JP2003012516A - 新規なCaMKK阻害剤 - Google Patents
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Abstract
キナーゼキナーゼ阻害剤を提供する。 【解決手段】 式(1): 【化1】 [式中、R1、またはR2は、独立して、水素原子、ハ
ロゲン原子、アルキル基、またはハロアルキル基のいず
れかである。R3は水素原子、アルキル基、または置換
アルキル基を表す。]で表される、7H−ベンズイミダ
ゾ−[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン−7−オ
ン誘導体、またはその薬学上許容される塩を有効成分と
して含有するカルシウム/カルモジュリン依存性キナー
ゼキナーゼ阻害剤。
Description
モジュリン依存性キナーゼキナーゼ(CaMKK)阻害
剤のハイスループットスクリーニング方法、およびカル
シウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ(Ca
MKK)に対して選択的に阻害活性を示す7H−ベンズ
イミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン−
7−オン誘導体に関する。
る細胞において細胞運動、分泌反応など、多岐にわたっ
て機能している。細胞内情報伝達系の初期の反応は主
に、遊離細胞内カルシウムが、カルモジュリンなどのカ
ルシウム受容蛋白質へ結合することであると考えられて
おり、これらカルシウム受容蛋白質がキナーゼなどの標
的分子の機能を調節する。カルシウム/カルモジュリン
依存性キナーゼキナーゼ(以下、CaMKKと略する)
は、その活性発現にカルシウムイオン、カルモジュリン
を必須とする蛋白質リン酸化酵素であり、大脳、小脳、
膵臓、脾臓などにおいて発現されている。CaMKKの
in vitro における基質としては、カルシウム/カルモジ
ュリン依存性キナーゼ I、およびIV(CaM-K
I、IV)が挙げられ、これらのキナーゼをリン酸化す
ることにより、活性化すると考えられている。また、ア
ポトーシス促進に関与すると考えられている、PKB
(Protein kinase B)を直接リン酸化し活性化すること
が報告されている。その生理的機能としては、既報のin
vitro試験結果から、中枢神経系、免疫系における遺伝
子発現の制御および中枢神経系における細胞死抑制など
が示唆されているが、実際の生体内での機能について
は、未だ不明な点が多い。その理由の一つは、CaMK
Kの選択的な阻害剤が無かったことである。従って選択
的にCaMKKを阻害する化合物は、CaMKKの細胞
内カルシウム情報伝達機構における役割、およびCaM
KKが関与する生理機能の解明に必須であると考えら
れ、in vitro試験およびin vivo試験にCaMKK選択
的な阻害剤を用いることができれば、CaMKKの機能
を特定するのが容易になる。また、CaMKK阻害剤の
医薬品としての用途は未だ研究途上にあるが、上述した
ようなCaMKKの発現器官および示唆されている生理
的機能から考えると、CaMKK阻害剤は、アレルギー
性疾患、炎症性疾患、中枢性疾患等の治療剤として応用
できる。
ゼ類の阻害剤としては、中枢神経系初め、広く生体に存
在し、多機能を有する、カルシウム/カルモジュリン依
存性キナーゼIIの阻害剤が知られている。具体的に
は、KN−62(J. Biol. Chem., 265, 4315-4320(199
0)) 、KN−93(Biochem. Biophys. Res. Commun.,1
81, 968-975(1991))、ペプチド性の化合物(公開特許公
報平11−152298)、アラキドン酸、12−HE
TE (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8550-8554(1
989) などが挙げられる。KN−62は、カルシウム/カ
ルモジュリン依存性キナーゼIVの阻害剤としても知ら
れている(J. Biol. Chem., 269, 15520-15527(199
4))。しかし、CaMKKを阻害する化合物については
知られていない。
ては、徳光らによってジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー、275巻、26号、20090頁に報告されて
いる方法が挙げられる。ここで用いられている方法は、
リン酸化源として[γ−3 2P]−ATPが用いられて
いる。しかしながら、32Pはエネルギーの高い放射性
同位元素であり、この方法をCaMKK阻害活性のハイ
スループットアッセイ系で用いることは位置的に近接す
るサンプル間で相互の放射活性の干渉作用が大き過ぎ、
正確な放射活性測定ができないという点で困難であっ
た。
[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン−7−オン誘
導体の分野では、多数の化合物が公知であり、多くは染
料または色素、およびその中間体として用いられてい
る。例えば、1,8-ナフトイレンベンズイミダゾール-4
(または5)-カルボン酸は、US2820037や有機合成化学
第20巻第11号1016頁(1962年)に記載されている。しか
し、医薬用途としては、特開平6−263759に記載
された、抗癌剤として有用な1、8−ナフトイレンベン
ズイミダゾール誘導体、および、US4670442に記載され
た、免疫調節剤として有用な1、8−ナフトイレンベン
ズイミダゾール誘導体が知られているに過ぎない。ま
た、これらの化合物の作用機序については、全く記載さ
れていない。
シウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ(Ca
MKK)阻害剤のハイスループットスクリーニング方
法、およびCaMKKが関与する生理活性を解明するた
めに必須であり、医薬品としても有用な、選択的CaM
KK阻害剤を供することにある。
た結果、[γ−33P]−ATPをリン酸化源として用
いることによって、リン酸化された基質を含む多数の反
応混合物を1枚のフィルターに吸着させても、近接した
反応混合物間の、相互の放射活性の干渉なしに正確な測
定ができることを見出した。また、この方法では使用す
る放射線量を著しく減少させることもできる。これによ
って、一度に多数のサンプルをアッセイするハイスルー
プットスクリーニング系を構築することができた。上記
の方法を用いて、選択的にCaMKKを阻害する化合物
をスクリーニングした結果、強いCaMKK阻害活性を
示す7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[d
e]イソキノリン−7−オン誘導体を見出すに至った。
本発明の7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ
[de]イソキノリン−7−オン誘導体またはその塩
は、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼIIに
対する阻害活性は低く、カルシウム/カルモジュリン依
存性キナーゼI、IV、MLCK、プロテインキナーゼ
A、C、およびp42MAPキナーゼ等に対してはほとん
ど阻害活性を示さず、極めて選択的にCaMKKを阻害
することがわかった。このようなプロフィールを有する
化合物はこれまで見出されていなかった。
ロゲン原子、アルキル基、またはハロアルキル基のいず
れかである。R3は水素原子、アルキル基、または置換
アルキル基を表し、COOR3基はナフタレン環のどの
位置に置換していてもよい。]で表される、7H−ベン
ズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン
−7−オン誘導体、またはその薬学上許容される塩を有
効成分として含有するカルシウム/カルモジュリン依存
性キナーゼキナーゼ阻害剤、[2]R1およびR2が水
素原子である、[1]記載のカルシウム/カルモジュリ
ン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、[3]R3が水素原
子である、請求項1または2記載のカルシウム/カルモ
ジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、[4]式(I
I):
る。)で表される7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]
ベンズ[de]イソキノリン−7−オン誘導体、または
その薬学上許容される塩を、有効成分として含有するカ
ルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、[5]R
1およびR2が水素原子である、[4]記載のカルシウ
ム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤、
[6]R3が水素原子である、[4]または[5]記載
のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ
阻害剤、[7]式(III):
る。)で表される7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]
ベンズ[de]イソキノリン−7−オン誘導体、または
その薬学上許容される塩を、有効成分として含有するカ
ルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害
剤。[8]R1およびR2が水素原子である、[7]記
載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナー
ゼ阻害剤、[9]R3が水素原子である、[7]または
[8]記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナー
ゼキナーゼ阻害剤、[10][1]から[9]記載のカ
ルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤を有効成分
として含有する、CaMKKの機能が亢進した病態を改
善する治療剤、[11][1]から[9]記載のカルモ
ジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害剤を有効成分とし
て含有する、アレルギー性疾患、炎症性疾患、または中
枢性疾患の治療剤、[12][γ−33P]−ATPを
基質のリン酸化源として用いて酵素反応を行い、リン酸
化された基質をフィルターに吸着させてその放射活性を
測定することを特徴とする、カルシウム/カルモジュリ
ン依存性キナーゼキナーゼ(CaMKK)阻害剤のハイ
スループットスクリーニング方法、に関するものであ
る。
素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を表し、好ま
しくはフッ素原子、または塩素原子である。アルキル基
としては炭素数1から4のアルキル基が挙げられ、具体
的には、メチル、エチル、プロピル、1−メチルエチ
ル、ブチル、1−メチルプロピル、2−メチルプロピル、
2,2−ジメチルエチルなどが挙げられる。ハロアルキ
ル基とは、1から5個のハロゲン原子が結合したアルキ
ル基を表し、好ましくは、1から3個のハロゲン原子が
結合したアルキル基を表す。具体的にはトリフルオロメ
チル、2−トリフルオロエチル、2−クロロエチルなど
が挙げられる。置換アルキル基における置換基として
は、炭素数1から4のアルコキシ基、炭素数1から4の
アルキルカルボニル基、炭素数1から4のアルキルカル
ボニルオキシ基、炭素数1から4のアルコキシカルボニ
ル基、炭素数1から4のアルコキシカルボニルオキシ基
等が挙げられる。式(I)〜式(III)における、R1
およびR2の好ましい例としては、同一または異なっ
て、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、エチル基、ト
リフルオロメチル基などが挙げられる。特に好ましいの
は水素原子である。
ましい例としては、水素原子、メチル基、エチル基、ア
セトキシメチル基、または、ピバロイルオキシメチル基
等が挙げられ、特に好ましいものは水素原子である。本
発明におけるCaMKK阻害剤は、好ましくは、式(I
I)で表される化合物、またはその薬学上許容される塩
であり、更に好ましくは、式(IV):
る。
表される7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ
[de]イソキノリン−7−オン誘導体の「薬学上許容
される塩」としては、例えば、塩基性塩の場合、ナトリ
ウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属
塩、亜鉛塩等の無機金属塩、メチルアミン、ジエチルア
ミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、トリ
ヒドロキシメチルアミノメタン等の一級、二級、三級の
有機アミン塩、ピリジニウム塩等が挙げられ、酸性塩の
場合、塩酸、硝酸、燐酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水
素酸などの無機酸、並びにメタンスルホン酸、p−トル
エンスルホン酸などの脂肪族、芳香族を含むスルホン酸
類、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢
酸、安息香酸などの脂肪族、芳香族を含むカルボン酸の
ような有機酸との塩を含む。また、本発明には、式
(I)〜式(IV)で表される7H−ベンズイミダゾ−
[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン−7−オン誘
導体またはその塩の水和物、エタノール溶媒和物等の溶
媒和物等も含まれる。
以下の方法で製造することができる。 製造法1:US2820037に記載された方法などを用いて、
以下の工程で製造することができる。すなわち、[1]
式(1−4)、または式(1−5)で表される化合物の
製造工程
トロ基、アミノ基、または保護基で保護されたアミノ基
を表す。) O−置換アニリン誘導体:式(1−2)と、ブロモナフ
タレン酸無水物:式(1−1)を、必要に応じて酸触媒
の存在下、水中、または酢酸、エタノール、DMFのよ
うな極性溶媒を用いて、通常0℃〜250℃の範囲で縮合
し、式(1−3)の化合物を製造することができる。X
がアミノ基である場合、式(1−3)の化合物は、必要
に応じてジシクロヘキシルカルボジイミドなどの脱水縮
合剤の存在下、DMFなどの不活性溶媒中で縮合反応を
行い、式(1−4)の化合物、および式(1−5)の化
合物へ導くことができる。Xが保護基で保護されたアミ
ノ基を表す場合、保護基を脱保護し、アミノ基へと返還
した後縮合反応を行うことができる。また、Xがニトロ
基の場合、接触水素化反応、鉄、亜鉛などの金属を用い
た還元反応を用いてアニリン誘導体を合成し、続いて上
述の縮合反応を行うことができる。式(1−4)の化合
物、および式(1−5)の化合物を含む混合物は、その
まま次の反応へ供することも可能であるが、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーや、分別再結晶等を用いて、
それぞれの位置異性体を分離精製することも可能であ
る。式(1−4)、および(1−5)の異性体は、各々
公知化合物であり、 1H−NMRデータを取得すること
で区別することができる。(Bull.Chem.Soc.Jpn.,74,17
3(2001))また、式(1−1)の化合物の位置異性体を
原料に用いることにより、上記と同様の方法で、式(1
−4)の化合物の他の異性体を合成することもできる。
の化合物、またはそれらの混合物等の、式(2−1)で
表される化合物から、実施例に記載された方法などを用
いて、式(2−2)の化合物を製造することができる。
式(2−2)で表される化合物が位置異性体の混合物で
ある場合は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分
別再結晶等を用いて位置異性体を分離することもでき
る。
酸化カリウムなどの塩基、あるいは濃塩酸などの酸の存
在下、加水分解反応を行い、式(3−1)で表される本
発明の化合物を製造することができる。上記式(3−
1)で表される化合物が位置異性体の混合物である場合
は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分別再結晶
等を用いて位置異性体を分離することもできる。式(3
−1)で表される化合物は、公知の方法でエステル化反
応を行い、カルボキシル基をエステルへと変換すること
ができる。該方法については、新実験化学講座(丸善;
第22巻)等に記載されている。また、前記製造方法で
使用されるアミノ基の保護基としては、当業者が通常使
用する保護基が挙げられ、保護・脱保護の方法等につい
ては、「Protective groups in organic chemistry(第
2版/Greene, T.W., John Wiley & Sons, Inc.)に記載
された方法等が挙げられる。
ログ、アイソフォームも含んでいる。例えばラットCa
MKKの配列は、Anderson, K.A. et al. (1998) J. Bi
ol. Chem. 273, 31880-31889 等に記載されているが、
CaMKKα、およびCaMKKβの2種類のアイソフ
ォームが知られている。また、ヒトCaMKKの配列に
ついても上記文献等に開示されている。
ニング方法とは、1度に多数のサンプルの酵素阻害活性
を評価することができるスクリーニング方法を表し、具
体的には、96穴プレート(具体的には、8.5cm x 12.7c
mの大きさのものなどが汎用されている。)等を用いて
評価する方法等が挙げられる。本発明のハイスループッ
トスクリーニング方法は、以下の工程を含むものであ
る。すなわち、 [1]96穴V底プレート等、多数のサンプルを独立した
反応槽にサンプリングできる構造を有するプレートの各
穴に、被検化合物、CaMKK、カルモジュリンキナー
ゼIなどの基質、カルモジュリン、[γ−33P]- AT
Pを添加して、適当な温度、例えば37℃で、約1時間、
リン酸化反応を進行させた後、 EDTA、トリクロロ
酢酸、塩酸などの試薬を用いて反応を停止させる。ここ
で、基質と酵素の相互作用を促進するために、酵素反応
時にコールドのATPを添加してもよい。また、33P
の取り込みを完全に停止させるために、反応停止時にコ
ールドのATPを添加してもよい。 [2]各穴の反応液の一部を等量ずつ、シート状のフィ
ルター、好ましくは、リン酸基が導入されたグラスファ
イバーフィルター上の対応する位置に滴下する。このフ
ィルターをリン酸溶液で5回、エタノールで1回洗浄し
て未反応の[γ-3 3P]- ATPを除いた後、乾燥させ
る。 [3]乾燥後のフィルターにシンチレータ、好ましくは
固形シンチレータシートを重ねて熱融解により浸透さ
せ、再固化後、プレートカウンタで[γ-33P]の放射
活性を定量する。 ここでCaMKKは、本発明明細書の実施例に示す方法
等を用いて調製することができる。本発明の7H−ベン
ズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン
−7−オン誘導体は、前述のように、CaMKKに選択
的な唯一の阻害剤であり、CaMKK阻害作用を指標と
した医薬品のスクリーニング等に用いることができる。
例えば、CaMKKの機能はそもそも不明であるが、当
該化合物を加えることにより、CaMKKの機能を阻害
した細胞培養系を構築することができる。従って、その
ような細胞培養系における生理学的な挙動を調べること
によって、CaMKKの機能を推定することができる。
また、本発明の7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベ
ンズ[de]イソキノリン−7−オン誘導体は、CaM
KKの機能を指標とする種々のスクリーニング系におい
て、陽性、あるいは陰性の対照化合物として用いること
ができる。また、本発明の7H−ベンズイミダゾ−
[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン−7−オン誘
導体は、CaMKKの機能亢進が増悪をもたらす疾患の
治療剤として用いることができる。本発明の7H−ベン
ズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン
−7−オン誘導体は、これを医薬として用いるにあた
り、経口的または非経口的(例えば、静脈内、皮下、も
しくは筋肉内注射、局所的、経直腸的、経皮的、または
経鼻的)に投与することができる。経口投与のための形
態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒
剤、散剤、液剤、シロップ剤または懸濁剤などが挙げら
れ、非経口投与のための形態としては、例えば、注射用
水性剤もしくは油性剤、軟膏剤、クリーム剤、ローショ
ン剤、エアロゾル剤、坐剤、貼付剤などが挙げられる。
これらの製剤は、従来公知の技術を用いて調製され、許
容される通常の担体、賦形剤、結合剤、安定剤等を含有
することができる。また、注射剤で用いる場合には許容
される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することも
できる。本発明の7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]
ベンズ[de]イソキノリン−7−オン誘導体またはそ
の医薬上許容される塩の投与量、投与回数は、症状、年
令、体重、投与形態によって異なるが、通常は成人に対
して本発明化合物の有効成分量として、1日あたり約1
〜2000mg、好ましくは10〜500mgを1回ま
たは数回に分けて投与することができる。
発明はもとよりこれに限定されるものではない。実施例
では、下記の略号が使用されている。 DMSO = ジメチルスルホキシド TFA=トリフルオロ酢酸 実施例1化合物の合成(混合物) 工程13−ブロモ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベン
ズ[de]イソキノリン−7−オンおよび4−ブロモ−
7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イ
ソキノリン−7−オンの混合物 3−ブロモ−1,8−ナフタリンジカルボン酸無水物
(2.79g)とO−フェニレンジアミン(1.10
g)、酢酸(15ml)をO−クロロベンゼン(25m
l)に懸濁させ、100℃で7時間加熱還流した。反応
液を放冷後、結晶を濾取、減圧乾燥した後、標記化合物
(2.49g)を得た。1 H−NMR(d6−DMSO,300MHz)δ:
8.81(m),8.67−8.49(m),8.44
(m),8.25(m),8.04(m),7.86
(m),7.49(m)
ズ[de]イソキノリン−7−オンおよび4−シアノ−
7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イ
ソキノリン−7−オンの混合物 3−ブロモ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベン
ズ[de]イソキノリン−7−オンおよび4−ブロモ−
7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イ
ソキノリン−7−オンの混合物(1.0g)とシアン化
銅(I)(0.31g)をピリジン(7.1ml)に加
え、封管中、150℃で10時間加熱した。反応液を放
冷後、アンモニア水で希釈し沈殿した結晶を濾取した。
濾上物は水で洗液が中性になるまで洗浄し、室温で減圧
乾燥し、標記化合物(1.13g)を得た。1 H−NMR(d6−DMSO,300MHz)δ:
8.78(m),8.61−8.37(m),8.13
(m),7.89(m),7.52(m)
ベンズ[de]イソキノリン−7−オンおよび4−カル
ボキシ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ
[de]イソキノリン−7−オンの混合物 3−シアノ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベン
ズ[de]イソキノリン−7−オンおよび4−シアノ−
7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イ
ソキノリン−7−オンの混合物(100mg)を濃硫酸
(10ml)、水(10ml)、酢酸(5ml)に懸濁
させ、120℃で5時間加熱した。反応液を放冷後、6
0mlの水に注入し、室温で1時間撹伴した。反応懸濁
液をろ過し、濾上物を室温で減圧乾燥して残渣を得た。
これを2%水酸化ナトリウム水溶液に懸濁し、100℃
で1時間撹伴した。反応懸濁液をろ過し、濾液を5%塩
酸水でpHを3に調整した後、酢酸エチルで抽出し有機
層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して
減圧濃縮後、標記化合物(80mg)を得た。1 H−NMR(d6−DMSO,300MHz)δ:
9.31(d,J=7.5Hz),9.03(d,J=
7.5Hz),8.72(m),8.39(m),8.
04−7.85(m),7.48(m)。
ベンズ[de]イソキノリン−7−オンと4−カルボキ
シ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[d
e]イソキノリン−7−オンの分離精製 3−カルボキシ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]
ベンズ[de]イソキノリン−7−オンおよび4−カル
ボキシ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ
[de]イソキノリン−7−オンの混合物(70μg)
をDMSO(1滴)アセトニトリル(7滴)に溶解し、
逆相HPLC条件[カラム,Cosmosil(登録商
標)5C18−AR−II(4.6mm×15cm)、
移動相,アセトニトリル:水:TFA(45:55:
0.05)]で分取し、保持時間10.9分の分画と保
持時間11.7分の分画を得、それぞれを減圧濃縮し、
異性体A(7.5μg)、異性体B(8.1μg)を得
た。
h. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 19320-19324)
は大腸菌(BL21)を用いて以下の条件で発現および精製
した。100μg/ml Ampicillin を含むLB-培地において培
養し600 nmの吸光度が1.2 となった時点において0.1mM
IPTG(終濃度)を加えさらに12-16時間培養した。その
後大腸菌を回収し、超音波破砕した後、その上清をMono
Qカラムに供しNaCl濃度勾配により溶出した。本方法に
より粗精製し、純度約90%の目的とする酵素を得た。
完全精製標品はCaM-セファロースカラムを用いて2mM EG
TAを含む溶出液にて溶出することにより純度約95%以
上の目的とする酵素を得た。酵素標品は50mM HEPES pH
7.5, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA, 1mM DTT, 0.1mM PMSF,4
0% グリセロール, 10% エチレングリコールに溶解して-
30度に保存した。ラットCaMKKβは、文献(Tokumi
tsu, H. et al.(2001), Bio-chemistry 40, 13925-13
932)記載の方法で調製した。
大腸菌(JM109)を用いて以下の条件で発現および精製し
た。100μg/ml Ampicillin を含むLB-培地において培養
し600 nmの吸光度が1.2 となった時点において1mM IPTG
(終濃度)を加えさらに12-16時間培養した。その後大
腸菌を回収し、0.1 mM PMSFを含むPBSに溶かし、超音波
破砕した後、その上清をグルタチオンセファロースに供
した。グルタチオンセファロースを0.1 mM PMSFを含むP
BSにより洗浄し、10 mM グルタチオンを含む50 mM Tris
pH 8.0 溶液にてGST-融合タンパク質を溶出した。本方
法により純度約90%の目的とする酵素を得た。精製標
品は50mM HEPES pH7.5, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTA, 1mM
DTT, 0.1mM PMSF,40% グリセロール, 10% エチレングリ
コールに溶解して-30度に保存した。
ニング) CaMKK(ここではCaMKKαを用いた。)の活性測定は、
[γ-33P]-ATPとCaM-KIを基質とし、CaMKKによるリン酸
化反応でCaM-KIに導入された[γ-33P]の放射活性を測定
することで定量した。以下のアッセイにおいて、各試薬
は、緩衝液(10mM Mg(Ac)2、0.1mM CaCl2、1mM DTTを含
む50mM HEPES(pH7.5))に溶解し、使用した。被検化合
物は、粉末をDMSOに溶解した後、緩衝液で必要濃度に希
釈して使用した。96穴V底プレートの各穴に、種々の濃
度の被検化合物溶液10μl、CaMKK、CaMK-I、カルモジ
ュリンを含む溶液10μl、[γ-33P]-ATP、cold ATPを含
む溶液10μlを順に添加して、反応を開始させた(反応
液総量30μl中の各試薬濃度は、CaMKK:CaMKKストック
液20μl/ml、CaM-KI:67μg/ml、カルモジュリン:1μ
M、[γ-33P]-ATP :6.7μCi/ml(2.2〜6.7nM)、Cold A
TP:0.3μM)。37℃で1時間、リン酸化反応を進行させ
た後、 100mM EDTA、10mM ATPを含む50mM HEPES(pH7.5)
を5μlずつ加えて反応を停止させた。反応停止後、反
応液を15μlずつ、シート状のグラスファイバーフィル
ター(Wallac、filtermat P30)の各穴に対応する位置
に滴下、浸透させた。このフィルターを150mMリン酸溶
液で5回、エタノールで1回洗浄して未反応の[γ-33P]
-ATPを除いた後、乾燥させた。乾燥後のフィルターに固
形シンチレータシートを重ねて熱融解により浸透させ、
再固化後、フィルターに補足されたCaM-KIに導入されて
いる[γ-33P]の放射活性をプレート用カウンタで測定、
定量した。被験化合物の阻害率は、以下の式により算出
した。 阻害率(%)=100×(A−B)/(A−C) A:CaMKK添加、被検化合物非添加の場合の放射活性カウ
ント B:CaMKK添加、被検化合物添加の場合の放射活性カウン
ト C:CaMKK非添加、被検化合物非添加の場合の放射活性カ
ウント(バックグランド) 1化合物につき4〜5種類の濃度で求めた阻害率を解析
して、IC50値を算出した。尚、各濃度においては、N=
3で測定し、平均値を求めた。実施例1、および実施例
2(異性体B)についてIC50値を測定した結果を表1に
示す。
ズ[de]イソキノリン−7−オンおよび4−ブロモ−
7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イ
ソキノリン−7−オンの合成 Bull.Chem.Soc.Jpn. 74, 173 (2001)に記載された方法
を参考に合成した。4−ブロモ−1,8−ナフチル酸無
水物(76.3g)の酢酸(300ml)中に室温下で
O−フェニレンジアミン(30.15g)およびクロロ
ベンゼン(600ml)を加えた後、5時間還流撹拌を
した。反応液を10−15℃に冷却し、結晶を濾取し、
3−ブロモ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベン
ズ[de]イソキノリン−7−オンおよび4−ブロモ−
7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イ
ソキノリン−7−オンの混合物(一番晶:80.2g,
二番晶:11.1g)を得た。一番晶およびほぼ同一組
成の結晶(103.99g)を数バッチに分けてクロロ
ホルムで再結晶を繰り返し、4−ブロモ−7H−ベンズ
イミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン−
7−オン(14.99g)を得た。二番晶およびほぼ同
一組成の結晶(33.75g)をあわせて数バッチに分
けてクロロホルムを用いてカラムクロマト精製を繰り返
し、3−ブロモ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]
ベンズ[de]イソキノリン−7−オン(1.16g)
を得た。それぞれの異性体の構造は、1H-NMRデータを
取得し、上記文献記載のデータと比較することで確認し
た。
ズ[de]イソキノリン−7−オン
[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン−7−オン
(1.13g)とシアン化銅(I)(0.47g)をピ
リジン(10ml)に加え、封管中、150℃で20時
間加熱した。反応液を放冷後、アンモニア水で希釈し沈
殿した結晶を濾取した。濾上物は水で洗液が中性になる
まで洗浄し、室温で減圧乾燥し、標記化合物を3−ブロ
モ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[d
e]イソキノリン−7−オンとの混合物として得た。収
量0.45g。HPLC面百値 83.5%(3−シア
ノ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[d
e]イソキノリン−7−オン)。1 H−NMR(d6−DMSO,300MHz)δ:
8.84−8.80(2H,m),8.62(1H,d
d,J=8.0,1.0Hz),8.51(1H,d,J
=7.5Hz),8.46−8.43(1H,m),
8.18(1H,d,J=7.5,1.0Hz),7.
94(1H,m),7.54(2H,m) 工程23−カルボキシ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]
ベンズ[de]イソキノリン−7−オン
ズ[de]イソキノリン−7−オン(0.45g)を濃
硫酸(5ml)、水(5ml)、酢酸(2.5ml)に
懸濁させ、3時間加熱還流した。反応液を放冷後、27
0mlの水に注入し、反応懸濁液をろ取して残渣を得
た。これを2%水酸化ナトリウム水溶液に加熱溶解して
不溶物を吸引ろ過により除いた。濾液を5%塩酸水でp
Hを2に調整した後、析出した結晶をろ取した。得られ
た粗結晶を酢酸で再結晶し、標記化合物(0.36g)
を得た。本化合物は、実施例2の異性体BとHPLC溶
出時間保持時間が完全に一致した。本化合物は、1モル
の酢酸を含む。1 H−NMR(d6−DMSO,300MHz)δ:
9.33(1H,d,J=8.0Hz),8.84−
8.76(2H,m),8.45(2H,m),8.0
6(1H,m),7.92(1H,m),7.54(2
H,m),1.91(3H,s)
ズ[de]イソキノリン−7−オン
[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン−7−オン
(6.90g)とシアン化銅(I)(2.18g)をピ
リジン(40ml)に加え、封管中、150℃で20時
間加熱した。反応液を放冷後、アンモニア水で希釈し沈
殿した結晶を濾取した。濾上物は水で洗液が中性になる
まで洗浄し、室温で減圧乾燥し、粗シアノ体(4.60
g)を得た。粗シアノ体(0.8g)をカラムクロマト
グラフィーで分離精製し、精シアノ体0.57gを得
た。1 H−NMR(d6−DMSO,300MHz)δ:
8.89(1H,d,J=8.0Hz),8.76(1
H,d,J=7.5Hz),8.56(1H,d,J=
7.5Hz),8.48(1H,d、J=8.0H
z),8.43(1H,m),8.16(1H,m),
7.90(1H,m),7.54(2H,m) 工程24−カルボキシ−7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]
ベンズ[de]イソキノリン−7−オン
ズ[de]イソキノリン−7−オン(992mg)を濃
硫酸(10ml)、水(10ml)、酢酸(5ml)に
懸濁させ、1時間加熱還流した。反応液を放冷後、60
0mlの水に注入してろ過し、濾上物を室温で減圧乾燥
して残渣を得た。これを2%水酸化ナトリウム水溶液に
溶解し、1時間加熱還流した。反応懸濁液をろ過し、濾
液を5%塩酸水でpHを3に調整した後、析出した結晶
をろ取し、酢酸で再結晶した後、標記化合物(179m
g)を得た。本化合物は、実施例2の異性体AとHPL
C保持時間が完全に一致した。1 H−NMR(d6−DMSO,300MHz)δ:
9.06(1H,d,J=8.5Hz),8.82(1
H,d,J=7.5Hz),8.76(1H,d,J=
7.5Hz),8.46−8.39(2H,m),8.
01(1H,m),7.90(1H,m),7.51
(2H,m)
例8の化合物のCaMKK阻害活性を測定した。結果を
表2に示した。
た。)に対する阻害作用を測定した。CaMKK(0.28 μg/m
l)の活性測定は、100 μM[γ-32P]-ATPと100 μg GST-C
aM-KI (1-293, K49E)を基質とし、CaMKKによるリン酸化
反応でGST-CaM-KIに導入された[γ-32P]の放射活性を測
定することで定量した。反応溶液は10mM Mg(Ac)2、1mM
CaCl2、1mMジチオトレイトール, 3 μM カルモデュリン
を含む50mM HEPES(pH7.5))使用し、反応時間は5 分間
である。被験化合物(実施例1の化合物)は、粉末をDM
SOに溶解した後、DMSOで必要濃度に希釈して終濃度4%
DMSO存在下の条件でCaMKKの活性を測定した。反応は2
5μl反応溶液のうち15μlをP-81 Phosphocellurose フ
ィルターにスポットすることにより終了させ、75 mM リ
ン酸溶液にて十分に洗浄し、遊離の[γ-32P]-ATPを除去
後乾燥させ放射活性をシンチレーションカウンターによ
り測定し、CaM-KK活性とした。
(0.57 μM) 活性測定は100 μM[γ-32P]-ATPと40 μM s
yntide-2を基質とし、それぞれのCaM依存性キナーゼ
によるリン酸化反応でsyntide-2に導入された[γ-32P]
の放射活性を測定することで定量した。反応溶液は10mM
Mg(Ac)2、1mM CaCl2、1mM DTT, 3 μM カルモデュリン
を含む50mM HEPES(pH7.5))使用し反応時間は5 分間で
ある。被験化合物(実施例1の化合物)は、粉末をDMSO
に溶解した後、DMSOで必要濃度に希釈して終濃度4%DM
SO存在下の条件(CaM-KK 活性測定と同条件)でCaM-KI,
CaM-KII, CaM-KIVの活性を測定した。反応は25μl反
応溶液のうち15μlをP-81 Phosphocellurose フィルタ
ーにスポットすることにより終了させ、75 mM リン酸溶
液にて十分に洗浄し、遊離の[γ-32P]-ATPを除去後乾燥
させ放射活性をシンチレーションカウンターにより測定
し、CaM-KI, CaM-KII, CaM-KIV 活性とした。結果を表
3に示した。
-KKβ(0.5μg/ml)と、10または100μgのGST-CaM-K I
(1-293, K49E)を、30℃で5分間、50mM HEPES(pH 7.
5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、50または100μM [γ-32
P]ATPを含む溶液(25μl)中で、1mM CaCl2/2または3μM
カルモジュリン(CaM)の存在下、種々の濃度の、実施
例7の化合物(最終濃度:0-10μg/ml 4%DMSO溶液)と
共にインキュベートした。酵素反応は、[γ-32P]ATP を
加えることによって開始し、ホスホセルロース紙(What
man P-81)上に 15μlをスポットすることによって終
了させ、これを75mM リン酸で数回洗浄した。GST-CaM-K
I (1-293, K49E)への取り込みは、フィルターの液体シ
ンチレーションカウントを測定することによって定量し
た。結果を表4に示した。
効果 CaMK Iは、実施例10と同様に調製した。CaMIIは文献
(Tokumitsu et al. (1990)J. Biol. Chem. 265, 431
5-4320)に記載の方法で調製した。CaMIVは文献( Bric
key, D.A., et al.(1990)Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 173, 578-584)に記載の方法で調製した。CaM-K
I(2.5μg/ml)、CaM-K II(0.75μg/ml)、CaM-K IV(9μ
g/ml)、またはMLCK(広島大学、Dr. Hiroshi Hosoya
より分与,0.6μg/ml)と、40μM Syntide-2(MLCKにつ
いては、50μM MLCペプチド)を、30℃で5分間、50mM
HEPES (pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、50または1
00μM [γ-32P]ATPを含む溶液(25μl)中で、1mM CaCl2/
2または3μM カルモジュリン(CaM)の存在下、種々の
濃度の実施例7の化合物(最終濃度:0-10μg/ml 4%DM
SO溶液)と共にインキュベートした。プロテインキナー
ゼ活性は、実施例10に記載されたホスホセルロースフ
ィルター法で測定した。
阻害効果 PKA(Promega、8μg/ml)、PKC(Promega、25ng/ml)、また
はp42MAPキナーゼ(upstate biotechnology、2μg/ml)
を、それぞれ100μM Kemptamide(PKA基質)、100μM
Neurograninペプチド(PKC基質;プロメガ製)、また
は0.4mg/ml Myelin basic protein(p42 MAPキナー
ゼ基質)と、30℃で5分間、50mM HEPES(pH 7.5)、10 mM
Mg(Ac)2、1 mM DTT、50μM [γ-32P]ATP (4500cpm/pmo
l)を含む溶液(25μl)中で、1mM CaCl2/0.4μg/ml ホス
ファチジルセリンおよび0.1mg/ml BSAの存在下(PK
C)、あるいは非存在下(PKAおよびp42MAPキナーゼ)
に、種々の濃度の実施例7の化合物(最終濃度:0-10μ
g/ml 4%DMSO溶液)と共にインキュベートした。プロテ
インキナーゼ活性は、実施例10に記載されたホスホセ
ルロースフィルター法で測定した。結果を表4に示し
た。
果 Ca2+/CaM-非依存型CaMK-IV(305HMDT-DEDD)、機能不全
変異型CaMK-IV(305HMDT-DEDD、K71E)、恒常的活性型C
aM-KK(1-434)のcDNAを含むリコンビナントアデノウイ
ルスは以下のように調製した。すなわち、pME18sプラス
ミド中のcDNAを制限酵素で切り出し、末端を平滑化して
pShuttle(Clontech)中に組み込んだ。Adeno-X発現シ
ステム(Clontech)を用いて添付のプロトコールに従
い、HEK293細胞よりリコンビナントウイルスが得られ
た。6穴培養プレートに播種してコンフルエントになっ
たSY5Y細胞に、上記のように得られたリコンビナントウ
イルスを種々の組み合わせで、37℃1時間、10プラーク
形成単位/Cellの感染多重度(M.O.I.)で感染させた。
感染後、ウイルスは吸引除去し、細胞は更に10%FBSを含
むRPMI培地で12時間培養した。その後細胞を6時間、種
々の濃度の実施例7の化合物(最終濃度:0-10μg/ml
0.5%DMSO溶液)の存在あるいは非存在下に無血清状態で
培養した。細胞を1μM イオノマイシン存在下あるいは
非存在下で10分間刺激した後、溶解し、抽出物をSDS-7.
5% PAGEに供した。これに抗CaM-K IV抗体(1:2000、Tra
nsduction Lab.)または抗phosphoThr286CaM-KII抗体
(熊本大 Dr.Koji Fukunagaより供与)を用いてウエス
タン・ブロッティングを行った。フィルム上のCaM-K IV
の免疫反応性バンドをデンシトメーターでスキャンして
数値化し、化合物1がCaM-K IVの活性型形成に及ぼす効
果を定量した。結果を図1に示した。この結果から、実
施例7の化合物は細胞膜透過性を有し、ヒト神経芽細胞
腫の細胞内で内因性CaM-KKに対しても阻害作用を示すこ
とがわかる。
1a]ベンズ[de]イソキノリン−7−オン誘導体ま
たはその塩は、その高い選択性のために、CaMKKの
生理作用を解明するために有用である。更に、本発明の
化合物は、高い選択性を示すため、生体内で重要な役割
を果たしている他の種類のカルシウム/カルモジュリン
依存性キナーゼ類を阻害することがない。従ってCaM
KK由来の病態のみを改善する薬剤の有効成分となり得
る。上記のように本発明により、選択的なカルシウム/
カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼの阻害剤を提供
することが可能になった。
に発現させたCa2+/CaM-非依存型CaM-KIVが、細胞内でCa
M-KKにより確かに活性型になる(リン酸化される)こと
を示す。Bは、ヒト神経芽細胞腫において遺伝子組み込
みにより発現されたCa2+/CaM-非依存型CaM-KIVが内因性
CaM-KKにより活性化(リン酸化)され、実施例7の化合
物がそれを濃度依存的に阻害していることを示す。C
は、CaM-KIIのリン酸化に対しては、実施例7の化合物
の阻害作用が弱く、その阻害作用がCaMKK特異的である
ことを示す。
Claims (7)
- 【請求項1】式(I): 【化1】 [式中、R1、およびR2は、独立して、水素原子、ハ
ロゲン原子、アルキル基、またはハロアルキル基のいず
れかである。R3は水素原子、アルキル基、または置換
アルキル基を表し、COOR3基はナフタレン環のどの
位置に置換していてもよい。]で表される、7H−ベン
ズイミダゾ−[2,1a]ベンズ[de]イソキノリン
−7−オン誘導体、またはその薬学上許容される塩を有
効成分として含有するカルシウム/カルモジュリン依存
性キナーゼキナーゼ阻害剤。 - 【請求項2】R1およびR2が水素原子である、請求項
1記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキ
ナーゼ阻害剤。 - 【請求項3】R3が水素原子である、請求項1または2
記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナ
ーゼ阻害剤。 - 【請求項4】式(II): 【化2】 [式中、R1、R2、およびR3は、式(I)と同義であ
る。]で表される7H−ベンズイミダゾ−[2,1a]
ベンズ[de]イソキノリン−7−オン誘導体、または
その薬学上許容される塩を、有効成分として含有するカ
ルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ阻害
剤。 - 【請求項5】R1およびR2が水素原子である、請求項
3記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキ
ナーゼ阻害剤。 - 【請求項6】R3が水素原子である、請求項3または4
記載のカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼキナ
ーゼ阻害剤。 - 【請求項7】[γ−33P]−ATPを基質のリン酸化
源として用いて酵素反応を行い、リン酸化された基質を
フィルターに吸着させてその放射活性を測定することを
特徴とする、カルシウム/カルモジュリン依存性キナー
ゼキナーゼ(CaMKK)阻害剤のハイスループットス
クリーニング方法。
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