JP2003012698A - Monoclonal antibody - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、モノクローナル抗
体、特に、安定性の高いモノクローナル抗体のスクリー
ニング方法、そのようなモノクローナル抗体の産生する
ハイブリドーマに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a monoclonal antibody, in particular, a method for screening a highly stable monoclonal antibody, and a hybridoma produced by such a monoclonal antibody.
【０００２】[0002]
【従来の技術】糖尿病性腎症は、糖尿病の主要な合併症
の一つであり、旧来は検尿法により尿タンパク陽性をも
って、診断されてきた。しかし、この方法によって診断
される時期には既に腎不全が進行している場合が多いた
め、これに代わる早期診断法が望まれていた。2. Description of the Related Art Diabetic nephropathy is one of the major complications of diabetes, and has been conventionally diagnosed by urinalysis with positive urinary protein. However, since renal failure often progresses at the time of diagnosis by this method, an early diagnosis method instead of this has been desired.
【０００３】近年、尿中タンパクの増加に先立ち、微量
のアルブミンが尿中に認められることが明らかになり、
糖尿病腎症の早期診断マーカーとしてアルブミンが注目
されてきている。微量マーカーの特異的検出には、これ
に対する特異的抗体を用いることが有利である。In recent years, it has become clear that a minute amount of albumin is found in urine prior to the increase of urinary protein,
Albumin has been attracting attention as a marker for early diagnosis of diabetic nephropathy. For specific detection of a trace marker, it is advantageous to use a specific antibody against it.
【０００４】このため、抗体を用いて尿中アルブミンを
検出するシステムが市販されている。本願と同一出願人
によって先に出願され公開されている特開２０００−１
３９４６０号公報には、ヒトアルブミンと高速で抗原抗
体反応を検出可能なまでに達成し、短時間で尿中アルブ
ミンを検出できるモノクローナル抗体やハイブリドーマ
が開示されている。For this reason, a system for detecting urinary albumin using an antibody is commercially available. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-1 previously filed and published by the same applicant as the present application
Japanese Patent No. 39460 discloses a monoclonal antibody or a hybridoma that can detect an antigen-antibody reaction with human albumin at a high speed and can detect albumin in urine in a short time.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、抗原抗
体反応を用いる検出システムとしては、システム作製後
から使用するまでの間に、抗体が徐々に結合能を失うと
いう問題があった。例えば、多くのヒトアルブミンモノ
クローナル抗体自体の結合能は、室温で１０日保存する
ことにより、おおよそ５０％以下になる。このため、測
定精度の低下を回避するためには、被験試料の測定と同
時に標準アルブミンによる検量線を作製する必要があっ
た。さらに、検出感度が低下することは避けられない問
題であった。特に、前述したように、糖尿病腎症の検出
には、尿中の微量アルブミンの検出を確実にかつ定量精
度よく達成する必要がある。なお、システム調製後から
使用時までの間を低温で貯蔵することは現実的ではな
い。However, the detection system using the antigen-antibody reaction has a problem that the antibody gradually loses its binding ability after the system is manufactured and before it is used. For example, the binding ability of many human albumin monoclonal antibodies themselves becomes about 50% or less when stored at room temperature for 10 days. Therefore, in order to avoid a decrease in measurement accuracy, it was necessary to prepare a calibration curve using standard albumin at the same time as the measurement of the test sample. Further, the decrease in detection sensitivity has been an unavoidable problem. In particular, as described above, in order to detect diabetic nephropathy, it is necessary to achieve the detection of trace albumin in urine reliably and accurately. In addition, it is not practical to store the system at a low temperature from the time of system preparation to the time of use.
【０００６】一方、各種モノクローナル抗体を安定化す
るための安定化剤を並存させるという手段も採用されて
いる。しかしながら、熱安定性の高いモノクローナル抗
体を創出し、これを用いるという試みは未だなされてい
ない。On the other hand, a means of coexisting a stabilizing agent for stabilizing various monoclonal antibodies has also been adopted. However, no attempt has yet been made to create a monoclonal antibody having high thermostability and use it.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトアル
ブミンを免疫原として、抗ヒトアルブミンモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマから、特に、熱安定性
の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
樹立した。すなわち、前記免疫原によりマウスを免疫
し、このマウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞とを細
胞融合してハイブリドーマを得た。さらに、得られたハ
イブリドーマの培養液上清を、一定の温度条件で処理し
た後にその抗体価を測定して、抗体価の良好なハイブリ
ドーマを選択して、本発明のハイブリドーマを得た。こ
うして得られる本発明による代表的なハイブリドーマが
マウスハイブリドーマ細胞６Ａ１２株である。なお、マ
ウスハイブリドーマ細胞６Ａ１２株は、２００１年６月
２１日付けで受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６３５とし
て、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン
ター（住所：日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１ 中
央第６）でに寄託されている。このようして得られたハ
イブリドーマから取得されるモノクローナル抗体は、高
い熱安定性を有している。すなわち、高温における安定
性のみならず常温における安定性も有している。かかる
モノクローナル抗体によれば、ヒトアルブミン検出シス
テムを作製しても、当初の検出感度をより長期にわたっ
て維持し、また、標準試料を用いた検量線を用いなくて
も定量性を確保できる。また、この方法によれば、ハイ
ブリドーマの抗体価測定工程前に培養液上清を加熱処理
するため、加熱処理後の抗体価測定により、一段階で熱
安定性のあるモノクローナル抗体産生能のあるクローン
をスクリーニングすることができる。このように、抗体
価の一次スクリーニングに先だって、加熱処理をするこ
とは、従来のスクリーニング方法とは全く相違する点で
ある。通常、抗体産生細胞スクリーニングは、産生され
たそのままの抗体の抗体価の大小を検出し、その後、抗
体価の有無あるいは大小に基づいてクローニングを行な
っていた。本発明は、抗体の結合特異性や抗体産生能の
大小に基づいてハイブリドーマをクローニングしようと
するものではなく、熱安定性モノクローナル抗体の検出
しようとするからこそ、従来の抗体価の一次スクリーニ
ングを排除できる。さらに、既存あるいは新規なモノク
ローナル抗体に対し、所定の温度条件下でのスクリーニ
ングを実施することによって、安定性の良好なモノクロ
ーナル抗体が得られる。[Means for Solving the Problems] The present inventors have established a hybridoma that produces an anti-human albumin monoclonal antibody, particularly a hybridoma that produces a highly heat-stable monoclonal antibody, using human albumin as an immunogen. That is, a mouse was immunized with the above immunogen, and splenocytes of this mouse were fused with mouse myeloma cells to obtain hybridomas. Further, the culture solution supernatant of the obtained hybridoma was treated under constant temperature conditions, and then its antibody titer was measured to select a hybridoma having a good antibody titer to obtain the hybridoma of the present invention. The thus-obtained representative hybridoma according to the present invention is mouse hybridoma cell line 6A12. The mouse hybridoma cell line 6A12 was designated as a deposit number FERM BP-7635 as of June 21, 2001 under the Incorporated Administrative Agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Address: 1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). 1 Central No. 6). The monoclonal antibody obtained from the hybridoma thus obtained has high thermostability. That is, it has not only stability at high temperature but also stability at room temperature. According to such a monoclonal antibody, even if a human albumin detection system is produced, the initial detection sensitivity can be maintained for a longer period of time, and the quantification can be ensured without using a calibration curve using a standard sample. Further, according to this method, since the culture supernatant is heat-treated before the step of measuring the antibody titer of the hybridoma, the antibody titer measurement after the heat treatment allows the clone having the ability to produce a monoclonal antibody having thermostability in one step. Can be screened. Thus, the heat treatment prior to the primary screening of antibody titer is completely different from the conventional screening method. Usually, in antibody-producing cell screening, the magnitude of the antibody titer of the produced antibody as it is is detected, and then cloning is performed based on the presence or absence or the magnitude of the antibody titer. The present invention does not attempt to clone a hybridoma based on the binding specificity of an antibody or the magnitude of antibody-producing ability, but eliminates the conventional primary screening of antibody titers because it attempts to detect a thermostable monoclonal antibody. it can. Furthermore, by screening an existing or new monoclonal antibody under a predetermined temperature condition, a stable monoclonal antibody can be obtained.
【０００８】すなわち、本発明は、熱的安定性の高いモ
ノクローナル抗体、その取得方法、その製造方法及び免
疫学的試薬に関し、以下の手段を提供する。
（１）ヒトアルブミンに対するモノクローナル抗体であ
って、このモノクローナル抗体は、室温における保存開
始後３０日以内において、保存前の抗体価に対して８０
％以上の抗体価を有する、モノクローナル抗体。
（２）マウスハイブリドーマ細胞６Ａ１２株（受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−７６３５）によって産生される抗ヒト
アルブミンモノクローナル抗体。
（３）（１）に記載のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ。
（４）マウスハイブリドーマ細胞６Ａ１２株（受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−７６３５）である、（３）記載のハイ
ブリドーマ。
（５）熱的に安定なモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマのスクリーニング方法であって、抗体産生細
胞とミエローマ細胞とを細胞融合してハイブリドーマを
得る工程と、取得されたハイブリドーマの培養液上清を
少なくとも熱処理する工程と、熱処理工程後に、前記抗
体産生細胞に由来する抗体価を測定する工程、を有す
る、方法。
（６）（５）記載の方法によって単離されるハイブリド
ーマである、（３）記載のハイブリドーマ。
（７）（３）、（４）及び（６）のいずれかに記載のハ
イブリドーマを培養する工程を有する、（１）記載のモ
ノクローナル抗体の製造方法。
（８）安定性の高いモノクローナル抗体をスクリーニン
グする方法であって、（ａ）被験モノクローナル抗体
を、４０℃〜６０℃の一定温度下に少なくとも３０分間
曝す工程、（ｂ）前記（ａ）工程後に、被験モノクロー
ナル抗体の抗体価を測定する工程、（ｃ）以下に示す条
件の少なくとも一つに合致する被験モノクローナル抗体
を選択する工程、（ｉ）試験温度が４０℃〜５０℃のい
ずれかの温度において、前記被験モノクローナル抗体の
加熱処理工程前の抗体価に対する残存活性が８０％以上
である（ii）試験温度が４５℃〜５５℃のいずれかの温
度において、前記被験モノクローナル抗体の加熱処理工
程前の抗体価に対する残存活性が７０％以上である（ii
i）試験温度が５０℃〜６０℃のいずれかの温度におい
て、前記被験モノクローナル抗体の加熱処理工程前の抗
体価に対する残存活性が６０％以上である、を含む方
法。
（９）前記被験モノクローナル抗体は、抗ヒトアルブミ
ン抗体である、（８）記載の方法。
（１０）（８）又は（９）に記載の方法によって単離さ
れる、（１）記載のモノクローナル抗体。
（１１）（１）、（２）および（１０）のいずれかに記
載のモノクローナル抗体を含む、尿中ヒトアルブミンの
免疫学的分析用試薬。
（１２）（１）、（２）および（１０）のいずれかに記
載のモノクローナル抗体を含む、尿中ヒトアルブミンの
免疫学的分析用装置。[0008] That is, the present invention relates to a monoclonal antibody having high thermal stability, a method for obtaining the same, a method for producing the same, and an immunological reagent, and provides the following means. (1) A monoclonal antibody against human albumin, which is 80% of the antibody titer before storage within 30 days after the start of storage at room temperature.
A monoclonal antibody having an antibody titer of% or more. (2) An anti-human albumin monoclonal antibody produced by mouse hybridoma cell line 6A12 (accession number FERM BP-7635). (3) A hybridoma producing the monoclonal antibody according to (1). (4) The hybridoma according to (3), which is a mouse hybridoma cell line 6A12 (accession number FERM BP-7635). (5) A method for screening a hybridoma that produces a thermally stable monoclonal antibody, comprising the steps of cell fusion of antibody-producing cells and myeloma cells to obtain a hybridoma, and at least the obtained culture supernatant of the hybridoma. A method comprising a heat treatment step and a step of measuring the antibody titer derived from the antibody-producing cells after the heat treatment step. (6) The hybridoma according to (3), which is a hybridoma isolated by the method according to (5). (7) The method for producing a monoclonal antibody according to (1), which comprises a step of culturing the hybridoma according to any one of (3), (4) and (6). (8) A method for screening a highly stable monoclonal antibody, which comprises: (a) exposing a test monoclonal antibody to a constant temperature of 40 ° C. to 60 ° C. for at least 30 minutes, and (b) after the step (a). Measuring the antibody titer of the test monoclonal antibody, (c) selecting a test monoclonal antibody that meets at least one of the following conditions, and (i) a test temperature of 40 ° C to 50 ° C. In the test, the residual activity of the test monoclonal antibody with respect to the antibody titer before the heat treatment step is 80% or more (ii) at a test temperature of 45 ° C. to 55 ° C. The residual activity for the antibody titer is 70% or more (ii
i) A method, which comprises a residual temperature of 60% or more with respect to the antibody titer of the test monoclonal antibody before the heat treatment step at a test temperature of 50 ° C to 60 ° C. (9) The method according to (8), wherein the test monoclonal antibody is an anti-human albumin antibody. (10) The monoclonal antibody according to (1), which is isolated by the method according to (8) or (9). (11) A reagent for immunological analysis of human albumin in urine, which comprises the monoclonal antibody according to any one of (1), (2) and (10). (12) An apparatus for immunological analysis of human albumin in urine, which comprises the monoclonal antibody according to any one of (1), (2) and (10).
【０００９】[0009]
【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
ヒトアルブミンに結合能を有している。免疫原として
は、各種市販のヒト血清アルブミンあるいはその一部、
あるいはヒトアルブミンに特異的なペプチド鎖を使用で
きる。なおヒトアルブミンの一部又は特異的ペプチド鎖
は、各種公知の方法で調製することができる。本発明の
モノクローナル抗体は、他のウシ血清アルブミンや卵白
アルブミン等と交差しない、特異的結合性を有している
ことが好ましい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The monoclonal antibody of the present invention is
It has the ability to bind to human albumin. As the immunogen, various commercially available human serum albumin or a part thereof,
Alternatively, a peptide chain specific for human albumin can be used. A part of human albumin or a specific peptide chain can be prepared by various known methods. The monoclonal antibody of the present invention preferably has a specific binding property that does not cross other bovine serum albumin or ovalbumin.
【００１０】ヒトアルブミン由来の免疫原は、適当はア
ジュバントと混合して免疫動物に投与される。アジュバ
ントには、フロイントコンプリート（ＦＣＡ）あるいは
インコンプリートアジュバント等が公知であり、各種ア
ジュバントを必要に応じて使用する。免疫操作は、抗体
価の上昇が確認できるまで適数回行なわれる。本発明に
おいて用いる免疫動物は、特に限定しないが、例えば、
細胞融合用の骨髄腫細胞株が多く存在し、かつ高確立で
ハイブリドーマを樹立する技術が確立されている動物種
を用いることが好ましい。例えば、マウスが好ましい免
疫動物である。また、免疫操作は、動物個体に対して行
なうものに限定されず、培養した免疫担当細胞に対して
インビトロで免疫感作して抗体産生細胞を得ることもで
きる。取得された抗体産生細胞は、本発明のモノクロー
ナル抗体を得るためにスクリーニング及びクローニング
可能に形質転換される。好ましくは、抗体産生細胞は、
ミエローマ細胞との細胞融合によってハイブリドーマと
する。The human albumin-derived immunogen is administered to an immunized animal, suitably mixed with an adjuvant. Freund's complete (FCA), incomplete adjuvant, and the like are known as adjuvants, and various adjuvants are used as necessary. Immunization is performed a suitable number of times until an increase in antibody titer can be confirmed. The immunized animal used in the present invention is not particularly limited, for example,
It is preferable to use an animal species in which there are many myeloma cell lines for cell fusion and a technique for establishing a hybridoma with high probability is established. For example, mice are the preferred immunized animals. In addition, the immunization operation is not limited to that performed on an animal individual, and antibody-producing cells can be obtained by immunizing cultured immunocompetent cells in vitro. The obtained antibody-producing cells are transformed so that they can be screened and cloned to obtain the monoclonal antibody of the present invention. Preferably, the antibody producing cell is
Hybridomas are obtained by cell fusion with myeloma cells.
【００１１】ハイブリドーマは、ヒトアルブミンに対す
る結合活性に基づいてスクリーニングされる。本発明に
おいては、好ましくは、ハイブリドーマの培養液上清
を、一定条件で加熱処理し、この処理液を、ヒトアルブ
ミンに対する結合活性の測定に供する。加熱処理条件
は、温度と時間とで規定されるが、激しすぎても有効な
スクリーニングを達成できず、また、穏やかすぎても同
様である。好ましくは、５０℃〜７０℃であり、より好
ましくは５５℃〜６５℃である。特開平に、５５℃〜６
５℃であると、適度な時間設定、例えば、１５分〜１時
間程度（好ましくは３０分以上）で、効果的に熱的安定
性の有無あるいはその程度を検出できる。５５℃未満で
あると、熱安定性の有無あるいはその程度を検出しにく
く、６５℃を超えると多くのタンパクが速やかに失活す
る温度であり、この場合も熱的安定性の程度を検出しに
くい。最も好ましくは、約６０℃である。なお、後述す
るように、６０℃、３０分の加熱処理後において抗体価
を検出できるクローンから、従来のヒトアルブミンモノ
クローナル抗体に比して良好な耐熱性を備えるモノクロ
ーナル抗体が得られている。Hybridomas are screened for binding activity to human albumin. In the present invention, the culture medium supernatant of the hybridoma is preferably heat-treated under constant conditions, and the treated solution is used for measuring the binding activity to human albumin. The heat treatment conditions are defined by temperature and time, but too violent cannot achieve effective screening, and too mild can be the same. The temperature is preferably 50 ° C to 70 ° C, more preferably 55 ° C to 65 ° C. Japanese Patent Laid-Open Publication No.
When the temperature is 5 ° C., the presence or absence of thermal stability or the degree thereof can be effectively detected with an appropriate time setting, for example, about 15 minutes to 1 hour (preferably 30 minutes or more). If it is less than 55 ° C, it is difficult to detect the presence or absence of thermal stability or its degree, and if it exceeds 65 ° C, it is a temperature at which many proteins are rapidly deactivated. In this case also, the degree of thermal stability cannot be detected. Hateful. Most preferably, it is about 60 ° C. As will be described later, from a clone whose antibody titer can be detected after heat treatment at 60 ° C. for 30 minutes, a monoclonal antibody having better heat resistance than a conventional human albumin monoclonal antibody is obtained.
【００１２】次いで、熱処理後の培養液上清の抗体価を
測定する。抗体価の測定は、例えば、ヒトアルブミンを
固定化したＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに処理液を加
え、インキュベートし、標識したモノクローナル抗体
（典型的にはマウス抗ヒトアルブミン抗体／アルカリフ
ォスファターゼコンジュゲート）を添加し、洗浄後にウ
エルに対してアルカリフォスファターゼ活性等の標識化
合物によって呈される活性を測定することによって行な
うことができる。なお、抗体価の検出のためには、各種
の標識抗体を用いることができる。例えば、上記したア
ルカリフォスファターゼをはじめとする各種酸素の他、
各種の蛍光物質、発光物質等で標識した抗体を用いるこ
とができる。また、標識の態様は、抗体に直接標識して
あってもよいし、アビヂン−ビオチン系を用いた間接標
識されていてもよい。Then, the antibody titer of the culture supernatant after heat treatment is measured. The antibody titer can be measured, for example, by adding the treatment solution to an ELISA microplate on which human albumin is immobilized, incubating, and adding a labeled monoclonal antibody (typically a mouse anti-human albumin antibody / alkaline phosphatase conjugate). After washing, the activity of the labeled compound such as alkaline phosphatase activity on the wells can be measured. Various labeled antibodies can be used to detect the antibody titer. For example, in addition to various oxygen such as the alkaline phosphatase described above,
Antibodies labeled with various fluorescent substances, luminescent substances and the like can be used. In addition, as a mode of labeling, the antibody may be directly labeled, or may be indirectly labeled using an avidin-biotin system.
【００１３】通常、細胞融合して得られたハイブリドー
マを、まずその抗体産生能をスクリーニングし、その
後、さらに別途のスクリーニングを施して所望のクロー
ンを得るのであるが、本工程では、これらのハイブリド
ーマの産生するモノクローナル抗体（培養液上清）に対
して、一定条件下における加熱処理を経た後に、抗体価
を測定することにより、簡易に効率的に熱安定性を有す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクロー
ンを得ることができる。Usually, the hybridomas obtained by cell fusion are first screened for their antibody-producing ability, and then further screened to obtain the desired clones. The monoclonal antibody (culture supernatant) produced is subjected to heat treatment under certain conditions, and then the antibody titer is measured to easily and efficiently produce a hybridoma clone that produces a monoclonal antibody having thermostability. Obtainable.
【００１４】なお、熱安定性であったクローンについて
はさらに、ウシ血清アルブミンあるいは卵白アルブミン
等の他のアルブミンに交差しない抗体を産生している細
胞を選択するスクリーニングを実施することができる。
本発明においては、好ましくは、ウシ血清アルブミン及
び卵白アルブミンとの交差性に基づくスクリーニングを
行う。以上のようなスクリーニングを経て選択されたク
ローンは必要に応じてサブクローニングされる。The thermostable clones can be further screened to select cells producing antibodies that do not cross other albumins such as bovine serum albumin or ovalbumin.
In the present invention, preferably, screening based on cross-reactivity with bovine serum albumin and ovalbumin is performed. The clones selected through the above screening are subcloned as necessary.
【００１５】得られたハイブリドーマを適当な条件下で
培養し、産生される抗体を回収することにより、本発明
のモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリド
ーマがホモハイブリドーマである場合には、同系の動物
の腹腔空に接種して生体内培養が可能であり、この動物
の腹水からモノクローナル抗体を回収できる。また、ヘ
テロハイブリドーマの場合には、ヌードマウスを宿主と
して使用して生体内培養が可能である。The monoclonal antibody of the present invention can be obtained by culturing the obtained hybridoma under appropriate conditions and recovering the produced antibody. When the hybridoma is a homohybridoma, it can be inoculated into the abdominal cavity of an animal of the same strain for in vivo culture, and the monoclonal antibody can be recovered from the ascites of this animal. In the case of a heterohybridoma, in vivo culture is possible using a nude mouse as a host.
【００１６】適当な条件を設定することにより、生体外
培養によっても本発明のモノクローナル抗体を製造でき
る。かかる生体外培養に好ましく用いられる培地や添加
剤は当業者においてよく知られている。生体外培養によ
る場合には、培養上清からモノクローナル抗体を回収す
ることができる。The monoclonal antibody of the present invention can be produced by in vitro culture by setting appropriate conditions. Those skilled in the art are well aware of media and additives preferably used for such in vitro culture. In the case of in vitro culture, the monoclonal antibody can be recovered from the culture supernatant.
【００１７】回収されたモノクローナル抗体は、さら
に、飽和硫安塩析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティクロマトグラフィー等の当業者に
周知の手段により精製することができる。The recovered monoclonal antibody can be further purified by means known to those skilled in the art such as saturated ammonium sulfate salting out, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
【００１８】このようにして得られた抗ヒトアルブミン
モノクローナル抗体は、高温における安定性を備えるの
みならず、常温における安定性、さらには酸やアルカリ
等に対する安定性も備えている。本発明のマウスハイブ
リドーマ細胞６Ａ１２株由来のヒトアルブミン特異モノ
クローナル抗体は、室温（２０℃〜３０℃）における長
期安定性試験において、２０日経過後に９５％以上、３
０日経過後に８０％以上（好ましくは９０％以上）、４
０日経過後に７０％以上（好ましくは８０％以上）、６
０日経過後に６０％以上（好ましくは７０％以上）の安
定性を有していることが確認されている（図１参照）。The thus-obtained anti-human albumin monoclonal antibody has not only stability at high temperature but also stability at room temperature and also stability against acids and alkalis. The human albumin-specific monoclonal antibody derived from the mouse hybridoma cell line 6A12 of the present invention is 95% or more after 20 days in a long-term stability test at room temperature (20 ° C to 30 ° C).
80% or more (preferably 90% or more) after 4 days, 4
70% or more (preferably 80% or more) after 6 days, 6
It has been confirmed that it has a stability of 60% or more (preferably 70% or more) after the lapse of 0 days (see FIG. 1).
【００１９】また、本発明のモノクローナル抗体および
／または既製のモノクローナル抗体に対して、さらに、
熱安定性を評価することにより、高温における安定性お
よび常温における安定性に優れるモノクローナル抗体を
得ることができる。特に、６Ａ１２株由来モノクローナ
ル抗体を評価の指標として用いることにより、各種の条
件の熱安定性試験における指標を容易に設定することが
できる。熱処理条件は、得ようとする安定性レベルによ
っても異なるが、好ましくは、４０℃〜６５℃の一定温
度下に一定時間曝すことが好ましい。４０℃未満である
と、熱安定性の差がでにくく、また６５℃を超えると、
タンパク質の変性程度が大きすぎて熱安定性の差がでに
くい。好ましくは、４０℃〜６０℃の一定温度に曝すよ
うにする。その後、抗体価を測定し、加熱処理前の抗体
価に対する残存活性を指標に熱安定性の良好なモノクロ
ーナル抗体をスクリーニングできる。本発明のモノクロ
ーナル抗体としては、例えば、以下に示す条件の少なく
とも一つに合致するものを採用することができる。
（ｉ）試験温度が４０℃〜５０℃のいずれかの温度にお
いて、前記被験モノクローナル抗体の加熱処理工程前の
結合活性に対する残存活性が８０％以上である
（ii）試験温度が４５℃〜５５℃のいずれかの温度にお
いて、前記被験モノクローナル抗体の加熱処理工程前の
結合活性に対する残存活性が７０％以上である
（iii）試験温度が５０℃〜６０℃のいずれかの温度に
おいて、前記被験モノクローナル抗体の加熱処理工程前
の結合活性に対する残存活性が６０％以上である
本発明のハイブリドーマである６Ａ１２株からのヒトア
ルブミン特異モノクローナル抗体と市販品との比較によ
れば、上記した温度範囲において、明確に本発明のモノ
クローナル抗体と市販品との残存活性を区別できること
が確認されており、上記温度範囲における残存活性％を
指標とすることにより、熱安定性の高いヒトアルブミン
モノクローナル抗体が選抜できることが確認されてい
る。Further, in addition to the monoclonal antibody of the present invention and / or the ready-made monoclonal antibody,
By evaluating the thermal stability, it is possible to obtain a monoclonal antibody having excellent stability at high temperature and stability at ordinary temperature. In particular, by using the 6A12 strain-derived monoclonal antibody as an index for evaluation, the index in the thermal stability test under various conditions can be easily set. Although the heat treatment conditions vary depending on the stability level to be obtained, it is preferable that the heat treatment is performed at a constant temperature of 40 ° C. to 65 ° C. for a certain period of time. When the temperature is lower than 40 ° C, the difference in thermal stability hardly occurs, and when the temperature exceeds 65 ° C,
The degree of denaturation of the protein is too large and it is difficult to make a difference in thermal stability. Preferably, it is exposed to a constant temperature of 40 ° C to 60 ° C. After that, the antibody titer is measured, and the monoclonal antibody having good heat stability can be screened by using the residual activity with respect to the antibody titer before the heat treatment as an index. As the monoclonal antibody of the present invention, for example, one that meets at least one of the following conditions can be adopted. (I) At any test temperature of 40 ° C to 50 ° C, the residual activity of the test monoclonal antibody with respect to the binding activity before the heat treatment step is 80% or more. (Ii) The test temperature is 45 ° C to 55 ° C. At any temperature, the residual activity of the test monoclonal antibody with respect to the binding activity before the heat treatment step is 70% or more (iii) The test temperature is at any temperature from 50 ° C. to 60 ° C. According to the comparison between the commercially available product and the human albumin-specific monoclonal antibody from the 6A12 strain, which is the hybridoma of the present invention having a residual activity of 60% or more with respect to the binding activity before the heat treatment step, It has been confirmed that the residual activity of the monoclonal antibody of the present invention and that of the commercial product can be distinguished, and the residual activity in the above temperature range is confirmed. By activity% as an index, high human albumin monoclonal antibodies thermal stability has been confirmed can be selected.
【００２０】さらに、一定温度で一定時間後における残
存活性、あるいは残存活性の経時変化を評価することに
よっても、好ましいヒトアルブミンモノクローナル抗体
を選抜できる。温度は、４０℃〜６５℃の範囲のいずれ
かの温度であることが好ましいが、より好ましくは５０
℃〜６５℃の範囲の一定温度である。好ましくは、５５
℃〜６５℃である。本発明のハイブリドーマである６Ａ
１２株からのヒトアルブミン特異モノクローナル抗体と
市販品との比較によれば、上記した温度範囲において、
本発明のモノクローナル抗体と市販品との残存活性を明
確に区別できることが確認されており、上記温度範囲に
おける残存活性％を指標とすることにより、熱安定性の
高いヒトアルブミンモノクローナル抗体が選抜できるこ
とが確認されている。処理時間は温度にもよるが、３０
分から２時間程度であることが好ましい、特に、６０℃
における６Ａ１２株由来ヒトアルブミン特異モノクロー
ナル体と市販品とを比較すると、３０分後には、市販品
は残存活性が２０％以下であり、１時間後には１０％以
下、２時間後には、ほとんど残存活性がなかったのに対
し、６Ａ１２株由来抗体は、それぞれ８０％、６０％、
５０％以上の残存活性を有していた。また、６０℃にお
ける安定試験では、３０分以上６時間以内で６Ａ１２株
由来抗体と市販抗体との間に明確な差が認められてい
る。Further, a preferable human albumin monoclonal antibody can be selected by evaluating the residual activity after a fixed time at a constant temperature or the change with time of the residual activity. The temperature is preferably any temperature in the range of 40 ° C to 65 ° C, more preferably 50 ° C.
It is a constant temperature in the range of ℃ to 65 ℃. Preferably 55
C to 65C. 6A which is the hybridoma of the present invention
According to the comparison between the human albumin-specific monoclonal antibody from 12 strains and the commercially available product, in the above temperature range,
It has been confirmed that the residual activity of the monoclonal antibody of the present invention and a commercially available product can be clearly distinguished, and by using the residual activity% in the above temperature range as an index, a human albumin monoclonal antibody having high heat stability can be selected. It has been confirmed. The processing time depends on the temperature, but it is 30
Minutes to 2 hours is preferable, especially 60 ° C
When the human albumin specific monoclonal antibody derived from the 6A12 strain is compared with the commercial product after 30 minutes, the residual activity of the commercial product is 20% or less after 30 minutes, and 10% or less after 1 hour and almost the remaining activity after 2 hours. In contrast, the 6A12 strain-derived antibody was 80%, 60%,
It had a residual activity of 50% or more. Further, in the stability test at 60 ° C., a clear difference was observed between the antibody derived from 6A12 strain and the commercially available antibody within 30 minutes or more and 6 hours or less.
【００２１】本発明のモノクローナル抗体は、ヒトアル
ブミンの免疫学的な分析に使用できる。特に、熱安定性
および常温安定性に優れるので、当初の検出感度を維持
でき、また、絶対定量性を確保して簡易でかつ正確な検
査用試薬として有用である。本発明のモノクローナル抗
体を免疫学的分析用試薬は、免疫学的沈降反応を利用し
た分析系、免疫学的粒子凝集反応を利用した分析系、サ
ンドイッチ法を利用する分析系、競合阻害反応原理を利
用した分析系等の各種公知の分析系（方法及び装置を含
む）に適用することができる。特に、糖尿病性腎症の初
期を検出するのに有用な尿中ヒトアルブミン検査用試薬
となる。すなわち、日常的なケア及び観察が必要とされ
る糖尿病患者あるいは糖尿病素因者が自宅で尿を採取し
て、尿中アルブミン量を自己管理するのに非常に有用で
ある。The monoclonal antibody of the present invention can be used for immunological analysis of human albumin. In particular, since it is excellent in thermal stability and room temperature stability, it is possible to maintain the initial detection sensitivity and ensure absolute quantification, and it is useful as a simple and accurate test reagent. The reagent for immunological analysis of the monoclonal antibody of the present invention comprises an assay system utilizing an immunological precipitation reaction, an assay system utilizing an immunological particle agglutination reaction, an assay system utilizing a sandwich method, and a competitive inhibition reaction principle. It can be applied to various known analysis systems (including methods and devices) such as the utilized analysis system. In particular, it is a reagent for testing human albumin in urine, which is useful for detecting the early stage of diabetic nephropathy. That is, it is very useful for a diabetic patient or a diabetic predisposed person who needs daily care and observation to collect urine at home and self-manage the urinary albumin amount.
【００２２】本発明のモノクローナル抗体によれば、高
温における安定性及び常温における安定性が優れるた
め、取り扱いや貯蔵が容易であるとともに、当該抗体の
結合活性に基づく免疫学的反応による分析系においてア
ッセイを精度よくまた正確に実施できる期間を長期化す
ることができる。したがって、本モノクローナル抗体を
含む組成物は、研究用試薬や検査用試薬等の各種分析用
試薬や分析用装置に有用である。また、熱的安定性が高
いことから、結晶化工程、精製工程等の各種の抗体に関
する操作においても取り扱いが容易であり、操作を複雑
化することがない。したがって、本モノクローナル抗体
産生細胞を培養してモノクローナル抗体を製造する方法
は、工業的な生産に有用であるとともに、得られたモノ
クローナル抗体は、工業的に実施されるヒトアルブミン
の製造方法の精製手段として及び他の薬剤や治療剤を製
造する場合におけるアルブミンの除去手段としても有用
性が高い抗体となっている。Since the monoclonal antibody of the present invention has excellent stability at high temperature and stability at room temperature, it is easy to handle and store, and is assayed in an assay system by an immunological reaction based on the binding activity of the antibody. It is possible to prolong the period in which the operation can be performed accurately and accurately. Therefore, the composition containing the present monoclonal antibody is useful for various analytical reagents and analytical devices such as research reagents and test reagents. Further, since it has high thermal stability, it can be easily handled in various antibody-related operations such as a crystallization step and a purification step, and the operation is not complicated. Therefore, the method for producing a monoclonal antibody by culturing the present monoclonal antibody-producing cells is useful for industrial production, and the obtained monoclonal antibody is a purification means for the industrial production method of human albumin. The antibody is also highly useful as a means for removing albumin in the production of other drugs and therapeutic agents.
【００２３】[0023]
【発明の効果】本発明によれば、安定性の高いヒトアル
ブミン特異モノクローナル抗体を得ることができ、抗体
の経時的失活に起因する課題を解決できる。すなわち、
免疫学的分析系における絶対的定量性の確保及び検出感
度の確保が容易となる。また、その安定性に基づいて、
ヒトアルブミン特異抗体を使用する、薬剤、治療剤、試
薬等の製造においても、工程における抗体安定性確保の
ための操作を簡略化することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a highly stable human albumin-specific monoclonal antibody can be obtained, and a problem caused by inactivation of the antibody over time can be solved. That is,
It becomes easy to secure absolute quantitativeness and detection sensitivity in the immunological analysis system. Also, based on its stability,
Even in the production of drugs, therapeutic agents, reagents, etc. using a human albumin-specific antibody, the operation for ensuring antibody stability in the process can be simplified.
【００２４】[0024]
【実施例】以下、本発明の具体例について説明するが、
これらの具体例は、本発明の正確な理解のために提示さ
れるものであり、本発明は以下の実施例に限定されるも
のではない。EXAMPLES Hereinafter, specific examples of the present invention will be described.
These specific examples are provided for an accurate understanding of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
【００２５】（実施例１）ハイブリドーマの作製
ヒトアルブミン１０ｍｇ／ｍｌが１５μｌ、ヒトＩｇＡ
２．９ｍｇが５２μｌ及びＰＢＳが１．４３ｍｌからな
る抗原液１．５ｍｌ中の１．４ｍｌを、等量のフロイン
トアジュバントと注射器内にて混合し、エマルジョンと
した。このエマルジョンを別の注射器に１ｍｌ採取し、
投与抗原量が０．２ｍｇとなるように、雌５週令ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスの腹腔内に注射した。この操作を2週間毎
に２回行い、ＥＬＩＳＡ法により抗体生産を確認した
後、同マウスの腹腔内に抗原注射を打った。(Example 1) Preparation of hybridoma 15 mg of human albumin 10 mg / ml, human IgA
1.4 ml of 1.5 ml of the antigen solution consisting of 52 μl of 2.9 mg and 1.43 ml of PBS was mixed with an equal amount of Freund's adjuvant in a syringe to form an emulsion. Take 1 ml of this emulsion into another syringe,
Female 5-week-old BAL so that the amount of antigen administered is 0.2 mg
B / c mice were injected intraperitoneally. This operation was performed twice every two weeks, and after antibody production was confirmed by the ELISA method, the mouse was intraperitoneally injected with an antigen.
【００２６】免疫終了後のマウス脾細胞を取り出し、RP
MI 1640培地10ｍｌで細胞をほぐした後、１５ｍｌ容の
遠心チューブに移して放置した。そして、塊が沈んだ上
清を別の遠心チューブに移し、１５００ｒｐｍで５分
間、上清を捨て、細胞をほぐし１０ｍｌのRPMI 1640培
地を加えた。After completion of immunization, the mouse splenocytes are taken out and RP
The cells were loosened with 10 ml of MI 1640 medium, transferred to a 15 ml centrifuge tube and left to stand. Then, the supernatant in which the lumps had settled was transferred to another centrifuge tube, the supernatant was discarded at 1500 rpm for 5 minutes, the cells were loosened, and 10 ml of RPMI 1640 medium was added.
【００２７】この細胞懸濁液から、後述するミエローマ
細胞の５倍相当量を採取し、１５００ｒｐｍで5分間遠
心して上清を捨てた後、融合バッファー５ｍｌを加え
た。これを１５００ｒｐｍで５分間遠心して上清を捨
て、融合バッファーにて４×１０ 7細胞／ｍｌとした。From this cell suspension, the myeloma described below
Collect 5 times the amount of cells and spin at 1500 rpm for 5 minutes.
After carefully discarding the supernatant, add 5 ml of fusion buffer
It was Centrifuge this at 1500 rpm for 5 minutes and discard the supernatant.
4x10 in fusion buffer 7Cells / ml.
【００２８】ミエローマ細胞については、マウス骨髄腫
細胞を取り出してRPMI 1640培地で細胞をほぐし、細胞
数をカウントした後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離
して上清を捨て、融合バッファーにて８×１０6細胞／
ｍｌとした。As for myeloma cells, mouse myeloma cells were taken out, loosened in RPMI 1640 medium, counted, counted, centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded. 6 cells /
ml.
【００２９】（実施例２）高安定性モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマのスクリーニング
上記により調製された脾細胞とミエローマ細胞とを、
５：１の細胞数割合で用いて電気細胞融合法により融合
させた後、いわゆるＨＡＴ培地に分散し９６ウェルマイ
クロプレートにて培養した。ハイブリドーマ細胞の出現
したウェルを目視でチェックし、その培養液上清をサン
プリングした。高安定性の抗体をスクリーニングするた
めに、培養液上清を一旦６０℃３０分間処理したのち、
ただちに抗ヒト血清アルブミン抗体価の有無を測定し
た。即ち、ヒト血清アルブミンをあらかじめコーティン
グしたＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに上記熱処理培養
液上清を加え、１時間インキュベートし、洗浄後、抗マ
ウスイムノグロブリンＧ／アルカリフォスファターゼコ
ンジュゲートを１時間反応させ、洗浄後ウェルに結合し
ているアルカリフォスファターゼ活性を測定した。通常
のスクリーニング法では熱処理工程がないが、このよう
な方法を用いることで、単なる抗体の生産能でなく高い
耐熱性ひいては高安定性のモノクローナル抗体を得るこ
とができる。こうして得られた抗体産生株はマウスハイ
ブリドーマ細胞６Ａ１２株と名付けた。(Example 2) Screening of highly stable monoclonal antibody-producing hybridoma The splenocytes and myeloma cells prepared as described above were
The cells were fused at a cell number ratio of 5: 1 by the electric cell fusion method, then dispersed in a so-called HAT medium and cultured in a 96-well microplate. The well in which the hybridoma cells appeared was visually checked and the culture supernatant was sampled. To screen highly stable antibodies, the culture supernatant was once treated at 60 ° C for 30 minutes,
The presence or absence of anti-human serum albumin antibody titer was immediately measured. That is, the heat-treated culture supernatant was added to an ELISA microplate precoated with human serum albumin, incubated for 1 hour, washed, and then reacted with an anti-mouse immunoglobulin G / alkaline phosphatase conjugate for 1 hour, and the wells were washed. The alkaline phosphatase activity bound to was measured. Although there is no heat treatment step in the usual screening method, by using such a method, it is possible to obtain a monoclonal antibody having high heat resistance and thus high stability rather than mere antibody-producing ability. The antibody-producing strain thus obtained was named mouse hybridoma cell line 6A12.
【００３０】（実施例３）抗体の熱安定性比較 その１
６Ａ１２株を培養して得た上清より、モノクローナル抗
体を精製し、当該抗体と市販されている抗ヒト血清アル
ブミンモノクローナル抗体３種とについて安定性試験を
実施し安定性を比較した。まず、各抗体をＰＢＳ（等張
リン酸緩衝液）に希釈し、腐敗防止のために０．０１％
のアジ化ナトリウムを添加し、室温で７０日間放置し、
ＥＬＩＳＡにより抗体価を経時的に測定した。なお、室
温とは、おおよそ２０℃〜３０℃を意味し、本安定性試
験は、この範囲に温度制御されかつ湿度が３０〜７０％
R.Hで制御された装置（暗所）内で実施された。安定性
試験前の抗体価を１００％として、所定時間経過時の残
存抗体価を％で表示した。結果を図１に示す。６Ａ１２
株由来抗体は室温でより長時間にわたって、市販抗体よ
りも著しい安定性を示した。すなわち、約１０日間経過
時において、６Ａ１２株由来抗体がほぼ１００%の残存
活性を有していたのに対し、市販品群では４０〜５０%
の残存活性であり、２０日間経過時に、６Ａ１２株由来
抗体が依然として約１００%であるのに対し、市販品群
は１０〜４０%であり、早期に顕著な安定性の差が観察
された。特に試験開始後１０日間内において市販品は顕
著に残存活性が低下した。さらに、６Ａ１２株由来抗体
は、３０日経過時に９０%、４０日経過時に８０%、０日
経過時に８０%、７０日経過時に７０%を維持していた。Example 3 Comparison of Thermal Stability of Antibody Part 1 Monoclonal antibody was purified from the supernatant obtained by culturing the 6A12 strain, and the antibody was compared with the commercially available anti-human serum albumin monoclonal antibody 3 types. The stability test was carried out to compare the stability. First, dilute each antibody in PBS (isotonic phosphate buffer) and add 0.01% to prevent spoilage.
Of sodium azide was added and left at room temperature for 70 days,
The antibody titer was measured over time by ELISA. It should be noted that room temperature means approximately 20 ° C to 30 ° C, and this stability test shows that the temperature is controlled in this range and the humidity is 30% to 70%.
It was carried out in a RH-controlled device (dark place). The antibody titer before the stability test was taken as 100%, and the residual antibody titer after the lapse of a predetermined time was expressed in%. The results are shown in Fig. 1. 6A12
Strain-derived antibodies showed greater stability than commercial antibodies at room temperature for longer periods of time. That is, after about 10 days, the antibody derived from the 6A12 strain had almost 100% residual activity, while in the commercial product group, 40-50%.
The residual activity of 6A12 strain-derived antibody was still about 100% after 20 days, whereas it was 10 to 40% in the commercial product group, and a remarkable difference in stability was observed at an early stage. In particular, the residual activity of the commercial product was remarkably reduced within 10 days after the start of the test. Further, the 6A12 strain-derived antibody maintained 90% after 30 days, 80% after 40 days, 80% after 0 days, and 70% after 70 days.
【００３１】以上の結果によれば、６Ａ１２株由来抗体
は、市販品抗体に比較して室温において顕著に高い安定
性を示しており、当該抗体は、高温における安定性に優
れるだけでなく、室温における安定性も高いことが示さ
れた。From the above results, the 6A12 strain-derived antibody exhibits remarkably high stability at room temperature as compared with the commercially available antibody, and the antibody is not only excellent in stability at high temperature but also at room temperature. It was also shown that the stability in
【００３２】（実施例４）抗体の熱安定性比較 その２
６Ａ１２株を培養して得た上清より、モノクローナル抗
体を精製し、当該抗体と市販されている抗ヒト血清アル
ブミンモノクローナル抗体３種（実施例３で使用したの
と同一種類である。）とについて安定性試験を実施し安
定性を比較した。まず、各抗体をＰＢＳ（等張リン酸緩
衝液）に希釈し、３０℃、４０℃、５０℃、６０°、７
０℃、及び８０℃の各温度で３０分間処理し、ＥＬＩＳ
Ａにより抗体価を測定した。安定性試験前の抗体価を１
００％として、処理後の残存抗体価を％で表示した。結
果を図２に示す。６Ａ１２抗体は特に５０℃以上で市販
抗体よりも著しい安定性を示した。これらの結果によれ
ば、少なくとも４０℃以上、好ましくは５０℃以上６０
℃以下でヒトアルブミンモノクローナル抗体を処理する
ことにより、これらの熱安定性を評価し、高温で安定で
ありおよび／または室温で安定である抗ヒトアルブミン
モノクローナル抗体をスクリーニングできることが明ら
かであった。Example 4 Comparison of Thermal Stability of Antibody Part 2 A monoclonal antibody was purified from the supernatant obtained by culturing the 6A12 strain, and the antibody and three commercially available anti-human serum albumin monoclonal antibodies ( The same type as that used in Example 3) was subjected to a stability test to compare the stability. First, each antibody was diluted with PBS (isotonic phosphate buffer), and then 30 ° C, 40 ° C, 50 ° C, 60 °, 7 ° C.
30 minutes treatment at each temperature of 0 ℃ and 80 ℃, ELIS
The antibody titer was measured by A. The antibody titer before the stability test is 1
The antibody titer remaining after the treatment was expressed as%, assuming that it was 00%. The results are shown in Figure 2. The 6A12 antibody showed significantly more stability than the commercially available antibody, especially at 50 ° C or higher. According to these results, at least 40 ° C or higher, preferably 50 ° C or higher 60
It was clear that treatment of human albumin monoclonal antibodies at or below 0 ° C. could evaluate their thermal stability and screen anti-human albumin monoclonal antibodies that are stable at high temperatures and / or stable at room temperature.
【００３３】（実施例５）抗体の熱安定性比較 その３
６Ａ１２株を培養して得た上清より、モノクローナル抗
体を精製し、当該抗体と市販されている抗ヒト血清アル
ブミンモノクローナル抗体３種（実施例３と同一種類で
ある。）とについて安定性試験を実施し安定性を比較し
た。まず、各抗体をＰＢＳ（等張リン酸緩衝液）に希釈
し、６０℃で３０分間から６時間処理し、ＥＬＩＳＡに
より抗体価を測定した。温度処理前の抗体価を１００％
として、処理後の残存抗体価を％で表示した。結果を図
３に示す。６Ａ１２株由来抗体は６０℃でより長時間に
わたって、市販抗体よりも著しい安定性を示した。これ
らの結果によれば、６０℃における安定性では、３０分
以上６時間以内の処理時間内では、６Ａ１２株由来抗体
と市販品の安定性は明確に区別できることがわかった。(Example 5) Comparison of heat stability of antibody Part 3 A monoclonal antibody was purified from a supernatant obtained by culturing 6A12 strain, and the antibody and three kinds of commercially available anti-human serum albumin monoclonal antibodies ( The same type as that of Example 3) was subjected to a stability test to compare the stability. First, each antibody was diluted with PBS (isotonic phosphate buffer), treated at 60 ° C. for 30 minutes to 6 hours, and the antibody titer was measured by ELISA. 100% antibody titer before temperature treatment
The residual antibody titer after treatment was expressed as%. The results are shown in Fig. 3. The 6A12 strain-derived antibody showed marked stability at 60 ° C over a longer period of time than the commercially available antibody. From these results, it was found that with respect to the stability at 60 ° C., the stability of the 6A12 strain-derived antibody and the commercial product can be clearly distinguished within the treatment time of 30 minutes to 6 hours.
【図１】実施例３における安定性試験結果を示すグラフ
図である。FIG. 1 is a graph showing the results of stability test in Example 3.
【図２】実施例４における安定性試験結果を示すグラフ
図である。FIG. 2 is a graph showing stability test results in Example 4.
【図３】実施例５における安定性試験結果を示すグラフ
図である。FIG. 3 is a graph showing the results of stability test in Example 5.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91 // Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 嶋村 隆 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 山田 幸生 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA44 DA02 GA03 HA15 4B029 AA07 BB17 FA12 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA91X BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 CA40 DA76 EA50 FA72─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) C12P 21/08 C12R 1:91 // G01N 33/577 C12N 5/00 C (C12P 21/08 15/00 (C C12R 1:91) (72) Inventor Takashi Shimamura, Nagakute-cho, Aichi-gun, Aichi Nagalete 1 41st Yokomichi Toyota Central Research Institute Co., Ltd. (72) Inventor Yukio Yamada Nagakute, Aichi-gun, Nagakute-cho F-Term 1 at 41 Yokochi (Inside) Toyota Central Research Laboratory 4B024 AA11 BA44 DA02 GA03 HA15 4B029 AA07 BB17 FA12 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA91X BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 CA40 DA76 EA50 FA72
Claims (12)
体であって、 このモノクローナル抗体は、室温における保存開始後３
０日以内において、保存前の抗体価に対して８０％以上
の抗体価を有する、モノクローナル抗体。1. A monoclonal antibody against human albumin, the monoclonal antibody 3
A monoclonal antibody having an antibody titer of 80% or more with respect to the antibody titer before storage within 0 days.
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６３５）によって産生される
抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体。2. An anti-human albumin monoclonal antibody produced by mouse hybridoma cell line 6A12 (accession number FERM BP-7635).
生するハイブリドーマ。3. A hybridoma producing the monoclonal antibody according to claim 1.
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６３５）である、請求項３記
載のハイブリドーマ。4. The hybridoma according to claim 3, which is a mouse hybridoma cell line 6A12 (accession number FERM BP-7635).
るハイブリドーマのスクリーニング方法であって、 抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合してハイブ
リドーマを得る工程と、 取得されたハイブリドーマの培養液上清を少なくとも熱
処理する工程と、 熱処理工程後に、前記抗体産生細胞に由来する抗体価を
測定する工程、 を有する、方法。5. A method for screening a hybridoma producing a thermostable monoclonal antibody, which comprises the step of cell fusion of antibody-producing cells and myeloma cells to obtain a hybridoma, and the culture supernatant of the obtained hybridoma. At least, and a step of measuring the antibody titer derived from the antibody-producing cells after the heat treatment step.
イブリドーマである、請求項３記載のハイブリドーマ。6. The hybridoma according to claim 3, which is a hybridoma isolated by the method according to claim 5.
ハイブリドーマを培養する工程を有する、請求項１記載
のモノクローナル抗体の製造方法。7. The method for producing a monoclonal antibody according to claim 1, which comprises a step of culturing the hybridoma according to any one of claims 3, 4, and 6.
ーニングする方法であって、（ａ）被験モノクローナル
抗体を、４０℃〜６０℃の一定温度下に少なくとも３０
分間曝す工程、（ｂ）前記（ａ）工程後に、被験モノク
ローナル抗体の抗体価を測定する工程、（ｃ）以下に示
す条件の少なくとも一つに合致する被験モノクローナル
抗体を選択する工程、（ｉ）試験温度が４０℃〜５０℃
のいずれかの温度において、前記被験モノクローナル抗
体の加熱処理工程前の抗体価に対する残存活性が８０％
以上である（ii）試験温度が４５℃〜５５℃のいずれか
の温度において、前記被験モノクローナル抗体の加熱処
理工程前の抗体価に対する残存活性が７０％以上である
（iii）試験温度が５０℃〜６０℃のいずれかの温度に
おいて、前記被験モノクローナル抗体の加熱処理工程前
の抗体価に対する残存活性が６０％以上である、を含む
方法。8. A method for screening a highly stable monoclonal antibody, comprising: (a) a test monoclonal antibody at least 30 at a constant temperature of 40 ° C. to 60 ° C.
Exposing for minutes, (b) measuring the antibody titer of the test monoclonal antibody after the step (a), (c) selecting a test monoclonal antibody that meets at least one of the following conditions, (i) Test temperature is 40 ℃ to 50 ℃
At either temperature, the residual activity of the test monoclonal antibody with respect to the antibody titer before the heat treatment step is 80%.
The above is (ii) the test temperature is any temperature from 45 ° C. to 55 ° C., and the residual activity of the test monoclonal antibody with respect to the antibody titer before the heat treatment step is 70% or more (iii) the test temperature is 50 ° C. A method comprising a residual activity of 60% or more with respect to the antibody titer of the test monoclonal antibody before the heat treatment step at any temperature of -60 ° C.
ルブミン抗体である、請求項８記載の方法。9. The method according to claim 8, wherein the test monoclonal antibody is an anti-human albumin antibody.
離される、請求項１記載のモノクローナル抗体。10. The monoclonal antibody according to claim 1, which is isolated by the method according to claim 8 or 9.
載のモノクローナル抗体を含む、尿中ヒトアルブミンの
免疫学的分析用試薬。11. A reagent for immunological analysis of human albumin in urine, which comprises the monoclonal antibody according to any one of claims 1, 2 and 10.
載のモノクローナル抗体を含む、尿中ヒトアルブミンの
免疫学的分析用装置。12. A device for immunological analysis of human albumin in urine, which comprises the monoclonal antibody according to any one of claims 1, 2 and 10.
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