JP2003098146A - Apparatus for recognizing base sequence, its manufacturing method and its using method - Google Patents
Apparatus for recognizing base sequence, its manufacturing method and its using methodInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は微細配列、特にＤＮ
Ａ塩基配列の効率の良い微細配列認識装置に関し、更
に、特に半導体微細加工技術で作製された小孔を用いた
ＤＮＡの微細配列認識装置に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to fine arrays, especially DN.
The present invention relates to a highly efficient fine sequence recognition device for A base sequences, and more particularly to a fine sequence recognition device for DNA using small holes produced by semiconductor fine processing technology.
【０００２】[0002]
【従来の技術】デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の塩基配列
決定やタンパクのアミノ酸配列決定は、信頼性が高く、
低コストでしかも高速であることが望まれている。2. Description of the Related Art Deoxyribonucleic acid (DNA) nucleotide sequencing and protein amino acid sequencing are highly reliable.
Low cost and high speed are desired.
【０００３】ＤＮＡの塩基配列決定法として、化学的方
法（プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス、ユーエスエー、第７４巻、第５
６０頁から第５６４頁、１９７７年）と、酵素的方法
（プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス、ユーエスエー、第７４巻、第５４
６３頁から第５４６７頁、１９７７年）が１９７０年代
に開発された。As a method for determining the nucleotide sequence of DNA, a chemical method (Proceedings of National Academy of Science, USA, Vol. 74, Vol. 5)
60 to 564, 1977) and enzymatic methods (Proceedings of National Academy of Sciences, USA, 74, 54).
Pp. 63 to 5467, 1977) was developed in the 1970s.
【０００４】化学的方法は、２本鎖ＤＮＡを解離させて
一本鎖とし、１本鎖ＤＮＡ中の４種類の塩基のうち１種
類だけを分解する方法である。分解が穏やかであれば、
ＤＮＡ１分子あたり塩基１個だけランダムな位置で分解
される。この結果、長さの異なる一群のＤＮＡ断片が得
られるが、長さの違いは元のＤＮＡ分子中の違った位置
にあった４種類の塩基のうち１種類の塩基が分解された
ことによる。全塩基に対して同じ操作を行い、それぞれ
のＤＮＡ断片群を並行にゲル電気泳動すると、そのバン
ドパターンから塩基配列が読み取れる。The chemical method is a method in which double-stranded DNA is dissociated into single strands and only one of four types of bases in single-stranded DNA is degraded. If the decomposition is gentle,
Only one base is decomposed at a random position per molecule of DNA. As a result, a group of DNA fragments having different lengths is obtained, and the difference in length is due to the decomposition of one of the four kinds of bases at different positions in the original DNA molecule. When the same operation is performed on all the bases and each DNA fragment group is subjected to gel electrophoresis in parallel, the base sequence can be read from the band pattern.
【０００５】化学的方法は塩基特異性が低く、不正確で
あるため、酵素的方法が今日の配列決定の主流である。Due to the low base specificity and inaccuracies of chemical methods, enzymatic methods are the predominant method of sequencing today.
【０００６】酵素的方法は、まず、配列を決めようとす
るＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼを用いて生
体外でＤＮＡ合成を行う。その際、合成原料である４種
類のデオキシリボヌクレオシド三りん酸と１種類の少量
のジデオキシリボヌククレオシド三りん酸を加える。ジ
デオキシリボヌクレオシド三りん酸がＤＮＡ鎖に取り込
まれると次のヌクレオチドが付加できない。例えば、過
剰なデオキシＡＴＰ（ｄＡＴＰ）とジデオキシＡＴＰ
（ｄｄＡＴＰ）が競合すると、ＤＮＡポリメラーゼによ
るＤＮＡ鎖の合成はランダムにＡのところでストップす
る。次に、化学的方法と同じようにゲル電気泳動を行っ
て塩基配列を読み取る。[0006] In the enzymatic method, first, DNA is synthesized in vitro using a DNA polymerase with a DNA whose sequence is to be determined as a template. At that time, four kinds of deoxyribonucleoside triphosphates which are synthetic raw materials and one small amount of dideoxyribonucleoside triphosphates are added. When the dideoxyribonucleoside triphosphate is incorporated into the DNA chain, the next nucleotide cannot be added. For example, excess deoxy ATP (dATP) and dideoxy ATP
When (ddATP) competes, the DNA strand synthesis by DNA polymerase randomly stops at A. Next, the base sequence is read by performing gel electrophoresis in the same manner as the chemical method.
【０００７】酵素的方法により配列決定できる塩基の長
さは数百程度である。これはゲル電気泳動の解像度によ
って制約を受けるからである。そのため、長いＤＮＡを
短いＤＮＡに断片化する必要がある。まず、ＤＮＡを１
０ｋ塩基から１００ｋ塩基の長さのクローンにしてすべ
てのＤＮＡを網羅するＤＮＡライブラリーを作成するこ
とからはじめる。各クローンをさらに切断し、分析が可
能な長さのＤＮＡ断片を作り塩基配列決定を行う。最後
に、塩基配列決定したＤＮＡ断片を再構築してもとの完
全なＤＮＡの塩基配列を得る。この方法は操作が簡単
で、並列処理ができるため、今日広く用いられている。The length of bases that can be sequenced by an enzymatic method is about several hundred. This is because it is limited by the resolution of gel electrophoresis. Therefore, it is necessary to fragment long DNA into short DNA. First, 1 DNA
Start by making a clone with a length of 0 kbase to 100 kbase to create a DNA library that covers all DNA. Each clone is further cleaved to form a DNA fragment having a length that can be analyzed, and the nucleotide sequence is determined. Finally, by reconstructing the base sequence-determined DNA fragment, the original complete base sequence of DNA is obtained. This method is widely used today because it is easy to operate and can be processed in parallel.
【０００８】しかし、サブクローンを作成する際、同じ
塩基配列を含むＤＮＡ断片が多数あるため、実際に塩基
配列決定したい部分の１０倍から２０倍の塩基長を分析
することになる。逆に重複部分が少ないと、塩基配列決
定したＤＮＡ断片の再構築が難しくなる。However, when creating a subclone, since there are many DNA fragments containing the same base sequence, a base length 10 to 20 times that of the portion for which the base sequence is to be determined is to be analyzed. On the contrary, if the overlapping portion is small, it becomes difficult to reconstruct the DNA fragment whose nucleotide sequence has been determined.
【０００９】同じ塩基配列を何度も重複して塩基配列決
定する必要がない方法に、プライマーウォーキング法が
ある（サイエンス、第２５８巻、第１７８７頁から第１
７９１頁、１９９２年）。プライマーウォーキング法で
は、巨大ＤＮＡをそのまま試料ＤＮＡとして用いる。ま
ず試料ＤＮＡの一部分の塩基配列を決定する。次に、決
定した塩基配列を元に、塩基配列決定した部分に特異的
にハイブリダイズするプライマーを合成して次の部分の
ＤＮＡ塩基配列を決定する。プライマーウォーキング法
では、重複して塩基配列決定する部分を最小にできる
が、塩基配列決定毎にプライマーを合成する必要があ
る。The primer walking method is a method that does not require repeated determination of the same base sequence many times (Science, vol. 258, pp. 1787 to 1).
791, 1992). In the primer walking method, huge DNA is used as it is as sample DNA. First, the base sequence of a part of the sample DNA is determined. Next, based on the determined base sequence, a primer that specifically hybridizes to the base sequence determined portion is synthesized to determine the DNA base sequence of the next portion. In the primer walking method, the portion where the base sequence is determined in duplicate can be minimized, but it is necessary to synthesize a primer for each base sequence determination.
【００１０】同じく、巨大ＤＮＡをそのまま塩基配列決
定できる方法に、チャネル法がある（ＵＳ Ｐａｔｅｎ
ｔ ６０１５７１４ または プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、ユー
エスエー、第９３巻、第１３７７０頁から第１３７７３
頁、１９９６年）。チャネル法では、金属イオンを含む
溶液を小孔（チャネル）をもつ脂質二重層によって２つ
に分け、一方の溶液に一本鎖ＤＮＡを入れる。分けられ
た溶液に電圧を加えると、負に帯電したＤＮＡは電位差
に沿って、小孔を通過して、もう一方の溶液へと移動す
る。ＤＮＡを構成している各４種類の塩基の大きさが異
なるため、塩基の違いによって小孔を塞ぐ割合が異な
る。そのため、小孔のイオン電流を測定すると、塩基の
違いによってイオン電流に差が生じる。ＤＮＡが小孔を
通過している時に、イオン電流を逐次計測することで、
ＤＮＡの塩基配列決定ができる。Similarly, there is a channel method (US Paten) as a method for directly determining the base sequence of a huge DNA.
t 6015714 or Proceedings of National Academy of Sciences, USA, Vol. 93, pp. 13770 to 13773.
P., 1996). In the channel method, a solution containing metal ions is divided into two by a lipid bilayer having small pores (channels), and one solution is filled with single-stranded DNA. When a voltage is applied to the separated solution, the negatively charged DNA moves along the potential difference through the small pores to the other solution. Since the size of each of the four types of bases that compose DNA is different, the ratio of blocking the small pores differs depending on the difference in the bases. Therefore, when the ionic current in the small holes is measured, the ionic current differs due to the difference in base. By sequentially measuring the ionic current while DNA is passing through the small pores,
The base sequence of DNA can be determined.
【００１１】小孔には、食中毒菌である黄色ぶどう球菌
の毒素であるアルファーヘモリシンや、大腸菌のマルト
ーポーリンが用いられる。アルファーヘモリシンやマル
トーポーリンはチャネルタンパクと呼ばれ、脂質二重層
に数ナノメーターの開口部をもつ小孔を形成する。チャ
ネルタンパクは、ＤＮＡ塩基配列決定の他に、分子アダ
プターを用いた分子計数（ネイチャー、第３９８巻、第
６８６頁から第６９０頁、１９９９年）や、ポリマーの
計数（ネイチャー、第３７０巻、第２７９頁から第２８
１頁、１９９４年）などのバイオセンサーとして働くこ
とが知られている。For the small holes, alpha-hemolysin which is a toxin of Staphylococcus aureus which is a food poisoning bacterium, and maltoporin of Escherichia coli are used. Alpha-hemolysin and maltoporin, called channel proteins, form small pores with several nanometer openings in the lipid bilayer. In addition to DNA sequencing, channel proteins can be used for molecular counting using a molecular adapter (Nature, vol. 398, pages 686 to 690, 1999) and polymer counting (Nature, vol. 370, vol. 279 to 28
1 page, 1994), etc., and is known to work as a biosensor.
【００１２】[0012]
【発明が解決しようとする課題】化学的方法と酵素的方
法による塩基配列決定では、同じ塩基配列部分を重複し
て読む必要があり、塩基配列の規模が大きくなると、手
間と時間が膨大にかかる。効率を上げるため重複を少な
くすると、塩基配列決定した各ＤＮＡ断片を繋ぎあわせ
るのが困難となり、元の長いＤＮＡ塩基配列を再構成で
きないという問題があった。また、クローニングされに
くい配列が存在し、読み取られない部分が生じ、再構成
できないという問題もあった。In the base sequence determination by the chemical method and the enzymatic method, it is necessary to read the same base sequence portion in duplicate, and if the scale of the base sequence becomes large, it takes a lot of time and labor. . If the duplication is reduced to improve the efficiency, it becomes difficult to connect the respective DNA fragments whose base sequences have been determined, and there is a problem that the original long DNA base sequence cannot be reconstructed. In addition, there is a problem that a sequence that is difficult to be cloned exists, an unreadable portion occurs, and it cannot be reconstructed.
【００１３】プライマーウォーキング法では、常に塩基
配列決定した部分から次のプライマーを合成して用いる
ために、塩基配列決定した部分の繋がりは明確である利
点がある。しかし、塩基配列決定は１本のＤＮＡ鎖を片
方から順次、数百塩基毎に行う必要があるため処理能力
に限界があること、さらに、塩基配列決定した部分を元
に合成したプライマーがうまく機能せずに、全塩基配列
決定が困難となる問題があった。In the primer walking method, the next primer is always synthesized from the base sequence-determined portion and used, so that there is an advantage that the connection between the base sequence-determined portions is clear. However, there is a limit to the processing capacity because it is necessary to perform sequencing on one DNA strand from one side for every several hundred bases. Furthermore, a primer synthesized based on the sequenced portion works well. Without this, there was a problem that it became difficult to determine the entire base sequence.
【００１４】チャネル法では、小孔に食中毒菌である黄
色ぶどう球菌の毒素のアルファーヘモリシンや、大腸菌
のマルトーポーリンなどを用いているために、小孔形成
自体に危険を伴う。また、小孔の形成は偶然性が伴い、
脂質二重層中に形成されるチャネルの数、位置などを制
御することは困難である。以上の理由のため、これまで
原理実験が行われたにとどまり、塩基配列決定や分子計
測が一部の生化学者を除いて、一般に行われることはな
かった。Since the channel method uses alpha-hemolysin, which is a toxin of Staphylococcus aureus, which is a food poisoning bacterium, maltoporin of Escherichia coli, etc. in the pores, the pore formation itself is dangerous. Also, the formation of small holes is contingent,
It is difficult to control the number and position of channels formed in the lipid bilayer. For the above reasons, only principle experiments have been conducted so far, and nucleotide sequencing and molecular measurement have not been generally performed except for some biochemists.
【００１５】[0015]
【発明の目的】上記問題を解決するため、本発明の目的
は、ＤＮＡを断片ＤＮＡに分ける必要がなく、安全で、
高速、しかも制御性の高い塩基配列決定装置を提供する
ことにある。更に、ＤＮＡに限らず、分子や細胞など微
細な配列の認識を可能にする装置を提供することにあ
る。To solve the above problems, the object of the present invention is to eliminate the need for dividing DNA into fragment DNA,
It is to provide a high-speed and highly controllable base sequence determination device. Another object of the present invention is to provide a device that enables recognition of not only DNA but also minute sequences such as molecules and cells.
【００１６】[0016]
【課題を解決するための手段】本発明の構成（Ａ）のＤ
ＮＡの微細配列認識装置では、小孔を持つ絶縁膜と、絶
縁膜で分離され金属イオンを含む溶液を入れる二つの液
溜め、二つの液溜めのそれぞれに設置された二つの電極
と、二つの電極間に電圧を加えるための電圧源、小孔を
通過する金属イオンによる電流を計測できる電流計を備
える。Means for Solving the Problems D of the constitution (A) of the present invention
In the NA fine array recognition device, an insulating film having small holes, two liquid reservoirs separated by the insulating film and containing a solution containing metal ions, two electrodes installed in each of the two liquid reservoirs, and two liquid reservoirs It is equipped with a voltage source for applying a voltage between the electrodes and an ammeter capable of measuring the current due to the metal ions passing through the small holes.
【００１７】本発明の構成（Ｂ）のＤＮＡの微細配列認
識装置では、小孔を持つ絶縁膜と、絶縁膜で分離され金
属イオンを含む溶液を入れる二つの液溜め、二つの液溜
めのそれぞれに設置された二つの電極と、二つの電極間
に電圧を加えるための電圧源、小孔を通過する金属イオ
ンによる電流を計測できる電流計、小孔付近に対向した
位置に設置された第３、第４の電極と、前記第３と第４
の電極間の伝導度を測定できる装置を備える。In the DNA fine sequence recognition apparatus of the constitution (B) of the present invention, an insulating film having small holes, two liquid reservoirs for containing a solution containing metal ions separated by the insulating film, and two liquid reservoirs respectively. And two electrodes installed in the space, a voltage source for applying a voltage between the two electrodes, an ammeter capable of measuring the current due to metal ions passing through the small hole, and a third electrode installed near the small hole. , A fourth electrode, and the third and fourth electrodes
It is equipped with a device that can measure the conductivity between the electrodes.
【００１８】本発明の構成（Ｃ）のＤＮＡの微細配列認
識装置では、小孔を持つ圧電薄膜と、圧電薄膜で分離さ
れ金属イオンを含む溶液を入れる二つの液溜め、前記二
つの液溜めのそれぞれに設置された二つの電極と、二つ
の電極間に電圧を加えるための電圧源、小孔を通過する
金属イオンによる電流を計測できる電流計、圧電薄膜の
両面に設置された１対の圧電膜制御用電極、圧電膜制御
用電極間に電圧を加えるための電圧源を備える。In the apparatus for recognizing a fine array of DNA according to the constitution (C) of the present invention, a piezoelectric thin film having small holes, two liquid reservoirs containing a solution containing metal ions separated by the piezoelectric thin film, and the two liquid reservoirs Two electrodes installed on each, a voltage source for applying a voltage between the two electrodes, an ammeter capable of measuring the current due to metal ions passing through the small holes, a pair of piezoelectrics installed on both sides of the piezoelectric thin film A voltage source for applying a voltage is provided between the film control electrode and the piezoelectric film control electrode.
【００１９】なお、以上の微細配列認識装置は、分子計
数、分子ふるい、分子ソータへの転用が可能である。The above fine array recognition device can be used for molecular counting, molecular sieving, and molecular sorter.
【００２０】[0020]
【作用】本発明では、半導体微細加工技術を用いて絶縁
膜に小孔を形成し、脂質二重層におけるタンパクチャネ
ルの役割を担わせる。タンパクチャネルに比べると作製
における安全性が高く、かつ制御性がよい。また、経時
変化や溶液のｐＨに対して安定性が高い。例えば、シリ
コン窒化膜は経時劣化がなく、また酸あるいはアルカリ
溶液に対して耐性があり用いるバッファー液を選ばな
い。さらに、メンブレインに加工すると、平坦性が高く
また強度の高い膜ができる。これは、シリコン窒化膜の
適度な内部応力のためである。In the present invention, small holes are formed in the insulating film by using the semiconductor microfabrication technique to play the role of protein channel in the lipid bilayer. Compared to protein channels, they are safer in production and have better controllability. In addition, it is highly stable against changes over time and the pH of the solution. For example, the silicon nitride film does not deteriorate with time, has resistance to an acid or alkaline solution, and a buffer solution to be used is not selected. Further, when processed into a membrane, a film having high flatness and high strength is formed. This is due to the moderate internal stress of the silicon nitride film.
【００２１】小孔を形成するには、集束イオンビーム装
置によるエッチング、あるいは、高解像度電子線レジス
ト、例えばカリックスアレーン系の電子線レジストを用
いる。To form the small holes, etching with a focused ion beam apparatus or high resolution electron beam resist, for example, calixarene type electron beam resist is used.
【００２２】集束イオンビーム装置は、ガリウムなどの
固体金属のイオン源から放出される金属イオンを数ｎｍ
にまで集束させることができる。集束したイオンビーム
を絶縁膜あるいは半導体膜に照射すると、エッチングさ
れて微小な孔を開けることができる。孔の直径は１０ｎ
ｍ以下が可能であり、イオンビーム径あるいはイオンド
ーズを調整することにより孔の直径を変えることができ
る（ジャーナル・オブ・バキューム・サイエンス・アン
ド・テクノロジーＢ、第１５巻、第２３７３頁から第２
３７８頁、１９９７年）。本集束イオンビーム装置を用
いれば、本発明にある小孔を容易に作製することができ
る。さらに、タングステンカルボニルガス雰囲気中で、
ガリウムイオンを照射すると、タングステンがビームの
照射された位置に堆積する。このことから、微小な電極
を所望の位置に形成することが可能である。The focused ion beam device is designed to measure metal ions emitted from an ion source of solid metal such as gallium by several nm.
It can be focused up to. When the insulating film or the semiconductor film is irradiated with the focused ion beam, it can be etched to form minute holes. The diameter of the hole is 10n
The diameter of the hole can be changed by adjusting the ion beam diameter or ion dose (Journal of Vacuum Science and Technology B, Vol. 15, pp. 2373 to 2).
378, 1997). By using this focused ion beam apparatus, the small hole according to the present invention can be easily produced. Furthermore, in a tungsten carbonyl gas atmosphere,
When gallium ions are irradiated, tungsten is deposited at the position where the beam is irradiated. From this, it is possible to form a minute electrode at a desired position.
【００２３】小孔を形成する第２の方法は、カリックス
アレーン系の高解像度電子ビームレジストを用いること
である。カリックスアレーン系の高解像度電子ビームレ
ジストは解像度が高く、カッリクスアレーンで１０ｎｍ
（アプライド・フィジックス・レター、第６８巻、第１
２９７頁より第１２９９頁、１９９６年）、クロロメチ
ルカッリクスアレーンで１３ｎｍ（アプライド・フィジ
ックス・レター、第７７巻、第３０１頁より第３０３
頁、２０００年）である。A second method of forming small holes is to use a calixarene-based high resolution electron beam resist. The high resolution electron beam resist of the calixarene system has a high resolution.
(Applied Physics Letter, Vol. 68, Vol. 1
297 to 1299, 1996), 13 nm with chloromethyl calixarene (Applied Physics Letters, Vol. 77, pp. 301 to 303).
Page, 2000).
【００２４】[0024]
【発明の実施の形態】次に、本発明の実施の形態につい
て図面を参照して詳細に説明する。本発明の微細配列認
識装置は図１に示されている。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Next, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. The fine array recognition apparatus of the present invention is shown in FIG.
【００２５】（実施例１）図１Ａは本発明の実施例１の
外観を示している。流路を設けた基板１０の上に絶縁膜
１１が配置され、さらに絶縁膜１１をガラスカバー１２
が覆っている。ガラスカバー１２には、バッファー入口
１３とバッファー出口１５、試料入口１４の入出力ポー
トが設けられる。絶縁膜１１からは電極に接続された配
線が延び、電圧源１６と電流計１７に接続されている。Example 1 FIG. 1A shows the appearance of Example 1 of the present invention. The insulating film 11 is arranged on the substrate 10 provided with the flow path, and the insulating film 11 is covered with the glass cover 12
Is covered. The glass cover 12 is provided with a buffer inlet 13, a buffer outlet 15, and an input / output port for a sample inlet 14. Wiring connected to the electrodes extends from the insulating film 11 and is connected to the voltage source 16 and the ammeter 17.
【００２６】図１Ｂは本発明の実施例１の内部構造を示
している。（１）流路２０を設けた基板１０と、（２）
陽極２１および２３、陰極２２、バッファー入口１３お
よびバッファー出口１５から流路２０へ通ずるための貫
通孔２４および２６、試料入口１４と流路２０へ通ずる
小孔２５が形成された絶縁膜１１、（３）バッファー入
口１３、バッファー出口１５、試料入口１４が形成され
たガラスカバー１２、から構成される。FIG. 1B shows the internal structure of the first embodiment of the present invention. (1) A substrate 10 provided with a flow path 20, and (2)
Insulating film 11 formed with through holes 24 and 26 for communicating from anodes 21 and 23, cathode 22, buffer inlet 13 and buffer outlet 15 to channel 20, and small hole 25 communicating to sample inlet 14 and channel 20 ( 3) It is composed of a buffer inlet 13, a buffer outlet 15, and a glass cover 12 on which a sample inlet 14 is formed.
【００２７】試料の溶液およびバッファー溶液は金属イ
オンを含み導電性とする。試料の溶液は陰極２２と接触
して陰極と等しい電位を持つ、一方、バッファー溶液は
陽極２１および２３と接触して陽極と等しい電位を持
つ。試料の溶液とバッファー溶液の電位差は、電圧源１
６によって制御される。小孔を金属イオンや帯電した分
子が通過すると回路に電流が流れ、電流は電流計１７で
検出される。The sample solution and the buffer solution contain metal ions and are made conductive. The sample solution contacts the cathode 22 and has the same potential as the cathode, while the buffer solution contacts the anodes 21 and 23 and has the same potential as the anode. The potential difference between the sample solution and the buffer solution depends on the voltage source 1.
Controlled by 6. When metal ions or charged molecules pass through the small holes, a current flows through the circuit, and the current is detected by the ammeter 17.
【００２８】図２Ａは絶縁膜１１上の小孔２５付近を真
上から見た図で、本実施例の場合の電極配置を示してい
る。陰極２２は小孔を取り囲むように配置される。FIG. 2A is a view of the vicinity of the small hole 25 on the insulating film 11 as seen from directly above, showing the electrode arrangement in the case of this embodiment. The cathode 22 is arranged so as to surround the small hole.
【００２９】図３および図４は本発明の実施例１に関す
る動作原理について説明したものである。図３Ａ、図４
Ａは絶縁膜１１を貫く小孔２５付近の断面図である。陽
極２１および陰極２２は、図１では絶縁膜上にあるが、
本図では模式的に溶液中に表示している。FIGS. 3 and 4 explain the operating principle of the first embodiment of the present invention. 3A and 4
A is a cross-sectional view near the small hole 25 penetrating the insulating film 11. Although the anode 21 and the cathode 22 are on the insulating film in FIG. 1,
In this figure, it is schematically shown in the solution.
【００３０】図３Ａにおいて、絶縁膜１１を境にして試
料を含む溶液４１とバッファー液４２に分けられてい
る。各溶液には正または負に帯電した金属イオンが含ま
れている。電圧源１６を用いて電圧を、陰極２２と陽極
２１の間に加えると、陰極２２と等電位である試料を含
む溶液４１と陽極２１と等電位であるバッファー液４２
に電位差Ｖが生じる。小孔の両端に電位差が生じると、
負に帯電した金属イオンは小孔を通過して、陰極側から
陽極側へと電位勾配に沿って移動する。一方、正に帯電
した金属イオンは小孔を通過して、陽極側から陰極側へ
と電位勾配に沿って移動する。その結果、金属イオンが
電荷を運び、外部回路に電流が生じる。電流の大きさ
は、小孔を通過する金属イオンの単位時間あたりの数に
比例する。金属イオンの単位時間あたりの数は小孔の断
面積Ｓ、電位差Ｖに対して比例の関係にあり、小孔の長
さＬに対して逆比例の関係にある。In FIG. 3A, the solution 41 containing the sample and the buffer solution 42 are separated with the insulating film 11 as a boundary. Each solution contains positively or negatively charged metal ions. When a voltage is applied between the cathode 22 and the anode 21 using the voltage source 16, a solution 41 containing a sample having the same potential as the cathode 22 and a buffer solution 42 having the same potential as the anode 21.
A potential difference V is generated at. When a potential difference occurs at both ends of the small hole,
The negatively charged metal ions pass through the small holes and move along the potential gradient from the cathode side to the anode side. On the other hand, the positively charged metal ions pass through the small holes and move along the potential gradient from the anode side to the cathode side. As a result, the metal ions carry an electric charge, and a current is generated in the external circuit. The magnitude of the electric current is proportional to the number of metal ions passing through the small hole per unit time. The number of metal ions per unit time is proportional to the cross-sectional area S of the small holes and the potential difference V, and inversely proportional to the length L of the small holes.
【００３１】図３Ａは、さらに、試料として分子４４を
溶液４１に加えた場合を示している。分子４４は小孔２
５の開口幅よりも小さいとする。試料を含む溶液４１と
バッファー溶液４２の間に電位差Ｖを加えた時に観測さ
れる模式的な電流を図３Ｂに示す。分子Ａが小孔を通過
すると、小孔の一部が塞がれるため、見かけ上の断面積
Ｓが小さくなる。そのため、小孔を通過する金属イオン
の数が変化し、電流が変調される。電流の変調の大きさ
は、小孔を通過する分子のサイズに比例する。電流の変
調の回数を数えることで溶液中に含まれる試料分子の濃
度を知ることでき、変調の大きさで分子のサイズを知る
ことができる。図３Ｂの例では、試料分子が３個、小孔
を通過したことを示している。本方法により、分子の計
数、サイズ測定が実現できることがわかる。FIG. 3A further shows the case where the molecule 44 is added to the solution 41 as a sample. Molecule 44 is small hole 2
It is assumed that it is smaller than the opening width of 5. A schematic current observed when a potential difference V is applied between the sample-containing solution 41 and the buffer solution 42 is shown in FIG. 3B. When the molecule A passes through the small hole, a part of the small hole is blocked, so that the apparent cross-sectional area S becomes small. Therefore, the number of metal ions passing through the small holes changes, and the current is modulated. The magnitude of the modulation of the current is proportional to the size of the molecule passing through the pore. By counting the number of times the current is modulated, the concentration of the sample molecule contained in the solution can be known, and the size of the molecule can be known from the magnitude of the modulation. The example in FIG. 3B shows that three sample molecules have passed through the small hole. It can be seen that this method can realize molecule counting and size measurement.
【００３２】図４Ａは、試料として一本鎖ＤＮＡ４５を
溶液４１に加えた場合を示している。一本鎖ＤＮＡはサ
イズの異なる塩基であるアデニン（a）、チミン（t）、
グアニン（g）、シトシン（c）が糖―リン酸のバックボ
ーンに結合した鎖状のポリマーである。一本鎖ＤＮＡが
小孔に入ると、電流が変調され、電流の大きさは各塩基
によって異なる。したがって、電流の変調を観測するこ
とで、塩基配列を決定することができる。図４Ｂは、観
測電流を模式的に示したもので、本例では、ＤＮＡの塩
基配列を、
ggtatgccaa ttattcaacg ttac 24
と決定できる。FIG. 4A shows the case where the single-stranded DNA 45 is added to the solution 41 as a sample. Single-stranded DNA consists of bases of different sizes: adenine (a), thymine (t),
It is a chain polymer in which guanine (g) and cytosine (c) are bound to the sugar-phosphate backbone. When the single-stranded DNA enters the small hole, the electric current is modulated, and the magnitude of the electric current varies depending on each base. Therefore, the base sequence can be determined by observing the modulation of the current. FIG. 4B schematically shows the observed current. In this example, the base sequence of DNA can be determined as ggtatgccaa ttattcaacg ttac 24.
【００３３】ＤＮＡを構成している塩基のいずれかを修
飾することにより、観測電流の変化を大きくすることが
できる。例えば、前記グアニン（g）に蛍光標識を付加
したヌクレオチドをグアニンの位置に挿入する。小孔を
前記標識を付加したグアニンが通過すると観測電流が増
大し、グアニンのＤＮＡ内での位置をより正確に求める
ことができる。蛍光標識を付加したグアニン以外にも、
アデニン（a）、チミン（t）、シトシン（c）を標識で
修飾した塩基を用いることにより、より正確な認識が可
能となる。The change in observed current can be increased by modifying any of the bases constituting DNA. For example, a nucleotide obtained by adding a fluorescent label to the guanine (g) is inserted at the position of guanine. When guanine to which the above-mentioned label is added passes through the small hole, the observed current increases, and the position of guanine in DNA can be determined more accurately. Besides guanine with a fluorescent label,
More accurate recognition can be achieved by using a base modified from adenine (a), thymine (t), and cytosine (c) with a label.
【００３４】図６は、本発明の実施例１の微細配列認識
装置の作製工程を示している。基板としてシリコン基板
を用い、半導体微細加工技術を用いて、微細配列認識装
置を実際に作製した。FIG. 6 shows a manufacturing process of the fine array recognition apparatus according to the first embodiment of the present invention. Using a silicon substrate as a substrate, a fine array recognition device was actually manufactured by using a semiconductor fine processing technology.
【００３５】（図６Ａ）用いる基板はシリコン基板で、
表面にシリコン窒化膜１０２、さらにシリコン酸化膜１
０１、裏面にシリコン窒素化膜１０４を気相成長法にて
形成する。シリコン窒化膜１０２および１０４の膜厚は
１０ｎｍから１００ｎｍ程度、シリコン酸化膜の膜厚は
３００ｎｍ程度である。裏面のシリコン窒化膜１０４を
テトラメチルアンモニウムハライド（ＴＭＡＨ）２５％
を用いてエッチングを行い、シリコン窒化膜１０２が露
出するまで溝１０５、１０６、１０７を形成する。ＴＭ
ＡＨの代わりに水酸化カリウム（ＫＯＨ）を用いてもよ
い。溝１０５と１０６および１０７と１０６の間の領域
も同様にシリコン基板をエッチングする。
（図６Ｂ）表面のシリコン酸化膜１０１の一部を開口
し、開口部１１１、１１２、１１３を設け、シリコン窒
化膜が露出したシリコン窒化膜メンブレン１１４、１１
５、１１６が形成される。
（図６Ｃ）真空蒸着法を用いて金電極１２１から１２６
を形成する。金電極の膜厚は５ｎｍから１００ｎｍ程度
である。
（図６Ｄ）集束イオンビーム装置によりシリコン窒化膜
メンブレン１１４、１１５、１１６の一部をエッチング
して貫通孔１３１、１３３および小孔１３２を一個以上
開ける。集束イオンビーム装置を用いる代わりに、カリ
ックスアレーンまたはクロロメチル化カリックスアレー
ンを用いて電子ビーム露光を行ってエッチングマスクを
形成し、反応性イオンエッチングで貫通孔を開けてもよ
い。また、貫通孔１３１、１３３はフォトレジストを用
いてパターンニングを行った後、反応性イオンエッチン
グ等でエッチングしてもよい。小孔１３２において、集
束イオンビーム装置中でイオンビームを、または走査型
電子顕微鏡中で電子ビームを照射することにより、コン
タミネーションを堆積させ、孔のサイズを狭めることが
できる。または、真空蒸着や電気メッキ法により金属を
堆積させてもよい。電気メッキ法を用いる際には、小孔
を通過する金属イオン数を計測しながら行うと、制御よ
く孔を狭めることができる。
（図６Ｅ）出入口を設けたガラスカバーを上面へ、さら
にガラス基板を裏面へ接着する。接着は陽極接合によっ
て行う。接着はＰＭＭＡなどのポリマーを用いて行って
もよい。(FIG. 6A) The substrate used is a silicon substrate,
Silicon nitride film 102 on the surface, and further silicon oxide film 1
01, a silicon nitride film 104 is formed on the back surface by vapor phase epitaxy. The film thickness of the silicon nitride films 102 and 104 is about 10 nm to 100 nm, and the film thickness of the silicon oxide film is about 300 nm. The silicon nitride film 104 on the back surface is made of 25% tetramethylammonium halide (TMAH).
Etching is performed by using to form trenches 105, 106 and 107 until the silicon nitride film 102 is exposed. TM
Potassium hydroxide (KOH) may be used instead of AH. The areas between the trenches 105 and 106 and 107 and 106 likewise etch the silicon substrate. (FIG. 6B) Silicon nitride film membranes 114 and 11 in which a part of the silicon oxide film 101 on the surface is opened and openings 111, 112 and 113 are provided, and the silicon nitride film is exposed.
5, 116 are formed. (FIG. 6C) Gold electrodes 121 to 126 using vacuum deposition
To form. The film thickness of the gold electrode is about 5 nm to 100 nm. (FIG. 6D) A part of the silicon nitride film membranes 114, 115 and 116 is etched by a focused ion beam device to form one or more through holes 131, 133 and small holes 132. Instead of using the focused ion beam apparatus, electron beam exposure may be performed using calixarene or chloromethylated calixarene to form an etching mask, and a through hole may be formed by reactive ion etching. The through holes 131 and 133 may be patterned by using a photoresist and then etched by reactive ion etching or the like. By irradiating the small holes 132 with an ion beam in a focused ion beam device or an electron beam in a scanning electron microscope, contamination can be deposited and the size of the holes can be narrowed. Alternatively, the metal may be deposited by vacuum vapor deposition or electroplating. When the electroplating method is used, the number of metal ions passing through the small holes can be measured while the holes can be narrowed with good control. (FIG. 6E) A glass cover provided with a doorway is bonded to the upper surface, and a glass substrate is bonded to the back surface. Adhesion is performed by anodic bonding. The adhesion may be performed using a polymer such as PMMA.
【００３６】以上の工程より、微細配列認識装置を作製
することができる。図９Ａは作製した微細配列認識装置
の小孔の電子顕微鏡写真である。A fine array recognition device can be manufactured through the above steps. FIG. 9A is an electron micrograph of the small holes of the manufactured fine array recognition device.
【００３７】（実施例２）本発明の実施例２について説
明する。本発明の実施例２の外観および内部構造は、絶
縁膜１１上の陰極２２の形状と２つの電極３１、３２が
異なる以外は図１Ａおよび図１Ｂと同じである。(Second Embodiment) A second embodiment of the present invention will be described. The external appearance and internal structure of Example 2 of the present invention are the same as those of FIGS. 1A and 1B except that the shape of the cathode 22 on the insulating film 11 and the two electrodes 31 and 32 are different.
【００３８】図２Ｂは絶縁膜１１上の小孔２５付近を真
上から見た図で、本実施例の電極配置を示している。陰
極２２とは別に、第３、第４の電極３１および３２が配
置される。電極３１、３２は小孔を挟んで近接して配置
される。FIG. 2B is a view of the vicinity of the small hole 25 on the insulating film 11 as seen from directly above, showing the electrode arrangement of this embodiment. Separately from the cathode 22, third and fourth electrodes 31 and 32 are arranged. The electrodes 31 and 32 are arranged close to each other with a small hole in between.
【００３９】第３および第４の電極３１および３２によ
って、分子が小孔２５を通過している時に、分子の伝導
度を測定することができる。ＤＮＡの４種類の塩基は、
電子雲の形がそれぞれ異なるため、伝導度が異なる。よ
って、第３および第４の電極３１および３２間の伝導度
によって、塩基配列を知ることができる。陽極２２と陰
極２１間の電流とともに、塩基配列決定を補完する働き
をする。The third and fourth electrodes 31 and 32 allow the conductivity of the molecule to be measured as it passes through the small hole 25. The four types of bases in DNA are
Since the shapes of electron clouds are different, the conductivity is different. Therefore, the base sequence can be known from the conductivity between the third and fourth electrodes 31 and 32. Together with the current between the anode 22 and the cathode 21, it serves to complement the base sequence determination.
【００４０】図７は、本発明の実施例２の微細配列認識
装置の作製工程を示している。基板としてシリコン基板
を用い、半導体微細加工技術を用いて、微細配列認識装
置を実際に作製する。FIG. 7 shows a manufacturing process of a fine array recognition apparatus according to the second embodiment of the present invention. A silicon array substrate is used as a substrate, and a fine array recognition device is actually manufactured by using a semiconductor fine processing technique.
【００４１】（図７Ａ）用いる基板はシリコン基板で、
表面にシリコン窒化膜１０２、さらにシリコン酸化膜１
０１、裏面にシリコン窒素化膜１０４を気相成長法にて
形成する。シリコン窒化膜１０２および１０４の膜厚は
１０ｎｍから１００ｎｍ程度、シリコン酸化膜の膜厚は
３００ｎｍ程度である。裏面のシリコン窒化膜１０４を
テトラメチルアンモニウムハライド（ＴＭＡＨ）２５％
を用いてエッチングを行い、シリコン窒化膜１０２が露
出するまで溝１０５、１０６、１０７を形成する。ＴＭ
ＡＨの代わりに水酸化カリウム（ＫＯＨ）を用いてもよ
い。溝１０５と１０６および１０７と１０６の間の領域
も同様にシリコン基板をエッチングする。
（図７Ｂ）表面のシリコン酸化膜１０１の一部を開口
し、開口部１１１、１１２、１１３を設け、シリコン窒
化膜メンブレン１１４、１１５、１１６が形成される。
（図７Ｃ）真空蒸着法を用いて金電極１２１から１２６
を形成する。金電極の膜厚は５ｎｍから１００ｎｍ程度
である。さらに、集束イオンビーム装置を用いて、電極
１２７を形成する。
（図７Ｄ）集束イオンビーム装置によりシリコン窒化膜
メンブレン１１４、１１５、１１６の一部をエッチング
して貫通孔１３１、１３３および小孔１３２を一個以上
の開ける。集束イオンビーム装置を用いる代わりに、カ
リックスアレーンまたはクロロメチル化カリックスアレ
ーンを用いて電子ビーム露光を行ってエッチングマスク
を形成し、反応性イオンエッチングで貫通孔および小孔
を開けてもよい。小孔１３２を作製する際、電極１２７
を切断することにより、電極１３４および１３５を作製
する。また、貫通孔１３１、１３３はフォトレジストを
用いてパターンニングを行った後、反応性イオンエッチ
ング等でエッチングしてもよい。
（図７Ｅ）出入口を設けたガラスカバーを上面へ、さら
にガラス基板を裏面へ接着する。接着は陽極接合によっ
て行う。接着はＰＭＭＡなどのポリマーを用いて行って
もよい。以上の工程より、微細配列認識装置を作製する
ことができる。図９Ｂは実施例２により作製した微細配
列認識装置の小孔の電子顕微鏡写真である。(FIG. 7A) The substrate used is a silicon substrate,
Silicon nitride film 102 on the surface, and further silicon oxide film 1
01, a silicon nitride film 104 is formed on the back surface by vapor phase epitaxy. The film thickness of the silicon nitride films 102 and 104 is about 10 nm to 100 nm, and the film thickness of the silicon oxide film is about 300 nm. The silicon nitride film 104 on the back surface is made of 25% tetramethylammonium halide (TMAH).
Etching is performed by using to form trenches 105, 106 and 107 until the silicon nitride film 102 is exposed. TM
Potassium hydroxide (KOH) may be used instead of AH. The areas between the trenches 105 and 106 and 107 and 106 likewise etch the silicon substrate. (FIG. 7B) A part of the silicon oxide film 101 on the surface is opened, openings 111, 112, 113 are provided, and silicon nitride film membranes 114, 115, 116 are formed. (FIG. 7C) Gold electrodes 121-126 using vacuum deposition
To form. The film thickness of the gold electrode is about 5 nm to 100 nm. Further, the electrode 127 is formed by using a focused ion beam device. (FIG. 7D) A part of the silicon nitride film membranes 114, 115 and 116 is etched by a focused ion beam device to form one or more through holes 131, 133 and small holes 132. Instead of using the focused ion beam device, electron beam exposure may be performed using calixarene or chloromethylated calixarene to form an etching mask, and through holes and small holes may be formed by reactive ion etching. When making the small hole 132, the electrode 127
The electrodes 134 and 135 are produced by cutting. The through holes 131 and 133 may be patterned by using a photoresist and then etched by reactive ion etching or the like. (FIG. 7E) A glass cover provided with a doorway is bonded to the upper surface, and a glass substrate is bonded to the back surface. Adhesion is performed by anodic bonding. The adhesion may be performed using a polymer such as PMMA. A fine array recognition device can be manufactured through the above steps. FIG. 9B is an electron micrograph of small holes of the fine array recognition device manufactured in Example 2.
【００４２】（実施例３）本発明の実施例３について説
明する。本発明の実施例２の外観および内部構造は、絶
縁膜１１上の陰極２２の形状と２つの電極３１、３２が
異なる以外は図１Ａおよび図１Ｂと同じである。また、
絶縁膜１１は圧電効果を有する圧電薄膜とする。(Third Embodiment) A third embodiment of the present invention will be described. The external appearance and internal structure of Example 2 of the present invention are the same as those of FIGS. 1A and 1B except that the shape of the cathode 22 on the insulating film 11 and the two electrodes 31 and 32 are different. Also,
The insulating film 11 is a piezoelectric thin film having a piezoelectric effect.
【００４３】図２Ｃは絶縁膜１１上の小孔２５付近を真
上から見た図で、本実施例の電極配置を示している。陰
極２２とは別に、圧電薄膜制御用の電極３３および３４
が配置される。電極３３、３４は圧電薄膜３５の表面お
よび裏面にそれぞれ配置される。FIG. 2C is a view of the vicinity of the small hole 25 on the insulating film 11 as seen from directly above, showing the electrode arrangement of this embodiment. Separately from the cathode 22, electrodes 33 and 34 for controlling the piezoelectric thin film
Are placed. The electrodes 33 and 34 are arranged on the front surface and the back surface of the piezoelectric thin film 35, respectively.
【００４４】図５は本発明の実施例３に関する動作原理
について説明したものである。図５Ａは圧電薄膜３５を
貫く小孔２５付近の断面図である。陽極２１および陰極
２２は、図１では絶縁膜上にあるが、本図では模式的に
溶液中に表示している。FIG. 5 explains the operation principle of the third embodiment of the present invention. FIG. 5A is a sectional view near the small hole 25 penetrating the piezoelectric thin film 35. Although the anode 21 and the cathode 22 are on the insulating film in FIG. 1, they are schematically shown in the solution in this figure.
【００４５】図５Ａにおいて、圧電薄膜３５を境にして
試料を含む溶液４１とバッファー液４２に分けられてい
る。各溶液には正または負に帯電した金属イオンが含ま
れている。電圧源１６を用いて電圧を、陰極２２と陽極
２１の間に加えると、陰極２２と等電位である試料を含
む溶液４１と陽極２１と等電位であるバッファー液４２
に電位差Ｖが生じる。小孔の両端に電位差が生じると、
負に帯電した金属イオンは小孔を通過して、陰極側から
陽極側へと電位勾配に沿って移動する。一方、正に帯電
した金属イオンは小孔を通過して、陽極側から陰極側へ
と電位勾配に沿って移動する。その結果、金属イオンが
電荷を運び、外部回路に電流が生じる。電流の大きさ
は、小孔を通過する金属イオンの単位時間あたりの数に
比例する。金属イオンの単位時間あたりの数は小孔の断
面積Ｓ、電位差Ｖに対して比例の関係にあり、小孔の長
さＬに対して逆比例の関係にある。In FIG. 5A, the piezoelectric thin film 35 is divided into a solution 41 containing a sample and a buffer solution 42. Each solution contains positively or negatively charged metal ions. When a voltage is applied between the cathode 22 and the anode 21 using the voltage source 16, a solution 41 containing a sample having the same potential as the cathode 22 and a buffer solution 42 having the same potential as the anode 21.
A potential difference V is generated at. When a potential difference occurs at both ends of the small hole,
The negatively charged metal ions pass through the small holes and move along the potential gradient from the cathode side to the anode side. On the other hand, the positively charged metal ions pass through the small holes and move along the potential gradient from the anode side to the cathode side. As a result, the metal ions carry an electric charge, and a current is generated in the external circuit. The magnitude of the electric current is proportional to the number of metal ions passing through the small hole per unit time. The number of metal ions per unit time is proportional to the cross-sectional area S of the small holes and the potential difference V, and inversely proportional to the length L of the small holes.
【００４６】圧電薄膜３５上の圧電薄膜制御用電極３
３、３４の間に電圧を加えると、圧電薄膜が圧縮あるい
は伸張される逆圧電効果によって、圧電薄膜の小孔の大
きさが変位分２７だけ変化する。小孔に分子あるいはＤ
ＮＡが通過する際に、上述のように電流が変化するが、
電流が一定、つまり、通過する金属イオンの数が一定と
なるように、圧電薄膜制御用電極間に負帰還電圧を加え
る。その結果、大きな分子が小孔を塞いでしまう恐れが
なくなり、かつ、小孔を通過する分子あるいはＤＮＡの
流れが一定に近づく。負帰還電圧は分子やＤＮＡの塩基
の大きさに比例するから、この負帰還電圧を読み取れ
ば、通過する分子の有無や大きさ、ＤＮＡの塩基の種類
を知ることができる。Piezoelectric thin film control electrode 3 on the piezoelectric thin film 35
When a voltage is applied between 3 and 34, the size of the small holes in the piezoelectric thin film changes by a displacement amount 27 due to the inverse piezoelectric effect in which the piezoelectric thin film is compressed or expanded. Molecules or D in small holes
When NA passes, the current changes as described above,
A negative feedback voltage is applied between the piezoelectric thin film control electrodes so that the current is constant, that is, the number of passing metal ions is constant. As a result, there is no risk that large molecules will block the small pores, and the flow of molecules or DNA passing through the small pores will approach a certain level. Since the negative feedback voltage is proportional to the size of the base of the molecule or DNA, it is possible to know the presence / absence or size of the passing molecule and the type of the base of DNA by reading the negative feedback voltage.
【００４７】図８は、本発明の実施例２の微細配列認識
装置の作製工程を示している。基板としてシリコン基板
を用い、半導体微細加工技術を用いて、微細配列認識装
置を実際に作製する。FIG. 8 shows a manufacturing process of a fine array recognition apparatus according to the second embodiment of the present invention. A silicon array substrate is used as a substrate, and a fine array recognition device is actually manufactured by using a semiconductor fine processing technique.
【００４８】（図８Ａ）用いる基板はシリコン基板で、
表面にシリコン窒化膜１０２、さらにシリコン酸化膜１
０１、裏面にシリコン窒素化膜１０４を気相成長法にて
形成する。シリコン窒化膜１０２および１０４の膜厚は
１０ｎｍから１００ｎｍ程度、シリコン酸化膜の膜厚は
３００ｎｍ程度である。裏面のシリコン窒化膜１０４を
テトラメチルアンモニウムハライド（ＴＭＡＨ）２５％
を用いてエッチングを行い、シリコン窒化膜１０２が露
出するまで溝１０５、１０６、１０７を形成する。ＴＭ
ＡＨの代わりに水酸化カリウム（ＫＯＨ）を用いてもよ
い。溝１０５と１０６および１０７と１０６の間の領域
も同様にシリコン基板をエッチングする。
（図８Ｂ）表面のシリコン酸化膜１０１の一部を開口
し、開口部１１１、１１２、１１３を開け、シリコン窒
化膜メンブレン１１４、１１５、１１６が形成される。
つづいて、スパッタ法によって圧電薄膜の一種であるチ
タン酸鉛（ＰＺＴ）１５０を成長する。スパッタ法以外
にゾル−ゲル法によっても成膜してもよい。チタン酸鉛
（ＰＺＴ）は、チタン酸バリウム、またはそれらの混合
化合物でもよい。
（図８Ｃ）反応性イオンエッチングによりシリコン窒化
膜の一部をエッチングして、圧電薄膜の両面が露出する
ようにする。真空蒸着法を用いて金電極１２１から１２
６、１５１、および１５２を形成する。金電極の膜厚は
５ｎｍから１００ｎｍ程度である。
（図８Ｄ）集束イオンビーム装置によりシリコン窒化膜
メンブレン１１４、１１５、１１６の一部をエッチング
して貫通孔１３１、１３３および小孔１３２を一個以上
の開ける。集束イオンビーム装置を用いる代わりに、カ
リックスアレーンまたはクロロメチル化カリックスアレ
ーンを用いて電子ビーム露光を行ってエッチングマスク
を形成し、反応性イオンエッチングで貫通孔を開けても
よい。また、貫通孔１３１、１３３はフォトレジストを
用いてパターンニングを行った後、反応性イオンエッチ
ング等でエッチングしてもよい。
（図８Ｅ）出入口を設けたガラスカバーを上面へ、さら
にガラス基板を裏面へ接着する。接着は陽極接合によっ
て行う。接着はＰＭＭＡなどのポリマーを用いて行って
もよい。以上の工程より、微細配列認識装置を作製する
ことができる。(FIG. 8A) The substrate used is a silicon substrate,
Silicon nitride film 102 on the surface, and further silicon oxide film 1
01, a silicon nitride film 104 is formed on the back surface by vapor phase epitaxy. The film thickness of the silicon nitride films 102 and 104 is about 10 nm to 100 nm, and the film thickness of the silicon oxide film is about 300 nm. The silicon nitride film 104 on the back surface is made of 25% tetramethylammonium halide (TMAH).
Etching is performed by using to form trenches 105, 106 and 107 until the silicon nitride film 102 is exposed. TM
Potassium hydroxide (KOH) may be used instead of AH. The areas between the trenches 105 and 106 and 107 and 106 likewise etch the silicon substrate. (FIG. 8B) A part of the silicon oxide film 101 on the surface is opened and openings 111, 112 and 113 are opened to form silicon nitride film membranes 114, 115 and 116.
Subsequently, lead titanate (PZT) 150, which is a kind of piezoelectric thin film, is grown by the sputtering method. The film may be formed by a sol-gel method other than the sputtering method. The lead titanate (PZT) may be barium titanate or a mixed compound thereof. (FIG. 8C) A part of the silicon nitride film is etched by reactive ion etching so that both surfaces of the piezoelectric thin film are exposed. Gold electrodes 121 to 12 using the vacuum deposition method
6, 151 and 152 are formed. The film thickness of the gold electrode is about 5 nm to 100 nm. (FIG. 8D) A part of the silicon nitride film membranes 114, 115 and 116 is etched by a focused ion beam device to form one or more through holes 131, 133 and small holes 132. Instead of using the focused ion beam apparatus, electron beam exposure may be performed using calixarene or chloromethylated calixarene to form an etching mask, and a through hole may be formed by reactive ion etching. The through holes 131 and 133 may be patterned by using a photoresist and then etched by reactive ion etching or the like. (FIG. 8E) A glass cover provided with a doorway is adhered to the upper surface, and a glass substrate is adhered to the back surface. Adhesion is performed by anodic bonding. The adhesion may be performed using a polymer such as PMMA. A fine array recognition device can be manufactured through the above steps.
【００４９】[0049]
【発明の効果】本発明による微細配列認識装置では、Ｄ
ＮＡの塩基配列を安価かつ効率的に、しかも迅速に決定
できる。According to the fine array recognition apparatus of the present invention, D
The base sequence of NA can be determined inexpensively, efficiently, and quickly.
【００５０】本発明による微細配列認識装置では、半導
体微細加工を用いているため、作製における安全性が高
く、材質として生体分子を用いていないため、経時変化
が少なく、かつ溶液の種類による安定性が高い。Since the fine array recognition apparatus according to the present invention uses semiconductor fine processing, it is highly safe in production, and since biomolecules are not used as a material, there is little change with time and stability depending on the type of solution. Is high.
【００５１】[0051]
【配列表】 <110> NEC Corporation <120> Device and method for analysis of individual molecules <130> 34103599 <160> 2 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <400> 1 ggtatgccaa ttattcaacg ttac 24[Sequence list] <110> NEC Corporation <120> Device and method for analysis of individual molecules <130> 34103599 <160> 2 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <400> 1 ggtatgccaa ttattcaacg ttac 24
【図１】微細配列認識装置の外観（Ａ）および内部構造
（Ｂ）FIG. 1 is an external view (A) and an internal structure (B) of a fine array recognition device.
【図２】小孔周辺の電極配置。（Ａ）実施例１、（Ｂ）
実施例２、（Ｃ）実施例３記載の微細配列認識装置の小
孔周辺の電極配置FIG. 2 shows an electrode arrangement around a small hole. (A) Example 1, (B)
Example 2 (C) Electrode arrangement around the small holes of the fine array recognition device described in Example 3
【図３】（Ａ）実施例１の分子計数としての動作原理と
（Ｂ）観測される電流。FIG. 3A is a principle of operation as a molecule counting in Example 1 and FIG. 3B is an observed current.
【図４】（Ａ）実施例１のＤＮＡ塩基配列決定の動作原
理と（Ｂ）観測される電流。4 (A) Operating principle of DNA sequencing of Example 1 and (B) Observed current.
【図５】（Ａ）実施例３の分子計数としての動作原理と
（Ｂ）観測される電流。5 (A) Operating principle of molecule counting in Example 3 and (B) Observed current.
【図６】実施例１の微細配列認識装置の作製工程FIG. 6 is a manufacturing process of the fine array recognition apparatus in Example 1
【図７】実施例２の微細配列認識装置の作製工程FIG. 7: Manufacturing process of a fine array recognition apparatus in Example 2
【図８】実施例３の微細配列認識装置の作製工程FIG. 8 is a manufacturing process of a fine array recognition apparatus of Example 3
【図９】（Ａ）実施例１および（Ｂ）実施例２の微細配
列認識装置の小孔部分FIG. 9 is a small hole portion of the fine array recognition device of (A) Example 1 and (B) Example 2;
１０．．．流路を設けた基板
１１．．．絶縁膜
１２．．．ガラスカバー
１３．．．バッファー入口
１４．．．試料入口
１５．．．バッファー出口
１６．．．電圧源
１７．．．電流計
２０．．．流路
２１、２３．．．陽極
２２．．．陰極
２４、２６．．．貫通孔
２５．．．小孔
３１．．．第３の電極
３２．．．第４の電極
３３、３４．．．圧電膜制御用電極
３５．．．圧電薄膜
４１．．．試料溶液
４２．．．バッファー溶液
４３．．．金属イオン
４４．．．試料分子
４５．．．ＤＮＡ
４６、４７．．．保護膜
４８．．．電圧源
１０１．．．シリコン酸化膜
１０２、１０４．．．シリコン窒化膜
１０３．．．シリコン基板
１０５、１０６、１０７．．．エッチング溝
１１１、１１２、１１３．．．開口部
１１４、１１５、１１６．．．シリコン窒化膜メンブレ
ン
１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２
６．．．金電極
１２７．．．タングステン電極
１３１、１３２、１３３．．．エッチング孔
１３４、１３５．．．タングステン電極
１４１、１４２．．．ガラスカバー
１５０．．．チタン酸鉛薄膜
１５１、１５２、１５３、１５４．．．金電極10. ． ． Substrate provided with flow channel 11. ． ． Insulating film 12. ． ． Glass cover 13. ． ． Buffer inlet 14. ． ． Sample inlet 15. ． ． Buffer outlet 16. ． ． Voltage source 17. ． ． Ammeter 20. ． ． Flow paths 21, 23. ． ． Anode 22. ． ． Cathode 24, 26. ． ． Through hole 25. ． ． Small hole 31. ． ． Third electrode 32. ． ． Fourth electrodes 33, 34. ． ． Piezoelectric film control electrode 35. ． ． Piezoelectric thin film 41. ． ． Sample solution 42. ． ． Buffer solution 43. ． ． Metal ion 44. ． ． Sample molecule 45. ． ． DNA 46, 47. ． ． Protective film 48. ． ． Voltage source 101. ． ． Silicon oxide films 102, 104. ． ． Silicon nitride film 103. ． ． Silicon substrates 105, 106, 107. ． ． Etching grooves 111, 112, 113. ． ． Openings 114, 115, 116. ． ． Silicon nitride film membranes 121, 122, 123, 124, 125, 12
6. ． ． Gold electrode 127. ． ． Tungsten electrodes 131, 132, 133. ． ． Etching holes 134, 135. ． ． Tungsten electrodes 141, 142. ． ． Glass cover 150. ． ． Lead titanate thin films 151, 152, 153, 154. ． ． Gold electrode
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｍ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ ３３６Ｂ ３３６Ｚ ３３６Ｇ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 飯田 一浩 東京都港区芝五丁目７番１号 日本電気株 式会社内 (72)発明者 佐野 亨 東京都港区芝五丁目７番１号 日本電気株 式会社内 (72)発明者 馬場 雅和 東京都港区芝五丁目７番１号 日本電気株 式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA13 GC20 JA07 2G060 AA06 AC02 AC10 AD06 AE17 AF01 AF06 AF08 AG11 FA01 FB02 HA01 HC07 HC18 HE05 JA06 KA06 4B024 AA11 CA01 CA09 HA13 HA19 4B029 AA07 BB20 FA10 FA12 HA09 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QR50 QR56 QS22 QX02 QX04 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) G01N 33/50 G01N 27/46 336M // C12N 15/09 ZNA 336B 336Z 336G C12N 15/00 ZNAA (72) Inventor Kazuhiro Iida 5-7-1, Shiba 5-chome, Minato-ku, Tokyo Inside NEC Corporation (72) Inventor Toru Sano 5-7-1, Shiba 5-chome, Minato-ku, Tokyo (72) Inventor Masakazu Baba 5-7-1 Shiba 5-chome, Minato-ku, Tokyo F-Term inside NEC Corporation (reference) 2G045 AA35 DA13 GC20 JA07 2G060 AA06 AC02 AC10 AD06 AE17 AF01 AF06 AF08 AG11 FA01 FB02 HA01 HC07 HC18 HE05 JA06 KA06 4B024 AA11 CA01 CA09 HA13 HA19 4B029 AA07 BB20 FA10 FA12 HA09 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QR50 QR56 QS22 QX02 QX04
Claims (15)
であって、イオンが透過する小孔(チャネル)を有する電
気的絶縁膜を介して分離された、複数の液溜めと、それ
らそれぞれの液溜め内の溶液に通電する複数の電極で構
成され、いずれかの電極間に電圧を印加し、小孔を通過
するイオンにより発生する電流を計測することを特徴と
する微細配列認識装置。1. A device capable of determining the base sequence of DNA at high speed, comprising a plurality of liquid reservoirs separated through an electrically insulating film having small pores (channels) through which ions pass, and their respective liquid reservoirs. A fine array recognition apparatus comprising a plurality of electrodes for energizing a solution in a liquid reservoir, applying a voltage between any of the electrodes, and measuring a current generated by ions passing through a small hole.
化膜、またはシリコン酸窒化膜であること、あるいは、
シリコン基板をエッチングしたことにより露出したシリ
コン窒化膜、シリコン酸化膜、またはシリコン酸窒化膜
であることを特徴とする請求項１に記載の微細配列認識
装置。2. The insulating film is a silicon nitride film, a silicon oxide film, or a silicon oxynitride film, or
The fine array recognition device according to claim 1, wherein the fine array recognition device is a silicon nitride film, a silicon oxide film, or a silicon oxynitride film exposed by etching a silicon substrate.
るＤＮＡや分子の配列構造決定や計数、選別（ふる
い）、ソート（分類）、検索をおこなうことを特徴とす
る請求項１、２のいずれかに記載の微細配列認識装置。3. The measured current information is used to perform sequence structure determination, counting, sorting (sieving), sorting (classification) and retrieval of DNAs and molecules passing through the small holes. 2. The fine array recognition device according to any one of 2.
孔を挟んで対向した電極が設置されることを特徴とする
請求項１、２、３のいずれかに記載の微細配列認識装
置。4. The fine array recognition device according to claim 1, wherein, in addition to a plurality of electrodes for energizing the solution, electrodes facing each other with a small hole in between are installed. .
両面に電極が形成されたことを特徴とする請求項１、
２、３のいずれかに記載の微細配列認識装置。5. The insulating film is a piezoelectric thin film, and electrodes are formed on both surfaces of the piezoelectric thin film.
The fine array recognition device according to any one of 2 and 3.
孔を形成することを特徴とする請求項１、２、３、４、
５のいずれかに記載の微細配列認識装置の製造方法。6. The small holes are formed by a focused ion beam (FIB) technique.
5. The method for manufacturing the fine array recognition device according to any one of 5 above.
ックスアレーン、またはポリスチレン等の高解像度電子
線レジストを用いて前記小孔を形成することを特徴とす
る請求項１、２、３、４、５のいずれかに記載の微細配
列認識装置の製造方法。7. The small hole is formed by using a high-resolution electron beam resist such as calixarene, chloromethylated calixarene, or polystyrene. A method for manufacturing a fine array recognition device according to claim 1.
狭めるために、真空蒸着法、化学的気相成長法、あるい
は、電気メッキ法を用いることを特徴とする請求項１、
２、３、４、５のいずれかに記載の微細配列認識装置の
製造方法あるいは請求項６、７のいずれかに記載の微細
配列認識装置の製造方法。8. The vacuum deposition method, the chemical vapor deposition method, or the electroplating method is used to reduce the size of the small holes after forming the small holes.
The method for manufacturing a fine array recognition device according to any one of 2, 3, 4, and 5, or the method for manufacturing a fine array recognition device according to any one of claims 6 and 7.
る絶縁膜が隔てた二つの溶媒間のイオン電流を計測、制
御して、小孔の大きさを決めることを特徴とする請求項
８に記載の微細配列認識装置の製造方法。9. The size of a small hole is determined by measuring and controlling an ionic current between two solvents separated by an insulating film having a small hole when the electroplating method is used. 8. The method for manufacturing the fine array recognition device according to item 8.
ーム（ＦＩＢ）技術を用いることを特徴とする請求項
１、２、３、４、５いずれかに記載の微細配列認識装置
の製造方法あるいは請求項６、７、８、９いずれかに記
載の微細配列認識装置の製造方法。10. A method or a method for manufacturing a fine array recognition apparatus according to claim 1, wherein a focused ion beam (FIB) technique is used in forming the electrodes. Item 10. A method for manufacturing a fine array recognition device according to any one of items 6, 7, 8 and 9.
基は、特定の小孔の特定の時間において一種類が認識さ
れることを特徴とする請求項１、２、３、４、５のいず
れかに記載の微細配列認識装置における微細配列認識方
法。11. The microarray or the DNA base passing through the small hole is recognized as one kind at a specific time in a specific small hole, according to claim 1, 2, 3, 4, 5. A fine array recognition method in the fine array recognition apparatus according to any one of claims.
度を測定して微細配列を認識することを特徴とする請求
項４に記載の微細配列認識装置における微細配列認識方
法。12. The fine array recognizing method in a fine array recognizing apparatus according to claim 4, wherein the fine array is recognized by measuring conductivity between electrodes facing each other across the small hole.
薄膜の両面に形成された一対の電極間に電圧を加えた
時、圧電薄膜の小孔の大きさが逆圧電効果によって変化
する信号を微細配列認識の情報に用いることを特徴とす
る請求項５に記載の微細配列装置の微細配列認識方法。13. A signal in which, when the insulating film is a piezoelectric thin film, the size of the small holes of the piezoelectric thin film changes due to an inverse piezoelectric effect when a voltage is applied between a pair of electrodes formed on both surfaces of the piezoelectric thin film. The fine array recognition method of the fine array apparatus according to claim 5, wherein is used as information for fine array recognition.
に負帰還電圧を加えて小孔の径を変化させて、小孔を通
過するイオンの流れを一定に保ち、前記負帰還電圧を読
み取ることによって、通過する分子の有無や大きさ、Ｄ
ＮＡの塩基の種類を認識することを特徴とする請求項１
３に記載の微細配列認識装置の微細配列認識方法。14. A negative feedback voltage is applied between the electrodes formed on both sides of the piezoelectric thin film to change the diameter of the small hole to keep the flow of ions passing through the small hole constant and to reduce the negative feedback voltage. By reading, the presence / absence of molecules passing through and the size, D
2. A type of NA base is recognized.
The fine array recognition method of the fine array recognition apparatus according to item 3.
基を修飾して塩基の分子サイズを変えると、前記修飾し
た塩基が小孔を通過する瞬間のイオン電流の変化が強調
され、前記塩基の検出が容易となることを特徴とする請
求項１、２、３、４、５のいずれかに記載の微細配列認
識装置における微細配列認識方法。15. When a specific base among DNA-constituting bases is modified to change the molecular size of the base, a change in ionic current at the moment when the modified base passes through a small hole is emphasized, and the base is modified. 6. The fine array recognition method in the fine array recognition apparatus according to claim 1, wherein the detection of [3] is facilitated.
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-
2001
- 2001-07-24 JP JP2001223009A patent/JP2003098146A/en not_active Withdrawn
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