JP2003075437A - 近赤外分光分析法による細胞アポトーシス誘導によるdnaの断片化の検出方法 - Google Patents
近赤外分光分析法による細胞アポトーシス誘導によるdnaの断片化の検出方法Info
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- JP2003075437A JP2003075437A JP2001266741A JP2001266741A JP2003075437A JP 2003075437 A JP2003075437 A JP 2003075437A JP 2001266741 A JP2001266741 A JP 2001266741A JP 2001266741 A JP2001266741 A JP 2001266741A JP 2003075437 A JP2003075437 A JP 2003075437A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 近赤外光分光分析法による細胞アポトーシス
誘導によるDNAの断片化の検出方法を提供すること。 【解決手段】 DNAからなる試料に800〜2500
nm波長の近赤外光を照射する工程と、試料からの反射
光又は透過光を受光して近赤外光領域に含まれる波長に
対する強度をセンサよって検出し、吸光度スぺクトルを
計測する工程と、吸光度スぺクトルのうち1乃至複数の
特定波長の吸光度スぺクトルを解析して試料中の細胞ア
ポトーシス誘導によるDNAの断片化の濃度を計測する
工程とによって、細胞アポトーシス誘導によるDNAの
断片化を検出する。
誘導によるDNAの断片化の検出方法を提供すること。 【解決手段】 DNAからなる試料に800〜2500
nm波長の近赤外光を照射する工程と、試料からの反射
光又は透過光を受光して近赤外光領域に含まれる波長に
対する強度をセンサよって検出し、吸光度スぺクトルを
計測する工程と、吸光度スぺクトルのうち1乃至複数の
特定波長の吸光度スぺクトルを解析して試料中の細胞ア
ポトーシス誘導によるDNAの断片化の濃度を計測する
工程とによって、細胞アポトーシス誘導によるDNAの
断片化を検出する。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】この発明は、近赤外分光分析
法による細胞アポトーシス誘導によるDNAの断片化の
検出方法に関する。
法による細胞アポトーシス誘導によるDNAの断片化の
検出方法に関する。
【0002】
【従来の技術】可視域に隣接する近赤外領域の光を用い
て物質の定量、定性分析を行う近赤外分光分析法は、近
年、農業分野をはじめ医療分野等の様々な分野で利用さ
れている(岩元睦夫、河野澄夫、魚住純「近赤外分光法
入門」幸書房、1994年9月10日初版発行)。近赤
外分光分析法は、 1)エネルギーの低い電磁波を用いるので試料を損傷す
ることがない。 2)固体、粉体、繊維、液体、気体など様々な状態の試
料に適用することができる。 3)赤外にくらべ近赤外では水の吸収強度が弱くなるの
で、水溶液あるいは含水系での分析ができる。 4)紫外光や可視光にくらべ近赤外光は、厚い組織をも
透過することができる。などの利点を有する。
て物質の定量、定性分析を行う近赤外分光分析法は、近
年、農業分野をはじめ医療分野等の様々な分野で利用さ
れている(岩元睦夫、河野澄夫、魚住純「近赤外分光法
入門」幸書房、1994年9月10日初版発行)。近赤
外分光分析法は、 1)エネルギーの低い電磁波を用いるので試料を損傷す
ることがない。 2)固体、粉体、繊維、液体、気体など様々な状態の試
料に適用することができる。 3)赤外にくらべ近赤外では水の吸収強度が弱くなるの
で、水溶液あるいは含水系での分析ができる。 4)紫外光や可視光にくらべ近赤外光は、厚い組織をも
透過することができる。などの利点を有する。
【0003】近赤外分光分析はその定量、定性分析を行
うためにいわゆるケモメトリクスと呼ばれる手法を用い
る。これは多変量解析手法や統計解析手法を用いて化学
分析を行う手法で、近年、パーソナルコンピュータの発
達とともに発展してきた。最近の近赤外分光分析では回
帰分析あるいはPLS回帰分析といった多変量解析手法
を用いて行われている。また、ニューラルネットワーク
やカオス理論等の解析への応用も試みられている。
うためにいわゆるケモメトリクスと呼ばれる手法を用い
る。これは多変量解析手法や統計解析手法を用いて化学
分析を行う手法で、近年、パーソナルコンピュータの発
達とともに発展してきた。最近の近赤外分光分析では回
帰分析あるいはPLS回帰分析といった多変量解析手法
を用いて行われている。また、ニューラルネットワーク
やカオス理論等の解析への応用も試みられている。
【0004】定量分析を行う場合、たとえば、PLS(P
anial Least Square)回帰分析と呼ばれる手法を用い
る。前記回帰分析は、予め本従来例の分析装置を用いて
既知濃度の試料の吸収スペクトルを測定する実験より検
量線を作成することにより行われる。前記検量線は、濃
度既知の複数試科から測定した吸光スペクトルを説明変
量とし、試料中成分の濃度を目的変数として回帰分析す
ることにより求める。
anial Least Square)回帰分析と呼ばれる手法を用い
る。前記回帰分析は、予め本従来例の分析装置を用いて
既知濃度の試料の吸収スペクトルを測定する実験より検
量線を作成することにより行われる。前記検量線は、濃
度既知の複数試科から測定した吸光スペクトルを説明変
量とし、試料中成分の濃度を目的変数として回帰分析す
ることにより求める。
【0005】上記のような優れた特性を有する近赤外分
光分析法は、臨床医学の分野で注目を集め、細胞の分
析、検出やモニタリング等に適用されている。
光分析法は、臨床医学の分野で注目を集め、細胞の分
析、検出やモニタリング等に適用されている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本願発明の目的は、近
赤外分光分析法(NIR法)を用いてDNAの挙動解析
を行った例がないことに着目して、形態学的に変化した
細胞や病的な状態であるアポトーシス細胞の検出、特に
近赤外分光分析法による細胞アポトーシス誘導によるD
NAの断片化の検出方法を提供することである。
赤外分光分析法(NIR法)を用いてDNAの挙動解析
を行った例がないことに着目して、形態学的に変化した
細胞や病的な状態であるアポトーシス細胞の検出、特に
近赤外分光分析法による細胞アポトーシス誘導によるD
NAの断片化の検出方法を提供することである。
【0007】
【課題を解決するための手段】本願発明は、DNAを含
む試料に800〜2500nm波長の近赤外光を照射す
る工程、前記試料からの反射光又は透過光を受光して近
赤外光領域に含まれる波長に対する強度をセンサよって
検出し、吸光度スぺクトルを計測する工程、前記吸光度
スぺクトルのうち1乃至複数の特定波長の吸光度スぺク
トルを解析して前記試料中の細胞アポトーシス誘導によ
るDNAの断片化を検出する工程、とからなることを特
徴とする近赤外分光分析法による細胞アポトーシス誘導
によるDNAの断片化の検出方法である。前記特定波長
は、1405〜1425、1510〜1535、154
5〜1570、1600〜1625、1845〜186
0、1865〜1890nmである。
む試料に800〜2500nm波長の近赤外光を照射す
る工程、前記試料からの反射光又は透過光を受光して近
赤外光領域に含まれる波長に対する強度をセンサよって
検出し、吸光度スぺクトルを計測する工程、前記吸光度
スぺクトルのうち1乃至複数の特定波長の吸光度スぺク
トルを解析して前記試料中の細胞アポトーシス誘導によ
るDNAの断片化を検出する工程、とからなることを特
徴とする近赤外分光分析法による細胞アポトーシス誘導
によるDNAの断片化の検出方法である。前記特定波長
は、1405〜1425、1510〜1535、154
5〜1570、1600〜1625、1845〜186
0、1865〜1890nmである。
【0008】
【発明の実施の形態】図1は、本発明において使用する
近赤外分光分析装置の模式図を示すもので、1100〜
2500nmの波長の近赤外光を光源11からの光を順
次フィルタ12を通して、特定波長のみを通すように制
御装置15によりフィルタを切り替えて、2nmの分解
能で分光する。この分光された光を試料台13中の測定
すべき試料に照射する。
近赤外分光分析装置の模式図を示すもので、1100〜
2500nmの波長の近赤外光を光源11からの光を順
次フィルタ12を通して、特定波長のみを通すように制
御装置15によりフィルタを切り替えて、2nmの分解
能で分光する。この分光された光を試料台13中の測定
すべき試料に照射する。
【0009】試料から反射または透過してくる反射光又
は透過光をセンサ14(透過光センサ14a、反射光セ
ンサ14bからなる。)によって検出し、波長毎に吸光
度スぺクトルを計測する。
は透過光をセンサ14(透過光センサ14a、反射光セ
ンサ14bからなる。)によって検出し、波長毎に吸光
度スぺクトルを計測する。
【0010】試料の近赤外域における吸収バンドを調べ
る。近赤外分光装置は、BRAN+LUEBBR社製I
nfraAlyzer500を用い、近赤外吸収スぺク
トルの測定波長範囲は1100−2500nm、測定温
度25℃とし、この範囲を2nm間隔で走査測定する。
る。近赤外分光装置は、BRAN+LUEBBR社製I
nfraAlyzer500を用い、近赤外吸収スぺク
トルの測定波長範囲は1100−2500nm、測定温
度25℃とし、この範囲を2nm間隔で走査測定する。
【0011】以下に、細胞アポトーシスの検出方法の詳
細を説明する。
細を説明する。
【0012】先ず、細胞アポトーシスの誘導は、FBS
(Fetal Bovine Serum ウシ胎児血
清)を10%、ペニシリンを1%添加したRPMI M
ediumを用いて、ヒト乳ガン由来乳腺上皮細胞(M
CF−7)1×106個を37℃の温度条件下で、5%
CO2インキュベーター内で培養する。次いで、スタウ
ロスポリン(非特異的リン酸化阻害剤)の濃度が1μM
となるように処理し、6時間培養して細胞のアポトーシ
スを起こさせる。未処理のものをコントロールとした。
(Fetal Bovine Serum ウシ胎児血
清)を10%、ペニシリンを1%添加したRPMI M
ediumを用いて、ヒト乳ガン由来乳腺上皮細胞(M
CF−7)1×106個を37℃の温度条件下で、5%
CO2インキュベーター内で培養する。次いで、スタウ
ロスポリン(非特異的リン酸化阻害剤)の濃度が1μM
となるように処理し、6時間培養して細胞のアポトーシ
スを起こさせる。未処理のものをコントロールとした。
【0013】細胞のDNAの抽出には、和光純薬製「W
AKO DNA Extractor WB Kit」
(ヨウ化ナトリウム法)を使用した。
AKO DNA Extractor WB Kit」
(ヨウ化ナトリウム法)を使用した。
【0014】先ず、細胞をPBS(Phosphate
Buffered Salineリン酸緩衝液)で洗
浄後、マイクロチューブに回収する。マイクロチューブ
によって回収した細胞を3000G、5分間遠心し、上
清を除去する。
Buffered Salineリン酸緩衝液)で洗
浄後、マイクロチューブに回収する。マイクロチューブ
によって回収した細胞を3000G、5分間遠心し、上
清を除去する。
【0015】分離された細胞に溶解液1mlを加えて、
VORTEXによって攪拌する。更に、10000G、
1分間遠心し、上清を除去する。この操作を再度繰り返
す。
VORTEXによって攪拌する。更に、10000G、
1分間遠心し、上清を除去する。この操作を再度繰り返
す。
【0016】上記操作で得られたものを、酵素反応液2
00μlとタンパク分解酵素10μlを添加し、混合
し、37℃の温度で1時間保温し、ヨウ化ナトリウム溶
液を300μl加えて混合し、イソプロピルアルコール
を0.5μl加えて混合し、DNAを沈殿させる。
00μlとタンパク分解酵素10μlを添加し、混合
し、37℃の温度で1時間保温し、ヨウ化ナトリウム溶
液を300μl加えて混合し、イソプロピルアルコール
を0.5μl加えて混合し、DNAを沈殿させる。
【0017】上記操作で得られたDNAを含む液を10
000G、10分間遠心し、上清を除去し、洗浄液を1
ml加えて混合し、さらに10000G、5分間遠心
し、上清を除去し、洗浄液を1ml加えて混合した後、
更に、10000G、5分間遠心し、上清を除去し、乾
燥させて、DNAを5μg抽出する。
000G、10分間遠心し、上清を除去し、洗浄液を1
ml加えて混合し、さらに10000G、5分間遠心
し、上清を除去し、洗浄液を1ml加えて混合した後、
更に、10000G、5分間遠心し、上清を除去し、乾
燥させて、DNAを5μg抽出する。
【0018】抽出されたDNAの濃度の調整は、分光光
度計(BECKMAN社製 DU600)を用いて測定
し、DNA濃度をそれぞれ1.0μg/ml、0.1μ
g/ml、0.01μg/mlに調整し、それぞれの試
料について、検出を行った。本発明の近赤外分光法によ
れば、0.01μg/ml低濃度の濃度でも検出でき
た。
度計(BECKMAN社製 DU600)を用いて測定
し、DNA濃度をそれぞれ1.0μg/ml、0.1μ
g/ml、0.01μg/mlに調整し、それぞれの試
料について、検出を行った。本発明の近赤外分光法によ
れば、0.01μg/ml低濃度の濃度でも検出でき
た。
【0019】上記した細胞アポトーシスが誘導された試
料と、未処理の細胞であるコントロールとを赤外分光装
置にかけて、角波長毎の吸収スぺクトルを収集し、10
回ずつ測定した。また、両試料とも、DNA電気泳動法
によって、DNAの断片化を確認した。
料と、未処理の細胞であるコントロールとを赤外分光装
置にかけて、角波長毎の吸収スぺクトルを収集し、10
回ずつ測定した。また、両試料とも、DNA電気泳動法
によって、DNAの断片化を確認した。
【0020】図2は、2次微分スぺクトルの主成分分析
(PCA)の線図を示している。
(PCA)の線図を示している。
【0021】図3、図4は、その2次微分スぺクトルを
示す線図である。図3の下段の図3(b)は、波長範囲
1400nm〜1430nmの部分拡大図であって、特
に波長1410nmの領域では、アポトーシスを起こし
たDNAとコントロールDNAとの判別が有効であるこ
とを示している。図4の下段の図4(b)は、波長範囲
1870nm〜1890nmの部分拡大図であって、特
に波長1882nmの領域では、アポトーシスを起こし
たDNAとコントロールDNAとの判別が有効であるこ
とを示している。
示す線図である。図3の下段の図3(b)は、波長範囲
1400nm〜1430nmの部分拡大図であって、特
に波長1410nmの領域では、アポトーシスを起こし
たDNAとコントロールDNAとの判別が有効であるこ
とを示している。図4の下段の図4(b)は、波長範囲
1870nm〜1890nmの部分拡大図であって、特
に波長1882nmの領域では、アポトーシスを起こし
たDNAとコントロールDNAとの判別が有効であるこ
とを示している。
【0022】収集した吸光度スぺクトル2次微分変換し
たものについて、図2に示されているように、2次微分
による主成分分析をおこなった。いずれも、第1主成分
(Factor1)、第2主成分(Factor2)に
よってアポトーシスを起こしたDNAを検出することが
できた。
たものについて、図2に示されているように、2次微分
による主成分分析をおこなった。いずれも、第1主成分
(Factor1)、第2主成分(Factor2)に
よってアポトーシスを起こしたDNAを検出することが
できた。
【0023】2次微分変換したスぺクトルは、第1主成
分によって、検出することができた。第1主成分は、図
2(b)の相関スぺクトル線図から相関のある特徴的な
波長領域、1405〜1425、1510〜1535、
1545〜1570、1600〜1625、1845〜
1860、1865〜1890nmを抽出することがで
きた。これらの波長を重回帰分析を行うことによって、
アポトーシスを起こしたDNAとコントロールDNAと
を明確に検出することができる。
分によって、検出することができた。第1主成分は、図
2(b)の相関スぺクトル線図から相関のある特徴的な
波長領域、1405〜1425、1510〜1535、
1545〜1570、1600〜1625、1845〜
1860、1865〜1890nmを抽出することがで
きた。これらの波長を重回帰分析を行うことによって、
アポトーシスを起こしたDNAとコントロールDNAと
を明確に検出することができる。
【0024】図8は、2次微分スぺクトルに基づいてク
ラスタ分析をした樹状図である。細胞アポトーシスを起
こしたDNAサンプルA.1〜A.10と、コントロー
ルDNAサンプルC.1〜C.10は、類似値0.4に
着目すると、前者と後者とが二つのグループに明確に分
類されていることが分り、細胞アポトーシスを起こした
DNAサンプルを検出できることが分る。
ラスタ分析をした樹状図である。細胞アポトーシスを起
こしたDNAサンプルA.1〜A.10と、コントロー
ルDNAサンプルC.1〜C.10は、類似値0.4に
着目すると、前者と後者とが二つのグループに明確に分
類されていることが分り、細胞アポトーシスを起こした
DNAサンプルを検出できることが分る。
【0025】
【発明の効果】本発明によれば、
(1)抗ガン剤による細胞アポトーシスの測定
(2)環境汚染によるDNA損傷の測定
(3)遺伝子組み換え作物の検出
が可能となるという効果を有する。
【図1】本発明の、近赤外分光分析装置の模式図。
【図2】近赤外分光分析法により得られた2次微分スぺ
クトルの主成分分析の線図。
クトルの主成分分析の線図。
【図3】近赤外分光分析法により得られた細胞アポとシ
ース誘導したDNAとコントロールDNAののそれぞれ
の吸光度スぺクトルの2次微分スぺクトルと、その一部
を拡大した線図。
ース誘導したDNAとコントロールDNAののそれぞれ
の吸光度スぺクトルの2次微分スぺクトルと、その一部
を拡大した線図。
【図4】近赤外分光分析法により得られた細胞アポとシ
ース誘導したDNAとコントロールDNAののそれぞれ
の吸光度スぺクトルの2次微分スぺクトルと、その一部
を拡大した線図。
ース誘導したDNAとコントロールDNAののそれぞれ
の吸光度スぺクトルの2次微分スぺクトルと、その一部
を拡大した線図。
【図5】近赤外分光分析法により得られた細胞アポとシ
ース誘導したDNAとコントロールDNAののそれぞれ
の吸光度スぺクトルの2次微分スぺクトルをクラスタ分
析から得られた樹状図。
ース誘導したDNAとコントロールDNAののそれぞれ
の吸光度スぺクトルの2次微分スぺクトルをクラスタ分
析から得られた樹状図。
11 光源、12 フィルタ、13 試料台、14 セ
ンサ、15 制御装置
ンサ、15 制御装置
【手続補正書】
【提出日】平成13年9月4日(2001.9.4)
【手続補正1】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Fターム(参考) 2G045 DA12 DA13 FA11 FA25
2G059 AA05 BB12 DD16 EE01 EE02
EE12 FF12 GG10 HH01 HH06
JJ01 JJ03 MM01 MM02 PP04
4B063 QA01 QQ42 QX10
Claims (2)
- 【請求項1】 DNAからなる試料に800〜2500
nm波長の近赤外光を照射する工程、 前記試料からの反射光又は透過光を受光して近赤外光領
域に含まれる波長に対する強度をセンサよって検出し、
吸光度スぺクトルを計測する工程、 前記吸光度スぺクトルのうち1乃至複数の特定波長の吸
光度スぺクトルを解析して前記試料中の細胞アポトーシ
ス誘導によるDNAの断片化を検出する工程、 とからなることを特徴とする近赤外分光分析法による細
胞アポトーシス誘導によるDNAの断片化の検出方法。 - 【請求項2】 前記特定波長は、1405〜1425、
1510〜1535、1545〜1570、1600〜
1625、1845〜1860、1865〜1890n
mであることを特徴とする請求項1の近赤外分光分析法
による細胞アポトーシス誘導によるDNAの断片化の検
出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001266741A JP2003075437A (ja) | 2001-09-04 | 2001-09-04 | 近赤外分光分析法による細胞アポトーシス誘導によるdnaの断片化の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001266741A JP2003075437A (ja) | 2001-09-04 | 2001-09-04 | 近赤外分光分析法による細胞アポトーシス誘導によるdnaの断片化の検出方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003075437A true JP2003075437A (ja) | 2003-03-12 |
Family
ID=19092979
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001266741A Pending JP2003075437A (ja) | 2001-09-04 | 2001-09-04 | 近赤外分光分析法による細胞アポトーシス誘導によるdnaの断片化の検出方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2003075437A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1313624C (zh) * | 2004-06-15 | 2007-05-02 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种单细胞凋亡dna片段化检测用微流控芯片 |
CN100425976C (zh) * | 2005-03-21 | 2008-10-15 | 江苏省人民医院 | 快速原位鉴别周围神经束性质的方法 |
CN111471589A (zh) * | 2020-04-23 | 2020-07-31 | 华中科技大学 | 一种红外定量pcr核酸检测装置 |
-
2001
- 2001-09-04 JP JP2001266741A patent/JP2003075437A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1313624C (zh) * | 2004-06-15 | 2007-05-02 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种单细胞凋亡dna片段化检测用微流控芯片 |
CN100425976C (zh) * | 2005-03-21 | 2008-10-15 | 江苏省人民医院 | 快速原位鉴别周围神经束性质的方法 |
CN111471589A (zh) * | 2020-04-23 | 2020-07-31 | 华中科技大学 | 一种红外定量pcr核酸检测装置 |
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