derived α-amylase. 【請求項６】 請求項１から５の何れかに記載のαアミ
ラーゼ活性測定用液を用いる、αアミラーゼ活性の測定
方法。6. A method for measuring α-amylase activity, which uses the liquid for measuring α-amylase activity according to claim 1. 【請求項７】 ｐ−ニトロフェノールで標識したオリゴ
糖基質およびαグルコシダーゼを含む分析要素に、αア
ミラーゼを含有する請求項１から４の何れかに記載のα
アミラーゼ活性測定用液を適用し、ｐ−ニトロフェノー
ルの生成速度を測定することを含む、請求項６に記載の
αアミラーゼ活性の測定方法。7. The α according to claim 1, wherein the analytical element containing an oligosaccharide substrate labeled with p-nitrophenol and α-glucosidase contains α-amylase.
The method for measuring α-amylase activity according to claim 6, which comprises applying a solution for measuring amylase activity and measuring the production rate of p-nitrophenol.