JP2003161725A

JP2003161725A - クロマトグラム解析方法

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Publication number: JP2003161725A
Application number: JP2002297130A
Authority: JP
Inventors: Masato Ito; 正人伊藤; Kisaburo Deguchi; 喜三郎出口; Junkichi Miura; 順吉三浦
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2002-10-10
Filing date: 2002-10-10
Publication date: 2003-06-06
Anticipated expiration: 2019-11-04
Also published as: JP3583771B2

Abstract

(57)【要約】【目的】クロマトグラムの波形歪を補正し、重なりの
ピ−ク波形をシャ−プにすることにより分離・独立さ
せ、ピ−ク面積をより正確に求め、定量分析の精度がよ
いクロマトグラム解析方法を提供することができる。【構成】非保持ピ−ク６１を同定する工程３２と、非
保持ピ−ク６１の面積を１に規格化する工程３３と、オ
ペレ−タが正確に定量したい重なりピ−クのある時間の
始点と終点を設定する工程３４と、規格化関数を用い
て、設定された区間内でディコンボリュ−ション処理を
行う工程３５と、処理前後のクロマトグラムを表示する
工程３６と、シャ−プになったピ−ク波形を積分し、定
量計算をする工程３７とから構成することを特徴とす
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、液体クロマトグラフ
ィ、ガスクロマトグラフィ等のクロマトグラフィ技術に
係り、特にクロマトグラム解析方法（以下、解析方法と
いう）およびそれに使用されるクロマトグラフ装置、前
記解析方法およびクロマトグラフ装置に用いられるデ−
タ処理装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来の技術の説明に先立ち、技術用語の
定義をする。本出願においては、コンボリューションと
は、二つの関数ｘ（ｔ）、ｙ（ｔ）に対するたたみ込み
積分として定義され、一般に計測機器からの出力波形
は、入力波形と装置関数（電気回路ではインパルス応
答、分光器ではスリット関数）とのコンボリューション
となる。ディコンボリューションとは、コンボリューシ
ョンの逆演算として定義される。具体的にはコンボリュ
ーションであらわされている積分方程式を解くことに相
当する。リコンボリューションとは、装置関数、すなわ
ち拡がりを表わす関数ｈ（ｔ）を用いてディコンボリュ
ーションした波形に対し、ふたたびその関数ｈ（ｔ）を
用いてコンボリューションすることをいう。

【０００３】さて、従来から一般に計測機器からの出力
波形デ−タは、その計測機器の動特性、すなわち装置関
数の影響によって歪をうける。クロマトグラフ装置にお
いても同様であり、装置関数、すなわち拡がりを表わす
関数ｈ（ｔ）によりクロマトグラム上に歪を生じたり、
クロマトグラム上にピ−クの重なりが生じる。このよう
な場合、それぞれクロマトグラムのピ−ク面積を正確に
求めることが困難であった。

【０００４】従来、上記歪をうけた場合は、ディコンボ
リュ−ション処理により、上記ピ−クの重なりに対して
は、通常曲線適合法を基本とした合成分離法を用い、デ
−タ処理的に分解し、定量することが提案されている。
これに関する一般的な解決手法については、南茂夫編著
「科学計測のための波形デ−タ処理」、ＣＱ出版株式会
社刊、（１９８６）の記載技術がある。また、多くの改
善技術が、例えば特開昭６２−１７４６５号公報記載の
技術、特開昭６３−１５１８５１号公報記載の技術等が
提案されている。

【０００５】前記特開昭６２−１７４６５号公報記載の
技術は、立上り側の半値幅が、立上り地点から終了点ま
での距離の所定倍になるガウシアンにて近似するもので
あるが、クロマトグラムが重なりピ−ク波形の場合、必
ずしもこのような近似で置換しうる場合は少ない。この
技術は、記憶容量を減らすことには有効であるけれど
も、ピーク波形が重なった場合、ピーク面積を正確に求
めることについては、必ずしも有効ではないという欠点
があった。

【０００６】前記特開昭６３−１５１８５１号公報記載
の技術においては、従来、重なりピークの分割をいわゆ
る垂直分割、スキミング分割処理をしていたものを二つ
のガウシアンに分割して近似し、最小二乗法と呼ばれる
手法にてディコンボリュ−ション処理を行っているが、
物理的に意味のある解が得られないという欠点があっ
た。

【０００７】また、米国特許４８０７１４８号、米国特
許４９４１１０１号明細書等記載の技術においては、デ
ィコンボリュ−ション処理において数値解析の手法が用
いられ、Ｊａｎｓｓｏｎの方法、ヤコビ法、ガウス−ザ
イデル法等があり、演算時間、記憶語数の点で有利とな
っていたが、解の不連続点の拡大等に欠点があった。

【０００８】

【特許文献１】特開昭６２−１７４６５号公報

【特許文献２】特開昭６３−１５１８５１号公報

【特許文献３】米国特許４８０７１４８号明細書

【特許文献４】米国特許４９４１１０１号明細書

【非特許文献１】南茂夫編著「科学計測のための波形デ
−タ処理」、ＣＱ出版株式会社刊、（１９８６）

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上記従来の種々のディ
コンボリュ−ション処理は、クロマトグラムが歪をうけ
た場合のディコンボリュ−ション処理、クロマトグラム
の重なりピ−ク波形を生じた場合に対する合成分離につ
いては、それぞれ個々に解決法を提供するが、歪をうけ
ることによる重なりピ−ク波形を生じた場合には、歪を
うけたことを考慮し、重なり波形を分離するところまで
は詳しく検討され、対処されていなかった。

【００１０】また、上記従来におけるクロマトグラムピ
−ク波形の重なりに対する合成分離法は、次のような問
題がある。１．ガウシアン等の非線形関数を仮定した場合、その関
数を選択する妥当性が疑問である。２．ＵＶスペクトル等のマルチチャンネル情報を導入す
る場合、フォトダイオ−ドアレイ検出器等の高価な検出
器が必要となる。３．ピ−ク分解においては最小自乗法を用いるため、解
が得られるまでに長い計算時間を要し、また物理的に意
味のある解が得られない場合もある。

【００１１】本発明は、上記従来技術の問題点を解決す
るためになされたもので、クロマトグラムの波形の歪を
補正し、重なりのピ−ク波形をシャ−プにすることによ
り分離を向上させ、ピ−ク面積をより正確に求め、定量
分析の精度が改良されたクロマトグラム解析方法を提供
することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、クロマトグラム解析方法に係る本発明の構成は、分
離カラムを通過した分析対象試料を検出器によって検出
し、検出によって得られたクロマトグラムの解析を行う
クロマトグラム解析方法において、前記分析対象試料を
前記分離カラムへ導入と別に、前記分離カラムによって
保持されない標準試料を前記分離カラムへ導入するステ
ップと、前記クロマトグラム上から、前記標準試料のピ
ークを同定するステップと、前記クロマトグラムから前
記分析対象試料の任意のピークのある時間の始点と終点
を設定するステップと、前記設定された時間区間内のデ
ータを、前記同定された標準試料のピーク波形を用いて
ディコンボリューション処理を行うステップと、を有す
ることを特徴とする。前記に記載のクロマトグラム解析
方法において、前記ディコンボリューション処理を行っ
た後のピークが複数のピークで、且つ重なりあった状態
のままであった場合に、当該重なりピークに対して、垂
直分割、あるいは非線形関数を用いた面積分割を行うこ
とを特徴とする。

【００１３】上記目的を達成するために、クロマトグラ
ム解析方法に係る本発明の他の構成は、分離カラムを通
過した分析対象試料を検出器によって検出し、検出によ
って得られたクロマトグラム内のピークを標準偏差σを
係数として有するガウシアン関数を用いて表し解析を行
うクロマトグラム解析方法において、前記ガウシアン関
数の標準偏差σに任意の値を設定するステップと、前記
クロマトグラムに対してディコンボリューション処理を
行うステップと、当該ディコンボリューション処理後の
クロマトグラムについて、クロマトグラムが発散してい
ないか、負の下限値を下回っていないか、不分離ピーク
がピーク間の谷を形成しているか、のいずれかの基準を
満たしているかどうかの判定を行うステップと、当該判
定で不合格の場合、前記ガウシアン関数の標準偏差値を
調整し、再度ディコンボリューション処理を行うステッ
プと、を有することを特徴とする。前記に記載のクロマ
トグラム解析方法において、前記ディコンボリューショ
ン処理に使用した拡がり関数を用いて、前記ディコンボ
リューション処理によって分離されたピークに対してリ
コンボリューション処理後の波形を前記ディコンボリュ
ーション処理前のピーク波形と重ねて表示することを特
徴とする。

【００１４】より詳しく説明すると、クロマトグラムの
ピ−クは、種々の原因により拡がっている。例えば配管
や検出器のフロ−セル等の流路を試料が流れることによ
り、試料ゾ−ンが拡がる。これはカラム外の拡がりと呼
ばれている。このカラム外の拡がりに代表される拡がり
による寄与は、オリジナルのピ−ク波形にコンボリュ−
ション演算され、検出波形に現われる。つまり、拡がり
関数が既知であれば、検出波形をディコンボリュ−ショ
ン演算することによりオリジナルのピ−ク波形を計算す
ることができる。

【００１５】拡がり関数ｈ（ｔ）を決定する手法はいろ
いろなものが考えられる。手法を大きく２つに分類する
と、実験的に検出デ−タから求める方法と波形を特徴づ
けるいくつかのパラメ−タを持つ解析数学的なｈ（ｔ）
を仮定する方法とがある。前者はｈ（ｔ）が既知の方
法、後者はｈ（ｔ）が未知の方法と考えることができ
る。

【００１６】前記ｈ（ｔ）を測定から求める方法とし
て、例えばカラム外の拡がりを得るために、カラムをジ
ョイントと交換し、試料を注入し、検出器で測定された
波形をｈ（ｔ）とみなす方法がある。試料内の成分の種
類に依存しないようなカラム内の拡がりも付加するな
ら、保持しない試料を注入し、そのピ−ク波形をｈ
（ｔ）とみなすことができる。

【００１７】保持しないピ−クを得る方法には、他に溶
離液に溶出能力の極めて強い溶媒を使用すること、カラ
ム充填剤に官能基を修飾しないものを作成し保持しない
ようにする等が考えられる。また、標準試料の中に保持
しない成分を添加し、非保持ピ−クを標準試料のクロマ
トグラムから得る方法も有効である。

【００１８】ｈ（ｔ）が未知の場合、次のような点を前
提条件し、ピ−ク幅の一部分に相当する拡がり関数ｈ
（ｔ）をディコンボリュ−ション処理し、よりシャ−プ
なピ−クを持つ処理クロマトグラムからピ−ク面積をも
とに正確に定量することができる。

【００１９】その前提条件とは、検出されるピ−ク波形
はオリジナルにはデルタ関数的あるいは非常にシャ−プ
な長方形的な濃度分布関数に対して、拡がり関数をコン
ボリュ−ション演算したものであると考えられる。ここ
で拡がり関数は、ほぼガウシアンであり、それが若干テ
−リング的あるいはリ−ディング的に修正された波形を
している。つまり、拡がり関数自体もガウシアンに対し
てテ−リングかリ−ディングの修正関数がコンボリュ−
ト演算されていると考えられる。

【００２０】また、ガウシアンには２つのガウシアンを
コンボリュ−ション演算すると、それもまたガウシアン
であるという加成性がある。以上により拡がり関数の一
部分を構成しているガウシアンをディコンボリュ−ショ
ン演算することにより、よりシャ−プなオリジナルな波
形に近づいたピ−クを計算することができることにな
る。

【００２１】

【作用】上記各技術的手段の働きは次のとおりである。
本発明の構成によれば、検出クロマトグラムから既知の
ｈ（ｔ）またはガウシアンを合理的に選択し、ディコン
ボリュ−ション演算することにより、検出クロマトグラ
ムの重なりピ−クよりシャ−プなピ−クを持つクロマト
グラムに分離・独立させ、分離・独立した各ピ−クを積
分した時、正確にピ−ク面積が求められ、正確な定量を
することができる。上記ディコンボリュ−ション演算
は、例えば非線形関数の最小自乗法と異なり、短い計算
時間により物理的に意味のある解を必ず得ることができ
る。

【００２２】また、上記ディコンボリュ−ション演算
は、重なりピ−クが分離・独立されたときに、そのクロ
マトグラムを観察し、その演算の妥当性を判断している
が、熟練が必要となる。そこで、ディコンボリュ−ショ
ン演算に用いた拡がり関数ｈ（ｔ）を用い、独立した各
ピークにリコンボリュ−ション演算を施し、最初の重な
りピ−クを構成している各ピークを再現することができ
る。このリコンボリュ−ション演算後の各ピークと最初
の重なりピ−クとを重ね描きすることにより上記ディコ
ンボリュ−ション演算の妥当性を正確に判断することが
できる。

【００２３】また、本発明の構成によれば、例えばフォ
トダイオ−ドアレイ検出器等の高価な検出器を省略し、
簡単な構成によりクロマトグラム解析方法を実施するこ
とができる。

【００２４】

【実施例】〔実施例１〕以下、本発明に基づく一実施
例を図１ないし図１１を参照して説明する。図１は、本
発明における一実施例に係るクロマトグラム解析方法
（以下、解析方法という）に用いるマイクロボアＨＰＬ
Ｃシステムの構成を示すブロック図、図２は、図１の解
析方法におけるクロマトグラムを示す線図、図３は、図
１の解析方法におけるクロマトグラムの拡がりメカニズ
ムの略示説明図、図４は、図１の解析方法におけるディ
コンボリュ−ション演算説明図、図５は、図１の解析方
法に係る処理工程のフロ−チヤ−ト、図６は、図１の解
析方法におけるクロマトグラムの重ね描きプロット図で
ある。

【００２５】また、図７は、図１の解析方法によるアミ
ノ酸分析のクロマトグラムを示す線図、図８は、図１の
解析方法によるグリコヘモグロビン分析のクロマトグラ
ムを示す線図、図９は、図１の解析方法において拡がり
関数が未知の場合の処理フロ−チャ−ト、図１０は、図
１の解析方法におけるカテコ−ルアミン分析のクロマト
グラムを示す線図、図１１は、図１の解析方法における
リコンボリュ−ション演算による重ね描き説明図であ
る。

【００２６】本発明に係るクロマトグラム解析方法を実
施するため、マイクロボアＨＰＬＣシステムを使用す
る。図１は、マイクロボアＨＰＬＣシステムの全体構成
を示している。図１において、４０はポンプ、４１はカ
ラム、４２は検出器、４３はサンプラ、４４は制御部、
４５はデ−タ解析部、４６はＣＲＴ表示部、４７はプリ
ンタ、４９は溶離液、５１は未知試料、５２は標準試
料、５４は入力部である。

【００２７】本システムを構成する各部は、デ−タ解析
部４５（〔実施例２〕において後述）を除き、通常の
クロマトグラム解析方法を用いられるものである。した
がって、詳細な説明は煩瑣となるので省略し、簡単に説
明する。

【００２８】前記マイクロボアＨＰＬＣシステムでは、
カラム外の拡がりが分離に大きく影響し、無視できな
い。制御部４４の命令によりポンプ４０は溶離液４９を
送液する。可動ニ−ドル弁を有するサンプラ４３は、未
知試料５１あるいは標準試料５２をカラム４１への流路
に注入する。試料は、溶離液４９とともにカラム４１に
送りこまれ、含有成分が分離展開され、検出器４２で検
出される。

【００２９】前記検出されたクロマトグラムは、デ−タ
解析部４５に記憶される。図２は、検出されたクロマト
グラムである。前記標準試料５２には非保持成分を添加
しているため、非保持ピ−ク６１としてそれが検出され
る。次に溶出されるピ−ク６２は標準試料の一成分であ
り、ピ−ク６１と異なりカラム内に保持され、ピ−ク幅
も若干広くなっている。

【００３０】図３を参照し、ピ−ク波形が形成されるメ
カニズムについて説明する。図３は、図１の一実施例に
係る解析方法におけるクロマトグラムの拡がりのメカニ
ズムの説明図である。図３において、図中、図１の符号
と同一符号は同等部分であるので詳細な説明は省略す
る。上段（ａ）図は、試料流路を示すブロック図であ
り、下段（ｂ）図は、上段（ａ）図の試料流路における
試料の濃度を示している。

【００３１】単一成分を含む試料は、サンプラ４３によ
り流路内に注入される。この時の流路内での試料濃度Ｃ
の空間分布図は、流れの方向をｘとすれば、長方形状の
分布線図７１である。この長方形状の分布線図７１がカ
ラム４１を通過すると拡大する。前記カラム４１を通過
した段階は、分布線図７２のようなガウシアンの形状で
ある。

【００３２】さらに、検出器４２において、前記ガウシ
アンの濃度分布を検出する時には流路配管や検出器のフ
ロ−セル等により濃度分布が拡げられ、分布線図７３の
ように分布前図７２よりも広い分布形状になっている。

【００３３】これを数式で記述すると、（２）式のよう
なモデルで表現できる。

【数２】上式において、時刻ｔにおける検出波形をｙ（ｔ），サ
ンプル注入時のオリジナルな長方形波形をｒ（ｔ），拡
がり関数をｈ（ｔ）とする。上式においては、検出波形
ｙ（ｔ）は、オリジナルな長方形波形ｒ（ｔ）と、拡が
り関数ｈ（ｔ）とのコンボリュ−ションであることを示
している。

【００３４】ピ−クの形状の拡がりについては、上記説
明でよいが、リテンションタイムについても考慮する
と、もう一つＤｉｒａｃのデルタ関数がコンボリュ−シ
ョン演算されていると考えられる。これを（３）式に示
す。

【数３】

【００３５】上式において、ＥＭＧ（ｔ）は、Ｅｘｐｏ
ｎｅｎｔｉａｌｌｙＭｏｄｉｆｉｅｄＧａｕｓｓｉ
ｎであり、σ、τ、ｔ_Rは、ＥＭＧ（ｔ）のパラメー
タ、δ(ｔ）はデルタ関数、ｍ(ｔ）は修正関数である。
拡がりのメカニズムについては、“ＤＹＮＡＭＩＣＳ
ＯＦＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＹ”，Ｊ．Ｃ．Ｇｉｄ
ｄｉｎｇｓ著，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ刊，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９６５に詳しく説明されているのでそれ
に譲る。

【００３６】拡がり関数ｈ（ｔ）は、カラム内での拡が
りとカラム外での拡がりの両方からの影響により形成さ
れる。つまりカラム内での拡がり関数とカラム外での拡
がり関数のコンボリュ−ションである。

【００３７】図２における非保持ピ−ク６１に着目し、
図３を参照し説明すると、注入時は長方形波形７１だっ
たものが、カラム４１を通過し、ガウシアン波形７２に
拡げられ、カラム外の拡がりの影響を受け、波形７３と
なり、ピ−ク６１として検出されていることになる。

【００３８】一方、保持ピ−ク６２も同様なメカニズム
で拡げられ、ピ−クが形成されているのであるが、前記
カラム４１内に保持されているために、若干広めのピ−
ク幅に拡げられている。すなわち、ピ−ク６２に影響す
る拡がり関数は、ピ−ク６１と共通の拡がり関数とそれ
以外の余剰の拡がり関数とのコンボリュ−ションになっ
ている。

【００３９】この場合、ピ−ク６２の拡がり関数からピ
−ク６１の拡がり関数の影響を取り除き、余剰の拡がり
関数だけを得ることができる。この処理をディコンボリ
ュ−ション処理と呼ぶ。

【００４０】前記ディコンボリュ−ション演算は、図２
に示すピ−ク６４とピ−ク６５とのような重なりピ−ク
に対して効果がある。図４を参照して説明する。図４
は、図２に示す重なりピ−クに対しディコンボリュ−シ
ョン演算を説明している。

【００４１】前記ピ−ク６４波形と前記ピ−ク６５波形
とに対して前記ピ−ク６１波形の拡がり関数をディコン
ボリュ−ション演算すると、図４に示すような分離され
た余剰分のピ−クが得られ、より正確にそれぞれのピ−
クの面積が計算できる。実際は、ピ−ク波形６１を面積
１に規格化した規格化関数をディコンボリュ−ション演
算に利用する。規格化はピ−ク面積を保存するために行
われる。

【００４２】厳密に言えば、この規格化関数は、（式）
２の注入時の長方形関数ｒ（ｔ）とピ−ク波形６１に影
響する拡がり関数ｈ（ｔ）の規格化されたコンボリュ−
ションである。実際には、ピ−ク波形６１以外のピ−ク
にも長方形関数の影響があるため、ピ−ク６１波形の規
格化関数でディコンボリュ−ション演算しても問題には
ならないわけである。

【００４３】以上の図４のディコンボリュ−ション手順
を図１のマイクロボアＨＰＬＣシステムのブロック図
と、図５に示す検出波形処理のフロ−チャ−トとを参照
して説明する。まず、非保持成分を添加した標準試料５
２が注入され、工程３１にて波形処理が開始される。

【００４４】次に、工程３２で非保持ピ−ク６１を同定
する。これはクロマトグラムの最初の時刻に現われるあ
る大きさ以上のピ−クとして自動的に同定するか、また
はオペレ−タが入力部５４から時刻指定を行うか、ＣＲ
Ｔ４６に表示しているクロマトグラムからマウスを使用
し、ピ−ク６１をピックアップすることで指定すること
ができる。

【００４５】工程３３において、非保持ピ−ク６１の面
積を１に規格化する。この時、ＣＲＴ４６に規格化関数
を表示することもできる。工程３４において、オペレ−
タが正確に定量したい重なりピ−クのある時間の始点と
終点を設定する。前記ＣＲＴ４６には、図４の左図のよ
うに、この部分だけを拡大したクロマトグラムを表示す
ることもできる。ここでオペレ−タはクロマトグラムの
全ての時間を設定することも可能である。

【００４６】工程３５において規格化関数を用いて、設
定された時間区間内でディコンボリュ−ション処理を行
う。工程３６において処理前後のクロマトグラムをＣＲ
Ｔ４６に図４の右側と左側とのように表示する。また、
図６に示す如く、プリンタ４７に重ね描きしたクロマト
グラムをプロットすることもできる。

【００４７】工程３７において、シャ−プになった図４
の右側のピ−クを対象に積分を実行し、定量計算を行
う。この処理後のクロマトグラムでもまだピ−クが重な
っている場合には、従来通りの垂直分割等で面積計算す
る。ここでガウシアン、ＥＭＧ等の非線形関数で最小自
乗法により面積分割することもできる。ここでＣＲＴ４
６かプリンタ４７に定量値を出力する。工程３８におい
て処理を終了する。

【００４８】ディコンボリュ−ション処理をする拡がり
関数を標準試料５２中の非保持成分のピ−ク波形の規格
化関数で代用したが、この方法の他にも拡がり関数を得
ることができる。標準試料に添加する代わりに、予め拡
がり関数を求めるために非保持成分だけ注入し、ピ−ク
波形を得ることができる。

【００４９】また、逆相クロマトグラフィ−ならメタノ
−ル，アセトニトリル，ＴＨＦ，クロロホルム等有機溶
媒１００％の溶離液を流し、保持の弱い成分を注入し、
非保持ピ−クを得ることができる。イオン交換クロマト
グラフィ−では、例えばアミノ酸分析計の場合、ｐＨの
高い再生液を流し、保持の弱いホスホセリン等を注入
し、そのピ−ク波形を得ることができる。

【００５０】また、カラム充填剤を操作し、非保持ピ−
クを得ることもできる。イオン交換クロマトグラフィ−
なら、イオン交換基の修飾しない坦体だけの充填剤を作
成し、非保持ピ−クを得ることもできる。

【００５１】ポストカラム反応ＬＣの実施例としてアミ
ノ酸分析計をあげる。このシステムもカラム外の拡がり
を無視できない。カラム外の拡がりは、カラムをジョイ
ントに交換し、非保持ピ−クの波形を拡がり関数として
見積ることができる。

【００５２】図７に示す如く検出されたクロマトグラム
においては、スレオニン（Ｔｈｒ）とセリン（Ｓｅｒ）
の重なり部分が１４％であるのに対し、ディコンボリュ
−ション処理されたクロマトグラムでは４％と１／３以
下に向上した。この処理クロマトグラムは、ポストカラ
ム反応ＬＣにおいて、カラムの直後で検出できたとした
場合のクロマトグラムに相当している。

【００５３】拡がり関数の共通部分の除去例として、
３．３分間処理のグリコヘモグロビン分析計をあげる。
拡がり関数を図８の左側に示すＨｂＦのピ−ク波形から
見積ることができる。これはＨｂＡ１ｃのピ−ク幅が、
リテンションタイムの順序を考慮し、ＨｂＦの幅よりも
若干広いと考えられるためである。

【００５４】図８の左側の検出クロマトグラムより孤立
したピ−クであるＨｂＦの波形を規格化し、拡がり関数
を得る。その規格化関数を用いて、不安定型と安定型と
のＨｂＡ１ｃの重なりピ−クをディコンボリュ−ション
処理すれば、図８の右側に示すような分離の向上したク
ロマトグラムが求められるわけである。

【００５５】ディコンボリュ−ション処理は、この場合
処理クロマトグラムを直接表示する必要はないが、定量
精度を向上するためには、一般的なＨＰＬＣであるグリ
コヘモグロビン分析計においても非常に有効な手法であ
る。

【００５６】次にディコンボリュ−ション演算を正しく
行うために演算前に利用すべき処理について説明する。
図２に示されているノイズ６７やドリフト６８がディコ
ンボリュ−ション演算を妨害する。これらをそのままデ
ィコンボリュ−ション処理すると、擬似的なピ−クとし
て増幅されたり、ディコンボリュ−ション処理されるべ
きピ−クが正しく処理されないといった弊害が起こる。

【００５７】まず、ノイズ除去処理としては一般的に検
出クロマトグラムのデ−タ点をいくつか足し算して低減
する方法が採られる。この他に平滑化の方法や公知の高
周波成分を除去する方法も利用できる。

【００５８】ドリフト除去処理としては一般的にピ−ク
間の谷から谷を直線で結だり、強制的に水平に直線を描
き、検出クロマトグラムからベ−スラインを引き算する
方法が採られる。この他に公知の低周波成分を除去する
方法，微積分を利用し低次の多項式成分を除去する方
法、微分の特徴点からベ−スラインを探索する方法，ニ
ュ−ラルネットワ−クを利用する方法等がある。

【００５９】ここまでは拡がり関数を測定デ−タより求
めてきたが、拡がり関数が未知である場合でも、ガウシ
アンをディコンボリュ−ト演算することができる。前述
したように検出クロマトグラムのピ−ク波形は、（２）
式で示されるように、拡がり関数ｈ（ｔ）と長方形波形
のｒ（ｔ）とのコンボリュ−ションで表わせる。

【００６０】この拡がり関数ｈ（ｔ）は、前述の“ＤＹ
ＮＡＭＩＣＳＯＦＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＹ”
Ｊ．Ｃ．Ｇｉｄｄｉｎｇｓ著により、カラム内の拡がり
がどのような物理学的，化学的相互作用に起因していて
も、カラム外の拡がりが無視できないくらい大きくと
も、ガウシアン様の形状をしている。

【００６１】ｈ（ｔ）がリ−ディンク的かまたはテ−リ
ング的にガウシアンから多少歪んでいたとしても、下記
の（４）式のようにガウシアンＧ（ｔ）と修正関数ｍ
（ｔ）とのコンボリュ−ションとして記述できる。

【数４】

【００６２】上式において、ガウシアンをＧ（ｔ）、修
正関数をｍ（ｔ）、σは標準偏差である。例として、ｈ
（ｔ）がＥＭＧ（ｔ）により表わせるテ−リングピ−ク
であるなら、前述の（３）式のように解析数学的に修正
関数が求められる。

【００６３】また、重なりピ−クは、（５）式のように
表わせる。

【数５】ここで、σ₁、σ₂はそれぞれ標準偏差である。

【００６４】ガウシアンは、上記の如く、加成性がある
ため、２つのガウシアンのコンボリュ−ションに分解で
きるため、下記（６）式のような関係を持っている。

【数６】

【００６５】つまり、（５）式で表わされている２つの
ピ−ク波形はガウシアンを用いて、ディコンボリュ−シ
ョン演算ができる。この時そのガウシアンは、２つのピ
−クの持つ標準偏差σ₁とσ₂よりも小さな標準偏差σ０
を持つ幅の狭い波形でなければならない。

【００６６】こうして、検出された重なりピ−クよりも
幅の狭いピ−クを得ることができる。最終的には、ｙ
（ｔ）をガウシアンＧ（ｔ，σ₀）によりディコンボリ
ュ−ション演算すると、クロマトグラムは、幅のより狭
いガウシアンともとのまま修正関数とのコンボリュ−シ
ョンにより表わすことができるわけである。

【００６７】

【数７】上式の〔〕内のように、σ₁，σ₂よりピーク幅の狭
いピークが得られる。より詳しくいえば、注入時の長方
形波形はこの修正関数によりコンボリュ−ション演算さ
れている。

【００６８】この拡がり関数ｈ（ｔ）が未知の場合の処
理を図９を参照して説明する。工程７１で処理を開始す
る。工程７２で検出クロマトグラムからノイズ・ドリフ
トを除去し、ディコンボリュ−ション処理の準備をす
る。工程７３でディコンボリュ−ション処理を手動で行
なうか、自動で行なうのかを入力する。

【００６９】自動の場合、工程８１で、検出クロマトグ
ラムのピ−ク幅を全体的に見て、最小の幅よりもやや小
さな標準偏差を持つガウシアンを拡がり関数として設定
する。これは面積１に規格化されている。ここで、リテ
ンションタイムの短いピ−クと長いピ−クでピ−ク幅が
２倍以上異なる場合は、時間を分割してディコンボリュ
−ション演算することもできる。

【００７０】ここで自動的にピ−ク幅を見つけ出すため
にフ−リエ変換を利用することもできる。工程７６でデ
ィコンボリュ−ション処理を実行する。工程７７で処理
クロマトグラムが発散していないか、負の下限値を下回
っていないか判定する。また不分離ピ−クがピ−ク間の
谷を形成しているか等を判定する。

【００７１】ここで判定が合格となれば、工程７９へ進
む。判定が不合格の場合、もう一度工程８１へ戻り、判
定を参照し標準偏差を加減し、ディコンボリュ−ション
処理を行なう。判定合格の場合、工程７９で処理クロマ
トグラムの表示，定量結果の表示等を行なう。工程８０
で終了する。

【００７２】手動の場合、工程７４で入力操作を行う。
一般的にはディコンボリュ−ション処理するガウシアン
の標準偏差を入力する。他に処理区間の始・終点の入力
もできる。また特定の重なりピ−クの分離を向上するた
めに、ガウシアンの最適な標準偏差を探索することもで
きる。

【００７３】この場合、標準偏差の初期値，推定される
ピ−クの個数，大きさ，幅，保持時間等を参考値として
入力することもできる。また制限値として、ピ−ク個数
は３個までとか、重なりピ−クの幅が０．２分以上０．
４分以下のように入力することもできる。

【００７４】工程７５で工程７４にて入力された情報を
演算し、ディコンボリュ−ション処理の設定値を求め、
判定の基準値を算出する。工程７６でディコンボリュ−
ション処理を実行する。工程７７で判定を行う。不合格
の場合、その理由を工程７８で表示し、工程７４で再入
力を促す。合格の場合、工程７９で処理クロマトグラム
と定量結果を表示する。工程８０で終了する。

【００７５】カテコ−ルアミン分析計により得られた生
の１０分間のクロマトグラムを図１０の上段（ａ）に示
す。これは、血漿や尿のような生体試料の分析例であ
る。生体試料を分析すると数多くのピ−クがしばしば現
われる。これを適切なガウシアンでディコンボリュ−シ
ョン処理すると、中段（ｂ）のようなクロマトグラムが
得られる。各ピ−クがベ−スラインまで完全に分離して
いる。

【００７６】しかし、これをそのまま表示しても、処理
クロマトグラムの意味するところは理解困難である。む
しろ、これを下段の（ｃ）に示した公知の表示法にして
も差し支えない。また、定量値のみを出力するだけで、
ディコンボリュ−ション処理をオペレ−タ−に意識させ
ないのがよいと考えられる。

【００７７】以上、本発明の一実施例について説明した
が、本発明は、上記実施例に限定されるものでなく、種
々の変形例が考えられる。本発明に係るクロマトグラム
解析方法の他の一方法を説明する。図１１は、本発明に
係る解析方法におけるディコンボリュ−ション、リィコ
ンボリュ−ションによる重ね描きの説明したものであ
る。

【００７８】図１１（１）は、検出されたオリジナルの
波形である。このオリジナルの波形にディコンボリュ−
ション処理し、各波形ピークを分離・独立させる。この
状態を図１１（２）に示す。分離・独立させた波形ピー
クをそれぞれディコンボリュ−ションしたときと同じ拡
がり関数ｈ（ｔ）によりリコンボリュ−ションする。リ
コンボリュ−ション演算された波形を検出されたオリジ
ナルの波形に重ね描きをする。図１１（３）は、この状
態を示したものである。

【００７９】〔実施例２〕本発明に係るクロマトグラ
フ解析装置の他の一実施例を説明する。図１２は本発明
に係る他の一実施例であるクロマトグラフ解析装置の構
成を示すブロック図である。本発明に係るクロマトグラ
フ解析装置の全体構成については、〔実施例１〕にお
いて、図１のマイクロボアＨＰＬＣシステムについて説
明したので、煩瑣となるので再度の説明を省略し、デー
タ解析部４５のみを説明する。

【００８０】前記データ解析部４５は、ノイズ・ドリフ
ト除去機構と、拡がり関数解析機構と、ディコンボリュ
ーション演算機構と、定量計算機構と、判定機構とから
構成されている。図中、図示されてないが、Ａ／Ｄ変換
器、記憶装置、インタフェース部等も備えていることは
いうまでもない。前記構成の内、ノイズ・ドリフト除去
機構、定量計算機構、判定機構は、公知の技術であるが
順序としてあわせて説明をする。なお、前記各機構部
は、バスによって接続されている。

【００８１】前記ノイズ・ドリフト除去機構は、平滑化
機構と、ベースライン算出機構と、高速フーリエ変換機
構と、ニューラル・ネットワーク機構と、微分・積分機
構と、ファジイ推論機構とを備えており、前記平滑化機
構は、検出器４３からのクロマトグラムの測定データ群
を移動平均法、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法、Ｋａ
ｗａｔａ−Ｍｉｎａｍｉ法、周波数領域法のいずれかに
より滑らかな曲線にフイットし、前記ベースライン算出
機構は、適切なアルゴリズムによりベースラインを決定
する。

【００８２】前記高速フーリエ変換機構は、高周波成分
であるノイズおよび低周波成分であるベースライン変動
をそれぞれ周波数分布に基づき除去する。また、前記ニ
ューラル・ネットワーク機構は、ドリフト形状を予め学
習しておき、測定データから所定の結合定数に従い、ド
リフトを除去する。

【００８３】前記微分・積分機構は、微分・積分により
低次の多項式で表現されるベースライン成分を除去す
る。この整理された測定データ点群をファジイ推論機構
が所定の結合定数に従い平滑化する。このようにして検
出器４３からのクロマトグラムのノイズおよびドリフト
は除去される。

【００８４】前記拡がり関数解析機構は、Ｇａｕｓｓｉ
ａｎ発生機構と、面積１規格化機構と、検出ピーク波形
設定機構とを備え、解析数学的拡がり関数の場合は、前
記Ｇａｕｓｓｉａｎ発生機構によりＧａｕｓｓｉａｎを
発生する。実測的拡がり関数の場合は、前記面積１規格
化機構により実測されたピーク波形を規格化し、前記検
出ピーク波形設定機構により前記規格化された実測波形
を拡がり関数としている。このようにして実測的ないし
解析数学的拡がり関数を発生する。

【００８５】前記ディコンボリューション演算機構は、
時間区間設定機構と、拡がり関数設定機構と、ディコン
ボリューション処理機構とを備え、前記時間区間設定機
構は、ディコンボリューション処理する区間を設定し、
前記拡がり関数設定機構は、上記の発生させた実測的な
いし解析数学的拡がり関数から拡がり関数を設定する。
前記ディコンボリューション処理機構は、設定されたデ
ィコンボリューション処理する区間の重なり波形を前記
拡がり関数によりディコンボリューション処理し、重な
り波形を分離・独立させる。

【００８６】前記定量計算機構は、積分機構を備え、前
記積分機構は、前記分離・独立させたピーク波形の面積
をそれぞれ算出する。このようにしてピーク面積ないし
高さに基づき定量を計算する。前記定量結果は、ＣＲＴ
４６、プリンタ部４７に出力される。

【００８７】各種の判定を行う判定機構は、ディコンボ
リューション処理の成功を判定するために利用する判別
式の値を計算する判別式計算機構、ディコンボリューシ
ョン処理するために利用するＧａｕｓｓｉｎを探索する
ときに制限となる値を算出する制限値算出機構と、所定
の結合係数に従いその最適なＧａｕｓｓｉｎを探索する
拡がり関数探索機構を具備し、上記各処理段階におい
て、各機構が所定の働きが可能となるようサポートして
いる。

【００８８】図１２における制御部４４、データ解析部
４５、ＣＲＴ部４６、プリンタ部４７等の機能を一体化
して、Ａ／Ｄ変換部と、メモリ部と、制御部と、インタ
フェース部と、出力機器とからなり、クマトグラムの検
出ピ−ク波形から拡がりを表わす関数ｈ（ｔ）を算出・
出力し、検出ピ−ク波形および前記関数ｈ（ｔ）を用い
て前記検出ピ−ク波形をディコンボリューション処理
し、ディコンボリューション処理後のクロマトグラムを
出力することを特徴とするクロマトグラム解析方法とク
ロマトグラフ装置とに用いられるデ−タ処理装置を構成
しても差し支ええない。

【００８９】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明の構
成によれば、クロマトグラムの波形の歪を補正し、重な
りのピ−ク波形をシャ−プにすることにより分離を向上
させ、ピ−ク面積をより正確に求められ、定量分析の精
度が改良されたクロマトグラム解析方法を提供すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における一実施例に係る解析方法に用い
るマイクロボアＨＰＬＣシステムの構成を示すブロック
図である。

【図２】図１の解析方法におけるクロマトグラムを示す
線図である。

【図３】図１の解析方法におけるクロマトグラムの拡が
りメカニズムの略示説明図である。

【図４】図１の解析方法におけるクロマトグラムの重な
りピークに対するディコンボリュ−ション演算説明図で
ある。

【図５】図１の解析方法に係る処理工程のフロ−チヤ−
トである。

【図６】図１の解析方法におけるクロマトグラムの重ね
描きプロット図である。

【図７】図１の解析方法によるアミノ酸分析のクロマト
グラムを示す線図である。

【図８】図１の解析方法によるグリコヘモグロビン分析
のクロマトグラムを示す線図である。

【図９】図１の解析方法において拡がり関数が未知の場
合の処理フロ−チャ−トである。

【図１０】図１の解析方法におけるカテコ−ルアミン分
析のクロマトグラムを示す線図である。

【図１１】図１の解析方法におけるリィコンボリューシ
ョン演算による重ね描き説明図である。

【図１２】本発明に係る他の一実施例に係るクロマトグ
ラフ解析装置の構成を示すブロック図である。

【符号の説明】

４０…ポンプ４１…カラム４２…検出器４３…サンプラ４４…制御部４５…デ−タ解析部４６…ＣＲＴ表示部４７…プリンタ４９…溶離液５１…未知試料５２…標準試料５４…入力部

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者三浦順吉茨城県勝田市大字市毛882番地株式会社日立製作所計測器事業部内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】分離カラムを通過した分析対象試料を検出
器によって検出し、検出によって得られたクロマトグラ
ム内のピークを、標準偏差σを係数として有するガウシ
アンを拡がり関数として用いて表し解析を行うクロマト
グラム解析方法において、前記ガウシアンの標準偏差σに任意の値を設定するステ
ップと、前記クロマトグラムに対してディコンボリューション処
理を行うステップと、当該ディコンボリューション処理後のクロマトグラムに
ついて、クロマトグラムが発散していないか、負の下限
値を下回っていないか、不分離ピークがピーク間の谷を
形成しているか、のいずれかの基準を満たしているかど
うかの判定を行うステップと、当該判定で不合格の場合、前記ガウシアンの標準偏差値
を調整し、再度ディコンボリューション処理を行うステ
ップと、を有することを特徴とするクロマトグラム解析
方法。
【請求項２】請求項１に記載のクロマトグラム解析方法
において、前記ディコンボリューション処理によって分離されたピ
ークに対して、前記ディコンボリューション処理に用い
た拡がり関数を用いてリコンボリューション処理を行
い、リコンボリューション処理後の波形を前記ディコン
ボリューション処理前のピーク波形と重ねて表示するこ
とを特徴とするクロマトグラム解析方法。
【請求項３】請求項１に記載のクロマトグラム解析方法
において、ガウシアンの標準偏差σを設定する前に、前記クロマト
グラムからノイズ及びドリフトを除去するステップを含
むことを特徴とするクロマトグラム解析方法。
【請求項４】請求項１に記載のクロマトグラム解析方法
において、前記拡がり関数ｈ（ｔ）は、ｈ（ｔ）＝Ｇ（ｔ）（ｔ）（ここで、Ｇ（ｔ）は上記ガウシアン、ｍ（ｔ）は修正
関数）前記ガウシアンは、（１）式で表されることを特徴とす
るクロマトグラム解析方法。【数１】
【請求項５】請求項１に記載のクロマトグラム解析方法
において、前記標準偏差σは、検出されたクロマトグラムのピーク
幅よりも小さな標準偏差を設定することを特徴とするク
ロマトグラム解析方法。