JP2003189899A - Snp discrimination method and sensor for snp site discrimination - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an SNP site discrimination method that can simply discrimi nate the SNP site of a target single strand nucleic acid with high sensitivity and provide a sensor for SNP site discrimination. <P>SOLUTION: This is a sensor for discriminating the SNP site of a target single strand nucleic acid, and has a single strand nucleic acid probe that can hybridize with the peptide sequence immediately downstream of the SNP site and a base plate where the 5'-terminus of the probe is fixed to the base plate. This SNP site discrimination method comprises a step where the target single strand nucleic acid, a single strand nucleic acid probe that is hybridiazed with the nucleotide sequence on the downstream of the SNP site are allowed to react with the 5'-terminus that is fixed to the base plate, in the presence of at least one labeled ddNTP and the DNA polymerase, a step where unreacting labeled ddNTP is removed, a step where the label is detected and a step where the SNP site is discriminated by the detected labels. <P>COPYRIGHT: (C)2003,JPO

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ＳＮＰを（Ｓｉｎ
ｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉ
ｓｍ）判別するための判別方法、およびＳＮＰ判別用セ
ンサに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to SNP (Sin
gle Nucleotide Polymorphi
sm) Discrimination method for discrimination and SNP discrimination sensor.

【０００２】[0002]

【従来の技術】平成１３年２月に米国のベンチャー企業
セレーラ社と国際ヒトゲノムプロジェクトからヒトゲノ
ムのドラフトシークエンスが公開された。このことは、
特に医療の分野において非常に重要な出来事であること
には違いないが、その結果が直ちに我々の生活や医療に
おいて活かされるわけではない。即ちドラフトシークエ
ンス完了は、あくまでもおおまかにヒトゲノム配列を決
定したに過ぎず、個々の遺伝子機能の解明や、あるいは
それらに基づく様々な病気のメカニズムの解明は今後の
大きな課題である。そのような現状において、現在最も
注目されているのがＤＮＡのＳＮＰである。2. Description of the Related Art In February 2001, a draft sequence of the human genome was published by the American venture company Serera and the International Human Genome Project. This is
It must be a very important event, especially in the medical field, but the results are not immediately useful in our lives and medical care. In other words, the completion of the draft sequence has only roughly determined the human genome sequence, and the elucidation of individual gene functions and the elucidation of the mechanisms of various diseases based on them will be a major issue in the future. Under such circumstances, the SNP of DNA is currently receiving the most attention.

【０００３】ＳＮＰはＤＮＡ配列中に見られる多型のう
ちでもっともよく見られ、数百〜一千塩基対に一箇所の
割合で存在していると推測されている。ＳＮＰは疾患易
罹患性や薬剤反応性に関連する遺伝子を探索する際の非
常に有用な多型マーカーであるが、中にはＳＮＰ自身が
遺伝子発現調節に影響を及ぼしたり、あるいはＳＮＰに
よるアミノ酸変化がそのタンパク質の働きに影響を与
え、その結果が他の遺伝子産物の質的異常や量異常につ
ながる場合がある。このような場合、ＳＮＰそのものを
病気のかかりやすさの診断や、あるいは特定の薬剤に対
する応答性の違いや、副作用の違いの判定に利用するこ
とができる。従ってＳＮＰの探索や研究を行うことは非
常に有用であり、現在わが国では、特に五大疾患に関連
するＳＮＰの探索・研究が盛んに行われている。 そし
てこのような研究結果が３〜５年後において実際の医療
に利用され始め、臨床の場等で我々自身のＳＮＰが診断
されるようになると考えられている。[0003] SNPs are the most common polymorphisms found in DNA sequences, and it is speculated that SNPs exist at a position of several hundred to one thousand base pairs. SNP is a very useful polymorphic marker when searching for genes associated with disease susceptibility or drug responsiveness, but some SNPs themselves influence gene expression regulation, or amino acid changes caused by SNPs. Influences the function of the protein, and the result may lead to qualitative abnormalities or abnormal amounts of other gene products. In such a case, the SNP itself can be used for diagnosing the susceptibility to diseases, or for determining the difference in responsiveness to a specific drug or the difference in side effects. Therefore, it is very useful to search and research SNPs, and in Japan, SNPs related to the five major diseases are currently being actively researched and researched. It is considered that such research results will start to be used in actual medical treatment after 3 to 5 years, and our own SNP will be diagnosed in clinical situations.

【０００４】ＳＮＰの判定方法として現在次のような方
法が提案されている。The following methods are currently proposed as SNP determination methods.

【０００５】Ｐｕｉ−Ｙａｎ Ｋｗｏｋらは、標的一本
鎖核酸の３’側からＳＮＰ部位直前のヌクレオチドまで
のある領域にハイブリダイズ可能であり、かつある種の
蛍光標識が施されたＤｙｅ−ｐｒｉｍｅｒと、塩基の種
類によって異なる蛍光標識で標識された標識ｄｄＮＴＰ
を用いる方法を提案している。この方法はＤｙｅ−ｐｒ
ｉｍｅｒの蛍光標識と標識ｄｄＮＴＰの蛍光標識間の蛍
光エネルギー移動を利用している。その概念図を図１に
示す。Pui-Yan Kwok et al. And Dye-primer capable of hybridizing to a region from the 3'side of the target single-stranded nucleic acid to the nucleotide immediately before the SNP site and having a fluorescent label of a certain type. , Labeled ddNTP labeled with a fluorescent label that varies depending on the type of base
Is proposed. This method is Dye-pr
The fluorescence energy transfer between the fluorescent label of the imer and the fluorescent label of the labeled ddNTP is used. The conceptual diagram is shown in FIG.

【０００６】図１は標的一本鎖核酸におけるＳＮＰ部位
の塩基がチミンかグアニンの可能性があり、左側はチミ
ンである場合、そして右側はグアニンである場合を示し
ている。FIG. 1 shows that the base of the SNP site in the target single-stranded nucleic acid may be thymine or guanine, where the left side is thymine and the right side is guanine.

【０００７】図１に示されるように、ＰＣＲ等で増幅さ
れた標的一本鎖核酸（１）を、上記Ｄｙｅ−ｐｒｉｍｅ
ｒ（２）およびに互いに異なる蛍光標識（５、７）で標
識されたｄｄＡＴＰ（４）およびｄｄＣＴＰ（６）、お
よびＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８）と反応させ
る。この結果、標的一本鎖核酸（１）のＳＮＰ部位（図
１中標的一本鎖の中央にＴまたはＧで示される）のヌク
レオチド種と対応する種類の標識ｄｄＮＴＰが、ホスホ
ジエステル結合により特異的にＤｙｅ−ｐｒｉｍｅｒに
結合する（図１の左側は標識ｄｄＡＴＰが付与され、そ
して右側は標識ｄｄＣＴＰが結合する）。従って、標的
一本鎖核酸のＳＮＰ部位のヌクレオチド種と対応する種
類の標識ｄｄＮＴＰはＤｙｅ−ｐｒｉｍｅｒと近距離に
存在しうるため、Ｄｙｅ−ｐｒｉｍｅｒからの蛍光エネ
ルギー移動を受けることができる（図１中の最下列に模
式的に示される）。As shown in FIG. 1, the target single-stranded nucleic acid (1) amplified by PCR or the like was added to the above-mentioned Dye-prime.
r (2) and ddATP (4) and ddCTP (6) labeled with mutually different fluorescent labels (5, 7), and DNA Polymerase (8). As a result, the type of labeled ddNTP corresponding to the nucleotide species of the SNP site (indicated by T or G in the center of the target single strand in FIG. 1) of the target single-stranded nucleic acid (1) is specific by phosphodiester bond. Bind to Dye-primer (labeled ddATP is attached on the left side of FIG. 1, and labeled ddCTP binds on the right side). Therefore, since the labeled ddNTP of the type corresponding to the nucleotide type of the SNP site of the target single-stranded nucleic acid can be present in a short distance from the Dye-primer, it can undergo fluorescence energy transfer from the Dye-primer (Fig. 1). Is schematically shown in the bottom row of).

【０００８】その一方、標的一本鎖核酸のＳＮＰ部位の
ヌクレオチド種と対応しない種類の標識ｄｄＮＴＰはＤ
ｙｅ−ｐｒｉｍｅｒに結合しない。そのためＤｙｅ−ｐ
ｒｉｍｅｒとの距離が離れているため蛍光エネルギー移
動を受けることはできない。ゆえに両者の蛍光強度の差
は大きく異なるようになり、ＳＮＰの判別が可能とな
る。On the other hand, the type of labeled ddNTP that does not correspond to the nucleotide species of the SNP site of the target single-stranded nucleic acid is D
Does not bind to ye-primer. Therefore Dye-p
It cannot receive fluorescence energy transfer because it is far from the trimer. Therefore, the difference between the fluorescence intensities of the two becomes largely different, and the SNP can be discriminated.

【０００９】[0009]

【発明が解決しようとする課題】上記従来の技術は、全
ての反応物質が反応液中において終始浮遊した状態で存
在する。従って、標的一本鎖核酸のＳＮＰ部位のヌクレ
オチド種と対応しない種類の標識ｄｄＮＴＰも最後の蛍
光検出の段階においても反応液中に存在してしまう。上
記従来の技術では、検出される蛍光とＳＮＰ部位のヌク
レオチド種とを対応させるために、Ｄｙｅ−ｐｒｉｍｅ
ｒにホスホジエステル結合により付与された標識ｄｄＮ
ＴＰの蛍光とを区別する手段として蛍光エネルギー移動
が利用される。In the above conventional technique, all the reactants exist in the reaction solution in a state of being suspended all the time. Therefore, a type of labeled ddNTP that does not correspond to the nucleotide type of the SNP site of the target single-stranded nucleic acid is also present in the reaction solution even at the final fluorescence detection step. In the conventional art, in order to correspond to the nucleotide species of fluorescence and SNP site to be detected, Dye-prime
Labeled ddN attached to r by a phosphodiester bond
Fluorescent energy transfer is used as a means to distinguish it from the fluorescence of TP.

【００１０】蛍光エネルギー移動を利用するため、Ｄｙ
ｅ−ｐｒｉｍｅｒは、標識ｄｄＮＴＰの蛍光標識と蛍光
エネルギー移動対を形成しうる蛍光標識で修飾されてい
る。蛍光エネルギー移動は、蛍光エネルギー移動対を形
成する蛍光標識間の距離に強く依存する。従って、Ｄｙ
ｅ−ｐｒｉｍｅｒは、高い効率で標的一本鎖核酸とハイ
ブリダイズ可能な配列からなり、かつ目的の標識ｄｄＮ
ＴＰと結合した際に、両蛍光標識間において十分蛍光エ
ネルギー移動が起こる部位に、蛍光標識が結合していな
ければならない。このような設計は非常に高度な知識が
要求され、適当な設計条件を得るまで多くの試行が必要
とされると考えられる。In order to utilize fluorescence energy transfer, Dy
The e-primer is modified with a fluorescent label capable of forming a fluorescent energy transfer pair with the fluorescent label of the labeled ddNTP. Fluorescent energy transfer strongly depends on the distance between fluorescent labels that form a fluorescent energy transfer pair. Therefore, Dy
The e-primer is composed of a sequence capable of hybridizing with the target single-stranded nucleic acid with high efficiency, and has the desired labeled ddN.
The fluorescent label must be bound to a site where sufficient fluorescence energy transfer occurs between both fluorescent labels when bound to TP. It is considered that such a design requires a very high level of knowledge, and many trials are required until an appropriate design condition is obtained.

【００１１】またさらにこの場合、利用可能な標識は、
エネルギー移動が利用できる蛍光物質に限られてしま
う。蛍光物質の検出には大掛かりで高価な機器を必要と
するため、上記従来技術を利用できる場所や施設は限ら
れたものとなってしまう。Still further in this case, the available labels are:
Energy transfer is limited to fluorescent materials that can be used. Since a large-scale and expensive device is required for detecting the fluorescent substance, the places and facilities where the above-mentioned conventional technique can be used are limited.

【００１２】本発明は上記課題の解決を意図するもので
あって、蛍光エネルギー移動を利用せずに核酸のＳＮＰ
を判別する方法および判別センサを提供することを目的
とする。[0012] The present invention is intended to solve the above-mentioned problems, and does not utilize fluorescence energy transfer to SNP nucleic acids.
An object of the present invention is to provide a method and a discrimination sensor for discriminating.

【００１３】[0013]

【課題を解決するための手段】本発明は、標的一本鎖核
酸のＳＮＰ部位を判別するセンサに関し、このセンサ
は、ＳＮＰ部位のすぐ下流に位置するヌクレオチド配列
にハイブリダイズ可能な一本鎖核酸プローブ、および基
板とを備え、上記プローブの５’末端は基板に固定され
ている。The present invention relates to a sensor for discriminating the SNP site of a target single-stranded nucleic acid, which sensor is capable of hybridizing to a nucleotide sequence located immediately downstream of the SNP site. A probe and a substrate are provided, and the 5 ′ end of the probe is fixed to the substrate.

【００１４】上記基板はガラスまたは導電体であり得
る。The substrate may be glass or a conductor.

【００１５】本発明はまた、標的一本鎖核酸のＳＮＰ部
位を判別する方法に関し、この方法は、標的一本鎖核酸
と、上記ＳＮＰ部位のすぐ下流に位置するヌクレオチド
配列にハイブリダイズ可能な一本鎖核酸プローブであっ
て、その５’末端が基板に固定されたプローブとを、少
なくとも一種類の標識ｄｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメ
ラーゼの存在下で反応させる工程、未反応の標識ｄｄＮ
ＴＰを除去する工程、上記標識を検出する工程、および
検出された標識によって前記ＳＮＰ部位を判別する工程
を包含する。The present invention also relates to a method for discriminating the SNP site of a target single-stranded nucleic acid, which comprises a method capable of hybridizing a target single-stranded nucleic acid with a nucleotide sequence located immediately downstream of the SNP site. A step of reacting a double-stranded nucleic acid probe having a 5'end fixed to a substrate in the presence of at least one kind of labeled ddNTP and a DNA polymerase, unreacted labeled ddN
It includes a step of removing TP, a step of detecting the above label, and a step of discriminating the SNP site based on the detected label.

【００１６】上記ｄｄＮＴＰは、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴ
Ｐ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰからなる群から選択
され得る。The ddNTP is ddATP or ddCT.
It may be selected from the group consisting of P, ddGTP, and ddTTP.

【００１７】好ましくは、複数の種類の標識ｄｄＮＴＰ
が用いられ、各々の標識は互いに異なる。Preferably, a plurality of types of labeled ddNTP
Is used, and each label is different from each other.

【００１８】好ましくは、上記の方法は、標的一本鎖核
酸に非特異的に結合した標識ｄｄＮＴＰを除去する工程
をさらに包含する。Preferably, the above method further comprises the step of removing the labeled ddNTP non-specifically bound to the target single-stranded nucleic acid.

【００１９】好ましくは、上記除去する工程は、上記反
応させる工程の後に行なわれる。Preferably, the removing step is performed after the reacting step.

【００２０】好ましくは、上記除去する工程は、反応液
の温度を上昇させることによって行なわれる。Preferably, the removing step is performed by raising the temperature of the reaction solution.

【００２１】好ましくは、上記標識は蛍光物質または電
気化学的活性物質である。[0021] Preferably, the label is a fluorescent substance or an electrochemically active substance.

【００２２】[0022]

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て添付する図２および図３を用いて説明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Embodiments of the present invention will be described below with reference to FIGS.

【００２３】先ず本発明を構成するそれぞれの要素につ
いて説明する。First, each element constituting the present invention will be described.

【００２４】本発明における一本鎖核酸プローブ（１
０）は、図２に示すように、標的一本鎖核酸（２２）内
に存在し、その５’末端ヌクレオチドが標的一本鎖核酸
のＳＮＰ部位（２３）のヌクレオチドのすぐ下流に位置
する配列に対してハイブリダイズ可能である。そしてこ
の一本鎖核酸プローブ（１０）の５’末端は、図３に示
すように、基板（１１）に固定されている。The single-stranded nucleic acid probe (1
0) is a sequence existing in the target single-stranded nucleic acid (22) and having its 5'terminal nucleotide located immediately downstream of the nucleotide of the SNP site (23) of the target single-stranded nucleic acid, as shown in FIG. Can be hybridized to. The 5'end of the single-stranded nucleic acid probe (10) is fixed to the substrate (11) as shown in FIG.

【００２５】核酸プローブの固定化は、当該分野で公知
の方法によって行なわれる。例えば、（Ｉ）ガラス基板
の場合、ガラス表面をポリＬ−リシンコートやシラン化
などにより修飾を行った後（あるいは、市販のコート済
みスライドガラスを用いてもよい）、プローブを固定す
る：（ＩＩ）金基板の場合、プローブの５’末端をチオ
ール化した後、金基板表面上に固定する、などの方法が
採用され得る。Immobilization of the nucleic acid probe is performed by a method known in the art. For example, in the case of (I) glass substrate, the probe is immobilized after modifying the glass surface by poly L-lysine coating or silanization (or a commercially available coated slide glass may be used): ( II) In the case of a gold substrate, a method of thiolizing the 5 ′ end of the probe and then fixing the probe on the surface of the gold substrate can be employed.

【００２６】図示されるように、本発明においては、少
なくとも標的一本鎖核酸（２２）に存在すると予想され
るＳＮＰ部位（２３）のヌクレオチド種（図３に示され
る例ではＴ）と相補的な一種類以上のｄｄＮＴＰ種から
なる標識ｄｄＮＴＰ（図３に示される例では１４、１
６、１８）を用いる。As shown in the figure, in the present invention, at least complementary to the nucleotide species (T in the example shown in FIG. 3) of the SNP site (23) expected to be present in the target single-stranded nucleic acid (22). Labeled ddNTPs consisting of one or more ddNTP species (14, 1 in the example shown in FIG. 3).
6, 18) is used.

【００２７】通常、これら標識ｄｄＮＴＰは、同時に複
数種のｄｄＮＴＰ種が用いられる場合、その種類に応じ
て互いに異なる種類の標識を有するようにする。しか
し、特に判別すべきＳＮＰ部位のヌクレオチド種の種類
が二種類であると想定される場合は、一方のＳＮＰ部位
のヌクレオチド種に対応するｄｄＮＴＰ種を標識すれ
ば、他方のＳＮＰ部位のヌクレオチド種に対応するｄｄ
ＮＴＰ種は必ずしも標識されなくてよい。あるいは、他
方のＳＮＰ部位のヌクレオチド種に対応するｄｄＮＴＰ
種は用いられなくても構わない。即ち、標識が検出され
るか否かで、そのＳＮＰ部位のヌクレオチド種が判別す
べき二種類のどちらであるかを決定できるからである。Usually, when a plurality of types of ddNTP species are used at the same time, these labeled ddNTPs have different types of labels depending on their types. However, when it is assumed that there are two kinds of nucleotide species of the SNP site to be particularly distinguished, if the ddNTP species corresponding to the nucleotide species of one SNP site is labeled, the nucleotide species of the other SNP site becomes Corresponding dd
The NTP species does not necessarily have to be labeled. Alternatively, ddNTP corresponding to the nucleotide species of the other SNP site
The seed need not be used. That is, it is possible to determine whether the nucleotide species of the SNP site is the two types to be discriminated or not depending on whether or not the label is detected.

【００２８】上記基板としては、白金、白金黒、金、パ
ラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそ
れらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、グラ
シーカーボン、パイロリティックグラファイト、カ−ボ
ンペ−スト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素など
の導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコ
ン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表さ
れる半導体材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレ
ータ）などに代表されるこれら半導体材料の複合素材；
ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミク
ス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；
ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブ
チレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエス
テル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリ
デン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビ
ニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリ
ル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネー
ト、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキ
シ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共
重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合
体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなど
の有機材料；ノボラック樹脂をベース樹脂とするノボラ
ック樹脂−ジアゾナフトキノン（ＤＮＱ）系感光材料；
ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）およびＰＭＭＡ
との共重合体、ポリメチレンスルホン、ポリヘキサフル
オロブチルメタクリレート、ポリメチルイソプロペニル
ケトン（ＰＭＩＰＫ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤ
ＭＳ）；および環化ポリイソプレンをベースポリマーと
するアジド化合物、例えば、２−６−ジ（４−ジドベザ
ール）−４−メチルシクロヘキサノンなどから構成され
る感光材料群；を含むがこれらに限定されない材料が用
いられる。この中で、アモルファスシリコン、単結晶シ
リコン、またはガラスが基板材料として好適に用いられ
る。Examples of the substrate include noble metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten and their compounds, and graphite, glassy carbon, pyrolytic graphite, carbon paste, carbon. -A conductive material such as carbon typified by bon fiber; a semiconductor material typified by single crystal silicon, amorphous silicon, silicon carbide, silicon oxide, silicon nitride, typified by SOI (silicon on insulator), etc. Composite materials of these semiconductor materials;
Inorganic materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, ceramics, forsterite, and photosensitive glass;
Polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate , Polyamides, phenolic resins, urea resins, epoxy resins, melamine resins, styrene-acrylonitrile copolymers, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymers, polyphenylene oxide and polysulfones, and other organic materials; Naphthoquinone (DNQ) type photosensitive material;
Polymethylmethacrylate (PMMA) and PMMA
Copolymer with, polymethylene sulfone, polyhexafluorobutyl methacrylate, polymethylisopropenyl ketone (PMIPK), polydimethylsiloxane (PD
MS); and a photosensitive compound group consisting of an azide compound having cyclized polyisoprene as a base polymer, for example, 2-6-di (4-didobezar) -4-methylcyclohexanone and the like; Is used. Among these, amorphous silicon, single crystal silicon, or glass is preferably used as the substrate material.

【００２９】次に本発明における作業の手順について説
明する。標的核酸（２２）のＳＮＰ部位（２３）の塩基
はアデニン、チミン、シトシン、グアニンの全ての可能
性があり、図３では、実際の標的一本鎖核酸のＳＮＰ部
位がチミンである場合を一例として挙げている。Next, the work procedure in the present invention will be described. The base of the SNP site (23) of the target nucleic acid (22) may be any of adenine, thymine, cytosine, and guanine. In FIG. 3, an example is shown in which the SNP site of the actual target single-stranded nucleic acid is thymine. As.

【００３０】まず、標的一本鎖核酸（１２）を、一本鎖
核酸プローブ（１０）が固定された基板（１１）上にお
いて、標識（１５、１７、１９）を有するｄｄＮＴＰ
（１４、１６、１８）とともにＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（１３）と反応させる。このとき、用いるＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１３）が、特に一本鎖特異的
３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を有するもので
あれば、そのＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１３）を
基板上に加える前に標的一本鎖核酸（１２）を加えるの
が好ましい。そして、基板上の一本鎖核酸プローブ（１
０）と標的一本鎖核酸（１２）とのハイブリダイゼーシ
ョン反応を行った後に、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（１３）と標識ｄｄＮＴＰを加えるのが好ましい。何故
なら、この場合、ハイブリダイゼイズしていない状態の
標的一本鎖核酸（１２）とＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（１３）が同じ反応液中に存在していると、標的一本鎖
核酸（１２）がＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１３）
によって切断されてしまうからである。しかし、用いる
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１３）が、上記の一本
鎖特異的３’→５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を有し
ていなければそのような切断は起こらないため、標的一
本鎖核酸（１２）とＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１
３）と標識ｄｄＮＴＰを同時に基板上に加え、ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応をさせて構わない。First, a target single-stranded nucleic acid (12) is added to a substrate (11) on which a single-stranded nucleic acid probe (10) is immobilized, and ddNTP having a label (15, 17, 19) is added.
(14, 16, 18) with DNA Polymer
react with ase (13). DNA used at this time
If the Polymerase (13) has a single-strand-specific 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity, the target single-stranded nucleic acid (12) is added before the DNA Polymerase (13) is added onto the substrate. Is preferred. Then, the single-stranded nucleic acid probe (1
0) and the target single-stranded nucleic acid (12) are subjected to a hybridization reaction, and then DNA Polymerase
It is preferable to add (13) and labeled ddNTP. Because, in this case, the target single-stranded nucleic acid (12) and DNAPolymerase in a non-hybridized state are used.
When (13) is present in the same reaction solution, the target single-stranded nucleic acid (12) becomes DNA Polymerase (13).
It will be cut off by. However, if the DNA Polymerase (13) used does not have the above-mentioned single-strand-specific 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity, such cleavage will not occur, so the target single-stranded nucleic acid (12) and DNA Polymerase (12) (1
3) and labeled ddNTP are simultaneously added onto the substrate, and DNA is added.
A Polymerase reaction may be performed.

【００３１】なお、上記のＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ反応の条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８
９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙなどの実験書に記載される方法に従って、ある
いは準じて行なわれ、当業者に公知である。The above-mentioned DNA Polymers
The conditions of the e reaction are described in, for example, Sambrook et al. (198).
9) Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual, 2nd edition, volumes 1-3,
Cold Spring Harbor Labora
It is carried out according to or according to the method described in the experimental manuals such as Tory and is known to those skilled in the art.

【００３２】ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応の結
果、図３の場合、標的一本鎖核酸（１２）上において、
一本鎖核酸プローブ（１０）は、標的一本鎖核酸のＳＮ
Ｐ部位のチミンに対応する標識ｄｄＡＴＰとのみ結合す
る。As a result of the DNA Polymerase reaction, in the case of FIG. 3, on the target single-stranded nucleic acid (12),
The single-stranded nucleic acid probe (10) is an SN of the target single-stranded nucleic acid.
It only binds to the labeled ddATP corresponding to the P site thymine.

【００３３】上記反応後、基板（１１）を洗浄する。こ
れにより、標的一本鎖核酸（１２）のＳＮＰ部位のヌク
レオチド種と相補的でないために、一本鎖核酸プローブ
（１０）とホスホジエステル結合しなかった標識ｄｄＮ
ＴＰは排除される。After the above reaction, the substrate (11) is washed. As a result, a labeled ddN that did not form a phosphodiester bond with the single-stranded nucleic acid probe (10) because it was not complementary to the nucleotide species of the SNP site of the target single-stranded nucleic acid (12).
TP is eliminated.

【００３４】しかし、条件によっては、標的一本鎖核酸
（１２）のＳＮＰ部位ではない任意のヌクレオチドに対
して様々な種類の標識ｄｄＮＴＰがハイブリダイズし、
上記洗浄後も基板（１１）上に残ってしまう場合があ
る。このような場合は、以下に記す最終の検出の工程に
おいて、これら標識ｄｄＮＴＰの標識も検出されてしま
い正確な結果を与えなくなる。そのため、これら標識ｄ
ｄＮＴＰを、高温等の適当な変性条件にて標的一本鎖核
酸（１２）より分離した後、洗浄する必要がある。この
際、標的一本鎖核酸（１２）も同時に一本鎖核酸プロー
ブ（１０）から分離してしまっても検出には影響無いの
で構わない。However, depending on the conditions, various types of labeled ddNTPs hybridize to arbitrary nucleotides other than the SNP site of the target single-stranded nucleic acid (12),
After the cleaning, it may remain on the substrate (11). In such a case, in the final detection step described below, the label of these labeled ddNTPs is also detected and an accurate result cannot be obtained. Therefore, these signs d
It is necessary to separate dNTP from the target single-stranded nucleic acid (12) under an appropriate denaturing condition such as high temperature and then wash. At this time, even if the target single-stranded nucleic acid (12) is also separated from the single-stranded nucleic acid probe (10) at the same time, there is no influence on the detection, so it does not matter.

【００３５】上記の変性および洗浄の後、当業者に公知
の適切な方法を用いて一本鎖核酸プローブを介して基板
に連結された標識ｄｄＮＴＰの標識の検出が行われ、標
的一本鎖核酸のＳＮＰ部位の判別が行われる。After the denaturation and washing described above, the label of the labeled ddNTP linked to the substrate via the single-stranded nucleic acid probe is detected by using an appropriate method known to those skilled in the art, and the target single-stranded nucleic acid is detected. The SNP site of is determined.

【００３６】標識検出方法は、標識が蛍光物質であれば
光学的に行われ、標識が電気化学的に活性な物質であれ
ば電気化学的な方法を用いて行われる。このような検出
方法は当業者に公知である。The label detection method is carried out optically when the label is a fluorescent substance and electrochemically when the label is an electrochemically active substance. Such detection methods are known to those skilled in the art.

【００３７】[0037]

【実施例】（実施例１）以下に示すように、標的一本鎖
核酸として３０塩基からなるＴ１およびＴ２を用いた。
両者は、５’末端から数えて１０番目の塩基が異なる
（Ｔ１＝Ａ、Ｔ２＝Ｃ）以外は同じ配列を有している。
また標的一本鎖核酸Ｔ１およびＴ２の５’末端から数え
て１１番目の塩基から３０番目の塩基までの配列と相補
的な配列を核酸プローブとして用いた。 ＜標的一本鎖核酸Ｔ１＞ ５’ＧＣＴＣＣＡＧＴＧＡＣＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＴＡ
ＧＧＡＡＴＧＣ３’ ＜標的一本鎖核酸Ｔ２＞ ５’ＧＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＴＡ
ＧＧＡＡＴＧＣ３’ ＜核酸プローブ＞ ５’ＧＣＡＴＴＣＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＧＣＣＧ３’ 先ず、スライドガラス表面を従来方法に従って、ポリＬ
−リシンコートにより修飾した。次に、核酸プローブの
５’末端側を、この修飾したスライドガラス表面上に固
定した。標識ｄｄＮＴＰとして、蛍光物質ＦＡＭ（ｃａ
ｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ：カルボキシフルオ
レセイン）により標識されたｄｄＣＴＰ、蛍光物質Ｒ６
Ｇ（ｒｈｏｄａｍｉｎ６Ｇ：ローダミン６Ｇ）により標
識されたｄｄＡＴＰ、蛍光物質ＴＡＭＲＡ（ｃａｒｂｏ
ｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ：カルボ
キシテトラメチルローダミン）により標識されたｄｄＧ
ＴＰ、および蛍光物質ＲＯＸ（ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒ
ｈｏｄａｍｉｎｅ：カルボキシ−Ｘ−ローダミン）によ
り標識されたｄｄＴＴＰを含む混合物を用いた。 ＜標識ｄｄＮＴＰ＞ ＦＡＭ−ｄｄＣＴＰ、Ｒ６Ｇ−ｄｄＡＴＰ、ＴＡＭＲＡ
−ｄｄＧＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＴＴＰ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応には、宝酒造（株）製のＤＮ
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用
した。そのため先ず、１００ｐｍｏｌの標的一本鎖核酸
Ｔ１を５０ｕＬの滅菌蒸留水中に混合し、この試料液を
上記核酸プローブが固定されたスライドガラス上に添加
した。そしてこのスライドガラスを２５℃の恒温槽内に
おいて１時間保存することで、スライドガラス上におけ
る核酸プローブと標的一本鎖核酸Ｔ１とのハイブリダイ
ゼーション反応を行った。Example (Example 1) As shown below, T1 and T2 consisting of 30 bases were used as target single-stranded nucleic acids.
Both have the same sequence except that the 10th base from the 5'end is different (T1 = A, T2 = C).
Also, a sequence complementary to the sequence from the 11th base to the 30th base counted from the 5'end of the target single-stranded nucleic acids T1 and T2 was used as a nucleic acid probe. <Target single-stranded nucleic acid T1>5'GCTCCCAGTG A CGGCGTAG GCCGTA
GGAATGC3 '<target single-stranded nucleic acid T2>5'GCTCCCAGTG C CGCGGTAGCCGTA
GGAATGC3 '<Nucleic acid probe>5'GCATTCCTACGGCTACGCCG3' First, a slide glass surface was subjected to poly L according to a conventional method.
-Modified with lysine coat. Next, the 5'end side of the nucleic acid probe was immobilized on the surface of this modified glass slide. As the labeled ddNTP, the fluorescent substance FAM (ca
rboxyfluorescein (carboxyfluorescein), ddCTP, fluorescent substance R6
DdATP labeled with G (rhodamine 6G: rhodamine 6G), fluorescent substance TAMRA (carbo
xyTetrametylrhodamine: ddG labeled with carboxytetramethylrhodamine)
TP and fluorescent substance ROX (carboxy-X-r
A mixture containing ddTTP labeled with (hodamine: carboxy-X-rhodamine) was used. <Labeled ddNTP> FAM-ddCTP, R6G-ddATP, TAMRA
-DdGTP, ROX-ddTTP Polymerase reaction, DN manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
A Polymerase I (E. coli) was used. Therefore, first, 100 pmol of the target single-stranded nucleic acid T1 was mixed in 50 uL of sterile distilled water, and this sample solution was added onto the slide glass on which the nucleic acid probe was immobilized. Then, this slide glass was stored in a thermostat at 25 ° C. for 1 hour to carry out a hybridization reaction between the nucleic acid probe on the slide glass and the target single-stranded nucleic acid T1.

【００３８】ハイブリダイゼーション反応後、滅菌蒸留
水を用いてスライドガラスを洗浄した。洗浄後、上記各
標識ｄｄＮＴＰ、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ、
１０×Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｉ Ｂｕｆｆｅｒおよび滅菌蒸留水から調製された５０
ｕＬの反応液を全量スライドガラス上に添加し、３７℃
にて１時間Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応させた。なお、こ
の反応液中の上記各標識ｄｄＮＴＰのそれぞれの濃度は
０．２ｍＭとし、またＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｉは０．５Ｕ／ｕＬの濃度で用い、そして１０×Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ Ｂｕｆｆｅ
ｒは１０倍に希釈して使用した。After the hybridization reaction, the slide glass was washed with sterile distilled water. After washing, each labeled ddNTP, DNA Polymerase I,
10xE. E.coli DNA Polymerase
50 prepared from I Buffer and sterile distilled water
Add all of the uL reaction solution onto a slide glass and incubate at 37 ℃.
Polymerization reaction was carried out for 1 hour. The concentration of each of the above-mentioned labeled ddNTPs in this reaction solution was 0.2 mM, and DNA Polymerase was used.
I was used at a concentration of 0.5 U / uL, and 10 × E. c
oli DNAPolymerase I Buffer
r was diluted 10 times before use.

【００３９】上記反応終了後、７０℃まで温度を上昇さ
せた後、滅菌蒸留水でスライドガラス上を洗浄した。After the above reaction was completed, the temperature was raised to 70 ° C., and the slide glass was washed with sterile distilled water.

【００４０】最後に、ＦＡＭ、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、お
よびＲＯＸのそれぞれの励起光を照射し、それぞれの蛍
光強度を測定した。Ｔ２においても、以上の一連の操作
と同様の操作を行った。測定結果を図４および図５に示
す。Finally, the excitation light of each of FAM, R6G, TAMRA, and ROX was irradiated, and the fluorescence intensity of each was measured. At T2, the same operation as the above series of operations was performed. The measurement results are shown in FIGS. 4 and 5.

【００４１】図４は、標的一本鎖核酸としてＴ１を用い
た場合の、各蛍光物質から発せられる蛍光強度の測定値
をＲＯＸの蛍光強度値を１００％として示したグラフで
ある。図４に示されるように、ＲＯＸ以外の各蛍光物質
から発せられる蛍光強度は、ＲＯＸと比較して十分に小
さく、ＳＮＰ部位がＴであることが判別された。FIG. 4 is a graph showing the measured value of the fluorescence intensity emitted from each fluorescent substance when T1 was used as the target single-stranded nucleic acid, with the fluorescence intensity value of ROX being 100%. As shown in FIG. 4, the fluorescence intensity emitted from each fluorescent substance other than ROX was sufficiently smaller than that of ROX, and it was determined that the SNP site was T.

【００４２】図５は、標的一本鎖核酸としてＴ２を用い
た場合の、各蛍光物質から発せられる蛍光強度の測定値
をＴＡＭＲＡの蛍光強度値を１００％として示したグラ
フである。図５に示されるように、ＴＡＭＲＡ以外の各
蛍光物質から発せられる蛍光強度は、ＴＡＭＲＡと比較
して十分に小さく、ＳＮＰ部位がＧであることが判別さ
れた。。FIG. 5 is a graph showing the measured values of the fluorescence intensity emitted from each fluorescent substance when T2 was used as the target single-stranded nucleic acid, with the fluorescence intensity value of TAMRA being 100%. As shown in FIG. 5, the fluorescence intensity emitted from each fluorescent substance other than TAMRA was sufficiently smaller than that of TAMRA, and it was determined that the SNP site was G. .

【００４３】以上の結果は、本発明がＳＮＰの判別にお
いて非常に有効であることを示している。The above results show that the present invention is very effective in discriminating SNPs.

【００４４】（実施例２）実施例１と同様に標的一本鎖
核酸プローブに関しては、実施例１の一本鎖核酸プロー
ブと同様の配列からなり、その５’末端がチオール化さ
れているものを用い、金基板表面上に固定した。標識ｄ
ｄＮＴＰとして、フェロセンカルボン酸により標識され
たｄｄＴＴＰのみを用いた。Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ反応
には、実施例１同様に、宝酒造（株）のＤＮＡ Ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用した。その
ため先ず、１００ｐｍｏｌの標的一本鎖核酸Ｔ１を５０
μＬの滅菌蒸留水中に混合し、この試料液を、上記核酸
プローブが固定された金電極上に添加した。そしてこの
金電極を２５℃の恒温槽内において１時間保存すること
で、金電極上における核酸プローブと標的一本鎖核酸Ｔ
１のハイブリダイゼーション反応を行った。(Example 2) As in Example 1, the target single-stranded nucleic acid probe has the same sequence as that of the single-stranded nucleic acid probe in Example 1, and its 5'end is thiolated. Was used to fix it on the surface of the gold substrate. Sign d
As dNTP, only ddTTP labeled with ferrocenecarboxylic acid was used. For the Polymerase reaction, DNA Pol of Takara Shuzo Co., Ltd. was used as in Example 1.
imagerase I (E. coli) was used. Therefore, first, 50 pmol of the target single-stranded nucleic acid T1 was added to 50
After mixing in μL of sterile distilled water, this sample solution was added onto the gold electrode on which the nucleic acid probe was immobilized. Then, by storing this gold electrode in a thermostat at 25 ° C. for 1 hour, the nucleic acid probe and the target single-stranded nucleic acid T on the gold electrode are stored.
1 hybridization reaction was performed.

【００４５】ハイブリダイゼーション反応後、滅菌蒸留
水にて金電極上を洗浄した。洗浄後、上記各標識ｄｄＮ
ＴＰ、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ、１０×Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ Ｂｕｆ
ｆｅｒおよび滅菌蒸留水から調製された５０ｕＬの反応
液を全量金電極上に添加し、３７℃にて１時間Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ反応させた。この反応液中の上記各標識ｄ
ｄＮＴＰのそれぞれの濃度は０．２ｍＭとし、またＤＮ
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉは０．５Ｕ／ｕＬで用
い、また１０×Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ Ｉ Ｂｕｆｆｅｒは１０倍に希釈して用いた。After the hybridization reaction, the gold electrode was washed with sterile distilled water. After washing, each labeled ddN
TP, DNA Polymerase I, 10 × E.
coli DNA Polymerase I Buf
50 uL of the reaction solution prepared from fer and sterile distilled water was added on the gold electrode in the total amount, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour with Poly.
The merase was reacted. Each of the above-mentioned labels d in this reaction solution
Each concentration of dNTP was 0.2 mM, and DN
A Polymerase I was used at 0.5 U / uL, and 10 × E. E.coli DNA Polymer
The case I Buffer was diluted 10-fold before use.

【００４６】上記反応終了後、７０℃まで温度を上昇さ
せた後、滅菌蒸留水にて金電極上を洗浄した。最後に、
リニアスイープボルタンメトリを用いて電流値の測定を
行った。Ｔ２においても、以上の一連の操作と同様の操
作を行った。その結果、Ｔ１を用いた場合はフェロセン
に由来する酸化電流がはっきりと認められ（ＳＮＰ部位
がＣであることが判別される）のに対し、Ｔ２を用いた
場合はそのような電流は認められなかった（ＳＮＰ部位
がＣでないことが判別される）。After the above reaction was completed, the temperature was raised to 70 ° C., and the gold electrode was washed with sterile distilled water. Finally,
The current value was measured using linear sweep voltammetry. At T2, the same operation as the above series of operations was performed. As a result, when T1 was used, an oxidative current derived from ferrocene was clearly observed (it was determined that the SNP site was C), whereas when T2 was used, such an electric current was observed. Not found (determined that the SNP site is not C).

【００４７】以上の結果は、本発明がＳＮＰの判別にお
いて非常に有効であることを示している。The above results show that the present invention is very effective in discriminating SNPs.

【００４８】[0048]

【発明の効果】大掛かりで高価な装置を必要とせずに、
高感度かつ簡便に標的一本鎖核酸のＳＮＰ部位の判別を
行うＳＮＰ部位判別方法およびＳＮＰ部位判別用センサ
が提供される。EFFECTS OF THE INVENTION Without requiring a large-scale and expensive device,
Provided are a SNP site discrimination method and a sensor for discriminating SNP site, which discriminates the SNP site of a target single-stranded nucleic acid with high sensitivity.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】従来技術によるＳＮＰ判別方法を示す概念図。FIG. 1 is a conceptual diagram showing a conventional SNP determination method.

【図２】標的一本鎖核酸と核酸プローブとの関係を示す
概念図。FIG. 2 is a conceptual diagram showing the relationship between a target single-stranded nucleic acid and a nucleic acid probe.

【図３】本発明のＳＮＰ判別方法を概略的に示す図。FIG. 3 is a diagram schematically showing a SNP determination method of the present invention.

【図４】本発明のＳＮＰ判別方法によるＳＮＰ判別結果
を示す図。FIG. 4 is a diagram showing SNP discrimination results by the SNP discrimination method of the present invention.

【図５】本発明のＳＮＰ判別方法によるＳＮＰ判別結果
を示す図。FIG. 5 is a diagram showing SNP discrimination results by the SNP discrimination method of the present invention.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１ ＳＮＰ部位の塩基がチミンである標的一本鎖核酸 ２ Ｄｙｅ−ｐｒｉｍｅｒ ３ ２で示すＤｙｅ−ｐｒｉｍｅｒに修飾された蛍光標
識 ４ ｄｄＡＴＰ ５ ４のｄｄＡＴＰに修飾された蛍光標識 ６ ｄｄＧＴＰ ７ ６のｄｄＧＴＰに修飾された蛍光標識 ８ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ９ ＳＮＰ部位の塩基がグアニンである標的一本鎖核酸 １０ 一本鎖核酸プローブα １１ 基板 １２ ＳＮＰ部位の塩基がチミンである標的一本鎖核酸 １３ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １４ ｄｄＣＴＰ １５ １４のｄｄＣＴＰに修飾された標識 １６ ｄｄＧＴＰ １７ １６のｄｄＧＴＰに修飾された標識 １８ ｄｄＴＴＰ １９ １８のｄｄＴＴＰに修飾された標識 ２０ ｄｄＡＴＰ ２１ ２０のｄｄＡＴＰに修飾された標識 ２２ 配列内にＳＮＰ部位を有する標的一本鎖核酸 ２３ ２２の標的一本鎖核酸内のＳＮＰ部位 ２４ ２２の標的一本鎖核酸内に存在し、５’末端が２
３のＳＮＰ部位のヌクレオチドと隣接している配列1 Target single-stranded nucleic acid whose base at SNP site is thymine 2 Dye-primer-modified fluorescent label 4 represented by Dye-primer 3 4 ddATP 5 4 ddATP-modified fluorescent label 6 ddGTP 7 6 ddGTP Modified fluorescent label 8 DNA Polymerase 9 Target single-stranded nucleic acid whose SNP site base is guanine 10 Single-stranded nucleic acid probe α 11 Substrate 12 Target single-stranded nucleic acid whose SNP site base is thymine 13 DNA Polymerase 14 ddCTP 15 14 ddCTP modified label 16 ddGTP 17 16 ddGTP modified label 18 ddTTP 19 18 ddTTP modified label 20 ddATP 21 20 ddATP modified label 22 having SNP site in sequence Target single-stranded nucleic acid 3 present in a target single-stranded nucleic acid of the SNP sites 24 22 within the target single-stranded nucleic acid, 22, 5 'end 2
Sequences flanking the nucleotides of the SNP site of 3

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. <120> A method for identifying SNP and a sensor for identifying SNP <130> Artificial sequence listing <140> H13-0057 <141> 2001-12-26 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: target sequence <400> 1 gctccagtga cggcgtagcc gtaggaatgc 30 <210> 2 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe <400> 2 gctccagtgc cggcgtagcc gtaggaatgc 20 <210> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe <400> 3 gcattcctac ggctacgccg 20 [Sequence list]                           SEQUENCE LISTING <110> Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. <120> A method for identifying SNP and a sensor for identifying SNP <130> Artificial sequence listing <140> H13-0057 <141> 2001-12-26 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: target sequence <400> 1 gctccagtga cggcgtagcc gtaggaatgc 30 <210> 2 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe <400> 2 gctccagtgc cggcgtagcc gtaggaatgc 20 <210> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe <400> 3 gcattcctac ggctacgccg 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/416 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/483 33/58 Ａ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｍ 33/58 27/30 ３５１ (72)発明者 杉原 宏和 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電器 産業株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA13 FA11 FB02 FB05 FB12 2G054 AA06 CA22 CE02 EA03 GA04 JA02 4B024 AA11 CA09 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC08 FA03 FA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR32 QR55 QR82 QR90 QS34 QS39 QX02 QX04 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) G01N 27/416 G01N 33/566 33/483 33/58 A 33/53 C12N 15/00 ZNAA 33/566 G01N 27/46 336M 33/58 27/30 351 (72) Inventor Hirokazu Sugihara 1006, Kadoma, Kadoma City, Osaka Prefecture Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. F term (reference) 2G045 AA35 DA13 FA11 FB02 FB05 FB12 2G054 AA06 CA22 CE02 EA03 GA04 JA02 4B024 AA11 CA09 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC08 FA03 FA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR32 QR55 QR82 QR90 QS34 QS39 QX02 QX04

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 標的一本鎖核酸のＳＮＰ部位を判別する
センサであって、 ＳＮＰ部位のすぐ下流に位置するヌクレオチド配列にハ
イブリダイズ可能な一本鎖核酸プローブ、および基板と
を備え、前記プローブの５’末端が基板に固定されてい
る、センサ。1. A sensor for discriminating an SNP site of a target single-stranded nucleic acid, comprising: a single-stranded nucleic acid probe capable of hybridizing to a nucleotide sequence located immediately downstream of the SNP site; The 5'end of which is fixed to the substrate. 【請求項２】 前記基板がガラスである、請求項１記載
のセンサ。2. The sensor according to claim 1, wherein the substrate is glass. 【請求項３】 前記基板が導電体である、請求項１記載
のセンサ。3. The sensor according to claim 1, wherein the substrate is a conductor. 【請求項４】 標的一本鎖核酸のＳＮＰ部位を判別する
方法であって、標的一本鎖核酸と、前記ＳＮＰ部位のす
ぐ下流に位置するヌクレオチド配列にハイブリダイズ可
能な一本鎖核酸プローブであって、その５’末端が基板
に固定されたプローブとを、少なくとも一種類の標識ｄ
ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で反応さ
せる工程、 未反応の標識ｄｄＮＴＰを除去する工程、 前記標識を検出する工程、および検出された標識によっ
て前記ＳＮＰ部位を判別する工程、 を包含する、方法。4. A method for discriminating a SNP site of a target single-stranded nucleic acid, which comprises a single-stranded nucleic acid probe capable of hybridizing to a target single-stranded nucleic acid and a nucleotide sequence located immediately downstream of the SNP site. And a probe having its 5'end fixed to a substrate is labeled with at least one kind of label d.
A method comprising: reacting in the presence of dNTP and DNA polymerase; removing unreacted labeled ddNTP; detecting the label; and discriminating the SNP site based on the detected label. 【請求項５】 前記ｄｄＮＴＰが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣ
ＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰからなる群から選
択される、請求項４に記載の方法。5. The ddNTP is ddATP or ddC.
The method of claim 4, wherein the method is selected from the group consisting of TP, ddGTP, and ddTTP. 【請求項６】 複数の種類の標識ｄｄＮＴＰを用いる請
求項４に記載の方法であって、各々の標識が互いに異な
る、請求項４に記載の方法。6. The method of claim 4, wherein multiple types of labeled ddNTPs are used, each label being different from each other. 【請求項７】 標的一本鎖核酸に非特異的に結合した標
識ｄｄＮＴＰを除去する工程をさらに包含する、請求項
４に記載の方法。7. The method of claim 4, further comprising the step of removing the labeled ddNTP non-specifically bound to the target single-stranded nucleic acid. 【請求項８】 前記除去する工程が、前記反応させる工
程の後に行なわれる、請求項７に記載の方法。8. The method according to claim 7, wherein the removing step is performed after the reacting step. 【請求項９】 前記除去する工程が、反応液の温度を上
昇させることによって行なわれる、請求項９に記載の方
法。9. The method according to claim 9, wherein the removing step is performed by increasing the temperature of the reaction solution. 【請求項１０】 前記標識が蛍光物質である、請求項４
に記載の方法。10. The label according to claim 4, which is a fluorescent substance.
The method described in. 【請求項１１】 前記標識が電気化学的活性物質であ
る、請求項４に記載の方法。11. The method of claim 4, wherein the label is an electrochemically active substance.