JP2003052398A - Method for detecting nucleic acid - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for simply and highly accurately detecting a multiple chain nucleic acid. SOLUTION: This method for detecting the nucleic acid contains a process for allowing a probe nucleic acid to interact with a specimen nucleic acid, thus hybridizing the probe nucleic acid with the specimen nucleic acid to form the hybrid multiple chain nucleic acid, and comprises allowing the hybrid multiple chain nucleic acid to interact with two or more multiple chain nucleic acid- affinitive compounds having different light-emitting characteristics, respectively, for the hybrid multiple chain nucleic acid and detecting light emitted as the result of energy transfer between the two or more multiple chain nucleic acid- affinitive compounds.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、多重鎖核酸を簡便
かつ高精度に検出する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting a multi-stranded nucleic acid simply and accurately.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ヒト遺伝子配列の解析がほぼ終了し、今
後これらの情報を元に遺伝子の機能解明が急速に進むも
のと予想されている。ＤＮＡチップは、スライドガラス
等の固相担体に多数のＤＮＡ分子を整列させたマイクロ
アレイであり、遺伝子の発現、変異、多型性等の同時解
析に非常に有用である。このＤＮＡチップを用いるＤＮ
Ａチップ技術は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能で
あり、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギ
ーや環境問題対策等の研究開発に新しい手段を提供する
ものとして期待されている。2. Description of the Related Art The analysis of human gene sequences is almost completed, and it is expected that the function of genes will be elucidated rapidly based on such information. A DNA chip is a microarray in which a large number of DNA molecules are aligned on a solid phase carrier such as a slide glass, and is very useful for simultaneous analysis of gene expression, mutation, polymorphism and the like. DN using this DNA chip
A-chip technology can be applied to biomolecules other than DNA, and is expected to provide new means for drug discovery research, diagnosis of diseases and development of preventive methods, and research and development of measures for energy and environmental problems. There is.

【０００３】ＤＮＡチップ技術の具体化は、ＤＮＡの塩
基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーショ
ンによって決定する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案された
ことに始まる（Ｄr m a n ac，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ，４，ｐａｇｅ １１４（１９８
９）），ＳＢＨは、ゲル電気泳動を用いる塩基配列決定
法の限界を克服できる方法ではあったが、実用化には至
らなかった。その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べるいわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏｒ，
Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ ７
６７（１９９１）及びＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９５））。The DNA chip technology is embodied by a method of determining the base sequence of DNA by hybridization with an oligonucleotide (SBH, sequencen).
It started with the invention of gby hybridization (Dr man ac, R. et al., G.
enomics, 4, page 114 (198)
9)), SBH was a method capable of overcoming the limitation of the nucleotide sequencing method using gel electrophoresis, but was not put into practical use. After that, a DNA chip manufacturing technology was developed, and so-called HTS (high-throughput) for efficiently examining gene expression, mutation, polymorphism, etc. in a short time.
screening is now possible (Fodor,
S. P. A. , Science, 251, page 7
67 (1991) and Schena, M .; , Science
Ce, 270, page 467 (1995)).

【０００４】しかしながら、ＤＮＡチップ作製技術を実
用化するためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオ
チドを固相担体表面に整列させるためのＤＮＡチップの
作製技術が必要とされるほか、作製されたＤＮＡチップ
上のＤＮＡ断片と試料核酸断片とのハイブリダイゼーシ
ョンを高感度かつ正確に検出する技術も必要となる。一
般的には、試料核酸断片を標識した後にハイブリダイゼ
ーションさせることにより検出が行なわれるが、この標
識工程は各試料毎に行う必要があり、標識反応の他に標
識された核酸と反応せずに残存する標識用化合物とを分
離するための精製工程も必要になるなど煩雑である。However, in order to put the DNA chip production technique into practical use, a DNA chip production technique for aligning a large number of DNA fragments and oligonucleotides on the surface of a solid support is required, and the produced DNA chip is produced. A technique for highly sensitively and accurately detecting the hybridization between the DNA fragment on the chip and the sample nucleic acid fragment is also required. Generally, detection is carried out by labeling the sample nucleic acid fragment and then hybridizing, but this labeling step needs to be performed for each sample, and does not react with the labeled nucleic acid in addition to the labeling reaction. This is complicated because a purification step for separating the remaining labeling compound is required.

【０００５】この煩雑な標識工程を省略する方法とし
て、例えば特開平５−１９９８９８号公報に記載されて
いるように、インターカレーターを用いてハイブリダイ
ゼーションにより形成される多重鎖核酸のみを検出する
方法が提案されている。共有結合による標識が検出対象
核酸を変成させ、正確なハイブリダイゼーションを阻害
してしまう懸念があるのに対して、インターカレーター
を用いる方法は標識工程を不要にするばかりでなく、上
記問題を解消できる可能性があるものと考えられてい
る。As a method of omitting this complicated labeling step, there is a method of detecting only a multi-stranded nucleic acid formed by hybridization using an intercalator, as described in, for example, JP-A-5-199898. Proposed. While there is a concern that the label by covalent bond denatures the nucleic acid to be detected and interferes with accurate hybridization, the method using an intercalator not only eliminates the labeling step but also solves the above problem. Thought to be possible.

【０００６】上記特開平５−１９９８９８号公報に記載
されているインターカレーターは検出を電気化学的に行
うものであり、電気化学的な検出のために装置の小型化
が可能であるなどいくつかの有利な点はあるものの、電
気化学的に検出を行うためにプローブ核酸を電極表面に
固定する必要があるため、電極の作成や電極表面への核
酸の固定化などいくつかの新たな難しい課題が生じてし
まう。The intercalator described in the above-mentioned Japanese Patent Laid-Open No. 5-199898 performs detection electrochemically, and there are several methods such as miniaturization of the device for electrochemical detection. Although there are advantages, it is necessary to immobilize the probe nucleic acid on the electrode surface in order to perform the electrochemical detection.Therefore, there are some new and difficult problems such as preparation of the electrode and immobilization of the nucleic acid on the electrode surface. Will occur.

【０００７】このような理由から、現在広く行われてい
る蛍光スキャナーを用いて検出を行う方法に適したイン
ターカレーターの開発が望まれている。しかし、これま
でに知られているインターカレーターは多重鎖核酸と相
互作用しうるばかりでなく、試料となる単鎖核酸とも相
互作用し、その選択性が不十分であるという問題を有し
ている。この問題以外にも、多重鎖核酸検出用のインタ
ーカレーターとして具備すべき条件として、高い感度、
高いＳ／Ｎを実現するため、多重鎖核酸へのインターカ
レート効率が高いこと、インターカレートした状態とし
ていない状態とでインターカレーターから発せられるシ
グナル強度が大きく異なることなどが要求される。ま
た、蛍光色素を結合した形のインターカレーターにおい
ては、高い蛍光色素の発光効率のほか、可視領域に吸収
極大を有するなど蛍光スキャナーの励起光源及び検出波
長に適性を有していることが必要であり、波長調節性の
高い色素骨格が望まれている。以上の条件を満たすイン
ターカレーターが強く望まれているが、実用的なレベル
のものが見出されているとは言えない状況にある。For these reasons, it is desired to develop an intercalator suitable for a detection method using a fluorescence scanner which is widely used at present. However, the known intercalators have not only the ability to interact with multi-stranded nucleic acids, but also the single-stranded nucleic acids used as a sample, and have a problem that their selectivity is insufficient. . In addition to this problem, as a condition to be provided as an intercalator for detecting a multi-stranded nucleic acid, high sensitivity,
In order to realize a high S / N, it is required that the efficiency of intercalation into a multi-stranded nucleic acid be high, and that the signal intensity emitted from the intercalator be greatly different between the intercalated state and the non-intercalated state. Further, in the intercalator in the form of binding a fluorescent dye, in addition to high emission efficiency of the fluorescent dye, it is necessary that the excitation light source and detection wavelength of the fluorescent scanner have an aptitude such as having an absorption maximum in the visible region. Therefore, a dye skeleton having high wavelength controllability is desired. Although an intercalator satisfying the above conditions is strongly desired, it cannot be said that a practical level has been found.

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、多重
鎖核酸の検出方法を提供することにある。より具体的に
は、ＤＮＡチップあるいはＤＮＡアレイなどの遺伝子解
析に利用可能な多重鎖核酸の検出方法を提供することに
あり、検出シグナルの強度向上と高いＳ／Ｎ比を与える
多重核酸の検出方法を提供することが本発明の課題であ
る。An object of the present invention is to provide a method for detecting a multi-stranded nucleic acid. More specifically, it is to provide a method for detecting a multi-stranded nucleic acid that can be used for gene analysis such as a DNA chip or a DNA array, and a method for detecting a multi-nucleic acid that improves detection signal intensity and provides a high S / N ratio. It is an object of the present invention to provide

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、発光性ク
ロモフォアを有し、単鎖核酸よりも多重鎖核酸に対して
選択的な親和性を有する化合物（以下、この性質を有す
る化合物を「多重鎖核酸親和性化合物」と称する。）を
プローブ核酸と試料核酸とのハイブリダイゼーションに
より生成したハイブリッド多重鎖核酸に相互作用させ、
該多重鎖核酸親和性化合物より発せられるシグナルを高
いＳ／Ｎ比で検出する方法について鋭意研究を行った。
その結果、それぞれ異なる波長で発光する２種以上の多
重鎖核酸親和性化合物を多重鎖核酸に相互作用させ、そ
れらの化合物間のエネルギー移動の結果として生じる発
光を検出することにより、極めて高感度に多重鎖核酸を
検出できることを見出した。本発明は上記の知見を基に
して完成されたものである。Means for Solving the Problems The present inventors have developed a compound having a luminescent chromophore and having a selective affinity for a multi-stranded nucleic acid over a single-stranded nucleic acid (hereinafter, a compound having this property "Multiplex nucleic acid affinity compound".) Interacts with a hybrid multiplex nucleic acid generated by hybridization of a probe nucleic acid and a sample nucleic acid,
The inventors have earnestly conducted research on a method for detecting a signal emitted from the compound having affinity for a multi-stranded nucleic acid at a high S / N ratio.
As a result, two or more kinds of multi-stranded nucleic acid-affinity compounds each emitting at a different wavelength are allowed to interact with the multi-stranded nucleic acid, and luminescence generated as a result of energy transfer between these compounds is detected, resulting in extremely high sensitivity. It has been found that multi-stranded nucleic acids can be detected. The present invention has been completed based on the above findings.

【００１０】すなわち、本発明は、プローブ核酸に対し
て試料核酸を相互作用させ、該プローブ核酸と該試料核
酸とのハイブリダイゼーションによりハイブリッド多重
鎖核酸を形成させる工程を含み、上記ハイブリッド多重
鎖核酸に対してそれぞれ異なる発光特性を有する２種以
上の多重鎖核酸親和性化合物を相互作用させ、該２種以
上の多重鎖核酸親和性化合物間で起こるエネルギー移動
の結果として生じる発光を検出する方法を提供するもの
である。That is, the present invention includes a step of allowing a sample nucleic acid to interact with a probe nucleic acid to form a hybrid multi-stranded nucleic acid by hybridization of the probe nucleic acid and the sample nucleic acid, A method for interacting two or more kinds of multi-stranded nucleic acid-affinity compounds having different luminescence properties with each other, and detecting luminescence generated as a result of energy transfer between the two or more kinds of multi-stranded nucleic acid-affinity compounds To do.

【００１１】本発明の好ましい態様によれば、プローブ
核酸が固相担体上に固定されている上記の方法；及び該
ハイブリッド多重鎖核酸と該多重鎖核酸親和性化合物と
を相互作用させた後、洗浄操作を行わずに該発光を検出
する上記の方法が提供される。According to a preferred embodiment of the present invention, the above method in which the probe nucleic acid is immobilized on a solid phase carrier; and, after interacting the hybrid multi-stranded nucleic acid and the multi-stranded nucleic acid affinity compound, There is provided the above method of detecting the luminescence without performing a washing operation.

【００１２】本発明のより好ましい態様によれば、エネ
ルギー移動が蛍光共鳴エネルギー移動である上記の方法
が提供される。この発明の好ましい態様では、エネルギ
ー移動の結果として生じる上記発光についての励起スペ
クトル及び発光スペクトルの最大値の波長差が、それぞ
れの多重鎖核酸親和性化合物についての励起スペクトル
及び発光スペクトルの最大値の波長差よりも拡大されて
いる上記の方法；励起スペクトル及び発光スペクトルの
最大値の波長差が８０ｎｍ以上の発光を検出する上記の
方法；励起スペクトル及び発光スペクトルの最大値の波
長差が１００ｎｍ以上の発光を検出する上記の方法；及
び分子吸光係数が７万以上のクロモフォアを有する多重
鎖核酸親和性化合物の２種以上を用いる上記の方法が提
供される。According to a more preferred embodiment of the present invention, there is provided the above method, wherein the energy transfer is fluorescence resonance energy transfer. In a preferred embodiment of the present invention, the wavelength difference between the maximum values of the excitation spectrum and the emission spectrum for the above-mentioned emission that occurs as a result of energy transfer is the wavelength of the maximum value of the excitation spectrum and the emission spectrum for each compound having a multi-stranded nucleic acid affinity. The above-mentioned method which is expanded from the difference; the above-mentioned method for detecting the emission having a maximum wavelength difference of 80 nm or more between the excitation spectrum and the emission spectrum; The emission having a wavelength difference of the maximum value between the excitation spectrum and the emission spectrum of 100 nm or more And a method of using two or more compounds having affinity for a multi-stranded nucleic acid having a chromophore with a molecular extinction coefficient of 70,000 or more.

【００１３】さらに好ましい態様によれば、多重鎖核酸
親和性化合物のうちの少なくとも１つの化合物が下記一
般式（Ｉ）： （ＩＣ）−〔(Ｌ)_m−(ＳＩＧ)_q〕_n （式中、ＩＣは多重鎖核酸との親和性を有する基を示
し；Ｌは２価の連結基を示し；ＳＩＧは検出可能なシグ
ナルを発するクロモフォアを示し；ｎは２、３、又は４
の整数を示し；ｍは０又は１を示し；ｑは０又は１を示
すが、ただしｎ個の(Ｌ)_m−(ＳＩＧ)_qにおいてすべての
ｑが０であることはなく、ｎ個の (Ｌ)_m−(ＳＩＧ)_qに
おいて、それぞれのＬ、ｍ、ＳＩＧ、ｑは同一であって
も異なっていてもよい）で表される化合物である上記の
方法が提供される。また、別の観点からは、上記のいず
れかの方法に用いるための上記一般式（Ｉ）で表される
化合物が本発明により提供される。According to a further preferred embodiment, at least one compound among the compounds having affinity for multi-stranded nucleic acid has the following general formula (I): (IC)-[(L) _m- (SIG) _q ] _n (wherein , IC represents a group having an affinity for a multi-stranded nucleic acid; L represents a divalent linking group; SIG represents a chromophore which emits a detectable signal; n represents 2, 3, or 4
M is 0 or 1; q is 0 or 1, provided that all _q in n (L) _m − (SIG) _q are not 0 and n (L) _m- (SIG) _q, wherein each L, m, SIG, and q may be the same or different) is provided. From another point of view, the present invention provides a compound represented by the above general formula (I) for use in any of the above methods.

【００１４】[0014]

【発明の実施の形態】本明細書において、多重鎖核酸と
は核酸が相補的配列に由来する相互作用により集合した
状態を指している（相互作用による多重鎖核酸の生成過
程を「ハイブリダイゼーション」と呼ぶ場合がある）。
多重鎖核酸は二本鎖、三本鎖、又は四本鎖などの状態を
とることが知られており、本明細書における多重鎖核酸
にはこれらの多重鎖も包含される。核酸としてはＤＮＡ
又はＲＮＡのほか、これらの化学修飾体が数多く知られ
ており、さらにＰＮＡと呼ばれるポリペプチド鎖を主鎖
に有する核酸類縁体なども知られているが、本明細書に
おける多重鎖核酸にはこれらがすべて包含される。本発
明においてより好ましく用いられる核酸はＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、及びこれらの化学修飾体であり、二本鎖、三本鎖、
又は四本鎖の中では二本鎖が好ましい。プローブ核酸と
試料核酸とのハイブリダイゼーションにより生成される
多重鎖核酸を本明細書において「ハイブリッド多重鎖核
酸」と呼ぶ。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present specification, a multi-stranded nucleic acid refers to a state in which nucleic acids are assembled by an interaction derived from a complementary sequence (the process of producing a multi-stranded nucleic acid by the interaction is called “hybridization”). Sometimes called).
It is known that the multi-stranded nucleic acid has a double-stranded, triple-stranded, or four-stranded state, and the multi-stranded nucleic acid in the present specification also includes these multi-stranded. DNA as the nucleic acid
In addition to RNA, a large number of these chemically modified compounds are known, and further, a nucleic acid analog having a polypeptide chain called PNA in its main chain is also known. Are all included. Nucleic acids more preferably used in the present invention are DNA and RN.
A, and chemical modifications thereof, such as double-stranded, triple-stranded,
Or, among the four strands, the double strand is preferable. The multi-stranded nucleic acid generated by the hybridization of the probe nucleic acid and the sample nucleic acid is referred to herein as “hybrid multi-stranded nucleic acid”.

【００１５】一般に、２つのクロモフォア間でのエネル
ギー移動は非常に近接したクロモフォア間でおこり易
く、距離が大きくなるとほとんど観測されなくなる。そ
れぞれ異なる発光特性を有する２種以上の多重鎖核酸親
和性化合物を核酸に相互作用させた場合、単鎖核酸では
色素間の距離が大きいために該化合物間でのエネルギー
移動がほとんど生じないが、多重鎖核酸ではクロモフォ
アが密に存在する確率が高くなるため、該化合物間での
エネルギー移動が起こる。本発明の方法では、上記のエ
ネルギー移動の結果として生じる発光を検出することに
より多重鎖核酸を検出することを特徴としている。In general, energy transfer between two chromophores is likely to occur between very close chromophores, and is hardly observed when the distance becomes large. When two or more kinds of multi-stranded nucleic acid-affinity compounds each having a different luminescence property are allowed to interact with a nucleic acid, a single-stranded nucleic acid causes a large distance between dyes, so that energy transfer between the compounds hardly occurs. In multi-stranded nucleic acids, chromophores are more likely to be densely present, resulting in energy transfer between the compounds. The method of the present invention is characterized by detecting the multi-stranded nucleic acid by detecting the luminescence generated as a result of the above energy transfer.

【００１６】また、一般に、蛍光スキャナーを用いてシ
グナルを読みとる際に励起光と多重鎖核酸親和性化合物
より発せられるシグナル（発光）の最大値の波長差が小
さいと、励起光がシグナルに混入する問題が生じる。こ
れを解決するために励起光をカットする光学フィルター
の波長や濃度を調節すると、シグナルがフィルターによ
りカットされ、結果として得られるシグナルが弱められ
てしまうジレンマがある。この問題を回避するために
は、通常、励起光の強度や波長分布（スペクトルの線
幅）、光学フィルターのシャープさなど種々の条件を最
適化しなければならず、極めて煩雑であるうえ、高い検
出感度を達成することも困難である。本発明の方法の好
ましい態様によれば、２種以上の多重核酸親和性化合物
間でのエネルギー移動を利用することによって、励起ス
ペクトルと発光スペクトルの最大値の波長差が８０ｎｍ
以上の条件で発光を検出することができ、さらに好まし
い態様では該波長差が１００ｎｍ以上の条件で発光を検
出できる。このような条件では、ノイズの少ないシグナ
ルの観測が可能になり、極めて高い検出感度と検出精度
を達成できる。[0016] In general, when the signal is read using a fluorescence scanner, if the wavelength difference between the maximum values of the excitation light and the signal (emission) emitted from the compound having affinity for the multiplex nucleic acid is small, the excitation light is mixed in the signal. The problem arises. If the wavelength or concentration of an optical filter that cuts the excitation light is adjusted to solve this, the signal is cut by the filter, and the resulting signal is weakened. In order to avoid this problem, it is usually necessary to optimize various conditions such as the intensity of excitation light, the wavelength distribution (spectral line width), and the sharpness of the optical filter, which is extremely complicated and high detection is required. Achieving sensitivity is also difficult. According to a preferred embodiment of the method of the present invention, the wavelength difference between the maximum values of the excitation spectrum and the emission spectrum is 80 nm by utilizing the energy transfer between two or more kinds of compounds having affinity for multiple nucleic acids.
The light emission can be detected under the above conditions, and in a more preferable embodiment, the light emission can be detected under the condition that the wavelength difference is 100 nm or more. Under such conditions, signals with less noise can be observed, and extremely high detection sensitivity and detection accuracy can be achieved.

【００１７】さらに、２種以上の多重鎖核酸親和性化合
物が多重鎖核酸と相互作用した結果として生じる多重鎖
核酸親和性化合物の間のエネルギー移動による発光は、
溶液状態においても検出が容易である。固相担体上に固
定されたプローブ核酸と試料核酸とがハイブリダイゼー
ションした多重鎖核酸を検出する場合には、余剰の多重
鎖核酸親和性化合物を洗浄によって除去する必要がな
く、洗浄によるシグナル強度の低下がなくなるほか、煩
雑な洗浄工程そのものを省略できるという利点もある。Further, the luminescence due to energy transfer between the multi-stranded nucleic acid-affinity compounds resulting from the interaction of two or more multi-stranded nucleic acid-affinity compounds with the multi-strand nucleic acid,
Detection is easy even in a solution state. When detecting a multi-stranded nucleic acid in which the probe nucleic acid immobilized on the solid-phase carrier and the sample nucleic acid are hybridized, it is not necessary to remove the excess compound having an affinity for the multi-stranded nucleic acid by washing, and In addition to eliminating the decrease, there is an advantage that the complicated washing process itself can be omitted.

【００１８】通常、励起スペクトルと発光スペクトルの
最大値の波長差は化合物が有するクロモフォアに依存す
る。励起スペクトルと発光スペクトルの最大値の波長差
が大きなクロモフォアは、例えば、モレキュラー・プロ
ーブス社のHandbook of Fluorescent Probes and Resea
rch Chemicals 8th Edition（Molecular Probes社刊Ｃ
Ｄ−ＲＯＭ、２００１年）の中に多数記載されている。
しかし、ごく少数の例を除いては分子吸光係数が数万程
度であり、それ自体を単独で用いても高い検出感度を望
むことはできない。本発明の方法においては、それぞれ
異なる波長で発光するクロモフォアを有する２種以上の
多重鎖核酸親和性化合物を用い、該化合物間でのエネル
ギー移動の結果として生じる発光を検出するが、エネル
ギー移動の結果として生じる発光は励起スペクトルと発
光スペクトルの最大値の波長差が十分大きいことから、
それぞれの化合物自体としては励起スペクトルと発光ス
ペクトルの最大値波長差が大きい化合物を選択する必要
はない。Usually, the wavelength difference between the maximum values of the excitation spectrum and the emission spectrum depends on the chromophore of the compound. Chromophores having a large wavelength difference between the maximum values of the excitation spectrum and the emission spectrum are, for example, Handbook of Fluorescent Probes and Resea of Molecular Probes.
rch Chemicals 8th Edition (Molecular Probes C
D-ROM, 2001).
However, the molecular extinction coefficient is on the order of tens of thousands except for a few cases, and high detection sensitivity cannot be expected even when used by itself. In the method of the present invention, two or more kinds of multi-stranded nucleic acid-affinity compounds each having a chromophore that emits light at a different wavelength are used, and luminescence generated as a result of energy transfer between the compounds is detected. Since the wavelength difference between the maximum value of the excitation spectrum and the maximum value of the emission spectrum is sufficiently large,
As each compound itself, it is not necessary to select a compound having a large maximum value wavelength difference between the excitation spectrum and the emission spectrum.

【００１９】本発明の方法では、好ましくは、分子吸光
係数が大きな色素を２種以上用いることにより、効率的
なエネルギー移動を惹起させ、検出感度を高めることが
できる。例えば、分子吸光係数が７万以上、好ましくは
１０万以上、さらに好ましくは１２万以上であるクロモ
フォアを有する多重鎖核酸親和性化合物を２種以上用
い、これらの化合物間でエネルギー移動、好ましくは蛍
光共鳴エネルギー移動を起こさせることにより、励起ス
ペクトルと発光スペクトルの最大値の波長差を大きくす
ることが可能であり、検出系の自由度も大きくなる。ク
ロモフォアの分子吸光係数の上限は特に限定されない
が、通常は５０万以下である。In the method of the present invention, preferably, two or more kinds of dyes having a large molecular extinction coefficient are used, whereby efficient energy transfer can be induced and detection sensitivity can be enhanced. For example, two or more kinds of multi-chain nucleic acid affinity compounds having a chromophore having a molecular extinction coefficient of 70,000 or more, preferably 100,000 or more, more preferably 120,000 or more are used, and energy transfer between these compounds, preferably fluorescence By causing the resonance energy transfer, it is possible to increase the wavelength difference between the maximum values of the excitation spectrum and the emission spectrum, and the degree of freedom of the detection system also increases. The upper limit of the molecular extinction coefficient of chromophore is not particularly limited, but it is usually 500,000 or less.

【００２０】本発明の方法で用いる２種以上の多重鎖核
酸親和性化合物は、それぞれ異なる発光特性を有してお
り、発光スペクトルにおいて最大値を与える波長が異な
るが、２種以上の化合物間での最大値波長の差は該化合
物間でのエネルギー移動が生じる範囲内であれば特に限
定されない。通常は、エネルギー移動の結果としての励
起スペクトルと発光スペクトルの最大値の波長差が８０
ｎｍ以上の条件、好ましくは９０ｎｍ以上、さらに好ま
しくは１００ｎｍ以上の条件で発光を検出できるように
２種以上の多重鎖核酸親和性化合物を選択することが望
ましい。The two or more kinds of multi-strand nucleic acid-affinity compounds used in the method of the present invention have different emission characteristics, and the wavelength giving the maximum value in the emission spectrum is different, but between the two or more kinds of compounds. The difference in the maximum value wavelength of is not particularly limited as long as it is within a range in which energy transfer between the compounds occurs. Usually, the wavelength difference between the maximum values of the excitation spectrum and the emission spectrum as a result of energy transfer is 80
It is desirable to select two or more kinds of multi-stranded nucleic acid-affinity compounds so that luminescence can be detected under the condition of nm or more, preferably 90 nm or more, more preferably 100 nm or more.

【００２１】一般的には、短波長側の多重鎖核酸親和性
化合物の励起スペクトルの最大値を与える波長（最大蛍
光波長）と長波長側の多重鎖核酸親和性化合物の発光ス
ペクトルの最大値を与える波長（最大発光波長）との差
が８０ｎｍ以上、好ましくは９０ｎｍ以上、最も好まし
くは１００ｎｍ以上となるように多重鎖核酸親和性化合
物を選択できる。短波長側の多重鎖核酸親和性化合物と
は、２種以上の多重鎖核酸親和性化合物の最大蛍光波長
を比較した場合に最大蛍光波長が最も低波長となる化合
物のことである。短波長側の多重鎖核酸親和性化合物の
最大蛍光波長と長波長側の多重鎖核酸親和性化合物の最
大発光波長の差の上限は特に限定されないが、通常は１
０００ｎｍ以下である。Generally, the wavelength (maximum fluorescence wavelength) giving the maximum value of the excitation spectrum of the compound having the affinity for the multiplex nucleic acid on the short wavelength side and the maximum value of the emission spectrum of the compound having the affinity for the multiplex nucleic acid on the long wavelength side are set as follows. The compound having affinity for a multi-stranded nucleic acid can be selected so that the difference from the given wavelength (maximum emission wavelength) is 80 nm or more, preferably 90 nm or more, and most preferably 100 nm or more. The compound having an affinity for a short-wavelength multi-stranded nucleic acid is a compound having the lowest maximum fluorescence wavelength when the maximum fluorescence wavelengths of two or more types of multi-stranded nucleic acid affinity compounds are compared. The upper limit of the difference between the maximum fluorescence wavelength of the compound having an affinity for the multi-stranded nucleic acid on the short wavelength side and the maximum emission wavelength of the compound having an affinity for the multi-stranded nucleic acid on the long wavelength side is not particularly limited, but is usually 1
It is 000 nm or less.

【００２２】本発明の方法に利用可能な多重鎖核酸親和
性化合物としては、例えば核酸染色剤を挙げることがで
きる。核酸染色剤としては、臭化エチジウムをはじめと
して、モレキュラー・プローブス社のHandbook of Fluo
rescent Probes and ResearchChemicals 8th Edition
（Molecular Probes社刊ＣＤ−ＲＯＭ、２００１年）の
中に核酸染色剤として記載されている種々の化合物が知
られている。これらの色素の多くは核酸が存在しない場
合には蛍光強度が小さく、核酸との相互作用により高い
蛍光強度を示すことが知られている。Examples of the compound having affinity for a multi-stranded nucleic acid that can be used in the method of the present invention include nucleic acid stains. Nucleic acid stains include ethidium bromide and the Molecular Probes Handbook of Fluo
rescent Probes and Research Chemicals 8th Edition
Various compounds described as nucleic acid stains in (Molecular Probes, CD-ROM, 2001) are known. It is known that many of these dyes have low fluorescence intensity in the absence of nucleic acid, and exhibit high fluorescence intensity due to interaction with nucleic acid.

【００２３】本発明で特に好ましく用いられる多重鎖核
酸親和性化合物は上記一般式（Ｉ）で表される。一般式
（Ｉ）において、好ましいＩＣとしては平面３環性構造
または平面４環性構造を有する基を挙げることができ
る。平面３環性構造の例としては、例えば、アントラセ
ン、アントラキノン、フェナントレン、フェナントロリ
ン、キサンテン、カルバゾール、フェナントリジン、フ
ェナジン、アクリジンなどが挙げられる。平面４環性構
造の例としては、平面３環性構造の例として挙げたもの
にさらに平面性の環構造を縮合させたものが挙げられ
る。より好ましい構造としては「分析化学」、第４８
巻、１２号、１０９５頁−１１０５頁（１９９９年）に
記載の縫い込み型インターカレーターとして記載されて
いる骨格が挙げられる。The compound having affinity for a multi-stranded nucleic acid which is particularly preferably used in the present invention is represented by the above general formula (I). In the general formula (I), a preferred IC is a group having a planar tricyclic structure or a planar tetracyclic structure. Examples of the planar tricyclic structure include anthracene, anthraquinone, phenanthrene, phenanthroline, xanthene, carbazole, phenanthridine, phenazine, acridine and the like. As an example of the planar 4-ring structure, a structure obtained by further condensing a planar ring structure with the one given as an example of the planar 3-ring structure can be mentioned. More preferable structure is “Analytical chemistry”, No. 48
The skeleton described as the sewn-in intercalator described in Vol. 12, No. 10, pages 1095 to 1105 (1999) can be mentioned.

【００２４】Ｌは−Ｃ(Ｒ)(Ｒ')−、−Ｏ−、−Ｎ(Ｒ)
−、−Ｎ⁺(Ｒ)(Ｒ')−・Ｘ^-、−Ｓ(Ｏ) _r−、−ＣＯ−、
−Ｓ(＝ＮＲ)_t−又はアリーレン基の中から選ばれる２
価の基、又はこれらを組み合わせて得られる２価の基が
好ましい。Ｒ及びＲ'はそれぞれ独立に水素原子、アル
キル基、アリール基、アルコキシ基、アミノ基、ハロゲ
ン原子、ニトロ基、スルホ基、カルボキシル基、アンモ
ニオ基から選ばれる基などを示す。ｒは０、１、又は２
を表し、ｔは１又は２を示す。L is -C (R) (R ')-, -O-, -N (R)
-, -N⁺(R) (R ')-・ X^-, -S (O) _r-, -CO-,
-S (= NR)_t-Or 2 selected from arylene groups
A divalent group, or a divalent group obtained by combining these,
preferable. R and R'are each independently a hydrogen atom,
Kill group, aryl group, alkoxy group, amino group, halogen
Group atom, nitro group, sulfo group, carboxyl group,
A group selected from nio groups and the like are shown. r is 0, 1, or 2
And t represents 1 or 2.

【００２５】ＳＩＧは検出可能なシグナルを発するクロ
モフォアを表すが、発光性化合物の残基であることが最
も好ましい。発光性化合物の中では蛍光性色素が好まし
く、蛍光性色素としてはシアニン色素、オキソノール色
素、又はキサンテン色素が好ましい。ＳＩＧで表される
基を与える特に好ましい蛍光性の色素化合物としては、
例えば、モレキュラー・プローブス社のHandbook of Fl
uorescent Probes and Research Chemicals 8th Editio
n（Molecular Probes社刊ＣＤ−ＲＯＭ、２００１年）
の中に記載されている色素化合物や、特開２００１−２
７０９５７号公報に記載の色素化合物、特開２００１−
１６３８９５号公報に記載の化合物の色素部分に相当す
るもの、あるいはアマシャム・ファルマシア社から販売
されているＣｙ３又はＣｙ５などの蛍光性色素が挙げら
れる。SIG represents a chromophore which emits a detectable signal, most preferably the residue of a luminescent compound. Among the light emitting compounds, a fluorescent dye is preferable, and a cyanine dye, an oxonol dye, or a xanthene dye is preferable as the fluorescent dye. As a particularly preferable fluorescent dye compound which gives a group represented by SIG,
For example, the Molecular Probes Handbook of Fl
uorescent Probes and Research Chemicals 8th Editio
n (Molecular Probes, CD-ROM, 2001)
And the dye compounds described in JP-A-2001-2
Dye compound described in JP 70957 A, JP 2001-2001A.
Examples thereof include those corresponding to the dye portion of the compound described in Japanese Patent No. 163895, or fluorescent dyes such as Cy3 and Cy5 sold by Amersham Pharmacia.

【００２６】本発明の方法の典型的態様は、下記の工
程： (1)プローブ核酸に対して試料核酸を相互作用させ、該
プローブ核酸と該試料核酸とのハイブリダイゼーション
によりハイブリッド多重鎖核酸を形成する工程； (2)それぞれ異なる波長で発光する２種以上の多重鎖核
酸親和性化合物を該ハイブリッド多重鎖核酸に対して相
互作用させる工程；及び (3)上記２種以上の多重鎖核酸親和性化合物と多重鎖核
酸とが相互作用することによって生じる多重鎖核酸親和
性化合物間のエネルギー移動の結果として生じる発光を
検出する工程を含んでいる。A typical embodiment of the method of the present invention includes the following steps: (1) A sample nucleic acid is allowed to interact with a probe nucleic acid, and a hybrid multi-stranded nucleic acid is formed by hybridization of the probe nucleic acid and the sample nucleic acid. (2) interacting two or more kinds of multi-stranded nucleic acid-affinity compounds each emitting at a different wavelength with the hybrid multi-stranded nucleic acid; and (3) the above-mentioned two or more kinds of multi-stranded nucleic acid affinity Detecting the luminescence resulting from the energy transfer between the compound and the compound having affinity for the multiplex nucleic acid caused by the interaction between the compound and the multiplex nucleic acid.

【００２７】プローブ核酸は溶液中に存在していてもよ
いが、固相担体に固定されていることが好ましい。固相
担体としては、疎水性の担体、あるいは親水性の低い担
体が好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の
低いものも好ましく用いることができる。固相担体の材
質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミック
ス若しくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタ
レート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカー
ボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等
のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質
セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織捕
物、不織布、減紙、短繊維、又はメンブレンフィルター
等の多孔質物質などを拳げることができる。固相担体の
形状及び大きさは特に限定されず、平板状、球状、又は
棒状等であってもよく、ナノメートルオーダーのものか
らセンチメートルオーダーのものであってもよい。多孔
質物質の細孔の大きさは、例えば２〜１０００ｎｍの範
囲にあることが好ましく、２〜５００n mの範囲にある
ことが特に好ましい。表面処理の容易さや電気化学的方
法による解析の容易さの観点から、固相担体の材質はガ
ラス又はシリコンであることが特に好ましい。平板プレ
ート状の固相担体（以下、このような形状の固相担体を
「基板」と呼ぶ場合があり、本発明の好ましい態様とし
て固相担体が基板である場合について説明する場合があ
る）の場合、固相担体の厚さは１００〜２０００μｍの
範囲にあることが好ましい。The probe nucleic acid may be present in the solution, but is preferably immobilized on a solid phase carrier. As the solid phase carrier, a hydrophobic carrier or a carrier having low hydrophilicity is preferable. Further, a material having unevenness on the surface and having low flatness can also be preferably used. Materials for the solid phase carrier include glass, cement, ceramics such as ceramics or new ceramics, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate of bisphenol A, polystyrene, polymer such as polymethylmethacrylate, silicon, activated carbon, porous glass, porous Ceramics, porous silicon, porous activated carbon, woven material, non-woven fabric, reduced paper, short fibers, or porous materials such as membrane filters can be used. The shape and size of the solid phase carrier are not particularly limited, and may be flat, spherical, rod-shaped, or the like, and may be in the order of nanometer to the order of centimeter. The size of the pores of the porous substance is preferably, for example, in the range of 2 to 1000 nm, and particularly preferably in the range of 2 to 500 nm. From the viewpoint of easiness of surface treatment and easiness of analysis by an electrochemical method, it is particularly preferable that the material of the solid phase carrier is glass or silicon. A flat plate-shaped solid phase carrier (hereinafter, such a solid phase carrier may be referred to as a “substrate”, and a case where the solid phase carrier is a substrate may be described as a preferred embodiment of the present invention). In this case, the thickness of the solid phase carrier is preferably in the range of 100 to 2000 μm.

【００２８】固相担体上へのプローブ核酸の固定化法
は、核酸断片の種類及び固相担体の種類に応じて適当な
方法を選択することができる（蛋白質・核酸・酵素，Ｖ
ｏｌ．４３，Ｎｏ．１３，２００４−２０１１（１９９
８））。例えば、核酸断片がｃＤＮＡやＰＣＲ産物の場
合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリシン、ポリエ
チレンイミン、ポリアルキルアミン等の陽イオンで表面
処理した基板に静電結合させる方法を用いることができ
る。表面処理された基板上に、さらに電荷を有する親水
性の高分子物質等からなる層や架橋剤からなる層を設け
てもよい。また、基板によっては、その基板中に親水性
の高分子等を含ませることも可能であり、このような処
理を施した基板も好ましく用いることができる。表面処
理を行うことによって、疎水性の基板、あるいは親水性
に乏しい基板と核酸断片との静電的な相互作用を促進す
ることができる。このような場合、基板としては、表面
処理の容易さと解析の容易さのため、スライドガラスを
用いることが好ましい。As the method for immobilizing the probe nucleic acid on the solid phase carrier, an appropriate method can be selected depending on the type of nucleic acid fragment and the type of solid phase carrier (protein, nucleic acid, enzyme, V
ol. 43, No. 13, 2004-2011 (199
8)). For example, when the nucleic acid fragment is a cDNA or PCR product, it is possible to use a method of electrostatically binding to a substrate surface-treated with a cation such as polylysine, polyethyleneimine, or polyalkylamine using the charge of DNA. . A layer made of a hydrophilic polymer substance having a charge or a layer made of a crosslinking agent may be further provided on the surface-treated substrate. In addition, depending on the substrate, it is possible to include a hydrophilic polymer in the substrate, and a substrate subjected to such a treatment can also be preferably used. By performing the surface treatment, electrostatic interaction between the hydrophobic substrate or the substrate having poor hydrophilicity and the nucleic acid fragment can be promoted. In such a case, it is preferable to use a slide glass as the substrate because of the ease of surface treatment and the ease of analysis.

【００２９】合成ヌクレオチドを固定する場合には、基
板上で直接合成する方法、あるいは予め末端に共有結合
のための官能基を導入したオリゴマーを合成し、表面処
理した基板に共有結合させる方法を用いることができ
る。官能基としてはアミノ基、アルデヒド基、メルカプ
ト基、ビオチン等を挙げることができる。基板として
は、ガラスやシリコンを用いることが好ましく、ガラス
やシリコンの表面処理には公知のシランカップリング剤
を用いることが好ましい。In the case of immobilizing the synthetic nucleotide, a method of directly synthesizing on a substrate or a method of previously synthesizing an oligomer into which a functional group for covalent bonding is introduced at the terminal and then covalently bonding to a surface-treated substrate is used. be able to. Examples of the functional group include an amino group, an aldehyde group, a mercapto group and biotin. As the substrate, it is preferable to use glass or silicon, and it is preferable to use a known silane coupling agent for the surface treatment of glass or silicon.

【００３０】基板上に固定される核酸は検出対象の試料
核酸であってもよいが、以下、便宜上、基板に固定する
核酸をプローブ核酸（以下、プローブ核酸の代表例とし
て「ＤＮＡ断片」について説明する。）とし、該プロー
ブ核酸に相互作用させる核酸を試料核酸として説明す
る。The nucleic acid immobilized on the substrate may be a sample nucleic acid to be detected, but hereinafter, for convenience, the nucleic acid immobilized on the substrate will be described as a probe nucleic acid (hereinafter, a "DNA fragment" is described as a typical example of the probe nucleic acid). The nucleic acid that interacts with the probe nucleic acid will be described as a sample nucleic acid.

【００３１】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅して
調製する。ＰＣＲ法によって増幅しないＤＮＡ断片も好
ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多
型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、
変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成
し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列
分析の場合には、４ⁿ（ｎは塩基の長さ）種のオリゴヌ
クレオチドを合成したものを使用することが好ましい。
ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によ
って予めその配列が決定されていることが好ましい。Ｄ
ＮＡ断片は、２〜５０量体であることが好ましく、１０
〜２５量体であることが特に好ましい。DNA fragments can be divided into two types depending on the purpose. To examine the expression of the gene, the cD
It is preferable to use NA, a part of cDNA, or a polynucleotide such as EST. The function of these polynucleotides may be unknown, but in general, based on the sequences registered in the database, a cDNA library, a genomic library, or a whole genome as a template is used as a DNA by the PCR method. Amplify and prepare the fragment. A DNA fragment that is not amplified by the PCR method can also be preferably used. In addition, in order to investigate mutations and polymorphisms in genes, based on known standard sequences,
It is preferable to synthesize various oligonucleotides corresponding to mutations and polymorphisms and use them. Furthermore, in the case of base sequence analysis, it is preferable to use 4 ⁿ (n is the base length) kinds of synthesized oligonucleotides.
The base sequence of the DNA fragment is preferably determined in advance by a general base sequence determination method. D
The NA fragment is preferably a 2-50 mer, and 10
It is particularly preferable that it is a 25-mer.

【００３２】ＤＮＡ断片の固相担体上への点着は、例え
ば、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解又は分散して水性液を
調製し、この水性液を９６穴又は３８４穴プラスチック
プレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等
を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好まし
い。For the spotting of the DNA fragment on the solid phase carrier, for example, the DNA fragment is dissolved or dispersed in an aqueous medium to prepare an aqueous solution, and the aqueous solution is dispensed into a 96-well or 384-well plastic plate. It is preferable that the dispensed aqueous liquid is dropped onto the surface of the solid phase carrier using a spotter device or the like.

【００３３】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片を溶解又は分散させた水性液中に高沸点の物
質を添加してもよい。高沸点の物質としては、ＤＮＡ断
片を溶解又は分散させた水性液に溶解し得るものであっ
て、ＤＮＡ断片と試料核酸とのハイブリダイゼーション
を妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質が好ま
しい。このような物質としては、グリセリン、エチレン
グリコール、ジメチルスルホキシド、及び低分子の親水
性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとし
ては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、
ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。ポ
リマーの分子量は１０³〜１０⁵の範囲にあることが好ま
しい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチ
レングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセ
リンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度
は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１〜２容量％の範囲に
あることが好ましく、０．５〜１容量％の範囲にあるこ
とが特に好ましい。また、同じ目的のために、ＤＮＡ断
片を点着した後の固相担体を９０％以上の湿度及び２５
〜５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。In order to prevent the DNA fragments from drying after spotting,
A substance having a high boiling point may be added to an aqueous liquid in which the DNA fragment is dissolved or dispersed. The substance having a high boiling point is preferably a substance which can be dissolved in an aqueous liquid in which DNA fragments are dissolved or dispersed, which does not interfere with the hybridization between the DNA fragments and the sample nucleic acid, and has a low viscosity. Such substances include glycerin, ethylene glycol, dimethylsulfoxide, and low molecular weight hydrophilic polymers. As the hydrophilic polymer, polyacrylamide, polyethylene glycol,
Examples thereof include sodium polyacrylate and the like. The molecular weight of the polymer is preferably in the range of 10 ³ to 10 ⁵ . As the substance having a high boiling point, it is more preferable to use glycerin or ethylene glycol, and it is particularly preferable to use glycerin. The concentration of the substance having a high boiling point is preferably in the range of 0.1 to 2% by volume, particularly preferably in the range of 0.5 to 1% by volume, in the aqueous solution of the DNA fragment. For the same purpose, the solid phase carrier after spotting the DNA fragments should have a humidity of 90% or more and 25% or more.
It is also preferable to place in an environment of a temperature range of -50 ° C.

【００３４】ＤＮＡ断片を固相担体に点着後、紫外線、
水素化ホウ素ナトリウム、又はシッフ試薬などによる後
処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を
組み合わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理など
を組み合わせて行うことが特に好ましい。点着後にイン
キュベーションを行うことも好ましい。インキュベート
後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ま
しい。After the DNA fragment is spotted on the solid-phase carrier, ultraviolet rays,
Post-treatment with sodium borohydride, Schiff reagent, or the like may be performed. These post-treatments may be performed by combining a plurality of types, and it is particularly preferable to perform a combination of heat treatment and ultraviolet treatment. It is also preferable to carry out incubation after spotting. After incubation, it is preferable to wash and remove unspotted DNA fragments.

【００３５】ＤＮＡ断片の密度は、固相担体表面に対し
て１０²〜１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが好まし
い。ＤＮＡ断片の量は、１〜１０^-15モルの範囲であ
り、質量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点
着によって、ＤＮＡ断片の水性液は固相担体表面にドッ
トの形状で固定される。ドットの形状は通常ほとんど円
形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量
的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドッ
ト間の距離は、０〜１．５ｍｍの範囲にあることが好ま
しく、１００〜３００μｍの範囲にあることが特に好ま
しい。１つのドットの大きさは、直径が５０〜３００μ
ｍの範囲にあることが好ましい。点着する水性液の容量
は１００ｐＬ〜１μＬの範囲にあることが好ましく、１
〜１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。The density of DNA fragments is preferably in the range of 10 ² to 10 ⁵ types / cm ² with respect to the surface of the solid phase carrier. The amount of DNA fragment is in the range of 1 to 10 ^-15 mol, and the mass is preferably several ng or less. By the spotting, the aqueous solution of DNA fragments is fixed in the form of dots on the surface of the solid-phase carrier. The dot shape is usually almost circular. The fact that there is no change in shape is important for quantitative analysis of gene expression and analysis of single nucleotide mutations. The distance between dots is preferably in the range of 0 to 1.5 mm, and particularly preferably in the range of 100 to 300 μm. The size of one dot is 50 to 300μ in diameter.
It is preferably in the range of m. The volume of the aqueous liquid to be spotted is preferably in the range of 100 pL to 1 μL.
It is particularly preferable to be in the range of -100 nL.

【００３６】上記の工程によって作製されたＤＮＡ断片
が固定された固相担体（以下、「ＤＮＡチップ」とい
う）の寿命は、ｃＤＮＡを固定したｃＤＮＡチップでは
数週間、オリゴＤＮＡを固定したオリゴＤＮＡチップで
はさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝
子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多
型解析等に利用できる。The life of the solid phase carrier (hereinafter referred to as "DNA chip") on which the DNA fragment produced by the above steps is fixed is several weeks for the cDNA chip on which the cDNA is fixed, and the oligo DNA chip on which the oligo DNA is fixed. Then it is even longer. These DNA chips can be used for gene expression monitoring, nucleotide sequence determination, mutation analysis, polymorphism analysis, and the like.

【００３７】試料核酸としては、その配列や機能が未知
であるＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片を含む試料を用いるこ
とが好ましい。試料核酸は、遺伝子発現を調べる目的で
は、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが
好ましい。試料がゲノムである場合には、赤血球を除く
任意の組織サンプルから試料核酸を単離することができ
る。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液りンパ球、皮
膚、毛髪、***等であることが好ましい。試料がｍＲＮ
Ａの場合には、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから
抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応によ
りｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、
シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）若しくはチミン（Ｔ）
であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り
込ませてｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとし
ては、化学的な安定性の観点からｄＣＴＰを用いること
が好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍ
ＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ
以下であることが好ましい。ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断
片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸は低分子化
しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮ
Ａの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識するこ
とが好ましい。As the sample nucleic acid, it is preferable to use a sample containing a DNA fragment or an RNA fragment whose sequence or function is unknown. The sample nucleic acid is preferably isolated from a eukaryotic cell or tissue sample for the purpose of examining gene expression. If the sample is genomic, the sample nucleic acid can be isolated from any tissue sample except red blood cells. The arbitrary tissue excluding red blood cells is preferably peripheral blood lymphocytes, skin, hair, semen and the like. Sample is mRN
In the case of A, it is preferable to extract from a tissue sample in which mRNA is expressed. mRNA is dNTP by reverse transcription (“dNTP” has a base of adenine (A),
Cytosine (C), guanine (G) or thymine (T)
Is a deoxyribonucleotide. Is preferably incorporated into cDNA. As the dNTP, it is preferable to use dCTP from the viewpoint of chemical stability. M required for one hybridization
The amount of RNA varies depending on the amount of liquid and the labeling method, but it is several μg
The following is preferable. When the DNA fragment on the DNA chip is oligo DNA, it is desirable that the sample nucleic acid has a low molecular weight. In prokaryotic cells, the mRN
Since it is difficult to selectively extract A, it is preferable to label total RNA.

【００３８】ハイブリダイゼーションは、試料核酸を溶
解又は分散させた水性液を９６穴又は３８４穴プラスチ
ックプレートに分注しておき、上記で作製したＤＮＡチ
ップ上のＤＮＡ断片の位置に点着することによって行う
ことができる。点着すべき水性液の容量は、例えば１〜
１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイ
ゼーションは、通常、室温〜７０℃の温度範囲で６〜２
０時間の範囲で行うことができる。Hybridization is carried out by dispensing an aqueous solution in which a sample nucleic acid is dissolved or dispersed into a 96-well or 384-well plastic plate and spotting the DNA fragments on the DNA chip prepared above. It can be carried out. The volume of the aqueous liquid to be spotted is, for example, 1 to
It is preferably in the range of 100 nL. Hybridization usually takes place in a temperature range of room temperature to 70 ° C. of 6 to 2
It can be performed in the range of 0 hours.

【００３９】ハイブリダイゼーション終了後、界面活性
剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の
試料核酸を除去することが好ましい。界面活性剤として
は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが
好ましく、緩衝液としては、クエン酸緩衝被、リン酸緩
衝液、ホウ酸緩衝被、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を
用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが
特に好ましい。もっとも、ハイブリダイゼーションに際
して一般式（Ｉ）で表される化合物を共存させ、ハイブ
リッド多重鎖核酸と該化合物とを相互作用させる場合に
は、上記と同様に洗浄を行ってもよいが、蛍光共鳴エネ
ルギー移動現象を利用してエネルギー移動の結果として
生じる発光を検出する場合などには洗浄を行わず、その
まま光学的検出を行うことも可能である。After the hybridization, it is preferable to wash with a mixed solution of a surfactant and a buffer solution to remove unreacted sample nucleic acid. As the surfactant, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferably used, and as the buffer, citrate buffer, phosphate buffer, borate buffer, Tris buffer, Good buffer, etc. are used. However, it is particularly preferable to use a citrate buffer. However, in the case of allowing the compound represented by the general formula (I) to coexist during hybridization and allowing the hybrid multi-stranded nucleic acid to interact with the compound, washing may be performed in the same manner as above, but the fluorescence resonance energy When detecting the light emission resulting from the energy transfer using the transfer phenomenon, it is possible to perform the optical detection as it is without cleaning.

【００４０】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、試料核酸の使用量が非常に少ないことで
ある。そのため、固相担体に固定するＤＮＡ断片の鎖長
や試料核酸の種類によりハイブリダイゼーションの最適
条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低
発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイ
ブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異
の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うこ
とが好ましい。A characteristic of hybridization using a DNA chip is that the amount of sample nucleic acid used is very small. Therefore, it is necessary to set the optimum hybridization conditions depending on the chain length of the DNA fragment immobilized on the solid phase carrier and the type of sample nucleic acid. For analysis of gene expression, it is preferable to carry out hybridization for a long time so that a gene with low expression can be sufficiently detected. For the detection of single nucleotide mutation, it is preferable to carry out hybridization for a short time.

【００４１】２種以上の多重鎖核酸親和性化合物をハイ
ブリッド多重鎖核酸に対して相互作用させる工程は、上
記ハイブリダイゼーションと同時に行ってもよいが、ハ
イブリダイゼーションのあとに行ってもよい。２種以上
の多重鎖核酸親和性化合物をハイブリダイゼーションの
工程において混合してもよく、あるいはハイブリダイゼ
ーション工程において１種以上の多重鎖核酸親和性化合
物を混合し、ハイブリダイゼーションの後に上記とは異
なる１種以上の多重鎖核酸親和性化合物を混合してもよ
い。相互作用工程の温度は特に限定されないが、ハイブ
リダイゼーションに際して多重鎖核酸親和性化合物を添
加する場合にはすでに説明したハイブリダイゼーション
の温度で行えばよく、ハイブリダイゼーションの後に多
重鎖核酸親和性化合物を添加する場合には、ハイブリッ
ド多重鎖核酸が解離しない温度で行う必要がある。例え
ば、１０℃〜７０℃の範囲が好ましく、２５℃〜６５℃
の範囲がより好ましい。The step of interacting two or more kinds of compounds having an affinity for a multi-stranded nucleic acid with a hybrid multi-stranded nucleic acid may be carried out simultaneously with the above-mentioned hybridization, or may be carried out after the hybridization. Two or more kinds of multi-strand nucleic acid affinity compounds may be mixed in the hybridization step, or one or more kinds of multi-strand nucleic acid affinity compounds may be mixed in the hybridization step and different from the above after hybridization. One or more multi-stranded nucleic acid affinity compounds may be mixed. The temperature of the interaction step is not particularly limited, but in the case of adding a compound having affinity for a multi-stranded nucleic acid at the time of hybridization, it may be carried out at the temperature of hybridization already described. In that case, it is necessary to carry out at a temperature at which the hybrid multi-stranded nucleic acid does not dissociate. For example, the range of 10 ° C to 70 ° C is preferable, and 25 ° C to 65 ° C.
Is more preferable.

【００４２】多重鎖核酸親和性化合物をハイブリッド多
重鎖核酸に対して接触させる際の溶媒としては、水又は
各種緩衝液のほか、水に混和しうる有機溶媒と水との混
合溶媒を適宜用いることができる。水に混和しうる有機
溶媒としてはジメチルスルホキシド、ジメチルホルムア
ミド、メタノール、エタノール、エチレングリコール、
グリセリンなどが好ましい。また、緩衝液とこれらの有
機溶媒を混合して用いることも好ましい。As the solvent for contacting the compound having affinity for the multi-stranded nucleic acid with the hybrid multi-stranded nucleic acid, water or various buffers, or a mixed solvent of water and an organic solvent miscible with water is appropriately used. You can Examples of the organic solvent miscible with water include dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, methanol, ethanol, ethylene glycol,
Glycerin and the like are preferable. It is also preferable to use a mixture of a buffer solution and these organic solvents.

【００４３】多重鎖核酸親和性化合物の使用量は、用い
るプローブ核酸の種類や塩基数などの条件により異なる
が、プローブ核酸の総塩基数に対して１０^-3〜１０⁷倍
程度、さらに好ましくは１０^-2〜１０⁵倍程度の分子数
を供給するように溶液濃度を調整することが好ましい。
また、本発明の方法において、２種以上の多重鎖核酸親
和性化合物は、それぞれこの範囲で使用することがで
き、それぞれの化合物のクロモフォアの分子吸光係数や
発光量子収率に合わせて検出感度が最適になるように使
用量を調節することができる。The amount of the compound having affinity for the multi-stranded nucleic acid varies depending on the conditions such as the type of probe nucleic acid used and the number of bases, but is about 10 ⁻³ to 10 ⁷ times, and more preferably the total number of bases of the probe nucleic acid. It is preferable to adjust the solution concentration so that the number of molecules is about 10 ^-2 to 10 ⁵ times.
Further, in the method of the present invention, two or more kinds of compounds having affinity for a multi-stranded nucleic acid can be used within the respective ranges, and the detection sensitivity is adjusted according to the molecular extinction coefficient of the chromophore or the emission quantum yield of each compound. The amount used can be adjusted to be optimal.

【００４４】多重鎖核酸親和性化合物をハイブリッド多
重鎖核酸に接触させた後、過剰の多重鎖核酸親和性化合
物を除去するために洗浄を行うことが好ましい。この場
合にはハイブリダイゼーション後の洗浄と同様の操作で
行うことができる。もっとも、本発明の方法ではこの洗
浄を行わなくても光学的検出が可能であり、洗浄操作を
省略することも好ましい。After the compound having affinity for the multi-stranded nucleic acid is brought into contact with the hybrid multi-stranded nucleic acid, washing is preferably carried out to remove the excess compound having the affinity for the multi-stranded nucleic acid. In this case, the same operation as washing after hybridization can be performed. However, in the method of the present invention, optical detection is possible without performing this washing, and it is also preferable to omit the washing operation.

【００４５】多重鎖核酸親和性化合物間の相互作用を光
学的手段により検出することができるが、溶液系でハイ
ブリッド多重鎖核酸を検出する場合には、通常の蛍光光
度計を用いることもでき、あるいは多数同時検出が可能
な点及び感度の点などから蛍光スキャナーを用いて行う
ことも好ましい。また、蛍光量の測定は、ハイブリダイ
ゼーション後の固相担体を乾燥させるか、あるいは水性
溶媒の存在下に、従来の蛍光レーザースキャナー法によ
って行ってもよく、あるいは固相担体を乾燥させないよ
うにカバーガラスで覆い、冷却ＣＣＤ（電荷結合素子）
法によって測定を行ってもよい。Although the interaction between the compounds having affinity for the multi-stranded nucleic acid can be detected by an optical means, in the case of detecting the hybrid multi-stranded nucleic acid in a solution system, an ordinary fluorometer can be used, Alternatively, it is also preferable to use a fluorescence scanner from the viewpoint of simultaneous detection of a large number and the sensitivity. The amount of fluorescence may be measured by drying the solid phase carrier after hybridization, or by a conventional fluorescence laser scanner method in the presence of an aqueous solvent, or by covering the solid phase carrier so as not to dry it. Covered with glass, cooled CCD (charge coupled device)
You may measure by a method.

【００４６】本発明の方法を行うにあたり、核酸試料を
適宜の手段で標識しておき、多重鎖核酸親和性化合物に
よる検出と組み合わせてハイブリッド多重鎖核酸を検出
してもよい。例えば、核酸試料を蛍光色素で標識してお
いてもよく、あるいはＲＩ法、非ＲＩ法としてビオチン
法又は化学発光法などの標識手段を採用できる。例え
ば、蛍光物質としては核酸の塩基部分と結合できるもの
であれば何れも用いることができるが、シアニン色素
（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５
等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−ア
セチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ
（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。In carrying out the method of the present invention, the nucleic acid sample may be labeled by an appropriate means, and the hybrid multi-stranded nucleic acid may be detected in combination with the detection by the compound having affinity for the multi-stranded nucleic acid. For example, the nucleic acid sample may be labeled with a fluorescent dye, or a labeling means such as a biotin method or a chemiluminescence method can be adopted as the RI method or the non-RI method. For example, any fluorescent substance can be used as long as it can bind to the base portion of a nucleic acid, and a cyanine dye (for example, Cy3 and Cy5 of CyDye ™ series) can be used.
Etc.), Rhodamine 6G reagent, N-acetoxy-N2-acetylaminofluorene (AAF) or AAIF
(Iodine derivative of AAF) can be used.

【００４７】[0047]

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 例１：ＤＮＡハイブリッドの検出 （１）ＤＮＡ断片固定スライドの作成 ２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆スライド（Ａ）を３質量％化合物ＶＳ−１
溶液に、１０分間浸した後取り出し、エタノールで洗浄
後、１２０℃で１５分間乾燥して、ＶＳ−１被覆スライ
ド（Ｂ）を作成した。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Example 1: Detection of DNA hybrid (1) Preparation of slide for fixing DNA fragment 2% by weight of aminopropylethoxysilane (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) in ethanol solution, slide glass (25
(mm × 75 mm) was soaked for 10 minutes, taken out, washed with ethanol, and then dried at 110 ° C. for 10 minutes to prepare a silane compound-coated slide (A). Then, this silane compound-coated slide (A) was mixed with 3% by mass of compound VS-1.
It was immersed in the solution for 10 minutes, taken out, washed with ethanol, and dried at 120 ° C. for 15 minutes to prepare a VS-1 coated slide (B).

【００４８】[0048]

【化１】 [Chemical 1]

【００４９】（２）ハイブリッド多重核酸の検出 ３’未端がアミノ基で修飾された配列表の配列番号１に
示すＤＮＡ断片を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）に
分散した水性液（１×１０^-6Ｍ、１μＬ）を上記（１）
で得たスライド（Ｃ）に点着した。直ちに、点着後のス
ライドを６０℃、湿度９０％にて１時間放置した後、１
２０℃で２０分間加熱した。このスライドを０．１質量
％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２
×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳ
Ｃ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、
０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上
記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ
１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸留水で洗浄し、
室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド
（Ｄ）を得た。(2) Detection of Hybrid Multiplex Nucleic Acid Aqueous solution obtained by dispersing the DNA fragment shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing in which the 3'end is modified with an amino group in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.8) ( 1 × 10 ⁻⁶ M, 1 μL) above (1)
It was spotted on the slide (C) obtained in. Immediately, leave the slide after spotting at 60 ° C and 90% humidity for 1 hour, then
Heated at 20 ° C. for 20 minutes. Slide this slide with 0.1 mass% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 2 x SSC (2
× SSC: A solution obtained by doubling the stock solution of SSC, SS
C: standard salt-citrate buffer solution) twice,
It was sequentially washed once with a 0.2 × SSC aqueous solution. Then, the slide after the above washing is treated with a 0.1 M glycine aqueous solution (pH
10) Immerse in 1 hour and 30 minutes, then wash with distilled water,
It was dried at room temperature to obtain a slide (D) on which the DNA fragment was fixed.

【００５０】このスライドに対して先ほどのＤＮＡ配列
と相補的な配列を有する６０m e rのＤＮＡをハイブリ
ダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣおよび１０質量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させ、多重鎖核
酸親和性化合物（比較例１、本発明１、及び本発明２と
して下記に示した。各々０．１ｍＭのジメチルスルホキ
シド溶液を１μＬ）添加して、上記で得たスライド
（Ｄ）に付与して表面を顕微鏡用カバーガラスで保護し
た後、モイスチャンバー内にて６０℃で１０時間インキ
ュベートした。このスライドガラスを洗浄せずに蛍光ス
キャニング装置で測定した。励起波長は短波長側の色素
の最大吸収波長にできるだけ近い波長で励起し、検出波
長はフィルターを調節して最大値が得られるようにし
た。A 60-mer DNA having a sequence complementary to the above-mentioned DNA sequence for this slide was dispersed in a hybridization solution (mixed solution of 4 × SSC and 10% by mass SDS) (20 μL), and multiplexed. A compound having an affinity for a strand nucleic acid (Comparative example 1, present invention 1 and present invention 2 is shown below. 1 μL of 0.1 mM dimethyl sulfoxide solution each) was added and applied to the slide (D) obtained above. The surface was protected with a microscope cover glass and then incubated in a moist chamber at 60 ° C. for 10 hours. The slide glass was measured with a fluorescence scanning device without washing. The excitation wavelength was as close as possible to the maximum absorption wavelength of the dye on the short wavelength side, and the detection wavelength was adjusted by a filter so that the maximum value was obtained.

【００５１】次いで、このスライドを０．１質量％ＳＤ
Ｓと２×ＳＳＣとの混合溶液で洗浄した後、６００ｒｐ
ｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。それぞれをスラ
イドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測
定した。励起波長は短波長側の色素の最大吸収波長にで
きるだけ近い波長で励起し、検出波長はフィルターを調
節して最大値が得られるようにした。また、同様の実験
を相補的な配列を有する６０ｍｅｒを添加しない実験を
行った。Then, this slide is used for 0.1 mass% SD.
After washing with a mixed solution of S and 2 × SSC, 600 rp
It was centrifuged at m for 20 seconds and dried at room temperature. The fluorescence intensity of the surface of each slide glass was measured with a fluorescence scanning device. The excitation wavelength was as close as possible to the maximum absorption wavelength of the dye on the short wavelength side, and the detection wavelength was adjusted by a filter so that the maximum value was obtained. In addition, the same experiment was conducted without adding a 60mer having a complementary sequence.

【００５２】表１では、相補鎖を添加したときの洗浄後
に測定した比較例１のサンプルの蛍光強度を１００とし
て相対的な蛍光強度を数値で示した。この結果、比較例
１では蛍光共鳴エネルギー移動が起こらないため、洗浄
しない場合には全くシグナルが得られず、バックグラウ
ンドも高い。これに対して、本発明１及び本発明２のサ
ンプルでは洗浄しない場合でもシグナルを検出すること
ができ、洗浄後においてもバックグラウンドが低く、良
好なＳ／Ｎが得られた。なお、比較例１では比較例１の
化合物を励起して該化合物からの発光を検出した。本発
明１及び本発明２のサンプルでは短波長側の化合物を励
起し、長波長側の化合物からの発光を検出した。In Table 1, the fluorescence intensity of the sample of Comparative Example 1 measured after washing when the complementary strand was added is set to 100, and the relative fluorescence intensity is shown numerically. As a result, in Comparative Example 1, since fluorescence resonance energy transfer does not occur, no signal is obtained without washing and the background is high. On the other hand, with the samples of the present invention 1 and the present invention 2, the signal could be detected even without washing, the background was low even after washing, and good S / N was obtained. In Comparative Example 1, the compound of Comparative Example 1 was excited to detect light emission from the compound. In the samples of the present invention 1 and the present invention 2, the compound on the short wavelength side was excited and the light emission from the compound on the long wavelength side was detected.

【００５３】[0053]

【表１】 [Table 1]

【００５４】[0054]

【化２】 [Chemical 2]

【００５５】[0055]

【化３】 [Chemical 3]

【００５６】[0056]

【化４】 [Chemical 4]

【００５７】例２：ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの検出 例１において、スライドガラス表面に固定した６０ｍｅ
ｒのＤＮＡの代わりに４０ｍｅｒのオリゴデオキシＡを
固定し、相補的な配列としてオリゴＵを使用した以外は
まったく同様の実験を行ったところ、実施例１と同様の
結果が得られた。Example 2: Detection of DNA / RNA hybrid In Example 1, 60 me immobilized on a glass slide surface
The same experiment was performed except that 40 mer oligodeoxy A was immobilized instead of r DNA and oligo U was used as a complementary sequence, and the same results as in Example 1 were obtained.

【００５８】[0058]

【発明の効果】本発明の方法では、多重鎖核酸親和性化
合物間のエネルギー移動の結果として生じる発光を検出
するため、励起スペクトルと発光スペクトルの最大値の
波長差を拡大でき、Ｓ／Ｎ比のよい検出が可能である。
この結果、発光ＤＮＡチップなどを用いた試料核酸の検
出においてＤＮＡ／ＤＮＡ及びＲＮＡ／ＤＮＡなどのハ
イブリッド多重鎖核酸を煩雑な標識操作や洗浄操作を行
わずに高感度に検出できる。In the method of the present invention, the luminescence resulting from the energy transfer between the compounds having affinity for the multi-stranded nucleic acid is detected, so that the wavelength difference between the maximum value of the excitation spectrum and the maximum value of the emission spectrum can be expanded, and the S / N ratio can be increased. The good detection of is possible.
As a result, in detecting a sample nucleic acid using a luminescent DNA chip or the like, hybrid multi-stranded nucleic acid such as DNA / DNA and RNA / DNA can be detected with high sensitivity without performing a complicated labeling operation or washing operation.

【００５９】[0059]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Fuji Photo Film Co. Ltd. <120> Method for detecting nucleic acid <130> A11353M <160> 1 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <400> 1 GCTGCTGCTG GGCCAGTGGT TCCTCCATGT CCGGGGAGGA TCAGACACTT CAAGGTCTAG 60[Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> Fuji Photo Film Co. Ltd. <120> Method for detecting nucleic acid <130> A11353M <160> 1 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <400> 1 GCTGCTGCTG GGCCAGTGGT TCCTCCATGT CCGGGGAGGA TCAGACACTT CAAGGTCTAG 60

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/533 Ｇ０１Ｎ 33/533 ４Ｃ０６５ 33/566 33/566 33/58 33/58 Ａ // Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 小島 政芳 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社朝霞研究所内 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 AA04 BA16 CA03 DA02 EA01 GA07 GB21 LA01 2G045 AA35 DA13 FA26 FB02 FB13 FB15 4B024 AA20 CA04 CA09 HA14 4B029 AA07 AA23 CC03 GA03 GB04 4B063 QA08 QA18 QQ42 QR55 QR66 QR82 QS03 QS34 QX02 4C065 AA07 AA19 BB09 CC09 DD02 EE02 HH01 JJ04 KK01 LL01 PP05 PP18 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) G01N 33/533 G01N 33/533 4C065 33/566 33/566 33/58 33/58 A // C12M 1 / 00 C12M 1/00 A C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA (72) Inventor Masayoshi Kojima 3-11-46 Izumisui, Asaka-shi, Saitama Fuji Shashin Film Co., Ltd. F-term in Asaka Research Laboratory 2G043 AA01 AA04 BA16 CA03 DA02 EA01 GA07 GB21 LA01 2G045 AA35 DA13 FA26 FB02 FB13 FB15 4B024 AA20 CA04 CA09 HA14 4B029 AA07 AA23 CC03 GA03 GB04 4B063 QA08 QA18 Q1818QQ18QQAQQAQQQQQQQQQQQQR

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 プローブ核酸に対して試料核酸を相互作
用させ、該プローブ核酸と該試料核酸とのハイブリダイ
ゼーションによりハイブリッド多重鎖核酸を形成させる
工程を含み、上記ハイブリッド多重鎖核酸に対してそれ
ぞれ異なる発光特性を有する２種以上の多重鎖核酸親和
性化合物を相互作用させ、該２種以上の多重鎖核酸親和
性化合物間で起こるエネルギー移動の結果として生じる
発光を検出する方法。1. A step of allowing a sample nucleic acid to interact with a probe nucleic acid to form a hybrid multi-stranded nucleic acid by hybridization of the probe nucleic acid and the sample nucleic acid, wherein the hybrid multi-stranded nucleic acid is different from each other. A method of allowing two or more kinds of multi-stranded nucleic acid-affinity compounds having luminescence properties to interact with each other, and detecting luminescence generated as a result of energy transfer between the two or more kinds of multi-stranded nucleic acid affinity compounds. 【請求項２】 プローブ核酸が固相担体上に固定されて
いる請求項１に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the probe nucleic acid is immobilized on a solid phase carrier. 【請求項３】 該ハイブリッド多重鎖核酸と該多重鎖核
酸親和性化合物とを相互作用させた後、洗浄操作を行わ
ずに該発光を検出する請求項２に記載の方法。3. The method according to claim 2, wherein after the interaction of the hybrid multi-stranded nucleic acid and the compound having affinity with the multi-stranded nucleic acid, the luminescence is detected without performing a washing operation. 【請求項４】 エネルギー移動が蛍光共鳴エネルギー移
動である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方
法。4. The method according to claim 1, wherein the energy transfer is fluorescence resonance energy transfer. 【請求項５】 エネルギー移動の結果として生じる上記
発光についての励起スペクトル及び発光スペクトルの最
大値の波長差が、それぞれの多重鎖核酸親和性化合物に
ついての励起スペクトル及び発光スペクトルの最大値の
波長差よりも拡大されている請求項４に記載の方法。5. The wavelength difference between the maximum value of the excitation spectrum and the maximum value of the emission spectrum for the emission generated as a result of energy transfer is obtained from the difference of the maximum value of the maximum value of the excitation spectrum and the maximum value of the emission spectrum of each compound having affinity for a multi-stranded nucleic acid. The method of claim 4, wherein the method is also expanded. 【請求項６】 励起スペクトル及び発光スペクトルの最
大値の波長差が８０ｎｍ以上の発光を検出する請求項４
又は５に記載の方法。6. The light emission in which the wavelength difference between the maximum values of the excitation spectrum and the emission spectrum is 80 nm or more is detected.
Or the method according to 5. 【請求項７】 励起スペクトル及び発光スペクトルの最
大値の波長差が１００ｎｍ以上の発光を検出する請求項
６に記載の方法。7. The method according to claim 6, wherein the emission having a wavelength difference between the maximum values of the excitation spectrum and the emission spectrum of 100 nm or more is detected. 【請求項８】 分子吸光係数が７万以上のクロモフォア
を有する多重鎖核酸親和性化合物の２種以上を用いる請
求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。8. The method according to claim 1, wherein two or more kinds of compounds having affinity for a multi-stranded nucleic acid having a chromophore having a molecular extinction coefficient of 70,000 or more are used. 【請求項９】 多重鎖核酸親和性化合物のうちの少なく
とも１つの化合物が下記一般式（Ｉ）： （ＩＣ）−〔(Ｌ)_m−(ＳＩＧ)_q〕_n （式中、ＩＣは多重鎖核酸との親和性を有する基を示
し；Ｌは２価の連結基を示し；ＳＩＧは検出可能なシグ
ナルを発するクロモフォアを示し；ｎは２、３、又は４
の整数を示し；ｍは０又は１を示し；ｑは０又は１を示
すが、ただしｎ個の(Ｌ)_m−(ＳＩＧ)_qにおいてすべての
ｑが０であることはなく、ｎ個の (Ｌ)_m−(ＳＩＧ)_qに
おいて、それぞれのＬ、ｍ、ＳＩＧ、ｑは同一であって
も異なっていてもよい）で表される化合物である請求項
１ないし８のいずれか１項に記載の方法。9. At least one compound of compounds having affinity for a multi-stranded nucleic acid is represented by the following general formula (I): (IC)-[(L) _m- (SIG) _q ] _n (wherein IC is a multi-stranded chain). L represents a group having an affinity with a nucleic acid; L represents a divalent linking group; SIG represents a chromophore that emits a detectable signal; n represents 2, 3, or 4
M is 0 or 1; q is 0 or 1, provided that all _q in n (L) _m − (SIG) _q are not 0 and n (L) _m- (SIG) _q, wherein each L, m, SIG, and q may be the same or different). The method described. 【請求項１０】 請求項１ないし８のいずれか１項に記
載の方法に用いるための請求項６に記載の一般式（Ｉ）
で表される化合物。10. The general formula (I) according to claim 6 for use in the method according to any one of claims 1 to 8.
The compound represented by.