JP2003107086A - Nucleic acid probe array using substrate with frosting surface - Google Patents
Nucleic acid probe array using substrate with frosting surfaceInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸ハイブリダイ
ゼーション反応に用いる核酸プローブアレイに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a nucleic acid probe array used in a nucleic acid hybridization reaction.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、遺伝子の発現頻度等を検出する手
法として、核酸プローブアレイを用いた核酸ハイブリダ
イゼーション反応が広く行われている。この核酸ハイブ
リダイゼーション反応は、標的核酸とこれに相補的な核
酸プローブとの間のハイブリダイゼーション反応によっ
て標的核酸を検出するものであり、核酸プローブを固定
化した核酸プローブアレイを用いて行われる。2. Description of the Related Art In recent years, a nucleic acid hybridization reaction using a nucleic acid probe array has been widely performed as a method for detecting the expression frequency of a gene. This nucleic acid hybridization reaction detects a target nucleic acid by a hybridization reaction between a target nucleic acid and a nucleic acid probe complementary thereto, and is performed using a nucleic acid probe array on which the nucleic acid probe is immobilized.
【０００３】核酸ハイブリダイゼーション反応は、当
初、DNAの負電荷を利用してナイロン膜上にプローブDNA
を固相化し、該ナイロン膜上でのブロッティング反応と
して行われていた。しかし、近年ではマイクロアレイ技
術により、一定規格のスライドガラス（約7.5cm×2.5c
m）上に多数のプローブDNAを高密度に固相化したもの
（特願平11-189360号）、およびフォトリソグラフィー
技術を用いて半導体基板上でDNAプローブを合成伸長さ
せたものが用いられるようになった。ナイロン膜の場合
には、一つのプローブスポットが3mm〜5mmであったのに
対して、このようなマイクロアレイ技術では、100μm〜
300μmの極微小なスポットが可能であるため、高密度化
が達成される。また、ハイブリダイゼーション反応後の
検出についても、ナイロン膜の場合は膜自体がバックグ
ラウンド蛍光を発するので蛍光標識を使用できず、その
ため化学発光やラジオアイソトープが標識に用いられて
いる。これに対して、マイクロアレイ技術では、基板に
使用するガラスまたはシリコン基板の蛍光が小さいの
で、蛍光標識を用いてハイブリダイゼーション反応の結
果を検出することが可能である。Initially, a nucleic acid hybridization reaction utilizes a negative charge of DNA to probe DNA on a nylon membrane.
Was solid-phased, and it was carried out as a blotting reaction on the nylon membrane. However, in recent years, due to the microarray technology, a certain standard slide glass (about 7.5 cm × 2.5 c
m) which has a large number of probe DNA immobilized on it in high density (Japanese Patent Application No. 11-189360), and a synthetically extended DNA probe on a semiconductor substrate using photolithography technology. Became. In the case of nylon membrane, one probe spot was 3 mm to 5 mm, whereas in such microarray technology, 100 μm to
Since a very small spot of 300 μm is possible, high density is achieved. Also, for the detection after the hybridization reaction, in the case of the nylon membrane, the membrane itself emits background fluorescence, so that a fluorescent label cannot be used, and therefore chemiluminescence or radioisotope is used for labeling. On the other hand, in the microarray technology, the fluorescence of the glass or silicon substrate used for the substrate is small, and therefore the result of the hybridization reaction can be detected by using the fluorescent label.
【０００４】しかし、マイクロアレイ技術で使用するガ
ラス基板やシリコン基板は、ナイロン膜と比較して１ス
ポット当りのプローブDNAの固相化量が少ないため、検
出時の蛍光出力が小さくなり、感度を向上するのが困難
であるという問題があった。However, since the glass substrate or silicon substrate used in the microarray technology has a smaller amount of immobilized probe DNA per spot as compared with a nylon film, the fluorescence output at the time of detection becomes small and the sensitivity is improved. There was a problem that it was difficult to do.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】上記事情に鑑み、本発
明は、核酸プローブアレイにおける各スポット当りのDN
Aプローブ固相化量を増大して、検出感度を高めること
を目的とする。In view of the above circumstances, the present invention provides a DN for each spot in a nucleic acid probe array.
The purpose is to increase the amount of immobilized A probe and increase the detection sensitivity.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】上記課題を達成するため
に、本発明では、核酸プローブアレイを構成する基板の
少なくとも核酸プローブ固相化領域表面をフロスト加工
することにより、プローブの固相化に使用できる基板表
面積を増大させることとした。In order to achieve the above object, in the present invention, at least the surface of a nucleic acid probe-immobilized region of a substrate constituting a nucleic acid probe array is frost-processed to immobilize the probes. It was decided to increase the usable substrate surface area.
【０００７】即ち、本発明による核酸プローブアレイ
は、固相担体と、該固相担体表面の少なくとも核酸プロ
ーブを固相化する領域に形成されたフロスト面と、該フ
ロスト面に固相化された核酸プローブとを具備すること
を特徴とするものである。That is, the nucleic acid probe array according to the present invention has a solid phase carrier, a frost surface formed on at least a region of the surface of the solid phase carrier for solidifying the nucleic acid probe, and a solid phase immobilized on the frost surface. And a nucleic acid probe.
【０００８】本発明によれば、固相担体表面における核
酸プローブの固相化のための表面積が大きくなるため、
より多くの核酸プローブを固相化でき、これによって検
出感度の向上を図ることができる。According to the present invention, since the surface area for immobilizing the nucleic acid probe on the surface of the solid phase carrier becomes large,
A larger amount of nucleic acid probe can be immobilized on the solid phase, which can improve the detection sensitivity.
【０００９】また、核酸プローブ溶液の点着を使用する
ときは、上記のような固相化表面積の増大だけでなく、
フロスト処理で表面状態が変化することにより核酸プロ
ーブ溶液を保持する能力が増大することも、スポット当
りで更に多くの核酸プローブを固相化することに寄与し
ていると思われる。Further, when the spotting of the nucleic acid probe solution is used, not only the above-mentioned increase of the solid-phased surface area,
The increase in the ability to hold the nucleic acid probe solution due to the change in the surface state by the frost treatment is also considered to contribute to immobilization of more nucleic acid probes per spot.
【００１０】[0010]
【実施の形態】本発明において、固相担体の材料は特に
限定されず、例えばシリコン、ガラス、石英ガラス、ア
ルミナ、サファイア、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素な
どの無機絶縁材料、並びにポリエチレンテレフタレー
ト、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレ
ン、ポリカーボネート、フェノール樹脂、ユリア樹脂、
エポキシ樹脂、シリコーン樹脂等の有機材料を用いるこ
とができる。蛍光を発しないものが好ましい。固相担体
の形状も特に限定されず、例えば、矩形または三角形等
を含む平板状、およびビーズのような球状、フローセ
ル、アフィニティーカラムまたはキャピラリーアレイの
ような中空状、紙面またはプラスチックテープのような
シート状等のように、所要量の反応成分を受容できる広
がりを持った平面的ないし曲面的な反応領域を形成した
ものが挙げられる。また、凹凸を形成し得る周面を有す
るような繊維状、紐状ないし棒状等の固相担体も挙げら
れる。これらの固相担体は、その剛性、光透過性、寸法
等を使用目的に応じて適宜最適化することにより、実用
的且つ有用性の高いものに設計することができる。顕微
鏡のようなステージ上での測定を実行する上では、生物
学的顕微鏡に使用されるようなスライドガラス規格に適
合した平板状が好ましい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present invention, the material of the solid phase carrier is not particularly limited, and examples thereof include inorganic insulating materials such as silicon, glass, quartz glass, alumina, sapphire, silicon carbide, silicon oxide and silicon nitride, and polyethylene terephthalate. Acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, polycarbonate, phenol resin, urea resin,
Organic materials such as epoxy resin and silicone resin can be used. Those that do not emit fluorescence are preferred. The shape of the solid phase carrier is not particularly limited, and for example, a flat plate shape including a rectangle or a triangle, a spherical shape such as beads, a hollow shape such as a flow cell, an affinity column or a capillary array, a paper surface or a sheet such as a plastic tape. Such as a shape or the like, one having a flat or curved reaction region having a spread capable of receiving a required amount of a reaction component is exemplified. Further, a fibrous, string-like or rod-like solid phase carrier having a peripheral surface capable of forming irregularities can also be mentioned. These solid phase carriers can be designed to be practical and highly useful by appropriately optimizing the rigidity, light transmittance, size and the like according to the purpose of use. In performing the measurement on a stage such as a microscope, a flat plate conforming to the glass slide standard used in a biological microscope is preferable.
【００１１】固相担体の表面のフロスト面は、サンドブ
ラスト法、レーザーアブレーション法、化学的エッチン
グ法等の公知の方法により、表面に微小な凹凸を形成す
ることにより設けることができる。凹凸の大きさおよび
深さは0.5〜100μmであり、好ましくは0.5〜10μmであ
る。このような有効範囲に設定された凹凸を所望の密
度、例えば100個／mm2以上に設定することは、特に、核
酸を固相化する場合に好適な固相の場を提供する。100
μmを越える寸法で且つ100個／mm2未満の密度で凹凸を
形成した固相担体に核酸を固相化した場合には、或る程
度の固相化量の増加は認められるにしても、反応領域お
よび／または測定領域が微小なので、測定データの顕著
な増加を望むことはできない。その結果、製造コストに
対する検査コストの比率が高くなり、大量処理には適さ
ないものとなる傾向がある。The frosted surface on the surface of the solid phase carrier can be provided by forming fine irregularities on the surface by a known method such as a sandblast method, a laser ablation method, or a chemical etching method. The size and depth of the irregularities is 0.5 to 100 μm, preferably 0.5 to 10 μm. Setting the concavities and convexities set in such an effective range to a desired density, for example, 100 / mm 2 or more, provides a solid phase field suitable for immobilizing nucleic acids. 100
When a nucleic acid is immobilized on a solid-phase carrier having irregularities formed with a size of more than 100 μm and a density of less than 100 pieces / mm 2 , a certain increase in the amount of immobilization is recognized, Due to the small reaction area and / or measurement area, a significant increase in measured data cannot be expected. As a result, the ratio of the inspection cost to the manufacturing cost becomes high, and it tends to be unsuitable for mass processing.
【００１２】図１（Ａ）に示すように、フロスト面２は
固相担体１の全面に設けてもよいが、図１（Ｂ）に示す
ようなキャピラリー形状、図１（Ｃ）に示すスポット形
状のように、核酸プローブを固相化する領域にのみ設け
てもよい。担体の所定領域にのみ選択的にフロスト面を
形成するには、フォトリソグラフィーを使用すればよ
い。先ず、ラミネータを用いることにより、ドライフィ
ルムレジスト（例えば東京応用化学社製のオーディルBF
-410または405）でコーティングする。このコーティン
グした担体に、通常のフォトリソグラフィーによりマス
クパターンを露光し現像することにより、フロスト形成
領域を露出させると共に、それ以外の領域をレジストパ
ターンで保護する。この状態でサンドブラスト法を適用
することにより、露出された基板表面にのみフロスト面
を形成することができる。また、固相担体の全面または
一定領域に一様にフロスト面を形成した後に、フロスト
面として残したい領域以外の部分を平坦化するようにし
てもよい。公知のプリント技術を利用すれば、任意領域
を選択的に適宜の膜（例えば、テフロン（登録商標）等
のプラスチック材料の膜）により被覆することができ
る。このような被覆膜は、測定に好ましいように光遮断
性であってもよい。後述する実施例のように蛍光量を測
定する場合には、所望の反応領域以外の部分を例えば暗
黒色の膜で被覆処理することにより、固相担体を伝播し
得る余分な蛍光を能動的に排除できる。As shown in FIG. 1 (A), the frosted surface 2 may be provided on the entire surface of the solid-phase carrier 1, but a capillary shape as shown in FIG. 1 (B) and a spot shown in FIG. 1 (C). Like the shape, the nucleic acid probe may be provided only in the region where it is immobilized. Photolithography may be used to selectively form the frosted surface only in a predetermined region of the carrier. First, a dry film resist (for example, Audil BF manufactured by Tokyo Applied Chemistry Co., Ltd.) is used by using a laminator.
-410 or 405). A mask pattern is exposed and developed on the coated carrier by ordinary photolithography to expose the frost formation region and protect the other regions with a resist pattern. By applying the sandblast method in this state, the frosted surface can be formed only on the exposed substrate surface. Alternatively, after the frosted surface is uniformly formed on the entire surface of the solid phase carrier or on a certain area, the area other than the area to be left as the frosted surface may be flattened. By using a known printing technique, an arbitrary region can be selectively covered with an appropriate film (for example, a film made of a plastic material such as Teflon (registered trademark)). Such a coating may be light-tight as preferred for the measurement. When measuring the amount of fluorescence as in the example described later, by coating the portion other than the desired reaction region with, for example, a dark black film, excess fluorescence that can propagate through the solid phase carrier is actively activated. Can be eliminated.
【００１３】上記フロスト面に固着される核酸プローブ
としては、ＤＮＡおよびＲＮＡの外、ＰＮＡ (peptide
nucleic acid)、メチルホスホネート核酸、ホスホロチ
オエートＤＮＡのような核酸誘導体等を使用することが
できる。また、合成オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ産物
等、如何なる方法で得た核酸も使用できる。As the nucleic acid probe fixed to the frosted surface, PNA (peptide
Nucleic acid), methylphosphonate nucleic acid, nucleic acid derivatives such as phosphorothioate DNA, and the like can be used. In addition, nucleic acids obtained by any method such as synthetic oligonucleotides and PCR products can be used.
【００１４】上記フロスト面に核酸プローブを固相化す
る方法としては、光固相化方式および点着方式の二つの
手法を用いることが可能である。As a method for immobilizing the nucleic acid probe on the frosted surface, two methods, a photoimmobilization method and a spotting method, can be used.
【００１５】光固相化方式とは、フォトリソグラフィー
技術を応用した方法である。まず、基板を予めマスクし
ておき、反応部位のみに光照射して脱保護を行い、脱保
護部分にのみ特異的にヌクレオチドを結合する。その後
に洗浄し、脱保護およびヌクレオチドの結合伸長を繰り
返して、核酸プローブを合成する。The photo-immobilization method is a method to which a photolithography technique is applied. First, the substrate is masked in advance, only the reaction site is irradiated with light for deprotection, and nucleotides are specifically bound only to the deprotected part. After that, washing is performed, and deprotection and nucleotide bond extension are repeated to synthesize a nucleic acid probe.
【００１６】点着方式とは、核酸プローブ溶液を基板に
点着することにより、核酸プローブを付着させる方法で
ある。核酸プローブ溶液を噴射させて点着するインクジ
ェット方式、および核酸プローブ溶液をピンで接触させ
ることにより点着するピン方式を利用することができ
る。The spotting method is a method of depositing a nucleic acid probe by spotting a nucleic acid probe solution on a substrate. An inkjet method in which a nucleic acid probe solution is sprayed to be spotted and a pin method in which a nucleic acid probe solution is spotted by contacting with a pin can be used.
【００１７】本発明においては、フロスト処理により微
小な凹凸が形成された固相基体表面に核酸プローブが固
相化されるため、平滑な基板表面を用いる場合よりも固
相化に利用可能な表面積が増大し、従って、より多くの
核酸プローブが固相化されることになる。加えて、点着
方式を用いる場合には、フロスト処理表面の液体吸引お
よび保持能力が増大するため、容積がより大きい核酸プ
ローブ溶液を点着保持されることも相俟って、更に多く
の核酸プローブを固相化することができる。こうして、
表面が平坦な担体を用いた場合に比較して、スポット当
りに固相化される核酸プローブの量が多くなるので、そ
の分だけ検出感度を向上することができる。フロスト処
理面の液体吸引力は、点着された領域からの滲みをもた
らすこともあるが、微小な凹凸の大きさが10μm以下、
好ましくは5μm以下、より好ましくは3μm未満、特に1
μm程度であれば液体を移動させる力が殆どなくなるの
で、余分な広がりを防止して良好な反応条件が得られ
る。逆に、凹凸の大きさおよび深さが3μm以上、特に10
μmを越える場合には、所望の反応領域内に実質的に一
定の表面積が得られるように凹凸の個数を略一定にする
のが好ましい。また、所要量の凹凸が固相基体の表面に
所定面積だけ露呈するようにフロスト加工の面積を設定
するか、或いはフロスト加工された表面をマスク部材で
覆うようにすれば、有効範囲内で任意の大きさおよび深
さからなる凹凸を採用することができる。また、フロス
ト加工の大きさ、深さ、間隔などの設定パラメータを一
定とすれば、加工が容易で且つ反応条件を均一にするこ
とができる。しかし、この設定パラメータについては、
例えば多項目検査、光学補正等の他の目的に応じて、異
なるパラメータを共存させてもよい。本発明における凹
凸は、上述した大きさおよび深さを有する点において、
単に光反射性および滑り特性を抑制することを目的とし
た擦りガラスの設定条件とは異なることが容易に理解で
きるであろう。また、成形過程で自然発生適に形成され
る極微小な凹凸とは異なることも、容易に理解できるで
あろう。本発明によれば、固相化すべき対象物に応じて
好ましい凹凸の設定条件がもたらされる。公知の多孔質
膜もしくはフィルター部材、または球状粒子を塗布した
表面のように、固相化すべき対象物が表面に対向する位
置から部分的または全体的に隠れるような凹凸では、み
かけ上の表面積は増加するが、測定精度の低下および反
応の非再現性を生じる場合があるので好ましくない。従
って、本発明は、固相化すべき対象物が反応過程または
測定過程において安定した結果を生じるような、固相担
体およびその製造方法を提供するという側面を含むもの
である。In the present invention, since the nucleic acid probe is solid-phased on the surface of the solid-phase substrate on which fine irregularities are formed by the frost treatment, the surface area available for solid-phase immobilization is greater than when a smooth substrate surface is used. , And therefore more nucleic acid probes will be immobilized. In addition, when the spotting method is used, since the liquid suction and holding capacity of the frost-treated surface is increased, the nucleic acid probe solution having a larger volume is spotted and held, so that more nucleic acid is added. The probe can be immobilized. Thus
Since the amount of the nucleic acid probe immobilized on each spot is larger than that in the case of using the carrier having a flat surface, the detection sensitivity can be improved accordingly. The liquid suction force on the frosted surface may cause bleeding from the spotted area, but the size of the minute irregularities is 10 μm or less,
Preferably 5 μm or less, more preferably less than 3 μm, especially 1
When the thickness is about μm, the force for moving the liquid is almost eliminated, so that excessive spreading can be prevented and favorable reaction conditions can be obtained. On the contrary, the size and depth of the unevenness is 3 μm or more, especially 10
When it exceeds μm, it is preferable to make the number of irregularities substantially constant so that a substantially constant surface area can be obtained in a desired reaction region. In addition, if the frosted area is set so that the required amount of unevenness is exposed on the surface of the solid-phase substrate by a predetermined area, or if the frosted surface is covered with a mask member, it can be set within the effective range. It is possible to employ the unevenness having the size and the depth. Further, by setting the setting parameters such as the size, depth, and interval of the frost processing to be constant, the processing is easy and the reaction conditions can be made uniform. But for this configuration parameter,
Different parameters may coexist according to other purposes such as multi-item inspection and optical correction. The unevenness in the present invention has the above-mentioned size and depth,
It will be easily understood that this is different from the setting conditions of the frosted glass simply for the purpose of suppressing the light reflectivity and the sliding property. Further, it can be easily understood that it is different from the extremely minute unevenness that is naturally generated during the molding process. According to the present invention, a preferable condition for setting unevenness is provided depending on the object to be solid-phased. In the case of a known porous membrane or filter member, or an uneven surface in which the object to be immobilized is partially or wholly hidden from the position facing the surface, such as the surface coated with spherical particles, the apparent surface area is Although it increases, it is not preferable because the measurement accuracy may decrease and the reaction may not be reproducible. Therefore, the present invention includes an aspect of providing a solid-phase carrier and a method for producing the same, in which an object to be solid-phased produces stable results in a reaction process or a measurement process.
【００１８】なお、上記のようにして核酸プローブを固
相担体に固相化した本発明の核酸プローブアレイを用い
て、標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を行う際
には、追跡可能な標識分子で標識された標的核酸を検体
として用いる方法が例示できる。この標識としては、例
えばＣｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩ、ビオチン、
ローダミン等を用いることができるが、これらに限定さ
れない。ハイブリダイゼーション反応は、一般には45℃
〜65℃前後の恒温状態において、一定の湿度を保って標
的ＤＮＡ溶液の蒸発を防止しながら、1時間から一晩、
標的核酸と核酸プローブとの反応が行われる。その後、
適切な洗浄操作により未反応の標的核酸を除去し、使用
した標識に適した方法で、核酸プローブとハイブリダイ
ズした標的核酸の検出を行う。一方、上述した直接的な
結合ではなく、固相化した核酸プローブと標的DNAとの
結合を媒介するような第三の核酸分子からなる間接的試
薬を用いる場合には、標的核酸に標識する代りに、この
第三の核酸分子を標識物質によって標識することもでき
る。言うまでもなく、反応系が標識物質を必要としない
場合には、上述したような標識化は必須ではない。な
お、本発明で言う「核酸プローブ」とは、標的DNAに関
与する核酸に対して直接的または間接的に特異的結合を
行う任意の反応用物質を包含するものであり、多様な用
途、例えば分離、精製、反応等に利用可能である。本発
明は、フロスト面に生じた反応物質を光学的に測定する
上でも光学的な長所を有する。フロスト面を介して検出
される光成分は、透過、反射または発光の何れを用いる
にしても、拡散された均一な測光条件を提供する。これ
に対して、フロスト面がない表面が介在した場合の光成
分は、往々にして不均一な測光データを提供する。一般
に、不均一な測光データは検出精度を低下させ、しかも
大量の検体または多項目試薬の相対的もしくは絶対的な
信頼性を損なわせる。従って、フロスト面を介して上述
の光学的処理（例えば、光固相、光測定等）を行う工
程、その工程のための装置および製造物は、ユーザーに
対して高い品質と信頼性を提供する。When carrying out a hybridization reaction with a target nucleic acid using the nucleic acid probe array of the present invention in which the nucleic acid probe is immobilized on a solid phase carrier as described above, a traceable labeled molecule is used. An example is a method of using a labeled target nucleic acid as a sample. Examples of the label include Cy3, Cy5, FITC, DAPI, biotin,
Rhodamine and the like can be used, but are not limited thereto. Hybridization reactions are generally 45 ° C
In a constant temperature state of about 65 ° C, keeping the humidity constant to prevent the evaporation of the target DNA solution, 1 hour to overnight,
The reaction between the target nucleic acid and the nucleic acid probe is performed. afterwards,
Unreacted target nucleic acid is removed by an appropriate washing operation, and the target nucleic acid hybridized with the nucleic acid probe is detected by a method suitable for the label used. On the other hand, when an indirect reagent consisting of a third nucleic acid molecule that mediates the binding between the immobilized nucleic acid probe and the target DNA is used instead of the direct binding described above, instead of labeling the target nucleic acid. In addition, the third nucleic acid molecule can be labeled with a labeling substance. Needless to say, the labeling as described above is not essential when the reaction system does not require a labeling substance. The "nucleic acid probe" referred to in the present invention includes any reaction substance that directly or indirectly specifically binds to a nucleic acid involved in a target DNA, and has various uses, for example, It can be used for separation, purification, reaction and the like. The present invention also has an optical advantage in optically measuring the reaction substance generated on the frosted surface. The light components detected through the frosted surface, whether transmitted, reflected or emitted, provide diffused, uniform photometric conditions. On the other hand, the light components often interspersed with a surface without a frosted surface provide non-uniform photometric data. In general, non-uniform photometric data reduces detection accuracy and also impairs the relative or absolute reliability of large quantities of analytes or multi-item reagents. Therefore, the process of performing the above-mentioned optical treatment (for example, optical solid phase, optical measurement, etc.) through the frosted surface, the apparatus and the product for the process provide the user with high quality and reliability. .
【００１９】また、本発明のフロスト面は、サンドブラ
スト法のように表面に微細な傷をランダムに形成する処
理によって、表面張力を生じ得る微量の液体に対してそ
の表面張力を破壊し、液面高さを平均化するという重要
な作用を有している。従って、本発明のフロスト面を有
する核酸プローブアレイによって微量の液滴を十分にア
レイ表面に広げることができ、固相化のみならず反応に
おいても微量化を図ることが可能である。The frosted surface of the present invention destroys the surface tension of a small amount of liquid which may generate surface tension by a treatment for randomly forming fine scratches on the surface like the sand blasting method, so that the liquid surface It has the important effect of averaging the heights. Therefore, the nucleic acid probe array having the frosted surface of the present invention can sufficiently spread a small amount of liquid droplets on the array surface, and it is possible to reduce the amount not only in the solid phase but also in the reaction.
【００２０】[0020]
【実施例】以下、本発明による核酸プローブアレイの製
造、および該プローブアレイを用いたハイブリダイゼー
ション反応の実施例を説明する。この実施例は、下記の
手順に従って行った。EXAMPLES Examples of the production of the nucleic acid probe array according to the present invention and the hybridization reaction using the probe array will be described below. This example was performed according to the following procedure.
【００２１】
（１）スライドガラスのフロスト処理
（２）スライドガラスの前処理（アルカリ処理および洗
浄）
（３）アミノシラン表面処理によるＮＨ基の導入、およ
び洗浄
（４）ＤＮＡ点着装置を用いたプローブＤＮＡの点着
（５）ＢＳＡ（Bovine Serum Albmin）を用いたブロッ
キング処理および洗浄
（６）ハイブリダイゼーション反応、および洗浄
（７）マイクロアレイ用蛍光検出器を用いた観察
（１）においては、約7.5cm×2.5cmのスライドガラスの
片面に対して、サンドブラスト法によりフロスト処理を
行い、平均深さ2μmの凹凸面を形成した。このフロスト
処理は、スライドガラスの片面を略二等分に分割し、そ
の一方の領域にのみに対して行った。このときに使用し
た研磨剤は Fujinami社制のグリーンシリコンカーバイ
ド（#2500）であり、Powder Beam Processer（Sony社
製）により、空気流量400m3／minパウダー吐出量80cc／
minの条件で、ガラス基板に吹き付けることによりフロ
スト面を形成した。(1) Frost treatment of slide glass (2) Pretreatment of slide glass (alkali treatment and washing) (3) NH group introduction and washing by aminosilane surface treatment (4) Probe using DNA spotting device About 7.5 cm in DNA spotting (5) Blocking treatment using BSA (Bovine Serum Albmin) and washing (6) Hybridization reaction, and washing (7) Observation using fluorescent detector for microarray (1) Frost treatment was performed by a sandblast method on one side of a slide glass of × 2.5 cm to form an uneven surface having an average depth of 2 μm. This frosting treatment was performed on one side of the slide glass and dividing only one side into two. The abrasive used at this time was Fujinami's Green Silicon Carbide (# 2500), and Powder Beam Processer (Sony's) air flow rate 400m3 / min powder discharge rate 80cc /
The frosted surface was formed by spraying the glass substrate under the condition of min.
【００２２】（２）の前処理法としては、一般には、ガ
ラス基板をアルカリや酸等で洗浄する。この実施例で
は、アルカリ処理した後に洗浄を行った。As the pretreatment method of (2), generally, the glass substrate is washed with alkali, acid or the like. In this example, cleaning was performed after the alkali treatment.
【００２３】（３）については、γ−アミノプロピルエ
トキシシラン（チッソ株式会社）を、70％エタノール溶
媒を用い、1％に調整して使用した。室温で導入反応を
約1時間行った後、蒸留水で洗浄を行った。As for (3), γ-aminopropylethoxysilane (Chisso Corporation) was used with a 70% ethanol solvent adjusted to 1%. After the introduction reaction was carried out at room temperature for about 1 hour, it was washed with distilled water.
【００２４】（４）においては、ピンタイプのアレイヤ
ーであるCartesians社製のＤＮＡ点着機（PixSys 750
0）を用いて、プローブＤＮＡの点着を行った。プロー
ブＤＮＡの配列は、5’-NH-ATG ATC ATA CAA TAA TAA T
3’（10量体）の配列をもった合成オリゴヌクレオチド
プローブである。核酸のスポッティングは、同一条件
（組成、能緯度、温度、吐出量等）の下で、複数箇所に
等間隔でマトリックス状に行った。この実験の場合、ス
ポッティング個所は37個所である。In (4), a DNA spotting machine (PixSys 750) manufactured by Cartesians, which is a pin type arrayer, is used.
0) was used to spot the probe DNA. The sequence of the probe DNA is 5'-NH-ATG ATC ATA CAA TAA TAAT
It is a synthetic oligonucleotide probe having a 3 '(decamer) sequence. Nucleic acid spotting was performed in a matrix at a plurality of positions at equal intervals under the same conditions (composition, latitude, temperature, discharge amount, etc.). In this experiment, there are 37 spotting points.
【００２５】（５）においては、ＰＢＳ（Phosphate Bu
ffered Saline）を溶媒として、ＢＳＡを3％に調製し
て、約30分間ブロッキング処理した後、蒸留水で洗浄を
行った。In (5), PBS (Phosphate Bu)
ffered Saline) as a solvent, BSA was adjusted to 3%, subjected to a blocking treatment for about 30 minutes, and then washed with distilled water.
【００２６】（６）においては、上記プローブ配列に対
して相補的な配列（5’-A TTA TTATTG TAT GAT CAT-
3’）を有し5’末端に蛍光標識を付したオリゴヌクレオ
チドを標的ＤＮＡとして、ハイブリダイゼーション反応
を行った。ここで用いた蛍光色素は、535nmの励起波長
で560nmの蛍光を発するＣｙ３である。なお、洗浄は1×
SSCで行った。In (6), a sequence complementary to the above probe sequence (5'-A TTA TTATTG TAT GAT CAT-
A hybridization reaction was carried out using an oligonucleotide having 3 ') and a fluorescent label at the 5'end as a target DNA. The fluorescent dye used here is Cy3 that emits fluorescence of 560 nm at an excitation wavelength of 535 nm. The cleaning is 1 ×
I went to SSC.
【００２７】（７）においては、蛍光検出器ScanArray
4000（GSI Lumonics社製）を用いて蛍光を検出すること
により、プローブＤＮＡにハイブリダイズした標的ＤＮ
Ａを検出した。なお、ネガティブコントロールとして、
標的ＤＮＡと同じ配列のオリゴプローブを用いた。In (7), the fluorescence detector ScanArray
Target DN hybridized with probe DNA by detecting fluorescence using 4000 (manufactured by GSI Lumonics)
A was detected. As a negative control,
An oligo probe having the same sequence as the target DNA was used.
【００２８】観察結果の一部を図２に示す。この図にお
いて、Ａは表面が平滑な従来のスライドガラス基板を用
いた比較例の結果であり、Ｂは表面をフロスト処理した
スライドガラス基板を用いた上記実施例の結果である。
プローブＤＮＡスポットの径は、約150〜200μmと微小
であった。両者の比較から、表面をフロスト処理した実
施例の基板を用いた場合の方が、ハイブリダイゼーショ
ンのシグナルが大きいことが分かる。A part of the observation result is shown in FIG. In this figure, A is the result of a comparative example using a conventional slide glass substrate having a smooth surface, and B is the result of the above example using a slide glass substrate having the surface frosted.
The diameter of the probe DNA spot was as small as about 150 to 200 μm. From a comparison between the two, it can be seen that the hybridization signal is larger when the substrate of the example whose surface is frosted is used.
【００２９】上記実施例においてプローブ点着のスポッ
ト数を変化させ、夫々の場合の蛍光強度を観察比較した
結果をグラフ化して図３に示す。なお、ここでの測定デ
ータは1個のスポット毎に得たものである。また、比較
においては、スライド上において同一の位置関係にある
スポット同士を比較することにより、スライド上の位置
による条件を合わせるようにした。また、複数箇所のス
ポットを測定することにより、スライド上での位置の違
いによるばらつきが分かるようにした。更に、光今日緯
度は、フロスト面自体に起因した光特性の変化を差引く
ために、全てのスポットの夫々について得られた光量か
ら、バックグラウンドとなる非固相化部分からの光量を
減算した。従って、差引かれた蛍光強度はスライド表面
の相違によるものではなく、各スポットにおけるプロー
ブの固相化量に相関している。In the above example, the number of spots on which the probe was spotted was changed, and the fluorescent intensity in each case was observed and compared. The measurement data here is obtained for each spot. In addition, in the comparison, spots having the same positional relationship on the slide are compared with each other to match the conditions depending on the position on the slide. In addition, by measuring spots at a plurality of locations, it was possible to understand variations due to differences in position on the slide. Furthermore, the present latitude of light was obtained by subtracting the amount of light from the non-solid-phased portion, which is the background, from the amount of light obtained for each of the spots in order to subtract the change in light characteristics due to the frost surface itself. . Therefore, the subtracted fluorescence intensity does not depend on the difference of the slide surface, but correlates with the immobilized amount of the probe in each spot.
【００３０】基板からのバックグラウンドを差引いて数
値化した信号強度の平均値は、実施例では33769.0±292
5.1、比較例では7374.2±1158.9であった。また、何れ
のスポット位置においても、比較例に対する実施例の出
力比は約４倍となった。この結果から、上記実施例にお
けるプローブＤＮＡの固相量は、何れのスポットについ
ても比較例に比べて約４倍程度増加したことが分かる。
これにより、同時再現性がよく、場所によるばらつきが
ないことが証明された。更に、凹凸の平均深さは2μmで
あるから、単純計算すると、１スポット当り約5600〜10
000個の凹凸が存在することが分かる。The average value of the signal intensity obtained by subtracting the background from the substrate and digitizing is 33769.0 ± 292 in the embodiment.
In the comparative example 5.1, it was 7374.2 ± 1158.9. The output ratio of the example to the comparative example was about 4 times at any spot position. From this result, it can be seen that the solid phase amount of the probe DNA in the above-mentioned example increased by about 4 times in any spot as compared with the comparative example.
From this, it was proved that the simultaneous reproducibility was good and there was no variation due to location. Furthermore, since the average depth of the unevenness is 2 μm, a simple calculation will result in approximately 5600 to 1060 per spot.
It can be seen that there are 000 irregularities.
【００３１】図３の結果によれば、本発明は、効率よく
核酸プローブを固相化して測定感度を高めた固相担体お
よびその製造方法を提供することができる。また、図３
の結果によれば、再現性が良く且つ場所によるばらつき
も殆どないので、原価が安く、信頼性が高く、しかも大
量処理が可能な固相化担体を提供することができる。ま
た、スポッティングの条件に忠実に固相化できるので、
多様な固相化が可能となる。例えば、所定面積当りのス
ポット数を増減させることにより、同一アレイ上または
複数のアレイ間において、スポット毎の間隔の疎密度を
個々に調節した複数の固相化領域を設けることによっ
て、測定領域を変えることなく種々の規定された固相量
による検査が可能となる。また、間隔は一定で広がりが
変るようにスポット数を増減させ、スポット毎のサイズ
を個々に調節した複数の固相化領域を同一アレイ上また
は複数のアレイ間に設けることによって、一定の測定感
度で種々の規定された固相量による検査を行うことがで
きる。また、間隔も広がりも一定にしてスポッティング
する核酸濃度を増減させたり、同一個所への繰り返しス
ポッティング回数を増減させたりして、１スポット中の
核酸濃度を個々に調節した複数の領域を同一アレイ上ま
たは複数のアレイ間に設けることによって、測定領域お
よび測定感度を一定にしながら、所望の規定された固相
量による検査を実行できる。According to the results shown in FIG. 3, the present invention can provide a solid-phase carrier in which a nucleic acid probe is efficiently solid-phased to enhance the measurement sensitivity and a method for producing the same. Also, FIG.
According to the result, since the reproducibility is good and there is almost no variation depending on the location, it is possible to provide the solid phased carrier which is low in cost, high in reliability, and capable of mass processing. Also, since it can be solid-phased faithfully to the spotting conditions,
Various immobilizations are possible. For example, by increasing or decreasing the number of spots per predetermined area, by providing a plurality of solid-phased regions on the same array or between a plurality of arrays in which the sparse density of each spot is individually adjusted, It is possible to inspect with various defined solid phase amounts without changing. In addition, the number of spots is increased or decreased so that the spacing is constant and the spread is changed, and a plurality of solid-phased regions whose sizes are individually adjusted are provided on the same array or between multiple arrays to obtain constant measurement sensitivity. It is possible to carry out inspections with various prescribed solid phase amounts. In addition, by increasing or decreasing the concentration of nucleic acids to be spotted with constant intervals and spreads or by increasing or decreasing the number of times of repeated spotting to the same place, multiple regions where the nucleic acid concentration in one spot is individually adjusted can be displayed on the same array. Alternatively, by providing the array between a plurality of arrays, it is possible to perform an inspection with a desired defined solid phase amount while keeping the measurement region and the measurement sensitivity constant.
【００３２】[0032]
【発明の効果】以上詳述したように、本発明によれば、
核酸プローブアレイにおける核酸プローブの固相化量を
増大して、ハイブリダイゼーション反応による標的核酸
の検出感度を増大できる等、顕著な効果を得ることがで
きる。As described in detail above, according to the present invention,
It is possible to obtain a remarkable effect such as increasing the amount of immobilized nucleic acid probes in the nucleic acid probe array and increasing the detection sensitivity of the target nucleic acid by the hybridization reaction.
【図１】本発明の核酸プローブアレイに用いるスライド
ガラス基板に形成された、フロスト処理面の種々の形態
を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing various forms of a frost-treated surface formed on a slide glass substrate used for a nucleic acid probe array of the present invention.
【図２】本発明の核酸プローブアレイおよび従来の核酸
プローブアレイを用いたハイブリダイゼーション反応に
より、標的核酸を検出した結果を比較して示す写真であ
る。FIG. 2 is a photograph showing a comparison of the results of detecting a target nucleic acid by a hybridization reaction using the nucleic acid probe array of the present invention and a conventional nucleic acid probe array.
【図３】本発明の核酸プローブアレイおよび従来の核酸
プローブアレイを用いたハイブリダイゼーション反応に
より、標的核酸を検出した結果を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the result of detecting a target nucleic acid by a hybridization reaction using the nucleic acid probe array of the present invention and the conventional nucleic acid probe array.
１…スライドガラス基板，２…フロスト処理領域 1 ... Slide glass substrate, 2 ... frost processing area
Claims (7)
の少なくとも核酸プローブを固相化する領域に形成され
た略均一な微小部分からなるフロスト面と、該フロスト
面に所要濃度でスポット状に固相化された核酸プローブ
とを具備することを特徴とする核酸プローブアレイ。1. A non-permeable solid phase carrier, a frost surface comprising substantially uniform minute portions formed in at least a region on the surface of the solid phase carrier where the nucleic acid probe is immobilized, and a required concentration on the frost surface. And a nucleic acid probe immobilized in the form of spots as described above.
ブラスト処理またはレーザーアブレーション処理により
形成されたものである、請求項１に記載の核酸プローブ
アレイ。2. The nucleic acid probe array according to claim 1, wherein the frosted surface is formed by sandblasting or laser ablating the solid phase carrier.
面の全体に形成されている、請求項１または２に記載の
核酸プローブアレイ。3. The nucleic acid probe array according to claim 1, wherein the frosted surface is formed on the entire main surface of the substrate.
面の限定された領域に選択的に形成されている、請求項
１または２に記載の核酸プローブアレイ4. The nucleic acid probe array according to claim 1, wherein the frosted surface is selectively formed in a limited region of the main surface of the substrate.
る請求項４に記載の核酸プローブアレイ。5. The nucleic acid probe array according to claim 4, wherein the frosted surface has a capillary shape.
を前記フロスト面に点着することにより固相化されてい
る、請求項１〜５の何れか１項に記載の核酸ーブアレ
イ。6. The nucleic acid probe array according to claim 1, wherein the nucleic acid probe is immobilized by spotting a nucleic acid probe solution on the frosted surface.
さの微小な凹凸で形成されている請求項１〜６の何れか
１項に記載の核酸プローブアレイ。7. The nucleic acid probe array according to claim 1, wherein the frosted surface is formed with minute irregularities having a size of 0.5 to 100 μm.
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