JP2003047337A - Vehicle for raising and regenerating plant body - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a vehicle for raising or regenerating a plant body, with which a raised or reproduced plant body can be readily recovered or subjected to passage. SOLUTION: This vehicle for raising or regenerating a plant body is made by using a polymer compound obtained by crosslinking a temperature-sensitive polymer compound having a LCST(lower critical solution temperature).

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、植物体の育成ある
いは再生に好適な高分子化合物担体に関し、より具体的
には、育成あるいは再生した植物体に損傷を与えること
なく、簡便に回収あるいは継代することを可能にする植
物体育成あるいは再生用の担体、およびこれを利用する
植物体の育成あるいは再生方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a polymer compound carrier suitable for growing or regenerating a plant, and more specifically, it can be easily recovered or passed over without damaging the grown or regenerated plant. The present invention relates to a carrier for growing or regenerating a plant that can be substituted, and a method for growing or regenerating a plant using the carrier.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年、目的とした形質を有する植物体の
育成あるいは再生技術の開発が大きな注目を集めてい
る。2. Description of the Related Art In recent years, much attention has been paid to the development of a technique for growing or regenerating a plant having a desired trait.

【０００３】近年、葉、茎、根、花弁、葯（花粉）ある
いは幼植物などの植物体を直接、育成する技術をはじめ
として、これらの植物体からプロトプラストを単離し、
該プロトプラストを培養しカルスあるいは毛状根を再生
し育成する技術など多彩な技術が開発されている。特に
プロトプラストの段階で遺伝子導入あるいは細胞融合な
どの技術を応用し、より目的に合った植物体の育成ある
いは再生が行われている。更には、葉、茎、根、花弁、
葯等の植物体組織に、遺伝子銃などで直接外来遺伝子を
導入する新しい育種法も開発されている。In recent years, protoplasts have been isolated from plant bodies such as leaves, stems, roots, petals, anthers (pollens) and seedlings by directly growing them.
A variety of techniques have been developed, such as a technique for culturing the protoplasts to regenerate callus or hairy roots for growth. In particular, techniques such as gene transfer or cell fusion are applied at the protoplast stage to cultivate or regenerate plants more suitable for the purpose. Furthermore, leaves, stems, roots, petals,
A new breeding method has also been developed in which a foreign gene is directly introduced into a plant tissue such as anther by a gene gun or the like.

【０００４】これらの新しい育種法に共通する最も重要
な点は、目的とする形質を獲得した植物体が効率良く、
育成あるいは再生することが可能な培養法を確立するこ
とである。[0004] The most important point common to these new breeding methods is that the plants that have acquired the desired trait are efficient,
It is to establish a culture method capable of growing or regenerating.

【０００５】植物体の培養は、液体培養と、寒天などの
ゲルを用いた固体培養に大きく分けられる。液体培養は
植物体を懸濁状態で培養するために、大量培養に適した
方法であると同時に、容易に継代培養が可能であり、ま
た植物体の分泌物生産を目的としたバイオリアクターに
向いているなどの利点を有しているが、植物の種類によ
っては、液体培養が困難なものがある。Cultivation of plants is roughly divided into liquid culture and solid culture using gel such as agar. Liquid culture is a method suitable for large-scale culture because it cultivates plants in suspension.At the same time, subculturing is easily possible, and it is a bioreactor for the production of secretions of plants. Although it has advantages such as being suitable, liquid culture may be difficult depending on the type of plant.

【０００６】一方、寒天（アガー）などを用いた固体培
養法は、広範囲の植物種に適用が可能な方法であり特に
変異体選抜に適した培養法であるが、以下に記すような
大きな問題点を有している。On the other hand, the solid culture method using agar or the like is a method applicable to a wide range of plant species and is particularly suitable for mutant selection, but it has the following major problems. Have a point.

【０００７】１） 寒天培地で育成あるいは再生した植
物体を、寒天フリーの状態で回収あるいは継代すること
が非常に困難である。1) It is very difficult to collect or passage a plant grown or regenerated on an agar medium in an agar-free state.

【０００８】２） 寒天培地で培養する場合に、栄養素
の補給はゲルの外側から拡散によって行われるために、
効率が非常に悪い。2) When culturing on an agar medium, since nutrients are supplied by diffusion from the outside of the gel,
Very inefficient.

【０００９】３） 寒天培地中に蓄積される老廃物の除
去も拡散によって行われるため、非常に効率が悪い。特
に植物体が自ら作るポリフェノールなどの生育阻害物質
などの除去は、ほとんど不可能である。3) The waste products accumulated in the agar medium are also removed by diffusion, which is very inefficient. In particular, it is almost impossible to remove growth inhibitory substances such as polyphenols produced by plants.

【００１０】４） 植物体の産生する物質を生産するこ
とを目的としたバイオリアクター用の担体としては向い
ていない。4) Not suitable as a carrier for a bioreactor intended to produce a substance produced by a plant.

【００１１】上記した問題点は、従来の固体培養に用い
られる寒天（アガー）などのゲルの物性に起因してい
る。即ちアガーあるいはアガロースは、ゾルーゲル転移
温度を有していて該転移温度より高い温度では溶解状態
即ちゾル状態を示し、該転移温度より低い温度でゲル状
態に変化する性質を有している。この性質を利用して、
ゾルーゲル転移温度より高いゾル状態で植物体をアガー
等に埋没し、温度を下げることによってゲル状に変化さ
せ、固体培養が実施されてきた。The above-mentioned problems are caused by the physical properties of gels such as agar used in conventional solid culture. That is, agar or agarose has a sol-gel transition temperature, exhibits a dissolved state or a sol state at a temperature higher than the transition temperature, and has a property of changing to a gel state at a temperature lower than the transition temperature. Utilizing this property,
A plant has been buried in an agar or the like in a sol state higher than the sol-gel transition temperature, and changed into a gel by lowering the temperature, and solid culture has been carried out.

【００１２】しかしながら、寒天のゲルの融解温度は非
常に高く、約９０℃近辺である（山内愛造ら、高分子 O
ne Point“機能性ゲル”Ｐ２９、共立出版）ために、植
物体を溶解状態の寒天に埋没する際に該植物体は熱的損
傷を受ける。また、育成あるいは再生した植物体を寒天
培地から回収あるいは継代する際に、温度をゾルーゲル
転移温度より高い温度に上げ、寒天をゾル状態に変化さ
せる必要があるが、その際にも植物体は高温にさらされ
非常に大きな熱的損傷を受ける。However, the melting temperature of agar gel is very high, around 90 ° C. (Yamauchi Aizo et al., Polymer O)
Due to ne Point "Functional gel" P29, Kyoritsu Shuppan), the plant is thermally damaged when it is immersed in the agar in a dissolved state. Also, when recovering or subculturing the grown or regenerated plant from the agar medium, it is necessary to raise the temperature to a temperature higher than the sol-gel transition temperature to change the agar to a sol state, but at that time, the plant is It is exposed to high temperatures and suffers great thermal damage.

【００１３】したがって従来の固体培養では、温度変化
によって寒天フリーの状態で回収あるいは継代すること
は極めて困難であった。一方、植物体に付着している寒
天を機械的に取り除くことは、多くの手間を必要とする
のみならず、脆弱な植物体の組織（特にカルス、毛状
根）に損傷を与えてしまう恐れがあった。Therefore, in the conventional solid culture, it was extremely difficult to recover or subculture in an agar-free state due to temperature change. On the other hand, mechanically removing the agar adhering to the plant not only requires a lot of labor, but also may damage the tissues of the fragile plant (especially callus and hairy root). was there.

【００１４】育成・再生後の寒天の除去には上記した問
題点があるため、従来の固体培養法では、実際には、育
成あるいは再生した植物体の土壌への移植が、植物体に
寒天を付けたまま実施されてきた。しかしながらこの場
合、寒天培地は栄養分を多く含むため、土壌中で細菌、
カビなどが繁殖し易く植物体を腐らせてしまうという問
題点が指摘されている。Since removal of agar after growth / regeneration has the above-mentioned problems, in the conventional solid culture method, transplantation of the grown or regenerated plant into the soil actually causes the agar to be removed from the plant. It has been implemented with it attached. However, in this case, since the agar medium contains a lot of nutrients, bacteria,
It has been pointed out that molds and the like are prone to breeding and rot the plants.

【００１５】一方、植物体の分泌物の産生を目的とした
バイオリアクターに於ては、ゲル状の寒天培地中からの
分泌物の回収は、液体培養法と比較して格段に困難であ
る。即ち、該分泌物を含有する寒天ゲルを溶解する際の
高温加熱が、分泌物に著しい損傷を与えるからである。On the other hand, in a bioreactor for the purpose of producing a secretion product of a plant, it is much more difficult to recover the secretion product from the gel-like agar medium as compared with the liquid culture method. That is, the high temperature heating during the dissolution of the agar gel containing the secretory substance causes a significant damage to the secretory substance.

【００１６】上記した寒天ゲルの問題点を軽減するため
に、アルギン酸ソーダーが植物体の育成あるいは再生用
担体として用いられて来ている。即ち、アルギン酸ソー
ダーの水溶液中に植物体を埋没した後、該溶液を濃厚塩
化カルシウム溶液に接触させることによって、アルギン
酸ソーダーをゲル状態に変化せしめる方法である。In order to alleviate the above problems of the agar gel, sodium alginate has been used as a carrier for growing or regenerating plants. That is, it is a method of immersing a plant in an aqueous solution of sodium alginate and then bringing the solution into contact with a concentrated calcium chloride solution to change the sodium alginate into a gel state.

【００１７】アルギン酸カルシウムは毒性が少ないとい
う長所はあるものの、上記方法には以下のような問題点
がある。Although calcium alginate has the advantage of being less toxic, the above method has the following problems.

【００１８】１） アルギン酸カルシウムゲル内で育成
あるいは再生した植物体の回収あるいは継代の際に、ア
ルギン酸カルシウムゲルを溶解する必要があり、その際
に使用されるＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテ
ィックアシッド）などのカルシウムキレート剤は細胞、
組織などに損傷を与える。1) It is necessary to dissolve the calcium alginate gel when recovering or subculturing the plant grown or regenerated in the calcium alginate gel, and EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) used at that time, etc. Calcium chelators are cells,
Damages tissues etc.

【００１９】２） アルギン酸カルシウムゲルは機械的
強度が弱い。2) Calcium alginate gel has low mechanical strength.

【００２０】３） リン酸濃度の高い培地などでは、ア
ルギン酸カルシウムゲルのカルシウムとリン酸が反応し
て、リン酸カルシウムの沈澱が形成され、培養が困難に
なると同時にゲルが脆弱になる。3) In a medium having a high phosphoric acid concentration, calcium in a calcium alginate gel reacts with phosphoric acid to form a precipitate of calcium phosphate, which makes culture difficult and at the same time weakens the gel.

【００２１】４） アルギン酸ソーダーのゲル化がカル
シウムとのイオン交換反応により起るために、ゲルの表
面から内部へとゲル化が進行し、ゲル内部に存在する植
物体が均一なゲル化反応を阻害し不均一な構造を有する
ゲルが生成し易い。4) Since gelation of sodium alginate occurs due to an ion exchange reaction with calcium, the gelation proceeds from the surface of the gel to the inside, and the plant present inside the gel undergoes a uniform gelation reaction. Gels with inhibition and non-uniform structure are likely to be formed.

【００２２】以上述べたように、従来、植物体の育成あ
るいは再生用として用いられてきたゲルには大きな問題
点が未解決のまま残されている。As described above, the gels that have been conventionally used for growing or regenerating plant bodies still have unsolved major problems.

【００２３】[0023]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、育成
あるいは再生した植物体を容易に回収あるいは継代する
ことが可能な植物体の育成あるいは再生用担体、および
これを用いる植物体の育成あるいは再生方法を提供する
ことにある。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a carrier for growing or regenerating a plant which can easily collect or pass the grown or regenerated plant, and a plant which uses the carrier. Alternatively, it is to provide a reproducing method.

【００２４】本発明の他の目的は、植物体が産生する物
質を生産するためのバイオリアクター用担体として好適
な材料を提供することにある。[0024] Another object of the present invention is to provide a material suitable as a carrier for a bioreactor for producing a substance produced by a plant.

【００２５】[0025]

【課題を解決するための手段】本発明者は鋭意研究の結
果、従来の寒天などのゲルが有するゾルーゲル転移温度
よりも著しく低い温度で、可逆的に液体状態とゲル状態
との変換を可能にした高分子化合物を、植物体の育成お
よび／又は再生用の担体として用いることが上述した問
題点の解消に極めて効果的なことを見出した。As a result of earnest research, the present inventor has made it possible to reversibly convert between a liquid state and a gel state at a temperature significantly lower than the sol-gel transition temperature of a conventional gel such as agar. It was found that using the above polymer compound as a carrier for growing and / or regenerating a plant is extremely effective in solving the above-mentioned problems.

【００２６】本発明の植物体の育成又は再生用担体は上
記知見に基づくものであり、より詳しくは、ＬＣＳＴ
（下限臨界共溶温度）を有する温度感応性高分子化合物
を架橋してなる高分子化合物を含むことを特徴とするも
のである。The carrier for growing or regenerating the plant of the present invention is based on the above findings, and more specifically, LCST
It is characterized by containing a polymer compound obtained by crosslinking a temperature-sensitive polymer compound having a (lower critical solution temperature).

【００２７】本発明によれば、更に、ＬＣＳＴを有する
温度感応性高分子化合物を架橋してなる担体を、該ＬＣ
ＳＴより高い温度で所定の培地に分散させ、該分散液体
中に植物体を混入し、前記ＬＣＳＴより低く温度を下げ
ることにより上記分散液体の流動性を減少させ、ゲル状
態として上記植物体の育成又は再生を行う植物体の育成
又は再生方法が提供される。According to the present invention, a carrier obtained by crosslinking a temperature-sensitive polymer compound having LCST is further prepared by
Disperse in a predetermined medium at a temperature higher than ST, mix the plant in the dispersion liquid, lower the temperature lower than the LCST to reduce the fluidity of the dispersion liquid, and grow the plant as a gel state. Alternatively, a method for growing or regenerating a plant to be regenerated is provided.

【００２８】本発明によれば、更に、ＬＣＳＴを有する
温度感応性高分子化合物を架橋してなる担体を、該ＬＣ
ＳＴより高い温度で所定の培地に分散させ、前記ＬＣＳ
Ｔより低く温度を下げることにより、上記該分散液体の
流動性を減少させてゲル状態とした後、該ゲルに植物体
を乗せるか又は差し込むことにより、該植物体の育成又
は再生を行う植物体の育成又は再生方法が提供される。According to the present invention, a carrier obtained by crosslinking a temperature-sensitive polymer compound having LCST is further prepared by
Disperse in a predetermined medium at a temperature higher than ST,
By lowering the temperature below T, the fluidity of the dispersion liquid is reduced to a gel state, and then a plant is cultivated or regenerated by placing or inserting the plant on the gel. There is provided a method for growing or reproducing the.

【００２９】本発明の担体は、ＬＣＳＴを有する温度感
応性高分子化合物が架橋してなる高分子化合物が水また
は培地中でＬＣＳＴより低い温度で吸水し膨潤し、ＬＣ
ＳＴより高い温度で脱水し収縮して体積が著しく変化す
る性質を利用したものである。In the carrier of the present invention, a polymer compound obtained by crosslinking a temperature-sensitive polymer compound having LCST absorbs water and swells in water or a medium at a temperature lower than LCST.
It utilizes the property of dehydration and shrinkage at a temperature higher than ST, resulting in a remarkable change in volume.

【００３０】したがって、例えば、本発明の担体の培地
分散液中における担体と培地の量比、温度感応性高分子
の架橋密度、および担体の大きさなどをコントロールす
ることにより、ＬＣＳＴより低い温度では流動性が著し
く低いゲル状態を、ＬＣＳＴより高い温度では流動性の
著しく高い液体状態を実現することができる。この液体
状態とゲル状態との変換は、温度に対して可逆的であ
る。また、上記の液体状態とゲル状態との変化温度は、
上記ＬＣＳＴによって決定される。Therefore, for example, by controlling the ratio of the carrier to the medium in the medium dispersion of the carrier of the present invention, the crosslink density of the temperature-sensitive polymer, the size of the carrier, etc., at a temperature lower than LCST. It is possible to realize a gel state having extremely low fluidity and a liquid state having extremely high fluidity at a temperature higher than LCST. The conversion between the liquid state and the gel state is reversible with temperature. Further, the change temperature between the liquid state and the gel state is
Determined by LCST above.

【００３１】[0031]

【発明の実施の形態】以下、必要に応じて図面を参照し
つつ本発明を更に具体的に説明する。以下の記載におい
て量比を表す「部」および「％」は、特に断らない限り
質量基準とする。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to the drawings as necessary. In the following description, "part" and "%" representing the quantitative ratio are based on mass unless otherwise specified.

【００３２】（液体ーゲル転移温度）本発明において、
「液体状態」「ゲル状態」および「液体ーゲル転移温
度」は以下のように定義される。この定義については文
献（Polymer Journal ，１８（５），４１１−４１６
（１９８６））を参照することができる。(Liquid-gel transition temperature) In the present invention,
“Liquid state”, “gel state” and “liquid-gel transition temperature” are defined as follows. For this definition, see the literature (Polymer Journal, 18 (5), 411-416.
(1986)).

【００３３】担体の分散液体１ｍＬを内径１ｃｍの試験
管に入れ、所定の温度（一定温度）とした水浴中で１２
時間保持する。この後、試験管の上下を逆にした場合
に、担体の分散液体／空気の界面（メニスカス）が担体
の分散液体の自重で変形した場合（担体の分散液体が流
出した場合を含む）には、上記所定温度において担体の
分散液体は「液体状態」であると定義する。一方、上記
試験管の上下を逆にしても、上記した担体の分散液体／
空気の界面（メニスカス）が担体の分散液体の自重で変
形しない場合には、該担体の分散液体は、上記所定温度
において「ゲル状態」であると定義する。1 mL of the dispersion liquid of the carrier was placed in a test tube having an inner diameter of 1 cm, and was placed in a water bath at a predetermined temperature (constant temperature) for 12 hours.
Hold for time. After that, when the test tube is turned upside down and the dispersion liquid / air interface (meniscus) of the carrier is deformed by its own weight of the dispersion liquid of the carrier (including the case where the dispersion liquid of the carrier flows out) The dispersion liquid of the carrier is defined to be in a "liquid state" at the above-mentioned predetermined temperature. On the other hand, even if the test tube is turned upside down,
When the interface (meniscus) of air is not deformed by its own weight of the dispersion liquid of the carrier, the dispersion liquid of the carrier is defined to be in a "gel state" at the above-mentioned predetermined temperature.

【００３４】一方、上記した「所定温度」を徐々に（例
えば１℃きざみで）上昇させて、「ゲル状態」が「液体
状態」に転移する温度を求めた場合、これによって求め
られる転移温度を「液体ーゲル転移温度」と定義する
（この際、「所定温度」を１℃きざみで下降させ、「液
体状態」が「ゲル状態」に転移する温度を求めてもよ
い）。On the other hand, when the temperature at which the "gel state" transitions to the "liquid state" is determined by gradually increasing the above "predetermined temperature" (in steps of 1 ° C, for example), the transition temperature determined by this It is defined as "liquid-gel transition temperature" (at this time, the "predetermined temperature" may be lowered in steps of 1 ° C to obtain the temperature at which the "liquid state" transitions to the "gel state").

【００３５】本発明の担体においては、上記液体ーゲル
転移温度は０℃より高く、６０℃以下であることが好ま
しく、更には４℃以上５０℃以下（特に４℃以上４０℃
以下）であることが、植物体の熱的損傷を防ぐ点から好
ましい。このように好適な液体ーゲル転移温度を有する
高分子化合物は、後述するような具体的な化合物の中か
ら上記したスクリーニング方法（液体ーゲル転移温度測
定法）に従って容易に選択することができる。In the carrier of the present invention, the liquid-gel transition temperature is higher than 0 ° C. and preferably 60 ° C. or lower, more preferably 4 ° C. or higher and 50 ° C. or lower (particularly 4 ° C. or higher and 40 ° C.).
The following is preferable from the viewpoint of preventing thermal damage to plants. The polymer compound having such a suitable liquid-gel transition temperature can be easily selected from the specific compounds described below according to the above-mentioned screening method (liquid-gel transition temperature measuring method).

【００３６】本発明の植物体の育成又は再生方法におい
ては、上記した液体ーゲル転移温度（ａ℃）を、植物体
の育成あるいは再生時の温度（ｂ℃）と、育成あるいは
再生した植物体を回収あるいは継代する時の温度（ｃ
℃）との間に設定することが好ましい。すなわち上記し
た３種の温度ａ℃、ｂ℃、およびｃ℃の間にはｂ＜ａ＜
ｃの関係があることが好ましい。より具体的には、（ａ
−ｂ）は１〜４０℃、更には２〜３０℃であることが好
ましく、また（ｃ−ａ）は１〜４０℃、更には２〜３０
℃であることが好ましい。In the method for growing or regenerating a plant according to the present invention, the liquid-gel transition temperature (a ° C.) described above and the temperature at the time of growing or regenerating the plant (b ° C.) are used for the plant grown or regenerated. Temperature at the time of recovery or passage (c
C)) is preferable. That is, b <a <between the three temperatures a ° C., b ° C., and c ° C.
It is preferable that there is a relationship of c. More specifically, (a
-B) is preferably 1 to 40 ° C, more preferably 2 to 30 ° C, and (c-a) is 1 to 40 ° C, further 2 to 30 ° C.
C. is preferred.

【００３７】本発明に用いられるＬＣＳＴを有する温度
感応性高分子化合物は、水中あるいは培地中でＬＣＳＴ
より高い温度では水又は培地に不溶性であるが、ＬＣＳ
Ｔより低い温度では可溶性に変化する性質を有してい
る。The temperature-sensitive polymer compound having an LCST used in the present invention is an LCST in water or in a medium.
Insoluble in water or medium at higher temperatures, but LCS
It has the property of becoming soluble at temperatures lower than T.

【００３８】温度感応性高分子化合物の状態変化は、水
和と脱水和によるものとされている。このような現象に
ついては、Haskins,M .,et al., Ｊ. Macromol. Ｓci.
Ｃhem., Ａ２( ８),１４４１，１９６８に、該高分子化
合物のひとつであるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）を例に挙げて説明がなされてい
る。ＰＮＩＰＡＡｍは水に対する溶解度温度係数が負の
高分子化合物である。そして、低温においては、ＰＮＩ
ＰＡＡｍ分子と水分子との水素結合に依存する水和物
（オキソニウムヒドロキシド）が生成している。しか
し、これはＬＣＳＴより高い温度に上げることによって
分解し、脱水和するため、結果としてＰＮＩＰＡＡｍ分
子同士が凝集して沈殿するとされている。The change in the state of the temperature-sensitive polymer compound is said to be due to hydration and dehydration. Regarding such a phenomenon, Haskins, M., et al., J. Macromol. Sci.
Chem., A2 (8), 1441, 1968 describes the poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAAm), which is one of the polymer compounds, as an example. PNIPAAm is a polymer compound having a negative temperature coefficient of solubility in water. And at low temperature, PNI
A hydrate (oxonium hydroxide) that depends on the hydrogen bond between the PAAm molecule and the water molecule is produced. However, this is decomposed and dehydrated by raising it to a temperature higher than LCST, and as a result, PNIPAAm molecules are aggregated and precipitated.

【００３９】上記のＬＣＳＴを有する温度感応性高分子
化合物に架橋構造を付与すると、水中あるいは培地中で
ＬＣＳＴより低い温度でも溶解することなく膨潤したゲ
ル状態を保持するが、ＬＣＳＴより高い温度にすると該
高分子は水不溶性に変化するために、ゲルから水が分離
し該架橋体の体積が著しく減少する。上述したように、
本発明の植物体の育生・再生用担体および植物体の育生
・再生方法は、架橋された温度感応性高分子化合物のこ
のような性質を利用している。When the above-mentioned temperature-sensitive polymer compound having LCST has a crosslinked structure, it retains a swollen gel state without being dissolved in water or a medium at a temperature lower than LCST, but at a temperature higher than LCST. Since the polymer changes to be water-insoluble, water is separated from the gel and the volume of the crosslinked product is significantly reduced. As mentioned above,
The carrier for growing / regenerating a plant and the method for growing / regenerating a plant of the present invention utilize such properties of the crosslinked temperature-sensitive polymer compound.

【００４０】（温度感応性高分子化合物）本発明に好ま
しく使用することができる温度感応性高分子化合物とし
ては、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリｎ−置
換メタアクリルアミド誘導体およびこれらの共重合体、
ポリビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキサイ
ド、ポリエチレンオキサイド、エーテル化メチルセルロ
ース、ポリビニルアルコール部分酢化物などが挙げられ
る。本発明において特に好ましく用いられるものは、ポ
リＮ−置換アクリルアミド誘導体またはポリＮ−置換メ
タアクリルアミド誘導体またはこれらの共重合体、ポリ
ビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキサイド、ポ
リビニルアルコール部分酢化物である。(Temperature-Sensitive Polymer Compound) The temperature-sensitive polymer compound that can be preferably used in the present invention includes poly N-substituted acrylamide derivatives, poly n-substituted methacrylamide derivatives and copolymers thereof.
Examples thereof include polyvinyl methyl ether, polypropylene oxide, polyethylene oxide, etherified methyl cellulose, polyvinyl alcohol partial acetic acid and the like. Particularly preferably used in the present invention are poly N-substituted acrylamide derivatives or poly N-substituted methacrylamide derivatives or copolymers thereof, polyvinyl methyl ether, polypropylene oxide, and polyvinyl alcohol partial acetyl chloride.

【００４１】本発明において好ましく用いられる高分子
化合物を、以下にＬＣＳＴが低い順に列挙する。The polymer compounds preferably used in the present invention are listed below in ascending order of LCST.

【００４２】ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン；ポリ
−Ｎ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルア
クリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルメタアクリルア
ミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド；ポリ
−Ｎ−アクリロイルピロリジン；ポリ−Ｎ，Ｎ−エチル
メチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタ
アクリルアミド；ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド上記
の高分子は単独重合体（ホモポリマー）であっても、上
記重合体を構成する単量体と他の単量体との共重合体で
あってもよい。このような共重合体を構成する他の単量
体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいずれも用
いることができる。Poly-N-acryloylpiperidine; poly-N-n-propylmethacrylamide; poly-N-isopropylacrylamide; poly-N, N-diethylacrylamide; poly-N-isopropylmethacrylamide; poly-N-cyclopropyl Acrylamide; poly-N-acryloylpyrrolidine; poly-N, N-ethylmethylacrylamide; poly-N-cyclopropylmethacrylamide; poly-N-ethylacrylamide Even if the above-mentioned polymer is a homopolymer (homopolymer) Also, it may be a copolymer of a monomer constituting the above polymer and another monomer. As the other monomer constituting such a copolymer, either a hydrophilic monomer or a hydrophobic monomer can be used.

【００４３】上記親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピ
ロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアク
リルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエ
チルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレー
ト、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメ
チルアクリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタア
クリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレ
ンスルホン酸など、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ−ジ
メチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチル
アミノエチルメタクリート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプ
ロピルアクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。Examples of the hydrophilic monomer include N-vinylpyrrolidone, vinylpyridine, acrylamide, methacrylamide, N-methylacrylamide, hydroxyethyl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, hydroxymethyl methacrylate, hydroxymethyl acrylate, acidic groups. With acrylic acid, methacrylic acid and salts thereof, vinyl sulfonic acid, styrene sulfonic acid and the like, and N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N, N-diethylaminoethyl methacrylate, N, N- having a basic group. Examples thereof include, but are not limited to, dimethylaminopropyl acrylamide and salts thereof.

【００４４】一方、上記疎水性単量体としては、エチル
アクリレート、メチルメタクリレート、ブチルメタクリ
レート、グリシジルメタクリレート等のアクリレート誘
導体およびメタクリレート誘導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタ
アクリルアミドなどのＮ−置換アルキルメタアクリルア
ミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレ
ン、酢酸ビニルなどが挙げられるが、これらに限定され
るものではない。On the other hand, as the above-mentioned hydrophobic monomer, acrylate derivatives and methacrylate derivatives such as ethyl acrylate, methyl methacrylate, butyl methacrylate and glycidyl methacrylate, N-substituted alkyl methacrylamide derivatives such as Nn-butyl methacrylamide, Examples thereof include, but are not limited to, vinyl chloride, acrylonitrile, styrene, vinyl acetate and the like.

【００４５】一般的には、上記温度感応性高分子化合物
に親水性単量体を共重合することによりＬＣＳＴは上昇
し、疎水性単量体を共重合することによりＬＣＳＴは下
降する。したがって、本発明の架橋構造を付与した温度
感応性高分子化合物の分散液体の液体−ゲル転移温度
は、親水性単量体を共重合した温度感応性高分子化合物
を用いると上昇し、疎水性単量体を共重合した温度感応
性高分子化合物を用いることにより下降する。したがっ
て、共重合単量体成分を選択することによっても、本発
明における液体−ゲル転移温度をコントロールすること
ができる。Generally, LCST is increased by copolymerizing the temperature-sensitive polymer compound with a hydrophilic monomer, and LCST is decreased by copolymerizing the hydrophobic monomer. Therefore, the liquid-gel transition temperature of the dispersion liquid of the temperature-sensitive polymer compound having the crosslinked structure of the present invention is increased when the temperature-sensitive polymer compound in which the hydrophilic monomer is copolymerized is used, and the hydrophobic property is increased. It is lowered by using a temperature-sensitive polymer compound obtained by copolymerizing monomers. Therefore, the liquid-gel transition temperature in the present invention can be controlled also by selecting the comonomer component.

【００４６】温度感応性高分子化合物に架橋構造（不可
逆的な架橋構造）を付与する方法としては、該温度感応
性高分子化合物を与えるべき単量体を重合する際に架橋
構造を導入する方法と、単量体の重合終了後に架橋構造
を導入する方法とがあるが、本発明ではいずれの方法も
採用することができる。As a method for imparting a crosslinked structure (irreversible crosslinked structure) to the temperature-sensitive polymer compound, a method for introducing a crosslinked structure when polymerizing a monomer to give the temperature-sensitive polymer compound And a method of introducing a cross-linking structure after completion of the polymerization of the monomer, any method can be adopted in the present invention.

【００４７】前者の方法は、一般的には、二官能性単量
体（あるいは３以上の官能基を有する単量体）を共重合
することによって行うことができる。例えば、Ｎ，Ｎ−
メチレンビスアクリルアミド、ヒドロキシエチルジメタ
クリレート、ジビニルベンゼンなどの二官能性単量体を
用いて行うことができる。The former method can be generally carried out by copolymerizing a bifunctional monomer (or a monomer having three or more functional groups). For example, N, N-
It can be performed using a bifunctional monomer such as methylenebisacrylamide, hydroxyethyldimethacrylate, or divinylbenzene.

【００４８】後者の方法は、一般的には、光、電子線、
γ線照射などにより分子間に架橋を形成することにより
行うことができる。The latter method generally uses light, electron beams,
It can be carried out by forming crosslinks between molecules by γ-ray irradiation or the like.

【００４９】また、後者の方法は、例えば、温度感応性
高分子化合物中の官能基（例えば、アミノ基）と結合し
得る官能基（例えば、イソシアネート基）を分子内に複
数個有する多官能性分子を架橋剤として用いて、温度感
応性高分子化合物を架橋させることにより行うことがで
きる。In the latter method, for example, a polyfunctional compound having a plurality of functional groups (for example, isocyanate groups) capable of binding to functional groups (for example, amino groups) in the temperature-sensitive polymer compound in the molecule is used. It can be carried out by crosslinking the temperature-sensitive polymer compound using the molecule as a crosslinking agent.

【００５０】本発明担体の水中における体積変化の割合
（倍率）は、ＬＣＳＴより高い温度における収縮時の体
積を１として、ＬＣＳＴより低い植物体育成あるいは再
生時の温度における平衡膨澗体積が１．１〜１０００、
さらには５〜１００となることが好ましい。ここで平衡
膨澗体積とは、本発明担体を過剰量の水中に所定温度
（一定温度）で少なくとも３日以上浸し、膨澗が平衡に
達した後の体積をいう（これについては、例えば文献、
T. Tanaka, et al., Phys. Rev. Lett. ５５，２４５５
（１９８５） を参照することができる）。Regarding the ratio (magnification) of volume change in water of the carrier of the present invention, the volume at contraction at a temperature higher than LCST is 1, and the equilibrium swollen volume at a temperature at plant growth or regeneration lower than LCST is 1. 1-1000,
Further, it is preferably 5 to 100. Here, the equilibrium swelling volume means the volume after the swelling reaches equilibrium by immersing the carrier of the present invention in an excess amount of water at a predetermined temperature (constant temperature) for at least 3 days (for example, refer to the literature. ,
T. Tanaka, et al., Phys. Rev. Lett. 55 , 2455
(1985)).

【００５１】上述したような本発明担体の温度に依存し
た体積変化の割合は、通常、その架橋構造、特に架橋密
度に依存し、一般に架橋密度が低い方が体積変化が大き
くなる傾向がある。その架橋密度は、前者の方法では、
例えば、二官能性単量体の共重合比を変えることで、後
者の方法では、例えば、光、電子線、γ線などの照射量
を変えることで任意に制御することが可能である。The rate of volume change depending on temperature of the carrier of the present invention as described above usually depends on its cross-linking structure, particularly cross-link density, and generally, the lower cross-link density tends to increase the volume change. The crosslink density is
For example, by changing the copolymerization ratio of the bifunctional monomer, the latter method can be arbitrarily controlled by changing the irradiation amount of light, electron beam, γ-ray, or the like.

【００５２】本発明において望ましい架橋密度の範囲
は、全単量体に対する分岐点のモル比で、約０．２ｍｏ
ｌ％〜約１０ｍｏｌ％、更には約０．５ｍｏｌ％〜約４
ｍｏｌ％であることが好ましい。前者の方法で架橋構造
を導入する場合、二官能性単量体の全単量体（該二官能
性単量体自体をも含む）に対する共重合重量比は、約
０．３質量％（ｗｔ％）〜約３質量％（ｗｔ％）（更に
は約０．５質量％（ｗｔ％）〜約１．５質量％（ｗｔ
％））の範囲であることが好ましい。In the present invention, the range of crosslink density desired is a molar ratio of branch points to all monomers of about 0.2 mo.
1% to about 10 mol%, further about 0.5 mol% to about 4
It is preferably mol%. When the crosslinked structure is introduced by the former method, the copolymerization weight ratio of the bifunctional monomer to all monomers (including the bifunctional monomer itself) is about 0.3% by mass (wt). %) To about 3 mass% (wt%) (further, about 0.5 mass% (wt%) to about 1.5 mass% (wt)
%)) Is preferable.

【００５３】本発明において、架橋密度が上記した約
０．２ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％の範囲を上回る場合に
は、本発明担体の温度に依存した体積変化の割合が小さ
くなるため、明瞭な液体−ゲル転移が生起しにくくな
る。一方、架橋密度がこの範囲を下回る場合には、本発
明担体の機械的強度が弱くなり、その分散液がゲル状態
において植物体を保持するための十分な強度を維持しに
くくなる。In the present invention, when the crosslink density exceeds the above range of about 0.2 mol% to about 10 mol%, the rate of volume change depending on the temperature of the carrier of the present invention becomes small, so that a clear liquid- Gel transition is less likely to occur. On the other hand, if the crosslink density is below this range, the mechanical strength of the carrier of the present invention will be weak, and it will be difficult for the dispersion to maintain sufficient strength for holding plants in a gel state.

【００５４】上述したような架橋密度（全単量体に対す
る分岐点のモル比）は、例えば、¹³Ｃ−ＮＭＲ（核磁気
共鳴吸収）測定またはＩＲ（赤外吸収スペクトル）測定
または元素分析によって定量することが可能である。The crosslink density (molar ratio of branch points to all monomers) as described above is determined by, for example, ¹³ C-NMR (nuclear magnetic resonance absorption) measurement, IR (infrared absorption spectrum) measurement or elemental analysis. It is possible to

【００５５】本発明の担体の形状は、育成・再生する植
物体の種類、大きさによって適宜、選択することがで
き、該担体は、例えば、粒子状、マイクロビーズ、繊維
状、フレーク状、スポンジ状、膜状、板状など種々の形
状をとることが可能である。吸水による膨潤を効率的に
行う点からは、担体の形状は表面積の大きな形状である
ことが好ましく、より具体的には例えば、粒子状および
／又はマイクロビーズ状であることが好ましい。The shape of the carrier of the present invention can be appropriately selected depending on the type and size of the plant to be grown and regenerated, and the carrier is, for example, particulate, microbead, fibrous, flake or sponge. It is possible to take various shapes such as a shape, a film shape, and a plate shape. From the viewpoint of efficiently swelling by water absorption, the shape of the carrier is preferably a shape having a large surface area, and more specifically, for example, a particle shape and / or a microbead shape is preferable.

【００５６】本発明の担体の大きさは、育成・再生する
植物体の種類、大きさによって適宜、選択することが可
能である。該担体が粒子状又はマイクロビーズ状の形状
を有する場合、水系分散液中収縮時、すなわち該担体を
構成する温度感応性高分子化合物のＬＣＳＴより高い温
度において、０．１μｍ〜１ｃｍ（更には１μｍ〜１ｍ
ｍ）の範囲の粒径を有することが好ましい。The size of the carrier of the present invention can be appropriately selected depending on the type and size of the plant to be grown and regenerated. When the carrier has a shape of particles or microbeads, 0.1 μm to 1 cm (further 1 μm) at the time of contraction in an aqueous dispersion, that is, at a temperature higher than the LCST of the temperature-sensitive polymer compound constituting the carrier. ~ 1m
It is preferred to have a particle size in the range m).

【００５７】本発明の担体の成型においては、通常の高
分子化合物の成型法を用いることが可能である。In molding the carrier of the present invention, it is possible to use an ordinary molding method for polymer compounds.

【００５８】特に、担体の形状がマイクロビーズ状ある
いは粒子状の場合には、乳化重合法、懸濁重合法、沈澱
重合法などの手段が好ましく用いられる。温度感応性高
分子化合物に架橋構造を付与する方法としては、上記し
たように、単量体を重合する際に二官能性単量体を用い
て架橋する方法；あるいは重合が終了し、形状が付与さ
れた後に光、電子線、γ線照射などにより架橋する方法
等を用いることが可能である。In particular, when the carrier is in the form of microbeads or particles, means such as emulsion polymerization method, suspension polymerization method and precipitation polymerization method are preferably used. As a method for imparting a crosslinked structure to the temperature-sensitive polymer compound, as described above, a method of crosslinking using a bifunctional monomer when polymerizing the monomer; It is possible to use a method of crosslinking by applying light, electron beam, γ-ray or the like after the application.

【００５９】特に、マイクロビーズ状の架橋された温度
感応性高分子化合物を、水溶性単量体および水溶性二官
能性単量体から合成する場合、逆相懸濁重合法が好適に
用いられる。In particular, when a microbead-shaped crosslinked temperature-sensitive polymer compound is synthesized from a water-soluble monomer and a water-soluble bifunctional monomer, the reverse phase suspension polymerization method is preferably used. .

【００６０】このような逆相懸濁重合法においては、分
散媒としては、単量体及び生成高分子を溶解しない有機
溶媒を用いることが好ましく、例えば、ヘキサン等の飽
和炭化水素が好ましく用いられる。また、懸濁助剤とし
て界面活性剤（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル等の
非イオン性界面活性剤）を上記有機溶媒と共に用いても
良い。得られるマイクロビーズの粒径は、添加する界面
活性剤の種類、量、あるいは攪拌速度などにより制御す
ることが可能である。重合開始剤としては、水溶性開始
剤、非水溶性開始剤のいずれも使用し得る。重合生成物
を効率的に回収する点からは、重合を上記温度感応性高
分子化合物のＬＣＳＴより低い温度で行うことが望まし
いので、レドックス開始剤系などの低温開始剤が好まし
く用いられる。In such a reversed-phase suspension polymerization method, it is preferable to use an organic solvent that does not dissolve the monomer and the produced polymer as the dispersion medium, for example, saturated hydrocarbon such as hexane is preferably used. . A surfactant (for example, a nonionic surfactant such as sorbitan fatty acid ester) may be used as a suspension aid together with the organic solvent. The particle size of the obtained microbeads can be controlled by the type and amount of the surfactant to be added, the stirring speed, or the like. As the polymerization initiator, either a water-soluble initiator or a water-insoluble initiator can be used. From the viewpoint of efficiently recovering the polymerization product, it is desirable to carry out the polymerization at a temperature lower than the LCST of the temperature-sensitive polymer compound, and thus a low-temperature initiator such as a redox initiator system is preferably used.

【００６１】本発明の担体を繊維状、フレーク状、スポ
ンジ状、粒子状などに成型する場合は、例えば、ＬＣＳ
Ｔより低い温度に冷却された温度感応性高分子化合物の
水溶液を、口金を用いてＬＣＳＴより高い温度の水中あ
るいは水を混合しない有機溶媒中に押し出すことによっ
て実施できる。このような成型方法を用いる場合は、架
橋構造の付与は、成型終了時に光、電子線、γ線照射な
どを用いることにより実施できる。When the carrier of the present invention is molded into a fibrous shape, a flake shape, a sponge shape, a particle shape or the like, for example, LCS is used.
It can be carried out by extruding an aqueous solution of a temperature-sensitive polymer compound cooled to a temperature lower than T into water or a water-immiscible organic solvent having a temperature higher than LCST using a die. When such a molding method is used, the crosslinked structure can be imparted by using light, electron beam, γ-ray irradiation or the like at the end of molding.

【００６２】本発明の担体を板状、膜状に成型する場合
には、例えば、上記温度感応性高分子化合物を有機溶媒
あるいはＬＣＳＴより低い温度の水に溶解し、ソルベン
トキャスティング法により実施することができる。この
ような成型方法を用いる場合も、架橋構造の付与は光、
電子線、γ線照射などを用いることによって実施でき
る。When the carrier of the present invention is molded into a plate shape or a film shape, for example, the temperature-sensitive polymer compound is dissolved in an organic solvent or water having a temperature lower than LCST, and the solvent casting method is used. You can Even when such a molding method is used, imparting a crosslinked structure is performed by light,
It can be carried out by using electron beam, γ-ray irradiation or the like.

【００６３】更には、上述した種々の成型方法によって
得られた各種の形状の担体を機械的な方法などで破砕
し、所望の大きさの担体に成型することも可能である。Furthermore, it is also possible to crush the carriers of various shapes obtained by the above-mentioned various molding methods by a mechanical method or the like and mold them into a carrier of a desired size.

【００６４】（培地）本発明においては、上述したよう
な高分子化合物を含む担体と組み合わせて用いるべき培
地ないし培養液として、寒天を実質的に含まない公知の
（植物体の育成および／又は再生用）培地ないし培養液
を特に制限なく使用することができる。(Medium) In the present invention, as a medium or a culture solution to be used in combination with a carrier containing the above-described polymer compound, a known (plant growing and / or regeneration) substantially free of agar is used. (For use) A medium or culture solution can be used without particular limitation.

【００６５】本発明において、上記架橋構造を有する温
度感応性高分子化合物からなる担体の植物体培養用培地
中の分散濃度は、該植物体の種類および形状によって適
宜選択することが可能であるが、通常、０．１〜３０質
量％（ｗｔ％）、更には１〜１０質量％（ｗｔ％）の濃
度が好ましく用いられる。In the present invention, the dispersion concentration of the carrier comprising the temperature-sensitive polymer compound having a crosslinked structure in the plant culture medium can be appropriately selected depending on the type and shape of the plant. Usually, a concentration of 0.1 to 30% by mass (wt%), more preferably 1 to 10% by mass (wt%) is preferably used.

【００６６】（植物体の育成・再生方法）上記した高分
子化合物担体を用いて植物体を育成あるいは再生する方
法の好ましい一例を以下に記載する。(Method for growing / regenerating plant body) A preferred example of a method for growing or regenerating a plant body using the above-described polymer compound carrier is described below.

【００６７】先づ上述したような高分子化合物担体を所
望の培地中に、該高分子化合物担体分散液の液体ーゲル
転移温度より高い温度で均一に分散する。次に、該高分
子化合物担体の培地分散液中に、葉、茎、根、花弁、葯
（花粉）、幼植物などからなる植物体、あるいは上記植
物体から再生したカルス、毛状根あるいはプロトプラス
トなどからなる植物体を混合分散させる。次に、該植物
体分散溶液の温度を、上記液体ーゲル転移点温度より低
い温度に設定することにより、所望の形状のゲル状体を
作製し、該植物体の育成あるいは再生を行うことができ
る。First, the polymer compound carrier as described above is uniformly dispersed in a desired medium at a temperature higher than the liquid-gel transition temperature of the polymer compound carrier dispersion. Next, in the medium dispersion liquid of the polymer carrier, plants consisting of leaves, stems, roots, petals, anthers (pollens), young plants, etc., or callus, hairy roots or protoplasts regenerated from the above plants A plant consisting of Next, by setting the temperature of the plant-dispersed solution to a temperature lower than the liquid-gel transition temperature, a gel-like body having a desired shape can be prepared, and the plant can be grown or regenerated. .

【００６８】一方、該ゲル中で育成あるいは再生した植
物体の回収あるいは継代は、温度を上記液体ーゲル転移
温度より高い温度に上げ、該ゲルを再び液化することに
よって容易に実施することができる。On the other hand, the recovery or subculture of the plant grown or regenerated in the gel can be easily carried out by raising the temperature to a temperature higher than the liquid-gel transition temperature and liquefying the gel again. .

【００６９】特に、本発明の高分子化合物担体の植物体
の育生・再生方法への応用の効果的なものは、植物体の
発根過程への応用である。Particularly, the effective application of the polymer carrier of the present invention to the method for growing and regenerating plants is to the rooting process of plants.

【００７０】より具体的には、例えば、本発明の高分子
化合物担体を所望の培地中に、該高分子化合物担体の液
体−ゲル転移温度より高い温度で均一に分散させた後、
温度を該液体−ゲル転移温度より低くすることによっ
て、架橋高分子の吸水・膨潤に基づき均一にゲル化させ
る。該ゲル上には、葉、茎、根、花弁、葯（花粉）、幼
植物などからなる植物体をのせ、あるいはさし込み、該
ゲル状態を維持した状態で培養し、ゲル中に発根させ
る。発根した該植物体を該ゲルから回収あるいは継代す
る際に、温度を液体−ゲル転移温度より高く上げること
によって架橋高分子の脱水・収縮に基づき上記ゲルを液
化し、収縮した該担体の分散液から容易にかつ無傷で発
根植物体を分離することができる。ここに、本発明の高
分子化合物担体においては、上述したように液体−ゲル
転移温度を適宜コントロール可能なことが、上記した従
来の寒天ゲルに比較して重要な特徴となる。More specifically, for example, after uniformly dispersing the polymer compound carrier of the present invention in a desired medium at a temperature higher than the liquid-gel transition temperature of the polymer compound carrier,
By lowering the temperature below the liquid-gel transition temperature, the cross-linked polymer is uniformly gelated due to water absorption and swelling. A plant body consisting of leaves, stems, roots, petals, anthers (pollens), seedlings, etc. is placed on the gel or placed therein, and the gel is cultivated in a state of maintaining the gel state, and rooted in the gel. Let When recovering or subculturing the rooted plant from the gel, the gel is liquefied based on the dehydration / shrinkage of the cross-linked polymer by raising the temperature above the liquid-gel transition temperature to shrink the carrier. The rooted plant can be easily and intactly separated from the dispersion. Here, in the polymer carrier of the present invention, it is an important feature that the liquid-gel transition temperature can be appropriately controlled as described above, as compared with the conventional agar gel described above.

【００７１】更に、ＬＣＳＴより高い温度では、上記高
分子化合物は脱水・収縮状態にあるため、該高分子から
なる担体を含む培地分散液の粘度は、実質的には培地の
粘度と同等である。この特性は、植物体の回収、継代を
容易にするばかりでなく、該回収、継代時の培地の洗浄
除去を簡便にし、しかも該回収、継代が植物体に与える
損傷も全くない。Further, at a temperature higher than LCST, the polymer compound is in a dehydrated / contracted state, and thus the viscosity of the medium dispersion containing the carrier comprising the polymer is substantially the same as the viscosity of the medium. . This property not only facilitates the recovery and passage of plants, but also simplifies the washing and removal of the medium during the recovery and passage, and there is no damage to the plants due to the recovery and passage.

【００７２】従来、発根過程終了後の植物体を寒天ゲル
から分離する際の操作が、その後の植物体の育成率の著
しい低下の大きな原因であったが、本発明の高分子化合
物担体はこのような問題点を完全に解消することができ
る。Conventionally, the operation of separating the plant body after the rooting process from the agar gel has been a major cause of the remarkable decrease in the growth rate of the plant body thereafter. Such a problem can be completely solved.

【００７３】また、上記ゲル培地中に不足した栄養素の
補給、あるいは育成あるいは再生を妨害するような老廃
物の除去も、上記した方法により古いゲルを液化し、除
去した後、植物体を新しい培地に移植することにより実
施可能である。本発明においては、このようにして容易
にゲル培養を続行することができる。Further, supplementation of nutrients deficient in the gel medium, or removal of waste products that interfere with growth or regeneration are also performed by liquefying and removing the old gel by the above-mentioned method, and then the plant is replaced with a new medium. It can be carried out by transplanting to. In the present invention, the gel culture can be easily continued in this manner.

【００７４】また、本発明の高分子化合物担体は、植物
体を上記の方法で育成・再生し、回収または継代した後
に、ＬＣＳＴより高い温度で、担体の分散液体から該担
体を（遠心分離などの方法によって）容易に回収し、洗
浄し再使用することも可能である。Further, the polymer compound carrier of the present invention is obtained by cultivating / regenerating a plant by the above-mentioned method, recovering or subculturing it, and then subjecting the carrier (centrifugation) to the carrier dispersion liquid at a temperature higher than LCST. It is also possible to easily collect, wash and reuse.

【００７５】以下に実施例を示し、本発明を更に具体的
に説明するが、本発明の範囲は特許請求の範囲の項の記
載により定まるものであり、以下の実施例により制限を
受けるものではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is determined by the description of the scope of claims and is not limited by the following examples. Absent.

【００７６】実施例１ （マイクロビーズ状担体の合成）Ｎ−イソプロピルアク
リルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）１５ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレ
ンビスアクリルアミド（Ｂｉｓ）０．１ｇ、および過硫
酸アンモニウム０．１ｇを蒸留水１００ｍｌに溶解し
た。この水溶液を、ヘキサン１０００ｍｌにソルビタン
モノオレエート（ＳＰＡＮ８０、関東化学（株）製）１
０ｇを溶解した液中に加え、窒素気流下で激しく攪拌、
懸濁させた後、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチ
レンジアミン３ｍｌを加えて、室温で４時間重合させ
た。 Example 1 (Synthesis of microbead carrier) 15 g of N-isopropylacrylamide (NIPAAm), 0.1 g of N, N'-methylenebisacrylamide (Bis), and 0.1 g of ammonium persulfate were dissolved in 100 ml of distilled water. did. This aqueous solution was added to 1000 ml of hexane and sorbitan monooleate (SPAN80, manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) 1
Add 0 g to the dissolved solution, stir vigorously under a nitrogen stream,
After suspending, 3 ml of N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine was added and polymerized at room temperature for 4 hours.

【００７７】水相を分離後、ヘキサン５００ｍｌで３回
洗浄した。次いで、蒸留水１０００ｍｌを加えて４℃に
冷却した後、４０℃に加温してマイクロビーズ状担体を
収縮させ、上清を捨てた。この水洗操作を３回繰り返し
た後、真空乾燥して本発明のマイクロビーズ状担体
（Ａ）を得た。After the aqueous phase was separated, it was washed 3 times with 500 ml of hexane. Then, 1000 ml of distilled water was added and cooled to 4 ° C., then heated to 40 ° C. to shrink the microbead-shaped carrier, and the supernatant was discarded. This water washing operation was repeated 3 times and then vacuum dried to obtain the microbead carrier (A) of the present invention.

【００７８】Ｂｉｓ０．４ｇを用いる以外は上記と全く
同様の操作で、本発明のマイクロビーズ状担体（Ｂ）を
得た。The microbead-shaped carrier (B) of the present invention was obtained by the same procedure as above except that 0.4 g of Bis was used.

【００７９】蒸留水中における担体（Ａ）および（Ｂ）
の直径を光学顕微鏡下、種々の温度で測定し、得られた
結果を図１のグラフに示した。また、これらの直径を、
マイクロビーズ収縮時の体積を１とした体積の変化割合
（倍率）に換算して、図２のグラフに示した。表１に
は、上記図１および図２に対応するデータを示した。Carriers (A) and (B) in distilled water
Was measured at various temperatures under an optical microscope, and the obtained results are shown in the graph of FIG. Also, these diameters
The change rate (magnification) of the volume, where the volume when the microbeads contracted is 1, was converted and shown in the graph of FIG. Table 1 shows data corresponding to FIGS. 1 and 2 above.

【００８０】[0080]

【表１】 [Table 1]

【００８１】（担体分散液の調整）上記で得た乾燥担体
（Ａ）５ｇを、ムラシゲースクーグ植物培地（ＭＳ培
地；コスモ・バイオ（株）製）１００ｍｌに４０℃で分
散させた。この分散液を徐々に冷却すると、約３１℃で
流動性を失い、ゲル化した。このゲル状態のものを徐々
に加温すると、約３２℃で再び流動性のある分散液に戻
った。(Preparation of carrier dispersion) 5 g of the dry carrier (A) obtained above was dispersed in 100 ml of Murashige Skoog plant medium (MS medium; Cosmo Bio Co., Ltd.) at 40 ° C. When this dispersion was gradually cooled, it lost its fluidity at about 31 ° C. and gelled. When gradually heating this gel state, it returned to a fluid dispersion at about 32 ° C.

【００８２】実施例２ カーネーションの側芽組織を切り出し、洗剤と水道水で
洗浄した後、７０％エタノール水溶液に３０秒間浸漬
し、１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に７分間浸漬する
ことによって滅菌した後、滅菌蒸留水によって数回、洗
浄した。このようにして得られた側芽組織を外植体とし
て、寒天０．８％含有のＭＳ培地上に植え、２週間培養
しシユートを形成させた後、該シユートを節ごとに切断
した。[0082]Example 2 Cut out the carnation side bud tissue and use detergent and tap water
After washing, soak in 70% ethanol aqueous solution for 30 seconds
And soak in 1% sodium hypochlorite solution for 7 minutes
After sterilization by sterilization, wash with sterile distilled water several times.
Clean The lateral bud tissue thus obtained is used as an explant.
Planted on MS medium containing 0.8% agar and cultured for 2 weeks
After forming a shout, the shout is cut into nodes.
did.

【００８３】次いで、実施例１で作製した本発明のマイ
クロビーズ状担体（Ａ）５ｇを、３７℃で、１−ナフタ
リン酢酸を０．１ｍｇ／ｌ、シュクロースを１０ｇ／ｌ
の濃度で含有する１００ｍｌのＭＳ培地に分散させた。
該分散培地をオートクレーブ（１２１℃、２０分間）処
理することによって滅菌した。Next, 5 g of the microbead carrier (A) of the present invention prepared in Example 1 was treated at 37 ° C. with 0.1 mg / l of 1-naphthaleneacetic acid and 10 g / l of sucrose.
It was dispersed in 100 ml of MS medium containing the above concentration.
The dispersion medium was sterilized by autoclaving (121 ° C., 20 minutes).

【００８４】上記で得た担体（Ａ）分散培地は３７℃で
は液体状態であったが、温度を約２３℃に下げることに
よって完全なゲル状態となった。このようにして担体
（Ａ）分散培地を完全なゲル状態とした後、該ゲル上
に、上記節ごとに切断されたカーネーションのシュート
を挿芽し、約２３℃で３週間培養したところ、培養３週
間後には該ゲル内に発根が認められた。The carrier (A) dispersion medium obtained above was in a liquid state at 37 ° C., but became a complete gel state by lowering the temperature to about 23 ° C. After the carrier (A) dispersion medium was completely gelled in this manner, carnation shoots cut into each node were inoculated on the gel and cultured at about 23 ° C. for 3 weeks. Rooting was recognized in the gel after 3 weeks.

【００８５】次に、上記発根した植物体を順化のため培
養器から回収するために、該発根植物体の培養器の温度
を約３７℃に上げたところ、ただちに上記マイクロビー
ズ状担体の体積が減少して、分散培地はゲル状態から液
体に変化し、該発根植物体を容易に培養器外に取り出す
ことができた。上記の回収工程に於て、根に付着した担
体（Ａ）は容易に水洗いによって除去が可能であり、ま
た根などの損傷は全く認められず、作業も非常に容易で
あった。Next, in order to recover the rooted plant from the incubator for acclimation, the temperature of the incubator of the rooted plant was raised to about 37 ° C., and immediately the microbead-shaped carrier The volume decreased, the dispersion medium changed from a gel state to a liquid, and the rooted plant could be easily taken out of the incubator. In the above recovery step, the carrier (A) attached to the roots could be easily removed by washing with water, and no damage such as roots was observed, and the work was very easy.

【００８６】比較例１ 通常の方法で、寒天を８ｇ／ｌ、１−ナフタリン酢酸を
０．１ｍｇ／ｌ、およびシュクロースを１０ｇ／ｌの濃
度で含有するＭＳ培地を作製し、オートクレーブ処理に
よって滅菌を行った。次いで、該培地を約２３℃に冷却
しゲル化させた後、該ゲル上に、実施例２で用いた節ご
とに切断されたカーネーションのシュートを挿芽し、約
２３℃で実施例２と同様の方法で３週間培養した。培養
３週間後にゲル内に発根が認められた。 Comparative Example 1 An MS medium containing agar at a concentration of 8 g / l, 1-naphthalene acetic acid at 0.1 mg / l and sucrose at a concentration of 10 g / l was prepared by a conventional method and sterilized by autoclaving. I went. Then, after the medium was cooled to about 23 ° C. to gel, the carnation shoots cut into each node used in Example 2 were inoculated on the gel, and the gel was treated at about 23 ° C. with Example 2. The cells were cultured in the same manner for 3 weeks. Rooting was observed in the gel after 3 weeks of culture.

【００８７】上記発根植物体をゲルから分離するため
に、ゲルが付着した状態で該植物体を培養器から取り出
し、常法に従って水中で機械的に振盪したが、毛状の根
に付着したゲルは除去することが困難であり、手によっ
て該ゲルを除去する操作で毛状の根がちぎれてしまっ
た。また手による洗浄は、非常に繁雑であった。In order to separate the rooted plant from the gel, the plant was taken out from the incubator with the gel attached and shaken mechanically in water according to a conventional method. Was difficult to remove, and hairy roots were torn off by the operation of removing the gel by hand. In addition, washing by hand was very complicated.

【００８８】実施例３ ４〜５月生育したタバコ（Nicotina glutinosa）の茎を
４〜５ｃｍに切り、洗剤と水道水で洗浄した後、７０％
エタノール水溶液に３０秒間浸漬し、１％次亜塩素酸ナ
トリウム水溶液に７分間浸漬することによって滅菌した
後、滅菌蒸留水によって数回洗浄した。 Example 3 Tobacco (Nicotina glutinosa) grown in April to May is cut into 4 to 5 cm stalks and washed with a detergent and tap water to give 70%.
The sample was immersed in an aqueous ethanol solution for 30 seconds and then immersed in a 1% aqueous sodium hypochlorite solution for 7 minutes for sterilization, and then washed several times with sterile distilled water.

【００８９】次に、滅菌したカミソリで上記の茎を５ｍ
ｍ程度に切断し、該切片に約３ｍｍの径のコルクボーラ
ーをさして髄組織を採取し、該髄組織を更に２〜３ｍｍ
程度に切断した、以上の操作はすべて無菌操作によって
行った。Next, the above-mentioned stem is 5 m with a sterilized razor.
It is cut to about m, and a cork borer with a diameter of about 3 mm is inserted into the section to collect the marrow tissue, and the marrow tissue is further cut by 2-3 mm.
The above operation, which was cut to some extent, was performed aseptically.

【００９０】次いで実施例１で作製した本発明のマイク
ロビーズ状の担体（Ａ）５ｇを、３７℃で、１００ｍｌ
の寒天を含まないタバコの細胞培養用培地（平井篤志
ら、生物化学実験法１６，“植物細胞育種入門”ｐ１５
（１９６９），学会出版センター）中に分散し、オート
クレーブ処理することによって滅菌した。Next, 5 g of the microbead-shaped carrier (A) of the present invention prepared in Example 1 was added to 100 ml at 37 ° C.
Agar-free tobacco cell culture medium (Atsushi Hirai et al., Biochemistry Experiment 16, "Introduction to Plant Cell Breeding" p15
(1969), Academic Publishing Center) and sterilized by autoclaving.

【００９１】上記マイクロビーズ状担体を含有する培地
中に、３７℃で、上記の方法で得られた数個の髄組織切
片を分散させた後に、温度を約２３℃に下げて該培地を
完全にゲル化させることにより該髄組織をゲル中に包埋
し、１０００〜３０００ルックスの人工照射条件下に１
５日間培養したところ、それぞれの髄組織切片から良好
なカルスの形成が認められた。After dispersing several marrow tissue sections obtained by the above method in a medium containing the above microbead-like carrier at 37 ° C., the temperature was lowered to about 23 ° C. to complete the medium. The medullary tissue is embedded in the gel by gelling the gel into a gel and the artificial irradiation is performed under the artificial irradiation condition of 1000 to 3000 lux.
After culturing for 5 days, good callus formation was observed from each marrow tissue section.

【００９２】次に、ゲル中に形成されたカルスを回収す
るために、該ゲルを約３分間、３７℃に昇温することに
よってゲルを溶解した後、ゆるやかに遠心することによ
って上記カルスを単離した。更に０．５Ｍマンニトール
液を加え再懸濁した後、遠心することによって、上記担
体（Ａ）を完全に除去したタバコのカルスを回収するこ
とができた。Next, in order to collect the callus formed in the gel, the gel was dissolved by raising the temperature of the gel to 37 ° C. for about 3 minutes, and then gently centrifuging the callus to remove the callus. Released. Further, 0.5M mannitol solution was added and resuspended, followed by centrifugation to collect tobacco callus from which the above carrier (A) was completely removed.

【００９３】[0093]

【発明の効果】上述したように本発明によれば、ゲル中
への植物体の包埋およびゲルからの植物体の回収等が、
例えば植物体の生理的温度範囲内の温度変化によって、
簡便に且つ植物体に全く損傷を与えることなく実施する
ことができる。したがって本発明によれば、従来の寒天
などを用いたゲル培養法の問題点を完全に解消すること
ができる。As described above, according to the present invention, the embedding of the plant body in the gel, the recovery of the plant body from the gel, etc.
For example, by changing the temperature within the physiological temperature range of the plant,
It can be carried out simply and without damaging the plant. Therefore, according to the present invention, the problems of the conventional gel culture method using agar or the like can be completely solved.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明のマイクロビーズ状担体の温度依存粒径
変化の一例を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing an example of temperature-dependent particle size change of the microbead-shaped carrier of the present invention.

【図２】本発明のマイクロビーズ状担体の温度依存体積
変化の一例を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing an example of temperature-dependent volume change of the microbead-shaped carrier of the present invention.

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ＬＣＳＴ（下限臨界共溶温度）を有する
温度感応性高分子化合物を架橋してなる高分子化合物を
含むことを特徴とする植物体の育成又は再生用担体。1. A carrier for growing or regenerating a plant, which comprises a polymer compound obtained by crosslinking a temperature-sensitive polymer compound having an LCST (lower critical solution temperature). 【請求項２】 前記ＬＣＳＴが０℃より高く６０℃以下
である請求項１記載の植物体の育成又は再生用担体。2. The carrier for growing or regenerating a plant according to claim 1, wherein the LCST is higher than 0 ° C. and lower than or equal to 60 ° C. 【請求項３】 粒子状、マイクロビーズ状、繊維状、フ
レーク状、スポンジ状、膜状、又は板状の形状を有する
請求項１記載の植物体の育成又は再生用担体。3. The carrier for growing or regenerating a plant according to claim 1, which has a particle shape, a microbead shape, a fiber shape, a flake shape, a sponge shape, a film shape, or a plate shape. 【請求項４】 ０．１μｍ〜１ｃｍの範囲の大きさを有
する請求項１記載の植物体の育成又は再生用担体。4. The carrier for growing or regenerating a plant according to claim 1, which has a size in the range of 0.1 μm to 1 cm.