JP2003088366A - New homeobox factor stimulating insulin expression in pancreatic islet cell - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for increasing an insulin level in the body of a diabetic mellitus patient for treating the patient with diabetic mellitus. SOLUTION: This new homeobox type pancreatic islet transcription factor protein useful for adjusting the insulin-expression level in both in vivo and in vitro by bonding with a tissue specific element in a pancreatic insula hormone gene promoter is provided. Also, the nucleic acid sequence encoding such transcription factor protein and an assay by using the same are provided. The transcription factor protein can be used for adjusting the RNA transcription for producing an antibody in a treating composition and a method for treatment by using such protein or antibody.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は核酸と、それによっ
てコードされるレセプター蛋白質に関するものである。
本発明による核酸は新しい組織特異性膵臓ホルモン転写
因子蛋白質をコードする。本発明はまた、そうした転写
因子をつくる方法と、インビボとインビトロの両方で、
膵臓島ホルモン遺伝子プロモータからのホルモン遺伝子
発現を調節するためにその転写因子蛋白質を用いる方法
に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a nucleic acid and a receptor protein encoded by the nucleic acid.
The nucleic acid according to the present invention encodes a novel tissue-specific pancreatic hormone transcription factor protein. The invention also provides methods for making such transcription factors, both in vivo and in vitro,
It relates to a method of using the transcription factor protein to regulate the expression of a hormone gene from the pancreatic islet hormone gene promoter.

【０００２】[0002]

【従来の技術】内分泌性器官である膵臓は、主にペプチ
ドホルモングルカゴン（Ａ−細胞）、インシュリン（Ｂ
−細胞）、ソマトスタチン（Ｄ−細胞）、および膵臓ポ
リペプチド（Ｆ−細胞）を合成し、分泌する。小腸から
発生学的手法で取り出したこれらの膵臓島細胞は、同じ
ペプチドホルモン遺伝子の発現を指令する腸を出発点と
する調節経路を有している可能性がある。形成初期の内
分泌性膵臓には、ソマトスタチン、インシュリン、およ
びグルカゴンを共発現する多分化能性（pluripotent）
細胞が存在している。これらの幹細胞が成熟すると、そ
の内分泌性ホルモンが単一の遺伝子からの発現に拘束さ
れてしまうことが観察され、このことは、一般の転写因
子が当初３つの遺伝子すべてを規制できるのに対して、
個々の核酸転写遺伝子蛋白質は、後で、個々の成熟島細
胞タイプにおいて組織特異性ペプチド生産を指定しなけ
ればならないことを示唆している。2. Description of the Related Art The pancreas, which is an endocrine organ, is mainly composed of peptide hormones glucagon (A-cell) and insulin (B).
-Cells), somatostatin (D-cells), and pancreatic polypeptides (F-cells). These pancreatic islet cells extracted from the small intestine by a developmental method may have a regulatory pathway starting from the intestine that directs the expression of the same peptide hormone gene. Pluripotent co-expressing somatostatin, insulin, and glucagon in the early endocrine pancreas
Cells are present. As these stem cells mature, we observed that their endocrine hormones were restricted to expression from a single gene, whereas common transcription factors could initially regulate all three genes. ,
Individual nucleic acid transcribed gene proteins have later been suggested to have to direct tissue-specific peptide production in individual mature islet cell types.

【０００３】グルカゴンおよびインシュリンの発現に比
べて、ソマトスタチンの発現の開始はやや遅い。マウス
では、ソマトスタチンの発現はインシュリン遺伝子を共
発現する細胞における胚発生の17日目に開始され、その
後、インシュリン遺伝子は成長したソマトスタチン生産
Ｄ−細胞において抑制される。また、インシュリンおよ
びソマトスタチン遺伝子の両方を共発現する細胞の別の
サブセットでは、膵臓ポリペプチド遺伝子は活性化さ
れ、その後、インシュリン遺伝子とソマトスタチン遺伝
子の両方が抑制される。この発生調節のパターンはイン
シュリンおよびソマトスタチン遺伝子の発現はポジティ
ブ制御メカニズムとネガティブ制御メカニズムの両方の
影響を受けていることを示している。The onset of somatostatin expression is somewhat slower than that of glucagon and insulin. In mice, somatostatin expression is initiated on day 17 of embryonic development in cells that co-express the insulin gene, after which the insulin gene is repressed in grown somatostatin-producing D-cells. Also, in another subset of cells that co-express both the insulin and somatostatin genes, the pancreatic polypeptide gene is activated, followed by repression of both the insulin and somatostatin genes. This pattern of developmental regulation indicates that the expression of the insulin and somatostatin genes is affected by both positive and negative regulatory mechanisms.

【０００４】ラットの膵臓島細胞系Ｔu−６のソマトス
タチン遺伝子の発現は、cＡＭＰ反応要素（ＣＲＥ）と
共同して高度の構成的活性をつくりだす組織特異性プロ
モータ要素（ＴＳＥ）を必要とすることが観察されてい
る。ＴＳＥ状の配列はソマトスタチンプロモータの500
塩基対領域で３度繰り返されており、−300および−100
に位置しているプロモータ近接ＴＳＥが最も高い活性を
示す。ソマトスタチンＴＳＥは通常ホメオボックス−タ
イプの蛋白質によって識別される正統ＴＡＡＴモチーフ
を含んでいる。ホメオボックス因子ＩＳＬ−１は、例え
ば、ＴＳＥに結合して、ラットインシュリノーマ細胞系
ＲＩＮ ５ＡＨ内のソマトスタチン発現を調節すること
ができる。しかしながら、ＩＳＬ−１はソマトスタチン
生産ＴＵ−６細胞の抽出物内のＴＳＥ結合活性のほとん
ど無視し得る程度の部分だけを含んでいるように思われ
る。膵臓島細胞に加えて、ソマトスタチン遺伝子はニュ
ーロン、甲状腺のＣ−細胞、それに消化腺のＤ−細胞で
も発現される。Expression of the somatostatin gene in the rat pancreatic islet cell line Tu-6 may require a tissue-specific promoter element (TSE) that cooperates with the cAMP response element (CRE) to produce a high degree of constitutive activity. Has been observed. The TSE-like sequence is the somatostatin promoter 500
Repeated three times in the base pair region, -300 and -100
The promoter-proximal TSE, located at, shows the highest activity. Somatostatin TSE contains an orthodox TAAT motif that is usually identified by homeobox-type proteins. The homeobox factor ISL-1 can, for example, bind to TSE and regulate somatostatin expression in the rat insulinoma cell line RIN 5AH. However, ISL-1 appears to contain only a negligible portion of the TSE binding activity within extracts of somatostatin-producing TU-6 cells. In addition to pancreatic islet cells, the somatostatin gene is also expressed in neurons, thyroid C-cells, and digestive gland D-cells.

【０００５】膵臓における個々の遺伝子のキー調節因子
として、多数のホメオボックス−タイプ因子が提案され
ているが、それらの構造、細胞分布およびそれらが豊富
に含まれている部位に関してはまだ解明されていない問
題が多数存在している。Many homeobox-type factors have been proposed as key regulators of individual genes in the pancreas, but their structure, cell distribution and their abundant sites have not yet been elucidated. There are many problems that do not exist.

【０００６】膵臓ホルモンの重要な機能はグルコースの
血管流体レベルを制御することである。グルカゴンはラ
ンゲルハンス島のＡ−細胞によって合成され、低血液グ
ルコースレベルに反応して放出される。グルカゴンは主
として肝臓細胞に影響を与え、アデニル酸シクラーゼお
よびcＡＭＰカスケードを誘発し、グリコーゲンの劣化
と血中グルコースの増大をもたらす。代謝にグルコース
がどの程度使えるかどうかは、体循環内のインシュリン
およびグルカゴン濃度の調節によって、（食事後の）過
剰時期と（急激な活動後の）欠乏時期の両方に調節され
る。An important function of pancreatic hormones is to control vascular fluid levels of glucose. Glucagon is synthesized by Langerhans islet A-cells and is released in response to low blood glucose levels. Glucagon mainly affects liver cells, induces adenylate cyclase and the cAMP cascade, resulting in glycogen degradation and increased blood glucose. The availability of glucose for metabolism is regulated by both insulin and glucagon concentrations in the systemic circulation, both during periods of excess (after meals) and during periods of deficiency (after acute activity).

【０００７】食事後に、血中グルコースが100mlあたり8
0〜90mgという正常レベル以上に上昇すると、インシュ
リンが膵臓のランゲルハンス島のＢ−細胞内の分泌小胞
から血液に放出される。島細胞自体はグルコースまたは
アミノ酸レベルの上昇に反応して血液中にインシュリン
を放出し、血液がそれを身体中に分配する。細胞表面レ
セプターに結合することによって、インシュリンは血液
からのグルコースを取り除かせ、それをグリコーゲンと
して蓄積させる。グルコースが100mlあたり80mg以下に
低下すると、その島のＡ−細胞がグルカゴンの分泌を開
始する。グルカゴンは肝臓細胞のグルカゴンレセプター
と結合し、アデニル酸シクラーゼおよびcＡＭＰカスケ
ードを活性化させる（エピネフィリンの反応に類似した
反応）。その結果。グリコーゲンの劣化と循環中へのグ
ルコースの放出をもたらす。After meal, blood glucose is 8 per 100 ml
Above the normal level of 0-90 mg, insulin is released into the blood from secretory vesicles within the B-cells of the islets of Langerhans in the pancreas. The islet cells themselves release insulin into the blood in response to elevated glucose or amino acid levels, which the blood distributes throughout the body. By binding to cell surface receptors, insulin removes glucose from the blood and accumulates it as glycogen. When glucose falls below 80 mg / 100 ml, the islet A-cells begin to secrete glucagon. Glucagon binds to the glucagon receptor on liver cells and activates the adenylate cyclase and cAMP cascades (a reaction similar to that of epinephrine). as a result. It leads to degradation of glycogen and release of glucose into the circulation.

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】糖尿病は体内のインシ
ュリン作用の不十分さによって起こされ、インシュリン
レベルの調整に関与する種々の欠陥から発生する場合が
ある。例えば、インシュリンレセプターの機能あるいは
調節における異常は、糖尿病を持つ一部の人々において
観察されている。この病気は、構造的に異常なインシュ
リンの生産、またはプロインシュリンのインシュリンへ
の転換の不良によって、正常なインシュリン合成が行わ
れないことによっても発生する。幼児期、あるいは早い
時期の糖尿病は膵臓島のＢ−細胞による不十分な、ある
いは異常なインシュリン合成によって引き起こされる。
こうした状況のほとんどでは、インシュリンの注射によ
って問題を克服することができる。したがって、特定の
タイプの糖尿病を持った患者を措置するためには、糖尿
病患者の体内でのインシュリンレベルを増大させる方法
の開発が望ましい。Diabetes is caused by inadequate insulin action in the body and may result from various deficiencies involved in regulating insulin levels. For example, abnormalities in insulin receptor function or regulation have been observed in some people with diabetes. The disease is also caused by the lack of normal insulin synthesis due to structurally abnormal insulin production or defective conversion of proinsulin to insulin. Early or early diabetes is caused by inadequate or abnormal insulin synthesis by B-cells of the pancreatic islets.
In most of these situations, insulin injections can overcome the problem. Therefore, in order to treat patients with certain types of diabetes, it is desirable to develop methods to increase insulin levels in the diabetic body.

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明によれば、新しい
ホメオボックス−タイプの転写因子蛋白質が提供され
る。本発明による蛋白質は膵臓島細胞から抽出され、イ
ンビボとインビトロの両方でのホルモン遺伝子の調節に
有益な役割を果たす。加えて、これらの蛋白質、あるい
はそれらの断片は、抗転写因子抗体をつくりだす免疫源
としても有益である。According to the present invention, a novel homeobox-type transcription factor protein is provided. The protein according to the invention is extracted from pancreatic islet cells and plays a beneficial role in the regulation of hormonal genes both in vivo and in vitro. In addition, these proteins, or their fragments, are also useful as immunogens to generate anti-transcription factor antibodies.

【００１０】上述の膵臓島転写因子蛋白質をコードする
分離された核酸分子、およびそうした分子を含んだ組換
え細胞も提供される。ここで述べた分子は当業者には公
知の種々の発現システムに組み込むことができる。加え
て、本発明による核酸分子は任意のサンプル内での膵臓
島転写因子遺伝子またはmＲＮＡトランスクリプトが存
在しているかどうか、そして、存在している場合の量に
関するアッセイのプローブとしても有用である。上に述
べた核酸分子、およびそれらの断片は、膵臓島転写因子
をコードする遺伝子の増強のためのＰＣＲ反応における
プライマーおよび／またはテンプレートとしても有用で
ある。Also provided are isolated nucleic acid molecules encoding the pancreatic islet transcription factor proteins described above, and recombinant cells containing such molecules. The molecules described herein can be incorporated into various expression systems known to those of skill in the art. In addition, the nucleic acid molecules according to the invention are also useful as probes in assays for the presence and, if present, the amount of pancreatic islet transcription factor gene or mRNA transcript in any sample. The nucleic acid molecules described above, and fragments thereof, are also useful as primers and / or templates in PCR reactions for the enhancement of genes encoding pancreatic islet transcription factors.

【００１１】本発明による膵臓島ホルモン転写因子蛋白
質と免疫反応性のある抗体も提供される。これらの抗体
は任意のサンプル、例えば組織サンプルやウェスターン
ブロットなどに存在する膵臓島転写因子蛋白質のレベル
を判定するための診断アッセイにおいて有用である。こ
れらの抗体は、膵臓島転写因子蛋白質を生成するために
も用いることができる。An antibody immunoreactive with the pancreatic islet hormone transcription factor protein according to the present invention is also provided. These antibodies are useful in diagnostic assays to determine levels of pancreatic islet transcription factor protein present in any sample, such as tissue samples and Western blots. These antibodies can also be used to produce pancreatic islet transcription factor protein.

【００１２】内分泌性膵臓ホルモン遺伝子を制御するプ
ロモータからの転写を調整するための方法も提供され
る。また、哺乳動物におけるインシュリンのレベルを調
節し、グルコースが存在している場合の哺乳動物におけ
る糖尿病を措置する方法も提供してくれる。Also provided are methods for regulating transcription from a promoter that controls the endocrine pancreatic hormone gene. It also provides a method of regulating insulin levels in a mammal to treat diabetes in the mammal when glucose is present.

【００１３】[0013]

【発明の実施の形態】本発明によれば、分離された哺乳
動物のホメオボックス−タイプの転写因子蛋白質が提供
される。“ホメオボックス−タイプの転写因子蛋白質”
あるいは“転写因子蛋白質”という表現は膵臓島ホルモ
ン遺伝子の天然のプロモータ領域に結合して、mＲＮＡ
転写を調節することができる蛋白質を意味している。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION According to the present invention, an isolated mammalian homeobox-type transcription factor protein is provided. "Homeobox-type transcription factor protein"
Alternatively, the expression "transcription factor protein" binds to the natural promoter region of the pancreatic islet hormone gene to express mRNA
It means a protein that can regulate transcription.

【００１４】本明細書および特許請求の範囲における、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、または蛋白質の形容詞
として“分離された”または“精製された”という用語
が使用されている場合、そのように限定されたＤＮＡ、
ＲＮＡ、ポリペプチド、または蛋白質が人の手によって
生産され、したがって、インビボ細胞環境におけるその
天然の状態からは分離されていることを意味している。
こうした人為的操作の結果として、本発明による組換え
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、および蛋白質は、天然
では発生しないＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、および
蛋白質の役割を果たすことができる。In the present specification and claims,
Where the term "isolated" or "purified" is used as an adjective for DNA, RNA, polypeptide, or protein, DNA so limited.
It means that the RNA, polypeptide, or protein is produced by the human hand and is therefore separated from its natural state in the in vivo cellular environment.
As a result of such human manipulation, the recombinant DNAs, RNAs, polypeptides and proteins according to the present invention can serve as non-naturally occurring DNAs, RNAs, polypeptides and proteins.

【００１５】ここで用いられている“哺乳動物の”とい
う用語は、例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、サ
ル、ヒヒ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ類、イヌ類、ネコ類
など、そこから本発明による転写因子蛋白質が抽出され
る種々の種を意味している。As used herein, the term "mammalian" refers to, for example, humans, rats, mice, rabbits, monkeys, baboons, chickens, pigs, sheep, dogs, cats, etc. Means the various species from which the transcription factor protein is extracted.

【００１６】ここで用いられている“ホメオボックス”
という用語は任意のプロモータ領域内の特定のヌクレオ
チド配列に結合する本発明による転写因子内部の約60〜
65のアミノ酸によって構成される領域を意味している。
ホメオボックス領域に関する一般的な検討については、
Gehring，W.，ＴＩＢＳ，17：277−280（August/1992）
参照。本発明によるホメオボックス領域は、好ましく
は、それそれＴＳＥ−ＩおよびＴＳＥ−ＩＩに対応した
ＳＥＱ ＩＤ NO：３およびNO：４に規定される“組織
特異性要素”のいずれか、あるいは両方に結合する。典
型的なホメオボックス領域は、ＳＥＱ ＩＤ NO：２の
アミノ酸146〜205と同じアミノ酸配列を有している。"Homeobox" used here
The term about 60 to 60 within the transcription factor according to the present invention binds to a specific nucleotide sequence within any promoter region.
It means a region composed of 65 amino acids.
For general considerations regarding the homeobox area,
Gehring, W., TIBS , 17: 277-280 (August / 1992)
reference. The homeobox region according to the present invention preferably binds to either or both of the "tissue specific elements" defined in SEQ ID NO: 3 and NO: 4 corresponding to TSE-I and TSE-II, respectively. To do. A typical homeobox region has the same amino acid sequence as amino acids 146-205 of SEQ ID NO: 2.

【００１７】ホメオボックス領域内に、“認識ヘリック
ス”と呼ばれるＤＮＡ−結合特性に関与するα−ヘリッ
クスが存在している。この認識ヘリックスは、通常、本
発明による蛋白質ホメオボックス領域のアミノ酸42〜52
で発生する（例えばＳＥＱＩＤ NO：２のアミノ酸187
〜197）。好ましい実施例においては、本発明による転
写因子蛋白質はホメオボックス領域のポシション44、例
えば、ＳＥＱ ＩＤNO：２のアミノ酸位置189にヒスチ
ジンアミノ酸残基を含んでいる。Within the homeobox region there is an α-helix involved in the DNA-binding properties called the "recognition helix". This recognition helix is usually located at amino acids 42-52 of the protein homeobox region according to the invention.
Occurs in (for example, amino acid 187 of SEQ ID NO: 2)
~ 197). In a preferred embodiment, the transcription factor protein according to the invention comprises a histidine amino acid residue at position 44 of the homeobox region, for example at amino acid position 189 of SEQ ID NO: 2.

【００１８】“プロモータに結合する”という表現、あ
るいはそれが文法的に変化した表現は、ＤＮＡ−結合転
写因子（例えば、クロリプレッサー、ラムダリプレッサ
ーなど）の核酸の特定の領域との、ＲＮＡ転写を調節す
るための結合を意味している〔例えば、Freifelder，
D.，分子生物学（Molecular Biology），188−194（第
２版、1987）参照〕。本発明による転写因子は少なくと
も、哺乳動物のインシュリンまたはソマトスタチン遺伝
子から選択されたプロモータ領域に結合する。典型的な
組織特異性要素としては、ラットインシュリン“Ｐ−ボ
ックス”（ＳＥＱＩＤ NO：８）（例えば、Ohlssonお
よびEdlund，1986， Cell，45：35−44、本明細書に引
例）に述べられているラットインシュリン遺伝子の−82
から−64のヌクレオチド位置）；ラットインシュリン−
１“ＦＬＡＴ”または“Ｅ２”応答要素（ＳＥＱ ＩＤ
NO：９）（例えば、上述のOhlssonおよびEdlundに述
べられているラットインシュリンの−222から−208ヌク
レオチド位置）；ＴＳＥ−Ｉ（ＳＥＱ ＩＤ NO：
３）；ＴＳＥ−ＩＩ（ＳＥＱ ＩＤ NO：４）などがあ
る。特に好ましい実施例においては、本発明による転写
因子は上に述べた応答要素のそれぞれを結合させる能力
を有している。The expression "binding to a promoter", or a grammatically altered expression thereof, refers to RNA transcription with a specific region of a nucleic acid of a DNA-binding transcription factor (eg, chloripressor, lambda repressor, etc.). Is meant to regulate binding [eg Freifelder,
D., Molecular Biology, 188-194 (2nd edition, 1987)]. The transcription factor according to the present invention binds at least to a promoter region selected from mammalian insulin or somatostatin genes. Exemplary tissue-specific elements are described in rat insulin "P-box" (SEQ ID NO: 8) (eg, Ohlsson and Edlund, 1986, Cell , 45: 35-44, cited herein). -82 of rat insulin gene
To -64 nucleotide positions); rat insulin-
1 "FLAT" or "E2" response element (SEQ ID
NO: 9) (eg, -222 to -208 nucleotide positions of rat insulin described in Ohlsson and Edlund, supra); TSE-I (SEQ ID NO:
3); TSE-II (SEQ ID NO: 4) and the like. In a particularly preferred embodiment, the transcription factor according to the invention has the ability to bind each of the above-mentioned response elements.

【００１９】“膵臓島ホルモン遺伝子”という表現は内
分泌性膵臓島細胞にとって内発性のホルモンをコードす
る遺伝子を示している。“膵臓島”とは、哺乳動物の内
分泌性膵臓（島細胞）から取り出した細胞のグループを
意味している。こうした細胞はペプチドホルモンのグル
アカゴン（膵臓Ａ−細胞）、インシュリン（膵臓Ｂ−細
胞）、ソマトスタチン（膵臓Ｄ−細胞）、および膵臓ポ
リペプチド（膵臓Ｆ−細胞）を合成し、分泌する。The expression "pancreatic islet hormone gene" refers to a gene encoding a hormone that is endogenous to endocrine pancreatic islet cells. By "pancreatic islet" is meant a group of cells removed from a mammalian endocrine pancreas (islet cells). These cells synthesize and secrete the peptide hormones gluacagon (pancreatic A-cell), insulin (pancreatic B-cell), somatostatin (pancreatic D-cell), and pancreatic polypeptide (pancreatic F-cell).

【００２０】本発明による転写因子は、膵臓島細胞にお
けるホルモン遺伝子発現を制御する複数のプロモータに
結合する能力（つまり、２つ以上のホルモン遺伝子プロ
モータに結合する能力）を有していることを特徴とす
る。好ましくは、本発明による転写因子は少なくともイ
ンシュリンおよびソマトスタチン遺伝子からのＲＮＡ転
写を調節する。本発明による転写因子はトランス活性
化、またはトランス抑制ＲＮＡ転写のいずれかで転写を
調節する。The transcription factor according to the present invention is characterized by having the ability to bind to a plurality of promoters that control the expression of hormone genes in pancreatic islet cells (ie, the ability to bind to two or more hormone gene promoters). And Preferably, the transcription factor according to the invention regulates RNA transcription from at least the insulin and somatostatin genes. Transcription factors according to the present invention regulate transcription by either trans-activating or trans-repressing RNA transcription.

【００２１】特殊な実施例においては、本発明による転
写因子はさらに膵臓ホルモン遺伝子をトランス活性化す
る能力、例えば、膵臓および小腸内部でのインシュリ
ン、グルカゴン、およびソマトスタチンの発現を活性化
する能力を有していることを特徴とする。“トランス活
性化”という表現、またはそれが文法的に変化した表現
は、それがホルモン遺伝子発現に関する場合、膵臓島ホ
ルモン遺伝子のプロモータ領域への結合とmＲＮＡ転写
開始における共同作業における本発明による転写因子の
作用を示している。In a special embodiment, the transcription factor according to the invention is additionally capable of transactivating the pancreatic hormone gene, for example activating the expression of insulin, glucagon and somatostatin inside the pancreas and small intestine. It is characterized by doing. The expression "transactivation", or its grammatically altered expression, when it relates to hormone gene expression, refers to the transcription factor according to the invention in the joint work of binding the pancreatic islet hormone gene to the promoter region and initiating mRNA transcription. Shows the action of.

【００２２】別の実施例で、本発明による転写因子は、
さらに、膵臓ホルモン遺伝子発現をトランス抑制する能
力、例えば、膵臓および小腸内部でのインシュリン、グ
ルカゴン、およびソマトスタチンの発現を抑制する能力
を有していることを特徴としている。“トランス抑制”
という表現、またはその文法的に変化した表現は、それ
がホルモン遺伝子発現に関する場合、膵臓島ホルモン遺
伝子のプロモータ領域への結合と、mＲＮＡ転写の開始
の抑止（つまり、プロモータからのＲＮＡ転写活性の除
去）における本発明による転写因子、またはそのポリペ
プチド断片の作用によるものである。In another embodiment, the transcription factor according to the present invention is
Furthermore, it is characterized by having the ability to trans-suppress pancreatic hormone gene expression, for example, the ability to suppress the expression of insulin, glucagon, and somatostatin in the pancreas and small intestine. "Transformer suppression"
Or its grammatically altered expression, when it relates to hormone gene expression, binds to the promoter region of the pancreatic islet hormone gene and inhibits initiation of mRNA transcription (ie removal of RNA transcription activity from the promoter). A) by the transcription factor according to the present invention, or a polypeptide fragment thereof.

【００２３】別の側面で、本発明による転写因子は、特
に小腸および膵臓における、インシュリンおよびソマト
スタチン転写の組織特異性レギュレータである。自然に
発生する本発明による蛋白質の発現は、それがインシュ
リンおよびソマトスタチンプロモータ上での機能的に重
要なcis要素での主要な結合活性を構成している膵臓お
よび小腸内部での内分泌細胞タイプに高度に限定されて
いる。本発明による蛋白質は、同じcis要素を通じてイ
ンビトロとインビボの両方で転写を刺激（つまり、トラ
ンス活性化）することが認められている。In another aspect, the transcription factors according to the invention are tissue-specific regulators of insulin and somatostatin transcription, especially in the small intestine and pancreas. The expression of the naturally-occurring protein according to the invention is highly dependent on the endocrine cell type within the pancreas and small intestine, which constitutes the major binding activity at the functionally important cis elements on the insulin and somatostatin promoters. Is limited to. The protein according to the invention has been found to stimulate (ie, transactivate) transcription both in vitro and in vivo through the same cis element.

【００２４】顕著な点は、本発明による転写因子はイン
シュリンおよびソマトスタチン生産膵臓島細胞からの核
酸抽出物における圧倒的なＴＳＥ結合活性の原因となっ
ており、この蛋白質がペプチドホルモン発現の調節と成
長中の腸組織内の内分泌性細胞の指定において重要な役
割を果たしているという仮説を裏づけるものである。Notably, the transcription factor according to the invention is responsible for the overwhelming TSE binding activity in nucleic acid extracts from insulin and somatostatin producing pancreatic islet cells, which protein regulates peptide hormone expression and growth. It supports the hypothesis that it plays an important role in the specification of endocrine cells within the intestinal tissue.

【００２５】ＣＲＥＢはＴu−６細胞におけるＣＲＥ結
合活性の主要な役割を果たしているので、インビボで観
察される協同性はＣＲＥＢと本発明による膵臓転写因子
との間の相互作用から生じているかもしれないと考えら
れている。ホルモン性刺激がない場合、ＣＲＥＢ活性は
cＡＭＰ調節ＰＫ−Ａ部位から発生するものではなく、
Ｑ２と呼ばれるグルタミンを豊富に含んだ領域から発生
しているように思われる。したがって、ＣＲＥＢは本発
明による細胞特異性転写因子と相乗作用してインシュリ
ンおよびソマトスタチン遺伝子などの膵臓ホルモン遺伝
子の高レベル発現を提供する役割を果たすホスホリル化
依存または構成的活性化領域を交互に採用することによ
っていくつかの機能を副次的に果たしているのかもしれ
ない。Since CREB plays a major role in CRE binding activity in Tu-6 cells, the cooperativity observed in vivo may result from the interaction between CREB and the pancreatic transcription factor according to the invention. It is believed that there is no. In the absence of hormonal stimulation, CREB activity is
It does not occur from the cAMP-regulated PK-A site,
It appears to originate from a glutamine-rich region called Q2. Thus, CREB alternately employs phosphorylation-dependent or constitutive activation regions that serve to synergize with cell-specific transcription factors according to the invention to provide high level expression of pancreatic hormone genes such as insulin and somatostatin genes. It may have some functions as a side effect.

【００２６】本発明のさらに別の実施例において、本発
明による転写因子は、内分泌性膵臓のＢ−細胞とＤ−細
胞では均一に発現されるのに外分泌性細胞では発現され
ないことを特徴としている。In yet another embodiment of the present invention, the transcription factor according to the present invention is characterized in that it is uniformly expressed in B-cells and D-cells of the endocrine pancreas but not in exocrine cells. .

【００２７】ここで用いられている“均一に発現され
る”という表現は本発明による転写因子をコードする自
然発生的なＲＮＡがインシュリンおよびソマトスタチン
をつくりだす膵臓島細胞タイプのそれぞれに検出するこ
とができることを意味している。好ましくは、発現のレ
ベルはこれらの膵臓島細胞タイプのそれぞれにおいて基
本的には均等である。As used herein, the expression "uniformly expressed" is detectable in each of the pancreatic islet cell types for which the naturally-occurring RNA encoding the transcription factor according to the invention produces insulin and somatostatin. Means Preferably, the level of expression is essentially equivalent in each of these pancreatic islet cell types.

【００２８】別の側面で、本発明による転写因子蛋白質
は、さらに、グルコース濃度の変動に反応を示すことを
特徴としている。ここで用いられている“グルコース濃
度の変動に反応を示す”という表現は、本発明による転
写因子の発現が存在しているグルコース濃度に対応して
変動することを意味している。例えば、本発明による蛋
白質をコードするmＲＮＡのレベルは、膵臓島細胞が20m
M程度のグルコースにおいて培養された場合、膵臓島細
胞が２mM程度のグルコース内部で培養する場合よりかな
り高い。[0028] In another aspect, the transcription factor protein according to the present invention is further characterized by being responsive to fluctuations in glucose concentration. The expression "responsive to changes in glucose concentration" as used herein means that expression of the transcription factor according to the present invention varies corresponding to the existing glucose concentration. For example, the level of mRNA encoding the protein according to the present invention is 20 mM in pancreatic islet cells.
When cultured in glucose at around M, the pancreatic islet cells are considerably higher than when cultured in glucose at around 2 mM.

【００２９】現在の段階で好ましい本発明による膵臓島
ホルモン転写因子蛋白質は、ＳＥＱＩＤ NO：２に示さ
れているアミノ酸配列と基本的に同じアミノ酸配列、お
よび、アクセス番号69385に基づいてＡＴＣＣに寄託さ
れたプラスミドpＩＴＦ−１転写因子コード発現部分に
よってコードされるアミノ酸配列と基本的に同じアミノ
酸配列、および生物学的な活性を有したその修飾された
形態である。当業者なら、結果としてもたらされるレセ
プター種の生物学的活性を変えずに、上に述べた配列の
多数の残基を他の、化学的、立体構造的および／または
電子的に同様の残基と取り替えることができることが分
かるであろう。The presently preferred pancreatic islet hormone transcription factor protein according to the present invention is deposited with the ATCC based on the amino acid sequence basically the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and accession number 69385. The plasmid pITF-1 transcription factor-encoding expression portion is basically the same amino acid sequence as the amino acid sequence, and its modified form having biological activity. One of ordinary skill in the art will appreciate that many residues in the sequences set forth above may be replaced by other, chemically, conformationally and / or electronically similar residues without altering the biological activity of the resulting receptor species. You will find that it can be replaced with

【００３０】大腸菌ＸＬ１−ブルー細胞（ストラタジー
ン）内で形質変換されたプラスミドpＩＴＦ−１は、本
条約によって布告された規制を目的とする微生物の寄託
の国際識別に関するブタペスト条約の条件に基づいて、
12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，U．S．
A．20852のAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣ
Ｃ）に、1993年８月12日に寄託された。寄託された素材
のサンプルは工業所有権事務局あるいは条約および規制
の諸条件、あるいは米国および他のすべての国、あるい
は本出願、または本出願の優先性を主張する出願が申請
されている、あるいは該出願に基づくいずれかの特許が
認められている国際的の特許法やその他の規制に基づい
てそれらを受けとる資格を持った個人に対して使用が認
められているし、将来においても使用が認められる。特
に、本出願に基づいた、あるいは本願に対する優先性を
主張する、あるいは参照によってそれを組み込んだすべ
ての出願に基づく米国特許が発行された場合、寄託され
た素材の利用可能性に関するすべての制限は撤廃され、
その制限解除は撤回されない。The plasmid pITF-1 transformed in E. coli XL1-Blue cells (Stratagene) is based on the conditions of the Budapest Treaty on the International Identification of Deposits of Microorganisms for the purposes of regulation promulgated by this Convention,
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U. S.
A. 20852 American Type Culture Collection (ATC
C), deposited on August 12, 1993. Samples of the deposited material have been filed for the Office of Industrial Property or the terms and conditions of treaties and regulations, or the United States and all other countries, or this application, or an application claiming priority to this application, or Use of any of the patents based on the application is permitted under the international patent law or other regulations, and the use is permitted for individuals who are eligible to receive them. To be In particular, if a U.S. patent is issued based on this application or any application claiming priority to, or incorporating by reference to, this application, all restrictions on the availability of deposited material are Abolished,
The restriction lift will not be withdrawn.

【００３１】ここで使われている“基本的に同じアミノ
酸配列”という表現は、基準となるアミノ酸配列に対し
て少なくとも70％程度の同一性を有しており、そして、
基準アミノ酸配列によって定義される蛋白質と同様の機
能的、および生物学的特性を保持しているアミノ酸配列
を示している。好ましくは、“基本的に同じアミノ酸配
列”を有している蛋白質は、基準アミノ酸配列に対して
少なくとも80％、より好ましくは90％のアミノ酸同一性
を有している。そして、95％以上のアミノ酸同一性を有
するものが最も好ましい。The expression "basically the same amino acid sequence" as used herein has at least about 70% identity with the reference amino acid sequence, and
It shows an amino acid sequence that retains the same functional and biological properties as the protein defined by the reference amino acid sequence. Preferably, proteins having "essentially the same amino acid sequence" have at least 80%, more preferably 90% amino acid identity to the reference amino acid sequence. And, those having 95% or more amino acid identity are most preferred.

【００３２】“生物学的な活性を有する”または“機能
的”という用語は、本明細書中で本発明による転写因子
蛋白質、またはそのポリペプチド断片の形容詞として用
いられた場合、ここで述べられているホメオボックス−
タイプの転写因子のいずれかと類似した機能的特性を示
すポリペプチドを意味している。例えば、ひとつの実施
例において、生物学的な活性を有する蛋白質はＴＳＥ−
Ｉ，ＴＳＥ−ＩＩ，“Ｐ−ＢＯＸ”，“ＦＬＡＴ”のい
ずれかと結合してそれらからのＲＮＡの転写を調節する
ものである。こうした活性は、ゲルシフトおよび実施例
５に述べるＤＮＡse Ｉ保護アッセイなど、当業者に公
知のいずれの方法によってでも評価することができる。The terms "biologically active" or "functional", when used herein as an adjective for a transcription factor protein according to the present invention, or a polypeptide fragment thereof, are mentioned herein. Homeo Box-
It is meant a polypeptide that exhibits similar functional properties to any of the types of transcription factors. For example, in one embodiment, the biologically active protein is TSE-
It binds to any of I, TSE-II, "P-BOX", and "FLAT" to regulate the transcription of RNA from them. Such activity can be assessed by any method known to those of skill in the art, such as gel shift and the DNAse I protection assay described in Example 5.

【００３３】本発明による転写因子蛋白質は、実施例１
〜３に述べられている方法、以下に述べる組換え発現シ
ステムなど、当業者に公知の種々の方法で分離すること
ができる。The transcription factor protein according to the present invention is obtained in Example 1.
It can be isolated by various methods known to those skilled in the art, such as the methods described in 1 to 3 and the recombinant expression system described below.

【００３４】本発明の別の実施例によれば、本発明によ
る転写因子蛋白質をコードする分離された核酸が提供さ
れる。ここに述べられている核酸分子は、こうした核酸
を当業者に公知の種々の蛋白質発現システムに組み込ん
だ場合、本発明による転写因子蛋白質をつくりだすのに
有益である。加えて、こうした核酸分子またはその断片
を簡単に検出可能な置換基とラベルすることができ、任
意のサンプルにおける膵臓ホルモン転写因子遺伝子また
はmＲＮＡ転写の存在および／またはその量の評価のた
めのハイブリダイゼーションプローブとして用いること
ができる。ここに述べられる核酸分子、およびその断片
は、ここで述べられている本発明による転写因子蛋白質
をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応におい
てプライマーおよび／またはテンプレートとしても有益
である。According to another embodiment of the present invention there is provided an isolated nucleic acid encoding a transcription factor protein according to the present invention. The nucleic acid molecules described herein are useful in producing transcription factor proteins according to the invention when such nucleic acids are incorporated into various protein expression systems known to those of skill in the art. In addition, such nucleic acid molecules or fragments thereof can be labeled with easily detectable substituents and hybridized to assess the presence and / or amount of pancreatic hormone transcription factor gene or mRNA transcript in any sample. It can be used as a probe. The nucleic acid molecules described herein, and fragments thereof, are also useful as primers and / or templates in PCR reactions to amplify the genes encoding transcription factor proteins according to the invention described herein.

【００３５】内分泌性転写因子をコードする典型的な核
酸は以下のものから選択することができる。 (a) ＳＥＱ ＩＤ NO：２に示されるアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ、または、アクセス番号69385に基づ
いてＡＴＣＣに寄託された、プラスミドpＩＴＦ−１の
転写因子コード部分、(b) やや厳格な条件下で(ａ)の
ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであって、該ＤＮＡ
が生物学的な活性を有する内分泌性転写因子をコードす
るＤＮＡ、(c) (ａ)か(ｂ)のＤＮＡの縮重したもの、
該ＤＮＡが生物学的な活性を有する内分泌性ホルモン転
写因子をコードするＤＮＡ。A typical nucleic acid encoding an endocrine transcription factor can be selected from the following: (a) DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or the transcription factor coding portion of plasmid pITF-1 deposited at the ATCC based on accession number 69385, (b) under rather strict conditions Which is a DNA that hybridizes with the DNA of (a),
Is a DNA encoding an endocrine transcription factor having biological activity, (c) a degenerate version of the DNA of (a) or (b),
A DNA which encodes an endocrine hormone transcription factor having a biological activity.

【００３６】ここで使われている“核酸”という用語
は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）を意味している。ＤＮＡは相補ＤＮＡ（cＤＮＡ）
であっても、内分泌性転写因子を発現する遺伝子など、
ゲノム性ＤＮＡであっても、いずれでもよい。The term "nucleic acid" as used herein refers to ribonucleic acid (RNA) or deoxyribonucleic acid (DN).
It means A). DNA is complementary DNA (cDNA)
Even a gene expressing an endocrine transcription factor,
It may be genomic DNA or any of them.

【００３７】ハイブリダイゼーションとは、染色体ＤＮ
Ａにおいて自然に発生する結合と類似した水素結合を通
じて核酸の相補ストランド（つまり、センス：アンチセ
ンスストランド、またはプローブ：標的−ＤＮＡ）が相
互に結合することを意味している。任意のプローブを標
的−ＤＮＡとハイブリダイズさせるのに用いられる厳し
さのレベルは当業者なら容易に変更できるであろう。Hybridization means chromosome DN
It means that complementary strands of nucleic acid (ie, sense: antisense strands, or probe: target-DNA) bind to each other through hydrogen bonds similar to the naturally occurring bonds in A. The level of stringency used to hybridize any probe to the target-DNA will be readily modified by one of ordinary skill in the art.

【００３８】“厳格なハイブリダイゼーション”という
用語は、ここでは、ポリ核酸ハイブリッドが安定的に存
在できる状態を意味している。当業者にはよく知られて
いるように、ハイブリッドの選択性はそのハイブリッド
の溶解温度（Ｔ_ｍ）に関連している。一般的に、ハイブ
リッドの安定性はナトリウムイオン濃度および温度の関
数である。通常、ハイブリダイゼーション反応は厳格さ
がより低い条件下で行われ、その後厳格さを変えて、よ
り高い厳格さで洗浄する。ハイブリダイゼーションの厳
格さとは、その洗浄条件に関連している。The term "strict hybridization" refers herein to the condition in which a polynucleic acid hybrid can stably exist. As is well known to those skilled in the art, the selectivity of a hybrid is related to the hybrid's melting temperature ( _Tm ). Hybrid stability is generally a function of sodium ion concentration and temperature. Hybridization reactions are usually performed under less stringent conditions, then varying in stringency and washing with higher stringency. The stringency of hybridization is related to the wash conditions.

【００３９】ここで用いられている“やや厳格なハイブ
リダイゼーション”とは、標的−ＤＮＡが、その標的−
ＤＮＡに対して60％程度、好ましくは75％程度、そして
より好ましくは85％程度、そして最も好ましくは90％以
上の相同性を有する相補核酸に結合できるようにする状
態を意味している。好ましくは、やや厳格な条件とは50
％ホルムアミド、５Ｘデンハート溶液、５Ｘ ＳＳＰ
Ｅ，0.2％ＳＤＳ内で42℃の温度下でハイブリダイゼー
ションを行い、その後、65℃の温度下で0.2ＸＳＳＰ
Ｅ，0.2％ＳＤＳで洗浄する場合と同等の条件である。As used herein, "slightly stringent hybridization" means that target-DNA is the target-
It means a state capable of binding to a complementary nucleic acid having a homology of about 60%, preferably about 75%, more preferably about 85%, and most preferably 90% or more with DNA. Preferably, a moderately stringent condition is 50
% Formamide, 5X Denhardt's solution, 5X SSP
E, Hybridization was performed in 0.2% SDS at a temperature of 42 ° C, and then 0.2X SSP was performed at a temperature of 65 ° C.
E, the same conditions as when washed with 0.2% SDS.

【００４０】“高厳格なハイブリダイゼーション”と
は、その核酸配列が65℃で0.018ＭＮａＣｌで安定にハ
イブリッドする許容条件である（即ち、もしハイブリッ
ドが65℃で0.018Ｍ ＮａＣｌで不安定であれば、ここ
でいう、高厳格な条件下で安定ではない）。高厳格な条
件は例えば、42℃で50％ホルムアミド、５Ｘデンハート
溶液、５Ｘ ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤＳ内でハイブリダイ
ゼーションし、後65℃で0.1Ｘ ＳＳＰＥおよび0.1％Ｓ
ＤＳ洗浄する条件である。"High stringency hybridization" is the permissive condition for a nucleic acid sequence to hybridize stably at 0.018M NaCl at 65 ° C (ie, if the hybrid is unstable at 0.018M NaCl at 65 ° C, then: Here, it is not stable under high stringency conditions). High stringency conditions are, for example, hybridization at 42 ° C in 50% formamide, 5X Denhardt's solution, 5X SSPE, 0.2% SDS, followed by 0.1X SSPE and 0.1% S at 65 ° C.
The conditions for DS cleaning.

【００４１】“低厳格度ハイブリダイゼーション”とい
う表現は、10％ホルムアミド、５Ｘデンハート溶液、６
Ｘ ＳＳＰＥ，0.2％ＳＤＳ内で42℃の温度下でハイブ
リダイゼーションを行い、その後、１Ｘ ＳＳＰＥ，0.
2％ＳＤＳ内で50℃の温度下で洗浄を行う場合と同様の
条件を意味する。デンハート溶液およびＳＳＰＥ（Samb
rookら、分子クローニング、実験マニュアル（Molecula
r Cloning，A Laboratory Manual），Cold Spring Harb
or Laboratory Press，1989）は、他の適切なハイブリ
ダイゼーション緩衝液と同様、当業者にはよく知られて
いる。The expression "low stringency hybridization" refers to 10% formamide, 5X Denhardt's solution, 6%.
Hybridization was performed in X SSPE, 0.2% SDS at a temperature of 42 ° C., followed by 1 × SSPE, 0.2.
This means the same conditions as when washing is performed at a temperature of 50 ° C. in 2% SDS. Denhardt's solution and SSPE (Samb
rook et al., Molecular Cloning, Experimental Manual (Molecula
r Cloning, A Laboratory Manual), Cold Spring Harb
or Laboratory Press, 1989), as well as other suitable hybridization buffers, are well known to those of skill in the art.

【００４２】ここで用いられている“縮重したもの”と
は、少なくともひとつのヌクレオチドが基準核酸、例え
ばＳＥＱ ＩＤ NO：１と違っているが、基準アミノ酸
と同じアミノ酸をコードするコドンを意味している。例
えば、“ＵＣＵ”，“ＵＣＣ”，“ＵＣＡ”および“Ｕ
ＣＧ”などの３文字で示されるコドンは、これら４つの
コドンがすべてアミノ酸セリンをコードするので、縮重
体である。As used herein, "degenerate" means a codon that differs in at least one nucleotide from a reference nucleic acid, eg, SEQ ID NO: 1, but encodes the same amino acid as the reference amino acid. ing. For example, "UCU", "UCC", "UCA" and "U"
The three letter codons such as CG "are degenerate as these four codons all encode the amino acid serine.

【００４３】好ましい実施例においては、ここで開示さ
れている内分泌性ホルモン低蛋白質をコードするcＤＮ
Ａは、ＳＥＱ ＩＤ NO：１のヌクレオチド331−118
2、あるいはアクセス番号69385に基づいてＡＴＣＣに寄
託されたプラスミドpＩＴＦ−１の転写因子コード部分
と基本的に同じヌクレオチド配列を有している。内分泌
性ホルモン転写因子蛋白質をコードする現在の段階で最
も好ましいcＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ NO：１のヌクレ
オチド331−1182、またはアクセス番号69385に基づいて
ＡＴＣＣに寄託されたプラスミドpＩＴＦ−１の転写因
子コード部分と同じヌクレオチド配列を有している。In a preferred embodiment, a cDNA encoding the endocrine hormone low protein disclosed herein.
A is nucleotides 331-118 of SEQ ID NO: 1
2, or has basically the same nucleotide sequence as the transcription factor coding portion of the plasmid pITF-1 deposited with the ATCC under accession number 69385. The most preferred cDNA at this stage which encodes an endocrine hormone transcription factor protein is nucleotide 331-1182 of SEQ ID NO: 1, or the transcription factor coding portion of plasmid pITF-1 deposited with the ATCC under accession number 69385. It has the same nucleotide sequence as.

【００４４】ここで用いられている“基本的に同じヌク
レオチド配列”という用語は、基準ポリヌクレオチドに
対して十分な相同性を有しており、やや厳格なハイブリ
ダイゼーション条件に基づいてハイブリダイズするＤＮ
Ａを意味している。ひとつの実施例において、基準とな
るヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列は、ＳＥＱ
ＩＤ NO：２に指定されているのと基本的に同じアミ
ノ酸配列をコードする。別の実施例で、基準ヌクレオチ
ド配列と“基本的に同じヌクレオチド配列”を有してい
るＤＮＡは、基準となるヌクレオチド配列に対して少な
くとも60％の相同性を有している。基準ヌクレオチド配
列に対して少なくとも70％、好ましくは90％、そして、
より好ましくは95％以上の相同性を有するＤＮＡが好ま
しい。As used herein, the term "essentially the same nucleotide sequence" has sufficient homology to the reference polynucleotide and is a DN that hybridizes under moderately stringent hybridization conditions.
It means A. In one embodiment, the same nucleotide sequence as the reference nucleotide sequence
It encodes basically the same amino acid sequence as specified in ID NO: 2. In another embodiment, a DNA having a "basically identical nucleotide sequence" to a reference nucleotide sequence has at least 60% homology to the reference nucleotide sequence. At least 70%, preferably 90%, relative to the reference nucleotide sequence, and
DNA having a homology of 95% or more is more preferable.

【００４５】本発明による核酸は、例えば、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ NO：１などの種々の領域からのオリゴヌクレオチド
プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行う実施例１および２
に述べられている方法など、先行技術において公知の種
々の方法によってつくることができる。The nucleic acid according to the present invention is, for example, SEQ I
Examples 1 and 2 in which PCR amplification is performed using oligonucleotide primers from various regions such as D NO: 1.
Can be prepared by various methods known in the prior art, such as the method described in 1.

【００４６】本発明のさらに別の実施例によれば、任意
にラベルされた転写因子コードcＤＮＡあるいはその断
片を用いて新しい哺乳動物の膵臓島ホルモン転写因子を
コードするさらに別の核酸配列のライブラリー（例え
ば、cＤＮＡ、ゲノム性など）をプローブすることがで
きる。実施例１および２に述べられているように、哺乳
動物の膵臓島cＤＮＡライブラリー、好ましくはヒトの
膵臓島cＤＮＡライブラリーの構造は先行技術において
公知である。こうしたcＤＮＡライブラリーのスクリー
ニングは、当初、約42℃以下の温度、約50％以下のホル
ムアミド濃度、そして、低塩分濃度を内容とする厳格さ
の低い条件で行われる。In accordance with yet another embodiment of the present invention, a library of additional nucleic acid sequences encoding a novel mammalian pancreatic islet hormone transcription factor using an optionally labeled transcription factor-encoding cDNA or fragment thereof. (Eg, cDNA, genomic, etc.) can be probed. As described in Examples 1 and 2, the construction of a mammalian pancreatic islet cDNA library, preferably a human pancreatic islet cDNA library, is known in the prior art. The screening of such a cDNA library is initially carried out under conditions of low stringency, including a temperature of about 42 ° C. or lower, a formamide concentration of about 50% or lower, and a low salt concentration.

【００４７】現在の段階で好ましいプローブに基づいた
スクリーニング条件は約37℃の温度、約20％のホルムア
ミド濃度、そして５Ｘ標準くえん酸食塩水（ＳＳＣ：20
ＸＳＳＣは３Ｍ塩化ナトリウム、0.3Ｍくえん酸ナトリ
ウム、pH7.0を含んでいる）を内容としている。こうし
た条件は、完全な相同性がなくても、プローブ配列とか
なりの程度の類似性を有する配列を確認できるようにし
てくれる。“かなりの類似性”という表現は少なくとも
50％の相同性を有している配列を意味している。好まし
くは、プローブと少なくとも70％の相同性を有する配列
が可能となり、プローブとより低い相同性を有する配列
を区別できるようにするハイブリダイゼーション条件が
指定される。その結果、ＳＥＱ ＩＤ NO：１のヌクレ
オチド331−1182と基本的には同じヌクレオチド配列が
得られる。Presently preferred probe-based screening conditions are a temperature of about 37 ° C., a formamide concentration of about 20%, and 5 × standard citrate saline (SSC: 20).
XSSC contains 3M sodium chloride, 0.3M sodium citrate, pH 7.0). These conditions allow the identification of sequences that have a significant degree of similarity to the probe sequence, even without complete homology. The expression "significant similarity" is at least
It means a sequence with 50% homology. Preferably, hybridization conditions are specified that allow sequences having at least 70% homology with the probe and allow the sequences having lower homology with the probe to be distinguished. As a result, a nucleotide sequence basically the same as nucleotides 331-1182 of SEQ ID NO: 1 is obtained.

【００４８】ここで用いられている核酸“プローブ”と
は一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはその断片で、Ｓ
ＥＱ ＩＤ NO：１のいずれか、好ましくはヌクレオチ
ド331−1182に示されているいずれか14またはそれ以上
と同じ（あるいはそれと相補的な）少なくとも14、好ま
しくは20、より好ましくは50の継続的な塩基を含んだヌ
クレオチドの配列を有している。それからプローブを構
成する好ましい領域はＳＥＱ ＩＤ NO：１の５′およ
び／または３′コーディング領域を含んでいる。さら
に、本発明の転写因子蛋白質のcＤＮＡコード領域全体
をプローブとして用いることもできる。プローブは、以
下に述べるような先行技術において公知の方法でラベル
することができ、種々の診断キットで用いることができ
る。As used herein, nucleic acid "probe" is single-stranded DNA or RNA, or fragments thereof, S
EQ ID NO: 1, preferably at least 14, preferably 20, and more preferably 50 consecutive with the same (or complementary) to any 14 or more shown in nucleotides 331-1182. It has a nucleotide sequence containing bases. A preferred region from which to construct the probe then comprises the 5'and / or 3'coding regions of SEQ ID NO: 1. Furthermore, the entire cDNA coding region of the transcription factor protein of the present invention can be used as a probe. The probe can be labeled by a method known in the prior art as described below and used in various diagnostic kits.

【００４９】ここで述べられている、種々の文法的形態
における“ラベル”または“表示手段”とは、検出可能
な信号をつくりだすのに直接または間接的に関与する単
一の原子または分子を示している。いずれのラベルまた
は表示手段も本発明の核酸プローブ、発現された蛋白
質、ポリペプチド断片、あるいは抗体分子に結合させる
ことができる。これらの原子または分子は単独でも、ま
たは別の試薬との組み合わせでも用いることができる。
こうしたラベルは臨床診断化学において良く知られてい
る。As used herein, the term "label" or "indicator" in its various grammatical forms refers to a single atom or molecule that is directly or indirectly involved in producing a detectable signal. ing. Any label or display means can be attached to the nucleic acid probe, expressed protein, polypeptide fragment or antibody molecule of the present invention. These atoms or molecules can be used alone or in combination with another reagent.
Such labels are well known in clinical diagnostic chemistry.

【００５０】このラベル手段は変性しないで抗体または
抗原と化学的に結合して有益な免疫蛍光トレーサである
フルオロクローム（染料）を形成する蛍光ラベリング試
薬などであってよい。適切な蛍光ラベリング試薬は、フ
ルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセイ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミ
ン−１−ナフタレンスルホニルクロライド（ＤＡＮＳ
Ｃ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（Ｔ
ＲＩＴＣ）、リスアミン、ローダミン8200スルホニルク
ロライド（ＲＢ−200−ＳＣ）などである。免疫蛍光分
析法の説明は、DeLuca，免疫蛍光分析（Immunofluoresc
ence Analysis），道具として抗体（Antibody As a Too
l）内，Marchalonisら、eds.，John Wiley& Sons，Lt
d.，pp.189−231（1982）に開示されている。この資料
は本明細書に引例として組み込まれいている。The labeling means may be, for example, a fluorescent labeling reagent that does not denature and chemically binds to the antibody or antigen to form the beneficial immunofluorescent tracer fluorochrome (dye). Suitable fluorescent labeling reagents include fluorescein isocyanate (FIC), fluorescein isothiocyanate (FITC), 5-dimethylamine-1-naphthalene sulfonyl chloride (DANS).
C), tetramethylrhodamine isothiocyanate (T
RITC), lithamine, rhodamine 8200 sulfonyl chloride (RB-200-SC) and the like. For a description of immunofluorescence analysis, see DeLuca, Immunofluorescence Analysis (Immunofluoresc
ence analysis), antibody as a tool (Antibody As a Too)
l), Marchalonis et al., eds., John Wiley & Sons, Lt
d., pp.189-231 (1982). This document is incorporated herein by reference.

【００５１】ひとつの実施形態では、その指示グループ
はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グ
ルコースオキシダーゼなどの酵素である。主要指示グル
ープが酵素である場合、目に見える信号をつくりだすた
めに別の試薬が必要となる。ＨＲＰのためのそうした追
加試薬としては過酸化水素、ジアミノベンジジンなどの
酸化染料前駆体などである。グルコースオキシダーゼを
用いて有用な追加試薬は２，２’−アジノ−ジ−（３−
エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴ
Ｓ）である。In one embodiment, the indicator group is an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), glucose oxidase. If the main indicator group is an enzyme, then another reagent is needed to produce a visible signal. Such additional reagents for HRP include hydrogen peroxide, oxidative dye precursors such as diaminobenzidine, and the like. An additional reagent useful with glucose oxidase is 2,2'-azino-di- (3-
Ethyl-benzthiazoline-G-sulfonic acid) (ABT
S).

【００５２】別の実施形態では、放射性元素がラベリン
グ用試薬として用いられる。典型的な放射ラベル用試薬
はガンマ線放射を発生する放射性元素である。¹²⁴Ｉ，
¹²⁵Ｉ，¹²⁶Ｉ，¹³¹Ｉおよび⁵¹rなどガンマ線を放出する
元素は、ひとつのタイプの放射性元素指示グループを代
表するものである。特に好ましいのは¹²⁵Ｉである。別
のグループの有用なラベルする手段は陽電子を放出する
¹¹Ｃ，¹⁸Ｆ，¹⁵Ｏおよび¹³Ｎなどの元素である。このよ
うに放出された陽電子は動物体内に存在する電子と衝突
するとガンマ線を発生する。³²Ｐ，¹¹¹インジウムまた
は³Ｈなどのデータ線放出元素も有用である。In another embodiment, radioactive elements are used as labeling reagents. A typical radiolabeling reagent is a radioactive element that produces gamma radiation. ¹²⁴ I,
Elements that emit gamma rays, such as ¹²⁵ I, ¹²⁶ I, ¹³¹ I and ⁵¹ r, represent one type of radioactive element indicating group. Especially preferred is ¹²⁵ I. Another group of useful labeling means emits positrons
Elements such as ¹¹ C, ¹⁸ F, ¹⁵ O and ¹³ N. The positrons thus emitted generate gamma rays when they collide with the electrons existing in the animal body. Data line emitting elements such as ³² P, ¹¹¹ indium or ³ H are also useful.

【００５３】核酸、抗体、ポリペプチド、および蛋白質
のラベリングなど、基質へのラベルの結合は先行技術に
おいて良く知られている。例えば、本発明による抗体は
培養媒体で提供される放射ラベルされたアミノ酸の代謝
による取り込みによってラベルすることができる。例え
ば、Galfreら、Meth．Enzymol.，73：３−46（1981）参
照。活性化された機能基による蛋白質接合、あるいは結
合の従来の手段は特に利用性が高い。例えば、Aurameas
ら、Scand．J．Immunol.，Vol．８，Suppl．７：７−23
（1978），Rodwellら、Biotech.，３：889−894（198
4）、および米国特許第4,493,795号参照。Binding of labels to substrates, such as labeling of nucleic acids, antibodies, polypeptides and proteins, is well known in the art. For example, the antibody according to the invention may be labeled by the metabolic uptake of radiolabeled amino acids provided in the culture medium. For example, Galfre et al . , Meth. See Enzymol ., 73: 3-46 (1981). Conventional means of protein conjugation or conjugation with activated functional groups are particularly useful. For example, Aurameas
Et al . , Scand. J. Immunol ., Vol. 8, Suppl. 7: 7-23
(1978), Rodwell et al., Biotech ., 3: 889-894 (198).
4), and U.S. Pat. No. 4,493,795.

【００５４】本発明のさらに別の実施形態においては、
適切な宿主細胞内に上に述べた核酸配列を発現させるこ
とによって本発明による転写因子を遺伝子組換えでつく
るための方法が提供される。ここで述べられている膵臓
転写因子をつくりだすのに適した組換えＤＮＡ発現シス
テムは先行技術において良く知られている。例えば、上
に述べたヌクレオチド配列をさらに操作するためにベク
ターに組み込むことができる。ここに用いられているベ
クター（またはプラスミド）という用語は、その発現ま
たは複製を目的としてヘテロロガスＤＮＡを細胞に導入
するために用いられる個々の要素を意味している。In yet another embodiment of the present invention,
Methods are provided for recombinantly producing transcription factors according to the present invention by expressing the nucleic acid sequences described above in a suitable host cell. Suitable recombinant DNA expression systems for producing the pancreatic transcription factors described herein are well known in the prior art. For example, the nucleotide sequences described above can be incorporated into a vector for further manipulation. The term vector (or plasmid) as used herein refers to the individual elements used to introduce heterologous DNA into a cell for the purpose of its expression or replication.

【００５５】適切な発現ベクターには、そうしたＤＮＡ
の発現を規制することができるプロモータ領域など、調
節配列に操作的に結合されるＤＮＡを発現することがで
きるベクターなどがある。したがって、発現ベクターと
は、プラスミド、ファージ、組換え体ウィルス、あるい
はその他の、適切な宿主細胞に導入すると挿入されたＤ
ＮＡの発現をもたらすベクターなど、組換え体ＤＮＡま
たはＲＮＡ構成を示している。適切な発現ベクターは当
業者にはよく知られており、真核細胞そして／または原
核細胞内で複製することができるもの、そしてエピゾー
ム性のままでいるもの、そして宿主細胞のゲノムに組み
込まれるなどを含む。Suitable expression vectors include such DNA
And a vector capable of expressing a DNA operably linked to a regulatory sequence such as a promoter region capable of regulating the expression of Escherichia coli. Therefore, an expression vector is a plasmid, phage, recombinant virus, or other D that has been inserted when introduced into an appropriate host cell.
The recombinant DNA or RNA constructs are shown, such as the vectors that result in the expression of NA. Appropriate expression vectors are well known to those of skill in the art and are capable of replicating in eukaryotic and / or prokaryotic cells and remain episomal and integrate into the genome of the host cell, etc. including.

【００５６】ここで用いられているプロモータ領域とい
う用語はそれが操作によって結合されるＤＮＡの転写を
制御するＤＮＡのセグメントを意味している。プロモー
タ領域としては、ポリメラーゼ認識、結合、および転写
を開始させるのに十分な特定の配列を含んでいる。さら
に、プロモータ領域には、ＲＮＡポリメラーゼの認識、
結合、および転写の開始を調節する配列を含んでいる。
これらの配列はcisアクティングであってもよいし、ト
ランスアクティング因子に反応性のあるものでもよい。
プロモータは、調節に応じて、構成的である場合もあ
り、また、規制的であってもよい。本発明の実施での使
用が考えられる典型的なプロモータには、ＳＶ40アーリ
ープロモータ、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモ
ータ、マウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）ステロイド
誘発性プロモータ、モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍ
ＭＬＶ）プロモータなどを含んでいる。As used herein, the term promoter region refers to the segment of DNA that controls the transcription of DNA to which it is operatively linked. The promoter region contains specific sequences that are sufficient to initiate polymerase recognition, binding, and transcription. Furthermore, in the promoter region, recognition of RNA polymerase,
It contains sequences that regulate binding and initiation of transcription.
These sequences may be cis acting or may be responsive to transacting factors.
The promoter may be constitutive or regulated, depending on the regulation. Typical promoters contemplated for use in the practice of the present invention include SV40 early promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, mouse mammary tumor virus (MMTV) steroid-induced promoter, Moloney murine leukemia virus (MV).
MLV) promoter etc. are included.

【００５７】ここで用いられている“操作的に結合され
る”という用語は、ＤＮＡとプロモータ、エンハンサ、
転写または翻訳停止サイト、および他の信号配列など、
調節およびエフェクタヌクレオチド配列との機能的な関
係を示している。例えば、ＤＮＡのプロモータへの操作
的結合とは、ＤＮＡとプロモータとの間の、そのＤＮＡ
の転写が、特にそのＤＮＡを識別し、そのＤＮＡに結合
し、そしてそれを転写するＲＮＡポリメラーゼによっ
て、そのプロモータから開始されるような物理的、機能
的関係を意味している。発現、そして／またはインビト
ロでの転写を最適化するためには、余分な、不適切な別
の翻訳の開始（スタート）コドン、あるいは転写または
翻訳のレベルのいずれかで発現に干渉したり、あるいは
それを低下させてしまう他の配列を除去するために、そ
れらクローンの５’未翻訳部分を取り除いたり、加えた
り、あるいは変更したりすることが必要な場合もある。
また、コンセンサスリボゾーム結合部位〔例えば、Koza
k（1991）J．Biol．Chem．266：19867−19870参照〕を
５′のスタートコドンに直接挿入することもできるし、
発現を増幅してもよい。こうした修正が望ましいこと
（あるいはその必要性）は経験的に判断できる。The term "operably linked" as used herein refers to DNA and promoters, enhancers,
Transcription or translation stop sites, and other signal sequences,
Figure 6 shows a functional relationship with regulatory and effector nucleotide sequences. For example, operably linked DNA to a promoter means that the DNA between the DNA and the promoter is
Transcription of the DNA specifically means a physical-functional relationship such that it is initiated from its promoter by an RNA polymerase that recognizes that DNA, binds to that DNA, and transcribes it. To optimize expression and / or transcription in vitro, either interfere with expression at an extra, inappropriate, alternative start codon for translation, or at the level of transcription or translation, or It may be necessary to remove, add, or alter the 5'untranslated portion of those clones to remove other sequences that reduce it.
Also, consensus ribosome binding sites [eg Koza
k (1991) J. Biol. Chem . 266: 19867-19870] can be directly inserted into the 5'start codon.
Expression may be amplified. It can be empirically determined that such a modification is desirable (or necessary).

【００５８】ここで用いられている発現という用語は、
ポリ核酸がmＲＮＡに転写されて、ペプチド、ポリペプ
チド、または蛋白質に翻訳されるプロセスを意味してい
る。ポリ核酸がゲノム性ＤＮＡから取り出される場合、
その発現には、適切な真核宿主細胞または生物が選ばれ
た場合、mＲＮＡのスプライシングが含まれる。The term expression as used herein refers to
It refers to the process by which a polynucleic acid is transcribed into mRNA and translated into a peptide, polypeptide, or protein. When the polynucleic acid is removed from the genomic DNA,
Its expression includes the splicing of mRNA, if an appropriate eukaryotic host cell or organism is chosen.

【００５９】原核形質転換ベクターは先行技術において
よく知られており、ｐブルースクリプト、およびファー
ジ／ラムダＺＡＰベクター（Stratagene，La Jolla，C
A）などを含んでいる。他の適切なベクターおよびプロ
モータは、1989年１月17日の米国特許第4,798,885号に
詳しく開示されており、その開示全体は本明細書に引例
として組み込まれる。さらに、lac ｚ遺伝子（オペレー
タ、プロモータ、転写スタート部位、シャイン−デリガ
ーノ配列、および翻訳開始信号を含む）の５′領域、ト
リプトファン遺伝子（trpオペレータ、プロモータ、リ
ボゾーム結合部位および翻訳イニシエータ）からの調節
領域、そして、tap−lacまたは一般的にＴacプロモータ
と呼ばれる２つのプロモータを含んでいる融合遺伝子な
どの配列を含む発現カセットを用いて、それらの配列に
それらカセットが選ばれたクローニングベクターに挿入
される前に、合成ＤＮＡを挿入しても差し支えない。Prokaryotic transformation vectors are well known in the prior art and include pBluescript and the phage / lambda ZAP vector (Stratagene, La Jolla, C.
A) etc. are included. Other suitable vectors and promoters are fully disclosed in US Pat. No. 4,798,885, Jan. 17, 1989, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. In addition, the 5'region of the lacz gene (including the operator, promoter, transcription start site, Shine-Derigano sequence, and translation initiation signal), the regulatory region from the tryptophan gene (trp operator, promoter, ribosome binding site and translation initiator). , And using an expression cassette containing sequences such as a fusion gene containing two promoters, commonly referred to as the tap-lac or Tac promoters, these sequences are inserted into the selected cloning vector. It does not matter if the synthetic DNA is inserted before.

【００６０】大腸菌細胞を形質転換させるための他の適
切なベクターには、ｐＥＴ発現ベクター（Novagen，米
国特許第4,952,496号参照）、例えば、Ｔ７プロモー
タ、Ｔ７ターミネータ、および大腸菌ompＴ分泌信号な
どを含むpＥＴ12ａ−ｃを含む。別の適切なベクター
は、lppプロモータ、lacＵＶ５プロモータオペレータ、
ompＡ分泌信号、およびlacレセプター遺伝子を含むpＩ
Ｎ−ＩＩＩopmＡ２（Duffaudら、Meth．in Enzymolog
y，153：492−507，1987）である。好ましい発現ベクタ
ーは実施例３に述べるＰＧＥＸ−２Ｔベクター（Pharma
cia）である。Other suitable vectors for transforming E. coli cells include pET expression vectors (Novagen, see US Pat. No. 4,952,496), such as pET12a containing the T7 promoter, T7 terminator, and E. coli ompT secretion signal. -C is included. Another suitable vector is the lpp promoter, the lacUV5 promoter operator,
pI containing ompA secretion signal and lac receptor gene
N-IIIopmA2 (Duffaud et al., Meth. In Enzymolog
y , 153: 492-507, 1987). A preferred expression vector is the PGEX-2T vector (Pharma
cia).

【００６１】典型的な真核形質転換ベクターには、クロ
ーンされた仔ウシパピローマウィルスゲノム、マウスレ
トロウィルスのクローンされたゲノム、および〔Mullig
anおよびBerg，Nature Vol.277：108−114（1979）〕に
述べられているpＳＶ−２ gptシステム、オカヤマ−ベ
ルグクローニングシステム〔Mol．Cell．Biol．Vol.
２：161−170（1982）〕、およびGeneticsInstitute〔S
cience Vol．228：810−815（1985）〕に述べられてい
る発現クローニングベクターなどが含まれており、形質
転換された真核細胞系において関心の対象となる蛋白質
を少なくとも一定程度確実に発現してくれる。Typical eukaryotic transformation vectors include the cloned calf papillomavirus genome, the mouse retrovirus cloned genome, and [Mullig
an and Berg, Nature Vol. 277: 108-114 (1979)], pSV-2 gpt system, Okayama-Berg cloning system [ Mol. Cell. Biol . Vol.
2: 161-170 (1982)], and Genetics Institute [ S
cience Vol. 228: 810-815 (1985)], and it reliably expresses the protein of interest in a transformed eukaryotic cell line to at least a certain extent.

【００６２】哺乳動物の細胞のトランスフェクションの
ために本発明による転写因子コードＤＮＡに結合するこ
とができる調節要素を含んでいる特に好ましいベースベ
クターはpcＤＮＡ１などのサイトメガロウィルス（ＣＭ
Ｖ）プロモータに基づくベクター（Invitrogen，San Di
ego，CA），pＭＡＭＮeo（Clontech，Palo Alto，C
A）、pＭＳＧ（Pharmacia，Piscataway，NJ）などのＭ
ＭＴＶプロモータに基づくベクター、およびpＳＶβ（C
lontech，Palo Alto，CA）などのＳＶ40プロモータに基
づくベクターである。A particularly preferred base vector containing regulatory elements capable of binding the transcription factor-encoding DNA according to the invention for transfection of mammalian cells is a cytomegalovirus (CM) such as pcDNA1.
V) Promoter-based vector (Invitrogen, San Di
ego, CA), pMAMNeo (Clontech, Palo Alto, C
A), pMSG (Pharmacia, Piscataway, NJ) and other M
Vector based on MTV promoter, and pSVβ (C
lontech, Palo Alto, CA) and other vectors based on the SV40 promoter.

【００６３】本発明の別の実施例によれば、本発明の核
酸分子（つまり、ＤＮＡまたはmＲＮＡ）を含む“組換
え細胞”が提供される。適切な宿主細胞、好ましくはバ
クテリア細胞、より好ましくは大腸菌細胞を形質転換す
る方法、およびヘテロロガス蛋白質をコードする遺伝子
を含む該細胞を培養するために適用可能な方法は、先行
技術においてよく知られている。例えば、Sambrookら、
分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Clonin
g：A Laboratory Manual）（２ed），Cold Spring Harb
or，Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA（1989）参照。According to another embodiment of the present invention, there is provided a "recombinant cell" containing the nucleic acid molecule of the present invention (ie, DNA or mRNA). Methods for transforming suitable host cells, preferably bacterial cells, more preferably E. coli cells, and methods applicable for culturing said cells containing a gene encoding a heterologous protein are well known in the prior art. There is. For example, Sambrook et al.
Molecular Cloning: Experimental Manual (Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual) (2ed), Cold Spring Harb
Or, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (1989).

【００６４】形質転換を行うための典型的な方法は、例
えば、プラスミド、ウィルス性またはバクテリア性ファ
ージベクターを用いた形質転換、トランスフェクショ
ン、エレクトロポレーション、リポフェクションなどで
ある。ヘテロロガスＤＮＡは、そのエクストラクロモゾ
ーマルメンテナンスを可能にする配列を任意に含み、該
ヘテロロガスＤＮＡは（宿主内で安定して保持されるよ
うにさせるための別の手段として）宿主のゲノムに組入
させることができる。Typical methods for carrying out transformation are, for example, transformation with plasmids, viral or bacterial phage vectors, transfection, electroporation, lipofection and the like. The heterologous DNA optionally contains sequences that enable its extrachromosomal maintenance, and the heterologous DNA integrates into the genome of the host (as an alternative means to ensure stable retention in the host). Can be made.

【００６５】本発明の実施において使用が考えられる宿
主生物としては、その内部においてヘテロロガス蛋白質
の遺伝子組換えによる生産が行われている生物を含んで
いる。こうした宿主生物の例としては、バクテリア（例
えば、大腸菌、イースト菌、サッカロミセスセレビシア
エ、カンジダトロピカリス、ハンセヌラポリモルフィ
ア、およびＰ．パストリスなど；米国特許第4,882,279
号、第4,837,148号、第4,929,555号および第4,855,231
号参照）、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ293，ＣＨＯ
およびＬtk細胞）、昆虫細胞などである。現在の段階で
好ましい宿主生物はバクテリアである。最も好ましいバ
クテリアは大腸菌である。Host organisms that can be used in the practice of the present invention include organisms in which heterologous protein is produced by gene recombination. Examples of such host organisms include bacteria such as E. coli, yeast, Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Hansenula polymorphia, and P. pastoris; US Pat. No. 4,882,279.
No. 4,837,148, 4,929,555 and 4,855,231
No.), mammalian cells (eg HEK293, CHO
And Ltk cells), insect cells and the like. The preferred host organism at this stage is a bacterium. The most preferred bacterium is E. coli.

【００６６】本発明の別の実施例によれば、本発明によ
る膵臓転写因子に対して発生する抗体が提供される。こ
うした抗体は、本発明による蛋白質、その断片を抗体生
産のための抗原として用いることによって、当業者によ
く知られている標準的な手法を用いてつくることができ
る（例えば、実施例６参照）。本発明による抗体は、通
常、本発明による転写因子蛋白質、またはその断片を含
むイノカラムで哺乳動物を免疫化し、それによって、免
疫化試薬のための免疫特性を有する抗体分子の生産を誘
発することによってつくりだされる。According to another embodiment of the invention there is provided an antibody raised against the pancreatic transcription factor according to the invention. Such an antibody can be prepared by using a standard method well known to those skilled in the art by using the protein of the present invention or a fragment thereof as an antigen for antibody production (see, for example, Example 6). . The antibody according to the present invention is usually obtained by immunizing a mammal with an inocolumn containing the transcription factor protein according to the present invention, or a fragment thereof, thereby inducing the production of antibody molecules having immunological properties for immunizing reagents. Be created.

【００６７】例えば、本発明による蛋白質の合成ペプチ
ド断片に対してウサギ内に発生される抗体は、合成ペプ
チドおよび等モルベースの対応する本発明による転写因
子蛋白質を識別し、好ましくは、天然の蛋白質の活性を
抑制する能力を有している。本発明に対する抗体は、例
えば、４℃で２時間の反応によるビスジアゾ化ベンジジ
ン（ＢＤＢ）リンケージによるＢＳＡにそれを抗原とし
て結合させるために、Ｃ−端末にＴyrが加えられた適切
な合成断片によって、雄および雌の生後３か月のニュー
ジーランド白ウサギを免疫化することによって得ること
ができる。低分子量物質を除去するためにこの反応混合
体を透析され、得られた物質を液体窒素内で凍結され、
−20℃で保存される。動物はBenoitら、P．N．A．S．US
A，79，917−921（1982）の手順によって、１mg当量の
ペプチド抗原で免疫化される。４週間の間隔を置いて、
これらの動物を200μgの抗原を注射することによってブ
ーストし、その後、10日から14日間飼育する。３回目の
ブースト後、クロラミン−Ｔ法によってつくられた放射
沃素化抗原ペプチドを結合する能力について抗血清を調
べ、ＣＭＣ−イオン交換カラムクロマトグラフィーによ
って精製される。次に、抗体分子を哺乳動物から集め
て、例えば、ＩgＧフラクションを得るためにＤＥＡＥ
セファデックスを用いるなどの、公知の方法において望
ましい程度にまで分離される。For example, an antibody raised in rabbits against synthetic peptide fragments of the protein according to the invention will identify the synthetic peptide and the corresponding transcription factor protein according to the invention on an equimolar basis, preferably of the native protein. It has the ability to suppress activity. Antibodies to the invention may be prepared, for example, by a suitable synthetic fragment in which Tyr is added to the C-terminus to bind it as an antigen to BSA by bisdiazotized benzidine (BDB) linkage by reaction at 4 ° C. for 2 hours. It can be obtained by immunizing male and female 3 month old New Zealand White rabbits. The reaction mixture was dialyzed to remove low molecular weight material and the resulting material was frozen in liquid nitrogen,
Stored at -20 ° C. Animals are described by Benoit et al . N. A. S. US
Immunization with 1 mg equivalent of peptide antigen by the procedure of A , 79, 917-921 (1982). 4 weeks apart,
These animals are boosted by injecting 200 μg of antigen and then housed for 10-14 days. After the third boost, the antisera are tested for their ability to bind the radioiodinated antigenic peptide made by the chloramine-T method and purified by CMC-ion exchange column chromatography. The antibody molecule is then collected from the mammal and, for example, DEAE to obtain the IgG fraction.
Separation to the desired extent in known methods, such as with Sephadex.

【００６８】この抗体の特異性をさらに強化するため
に、これらの抗体を固体相添加免疫化ポリペプチドを用
いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製するこ
とができる。抗体は抗体分子と免疫反応して固体相免疫
複合体を形成するのに十分な時間、固体相転写因子ペプ
チドと接触される。結合した抗体は、次に、標準的な手
法で複合体から分離される。ＳＥＱ ＩＤ NO：２のア
ミノ酸196−214と免疫反応性がある典型的な抗膵臓ホル
モン抗体については、実施例６に述べる。To further enhance the specificity of this antibody, these antibodies can be purified by immunoaffinity chromatography using a solid phase loaded immunizing polypeptide. The antibody is contacted with the solid phase transcription factor peptide for a time sufficient to immunoreact with the antibody molecule to form the solid phase immune complex. Bound antibody is then separated from the complex by standard techniques. A typical anti-pancreatic hormone antibody immunoreactive with amino acids 196-214 of SEQ ID NO: 2 is described in Example 6.

【００６９】このようにしてつくられた抗体は、なかん
ずく、組織または血管流体などの哺乳動物、好ましくは
ヒトの体サンプルに存在している膵臓島転写因子蛋白質
のレベルを検出するための診断方法およびシステムにお
いて用いることができる。こうした抗体は、また、本発
明による転写因子蛋白質の免疫親和性または親和性クロ
マトグラフィーによる精製のために用いることができ
る。The antibodies thus produced are among others diagnostic methods for detecting the levels of pancreatic islet transcription factor protein present in body samples of mammals, such as tissues or vascular fluids, preferably humans. Can be used in the system. Such antibodies can also be used for the purification of the transcription factor proteins according to the invention by immunoaffinity or affinity chromatography.

【００７０】本発明のさらに別の実施例においては、膵
臓ホルモン遺伝子を制御する転写を調節する方法が提供
され、この方法は： 該プロモータを本発明による転写
因子蛋白質と接触させるステップを含んでいる。In yet another embodiment of the present invention there is provided a method of regulating pancreatic hormone gene-regulating transcription, the method comprising: contacting the promoter with a transcription factor protein according to the present invention. .

【００７１】ここで用いられいる“接触させる”という
用語は、（例えば、適切な緩衝液、または生理学的条件
など）適切な環境条件の下で、本発明による転写因子、
あるいはＤＮＡに結合するその断片を、膵臓ホルモン遺
伝子プロモータからの組織特異性プロモータ要素、好ま
しくはインシュリン遺伝子プロモータと結合させるのに
十分な時間だけ提供することを意味している。こうした
接触は細胞を含まないインビトロシステムか、生物学的
に活性を有するインシュリン蛋白質をコードする遺伝子
を含んだ細胞の内部で、インビトロまたはインビボで培
養された細胞のいずれかで行われる。As used herein, the term "contacting" refers to a transcription factor according to the present invention, under appropriate environmental conditions (eg, appropriate buffer, or physiological conditions, etc.),
Alternatively, it means that the fragment that binds to DNA is provided for a time sufficient to bind to a tissue-specific promoter element from the pancreatic hormone gene promoter, preferably the insulin gene promoter. Such contacting is carried out either in a cell-free in vitro system or inside cells containing a gene encoding a biologically active insulin protein, either in vitro or in vivo cultured cells.

【００７２】本発明のさらに別の実施例においては、哺
乳動物におけるインシュリンのレベルを調整する方法が
提供され、該方法は： グルコースの存在下で、生物学
的に活性を有するインシュリン蛋白質をコードする遺伝
子を本発明による転写因子蛋白質、またはそのＤＮＡ結
合断片と接触させるステップを含んでいる。In yet another embodiment of the present invention there is provided a method of modulating insulin levels in a mammal, which method comprises: encoding a biologically active insulin protein in the presence of glucose. Contacting the gene with a transcription factor protein according to the invention, or a DNA binding fragment thereof.

【００７３】“グルコースの存在下で”という表現は、
本発明による転写因子蛋白質のグルコースに応答した発
現が発生するのに十分な濃度でグルコースが存在してい
ることを意味している。例えば、グルコースレベルが80
〜90mg/ml血管流体の正常範囲より慢性的に高い患者に
おいては、本発明による転写因子蛋白質のグルコース応
答反応が起きる。The expression "in the presence of glucose"
It means that glucose is present at a concentration sufficient to cause expression of the transcription factor protein according to the present invention in response to glucose. For example, if your glucose level is 80
In patients chronically above the normal range of ˜90 mg / ml vascular fluid a glucose responsive response of the transcription factor protein according to the invention occurs.

【００７４】本治療法を実施するためには、膵臓転写因
子蛋白質をコードする本発明による核酸を膵臓島Ｂ−細
胞などの生物学的に活性のあるインシュリンを発現する
ことができる適切な細胞に導入する。本発明によるホメ
オボックス−タイプの転写因子はインシュリン遺伝子の
発現をトランス活性化することは分かっているので、本
発明による転写因子蛋白質の発現を発生させると、イン
シュリン遺伝子を含んだ任意の細胞のインシュリンの発
現を発生させると考えられる。加えて、本発明による転
写因子蛋白質の発現レベルは種々の濃度のグルコースと
反応することが分かっているので、本発明による方法
は、インシュリンのグルコース応答発現のための手段を
提供してくれる。In order to carry out the present method of treatment, the nucleic acid according to the present invention encoding the pancreatic transcription factor protein is introduced into suitable cells capable of expressing biologically active insulin such as pancreatic islet B-cells. Introduce. It is known that the homeobox-type transcription factor according to the present invention transactivates the expression of the insulin gene. Therefore, when the expression of the transcription factor protein according to the present invention is generated, the insulin gene of any cell containing the insulin gene is expressed. Is thought to cause the expression of In addition, since the expression level of the transcription factor protein according to the present invention is known to react with various concentrations of glucose, the method according to the present invention provides a means for glucose-responsive expression of insulin.

【００７５】本発明による核酸はインビボでそうした細
胞に導入することもできるし、あるいは、それら細胞を
そうしたことを必要とする患者の体内に移植する前にイ
ンビトロで培養された細胞に導入することもできる。本
発明による核酸は、インビトロで上に述べた組換え細胞
をつくるためのいずれかの方法を用いて適切な内分泌性
細胞に導入することができる。The nucleic acids according to the invention can be introduced into such cells in vivo, or they can be introduced into cells cultured in vitro before transplantation into the body of a patient in need thereof. it can. The nucleic acids according to the invention can be introduced in vitro into suitable endocrine cells using any of the methods for making recombinant cells described above in vitro.

【００７６】膵臓細胞を移植するための方法は先行技術
においてよく知られている。例えば、ヒトへの挿入に適
した成長可能な細胞、好ましくは膵臓島細胞を含んでい
る移植可能な合成組織マトリックス構造について開示し
ている米国特許第4,997,443号および第4,902,295号参
照。移植される細胞を宿主の免疫応答から保護するため
の細胞カプセル化移植法は先行技術においてよく知られ
ている（例えば、米国特許第4,353,888号および第4,69
6,286号参照）。したがって、インシュリンをプロセス
できるどのヒト細胞、好ましくは内分泌性細胞を、ここ
で述べられている治療法での使用の対象として考えるこ
とができる。Methods for transplanting pancreatic cells are well known in the prior art. See, for example, US Pat. Nos. 4,997,443 and 4,902,295, which disclose implantable synthetic tissue matrix structures containing viable cells, preferably pancreatic islet cells, suitable for insertion into humans. Cell-encapsulated transplantation methods for protecting transplanted cells from the host's immune response are well known in the art (eg, US Pat. Nos. 4,353,888 and 4,69).
See No. 6,286). Thus, any human cell capable of processing insulin, preferably an endocrine cell, may be considered for use in the therapeutic methods described herein.

【００７７】例えば、本発明による転写因子蛋白質のグ
ルコース応答発現を確実に行わせ、それによってインシ
ュリンのグルコース応答発現を起こさせるようにするた
めに、哺乳動物のプライマリー発生時島細胞、好ましく
はヒトのものを、本発明による転写因子をコードする核
酸および／または生物学的に活性を有するインシュリン
蛋白質をコードするひとつ、または複数の適切なベクタ
ーと共に分離または形質導入してもよい。さらに、上皮
細胞を島細胞内に区別させる方法について述べた米国特
許第4,935,000号および生物学的な活性を有するインシ
ュリンをつくりだすことができるランゲルハンス島をつ
くりだす方法について述べている米国特許第4,868,121
号参照。For example, in order to ensure the glucose-responsive expression of the transcription factor protein according to the present invention and thereby the glucose-responsive expression of insulin, mammalian primary islet cells, preferably human, are used. One may be isolated or transduced with one or more suitable vectors encoding a nucleic acid encoding a transcription factor according to the invention and / or a biologically active insulin protein. In addition, U.S. Pat.No. 4,935,000 describing a method of differentiating epithelial cells into islet cells and U.S. Pat.No. 4,868,121 describing a method of producing islets of Langerhans capable of producing biologically active insulin.
See issue.

【００７８】ひとつの実施例において、本発明による転
写因子蛋白質をコードする核酸を哺乳動物の細胞、好ま
しくは膵臓島細胞に、適切な先行技術においてよく知ら
れているウィルス性ベクターを用いて、インビボまたは
インビトロのいずれかで伝達することができる。特にイ
ンビボでの“遺伝子治療”方法のために設計された適切
なレトロウィルス性ベクターは、例えば、ＷＩＰＯの刊
行物ＷＯ 9205266およびＷＯ 9214829に述べられてお
り、これらの資料は核酸をインビボでヒトの細胞に効率
的に導入する方法について述べている。さらに、本発明
による転写因子のインビボでの発現を制限あるいは低下
させることが望ましい場合、本発明による核酸のアンチ
センスストランドを導入することが考えられる。In one embodiment, the nucleic acid encoding the transcription factor protein according to the present invention is applied in vivo to a mammalian cell, preferably a pancreatic islet cell, using a viral vector well known in the prior art. Alternatively, it can be delivered either in vitro. Suitable retroviral vectors specifically designed for in vivo "gene therapy" methods are described, for example, in WIPO publications WO 9205266 and WO 9214829, which reference nucleic acids to humans in vivo. It describes a method for efficient introduction into cells. Furthermore, if it is desired to limit or reduce the in vivo expression of the transcription factor according to the invention, it is envisaged to introduce the antisense strand of the nucleic acid according to the invention.

【００７９】ここで望まれている“生物学的に活性を有
するインシュリン蛋白質をコードする遺伝子”とは、イ
ン−ビボで発現された場合に、その蛋白質が生理学的に
正常な方法でグルコースの濃度を調整できるように、イ
ンシュリン蛋白質をコードする遺伝子を指している。As used herein, the term "gene encoding a biologically active insulin protein" means that when expressed in vivo, the protein has a glucose concentration in a physiologically normal manner. Is a gene that encodes an insulin protein so that it can be regulated.

【００８０】本発明のさらに別の実施例においては、哺
乳動物の糖尿病を措置するための方法が提供され、該方
法はグルコースの存在下で、生物学的に活性を有するイ
ンシュリン蛋白質をコードする遺伝子を含んだ細胞内
で、本発明の核酸ベクターを発現するステップを含んで
いる。In yet another embodiment of the present invention, there is provided a method for treating diabetes in a mammal, the method comprising: a gene encoding a biologically active insulin protein in the presence of glucose. And expressing the nucleic acid vector of the present invention in a cell containing.

【００８１】以下の非限定的実施例を参照して、本発明
についてさらに詳しく説明する。ここで触れられている
すべての米国特許および刊行物はその全体が引例として
組み込まれる。The invention will be described in more detail with reference to the following non-limiting examples. All US patents and publications mentioned herein are incorporated by reference in their entirety.

【００８２】特に他の記述がないかぎり、本発明は、例
えば、Maniatisら、分子クローニング：実験マニュアル
（Molecular Cloning：A Laboratory Manual），Cold S
pring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbo
r，New York，USA （1982）；Sambrookら、分子クロー
ニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Labor
atory Manual）（２ed），Cold Spring Harbor Laborat
ory Press， Cold SpringHarbor，New York，USA（198
9）；Davisら、分子生物学における基礎的方法（Basic
Methods in Molecular Biology），Elsevier Science u
blishing，Inc.，New York，USA（1986）；または、メ
ソドシン酵素学：分子クローニング技術ガイド（Method
sin Enzymology：Guide to Molecular Cloning Techniq
ue）：Vol.152，S．L．BergerおよびA．R．Kimmerl Ed
s.，Academic Press Inc.，San Diego，USA（1987）な
どの資料に述べられている。 Ｔu６細胞系は膵臓腫瘍
から得られたものである（Madsenら、1986，J．Cell Bi
ol.，103：2025−2034参照）。本発明によるcＤＮＡ
は、先行技術においてよく知られている方法を用いてい
ずれかの膵臓島細胞源から得ることができる。すべての
場合に、共トランスフェクションされたＲＳＶ−ルシフ
ェラーゼレセプタープラスミドの活性に正常化した後、
ＣＡＴ活性が測定された。ＣＭＶ−ＩＴＦ−１発現プラ
スミドは標準クローニング手順を用いて、ペアレントプ
ラスミドを含んだＣＭＶプロモータ（例えば、Stratage
ne，La Joll，CAから商業的に入手できるpＯＧ44など）
にＩＴＦ−１cＤＮＡを挿入することによって構成され
た。“−ＴＳＥ”および“４Ｘ ＴＳＥ”ソマトスタチ
ンプラスミドがLeonardら、(1992）ＰＮＡＳ，89：6247
−6251に述べられている手順で作成された。Unless otherwise specified, the present invention is described in, for example, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold S.
pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, New York, USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
atory Manual) (2ed), Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (198
9); Davis et al., Basic methods in molecular biology (Basic
Methods in Molecular Biology), Elsevier Science u
blishing, Inc., New York, USA (1986); or Methodocin Enzymology: Molecular Cloning Technology Guide (Method
sin Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniq
ue): Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl Ed
s., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987). The Tu6 cell line was obtained from pancreatic tumors (Madsen et al., 1986, J. Cell Bi.
ol ., 103: 2025-2034). CDNA according to the invention
Can be obtained from any pancreatic islet cell source using methods well known in the art. In all cases, after normalization to the activity of the cotransfected RSV-luciferase receptor plasmid,
CAT activity was measured. CMV-ITF-1 expression plasmids were cloned using standard cloning procedures using the CMV promoter containing the parental plasmid (eg, Stratagem).
(eg pOG44 commercially available from ne, La Joll, CA)
It was constructed by inserting ITF-1 cDNA into The "-TSE" and "4X TSE" somatostatin plasmids have been described by Leonard et al. (1992) PNAS , 89: 6247.
Created by the procedure described in −6251.

【００８３】[0083]

【実施例】実施例１ Ｔu６ cＤＮＡライブラリー構成 Ｔu６ cＤＮＡは、タイムセーバーcＤＮＡ合成キット
（Pharmacia）を用いて５μgのＴu６細胞誘導ポリ(Ａ)
指定ＲＮＡから合成された。Ｅco ＲＩオーバーハング
を有するＮot Ｉ/Ｅco ＲＩアダプタがcＤＮＡ端に結
紮され、組み込まれなかったリンカーはＣＬ−４Ｂセフ
ァロースカラム（Pharmacia）によるクロマトグラフィ
ーによってcＤＮＡから分離した。1.5〜４kbのcＤＮＡ
がアガロースゲル電気泳動によってサイズ指定され、λ
gt−11ファージアームに結紮された。Gigapack ＩＩ G
old（Stratagene）でパッケージングした後、このライ
ブラリーは４×10⁶pfuを含んでおり、これは青／白色選
択で判定して再結紮されたファージアームの２％以下で
あった。EXAMPLES Example 1 Construction of Tu6 cDNA Library Tu6 cDNA was prepared using 5 μg of Tu6 cell-derived poly (A) using a time saver cDNA synthesis kit (Pharmacia).
Synthesized from designated RNA. A Not I / Eco RI adapter with an Eco RI overhang was ligated to the cDNA ends and the unincorporated linker was separated from the cDNA by chromatography on a CL-4B Sepharose column (Pharmacia). 1.5-4 kb cDNA
Are sized by agarose gel electrophoresis, λ
It was ligated to the gt-11 phage arm. Gigapack II G
After packaging with old (Stratagene), this library contained 4 × 10 ⁶ pfu, which was less than 2% of the phage arms religated as judged by blue / white selection.

【００８４】実施例２ ホメオボックス−タイプ転写因子蛋白質をコードするc
ＤＮＡの分離 ホメオボックス配列はアミノ酸ＬＥＫＥＦ（センス方
向、aa.ホメオドメインの17−21）およびＩＷＦＱＮ
（アンチセンス方向、aa.48−52）をコードする変性オ
リゴヌクレオチドプライマーによってＰＣＲ増幅を行う
ことによってファージＴu−６ cＤＮＡライブラリーか
ら分離された。用いられた合成プライマーは５’−GGCG
GATCCCTXRARARRGART（Ａ/Ｔ）Ｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ
NO：５）および５’GGCGGATCCC（Ｇ/Ｔ）RTTYTGRAACC
A−３’（ＳＥＱ ＩＤ NO：６）で、ここでＲ＝Ａ/Ｇ
およびＹ＝Ｃ/Ｔである。ＰＣＲは各プライマーおよび
１ngＴu６ cＤＮＡを20pmol用いて行われた。アニーリ
ング温度が45℃で３サイクル行われ、その後55℃の温度
で35サイクル行われた。予想された129bpのＰＣＲ生成
物をアガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルから取り出
して、ブルースクリプトＳＫ ＩＩにサブクローンし、
そして、二重鎖ＤＮＡ配列決定によって分析された。予
想されたサイズの６つの増幅されたＤＮＡ断片が得ら
れ、ブルースクリプトＳＫ ＩＩにサブクローンされ
た。分析の対象となった６つの組換えクローンのうち、
５つは同じホメオドメイン断片に対応していた。Example 2 c encoding a homeobox-type transcription factor protein
The isolated homeobox sequences of DNA are amino acids LEKEF (sense orientation, aa. 17-21 of homeodomain) and IWFQN.
It was isolated from the phage Tu-6 cDNA library by PCR amplification with degenerate oligonucleotide primers encoding (antisense orientation, aa.48-52). The synthetic primer used was 5'-GGCG
GATCCCTXRARARRGART (A / T) C-3 '(SEQ ID
NO: 5) and 5'GGCGGATCCC (G / T) RTTYTGRAACC
A-3 '(SEQ ID NO: 6), where R = A / G
And Y = C / T. PCR was performed using 20 pmol of each primer and 1 ng Tu6 cDNA. The annealing temperature was 45 ° C. for 3 cycles followed by 55 ° C. for 35 cycles. The expected 129 bp PCR product was separated by agarose gel electrophoresis, removed from the gel and subcloned into Bluescript SK II,
It was then analyzed by double-stranded DNA sequencing. Six amplified DNA fragments of the expected size were obtained and subcloned into Bluescript SKII. Of the 6 recombinant clones analyzed,
Five corresponded to the same homeodomain fragment.

【００８５】全長ＩＴＦ−１ cＤＮＡクローンを得る
ために、ＩＴＦ−１ ＰＣＲ断片をランダムプライマー
ラベリングで高度の特異活性にラベルした。Ｔｕ−６
λgtllライブラリーから10^６程度のプラークがＩＴＦ−
１断面プローブへのハイブリダイゼーションによってス
クリーンされた。30のポジティブプラークが精製され、
そのうちのいくつかはブルースクリプトＳＫ ＩＩにサ
ブクローンされ、両方の鎖の上で配列決定された。283
個のアミノ酸によって構成される新しい蛋白質をコード
する全長1.6kbのcＤＮＡクローンが得られ、これはイン
シュリン転写因子−１またはＩＴＦ−１（ＳＥＱ ＩＤ
NO：１）と命名された。To obtain the full length ITF-1 cDNA clone, the ITF-1 PCR fragment was labeled with a high degree of specific activity by random primer labeling. Tu-6
About 10 ⁶ plaques from the λgtll library are ITF-
Screened by hybridization to a 1-section probe. 30 positive plaques have been purified,
Some of them were subcloned into Bluescript SK II and sequenced on both strands. 283
A 1.6 kb full length cDNA clone encoding a new protein composed of 4 amino acids was obtained, which is insulin transcription factor-1 or ITF-1 (SEQ ID
It was named NO: 1).

【００８６】実施例３ 大腸菌内でのホメオボックス−タイプ転写因子蛋白質の
発現 上の実施例２に述べられた1.6kb ＩＴＦ−１のcＤＮＡ
配列をフレームで、バクテリア性発現ベクターpＧＥＸ
−２Ｔ（Pharmacia）に挿入した。その結果得られた発
現プラスミドを“pＩＴＦ−１”とラベルして、大腸菌
鎖ＢＬ21に導入した。ＬＢ培養液（Sambrookら、上記参
照）＋30μg/mlのアンピシリンを0.6のＯＤ Ａ₆₀₀に加
えたもの１リットル内で培養された。0.25ｇ ＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピアノシド）で
３時間刺激を与えた後、遠心分離にかけ、プロテアーゼ
抑制因子（１mM ＰＭＳＦ、トラシロル、および100Ｕ/
mlレウペプチン）を含んでいるＨＤＢ緩衝液（140mM Ｎ
ａＣｌ，５mM ＫＣｌ，0.7mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄，25mMヘペ
スpH7.4）に再懸濁させた。氷上で30分間リソザイム
（１mg/ml）によって措置することによって細胞を溶解
した。その後、抽出物が１％トリトンＸ−100、５mM Ｅ
ＤＴＡ，１mM ＤＴＴ，１Ｍ ＮａＣｌの最終濃度を持つ
ように、細胞溶解液を加えた。次に細胞溶解物を40kgで
30分間遠心分離にかけ、上澄液を１％トリトン、プロテ
アーゼ抑制因子、およびＤＴＴを含んだＨＤＢ緩衝液内
で１mMで２時間平衡透析した。その溶解物をさらに500
μlグルタチオン−アガロースビーズと４℃の温度下で2
0分間混合した。このビーズを７回洗浄し、分離したと
ころ、このビーズを７ユニットのトロンビンと室温で１
時間培養することによって、組換えＩＴＦ−１蛋白質が
溶出した。Example 3 Expression of Homeobox-Type Transcription Factor Protein in E. coli 1.6 kb ITF-1 cDNA described in Example 2 above.
Bacterial expression vector pGEX
-2T (Pharmacia) was inserted. The resulting expression plasmid was labeled "pITF-1" and introduced into E. coli chain BL21. LB broth (Sambrook et al., Supra) + 30 μg / ml ampicillin added to an ODA ₆₀₀ of 0.6 and cultured in 1 liter. 0.25g IPTG
After stimulation with (isopropyl-β-D-thiogalactopianoside) for 3 hours, centrifugation was performed and protease inhibitors (1 mM PMSF, trasilol, and 100 U /
ml leupeptin) containing HDB buffer (140 mM N
aCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na ₂ HPO ₄ , 25 mM Hepes pH 7.4). Cells were lysed by treatment with lysozyme (1 mg / ml) for 30 minutes on ice. Then the extract was 1% Triton X-100, 5 mM E
Cell lysate was added to have a final concentration of DTA, 1 mM DTT, 1M NaCl. Then 40 kg of cell lysate
After centrifugation for 30 minutes, the supernatant was equilibrated for 2 hours at 1 mM in HDB buffer containing 1% Triton, protease inhibitor and DTT. 500 more of the lysate
2 μl glutathione-agarose beads and 4 ° C
Mix for 0 minutes. The beads were washed 7 times and separated, and the beads were treated with 7 units of thrombin at room temperature for 1 hour.
The recombinant ITF-1 protein was eluted by culturing for a period of time.

【００８７】実施例４ ＲＮＡse保護およびインシトゥ（in situ）ハイブリダ
イゼーション分析 本発明による転写因子蛋白質の生産がインシュリンおよ
びソマトスタチン生産に関連する内分泌性細胞タイプに
だけ限定されているかどうかを判定するために、ＲＮＡ
se保護アッセイを種々の細胞系および組織から得たＲＮ
Ａに関して行った。ＲＮＡは、11種類のラットの細胞株
と、11匹の成熟したラットの視床下部、大脳、中脳、脳
幹、小腸、皮質、膵臓、心臓、腎臓、肝臓、および脾臓
から得た組織を用いて、標準酸／グアジニジウム／フェ
ノール方法（上述Sambrook参照）で作成された。ＲＮＡ
se保護分析を行うために、ＳＥＱ ＩＤ NO：１のアミ
ノ酸60〜165に対応するＩＴＦ−１ cＤＮＡの318bp断
片を含むHind ＩＩＩ直線化プラスミドリボプローブが
用いられた。このリボプローブを総量30μgのＲＮＡに
アニールして、上のLeanordらに述べられているように
処理した。Example 4 RNAse Protection and In Situ Hybridization Analysis To determine if the production of transcription factor proteins according to the invention is limited only to endocrine cell types associated with insulin and somatostatin production. RNA
RNs obtained from se protection assay from various cell lines and tissues
I went for A. RNA was derived from 11 rat cell lines and tissues from 11 adult rat hypothalamus, cerebrum, midbrain, brain stem, small intestine, cortex, pancreas, heart, kidney, liver, and spleen. , Standard acid / guadinidinium / phenol method (see Sambrook, supra). RNA
A Hind III linearized plasmid riboprobe containing a 318 bp fragment of ITF-1 cDNA corresponding to amino acids 60-165 of SEQ ID NO: 1 was used to perform the se protection analysis. The riboprobe was annealed to a total of 30 μg of RNA and treated as described by Leanord et al., Supra.

【００８８】Ｔu−６およびＲＩＮ５ ＡＨ膵臓島細胞
系の両方でＩＴＦ−１ＲＮＡが観察されたが、ＰＣ12，
ＪＥＧ−３，ＣＯＳ，ＨＴ22，Helaその他を含む非内分
泌性細胞株では検出できる程のＩＴＦ−１ ＲＮＡは観
察されなかった。検査された11種類のラット組織のう
ち、膵臓および小腸だけがＩＴＦ−１ ＲＮＡを含んで
おり、対応する本発明による転写因子蛋白質が小腸およ
び膵臓の内分泌性細胞だけに高度に限定されていること
を示している。Although ITF-1 RNA was observed in both Tu-6 and RIN5 AH pancreatic islet cell lines, PC12,
No detectable ITF-1 RNA was observed in non-endocrine cell lines including JEG-3, COS, HT22, Hela and others. Of the 11 rat tissues tested, only the pancreas and small intestine contain ITF-1 RNA and the corresponding transcription factor proteins according to the invention are highly restricted to small intestinal and pancreatic endocrine cells only. Is shown.

【００８９】ＩＴＦ−１ ＲＮＡ生産の部位はインシト
ゥ（in situ）ハイブリダイゼーションでも確認され
た。インシトゥハイブリダイゼーションを行うために、
膵臓および小腸を低温保持装置上で切開して、スライド
上に載せ、ＩＴＦ−１アンチセンリボプローブとハイブ
リダイズさせた（例えば、Leeら、（1990）Mol．and Ce
llular Neuroscience，１：168−177参照）。³⁵Ｓでラ
ベルしたＩＴＦ−１アンチセンスリボプローブを用い
て、ＩＴＦ−１ ＲＮＡが島に観察されたが、周辺の外
分泌性腺房細胞では観察されなかった。島内部では、ハ
イブリダイゼーション信号はすべての細胞に均等に分散
されていた。島細胞のわずか10〜20％だけがソマトスタ
チンをつくりだすので、β−細胞を含んでいるインシュ
リンなどの他の細胞タイプもこの因子をつくりだすもの
と考えられる。ＩＴＦ−１ ＲＮＡは小腸のほとんどの
上皮細胞に存在しているが、これらのうちの少数のみが
ソマトスタチンをつくりだすことが分かっている。した
がって、両方の組織で、ソマトスタチンをつくりだす細
胞はＩＴＦ−１を発現する細胞のうちの小部分だけであ
るように思われる。The site of ITF-1 RNA production was also confirmed by in situ hybridization. To perform in situ hybridization,
The pancreas and small intestine were dissected on a cryostat , mounted on slides and hybridized with the ITF-1 antisen riboprobe (eg, Lee et al., (1990) Mol. And Ce.
llular Neuroscience , 1: 168-177). ^{Using the} 35S-labeled ITF-1 antisense riboprobe, ITF-1 RNA was observed in the islets, but not in the surrounding exocrine acinar cells. Within the island, the hybridization signal was evenly distributed among all cells. Since only 10-20% of the islet cells produce somatostatin, other cell types such as insulin containing β-cells are also likely to produce this factor. ITF-1 RNA is present in most epithelial cells of the small intestine, but only a few of these are known to produce somatostatin. Therefore, in both tissues, the cells that produce somatostatin appear to be only a small proportion of the cells that express ITF-1.

【００９０】実施例５ ゲル移動度シフトアッセイ変動およびＤＮＡse Ｉ保護
分析 ラットのインシュリンプロモータ内部では、“Ｐ−Ｂo
x”（ＳＥＱ ＩＤ NO：８）および“ＦＬＡＴ”また
は“Ｅ２”（ＳＥＱ ＩＤ NO：９）と呼ばれる２つの
組織特異性要素は、膵臓島細胞内のインシュリン発現の
促進に関与している。ソマトスタチンプロモータの内部
では、ＴＳＥ Ｉ（ＳＥＱ ＩＤ NO：３）およびＴＳ
Ｅ ＩＩ（ＳＥＱ ＩＤ NO：４）と呼ばれる２つの相
互に関連した組織特異性要素が膵臓島Ｔu−６細胞内で
のソマトスタチン発現を促進する。ＩＴＦ−１がこれら
機能的に定義された要素に結合できるかどうかを判定す
るために、組換えＩＴＦ−１蛋白質を原核ＧＳＴ−ＩＴ
Ｆ−１発現プラスミド（実施例３に説明）を用いて形質
変換した大腸菌から作成した。グルタチオン−アガロー
スビーズ上で精製した後、ＧＳＴ−ＩＴＦ−１融合蛋白
質をスロンビンで切断してアミノ酸から伸びた161アミ
ノ酸ＩＴＦ−１ポリペプチド断片の検索を可能にした。
ＳＥＱ ＩＤ NO：２の124−283である。Example 5 Gel Mobility Shift Assay Variability and DNAse I Protection Assay Within the rat insulin promoter, “P-Bo
Two tissue-specific elements called x "(SEQ ID NO: 8) and" FLAT "or" E2 "(SEQ ID NO: 9) are involved in promoting insulin expression in pancreatic islet cells. Inside the promoter, TSE I (SEQ ID NO: 3) and TS
Two interrelated tissue-specific elements, called EII (SEQ ID NO: 4), promote somatostatin expression in pancreatic islet Tu-6 cells. To determine whether ITF-1 can bind to these functionally defined elements, recombinant ITF-1 protein was labeled with prokaryotic GST-IT.
Created from E. coli transformed with the F-1 expression plasmid (described in Example 3). After purification on glutathione-agarose beads, the GST-ITF-1 fusion protein was cleaved with thrombin to allow the search for a 161 amino acid ITF-1 polypeptide fragment extending from the amino acid.
It is 124-283 of SEQ ID NO: 2.

【００９１】ソマトスタチンプロモータによるＤＮＡse
Ｉ保護に関する研究それぞれ−104から−86まで（５’
−TTGCGAGGCTAATGGTGCG−３’、ＳＥＱ ＩＤ NO：
３）および−303から−281（５’−GATCTCAGTAATAATCAT
GCAG−３’，ＳＥＱ ＩＤ NO：４）に広がっている二
重鎖スマトスタチンＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ ＩＩオリゴ
類を用いて行われた（ヤマモトら、1990，Cell，60：61
1−617参照）。ミュータントＴＳＥ Ｉは上述のLeonard
らに述べられている方法にしたがって作成され、ＴＳＥ
ＩＩオリゴは５’−GATCTCAGGCCGGCCGCATGCAC−３’
（ＳＥＱ ＩＤ NO：７）の配列を含んでいた。ＴＳＥ
ＩおよびＴＳＥ ＩＩ部位の両方にわたって個別のフッ
トプリントが観察された。両方の部位での保護は粗Ｔu
−６核抽出物を用いて得られたフットプリンティングパ
ターンと一致していた。ＴＳＥ ＩＩ部位は更に低い濃
度のＩＴＦ−１で完全に保護されたが、このことはこの
部位がＴＳＥ Ｉ部位より高い親和性でこの蛋白質と結
合するのかもしれないことを示している。DNAse driven by somatostatin promoter
I Studies on protection -104 to -86 respectively (5 '
-TTGCGAGGCTAATGGTGCG-3 ', SEQ ID NO:
3) and -303 to -281 (5'-GATCTCAGTAATAATCAT
GCAG-3 ′, SEQ ID NO: 4) spanning double-stranded sumatostatin TSE I and TSE II oligos (Yamamoto et al., 1990, Cell 60:61).
See 1-617). Mutant TSE I is the above Leonard
And the TSE
II oligo is 5'-GATCTCAGGCCGGCCGCATGCAC-3 '
The sequence of (SEQ ID NO: 7) was included. TSE
Separate footprints were observed across both the I and TSE II sites. Protection at both sites is rough Tu
It was consistent with the footprinting pattern obtained with -6 nuclear extract. The TSE II site was fully protected at lower concentrations of ITF-1, indicating that this site may bind this protein with higher affinity than the TSE I site.

【００９２】同様のＤＮＡse保護アッセイがラットイン
シュリンＩ組織−特異性プロモータ断片“Ｐ−Ｂox”
（ＳＥＱ ＩＤ NO：８）および“ＦＬＡＴ”（ＳＥＱ
ＩＤNO：９）（上述のOhlssonおよびEdlund参照）に
対応する二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行われた。
ソマトスタチンプロモータ断片のために得られた結果と
同様、組換えＩＴＦ−１蛋白質を用いて行われたアッセ
イで、インシュリンプロモータ“Ｐ−Ｂox”および“Ｆ
ＬＡＴ”部位の両方に広がる個別フットプリントが観察
された。A similar DNAse protection assay was performed using the rat insulin I tissue-specific promoter fragment "P-Box".
(SEQ ID NO: 8) and "FLAT" (SEQ
IDNO: 9) (see Ohlsson and Edlund, supra).
Similar to the results obtained for the somatostatin promoter fragment, the insulin promoters "P-Box" and "F" were assayed in assays performed with recombinant ITF-1 protein.
A distinct footprint was observed that spans both LAT "sites.

【００９３】ラベルされたＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ ＩＩ
オリゴを用いたゲル移動度シフトアッセイ（例えば、上
述のYamamotoら参照）が、ＩＴＦ−１のＤＮＡ結合特性
を評価するために行われた。その結果はいずれの部位に
対する組換えＩＴＦ−１蛋白質の結合もラベルされてい
ない野生タイプのＴＳＥ ＩまたはＴＳＥ ＩＩコンペテ
ィタＤＮＡによって簡単に取って代わられることを示し
ている。しかしながら、ＴＡＡＴ認識モチーフに置換基
を有したＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ ＩＩのミュータントバ
ージョン（Version）はＩＴＦ−１結合に対して同様の
能力を示すことはできなかった。フットプリンティング
に関する研究の場合と同様、ＩＴＦ−１蛋白質のＴＳＥ
ＩＩ蛋白質に対する親和性はＴＳＥ Ｉに対する親和性
より高いように思われる。Labeled TSE I and TSE II
A gel mobility shift assay with oligos (see, eg, Yamamoto et al., Supra) was performed to assess the DNA binding properties of ITF-1. The results show that the binding of recombinant ITF-1 protein to either site is simply replaced by unlabeled wild type TSE I or TSE II competitor DNA. However, mutant versions of TSE I and TSE II with substituents on the TAAT recognition motif were unable to show similar potency for ITF-1 binding. As in the case of footprinting studies, ITF-1 protein TSE
The affinity for the II protein appears to be higher than the affinity for TSE I.

【００９４】同様のゲル流動性変動アッセイがラットイ
ンシュリンＩ組織特異性プロモータ断片“Ｐ−Ｂox”お
よび“ＦＬＡＴ”（上述の、OhlssonおよびEdlund参
照）に対応する二重鎖オリゴヌクレオチド類を用いて行
われた。その結果は、いずれの部位に対する組換えＩＴ
Ｆ−１蛋白質の結合もラベルされない野生タイプのＰ−
ＢoxまたはＦＬＡＴコンペティタＤＮＡによって簡単に
取って代わられることを示している。しかしながら、Ｐ
−ＢoxおよびＦＬＡＴのミュータントバージョンがＩＴ
Ｆ−１結合に関して同様の力を発揮することはできなか
った。A similar gel fluidity variation assay was performed using double-stranded oligonucleotides corresponding to the rat insulin I tissue-specific promoter fragments "P-Box" and "FLAT" (see Ohlsson and Edlund, supra). I was broken. The result is that recombinant IT for any site
Wild-type P-, which is also unlabeled for F-1 protein binding
It is shown to be easily replaced by the Box or FLAT competitor DNA. However, P
-A mutant version of Box and FLAT is IT
Similar forces could not be exerted on F-1 binding.

【００９５】ソマトスタチン発現細胞における他のＤＮ
Ａ−結合活性に対してＩＴＦ−１ＤＮＡ−結合が相対的
にどれ程強力かについてのアッセイがＴu−６核抽出物
を用いた変動実験で行われた。高親和性ＴＳＥ ＩＩプ
ローブを用いて、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３と命名された３つの
複合体がそれぞれの流動性に基づいて観察された。複合
体Ｃ１とＣ３は抽出物の量が少なくても現れたのに、複
合体Ｃ２は抽出物の濃度を高くした場合にだけ現れた。
Ｃ１とＣ２は、両方とも野生タイプに取って代わられた
のに対して、ミュータントＴＳＥ ＩおよびＴＳＥ ＩＩ
オリゴによっては取って代わられなかったので、高い親
和性複合体を示しているように思われる。Ｃ１とＣ２の
いずれも、Helaなどの非内分泌性細胞抽出物では観察さ
れなかったので、これらの複合体も組織特異性であるよ
うに思われる。Other DNs in somatostatin expressing cells
An assay of how strong ITF-1 DNA-binding was relative to A-binding activity was performed in a variability experiment with Tu-6 nuclear extracts. Using the high affinity TSE II probe, three complexes designated C1, C2 and C3 were observed based on their respective fluidity. Complexes C1 and C3 appeared even with low amounts of extract, while complex C2 appeared only at higher extract concentrations.
Both C1 and C2 were replaced by wild type, whereas mutants TSE I and TSE II
It was shown not to be superseded by oligos, thus indicating a high affinity complex. Since neither C1 nor C2 was observed in non-endocrine cell extracts such as Hela, these complexes also appear to be tissue specific.

【００９６】実施例６ 抗体およびウェスタンブロット分析 （実施例５に述べられた）Ｃ１，Ｃ２およびＣ３複合体
がＩＴＦ−１に関連した因子を持っているかどうかを判
定するために、ＳＥＱ ＩＤ NO：２のアミノ酸196−2
14から延びている合成ＩＴＦ−１ペプチドに対して、ウ
サギのモノクローナル抗血清（抗ＩＴＦ−１）が形成さ
れた。この抗ＩＴＦ−１抗血清は、ウェスタンブロット
分析で組換えＩＴＦ−１蛋白質を特異的に識別する。Ｉ
ＴＦ−１抗血清によるウェスタンブロット分析は細胞質
および核Ｔu−６抽出物（例えば、上述Leonardら参照）
で行われた。Example 6 Antibody and Western Blot Analysis To determine whether the C1, C2 and C3 complexes (described in Example 5) carry ITF-1 related factors, SEQ ID NO: 2 amino acids 196-1
Rabbit monoclonal antiserum (anti-ITF-1) was formed against a synthetic ITF-1 peptide extending from 14. This anti-ITF-1 antiserum specifically identifies recombinant ITF-1 protein by Western blot analysis. I
Western blot analysis with TF-1 antiserum revealed cytoplasmic and nuclear Tu-6 extracts (see, eg, Leonard et al., Supra).
Made in.

【００９７】Ｔu−６抽出物において、ＩＴＦ−１抗血
清は核および細胞質抽出物の49kD蛋白質を特異的に識別
した。この帯域の分子量は予想されたＩＴＦ−１の質量
（31kD）とはまったく異なっており、この49kD免疫反応
性生成物がＩＴＦ−１ ＲＮＡによってプログラムされ
るレチクロサイト細胞溶解物からのインビトロ翻訳生成
物とコミグレートする。In Tu-6 extract, ITF-1 antiserum specifically identified the 49 kD protein of nuclear and cytoplasmic extracts. The molecular weight of this band is quite different from the expected mass of ITF-1 (31 kD), and this 49 kD immunoreactive product produced in vitro translation products from reticulocytic cell lysates programmed by ITF-1 RNA. To migrate with things.

【００９８】核および細胞質フラクションの両方でのＩ
ＴＦ−１蛋白質を示しているウェスタンブロットデータ
から予想されるように、複合体Ｃ１は両方の抽出物（細
胞質と核）で観察され、この蛋白質が抽出物調製中に漏
出する可能性を示唆している。Ｔu−６核抽出物によっ
て予備培養した場合、ＩＴＦ−１抗血清はＣ１およびＣ
２複合体を完全に破壊したが、Ｃ３に対してはまったく
影響を示さなかった。免疫前血清はこれら複合体のいず
れに対してもまったく影響を示さなかったので、我々が
得た結果は、ＩＴＦ−１蛋白質がＴu−６細胞内のＴＳ
Ｅ結合活性の大部分を担っていることを示唆している。I in both nuclear and cytoplasmic fractions
As expected from the Western blot data showing the TF-1 protein, complex C1 was observed in both extracts (cytoplasmic and nuclear), suggesting that this protein may leak during extract preparation. ing. ITF-1 antiserum, when pre-cultured with Tu-6 nuclear extract, contained C1 and C
The 2 complex was completely destroyed but had no effect on C3. Since the preimmune sera had no effect on either of these complexes, our results indicate that the ITF-1 protein is TS in Tu-6 cells.
It is suggested that it is responsible for most of the E-binding activity.

【００９９】さらに、複合体Ｃ１は全長組換えＩＴＦ−
１蛋白質−ＴＳＥ複合体と同じ相対流動性を示している
おり、これはＣ１がＩＴＦ−１を含んでいることを示し
ている。Ｔu−６核抽出物の濃度を増大させるとＣ２が
出現するという事実は、この複合体がＩＴＦ−１の２量
体形態に基づくものかもしれない可能性を示唆してい
る。実際に、ＴＳＥ ＩＩ部位はこの部位上の２つのホ
メオドメインモノマー間の協同的結合を促進する可能性
のある２ＴＡＡＴモチーフを含んでいる。Furthermore, the complex C1 is a full-length recombinant ITF-.
It shows the same relative fluidity as the 1 protein-TSE complex, indicating that C1 contains ITF-1. The fact that C2 appears with increasing concentrations of Tu-6 nuclear extract suggests that this complex may be due to the dimeric form of ITF-1. In fact, the TSE II site contains a 2TAAT motif that may facilitate cooperative binding between two homeodomain monomers on this site.

【０１００】ゲル移動度シフトアッセイのテストでは、
ＩＴＦ抗血清は組換えＩＴＦ−１のＴＳＥプローブへの
結合を特異的に抑制したが、ＩＳＬ−１蛋白質の結合は
抑制しなかった。In testing the gel mobility shift assay,
ITF antiserum specifically suppressed the binding of recombinant ITF-1 to the TSE probe, but not the binding of ISL-1 protein.

【０１０１】実施例７ インビトロ転写 インシュリンおよびソマトスタチンプロモータからの転
写に対する組換えＩＴＦ−１の影響は、ＰＣ12抽出物の
代わりにHeLa核抽出物が用いられたことを除けば、以前
に述べたのと同様の方法で（例えば、Gonzalesら、（19
91）Mol．& Cell．Biol.，11（３）：1306−1312参照）
行われた。ＩＴＦ−１およびＣＲＥＢ蛋白質は個別と組
み合わせの両方で評価が行われた。Hela核抽出物は検出
可能なレベルのＩＴＦ−１蛋白質を含んでおらず、内発
性の蛋白質の干渉を受けずにこの因子のテストを行うこ
とが可能であった。Example 7 In Vitro Transcription The effect of recombinant ITF-1 on transcription from the insulin and somatostatin promoters was previously described, except that HeLa nuclear extract was used in place of PC12 extract. In a similar way (eg Gonzales et al. (19
91) Mol. & Cell. Biol ., 11 (3): 1306-1312).
It was conducted. The ITF-1 and CREB proteins were evaluated both individually and in combination. Hela nuclear extract did not contain detectable levels of ITF-1 protein and it was possible to test for this factor without the interference of endogenous proteins.

【０１０２】簡単に言うと、10mM ＨＥＰＥＳ pH7.9，6
0mM ＫＣｌ，0.2mM ＥＤＴＡ，５mMＭｇＣｌ₂，５％グ
リセロール、２％ポリビニルアルコール、２mM ＤＴ
Ｔ，100ng pＵＣα１ （コントロールＤＮＡテンプレ
ート）、200ngソマトスタチンプロモータテンプレー
ト、83ｇ核酸抽出物、および組換え転写アクチベータ
“−ＴＳＥ”および“４Ｘ ＴＳＥ”を含んだ最終体積
50ｌ内で反応が行われた。“−ＴＳＥ”プラスミドはＣ
ＲＥ部位は含んでいるが、ＴＳＥ部位は含んでいない最
小ソマトスタチンプロモータ構成物を含んでいる。“４
Ｘ ＴＳＥ”プラスミドはＣＲＥ部位の上流に配置され
た４つのＴＳＥ Ｉ部位を含むソマトスタチンプロモー
タベクターである。中間コントロールとして、ヒトα−
グロブリンテンプレートが用いられた。Briefly, 10 mM HEPES pH7.9,6
0 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 5 mM MgCl ₂ , 5% glycerol, 2% polyvinyl alcohol, 2 mM DT
Final volume containing T, 100 ng pUCα1 (control DNA template), 200 ng somatostatin promoter template, 83 g nucleic acid extract, and recombinant transcription activators "-TSE" and "4X TSE"
The reaction was carried out in 50 l. "-TSE" plasmid is C
It contains a minimal somatostatin promoter construct that contains the RE site but not the TSE site. "4
The X TSE "plasmid is a somatostatin promoter vector containing four TSE I sites located upstream of the CRE site. As an intermediate control, human α-
Globulin template was used.

【０１０３】４つのリボヌクレオチドすべてを加えてそ
れぞれ400Ｍの最終濃度にするまえに、ＤＮＡテンプレ
ート、核抽出物、およびアクチベータ蛋白質が30℃の温
度下で、30分間、集合させられた。さらに30分間培養し
た後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ル［50：49：１］による抽出を行って反応を終わらせ、
プライマー延長分析によって分析された（上述のGonzal
esら参照）。α−グロブリンプロモータからの延長生成
物は64ヌクレオチドであり、ソマトスタチンプロモータ
からの生成物は56および57ヌクレオチドの二重構造であ
る。The DNA template, nuclear extract and activator protein were allowed to assemble for 30 minutes at a temperature of 30 ° C. before adding all four ribonucleotides to a final concentration of 400 M each. After culturing for another 30 minutes, phenol / chloroform / isoamyl alcohol [50: 49: 1] extraction is performed to terminate the reaction.
Analyzed by primer extension analysis (Gonzal described above)
See es et al.). The extension product from the α-globulin promoter is 64 nucleotides, and the product from the somatostatin promoter is a 56 and 57 nucleotide double structure.

【０１０４】精製ＩＴＦ−１蛋白質を追加した後にソマ
トスタチン転写が著しく誘発されることが、ソマトスタ
チンＣＲＥの上流に挿入された４ＴＳＥ Ｉ部位を用い
て観察された。対照的に、ＩＴＦ−１は、テストされた
蛋白質のどのようなレベルでも、ＴＳＥ部位（−ＴＳ
Ｅ）を欠いたα−グロブリン制御プライマーやソマトス
タチンテンプレートには刺激性の影響を及ぼさなかっ
た。対照的に、精製されたＣＲＥＢ蛋白質は−ＴＳＥと
４Ｘ ＴＳＥ Ｉテンプレートの両方から転写を開始さ
せた。Significant induction of somatostatin transcription after addition of purified ITF-1 protein was observed using the 4TSE I site inserted upstream of somatostatin CRE. In contrast, ITF-1 was found to have a TSE site (-TS) at any level of the tested protein.
The α-globulin control primer lacking E) and the somatostatin template had no stimulatory effect. In contrast, the purified CREB protein initiated transcription from both -TSE and 4X TSE I template.

【０１０５】ＩＴＦ−１がインビボでのソマトスタチン
転写を刺激するかどうかを判定するために、ＩＴＦ−１
cＤＮＡが、標準的な方法を用いて、サイトメガロウ
ィルス（ＣＭＶ）発現ベクター（例えば、ＰＯＧ４，St
ratagene）に挿入された。Hela細胞で調べた場合、ＣＭ
Ｖ−ＩＴＦ−１発現プラスミドはＴＳＥ ＩおよびＴＳ
Ｅ ＩＩソマトスタチンレポータープラスミドの両方を1
2倍程度刺激したのに対して、これらの部位を含んでい
ない親のソマトスタチンプラスミドには軽微な影響が現
れただけだった。ＣＭＶ−ＩＴＦ−１はまた、ＰＣ12細
胞に共トランスフェクションするとＴＳＥ ＩおよびＴ
ＳＥ ＩＩレポーター活性を刺激したが、−ＴＳＥプラ
スミドは誘導を示さなかった。これらの結果は、ＩＴＦ
−１が細胞のタイプに依存して、ソマトスタチンプロモ
ータからの転写を特異的に刺激することができることを
示している。To determine whether ITF-1 stimulates somatostatin transcription in vivo, ITF-1
The cDNA can be cloned using standard methods using cytomegalovirus (CMV) expression vectors (eg, POG4, St
ratagene). CM when examined with Hela cells
V-ITF-1 expression plasmids are TSE I and TS
Both E II somatostatin reporter plasmids 1
There was only a minor effect on the parental somatostatin plasmid, which did not contain these sites, whereas it was stimulated about 2-fold. CMV-ITF-1 also showed TSE I and T when cotransfected into PC12 cells.
The SE II reporter activity was stimulated, but the -TSE plasmid showed no induction. These results are ITF
It has been shown that -1 can specifically stimulate transcription from the somatostatin promoter depending on the cell type.

【０１０６】組換えＩＴＦ−１のラットインシュリンプ
ロモータへの影響を評価するために、同様のアッセイが
行われた。この場合も、結果は、ＩＴＦ−１が細胞タイ
プに依存した形態でインシュリンプロモータからの転写
を特異的に刺激することができることを示している。A similar assay was performed to assess the effect of recombinant ITF-1 on the rat insulin promoter. Again, the results show that ITF-1 can specifically stimulate transcription from the insulin promoter in a cell type-dependent manner.

【０１０７】実施例８ 本発明によるホメオボックス−タイプ転写因子蛋白質の
内発性遺伝子発現に対するグルコース濃度の影響Example 8 Effect of glucose concentration on endogenous gene expression of homeobox-type transcription factor protein according to the present invention

【０１０８】膵臓島細胞を０〜20mMの範囲の種々の濃度
のグルコースの存在下で培養した。次に、ＲＮＡを島細
胞の種々の培養物から分離して、ＳＥＱ ＩＤ NO：１
から選んだcＤＮＡ断片でプローブした。Pancreatic islet cells were cultured in the presence of varying concentrations of glucose ranging from 0-20 mM. RNA was then isolated from various cultures of islet cells and SEQ ID NO: 1
It was probed with a cDNA fragment selected from.

【０１０９】その結果は、グルコース濃度が高い場合
（つまり、20mM程度）、ＩＴＦ−１ＲＮＡの量に対して
かなり高いレベルのＩＴＦ−１ ＲＮＡが検出された。
したがって、本発明による膵臓転写因子の内発性発現は
グルコースの濃度に対応した反応性を示す。As a result, when the glucose concentration was high (that is, about 20 mM), a considerably high level of ITF-1 RNA was detected with respect to the amount of ITF-1 RNA.
Therefore, the endogenous expression of the pancreatic transcription factor according to the present invention shows reactivity corresponding to the concentration of glucose.

【０１１０】いくつかの好ましい実施例を参照にしつ
つ、上に本発明について説明してきたが、本明細書およ
び特許請求の範囲に述べられている本発明の精神と範囲
を逸脱せずに修正、変更が可能なことは分かるであろ
う。While the present invention has been described above with reference to some preferred embodiments, modifications have been made without departing from the spirit and scope of the invention as set forth in the specification and claims. It will be appreciated that changes are possible.

【０１１１】[0111]

【発明の効果】本発明にの新しいホメオボックス−タイ
プの転写因子蛋白質は、インビボとインビトロの両方で
のホルモン遺伝子の調節に有益な役割を果たす。加え
て、これらの蛋白質、あるいはそれらの断片は、抗転写
因子抗体をつくりだす免疫源としても有益である。INDUSTRIAL APPLICABILITY The novel homeobox-type transcription factor protein of the present invention plays a beneficial role in the regulation of hormone genes both in vivo and in vitro. In addition, these proteins, or their fragments, are also useful as immunogens to generate anti-transcription factor antibodies.

【０１１２】本発明の膵臓島転写因子蛋白質をコードす
る分離された核酸分子は任意のサンプル内での膵臓島転
写因子遺伝子またはmＲＮＡトランスクリプトが存在し
ているかどうか、そして、存在している場合の量に関す
るアッセイのプローブとしても有用である。上に述べた
核酸分子、およびそれらの断片は、膵臓島転写因子をコ
ードする遺伝子の増強のためのＰＣＲ反応におけるプラ
イマーおよび／またはテンプレートとしても有用であ
る。An isolated nucleic acid molecule encoding a pancreatic islet transcription factor protein of the present invention can be used to determine whether and in the presence of the pancreatic islet transcription factor gene or mRNA transcript in any sample. It is also useful as a probe in a quantitative assay. The nucleic acid molecules described above, and fragments thereof, are also useful as primers and / or templates in PCR reactions for the enhancement of genes encoding pancreatic islet transcription factors.

【０１１３】本発明による膵臓島ホルモン転写因子蛋白
質と免疫反応性のある抗体は任意のサンプル、例えば組
織サンプルやウェスターンブロットなどに存在する膵臓
島転写因子蛋白質のレベルを判定するための診断アッセ
イにおいて有用である。これらの抗体は、膵臓島転写因
子蛋白質を生成するためにも用いることができる。Antibodies immunoreactive with the pancreatic islet hormone transcription factor protein according to the present invention may be used in diagnostic assays to determine the level of pancreatic islet transcription factor protein present in any sample, such as tissue samples or Western blots. It is useful. These antibodies can also be used to produce pancreatic islet transcription factor protein.

【０１１４】 SEQUENCE LISTING <110> Resarch Development Foundation <120> A novel homeobox factor which stimulates insulin expression in pan creatic islet cells <130> SFP-454 <160> 9 <210> 1 <211> 1614 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <221> CDS <222> 331..1182 <223> ITF-1 Homeobox-type transcription facter <400> 1 CAATTCCACG CGGCTGGTGG TGATAGGAGC CATGTTTTCT GCGTGCTCTG TCCGAGGTGC 60 TGAAAGAACT CCAGGCAGAT TCACCTGGAA GGACCCTGAA ACAAGGCTTC CAGGGGAAAC 120 ACGGGGGATC CGGGGACCGG CAGCGGCAGC GGGAGGGGCT GGAGGAAGGT CCGCGCTCTC 180 TATCAGCAAT GTGCCACCCT GCCCAGAGCA GTGGAGAACT GTCAAAGCGA TCTGGGGTGC 240 CGCTGAGAGT CCGTGAGCTC CCCAGCGCCT TAAGGCCTGG CTTGTAGCTC CCTACCCCGG 300 GCTGCCGGCC CCGAAGTGCC GGCTGCCACC ATG AAT AGT GAG GAG CAG TAC TAC 354 Met Asn Ser Glu Glu Gln Tyr Tyr 1 5 GCG GCC ACA CAG CTC TAC AAG GAC CCG TGC GCA TTC CAG AGG GGT CCG 402 Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro 10 15 20 GTG CCA GAG TTC AGT GCT AAT CCC CCT GCG TGC CTG TAC ATG GGC CGC 450 Val Pro Glu Phe Ser Ala Asn Pro Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg 25 30 35 40 CAG CCC CCA CCT CCG CCG CCA CCC CAG TTT GCA GGC TCG CTG GGA ACC 498 Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Phe Ala Gly Ser Leu Gly Thr 45 50 55 CTG GAA CAG GGA AGT CCC CCG GAC ATC TCC CCA TAC GAA GTG CCC CCG 546 Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro 60 65 70 CTC GCC GAT GAC CCG GCT GGC GCG CAC CTC CAC CAC CAC CTC CCA GCT 594 Leu Ala Asp Asp Pro Ala Cly Ala His Leu His His His Leu Pro Ala 75 80 85 CAG CTC GGG CTC GCC CAT CCA CCT CCC GGA CCT TTC CCG AAT GGA ACC 642 Gln Leu Gly Leu Ala His Pro Pro Pro Gly Pro Phe Pro Asn Gly Thr 90 95 100 GAG ACT GGG GGC CTG GAA GAG CCC AGC CGC GTT CAT CTC CCT TTC CCG 690 Glu Thr Gly Gly Leu Glu Glu Pro Ser Arg Val His Leu Pro Phe Pro 105 110 115 120 TGG ATG AAA TCC ACC AAA GCT CAC GCG TGG AAA AGC CAG TGG GCA GGA 738 Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Trp Lys Ser Gln Trp Ala Gly 125 130 135 GGT GCA TAC GCA GCA GAA CCG GAG GAG AAT AAG AGG ACC CGT ACA GCC 786 Gly Ala Tyr Ala Ala Glu Pro Glu Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala 140 145 150 TAC ACT CGG GCC CAG CTG CTG GAG CTG GAG AAG GAA TTC TTA TTT AAC 834 Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn 155 160 165 AAA TAC ATC TCC CGG CCT CGC CGG GTG GAG CTG GCA GTG ATC CTC AAC 882 Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg Arg Val Glu Leu Ala Val Met Leu Asn 170 175 180 TTG ACT GAG AGA CAC ATC AAA ATC TGG TTC CAA AAC CGT CGC ATG AAG 930 Leu Thr Glu Arg His Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys 185 190 195 200 TGG AAG AAA GAG GAA GAT AAG AAA CGT AGT AGC GGG ACA ACG AGC GGG 978 Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys Arg Ser Ser Gly Thr Thr Ser Gly 205 210 215 GGC GGT GGG GGC GAA GAG CCG GAG CAG GAT TGT GCC GTA ACC TCG GGC 1026 Gly Gly Gly Gly Glu Glu Pro Glu Gln Asp Cys Ala Val Thr Ser Gly 220 225 230 GAG GAG CTG CTG GCA TTG CCA CCG CCA CCA CCT CCC GGA GGT GCT GTG 1074 Glu Glu Leu Leu Ala Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Gly Ala Val 235 240 245 CCC TCA GGC GTC CCT GCT GCT GCC CGG GAG GGC CGA CTG CCT TCC GGC 1122 Pro Ser Gly Val Pro ALa Ala Ala Arg Glu Gly Arg Leu Pro Ser Gly 250 255 260 CTT AGT GCG TCC CCA CAG CCC TCC AGC ATC GCG CCA CTG CGA CCG CAG 1170 Leu Ser Ala Ser Pro Gln Pro Ser Ser Ile Ala Pro Leu Arg Pro Gln 265 270 275 280 GAA CCC CGG TGAGGACCGC AGGCTGAGGG TGAGCGGGTC TGGGACCCAG 1219 Glu Pro Arg AGTGCGGACA TGGGCATGGG CCCGGGCAGC TGGATAAGGG AGGGGATCAT GAGGCTTAAC 1279 CTAAACGCCA CACAAGGAGA ACATTCTTCT TGGGGGCACA AGAGCCAGTT GGGTATAGCC 1339 AGCGAGATGC TGGCAGACCT CTGGCAAAAA AAAAGACCCG AGCTTCTGAA AACTTTGAGG 1399 CTGCCTCTCG TGCCATGTGA ACCGCCAGGT CTGCCTCTGG GACTCTTTCC TGGGACCAAT 1459 TTAGAGAATC AGGCTCCCAA CTGAGGACAA TGAAAAGGTT ACAAACTTGA GCGGTCCCAT 1519 AACAGCCACC AGGCGAGCTG GACCGGGTGC CTTTGACTGG TCGGCCGAGC AATCTAAGGT 1579 TGAGAATAAA GGGAGCTGTT TGAGGTTTCG TTTTT 1614 <210> 2 <211> 2834 <212> PRT <213> Artifical Sequence <220> <223> ITF-1 Homeobox-type transcription facter <400> 2 Met Asn Ser Glu Glu Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp 1 5 10 15 Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro Val Pro Glu Phe Ser Ala Asn Pro 20 25 30 Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 35 40 45 Gln Phe Ala Gly Ser Leu Gly Thr Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp 50 55 60 Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro Leu Ala Asp Asp Pro Ala Gly Ala 65 70 75 80 His Leu His His His Leu Pro Ala Gln Leu Gly Leu Ala His Pro Pro 85 90 95 Pro Gly Pro Phe Pro Asn Gly Thr Glu Thr Gly Gly Leu Glu Glu Pro 100 105 110 Ser Arg Val His Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala His 115 120 125 Ala Trp Lys Ser Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Ala Ala Glu Pro Glu 130 135 140 Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu Glu 145 150 155 160 Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg Arg 165 170 175 Val Glu Leu Ala Val Met Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys Ile 180 185 190 Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys 195 200 205 Agr Ser Ser Gly Thr Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Pro Glu 210 215 220 Gln Asp Cys Ala Val Thr Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Leu Pro Pro 225 230 235 240 Pro Pro Pro Pro Gly Gly Ala Val Pro Ser Gly Val Pro Ala Ala Ala 245 250 255 Arg Glu Gly Arg Leu Pro Ser Gly Leu Ser Ala Ser Pro Gln Pro Ser 260 265 270 Ser Ile Ala Pro Leu Arg Pro Gln Glu Pro Arg 275 280 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Rattus <220> <221> promoter <222> 1..19 <223> Somatostantin TSE-I region <400> 3 TTGCGAGGCT AATGGTGCG 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Rattus <220> <221> promoter <222> 1..22 <223> Somatostantin TSE-II region <400> 4 GATCTCAGTA ATAATCATGC AG 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Rattus <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 GGCGGATCCC TNRARARRGA RTWC 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Rattus <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 GGCGGATCCC KRTTYTGRAA CCA 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Rattus <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 GATCTCAGGC CGGCCGCATG CAC 23 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Rattus <220> <221> promoter <222> 1..19 <223> Rat Insulin-I P-Box region <400> 8 CTTAATGGGC CAAACGGCA 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Rattus <220> <221> promoter <222> 1..18 <223> Rat Insulin-I E2 region <400> 9 TTAATAATCT AATTACC 18 [0114]   SEQUENCE LISTING <110> Resarch Development Foundation <120> A novel homeobox factor which stimulates insulin expression in pan creatic islet cells <130> SFP-454 <160> 9 <210> 1 <211> 1614 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <221> CDS <222> 331..1182 <223> ITF-1 Homeobox-type transcription facter <400> 1 CAATTCCACG CGGCTGGTGG TGATAGGAGC CATGTTTTCT GCGTGCTCTG TCCGAGGTGC 60 TGAAAGAACT CCAGGCAGAT TCACCTGGAA GGACCCTGAA ACAAGGCTTC CAGGGGAAAC 120 ACGGGGGATC CGGGGACCGG CAGCGGCAGC GGGAGGGGCT GGAGGAAGGT CCGCGCTCTC 180 TATCAGCAAT GTGCCACCCT GCCCAGAGCA GTGGAGAACT GTCAAAGCGA TCTGGGGTGC 240 CGCTGAGAGT CCGTGAGCTC CCCAGCGCCT TAAGGCCTGG CTTGTAGCTC CCTACCCCGG 300 GCTGCCGGCC CCGAAGTGCC GGCTGCCACC ATG AAT AGT GAG GAG CAG TAC TAC 354                                  Met Asn Ser Glu Glu Gln Tyr Tyr                                    1 5 GCG GCC ACA CAG CTC TAC AAG GAC CCG TGC GCA TTC CAG AGG GGT CCG 402 Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro      10 15 20 GTG CCA GAG TTC AGT GCT AAT CCC CCT GCG TGC CTG TAC ATG GGC CGC 450 Val Pro Glu Phe Ser Ala Asn Pro Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg  25 30 35 40 CAG CCC CCA CCT CCG CCG CCA CCC CAG TTT GCA GGC TCG CTG GGA ACC 498 Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Phe Ala Gly Ser Leu Gly Thr                  45 50 55 CTG GAA CAG GGA AGT CCC CCG GAC ATC TCC CCA TAC GAA GTG CCC CCG 546 Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro              60 65 70 CTC GCC GAT GAC CCG GCT GGC GCG CAC CTC CAC CAC CAC CTC CCA GCT 594 Leu Ala Asp Asp Pro Ala Cly Ala His Leu His His His Leu Pro Ala          75 80 85 CAG CTC GGG CTC GCC CAT CCA CCT CCC GGA CCT TTC CCG AAT GGA ACC 642 Gln Leu Gly Leu Ala His Pro Pro Pro Gly Pro Phe Pro Asn Gly Thr      90 95 100 GAG ACT GGG GGC CTG GAA GAG CCC AGC CGC GTT CAT CTC CCT TTC CCG 690 Glu Thr Gly Gly Leu Glu Glu Pro Ser Arg Val His Leu Pro Phe Pro 105 110 115 120 TGG ATG AAA TCC ACC AAA GCT CAC GCG TGG AAA AGC CAG TGG GCA GGA 738 Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala His Ala Trp Lys Ser Gln Trp Ala Gly                 125 130 135 GGT GCA TAC GCA GCA GAA CCG GAG GAG AAT AAG AGG ACC CGT ACA GCC 786 Gly Ala Tyr Ala Ala Glu Pro Glu Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala             140 145 150 TAC ACT CGG GCC CAG CTG CTG GAG CTG GAG AAG GAA TTC TTA TTT AAC 834 Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn         155 160 165 AAA TAC ATC TCC CGG CCT CGC CGG GTG GAG CTG GCA GTG ATC CTC AAC 882 Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg Arg Val Glu Leu Ala Val Met Leu Asn     170 175 180 TTG ACT GAG AGA CAC ATC AAA ATC TGG TTC CAA AAC CGT CGC ATG AAG 930 Leu Thr Glu Arg His Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys 185 190 195 200 TGG AAG AAA GAG GAA GAT AAG AAA CGT AGT AGC GGG ACA ACG AGC GGG 978 Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys Arg Ser Ser Gly Thr Thr Ser Gly                 205 210 215 GGC GGT GGG GGC GAA GAG CCG GAG CAG GAT TGT GCC GTA ACC TCG GGC 1026 Gly Gly Gly Gly Glu Glu Pro Glu Gln Asp Cys Ala Val Thr Ser Gly             220 225 230 GAG GAG CTG CTG GCA TTG CCA CCG CCA CCA CCT CCC GGA GGT GCT GTG 1074 Glu Glu Leu Leu Ala Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Gly Ala Val         235 240 245 CCC TCA GGC GTC CCT GCT GCT GCC CGG GAG GGC CGA CTG CCT TCC GGC 1122 Pro Ser Gly Val Pro ALa Ala Ala Arg Glu Gly Arg Leu Pro Ser Gly     250 255 260 CTT AGT GCG TCC CCA CAG CCC TCC AGC ATC GCG CCA CTG CGA CCG CAG 1170 Leu Ser Ala Ser Pro Gln Pro Ser Ser Ile Ala Pro Leu Arg Pro Gln 265 270 275 280 GAA CCC CGG TGAGGACCGC AGGCTGAGGG TGAGCGGGTC TGGGACCCAG 1219 Glu Pro Arg AGTGCGGACA TGGGCATGGG CCCGGGCAGC TGGATAAGGG AGGGGATCAT GAGGCTTAAC 1279 CTAAACGCCA CACAAGGAGA ACATTCTTCT TGGGGGCACA AGAGCCAGTT GGGTATAGCC 1339 AGCGAGATGC TGGCAGACCT CTGGCAAAAA AAAAGACCCG AGCTTCTGAA AACTTTGAGG 1399 CTGCCTCTCG TGCCATGTGA ACCGCCAGGT CTGCCTCTGG GACTCTTTCC TGGGACCAAT 1459 TTAGAGAATC AGGCTCCCAA CTGAGGACAA TGAAAAGGTT ACAAACTTGA GCGGTCCCAT 1519 AACAGCCACC AGGCGAGCTG GACCGGGTGC CTTTGACTGG TCGGCCGAGC AATCTAAGGT 1579 TGAGAATAAA GGGAGCTGTT TGAGGTTTCG TTTTT 1614 <210> 2 <211> 2834 <212> PRT <213> Artifical Sequence <220> <223> ITF-1 Homeobox-type transcription facter <400> 2 Met Asn Ser Glu Glu Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp   1 5 10 15 Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro Val Pro Glu Phe Ser Ala Asn Pro              20 25 30 Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro          35 40 45 Gln Phe Ala Gly Ser Leu Gly Thr Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp      50 55 60 Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro Leu Ala Asp Asp Pro Ala Gly Ala  65 70 75 80 His Leu His His His Leu Pro Ala Gln Leu Gly Leu Ala His Pro Pro                  85 90 95 Pro Gly Pro Phe Pro Asn Gly Thr Glu Thr Gly Gly Leu Glu Glu Pro             100 105 110 Ser Arg Val His Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala His         115 120 125 Ala Trp Lys Ser Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Ala Ala Glu Pro Glu     130 135 140 Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu Glu 145 150 155 160 Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg Arg                 165 170 175 Val Glu Leu Ala Val Met Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys Ile             180 185 190 Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys         195 200 205 Agr Ser Ser Gly Thr Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Pro Glu     210 215 220 Gln Asp Cys Ala Val Thr Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Leu Pro Pro 225 230 235 240 Pro Pro Pro Gly Gly Ala Val Pro Ser Gly Val Pro Ala Ala Ala                 245 250 255 Arg Glu Gly Arg Leu Pro Ser Gly Leu Ser Ala Ser Pro Gln Pro Ser             260 265 270 Ser Ile Ala Pro Leu Arg Pro Gln Glu Pro Arg         275 280 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Rattus <220> <221> promoter <222> 1..19 <223> Somatostantin TSE-I region <400> 3 TTGCGAGGCT AATGGTGCG 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Rattus <220> <221> promoter <222> 1..22 <223> Somatostantin TSE-II region <400> 4 GATCTCAGTA ATAATCATGC AG 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Rattus <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 GGCGGATCCC TNRARARRGA RTWC 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Rattus <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 GGCGGATCCC KRTTYTGRAA CCA 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Rattus <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 GATCTCAGGC CGGCCGCATG CAC 23 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Rattus <220> <221> promoter <222> 1..19 <223> Rat Insulin-I P-Box region <400> 8 CTTAATGGGC CAAACGGCA 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Rattus <220> <221> promoter <222> 1..18 <223> Rat Insulin-I E2 region <400> 9 TTAATAATCT AATTACC 18

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 モントミニィ，マーク，アー. アメリカ合衆国 92024 キャリフォーニ ア，エンシニタス，クエイル ガードン コート 1002 (72)発明者 レナド，ジェイムズ エヌ. アメリカ合衆国 92111 キャリフォーニ ア，サン ディエイゴウ，タングルウッド アヴァニュー 6653 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA06 HA17 4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA91Y AB01 BA01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 DB33 MA01 ZC032 ZC352 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZC03 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA42 EA27 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) C07K 14/47 C12N 1/15 4H045 16/18 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21 / 02 C 1/21 21/08 5/10 C12N 15/00 A C12P 21/02 5/00 A // C12P 21/08 A61K 37/02 (72) Inventor Montminy, Mark, A. United States 92024 Californi A, Encinitas, Quail Gardon Coat 1002 (72) Inventor Lenad, James N. United States 92111 California, San Diego, Tanglewood Avenue 6653 F Term (reference) 4B024 AA01 BA80 CA04 DA06 HA17 4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26 AA91Y AB01 BA01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 DB33 MA01 ZC032 ZC352 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZC03 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA42 EA27 FA74

Claims (20)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 (a) ＳＥＱ ＩＤ NO：２に示されて
いるアミノ酸配列をコードする核酸、 (b) ＳＥＱ ＩＤ NO：１に示された核酸と相補的な
核酸に高厳格なハイブリダイゼーションの条件でハイブ
リダイズする核酸、及び、 (c) 上記(ａ)または(ｂ)の核酸に対する縮重した核
酸、で構成された群から選択される、哺乳類インシュリ
ン転写因子蛋白質をコードする分離された核酸、または
その断片。1. A nucleic acid encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, (b) a highly stringent hybridization of a nucleic acid complementary to the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 1. An isolated nucleic acid encoding a mammalian insulin transcription factor protein selected from the group consisting of a nucleic acid that hybridizes under conditions, and (c) a nucleic acid degenerate with respect to the nucleic acid of (a) or (b) above , Or a fragment thereof. 【請求項２】 核酸のヌクレオチド配列が、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ NO：１に示されたヌクレオチド331-1182を含むもの
である請求項１記載の核酸。2. The nucleotide sequence of the nucleic acid is SEQ I
The nucleic acid according to claim 1, which comprises the nucleotides 331-1182 shown in D NO: 1. 【請求項３】 核酸がｃＤＮＡである請求項１記載の核
酸。3. The nucleic acid according to claim 1, wherein the nucleic acid is cDNA. 【請求項４】 請求項１記載の核酸を含むベクター。4. A vector containing the nucleic acid according to claim 1. 【請求項５】 請求項４記載のベクターでトランスフェ
クション、又は、形質転換された宿主細胞。5. A host cell transfected or transformed with the vector according to claim 4. 【請求項６】 請求項１記載の核酸でトランスフェクシ
ョン、又は、形質転換された宿主細胞。6. A host cell transfected or transformed with the nucleic acid of claim 1. 【請求項７】 ホメオボックス−タイプの膵臓島ホルモ
ン転写因子を発現する方法であって、該方法が請求項６
記載の細胞を該転写因子の発現に適した条件の下で培養
するステップを含む方法。7. A method of expressing a homeobox-type pancreatic islet hormone transcription factor, the method comprising:
A method comprising culturing the cells described under conditions suitable for expression of said transcription factor. 【請求項８】 ホメオボックス−タイプの膵臓島ホルモ
ン転写因子を発現する方法であって、該方法が請求項６
記載の細胞を該転写因子の発現に適した条件の下で培養
し、該転写因子を回収するステップを含む方法。8. A method of expressing a homeobox-type pancreatic islet hormone transcription factor, the method comprising:
A method comprising culturing the cells described under conditions suitable for expression of the transcription factor, and recovering the transcription factor. 【請求項９】 請求項４記載のベクターを含む製薬組成
物であって、該ベクターが生物学的に活性なインシュリ
ン遺伝子の発現を誘発する組成物。9. A pharmaceutical composition comprising the vector according to claim 4, wherein the vector induces the expression of a biologically active insulin gene. 【請求項１０】 請求項１記載の核酸によってコードさ
れる、分離されたホメオボックス−タイプ転写因子蛋白
質。10. An isolated homeobox-type transcription factor protein encoded by the nucleic acid of claim 1. 【請求項１１】 インシュリン、グルカゴン、およびソ
マトスタチンで構成された群から選択されたホルモン遺
伝子の発現を誘発する蛋白質である請求項10記載の蛋白
質。11. The protein according to claim 10, which is a protein that induces the expression of a hormone gene selected from the group consisting of insulin, glucagon, and somatostatin. 【請求項１２】 該蛋白質がＳＥＱ ＩＤ NO：３，Ｓ
ＥＱ ＩＤ NO：４，ＳＥＱ ＩＤ NO：８及びＳＥＱ
ＩＤ NO：９で構成された群から選択される核酸配列
を有する組織特異性プロモータ要素（ＴＳＥ）と結合す
る請求項10記載の転写因子蛋白質。12. The protein is SEQ ID NO: 3, S
EQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8 and SEQ
The transcription factor protein according to claim 10, which binds to a tissue-specific promoter element (TSE) having a nucleic acid sequence selected from the group consisting of ID NO: 9. 【請求項１３】 該転写因子蛋白質が細胞外のグルコー
ス濃度の変動に反応を示す請求項10記載の転写因子蛋白
質。13. The transcription factor protein according to claim 10, wherein the transcription factor protein responds to changes in extracellular glucose concentration. 【請求項１４】 請求項10記載の転写因子蛋白質に対し
て発生する分離された抗体。14. An isolated antibody raised against the transcription factor protein of claim 10. 【請求項１５】 該抗体がモノクローナル抗体である請
求項14記載の抗体。15. The antibody according to claim 14, wherein the antibody is a monoclonal antibody. 【請求項１６】 内分泌性膵臓島ホルモン遺伝子の天然
のプロモータからの転写をインビトロで制御する方法で
あって、グルコースの存在下で、該プロモータを請求項
10記載の転写因子蛋白質と接触させるステップを含む方
法。16. A method for controlling the transcription of an endocrine pancreatic islet hormone gene from a natural promoter in vitro, said promoter being present in the presence of glucose.
11. A method comprising contacting with a transcription factor protein according to 10. 【請求項１７】 該転写因子蛋白質がＳＥＱ ＩＤ N
O：１のヌクレオチド331−1182によってコードされる請
求項16記載の方法。17. The transcription factor protein is SEQ ID N.
17. The method of claim 16 encoded by nucleotides 331-1182 of O: 1. 【請求項１８】 請求項10記載の転写因子蛋白質を含む
製薬組成物であって、哺乳動物においてグルコースの存
在下でインシュリンレベルの調節を行う組成物。18. A pharmaceutical composition comprising the transcription factor protein according to claim 10, wherein insulin level is regulated in the presence of glucose in a mammal. 【請求項１９】 転写因子蛋白質がＳＥＱ ＩＤ NO：
１のヌクレオチド331−1182によってコードされるもの
である請求項18記載の製薬組成物。19. The transcription factor protein is SEQ ID NO:
19. The pharmaceutical composition according to claim 18, which is encoded by nucleotides 331-1182 of 1. 【請求項２０】 ＳＥＱ ＩＤ NO：１の少なくとも５
０個の連続したヌクレオチドを含む分離された核酸プロ
ーブ。20. At least 5 of SEQ ID NO: 1
An isolated nucleic acid probe containing 0 consecutive nucleotides.