JP2003064100A - Method for immobilizing protein on carrier, carrier with immobilized protein, and reagent for measuring specimen by using carrier with immobilized protein - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for expressing a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene while keeping the state of possessing the signal sequence, and immobilizing the protein having the signal sequence on a carrier, and further to provide the carrier having the protein expressed in the state of possessing the signal sequence in the base sequence of the gene immobilized by the method, and a reagent for measuring a specimen by using the carrier. SOLUTION: This method for immobilizing the protein is characterized in that the protein having the signal sequence in the base sequence of the gene is expressed while keeping the state of possessing the signal sequence, and the protein having the signal sequence is immobilized on the carrier. The carrier is obtained by immobilizing the protein having the signal sequence in the base sequence of the gene in the state of possessing the signal sequence. The reagent for measuring the specimen contains the carrier obtained by immobilizing the protein having the signal sequence in the base sequence of the gene in the state of possessing the signal sequence.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の塩基配列
中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を
有した状態で発現させ、このタンパク質を担体に固定化
する方法、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有する
タンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させたタ
ンパク質を固定化した担体、及び遺伝子の塩基配列中に
シグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有し
た状態で発現させたタンパク質を固定化した担体を用い
た被検物質の測定試薬に関する。本発明は、臨床検査、
免疫学、及び医学などの生命科学分野、分析化学などの
化学分野、食品衛生分野、並びに環境衛生分野等におい
て有用なものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for immobilizing a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene in a state of having the signal sequence and immobilizing the protein on a carrier, and a signal in the base sequence of the gene. A carrier on which a protein having a sequence was expressed in the state of having a signal sequence was immobilized, and a protein at which a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene was expressed was immobilized. The present invention relates to a reagent for measuring a test substance using a carrier. The present invention is a clinical test,
It is useful in the fields of life sciences such as immunology and medicine, chemistry such as analytical chemistry, food hygiene, and environmental hygiene.

【０００２】[0002]

【従来の技術】タンパク質の固定化方法には、共有結合
法及び架橋法等の化学的結合法、並びに物理的吸着法等
が知られている。これらの固定化方法のうち、共有結合
法は担体からのタンパク質の脱離が極めて少ないという
利点をもつが、担体に対するタンパク質の固定化量が比
較的少なく、固定化する際の化学反応によってタンパク
質が変性したり、タンパク質の生理学的活性の低下が起
こりやすい。また、架橋法は多量のタンパク質を必要と
する上効率が悪く、固定化する際にタンパク質の生理学
的活性の低下が起こりやすい。これに対して物理的吸着
法は、操作が簡便で短時間にタンパク質を担体に固定化
できることや、担体に対してタンパク質を均一に固定化
できること、担体に対するタンパク質の固定化量が比較
的多いことなどから、一般的に広く利用されている。2. Description of the Related Art As a protein immobilization method, a chemical bonding method such as a covalent bonding method and a crosslinking method, and a physical adsorption method are known. Among these immobilization methods, the covalent bond method has an advantage that the desorption of the protein from the carrier is extremely small. It is apt to be denatured or the physiological activity of the protein is decreased. Further, the cross-linking method requires a large amount of protein and is inefficient, so that the physiological activity of the protein is likely to decrease when immobilized. On the other hand, the physical adsorption method is simple in operation and capable of immobilizing the protein on the carrier in a short time, uniformly immobilizing the protein on the carrier, and relatively large amount of immobilizing the protein on the carrier. Therefore, it is widely used.

【０００３】一方、被検物質に対する特異的結合物質で
あるタンパク質を固定化した担体を使用して、試料中の
被検物質を測定する測定方法、又は測定試薬が繁用され
ている。例えば、抗原と抗体、糖とレクチン、ヌクレオ
チド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖、リガンドとレ
セプター等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利
用した試料中に含まれる微量の被検物質の測定方法及び
測定試薬は種々のものが知られている。これは、試料中
に含まれる被検物質と、この被検物質に対する特異的結
合物質との結合の有無、又は結合の量を測ることによ
り、試料中に含まれる被検物質の有無の測定〔定性測
定〕、又はその含有量（濃度）の測定〔定量測定〕を行
うものである。例えば、抗原と抗体の間の抗原抗体反応
（免疫反応、免疫学的反応）を利用した免疫学的測定方
法（免疫学的測定試薬）においては、ラテックス粒子を
担体として使用するラテックス比濁測定方法（測定試
薬）；ラテックス粒子、有機高分子粒子、無機粒子、金
属粒子、若しくは赤血球などを担体として使用する間接
凝集反応測定方法（測定試薬）；マイクロタイタープレ
ート、ビーズ、粒子、試験管、若しくは容器などを担体
として使用する酵素免疫測定法、発光免疫測定法などの
標識免疫測定法（測定試薬）；又は、セルロース、若し
くは不織布などを担体として使用するイムノクロマトグ
ラフィー法（測定試薬）等が繁用されている。これらの
測定方法又は測定試薬においては、多くの場合、被検物
質に対する特異的結合物質であるタンパク質が固定化さ
れた担体を使用する。しかしながら、担体への被検物質
に対する特異的結合物質であるタンパク質の固定化に物
理的吸着法を使用した場合、被検物質に対する特異的結
合物質であるタンパク質の種類によっては担体への固定
化が難しいものもあった。また、一度固定化したタンパ
ク質が脱離してしまうこともあった。そして、この被検
物質に対する特異的結合物質であるタンパク質の担体へ
の固定化が十分でないと、この固定化された担体を使用
して試料中の被検物質の測定を行う場合には、測定反応
の際に生成するシグナルの量が減少してしまうことによ
り測定の感度が低下してしまう恐れがあった。この場
合、被検物質を含む試料の測定においても、被検物質が
含まれていないという誤った測定結果（偽陰性）が得ら
れる可能性があり、特に臨床検査等においては患者など
の疾病の診断を誤らせる危険性を含むものであった。
（一定の測定感度が得られず正確な測定を行うことが困
難な場合もあった。）On the other hand, a measuring method or a measuring reagent for measuring a test substance in a sample by using a carrier on which a protein which is a specific binding substance for the test substance is immobilized is widely used. For example, a trace amount of a test substance contained in a sample using a reaction between substances having a specific affinity such as an antigen and an antibody, a sugar and a lectin, a nucleotide chain and a complementary nucleotide chain, a ligand and a receptor Various measuring methods and measuring reagents are known. This is a measurement of the presence or absence of the test substance contained in the sample by measuring the presence or absence of the binding between the test substance contained in the sample and the specific binding substance for this test substance, or the amount of binding. Qualitative measurement] or its content (concentration) measurement [quantitative measurement]. For example, in an immunological measuring method (immunological measuring reagent) utilizing an antigen-antibody reaction (immunological reaction, immunological reaction) between an antigen and an antibody, a latex turbidimetric measuring method using latex particles as a carrier. (Measurement reagent); Indirect agglutination measurement method using latex particles, organic polymer particles, inorganic particles, metal particles, or red blood cells as a carrier (measurement reagent); microtiter plate, beads, particles, test tube, or container Labeled immunoassays (measurement reagents) such as enzyme immunoassays and luminescence immunoassays that use as a carrier; or immunochromatography methods (measurement reagents) that use cellulose or non-woven fabric as a carrier are commonly used. ing. In most of these measuring methods or measuring reagents, a carrier on which a protein that is a specific binding substance for a test substance is immobilized is used. However, when the physical adsorption method is used to immobilize the protein, which is the specific binding substance for the test substance, to the carrier, depending on the type of the protein, which is the specific binding substance to the test substance, the immobilization to the carrier is not possible. Some were difficult. In addition, once immobilized proteins may be released. Then, if the immobilization of the protein, which is a substance that specifically binds to the test substance, to the carrier is not sufficient, when the test substance in the sample is measured using this immobilized carrier, the measurement is performed. There is a possibility that the sensitivity of the measurement may decrease due to the decrease in the amount of signal generated during the reaction. In this case, an erroneous measurement result (false negative) that the test substance is not contained may be obtained even in the measurement of the sample containing the test substance. It included the risk of misdiagnosis.
(In some cases, it was difficult to obtain a certain measurement sensitivity and to make accurate measurements.)

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】前記したように、タン
パク質の固定化方法のうち、共有結合法は、担体に対す
るタンパク質の固定化量が比較的少なく、固定化する際
の化学反応によってタンパク質が変性したり、タンパク
質の生理学的活性の低下が起こりやすいという問題があ
った。また、架橋試薬等による化学的結合法は、多量の
タンパク質を必要とする上に効率が悪く、固定化する際
にタンパク質の生理学的活性の低下が起こりやすいとい
う問題点があった。更に、物理的吸着法においても、タ
ンパク質の種類によっては担体への固定化が難しいとい
う問題点があった。また、一度固定化したタンパク質が
脱離してしまうという問題点があった。従って、本発明
の課題は、タンパク質の担体への固定化方法、タンパク
質が固定化された担体、及びタンパク質が固定化された
担体を使用した被検物質の測定試薬において、タンパク
質を担体に容易に固定化し、かつタンパク質の生理学的
活性を低下させたり、変性させたりすることなく長期間
固定化することができる手段を提供することである。As described above, among the protein immobilization methods, the covalent bond method has a relatively small amount of protein immobilized on a carrier, and the protein is denatured by a chemical reaction during immobilization. However, there is a problem that the physiological activity of the protein is likely to decrease. In addition, the chemical coupling method using a crosslinking reagent or the like requires a large amount of protein and is inefficient, and there is a problem that the physiological activity of the protein is likely to decrease when immobilized. Further, even in the physical adsorption method, there is a problem that it is difficult to immobilize it on a carrier depending on the type of protein. Further, there is a problem that the protein once immobilized is released. Therefore, an object of the present invention is to easily immobilize a protein on a carrier in a method for immobilizing a protein on a carrier, a carrier on which a protein is immobilized, and a reagent for measuring a test substance using the carrier on which a protein is immobilized. It is an object of the present invention to provide a means for immobilizing and capable of immobilizing for a long period of time without reducing or deteriorating the physiological activity of a protein.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタ
ンパク質を、シグナル配列を有した状態で発現させて担
体に固定化すると、この担体への固定化を容易かつ多量
に行うことができ、更にこの固定化を長期間安定に保つ
ことができることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。Means for Solving the Problems As a result of earnest studies, the present inventors have found that when a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene is expressed in a state having the signal sequence and immobilized on a carrier, The inventors have found that immobilization on a carrier can be carried out easily and in a large amount, and this immobilization can be kept stable for a long period of time, thus completing the present invention.

【０００６】すなわち、本発明は遺伝子の塩基配列中に
シグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有し
た状態で発現させ、このシグナル配列を有するタンパク
質を担体に固定化することを特徴とするタンパク質の固
定化方法である。That is, the present invention is characterized in that a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene is expressed in the state of having the signal sequence, and the protein having the signal sequence is immobilized on a carrier. It is a method of conversion.

【０００７】また、本発明は、タンパク質を固定化した
担体であって、このタンパク質が遺伝子の塩基配列中に
シグナル配列を有するタンパク質をシグナル配列を有し
た状態で発現させたタンパク質であることを特徴とす
る、タンパク質を固定化した担体である。Further, the present invention is a carrier on which a protein is immobilized, which is a protein in which a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene is expressed in the state of having the signal sequence. And a carrier on which a protein is immobilized.

【０００８】更に、本発明は、タンパク質を固定化した
担体を含む被検物質の測定試薬であって、このタンパク
質が遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパ
ク質をシグナル配列を有した状態で発現させたタンパク
質であることを特徴とする、被検物質の測定試薬であ
る。Furthermore, the present invention is a reagent for measuring a test substance, which comprises a carrier on which a protein is immobilized, which protein expresses a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene in the state of having the signal sequence. It is a reagent for measuring a test substance, which is characterized in that it is a protein.

【０００９】本発明においては、前記タンパク質が膜タ
ンパク質又は分泌タンパク質であることが好適である。In the present invention, the protein is preferably a membrane protein or secretory protein.

【００１０】また、本発明においては、前記タンパク質
が被検物質に対する特異的結合物質であることが好適で
ある。Further, in the present invention, it is preferable that the protein is a substance that specifically binds to a test substance.

【００１１】更に、本発明においては、被検物質がトレ
ポネーマ・パリダムに対する抗体であり、被検物質に対
する特異的結合物質がトレポネーマ・パリダムの抗原で
あることが好適である。Further, in the present invention, it is preferable that the test substance is an antibody against Treponema pallidum and the specific binding substance with respect to the test substance is an antigen of Treponema pallidum.

【００１２】[0012]

【発明の実施の形態】（１）発明の基本要件 本発明の「タンパク質の担体への固定化方法」、「タン
パク質を固定化した担体」、及び「タンパク質を固定化
した担体を含む被検物質の測定試薬」においては、担体
に固定化するタンパク質は、その遺伝子の塩基配列中に
シグナル配列を有するタンパク質であり、このシグナル
配列を有した状態で発現させたタンパク質を担体に固定
化するものである。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION (1) Basic Requirements of the Invention "Method for immobilizing protein on carrier", "carrier on which protein is immobilized", and "test substance containing carrier on which protein is immobilized" of the present invention In the "measurement reagent of", the protein to be immobilized on the carrier is a protein having a signal sequence in the base sequence of the gene, and the protein expressed with the signal sequence is immobilized on the carrier. is there.

【００１３】（２）遺伝子の塩基配列中にシグナル配列
を有するタンパク質 本発明において、担体に固定化するタンパク質は、遺伝
子の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質であ
る。この遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタ
ンパク質としては、その遺伝子の塩基配列中にシグナル
配列を有するもの、すなわち、成熟型タンパク質のＮ末
端側にシグナル配列を有するものであれば、どのような
種類のタンパク質でも用いることができる。なお、シグ
ナル配列とは、タンパク質がＮ末端側に有している、細
胞質膜の脂質二重層を通過する際に必要な１５〜３０個
程度のアミノ酸残基のことである。このシグナル配列の
中央部には疎水性アミノ酸残基が連続する疎水性領域が
あり、Ｎ末端側には塩基性アミノ酸残基が存在してお
り、Ｃ末端側には親水的で側鎖の比較的小さいアミノ酸
残基が存在している。また、このアミノ酸残基からなる
配列の部分はシグナルペプチドと呼ばれている。このシ
グナル配列は、タンパク質が細胞質膜の脂質二重層を通
過する際の先導役を務めると考えられており、通常、タ
ンパク質が細胞質膜を通過した後に、シグナルペプチダ
ーゼによって切断・除去される。よって、生体内で作ら
れ細胞質膜の表面に付着しているか、内部に埋もれてい
るもの、又は細胞質外に分泌された成熟型タンパク質
は、シグナル配列を有していない。(2) Protein Having a Signal Sequence in the Gene Base Sequence In the present invention, the protein immobilized on the carrier is a protein having a signal sequence in the gene base sequence. As a protein having a signal sequence in the base sequence of this gene, any protein having a signal sequence in the base sequence of the gene, that is, a protein having a signal sequence at the N-terminal side of the mature protein Different types of proteins can also be used. The signal sequence refers to about 15 to 30 amino acid residues that the protein has on the N-terminal side and is necessary for passing through the lipid bilayer of the cytoplasmic membrane. In the center of this signal sequence, there is a hydrophobic region where hydrophobic amino acid residues are continuous, a basic amino acid residue exists at the N-terminal side, and a hydrophilic side chain comparison at the C-terminal side. Smaller amino acid residues are present. The portion of the sequence consisting of this amino acid residue is called a signal peptide. This signal sequence is considered to play a leading role in passing the protein through the lipid bilayer of the cytoplasmic membrane, and is usually cleaved and removed by the signal peptidase after the protein passes through the cytoplasmic membrane. Therefore, a protein produced in vivo and attached to the surface of the cytoplasmic membrane, buried inside, or a mature protein secreted outside the cytoplasm does not have a signal sequence.

【００１４】また、本発明においては、タンパク質が、
膜タンパク質又は分泌タンパク質であることが好まし
い。ここで、膜タンパク質とは、生体膜を構成している
タンパク質のことをいい、生体膜の表面に付着している
ものを膜表在性タンパク質、内部に埋もれているものを
膜内在性タンパク質と呼ぶ。この膜タンパク質として
は、例えば、各種酵素、レセプター、輸送体、イオンチ
ャンネル、抗原タンパク質等を挙げることができる。ま
た、分泌タンパク質とは、細胞質膜外へ分泌されるタン
パク質であり、細胞質内のリボソーム上で合成された
後、細胞質外へ分泌されることにより成熟型タンパク質
となるものをいう。この分泌タンパク質としては、例え
ば、各種消化酵素、ペプチドホルモン類、抗体タンパク
質、乳タンパク質、卵白タンパク質等を挙げることがで
きる。In the present invention, the protein is
It is preferably a membrane protein or a secreted protein. Here, a membrane protein refers to a protein that constitutes a biological membrane, one attached to the surface of the biological membrane is a membrane-exposed protein, and one embedded inside is a membrane-integrated protein. Call. Examples of this membrane protein include various enzymes, receptors, transporters, ion channels, and antigen proteins. The secretory protein is a protein that is secreted outside the cytoplasmic membrane, and is a protein that is synthesized on the ribosome in the cytoplasm and then secreted outside the cytoplasm to become a mature protein. Examples of this secretory protein include various digestive enzymes, peptide hormones, antibody proteins, milk proteins, egg white proteins and the like.

【００１５】また、本発明においては、タンパク質が、
梅毒の原因菌として知られている、トレポネーマ・パリ
ダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ Ｐａｌｌｉｄｕｍ）の抗原
タンパク質であることが好ましい。このトレポネーマ・
パリダムの抗原タンパク質としては、トレポネーマ・パ
リダムの表面抗原タンパク質である１５Ｋダルトン抗原
タンパク質、１７Ｋダルトン抗原タンパク質、又は４７
Ｋダルトン抗原タンパク質等が知られている。なお、こ
れらの表面抗原タンパク質は、膜表在性タンパク質であ
る。また、これら表面抗原タンパク質のアミノ酸配列や
塩基配列は既に報告されている。（１５Ｋダルトン抗原
タンパク質：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ ４巻，１３７１〜１３７９頁，１９９０年、１
７Ｋダルトン抗原タンパク質：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６１巻，１２０２〜１２１０
頁，１９９３年、４７Ｋダルトン抗原タンパク質：Ｉｎ
ｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６０巻，
１５６８〜１５７６頁，１９９２年）In the present invention, the protein is
It is preferably an antigen protein of Treponema Pallidum known as a causative bacterium of syphilis. This Treponema
As the paridum antigen protein, 15K dalton antigen protein, 17K dalton antigen protein or 47K which is a surface antigen protein of Treponema pallidum.
K Dalton antigen protein and the like are known. Note that these surface antigen proteins are membrane-exposed proteins. The amino acid sequences and base sequences of these surface antigen proteins have already been reported. (15K Dalton Antigen Protein: Molecular Microbiol
Vol.4, 1371-1379, 1990, 1
7K Dalton Antigen Protein: Infection a
nd Immunity 61 volumes, 1202-1210
Page, 1993, 47K Dalton Antigen Protein: In
section 60 of "Faction and Immunity",
1568-1576, 1992)

【００１６】なお、小胞体、ゴルジ体、リソソームに局
在するタンパク質のうち、遺伝子の塩基配列中にシグナ
ル配列を含んでいるものについても、本発明におけるタ
ンパク質ということができる。Among the proteins localized in the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus and lysosome, those containing a signal sequence in the base sequence of the gene can be referred to as the protein of the present invention.

【００１７】（３）担体 本発明において、担体は、少なくともタンパク質を固定
化する箇所の表面が疎水性であることが好ましい。な
お、担体において、表面が疎水性であるとは、その表面
が疎水性の材質よりなるか、又はその表面に疎水性の物
質又は官能基が結合若しくは被覆されて疎水性の性質が
付与されていること等を挙げることができる。このよう
な担体としては、以下記載したような、免疫学的測定方
法、免疫学的測定試薬等において通常用いられている担
体等を挙げることができる。(3) Carrier In the present invention, it is preferable that at least the surface of the carrier on which the protein is immobilized is hydrophobic. Incidentally, in the carrier, the surface being hydrophobic means that the surface is made of a hydrophobic material, or a hydrophobic substance or a functional group is bound or coated on the surface to impart a hydrophobic property. Can be mentioned. Examples of such carriers include carriers that are usually used in immunological measurement methods, immunological measurement reagents and the like as described below.

【００１８】本発明における担体としては、例えば、ラ
テックス比濁法に使用されているラテックス粒子、又は
ラテックス比濁法に使用することが可能な粒子を挙げる
ことができる。このようなラテックス粒子としては、例
えば、ポリスチレン・ラテックス粒子、スチレン−スチ
レンスルホン酸塩共重合体・ラテックス粒子、アクリロ
ニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体・ラテックス
粒子、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体・ラテ
ックス粒子、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体・ラテッ
クス粒子、ポリアクロレイン・ラテックス粒子、スチレ
ン−メタクリル酸共重合体・ラテックス粒子、スチレン
−グリシジル（メタ)アクリル酸共重合体・ラテックス
粒子、メタクリル酸重合体・ラテックス粒子、又はアク
リル酸重合体・ラテックス粒子などの合成高分子粒子を
均一に懸濁させたラテックス粒子等を挙げることができ
る。このラテックス粒子の粒径については、特に制限は
ない。なお、ラテックス比濁法を測定原理として被検物
質の測定を行う場合、ラテックス粒子が被検物質を介し
て結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝
集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒
径は、その平均粒径が０．０４〜１μｍであることが好
ましい。また、被検物質の測定試薬において、「被検物
質に対する特異的結合物質を固定化したラテックス粒
子」を含ませる濃度であるが、これは、被検物質の種類
と試料中の濃度、被検物質に対する特異的結合物質の種
類とラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒
子の粒径、試料と前記測定試薬の混合比率等の各種条件
により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできな
い。しかし、通常は、試料と被検物質の測定試薬が混合
され、ラテックス粒子に固定化された「被検物質に対す
る特異的結合物質」と試料中に含まれていた「被検物
質」との特異的な結合反応が行われる測定反応時に、
「被検物質に対する特異的結合物質を固定化したラテッ
クス粒子」の濃度が、反応混合液中において０．００５
〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、
この場合、反応混合液中においてこのような濃度になる
ような濃度の「被検物質に対する特異的結合物質を固定
化したラテックス粒子」を前記被検物質の測定試薬に含
ませる。Examples of the carrier in the present invention include latex particles used in the latex nephelometry or particles usable in the latex nephelometry. Examples of such latex particles include polystyrene / latex particles, styrene / styrene sulfonate copolymer / latex particles, acrylonitrile / butadiene / styrene copolymer / latex particles, vinyl chloride / acrylic acid ester copolymer / Latex particles, vinyl acetate-acrylic acid copolymer / latex particles, polyacrolein / latex particles, styrene-methacrylic acid copolymer / latex particles, styrene-glycidyl (meth) acrylic acid copolymer / latex particles, methacrylic acid Examples thereof include coalesce / latex particles, or latex particles in which synthetic polymer particles such as acrylic acid polymer / latex particles are uniformly suspended. The particle size of the latex particles is not particularly limited. When measuring a test substance using the latex nephelometry as a measurement principle, the extent to which latex particles are bound through the test substance to form an aggregate, and the ease with which this aggregate is generated can be measured. For this reason, the average particle size of the latex particles is preferably 0.04 to 1 μm. In addition, in the measurement reagent for the test substance, it is the concentration that contains "latex particles in which a substance that specifically binds to the test substance is immobilized" is included. This depends on the type of the test substance, the concentration in the sample, and the test substance. The optimum concentration varies depending on various conditions such as the type of the substance that specifically binds to the substance, the distribution density on the surface of the latex particles, the particle size of the latex particles, the mixing ratio of the sample and the measurement reagent, etc., and therefore cannot be generally stated. However, in general, the sample and the measurement reagent for the test substance are mixed, and the "specific binding substance for the test substance" immobilized on the latex particles and the "test substance" contained in the sample During a measurement reaction in which a specific binding reaction is performed,
The concentration of "latex particles having a substance that specifically binds to the test substance immobilized" was 0.005 in the reaction mixture.
It is generally set to be 1% (w / v),
In this case, "latex particles having a substance that specifically binds to the test substance immobilized" in such a concentration in the reaction mixture is included in the measurement reagent for the test substance.

【００１９】また、本発明における担体としては、例え
ば、ゼラチン粒子などを用いる粒子凝集反応測定法又は
ラテックス凝集反応測定法などの間接凝集反応測定法に
使用されている粒子、又はこの間接凝集反応測定法に使
用することが可能な粒子等を挙げることができる。この
ような粒子としては、例えば、ポリスチレン、リポソー
ム、ラテックス、ゼラチン、ポリアクリルアミド、マイ
クロカプセル若しくはエマルジョン等の有機高分子物質
よりなる粒子、ガラス、シリカゲル、カーボン若しくは
ベントナイト等の無機高分子物質よりなる粒子又はその
他の人工担体等を挙げることができる。更に、粒子とし
て、色素を被覆するか又は色素を粒子中に分散若しくは
封入させることにより着色したものを使用してもよい。
こららの粒子の粒径については、特に制限はない。しか
し、これらの粒子の粒径としては、その平均粒子径が
０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、
０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。
また、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にある
ことが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ま
しい。Further, as the carrier in the present invention, for example, particles used in an indirect agglutination reaction measuring method such as a particle agglutination reaction measuring method using gelatin particles or a latex agglutination reaction measuring method, or the indirect agglutination reaction measuring method. Examples thereof include particles that can be used in the method. Examples of such particles include particles made of an organic polymer such as polystyrene, liposome, latex, gelatin, polyacrylamide, microcapsule or emulsion, and particles made of an inorganic polymer such as glass, silica gel, carbon or bentonite. Alternatively, other artificial carriers and the like can be mentioned. Further, as the particles, particles coated with a pigment or dispersed or encapsulated in the pigment to be colored may be used.
The particle size of these particles is not particularly limited. However, as the particle size of these particles, the average particle size is preferably in the range of 0.01 to 100 μm,
More preferably, it is in the range of 0.5 to 10 μm.
The specific gravity of these particles is preferably in the range of 1 to 10, more preferably in the range of 1 to 2.

【００２０】また、本発明における担体としては、例え
ば、間接凝集反応測定法に使用されている容器、又はこ
の間接凝集反応測定法に使用することが可能な容器等を
挙げることができる。このような容器としては、例え
ば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメ
タクリレートなどからなる試験管、マイクロプレート
（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げるこ
とができる。なお、前記容器の溶液収容部分（マイクロ
プレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型
等の底面中央から周辺にかけて傾斜をもつ形状であるこ
とが好ましい。The carrier used in the present invention may be, for example, a container used in the indirect agglutination reaction measuring method, or a container that can be used in the indirect agglutination reaction measuring method. Examples of such a container include a test tube made of glass, polystyrene, polyvinyl chloride, polymethacrylate, or the like, a microplate (microtiter plate), a tray, or the like. The bottom surface of the solution storage portion (well of microplate, etc.) of the container is preferably U-shaped, V-shaped, UV-shaped or the like, and has a shape inclined from the center to the periphery.

【００２１】また、本発明における担体としては、例え
ば、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定
法、若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる免
疫測定法、すなわち標識免疫測定法に使用されている担
体、又はこの標識免疫測定法に使用することが可能な担
体等を挙げることができる。このような担体としては、
例えば、ポリスチレン、ポリカーボネイト、ポリビニル
トルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビ
ニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルア
ミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロー
ス、セルロース、セファロース、ガラス等の材質よりな
る粒子、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート
（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又
は試験片等を挙げることができる。Further, the carrier in the present invention is, for example, an immunoassay using a labeling substance such as an enzyme immunoassay, a fluorescent immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescent immunoassay, that is, a labeled immunoassay. The carrier used, or the carrier that can be used in this labeled immunoassay can be mentioned. As such a carrier,
For example, polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, polyacrylamide, latex, liposome, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, particles made of a material such as glass, microcapsules, beads, Examples thereof include a microplate (microtiter plate), a test tube, a stick or a test piece.

【００２２】また、本発明における担体としては、例え
ば、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１
３２８１９号公報などに記載された被検物質（被検物
質）に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面
を有する担体並びに被検物質（被検物質）に対する特異
的結合物質が固定化された粒子を用いる測定法に使用さ
れる担体、又はこの測定法に使用することが可能な担体
等を挙げることができる。このような担体としては、例
えば、ポリスチレン、ガラス、ポリ塩化ビニル、ポリア
クリレート、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレ
ン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート等の非吸水
性の材質が挙げられる。The carrier used in the present invention is, for example, JP-A-9-229936 and JP-A-10-1.
A carrier having a surface coated with a specific binding substance for a test substance (test substance) described in JP-A-32819 and the like and a specific binding substance for the test substance (test substance) are fixed. Examples of the carrier include a carrier used in the measuring method using the particles, or a carrier that can be used in the measuring method. Examples of such a carrier include non-water-absorbing materials such as polystyrene, glass, polyvinyl chloride, polyacrylate, polypropylene, nylon, polyethylene, polycarbonate and polymethacrylate.

【００２３】また、以上記載した担体を強磁性体で被覆
又は担体成型時に強磁性体を含有させて調製した磁性担
体等を用いることもできる。なお、本発明においては、
担体がポリスチレンであることが好ましい。It is also possible to use a magnetic carrier or the like prepared by coating the above-mentioned carrier with a ferromagnetic material or incorporating a ferromagnetic material in molding the carrier. In the present invention,
It is preferred that the carrier is polystyrene.

【００２４】（４）遺伝子の塩基配列中にシグナル配列
を有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現
させる方法 本発明において、遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を
有するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現さ
せるためには、例えば、遺伝子工学技術として知られて
いる方法等の通常の方法を用いればよい。例えば、まず
タンパク質の遺伝子（成熟型タンパク質の遺伝子のＮ末
端側にシグナル配列を有するもの）をクローニングし、
得られた遺伝子をプラスミド等の発現ベクターへ組み込
む。この発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し、
得られた形質転換体を培養することにより遺伝子の塩基
配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配
列を有した状態で発現させることが出来る。遺伝子の塩
基配列をクローニングする方法としては、例えば、ＰＣ
Ｒ法、リコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法、リ
ンカーライゲーション法等を挙げることができる。例え
ば、ＰＣＲ法を用いる場合には、天然のタンパク質の遺
伝子の塩基配列をプライマーを用いて増幅させる事によ
り、シグナル配列を有した状態で遺伝子の塩基配列を得
ることが出来る。例えば、遺伝子の塩基配列中にシグナ
ル配列を有するトレポネーマ・パリダム表面抗原タンパ
ク質をシグナル配列を有した状態で発現させるための方
法を１７Ｋダルトン抗原タンパク質を例にして説明する
と、まず、ＰＣＲ法を用いて天然の１７Ｋダルトン抗原
タンパク質の遺伝子の塩基配列中の「シグナル配列を有
する１７Ｋダルトン抗原タンパク質の遺伝子の塩基配
列」のみを、プライマーを用いて増幅することにより、
「シグナル配列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質
の遺伝子の塩基配列」を得る。このようにして得られた
「シグナル配列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質
の遺伝子の塩基配列」をライゲーション法等により発現
ベクターに組み込み、この発現ベクターを大腸菌に導入
し、得られた形質転換体を培養することにより、遺伝子
の塩基配列中にシグナル配列を有する１７Ｋダルトン抗
原タンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させる
ことができる。(4) Method of expressing a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene in a state having a signal sequence In the present invention, a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene has a signal sequence For expression in E. coli, for example, an ordinary method such as a method known as a genetic engineering technique may be used. For example, first, a protein gene (having a signal sequence at the N-terminal side of the mature protein gene) is cloned,
The obtained gene is incorporated into an expression vector such as a plasmid. This expression vector is introduced into a host cell such as Escherichia coli,
By culturing the obtained transformant, a protein having a signal sequence in the base sequence of the gene can be expressed with the signal sequence. As a method for cloning the nucleotide sequence of a gene, for example, PC
The R method, the recombinant PCR method, the ligation method, the linker ligation method and the like can be mentioned. For example, when the PCR method is used, the base sequence of a gene of a natural protein can be obtained by amplifying the base sequence of a gene of a natural protein using a primer. For example, a method for expressing a Treponema pallidum surface antigen protein having a signal sequence in the base sequence of a gene in a state having a signal sequence will be described by taking a 17K dalton antigen protein as an example. By amplifying only “the nucleotide sequence of the gene of the 17K dalton antigen protein having a signal sequence” in the nucleotide sequence of the gene of the natural 17K dalton antigen protein,
The "base sequence of the 17K Dalton antigen protein gene having a signal sequence" is obtained. The thus obtained “base sequence of the gene of the 17K Dalton antigen protein having a signal sequence” is incorporated into an expression vector by a ligation method or the like, the expression vector is introduced into Escherichia coli, and the obtained transformant is cultured. Thus, the 17K Dalton antigen protein having a signal sequence in the base sequence of the gene can be expressed in the state having the signal sequence.

【００２５】（５）シグナル配列を有するタンパク質を
担体へ固定化する方法 本発明において、シグナル配列を有するタンパク質を担
体に固定化するには、シグナル配列を有するタンパク質
を担体に接触させることにより、行うことができる。(5) Method of immobilizing a protein having a signal sequence on a carrier In the present invention, the protein having a signal sequence is immobilized on the carrier by bringing the protein having the signal sequence into contact with the carrier. be able to.

【００２６】例えば、担体が容器である場合には、緩衝
液等に溶解したシグナル配列を有するタンパク質を、容
器の溶液収容部分に添加し内壁面に接触させたり、又は
担体が粒子である場合には、シグナル配列を有するタン
パク質と粒子とを緩衝液等の溶液中で混合し接触させた
後に、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間行
うことにより、担体への固定化を行うことができる。For example, when the carrier is a container, a protein having a signal sequence dissolved in a buffer or the like is added to the solution containing portion of the container and brought into contact with the inner wall surface, or when the carrier is particles. Is immobilized on a carrier by mixing a protein having a signal sequence and particles in a solution such as a buffer solution and bringing them into contact with each other, and then performing this at about 2 ° C. to about 40 ° C. for about 10 minutes to about 1 day. Can be converted.

【００２７】また、更に非特異的反応や担体の自然凝集
等を抑制するために処理を行う必要があれば、ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アル
ブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又
は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法
により、シグナル配列を有するタンパク質を固定化させ
た担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行って
もよい。なお、本発明においては、担体に固定化するタ
ンパク質がシグナル配列を有しているため、このシグナ
ル配列部分の疎水性により担体表面と疎水性相互作用に
より強くかつ安定的に結合、吸着し、脱離を起こし難い
ものと推測される。Further, if it is necessary to perform a treatment for suppressing non-specific reaction or spontaneous aggregation of the carrier, proteins such as bovine serum albumin (BSA), casein, gelatin, ovalbumin or a salt thereof, an interface. The carrier on which the protein having a signal sequence is immobilized may be subjected to blocking treatment (masking treatment) by a known method such as contact with an activator or skim milk powder to coat the carrier. In the present invention, since the protein to be immobilized on the carrier has a signal sequence, the hydrophobicity of this signal sequence portion causes strong and stable binding, adsorption and desorption by the hydrophobic interaction with the carrier surface. It is presumed that it is difficult to separate.

【００２８】（６）被検物質の測定試薬 本発明の被検物質の測定試薬は、タンパク質を固定化し
た担体を含む被検物質の測定試薬であって、このタンパ
ク質が遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有するタン
パク質をシグナル配列を有した状態で発現させたタンパ
ク質であることを特徴とするものであり、「被検物質に
対する特異的結合物質を固定化した担体」として、「シ
グナル配列を有するタンパク質を固定化した担体」を用
いて、試料中の被検物質の測定を行うための測定試薬で
ある。(6) Test Reagent Measuring Reagent The test substance measuring reagent of the present invention is a test substance measuring reagent containing a carrier on which a protein is immobilized. It is characterized in that it is a protein expressed in the state of having a signal sequence having a signal sequence, and that it has a "signal sequence having a signal sequence" as a "carrier on which a substance that specifically binds to a test substance is immobilized". It is a measuring reagent for measuring a test substance in a sample using a "carrier on which a protein is immobilized".

【００２９】（７）被検物質 被検物質 本発明の被検物質の測定試薬において、被検物質とは、
試料中におけるその存在の有無、又は含有量（濃度）を
測定しようとする物質である。(7) Test substance Test substance In the measurement reagent for the test substance of the present invention, the test substance means
A substance whose presence or absence in a sample or its content (concentration) is to be measured.

【００３０】この被検物質としては、被検物質に対する
特異的結合物質としてのシグナル配列を有するタンパク
質を固定化した担体を含む被検物質の測定試薬を使用し
て測定を行うことができるものであれば如何なるもので
もよい。This test substance can be measured by using a test substance measuring reagent containing a carrier on which a protein having a signal sequence as a specific binding substance for the test substance is immobilized. Anything will do as long as it is available.

【００３１】この被検物質を例示すると、例えば、タン
パク質、糖質、脂質、又は核酸などのような有機物質等
を挙げることができる。Examples of this test substance include organic substances such as proteins, sugars, lipids, nucleic acids and the like.

【００３２】この被検物質としては、ウイルス関連の抗
原若しくは抗体、又は細菌関連の抗原若しくは抗体等が
好適であるが、特にトレポネーマ・パリダムに対する抗
体（抗トレポネーマ・パリダム抗体）である場合が好適
である。The test substance is preferably a virus-related antigen or antibody, or a bacterium-related antigen or antibody, and particularly preferably an antibody against T. pallidum (anti-Treponema pallidum antibody). is there.

【００３３】 試料 本発明において、試料とは、前記の被検物質が存在する
可能性があり、かつその被検物質の存在の有無、又は含
有量（濃度）の測定を行おうとするものをいう。Sample In the present invention, the sample means a sample in which the above-mentioned test substance may exist, and the presence or absence of the test substance or its content (concentration) is to be measured. .

【００３４】例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血
漿、尿、***、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体
液；ヒト若しくは動物の脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、
筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の
抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液等を挙げる
ことができる。For example, human or animal blood, serum, plasma, urine, semen, spinal fluid, saliva, sweat, tears, ascites, amniotic fluid and other body fluids; human or animal brain and other organs, hair, skin, nails,
Examples thereof include extracts of muscle or nerve tissue; extracts or suspensions of human or animal feces; extracts of cells or cells.

【００３５】（８）被検物質に対する特異的結合物質 本発明の被検物質の測定試薬において、被検物質に対す
る特異的結合物質とは、前記の被検物質に特異的な親和
性を有し結合することができる物質のことである。な
お、本発明の被検物質の測定試薬においては、「被検物
質に対する特異的結合物質」として、「シグナル配列を
有するタンパク質」を固定化した担体を用いることは必
須であるが、更に同一又は異なる「被検物質に対する特
異的結合物質」を組み合わせて使用してもよい。(8) Specific binding substance for test substance In the assay reagent for a test substance of the present invention, the specific binding substance for the test substance has a specific affinity for the test substance. A substance that can be bound. In the reagent for measuring a test substance of the present invention, it is indispensable to use a carrier on which a “protein having a signal sequence” is immobilized as a “specific binding substance for the test substance”. Different "specific binding substances for the test substance" may be used in combination.

【００３６】また、この被検物質に対する特異的結合物
質としては、例えば、被検物質が抗原である場合にはこ
の抗原に対する抗体、被検物質が抗体である場合にはこ
の抗体に対する抗原若しくはこの抗体に対する抗体、被
検物質がタンパク質などよりなる物質である場合にはそ
のリガンド、被検物質が糖である場合にはこの糖と結合
するレクチン、又は被検物質がレセプターである場合に
はこのレセプターに対する物質等を挙げることができ
る。The specific binding substance to the test substance is, for example, an antibody against the antigen when the test substance is an antigen, an antigen against the antibody when the test substance is an antibody, or the antigen against the antibody. An antibody against an antibody, a ligand when the test substance is a substance such as a protein, a lectin that binds to the sugar when the test substance is a sugar, or a ligand when the test substance is a receptor Examples include substances for receptors.

【００３７】すなわち、被検物質に特異的な親和性を有
し結合することができる物質であれば、特に制限なく、
被検物質に対する特異的結合物質として、本発明におい
て用いることができる。That is, there is no particular limitation as long as it is a substance that has a specific affinity and can bind to the test substance.
It can be used in the present invention as a specific binding substance for a test substance.

【００３８】なお、本発明においては、被検物質が抗原
であり、被検物質に対する特異的結合物質が前記抗原に
対する抗体である場合が好適である。In the present invention, it is preferable that the test substance is an antigen and the specific binding substance for the test substance is an antibody against the antigen.

【００３９】ここで、抗体としては、ポリクローナル抗
体、又はモノクローナル抗体のいずれでもよく、そして
これらの断片〔Ｆ（ａｂ）’_２又はＦａｂ’など〕等で
もよい。Here, the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and may be a fragment thereof [F (ab) ' ₂ or Fab' etc.] and the like.

【００４０】また、本発明においては、被検物質が抗体
であり、被検物質に対する特異的結合物質が前記抗体に
対する抗原、又は前記抗体に対する抗体である場合が好
適である。In the present invention, it is preferable that the test substance is an antibody and the specific binding substance for the test substance is an antigen for the antibody or an antibody for the antibody.

【００４１】この被検物質が抗体であり、被検物質に対
する特異的結合物質が前記抗体に対する抗原である場
合、この「前記抗体に対する抗原」は、遺伝子組み換え
法などにより人為的に調製したものであってもよい。When the test substance is an antibody and the specific binding substance for the test substance is an antigen for the antibody, the "antigen for the antibody" is artificially prepared by a gene recombination method or the like. It may be.

【００４２】そして、この遺伝子組み換え法などにより
人為的に調製した「前記抗体に対する抗原」は、他のタ
ンパク質と融合しているものであってもよく、この融合
させる他のタンパク質としては、例えば、グルタチオン
−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースバイ
ンディングプロテイン（ＭＢＰ）、チオレドキシン、β
−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、ビオチン化タンパ
ク、プロテインＡ、又はジーン１０等を挙げることがで
きる。The "antigen against the antibody" artificially prepared by the gene recombination method may be one fused with another protein. Examples of the other protein to be fused are: Glutathione-S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin, β
-Galactosidase, lactase, biotinylated protein, protein A, gene 10, etc. can be mentioned.

【００４３】これをより具体的に例示すると、例えば、
被検物質がトレポネーマ・パリダムに対する抗体である
場合、被検物質に対する特異的結合物質として、シグナ
ル配列を有するトレポネーマ・パリダムの１７Ｋダルト
ン抗原にマルトースバインディングプロテイン（ＭＢ
Ｐ）が融合しているもの、又はシグナル配列を有するト
レポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原にグルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が融合してい
るもの等を挙げることができる。More specifically exemplifying this, for example,
When the test substance is an antibody against Treponema pallidum, the 17K Dalton antigen of Treponema paridum having a signal sequence is used as a specific binding substance for the test substance with maltose binding protein (MB
P) is fused, or the 47K Dalton antigen of Treponema pallidum having a signal sequence is fused with glutathione-S-transferase (GST).

【００４４】なお、本発明においては、被検物質がトレ
ポネーマ・パリダムに対する抗体であり、被検物質に対
する特異的結合物質がトレポネーマ・パリダムの抗原で
ある場合が好適である。In the present invention, it is preferable that the test substance is an antibody against Treponema pallidum and the specific binding substance to the test substance is an antigen of Treponema pallidum.

【００４５】なお、前記のトレポネーマ・パリダムの抗
原としては、例えば、１５Ｋダルトン抗原、１７Ｋダル
トン抗原、又は４７Ｋダルトン抗原等を挙げることがで
きる。Examples of the Treponema pallidum antigens include 15K dalton antigen, 17K dalton antigen, 47K dalton antigen and the like.

【００４６】これらのトレポネーマ・パリダムの各抗原
は、遺伝子組み換え法などにより人為的に調製したもの
であってもよい。Each of these Treponema pallidum antigens may be artificially prepared by a gene recombination method or the like.

【００４７】そして、この遺伝子組み換え法などにより
人為的に調製したトレポネーマ・パリダムの抗原は、例
えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）、マルトースバインディングプロテイン（ＭＢ
Ｐ）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ラクタ
ーゼ、ビオチン化タンパク、プロテインＡ、又はジーン
１０等の他のタンパク質と融合しているものであっても
よい。The antigen of Treponema pallidum artificially prepared by this gene recombination method is, for example, glutathione-S-transferase (GS
T), maltose binding protein (MB
P), thioredoxin, β-galactosidase, lactase, biotinylated protein, protein A, or those fused with other proteins such as gene 10 may be used.

【００４８】なお、本発明においては、以上の被検物質
に対する特異的結合物質として用いるトレポネーマ・パ
リダムの抗原のうち、担体に固定化するものの少なくと
も１種類はシグナル配列を有するものである必要があ
る。In the present invention, at least one of the antigens of Treponema pallidum used as the specific binding substance for the above-described test substance, which is immobilized on the carrier, must have a signal sequence. .

【００４９】（９）測定試薬 測定試薬の測定原理（測定方法） 本発明におけるタンパク質を固定化した担体は、試料中
の被検物質を測定する測定試薬に使用することができ
る。例えば、担体に固定化された「被検物質に対する特
異的結合物質」としての「シグナル配列を有するタンパ
ク質」と試料中に含まれていた「被検物質」との特異的
な結合反応を利用して、試料中の被検物質の測定を行う
方法を測定原理とする測定試薬に使用することができ
る。(9) Measuring Reagent Measuring Principle of Measuring Reagent (Measuring Method) The protein-immobilized carrier of the present invention can be used as a measuring reagent for measuring a test substance in a sample. For example, a specific binding reaction between a “protein having a signal sequence” as a “specific binding substance for a test substance” immobilized on a carrier and a “test substance” contained in a sample is used. Thus, the method of measuring the test substance in the sample can be used as a measurement reagent having a measurement principle.

【００５０】なお、この「被検物質に対する特異的結合
物質」と「被検物質」との特異的な結合反応としては、
例えば、抗原と抗体の抗原抗体反応（免疫反応）、タン
パク質などよりなる物質とそのリガンドとの反応、糖と
レクチンの反応、又はレセプターとそれに対する物質の
反応等を挙げることができる。The specific binding reaction between the "specific binding substance for the test substance" and the "test substance" is as follows.
For example, an antigen-antibody reaction (immune reaction) between an antigen and an antibody, a reaction between a substance such as a protein and its ligand, a reaction between a sugar and a lectin, or a reaction between a receptor and a substance therefor can be mentioned.

【００５１】そして、このような結合反応を利用して、
試料中の被検物質の測定を行う方法の例としては、例え
ば、免疫学的測定方法等を挙げることができる。Then, utilizing such a binding reaction,
Examples of the method for measuring the test substance in the sample include an immunological measurement method and the like.

【００５２】なお、この免疫学的測定方法としては、例
えば、ラテックス比濁法；ラテックス凝集反応測定法な
どの間接凝集反応測定法；酵素免疫測定法、蛍光免疫測
定法、放射免疫測定法、若しくは発光免疫測定法などの
標識物質を用いる免疫測定法、すなわち標識免疫測定
法；ウエスタンブロット法；Ｄａｈｌｂｅａｃｋらが示
したＥＬＳＡ法（enzyme-linked ligandsorbent assa
y）〔Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６
７〜７７２頁，１９９８年、及びＷＯ９８／２３９６３
号公報〕；又は特開平９−２２９９３６号公報及び特開
平１０−１３２８１９号公報等に記載された被検物質に
対する特異的結合物質が固定化され被覆された面を有す
る担体並びに被検物質に対する特異的結合物質が固定化
された粒子を用い、該粒子が担体の被検物質に対する特
異的結合物質が固定化され被覆された面に集まるか否か
により測定を行う方法等を挙げることができる。Examples of the immunological measurement method include latex nephelometry; indirect agglutination assay such as latex agglutination assay; enzyme immunoassay, fluorescent immunoassay, radioimmunoassay, or An immunoassay using a labeling substance such as a luminescent immunoassay, that is, a labeled immunoassay; a Western blot method; an ELSA method (enzyme-linked ligand sorbent assa shown by Dahlbeack et al.
y) [Thromb. Haemost. , Volume 79, 76
7-772, 1998, and WO98 / 23963.
Gazette]; or a carrier having a surface coated with a specific binding substance to a test substance described in JP-A Nos. 9-229936 and 10-132819, and specific to the test substance Examples of the method include a method in which particles to which a specific binding substance is immobilized are used, and whether or not the particles are collected on the surface of the carrier on which the specific binding substance to the analyte is immobilized and coated.

【００５３】そして、前記の標識免疫測定法であるが、
これは、サンドイッチ法、競合法、又は均一系法（ホモ
ジニアス系法）等のいずれの手法においても本発明を適
用することができる。In the labeled immunoassay described above,
The present invention can be applied to any method such as a sandwich method, a competitive method, or a homogeneous method (homogeneous method).

【００５４】 測定試薬 本発明における被検物質の測定試薬は、前記した測定方
法を測定原理とすることができるものであって、遺伝子
の塩基配列中にシグナル配列を有するタンパク質を、シ
グナル配列を有した状態で発現させたシグナル配列を有
するタンパク質を固定化した担体を含む被検物質の測定
試薬である。Assay Reagent The assay reagent for a test substance according to the present invention can be based on the above-described assay method as a measurement principle, and includes a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene and a signal sequence having a signal sequence. It is a reagent for measuring a test substance, which comprises a carrier on which a protein having a signal sequence expressed in the above state is immobilized.

【００５５】なお、本発明における被検物質の測定試薬
は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中の被検物質
の測定に使用することができる。また、本発明における
被検物質の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売
し、又は試料中の被検物質の測定に使用することもでき
る。The reagent for measuring a test substance in the present invention can be sold alone or used for measuring the test substance in a sample. The reagent for measuring a test substance according to the present invention can also be sold in combination with other reagents or used for measuring the test substance in a sample.

【００５６】前記の他の試薬としては、例えば、緩衝
液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試
薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試
薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質
を含有する物質の試薬等を挙げることができる。Examples of the above-mentioned other reagents include, for example, a buffer solution, a sample diluent, a reagent diluent, a reagent containing a labeling substance, a reagent containing a substance that produces a signal such as a color, or a calibration. Examples of the reagent include a substance containing a substance for performing.

【００５７】そして、前記の他の試薬を第１試薬とし、
本発明における被検物質の測定試薬を第２試薬とした
り、又は本発明における被検物質の測定試薬を第１試薬
とし、前記の他の試薬を第２試薬としたりして、適宜様
々な組合せにて販売、及び使用を行うことができる。Then, the above-mentioned other reagent is used as the first reagent,
The measurement reagent for the test substance according to the present invention may be used as the second reagent, or the measurement reagent for the test substance according to the present invention may be used as the first reagent and the other reagent may be used as the second reagent, and various combinations may be appropriately used. It can be sold and used at.

【００５８】なお、本発明における被検物質の測定試薬
の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができ
る。Various aqueous solvents can be used as the solvent of the reagent for measuring the test substance in the present invention.

【００５９】この水系溶媒としては、例えば、精製水、
生理食塩水、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン緩衝液、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理
食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。Examples of the aqueous solvent include purified water,
Examples thereof include physiological saline, and various buffers such as tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, phosphate buffered saline and the like.

【００６０】この緩衝液のｐＨについては、適宜適当な
ｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、
通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いる
ことが一般的である。The pH of the buffer solution may be appropriately selected and used without any particular limitation.
Generally, it is common to select and use a pH within the range of pH 3-12.

【００６１】なお、本発明における被検物質の測定試薬
のｐＨは、アルカリ性領域のｐＨを用いる方が、測定試
薬の安定化効果を高めることができるので好ましい。例
えば、ｐＨがｐＨ７．３以上であるとより好ましい。It should be noted that the pH of the measurement reagent for the test substance in the present invention is preferably a pH in the alkaline range since the stabilizing effect of the measurement reagent can be enhanced. For example, it is more preferable that the pH is 7.3 or higher.

【００６２】また、本発明における被検物質の測定試薬
には、前記の被検物質に対する特異的結合物質であるタ
ンパク質を固定化した担体の他に、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン
若しくはその塩などのタンパク質；前記の陽イオン及び
陰イオン以外の各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウ
サギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しく
は抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物
質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特
異的反応抑制物質等の１種又は２種以上を適宜含有させ
てもよい。Further, in the reagent for measuring a test substance in the present invention, in addition to the carrier on which the protein which is a specific binding substance for the test substance is immobilized, bovine serum albumin (BSA), human serum albumin ( HSA), proteins such as casein or its salts; various salts other than the above cations and anions; various sugars; skim milk powder; various animal sera such as normal rabbit serum; various preservatives such as sodium azide or antibiotics; One or more of an activator; a reaction accelerating substance; a sensitivity-increasing substance such as polyethylene glycol; a non-specific reaction suppressing substance and the like may be appropriately contained.

【００６３】そして、これらを被検物質の測定試薬に含
有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、
０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０
１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。The concentrations of these substances when they are contained in the measuring reagent of the test substance are not particularly limited,
0.001 to 10% (w / v) is preferable, and particularly 0.0
1 to 5% (w / v) is preferable.

【００６４】（１０）試料中の被検物質の測定 本発明における被検物質の測定試薬を用いて、試料中の
被検物質の測定を行うには、その被検物質の測定試薬の
測定原理である測定方法の操作法に従って測定操作を行
えばよい。(10) Measurement of Test Substance in Sample To measure the test substance in the sample using the reagent for measuring the test substance in the present invention, the measurement principle of the reagent for measuring the test substance The measurement operation may be performed according to the operation method of the measurement method.

【００６５】この測定は、用手法により行ってもよい
し、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。This measurement may be carried out manually or by using a device such as an analyzer.

【００６６】また、この測定は、１ステップ法（１試薬
法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬
法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実
施してもよい。Further, this measurement may be carried out by a one-step method (one-reagent method) or by a plurality of operating steps such as a two-step method (two-reagent method).

【００６７】[0067]

【実施例】以下、本発明を実施例により更に説明する。
なお、本発明は、これらにより限定されるものではな
い。EXAMPLES The present invention will be further described below with reference to examples.
The present invention is not limited to these.

【００６８】〔実施例１〕 （シグナル配列を有するトレポネーマ・パリダムの１７
Ｋダルトン抗原タンパク質を固定化した担体の調製、及
びこの担体を含むトレポネーマ・パリダムに対する抗体
の測定試薬の調製）Example 1 (17 of Treponema pallidum having a signal sequence)
Preparation of carrier on which K dalton antigen protein is immobilized, and preparation of reagent for measuring antibody against Treponema pallidum containing this carrier)

【００６９】（１）シグナル配列を有する１７Ｋダルト
ン抗原タンパク質固定化プレートの調製(1) Preparation of 17K Dalton Antigen Protein Immobilized Plate Having Signal Sequence

【００７０】 遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を
有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質の調製 トレポネーマ・パリダムを継代培養したウサギ睾丸の破
砕物より、トレポネーマ・パリダム菌体を抽出し、遺伝
子の塩基配列を抽出した。１７Ｋダルトン抗原タンパク
質の塩基配列は、既述のように既に知られており、その
全塩基配列とアミノ酸配列は配列表の配列番号１及び配
列番号２に示すとおりである。なお、配列番号１中の２
２番目の配列（ｔｇｔ／Ｃｙｓ）は成熟型１７Ｋダルト
ン抗原タンパク質のＮ末端であり、１から２１番目の配
列（ａｔｇ／Ｍｅｔからｔｔｇ／Ｌｅｕ）がシグナル配
列である。この抽出した配列番号１に示したシグナル配
列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質の塩基配列の
両端の２０塩基程度のオリゴヌクレオチドを各々プライ
マーとして合成した。ここで抽出された前記のシグナル
配列を有する塩基配列を鋳型とし、上記のプライマーを
用いて、ＰＣＲ法によりシグナル配列を有する１７Ｋダ
ルトン抗原タンパク質の塩基配列を増幅した。次に、グ
ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の塩基
配列を含むベクター（ファルマシア社製；ｐＧＥＸ４Ｔ
３）に、上記で得られた塩基配列を挿入した。このベク
ターを大腸菌に導入し、菌体の培養を行った。その後、
シグナル配列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質が
十分に発現した大腸菌を超音波処理により破砕し、これ
を遠心分離しその上清を、グルタチオンセファロース４
Ｂカラムにかけた。洗浄後、グルタチオン溶液を流すこ
とによりＧＳＴを融合したシグナル配列を有する１７Ｋ
ダルトン抗原タンパク質を溶出した。これを透析して、
グルタチオンを除いた後、トロンビンを添加し、ＧＳＴ
とシグナル配列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質
を切断した。再度、グルタチオンセファロース４Ｂカラ
ムにかけ、素通り画分を回収することにより、シグナル
配列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質を得た。Preparation of 17K Dalton Antigen Protein Having Signal Sequence in Nucleotide Sequence of Gene Treponema pallidum cells were extracted from the crushed rabbit testicles of Treponema parisdam, and the nucleotide sequence of the gene was extracted. . The nucleotide sequence of the 17K Dalton antigen protein is already known as described above, and its entire nucleotide sequence and amino acid sequence are as shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. In addition, 2 in SEQ ID NO: 1
The second sequence (tgt / Cys) is the N-terminus of the mature 17K Dalton antigen protein, and the 1st to 21st sequences (atg / Met to ttg / Leu) are signal sequences. Oligonucleotides of about 20 bases at both ends of the base sequence of the extracted 17K dalton antigen protein having the signal sequence shown in SEQ ID NO: 1 were synthesized as primers. The nucleotide sequence of the 17K Dalton antigen protein having the signal sequence was amplified by PCR using the above-extracted nucleotide sequence having the signal sequence as a template and the above primers. Next, a vector containing the nucleotide sequence of glutathione-S-transferase (GST) (Pharmacia; pGEX4T).
The nucleotide sequence obtained above was inserted in 3). This vector was introduced into Escherichia coli and the cells were cultured. afterwards,
Escherichia coli in which a 17K dalton antigen protein having a signal sequence was sufficiently expressed was disrupted by sonication, and this was centrifuged, and the supernatant was treated with glutathione sepharose 4
Run on column B. After washing, a glutathione solution is allowed to flow to allow GST-fused signal sequence 17K
Dalton antigen protein was eluted. Dialyze this,
After removing glutathione, add thrombin and add GST
The 17K dalton antigen protein having the signal sequence and was cleaved. The glutathione sepharose 4B column was applied again and the flow-through fraction was collected to obtain a 17K Dalton antigen protein having a signal sequence.

【００７１】 洗浄液の調製 ０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝
生理食塩水を調製し、洗浄液とした。Preparation of Wash Solution Phosphate buffered saline containing 0.02% (w / v) Tween 20 was prepared and used as a wash solution.

【００７２】 ブロッキング液の調製 ０．５％（ｗ／ｖ）カゼインナトリウムを含むリン酸緩
衝生理食塩水を調製し、ブロッキング液とした。Preparation of Blocking Solution Phosphate buffered saline containing 0.5% (w / v) sodium caseinate was prepared as a blocking solution.

【００７３】 シグナル配列を有する１７Ｋダルトン
抗原タンパク質固定化プレートの調製 前記のシグナル配列を有する１７Ｋダルトン抗原を、
０μｇ／ｍＬ、０．０３１２５μｇ／ｍＬ、０．０６２
５μｇ／ｍＬ、０．１２５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／
ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ
となるように、リン酸緩衝生理食塩水に加えた。これを
ＥＬＩＳＡ用プレートＳ（住友ベークライト社製）のウ
ェルに各５０μＬずつ分注し、その後４℃で一晩放置し
て、シグナル配列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク
質を各ウェルの内壁に固定化させた。Preparation of 17K Dalton Antigen Protein-Immobilized Plate Having Signal Sequence
0 μg / mL, 0.03125 μg / mL, 0.062
5 μg / mL, 0.125 μg / mL, 0.25 μg / mL
mL, 0.5 μg / mL, 1 μg / mL, 2 μg / mL
To the phosphate buffered saline. 50 μL of each was dispensed into wells of an ELISA plate S (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and then left overnight at 4 ° C. to immobilize a 17K Dalton antigen protein having a signal sequence on the inner wall of each well. .

【００７４】次に、このＥＬＩＳＡ用プレートＳの各ウ
ェル内の液を除き、前記の洗浄液で２回洗浄した。そ
の後、各ウェルに前記のブロッキング液を２００μＬ
ずつ分注して、各ウェルのブロッキングを行った。そし
て、このプレートの各ウェル内の液を除き、前記洗浄液
で２回洗浄を行った。以上の操作により調製したもの
を、シグナル配列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク
質固定化プレートとした。Next, the liquid in each well of the ELISA plate S was removed, and the plate was washed twice with the above-mentioned washing liquid. Then, add 200 μL of the blocking solution to each well.
Each well was blocked and each well was blocked. Then, the liquid in each well of this plate was removed, and the plate was washed twice with the washing liquid. The 17K Dalton antigen protein-immobilized plate having a signal sequence was prepared by the above operation.

【００７５】（２）ＰＯＤ標識抗体の調製 ＰＯＤ標識抗体希釈液 ０．５％（ｗ／ｖ）カゼインナトリウムを含むリン酸緩
衝生理食塩水を調製し、ＰＯＤ標識抗体希釈液とした。(2) Preparation of POD-labeled antibody POD-labeled antibody diluent A phosphate-buffered saline containing 0.5% (w / v) sodium caseinate was prepared and used as a POD-labeled antibody diluent.

【００７６】ＰＯＤ標識抗体の調製 ＰＯＤ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体溶液（ダコ社製；Ｐ
０４０６）を前記で調製したＰＯＤ標識抗体希釈液で
１０００倍に希釈し調製した。Preparation of POD-labeled antibody POD-labeled rabbit anti-human IgG antibody solution (manufactured by Dako; P
0406) was diluted 1000-fold with the POD-labeled antibody diluent prepared above to prepare.

【００７７】〔実施例２〕 （ＥＬＩＳＡ法によるトレポネーマ・パリダムに対する
抗体の測定）本発明の被検物質の測定試薬を用いて、被
検物質であるトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測
定した。Example 2 (Measurement of Antibodies to Treponema paridum by ELISA Method) Antibodies to Treponema paridum, which is a test substance, were measured using the measurement reagent for the test substance of the present invention.

【００７８】（１）測定 ０．５％（ｗ／ｖ）カゼインナトリウムを含むリン酸緩
衝生理食塩水で２０００倍希釈したＴＰ抗体陽性血清５
０μＬを、前記実施例１の（１）で調製したシグナル配
列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化プレー
トの各ウェルに添加し、３７℃で４時間反応させた。そ
の後、このプレートのウェル内の血清液を除き、前記洗
浄液で洗浄した。更に、前記実施例１の（２）で調製し
たＰＯＤ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体溶液を各ウェルに
５０μＬずつ添加し、室温で４時間反応させた。次い
で、各ウェルを前記洗浄液にて洗浄した。(1) Measurement 5 TP antibody positive serum 5 diluted 2000-fold with phosphate buffered saline containing 0.5% (w / v) sodium caseinate
0 μL was added to each well of the 17K Dalton antigen protein-immobilized plate having the signal sequence prepared in (1) of Example 1 above, and reacted at 37 ° C. for 4 hours. After that, the serum solution in the well of this plate was removed, and the plate was washed with the above washing solution. Further, 50 μL of the POD-labeled rabbit anti-human IgG antibody solution prepared in (2) of Example 1 was added to each well and reacted at room temperature for 4 hours. Then, each well was washed with the washing solution.

【００７９】この後、発色液（４ｍＭο−フェニレンジ
アミン基質液を含む１０３ｍＭリン酸水素二ナトリウム
−４９ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して３３μＬの
０．３％過酸化水素を使用直前に添加したもの）１００
μＬを各ウェルに添加し、室温で２０分間反応させた
後、４Ｎ硫酸水溶液５０μＬを各ウェルに添加し、反応
を停止させた。その後、マイクロプレートリーダー（バ
イオラッド社製；３５５０型）を用いて各ウェルの４９
０ｎｍの吸光度を測定した。After that, 33 μL of 0.3% hydrogen peroxide was added to 1 mL of a color developing solution (103 mM disodium hydrogen phosphate-49 mM citrate buffer containing 4 mM o-phenylenediamine substrate solution) immediately before use. ) 100
After adding μL to each well and reacting at room temperature for 20 minutes, 50 μL of 4N sulfuric acid aqueous solution was added to each well to stop the reaction. Then, using a microplate reader (BioRad; model 3550), 49
The absorbance at 0 nm was measured.

【００８０】（２） 測定結果 前記（１）において、試料中の被検物質（トレポネーマ
・パリダムに対する抗体）の測定を行って得られた吸光
度を、表１及び図１に示した。(2) Measurement Results The absorbance obtained by measuring the test substance (antibody against Treponema pallidum) in the sample in (1) above is shown in Table 1 and FIG.

【００８１】[0081]

【表１】 [Table 1]

【００８２】なお、この図において、横軸はプレートの
ウェルに固定化を行った時の１７Ｋダルトン抗原タンパ
ク質の濃度、縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度の測定値
を表す。In this figure, the horizontal axis represents the concentration of 17K dalton antigen protein when immobilized in the wells of the plate, and the vertical axis represents the measured absorbance at 490 nm.

【００８３】〔比較例〕実施例１における、シグナル配
列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質の塩基配列の
代わりに、シグナル配列を除去した１７Ｋダルトン抗原
タンパク質の塩基配列を用いたこと以外は、実施例１と
同様にして測定試薬を調製し、このシグナル配列を有し
ていないトレポネーマ・パリダムの１７Ｋダルトン抗原
タンパク質を固定化したプレートを含む測定試薬を用い
て実施例２の記載に従って、被検物質であるトレポネー
マ・パリダムに対する抗体を測定した。測定結果を表１
及び図１に示した。[Comparative Example] Example 1 was the same as Example 1 except that the base sequence of the 17K Dalton antigen protein having the signal sequence was used in place of the base sequence of the 17K Dalton antigen protein having the signal sequence in Example 1. A measurement reagent was prepared in the same manner, and a measurement reagent containing a plate on which the 17K dalton antigen protein of Treponema pallidum not having this signal sequence was immobilized was used, and the test substance Treponemal was used as described in Example 2. -Antibodies against paridum were measured. Table 1 shows the measurement results
And shown in FIG.

【００８４】◎実施例２及び比較例における測定結果に
ついての考察 表１及び図１より、比較例のシグナル配列を有していな
い１７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化プレートを含む
測定試薬においては、固定化のためプレートのウェルに
接触させた１７Ｋダルトン抗原タンパク質の濃度が増加
しても、吸光度の増加が見られない。すなわちプレート
に対するシグナル配列を有していない１７Ｋダルトン抗
原タンパク質の固定化が困難であり、十分行われていな
いため、測定反応の際に生成するシグナル（吸光度）の
量がわずかしか生じず、測定の感度が低下してしまって
いることが分かる。Consideration on Measurement Results in Example 2 and Comparative Example From Table 1 and FIG. 1, in the measurement reagent containing the 17K Dalton antigen protein-immobilized plate having no signal sequence of Comparative Example, immobilization Therefore, even if the concentration of the 17K Dalton antigen protein brought into contact with the wells of the plate is increased, the absorbance is not increased. That is, since immobilization of the 17K Dalton antigen protein having no signal sequence on the plate is difficult and is not performed sufficiently, a small amount of signal (absorbance) is generated during the measurement reaction, and It can be seen that the sensitivity has decreased.

【００８５】これに対して、本発明のシグナル配列を有
する１７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化プレートを含
む測定試薬においては、固定化のためプレートのウェル
に接触させた１７Ｋダルトン抗原タンパク質の濃度に応
じて、得られる吸光度が増加しており、プレートにシグ
ナル配列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質が容易
に、かつ多量に固定化されていることが分かる。On the other hand, in the assay reagent containing the 17K dalton antigen protein-immobilized plate having the signal sequence of the present invention, depending on the concentration of the 17K dalton antigen protein contacted to the well of the plate for immobilization, The obtained absorbance is increased, and it can be seen that the 17K Dalton antigen protein having a signal sequence is immobilized on the plate easily and in large amounts.

【００８６】従って、プレートへの固定化にシグナル配
列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質を使用するこ
とにより、抗原タンパク質をプレートに十分に固定化す
ることができ、試料中の被検物質を高感度に測定できる
ことが確かめられた。そして、本発明の測定試薬によ
り、試料中のトレポネーマ・パリダムに対する抗体を正
確に測定できることが確かめられた。Therefore, by using the 17K Dalton antigen protein having a signal sequence for immobilization on the plate, the antigen protein can be sufficiently immobilized on the plate, and the test substance in the sample can be measured with high sensitivity. It was confirmed that it was possible. It was confirmed that the measuring reagent of the present invention can accurately measure the antibody against Treponema pallidum in the sample.

【００８７】〔実施例３〕 （シグナル配列を有するトレポネーマ・パリダムの１７
Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子の調製、及びこの
粒子を含むトレポネーマ・パリダムに対する抗体の測定
試薬の調製）Example 3 (17 of Treponema pallidum having a signal sequence)
Preparation of K Dalton Antigen Protein-Immobilized Particles and Preparation of Reagents for Measuring Antibodies to Treponema pallidum Containing the Particles)

【００８８】（１）シグナル配列を有する１７Ｋダルト
ン抗原タンパク質固定化粒子の調製(1) Preparation of 17K Dalton Antigen Protein Immobilized Particles Having a Signal Sequence

【００８９】 洗浄液の調製 実施例１と同様に調製した。Preparation of cleaning solution Prepared as in Example 1.

【００９０】 ブロッキング液の調製 実施例１と同様に調製した。Preparation of blocking solution Prepared as in Example 1.

【００９１】 シグナル配列を有する１７Ｋダルトン
抗原タンパク質固定化粒子の調製 実施例１で得られたシグナル配列を有する１７Ｋダルト
ン抗原と、磁性粒子〔ダイナル社製；Dynabeads M-450
uncoated、粒径：４．５μｍ、粒径のＣ．Ｖ．５％以
下、比重１．５、濃度６％（ｗ／ｖ）〕とを抗原タンパ
ク質濃度２００μｇ／ｍＬ、粒子濃度６％となるように
混合し、室温で１時間反応させた。その後、上清を除去
し、前記のブロッキング液を約２０倍量加えて３７℃
で一晩放置し、ブロッキングを行った。その後、得られ
た粒子を前記の洗浄液にて洗浄した。この粒子を粒子
濃度が０．２％（ｗ／ｖ）となるように５０ｍＭグリシ
ン緩衝液（ｐＨ９．５）に分散させ、シグナル配列を有
する１７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子を調製し
た。Preparation of 17K Dalton Antigen Protein-Immobilized Particles Having a Signal Sequence The 17K dalton antigen having a signal sequence obtained in Example 1 and magnetic particles [manufactured by Dynal Co .; Dynabeads M-450]
uncoated, particle size: 4.5 μm, particle size C.I. V. 5% or less, specific gravity 1.5, concentration 6% (w / v)] were mixed so that the antigen protein concentration was 200 μg / mL and the particle concentration was 6%, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After that, the supernatant is removed, the blocking solution is added in an amount of about 20 times, and the mixture is incubated at 37 ° C.
It was left to stand overnight and blocked. Then, the obtained particles were washed with the above washing liquid. The particles were dispersed in a 50 mM glycine buffer solution (pH 9.5) so that the particle concentration was 0.2% (w / v) to prepare 17K Dalton antigen protein-immobilized particles having a signal sequence.

【００９２】（２）ＰＯＤ標識抗体の調製(2) Preparation of POD-labeled antibody

【００９３】ＰＯＤ標識抗体希釈液 実施例１と同様に調製した。POD-labeled antibody diluent Prepared as in Example 1.

【００９４】ＰＯＤ標識抗体の調製 ＰＯＤ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体溶液（ダコ社製；Ｐ
０４０６）を前記で調製したＰＯＤ標識抗体希釈液で
５００倍に希釈し調製した。Preparation of POD labeled antibody POD labeled rabbit anti-human IgG antibody solution (Dako; P
0406) was diluted 500-fold with the POD-labeled antibody diluent prepared above to prepare.

【００９５】〔実施例４〕 （ＥＬＩＳＡ法によるトレポネーマ・パリダムに対する
抗体の測定）本発明の被検物質の測定試薬を用いて、被
検物質であるトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測
定した。Example 4 (Measurement of Antibody Against Treponema pallidum by ELISA Method) An antibody against Treponema pallidum, which is a test substance, was measured using the measurement reagent for the test substance of the present invention.

【００９６】（１）測定 ０．５％（ｗ／ｖ）カゼインナトリウムを含むリン酸緩
衝生理食塩水で２０００倍希釈したＴＰ抗体陽性血清５
００μＬと、実施例３の（１）で調製したシグナル配列
を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子１５
０μＬとを混合し、室温で１時間反応させた。その後、
遠心分離により粒子のみを取り出し、この粒子を前記の
洗浄液で洗浄した。更に、実施例３の（２）で調製した
ＰＯＤ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体溶液５００μＬを添
加し、室温で１時間反応させた。次いで、遠心分離によ
り粒子のみを取り出し、粒子を洗浄液にて洗浄した。(1) Measurement TP antibody positive serum 5 diluted 2000-fold with phosphate buffered saline containing 0.5% (w / v) casein sodium
15 μL of 17K Dalton antigen protein-immobilized particle having 00 μL and the signal sequence prepared in (3) of Example 3
0 μL was mixed and reacted at room temperature for 1 hour. afterwards,
Only the particles were taken out by centrifugation, and the particles were washed with the above washing solution. Furthermore, 500 μL of the POD-labeled rabbit anti-human IgG antibody solution prepared in (2) of Example 3 was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. Then, only particles were taken out by centrifugation and washed with a washing liquid.

【００９７】この後、発色液（４ｍＭο−フェニレンジ
アミン基質液を含む１０３ｍＭリン酸水素二ナトリウム
−４９ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して３３μＬの
０．３％過酸化水素を使用直前に添加したもの）１００
μＬを添加し、３７℃で２０分間反応させた後、４Ｎ硫
酸水溶液５０μＬを添加し、反応を停止させた。その
後、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製；３
５５０型）を用いて上清の４９０ｎｍの吸光度を測定し
た。Then, a coloring solution (33 μL of 0.3% hydrogen peroxide was added to 1 mL of 103 mM disodium hydrogen phosphate-49 mM citrate buffer containing 4 mM o-phenylenediamine substrate solution immediately before use) ) 100
After adding μL and reacting at 37 ° C. for 20 minutes, 50 μL of 4N sulfuric acid aqueous solution was added to stop the reaction. Then, a microplate reader (Bio-Rad; 3
(550 type) was used to measure the absorbance of the supernatant at 490 nm.

【００９８】（２） 測定結果 前記（１）において、試料中の被検物質（トレポネーマ
・パリダムに対する抗体）の測定を行って得られた吸光
度を、表２及び図２に示した。(2) Measurement results The absorbance obtained by measuring the test substance (antibody against Treponema pallidum) in the sample in (1) above is shown in Table 2 and FIG.

【００９９】[0099]

【表２】 [Table 2]

【０１００】なお、この図において、縦軸は４９０ｎｍ
における吸光度の測定値を表す。In this figure, the vertical axis is 490 nm.
Represents the measured value of the absorbance at.

【０１０１】〔比較例〕実施例１における、シグナル配
列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質の塩基配列の
代わりに、シグナル配列を除去した１７Ｋダルトン抗原
タンパク質の塩基配列を用いたこと以外は、実施例３と
同様にして測定試薬を調製し、このシグナル配列を有し
ていないトレポネーマ・パリダムの１７Ｋダルトン抗原
タンパク質を固定化した粒子を含む測定試薬を用いて実
施例４の記載に従って、被検物質であるトレポネーマ・
パリダムに対する抗体を測定した。測定結果を表２及び
図２に示した。[Comparative Example] Example 3 was the same as Example 3 except that the base sequence of the 17K Dalton antigen protein having the signal sequence was replaced with the base sequence of the 17K Dalton antigen protein having the signal sequence removed. A measurement reagent was prepared in the same manner, and a measurement reagent containing particles immobilized with the 17 K dalton antigen protein of Treponema pallidum not having this signal sequence was used, and the test substance Treponemal was measured according to the procedure described in Example 4.・
Antibodies to paridum were measured. The measurement results are shown in Table 2 and FIG.

【０１０２】〔対照〕また、対照として、実施例３の手
順に順じ、１７Ｋダルトン抗原タンパク質を固定してい
ない磁性粒子、及びＰＯＤ標識抗体等の測定試薬を調製
し、この測定試薬を用いて実施例４の記載に従って、被
検物質であるトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測
定した。測定結果を表２及び図２に示した。[Control] As a control, magnetic particles not immobilized with 17K Dalton antigen protein and a measuring reagent such as a POD-labeled antibody were prepared according to the procedure of Example 3 and the measuring reagent was used. Antibodies to the test substance Treponema pallidum were measured as described in Example 4. The measurement results are shown in Table 2 and FIG.

【０１０３】◎実施例４及び比較例における測定結果に
ついての考察 表２及び図２より、比較例の測定試薬を使用して得られ
た吸光度は、本発明の測定試薬を使用して得られた吸光
度の３７％にとどまっている。すなわち、粒子に対する
シグナル配列を有していない１７Ｋダルトン抗原タンパ
ク質の固定化が困難であり、十分でないため、測定反応
のシグナル（吸光度）の生成が低いものにとどまり、測
定の感度が低下してしまっていることが分かる。Consideration on Measurement Results in Example 4 and Comparative Example From Table 2 and FIG. 2, the absorbance obtained using the measurement reagent of the comparative example was obtained using the measurement reagent of the present invention. It remains at 37% of the absorbance. That is, immobilization of the 17K Dalton antigen protein that does not have a signal sequence for particles is difficult and not sufficient, so that only a low amount of signal (absorbance) is produced in the measurement reaction, and the sensitivity of the measurement decreases. I understand that.

【０１０４】これに対して、本発明のシグナル配列を有
する１７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子を含む測
定試薬においては、得られる吸光度は高いものであり、
粒子にシグナル配列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパ
ク質が容易に、かつ多量に固定化されていることが分か
る。On the other hand, in the measurement reagent containing the 17K Dalton antigen protein-immobilized particles having the signal sequence of the present invention, the obtained absorbance is high,
It can be seen that the 17K Dalton antigen protein having a signal sequence on the particles is easily and abundantly immobilized.

【０１０５】従って、粒子への固定化にシグナル配列を
有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質を使用することに
より、抗原タンパク質を粒子に十分に固定化することが
でき、試料中の被検物質を高感度に測定できることが確
かめられた。そして、本発明の測定試薬により、試料中
のトレポネーマ・パリダムに対する抗体を正確に測定で
きることが確かめられた。Therefore, by using the 17K Dalton antigen protein having a signal sequence for immobilization on the particle, the antigen protein can be sufficiently immobilized on the particle, and the test substance in the sample can be measured with high sensitivity. It was confirmed that it was possible. It was confirmed that the measuring reagent of the present invention can accurately measure the antibody against Treponema pallidum in the sample.

【０１０６】〔実施例５〕（トレポネーマ・パリダムに
対する抗体の測定試薬の保存安定性の確認）[Example 5] (Confirmation of storage stability of a reagent for measuring an antibody against Treponema pallidum)

【０１０７】前記実施例３と同様に調製した、シグナル
配列を有する１７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子
を含む測定試薬を、５℃で長期間保存し、保存時の安定
性の確認を行った。A measurement reagent prepared in the same manner as in Example 3 and containing 17K Dalton antigen protein-immobilized particles having a signal sequence was stored at 5 ° C. for a long time, and the stability during storage was confirmed.

【０１０８】（１）測定試薬の保存 前記実施例３の（１）及び（２）で調製した測定試薬
を、５℃で１年間保存した。(1) Storage of measurement reagent The measurement reagents prepared in (1) and (2) of Example 3 were stored at 5 ° C for 1 year.

【０１０９】（２）測定試薬の安定性の確認 調製直後及び保存後の前記測定試薬の各々を用いて試料
中の被検物質（トレポネーマ・パリダムに対する抗体）
の測定を行い、前記測定試薬の保存時の安定性の確認を
行った。(2) Confirmation of stability of measurement reagent The test substance (antibody against Treponema pallidum) in a sample was prepared using each of the measurement reagents immediately after preparation and after storage.
Was measured to confirm the stability of the measurement reagent during storage.

【０１１０】（３）試薬 下記の測定試薬を用いた。 前記（１）における５℃での保存１年後の測定試薬。 測定試薬調製直後すなわち保存開始前の測定試薬。(3) Reagent The following measuring reagents were used. The measuring reagent in (1) above after 1 year of storage at 5 ° C. Immediately after preparation of the measuring reagent, that is, before starting storage.

【０１１１】（４）試料 トレポネーマ・パリダムに対する抗体を含むヒト血清を
試料として用いた。(4) Sample Human serum containing an antibody against Treponema pallidum was used as a sample.

【０１１２】（５）試料中の被検物質（トレポネーマ・
パリダムに対する抗体）の測定 前記及びの測定試薬を用いて、実施例４の記載に従
って、被検物質であるトレポネーマ・パリダムに対する
抗体を測定した。(5) Test substance in sample (treponema
(Antibody against paridum) Using the above-mentioned and the measuring reagents, an antibody against Treponema pallidum as a test substance was measured according to the description of Example 4.

【０１１３】（６） 測定結果 前記（５）において、試料中の被検物質（トレポネーマ
・パリダムに対する抗体）の測定を行って得られた吸光
度を、表３及び図３に示した。(6) Measurement Results The absorbance obtained by measuring the test substance (antibody against Treponema pallidum) in the sample in (5) above is shown in Table 3 and FIG.

【０１１４】[0114]

【表３】 [Table 3]

【０１１５】（７） まとめ 表３及び図３より、シグナル配列を有する１７Ｋダルト
ン抗原タンパク質を粒子に固定化した測定試薬において
は、５℃での保存１年後に得た吸光度の値は、調製直後
（保存開始前）の吸光度の値の１００．６％であり、長
期間保存した後においても測定試薬は安定であり、正確
な測定値を得られることが分かる。(7) From the summary table 3 and FIG. 3, in the measurement reagent in which the 17K Dalton antigen protein having a signal sequence is immobilized on the particles, the absorbance value obtained after 1 year of storage at 5 ° C. is the value immediately after the preparation. It is 100.6% of the absorbance value (before the start of storage), and it can be seen that the measurement reagent is stable even after storage for a long time, and an accurate measurement value can be obtained.

【０１１６】従って、シグナル配列を有する１７Ｋダル
トン抗原タンパク質を用いることにより、粒子（担体）
への固定化を容易に、かつ多量に行えるだけでなく、前
記タンパク質を粒子（担体）に長期間安定に固定化して
おくことができることが確かめられた。Therefore, by using the 17K Dalton antigen protein having a signal sequence, particles (carriers) can be obtained.
It was confirmed that the protein can be immobilized on the particles (carriers) stably for a long period of time, as well as being immobilized easily and in large amounts.

【０１１７】[0117]

【発明の効果】本発明の、タンパク質の担体への固定化
方法、タンパク質が固定化された担体、及びタンパク質
が固定化された担体を用いた被検物質の測定試薬では、
タンパク質としてシグナル配列を有するタンパク質を使
用するため、タンパク質の担体への固定化が容易に、か
つ多量に行えるものである。また、本発明のタンパク質
が固定化された担体、及び測定試薬の保存中に、タンパ
ク質を固定化した担体からタンパク質が脱離してしまう
ことを防止し、タンパク質を担体に長期間安定に固定化
しておくことができるものである。これにより前記測定
試薬の測定の感度の低下を防いで前記測定試薬の安定化
が図られ、長期間、正確な被検物質の測定結果を得るこ
とができるという効果を有するものである。更に、本発
明では、そのタンパク質がもともと有しているシグナル
配列を有した状態で発現させたタンパク質を用いて担体
に固定化を行う。このため、そのタンパク質と本来関係
がないペプチドを結合させたタンパク質の場合に考えら
れる立体障害等によりタンパク質の構造又は機能に障害
が起きてしまう可能性が少なく、従って、そのタンパク
質が本来持っている酵素反応又は抗原抗体反応等を固定
化後も十分に発揮することができるものである。また、
本発明では、タンパク質の担体への固定化を容易にでき
るため、担体に対する固定化量が少なくてすむものであ
る。INDUSTRIAL APPLICABILITY The method for immobilizing a protein on a carrier, the carrier on which a protein is immobilized, and the reagent for measuring a test substance using the carrier on which a protein is immobilized according to the present invention,
Since a protein having a signal sequence is used as the protein, the protein can be immobilized on the carrier easily and in large quantities. Further, during the storage of the carrier on which the protein of the present invention is immobilized, and the measurement reagent, it is prevented that the protein is detached from the carrier on which the protein is immobilized, and the protein is immobilized on the carrier stably for a long period of time. It can be set. As a result, the measurement sensitivity of the measurement reagent is prevented from being lowered, the measurement reagent is stabilized, and an accurate measurement result of the test substance can be obtained for a long period of time. Further, in the present invention, a protein expressed in a state of having a signal sequence originally possessed by the protein is used for immobilization on a carrier. Therefore, it is less likely that the structure or function of the protein will be impaired due to steric hindrance or the like, which is considered in the case of a protein to which a peptide not originally related to the protein is bound. The enzyme reaction or the antigen-antibody reaction can be sufficiently exerted even after immobilization. Also,
In the present invention, since the protein can be easily immobilized on the carrier, the amount of immobilization on the carrier can be small.

【０１１８】[0118]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SHINO-TEST CORPORATION <120> IMMOBILIZING METHOD OF PROTEIN FOR CARRIER, PROTEIN IMMOBILIZED CA RRIER, AND REAGENT WHICH FOR ANALITE, USING PROTEIN IMMOBILIZED CARRIER <130> P01-10-173 <160> 2 <210> 1 <211> 468 <212> DNA <213> Treponema Pallidum <220> <223> Nucleic Acid Sequence of 17Kiro-Dalton Antigen Protein of Treponem a Pallidum <400> 1 atg aaa gga tct gtc cgc gcg ctg tgc gcg ttc ctt ggt gtt gga gcg ctc ggt Met Lys Gly Ser Val Arg Ala Leu Cys Ala Phe Leu Gly Val Gly Ala Leu Gly 1 5 10 15 agc gct ttg tgt gtc tcg tgc aca acc gtg tgt ccg cac gcc ggg aag gcc aaa Ser Ala Leu Cys Val Ser Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala Gly Lys Ala Lys 20 25 30 35 gcg gaa aag gta gag tgc gcg ttg aag gga ggt atc ttt cgg ggt acg cta cct Ala Glu Lys Val Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly Ile Phe Arg Gly Thr Leu Pro 40 45 50 gcg gcc gat tgc ccg gga atc gat acg act gtg acg ttc aac gcg gat ggc act Ala Ala Asp Cys Pro Gly Ile Asp Thr Thr Val Thr Phe Asn Ala Asp Gly Thr 55 60 65 70 gcg caa aag gta gag ctt gcc ctt gag aag aag tcg gca cct tct cct ctt acc Ala Gln Lys Val Glu Leu Ala Leu Glu Lys Lys Ser Ala Pro Ser Pro Leu Thr 75 80 85 90 tat cgc ggt acg tgg atg gta cgt gaa gac gga att gtc gaa ctc tcg ctt gtg Tyr Arg Gly Thr Trp Met Val Arg Glu Asp Gly Ile Val Glu Leu Ser Leu Val 95 100 105 tcc tcg gag caa tcg aag gca ccg cac gag aaa gag ctg tac gag ctg ata gac Ser Ser Glu Gln Ser Lys Ala Pro His Glu Lys Glu Leu Tyr Glu Leu Ile Asp 110 115 120 125 agt aac tcc gtt cgc tac atg ggc gct ccc ggc gca gga agg cct tca aag gag Ser Asn Ser Val Arg Tyr Met Gly Ala Pro Gly Ala Gly Arg Pro Ser Lys Glu 130 135 140 atg gcg ccg ttt tac gtg ctc aaa aaa aca aag aaa Met Ala Pro Phe Tyr Val Leu Lys Lys Thr Lys Lys 145 150 155 <210> 2 <211> 156 <212> PRT <213> Treponema Pallidum <220> <223> Amino Acid Sequence of 17Kiro-Dalton Antigen Protein of Treponema Pallidum <400> 2 Met Lys Gly Ser Val Arg Ala Leu Cys Ala Phe Leu Gly Val Gly Ala Leu Gly 1 5 10 15 Ser Ala Leu Cys Val Ser Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala Gly Lys Ala Lys 20 25 30 35 Ala Glu Lys Val Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly Ile Phe Arg Gly Thr Leu Pro 40 45 50 Ala Ala Asp Cys Pro Gly Ile Asp Thr Thr Val Thr Phe Asn Ala Asp Gly Thr 55 60 65 70 Ala Gln Lys Val Glu Leu Ala Leu Glu Lys Lys Ser Ala Pro Ser Pro Leu Thr 75 80 85 90 Tyr Arg Gly Thr Trp Met Val Arg Glu Asp Gly Ile Val Glu Leu Ser Leu Val 95 100 105 Ser Ser Glu Gln Ser Lys Ala Pro His Glu Lys Glu Leu Tyr Glu Leu Ile Asp 110 115 120 125 Ser Asn Ser Val Arg Tyr Met Gly Ala Pro Gly Ala Gly Arg Pro Ser Lys Glu 130 135 140 Met Ala Pro Phe Tyr Val Leu Lys Lys Thr Lys Lys 145 150 155[Sequence list]                          SEQUENCE LISTING <110> SHINO-TEST CORPORATION <120> IMMOBILIZING METHOD OF PROTEIN FOR CARRIER, PROTEIN IMMOBILIZED CA RRIER, AND REAGENT WHICH FOR ANALITE, USING PROTEIN IMMOBILIZED CARRIER <130> P01-10-173 <160> 2 <210> 1 <211> 468 <212> DNA <213> Treponema Pallidum <220> <223> Nucleic Acid Sequence of 17Kiro-Dalton Antigen Protein of Treponem a Pallidum <400> 1 atg aaa gga tct gtc cgc gcg ctg tgc gcg ttc ctt ggt gtt gga gcg ctc ggt Met Lys Gly Ser Val Arg Ala Leu Cys Ala Phe Leu Gly Val Gly Ala Leu Gly   1 5 10 15 agc gct ttg tgt gtc tcg tgc aca acc gtg tgt ccg cac gcc ggg aag gcc aaa Ser Ala Leu Cys Val Ser Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala Gly Lys Ala Lys      20 25 30 35 gcg gaa aag gta gag tgc gcg ttg aag gga ggt atc ttt cgg ggt acg cta cct Ala Glu Lys Val Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly Ile Phe Arg Gly Thr Leu Pro              40 45 50 gcg gcc gat tgc ccg gga atc gat acg act gtg acg ttc aac gcg gat ggc act Ala Ala Asp Cys Pro Gly Ile Asp Thr Thr Val Thr Phe Asn Ala Asp Gly Thr  55 60 65 70 gcg caa aag gta gag ctt gcc ctt gag aag aag tcg gca cct tct cct ctt acc Ala Gln Lys Val Glu Leu Ala Leu Glu Lys Lys Ser Ala Pro Ser Pro Leu Thr          75 80 85 90 tat cgc ggt acg tgg atg gta cgt gaa gac gga att gtc gaa ctc tcg ctt gtg Tyr Arg Gly Thr Trp Met Val Arg Glu Asp Gly Ile Val Glu Leu Ser Leu Val                  95 100 105 tcc tcg gag caa tcg aag gca ccg cac gag aaa gag ctg tac gag ctg ata gac Ser Ser Glu Gln Ser Lys Ala Pro His Glu Lys Glu Leu Tyr Glu Leu Ile Asp     110 115 120 125 agt aac tcc gtt cgc tac atg ggc gct ccc ggc gca gga agg cct tca aag gag Ser Asn Ser Val Arg Tyr Met Gly Ala Pro Gly Ala Gly Arg Pro Ser Lys Glu             130 135 140 atg gcg ccg ttt tac gtg ctc aaa aaa aca aag aaa Met Ala Pro Phe Tyr Val Leu Lys Lys Thr Lys Lys 145 150 155 <210> 2 <211> 156 <212> PRT <213> Treponema Pallidum <220> <223> Amino Acid Sequence of 17Kiro-Dalton Antigen Protein of Treponema Pallidum <400> 2 Met Lys Gly Ser Val Arg Ala Leu Cys Ala Phe Leu Gly Val Gly Ala Leu Gly   1 5 10 15 Ser Ala Leu Cys Val Ser Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala Gly Lys Ala Lys      20 25 30 35 Ala Glu Lys Val Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly Ile Phe Arg Gly Thr Leu Pro              40 45 50 Ala Ala Asp Cys Pro Gly Ile Asp Thr Thr Val Thr Phe Asn Ala Asp Gly Thr  55 60 65 70 Ala Gln Lys Val Glu Leu Ala Leu Glu Lys Lys Ser Ala Pro Ser Pro Leu Thr          75 80 85 90 Tyr Arg Gly Thr Trp Met Val Arg Glu Asp Gly Ile Val Glu Leu Ser Leu Val                  95 100 105 Ser Ser Glu Gln Ser Lys Ala Pro His Glu Lys Glu Leu Tyr Glu Leu Ile Asp     110 115 120 125 Ser Asn Ser Val Arg Tyr Met Gly Ala Pro Gly Ala Gly Arg Pro Ser Lys Glu             130 135 140 Met Ala Pro Phe Tyr Val Leu Lys Lys Thr Lys Lys 145 150 155

【０１１９】[0119]

【配列表フリーテキスト】配列番号１：トレポネーマ・
パリダムの１７Ｋダルトン抗原タンパク質の塩基配列 配列番号２：トレポネーマ・パリダムの１７Ｋダルトン
抗原タンパク質のアミノ酸配列[Sequence listing free text] SEQ ID NO: 1 Treponema
Nucleotide sequence of 17K dalton antigen protein of paridum SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of 17K dalton antigen protein of Treponema pallidum

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明及び比較例の測定試薬を用いて、試料中
のトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測定して結果
を示した図である。FIG. 1 is a diagram showing the results of measuring antibodies against Treponema pallidum in samples using the measurement reagents of the present invention and comparative examples.

【図２】本発明、比較例及び対照の測定試薬を用いて、
試料中のトレポネーマ・パリダムに対する抗体を測定し
て結果を示した図である。[FIG. 2] Using the measuring reagents of the present invention, Comparative Example and Control,
It is the figure which showed the result of having measured the antibody with respect to Treponema pallidum in a sample.

【図３】本発明の測定試薬の保存安定性の結果を示した
図である。FIG. 3 is a diagram showing the results of storage stability of the measurement reagent of the present invention.

Claims (12)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有す
るタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させ、
このシグナル配列を有するタンパク質を担体に固定化す
ることを特徴とするタンパク質の固定化方法。1. A protein having a signal sequence in the base sequence of a gene is expressed in the state of having the signal sequence,
A method for immobilizing a protein, which comprises immobilizing a protein having this signal sequence on a carrier. 【請求項２】タンパク質が膜タンパク質又は分泌タンパ
ク質であることを特徴とする請求項１記載のタンパク質
の固定化方法。2. The method for immobilizing a protein according to claim 1, wherein the protein is a membrane protein or a secretory protein. 【請求項３】タンパク質が被検物質に対する特異的結合
物質であることを特徴とする請求項１又は２記載のタン
パク質の固定化方法。3. The method for immobilizing a protein according to claim 1 or 2, wherein the protein is a substance that specifically binds to a test substance. 【請求項４】被検物質がトレポネーマ・パリダムに対す
る抗体であり、被検物質に対する特異的結合物質がトレ
ポネーマ・パリダムの抗原である、請求項３記載のタン
パク質の固定化方法。4. The method for immobilizing a protein according to claim 3, wherein the test substance is an antibody against Treponema pallidum, and the substance specifically binding to the test substance is an antigen of Treponema pallidum. 【請求項５】タンパク質を固定化した担体であって、こ
のタンパク質が遺伝子の塩基配列中にシグナル配列を有
するタンパク質をシグナル配列を有した状態で発現させ
たタンパク質であることを特徴とする、タンパク質を固
定化した担体。5. A protein-immobilized carrier, wherein the protein is a protein in which a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene is expressed in a state of having the signal sequence. A carrier on which is immobilized. 【請求項６】タンパク質が膜タンパク質又は分泌タンパ
ク質であることを特徴とする請求項５記載のタンパク質
を固定化した担体。6. The carrier on which the protein of claim 5 is immobilized, wherein the protein is a membrane protein or a secretory protein. 【請求項７】タンパク質が被検物質に対する特異的結合
物質であることを特徴とする請求項５又は６記載のタン
パク質を固定化した担体。7. The carrier on which the protein of claim 5 or 6 is immobilized, wherein the protein is a substance that specifically binds to the test substance. 【請求項８】被検物質がトレポネーマ・パリダムに対す
る抗体であり、被検物質に対する特異的結合物質がトレ
ポネーマ・パリダムの抗原である、請求項７記載のタン
パク質を固定化した担体。8. The protein-immobilized carrier according to claim 7, wherein the test substance is an antibody against Treponema pallidum and the specific binding substance to the test substance is an antigen of Treponema pallidum. 【請求項９】タンパク質を固定化した担体を含む被検物
質の測定試薬であって、このタンパク質が遺伝子の塩基
配列中にシグナル配列を有するタンパク質をシグナル配
列を有した状態で発現させたタンパク質であることを特
徴とする、被検物質の測定試薬。9. A reagent for measuring a test substance, which comprises a carrier on which a protein is immobilized, which is a protein in which a protein having a signal sequence in the base sequence of a gene is expressed in the state of having the signal sequence. A reagent for measuring a test substance, which is characterized by being present. 【請求項１０】タンパク質が膜タンパク質又は分泌タン
パク質であることを特徴とする請求項９記載の被検物質
の測定試薬。10. The reagent for measuring a test substance according to claim 9, wherein the protein is a membrane protein or a secretory protein. 【請求項１１】タンパク質が被検物質に対する特異的結
合物質であることを特徴とする請求項９又は１０記載の
被検物質の測定試薬。11. The reagent for measuring a test substance according to claim 9 or 10, wherein the protein is a substance that specifically binds to the test substance. 【請求項１２】被検物質がトレポネーマ・パリダムに対
する抗体であり、被検物質に対する特異的結合物質がト
レポネーマ・パリダムの抗原である、請求項１１記載の
被検物質の測定試薬12. The reagent for measuring a test substance according to claim 11, wherein the test substance is an antibody against Treponema pallidum and the specific binding substance to the test substance is an antigen of Treponema pallidum.