JP2003012503A - 脂質ベシクルおよび遺伝子を固定化する方法 - Google Patents
脂質ベシクルおよび遺伝子を固定化する方法Info
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- JP2003012503A JP2003012503A JP2001190515A JP2001190515A JP2003012503A JP 2003012503 A JP2003012503 A JP 2003012503A JP 2001190515 A JP2001190515 A JP 2001190515A JP 2001190515 A JP2001190515 A JP 2001190515A JP 2003012503 A JP2003012503 A JP 2003012503A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】従来の遺伝子キャリアとして使用されるリポソ
ームが安定性、代謝性に問題があり、また高価でありＤ
ＤＳとして利用しにくいという問題を解決し、安定性、
代謝性に優れ、安価なＤＤＳとしての脂質ベシクルと遺
伝子を固定化する方法を提供する。 【解決手段】脂質ベシクルを構成する人工脂質にカチオ
ン性ペプチド脂質を加え、脂質ベシクルの表面をプラス
極性にしてＤＮＡを付着しやすくするとともに、プラス
ミド遺伝子にヒストン等の核酸結合性タンパクを加えて
遺伝子導入効率を高めた上で、脂質ベシクルに遺伝子を
固定化する方法により、安定性、代謝性に優れ、安価で
かつ遺伝子導入効率の高い遺伝子固定化方法を実現す
る。
ームが安定性、代謝性に問題があり、また高価でありＤ
ＤＳとして利用しにくいという問題を解決し、安定性、
代謝性に優れ、安価なＤＤＳとしての脂質ベシクルと遺
伝子を固定化する方法を提供する。 【解決手段】脂質ベシクルを構成する人工脂質にカチオ
ン性ペプチド脂質を加え、脂質ベシクルの表面をプラス
極性にしてＤＮＡを付着しやすくするとともに、プラス
ミド遺伝子にヒストン等の核酸結合性タンパクを加えて
遺伝子導入効率を高めた上で、脂質ベシクルに遺伝子を
固定化する方法により、安定性、代謝性に優れ、安価で
かつ遺伝子導入効率の高い遺伝子固定化方法を実現す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、癌治療や遺伝子治
療のためのＤＤＳにおける、薬物キャリアとして有用な
脂質ベシクル（脂質分子膜からなる閉鎖小胞体）および
脂質ベシクルへの遺伝子の固定化方法に関するものであ
る。
療のためのＤＤＳにおける、薬物キャリアとして有用な
脂質ベシクル（脂質分子膜からなる閉鎖小胞体）および
脂質ベシクルへの遺伝子の固定化方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】ＤＤＳに使用される非ウィルス性キャリ
アとしては、脂質膜成分の５０％以上（現実的にはほぼ
全て）が天然リン脂質よりなるリポソームであり、これ
らは逆相蒸発法あるいは超音波照射法などによって調製
されている。このリポソームに、核酸結合性タンパクで
ある商品名リポフェクトアミンプラス試薬（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ社製）により処理されたＤＮＡを付着させ、遺
伝子キャリアとして用いる。しかしながらこれらのリポ
ソームは、リポソームの安定性が悪い、代謝性が悪
い、という問題を有する。また、リポソームおよびリポ
フェクトアミンプラス試薬は高価である。
アとしては、脂質膜成分の５０％以上（現実的にはほぼ
全て）が天然リン脂質よりなるリポソームであり、これ
らは逆相蒸発法あるいは超音波照射法などによって調製
されている。このリポソームに、核酸結合性タンパクで
ある商品名リポフェクトアミンプラス試薬（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ社製）により処理されたＤＮＡを付着させ、遺
伝子キャリアとして用いる。しかしながらこれらのリポ
ソームは、リポソームの安定性が悪い、代謝性が悪
い、という問題を有する。また、リポソームおよびリポ
フェクトアミンプラス試薬は高価である。
【０００３】一方、人工脂質により構成されるベシクル
が、薬物キャリアとして提案されている。しかし、脂質
ベシクルは外部がマイナス極性であり、同じくマイナス
極性であるＤＮＡを付着させにくい。従って、従来の脂
質ベシクルではＤＮＡの付着効率が悪く、遺伝子キャリ
アとして遺伝子治療等に使用するのは困難である。
が、薬物キャリアとして提案されている。しかし、脂質
ベシクルは外部がマイナス極性であり、同じくマイナス
極性であるＤＮＡを付着させにくい。従って、従来の脂
質ベシクルではＤＮＡの付着効率が悪く、遺伝子キャリ
アとして遺伝子治療等に使用するのは困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安定
性、代謝性に優れ、安価でかつ遺伝子キャリアとして効
果的な脂質ベシクルおよびその脂質ベシクルへの遺伝子
固定化方法を提供することにある。
性、代謝性に優れ、安価でかつ遺伝子キャリアとして効
果的な脂質ベシクルおよびその脂質ベシクルへの遺伝子
固定化方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上述の目的を達成するた
め、本発明に係る脂質ベシクルは、カチオン性ペプチド
脂質を含む人工脂質より構成されるものである。カチオ
ン性ペプチド脂質を加えることにより、脂質ベシクルの
外表面がプラス極性となり、マイナス極性であるＤＮＡ
を効率的に固定化できる。また、上述の目的を達成する
ため、本発明に係る遺伝子を固定化する方法は、核酸結
合性タンパクにより処理されたＤＮＡを、カチオン性ペ
プチド脂質を含む脂質ベシクルに混合し、ＤＮＡを脂質
ベシクルに付着させるものである。ここで、核酸結合性
タンパクとして、ヒストン、プロタミン又はポリＬリジ
ンを用いれば、少ないコストで効率的に本発明を適用で
き、さらに、ヒストン、プロタミン、ポリＬリジンを適
宜組み合わせて使用すれば遺伝子の導入効率は高まる。
め、本発明に係る脂質ベシクルは、カチオン性ペプチド
脂質を含む人工脂質より構成されるものである。カチオ
ン性ペプチド脂質を加えることにより、脂質ベシクルの
外表面がプラス極性となり、マイナス極性であるＤＮＡ
を効率的に固定化できる。また、上述の目的を達成する
ため、本発明に係る遺伝子を固定化する方法は、核酸結
合性タンパクにより処理されたＤＮＡを、カチオン性ペ
プチド脂質を含む脂質ベシクルに混合し、ＤＮＡを脂質
ベシクルに付着させるものである。ここで、核酸結合性
タンパクとして、ヒストン、プロタミン又はポリＬリジ
ンを用いれば、少ないコストで効率的に本発明を適用で
き、さらに、ヒストン、プロタミン、ポリＬリジンを適
宜組み合わせて使用すれば遺伝子の導入効率は高まる。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の実施の形態を図１を用い
て説明する。付着する遺伝子には、プラスミド遺伝子と
してｐｃＤＮＡ３を骨格とし、レポータージーンとして
ルシフェラーゼ発現遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３−
ｌｕｃｉを用いた。このプラスミドＤＮＡを核酸結合性
タンパクによりプラスリージェント（核酸結合性タンパ
クと核移行シグナルの結合体）処理を行った。ベシクル
は構成脂質に２０〜３０重量％のカチオン性ペプチド脂
質（ＣＰＬ）を混合することで、カチオン性脂質含有脂
質ベシクルとして調製した。ここで用いたカチオン性ペ
プチド脂質は、Ｎ＋Ｃ５Ａｌａ２Ｃ１６である。このベ
シクルをプラスリージェント処理を行ったプラスミドＤ
ＮＡと混合し、遺伝子をベシクルに固定化した。このプ
ラスミド−脂質ベシクル複合体をターゲット細胞に接触
させることにより、ターゲット細胞において遺伝子を機
能させ、形質転換を行った。
て説明する。付着する遺伝子には、プラスミド遺伝子と
してｐｃＤＮＡ３を骨格とし、レポータージーンとして
ルシフェラーゼ発現遺伝子を組み込んだｐｃＤＮＡ３−
ｌｕｃｉを用いた。このプラスミドＤＮＡを核酸結合性
タンパクによりプラスリージェント（核酸結合性タンパ
クと核移行シグナルの結合体）処理を行った。ベシクル
は構成脂質に２０〜３０重量％のカチオン性ペプチド脂
質（ＣＰＬ）を混合することで、カチオン性脂質含有脂
質ベシクルとして調製した。ここで用いたカチオン性ペ
プチド脂質は、Ｎ＋Ｃ５Ａｌａ２Ｃ１６である。このベ
シクルをプラスリージェント処理を行ったプラスミドＤ
ＮＡと混合し、遺伝子をベシクルに固定化した。このプ
ラスミド−脂質ベシクル複合体をターゲット細胞に接触
させることにより、ターゲット細胞において遺伝子を機
能させ、形質転換を行った。
【０００７】
【実施例１】本実施例では、脂質ベシクルとして粒径が
１μｍ以上のいわゆるマイクロサイズベシクルを用い
た。主成分としてソルビタンオレイン酸モノエステル
（商品名「スパン８０」和光純薬製）を使用している。
ここで、本発明に係る脂質ベシクルには構成脂質に対し
て３０重量％の割合のＣＰＬを調整してある。生成され
たベシクル含有溶液を適宜生理食塩水で希釈しながら用
いてプラスミドＤＮＡと混合し、脂質ベシクルに遺伝子
を固定化させて、これをターゲット細胞であるＨｅＬａ
細胞に３時間作用させた。その後、４８時間おいた後、
基質物質を加え、その発色を測定した。遺伝子にはルシ
フェラーゼ発現遺伝子を組み込んでいるため、導入され
た遺伝子が機能し、ルシフェラーゼを発現すれば、基質
物質と反応して発色する。
１μｍ以上のいわゆるマイクロサイズベシクルを用い
た。主成分としてソルビタンオレイン酸モノエステル
（商品名「スパン８０」和光純薬製）を使用している。
ここで、本発明に係る脂質ベシクルには構成脂質に対し
て３０重量％の割合のＣＰＬを調整してある。生成され
たベシクル含有溶液を適宜生理食塩水で希釈しながら用
いてプラスミドＤＮＡと混合し、脂質ベシクルに遺伝子
を固定化させて、これをターゲット細胞であるＨｅＬａ
細胞に３時間作用させた。その後、４８時間おいた後、
基質物質を加え、その発色を測定した。遺伝子にはルシ
フェラーゼ発現遺伝子を組み込んでいるため、導入され
た遺伝子が機能し、ルシフェラーゼを発現すれば、基質
物質と反応して発色する。
【０００８】この結果を示すのが、図２及び図３であ
る。縦軸はルシフェラーゼの活性量を表示し、この値が
高いほど導入された遺伝子が機能して、ターゲット細胞
で形質転換が生じていることを示す。図中でＬ‘ＡＭＩ
ＮＥと記されているのは比較例であり、リポフェクトア
ミンプラス試薬で処理されたプラスミドをリポソームに
結合させたものの結果である。図２中でＳｐａｎ８０
Ｖｅｓｉｃｌｅと示されるのはＣＰＬを混合していない
脂質ベシクルの実験値である。これによると、ＣＰＬな
しベシクルでは、遺伝子導入が十分に行われていない。
一方、ＣＰＬ入りベシクルでは、遺伝子導入がよく行わ
れ、希釈の程度を適切にすることによりリポソームと同
等以上の働きを有する。
る。縦軸はルシフェラーゼの活性量を表示し、この値が
高いほど導入された遺伝子が機能して、ターゲット細胞
で形質転換が生じていることを示す。図中でＬ‘ＡＭＩ
ＮＥと記されているのは比較例であり、リポフェクトア
ミンプラス試薬で処理されたプラスミドをリポソームに
結合させたものの結果である。図２中でＳｐａｎ８０
Ｖｅｓｉｃｌｅと示されるのはＣＰＬを混合していない
脂質ベシクルの実験値である。これによると、ＣＰＬな
しベシクルでは、遺伝子導入が十分に行われていない。
一方、ＣＰＬ入りベシクルでは、遺伝子導入がよく行わ
れ、希釈の程度を適切にすることによりリポソームと同
等以上の働きを有する。
【０００９】
【実施例２】本発明の第２の実施例として、脂質ベシク
ルとして粒径が１００ｎｍ以下のいわゆるナノサイズベ
シクルを用いた。その結果を図４に示す。ナノサイズベ
シクルの場合でも遺伝子キャリアとして機能しているこ
とがわかる。ターゲット細胞としてＨｅＬａ細胞以外に
ＭＤＡＭＢ−４６８（ヒト乳がん細胞）、ＣＨＯ（チャ
イニーズハムスター卵巣細胞）、ＣＯＳ７（アフリカミ
ドリザル腎臓由来細胞）に対しても実験したが、それぞ
れにおいて遺伝子キャリアとして機能していることが確
認された。
ルとして粒径が１００ｎｍ以下のいわゆるナノサイズベ
シクルを用いた。その結果を図４に示す。ナノサイズベ
シクルの場合でも遺伝子キャリアとして機能しているこ
とがわかる。ターゲット細胞としてＨｅＬａ細胞以外に
ＭＤＡＭＢ−４６８（ヒト乳がん細胞）、ＣＨＯ（チャ
イニーズハムスター卵巣細胞）、ＣＯＳ７（アフリカミ
ドリザル腎臓由来細胞）に対しても実験したが、それぞ
れにおいて遺伝子キャリアとして機能していることが確
認された。
【００１０】
【実施例３】本発明の第３の実施例として、核酸結合性
タンパクにヒストン、プロタミン又はポリＬリジンを使
用した例を示す。これらの核酸結合性タンパクは、リポ
フェクトアミンプラス試薬に比べて安価で入手しやす
い。図５にヒストンを用いたときの結果を示すが、濃度
を適切に調整して使用すれば、高価なリポフェクトアミ
ンプラス試薬と比べても、同等以上の効果を有すること
がわかる。さらにヒストン、プロタミン及びポリＬリジ
ンはそれぞれ単独で用いるよりも組み合わせて使用すれ
ば、より効果的である。組み合わせを変えて実験した結
果を図６に示す。これより、プロタミンとポリＬリジン
の組み合わせ、およびヒストン、プロタミン、ポリＬリ
ジンの組み合わせが特に優れていることがわかる。これ
は、ＣＰＬ入りベシクルとしてマイクロサイズを用いた
ときでも、ナノマイクロサイズを用いたときでも同様で
ある。
タンパクにヒストン、プロタミン又はポリＬリジンを使
用した例を示す。これらの核酸結合性タンパクは、リポ
フェクトアミンプラス試薬に比べて安価で入手しやす
い。図５にヒストンを用いたときの結果を示すが、濃度
を適切に調整して使用すれば、高価なリポフェクトアミ
ンプラス試薬と比べても、同等以上の効果を有すること
がわかる。さらにヒストン、プロタミン及びポリＬリジ
ンはそれぞれ単独で用いるよりも組み合わせて使用すれ
ば、より効果的である。組み合わせを変えて実験した結
果を図６に示す。これより、プロタミンとポリＬリジン
の組み合わせ、およびヒストン、プロタミン、ポリＬリ
ジンの組み合わせが特に優れていることがわかる。これ
は、ＣＰＬ入りベシクルとしてマイクロサイズを用いた
ときでも、ナノマイクロサイズを用いたときでも同様で
ある。
【００１１】
【発明の効果】以上、本発明の脂質ベシクル及び遺伝子
の固定化方法により、安定性、代謝性に優れ、安価でか
つ遺伝子導入効率の高い遺伝子キャリアおよび遺伝子の
固定方法が実現できる。
の固定化方法により、安定性、代謝性に優れ、安価でか
つ遺伝子導入効率の高い遺伝子キャリアおよび遺伝子の
固定方法が実現できる。
【図１】本発明に係る遺伝子を固定化する方法の説明図
である。
である。
【図２】本発明をマイクロサイズベシクルに適用した結
果を示すグラフである。
果を示すグラフである。
【図３】同グラフのさらに詳細なグラフである。
【図４】本発明をナノサイズベシクルに適用した結果を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図５】ヒストンを用いて本発明を適用した結果を示す
グラフである。
グラフである。
【図６】核酸結合性タンパクの各種組み合わせを比較し
た結果を示すグラフである。
た結果を示すグラフである。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(72)発明者 平家 勇司
愛媛県松山市堀之内13番地国立病院四国が
んセンター内
(72)発明者 久枝 良雄
福岡県福岡市東区箱崎６丁目10番１号九州
大学大学院工学研究院応用化学部門内
(72)発明者 高嶋 成光
愛媛県松山市堀之内13番地国立病院四国が
んセンター内
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 EA04 GA11 HA17
4C076 AA19 AA95 CC27 DD08 DD46
EE41A FF02 FF68
4C084 AA13 MA24 NA13 ZB261
Claims (9)
- 【請求項１】カチオン性ペプチド脂質を含む人工脂質よ
り構成される脂質ベシクル。 - 【請求項２】ソルビタンエステルとカチオン性ペプチド
脂質を含む脂質ベシクル。 - 【請求項３】ソルビタンエステルとしてソルビタンオレ
イン酸モノエステルを含む請求項１又は請求項２に記載
の脂質ベシクル。 - 【請求項４】カチオン性ペプチド脂質の全脂質に対する
割合が２０〜３０重量％である請求項１乃至請求項３に
記載の脂質ベシクル。 - 【請求項５】プラスミド遺伝子をカチオン性ペプチド脂
質を含む人工脂質より構成される脂質ベシクルと混合す
ることにより、脂質ベシクルに遺伝子を固定化する方
法。 - 【請求項６】プラスミド遺伝子に核酸結合性タンパクを
加え、カチオン性ペプチド脂質を含む人工脂質より構成
される脂質ベシクルと混合することにより、脂質ベシク
ルに遺伝子を固定化する方法。 - 【請求項７】前記核酸結合性タンパクは、ヒストン、プ
ロタミン及びポリＬリジンからなる群から選ばれること
を特徴とする請求項６に記載の遺伝子を固定化する方
法。 - 【請求項８】前記核酸結合性タンパクは、ヒストン、プ
ロタミン及びポリＬリジンからなる群から選ばれる２つ
以上の核酸結合性タンパクの組み合わせであることを特
徴とする請求項６に記載の遺伝子を固定化する方法。 - 【請求項９】請求項５乃至請求項８に記載の遺伝子を固
定化する方法により遺伝子を固定化した脂質ベシクル。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001190515A JP2003012503A (ja) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | 脂質ベシクルおよび遺伝子を固定化する方法 |
| PCT/JP2002/006312 WO2003000291A1 (en) | 2001-06-22 | 2002-06-24 | Lipid vesicles, process for producing lipid vesicles and method of immobilizing gene on lipid vesicles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001190515A JP2003012503A (ja) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | 脂質ベシクルおよび遺伝子を固定化する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003012503A true JP2003012503A (ja) | 2003-01-15 |
Family
ID=19029275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001190515A Pending JP2003012503A (ja) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | 脂質ベシクルおよび遺伝子を固定化する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003012503A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010193875A (ja) * | 2009-02-26 | 2010-09-09 | Keiichi Kato | 遺伝子導入ベクターとしての非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０二重ベシクルの調製と遺伝子導入機能 |
| JP2023513132A (ja) * | 2020-02-05 | 2023-03-30 | コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ | 吸入送達のための核酸又はタンパク質を担持した肺サーファクタント粒子及びその製造方法 |
-
2001
- 2001-06-22 JP JP2001190515A patent/JP2003012503A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010193875A (ja) * | 2009-02-26 | 2010-09-09 | Keiichi Kato | 遺伝子導入ベクターとしての非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０二重ベシクルの調製と遺伝子導入機能 |
| JP2023513132A (ja) * | 2020-02-05 | 2023-03-30 | コリア アドバンスド インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジィ | 吸入送達のための核酸又はタンパク質を担持した肺サーファクタント粒子及びその製造方法 |
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