JP2003149245A - Biosensor surface carrying polymer derivative containing poly(ethylene glycol) segment - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a biosensor surface that is hardly affected by foreign matters having possibilities of existing in biological materials. SOLUTION: A biosensor uses a polymer derivative basically containing a poly(ethylene glycol) having a functional group which can bond antibodies, etc., at one fragment end and a trialkyloxysilyl portion at the other fragment end. The biosensor has a surface onto which the polymer derivative is grafted through the trialkyloxysilyl portion.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】本発明は、主として生物学的材料の分析セ
ンサー表面の改質およびそれに用いるポリマーに関す
る。The present invention relates primarily to the modification of analytical sensor surfaces of biological materials and polymers used therein.

【０００２】[0002]

【従来の技術】体液、血液等の生物学的材料における被
検体を検出するためのバイオセンサーでは、目的とする
被検体以外の成分の干渉を排除する必要がある場合があ
る。かような干渉には被検体以外の成分、例えば、タン
パク質等のバイオセンサー表面への付着等が挙げられ
る。一般的に、ある表面へのタンパク質の付着は、ポリ
（エチレングリコール）（以下、ＰＥＧという場合あ
り）を表面にグラフトすることにより抑制できることが
示唆されている（例えば、Jo et al.,Biomaterials２１
（２０００）６０５−６１６参照）。Jo et al．は片末
端がメトキシ基をもち、もう一つの末端がエトキシシリ
ル化されたＰＥＧ誘導体を生成し、得られた誘導体をそ
のエトキシシリル部分を介してガラス表面へ共有結合さ
せると、フィブリノーゲンの該表面への吸着が有意に低
減できることを示唆している。2. Description of the Related Art In a biosensor for detecting an analyte in a biological material such as body fluid or blood, it may be necessary to eliminate interference of components other than the intended analyte. Such interference includes the attachment of components other than the analyte, such as proteins, to the biosensor surface. In general, it has been suggested that protein attachment to a certain surface can be suppressed by grafting poly (ethylene glycol) (hereinafter sometimes referred to as PEG) onto the surface (for example, Jo et al., Biomaterials21.
(2000) 605-616). Jo et al. Produces a PEG derivative having a methoxy group at one end and an ethoxysilyl group at the other end, and the resulting derivative is covalently bonded to the glass surface via its ethoxysilyl moiety to give a surface of fibrinogen. It is suggested that the adsorption of P can be significantly reduced.

【０００３】ところで、バイオセンサー表面と、多種多
様な成分の共存する生物学的材料中の特定の被検体との
間で生じる過程を in situe で追跡する必要のある分析
系では、被検体と特異的に結合しうる結合パートナー
（例えば、抗原に対する抗体またはその逆、ポリヌクレ
オチドに対するその相補鎖、アビジンに対するビオチ
ン、レクチンに対する糖類、リガンドに対するレセプタ
ータンパク質またはその逆）を該表面に担持させる必要
がある場合もある。かような検出系では、結合パートナ
ーを表面に担持させるとともに、生物学的材料中に存在
しうる夾雑物の悪影響を排除できる糸を構築する必要が
ある。By the way, in an analysis system in which it is necessary to trace in situ the process that occurs between a biosensor surface and a specific analyte in a biological material in which various components coexist, a specific analyte When it is necessary to carry a binding partner (eg, an antibody against an antigen or the reverse thereof, a complementary strand thereof against a polynucleotide, biotin for avidin, a sugar for a lectin, a receptor protein for a ligand, or vice versa) capable of specifically binding to the surface. There is also. In such detection systems, it is necessary to support the binding partner on the surface and construct a thread that can eliminate the adverse effects of contaminants that may be present in the biological material.

【０００４】[0004]

【発明が解決しよとする課題】したがって、本発明の目
的は、特に上記のような分析系で用いることのできる改
変されたバイオセンサー表面を提出することにある。Accordingly, it is an object of the present invention to provide a modified biosensor surface that can be used especially in an analytical system as described above.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成すべく検討してきた。その結果、限定されるも
のでないが、例えば、レーザー光の金属薄膜の表面およ
びその近傍における屈折率の変化を高感度で検出できる
という、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を応用したバイ
オセンサーの表面へ上述のような被検体と特異的に結合
しうる結合パートナーを担持せしめ、しかも、試料中の
夾雑物の影響を実質的に排除でき、しかも高感度を維持
しうる手段を見いだした。より具体的には、かかる手段
として、片末端に前記のような結合パートナーを直接ま
たは間接的に共有結合できる官能基を有し、かつ、もう
一方の末端にトリアルコキシシリル部分を有するＰＥＧ
誘導体が有利に使用できることを見いだした。すなわ
ち、本発明に従うＰＥＧ誘導体は、上述の Jo et al．
の片末端のメトキシ基に代え、前記官能基を有するにも
かかわらず、トリアルコキシシリル部分を介した金属酸
化物表面等への結合に対して悪影響を及ぼさない。のみ
ならず、ＰＥＧ誘導体を固相表面に結合した後、前記官
能基を利用して、前記のような結合パートナーを容易に
担持できる。かような、両末端に官能基または機能性部
分を有するＰＥＧ誘導体は、ＳＰＲを応用したバイオセ
ンサーだけでなく、被検体との間で生じる変化を直接追
跡できるような、例えば、電極表面、その他核酸検出用
チップ表面の構築に適する。The present inventors have studied to achieve the above object. As a result, for example, but not limited to, the surface of a biosensor to which surface plasmon resonance (SPR) is applied, which can detect a change in the refractive index on the surface of a metal thin film of laser light and its vicinity with high sensitivity. The present inventors have found a means capable of supporting a binding partner capable of specifically binding to an analyte as described above, and substantially eliminating the influence of contaminants in the sample, and maintaining high sensitivity. More specifically, as such means, PEG having a functional group capable of directly or indirectly covalently bonding the above-mentioned binding partner at one end and a trialkoxysilyl moiety at the other end.
It has been found that the derivatives can be used to advantage. That is, the PEG derivative according to the present invention can be prepared by the method described in Jo et al.
Despite having the above-mentioned functional group instead of the methoxy group at one end, does not adversely affect the bond to the metal oxide surface or the like through the trialkoxysilyl moiety. In addition, after binding the PEG derivative to the surface of the solid phase, the above-mentioned functional group can be utilized to easily support the above-mentioned binding partner. Such a PEG derivative having a functional group or a functional moiety at both ends can be used not only for a biosensor to which SPR is applied but also for directly tracking a change with an analyte, such as an electrode surface, Suitable for constructing nucleic acid detection chip surface.

【０００６】したがって、本発明によれば、一般式
（Ｉ）：Therefore, according to the present invention, the general formula (I):

【０００７】[0007]

【化８】 [Chemical 8]

【０００８】（上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は独立して
低級アルキルを表し、Ｌ₁は第一の連結基または原子価
結合を表し、Ａは式(Wherein R ¹ , R ² and R ³ independently represent lower alkyl, L ₁ represents a first linking group or a valence bond, and A is a formula

【０００９】[0009]

【化９】 [Chemical 9]

【００１０】を表し、ここで２つのＲ^aは独立して水素
原子または低級アルキル基であり、そしてｑは２〜５の
整数であり、Ｌ₂は第二の連結基であり、Ｂは官能基ま
たはリガンド、好ましくは式Wherein two R ^a are independently hydrogen atoms or lower alkyl groups, q is an integer from 2 to 5, L ₂ is a second linking group, and B is a functional group. Group or ligand, preferably of formula

【００１１】[0011]

【化１０】 [Chemical 10]

【００１２】を表し、ここで２つのＲ^bは独立して水素
原子または有機シリル型のアミノ保護基を表すか、また
はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜７員
のジシラーアザシクロヘテロ環を形成しうる有機シリル
型のアミノ保護基を表し、２つのＲ^cは独立して低級ア
ルキルオキシを表すか、またはそれらが結合する炭素原
子と一緒になって４位もしくは５位において低級アルキ
ル基で置換されていてもよい１,３−ジオキソランを形
成しうる基を表すか、あるいは一緒になってオキソを表
し、あるいは上記のいずれかの基を介して共有結合した
被検体と特異的に結合しうる結合パートナーの結合した
部分を表し、ｐは２〜５の整数を表し、ｍは０または１
〜１０００の整数を表し、そしてｎは１０〜２０,００
０の整数を表す。）で表されるポリ（エチレングリコー
ル）セグメントを含有するポリマー誘導体を、該誘導体
のトリアルコキシシリル部分を介して形成される結合に
よって表面に固定したバイオセンサー表面、が提供され
る。好適な態様では、一般式（Ｉ）におけるＬ₁が−Ｎ
ＨＣＯ−、Ｎ(Ｒ^d)−または原子価結合であって、ここ
で、Ｒ^dは低級アルキル基であり、そして、Ｌ₂が−(Ｃ
Ｈ₂)_r−または−ＣＯ(ＣＨ₂)_s−であって、ここでｒお
よびｓは独立して２〜５の整数である、ポリマー誘導体
（以下、一般式（Ｉ′）として表示される。）が表面に
固定される。このようなポリマー誘導体は、本発明者ら
の知る限りでは、従来技術文献未載の新規ポリマー誘導
体である。したがって、本発明によれば、かような新規
ポリマー誘導体も提供される。Wherein the two R ^b independently represent a hydrogen atom or an amino-protecting group of the organosilyl type, or together with the nitrogen atom to which they are attached, a 4- to 7-membered disilaler. Represents an organic silyl type amino-protecting group capable of forming an azacycloheterocycle, and two R ^c 's each independently represent lower alkyloxy, or, together with the carbon atom to which they are bonded, the 4- or 5-position. Represents a group capable of forming 1,3-dioxolane optionally substituted with a lower alkyl group, or represents together oxo, or is bound to an analyte covalently via any of the above groups. Represents a bound part of a binding partner capable of specifically binding, p represents an integer of 2 to 5, and m represents 0 or 1.
Represents an integer of ~ 1000, and n is 10 to 20,000
Represents an integer of 0. The biosensor surface which fixed the polymer derivative containing the poly (ethylene glycol) segment represented by these to the surface by the bond formed through the trialkoxy silyl part of this derivative is provided. In a preferred embodiment, L ₁ in the general formula (I) is —N
HCO-, N (R ^d )-or a valence bond, wherein R ^d is a lower alkyl group and L ₂ is-(C
H ₂ ) _r − or —CO (CH ₂ ) _s −, wherein r and s are independently integers of 2 to 5, and are represented by polymer derivatives (hereinafter represented by general formula (I ′)). .) Is fixed to the surface. As far as the inventors know, such a polymer derivative is a novel polymer derivative which has not been published in the prior art document. Therefore, according to the present invention, such a novel polymer derivative is also provided.

【００１３】また、本発明によれば、ガラス、半導体
（シリコンウェーハーを含む。）、セラミック、金属お
よび合金からなる群より選ばれる材料で形成された表面
を有するバイオセンサー表面を、上記一般式（Ｉ）また
は一般式（Ｉ′）で表されるポリマー誘導体と、該誘導
体の溶媒の存在下で接触させ、溶媒を除去し、次いで乾
燥させることを特徴とする前記バイオセンサー表面の作
製方法も提供される。Further, according to the present invention, a biosensor surface having a surface formed of a material selected from the group consisting of glass, semiconductors (including silicon wafers), ceramics, metals and alloys can be obtained by using the above general formula ( Also provided is a method for preparing the above biosensor surface, which comprises contacting the polymer derivative represented by I) or the general formula (I ′) in the presence of a solvent for the derivative, removing the solvent, and then drying. To be done.

【００１４】[0014]

【発明の具体的な態様】本発明において、「低級アルキ
ル」および「低級アルキルオキシ」という場合の低級ア
ルキル部分は、炭素数１〜６個の直鎖または分岐鎖のア
ルキル基を意味し、限定されるものでないが、例えば、
メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ
−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペ
ンチル、ｎ−ヘキシルを挙げることができるが、好まし
くはメチルおよびエチルである。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present invention, the term "lower alkyl" and "lower alkyloxy" as used in the present invention mean a lower or lower alkyl moiety which is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. It is not something that is
Methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n
-Butyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, n-hexyl can be mentioned, but methyl and ethyl are preferred.

【００１５】一般式（Ｉ）におけるｍが０を表わすポリ
マー誘導体は、いずれかの方法、で製造したポリ（エチ
レングリコール）を適用できるいずれかの方法によっ
て、片末端に選択的にトリ−低級アルキルオキシシリル
基（または部分）を導入し、他方、もう一つの末端にカ
ルボキシル基、保護されたアミノ基、アセタールもしく
はケタール部分を有する基を導入することによって、得
ることができる。したがって、一般式（Ｉ）における連
結基Ｌ₁およびＬ₂は、本発明の目的に沿う限り、該ポリ
マー誘導体を製造するのに選んだ方法によって、任意の
ものであることができる。The polymer derivative in which m in formula (I) represents 0 is selected from tri-lower alkyl at one end selectively by any method applicable to poly (ethylene glycol) produced by any method. It can be obtained by introducing an oxysilyl group (or moiety), while introducing a carboxyl group, a protected amino group, a group having an acetal or ketal moiety at the other end. Thus, the linking groups L ₁ and L ₂ in general formula (I) can be any, depending on the method chosen to produce the polymer derivative, so long as the object of the invention is met.

【００１６】しかし、例えば、ある一定表面の変化に高
い感受性を有するＳＰＲを応用したバイオセンサー表面
等では、その表面にグラフトされるポリマー鎖の鎖長等
が厳密に規定されていることが一般に望ましい。このよ
うな要望に応えるには、ほぼ単分散性のポリマーを提供
することのできる、リビング重合によるのが好都合であ
ろう。However, for example, in a biosensor surface to which SPR having a high sensitivity to a certain surface change is applied, it is generally desirable that the chain length of the polymer chain grafted on the surface is strictly defined. . To meet these needs, it would be convenient to rely on living polymerization, which can provide polymers that are nearly monodisperse.

【００１７】例えば、一般式（Ｉ）におけるＢがFor example, B in the general formula (I) is

【００１８】[0018]

【化１１】 [Chemical 11]

【００１９】であるポリマー誘導体はリビング重合開始
剤：The polymer derivative which is a living polymerization initiator is:

【００２０】[0020]

【化１２】 [Chemical 12]

【００２１】として、次の式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）
を生成した後、下記の反応スキーム１に従って製造でき
る。As the following formula (II) or (III)
Can be prepared according to Reaction Scheme 1 below.

【００２２】[0022]

【化１３】 [Chemical 13]

【００２３】反応スキーム１： Reaction Scheme 1 :

【００２４】[0024]

【化１４】 [Chemical 14]

【００２５】また別法として、下記にそれぞれ示す反応
スキーム２および３に従って、一般式（Ｉ）のポリマー
誘導体を製造することもできる。反応スキーム２ ：Alternatively, the polymer derivative of the general formula (I) can be produced according to the reaction schemes 2 and 3 shown below, respectively. Reaction scheme 2 :

【００２６】[0026]

【化１５】 [Chemical 15]

【００２７】反応スキーム３： Reaction scheme 3 :

【００２８】[0028]

【化１６】 [Chemical 16]

【００２９】（以上の各式中の略号は、それぞれ、一般
式（Ｉ）について定義したものと同義であり、Ｍはカリ
ウム、ナトリウム、リチウムを表す。） 以上のリビング重合工程は、それぞ自体公知の反応条件
の下で実施できる（例えば、ＷＯ ９６／３２４３４、
ＷＯ ９７／０６２０２、等を参照されたい。）。その
他は、後述する実施例に従い、または記載されている条
件を改変して実施できる。(The abbreviations in each of the above formulas have the same meanings as defined for the general formula (I), and M represents potassium, sodium, or lithium.) The above living polymerization steps are themselves performed. It can be carried out under known reaction conditions (eg WO 96/32434,
See WO 97/06202, etc. ). Others can be carried out according to the examples described below or by modifying the described conditions.

【００３０】以上によれば、ｍおよびｎが、それぞれ実
質的に単分散性ポリマーを表すものを製造できる。した
がって、一般式（Ｉ）における連結基Ｌ₁は、−ＮＨＣ
Ｏ−、−Ｎ(Ｒ^d)ＣＨ₂ＣＨ₂−または−ＯＣＨ₂ＣＨ₂−
であることが好ましく、一方、連結基Ｌ₂は、−(ＣＨ₂)
_r−または−ＣＯ(ＣＨ₂)_s−であることが好ましい。こ
のような好ましい態様のポリマー誘導体は一般式
（Ｉ′）として示している。Based on the above, it is possible to produce a polymer in which m and n each represent a substantially monodisperse polymer. Therefore, the linking group L ₁ in the general formula (I) is —NHC.
^{O -, - N (R d} ) CH 2 CH 2 - or -OCH ₂ CH ₂ -
While it is preferable that the linking group L ₂ is — (CH ₂ ).
It is preferably _r − or —CO (CH ₂ ) _s −. The polymer derivative of such a preferred embodiment is shown as the general formula (I ′).

【００３１】上記反応スキーム１にも示されているAlso shown in Reaction Scheme 1 above.

【００３２】[0032]

【化１７】 [Chemical 17]

【００３３】の２つのＲ^bが独立して有機シリル型のア
ミノ保護基を表すか、またはそれらが結合する窒素原子
と一緒になって、４〜７員のジシラ−アザシクロヘテロ
環を表す場合をさらに説明する。Two R ^b 's independently represent an organosilyl-type amino protecting group or, together with the nitrogen atom to which they are attached, represent a 4-7 membered disila-azacycloheterocycle. Will be further explained.

【００３４】かような有機シリル基の具体的なものとし
ては、Ｒ^bの一方が式Specific examples of such an organic silyl group include one in which R ^b has the formula

【００３５】[0035]

【化１８】 [Chemical 18]

【００３６】で示され、Ｒ^bのもう一方が式And the other side of R ^b is

【００３７】[0037]

【化１９】 [Chemical 19]

【００３８】で示され、上記式中、Ｒ¹′、Ｒ²′、
Ｒ³′、Ｒ⁴′、Ｒ⁵′およびＲ⁶′は、相互に独立して低
級アルキル基であることができ、また、２つのＲ^bが一
体となったアミノ保護基であるときは、Ｒ¹′、Ｒ²′お
よびＲ³′のいずれかが、Ｒ⁴′、Ｒ ⁵′およびＲ⁶′のい
ずれかと一緒になって、メチレン、エチレン、プロピレ
ン、またはブチレンであることができる。この一体とな
ったアミノ保護基は、例えば、式And R in the above formula¹′, R²′,
R³′, R^Four′, R^Five'And R⁶′ Is low independently of each other
Can be a secondary alkyl group and can also contain two R^bIs one
When it is a body-protecting amino group, R¹′, R²‘O
And R³′ Is R^Four′, R ^Five'And R⁶’No
Together with the gap, methylene, ethylene, propylene
, Or butylene. With this one
Amino protecting groups are represented by, for example,

【００３９】[0039]

【化２０】 [Chemical 20]

【００４０】（式中、ｍ′は１〜４の正数である）で示
され、該保護基が結合するアミノ基の窒素原子と一緒に
なって、４〜７員のジシラ−アザシクロヘテロ環式環を
形成するものである。(In the formula, m ′ is a positive number of 1 to 4), together with the nitrogen atom of the amino group to which the protecting group is bonded, is a 4- to 7-membered disila-azacyclohetero group. It forms a cyclic ring.

【００４１】これらのアミノ保護基のうちでは、４〜７
員のジシラ−アザシクロヘテロ環式環を形成するもので
あって、Ｒ²′、Ｒ³′、Ｒ⁵′およびＲ⁶′が独立して、
低級アルキル基であるものが好ましく、特に、２,２,
５,５−テトラメチル−２,５−ジシラ−１−アザシクロ
ペンタンを形成するものが好ましい。Of these amino protecting groups, 4-7
To form a membered disila-azacycloheterocyclic ring wherein R ² ′, R ³ ′, R ⁵ ′ and R ⁶ ′ are independently
A lower alkyl group is preferable, and particularly 2,2,
Those which form 5,5-tetramethyl-2,5-disila-1-azacyclopentane are preferred.

【００４２】また、In addition,

【００４３】[0043]

【化２１】 [Chemical 21]

【００４４】の２つのＲ^cが独立して低級アルキルオキ
シを表すか、またはそれらが結合する炭素原子と一緒に
なって、４位もしくは５位において低級アルキル基で置
換されてもよい１,３−ジオキソランを形成しうる場合
には、これらの基はアセタールまたはケタールを形成し
ており、酸性条件下で容易にアルデヒド基（ＯＣＨ−）
に転化される。なお、低級アルキル基で置換されてもよ
い１,３−ジオキソランの代表的なものとしては、次の
式で表されるものを挙げることができる。The two R ^{c s} independently represent lower alkyloxy or, together with the carbon atom to which they are attached, may be substituted in the 4 or 5 position by a lower alkyl group, 1,3 -When dioxolane can be formed, these groups form an acetal or a ketal, and easily form an aldehyde group (OCH-) under acidic conditions.
Be converted to. In addition, typical examples of 1,3-dioxolane which may be substituted with a lower alkyl group include those represented by the following formula.

【００４５】[0045]

【化２２】 [Chemical formula 22]

【００４６】一般式（Ｉ）および（Ｉ′）において、限
定されるものでないが、Ｒ^aは、好ましくは水素原子ま
たはメチルであり、ｍは０または１〜１０００、好まし
くは０または１〜１００の整数であり、ｎは１０〜２
０,０００、好ましくは１０〜５,０００の整数である。In the general formulas (I) and (I '), R ^a is preferably a hydrogen atom or methyl, and m is 0 or 1 to 1000, preferably 0 or 1 to 100, although not limited thereto. Is an integer and n is 10 to 2
It is an integer of 0000, preferably 10 to 5,000.

【００４７】また、Ｂが、それ自体アミノ基、アルデヒ
ド基またはカルボキシル基である場合のいずれかの基を
介して共有結合した、被検体と特異的に結合しうる結合
パートナーの結合した部分であるときの「被検体と特異
的に結合しうる結合パートナー」とは、抗原と抗体、レ
クチンと糖類、リガンドとレセプタータンパク質、ポリ
ヌクレオチドと少なくとも一部について相補的である相
補ポリヌクレオチド、等からなる結合対を形成しうる員
の一方を意味する。かような結合パートナーは、上記ア
ミノ基、アルデヒド基またはカルボキシル基にそれ自体
公知の方法で結合させることができる。B is a moiety to which a binding partner capable of specifically binding to the analyte is covalently bound via an amino group, an aldehyde group or a carboxyl group. The "binding partner capable of specifically binding to the analyte" in this case is a binding consisting of an antigen and an antibody, a lectin and a saccharide, a ligand and a receptor protein, a polynucleotide and a complementary polynucleotide that is at least partially complementary, and the like. It means one of the members that can form a pair. Such a binding partner can be bound to the above amino group, aldehyde group or carboxyl group by a method known per se.

【００４８】一般式（Ｉ）または（Ｉ′）におけるＢが
保護されたアミノ基またはアセタール部分を示す場合に
は、相当するポリマー誘導体をセンサー表面に結合させ
た後、それぞれ遊離のアミノ基またはアルデヒド基に転
化し、次いで前記結合パートナーを結合させるのが好ま
しい。なお、本発明によれば、Ｂが遊離のアミノ基また
はカルボキシル基であっても、相当する式（Ｉ）のポリ
マー誘導体を、そのトリアルコキシシリル部分を介し
て、センサー表面へ結合することができる。このような
センサー表面は、本発明の目的を達成できるものであれ
ば、いかなる材質のものであってもよいが、水酸基を表
面に有するガラス、半導体（シリコンウエハーを含
む。）、セラミック、金属および合金製であることが好
ましい。When B in the general formula (I) or (I ') represents a protected amino group or acetal moiety, after attaching the corresponding polymer derivative to the sensor surface, the free amino group or aldehyde, respectively. It is preferred to convert it to a group and then attach the binding partner. According to the present invention, even if B is a free amino group or carboxyl group, the corresponding polymer derivative of the formula (I) can be bound to the sensor surface via its trialkoxysilyl moiety. . Such a sensor surface may be made of any material as long as the object of the present invention can be achieved. However, glass having a hydroxyl group on the surface, semiconductor (including silicon wafer), ceramic, metal and It is preferably made of an alloy.

【００４９】式（Ｉ）のポリマー誘導体を非水有機溶媒
（トルエン等）または水性溶媒（水または水混和性有機
溶媒と水との混合液）に溶解または分散させた後、得ら
れた溶液と上記センサー表面を接触させて、次いで溶媒
を除去（好ましくは留去）し、必要により湿分の存在下
で加熱処理することにより、少なくともポリマー誘導体
の一部はトリアルキルオキシシリル部分のアルキルオキ
シ基の脱離（相当するアルカノールの放出を伴う）を経
て、上記センサー表面に共有結合して、所謂、グラフト
される。グラフトされるポリマー誘導体の密度は、表面
やセンサーの種類に応じて、適宜調整すればよい。調整
の目安は、それ自体公知の方法で表面へのタンパク質の
吸着特性を調べ、または後述する表面プラズモン共鳴特
性を調べて設定できるであろう。The polymer derivative of the formula (I) is dissolved or dispersed in a non-aqueous organic solvent (such as toluene) or an aqueous solvent (water or a mixed solution of water and a water-miscible organic solvent) and then the resulting solution is prepared. At least a part of the polymer derivative is treated with the alkyloxy group of the trialkyloxysilyl moiety by bringing the above sensor surface into contact, then removing the solvent (preferably distilling off), and performing heat treatment in the presence of moisture if necessary. Via desorption (with corresponding release of alkanol), covalently bound to the sensor surface, so-called grafted. The density of the polymer derivative to be grafted may be appropriately adjusted depending on the surface and the type of sensor. The standard of adjustment could be set by examining the adsorption property of the protein on the surface by a method known per se, or by examining the surface plasmon resonance property described later.

【００５０】以上のようにして得られるバイオセンサー
表面は、１）タンパク質の非特異吸着を効果的に抑制
し、２）夾雑タンパク質の存在下においてすらリガンド
−レセプター間の特異的反応を高感度に検出できる。The biosensor surface obtained as described above 1) effectively suppresses nonspecific adsorption of proteins, and 2) highly sensitively reacts with a ligand-receptor specific reaction even in the presence of contaminating proteins. Can be detected.

【００５１】[0051]

【実施例】以下、具体例を挙げ本発明をさらに説明する
が、本発明は、これらに限定されるものでない。 ポリマーの製造例１：α末端に１級アミン、ω末端にア
ルコキシシランを有するヘテロ二官能性ポリエチグリコ
ールの合成 アルゴン下、受器中に於いて、溶媒としてＴＨＦ３０ｍ
ｌ、開始剤として２,２,５,５−テトラメチル−２,５−
ジシラ−１−アザシクロペンタン（ＴＤＡ）を１.０ｍ
ｍｏｌ加えた。カリウムナフタレンのＴＨＦ溶液を１.
０ｍｍｏｌ加え、１時間メタル化し、エチレンオキシド
（ＥＯ）を１００ｍｍｏｌ加え、２日間重合した。その
後、停止反応として３−トリエトキシシリルプロピルイ
ソシアナートを１.０ｍｍｏｌ加え、さらに１時間反応
させた。脱保護を行うため、酢酸を数滴加え、１時間攪
拌、クロロホルム抽出、飽和食塩水洗浄、有機相を無水
硫酸ナトリウムで脱水し、ジエチルエーテルで再沈殿回
収した。 ポリマーの製造例２：α末端にカルボキシル基、ω末端
にアルコキシシランを有するヘテロ二官能性ポリエチグ
リコールの合成１ アルゴン下、受器中に於いて、溶媒としてＴＨＦ３０ｍ
ｌ、開始剤としてＮ−メチルアミノプロピルトリメトキ
シシラン１.０ｍｍｏｌ、カリウムナフタレンのＴＨＦ
溶液を１.０ｍｍｏｌ加え、さらにエチレンオキシド
（ＥＯ）を６８ｍｍｏｌ加え、２日間重合した。ジエチ
ルエーテルで再沈殿回収後、無水コハク酸を加え、トリ
メトキシシラン−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを得た。 ポリマーの製造例３：α末端にカルボキシル基、ω末端
にアルコキシシランを有するヘテロ二官能性ポリエチグ
リコールの合成２ アルゴン下、受器中に於いて、溶媒としてＴＨＦ３０ｍ
ｌ、開始剤としてアリルアルコール１.０ｍｍｏｌ、カ
リウムナフタレンのＴＨＦ溶液を１.０ｍｍｏｌ加え、
さらにエチレンオキシド（ＥＯ）を６８ｍｍｏｌ加え、
２日間重合した。さらにＨ₂ＰｔＣｌ₆、トリエトキシシ
ラン、Ｋ₂ＣＯ₃水溶液を加えトリエトキシシラン−ＰＥ
Ｇを得た。後、無水コハク酸を加え、トリメトキシシラ
ン−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを得た。 実施例１：ＳＰＲ用センサーチップチタン表面のＰＥＧ
修飾の製造例１で得られたアルコキシシランＰＥＧの無
水トルエン溶液中に、きれいに洗浄したチタン表面を２
４時間浸漬放置した。反応後、チタン表面をトルエン、
エタノールで洗浄し７０℃で２４時間減圧乾燥した。 実施例２：ＳＰＲ用センサーチップチタン表面のＰＥＧ
修飾１０μｇの製造例１で得られたアルコキシシランＰ
ＥＧ（分子量１００００）の無水トルエン溶液をＳＰＲ
センサーキュベットに１００μｌ導入し、攪拌しながら
２０分間吸着、１Ｍ−ＰＢＳで２分間攪拌洗浄、再度、
攪拌しながら１５分間吸着、１Ｍ−ＰＢＳで２分間攪拌
洗浄した。そのセンサーグラムを図１に示す。The present invention will be further described below with reference to specific examples, but the present invention is not limited thereto. Polymer Production Example 1: Synthesis of Heterobifunctional Polyethylene Glycol Having a Primary Amine at the α-Terminal and an Alkoxysilane at the ω-Terminal THF 30m as a solvent in a receiver under argon
l, 2,2,5,5-tetramethyl-2,5-as an initiator
Disila-1-azacyclopentane (TDA) 1.0m
mol was added. A solution of potassium naphthalene in THF 1.
After adding 0 mmol, metallized for 1 hour, added 100 mmol of ethylene oxide (EO), and polymerized for 2 days. Then, as a termination reaction, 1.0 mmol of 3-triethoxysilylpropyl isocyanate was added, and the reaction was further performed for 1 hour. To carry out deprotection, a few drops of acetic acid were added, and the mixture was stirred for 1 hour, extracted with chloroform, washed with saturated brine, the organic phase was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, and reprecipitated and recovered with diethyl ether. Production Example 2 of Polymer: Synthesis of Heterobifunctional Polyethylene Glycol Having Carboxyl Group at α-Terminal and Alkoxysilane at ω-Terminal 1 THF 30 m as a solvent in a receiver under argon
l, N-methylaminopropyltrimethoxysilane 1.0 mmol as an initiator, potassium naphthalene THF
1.0 mmol of the solution was added, 68 mmol of ethylene oxide (EO) was added, and the mixture was polymerized for 2 days. After reprecipitation and recovery with diethyl ether, succinic anhydride was added to obtain trimethoxysilane-PEG-COOH. Production Example 3 of Polymer: Synthesis of Heterobifunctional Polyethylene Glycol Having Carboxyl Group at α-Terminal and Alkoxysilane at ω-Terminal 2 Under argon, in a receiver, THF 30 m as a solvent
l, 1.0 mmol of allyl alcohol as an initiator, 1.0 mmol of THF solution of potassium naphthalene,
Furthermore, 68 mmol of ethylene oxide (EO) is added,
Polymerized for 2 days. Furthermore, H ₂ PtCl ₆ , triethoxysilane, and K ₂ CO ₃ aqueous solution were added to add triethoxysilane-PE.
Got G. Then, succinic anhydride was added to obtain trimethoxysilane-PEG-COOH. Example 1: SPR sensor chip PEG on titanium surface
Modification In the anhydrous toluene solution of the alkoxysilane PEG obtained in Production Example 1, the cleaned titanium surface was washed with 2 parts.
It was left immersed for 4 hours. After the reaction, the titanium surface was
It was washed with ethanol and dried under reduced pressure at 70 ° C. for 24 hours. Example 2: SPR sensor chip PEG on titanium surface
Modified 10 μg of alkoxysilane P obtained in Production Example 1
SPR of anhydrous toluene solution of EG (molecular weight 10,000)
100 μl was introduced into the sensor cuvette, adsorbed for 20 minutes with stirring, washed with stirring with 1M-PBS for 2 minutes, and again,
The mixture was adsorbed for 15 minutes while stirring, and washed with 1M-PBS for 2 minutes while stirring. The sensorgram is shown in FIG.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例２により得られたセンサーグラムであ
る。FIG. 1 is a sensorgram obtained in Example 2.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大塚 英典 神奈川県川崎市中原区井田中の町404 Ｆターム(参考） 4J005 AA04 BB01    ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (72) Inventor Hidenori Otsuka             404, Itanaka, Nakahara-ku, Kawasaki-shi, Kanagawa F-term (reference) 4J005 AA04 BB01

Claims (12)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 一般式（Ｉ） 【化１】 （上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は独立して、低級アルキ
ルを表し、Ｌ₁は第一の連結基または原子価結合を表
し、Ａは式 【化２】 を表し、ここで２つのＲ^aは独立して、水素原子または
低級アルキル基であり、そしてｑは２〜５の整数であ
り、Ｌ₂は第二の連結基であり、Ｂは官能基またはリガ
ンドを表し、ｐは２〜５の整数を表し、ｍは０または１
〜１０００の整数を表し、そしてｎは１０〜２０,００
０の整数を表す。）で表されるポリ（エチレングリコー
ル）セグメントを含有するポリマー誘導体を、該誘導体
のトリアルコキシシリル部分を介して形成される結合に
よって表面に固定したバイオセンサー表面。1. A compound represented by the general formula (I): (Wherein R ¹ , R ² and R ³ independently represent lower alkyl, L ₁ represents a first linking group or a valence bond, and A is of the formula Wherein two R ^a are independently a hydrogen atom or a lower alkyl group, q is an integer of 2 to 5, L ₂ is a second linking group, B is a functional group or Represents a ligand, p represents an integer of 2 to 5, and m represents 0 or 1.
Represents an integer of ~ 1000, and n is 10 to 20,000
Represents an integer of 0. The biosensor surface which fixed the polymer derivative containing the poly (ethylene glycol) segment represented by these to the surface by the bond formed through the trialkoxy silyl part of this derivative. 【請求項２】 Ｂが 【化３】 を表し、ここで２つのＲ^bは独立して、水素原子または
有機シリル型のアミノ保護基を表すか、またはそれらが
結合する窒素原子と一緒になって、４〜７員のジシラー
アザシクロヘテロ環を形成しうる有機シリル型のアミノ
保護基を表し、２つのＲ^cは独立して低級アルキルオキ
シを表すか、またはそれらが結合する炭素原子と一緒に
なって４位もしくは５位において低級アルキル基で置換
されていてもよい１,３−ジオキソランを形成しうる基
を表すか、あるいは一緒になってオキソを表し、そして
リガンドが上記のいずれかの基（アミノ基、アルデ基、
カルボキシル基）を介して共有結合した、被検体と特異
的に結合しうる結合パートナーの結合した部分を表す、
請求項１記載のバイオセンサー表面。2. B is the following: Wherein the two R ^b independently represent a hydrogen atom or an amino-protecting group of organosilyl type, or together with the nitrogen atom to which they are attached, a 4- to 7-membered disilaazacyclo. Represents an organosilyl-type amino-protecting group capable of forming a heterocycle, and two R ^c independently represent lower alkyloxy, or, together with the carbon atom to which they are attached, is lower in the 4- or 5-position. Represents a group capable of forming a 1,3-dioxolane which may be substituted with an alkyl group, or represents oxo together, and the ligand is one of the groups (amino group, alde group,
Represents a bound portion of a binding partner capable of specifically binding to an analyte, which is covalently bound via a (carboxyl group),
The biosensor surface according to claim 1. 【請求項３】 バイオセンサー表面がガラス、半導体、
セラミック、金属および合金からなる群より選ばれる材
料で形成されており、そして前記形成される結合の少な
くとも一部が前記トリアルコキシシリル部分と前記材料
表面の酸化物および／または水酸化物との化学反応によ
りもたらされる請求項１記載のバイオセンサー表面。3. The surface of the biosensor is glass, semiconductor,
It is formed of a material selected from the group consisting of ceramics, metals and alloys, and at least a part of the bond formed is a chemistry of the trialkoxysilyl moiety and the oxide and / or hydroxide of the surface of the material. The biosensor surface of claim 1 provided by a reaction. 【請求項４】 バイオセンサーが表面プラズモン共鳴
（ＳＰＲ）を応用したものである請求項１〜３のいずれ
かに記載のバイオセンサー表面。4. The biosensor surface according to claim 1, wherein the biosensor is an application of surface plasmon resonance (SPR). 【請求項５】 一般式（Ｉ）における連結基Ｌ₁が−Ｎ
ＨＣＯ−、Ｎ(Ｒ^d)ＣＨ₂ＣＨ₂−または−ＯＣＨ₂ＣＨ₂
−であり（ここで、Ｒ^dは低級アルキル基である）、そ
して、Ｌ₂が−(ＣＨ₂)_r−または−ＣＯ(ＣＨ₂)_s−であ
る（ここで、ｒおよびｓは独立して２〜４の整数であ
る。）、請求項１に記載のバイオセンサー表面。5. The linking group L ₁ in formula (I) is —N.
^{HCO-, N (R d) CH} 2 CH 2 - or -OCH ₂ CH ₂
- and (wherein, R ^d is a lower alkyl group), and, L ₂ is - (CH _{2) r} - or -CO (CH _{2) s} - a (where, r and s are independently Is an integer of 2 to 4)), and the biosensor surface according to claim 1. 【請求項６】 一般式（Ｉ）におけるｍが０である請求
項５記載のバイオセンサー表面。6. The biosensor surface according to claim 5, wherein m in the general formula (I) is 0. 【請求項７】 一般式（Ｉ）におけるｍが０以外である
請求項５記載のバイオセンサー表面。7. The biosensor surface according to claim 5, wherein m in the general formula (I) is other than 0. 【請求項８】 一般式（Ｉ′） 【化４】 （上式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ａ、Ｂ、ｐ、ｍおよびｎは
請求項１の一般式（Ｉ）について定義したのと同義であ
り、Ｌ₁′は−ＮＨＣＯ−、Ｎ(Ｒ^d)ＣＨ₂ＣＨ₂−または
−ＯＣＨ₂ＣＨ₂−であって、ここで、Ｒ^dは低級アルキ
ル基であり、そしてＬ₂′は−(ＣＨ₂)_r−または−ＣＯ
(ＣＨ₂)_s−であって、ここでｒおよびｓは独立して、２
〜４の整数である）で表されるポリ（エチレングリコー
ル）セグメントを含有するポリマー誘導体。8. A compound represented by the general formula (I ′): (In the above formula, R ¹ , R ² , R ³ , A, B, p, m and n have the same meanings as defined for the general formula (I) of claim 1, L ₁ ′ is —NHCO—, N (R ^d ) CH ₂ CH ₂ — or —OCH ₂ CH ₂ —, where R ^d is a lower alkyl group, and L ₂ ′ is — (CH ₂ ) _r — or —CO.
(CH _{2) s} - a A, where r and s are independently 2
A polymer derivative containing a poly (ethylene glycol) segment represented by the formula: 【請求項９】 一般式（Ｉ′）におけるＢが 【化５】 で表され、かつ２つのＲ^bがそれらが結合する窒素原子
と一緒になって４〜７員のジシラーアザシクロヘテロ環
を形成しうる有機シリル型のアミノ保護基であるか、ま
たは２つのＲ^bが水素原子である請求項８記載のポリマ
ー誘導体。9. B in the general formula (I ′) is And two R ^b are an organic silyl type amino protecting group capable of forming a 4 to 7-membered disilaazacycloheterocycle together with the nitrogen atom to which they are attached, or The polymer derivative according to claim 8, wherein R ^b is a hydrogen atom. 【請求項１０】 一般式（Ｉ′）におけるｍが０である
請求項８記載のポリマー誘導体。10. The polymer derivative according to claim 8, wherein m in the general formula (I ′) is 0. 【請求項１１】 一般式（Ｉ′）におけるｍが０以外で
ある請求項９記載の誘導体。11. The derivative according to claim 9, wherein m in the general formula (I ′) is other than 0. 【請求項１２】 ガラス、半導体、セラミック、金属お
よび合金からなる群より選ばれる材料で形成された表面
を有するバイオセンサー表面を、一般式（Ｉ） 【化６】 （上式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は独立して、低級アルキ
ルを表し、Ｌ₁は第一の連結基または原子価結合を表
し、Ａは式 【化７】 を表し、ここで２つのＲ^aは独立して、水素原子または
低級アルキル基であり、そしてｑは２〜５の整数であ
り、Ｌ₂は第二の連結基であり、Ｂは官能基またはリガ
ンドを表し、ｐは２〜５の整数を表し、ｍは０または１
〜１０００の整数を表し、そしてｎは１０〜２０,００
０の整数を表す。）で表されるポリ（エチレングリコー
ル）セグメントを含有するポリマー誘導体と該誘導体の
溶媒の存在下で接触させ、溶媒を除去し、次いで乾燥さ
せ、必要により保護基を離脱した後、被検体と特異的に
結合しうる結合パートナーをポリマー末端に結合させる
ことを特徴とする請求項１記載のバイオセンサー表面の
作製方法。12. A biosensor surface having a surface formed of a material selected from the group consisting of glass, semiconductors, ceramics, metals and alloys, wherein the biosensor surface is represented by the general formula (I): (Wherein R ¹ , R ² and R ³ independently represent lower alkyl, L ₁ represents a first linking group or a valence bond, and A is of the formula Wherein two R ^a are independently a hydrogen atom or a lower alkyl group, q is an integer of 2 to 5, L ₂ is a second linking group, B is a functional group or Represents a ligand, p represents an integer of 2 to 5, and m represents 0 or 1.
Represents an integer of ~ 1000, and n is 10 to 20,000
Represents an integer of 0. ) Is brought into contact with a polymer derivative containing a poly (ethylene glycol) segment in the presence of a solvent for the derivative, the solvent is removed, and then the residue is dried, and if necessary, the protective group is removed, and then a specific substance with an analyte is obtained. The method for producing a biosensor surface according to claim 1, wherein a binding partner capable of mechanically binding is bound to a polymer end.