JP2003047488A - Human hepatic cancer-derived growth factor-2 - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a matured polypeptide, its fragments, analogs and their derivatives having biological activities and useful for a diagnosis or treatment. SOLUTION: The maturated polynucleotide is isolated and the isolated polypeptide includes members selected from the group consisting of (a) a polynucleotide encoding a polypeptide having a specific sequence; (b) a polynucleotide encoding a matured polypeptide having a specific amino acid sequence; (c) a polynucleotide capable of hybridizing with the polynucleotide of (a) or (b) and having at least 70% homology to either one of the polynucleotide; and (d) polynucleotide fragments of the polynucleotide (a), (b) or (c).

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より
詳細には、本発明のポリペプチドは、肝ガン由来の増殖
因子（時々、本明細書中で以降「ＨＤＧＦ−２」とい
う）として推定的に同定された。本発明はまた、このよ
うなポリペプチドの作用を阻害することに関する。 【０００２】 【従来の技術】細胞増殖は、種々の成長因子およびサイ
トカインによって調節される。これらは、転写因子の活
性化に対する細胞内の生化学的シグナルのカスケードを
誘発するための特異的膜レセプターに結合し、それによ
り種々のサブセットの遺伝子の種々の活性化および抑制
をもたらす（Ａａｒｏｓｏｎ，Ｓ．Ａ、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５４：１１４６−１１５３（１９９１））。 【０００３】肝ガン由来の増殖因子（ＨＤＧＦ）は、最
近クローン化されている（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．ら、
Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６９（４０）：２５１４３
−２５１４９（１９９４））。ＨＤＧＦは、線維芽細胞
に対して***促進的な（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）ヘパリン
結合タンパク質である。ＨＤＧＦは、ヒト肝ガン由来の
細胞株ＨｕＨ−７の馴化培地よりＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細
胞中へのトリチウム化チミジンの組み込みによって精製
された。ＨＤＧＦは、シグナルペプチドを有しないが、
ｃＤＮＡクローンのトランスフェクション後、ＣＯＳ−
７細胞の培地中に分泌される。これは、ヘパリン結合タ
ンパク質であり、そしていくつかの腫瘍由来の細胞株お
よび組織中に遍在的に発現する。これは、肝ガン細胞の
細胞質中に局在し、そして強い成長刺激活性を有する。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
の成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に活性で、かつ
診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログ、
およびそれらの誘導体を提供することである。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明は、単離されたポ
リヌクレオチドを提供し、この単離されたポリヌクレオ
チドは、以下： （ａ）図１に記載のポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第 号に含まれるＤＮ
ａによって発現するアミノ酸配列を有する成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）の該ポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズし得、そして該ポリヌクレオチドと少なくと
も７０％同一であるポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）または（ｃ）の該ポリヌク
レオチドのポリヌクレオチドフラグメント、からなる群
から選択されるメンバーを含む。 【０００６】１つの実施形態においては、配列番号２の
アミノ酸１〜２４９を含むポリペプチドをコードする、
上記のポリヌクレオチドを提供する。 【０００７】本発明はさらに、上記のポリヌクレオチド
を含むベクターを提供する。 【０００８】本発明はさらに、上記のベクターを用いて
遺伝子操作される宿主細胞を提供する。 【０００９】本発明はまた、ポリペプチドを生成するプ
ロセスを提供し、このプロセスは、以下の工程：請求項
４に記載の宿主細胞から該ポリペプチドによってコード
されるポリペプチドを発現する工程、を包含する。 【００１０】本発明はさらに、上記のベクターを用い
て、細胞を遺伝子操作する工程を包含する、ポリペプチ
ドの発現が可能な細胞を生成するためのプロセスを提供
する。 【００１１】本発明はまた、（ｉ）配列番号２の推定ア
ミノ酸配列、ならびにそのフラグメント、アナログ、お
よび誘導体を有するポリペプチド；および（ｉｉ）ＡＴ
ＣＣ受託番号第 号のｃＤＮＡによってコード
されるポリペプチドならびに該ポリペプチドのフラグメ
ント、アナログおよび誘導体、からなる群から選択され
る、ポリペプチドを提供する。 【００１２】１つの実施形態においては、図１のアミノ
酸を含む、上記のポリペプチドが提供される。 【００１３】本発明はまた、上記のポリペプチドに対す
る抗体を提供する。 【００１４】本発明はさらに、上記のポリペプチドの活
性化を阻害する化合物を提供する。 【００１５】本発明はまた、ＨＤＧＦ−２の必要性を有
する患者の処置のための方法を提供し、この方法は、以
下：請求項７に記載の治療有効量のポリペプチドを該患
者に投与する工程、を包含する。 【００１６】１つの実施形態においては、上記治療有効
量のポリペプチドを、このポリペプチドをコードする患
者のＤＮＡに提供する工程、およびこのポリペプチドを
インビボで発現させる工程により投与する方法を提供す
る。 【００１７】本発明はさらに、ＨＤＧＦ−２ポリペプチ
ドを阻害する必要性を有する患者の処置のための方法を
提供し、この方法は、以下：上記の治療有効量の化合物
を患者に投与する工程；を包含する。 【００１８】本発明はまた、患者において上記のポリペ
プチドの過少発現に関する疾患または疾患に対する感受
性を診断するためのプロセスを提供し、このプロセス
は、以下：患者由来のサンプルにおいて該ポリペプチド
をコードする核酸配列中の変異を同定する工程、を包含
する。 【００１９】本発明はさらに、診断プロセスを提供し、
この診断プロセスは、以下：宿主由来のサンプルにおい
て請求項７に記載の前記ポリペプチドの存在を分析する
工程、を包含する。 【００２０】本発明はさらに、上記のポリペプチドのア
ゴニストである化合物を同定する方法を提供し、この方
法は、以下の工程：該ポリペプチドのレセプターをその
表面上で発現する細胞と化合物とを該レセプターへの結
合を許容する条件下で接触させる工程であって、該レセ
プターは、該化合物の該レセプターへの結合に応答して
検出可能なシグナルを提供し得る第２の成分と会合され
る、工程；および該化合物の該レセプターとの相互作用
により生じるシグナルの存在を検出することによって、
該化合物が該レセプターに結合し、そして活性化するか
どうかを同定する工程、を包含する。 【００２１】本発明はまた、上記のポリペプチドに結合
し、そして活性化を阻害する化合物を同定する方法を提
供し、この方法は、以下の工程：ＨＤＧＦ−２ポリペプ
チドおよびスクリーニングされるべき化合物と、ＨＤＧ
Ｆ−２レセプターポリペプチドをその表面上で発現する
細胞をと該レセプターポリペプチドへの結合を許容する
条件下で接触させる工程であって、該レセプターは、化
合物の該レセプターポリペプチドへの結合に応答して検
出可能なシグナルを提供し得る第２の成分と会合され
る、工程；およびシグナルの非存在を検出することによ
って、該化合物がＨＤＧＦ−２ポリペプチドを阻害する
かどうかを同定する工程、を包含する。 【００２２】 【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドは、ＨＤＧ
Ｆ−２ポリペプチドとして推定的に同定された。この同
定は、ヒトＨＤＧＦに相同なアミノ酸配列の結果として
作製されている。 【００２３】本発明の１つの局面によれば、新規の成熟
ポリペプチド、ならびに生物学的に活性で、かつ診断ま
たは治療に有用なそのフラグメント、アナログ、および
それらの誘導体が提供される。本発明のポリペプチドは
ヒト起源である。 【００２４】本発明の別の局面によれば、単離された核
酸分子が提供され、それには、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそのアナログ、および生
物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラ
グメントが含まれる。 【００２５】本発明のなおさらに別の局面によれば、組
換え技術によりこのようなポリペプチドを産生するため
のプロセスが提供される。組換え技術は、本発明のポリ
ペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核生物宿
主細胞および／または組換え真核生物宿主細胞を、この
タンパク質の発現を促進する条件下で培養し、その後こ
のタンパク質を回収する工程を包含する。 【００２６】本発明のさらなる局面によれば、このよう
なポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを、それに対するアゴニストお
よびアンタゴニスト化合物をスクリーニングする目的、
および治療目的（例えば、火傷、組織修復、および潰瘍
の結果としての傷害の治癒の促進、血栓症および動脈硬
化症を処置すること、神経障害による神経損傷を防止
し、そして神経増殖を促進すること、骨および歯周の再
生を促進すること、日焼けを処置すること、骨髄細胞お
よび角膜に内皮の成長および／または分化を刺激するこ
と、肌の老化および抜け毛を防止すること、器官形成を
刺激すること）に利用するプロセスが提供される。 【００２７】本発明のさらなる局面によれば、本発明の
ポリペプチドをコードする核酸配列に特異的にハイブリ
ダイズするために十分な長さの核酸分子を含む核酸プロ
ーブがまた提供される。 【００２８】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドに対する抗体が提供される。 【００２９】本発明の別の局面によれば、それらに対す
るレセプターに結合および活性化することによって本発
明のポリペプチドを模倣するアゴニストが提供される。 【００３０】本発明のさらに別の局面によれば、このよ
うなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され
る。これは、このようなポリペプチドの作用を阻害する
（例えば、血管形成、腫瘍新脈管形成後の再狭窄の処置
において、瘢痕形成（ｓｃａｒｒｉｎｇ）を防止し、そ
して血管過多症（ｈｙｐｅｒ−ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉ
ｓｅａｓｅ）を処置すること）ために使用される。 【００３１】本発明のなお別の局面によれば、疾患およ
び本発明の核酸配列内の変異に関連する疾患に対する感
受性を検出するための、およびこのような配列によりコ
ードされるポリペプチドの過剰発現を検出するための診
断アッセイが提供される。 【００３２】本発明の別の局面によれば、このようなポ
リペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを、科学的研究、ＤＮＡ合成および
ＤＮＡベクターの製造に関連するインビトロにおける目
的のために利用するためのプロセスが提供される。 【００３３】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。 【００３４】本発明の１つの局面によれば、図１（配列
番号２）の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチ
ドまたは１９９５年５月２４日にＡＴＣＣ受託番号第 号
として寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされ
る成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリ
ヌクレオチド）が提供される。 【００３５】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、心臓、脳、および骨格筋から得られ得
る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト臍静脈内皮組織
由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。これは、
ＨＤＧＦファミリーに構造的に関連する。これは、２４
９アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンレー
ディングフレームを含む。このタンパク質は、２０１ア
ミノ酸長にわたり、ヒトＨＤＧＦに対して最も高い程度
の相同性（２３％の同一性および６１％の類似性）を示
す。 【００３６】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡ（このＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、および合成ＤＮＡを包含する）の形態であり得る。
一本鎖がコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖で
あり得る場合、ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得
る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１
（配列番号１）に示すコード配列または寄託したクロー
ンのコード配列と同一であり得、あるいはそのコード配
列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１
（配列番号１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ
成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり
得る。 【００３７】図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドま
たは寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る
がこれらに限定されない：成熟ポリペプチドのコード配
列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなる
コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必
要に応じてさらなるコード配列）ならびに非コード配列
（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコー
ド配列の５’および／または３’非コード配列）。 【００３８】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
含む。 【００３９】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託し
たクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド
のフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする
本明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。
ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然
に存在する対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの
天然に存在しない変異体であり得る。 【００４０】従って、本発明は、図１（配列番号２）に
示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託したクロ
ーンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド、およびそのようなポ
リヌクレオチドの変異体を包含する。この変異体は、図
１のポリペプチドまたは寄託したクローンのｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体
またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド
変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または
挿入変異体を含む。 【００４１】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列また
は寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立
遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。当該分野で
公知なように、対立遺伝子変異体は、１つ以上のヌクレ
オチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオ
チド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペ
プチドの機能を実質的に変化させない。 【００４２】本発明はまたポリヌクレオチドを包含し、
ここで成熟ポリペプチドのコード配列は、宿主細胞から
のポリペプチドの発現および分泌を援助するポリヌクレ
オチド配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を
制御する分泌配列として機能するリーダー配列）に対す
る同じリーディングフレームで融合され得る。リーダー
配列を有するポリペプチドはプレプロテインであり、そ
してポリペプチドの成熟形態を形成するために宿主細胞
により切断されたリーダー配列を有し得る。ポリヌクレ
オチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる５’アミ
ノ酸残基であるプロプロテインをコードし得る。プロ配
列を有する成熟タンパク質はプロプロテインであり、お
よびタンパク質の不活性形態である。プロ配列が一旦切
断されれば、活性な成熟タンパク質が残る。 【００４３】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは成熟タンパク質をコードし得るか、あるいはプロ配
列を有するタンパク質またはプロ配列およびプレ配列
（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードし
得る。 【００４４】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成
熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクター
により供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あ
るいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例え
ば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、血球凝集素
（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザ
血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する
（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ， ３７：７６７
（１９８４））。 【００４５】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生
に関与するＤＮＡセグメントを意味する；これは、コー
ド領域に先行する領域および後に続く領域（リーダーお
よびトレイラー）ならびに個々のコードセグメント（エ
クソン）の間に介在する配列（イントロン）を含む。 【００４６】全長のＨＤＧＦ−２遺伝子のフラグメント
は、全長のＨＤＧＦ−２遺伝子を単離するための、およ
びこの遺伝子と高い配列類似性を有するか、または類似
の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するためのｃ
ＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブ
として使用され得る。このタイプのプローブは、好まし
くは少なくとも３０塩基を有し、そして例えば、５０ま
たはそれ以上の塩基を含み得る。このプローブはまた、
全長の転写産物に対応するｃＤＮＡクローン、ならびに
調節領域およびプロモーター領域、エクソン、およびイ
ントロンを含む完全な遺伝子を含むゲノムクローン（単
数または複数）を同定するために使用され得る。スクリ
ーニングの例として、オリゴヌクレオチドプローブを合
成するための既知のＤＮＡ配列を使用することにより、
遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺
伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオ
チドは、このプローブがライブラリーのどのメンバーと
ハイブリダイズするかを決定するために、ヒトｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライブラリーをス
クリーニングするために使用される。 【００４７】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましく
は少なくとも９５％の同一性が存在する場合、本明細書
中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに
関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオ
チドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用
語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーシ
ョンが、配列間に少なくとも９５％および好ましくは少
なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じるこ
とを意味する。好ましい実施態様において本明細書中上
記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドは、図１（配列番号１）のｃＤＮＡまたは寄託し
たｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質
的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持する
ポリペプチドをコードする。 【００４８】あるいは、このポリヌクレオチドは、少な
くとも２０塩基、好ましくは３０塩基、そしてより好ま
しくは５０塩基を有し得る。これらは、本発明のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズし、そして、本明細書上記
のように、それに対する同一性を有し、そして活性を保
持してもよいし、または保持しなくてもよい。例えば、
このようなポリヌクレオチドは、例えば、このポリヌク
レオチドの回収のために配列番号１のポリヌクレオチド
のためのプローブとして、あるいは診断プローブまたは
ＰＣＲプライマーとして使用され得る。 【００４９】従って、本発明は、配列番号２のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して、ならびに
少なくとも３０塩基、そして好ましくは少なくとも５０
塩基を有するそのフラグメントに対して、そしてそのよ
うなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なく
とも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％の
同一性を有するポリヌクレオチドならびに、このような
ポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチド
に関する。 【００５０】本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の
存続期間の下に維持される。これらの寄託物は、単に当
業者の便宜上提供されるのみであり、そして米国特許法
第１１２条の下で寄託が必要とされることを認めたわけ
ではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、
ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そ
して本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えて
いる。寄託物を製造し、使用し、または販売するために
は実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾
はこれによって与えられるわけではない。 【００５１】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したｃＤＮＡ
によりコードされるアミノ酸配列を有するＨＤＧＦ−２
ポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラ
グメント、アナログおよび誘導体に関する。 【００５２】用語「フラグメント」、「誘導体」および
「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチドま
たは寄託したｃＤＮＡにコードされるポリペプチドをい
う場合は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物
学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味す
る。従ってアナログは、プロタンパク質部分の切断によ
り活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生じ得るプロ
タンパク質を包含する。 【００５３】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 【００５４】図１（配列番号２）のポリペプチドまたは
寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つ以上
のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ
酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そ
してこのような置換アミノ酸残基がその遺伝コードによ
りコードされるアミノ酸残基であるかもしれないし、ま
たはそうではないかもしれないもの、あるいは（ｉｉ）
１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、ある
いは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減
期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコー
ル）のような別の化合物と融合されているもの、あるい
は（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、成熟ポリペプチドに融
合され、そして成熟ポリペプチドの精製に使用されるも
のであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およ
びアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内に
あると考えられる。 【００５５】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均質に精製される。 【００５６】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチド
またはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系
において共存する物質の幾らかまたは全てから分離され
ている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、
単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクタ
ーの一部であり得、および／またはこのようなポリヌク
レオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり
得、そしてそのようなベクターまたは組成物がその天然
の環境の一部ではない点で、なお単離され得る。 【００５７】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに配列番号
２のポリペプチドと少なくとも７０％の類似性（好まし
くは少なくとも７０％の同一性）、そしてより好ましく
は配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０％の類似
性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）、そし
てさらにより好ましくは配列番号２のポリペプチドと少
なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは少なく
とも９５％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そ
して、また一般的に少なくとも３０アミノ酸そしてより
好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含むポリペプチド
のこのような一部分を有するこのようなポリペプチドの
部分を含む。 【００５８】当該分野に公知であるように、２つのポリ
ペプチドの間の「類似性」は、第２のポリペプチドの配
列に対して、１つのポリペプチドのアミノ酸配列および
その保存されたアミノ酸置換を比較することにより決定
される。 【００５９】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。従って、このフラグ
メントは全長ポリペプチドを産生するための中間体とし
て使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメ
ントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合
成するために使用され得る。 【００６０】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。 【００６１】宿主細胞は、本発明のベクター（これは例
えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり
得る）を用いて遺伝子操作（形質導入、または形質転
換、またはトランスフェクト）される。ベクターは、例
えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態
であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活
性化するか、形質転換体を選択するか、または本発明の
遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地
において培養され得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨ
など）は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用
された条件であり、そして当業者には明らかである。 【００６２】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非
染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含む。この
ようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌性
プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母
プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わ
せ由来のベクター；ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニ
ア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬
病）である。しかし、宿主において複製可能で、かつ存
続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得
る。 【００６３】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は当該分野
で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位
に挿入される。このような手順および他の手順は、当業
者の範囲内であると考えられる。 【００６４】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発
現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、ｍ
ＲＮＡの合成を指示する。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたは
ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ． ｌａｃまたは
ｔｒｐ、λファージＰ_Lプロモーター、および原核細胞
または真核細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現
を制御することが知られている他のプロモーター。発現
ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位
および転写ターミネーターを含有する。ベクターはま
た、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。 【００６５】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン
耐性）を提供する１つ以上のマーカー遺伝子を含有す
る。 【００６６】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。 【００６７】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、 Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫
細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐ
ｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイル
ス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の
教示から当業者の範囲内であると考えられる。 【００６８】より詳細には、本発明はまた、上記で広範
に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含す
る。この構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベク
ターまたはウイルスベクター）を含み、このベクターの
中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面において、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを含む）を含む。多数の適切なベクタ
ーおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして
購入可能である。以下のベクターが例として提供され
る。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑ
ｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉ
ｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１
８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒ
ｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤ
Ｒ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核生
物性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐ
ＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、
ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクター
が、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能で
ある限り、使用され得る。 【００６９】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、Ｐ
ＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特によく知られ
た細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ
７、ｇｐｔ、λＰ_R、Ｐ_Lおよびｔｒｐを含む。真核生物
プロモーターは、ＣＭＶ即時初期型、ＨＳＶチミジンキ
ナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウイ
ルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩを
含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十
分に当業者のレベルの範囲内である。 【００７０】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）あるいは下等真核
生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿
主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得
る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラ
ンスフェクション、またはエレクトロポレーションによ
り達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，
Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１
９８６））。 【００７１】宿主細胞中の構築物は、組換え配列により
コードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法
において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチ
ドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得
る。 【００７２】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ
構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパ
ク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主およ
び真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）に記載されて
いる。 【００７３】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約
３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその
転写を増大させる。例として、複製起点の後期側ｂｐ１
００〜２７０のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウ
イルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後
期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーが挙げられる。 【００７４】一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞
の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、なら
びに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーター
は、中でも、解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファター
ゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロン
に由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻
訳終止配列と適切な相で組立てられる。必要に応じて、
異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産
物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同
定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。 【００７５】細菌での使用に有用な発現ベクターは、機
能的なプロモーターを有する作動可能な読み取り相で、
所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適切
な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入
することにより構築される。ベクターは、１つ以上の表
現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、
かつ所望により宿主内での増幅を提供するための複製起
点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主
は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、
ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内
の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として
用いられ得る。 【００７６】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニン
グベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺
伝子エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択
マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよ
うな市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，
Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗ
Ｉ， ＵＳＡ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「骨格」
部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造
配列と組み合わされる。 【００７７】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモータ
ーは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養さ
れる。 【００７８】細胞は、代表的には遠心分離により収集さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。 【００７９】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法（このような方法は、当業者に周知である）により破
砕され得る。 【００８０】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｃｅｌｌ， ２
３：１７５ （１９８１）により記載されるサル腎臓線
維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発
現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨ
Ｏ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳
動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターお
よびエンハンサー、を含有し、そしてまた任意の必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終
結配列、および５’フランキング非転写配列を含有す
る。ＳＶ４０スプライスに由来するＤＮＡ配列、および
ポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝子エレメント
を提供するために使用され得る。 【００８１】ＨＤＧＦ−２ポリペプチドは、以下で使用
される方法により組換え細胞培養物から回収され、そし
て精製され得る：硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、および
レクチンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク
質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟
タンパク質の配置を完了するために使用され得る。最終
的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最
終的な精製工程のために用いられ得る。 【００８２】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物であり得るか、または化学合成手順の産物であり
得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主（例
えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および
哺乳動物細胞による）から組換え技術により産生され得
る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発
明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または
グリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドはま
た、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。 【００８３】本発明のポリペプチドは、血管形成能力の
結果として、血管内皮細胞増殖を刺激し、そして種々の
疾患病状（例えば、血栓症、動脈硬化症、および他の心
血管病状）による虚血組織の再血管形成を刺激するため
の処置に使用され得る。 【００８４】これらのポリペプチドはまた、血管形成能
力の結果として、中胚葉の誘導および初期胚における四
肢の再生を刺激するために使用され得る。 【００８５】ポリペプチドはまた、損傷、火傷、手術、
および潰瘍による傷の治癒を促進するために使用され得
る。なぜならこれらのポリペプチドが、異なる起源の種
々の細胞（例えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対
して細胞***促進性であり、そしてそれゆえ、損傷を受
けた組織または疾病組織の修復または置換を促進するか
らである。 【００８６】本発明のポリペプチドはまた、神経の成長
を刺激するために、そして特定の神経損傷またはアルツ
ハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関連コン
プレックスのような神経変性状態に生じる神経損傷を処
置および予防するために使用され得る。 【００８７】このポリペプチドは、軟骨細胞増殖を刺激
するために使用され、従ってこのポリペプチドは骨の再
生および歯周の再生を増大するために、そして組織移植
または骨の移植片を支援するために使用され得る。 【００８８】本発明のポリペプチドは、ケラチン生成細
胞の増殖を刺激することにより、日焼けによる皮膚老化
を妨げるために使用され得る。 【００８９】このポリペプチドはまた、毛髪形成細胞を
活性化し、そしてメラニン細胞増殖を促進することによ
り、脱毛を防止するために使用され得る。 【００９０】本発明のポリペプチドはまた、造血細胞お
よび骨髄細胞の増殖および分化を刺激するために使用さ
れ得る。 【００９１】ポリペプチドはまた、移植前の器官を維持
するために、または初代組織の細胞培養を支持するため
に使用され得る。 【００９２】本発明のポリペプチドはまた、中胚葉起源
の組織を誘導して初期胚を分化させるために使用され得
る。 【００９３】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、ヒトの疾患に対する処置および診断の発見のた
めの研究試薬および研究材料として使用され得る。 【００９４】本発明は、本発明のポリペプチドのレセプ
ターの同定のための方法を提供する。このレセプターを
コードする遺伝子は、例えば、リガンドパニングおよび
ＦＡＣＳ探索（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２），第
５章、（１９９１））のような、当該業者に公知の多数
の方法により同定され得る。好ましくは、発現クローニ
ングは、ポリアデニル化ＲＮＡがＨＤＧＦ−２ポリペプ
チドに応答性の細胞から調製される場合に使用される。
そしてこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリー
をプールに分割し、そして応答しないＣＯＳ細胞または
他の細胞にトランスフェクトするために使用される。ス
ライドガラス上で増殖したトランスフェクトした細胞
を、標識されたＨＤＧＦ−２に曝露する。ＨＤＧＦ−２
ポリペプチドは、ヨウ素化または部位特異的プロテイン
キナーゼに対する認識部位の含有を含む種々の手段によ
り標識され得る。固定およびインキュベーションの後、
スライドをオートラジオグラフィー分析に供する。陽性
プールを同定しそしてサブプールを調製しそして反復性
のサブプールおよび再スクリーニングプロセスを用いて
再トランスフェクトし、推定のレセプターをコードする
単一クローンを最終的に得る。レセプター同定のための
１つの別のアプローチとして、標識されたリガンドは、
レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光
学親和結合（ｐｈｏｔｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｉｎｋｅ
ｄ）され得る。架橋物質はＰＡＧＥ分析により分離さ
れ、そしてＸ線フィルムに曝露される。リガンド−レセ
プターを含有する標識された複合体は、切り出され、ペ
プチドフラグメントに分解され、そしてタンパク質微小
配列決定に供され得る。微小配列決定から得られたアミ
ノ酸配列は、一連の縮重オリゴヌクレオチドプローブを
設計して推定のレセプターをコードする遺伝子を同定す
るためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
めに使用される。 【００９５】本発明は、化合物をスクリーニングして、
ＨＤＧＦ−２レセプター（アゴニスト）に結合し、かつ
活性化するか、またはＨＤＧＦ−１レセプター（アンタ
ゴニスト）に結合し、かつ阻害する化合物を同定する。
例えば、競合アッセイが使用され得、ここで、ＨＤＧＦ
−２レセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物
を標識されたＨＤＧＦ−２および試験されるべき化合物
と共にインキュベートする。ＨＤＧＦ−２レセプターに
競合するための化合物の能力は、化合物の存在および非
存在における結合ＨＤＧＦ−２ポリペプチドの量を同定
するために、液体シンチレーションカウンティングによ
って同定され得る。 【００９６】あるいは、アゴニスト化合物は、試験され
るべき化合物の相互作用の後、公知のセカンドメッセン
ジャー系の応答を検出することによって同定され得、そ
してＨＤＧＦ−２レセプターは、放射能を有する化合物
を標識すること、およびＨＤＧＦ−２レセプターを発現
する細胞と接触することにより測定される。このような
セカンドメッセンジャー系は、ｃＡＭＰグアニル酸シク
ラーゼ、イオンチャンネル、またはホスホイノシチド加
水分解を含むが、これらに限定されない。アンタゴニス
ト化合物は、このアッセイを用いて同定され得、ここ
で、アンタゴニストは、レセプターに結合するがセカン
ドメッセンジャー応答を誘発せず、その結果そのレセプ
ター由来のＨＤＧＦ−２ポリペプチドを効率よく阻止す
る。 【００９７】上記のアッセイについて細胞を調製する方
法は、細胞集団（レセプターを含まないと仮定される）
をＨＤＧＦ−２レセプターをコードするＤＮＡを含む適
切なベクターでトランスフェクトする工程を包含し、そ
れにより細胞はレセプターを発現する。適切な応答系
は、所望のセカンドメッセンジャー経路（ｃＡＭＰ、イ
オンチャンネル、ホスホイノシチドキナーゼ、またはカ
ルシウム応答を含む）を含む適切な宿主へのＤＮＡのト
ランスフェクションによって得られる。このようなトラ
ンスフェクション系は、種々の化合物および細胞に曝露
されたポリペプチドの活性を分析するための応答系を提
供する。 【００９８】特異性アッセイにおいて、ＨＤＧＦ−２の
増殖刺激活性は、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１８３：２７３−２８４（１
９８９）（これは、本明細書によりその全体が参考とし
て援用される）によるＷｅｉｓｓアルビノマウス３Ｔ３
細胞への［³Ｈ］チミジンの取り込みを測定することに
よる潜在的な化合物の存在下でアッセイされ得る。 【００９９】アンタゴニスト化合物の例としては、ＨＤ
ＧＦ−２レセプター上の種々の重要な位置を有する、免
疫反応性であり、そしてレセプターに結合し、そしてＨ
ＤＧＦ−２ポリペプチド由来のレセプターをブロックす
る抗体が挙げられる。抗体には、一般に、抗体の抗原結
合部位に結合した独特の決定基を認識する抗イディオタ
イプの抗体が含まれる。このタイプの抗体は、ＨＤＧＦ
−２ポリペプチド自身に対して調製されて抗体に結合
し、そして抗体のそのレセプターとの相互作用を防止す
る。 【０１００】ＨＤＧＦ−２自身との競合においてＨＤＧ
Ｆ−２レセプターに結合するがセカンドメッセンジャー
応答を惹起しないオリゴペプチドはまた、アンタゴニス
ト化合物として使用され得る。オリゴペプチドの例とし
ては、例えば、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げ
られる。オリゴペプチドはまた、ＨＤＧＦ−２の活性部
位に結合して、ＨＤＧＦ−２のそのレセプターとの相互
作用をブロックし得る。 【０１０１】アンチセンス技術を用いて調製されたアン
チセンス構築物はまた、ＨＤＧＦ−２ポリペプチドの産
生を防止するためのアンタゴニスト化合物として使用さ
れ得る。アンチセンス技術は、三重らせん形成またはア
ンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介した遺伝子発現を
制御するために用いられ得、これらの方法の両方は、ポ
リヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡに結合することに
基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、長
さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌ
クレオチドを設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的
であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃ
ｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６：３０７３ （１９
７９）； Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４
１：４５６ （１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ， ２５１： １３６０ （１９９１）を
参照のこと）、それにより、転写およびＨＤＧＦ−２の
産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍ
ＲＮＡ分子のＨＤＧＦ−２ポリペプチドへの翻訳をブロ
ックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｃｈｅｍ．， ５６：５６０ （１９９１）； 遺伝子
発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴヌクレ
オチド， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏ
ｎ， ＦＬ （１９８８））。上記のオリゴヌクレオチ
ドはまた、細胞に送達され得、それによって、アンチセ
ンスＲＮＡまたはＤＮＡが、ＨＤＧＦ−２の産生を阻害
するためにインビボで発現され得る。 【０１０２】アンタゴニストは、新生物細胞および組織
上での本発明のポリペプチドの細胞成長および増殖効果
を（すなわち、腫瘍の血管形成の刺激）を阻害するため
に使用され得る。そしてそれゆえ、異常な細胞成長およ
び増殖（例えば、腫瘍形成または増殖において）を遅延
するかまたは妨げる。 【０１０３】アンタゴニストはまた、血管過多疾患の予
防に使用され得、そしてカプセル外の白内障手術後の上
皮レンズ細胞の増殖を妨げる。 【０１０４】本発明のポリペプチドの細胞***促進性活
性の予防はまた、血管形成術バルーン後の再狭窄のよう
な場合に所望される。 【０１０５】アンタゴニストはまた創傷治癒の間の瘢痕
組織の炎症および増殖を妨ぐために使用され得る。 【０１０６】アンタゴニストはまた薬学的に受容可能な
キャリア（例えば、以下に記載のような）を有する化合
物において使用され得る。 【０１０７】本発明のポリペプチドおよびアゴニストな
らびにアンタゴニスト化合物は、適切な薬学的キャリア
と組み合わせて使用され得る。このような組成物は、治
療有効量のポリペプチドまたは化合物、および薬学的に
受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキ
ャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキ
ストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそ
れらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されな
い。処方は、投与の態様に合わせるべきである。 【０１０８】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
以上の成分で満たされた１以上の容器を含む薬学的パッ
クまたはキットを提供する。このような容器に関して、
薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統
制する政府機関により規定された形式の製品表示をし
得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使
用、または販売における機関による認可を表す。さら
に、本発明のポリペプチドおよび化合物は、他の治療化
合物と共に用いられ得る。 【０１０９】これらの薬学的組成物は、局所、静脈内、
腹腔内、筋肉内、皮下、または皮内経路によるような簡
便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の徴候
の処置および／または予防に効果的な量で投与される。
一般に、薬学的組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体
重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日あ
たり約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。多
くの場合、投薬量は、１日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重
から約１ｍｇ／ｋｇ体重であり、投与経路、症状などが
考慮される。 【０１１０】ＨＤＧＦ−２ポリペプチドおよびポリペプ
チドであるアゴニストおよびアンタゴニストはまた、イ
ンビボでのこのようなポリペプチドの発現により本発明
に従って用いられ得、これはしばしば、「遺伝子治療」
といわれる。 【０１１１】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエクソビボで操作され得、次いで、こ
の操作された細胞はポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
り、そして本明細書中の教示から明らかである。例え
ば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ
を含むレトロウイルスプラスミドベクターの使用により
操作され得る。 【０１１２】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。例えば、パッケージング細
胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含む
レトロウイルスプラスミドベクターで形質導入される。
その結果、ここでパッケージング細胞は、目的の遺伝子
を含有する感染性ウイルス粒子を産生する。これらのプ
ロデューサー細胞は、インビボにおける細胞を操作する
ために、およびインビボでのポリペプチドの発現を操作
するために患者に投与され得る。このような方法による
本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法お
よび他の方法は、本発明の教示により当業者には明らか
であるはずである。 【０１１３】本明細書中上記の、誘導され得るレトロウ
イルスプラスミドベクター由来のレトロウイルスは、モ
ロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、レトロ
ウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）、ハーベイ肉腫
ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病
ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨
髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスを
包含するが、これらに限定されない。１つの実施態様に
おいて、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニ
ーマウス白血病ウイルスより誘導される。 【０１１４】ベクターは、１以上のプロモーターを含有
する。使用され得る適切なプロモーターは、レトロウイ
ルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅ
ｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第７巻、第９号、
９８０−９９０（１９８９）に記載されるヒトサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または任意の他
のプロモーター（例えば、これらに限定しないが、ヒス
トン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモータ
ーを包含する、真核生物細胞性プロモーターのような細
胞プロモーター）を包含するが、これらに限定されな
い。使用され得る他のウイルスプロモーターは、アデノ
ウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロ
モーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターを
包含するが、これらに限定されない。適切なプロモータ
ーの選択は、本明細書中に含まれる技術より当業者に明
らかである。 【０１１５】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得
る適切なプロモーターは、以下を包含するが、これらに
限定されない：アデノウイルス主要後期プロモーターの
ようなアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような異種プロモ
ーター；ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙ
ｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）プロモータ
ー；ＭＭＴプロモーターのような誘導プロモーター；メ
タロチオネインプロモーター；熱ショックプロモータ
ー；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモータ
ー；ヒトグロブリンプロモーター；ヘルペス単純チミジ
ンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナ
ーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（本明細書中
上記の改変されたレトロウイルスＬＴＲを包含する）；
β−アクチンプロモーター；およびヒト増殖ホルモンプ
ロモーター。プロモーターはまた、ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得
る。 【０１１６】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージング細胞株を形質導入するために使用され、プ
ロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ
得るパッケージング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１
７、ψ−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、Ｖ
Ｔ−１９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋
Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、および本明細書中で
その全体が参考として援用される、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕ
ｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， 第１巻、５−１
４頁（１９９０）に記載されるＤＡＮ細胞株を含むが、
これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の
任意の手法を通じてパッケージング細胞を形質導入し得
る。このような手法は、エレクトロポレーション、リポ
ソームの使用、およびＣａＰＯ₄沈澱を包含するが、こ
れらに限定されない。１つの改変においては、レトロウ
イルスプラスミドベクターは、リポソーム中へカプセル
化され得るか、または脂質と結合し、次いで宿主に投与
され得る。 【０１１７】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レ
トロウイルスベクター粒子を生成する。次いで、このよ
うなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロ、また
はインビボのいずれかにおいて、真核生物細胞を形質導
入するために使用され得る。形質導入された真核生物細
胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または
複数）を発現する。形質導入され得る真核生物細胞は、
胚幹細胞、胚癌腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、
線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞、
および気管支の上皮細胞を包含するが、これらに限定さ
れない。 【０１１８】本発明はまた、診断としてのＨＤＧＦ−２
遺伝子の使用に関する。ＨＤＧＦ−２をコードする核酸
配列における変異の検出は、疾患またはＨＤＧＦ−２の
過小発現を生じる疾患に対する感受性の診断を可能にす
る。 【０１１９】ヒトＨＤＧＦ−２遺伝子における変異を有
する個体は、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され
得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血
液、尿、唾液、組織バイオプシー、および剖検材料）よ
り得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用
され得るか、または分析前にＰＣＲを用いることにより
酵素的に増幅され得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、
３２４：１６３−１６６（１９８６））。ＲＮＡまたは
ｃＤＮＡもまた同じ目的のために使用され得る。一例と
して、本発明のポリペプチドをコードする核酸に相補的
なＰＣＲプライマーが、ＨＤＧＦ−２変異を同定および
分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入
は、正常な遺伝子型との比較における増幅された産物の
サイズの変化により検出され得る。点突然変異は、放射
標識されたＨＤＧＦ−２ ＲＮＡまたは、あるいは、放
射標識されたＨＤＧＦ−２アンチセンスＤＮＡ配列に、
増幅したＤＮＡをハイブリダイズさせることにより同定
され得る。完全に対合した配列は、ＲＮａｓｅ Ａ消化
または融解温度の差により、ミスマッチした二本鎖と区
別され得る。 【０１２０】参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の
配列の相違は、直接配列決定法によって明らかにされ得
る。さらに、クローン化ＤＮＡセグメントは、特異的な
ＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用
され得る。本方法の感度は、ＰＣＲと組み合わせた場
合、大いに増強される。例えば、配列決定プライマー
は、二本鎖ＰＣＲ産物または改変ＰＣＲによって生成さ
れた一本鎖鋳型分子と共に使用される。配列決定は、放
射性標識ヌクレオチドを用いる従来の手順によって、ま
たは蛍光タグを用いる自動配列決定手順によって行われ
る。 【０１２１】ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝子試験
は、変性剤を含むかまたは含まないゲル中のＤＮＡフラ
グメントの電気泳動の移動度における変化の検出により
達成され得る。小さな配列の欠損および挿入は、高分離
ゲル電気泳動により視覚化され得る。異なる配列のＤＮ
Ａフラグメントは、変性ホルムアミドグラジエントゲル
上で区別され得る。このゲル中で、異なるＤＮＡフラグ
メントの移動度は、それらの特異的な融解温度または部
分的融解温度に従い、異なる位置に、ゲル中で、遅滞さ
れる（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３
０：１２４２ （１９８５））。 【０１２２】特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレ
アーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ
１保護または化学的切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、
ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１ （１９
８５）））により明らかにされ得る。 【０１２３】従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、例え
ば、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的
切断、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例え
ば、制限フラグメント長多形（ＲＦＬＰ））、およびゲ
ノムＤＮＡのサザンブロッティングのような方法により
達成され得る。 【０１２４】より慣習的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定に加えて、変異はまた、インサイチュ分析により
検出され得る。 【０１２５】本発明はまた、種々の組織におけるＨＤＧ
Ｆ−２タンパク質のレベルの変化を検出するための診断
アッセイに関する。なぜなら、正常コントロール組織サ
ンプルと比較したこのタンパク質の過剰発現は、例え
ば、新生物において生じる異常な細胞の分化および増殖
の存在を検出し得るからである。宿主に由来するサンプ
ル中のＨＤＧＦ−２タンパク質のレベルを検出するため
に使用されるアッセイは、当業者には周知であり、そし
てラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエス
タンブロット分析、および好ましくは、ＥＬＩＳＡアッ
セイを含む。ＥＬＩＳＡアッセイは、最初にＨＤＧＦ−
２抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体
を調製する工程を包含する。さらに、レポーター抗体が
このモノクローナル抗体に対して調製される。このレポ
ーター抗体に対して、検出可能な試薬、例えば、放射
能、蛍光、またはこの実施例においては、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ酵素を結合させる。ここで、サンプルは
宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質と
結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシ
ュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上
の任意の遊離のタンパク質結合部位は、ウシ血清アルブ
ミンのような非特異的タンパク質を用いてインキュベー
トすることにより覆われる。次に、モノクローナル抗体
は、ディッシュ中でインキュベートされる。この間に、
モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合
した任意のＨＤＧＦ−２タンパク質に結合する。全ての
非結合モノクローナル抗体は、緩衝液で洗い出される。
西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したレポーター抗体
はここで、ディッシュ中に置かれ、ＨＤＧＦ−２と結合
した任意のモノクローナル抗体に対するレポーター抗体
の結合を生じる。次いで、非結合レポーター抗体は、洗
い出される。次いで、ペルオキシダーゼ基質がディッシ
ュに加えられ、そして所定の時間内の発色量は、標準曲
線と比較した場合、患者サンプルの所定の容量中に存在
するＨＤＧＦ−２タンパク質の測定値である。 【０１２６】競合アッセイが使用され得る。ここで、Ｈ
ＤＧＦ−２に特異的な抗体は、固体支持体に結合し、そ
して標識ＨＤＧＦ−２および宿主由来のサンプルは、固
体支持体上を通過し、そして、固体支持体に結合した検
出された標識の量は、サンプル中のＨＤＧＦ−２の量と
相関し得る。 【０１２７】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を
特異的に標的化し、そしてハイブリダイズし得る。さら
に、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要があ
る。現在、染色***置の標識に利用可能な実際の配列デ
ータ（反復多形）に基づく染色体標識試薬はほとんどな
い。本発明に従うＤＮＡの染色体へのマッピングは、こ
れらの配列と疾患に関する遺伝子とを相関させる重要な
第１段階である。 【０１２８】簡潔に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ ｂｐ）を調製
することにより染色体にマップされ得る。この遺伝子の
３’非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ
内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プ
ロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するため
に使用される。次いで、これらのプライマーは、個々の
ヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリー
ニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子
を含むこれらのハイブリッドのみが、増幅フラグメント
を生じる。 【０１２９】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いる本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメ
ントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローン
のプールを用いて部分的局在性（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚ
ａｔｉｏｎ）が達成され得る。その染色体に対してマッ
プするために同様に使用され得る他のマッピングストラ
テジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識
化フロー選別（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプ
レスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブ
ラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる
予備選択を含む。 【０１３０】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）は、１工程で正確な染色***置を提供するために使
用され得る。この技術は、少なくとも５０または６０塩
基を有するｃＤＮＡを用いて使用され得る。この技術の
総説としては、Ｖｅｒｍａら， Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏ
ｍｏｓｏｍｅｓ： ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉ
ｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒ
ｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参照のこ
と。 【０１３１】一旦配列が正確な染色***置にマップされ
ると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝的地図の
データと相関し得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈ
ｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐ
ｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄ
ｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能で
ある）に見出される。次いで、同一の染色体領域にマッ
プされる遺伝子と疾患との間の関係が、連結解析（物理
的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 【０１３２】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変
異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正
常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因
因子でありそうである。 【０１３３】物理的マッピング技術および遺伝子マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関する染色体領域
に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００との
間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１
メガベースのマッピング解像度で、そして２０ｋｂあた
り１遺伝子と仮定する。） このポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘
導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現
する細胞は、それらに対する抗体を産生するための免疫
原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリ
クローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得
る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化
抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現
ライブラリーの産物を含む。当該分野で公知の種々の手
順が、このような抗体およびフラグメントの産生のため
に使用され得る。 【０１３４】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次い
で、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体
に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ
ントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチ
ド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。
次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現す
る組織からポリペプチドを単離するために使用され得
る。 【０１３５】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的な細胞株の培養により産生される抗体を提供する任意
の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技
術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， １９７
５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５−４９７）、
トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏ
ｚｂｏｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔ
ｏｄａｙ ４： ７２）、およびヒトモノクローナル抗
体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌ
ｅら， １９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ， Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６
頁）が挙げられる。 【０１３６】単鎖抗体を産生するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合し得る。また、トランスジェニックマウスが、本
発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体の
発現に使用され得る。 【０１３７】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことが理解されるべきである。すべての部または
量は、他に明記しない限り重量基準である。 【０１３８】以下の実施例の理解を容易にするために、
出現頻度の高い所定の方法および／または用語を記載す
る。 【０１３９】「プラスミド」は、先行する小文字のｐお
よび／またはそれに続く大文字および／または数字によ
り命名される。本明細書中の出発プラスミドは、市販さ
れているか、制限無く公的に入手可能であるか、または
公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築
され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラ
スミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そ
して当業者には通常明らかである。 【０１４０】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的のために、代表的には１μｇのプラ
スミドまたはＤＮＡフラグメントには、約２単位の酵素
が約２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構
築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的のため
に、代表的には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単
位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制
限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者に
より特定される。３７℃にての約１時間のインキュベー
ション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の
説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアク
リルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメント
を単離する。 【０１４１】切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，８： ４０５７ （１９８０）により記載され
た８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。 【０１４２】「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。 【０１４３】「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、同上、１４６頁）。他に
提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件
で、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント
０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。 【０１４４】記載しない限り、形質転換はＧｒａｈａ
ｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ａ．， Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６−４５７ （１９７３）
の方法に記載のように実施された。 【０１４５】 【実施例】（実施例１） （ＨＤＧＦ−２タンパク質の細菌発現および精製）ＨＤ
ＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第
号）を、タンパク質の５’配列および遺伝子
に対する３’ベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて最初に増幅する。この遺伝
子に対応するさらなるヌクレオチドを、５’および３’
配列にそれぞれ添加した。ＨＤＧＦ−２の５’オリゴヌ
クレオチドプライマーは、配列 【０１４６】 【数１】 （配列番号３）を有し、ＢａｍＨＩ制限酵素部位を含
む。３’配列 【０１４７】 【数２】 （配列番号４）は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に相補的な配列
を有し、その後にＴＧＦα−ＨＩＩコード配列が続く。 【０１４８】制限酵素部位は、細菌性発現ベクターｐＱ
Ｅ−９（Ｑｉａｇｅｎ、 Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒ
ｔｈ、 ＣＡ ９１３１１）上の制限酵素部位に対応す
る。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐ^r）、細菌の
複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ調節可能プロモーターオ
ペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢ
Ｓ）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位をコードす
る。次いで、ｐＱＥ−９をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化する。増幅された配列をｐＱＥ−９に連結
し、そしてヒスチジンタグおよびＲＢＳをコードする配
列とインフレームで挿入する。次いで、連結混合物を用
いて、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｍ１５／ｒｅｐ４株（Ｑｉａｇ
ｅｎ，Ｉｎｃ）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８９）に記
載の手順により形質転換する。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、
ｌａｃＩリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐
性（Ｋａｎ^r）をもまた付与するプラスミドｐＲＥＰ４
のマルチコピーを含有する。形質転換体をＬＢプレート
上で増殖する能力により同定し、そしてアンピシリン／
カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮ
Ａを単離して、制限酵素分析により確認する。所望の構
築物を含有するクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍ
ｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充した
ＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させ
る。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、１：１００〜１：２５０の
比で大規模培養物に接種する。細胞を、６００の光学密
度（Ｏ．Ｄ．⁶⁰⁰）が０．４と０．６との間になるまで
増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−
Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を加えて１ｍＭの最終
濃度にする。ＩＰＴＧはｌａｃＩリプレッサーを不活性
化し、Ｐ／Ｏリーディングを解読して遺伝子発現を増加
することにより誘導する。細胞を３〜４時間増殖させ
る。次いで、細胞を遠心分離により収集する。この細胞
ペレットをカオトロピック薬剤６ＭグアニジンＨＣｌ中
で可溶化する。明澄化の後、６−Ｈｉｓタグを含有する
タンパク質による緊密な結合を可能にする条件下でのニ
ッケル−キレートカラムにおけるクロマトグラフィーに
よって、この溶液から可溶化ＨＤＧＦ−２を精製する
（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ ４１１：１７７−１８４（１９８４））。この
タンパク質を６ＭグアニジンＨＣｌ ｐＨ５．０でカラ
ムから溶出し、そして復元のために３ＭグアニジンＨＣ
ｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオ
ン（還元型）、および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に
調整した。この溶液中での１２時間のインキュベーショ
ンの後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対し
て透析した。 【０１４９】（実施例２） （バキュロウイルス発現系を用いるケモカインＨＤＧＦ
−２の発現および精製）全長のＨＤＧＦ−２タンパク質
をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第 号）を、
遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて増幅した。 【０１５０】５’プライマーは、配列 【０１５１】 【数３】 （配列番号５）を有し、そしてＢａｍＨＩ制限酵素部位
（太字）、それに続く真核生物細胞における翻訳の開始
に有効なシグナルに類似する６ヌクレオチド（Ｋｏｚａ
ｋ， Ｍ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９６，
９４７−９５０，（１９８７））を含み、ＨＤＧＦ−２
遺伝子の２５ヌクレオチドが続く（翻訳開始コドン「Ａ
ＴＧ」は下線を付される）。 【０１５２】３’プライマーは、配列 【０１５３】 【数４】 （配列番号６）を有し、そして制限エンドヌクレアーゼ
Ａｓｐ７１８の切断部位およびＨＤＧＦ−２遺伝子の
３’非翻訳配列に相補的な２６ヌクレオチドを含む。増
幅配列を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」 Ｂ
ＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃ
ａ．）を用いて、１％アガロースゲルより単離した。次
いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩお
よびＡｓｐ７１８で消化し、そして次いで再び１％アガ
ロースゲルで精製した。このフラグメントをＦ２と称す
る。 【０１５４】ベクターｐＡ２（ｐＶＬ９４１ベクターの
改変体、下記）をバキュロウイルス発現系を用いるＨＤ
ＧＦ−２タンパク質の発現のために用いる（総説につい
て、Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，
Ｇ．Ｅ． １９８７， Ａｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔ
ｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕ
ｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａ
ｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． １５５５を参照
のこと）。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭ
ＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続
く制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。シミアン
ウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、効率的
なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容
易に選択するために、Ｅ． ｃｏｌｉ由来のβガラクト
シダーゼ遺伝子をポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化
シグナルが続くポリヘドリンプロモーターと同方向に挿
入する。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクト野生
型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えのためのウイ
ルス配列により両端で隣接させる。多くの他のバキュロ
ウイルスベクターが、ｐＡ２の代わり（例えば、ｐＲＧ
１、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ
１）に用いられ得る（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳ
ｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １７
０：３１−３９）。 【０１５５】プラスミドを制限酵素で消化し、そして次
いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスファター
ゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを市販のキ
ット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」 ＢＩＯ １０１ Ｉｎ
ｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を用いて、１％ア
ガロースゲルより単離した。このベクターＤＮＡをＶ２
と称する。 【０１５６】フラグメントＦ２および脱リン酸化プラス
ミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
次いで、Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形
質転換し、そして酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８を
用いて、ＨＤＧＦ−２遺伝子を有するプラスミド（ｐＢ
ａｃ−ＨＤＧＦ−２）を含む細菌を同定した。クローン
化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認し
た。 【０１５７】５μｇのプラスミドｐＢａｃ−ＨＤＧＦ−
２を、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，
８４：７４１３−７４１７ （１９８７））を用いて、
１．０μｇの市販の線状化バキュロウイルス（「Ｂａｃ
ｕｌｏＧｏｌｄ^TM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮ
Ａ」， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ， ＣＡ．）とともにコトランスフェクトした。 【０１５８】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TMウイルス
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃ−ＨＤＧＦ−
２を、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ， ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの
滅菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌのリポフェ
クチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合
し、そして室温にて１５分間インキュベートした。次い
で、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレー
ス培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播
種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１
１）に滴下した。プレートを、新たに加えられた溶液を
混合するために、前後に振とうした。次いでプレート
を、２７℃で５時間インキュベートした。５時間後、ト
ランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして
１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培
地を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そ
して２７℃で４日間培養を続けた。 【０１５９】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法として、青く染色された
プラークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａ
ｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロー
スゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述
はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細
胞培養法およびバキュロウイルス学のための使用者ガイ
ド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。 【０１６０】連続希釈物の４日後、ウィルスを細胞に加
え、そして青く染色されたプラークをエッペンドルフピ
ペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含
む寒天を、２００μｌのグレース培地を含むエッペンド
ルフチューブ中で再懸濁した。寒天を、短時間の遠心分
離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む
上清を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞を
感染するために用いた。４日後、これらの培養ディッシ
ュの上清を回収し、次いで４℃で保存した。 【０１６１】Ｓｆ９細胞を、１０％熱失活化ＦＢＳを補
充したグレース培地中で増殖した。細胞を、感染多重度
（ＭＯＩ）２で、組換えバキュロウイルスＶ−ＨＤＧＦ
−２で感染させた。６時間後、その培地を除去し、そし
てメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００ Ｉ
Ｉ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４
２時間後、５μＣｉの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉ
の³⁵Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細
胞を、さらに１６時間インキュベートし、その後細胞を
遠心分離により採集し、そして標識されたタンパク質を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより
可視化した。 【０１６２】（実施例３） （ＣＯＳ細胞における組換えＨＤＧＦ−２の発現）プラ
スミドＣＭＶ−ＨＤＧＦ−２ ＨＡの発現は、以下を含
むベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）に由来する：１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシ
リン耐性遺伝子、３）Ｅ． ｃｏｌｉ複製起点、４）ポ
リリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデ
ニル化部位が続くＣＭＶプロモーター。完全なＨＤＧＦ
−２前駆体およびその３’末端にインフレームで融合さ
れたＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントを、ベク
ターのポリリンカー領域にクローン化する。それゆえ、
組換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーター下で支配
される。ＨＡタグは、以前に記載されたようなインフル
エンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応
する（Ｉ． Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７， ７６
７（１９８４））。標的タンパク質に対するＨＡタグの
融合は、ＨＡエピトープを認識する抗体での組換えタン
パク質の容易な検出を可能にする。 【０１６３】プラスミド構築ストラテジーを以下に記載
する：プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に
含まれるＨＤＧＦ−２をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣ
Ｃ受託番号第 号）は、５’末端においてｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクタープライマー（Ｔ３）および
ＸｈｏＩ制限部位を含むＨＤＧＦ−２コード配列の３’
末端におけるＨＤＧＦ−２特異的プライマーを用いるＰ
ＣＲによって増幅される。ＰＣＲを介した増幅後、得ら
れたＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いて
消化し、そしてＸｈｏＩ制限部位の後ろにインフレーム
でＨＡタグを含む改変ｐｃＤＮＡ−１ベクターに連結し
た。得られたプラスミドは、Ｃ末端でＨＡタグにインフ
レームで融合した全コード配列が続くＨＤＧＦ−２の
５’非翻訳領域を含む。 【０１６４】連結混合物を、Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ
株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）に形質転換し、形
質転換された培養物をアンピシリン培地プレートに播種
し、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡ
を形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの
存在について制限分析により試験する。組換えＨＤＧＦ
−２の発現のために、ＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥ−ＤＥＸ
ＴＲＡＮ法（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓ
ｃｈ、Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ， Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８９））により発現ベクター
でトランスフェクトする。ＨＤＧＦ−２−ＨＡタンパク
質の発現を、放射標識および免疫沈降法（Ｅ． Ｈａｒ
ｌｏｗ， Ｄ． Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８８））により検出する。細
胞を、トランスフェクションの２日後、³⁵Ｓ−システイ
ンで８時間標識する。次いで培養培地を回収し、そして
細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ Ｎ
Ｐ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐ
Ｈ７．５））（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、同上 ３７：７
６７ （１９８４））で溶解する。細胞溶解物および培
養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用い
て沈降させる。沈降したタンパク質を、１５％ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルで分析する。 【０１６５】（実施例４） （遺伝子治療を介した発現）線維芽細胞を皮膚バイオプ
シーにより被験体から得る。生じた組織を組織培養培地
に置き、そして小片に分離する。組織の小片を、各フラ
スコに約１０片ずつ、組織培養フラスコの湿った表面上
に置く。このフラスコを上下逆さに回し、堅く密封して
室温で一晩放置する。室温で２４時間後、このフラスコ
を逆さにし、そして組織の小片をフラスコの底に固定
し、そして新鮮な培地（例えば１０％ＦＢＳ、ペニシリ
ンおよびストレプトマイシン含有Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培
地、）を添加する。次いで、これを３７℃で約１週間イ
ンキュベートする。このとき、新鮮な培地を添加し、そ
して続いて、２、３日毎に培地を交換する。さらなる２
週間の培養後、線維芽細胞の単層が出現する。この単層
をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコへスケ
ールアップする。 【０１６６】Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスのロン
グターミナルリピートの側面に配置されるｐＭＶ−７
（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：
２１９−２５（１９８８）を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化し、そして続いて仔ウシ腸ホスファター
ゼで処理する。線状化ベクターをアガロースゲル上で分
画し、そしてガラスビーズを用いて精製する。 【０１６７】本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａを、それぞれ各５’および３’末端配列に対応するＰ
ＣＲプライマーを用いて増幅する。５’プライマーはＥ
ｃｏＲＩ部位を含有し、そして３’プライマーはさらに
ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する。等量のＭｏｌｏｎｅｙ
マウス肉腫ウイルス線状化骨格と増殖したＥｃｏＲＩお
よびＨｉｄＩＩＩフラグメントとを、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼの存在下に共に加える。生じた混合物を２つのフラ
グメントの連結のために適切な条件下に維持する。この
連結混合物を用いて細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次い
で、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有する
ことを確認する目的のために、これをカナマイシン含有
アガー上にプレートする。 【０１６８】アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ
＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清
（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン含有ダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でコンフルエ
ントな密度まで組織培養で増殖する。次いで、遺伝子を
含有するＭＳＶベクターを培地に添加し、そしてパッケ
ージング細胞をベクターで形質導入する。このパッケー
ジング細胞は、遺伝子を含有する感染ウイルス粒子を産
生する（このパッケージング細胞はプロデューサー細胞
といわれる）。 【０１６９】形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮
な培地を添加し、そして続いて、この培地をコンフルエ
ントなプロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから回収
する。感染ウイルス粒子を含有する使用した培地を、ミ
リポアフィルターを通して濾過して未接着のプロデュー
サー細胞を取り除き、そして次いでこの培地を線維芽細
胞の感染に使用する。培地を線維芽細胞のサブコンフル
エントなプレートから取り除き、プロデューサー細胞由
来培地に素早く置き換える。この培地を除去し、そして
新鮮な培地に置き換える。ウイルスの力価が高い場合、
次いで、実質的にすべての線維芽細胞が感染され、そし
て選択の必要はない。ウイルス力価が非常に低い場合、
次いでｎｅｏまたはｈｉｓのような選択マーカーを有す
るレトロウイルスベクターを使用することが必要であ
る。 【０１７０】次いで、単独でまたはサイトデックス（ｃ
ｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリアビーズ上でコンフル
エントに増殖した後のいずれかで、操作された線維芽細
胞を宿主に注入する。この線維芽細胞はタンパク質産物
を産生する。 【０１７１】本発明の多数の改変および種々の変化が上
記の教示に照らして可能であり、そしてそれゆえ、添付
の請求の範囲の範囲内で、特に記載のない限りは本発明
は実施され得る。 【０１７２】以下の図面は、本発明の実施態様を例示す
るものであり、請求の範囲により包含される本発明の範
囲を制限することを意味しない。 【０１７３】 【発明の効果】本発明によれば、新規の成熟ポリペプチ
ド、ならびに生物学的に活性で、かつ診断または治療に
有用なそのフラグメント、アナログ、およびそれらの誘
導体が提供される。 【０１７４】 【配列表】 【０１７５】 【表１】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [0001] FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a newly identified
A polynucleotide, such a polynucleotide
Encoded polypeptide, such a polynucleotide
Use of peptides and polypeptides, and the
It concerns the production of nucleotides and polypeptides. Than
In particular, the polypeptides of the present invention are
Factor (sometimes referred to hereinafter as "HDGF-2")
). The present invention also
Inhibiting the action of such polypeptides. [0002] BACKGROUND OF THE INVENTION Cell growth is dependent on various growth factors and sizes.
Regulated by tocaine. These are transcription factor activities.
Cascade of intracellular biochemical signals for
Binds to a specific membrane receptor to elicit
Activation and repression of different subsets of genes
(Aaroson, SA, Sciencec
e, 254: 1146-1153 (1991)). [0003] Growth factor (HDGF) derived from liver cancer is the most important.
Recently cloned (Nakamura, H. et al.,
J. Bio. Chem. , 269 (40): 25143.
-25149 (1994)). HDGF is a fibroblast
Mitogenic heparin
It is a binding protein. HDGF is derived from human liver cancer
Swiss 3T3 cells from conditioned medium of cell line HuH-7
Purified by incorporation of tritiated thymidine into cells
Was done. HDGF has no signal peptide,
After transfection of the cDNA clone, COS-
Secreted into the medium of 7 cells. This is a heparin-binding
Protein and some tumor-derived cell lines and
And ubiquitously expressed in tissues. This is for liver cancer cells
It is located in the cytoplasm and has strong growth stimulating activity. [0004] SUMMARY OF THE INVENTION The object of the present invention is to provide a novel
And a biologically active, and
Fragments or analogs thereof useful for diagnosis or therapy,
And derivatives thereof. [0005] SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides an isolated
Providing the isolated polynucleotide
The tide is: (A) Polynucleic acid encoding the polypeptide of FIG.
Leotide; (B) ATCC accession number DN included in issue
matured polypep having an amino acid sequence expressed by a
A polynucleotide encoding a tide; (C) High in the polynucleotide of (a) or (b)
Be capable of hybridizing and at least
A polynucleotide that is also 70% identical; and (D) the polynucle of (a) or (b) or (c)
A polynucleotide fragment of leotide
Including members selected from: In one embodiment, SEQ ID NO: 2
Encoding a polypeptide comprising amino acids 1-249,
A polynucleotide as described above is provided. [0007] The present invention further provides the above polynucleotide.
A vector comprising: [0008] The present invention further provides a method using the above-described vector.
A genetically engineered host cell is provided. [0009] The present invention also provides a process for producing a polypeptide.
Process, the process comprises the following steps: Claims
Encoding the polypeptide from the host cell of claim 4
Expressing the polypeptide to be expressed. [0010] The present invention further provides the use of the above vector.
And genetically manipulating the cells.
Provides a process for generating cells capable of expressing
I do. The present invention also relates to (i) the putative amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
Amino acid sequences and their fragments, analogs,
And polypeptides having derivatives; and (ii) AT
CC accession number Coded by the cDNA of the issue
Polypeptides and fragments of the polypeptides
Selected from the group consisting of
A polypeptide. In one embodiment, the amino acid of FIG.
Provided is a polypeptide as described above, comprising an acid. The present invention also relates to the above-mentioned polypeptides.
Antibodies. The present invention further provides an activity of the above-mentioned polypeptide.
A compound that inhibits sexual activity is provided. The present invention also has a need for HDGF-2.
Providing a method for treating a patient having
Bottom: a therapeutically effective amount of the polypeptide of claim 7
Administering to an individual. [0016] In one embodiment, the therapeutically effective
An amount of the polypeptide encoding the polypeptide
Providing the DNA to the subject's DNA, and the polypeptide
Providing a method of administering by expressing in vivo.
You. The present invention further relates to a HDGF-2 polypeptide.
Methods for the treatment of patients having a need to inhibit
The method comprises providing a therapeutically effective amount of a compound as described above.
Administering to the patient. The present invention also relates to the use of the above polypeptide in a patient.
Sensitivity to diseases or disorders related to underexpression of peptides
Provide a process for diagnosing sex
Comprises: the polypeptide in a patient-derived sample
Identifying a mutation in the nucleic acid sequence encoding
I do. The present invention further provides a diagnostic process,
This diagnostic process involves the following:
Analyzing the presence of the polypeptide according to claim 7.
Step. [0020] The present invention further relates to the above-mentioned polypeptides.
A method for identifying compounds that are gonists is provided.
The method comprises the steps of:
Binding of cells and compounds expressed on the surface to the receptor
Contacting under conditions that permit
The putter responds to the binding of the compound to the receptor
Associated with a second component capable of providing a detectable signal
And the interaction of the compound with the receptor
By detecting the presence of the signal generated by
Whether the compound binds and activates the receptor
Identifying whether it is. The present invention also relates to a polypeptide
And methods to identify compounds that inhibit activation
The method comprises the following steps: HDGF-2 polypeptide
And the compound to be screened, HDG
Expressing the F-2 receptor polypeptide on its surface
Permit cells to bind to the receptor polypeptide
Contacting under conditions, wherein the receptor is
Test in response to binding of the compound to the receptor polypeptide.
Associated with a second component capable of providing an emittable signal
Detecting the absence of a signal.
The compound inhibits the HDGF-2 polypeptide
Identifying whether or not it is. [0022] DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The polypeptide of the present invention is HDG.
It was putatively identified as an F-2 polypeptide. This same
Is determined as a result of the amino acid sequence homologous to human HDGF.
Has been made. According to one aspect of the present invention, a novel mature
Polypeptides and biologically active and diagnostic
Or therapeutically useful fragments, analogs, and
Derivatives thereof are provided. The polypeptide of the present invention
It is of human origin. According to another aspect of the invention, the isolated nucleus
Acid molecules are provided, including mRNA, DNA, cD
NA, genomic DNA and its analogs and raw
This flag is physically active and useful for diagnosis or treatment.
Segment. According to yet another aspect of the present invention, a set
To produce such polypeptides by recombinant techniques
Process is provided. Recombinant technology uses the poly
A recombinant prokaryotic inn containing a nucleic acid sequence encoding the peptide
The main cell and / or the recombinant eukaryotic host cell is
Culture under conditions that promote protein expression.
And recovering the protein. According to a further aspect of the present invention,
Or a polypeptide such as
A polynucleotide to be administered
And screening for antagonist compounds,
And therapeutic goals (eg, burns, tissue repair, and ulcers)
Acceleration of injury healing as a result of thrombosis and arterial stiffness
Treating keratosis, preventing nerve damage due to neuropathy
And promote nerve growth, bone and periodontal regeneration
Promoting life, treating sunburn, bone marrow cells and
To stimulate endothelial growth and / or differentiation
Prevents skin aging and hair loss, reduces organ formation
Stimulating) is provided. According to a further aspect of the present invention, there is provided a method according to the present invention.
Specifically hybridizes to the nucleic acid sequence encoding the polypeptide
Nucleic acid probes containing nucleic acid molecules of sufficient length to soy
A probe is also provided. According to a still further aspect of the present invention,
Antibodies to such polypeptides are provided. According to another aspect of the present invention,
By binding and activating receptors
An agonist is provided that mimics a polypeptide of the invention. According to yet another aspect of the present invention,
Antagonists to such polypeptides are provided
You. It inhibits the action of such polypeptides
(Eg treatment of restenosis after angiogenesis, tumor angiogenesis
To prevent scarring,
Hyper-vascular di
treatment). [0031] According to yet another aspect of the present invention, diseases and
And diseases associated with mutations in the nucleic acid sequences of the invention.
For detecting competence and by such sequences
Diagnostics to detect overexpression of a loaded polypeptide
A shear assay is provided. According to another aspect of the present invention, such a
A polypeptide, or a polypeptide encoding such a polypeptide.
Polynucleotides for scientific research, DNA synthesis and
In Vitro Eyes Related to DNA Vector Production
A process is provided for utilization for a target. [0033] These and other aspects of the invention are described in detail herein.
It should be apparent to those skilled in the art from the teachings herein. According to one aspect of the invention, FIG.
Mature polypeptide having the deduced amino acid sequence of No. 2)
Or ATCC Accession No. on May 24, 1995 issue
Encoded by the cDNA of the clone deposited as
Isolated nucleic acid encoding a mature polypeptide (poly
Nucleotides) are provided. Polynucleic acid encoding the polypeptide of the present invention
Nucleotides can be obtained from heart, brain, and skeletal muscle
You. The polynucleotide of the present invention comprises human umbilical vein endothelial tissue.
Was found in the derived cDNA library. this is,
It is structurally related to the HDGF family. This is 24
Openlay encoding a 9 amino acid residue protein
Including frame. This protein has 201
Highest degree for human HDGF over amino acid length
(23% identity and 61% similarity)
You. The polynucleotide of the present invention may be in the form of RNA.
Or DNA (this DNA is cDNA, genomic DN
A, and synthetic DNA).
Single strand is coding strand or non-coding (antisense) strand
Where possible, the DNA can be double-stranded or single-stranded.
You. The coding sequence encoding the mature polypeptide is shown in FIG.
(SEQ ID NO: 1) or the deposited claw
Can be identical to the coding sequence of the
The columns are shown in FIG. 1 as a result of duplication or degeneracy of the genetic code.
Same as the DNA of (SEQ ID NO: 1) or the deposited cDNA
A different coding sequence that encodes the mature polypeptide
obtain. The mature polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2)
Or the mature polypeptide encoded by the deposited cDNA
The polynucleotide encoding the tide may include:
But not limited to: coding sequence for mature polypeptide
Sequence only; coding sequence for mature polypeptide and additional
Coding sequence; coding sequence for mature polypeptide (and required
Additional coding sequences as needed) and non-coding sequences
(Eg, intron or mature polypeptide coding
Sequence 5 'and / or 3' non-coding sequence). Thus, the term "encoding a polypeptide"
"Polynucleotide" refers to the polypeptide coding sequence only.
And a further coding sequence
And / or a polynucleotide comprising a non-coding sequence
Including. The present invention further relates to FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
A polypeptide having a defined amino acid sequence, or
Polypeptide encoded by cDNA of clone
Encoding fragments, analogs, and derivatives of
The present invention relates to variants of the polynucleotide described above.
Polynucleotide variants are naturally occurring polynucleotides.
Allelic variants or polynucleotides present in
It may be a non-naturally occurring variant. Accordingly, the present invention provides a method as shown in FIG.
The same mature polypeptide as indicated, or
Mature polypeptide encoded by the cDNA of the
Polynucleotide that encodes
Includes variants of the oligonucleotide. This variant is
1 polypeptide or cDNA of the deposited clone
Fragments and derivatives of polypeptides encoded by
Or code analog. Such nucleotides
Mutants include deletion mutants, substitution mutants, and addition or
Includes insertion variants. As indicated hereinabove, polynucleic acid
Leotide has the coding sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or
Is a naturally occurring allele of the coding sequence of the deposited clone
It may have a coding sequence that is a genetic variant. In the field
As is known, allelic variants can have one or more
Polynucleotides that may have otide substitutions, deletions or additions
Another form of peptide sequence, which is the encoded polypeptide
Does not substantially alter the function of the peptide. The present invention also encompasses polynucleotides,
Here, the coding sequence for the mature polypeptide is derived from the host cell.
Nucleic Acid Aids Expression and Secretion of Polypeptides
Otide sequences (eg, to transport polypeptides from cells)
Leader sequence that functions as a controlling secretory sequence)
Can be fused with the same reading frame. leader
The polypeptide having the sequence is a preprotein, and
Host cells to form a mature form of the polypeptide
May have a leader sequence cleaved by Polynucleus
Otides also contain the mature protein and additional 5 '
It may encode a non-acid residue, a protein. Professional distribution
The mature protein with the sequence is a protein,
And inactive forms of the protein. Once the pro sequence is cut
Otherwise, the active mature protein remains. Thus, for example, the polynucleotides of the present invention
Can encode a mature protein or
Protein or prosequence and presequence with sequence
(Leader sequence)
obtain. The polynucleotide of the present invention also relates to the polynucleotide of the present invention.
To a marker sequence that allows for purification of the polypeptide
It may have the coding sequence fused in frame. marker
The sequence may be, in the case of a bacterial host, a sequence fused to a marker.
A pQE-9 vector that provides for purification of a mature polypeptide
Hex histidine tag supplied by Ah
Alternatively, for example, the marker sequence may be a mammalian host (eg,
If COS-7 cells are used, hemagglutinin
(HA) tags. HA tag is for influenza
Matches an epitope derived from the hemagglutinin protein
(Wilson, I. et al., Cell, 37: 767.
(1984)). The term "gene" refers to the production of a polypeptide chain.
Means the DNA segment involved in the
Area that precedes and follows the
And trailers) and individual code segments (d
(Xons). Fragment of the full length HDGF-2 gene
Is to isolate the full length HDGF-2 gene, and
Have high sequence similarity or similarity to this gene
C for isolating other genes having the biological activity of
Hybridization probe for DNA library
Can be used as This type of probe is preferred
Or at least 30 bases, and
Or more bases. This probe also
CDNA clone corresponding to the full-length transcript, and
Regulatory and promoter regions, exons, and
Genomic clone containing the entire gene
Number (s)). Screw
For example, combining oligonucleotide probes
By using known DNA sequences to generate
Isolating the coding region of the gene. Remains of the present invention
Labeled oligonucleotides with sequences complementary to gene sequences
The probe indicates that this probe matches any member of the library
To determine whether to hybridize, human cDN
A, genomic DNA or mRNA libraries
Used for cleaning. The present invention further provides that at least 70
%, Preferably at least 90%, and more preferably
Here means that at least 95% identity is present
In the polynucleotide that hybridizes to the above sequence
Related. The invention particularly relates to the polynucleotides described herein above.
Hybridizes under stringent conditions
Related to polynucleotides. For use herein
The term "stringent conditions" is used for hybridization.
At least 95% and preferably less between sequences
Can only occur if at least 97% identity exists.
Means In a preferred embodiment hereinabove
A polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide
Otide was deposited in the cDNA of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or deposited.
Mature polypeptide encoded by the cDNA
Retain the same biological function or activity
Encodes a polypeptide. Alternatively, the polynucleotide may comprise
At least 20 bases, preferably 30 bases, and more preferably
Or 50 bases. These are the polynuclear compounds of the present invention.
Hybridized to nucleotides, and
Have an identity to it and retain activity
It may or may not be carried. For example,
Such a polynucleotide may be, for example, the polynucleotide
Polynucleotide of SEQ ID NO: 1 for recovery of leotide
As a probe for or a diagnostic probe or
It can be used as a PCR primer. Accordingly, the present invention relates to the polypeptide of SEQ ID NO: 2
For polynucleotides encoding the tides, and
At least 30 bases, and preferably at least 50 bases
For that fragment with bases, and
Polypeptide encoded by such a polynucleotide
At least 70%, preferably less
At least 90%, and more preferably at least 95%
Polynucleotides having identity as well as such
Polynucleotides encoded by polynucleotides
About. Deposits referred to in this specification are subject to patent procedures.
Of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms
Maintained under lifetime. These deposits are simply
Provided solely for the convenience of the trader and
Recognition that a deposit is required under Article 112
is not. A polynucleotide sequence contained in the deposit,
And amino acids of the polypeptide encoded thereby
The acid sequence is incorporated herein by reference, and
To control any inconsistencies with the sequence descriptions herein.
I have. To manufacture, use or sell the deposit
May require a license, and such a license
Is not given by this. The present invention further relates to FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
CDNA having a defined amino acid sequence or deposited
HDGF-2 having an amino acid sequence encoded by
Polypeptides, and polypeptides of such polypeptides
, Analogs and derivatives. The terms “fragment”, “derivative” and
"Analog" refers to the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
Or the polypeptide encoded by the deposited cDNA.
If so, the organism is essentially the same as such a polypeptide.
Polypeptide that retains a biological function or activity
You. Therefore, the analog is formed by cleavage of the proprotein part.
That can be activated to produce an active mature polypeptide
Proteins. The polypeptide of the present invention is a recombinant polypeptide.
Tide, a natural polypeptide or a synthetic polypeptide.
And preferably a recombinant polypeptide. The polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2)
Phage of the polypeptide encoded by the deposited cDNA
The fragment, derivative or analog is (i) one or more
Amino acid residues are conserved or non-conserved amino acids
Substituted with an acid residue (preferably a conserved amino acid residue)
The substitution of such amino acid residues in the genetic code
May be encoded amino acid residues, or
Or may not be, or (ii)
Wherein one or more amino acid residues contain a substituent
(Iii) mature polypeptide is halved in polypeptide
Compounds (eg, polyethylene glycol)
Or fused with another compound such as
(Iv) additional amino acids are fused to the mature polypeptide
And used to purify the mature polypeptide
It can be. Such fragments, derivatives, and
And analogs are within the purview of those skilled in the art from the teachings herein.
It is believed that there is. Polypeptides and Polynucleotides of the Invention
The tide is preferably provided in an isolated form; and
Preferably it is purified to homogeneity. The term “isolated” means that a substance is
Environment (for example, the natural environment, if it occurs naturally)
Means that it has been removed from For example, alive
Naturally occurring polynucleotides present in animals
Alternatively, the polypeptide is not isolated, but is a naturally occurring system.
Separated from some or all of the coexisting materials in
The same polynucleotide or polypeptide that is
Has been isolated. Such a polynucleotide is a vector
And / or such polynuclei
The leotide or polypeptide is part of the composition
Obtained, and such a vector or composition is
In that it is not part of the environment. The polypeptide of the present invention comprises the polypeptide of SEQ ID NO: 2.
Ripeptides (especially mature polypeptides) and SEQ ID NOs
At least 70% similarity to the two polypeptides (preferably
Or at least 70% identity), and more preferably
Is at least 90% similar to the polypeptide of SEQ ID NO: 2
Sex (more preferably at least 90% identity), and
And even more preferably with the polypeptide of SEQ ID NO: 2.
At least 95% similarity (even more preferably less
And 95% identity).
And generally also at least 30 amino acids and more
Polypeptide preferably comprising at least 50 amino acids
Of such a polypeptide having such a portion of
Including parts. As is known in the art, two poly
"Similarity" between peptides is the distribution of the second polypeptide.
The amino acid sequence of one polypeptide and
Determined by comparing its conserved amino acid substitutions
Is done. A fragment of the polypeptide of the present invention or
Is the corresponding full-length polypeptide from peptide synthesis.
Can be used to produce Therefore, this flag
Is an intermediate for producing the full-length polypeptide.
Can be used. Fragmentation of the polynucleotide of the present invention
Part or portion combines the full-length polynucleotide of the invention.
Can be used to generate The present invention also relates to the polynucleotide of the present invention.
Using the vector of the present invention
Host cells to be used
For the production of peptides. The host cell is a vector of the present invention (this is
For example, a cloning vector or an expression vector
Genetic engineering (transduction or transformation)
Or transfected). Vector is an example
For example, plasmids, virus particles, phages, etc.
Can be The engineered host cell activates the promoter.
To transform, select a transformant, or
Conventional nutrient media modified appropriately to amplify genes
Can be cultured. Culture conditions (eg, temperature, pH
Previously used in the host cell selected for expression
Conditions, and will be apparent to those skilled in the art. The polynucleotide of the present invention can be produced by a recombinant technique.
Can be used to produce a polypeptide. Obedience
Thus, for example, a polynucleotide emits a polypeptide
Included in any one of a variety of expression vectors for expression
Can be Such vectors contain chromosomal DNA sequences,
Includes chromosomal and synthetic DNA sequences. this
Such vectors are, for example, derivatives of SV40;
Plasmid; phage DNA; baculovirus; yeast
Plasmid; Combination of plasmid and phage DNA
Virus-derived vectors; for example,
A, adenovirus, fowlpox virus, and pseudorabies
Disease). However, it is replicable and
Any other vector can be used as long as
You. The appropriate DNA sequence may be determined by various procedures.
Can be inserted into the reactor. Generally, DNA sequences are
Appropriate restriction endonuclease sites by procedures known in
Is inserted into These and other procedures are well-known in the art.
It is considered to be within the range of the person. The DNA sequence in the expression vector is
Operably linked to a current control sequence (promoter);
Directs RNA synthesis. Such promoters
Tabular examples may include: LTR or
SV40 promoter,E. FIG. coli. lacOr
trp, Phage P_LPromoters and prokaryotic cells
Or gene expression in eukaryotic cells or their viruses
Other promoters known to control. Expression
The vector also contains a ribosome binding site for translation initiation.
And a transcription terminator. Vector hammer
It may also contain appropriate sequences for amplifying expression. Furthermore, the expression vector is preferably
Phenotypic traits for selection of transformed host cells (eg,
For eukaryotic cell cultures, dihydrofolate reductor
Ze or neomycin resistance, or, for example,E. FIG. co
liResistance or ampicillin in rats
Contains one or more marker genes that provide
You. Suitable DNA sequences as described herein above
Contains appropriate promoter or control sequences
The appropriate vector is transformed into an appropriate host and
It can be used to express protein. Representative examples of suitable hosts include:
Can include: bacterial cells (eg,E. FIG. coli,S
treptomyces,Salmonella ty
phimuriumFungal cells (eg, yeast); insects
Cells (for example,Drosophila S2andSp
odoptera Sf9); Animal cells (eg, CH
O, COS or Bowes melanoma); adenovirus
And plant cells. Selection of an appropriate host is described herein.
It is considered within the skill of the art from the teachings. More specifically, the present invention is also broadly described above.
A recombinant construct comprising one or more sequences as described in
You. This construct is compatible with a vector (eg, a plasmid vector).
Vector or viral vector).
In which the sequence of the present invention is inserted in the forward or reverse direction
I have. In a preferred aspect of this embodiment, the construct comprises
In addition, a regulatory sequence operably linked to the sequence (eg,
(Including a promoter). Many suitable vectors
And promoters are known to those of skill in the art, and
Available for purchase. The following vectors are provided as examples
You. Bacterial: pQE70, pQE60, pQE-9 (Q
iagen), pBS, pD10, phaescri
pt, psiX174, pbluescript S
K, pbsks, pNH8a, pNH16a, pNH1
8A, pNH46A (Stratagene); ptr
c99a, pKK223-3, pKK233-3, pD
R540, pRIT5 (Pharmacia); eukaryote
Physical properties: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, p
XT1, pSG (Stratagene) pSVK3,
pBPV, pMSG, pSVL (Pharmaci
a). However, any other plasmid or vector
That they are replicable and viable in the host
As long as it can be used. The promoter region is CAT (chloramph
Enicol transferase) vector or selection
Any other desired vector using other vectors with
It can be selected from genes. Two suitable vectors are P
KK232-8 and pCM7. Especially well-known
The bacterial promoters were lacI, lacZ, T3, T
7, gpt, λP_R, P_LAnd trp. Eukaryote
Promoters are CMV immediate early, HSV thymidine
Nase, early SV40 and late SV40, retrovirus
Ruth-derived LTR and mouse metallothionein I
Including. Selection of appropriate vectors and promoters is
Minutes are within the level of ordinary skill in the art. In a further embodiment, the invention relates to the above-described structure.
The present invention relates to host cells containing structures. The host cell is higher
Eukaryotic cells (eg, mammalian cells) or lower eukaryotes
It can be a biological cell (eg, a yeast cell) or
The primary cell can be a prokaryotic cell (eg, a bacterial cell)
You. Introduction of the construct into the host
Transfection, DEAE-dextran mediated tiger
By transfection or electroporation
(Davis, L., Dibner,
M. Battey, I .; , Basic Method
s in Molecular Biology, (1
986)). The construct in the host cell may be
Conventional methods for producing encoded gene products
Can be used. Alternatively, the polypeptide of the present invention
Can be produced synthetically by conventional peptide synthesizers.
You. [0072] Mature proteins include mammalian cells, yeast,
Under control of an appropriate promoter in bacteria or other cells
Can be expressed. The cell-free translation system is also a DNA of the present invention.
Using RNA from the construct,
It can be used to produce proteins. Prokaryotic hosts and
Cloning vectors for use in eukaryotic hosts
And expression vectors are described in Sambrook et al., Mol.
eco Cloning: A Laborat
ory Manual, 2nd edition, Cold Spring
g Harbor, N .; Y. , (1989) (this disclosure
Is incorporated herein by reference).
I have. DNA encoding the polypeptide of the present invention
Transcription by higher eukaryotes enhances vector
Augmented by inserting sequences. Enhancers
Cis-acting element of DNA, usually about 10 to about
300 bp, which act on the promoter and
Increase transcription. As an example, the late bp1 of the replication origin
SV40 enhancer from 00 to 270, cytomegalow
ILS early promoter enhancer, after origin of replication
Phase polyoma enhancer and adenovirus
Enhancers. Generally, a recombinant expression vector is
Origins and selectable markers that allow transformation of yeast
(For example,E. FIG. coliAmpicillin resistance gene and
AndS. cerevisiaeTRP1 gene)
From highly expressed genes that direct transcription of structural sequences downstream
Contains a promoter. Such a promoter
Are, among others, glycolytic enzymes (eg, 3-phosphoglycerin)
Acid kinase (PGK)), α-factor, acid phosphater
Operon that encodes heat shock protein
Can be derived from The heterologous structural sequence includes a translation initiation sequence and a translation sequence.
Assembled in proper phase with the translation stop array. If necessary,
Heterologous sequences have the desired characteristics (eg, expressed recombinant products).
N-terminus to provide product stabilization or simplified purification).
A fusion protein comprising a constant peptide may be encoded. Expression vectors useful for use in bacteria are available from
An operable read phase with an active promoter,
Insert the structural DNA sequence encoding the desired protein
Inserts with translation start and stop signals
It is built by doing. Vectors can contain one or more tables
Ensure the maintenance of the genotype selectable marker and vector,
And replication origin to provide for amplification in the host, if desired.
Contains dots. Prokaryotic hosts suitable for transformation
IsE. FIG. coli,Bacillus subtili
s,Salmonella typhimurium,
And Pseudomonas sp., Streptom
genus yces and Staphylococcus
, But also other species for selection
Can be used. As a representative, but not limiting, example,
Expression vectors useful for use in fungi include the well-known clonin
Of the vector pBR322 (ATCC 37017)
Selection from commercially available plasmids containing gene elements
It may contain a marker and a bacterial origin of replication. This
Commercially available vectors include, for example, pKK223-3 (P
harmcia Fine Chemicals,
Uppsala, Sweden and GEM1 (P
romega Biotec, Madison, W
I, USA). These pBR322 "skeletons"
The part contains the appropriate promoter and the structure to be expressed
Combined with an array. Transformation of a suitable host strain and suitable cells
Following growth of the host strain to density, the selected promoter
-The appropriate means (eg, temperature shift or chemical induction)
And the cells are cultured for a further period of time.
It is. [0078] Cells are typically collected by centrifugation.
Crushed by physical or chemical means, and
The crude extract obtained is retained for further purification.
You. Microbes used in protein expression
Cells are subjected to freeze-thaw cycles, sonication, mechanical disruption
Any convenient method, including disruption or use of cell lysing agents
By law (such methods are well known to those skilled in the art).
Can be crushed. Various mammalian cell culture systems may also be recombinant.
And can be used to express proteins. Mammal
Examples of expression systems include Gluzman, Cell, 2
3: 175 (1981) Monkey kidney line described by
Release of COS-7 strain of fibroblasts and compatible vector
Other cell lines that can be expressed (eg, C127, 3T3, CH
O, HeLa, and BHK cell lines). Feeding
Animal expression vectors contain an origin of replication, an appropriate promoter and
And enhancers, and also contain any necessary
Ribosome binding site, polyadenylation site, splice
Donor and splice acceptor sites, transcription termination
Contains a binding sequence and a 5 'flanking non-transcribed sequence
You. A DNA sequence derived from the SV40 splice, and
The polyadenylation site is a required non-transcribed genetic element
Can be used to provide The HDGF-2 polypeptide is used below.
Recovered from the recombinant cell culture by
Can be purified: ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction
Chromatography, anion or cation exchange chromatography,
Phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction
Chromatography, affinity chromatography
-, Hydroxyapatite chromatography, and
Lectin chromatography. If necessary, protein
Quality refolding process is mature
Can be used to complete protein placement. Final
High performance liquid chromatography (HPLC)
Can be used for final purification steps. [0082] The polypeptides of the present invention may be naturally occurring purified
Product of a chemical synthesis procedure
Obtained or obtained from a prokaryotic or eukaryotic host (eg,
For example, bacteria, yeast, higher plants, insects, and
(By mammalian cells)
You. Depending on the host used in the recombinant production procedure,
The light polypeptide can be glycosylated, or
It cannot be glycosylated. The polypeptide of the present invention is
And may include the first methionine amino acid residue. The polypeptide of the present invention has an angiogenic ability.
As a result, it stimulates vascular endothelial cell proliferation and
Disease conditions (eg, thrombosis, arteriosclerosis, and other heart
Vascular disease) to stimulate revascularization of ischemic tissue
Can be used for the treatment of These polypeptides also have angiogenic potential
As a result of force, induction of mesoderm and four
Can be used to stimulate limb regeneration. The polypeptide may also be used for injuries, burns, surgery,
And can be used to promote healing of wounds due to ulcers
You. Because these polypeptides are species of different origin
Each cell (eg, fibroblasts and skeletal muscle cells)
Are mitogenic and therefore injured.
Promote the repair or replacement of guttered or diseased tissue
It is. The polypeptides of the present invention may also be used for nerve growth.
To stimulate, and certain nerve damage or Alz
Hymer's disease, Parkinson's disease, and AIDS-related con
Treats nerve damage that occurs in neurodegenerative conditions such as plexes.
Can be used to place and prevent. This polypeptide stimulates chondrocyte proliferation
This polypeptide is therefore used for bone regeneration.
To increase raw and periodontal regeneration and for tissue transplantation
Or it can be used to support bone grafts. The polypeptide of the present invention is a keratin-forming polypeptide.
Skin aging due to sunburn by stimulating vesicle growth
Can be used to prevent This polypeptide also activates hair-forming cells
By activating and promoting melanocyte proliferation
And can be used to prevent hair loss. The polypeptides of the present invention also include hematopoietic cells and
And used to stimulate the proliferation and differentiation of bone marrow cells
Can be The polypeptide also maintains organs prior to transplantation.
Or to support primary tissue cell culture
Can be used for The polypeptides of the present invention may also be of mesodermal origin.
Can be used to induce different tissues to differentiate early embryos
You. [0093] The polynucleotide and the polypep of the present invention
Pide is the discovery of treatment and diagnosis for human diseases.
Used as research reagents and materials for research. The present invention relates to a receptor for the polypeptide of the present invention.
A method for the identification of a protein is provided. This receptor
Encoding genes include, for example, ligand panning and
FACS search (Coligan et al., Current P
rotocols in Immun. , 1 (2),
Chapter 5, (1991)).
Can be identified. Preferably, the expression clone
The polyadenylation RNA was used for HDGF-2 polypep- ing.
Used when prepared from cells responsive to the tide.
And a cDNA library made from this RNA
Are divided into pools and unresponsive COS cells or
Used to transfect other cells. S
Transfected cells grown on ride glass
Is exposed to labeled HDGF-2. HDGF-2
The polypeptide may be an iodinated or site-specific protein
By various means, including the inclusion of a recognition site for the kinase.
Can be labeled. After fixation and incubation,
Slides are subjected to autoradiographic analysis. Positive
Identify pools and prepare subpools and repeatability
Using a subpool and rescreening process
Retransfected and encodes a putative receptor
A single clone is finally obtained. For receptor identification
In one alternative approach, the labeled ligand is
Cell membrane or extract preparation expressing receptor molecules and light
Photoaffinity link
d) can be done. Crosslinked material was separated by PAGE analysis.
And exposed to X-ray film. Ligand-Receive
The labeled complex containing the putter is excised and
Is broken down into peptide fragments and
It can be subjected to sequencing. Amy from microsequencing
The acid sequence is a series of degenerate oligonucleotide probes.
Design to identify genes encoding putative receptors
For screening cDNA libraries for
Used for The present invention provides a method for screening compounds,
Binds to the HDGF-2 receptor (agonist), and
Activate or activate the HDGF-1 receptor (Anta
Gonist) and identify compounds that bind and inhibit.
For example, a competition assay may be used, where HDGF
Cell or Membrane Preparation Expressing the 2-2 Receptor
-Labeled HDGF-2 and compounds to be tested
Incubate with HDGF-2 receptor
The ability of a compound to compete depends on the presence and absence of the compound.
The amount of bound HDGF-2 polypeptide in the presence
Liquid scintillation counting
Can be identified. Alternatively, the agonist compound may be tested
After the interaction of the compound to be
Can be identified by detecting the response of the jar system.
HDGF-2 receptor is a radioactive compound
And expressing the HDGF-2 receptor
It is measured by contact with the cells to be treated. like this
The second messenger system is cAMP guanylate
Enzymes, ion channels, or phosphoinositide
Including, but not limited to, water splitting. Antagonis
Compounds can be identified using this assay,
Where the antagonist binds to the receptor but
Do not elicit a demessenger response and, as a result,
Efficient blocking of HDGF-2 polypeptide derived from
You. Methods for Preparing Cells for the Assays Above
The method is based on the cell population (assumed to contain no receptor)
Containing DNA encoding the HDGF-2 receptor
Transfection with a unique vector.
This causes the cells to express the receptor. Appropriate response system
Is the desired second messenger pathway (cAMP,
On-channel, phosphoinositide kinase, or
Transfer of the DNA to a suitable host (including a lucium response).
Obtained by transfection. Such a tiger
The transfection system is exposed to various compounds and cells
To provide a response system for analyzing the activity of
Offer. In a specificity assay, HDGF-2
Proliferation stimulating activity is described in Nakamura, H .; Et al., Cli
n. Chim. Acta, 183: 273-284 (1
989), which is hereby incorporated by reference in its entirety.
Albino mouse 3T3
To cells^ThreeH] To measure thymidine incorporation
Assay in the presence of potential compounds. Examples of antagonist compounds include HD
Having various important positions on the GF-2 receptor,
Is epidemiologically reactive and binds to a receptor and
Blocks receptors derived from DGF-2 polypeptide
Antibodies. Antibodies generally include the antigen binding of the antibody.
Anti-idiota recognizes unique determinants attached to the binding site
Ip antibodies are included. This type of antibody is HDGF
-2 prepared against the polypeptide itself and binds to the antibody
And prevents the interaction of the antibody with its receptor
You. In competition with HDGF-2 itself, HDG-2
Second messenger that binds to F-2 receptor
Oligopeptides that do not elicit a response are also
Can be used as a compound. As an example of an oligopeptide
Include, for example, small peptides or peptide-like molecules.
Can be The oligopeptide is also the active part of HDGF-2
Binding to HDGF-2 and its interaction with its receptor
May block action. An antisense prepared using antisense technology
The antisense construct also produces a HDGF-2 polypeptide.
Used as an antagonist compound to prevent
Can be Antisense technology is based on triple helix formation or
Gene expression via antisense DNA or RNA
Can be used to control both of these methods.
That the nucleotides bind to DNA or RNA
Based on. For example, a mature polypeptide of the invention
The 5 'coding portion of the polynucleotide sequence to be encoded has a length
Antisense RNA oligonucleotides of about 10 to 40 base pairs
Used to design nucleotides. DNA oligo
Nucleotides are complementary to regions of the gene involved in transcription
(Triple helix-Lee et al., Nuc
l. Acids Res. , 6: 3073 (19
79); Cooney et al., Science, 24.
1: 456 (1988); and Dervan et al., S.
science, 251: 1360 (1991)
See, eg, transcription and HDGF-2
Inhibits production. Antisense RNA oligonucleotide
Will hybridize to the mRNA in vivo and
Block translation of RNA molecule into HDGF-2 polypeptide
(Antisense-Okano, J. Neuro
chem. , 56: 560 (1991);
Oligonucleotides as antisense inhibitors of expression
Otide, CRC Press, Boca Rato
n, FL (1988)). The above oligonucleotide
Can also be delivered to the cells, thereby
RNA or DNA inhibits HDGF-2 production
To be expressed in vivo. Antagonists include neoplastic cells and tissues
Growth and proliferation effects of polypeptides of the invention on
To inhibit (ie, stimulate tumor angiogenesis)
Can be used for And therefore, abnormal cell growth and
Delays growth and growth (eg, in tumorigenesis or growth)
Do or hinder. [0103] Antagonists are also predictive of hypervascular disease.
Can be used to prevent and prevent post-capsule cataract surgery
Inhibits the growth of skin lens cells. Cell mitogenic activity of the polypeptide of the present invention
Sexual prophylaxis is also like restenosis after angioplasty balloons
Is desired in such cases. Antagonists may also inhibit scarring during wound healing.
It can be used to prevent tissue inflammation and proliferation. The antagonist may also be pharmaceutically acceptable
Compounds having a carrier (eg, as described below)
Can be used in products. The polypeptides and agonists of the present invention
In addition, antagonist compounds are suitable pharmaceutical carriers
Can be used in combination with Such compositions are cured
A therapeutically effective amount of a polypeptide or compound, and pharmaceutically
Includes an acceptable carrier or excipient. Such a key
Carriers include saline, buffered saline, and
Strawose, water, glycerol, ethanol, and
These combinations include, but are not limited to
No. The formulation should suit the mode of administration. The present invention also relates to one of the pharmaceutical compositions of the present invention.
Pharmaceutical package comprising one or more containers filled with the above ingredients
Provide kits or kits. For such containers,
Controls the manufacture, use, or sale of a drug or biological product.
Product labeling in the format prescribed by the controlling government agency.
This product labeling applies to the manufacture and use of human
Represents institutional or commercial approval. Further
In addition, the polypeptides and compounds of the present invention may be used in other therapeutic applications.
It can be used with compounds. These pharmaceutical compositions can be topical, intravenous,
As simple as by intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, or intradermal route
It can be administered in a convenient manner. Pharmaceutical compositions have certain signs
Is administered in an amount effective for treatment and / or prevention of
Generally, the pharmaceutical composition will be at least about 10 μg / kg body
Administered in heavy doses, and often they
Or less than about 8 mg / kg body weight. Many
In most cases, the dosage is about 10 μg / kg body weight per day.
From about 1 mg / kg body weight, depending on the administration route, symptoms, etc.
Be considered. HDGF-2 polypeptide and polypep
Agonists and antagonists which are also
The expression of such polypeptides ex vivo provides the invention
Which is often referred to as "gene therapy"
It is said that Thus, for example, cells from a patient
A polynucleotide encoding a peptide (DNA or
RNA), and can be manipulated ex vivo using
Manipulated cells in a patient to be treated with the polypeptide
Provided to Such methods are well known in the art.
And will be apparent from the teachings herein. example
The cell may be an RNA encoding a polypeptide of the invention.
By using a retroviral plasmid vector containing
Can be manipulated. Similarly, cells can be used to produce polypeptides in vivo.
For expression of the peptide, for example, by procedures known in the art.
Can be manipulated in vivo. For example, packaging details
The vesicle contains RNA encoding the polypeptide of the present invention.
Transduced with a retroviral plasmid vector.
As a result, the packaging cell
To produce infectious viral particles containing These programs
Reducer cells manipulate cells in vivo
And engineer polypeptide expression in vivo
To be administered to a patient. In this way
These methods and methods for administering the polypeptides of the present invention.
And other methods will be apparent to those skilled in the art from the teachings of the present invention.
It should be. The inducible retrovirus described herein above.
Retroviruses derived from the ills plasmid vector
Ronnie mouse leukemia virus, spleen necrosis virus, retro
Virus (eg Rous sarcoma virus), Harvey sarcoma
Virus, chicken leukemia virus, gibbon leukemia
Virus, human immunodeficiency virus, adenovirus, bone
Myeloproliferative sarcoma virus and mammalian tumor virus
Including but not limited to. In one embodiment
The retroviral plasmid vector is Moroni
-Induced by mouse leukemia virus. Vectors contain one or more promoters
I do. Suitable promoters that can be used are retroviruses.
Lus LTR; SV40 promoter; and Mille
r et al.Biotechniques, Volume 7, Issue 9,
980-990 (1989).
Gallovirus (CMV) promoter, or any other
Promoter (for example, but not limited to,
Ton, pol III, and β-actin promoters
Cells such as eukaryotic cellular promoters
Cell promoter), but are not limited to
No. Other viral promoters that can be used include adeno
Viral promoter, thymidine kinase (TK) pro
Motor and B19 parvovirus promoter
Including but not limited to. The right promoter
The choice of key is obvious to one of ordinary skill in the art based on the techniques included herein.
It is easy. A nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention
The rows are under the control of a suitable promoter. Can be used
Suitable promoters include, but are not limited to:
Not limited: adenovirus major late promoter
Adenovirus promoter such as; or cytomega
Heterologous promoters, such as the rovirus (CMV) promoter
Data; RS virus (respiratory sy
ncytial virus) (RSV) promoter
-; An inducible promoter such as the MMT promoter;
Tarothioneine promoter; heat shock promoter
-; Albumin promoter; ApoAI promoter
ー; human globulin promoter; herpes simple thymiji
Virus thymidine quina such as the kinase kinase promoter
Ase promoter; retroviral LTR (as used herein)
Including the modified retroviral LTRs described above);
β-actin promoter; and human growth hormone
Motor. The promoter also encodes the polypeptide.
Can be a natural promoter that controls the gene
You. The retroviral plasmid vector is
Used to transduce packaging cell lines,
Form a reducer cell line. Transfected
Examples of packaging cells obtained are PE501, PA31
7, ψ-2, ψ-AM, PA12, T19-14X, V
T-19-17-H2, $ CRE, $ CRIP, GP +
E-86, GP + envAm12, and herein
Miller, which is incorporated by reference in its entirety.Hu
man Gene Therapy, Volume 1, 5-1
Including the DAN cell line described on page 4 (1990),
It is not limited to these. Vectors are known in the art.
Transform packaging cells through any technique
You. Such techniques include electroporation,
Use of Sosomes and CaPO_FourIncluding precipitation
It is not limited to these. In one modification, the retro
Ils plasmid vector is encapsulated in liposomes
Or binds to lipids and then administered to the host
Can be done. The producer cell line contains the polypeptide
An infectious agent containing the encoding nucleic acid sequence (s)
Generate torovirus vector particles. Then this
Such retroviral vector particles can be used in vitro,
Transduces eukaryotic cells either in vivo
Can be used to enter. Transduced eukaryotic cells
The vesicle is a nucleic acid sequence (single or
Expression). Eukaryotic cells that can be transduced
Embryonic stem cells, embryo carcinoma cells, and hematopoietic stem cells, hepatocytes,
Fibroblasts, myoblasts, keratinocytes, endothelial cells,
And bronchial epithelial cells, including but not limited to
Not. The present invention also provides HDGF-2 as a diagnostic.
Related to the use of genes. HDGF-2 encoding nucleic acid
Detection of a mutation in the sequence is indicative of disease or HDGF-2
Enables the diagnosis of susceptibility to diseases that cause under-expression
You. A mutation in the human HDGF-2 gene
Individuals are detected at the DNA level by various techniques.
obtain. Nucleic acids for diagnosis may be derived from patient cells (eg, blood
Fluid, urine, saliva, tissue biopsy, and autopsy material)
Can be obtained. Genomic DNA is used directly for detection
Or by using PCR before analysis
Can be enzymatically amplified (Saiki et al., Nature,
324: 163-166 (1986)). RNA or
cDNA can also be used for the same purpose. One example
To complement a nucleic acid encoding a polypeptide of the invention.
PCR primers identify HDGF-2 mutations and
Can be used to analyze. For example, deletions and insertions
Is the amplified product in comparison to the normal genotype
It can be detected by a change in size. Point mutation, radiation
Labeled HDGF-2 RNA or
The radiolabeled HDGF-2 antisense DNA sequence
Identification by hybridizing amplified DNA
Can be done. Perfectly matched sequences are RNase A digested
Or, due to the difference in melting temperature,
Can be separated. Between the reference gene and the gene having the mutation
Sequence differences can be revealed by direct sequencing.
You. In addition, the cloned DNA segment contains specific
Used as a probe to detect DNA segments
Can be done. The sensitivity of this method is
If so, it is greatly enhanced. For example, sequencing primers
Generated by double-stranded PCR product or modified PCR
Used with a single-stranded template molecule. Sequencing
By conventional procedures using radiolabeled nucleotides,
Or by automated sequencing procedures using fluorescent tags.
You. Genetic Testing Based on DNA Sequence Differences
Is the DNA fragment in the gel with or without denaturing agent.
By detecting changes in the electrophoretic mobility of
Can be achieved. Highly isolated deletions and insertions of small sequences
It can be visualized by gel electrophoresis. DN of different sequence
A fragment is a denaturing formamide gradient gel
Can be distinguished above. In this gel, different DNA flags
The mobility of the element depends on their specific melting temperature or part
Delayed in the gel, at different locations, according to the fractional melting temperature
(Eg, Myers et al., Science, 23
0: 1242 (1985)). A sequence change at a particular position may also
Ase protection assays (eg, RNase protection and S
1 Protection or chemical cleavage methods (eg, Cotton et al.,
PNAS, USA, 85: 4397-4401 (19
85))). Therefore, the detection of a specific DNA sequence is, for example,
Hybridization, RNase protection, chemical
Cleavage, direct DNA sequencing or the use of restriction enzymes (eg,
Restriction fragment length polymorphism (RFLP))
By a method such as Southern blotting of nome DNA
Can be achieved. More conventional gel electrophoresis and DNA sequencing
In addition to sequencing, mutations can also be determined by in situ analysis.
Can be detected. The present invention also provides HDG in various tissues.
Diagnostics for detecting changes in F-2 protein levels
For the assay. Because normal control tissue support
Overexpression of this protein compared to
Abnormal cell differentiation and proliferation that occurs in neoplasms
This is because the presence of the Sump derived from host
To detect the level of HDGF-2 protein in DNA
The assays used for are well known to those skilled in the art, and
Radioimmunoassay, competitive binding assay, waste cloth
Tan blot analysis, and preferably, ELISA
Including Say. The ELISA assay is performed first with HDGF-
Antibodies specific to two antigens, preferably monoclonal antibodies
The step of preparing In addition, reporter antibodies
Prepared against this monoclonal antibody. This repo
Detectable reagents, e.g., radiation,
Ability, fluorescence, or, in this embodiment, horseradish
The oxidase enzyme is bound. Where the sample is
Removed from the host, and
The solid support to which it is attached (eg, a polystyrene dish)
). Then on the dish
Any free protein binding site in bovine serum albumin
Incubate with a non-specific protein such as
Cover it. Next, the monoclonal antibody
Is incubated in the dish. During this time,
Monoclonal antibody conjugated to polystyrene dish
Binds to any given HDGF-2 protein. All of
Unbound monoclonal antibodies are washed out with a buffer.
Reporter antibody conjugated to horseradish peroxidase
Is now placed in the dish and binds to HDGF-2
Reporter antibody to any monoclonal antibody
To form a bond. The unbound reporter antibody is then washed
Be sent out. Then, the peroxidase substrate is
Color and the amount of color development within a given time
Present in a given volume of patient sample when compared to the line
This is a measured value of the HDGF-2 protein. A competition assay can be used. Where H
Antibodies specific for DGF-2 bind to the solid support and
The labeled HDGF-2 and the host-derived sample are
The test passed over the support and bound to the solid support.
The amount of label released was determined by the amount of HDGF-2 in the sample.
Can be correlated. The sequences of the present invention are also useful for chromosome identification.
It is. This sequence maps a specific position on an individual human chromosome.
It can be specifically targeted and hybridized. Further
Now, it is necessary to identify a specific site on the chromosome.
You. The actual sequence data currently available for labeling chromosome locations
Chromosome labeling reagents based on
No. The mapping of DNA to chromosomes according to the present invention is
Important to correlate these sequences with disease genes
This is the first stage. [0127] Briefly, the sequence was converted from cDNA to P
Prepare CR primer (preferably 15-25 bp)
Can be mapped to a chromosome. Of this gene
Computer analysis of 3 'untranslated region
Does not span more than one exon within
To quickly select primers that do not complicate the process
Used for These primers are then
PCR screening of somatic cell hybrids containing human chromosomes
Used for ning. Human gene corresponding to primer
Only those hybrids containing
Is generated. PCR mapping of somatic cell hybrids
To assign specific DNA to specific chromosomes
This is a quick procedure. The same oligonucleotide primer
The present invention can be used to identify fragments from specific chromosomes.
Panel or a large genomic clone in a similar fashion
Localization using a pool of
ation) can be achieved. The chromosome
Other mapping strategies that can also be used to
Teggie, in situ hybridization, labeling
Flow-sorted chromosomes
Rescreening and live chromosome-specific cDNA
By hybridization to build a rally
Including preselection. Metaphase chromosome spread of cDNA clones
In situ hybridization (FIS)
H) is used to provide accurate chromosomal locations in one step.
Can be used. This technique requires at least 50 or 60 salts
It can be used with cDNA having a group. Of this technology
For a review, see Verma et al., Human Chrom.
mosomes: a Manual of Basi
c Technologies, Pergamon Pr
ess, New York (1988)
When. Once the sequence has been mapped to a precise chromosomal location,
Then, the physical position of the sequence on the chromosome
Can correlate with data. Such data, for example,
V. McKusick, Mendelian Inh
eritance in Man (Johns Hop
kins University Welch Med
available online from ical Library
A) is found. Then, map to the same chromosome region.
The relationship between the gene and the disease to be
Co-inheritance of closely adjacent genes). Next, the cD between affected and unaffected individuals
It is necessary to determine NA or genomic sequence differences. Strange
Differences observed in some or all affected individuals but positive
If not observed in normal individuals, this mutation can cause disease
It is likely to be a factor. Physical Mapping Techniques and Gene Mapping
Chromosomal regions for disease at the current resolution of
The cDNA accurately located at 50 and 500
May be one of the potential causal genes in between. (This is 1
Mega-based mapping resolution and 20kb warm
Assume one gene. ) This polypeptide, their fragments or other proteins
Conductors, their analogs, or express them
Immunizing cells to produce antibodies against them
Can be used as a source. These antibodies are, for example, poly
Can be a clonal or monoclonal antibody
You. The present invention also relates to chimeric antibodies, single chain antibodies and humanized
Antibodies, and Fab fragments, or Fab expression
Includes library products. Various hands known in the art
Order for the production of such antibodies and fragments
Can be used for For polypeptides corresponding to the sequences of the present invention,
Antibodies produced by direct injection of the polypeptide into animals.
Or by administration of the polypeptide to the animal.
Can be The animal is preferably non-human. Next
The antibody thus obtained is the polypeptide itself.
To join. In this way, the fragmentation of the polypeptide
Even sequences that encode only native polypeptides
Can be used to generate antibodies that bind to the entire drug.
Such antibodies then express the polypeptide.
Used to isolate a polypeptide from a tissue.
You. For preparation of monoclonal antibodies, serial
Providing antibodies produced by cultivation of a specific cell line
Techniques may be used. For example, hybridoma technology
Surgery (Kohler and Milstein, 197
5, Nature, 256: 495-497),
Trioma technology, human B cell hybridoma technology (Ko
Zbor et al., 1983, Immunology T.
day 4: 72), and human monoclonal antibodies
EBV hybridoma technology for producing the body (Col
e et al., 1985, Monoclonal Anti.
bodies and Cancer Therap
y, Alan R. Liss, Inc. , 77-96
Page). Techniques Described for Producing Single Chain Antibodies
(U.S. Pat. No. 4,946,778) shows the immunity of the invention.
To generate a single-chain antibody to a non-genic polypeptide product
Can be adapted. In addition, transgenic mice
Of humanized antibodies against the immunogenic polypeptide products of the invention
Can be used for expression. The present invention will be further described with reference to the following examples.
However, the invention is limited to such examples.
It should be understood that not. All departments or
Amounts are by weight unless otherwise specified. To facilitate understanding of the following examples,
Describe certain frequently occurring methods and / or terms
You. “Plasmids” are preceded by lowercase p and
And / or followed by capital letters and / or numbers
Is named. The starting plasmids herein are commercially available.
Is publicly available without restriction, or
Constructed from available plasmids according to published procedures
Can be either. In addition,
Plasmids equivalent to sumids are known in the art and
And it is usually obvious to a person skilled in the art. “Digestion” of DNA refers to specific arrangements in the DNA.
Catalytically catalyzes the DNA with a restriction enzyme that acts only in the
Refers to cutting. Various controls used in this specification
Restriction enzymes are commercially available and their reaction conditions,
Cofactors and other requirements are those known to those skilled in the art.
Was used. For analytical purposes, typically 1 μg
Approximately 2 units of enzyme are included in the sumid or DNA fragment.
Is used in about 20 μl of buffer solution. Plasmid construction
For the purpose of isolating DNA fragments for construction
Typically, 5 to 50 μg of DNA is 20 to 250 singly.
Is digested in a larger volume. Specific system
Appropriate buffers and substrate amounts for restriction enzymes are provided by the manufacturer.
More specific. Incubation at 37 ℃ for about 1 hour
Is usually used, but this is
Can vary according to instructions. After digestion, remove the reaction
Direct electrophoresis on a Lilamide gel to obtain the desired fragment
Is isolated. The size separation of the cleaved fragments was performed according to Goe
ddel, D.E. Et al., Nucleic Acids R
es. , 8: 4057 (1980).
Performed using 8% polyacrylamide gel. “Oligonucleotide” is a single-stranded polynucleotide.
Oxynucleotide or two complementary polydeoxy
Any of the nucleotide chains, which are chemically combined
Can be achieved. Such synthetic oligonucleotides are
No 5 'phosphate and therefore phosphate in the presence of kinase
If you do not add ATP and another oligonucleotide
Do not connect. Synthetic oligonucleotides are dephosphorylated
Ligation to the missing fragment. "Ligation" refers to two double-stranded nucleic acid fragments.
Process to form a phosphodiester bond between
(Maniatis, T et al., Supra, p. 146). other
If not provided, ligation is performed using known buffers and conditions.
In approximately equimolar amounts of the DNA fragments to be ligated.
10 units of T4 DNA ligase per 0.5 μg
("Ligases"). Unless otherwise stated, transformation was performed using Graha
m, F. And Van der Eb, A. et al. , Vi
rology, 52: 456-457 (1973).
Was performed as described in the method of [0145] Example (Example 1) (Bacterial expression and purification of HDGF-2 protein) HD
DNA sequence encoding GF-2 (ATCC Accession No.
No.), the 5 'sequence of the protein and the gene
PCR oligonucleotide corresponding to the 3 'vector sequence for
First amplify using leotide primers. This heredity
Additional nucleotides corresponding to the offspring are 5 'and 3'
Each was added to the sequence. 5 'Oligonus of HDGF-2
The nucleotide primer has the sequence [0146] (Equation 1) (SEQ ID NO: 3) and contains a BamHI restriction enzyme site.
No. 3 'array [0147] (Equation 2) (SEQ ID NO: 4) is a sequence complementary to the HindIII site
, Followed by the TGFα-HII coding sequence. The restriction enzyme site was constructed using the bacterial expression vector pQ.
E-9 (Qiagen, Inc., Chatsworth)
th, CA 91311).
You. pQE-9 is resistant to antibiotics (Amp^r), Bacterial
Origin of replication (ori), IPTG regulatable promoter
Pererator (P / O), ribosome binding site (RB
S), encoding a 6-His tag and a restriction enzyme site
You. The pQE-9 was then replaced with BamHI and HindI.
Digest with II. Ligate amplified sequence to pQE-9
And a sequence encoding the histidine tag and RBS
Insert in column and in frame. Then use the combined mixture
AndE. FIG. coli  M15 / rep4 strain (Qiag
en, Inc) by Sambrook, J. et al. Mo
rectangular Cloning: A Labora
tory Manual, ColdSpring L
Laboratory Press, (1989)
Transform according to the procedure described above. M15 / rep4 is
expresses the lacI repressor and is resistant to kanamycin
Sex (Kan^r) Also provides the plasmid pREP4
Contains multiple copies of Transformants on LB plate
Identified by their ability to grow on, and ampicillin /
Select kanamycin resistant colonies. Plasmid DN
A is isolated and confirmed by restriction enzyme analysis. Desired structure
The clones containing the build were amplified with Amp (100 μg / m
l) and Kan (25 μg / ml) were both supplemented
Grow overnight (O / N) in liquid culture in LB medium
You. Using an O / N culture, 1: 100 to 1: 250.
Inoculate a large culture in ratio. Cells are grown at 600 optical densities.
Degree (OD⁶⁰⁰) Is between 0.4 and 0.6
Propagate. Next, IPTG (“isopropyl-B-
D-thiogalactopyranoside ") and add 1 mM final
To the concentration. IPTG inactivates lacI repressor
And decipher the P / O reading to increase gene expression
Induce by doing. Allow cells to grow for 3-4 hours
You. The cells are then collected by centrifugation. This cell
Pellets in chaotropic drug 6M guanidine HCl
And solubilize. After clarification, contains 6-His tag
Under conditions that allow tight binding by the protein
For chromatography on a nickel-chelate column
Therefore, the solubilized HDGF-2 is purified from this solution.
(Hochuli, E et al., J. Chromatogra
phy 411: 177-184 (1984)). this
The protein was washed with 6 M guanidine HCl pH 5.0.
Eluted from the system and 3M guanidine HC for reconstitution
1, 100 mM sodium phosphate, 10 mM glutathiol
(Reduced) and 2 mM glutathione (oxidized)
It was adjusted. 12 hours incubation in this solution
After the protein has been
Dialyzed. (Example 2) (Chemokine HDGF using baculovirus expression system
-2 expression and purification) Full length HDGF-2 protein
DNA sequence (ATCC Accession No. No.)
PCR oligonucleotides corresponding to the 5 'and 3' sequences of the gene
Amplification was performed using nucleotide primers. The 5 'primer has the sequence [0151] [Equation 3] (SEQ ID NO: 5) and a BamHI restriction enzyme site
(Bold), followed by initiation of translation in eukaryotic cells
Nucleotides (Koza) similar to the signal available for
k, M, J.M. Mol. Biol. , 196,
947-950, (1987)) and HDGF-2.
Followed by 25 nucleotides of the gene (translation initiation codon "A
"TG" is underlined). The 3 'primer has the sequence [0153] (Equation 4) (SEQ ID NO: 6) and a restriction endonuclease
Asp718 cleavage site and HDGF-2 gene
Contains 26 nucleotides complementary to the 3 'untranslated sequence. Increase
The width array was converted to a commercially available kit (“Geneclean” B
IO 101 Inc. , La Jolla, C
a. ) Was used to isolate from a 1% agarose gel. Next
Now, the fragment is ligated with the endonuclease BamHI and
And Asp718 and then again with 1% agar
Purified on Rose gel. Call this fragment F2
You. The vector pA2 (of the pVL941 vector)
HD using a baculovirus expression system
Used for expression of GF-2 protein (for review
Summers, M .; D. And Smith,
G. FIG. E. FIG. 1987, Manual of met
hods for baculovirus vector
ors and insect cell culture
re procedures, Texas Agri
cultural Experimental Sta
Tion Bulletin No. See 1555
That). This expression vector is Autographa
  californica nuclear polyhedrosis virus (AcM
NPV) strong polyhedrin promoter, followed by
And a recognition site for restriction endonuclease. Simian
Virus (SV) 40 polyadenylation site
Used for efficient polyadenylation. Recombinant virus
For easy selection, E.I. E. coli-derived β-galacto
Polyadenylation of the polyhedrin gene with the sidase gene
Insert in the same direction as the polyhedrin promoter followed by the signal
Enter. Polyhedrin sequence in co-transfected wild
For cell-mediated homologous recombination of type I viral DNA
Adjacent at both ends by a loose arrangement. Many other baculo
A viral vector replaces pA2 (eg, pRG
1, pAc373, pVL941, and pAcIM
1) (Luckow, VA and S)
Ummers, M .; D. , Virology, 17
0: 31-39). The plasmid was digested with restriction enzymes and
Calf intestinal phosphatase by procedures known in the art.
Dephosphorylation was carried out using ze. The DNA is then transferred to a commercially available key.
("Geneclean" BIO 101 In
c. , La Jolla, Ca. ) Using 1%
It was isolated from a gelose gel. This vector DNA is
Called. Fragment F2 and dephosphorylation plus
Mid V2 was ligated using T4 DNA ligase.
Then, E. coli XL-1 Blue cells
And the enzymes BamHI and Asp718
Using a plasmid containing the HDGF-2 gene (pB
Bacteria containing ac-HDGF-2) were identified. clone
The sequence of the fragment was confirmed by DNA sequencing.
Was. 5 μg of plasmid pBac-HDGF-
2 using the lipofection method (Felgner et al. Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA,
84: 7413-7417 (1987)).
1.0 μg of commercially available linearized baculovirus (“Bac
uloGold^TM  baculovirus DN
A ", Pharmingen, San Dieg
o, CA. ) And co-transfected. 1 μg of BaculoGold^TMVirus
DNA and 5 μg of plasmid pBac-HDGF-
2 in 50 μl of serum-free Grace's medium (Life Te)
channels Inc. , Gaithers
burg, MD) containing microtiter plates
Mix in sterile wells. Thereafter, 10 μl of lipofer
Add Kuching and 90 μl Grace's medium and mix
And incubated for 15 minutes at room temperature. Next
The transfection mixture in serum-free gray
In a 35 mm tissue culture plate with 1 ml of culture medium
Seed Sf9 insect cells (ATCC CRL 171)
1) was dropped. Plate the newly added solution
Shake back and forth for mixing. Then plate
Was incubated at 27 ° C. for 5 hours. Five hours later,
Remove the transfection solution from the plate, and
1 ml Grace's insect culture supplemented with 10% fetal bovine serum
Ground was added. Return the plate to the incubator and
The culture was continued at 27 ° C. for 4 days. After 4 days, the supernatant was collected and the Summe
rs and Smith (supra)
Workup assay was performed. As a modification, stained blue
"Blue Ga", which allows easy isolation of plaques
l ”(Life Technologies In
c. , Gaithersburg)
Sgel was used. (Detailed description of "plaque assay"
Also has Life Technologies In
c. Insects distributed by Gaithersburg
User Guidance for Cell Culture and Baculovirology
(P. 9-10). Four days after serial dilution, virus was added to the cells.
And plaque stained blue with Eppendorf
Picked up with pet chips. Next, the recombinant virus
Mugar agar in 200 µl Grace's medium
Resuspended in a Ruff tube. Centrifuge the agar for a short time.
Removed by release and contains recombinant baculovirus
The supernatant was used to transfer Sf9 cells seeded to a 35 mm dish.
Used to infect. Four days later, these culture dishes
The supernatant of the mouse was collected and then stored at 4 ° C. Sf9 cells were supplemented with 10% heat-inactivated FBS.
Grow in filled Grace's medium. Cells are multiplied
(MOI) 2, recombinant baculovirus V-HDGF
-2. After 6 hours, the medium is removed and
SF900 I excluding methionine and cysteine
I Medium (Life Technologies In
c. , Gaithersburg). 4
2 hours later, 5 μCi³⁵S-methionine and 5 μCi
of³⁵S-cysteine (Amersham) was added. Fine
The cells are incubated for a further 16 hours, after which the cells are
Collect by centrifugation and remove labeled protein
By SDS-PAGE and autoradiography
Visualized. (Example 3) (Expression of recombinant HDGF-2 in COS cells)
Expression of Sumid CMV-HDGF-2 HA includes:
Vector pcDNAI / Amp (Invitroge
n): 1) SV40 origin of replication, 2) Ampici
Phosphorus resistance gene, 3) E. coli origin of replication, 4) Po
Relinker region, SV40 intron, and polyadene
CMV promoter followed by a Nylation site. Complete HDGF
-2 precursor and fused in frame to its 3 'end
DNA fragment encoding the HA tag
Cloned into the polylinker region of the promoter. therefore,
Recombinant protein expression is controlled under the CMV promoter
Is done. The HA tag is influenza as previously described.
For epitopes derived from Enza hemagglutinin protein
(I. Wilson et al., Cell 37, 76)
7 (1984)). HA tag for target protein
The fusion was performed using a recombinant protein with an antibody that recognizes the HA epitope.
Enables easy detection of protein. The plasmid construction strategy is described below.
Yes: in the plasmid vector pBluescript
The DNA sequence encoding HDGF-2 (ATC
C accession number Symbol) has pB at the 5 'end.
bluescript vector primer (T3) and
3 'of HDGF-2 coding sequence including XhoI restriction site
P with HDGF-2 specific primer at the end
Amplified by CR. After amplification via PCR
PCR product was digested with BamHI and XhoI
Digest and in-frame behind the XhoI restriction site
To the modified pcDNA-1 vector containing the HA tag
Was. The resulting plasmid was cloned into the HA tag at the C-terminus.
HDGF-2 followed by the entire coding sequence fused at the frame
Includes 5 'untranslated region. The ligation mixture was prepared as follows: coli SURE
(Stratagene Cloning System)
ems, La Jolla, CA).
Transformed cultures are plated on ampicillin medium plates
And select resistant colonies. Plasmid DNA
Was isolated from the transformant and the correct fragment
Test for presence by restriction analysis. Recombinant HDGF
For expression of -2, COS cells were transformed with DEAE-DEX.
TRAN method (J. Sambrook, E. Frits)
ch. Maniatis, Molecular
Cloning: A Laboratory Man
ual, Cold SpringLaborator
y Press, (1989)).
Transfect with. HDGF-2-HA protein
Quality expression is determined by radiolabeling and immunoprecipitation (E. Har.
low, D.C. Lane, Antibodies:
  A Laboratory Manual, Col
d Spring Harbor Laboratory
y Press, (1988)). Fine
Vesicles, two days after transfection,³⁵S-Systay
Label for 8 hours. The culture medium is then collected, and
Cells are washed with detergent (RIPA buffer (150 mM Na
Cl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% N
P-40, 0.5% DOC, 50 mM Tris (p
H7.5)) (Wilson, I. et al., Id. 37: 7).
67 (1984)). Cell lysates and media
Both of the nutrient media were prepared using HA-specific monoclonal antibodies.
To settle. The precipitated protein was purified by 15% SDS-
Analyze on a PAGE gel. (Example 4) (Expression via gene therapy)
Obtained from the subject by sea. Generate the resulting tissue in tissue culture medium
And separate into small pieces. Remove a small piece of tissue
Approximately 10 pieces each on a wet surface of a tissue culture flask
Put on. Turn the flask upside down and seal tightly
Leave at room temperature overnight. After 24 hours at room temperature, the flask
Upside down, and secure a small piece of tissue to the bottom of the flask
And fresh medium (eg, 10% FBS, Penicillium)
Ham's F12 culture medium containing streptomycin and streptomycin
Ground)). This is then incubated at 37 ° C for about one week.
Incubate. At this time, add fresh medium and add
Subsequently, the medium is changed every few days. 2 more
After a week of culture, a monolayer of fibroblasts appears. This single layer
Trypsinize and transfer to a larger flask.
Upgrade. Ron of the Moloney mouse sarcoma virus
PMV-7 placed on the side of the GU terminal repeat
(Kirschmeier, PT, et al., DNA, 7:
219-25 (1988), EcoRI and Hin.
digested with dIII and subsequently calf intestinal phosphatase
Treat with ze. Separate the linearized vector on an agarose gel.
And purified using glass beads. CDN encoding the polypeptide of the present invention
A is the P corresponding to each 5 'and 3' terminal sequence, respectively.
Amplify using CR primers. The 5 'primer is E
contains a coRI site and the 3 'primer
Contains a HindIII site. Equal amount of Moloney
Mouse sarcoma virus linearized skeleton and proliferated EcoRI
And the HidIII fragment were combined with T4 DNA ligase.
Add together in the presence of. The resulting mixture is separated into two
Under appropriate conditions for ligation of the fragment. this
The ligation mixture is used to transform bacteria HB101 and then
The vector has the gene of interest properly inserted
This contains kanamycin for the purpose of confirming that
Plate on agar. Amphotropic pA317 or GP
+ Am12 packaging cells with 10% calf serum
(CS), penicillin and streptomycin
Confluence in Rubecco's Modified Eagle Medium (DMEM)
And grow in tissue culture to optimal density. Then, the gene
The containing MSV vector is added to the medium and the
The soaking cells are transduced with the vector. This package
Zing cells produce infectious virus particles containing the gene.
(The packaging cells are producer cells
It is said). Freshly transduced producer cells
Medium, and then the medium is confluent.
Harvest Producer Cells from 10cm Plate
I do. The used medium containing the infectious virus particles is
Non-adhesive produced by filtration through Lipore filter
Sir cells are removed and the medium is then
Used to infect vesicles. Subculture confluent medium for fibroblasts
Remove from the plate and remove from producer cells
Quickly replace with fresh medium. Remove this medium, and
Replace with fresh medium. If the virus titer is high,
Then substantially all fibroblasts are infected and
There is no need to choose. If the virus titer is very low,
ThenneoOrhisHas a selectable marker like
Requires the use of retroviral vectors
You. Then, alone or with Cytodex (c
ytodex) confluent on 3 microcarrier beads
Either after growing into the
The vesicles are injected into the host. This fibroblast is a protein product
To produce Many modifications and variations of the present invention have been described above.
Is possible in light of the teachings of
Of the present invention unless otherwise specified.
Can be implemented. The following drawings illustrate embodiments of the present invention.
And the scope of the present invention which is encompassed by the following claims.
It does not mean to limit the enclosure. [0173] According to the present invention, a novel mature polypeptide is provided.
And biologically active and diagnostic or therapeutic
Useful fragments, analogs, and their derivatives
A conductor is provided. [0174] [Sequence list] [0175] [Table 1]

【図面の簡単な説明】 【図１Ａ】図１Ａは、ＨＤＧＦ−２のｃＤＮＡ配列、お
よび対応するＨＤＧＦ−２の推定アミノ酸配列を示す。
アミノ酸の標準的な１文字表記を使用する。配列決定
は、３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。 【図１Ｂ】図１Ｂは、ＨＤＧＦ−２のｃＤＮＡ配列、お
よび対応するＨＤＧＦ−２の推定アミノ酸配列を示す。
アミノ酸の標準的な１文字表記を使用する。配列決定
は、３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。 【図１Ｃ】図１Ｃは、ＨＤＧＦ−２のｃＤＮＡ配列、お
よび対応するＨＤＧＦ−２の推定アミノ酸配列を示す。
アミノ酸の標準的な１文字表記を使用する。配列決定
は、３７３自動化ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。 【図２】図２は、本発明のポリペプチド（上列）とヒト
ＨＤＧＦ−１（下列）との間のアミノ酸組成である。 【符号の説明】BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1A shows the cDNA sequence of HDGF-2 and the corresponding deduced amino acid sequence of HDGF-2.
Use the standard one letter code for amino acids. Sequencing was performed using a 373 automated DNA sequencer (Applied).
Biosystems, Inc. ). FIG. 1B shows the cDNA sequence of HDGF-2 and the corresponding deduced amino acid sequence of HDGF-2.
Use the standard one letter code for amino acids. Sequencing was performed using a 373 automated DNA sequencer (Applied).
Biosystems, Inc. ). FIG. 1C shows the cDNA sequence of HDGF-2 and the corresponding deduced amino acid sequence of HDGF-2.
Use the standard one letter code for amino acids. Sequencing was performed using a 373 automated DNA sequencer (Applied).
Biosystems, Inc. ). FIG. 2 is the amino acid composition between a polypeptide of the invention (top row) and human HDGF-1 (bottom row). [Explanation of symbols]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/06 Ａ６１Ｐ 9/00 9/00 9/10 １０１ 9/10 １０１ 17/00 17/00 17/02 17/02 17/14 17/14 17/16 17/16 19/08 19/08 25/16 25/16 25/28 25/28 27/02 27/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (71)出願人 597018381 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 チャールズ エイ． クンシュ アメリカ合衆国 メリーランド 20874, ジャーマンタウン， アマリロ コート 15 (72)発明者 クレイグ エイ． ローゼン アメリカ合衆国 メリーランド 20882, レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA13 HA01 4C084 AA13 AA17 NA14 ZA022 ZA162 ZA332 ZA362 ZA452 ZA542 ZA672 ZA892 ZA922 ZA962 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 7/06 A61P 9/00 9/00 9/10 101 9/10 101 17/00 17/00 17 / 02 17/02 17/14 17/14 17/16 17/16 19/08 19/08 25/16 25/16 25/28 25/28 27/02 27/02 C12N 15/00 ZNAA (71) Applicant 597018381 9410 Key West Avenue, Rockville, Maryland 20850, United States of America (72) Inventor Charles A. Kunsh United States Maryland 20874, Germantown, Amarillo Court 15 (72) Inventor Craig A. Rosen USA Maryland 20882, Leightonsville, Rolling Hill Road 22400 F-term (reference) 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA13 HA01 4C084 AA13 AA17 NA14 ZA022 ZA162 ZA332 ZA362 ZA452 ZA542 ZA672 ZA892 ZA922Z962

Claims (1)

【特許請求の範囲】 【請求項１】 １．単離されたポリヌクレオチドであっ
て、以下： （ａ）図１に記載のポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第 号に含まれるＤＮ
ａによって発現するアミノ酸配列を有する成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）の該ポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズし得、そして該ポリヌクレオチドと少なくと
も７０％同一であるポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）または（ｃ）の該ポリヌク
レオチドのポリヌクレオチドフラグメント、からなる群
から選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレ
オチド。[Claims 1] 1. An isolated polynucleotide comprising: (a) a polynucleotide encoding the polypeptide of FIG. 1; (b) an ATCC accession number DN included in issue
a polynucleotide that encodes a mature polypeptide having an amino acid sequence expressed by a; (c) a polynucleotide that is capable of hybridizing to the polynucleotide of (a) or (b) and is at least 70% identical to the polynucleotide And d) a member selected from the group consisting of (a) or (b) or a polynucleotide fragment of said polynucleotide of (c).