JP2003121396A - Melting temperature measuring apparatus using spectrometry - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To improve accuracy while shortening measuring time in an apparatus for measuring the relation between temperatures and absorbances to ultraviolet light and computing Tm values on the basis of the measurement. SOLUTION: A temperature profile can be set so as to raise or lower temperatures stepwise when sequentially and repeatedly measuring the absorbance of a sample solution to be measured or a blank sample solution housed in each cell of multi-cells 32 while raising or lowering temperatures. The temperature of a thermostatic block 33 is raised to a certain temperature by a heating/cooling unit 34 at measurement, and its temperature is maintained for a period of time specified as measurement stand-by time. Since the temperatures of the sample solutions are stabilized during this, the absorbance of each cell is measured while sequentially moving the multi-cells 32 by a slide drive part 37 after its stabilization. Since temperatures become the same at the absorbance measurement of the sample solution to be measured and the absorbance measurement of the blank sample solution by this, it is possible to remove the effects of solvents and highly accurately obtain absorbance by DNA.

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、紫外可視分光光度
計を利用してＤＮＡ溶液の温度変化に対する吸光度変化
を測定し、その測定結果に基づいてＤＮＡの融解温度を
算出するための融解温度測定装置に関する。 【０００２】 【従来の技術】近年、人間やそのほかの生物のＤＮＡ
（デオキシリボ核酸）の構造解析が各種の研究機関で非
常に盛んに行われている。一般に、ＤＮＡは、２本のＤ
ＮＡ分子の間でアデニンとチミン、又はグアニンとシト
シンとが相補的塩基対を形成した２本鎖構造を有してい
る。このような２本鎖構造は、ＤＮＡを溶解させたＤＮ
Ａ溶液の温度を上昇させてゆくことによって徐々に解れ
てゆき、高温溶液中では完全に解れて１本鎖構造にな
る。 【０００３】融解温度（以下「Ｔｍ値」という）は、こ
うしたＤＮＡの２重鎖構造の安定性を示す重要な指標値
の一つである。一般にＴｍ値の測定は次のような手順で
行われる。上述したようにＤＮＡが２本鎖から１本鎖に
変化すると、波長２６０μｍ付近の紫外光の吸光度が上
昇する。そこで、ＤＮＡ溶液を低温度から徐々に加温し
つつ、又は逆に高温度から徐々に冷却しつつ所定の紫外
波長での吸光度を繰り返し測定し、横軸を温度、縦軸を
吸光度とした図２に示すような熱融解曲線を作成する。
そして、その熱融解曲線に基づいて（通常、吸光度上昇
の中点をとって）Ｔｍ値を求める。 【０００４】紫外光の吸光度の測定は紫外可視分光光度
計を用いて行われるが、複数種類のＤＮＡのＴｍ値を並
行して測定するなど効率的な測定を行うために、試料溶
液を収容するセルとしては、マルチセルと呼ばれる複数
の小型のセルを連装した多連装セルが利用されている。
このようなマルチセルを使用した分光測定では、マルチ
セルのうちの１個乃至複数個のセルに溶媒のみのブラン
ク試料溶液を収容し、残りのセルに分析対象の測定試料
溶液を収容した状態で、これら全体を予め作成された温
度制御プログラムに従って温冷ユニットにより加温又は
冷却しながら、設定された温度間隔毎に各セルの吸光度
を測定する。そして、各温度での測定試料溶液による吸
光度からブランク試料溶液による吸光度を差し引くこと
によって溶媒の影響を排除したＤＮＡによる吸光度を求
める。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うなマルチセルを使用した分光測定では、各セルに対す
る吸光度測定を順番に行ってゆくため、全てのセルに対
する測定を一通り行う間にも加温又は冷却が進んでしま
う。そのため、ブランク試料溶液による吸光度を測定し
た時点での温度と測定試料溶液による吸光度を測定した
時点での温度とは厳密には同一とはならない。また、セ
ル内の試料溶液が温冷ユニットの温度に達するまでには
時間的な遅れがある。そのため、ＤＮＡのＴｍ値を求め
る際にはこうしたことが大きな誤差要因となり得る。 【０００６】上記理由のため、精度の高い測定を行うに
は、計算上無視できる程度に加温速度又は冷却速度を小
さく設定しておくか、或いは、ブランク試料溶液による
吸光度を測定した時点と測定試料溶液による吸光度を測
定した時点での温度差を想定したデータ補正処理を行う
必要があった。前者によると全体的な測定時間が非常に
長くなり能率が悪く実用的でない。一方、後者では、複
雑な演算が必要である上に、完全な補正は困難であるた
めに補正しきれない分だけ精度が落ちることは避けられ
ない。 【０００７】本発明はこのような課題を解決するために
成されたものであり、その主たる目的とするところは、
マルチセルを用いた分光測定によりＤＮＡ溶液の吸光度
を測定し、これによってＤＮＡのＴｍ値を算出する場合
に、複雑な補正演算処理などを行うことなく高い精度を
達成するとともに、測定時間が極端に長くなることも回
避することができる融解温度測定装置を提供することに
ある。 【０００８】 【課題を解決するための手段、及び効果】上記課題を解
決するために成された本発明は、溶媒のみのブランク試
料溶液を収容した少なくとも１つのセルと、ＤＮＡが前
記溶媒に溶解した測定試料溶液を収容した少なくとも１
つのセルとを備える多連装のセルを用い、前記ブランク
試料溶液及び測定試料溶液の温度を変化させつつ、測定
光に対する前記ブランク試料溶液による吸光度と測定試
料溶液による吸光度とを繰り返し測定し、その測定結果
から溶媒の影響を除去したＤＮＡによる吸光度と温度と
の関係を求め、それに基づいてＤＮＡの融解温度を算出
する融解温度測定装置において、 a)前記多連装セルの温度を上昇又は下降させるための温
冷手段と、 b)前記多連装セルの温度を階段状に上昇又は下降させる
べく前記温冷手段を制御する温度制御手段と、 c)階段状に温度が変化する際の温度が一定である期間中
にあって、所定時間だけ温度一定状態が継続した後に、
前記多連装セルに収容されている複数の試料溶液の吸光
度測定を順次実行し、温度が階段状に上昇又は下降する
毎に該測定を繰り返す測定実行手段と、を備えることを
特徴としている。 【０００９】本発明に係る融解温度測定装置では、測定
対象であるＤＮＡの或る温度Ｔ１における吸光度を算出
するために必要な、ブランク試料溶液による吸光度と測
定試料溶液による吸光度とを測定する時点に先立って、
両試料溶液を収容したセルを備えた多連装セルは、温度
制御手段及び温冷手段により、温度Ｔ１に昇温又は降温
されてから所定時間だけその温度Ｔ１に維持される。し
たがって、セル内の試料溶液の温度は目的とする温度Ｔ
１に充分に安定するとともに、両試料溶液の温度は必ず
同一になる。そのため、温度Ｔ１における、溶媒の影響
を除去したＤＮＡによる吸光度を算出する際に温度に起
因する誤差が発生せず、ＤＮＡによる吸光度と温度との
関係を高い精度で求めることができる。これにより、複
雑な補正演算処理を行うことなく、高い精度でＴｍ値を
算出することができる。 【００１０】また、昇温又は降温実行後に温度を一定に
維持する待機時間を確保する必要はあるものの、昇温や
降温速度自体は温冷手段の能力によって制限を受ける程
度まで大きくしてもよいので、従来のように計算上問題
がない程度に昇温又は降温速度を落として測定を行う場
合に比べると、遙かに短時間で測定を終了させることが
できる。したがって、効率的な測定が可能である。 【００１１】 【発明の実施の形態】以下、本発明の一実施例による融
解温度測定装置について図面を参照して説明する。 【００１２】図１は本実施例の融解温度測定装置の全体
構成図である。この装置は、主要部として、いわゆるダ
ブルビーム方式の紫外可視分光光度計の測光部１と、各
種の演算処理や制御処理を行うパーソナルコンピュータ
（ＰＣ）２０と、マルチセル３２を備えた試料ユニット
３０とを含む。パーソナルコンピュータ２０には所定の
制御プログラムが搭載されており、この制御プログラム
を実行することにより後述するような各種の処理が実行
される。 【００１３】測光部１にあっては、光源２から発した光
は分光器３に入射され、ここで所望の波長を有する単色
光が取り出される。ここで波長としては、230〜280μｍ
位の範囲内の紫外光が利用されることが多い。この単色
光は反射鏡４によりセクタ鏡５に送られ、セクタ鏡５に
より試料側光束Ｓと対照側光束Ｒの２光束に分割され
る。また、セクタ鏡５には光の遮蔽部が設けられてお
り、試料側光束Ｓ及び対照側光束Ｒの発生期間と交互に
遮光期間が発生するようにしている。試料側光束Ｓは反
射鏡６を介して、試料ユニット３０に備えられたマルチ
セル３２のうちの１つのセルに照射され、そのセルを通
過した光は反射鏡８、１０を介して光検出器１１の受光
面に送られる。他方、対照側光束Ｒは反射鏡７を介して
試料ユニット３０内のアパーチャ板３１に照射され、ア
パーチャ板３１を通過することによって試料側と光束径
が揃えられ、その光が反射鏡９を介して同じく光検出器
１１の受光面に送られる。なお、アパーチャ板３１の代
わりにダミーのセルを配置してもよい。 【００１４】光検出器１１の出力信号は、サンプルホー
ルド回路やアナログ−デジタル変換器などを含むインタ
フェイス部（Ｉ/Ｆ）１２を介してパーソナルコンピュ
ータ２０によって具現化される吸光度算出部２２に入力
され、ここで例えば吸光度を算出するための各種の演算
処理が実行される。その演算結果である吸光度はＴｍ値
算出部２３に与えられ、ここで図２に示すような熱融解
曲線が作成されるとともに、この曲線に基づいてＴｍ値
が計算される。中央制御部２１は、測光部１や試料ユニ
ット３０内の各部の動作を制御する機能を有する。ま
た、パーソナルコンピュータ２０に接続された操作部２
４は例えばキーボードやポインティングデバイスなどで
あり、測定に関連する各種パラメータの設定や各種測
定、処理の指示を行うためのものである。更にまた、表
示部２５は操作のための補助的情報や測定結果等を画面
に表示するものである。 【００１５】試料ユニット３０において、マルチセル３
２は容量が１００μｍ程度である小型の石英製のセルを
複数一列に並べて配置したものであり、その全体がスラ
イド駆動部３７によって試料側光束Ｓと略直交する方向
に往復直線運動をするように構成されている。これによ
り、いずれのセルにも選択的に試料側光束Ｓが照射され
る。このマルチセル３２は恒温ブロック３３に保持され
ており、該恒温ブロック３３はペルチエ素子などを利用
した温冷ユニット３４で迅速に加温又は冷却されるよう
になっている。恒温ブロック３３には１乃至複数の温度
センサ３６が付設されており、それによる検出温度は温
度制御部３５に与えられている。温度制御部３５は中央
制御部２１より温度の制御目標値Ｔｃを受け取り、検出
温度がその制御目標値Ｔｃになるように、つまりその差
がゼロになるように温冷ユニット３４に供給する電力を
制御する。したがって、本装置では、制御目標値Ｔｃを
適宜に設定することにより、所定の温度範囲（通常は温
冷ユニット３４の能力の範囲）で任意の温度における試
料の吸光度の測定が可能である。 【００１６】次に、本実施例の装置における測定時の温
度制御方法について説明する。測定の開始に先立って、
測定条件の一つとして温度プログラムを入力設定する。
図４は本実施例の装置において温度プログラムを設定す
るための表示画面を示す図である。オペレータが操作部
２４より所定の操作を行うと、表示部２５の画面上には
図４に示すような温度設定ダイアログ４０が表示され
る。 【００１７】この温度設定ダイアログ４０中の主要パラ
メータ設定部４１では、温度プログラムを設定するため
のパラメータとして、「開始温度」、「開始保持（時
間）」、「温度速度」、「測定待機（時間）」及び「測
定（温度）間隔」がそれぞれ数値で入力設定できるよう
になっている。ここで、「開始保持」とは上記開始温度
を維持する時間、「測定待機」とは、それぞれの昇温後
において測定が開始されるまでに待機する時間である。 【００１８】図４の例では、昇温の開始温度が２０℃
で、その温度を６０秒間維持した後に、１℃／分の昇温
速度でもって０．５℃上昇する毎に１２０秒の測定待機
時間を設けている。このようなパラメータが全て入力さ
れると、それに応じた温度プロファイルがグラフ４２に
表示される。本装置では、「測定待機」というパラメー
タを設けることによって、階段状に上昇する温度プロフ
ァイルを設定することが可能である。なお、主要パラメ
ータ設定部４１では複数行に亘って温度プログラムを入
力設定することができるから、測定温度範囲毎に測定温
度間隔を変えた温度プロファイルを作成することもでき
る。例えば、通常、熱融解曲線は温度が２５〜５０℃位
の範囲でその傾きが大きくなるので、２０〜２５℃及び
５０℃以上の範囲では測定温度間隔を１℃とし、２５〜
５０℃の範囲では測定温度間隔を０．５℃と細かくすれ
ば、精度の高い熱融解曲線を作成することができる。 【００１９】マルチセル３２のうちの１乃至複数のセル
にはＤＮＡが溶解していない溶媒のみのブランク試料溶
液が、残りのセルにはＤＮＡが溶解した測定試料溶液が
収容され、上記のような温度設定ダイアログ４０におい
て温度プログラムが設定された後に、測定開始が指示さ
れる。 【００２０】測定が開始されると、中央制御部２１は上
述したように設定された温度プログラムに従って温度の
制御目標値Ｔｃを温度制御部３５へと送る。温度制御部
３５はこれに応じて温度センサ３６による検出温度が制
御目標値Ｔｃと一致するように温冷ユニット３４への供
給電力を制御する。いま、例えば図３（ａ）に示すよう
に制御目標値Ｔｃが与えられたとする。すると、それに
応じて温度制御部３５は温冷ユニット３４を制御する
が、恒温ブロック３３の実際の温度はオーバシュートが
生じたり時間的な遅延が生じたりするから、例えば図３
（ｂ）に示すようになる。マルチセル３２の各セルに収
容されている試料溶液は恒温ブロック３３からの熱伝導
によって変化するから、試料溶液の実際の温度は更に遅
延して例えば図３（ｃ）に示すように変化する。 【００２１】上記のように昇温後には「測定待機」とし
て設定された時間だけ温度が一定に維持されるから、そ
の時間は図３（ｄ）に示すように温度安定化期間とな
り、試料溶液の実際の温度は上記のように遅延して変化
したとしても、温度安定化期間中には所望の、つまり制
御目標値Ｔｃに落ち着く。測定待機時間が経過した後も
制御目標値Ｔｃはその直前までの温度に維持され、その
状態で、中央制御部２１からの指示により所定波長の紫
外光に対する吸光度の測定が実行される。 【００２２】すなわち、スライド駆動部３７は各セルに
順番に試料側光束Ｓが照射されるようにマルチセル３２
を順次移動させる。測光部１は各セルに対して、そのセ
ルを通過した光の強度を光検出器１１で検出するととも
に、セクタ鏡５の回転に同期して交互に対照側光束Ｒの
光の強度も光検出器１１で検出する。いま、対照側光束
Ｒの光量に対して光検出器１１で得られる電気信号が
ｒ、試料側光束Ｓの光量に対して光検出器１１で得られ
る電気信号がｓであり、更に、セクタ鏡５による光の断
続的な遮蔽によって、対照側光束Ｒに対応したゼロ信号
がｚ_ｒ、試料側光束Ｓに対応したゼロ信号がｚ_ｓとして
それぞれ得られるとき、対照側光束Ｒと試料側光束Ｓの
信号比Ｗは、Ｗ＝（ｓ−ｚ_ｓ）／（ｒ−ｚ_ｒ）として得
られる。これにより、光源２の光量変動などの影響を除
去することができる。 【００２３】なお、１個のセルに対する測定は、或る１
つの波長の紫外光を用いて行う場合もあるし、或いは、
分光器３を駆動することによって所定の波長範囲で波長
走査を行う場合もあるが、ここでは前者の測定を行うも
のとする。 【００２４】所定波長の紫外光に対する各セルの通過光
量の測定を順次行う間、マルチセル３２の温度は一定に
維持される。したがって、吸光度算出部２２では、光検
出器１１からの検出信号を受けて、或る温度における測
定試料溶液による測定結果とブランク試料溶液による測
定結果から、溶媒の影響を除外したＤＮＡによる吸光度
を算出することができる。このような測定を、昇温を階
段状に行う各段階において１巡ずつ実行すると、Ｔｍ値
算出部２３では、温度と吸光度との関係から各測定試料
溶液に対する熱溶融曲線が作成できる。そこで、この熱
溶融曲線に基づいてＴｍ値を算出する。 【００２５】このように、本実施例の装置では、吸光度
を算出する際に利用される測定試料溶液の吸光度測定及
びブランク試料溶液の吸光度測定における温度が同一で
あるので、ＤＮＡによる吸光度を非常に高い精度で算出
することができる。したがって、熱融解曲線に基づくＴ
ｍ値も高い精度で算出することができる。また、所定温
度だけ昇温又は降温した後に試料溶液の温度が安定する
までの時間だけ待機することを除けば、昇温や降温は急
速に行うことができるので、測定全体に要する時間はそ
れほど長くならずに済む。 【００２６】なお、上記実施例は単に一例であって、本
発明の趣旨の範囲で適宜に変更や修正を行えることは明
らかである。Description: BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention measures an absorbance change of a DNA solution with respect to a temperature change by using an ultraviolet-visible spectrophotometer, and based on the measurement result, determines the amount of DNA. The present invention relates to a melting temperature measuring device for calculating a melting temperature. [0002] In recent years, DNA of humans and other organisms has been
Structural analysis of (deoxyribonucleic acid) has been very active in various research institutions. Generally, DNA contains two D
It has a double-stranded structure in which adenine and thymine or guanine and cytosine form complementary base pairs between NA molecules. Such a double-stranded structure is obtained by dissolving DNA in DN.
As the temperature of the solution A increases, it gradually dissolves, and completely dissolves in a high-temperature solution to form a single-stranded structure. [0003] The melting temperature (hereinafter referred to as "Tm value") is one of the important index values indicating the stability of such a double-stranded structure of DNA. Generally, the measurement of the Tm value is performed in the following procedure. As described above, when the DNA changes from double-stranded to single-stranded, the absorbance of ultraviolet light having a wavelength of about 260 μm increases. Therefore, while gradually heating the DNA solution from a low temperature, or conversely, gradually cooling from a high temperature, the absorbance at a predetermined ultraviolet wavelength is repeatedly measured, and the horizontal axis represents the temperature, and the vertical axis represents the absorbance. A heat melting curve as shown in FIG.
Then, a Tm value is obtained based on the heat melting curve (usually by taking the midpoint of the increase in absorbance). [0004] The measurement of the absorbance of ultraviolet light is performed using an ultraviolet-visible spectrophotometer. In order to perform an efficient measurement such as measuring the Tm values of a plurality of types of DNA in parallel, a sample solution is stored. As a cell, a multi-connected cell called a multi-cell in which a plurality of small cells are connected is used.
In the spectroscopic measurement using such a multi-cell, one or more of the multi-cells contain a blank sample solution containing only a solvent, and the remaining cells contain a measurement sample solution to be analyzed. While the whole is heated or cooled by a heating / cooling unit according to a temperature control program created in advance, the absorbance of each cell is measured at set temperature intervals. Then, by subtracting the absorbance of the blank sample solution from the absorbance of the measurement sample solution at each temperature, the absorbance of the DNA excluding the influence of the solvent is determined. [0005] However, in such a spectroscopic measurement using a multi-cell, since the absorbance measurement for each cell is performed in order, it is necessary to perform the measurement for all the cells in one go. Heating or cooling proceeds. Therefore, the temperature at the time of measuring the absorbance of the blank sample solution and the temperature at the time of measuring the absorbance of the measurement sample solution are not exactly the same. There is a time delay before the sample solution in the cell reaches the temperature of the heating / cooling unit. Therefore, when obtaining the Tm value of DNA, such a situation can be a major error factor. For the above reasons, in order to perform highly accurate measurement, the heating rate or the cooling rate should be set to be negligibly small in the calculation, or the time when the absorbance of the blank sample solution was measured and the measurement time should be measured. It was necessary to perform data correction processing assuming a temperature difference at the time when the absorbance of the sample solution was measured. According to the former, the overall measurement time becomes very long, the efficiency is poor and it is not practical. On the other hand, in the latter, complicated calculations are required, and it is inevitable that the accuracy is reduced by an amount that cannot be completely corrected because complete correction is difficult. The present invention has been made to solve such a problem, and its main object is to provide:
When measuring the absorbance of a DNA solution by spectrometry using a multi-cell and calculating the Tm value of the DNA thereby, high accuracy is achieved without performing complicated correction arithmetic processing and the measurement time is extremely long. It is another object of the present invention to provide a melting temperature measuring device that can prevent the occurrence of the melting temperature. Means for Solving the Problems and Effects The present invention has been made to solve the above-mentioned problems. According to the present invention, at least one cell containing a blank sample solution containing only a solvent and DNA are dissolved in the solvent. At least one containing the measured sample solution
Using a plurality of cells including a plurality of cells, while changing the temperature of the blank sample solution and the measurement sample solution, the absorbance of the blank sample solution and the absorbance of the measurement sample solution with respect to the measurement light are repeatedly measured, and the measurement is performed. In a melting temperature measuring device for determining the relationship between the absorbance and the temperature of the DNA from which the influence of the solvent has been removed from the results and calculating the melting temperature of the DNA based on the relationship, a) for raising or lowering the temperature of the multiple cells; Heating / cooling means; b) a temperature control means for controlling the heating / cooling means to raise or lower the temperature of the multiple cells in a stepwise manner; c) a temperature at which the temperature changes stepwise is constant. During the period, after the temperature constant state has continued for a predetermined time,
And a measurement execution unit for sequentially executing the absorbance measurement of the plurality of sample solutions contained in the multiple cells and repeating the measurement every time the temperature rises or falls stepwise. In the melting temperature measuring apparatus according to the present invention, at the time of measuring the absorbance of the blank sample solution and the absorbance of the measurement sample solution required for calculating the absorbance of the DNA to be measured at a certain temperature T1. prior to,
The multiple mounted cell including the cells containing both sample solutions is maintained at the temperature T1 for a predetermined time after the temperature is raised or lowered to the temperature T1 by the temperature control means and the heating / cooling means. Therefore, the temperature of the sample solution in the cell is equal to the target temperature T.
In addition to being sufficiently stable to 1, the temperatures of both sample solutions are always the same. Therefore, when calculating the absorbance of the DNA from which the influence of the solvent has been removed at the temperature T1, no error due to the temperature occurs, and the relationship between the absorbance of the DNA and the temperature can be obtained with high accuracy. Thus, the Tm value can be calculated with high accuracy without performing complicated correction calculation processing. Although it is necessary to secure a standby time for keeping the temperature constant after the temperature increase or decrease, the temperature increase or decrease rate itself may be increased to the extent that it is limited by the capability of the heating and cooling means. Therefore, the measurement can be completed in a much shorter time as compared with the conventional case where the measurement is performed with the temperature rising or lowering rate lowered to such an extent that there is no problem in calculation. Therefore, efficient measurement is possible. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, a melting temperature measuring apparatus according to an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is an overall configuration diagram of a melting temperature measuring apparatus according to the present embodiment. This apparatus includes, as main components, a photometer 1 of a so-called double beam ultraviolet-visible spectrophotometer, a personal computer (PC) 20 for performing various arithmetic processing and control processing, and a sample unit 30 having a multi-cell 32. including. The personal computer 20 is loaded with a predetermined control program, and by executing this control program, various processes described later are executed. In the photometric unit 1, light emitted from a light source 2 is incident on a spectroscope 3, where monochromatic light having a desired wavelength is extracted. Here, the wavelength is 230-280 μm
Ultraviolet light in the range of the order is often used. The monochromatic light is sent to the sector mirror 5 by the reflecting mirror 4 and is divided by the sector mirror 5 into two light beams, ie, the sample-side light beam S and the reference-side light beam R. Further, the sector mirror 5 is provided with a light shielding portion, so that a light shielding period is generated alternately with a generation period of the sample-side light flux S and the control-side light flux R. The sample-side light flux S is applied to one of the multi-cells 32 provided in the sample unit 30 via the reflecting mirror 6, and the light passing through the cell is reflected by the photodetector 11 via the reflecting mirrors 8 and 10. Is sent to the light receiving surface. On the other hand, the control-side light beam R is applied to the aperture plate 31 in the sample unit 30 via the reflecting mirror 7 and passes through the aperture plate 31 so that the light beam diameter is equal to that of the sample side. The light is similarly sent to the light receiving surface of the photodetector 11. Note that a dummy cell may be arranged instead of the aperture plate 31. The output signal of the photodetector 11 is input to an absorbance calculator 22 embodied by a personal computer 20 via an interface (I / F) 12 including a sample-hold circuit and an analog-digital converter. Then, for example, various calculation processes for calculating the absorbance are executed. The absorbance as the calculation result is provided to the Tm value calculation unit 23, where a heat melting curve as shown in FIG. 2 is created, and the Tm value is calculated based on this curve. The central control unit 21 has a function of controlling operations of the photometric unit 1 and each unit in the sample unit 30. The operation unit 2 connected to the personal computer 20
Reference numeral 4 denotes a keyboard or a pointing device, for example, for setting various parameters related to measurement and for giving instructions for various measurements and processes. Further, the display unit 25 displays auxiliary information for operation, measurement results, and the like on a screen. In the sample unit 30, the multi-cell 3
Numeral 2 denotes a plurality of small quartz cells having a capacity of about 100 μm arranged in a line, and the whole is reciprocated linearly by a slide drive unit 37 in a direction substantially orthogonal to the sample side light flux S. It is configured. As a result, the sample-side light flux S is selectively irradiated to any of the cells. The multicell 32 is held in a constant temperature block 33, and the constant temperature block 33 is quickly heated or cooled by a heating / cooling unit 34 using a Peltier element or the like. One or a plurality of temperature sensors 36 are attached to the constant temperature block 33, and the temperature detected thereby is given to the temperature control unit 35. The temperature control unit 35 receives the temperature control target value Tc from the central control unit 21 and controls the power supplied to the heating / cooling unit 34 so that the detected temperature becomes the control target value Tc, that is, the difference becomes zero. Control. Therefore, in the present apparatus, by appropriately setting the control target value Tc, it is possible to measure the absorbance of the sample at an arbitrary temperature in a predetermined temperature range (usually the range of the capacity of the heating / cooling unit 34). Next, a description will be given of a temperature control method at the time of measurement in the apparatus of this embodiment. Before starting the measurement,
Input and set a temperature program as one of the measurement conditions.
FIG. 4 is a view showing a display screen for setting a temperature program in the apparatus of this embodiment. When the operator performs a predetermined operation from the operation unit 24, a temperature setting dialog 40 as shown in FIG. In the main parameter setting section 41 in the temperature setting dialog 40, parameters for setting a temperature program include "start temperature", "start hold (time)", "temperature speed", and "measurement standby (time)". )) And “measurement (temperature) interval” can be input and set in numerical values. Here, “start holding” is a time for maintaining the above-mentioned start temperature, and “measurement standby” is a time for waiting until the measurement is started after each temperature rise. In the example of FIG. 4, the starting temperature of the temperature rise is 20 ° C.
After maintaining the temperature for 60 seconds, a measurement standby time of 120 seconds is provided for every 0.5 ° C. increase at a rate of 1 ° C./min. When all such parameters are input, a temperature profile corresponding to the parameters is displayed on the graph 42. In the present apparatus, by providing a parameter “standby for measurement”, it is possible to set a temperature profile that rises stepwise. Since the main parameter setting section 41 can input and set a temperature program over a plurality of rows, it is also possible to create a temperature profile in which the measurement temperature interval is changed for each measurement temperature range. For example, the slope of the heat melting curve usually increases in the temperature range of about 25 to 50 ° C., so that the measurement temperature interval is set to 1 ° C. in the range of 20 to 25 ° C. and 50 ° C. or higher, and 25 to 25 ° C.
In the range of 50 ° C., if the measurement temperature interval is made as small as 0.5 ° C., a highly accurate heat melting curve can be created. One or more cells of the multi-cell 32 contain a blank sample solution containing only a solvent in which DNA is not dissolved, and the remaining cells contain a measurement sample solution in which DNA is dissolved. After the temperature program is set in the setting dialog 40, the start of measurement is instructed. When the measurement is started, the central control unit 21 sends the temperature control target value Tc to the temperature control unit 35 according to the temperature program set as described above. The temperature controller 35 controls the power supplied to the heating / cooling unit 34 so that the temperature detected by the temperature sensor 36 matches the control target value Tc. Now, it is assumed that the control target value Tc is given, for example, as shown in FIG. Then, the temperature control unit 35 controls the heating / cooling unit 34 in response thereto. However, the actual temperature of the constant temperature block 33 causes an overshoot or a time delay.
The result is as shown in FIG. Since the sample solution contained in each cell of the multi-cell 32 changes due to the heat conduction from the constant temperature block 33, the actual temperature of the sample solution further changes further, for example, as shown in FIG. As described above, after the temperature is raised, the temperature is kept constant for a time set as "measurement standby", and the time is a temperature stabilization period as shown in FIG. Even if the actual temperature changes with a delay as described above, during the temperature stabilization period, the actual temperature settles at a desired, that is, the control target value Tc. Even after the elapse of the measurement standby time, the control target value Tc is maintained at the temperature immediately before that, and in that state, the measurement of the absorbance with respect to the ultraviolet light of the predetermined wavelength is executed according to an instruction from the central control unit 21. That is, the slide driving unit 37 operates the multi-cell 32 so that each sample is irradiated with the sample side light flux S in turn.
Are sequentially moved. The photometric unit 1 detects the intensity of the light passing through the cell with the photodetector 11 for each cell, and also detects the intensity of the light of the reference light beam R alternately in synchronization with the rotation of the sector mirror 5. Is detected by the detector 11. Now, r is an electric signal obtained by the photodetector 11 with respect to the light amount of the control side light beam R, and s is an electric signal obtained by the light detector 11 with respect to the light amount of the sample side light beam S. When the zero signal corresponding to the reference light beam R is obtained as z _r and the zero signal corresponding to the sample light beam S is obtained as z _s by the intermittent blocking of the light by 5, respectively, the control light beam R and the sample light beam S are obtained. Is obtained as W = (s−z _s ) / (r−z _r ). As a result, it is possible to eliminate the influence of the light amount fluctuation of the light source 2 and the like. Note that the measurement for one cell is a certain one.
May be performed using ultraviolet light of two wavelengths, or
In some cases, wavelength scanning may be performed in a predetermined wavelength range by driving the spectroscope 3, but here the former measurement is performed. The temperature of the multi-cell 32 is kept constant while sequentially measuring the amount of light passing through each cell with respect to ultraviolet light of a predetermined wavelength. Therefore, the absorbance calculation unit 22 receives the detection signal from the photodetector 11 and calculates the absorbance of the DNA excluding the influence of the solvent from the measurement result of the measurement sample solution at a certain temperature and the measurement result of the blank sample solution at a certain temperature. can do. When such measurement is performed one cycle at each stage in which the temperature is raised stepwise, the Tm value calculation unit 23 can create a heat melting curve for each measurement sample solution from the relationship between the temperature and the absorbance. Therefore, a Tm value is calculated based on the heat melting curve. As described above, in the apparatus according to the present embodiment, since the temperature in the absorbance measurement of the measurement sample solution used for calculating the absorbance and the temperature in the absorbance measurement of the blank sample solution are the same, the absorbance due to DNA is extremely low. It can be calculated with high accuracy. Therefore, T based on the heat melting curve
The m value can also be calculated with high accuracy. Also, except for waiting for the time until the temperature of the sample solution stabilizes after raising or lowering the temperature by a predetermined temperature, the temperature can be raised or lowered rapidly, so that the time required for the entire measurement is so long. You don't have to. The above embodiment is merely an example, and it is apparent that changes and modifications can be made as appropriate within the scope of the present invention.

【図面の簡単な説明】 【図１】 本発明の一実施例による融解温度測定装置の
要部の構成図。 【図２】 熱融解曲線の一例を示す図。 【図３】 本実施例の融解温度測定装置における昇温動
作を説明するための図。 【図４】 本実施例の融解温度測定装置における温度プ
ログラム設定時の表示画面を示す図。 【符号の説明】 １…測光部 ２…光源 ３…分光器 ４，６，７，８，９，１０…反射鏡 ５…セクタ鏡 １１…光検出器 １２…インタフェイス部 ２０…パーソナルコンピュータ ２１…中央制御部 ２２…吸光度算出部 ２３…Ｔｍ値算出部 ２４…操作部 ２５…表示部 ３０…試料ユニット ３１…アパーチャ板 ３２…マルチセル ３３…恒温ブロック ３４…温冷ユニット ３５…温度制御部 ３６…温度センサ ３７…スライド駆動部 Ｒ…対照側光束 Ｓ…試料側光束BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a configuration diagram of a main part of a melting temperature measuring device according to an embodiment of the present invention. FIG. 2 is a diagram showing an example of a heat melting curve. FIG. 3 is a diagram for explaining a temperature raising operation in the melting temperature measuring device of the present embodiment. FIG. 4 is a view showing a display screen when a temperature program is set in the melting temperature measuring apparatus of the present embodiment. [Description of Signs] 1... Photometric unit 2. Light source 3 Spectroscope 4, 6, 7, 8, 9, 10… Reflector mirror 5… Sector mirror 11… Photodetector 12… Interface unit 20… Personal computer 21… Central control unit 22 ... Absorbance calculation unit 23 ... Tm value calculation unit 24 ... Operation unit 25 ... Display unit 30 ... Sample unit 31 ... Aperture plate 32 ... Multi cell 33 ... Constant temperature block 34 ... Heating / cooling unit 35 ... Temperature control unit 36 ... Temperature Sensor 37: slide drive unit R: control side light beam S: sample side light beam

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G020 AA05 BA05 BA20 CA02 CB05 CB44 CC13 CC53 CD04 CD13 CD22 CD34 2G040 BA01 BA24 CA12 EC03 2G057 AA01 AB03 AB06 AC01 BA01 BD10 EA06 HA01 2G059 AA01 AA03 BB12 DD12 DD13 DD16 EE01 EE12 FF09 GG10 HH03 HH06 JJ06 JJ14 JJ30 KK01 MM01 MM11 NN05    ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    F term (reference) 2G020 AA05 BA05 BA20 CA02 CB05                       CB44 CC13 CC53 CD04 CD13                       CD22 CD34                 2G040 BA01 BA24 CA12 EC03                 2G057 AA01 AB03 AB06 AC01 BA01                       BD10 EA06 HA01                 2G059 AA01 AA03 BB12 DD12 DD13                       DD16 EE01 EE12 FF09 GG10                       HH03 HH06 JJ06 JJ14 JJ30                       KK01 MM01 MM11 NN05

Claims (1)

【特許請求の範囲】 【請求項１】 溶媒のみのブランク試料溶液を収容した
少なくとも１つのセルと、ＤＮＡが前記溶媒に溶解した
測定試料溶液を収容した少なくとも１つのセルとを備え
る多連装のセルを用い、前記ブランク試料溶液及び測定
試料溶液の温度を変化させつつ、測定光に対する前記ブ
ランク試料溶液による吸光度と測定試料溶液による吸光
度とを繰り返し測定し、その測定結果から溶媒の影響を
除去したＤＮＡによる吸光度と温度との関係を求め、そ
れに基づいてＤＮＡの融解温度を算出する融解温度測定
装置において、 a)前記多連装セルの温度を上昇又は下降させるための温
冷手段と、 b)前記多連装セルの温度を階段状に上昇又は下降させる
べく前記温冷手段を制御する温度制御手段と、 c)階段状に温度が変化する際の温度が一定である期間中
にあって、所定時間だけ温度一定状態が継続した後に、
前記多連装セルに収容されている複数の試料溶液の吸光
度測定を順次実行し、温度が階段状に上昇又は下降する
毎に該測定を繰り返す測定実行手段と、 を備えることを特徴とする、分光測定を用いた融解温度
測定装置。Claims: 1. A multiple cell comprising at least one cell containing a blank sample solution containing only a solvent and at least one cell containing a measurement sample solution in which DNA is dissolved in the solvent. The DNA obtained by repeatedly measuring the absorbance of the blank sample solution and the absorbance of the measurement sample solution with respect to the measurement light while changing the temperatures of the blank sample solution and the measurement sample solution, and removing the influence of the solvent from the measurement results A melting temperature measuring device for calculating the melting temperature of DNA based on the relationship between the absorbance and the temperature of the multiple cells; a) heating and cooling means for raising or lowering the temperature of the multiple cells; Temperature control means for controlling the heating / cooling means so as to raise or lower the temperature of the connected cells stepwise; c) the temperature at which the temperature changes stepwise Be in a constant across time, after the constant temperature state continues for a predetermined time,
Measurement execution means for sequentially executing the absorbance measurement of a plurality of sample solutions contained in the multiple cells, and repeating the measurement each time the temperature rises or falls stepwise, comprising: Melting temperature measurement device using measurement.