JP2003144193A - 微生物の検出方法及び装置 - Google Patents
微生物の検出方法及び装置Info
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 様々な環境中より特定の機能を持った微生物
を検出する方法及び装置を提供する。 【解決手段】 目的とする代謝反応の代謝生成物または
中間代謝物と反応して発色する発色検出試薬、または励
起光により蛍光を発する蛍光検出試薬をサンプルに添加
して、該代謝生成物または中間代謝物と該蛍光検出試薬
または発色検出試薬とを反応させるステップと、該蛍光
検出試薬または発色検出試薬の発色または蛍光を検出す
ることにより目的とする代謝反応を行う微生物を検出す
るステップにより、微生物を検出する。また、サンプル
容器と、蛍光検出試薬または発色検出試薬を該サンプル
容器に注入するための試薬注入手段と、発色または蛍光
検出手段とを備えた微生物検出装置を用いて微生物の検
出を行う。
を検出する方法及び装置を提供する。 【解決手段】 目的とする代謝反応の代謝生成物または
中間代謝物と反応して発色する発色検出試薬、または励
起光により蛍光を発する蛍光検出試薬をサンプルに添加
して、該代謝生成物または中間代謝物と該蛍光検出試薬
または発色検出試薬とを反応させるステップと、該蛍光
検出試薬または発色検出試薬の発色または蛍光を検出す
ることにより目的とする代謝反応を行う微生物を検出す
るステップにより、微生物を検出する。また、サンプル
容器と、蛍光検出試薬または発色検出試薬を該サンプル
容器に注入するための試薬注入手段と、発色または蛍光
検出手段とを備えた微生物検出装置を用いて微生物の検
出を行う。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、様々な環境中から
特定の機能を持った微生物を検出する方法及び装置に関
する。
特定の機能を持った微生物を検出する方法及び装置に関
する。
【０００２】
【従来の技術】廃水処理における活性汚泥や土壌・河川
などの自然環境中で、特定の機能を持った微生物群の動
態を把握することは、処理の安定化・効率化や物質循環
のしくみを解明する上で極めて重要である。例えば、活
性汚泥の活性が低いときに原因を解明して改善するため
には、目的とする活性を有する微生物の検出及び定量が
必要である。
などの自然環境中で、特定の機能を持った微生物群の動
態を把握することは、処理の安定化・効率化や物質循環
のしくみを解明する上で極めて重要である。例えば、活
性汚泥の活性が低いときに原因を解明して改善するため
には、目的とする活性を有する微生物の検出及び定量が
必要である。
【０００３】サンプル中に特定の微生物が存在するか否
かを検出する方法としては、例えば、平板培養法や、Ｍ
ＰＮ法（Most Probable Number法；最確値法）が挙げら
れる。平板培養法は、目的とする微生物の増殖に適した
平板培地にサンプルをまき、コロニーが出現するか否か
を確認する方法である。一方、ＭＰＮ法は、目的とする
微生物の増殖に適した培地を入れた多数の試験管に数段
階に希釈したサンプルを一定量ずつ摂取して、十分な期
間培養した後に、菌の生育の有無を判定して統計処理に
より計数する方法である。
かを検出する方法としては、例えば、平板培養法や、Ｍ
ＰＮ法（Most Probable Number法；最確値法）が挙げら
れる。平板培養法は、目的とする微生物の増殖に適した
平板培地にサンプルをまき、コロニーが出現するか否か
を確認する方法である。一方、ＭＰＮ法は、目的とする
微生物の増殖に適した培地を入れた多数の試験管に数段
階に希釈したサンプルを一定量ずつ摂取して、十分な期
間培養した後に、菌の生育の有無を判定して統計処理に
より計数する方法である。
【０００４】これらの方法は、ともに培養を要する方法
である。平板培養法は簡便だが、培養の遅い微生物につ
いて検出を行う場合は検出に時間がかかるうえ、平板培
養法で培養できる微生物は全菌の数％と言われており、
実際の菌数よりも低く見積もられるという問題点があっ
た。また、ＭＰＮ法では、活性に基づき計測できるもの
の、平板培養法と同様に、検出される微生物数が低めに
カウントされるという難点がある。
である。平板培養法は簡便だが、培養の遅い微生物につ
いて検出を行う場合は検出に時間がかかるうえ、平板培
養法で培養できる微生物は全菌の数％と言われており、
実際の菌数よりも低く見積もられるという問題点があっ
た。また、ＭＰＮ法では、活性に基づき計測できるもの
の、平板培養法と同様に、検出される微生物数が低めに
カウントされるという難点がある。
【０００５】これらの問題点を克服するために、近年、
培養を伴わない微生物の検出方法が広く用いられるよう
になっている。例えば、ＦＩＳＨ法（Fluorescence in
situhybridization法）では、１６Ｓ ｒＲＮＡに相補
的な遺伝子プローブを蛍光ラベルし、微生物のＤＮＡと
反応させ、プローブとハイブリッドしたものを蛍光で検
出することにより特定の微生物を検出する。この方法で
は、検出は、顕微鏡により直接観察して行うことができ
る。抗体法では、特定の微生物の抗原と特異的に反応す
る抗体を蛍光標識し、微生物と反応させ、蛍光の有無に
より微生物を検出する方法であり、特異性が高い方法で
ある。
培養を伴わない微生物の検出方法が広く用いられるよう
になっている。例えば、ＦＩＳＨ法（Fluorescence in
situhybridization法）では、１６Ｓ ｒＲＮＡに相補
的な遺伝子プローブを蛍光ラベルし、微生物のＤＮＡと
反応させ、プローブとハイブリッドしたものを蛍光で検
出することにより特定の微生物を検出する。この方法で
は、検出は、顕微鏡により直接観察して行うことができ
る。抗体法では、特定の微生物の抗原と特異的に反応す
る抗体を蛍光標識し、微生物と反応させ、蛍光の有無に
より微生物を検出する方法であり、特異性が高い方法で
ある。
【０００６】ＦＩＳＨ法及び抗体法は、あくまで１６Ｓ
ｒＲＮＡの相同性や血清型といった微生物の分類に基
づく方法であり、系統的に近縁な微生物群を検出するこ
とが可能である。しかし、硝化を行う硝化菌や脱膣菌と
いったような同等の機能を有するが、系統的に離れた微
生物群は検出できないという欠点がある。また、これら
の方法により微生物の存在は確認できるものの、その微
生物が活性を発揮しているかどうかについては確認する
ことができない。例えば、ＦＩＳＨ法を用いてアンモニ
ア酸化細菌を検出する場合、Nitrosomonas属などに反応
するプローブを用いて検出を行うが、この方法では遺伝
学的に離れたアンモニア酸化細菌が存在しているときに
は検出することができない。また、検出されたアンモニ
ア酸化細菌が反応に関与しているのか、それとも休止状
態にあるのかということは判断できない。
ｒＲＮＡの相同性や血清型といった微生物の分類に基
づく方法であり、系統的に近縁な微生物群を検出するこ
とが可能である。しかし、硝化を行う硝化菌や脱膣菌と
いったような同等の機能を有するが、系統的に離れた微
生物群は検出できないという欠点がある。また、これら
の方法により微生物の存在は確認できるものの、その微
生物が活性を発揮しているかどうかについては確認する
ことができない。例えば、ＦＩＳＨ法を用いてアンモニ
ア酸化細菌を検出する場合、Nitrosomonas属などに反応
するプローブを用いて検出を行うが、この方法では遺伝
学的に離れたアンモニア酸化細菌が存在しているときに
は検出することができない。また、検出されたアンモニ
ア酸化細菌が反応に関与しているのか、それとも休止状
態にあるのかということは判断できない。
【０００７】同様に、蛍光抗体を用いた方法でも、ある
特定のアンモニア酸化細菌の検出は可能であるが、それ
以外の株には反応しない可能性が高く、しかも活性との
相関は得ることができない。
特定のアンモニア酸化細菌の検出は可能であるが、それ
以外の株には反応しない可能性が高く、しかも活性との
相関は得ることができない。
【０００８】ＰＣＲ法では、特定の遺伝子の両端の配列
に相補的なプライマーを用いて増幅させることにより微
生物を検出する。ＰＣＲ法では、例えば特定の酵素をコ
ードする遺伝子をターゲットとして特定の機能を有する
微生物を検出することは理論的には可能であるが、手順
上、抽出や増幅など、定量に影響を与える因子が多く、
また、ターゲットとする遺伝子がゲノム内に複数コピー
含まれている場合もあるため、特定の微生物の定量は困
難である。
に相補的なプライマーを用いて増幅させることにより微
生物を検出する。ＰＣＲ法では、例えば特定の酵素をコ
ードする遺伝子をターゲットとして特定の機能を有する
微生物を検出することは理論的には可能であるが、手順
上、抽出や増幅など、定量に影響を与える因子が多く、
また、ターゲットとする遺伝子がゲノム内に複数コピー
含まれている場合もあるため、特定の微生物の定量は困
難である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、特定の機能を有する微生物を定量的に検出できる方
法を鋭意検討し、本発明に想達するに至った。本発明
は、特定の代謝反応を有する微生物を、活性汚泥や、硝
化汚泥、あるいは土壌や河川水等の混合菌群から容易か
つ迅速に検出および定量できる方法及び装置を提供する
ことを目的とする。
は、特定の機能を有する微生物を定量的に検出できる方
法を鋭意検討し、本発明に想達するに至った。本発明
は、特定の代謝反応を有する微生物を、活性汚泥や、硝
化汚泥、あるいは土壌や河川水等の混合菌群から容易か
つ迅速に検出および定量できる方法及び装置を提供する
ことを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、特定の代謝反
応における代謝生成物または中間代謝物と特異的に反応
し、発色するかまたは蛍光を発する物質を用いることに
より、実際にその代謝活性を有する（機能している）微
生物を選択的に検出する方法および装置を提供する。
応における代謝生成物または中間代謝物と特異的に反応
し、発色するかまたは蛍光を発する物質を用いることに
より、実際にその代謝活性を有する（機能している）微
生物を選択的に検出する方法および装置を提供する。
【００１１】即ち、本発明は、目的とする代謝反応の代
謝生成物または中間代謝物と反応して発色する発色検出
試薬または励起光により蛍光を発する蛍光検出試薬をサ
ンプルに添加して、該代謝生成物または中間代謝物と該
蛍光検出試薬または発色検出試薬とを反応させるステッ
プと、該蛍光検出試薬または発色検出試薬の発色または
蛍光を検出することにより目的とする代謝反応を行う微
生物を検出するステップとを含む微生物の検出方法を提
供する。本発明の微生物の検出方法において、目的とす
る代謝反応の例としては、アンモニア酸化を挙げること
ができ、この場合、蛍光検出試薬にＤＡＦ−２、ＤＡＦ
−２ＤＡ、ＤＡＦ−ＦＭ、ＤＡＦ−ＦＭ ＤＡ、ＤＡＲ
−４Ｍ、ＤＡＲ−４ＭＡＭ、およびＤＡＮを用いること
ができる。
謝生成物または中間代謝物と反応して発色する発色検出
試薬または励起光により蛍光を発する蛍光検出試薬をサ
ンプルに添加して、該代謝生成物または中間代謝物と該
蛍光検出試薬または発色検出試薬とを反応させるステッ
プと、該蛍光検出試薬または発色検出試薬の発色または
蛍光を検出することにより目的とする代謝反応を行う微
生物を検出するステップとを含む微生物の検出方法を提
供する。本発明の微生物の検出方法において、目的とす
る代謝反応の例としては、アンモニア酸化を挙げること
ができ、この場合、蛍光検出試薬にＤＡＦ−２、ＤＡＦ
−２ＤＡ、ＤＡＦ−ＦＭ、ＤＡＦ−ＦＭ ＤＡ、ＤＡＲ
−４Ｍ、ＤＡＲ−４ＭＡＭ、およびＤＡＮを用いること
ができる。
【００１２】さらに、本発明では、サンプル容器と、蛍
光検出試薬または発色検出試薬を該サンプル容器に注入
するための試薬注入手段と、発色または蛍光検出手段と
を備えた微生物検出装置を提供する。
光検出試薬または発色検出試薬を該サンプル容器に注入
するための試薬注入手段と、発色または蛍光検出手段と
を備えた微生物検出装置を提供する。
【００１３】本発明の方法及び装置により、遺伝的に近
縁ではないが同等の代謝活性を有する微生物を、その活
性に基づき定量的に検出することができる。また本発明
の方法は、試薬及び通常の顕微鏡でも検出することがで
き、極めて簡便かつ安全な方法である。
縁ではないが同等の代謝活性を有する微生物を、その活
性に基づき定量的に検出することができる。また本発明
の方法は、試薬及び通常の顕微鏡でも検出することがで
き、極めて簡便かつ安全な方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明は、反応生成物または中間
代謝物と特異的に反応し、発色するかまたは蛍光を発す
る物質を用いることにより、混合微生物系より特定の機
能を保持した微生物のみを選択的に検出する方法であ
る。
代謝物と特異的に反応し、発色するかまたは蛍光を発す
る物質を用いることにより、混合微生物系より特定の機
能を保持した微生物のみを選択的に検出する方法であ
る。
【００１５】本発明の適用先としては、活性汚泥や、硝
化汚泥、食品、あるいは土壌や河川水などが挙げられる
が、これに限るものではなく、広く適用可能である。
化汚泥、食品、あるいは土壌や河川水などが挙げられる
が、これに限るものではなく、広く適用可能である。
【００１６】本発明の方法及び装置により検出できる特
定の代謝活性を有する微生物とは、アンモニア酸化細
菌、亜硝酸酸化細菌、脱窒細菌、難分解性物質分解性細
菌、重金属酸化・還元細菌を例示できるが、これらに限
定されない。難分解性物質としては、ダイオキシンまた
はプラスチックが例示される。
定の代謝活性を有する微生物とは、アンモニア酸化細
菌、亜硝酸酸化細菌、脱窒細菌、難分解性物質分解性細
菌、重金属酸化・還元細菌を例示できるが、これらに限
定されない。難分解性物質としては、ダイオキシンまた
はプラスチックが例示される。
【００１７】本発明の発色物質（発色検出試薬）または
蛍光を発する物質（蛍光検出試薬）は、目的とする代謝
反応における代謝生成物または中間代謝物と特異的に反
応することによって、発色するかまたは蛍光を発する物
質であればよく、特に限定されない。発色検出試薬とし
ては、発色が強く、退色がほとんど起こらず、目視によ
り容易に検出可能なものが検出には好ましい。蛍光検出
試薬としては、蛍光強度が高いものがよく、蛍光の減弱
がほとんどなく、時間経過に伴う退色性が低いものが検
出には好ましい。
蛍光を発する物質（蛍光検出試薬）は、目的とする代謝
反応における代謝生成物または中間代謝物と特異的に反
応することによって、発色するかまたは蛍光を発する物
質であればよく、特に限定されない。発色検出試薬とし
ては、発色が強く、退色がほとんど起こらず、目視によ
り容易に検出可能なものが検出には好ましい。蛍光検出
試薬としては、蛍光強度が高いものがよく、蛍光の減弱
がほとんどなく、時間経過に伴う退色性が低いものが検
出には好ましい。
【００１８】本発明の方法では、例えばアンモニア酸化
細菌を検出する場合には、アンモニアからの代謝生成物
と反応して蛍光を発するＤＡＦ−２（ジアミノフルオレ
セイン−２、Diaminofluorescein-2）、ＤＡＦ−２ＤＡ
(Diaminofluorescein-2DA)、ＤＡＦ−ＦＭ(Diaminofluo
rescein-FM)、ＤＡＦ−ＦＭ ＤＡ(Diaminofluorescein
-FM diacetyl)、ＤＡＲ−４Ｍ(Diaminorhodamine-4M)、
ＤＡＲ−４Ｍ ＡＭ(Diaminorhodamine-4M AM)、ＤＡＮ
（Diaminonaphthalene)を用いることにより実際にアン
モニア酸化に関与している微生物のみを検出することが
できる。特に、ＤＡＦ−２ＤＡは、細胞内への透過性が
高いため、バックグランドを低く押さえることができ、
好ましい。これらの物質は、哺乳類の生体組織、培養細
胞、組織切片においてＮＯを検出するために使用される
が、アンモニア酸化細菌の検出に用いられたことはな
い。なお、これらの物質は、例えば第一化学薬品から入
手可能である。
細菌を検出する場合には、アンモニアからの代謝生成物
と反応して蛍光を発するＤＡＦ−２（ジアミノフルオレ
セイン−２、Diaminofluorescein-2）、ＤＡＦ−２ＤＡ
(Diaminofluorescein-2DA)、ＤＡＦ−ＦＭ(Diaminofluo
rescein-FM)、ＤＡＦ−ＦＭ ＤＡ(Diaminofluorescein
-FM diacetyl)、ＤＡＲ−４Ｍ(Diaminorhodamine-4M)、
ＤＡＲ−４Ｍ ＡＭ(Diaminorhodamine-4M AM)、ＤＡＮ
（Diaminonaphthalene)を用いることにより実際にアン
モニア酸化に関与している微生物のみを検出することが
できる。特に、ＤＡＦ−２ＤＡは、細胞内への透過性が
高いため、バックグランドを低く押さえることができ、
好ましい。これらの物質は、哺乳類の生体組織、培養細
胞、組織切片においてＮＯを検出するために使用される
が、アンモニア酸化細菌の検出に用いられたことはな
い。なお、これらの物質は、例えば第一化学薬品から入
手可能である。
【００１９】本発明の方法では、サンプルを中性のバッ
ファーで洗浄後、蛍光または発色検出試薬を含むバッフ
ァーに再懸濁する。このとき、検出を目的とする微生物
の栄養源をバッファーに添加するのが好ましい。例え
ば、アンモニア酸化細菌を検出する場合には、バッファ
ーにアンモニア性窒素を添加する。一定時間反応後、そ
のサンプルを顕微鏡にて肉眼で観察または写真撮影し
て、染色されているものまたは蛍光を発しているもの
を、検出対象である微生物として計数することができ
る。顕微鏡観察には、蛍光検出物質を用いる場合には、
落射式蛍光顕微鏡を使用することが可能であるが、これ
に限定されない。あるいは、フローセルやフローサイト
メトリーにより自動的に計数することもできる。
ファーで洗浄後、蛍光または発色検出試薬を含むバッフ
ァーに再懸濁する。このとき、検出を目的とする微生物
の栄養源をバッファーに添加するのが好ましい。例え
ば、アンモニア酸化細菌を検出する場合には、バッファ
ーにアンモニア性窒素を添加する。一定時間反応後、そ
のサンプルを顕微鏡にて肉眼で観察または写真撮影し
て、染色されているものまたは蛍光を発しているもの
を、検出対象である微生物として計数することができ
る。顕微鏡観察には、蛍光検出物質を用いる場合には、
落射式蛍光顕微鏡を使用することが可能であるが、これ
に限定されない。あるいは、フローセルやフローサイト
メトリーにより自動的に計数することもできる。
【００２０】検出試薬とサンプルとの反応方法として
は、チューブ内で反応させる方法やスライドグラス上で
反応させる方法、あるいはフィルター上に集めた微生物
に対して反応させる方法などを適用することができる
が、反応が進む条件下で行う限り特に限定されない。
は、チューブ内で反応させる方法やスライドグラス上で
反応させる方法、あるいはフィルター上に集めた微生物
に対して反応させる方法などを適用することができる
が、反応が進む条件下で行う限り特に限定されない。
【００２１】反応時間は、１０分から３時間程度であ
り、好ましくは１〜２時間である。反応温度は、１７〜
４７℃、好ましくは２７〜３７℃である。４７℃以上で
あると、バックグラウンドが高く、検出が困難になるほ
か、退色しやすいという難点がある。発色または蛍光の
検出時間は、２０秒程度がよく、短時間であるほど好ま
しい。長時間の励起光の照射は退色を起こすため望まし
くない。
り、好ましくは１〜２時間である。反応温度は、１７〜
４７℃、好ましくは２７〜３７℃である。４７℃以上で
あると、バックグラウンドが高く、検出が困難になるほ
か、退色しやすいという難点がある。発色または蛍光の
検出時間は、２０秒程度がよく、短時間であるほど好ま
しい。長時間の励起光の照射は退色を起こすため望まし
くない。
【００２２】この方法は従来のＦＩＳＨ法や蛍光抗体法
と比較して非常に簡便であり、また反応に直接関与する
微生物を系統的に近縁でないものも含めて検出および定
量できるという意味において画期的である。
と比較して非常に簡便であり、また反応に直接関与する
微生物を系統的に近縁でないものも含めて検出および定
量できるという意味において画期的である。
【００２３】また、本発明の装置は、試薬注入手段、サ
ンプル容器、発色または蛍光検出手段を組み合わせて一
体化し、検出を自動化するものである。サンプル容器の
大きさ及び形状は特に限定されず、チューブ、スライド
グラス、フィルターを有する容器などが例示される。試
薬注入手段は、一定量の試薬をサンプル容器に注入でき
る手段であれば特に限定されない。例えば、液体クロマ
トグラフ用定量送液装置（液体クロマトグラフ用定量ポ
ンプ等）のような装置により試薬注入を行うことができ
る。また検出手段の例としては、一定時間経過後に、そ
のまま、または励起光を照射して発色させたうえで、画
像処理により発色または蛍光の程度を数値化したり、フ
ローセルまたはフローサイトメトリーにより目的とする
微生物数を計数する。また、蛍光顕微鏡等による検出も
可能である。なお、適宜選択に応じて、反応温度を一定
に、例えば２７〜３７℃に保つための温度保持手段等を
設けることもできる。
ンプル容器、発色または蛍光検出手段を組み合わせて一
体化し、検出を自動化するものである。サンプル容器の
大きさ及び形状は特に限定されず、チューブ、スライド
グラス、フィルターを有する容器などが例示される。試
薬注入手段は、一定量の試薬をサンプル容器に注入でき
る手段であれば特に限定されない。例えば、液体クロマ
トグラフ用定量送液装置（液体クロマトグラフ用定量ポ
ンプ等）のような装置により試薬注入を行うことができ
る。また検出手段の例としては、一定時間経過後に、そ
のまま、または励起光を照射して発色させたうえで、画
像処理により発色または蛍光の程度を数値化したり、フ
ローセルまたはフローサイトメトリーにより目的とする
微生物数を計数する。また、蛍光顕微鏡等による検出も
可能である。なお、適宜選択に応じて、反応温度を一定
に、例えば２７〜３７℃に保つための温度保持手段等を
設けることもできる。
【００２４】本発明の装置は、検出対象となる活性汚泥
等のサンプルをバッファーなどで洗浄後、サンプル容器
に入れると、適量の発色検出試薬または蛍光検出試薬が
試薬注入手段によりサンプル容器に投入される。適当な
反応時間が経過した後（例えば、２時間後）に、発色ま
たは蛍光検出手段により目的とする微生物を検出及び定
量する。
等のサンプルをバッファーなどで洗浄後、サンプル容器
に入れると、適量の発色検出試薬または蛍光検出試薬が
試薬注入手段によりサンプル容器に投入される。適当な
反応時間が経過した後（例えば、２時間後）に、発色ま
たは蛍光検出手段により目的とする微生物を検出及び定
量する。
【００２５】本発明の装置の一例を、図１に示す。定量
送液ポンプのような試薬注入手段１により試薬容器２か
ら反応器３内のサンプル容器に注入される。反応器３内
のサンプル容器には、予め洗浄等の処理を行った汚泥や
土壌が投入されていて、検出試薬が注入された後、混合
及び加熱される。反応は、液中、スライドガラス上、フ
ィルター上など様々な状態で行うことができる。反応器
３に接続した発色または蛍光検出手段４は、反応後のサ
ンプルをフローセル、フローサイトメトリー、蛍光顕微
鏡などにより検出できる。検出手段４には、検出した結
果を解析するための解析装置５が備えられている。この
ような本発明の装置により、小型の装置で簡便に、目的
とする微生物微生物の検出及び定量を行うことができ
る。
送液ポンプのような試薬注入手段１により試薬容器２か
ら反応器３内のサンプル容器に注入される。反応器３内
のサンプル容器には、予め洗浄等の処理を行った汚泥や
土壌が投入されていて、検出試薬が注入された後、混合
及び加熱される。反応は、液中、スライドガラス上、フ
ィルター上など様々な状態で行うことができる。反応器
３に接続した発色または蛍光検出手段４は、反応後のサ
ンプルをフローセル、フローサイトメトリー、蛍光顕微
鏡などにより検出できる。検出手段４には、検出した結
果を解析するための解析装置５が備えられている。この
ような本発明の装置により、小型の装置で簡便に、目的
とする微生物微生物の検出及び定量を行うことができ
る。
【００２６】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細
に説明するが、これらにより本発明を制限するものでは
ない。 実施例１ アンモニア酸化細菌Nitrosomonas sp. MK-8 (FERM P-12
555)の洗浄液２ｍＬを０．２μｍのフィルターに通して
菌体を回収した。この菌体を５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッ
ファーで洗浄し、遠心分離によりさらに回収した。洗浄
を２回行った後に、菌体を５０ｍｇＮ／Ｌのアンモニア
性窒素を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー１ｍＬに
再懸濁し、ＤＡＦ−２を５μＬ添加した。撹拌した後VE
CTABONDでコーティングしたスライドグラスにサンプル
を滴下し、カバーグラスをかけ、２７℃で２時間放置
後、落射式蛍光顕微鏡（BX-50 OLYMPUS製）で観察し
た。観察はＢ励起にて行った。
に説明するが、これらにより本発明を制限するものでは
ない。 実施例１ アンモニア酸化細菌Nitrosomonas sp. MK-8 (FERM P-12
555)の洗浄液２ｍＬを０．２μｍのフィルターに通して
菌体を回収した。この菌体を５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッ
ファーで洗浄し、遠心分離によりさらに回収した。洗浄
を２回行った後に、菌体を５０ｍｇＮ／Ｌのアンモニア
性窒素を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー１ｍＬに
再懸濁し、ＤＡＦ−２を５μＬ添加した。撹拌した後VE
CTABONDでコーティングしたスライドグラスにサンプル
を滴下し、カバーグラスをかけ、２７℃で２時間放置
後、落射式蛍光顕微鏡（BX-50 OLYMPUS製）で観察し
た。観察はＢ励起にて行った。
【００２７】その結果を図２及び図３に示す。図２は明
視野、図３はＢ励起による写真である。なお、菌体をア
ンモニア性窒素を含まないＨＥＰＥＳバッファーに再懸
濁し、同様な操作を行い確認した結果を図４及び図５に
示す。アンモニア性窒素を添加した系では、多くの細胞
が蛍光を発しているのに対し（図３）、アンモニア性窒
素を添加しなかった系では蛍光を発する細胞は認められ
なかった（図５）。アンモニア性窒素を添加した系で蛍
光を発しなかった細胞は、死滅したか活性の低い細胞で
あると考えられる。
視野、図３はＢ励起による写真である。なお、菌体をア
ンモニア性窒素を含まないＨＥＰＥＳバッファーに再懸
濁し、同様な操作を行い確認した結果を図４及び図５に
示す。アンモニア性窒素を添加した系では、多くの細胞
が蛍光を発しているのに対し（図３）、アンモニア性窒
素を添加しなかった系では蛍光を発する細胞は認められ
なかった（図５）。アンモニア性窒素を添加した系で蛍
光を発しなかった細胞は、死滅したか活性の低い細胞で
あると考えられる。
【００２８】実施例２
連続培養を行っている硝化汚泥（MLSS 約5000mg/L）
０．５ｍＬを遠心回収し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッフ
ァーで２回洗浄し遠心分離により菌体をさらに回収し
た。その後、汚泥を５０ｍｇ−Ｎ／Ｌのアンモニア性窒
素を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー１ｍＬに再懸
濁し、ＤＡＦ−２を５μＬ添加した。撹拌した後、ＶＥ
ＣＴＡＢＯＮＤ（フナコシ製）でコーティングしたスラ
イドグラスにサンプルを滴下し、カバーグラスをかけ、
２時間放置後、落射式蛍光顕微鏡（BX-50 OLYMPUS製）
で観察した。観察はＢ励起にて行った。
０．５ｍＬを遠心回収し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッフ
ァーで２回洗浄し遠心分離により菌体をさらに回収し
た。その後、汚泥を５０ｍｇ−Ｎ／Ｌのアンモニア性窒
素を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー１ｍＬに再懸
濁し、ＤＡＦ−２を５μＬ添加した。撹拌した後、ＶＥ
ＣＴＡＢＯＮＤ（フナコシ製）でコーティングしたスラ
イドグラスにサンプルを滴下し、カバーグラスをかけ、
２時間放置後、落射式蛍光顕微鏡（BX-50 OLYMPUS製）
で観察した。観察はＢ励起にて行った。
【００２９】その結果を図６及び図７に示す。図６が明
視野、図７がＢ励起による写真である。アンモニアを酸
化し、亜硝酸性窒素を生成した菌体のみが蛍光を発し、
活性汚泥からアンモニア酸化細菌を検出することができ
た。
視野、図７がＢ励起による写真である。アンモニアを酸
化し、亜硝酸性窒素を生成した菌体のみが蛍光を発し、
活性汚泥からアンモニア酸化細菌を検出することができ
た。
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、非常に簡便に、目的と
する反応に直接関与する微生物を系統的に近縁でないも
のも含めて検出および定量できる。例えば、アンモニア
から生じる代謝生成物と反応し、蛍光を発する物質を用
いることにより、活性汚泥中よりアンモニア酸化細菌を
検出することができる。また、本発明の装置は、小型の
装置で簡便に、目的とする微生物微生物の検出及び定量
を行うことができる。
する反応に直接関与する微生物を系統的に近縁でないも
のも含めて検出および定量できる。例えば、アンモニア
から生じる代謝生成物と反応し、蛍光を発する物質を用
いることにより、活性汚泥中よりアンモニア酸化細菌を
検出することができる。また、本発明の装置は、小型の
装置で簡便に、目的とする微生物微生物の検出及び定量
を行うことができる。
【図１】本発明の検出装置の一例を示す図である。
【図２】図２は、実施例１の結果のうち、アンモニア性
窒素を添加した系の明視野の写真を示す。
窒素を添加した系の明視野の写真を示す。
【図３】図３は、実施例１の結果のうち、アンモニア性
窒素を添加した系のＢ励起による写真である。
窒素を添加した系のＢ励起による写真である。
【図４】図４は、実施例１の結果のうち、アンモニア性
窒素を添加していない系の明視野による写真である。
窒素を添加していない系の明視野による写真である。
【図５】図５は、実施例１の結果のうち、アンモニア性
窒素を添加していない系のＢ励起による写真である。
窒素を添加していない系のＢ励起による写真である。
【図６】図６は、実施例２の結果のうち、明視野の写真
を示す。
を示す。
【図７】図７は、実施例２の結果のうち、Ｂ励起による
写真を示す。
写真を示す。
１ 試薬注入手段
２ 試薬容器
３ 反応器
４ 蛍光検出手段
５ 解析装置
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA17 CA03 DA02 DA05
EA01 FA02 GA07 GB07 GB21
LA01
2G054 AA08 AB03 CA20 EA03 FA08
GA04
4B029 AA07 BB01 CC01 FA01
4B063 QA01 QQ05 QR66 QR74 QS20
QS36 QX02
Claims (4)
- 【請求項１】 目的とする代謝反応の代謝生成物または
中間代謝物と反応して発色する発色検出試薬、または励
起光により蛍光を発する蛍光検出試薬をサンプルに添加
して、該代謝生成物または中間代謝物と該蛍光検出試薬
または発色検出試薬とを反応させるステップと、該蛍光
検出試薬または発色検出試薬の発色または蛍光を検出す
ることにより目的とする代謝反応を行う微生物を検出す
るステップとを含む微生物の検出方法。 - 【請求項２】 目的とする代謝反応が、アンモニア酸化
である請求項１に記載の微生物の検出方法。 - 【請求項３】 蛍光検出試薬が、ＤＡＦ−２、ＤＡＦ−
２ＤＡ、ＤＡＦ−ＦＭ、ＤＡＦ−ＦＭ ＤＡ、ＤＡＲ−
４Ｍ、ＤＡＲ−４Ｍ ＡＭ、およびＤＡＮの何れか一以
上から選ばれる請求項２に記載の微生物の検出方法。 - 【請求項４】 サンプル容器と、蛍光検出試薬または発
色検出試薬を該サンプル容器に注入するための試薬注入
手段と、発色または蛍光検出手段とを備えた微生物検出
装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001344823A JP2003144193A (ja) | 2001-11-09 | 2001-11-09 | 微生物の検出方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001344823A JP2003144193A (ja) | 2001-11-09 | 2001-11-09 | 微生物の検出方法及び装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003144193A true JP2003144193A (ja) | 2003-05-20 |
Family
ID=19158284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001344823A Withdrawn JP2003144193A (ja) | 2001-11-09 | 2001-11-09 | 微生物の検出方法及び装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003144193A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1593736A1 (en) * | 2004-05-06 | 2005-11-09 | Sanyo Electric Co., Ltd. | Microorganisms detecting device and method |
| JP2016106632A (ja) * | 2014-12-02 | 2016-06-20 | 国立大学法人信州大学 | 微生物の検知方法及び検知装置 |
| CN113604328A (zh) * | 2021-08-09 | 2021-11-05 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 扩增检测装置及扩增检测方法 |
-
2001
- 2001-11-09 JP JP2001344823A patent/JP2003144193A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1593736A1 (en) * | 2004-05-06 | 2005-11-09 | Sanyo Electric Co., Ltd. | Microorganisms detecting device and method |
| JP2016106632A (ja) * | 2014-12-02 | 2016-06-20 | 国立大学法人信州大学 | 微生物の検知方法及び検知装置 |
| CN113604328A (zh) * | 2021-08-09 | 2021-11-05 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 扩增检测装置及扩增检测方法 |
| CN113604328B (zh) * | 2021-08-09 | 2024-04-09 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 扩增检测装置及扩增检测方法 |
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|---|---|---|---|
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