JP2003002895A - Method for synthesizing nucleic acid - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To synthesize a nucleic acid promptly and accurately. SOLUTION: In this method for synthesizing the nucleic acid, the nucleic acid is synthesized without protecting a base part thereof, and nucleotides are subjected to a condensation reaction in the presence of a proton donor.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業の利用分野】本発明は、核酸の合成法に関し、特
に核酸の塩基部分を保護せずに当該核酸を合成する核酸
の合成法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for synthesizing a nucleic acid, and more particularly to a method for synthesizing a nucleic acid which does not protect the base portion of the nucleic acid.

【０００２】[0002]

【従来の技術】核酸の合成法は、核酸を人工的に合成す
る技術であり、例えば、ある特定のＤＮＡプライマーを
人工的に合成する際に必要な技術である。また、ＰＣＲ
を用いれば、人工のＤＮＡプライマーを使って目的とす
る遺伝子を増幅することもできる。2. Description of the Related Art A method for synthesizing a nucleic acid is a technique for artificially synthesizing a nucleic acid, for example, a technique required for artificially synthesizing a specific DNA primer. Also, PCR
Using, it is also possible to amplify the target gene using an artificial DNA primer.

【０００３】核酸合成の骨子は、保護基をつけたヌクレ
オチドのリン酸基を活性化して、他のヌクレオチドの水
酸基とリン酸エステル結合させることである。The essence of nucleic acid synthesis is to activate the phosphate group of a nucleotide having a protecting group to form a phosphate ester bond with the hydroxyl group of another nucleotide.

【０００４】現在までに、核酸の合成法として、ホスホ
ルアミダイト法が良く知られている。ホスホルアミダイ
ト法は、固相法の一種であり、ポリスチレンなどの固体
(支持体)にヌクレオチドを結合させ、それを鎖伸長して
いくことによって合成中間体の単離を簡単にする方法で
ある。この方法は、反応に用いた試薬、過剰のヌクレオ
チドなどは支持体を洗浄するだけで除去される利点があ
る。合成され支持体についている目的物は、最後に支持
体から切り離されクロマトグラフィーなどで精製され
る。To date, the phosphoramidite method has been well known as a method for synthesizing nucleic acids. The phosphoramidite method is a type of solid-phase method, and is a solid such as polystyrene.
This is a method for simplifying the isolation of synthetic intermediates by binding nucleotides to a (support) and extending the chain. This method has an advantage that reagents used in the reaction, excess nucleotides, etc. are removed only by washing the support. The target compound synthesized and attached to the support is finally separated from the support and purified by chromatography or the like.

【０００５】また最近では、核酸塩基部位に保護基を使
用しない条件下、ＤＮＡオリゴマーを構築できる塩基部
位無保護アミダイト法が知られている。Recently, there has been known a base site-unprotected amidite method capable of constructing a DNA oligomer under the condition that a protecting group is not used at the nucleic acid base site.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述の
ホスホルアミダイト法は、核酸塩基部のアミノ基にアシ
ル型の保護基を使用することを前提とする。このため、
最終目的物を得るためにこの保護基を脱保護する必要が
あり、一般に脱保護を55℃で長時間のアンモニア処理を
行っている。しかし、このアンモニア処理のような塩基
性の条件を用いると、標的化合物が不安定な場合、目的
物が分解し、合成収率、純度の低下をもたらす。However, the above phosphoramidite method is premised on the use of an acyl-type protecting group for the amino group of the nucleic acid base moiety. For this reason,
This protecting group needs to be deprotected in order to obtain the final product, and deprotection is generally carried out by treating with ammonia at 55 ° C for a long time. However, when basic conditions such as this ammonia treatment are used, when the target compound is unstable, the target compound is decomposed, resulting in a decrease in synthetic yield and purity.

【０００７】また、塩基部が保護されたヌクレオシドの
グリコシド結合は、酸性条件下において不安定であり、
無保護体と比較してアデノシンとグアノシンでは脱プリ
ン化反応が起こりやすい。Further, the glycoside bond of the nucleoside whose base moiety is protected is unstable under acidic conditions,
Depurination is more likely to occur with adenosine and guanosine than with the unprotected form.

【０００８】したがって、核酸の塩基部位のアミノ基を
保護しないで、核酸を合成することが好ましい。Therefore, it is preferable to synthesize a nucleic acid without protecting the amino group at the base site of the nucleic acid.

【０００９】しかしながら、上述の無保護アミダイト法
では、デオキシシチジン(ｄＣ)とデオキシアデノシン
(ｄＡ)塩基部位にも縮合反応が起こることが知られてお
り、そのため、1サイクル毎にこの副反応の結果生じる
Ｐ-Ｎ結合を開裂除去する余分な工程が必要とされる。
Ｐ-Ｎ結合を除去するには、例えば、塩基部位のアミノ
基へのホスファチル化体のＰ-Ｎ結合をベンズイミダゾ
ールトリフラート存在下メタノールと反応させるなどの
工程が必要であった。しかし、このような工程を必要と
するとより迅速に所望の核酸を合成することができな
い。したがって、より迅速に核酸を合成しうる方法が望
まれていた。However, in the above-mentioned unprotected amidite method, deoxycytidine (dC) and deoxyadenosine are used.
It is known that a condensation reaction also takes place at the (dA) base site, so that an extra step of cleaving off the P—N bond resulting from this side reaction is required every cycle.
In order to remove the P—N bond, for example, a step of reacting the P—N bond of the phosphatilated product to the amino group at the base site with methanol in the presence of benzimidazole triflate was required. However, if such a step is required, the desired nucleic acid cannot be synthesized more rapidly. Therefore, a method capable of synthesizing a nucleic acid more rapidly has been desired.

【００１０】そこで、本発明の目的は、より迅速、か
つ、正確に核酸を合成する方法を提供することにある。Therefore, an object of the present invention is to provide a method for synthesizing a nucleic acid more rapidly and accurately.

【００１１】[0011]

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、発明者らは、種々の縮合剤を合成し、縮合反応につ
いて鋭意研究を積み重ねた結果、所望の核酸を迅速かつ
正確に合成できることを見出した。In order to achieve the above-mentioned object, the inventors have synthesized various condensing agents and have conducted intensive studies on the condensation reaction. As a result, the desired nucleic acid can be rapidly and accurately synthesized. Found.

【００１２】本発明の核酸の合成法は、核酸の塩基部分
を保護せずに当該核酸を合成する方法であって、プロト
ン供与体の存在下、ヌクレオチド同士を縮合反応させる
ことを特徴とする。The method for synthesizing a nucleic acid of the present invention is a method for synthesizing a nucleic acid without protecting the base portion of the nucleic acid, and is characterized in that the nucleotides are subjected to a condensation reaction in the presence of a proton donor.

【００１３】本発明の核酸の合成法の好適な実施態様に
おいて、前記プロトン供与体のpKaが、3.6以下であるこ
とを特徴とする。In a preferred embodiment of the method for synthesizing a nucleic acid of the present invention, the proton donor has a pKa of 3.6 or less.

【００１４】本発明の核酸の合成法の好適な実施態様に
おいて、前記プロトン供与体が、４−ニトロベンズイミ
ダゾールトリフラート、4−ニトロ−６−(トリフルオロ
メチル)ベンゾトリアゾール−１−オール、又はトリア
ゾールトリフラートからなる群から選択される少なくと
も1種であることを特徴とする。In a preferred embodiment of the method for synthesizing a nucleic acid according to the present invention, the proton donor is 4-nitrobenzimidazole triflate, 4-nitro-6- (trifluoromethyl) benzotriazol-1-ol, or triazole. It is characterized by being at least one selected from the group consisting of triflates.

【００１５】本発明の核酸の合成法の好適な実施態様に
おいて、前記縮合反応を液相で行うことを特徴とする。In a preferred embodiment of the method for synthesizing a nucleic acid of the present invention, the condensation reaction is carried out in a liquid phase.

【００１６】本発明の核酸の合成法の好適な実施態様に
おいて、前記縮合反応を固相で行うことを特徴とする。In a preferred embodiment of the method for synthesizing a nucleic acid of the present invention, the condensation reaction is carried out in a solid phase.

【００１７】[0017]

【発明の実施の形態】本発明の核酸の合成法は、核酸の
塩基部分を保護せずに当該核酸を合成する方法であっ
て、プロトン供与体の存在下、ヌクレオチド同士を縮合
反応させる。本発明において、プロトン供与体を用いた
のは、プロトン供与体が、ヌクレオチド同士の縮合反応
を円滑に行うために水酸基への反応性を落とすことな
く、かつ塩基部位への反応を抑制し得るからである。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The method for synthesizing a nucleic acid of the present invention is a method for synthesizing a nucleic acid without protecting the base portion of the nucleic acid, in which nucleotides are condensed with each other in the presence of a proton donor. In the present invention, the proton donor is used because the proton donor can suppress the reaction to the base site without lowering the reactivity to the hydroxyl group in order to smoothly carry out the condensation reaction between nucleotides. Is.

【００１８】即ち、プロトン供与体を用いることによ
り、副反応で問題となるシトシン、アデニン塩基などを
プロトン化してアミノ基の反応性を下げ、塩基部位への
反応性を抑制することが可能となる。That is, by using a proton donor, it becomes possible to protonate cytosine, adenine base and the like which are problematic in side reactions to lower the reactivity of the amino group and suppress the reactivity to the base site. .

【００１９】本発明において、プロトン供与体は、上述
のように水酸基への反応性を落とすこなく、塩基部位へ
の反応を抑制し得るものであれば、特に限定されない。
プロトン供与体の好ましい性質としては、縮合能が高い
こと、吸湿性がないこと、反応溶媒への溶解性が高いこ
となどを挙げることができる。In the present invention, the proton donor is not particularly limited as long as it can suppress the reaction to the basic site without lowering the reactivity to the hydroxyl group as described above.
Preferable properties of the proton donor include high condensation ability, no hygroscopicity, and high solubility in a reaction solvent.

【００２０】さらに、好ましい性質として、前記プロト
ン供与体のpKaが、3.6以下であることを挙げることがで
きる。これは、下記[化1]に示すように、アデニン、シ
トシン塩基などのプロトン化が、それぞれ、pKa3.6、pK
a4.2で起こるからである。Furthermore, as a preferable property, the pKa of the proton donor may be 3.6 or less. As shown in the following [Chemical formula 1], the protonation of adenine, cytosine bases, etc. is changed to pKa3.6 and pK, respectively.
Because it happens in a4.2.

【化１】 [Chemical 1]

【００２１】即ち、本発明においては、pKaの低い活性
化剤を縮合反応に用いることにより、シトシン、アデニ
ン塩基をプロトン化することにより、アミノ基の反応性
を下げ、塩基部位への反応性を抑制することが可能とな
る。That is, in the present invention, an activator having a low pKa is used in the condensation reaction to protonate the cytosine and adenine bases to lower the reactivity of the amino group and reduce the reactivity to the base site. It becomes possible to suppress.

【００２２】本発明においては、プロトン供与体のpKa
は、好ましくは、3.6以下である。プロトン供与体のpKa
は、さらに好ましくは、3以下である。これは、pKaが3
以下であれば、核酸の塩基のプロトン化を強化すると共
に、アミノ基の反応性を低減できるという観点からであ
る。In the present invention, the pKa of the proton donor is
Is preferably 3.6 or less. PKa of proton donor
Is more preferably 3 or less. This has a pKa of 3
The following is from the viewpoint that the protonation of the base of the nucleic acid can be enhanced and the reactivity of the amino group can be reduced.

【００２３】また、特にヌクレオチド同士を縮合反応さ
せる能力が高いという観点から、プロトン供与体として
は、４−ニトロベンズイミダゾールトリフラート、4−
ニトロ−６−(トリフルオロメチル)ベンゾトリアゾール
−１−オール、又はトリアゾールトリフラートを挙げる
ことができる。In particular, from the viewpoint of high ability to cause a condensation reaction between nucleotides, 4-nitrobenzimidazole triflate, 4-
Mention may be made of nitro-6- (trifluoromethyl) benzotriazol-1-ol or triazole triflate.

【００２４】本発明の核酸の合成方法は、いわゆる塩基
部位無保護のホスホロアミダイトユニットと活性化剤と
してのプロトン供与体を用いて、ヌクレオシド及び／又
はヌクレオチド同士を縮合反応させることにより行うこ
とができる。塩基部位無保護のホスホロアミダイトユニ
ットは、糖の5’のトリチル化、及び3’のアミダイト化
を行うことにより調製する。これらの調製には、常法を
用いることができる。The method of synthesizing a nucleic acid of the present invention can be carried out by subjecting a nucleoside and / or a nucleotide to a condensation reaction using a so-called base site-unprotected phosphoramidite unit and a proton donor as an activator. it can. A phosphoramidite unit with no base moiety protected is prepared by performing 5'tritylation of sugar and 3'amididation of sugar. A conventional method can be used for these preparations.

【００２５】本発明において、核酸の合成は、例えば、
液相及び固相で行うことができる。まず、核酸の合成を
液相で行った場合について説明する。In the present invention, nucleic acid synthesis is performed, for example, by
It can be performed in a liquid phase and a solid phase. First, the case where the nucleic acid is synthesized in the liquid phase will be described.

【００２６】液相法では、上述の塩基部位無保護のホス
ホロアミダイトユニットと、活性化剤とを用いて、適当
な溶媒中で縮合反応を行うことができる。溶媒として
は、ＴＨＦ、ＣＨ₃ＣＮ、ジオキサン、ジメトキシエタ
ン、DMF、DMA、N−メチルピロリドン等を挙げることが
できる。反応温度は、特に限定されず、縮合反応を室温
下で行うことができる。In the liquid phase method, the condensation reaction can be carried out in a suitable solvent by using the phosphoramidite unit without protection of the base site and the activator. As the solvent, mention may be made of THF, CH ₃ CN, dioxane, dimethoxyethane, DMF, DMA, and N- methylpyrrolidone. The reaction temperature is not particularly limited, and the condensation reaction can be performed at room temperature.

【００２７】また、固相法では、まず固相担体の調製が
必要である。固相担体は、特に限定されず、固相ポリマ
ー、結晶ビーズ担体等の従来のものを使用することがで
きる。固相担体に3’末端でヌクレオチドを結合させ、
順にヌクレオチドを結合させていく。ヌクレオチド同士
の結合は、上述のプロトン供与体の存在下、適当な溶媒
中で行う。溶媒としては、ＴＨＦ、ＣＨ₃ＣＮ、ジメト
キシエタン、ジオキサン、DMF、DMA、Nメチルピロリド
ン等を挙げることができる。反応温度は、特に限定され
ず、縮合反応を室温下で行うことができる。In the solid phase method, it is first necessary to prepare a solid phase carrier. The solid phase carrier is not particularly limited, and a conventional solid phase polymer, crystal bead carrier or the like can be used. Attaching a nucleotide to the solid support at the 3'end,
Nucleotides are linked in sequence. The binding between nucleotides is performed in the presence of the above-mentioned proton donor in a suitable solvent. Examples of the solvent include THF, CH ₃ CN, dimethoxyethane, dioxane, DMF, DMA, N-methylpyrrolidone and the like. The reaction temperature is not particularly limited, and the condensation reaction can be performed at room temperature.

【００２８】[0028]

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される
意図ではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not intended to be construed as being limited to the following examples.

【００２９】実施例１ 本実施例では、液相での核酸の合成を試みた。Example 1 In this example, an attempt was made to synthesize a nucleic acid in a liquid phase.

【００３０】塩基部位無保護ホスホロアミダイトユニッ
トの合成 塩基部位無保護ホスホロアミダイト法によりDNAを合成
する場合、核酸塩基部位が保護されていないdA、dC、デ
オキシグアノシン(dG)、そしてチミン(T)のアミダイト
ユニットが必要となる。そのために、まず5’-水酸基の
みジメトキシトリチル(DMTr)基で保護されたヌクレオシ
ドの合成に取り組んだ。 Base site unprotected phosphoramidite unit
Synthesis of DNA When DNA is synthesized by the phosphoramidite method without base site protection, amidite units of dA, dC, deoxyguanosine (dG), and thymine (T) whose nucleobase site is not protected are required. For this purpose, we first worked on the synthesis of nucleosides in which only the 5'-hydroxyl group was protected with a dimethoxytrityl (DMTr) group.

【００３１】dAとdCの水酸基選択的なトリチル化は、常
法に従い、ピリジン中、当量のジクロロ酢酸、トリエチ
ルアミンの存在下、小過剰のトリチルクロライドを反応
させている。わずか一工程でdA,dCのトリチル体は、そ
れぞれ74%、71%の収率で得られた(化２)。化２は、dAと
dCの水酸基選択的なトリチル化の反応を示す。For selective tritylation of hydroxyl groups of dA and dC, a small excess of trityl chloride is reacted in pyridine in the presence of equivalent amounts of dichloroacetic acid and triethylamine according to a conventional method. In only one step, dA and dC trityl compounds were obtained at yields of 74% and 71%, respectively (Chemical Formula 2). Formula 2 is dA
3 shows a reaction of tritylation of dC with hydroxyl group selective.

【化２】 [Chemical 2]

【００３２】また、dCだけは、DMF中、小過剰の4-ヒド
ロキシピリジンとトリチルクロライドを用いることでも
水酸基選択的なトリチル化が可能であることがわかった
(化３)。化３は、ヒドロキシピリジンを用いたdCの水酸
基選択的トリチル化の反応を示す。It was also found that dC alone can be tritylated selectively with hydroxyl groups by using a small excess of 4-hydroxypyridine and trityl chloride in DMF.
(Chemical formula 3). Chemical formula 3 shows a reaction of hydroxyl group-selective tritylation of dC using hydroxypyridine.

【化３】 [Chemical 3]

【００３３】dGの水酸基選択的なトリチル化は、dAやdC
よりも困難であり、上記のような手法を用いることはで
きなかった。過去に早川らは、dGの水酸基選択的なトリ
チル化の報告をおこなっている（M. Kataoka, Y. Hayak
awa, J. Org. Chem., 64. 6087(1999).）が、同様な操
作を行っても反応は進行しなかった(化４)。化４は、早
川らによる報告されたdGの水酸基選択的トリチル化の反
応を示す。The hydroxyl group-selective tritylation of dG is carried out by dA and dC.
It is more difficult than that and the above method could not be used. In the past, Hayakawa et al. Have reported hydroxyl group-selective tritylation of dG (M. Kataoka, Y. Hayak).
awa, J. Org. Chem., 64. 6087 (1999).), but the reaction did not proceed even if the same operation was performed (Chemical formula 4). Chemical formula 4 shows the reaction of hydroxyl group-selective tritylation of dG reported by Hayakawa et al.

【化４】 [Chemical 4]

【００３４】そこで、dGに限っては多少の手間はかかる
が塩基部位のアミノ基をアミジン型の保護基で一時的に
保護することで、塩基部位のアミノ基が遊離しているdG
のトリチル体を58%で単離した(化5)。化5は、dGの水酸
基選択的トリチル化の反応を示す。Therefore, although it takes some time and effort only for dG, by temporarily protecting the amino group at the base site with an amidine-type protecting group, the amino group at the base site is released.
Was isolated in 58% (Chemical formula 5). Chemical formula 5 shows a reaction of hydroxyl group-selective tritylation of dG.

【化５】 [Chemical 5]

【００３５】このようにして合成したdA、dC、dGのトリ
チル体と別途合成したTのトリチル体は、それぞれ(2-シ
アノエチル)(N,N-ジイソプロピルアミノ)クロロホスフ
ィンを用いてアミダイト化をおこなった。この時、反応
系を-78℃まで冷却することで、塩基部位のアミノ基に
対する試薬の副反応が抑制される(化6)。化６は、DMTr
ヌクレオシドのアミダイト化の反応を示す。The trityl compound of dA, dC and dG thus synthesized and the trityl compound of T separately synthesized are each amiditized using (2-cyanoethyl) (N, N-diisopropylamino) chlorophosphine. It was At this time, by cooling the reaction system to −78 ° C., the side reaction of the reagent with the amino group at the base site is suppressed (Chemical Formula 6). CH6 is DMTr
The reaction of amidite conversion of a nucleoside is shown.

【化６】 [Chemical 6]

【００３６】また、本研究では５’-水酸基に保護基にD
MTr基よりも酸性条件に多少安定なモノメトキシトリチ
ル（MMTr）基を用いたアミダイトユニットを用いたオリ
ゴヌクレオチドの合成検討も行っている。ヌクレオシド
のMMTr化は、DMTr化と同様な条件を用いてdA、dG、dC、
Tそれぞれ収率75%、81%、83%、93%で合成した。続く、
アミダイト化も先程と同様な条件のもとdA、dG、dC、T
それぞれ収率83%、71%、85%、94%で合成した。In addition, in this study, D was used as a protective group for the 5'-hydroxyl group.
We are also investigating the synthesis of an oligonucleotide using an amidite unit that uses a monomethoxytrityl (MMTr) group that is slightly more stable under acidic conditions than the MTr group. Nucleoside conversion to MMTr is carried out using dA, dG, dC, and
T was synthesized in 75%, 81%, 83% and 93% yields, respectively. Continue,
Amidite conversion is performed under the same conditions as above, dA, dG, dC, T
The respective yields were 83%, 71%, 85% and 94% respectively.

【００３７】後述する実施例4のオリゴヌクレオチドの
合成検討では、アミダイトユニット自体の反応性を変え
るためにリンの保護基をシアノエチル基からメチル基に
変えて縮合反応を行っている。このリンの保護基がメチ
ル基になっているアミダイトユニットは、クロロ[ビス
(N,N-ジイソプロピルアミノ)]メトキシホスフィンを先
程合成したdCのMMTr体に反応させることで83%の収率で
合成した(化７)。化7は、リンの保護基がメチル基のア
ミダイトユニットの合成を示す。In the investigation of the synthesis of the oligonucleotide of Example 4 which will be described later, in order to change the reactivity of the amidite unit itself, the protecting group of phosphorus is changed from a cyanoethyl group to a methyl group to carry out the condensation reaction. The amidite unit in which the phosphorus protecting group is a methyl group is chloro [bis
(N, N-diisopropylamino)] methoxyphosphine was reacted with the dC MMTr body synthesized above to synthesize in a yield of 83% (Chemical Formula 7). Chemical formula 7 shows the synthesis of an amidite unit in which the phosphorus protecting group is a methyl group.

【化７】 [Chemical 7]

【００３８】活性化剤の合成 本実施例では、活性化剤のpKa、溶解性、吸湿性、そし
てアミダイトユニットの活性化能の条件を満たす化合物
の内、以下の(1)〜(3)の化合物を用いた。以下、これら
の活性化剤の合成法について記述する。 Synthesis of Activator In this example, among compounds satisfying the conditions of pKa, solubility, hygroscopicity, and amidite unit activation ability of the activator, the following (1) to (3) were selected. The compound was used. Hereinafter, methods for synthesizing these activators will be described.

【化８】 [Chemical 8]

【００３９】4−ニトロ-6-(トリフルオロメチル)ベンゾ
トリアゾール-1-オールを、以下の[化９]に示すように1
-クロロ-2,6-ジニトロ-4-トリフルオメチルベンゼンを
出発原料として、3ステップで55%の収率で合成した。合
成についての詳細は以下の通りである。4-nitro-6- (trifluoromethyl) benzotriazol-1-ol was prepared as shown in the following [Chemical Formula 9]
-Chloro-2,6-dinitro-4-trifluoromethylbenzene was used as a starting material and was synthesized in 55% yield in 3 steps. Details of the synthesis are as follows.

【００４０】4-ニトロ-6-(トリフルオロメチル)ベンゾ
トリアゾール-1-オール アルゴン雰囲気下、室温で4-クロロ-3,5-ジニトロベン
ゾトリフルオライド(20g 74mmol)のメタノール溶液(80m
l)に、ナトリウムメトキシド(7.5g 130mmol)のメタノー
ル溶液(30ml)を徐々に滴下し、撹拌を行った。30分後、
2Mの塩酸水溶液(100ml)を加え、反応溶液をろ過した。
ろ液を回収し、溶媒を減圧留去し目的の固体(2,6-ジニ
トロ4-トリフルオロメチルアニソール)を得た。¹ H NMR : 4.10( s, 3H ), 8.15( s, 1H ), 8.23( s, 1H
), 4-nitro-6- (trifluoromethyl) benzo
Triazol-1-ol 4-chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride (20 g 74 mmol) in methanol at room temperature under argon atmosphere (80 m
To l), a methanol solution (30 ml) of sodium methoxide (7.5 g, 130 mmol) was gradually added dropwise, and the mixture was stirred. 30 minutes later,
A 2M aqueous hydrochloric acid solution (100 ml) was added, and the reaction solution was filtered.
The filtrate was collected and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the target solid (2,6-dinitro4-trifluoromethylanisole). ¹ H NMR: 4.10 (s, 3H), 8.15 (s, 1H), 8.23 (s, 1H).
),

【００４１】この固体を十分に乾燥させた後、無水エタ
ノール(100ml)に溶解した。次に、この溶液にヒドラジ
ン一水和物(3.6ml 74mmol)の無水エタノール(25ml)溶液
を、アルゴン雰囲気下、0℃で徐々に滴下した。その
後、0℃で1時間撹拌をおこなって、溶媒を減圧留去し目
的の固体(2,6-ジニトロ4-トリフルオロメチルフェニル
ヒドラジン)を得た。The solid was thoroughly dried and then dissolved in absolute ethanol (100 ml). Then, a solution of hydrazine monohydrate (3.6 ml 74 mmol) in absolute ethanol (25 ml) was gradually added dropwise to this solution at 0 ° C. under an argon atmosphere. Then, the mixture was stirred at 0 ° C. for 1 hour, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the target solid (2,6-dinitro-4-trifluoromethylphenylhydrazine).

【００４２】¹H NMR : 4.85 ( s, 2H ), 8.41 ( s, 2H
), 9.67 ( s, 1H ) さらに、この2,6-ジニトロ4-トリフルオロメチルフェニ
ルヒドラジン、ヒドラジン一水和物(3.6ml 74mmol)、酢
酸(16.9ml 296mmol)そして酢酸ナトリウム三水和物(35g
259mmol)をエタノール-水の混合溶媒(100ml 2:1 v/v)
に溶解させ、アルゴン雰囲気下5時間、加熱還流させ
た。この反応溶液を冷却した後、クロロホルム200mlで
希釈し0.1M塩酸水溶液100mlで3回抽出操作を行った。有
機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶
媒を減圧留去させ目的物(4-ニトロ-6-(トリフルオロメ
チル)ベンゾトリアゾール-1-オール)を得た。(10g 55%) ¹ H NMR: 4.85 (s, 2H), 8.41 (s, 2H
), 9.67 (s, 1H) Furthermore, this 2,6-dinitro 4-trifluoromethylphenylhydrazine, hydrazine monohydrate (3.6 ml 74 mmol), acetic acid (16.9 ml 296 mmol) and sodium acetate trihydrate (35 g
259 mmol) in ethanol-water mixed solvent (100 ml 2: 1 v / v)
And was heated to reflux under an argon atmosphere for 5 hours. After the reaction solution was cooled, it was diluted with 200 ml of chloroform and extracted three times with 100 ml of 0.1 M hydrochloric acid aqueous solution. The organic layer was collected, dried over anhydrous sodium sulfate and filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the desired product (4-nitro-6- (trifluoromethyl) benzotriazol-1-ol). (10g 55%)

【００４３】¹H NMR : 4.72 −4.98 ( m, 1H ), 9.80
( s, 1H ), 10.15 ( s, 1H ),¹³ C NMR : 116.5, 118.6, 122.8, 126.5, 135.8, 138.0 Anal. Calcd for C₇H₃F₃N₄O₃ : C 33.88, H 1.22, N 2
2.58, F 22.97 Found :C 33.88, H 1.36, N 22.69, F
22.35 ¹ H NMR: 4.72 −4.98 (m, 1H), 9.80
(s, 1H), 10.15 (s, 1H), ¹³ C NMR: 116.5, 118.6, 122.8, 126.5, 135.8, 138.0 Anal.Calcd for C ₇ H ₃ F ₃ N ₄ O ₃ : C 33.88, H 1.22, N 2
2.58, F 22.97 Found: C 33.88, H 1.36, N 22.69, F
22.35

【００４４】このヒドロキシトリアゾール誘導体（以
下、NT-HOBtと記述する）のpKaは2.70でアセトニトリル
やTHFなどの有機溶媒に溶解性が高いほか、吸湿性もな
く、従来の活性化剤よりもアミダイトユニットの活性化
能は高かった。[化９]は、NT-HOBtの合成を示す。The hydroxytriazole derivative (hereinafter referred to as NT-HOBt) has a pKa of 2.70 and is highly soluble in organic solvents such as acetonitrile and THF, has no hygroscopicity, and is more amidite unit than conventional activators. Had a high activation capacity. [Chemical Formula 9] shows the synthesis of NT-HOBt.

【化９】 [Chemical 9]

【００４５】4-ニトロベンゾイミダゾリニウトリフラー
ト(NBT)とトリアゾリニウムトリフラート(TRT)の合成
は、早川らのベンゾイミダゾリニウトリフラート（BI
T）(Y.Hayakawa, M. Kataoka, and R. Noyori, J. Org.
Chem., 61. 7996(1996))の調製報告例に従って行い、
高収率で目的物を合成することができた。化１０は、NB
TとTRTの合成の反応を示す。Synthesis of 4-nitrobenzimidazolinium triflate (NBT) and triazolinium triflate (TRT) was carried out by Hayakawa et al.'S benzimidazolinium triflate (BI
T) (Y. Hayakawa, M. Kataoka, and R. Noyori, J. Org.
Chem., 61. 7996 (1996)).
The target product could be synthesized in high yield. Chemical formula 10 is NB
The reaction of T and TRT synthesis is shown.

【化１０】 [Chemical 10]

【００４６】合成法についての詳細は以下の通りであ
る。4-ニトロベンゾイミダゾリニウムトリフラート ニトロベンズイミダゾール(7.1g 44mmol)をメタノール-
エーテルの混合溶媒(50ml 1:1 v/v)に溶解させたのち、
0℃冷却しながらトリフラート(3.9ml 44mml)を徐々に滴
下し、撹拌を行った。その後、反応溶液をエーテル(200
ml)にあけることで結晶化させ、その固体をろ過し回収
した。(13.2g 96%)The details of the synthesis method are as follows. 4-Nitrobenzimidazolinium triflate Nitrobenzimidazole (7.1 g 44 mmol) in methanol-
After dissolving in a mixed solvent of ether (50 ml 1: 1 v / v),
While cooling at 0 ° C., triflate (3.9 ml 44 mml) was gradually added dropwise and the mixture was stirred. Then, the reaction solution was added with ether (200
(ml) to crystallize and the solid was filtered and collected. (13.2g 96%)

【００４７】融点 138〜140℃(酢酸エチル) ¹ H NMR : 7.97 ( d, 1H, J = 8.91Hz ), 8.30−8.34 (
m, 1H ), 8.63 ( d, 1H,J = 2.16 Hz ), 9.51 ( s, 1H)¹³ C NMR : 111.7, 115.5, 120.5, 131.8, 135.8, 144.
7,145.4 Anal. Calcd for C₈H₆F₃N₃O₅S : C 30.68, H 1.93, N 1
3.42, F 18.20, S 10.24 Found : C30.60, H1.91, N13.44, F 18.28, S 9.21Melting point 138-140 ° C. (ethyl acetate) ¹ H NMR: 7.97 (d, 1H, J = 8.91Hz), 8.30-8.34 (
m, 1H), 8.63 (d, 1H, J = 2.16 Hz), 9.51 (s, 1H)¹³ C NMR: 111.7, 115.5, 120.5, 131.8, 135.8, 144.
7,145.4 Anal. Calcd for C₈H₆F₃N₃O_FiveS: C 30.68, H 1.93, N 1
3.42, F 18.20, S 10.24 Found: C30.60, H1.91, N13.44, F 18.28, S 9.21

【００４８】1,2,4-トリアゾリニウムトリフラート トリアゾール(3.0g 44mmol)をメタノール-エーテルの混
合溶媒(50ml 1:1 v/v)に溶解させたのち、0℃冷却しな
がらトリフラート(3.9ml 44mml)を徐々に滴下し、撹拌
を行った。その後、反応溶液をエーテル(200ml)にあけ
ることで結晶化させ、その固体をろ過し回収した。(9.4
g 98%) 1,2,4-Triazolinium triflate triazole (3.0 g 44 mmol) was dissolved in a mixed solvent of methanol-ether (50 ml 1: 1 v / v), and then triflate (3.9 ml was cooled at 0 ° C.). (44 mml) was gradually added dropwise, and the mixture was stirred. Then, the reaction solution was poured into ether (200 ml) for crystallization, and the solid was filtered and collected. (9.4
g 98%)

【００４９】融点：162〜164℃(酢酸エチル−アセトニ
トリル)¹H NMR : 9.31 ( s, 1H), 9.33 ( s, 1H)¹³ C NMR : 142.85 Anal. Calcd for C₃H₄F₃N₃O₃S : C 16.4, H 1.84, N 1
9.17, F 26.01, S 14.63 Found : C 16.33, H 1.75, N 19.35, F 25.82, S 14.3Melting point: 162-164 ° C. (ethyl acetate-acetonitrile) ¹ H NMR: 9.31 (s, 1H), 9.33 (s, 1H) ¹³ C NMR: 142.85 Anal. Calcd for C ₃ H ₄ F ₃ N ₃ O ₃ S: C 16.4, H 1.84, N 1
9.17, F 26.01, S 14.63 Found: C 16.33, H 1.75, N 19.35, F 25.82, S 14.3

【００５０】NBTのpKaは2.76で、NT-HOBtと同様に、溶
解性、吸湿性、活性化能ともに理想的なものであった。
TRTに関しては、やや難溶性であるもののpKaが2.85で、
吸湿性はなく、また活性化能も高かった。NBT had a pKa of 2.76, and was ideal in solubility, hygroscopicity and activating ability as in the case of NT-HOBt.
Regarding TRT, although it is slightly soluble, pKa is 2.85,
It was not hygroscopic and had a high activation capacity.

【００５１】液相での二量体の合成 本実施例では、上述したように合成したアミダイトユニ
ットと活性化剤を用いて塩基部位無保護ホスホロアミダ
イト法による液相でのTpC二量体の合成をおこない、従
来の活性化剤との比較を行った。 Synthesis of Dimer in Liquid Phase In this Example, a TpC dimer in liquid phase was prepared by phosphoramidite method without base site protection using amidite unit and activator synthesized as described above. It was synthesized and compared with conventional activators.

【００５２】シチジンのアミノ基は、その求核性の高さ
からもっとも副反応が起こりやすいことが過去の知見か
らわかっている。そこで、新規の活性化剤の縮合能を確
認するために、今回は液相でTpC二量体の合成をおこな
った。It has been known from past findings that the amino group of cytidine is most likely to cause a side reaction because of its high nucleophilicity. Therefore, in order to confirm the condensation ability of the novel activator, we synthesized TpC dimer in the liquid phase this time.

【００５３】まず、³¹P-NMRで反応を追いやすくするた
め、縮合反応中の副生成物を事前に合成し、³¹P-NMRの
数値を求めることからはじめた。[化１１]に示すよう
に、アミダイトユニットに過酸化物を反応させることで
化合物（4）を定量的に得ることができた。その³¹P-NMR
の値は、8.03、8.33ppmであった。化11は、化合物（4）
の合成と化合物(4)の³¹P-NMRを示す。First, in order to easily follow the reaction by ³¹ P-NMR, the by-product in the condensation reaction was synthesized in advance and the value of ³¹ P-NMR was calculated. As shown in [Chemical Formula 11], the compound (4) could be quantitatively obtained by reacting the amidite unit with a peroxide. Part ³¹ P-NMR
The values of were 8.03 and 8.33 ppm. Chemical formula 11 is compound (4)
And ³¹ P-NMR of the compound (4).

【化１１】 [Chemical 11]

【００５４】H-ホスホネート体（5）は、ベンズイミダ
ゾールトリフラートを用いることでほぼ定量的に合成す
ることができた(7.60、7.57ppm)。The H-phosphonate (5) could be synthesized almost quantitatively by using benzimidazole triflate (7.60, 7.57 ppm).

【化１２】 化１２は、化合物(5)の合成と化合物(5)の³¹P-NMRを示
す。[Chemical 12] Chemical formula 12 shows the synthesis of compound (5) and ³¹ P-NMR of compound (5).

【００５５】また、アミノ基が保護されていないシチジ
ン誘導体にテトラゾールを活性化剤としてアミダイトユ
ニットを反応させ、80%の収率でアミデート体（6）を合
成することができた (5.28、5.16ppm)。Further, an amidite unit (6) could be synthesized in a yield of 80% by reacting an amidite unit with a cytidine derivative whose amino group is not protected using tetrazole as an activator (5.28, 5.16 ppm). ).

【化１３】 化１３は、化合物（6）の合成と化合物(6)の³¹P-NMRを
示す。[Chemical 13] Chemical formula 13 shows the synthesis of compound (6) and ³¹ P-NMR of compound (6).

【００５６】これらの³¹P-NMRの値を参考にし、以降の
二量体合成での活性化剤の評価を行った。TpC二量体の
合成は、別途合成した3’-水酸基をTBS基で保護したシ
チジンに1.2当量のユニットと2.2当量の活性化剤を用い
て室温、5分で縮合させた後、ヨウ素酸化をおこなっ
た。活性化剤は、新規の3種の化合物以外にも、比較の
ために現在までに報告例のあるS-エチルテトラゾールと
ベンゾイミダゾールトリフラートを用いた。With reference to these ³¹ P-NMR values, the activator in the subsequent dimer synthesis was evaluated. The TpC dimer was synthesized by condensing separately synthesized cytidine with a 3'-hydroxyl group protected by a TBS group by using 1.2 equivalent units and 2.2 equivalents of an activator at room temperature for 5 minutes, followed by iodine oxidation. I did it. In addition to the three new compounds, the activators used were S-ethyltetrazole and benzimidazole triflate, which have been reported so far for comparison.

【化１４】 [Chemical 14]

【００５７】化１４は、液相でのTpC二量体の合成を示
す。S-エチルテトラゾールはその活性化能があまり高く
ないため、5分の縮合反応では活性化されないまま酸化
された化合物（4）をみることができた。そのため、こ
の時のTpC二量体の単離収率は68%とあまり高いものでは
なかった。また、この反応系には、アミデート体（6）
に近い値のケミカルシフトをもつピークが得られていな
いため、塩基部位への副反応がおこっていないことがわ
かる。このことは、ホスフィチル化反応において塩基部
位のアミノ基と一級水酸基を比較した場合、圧倒的に一
級水酸基の方が高い反応性をもつことを示唆している。
この反応性の差を利用して、DNAを合成していく方法が
塩基部位無保護法とも言える。図１は、S-エチルテトラ
ゾールを用いたTpC二量体の合成した結果を示す。Chemical formula 14 shows the synthesis of the TpC dimer in the liquid phase. Since S-ethyltetrazole is not very active, the compound (4) that was oxidized without being activated in the condensation reaction for 5 minutes could be seen. Therefore, the isolation yield of the TpC dimer at this time was not so high as 68%. In addition, this reaction system has amidate (6)
It can be seen that no side reaction to the base site has occurred, since no peak with a chemical shift close to the value was obtained. This suggests that when the amino group at the base site and the primary hydroxyl group are compared in the phosphitylation reaction, the primary hydroxyl group has overwhelmingly higher reactivity.
It can be said that the method of synthesizing DNA by utilizing this difference in reactivity is a method without base site protection. FIG. 1 shows the result of synthesizing a TpC dimer using S-ethyltetrazole.

【００５８】また、図2に示すように、新しく用いた活
性化剤であるNBI、NT-HOBtそしてTRTは、ともに塩基部
位への副反応を起こすことなく、それぞれ94、83、95%
高収率でTpC二量体を合成することができた。As shown in FIG. 2, the newly used activators NBI, NT-HOBt and TRT were 94%, 83% and 95%, respectively, without causing side reactions at the base site.
It was possible to synthesize the TpC dimer in high yield.

【００５９】以上のことから、今回新規に合成した活性
化剤を液相中、塩基部位のアミノ基に保護基を用いない
条件の縮合反応に用いても、副反応を起こすことなく充
分高い収率でDNA二量体の合成を行うことができるとい
える。From the above, even if the activator newly synthesized this time is used for the condensation reaction in the liquid phase under the condition that a protecting group is not used for the amino group at the base site, a sufficiently high yield is obtained without causing a side reaction. It can be said that the rate of DNA dimer synthesis can be carried out.

【００６０】実施例２ 次に、固相での核酸の合成を試みた。本実施例では、液
相中での反応では副反応が観測されなかった新規の活性
化剤を過剰のユニットを使用する固相上での反応に用い
て、核酸塩基部位への副反応をHPLCで観測した。Example 2 Next, an attempt was made to synthesize a nucleic acid on a solid phase. In this example, a novel activator, in which no side reaction was observed in the reaction in the liquid phase, was used for the reaction on the solid phase using an excess unit, and the side reaction to the nucleobase site was analyzed by HPLC. Observed at.

【００６１】固相担体の調製 固相合成のための固相担体として本研究で使用した担体
は、高架橋度ポリスチレン²⁶⁾である。この固相担体表
面には、およそ35μmol/gの一級のアミノ基が存在して
いて、今回はこの反応点に縮合剤・DCCを用いてサクシ
ニルリンカー介したヌクレオシドを導入した。またこの
際、シチジンとアデノシンの塩基部位のアミノ基はDMTr
基で保護されている。化１５は、固相担体の調製を示
す。 Preparation of solid phase carrier The carrier used in this study as a solid phase carrier for solid phase synthesis is highly crosslinked polystyrene ²⁶⁾ . On the surface of this solid-phase carrier, a primary amino group of about 35 μmol / g was present, and this time, a nucleoside via a succinyl linker was introduced at this reaction point using a condensing agent, DCC. At this time, the amino group at the base site of cytidine and adenosine is DMTr.
It is protected by a group. Chemical formula 15 shows the preparation of the solid phase carrier.

【化１５】 [Chemical 15]

【００６２】二量体の合成 まず、先程合成したチミジンが導入された固相担体を用
いてApT、CpT二量体の合成を行った。合成のサイクルは
表１に示す通りであり、その評価は逆相HPLCを用いて行
った。 Synthesis of dimer First, ApT and CpT dimers were synthesized using the thymidine-incorporated solid-phase carrier synthesized above. The cycle of synthesis is as shown in Table 1, and the evaluation was performed using reverse phase HPLC.

【表１】 [Table 1]

【００６３】ApTの合成においては、今回新規に活性化
剤として用いたNT-HOBt、TRT、NBTの三種の化合物の他
にも、比較のためにテトラゾールとBITを用いた場合に
ついても逆相HPLCによる解析を行っている。まず、解析
の参考にApTの逆相HPLCチャートとフォトダイオードア
レイ検出器で同時に測定したUV波形を示す。図4に固相
上で合成検討した逆相HPLCチャートを示す。また、以下
に、逆相ＨＰＬＣの条件を示す。In the synthesis of ApT, in addition to the three kinds of compounds newly used as activators, NT-HOBt, TRT and NBT, reverse phase HPLC was also performed for the case of using tetrazole and BIT for comparison. Is being analyzed. First, for analysis reference, a reverse-phase HPLC chart of ApT and a UV waveform simultaneously measured by a photodiode array detector are shown. Figure 4 shows the reversed-phase HPLC chart of the synthetic study on the solid phase. Moreover, the conditions of reverse phase HPLC are shown below.

【００６４】逆相HPLC Waters Aliance systemにWaters 3D UV detectorを接続
して用いた。操作条件を以下に示す。 （条件A） カラム温度 : 50℃ 移動相 : solution A: 0.1 M 酢酸アンモニウム (pH 7.0) solution B : アセトニトリル (B: 0-10%linear gradient ) 流量 : 1.0 ml / min。 分析時間 : 30 min （条件B） カラム温度 : 50℃ 移動相 : solution A: 0.1 M 酢酸アンモニウム (pH 7.0) solution B : アセトニトリル (B: 0-30%linear gradient ) 流量 : 1.0 ml / min。 分析時間 : 30 min A Waters 3D UV detector was connected to a reverse phase HPLC Waters Aliance system and used. The operating conditions are shown below. (Condition A) Column temperature: 50 ° C Mobile phase: solution A: 0.1 M ammonium acetate (pH 7.0) solution B: Acetonitrile (B: 0-10% linear gradient) Flow rate: 1.0 ml / min. Analysis time: 30 min (Condition B) Column temperature: 50 ° C Mobile phase: solution A: 0.1 M ammonium acetate (pH 7.0) solution B: Acetonitrile (B: 0-30% linear gradient) Flow rate: 1.0 ml / min. Analysis time: 30 min

【００６５】テトラゾールは、塩基部位が保護されたア
ミダイトユニットを用いた固相合成に広く使用されてい
る。このテトラゾールを用いて縮合反応を行った時のHP
LCチャートがエントリー1である。目的の二量体のほか
にも、塩基部位への副反応生成物のピークを多数観測す
ることができる。このことから、テトラゾールを活性化
剤に用いるためには、塩基部位は必ず保護しなければな
らないことがわかる。Tetrazole is widely used for solid phase synthesis using an amidite unit in which the base site is protected. HP when performing condensation reaction using this tetrazole
LC chart is entry 1. In addition to the desired dimer, many peaks of side reaction products at the base site can be observed. From this, it can be seen that the basic site must be protected in order to use tetrazole as an activator.

【００６６】また、液相反応では塩基部位への副反応が
観測されなかったBITでは、テトラゾールを用いたとき
よりは幾分か減るが、同じ副反応生成物のピークが得ら
れる(エントリー2)。In the BIT in which no side reaction to the base site was observed in the liquid phase reaction, the same peak of the side reaction product was obtained although it was somewhat reduced as compared with the case where tetrazole was used (entry 2). .

【００６７】エントリー3では、今回合成したNT-HOBtを
活性化剤として縮合反応に用いたときのHPLCチャートで
ある。エントリー1や2で用いている従来の活性化剤より
は、はるかに塩基部位への副反応が抑制されている。し
かし、保持時間27分の領域にテトラゾールやBITと同じ
副反応生成物のピークがわずかであるが観測された。Entry 3 is a HPLC chart when the newly synthesized NT-HOBt was used as an activator in the condensation reaction. Compared to the conventional activators used in entries 1 and 2, side reactions to the base site are much suppressed. However, a few peaks of the same side reaction products as tetrazole and BIT were observed in the region where the retention time was 27 minutes.

【００６８】前述したようにTRTは、テトラゾールと同
様にTHF溶媒に対し溶解性が悪く、アセトニトリル溶媒
中でのみ反応行った。そのとき得られた逆相HPLCチャー
トがエントリー4である。エントリー4では、エントリー
1−3でみられる副反応生成物は、かなり減少しているが
これらのピークとは別に、目的物ApTの直後にピークが
観測できた。化１６は、活性化剤によるDMTr基の脱離と
それに続く縮合反応を示す。As described above, TRT, like tetrazole, has poor solubility in a THF solvent and was reacted only in an acetonitrile solvent. The reverse phase HPLC chart obtained at that time is entry 4. In entry 4, entry
The side reaction products observed in 1-3 were considerably reduced, but apart from these peaks, a peak could be observed immediately after the target ApT. Chemical formula 16 shows elimination of DMTr group by an activator and subsequent condensation reaction.

【化１６】 [Chemical 16]

【００６９】これと共通したピークは、エントリー5で
も確認できる。このピークは、その保持時間とUV波長か
ら、塩基部位への副反応ではなくDMTr基の脱離によりさ
らに鎖長が伸びたApApT三量体と考えられる。A common peak with this can also be confirmed in entry 5. Based on its retention time and UV wavelength, this peak is considered to be an ApApT trimer whose chain length is further extended by elimination of DMTr group rather than side reaction to the base site.

【００７０】エントリー6では、THF溶媒中、NBTを活性
化剤として縮合反応を行ったときの結果である。前述し
た副反応物のピークは一切観測されず、99％以上の縮合
率で目的のApT二量体を合成することができた。化１７
は、溶媒によるDMTr基の挙動の相違を示す。Entry 6 shows the result when the condensation reaction was carried out in THF solvent using NBT as an activator. No peak of the above-mentioned side reaction product was observed, and the target ApT dimer could be synthesized with a condensation rate of 99% or more. Conversion 17
Shows the difference in the behavior of the DMTr group depending on the solvent.

【化１７】 [Chemical 17]

【００７１】エントリー5で観測されたDMTr基の脱離が
エントリー6で見られなかった理由については、[化１
７]に記しているようにTHFのバッファー効果によりエン
トリー6の条件においてDMTr基が比較的脱離しにくくな
っていると考えられる。The reason why the elimination of the DMTr group observed in Entry 5 was not observed in Entry 6 is as follows.
As described in [7], it is considered that the DMTr group is relatively difficult to be eliminated under the condition of entry 6 due to the buffer effect of THF.

【００７２】また、エントリー3とエントリー6の比較
で、pKaがほぼ同等な活性化剤であるのにもかかわら
ず、NT-HOBtの方のみが副反応を起こす理由について二
つの可能性が考えられる。In addition, in comparison between entry 3 and entry 6, there are two possibilities as to the reason why only NT-HOBt causes a side reaction even though pKa is an activator having almost the same activity. .

【００７３】一つめは、アデニン塩基がプロトン化され
た際の対アニオンの違いに着目した説明である。[化１
８]に示すようにエントリー6の条件では、アデニン塩基
が強酸であるトリフラートとの塩を形成している。一
方、エントリー3では、弱酸である活性化剤自身との塩
形成である。The first is an explanation focusing on the difference in counter anion when the adenine base is protonated. [Chemical 1
As shown in [8], under the condition of entry 6, the adenine base forms a salt with the strong acid triflate. On the other hand, in entry 3, it is salt formation with the activator itself which is a weak acid.

【００７４】ここで、k₁、k₃ << k₂ならびにk₁、k’₃ <
< k’₂である。しかしk_３ がk’_３より大きく、（9）よ
り（10）の方の寿命が長いため、エントリー6では副反
応が観測されないけれども、エントリー3では、多少の
副反応がおこったと考えられる。化18は、アデニン塩基
がプロトン化された際の対アニオンの違いを示す。Here, k ₁ , k ₃ << k ₂ and k ₁ , k ' ₃ <
<k ' ₂ . However, since k ₃ is larger than k ′ _{3 and} the lifetime of (10) is longer than that of (9), side reactions are not observed in entry 6, but it is considered that some side reactions occurred in entry 3. Chemical formula 18 shows a difference in counter anion when the adenine base is protonated.

【化１８】 [Chemical 18]

【００７５】二つめは、縮合反応の活性中間体に着目し
たものである。エントリー6の条件では、[化１９]のよ
うに活性中間体がP-N結合を持っているアミダイト型(9)
を経由する。このアミダイト型の中間体は、他のアゾー
ルを活性化剤として用いた場合も生成する。しかし、NT
-HOBtの場合はこのようなアミダイト型ではなく、ホス
ファイト型の中間体(10)を経由し反応が進行する。この
中間体の反応性が全く違うため、エントリー3では観測
される副反応がエントリー6では全く観測されないとい
う説明も考えられる。化１９は、活性化剤よる中間体の
相違を示す。The second one focuses on the active intermediate of the condensation reaction. Under the condition of entry 6, the amidite type (9) in which the active intermediate has a PN bond as shown in [Chemical formula 19]
Via. This amidite-type intermediate is also produced when another azole is used as an activator. But NT
In the case of -HOBt, the reaction proceeds via a phosphite type intermediate (10) instead of such an amidite type intermediate. It is possible that the side reaction observed in entry 3 is not observed in entry 6 because the reactivity of this intermediate is completely different. Chemical formula 19 shows the difference in the intermediates depending on the activator.

【化１９】 [Chemical 19]

【００７６】次に、上述の新規活性化剤を用いて、ApT
二量体と同様の合成サイクルでCpT二量体の合成を行っ
た。その逆相HPLCチャートを図５に示す。新規の活性化
剤いずれの場合においても、ApT合成においてみられた
塩基部位への副反応・DMTr基の脱離は、観測することな
く高い縮合率でCpT二量体を合成できた。ちなみに、エ
ントリー7の保持時間22分のピークとエントリー8の保持
時間4分のピークは、核酸由来のものではなく溶媒由来
のピークである。Next, using the above-mentioned novel activator, ApT
The CpT dimer was synthesized by the same synthesis cycle as the dimer. The reverse phase HPLC chart is shown in FIG. With any of the novel activators, CpT dimers could be synthesized with a high condensation rate without observing side reaction to the base site and elimination of DMTr group observed in ApT synthesis. Incidentally, the peak with a retention time of 22 minutes in entry 7 and the peak with a retention time of 4 minutes in entry 8 are peaks derived from the solvent, not from nucleic acids.

【００７７】また、NBTをアセトニトリル溶媒中で用い
ても、エントリー5の様なDMTr基の脱離は観測されなか
った。これらCpTの合成においてDMTr基の脱離が見られ
なかったのは、シトシン塩基の塩基性がアデニン塩基よ
りも高いためDMTr基が脱離しにくくなっていると考えら
れる。Even when NBT was used in an acetonitrile solvent, the elimination of DMTr group as in entry 5 was not observed. The elimination of the DMTr group was not observed in the synthesis of these CpTs, probably because the cytosine base has higher basicity than the adenine base, which makes it difficult to eliminate the DMTr group.

【００７８】また、エントリー7で副反応がみられない
のは、前述の通りシトシン塩基の塩基性がアデニン塩基
よりも高いため、シトシン塩基がNT-HOBtによってプロ
トン化された状態がアデニン塩基の場合よりも安定であ
るためであろう。In addition, no side reaction is observed in Entry 7 when the cytosine base is adenine base protonated by NT-HOBt because the cytosine base is higher in basicity than the adenine base as described above. Because it is more stable than.

【００７９】これまでのCpT、ApT合成の結果からNT-HOB
tとTRTを用いた縮合反応は、多少の問題点が指摘できた
が、NBIをTHF溶媒中で用いた縮合系では、副反応なく高
い縮合率で目的物を合成することができた。以下、この
活性化剤に焦点を絞ってApA、CpC、GpTの合成検討を行
った。ApAとCpCの合成では、3-2.で調製した末端にdAも
しくはdCを導入した固相担体として使用した。末端に導
入したdA・dCの塩基部位のアミノ基はDMTr基で保護され
ているが、このDMTr基の脱保護には水酸基のDMTr基の脱
保護の場合よりも長時間の酸処理を必要とする。今回
は、和田らの報告例に従いdAは1%TFA-ジクロロメタン溶
液で5分間、dCは3%TFA-ジクロロメタン溶液で30分間そ
れぞれ処理をし、脱保護を行った。化２０は、塩基部位
のアミノ基に導入したDMTr基の固相上での脱保護の反応
を示す。From the results of CpT and ApT synthesis up to now, NT-HOB
Although some problems could be pointed out in the condensation reaction using t and TRT, in the condensation system using NBI in THF solvent, the target compound could be synthesized with a high condensation rate without side reaction. Hereinafter, focusing on this activator, synthetic studies of ApA, CpC, and GpT were conducted. In the synthesis of ApA and CpC, it was used as a solid phase carrier having dA or dC introduced at the end prepared in 3-2. The amino group at the base site of the dA / dC introduced at the terminal is protected by the DMTr group, but deprotection of this DMTr group requires longer acid treatment than in the case of deprotecting the DMTr group of the hydroxyl group. To do. This time, according to the example reported by Wada et al., Deprotection was performed by treating dA with a 1% TFA-dichloromethane solution for 5 minutes and dC with a 3% TFA-dichloromethane solution for 30 minutes. Chemical formula 20 represents a deprotection reaction on the solid phase of the DMTr group introduced into the amino group at the base site.

【化２０】 [Chemical 20]

【００８０】固相合成サイクルは基本的には先程のApT
合成時と同様であるが、今回は活性化剤としてニトロベ
ンズイミダゾリニウムトリフラートのみを用いている。
また、dGアミダイトを用いた縮合では、グアニン塩基に
ほとんど塩基性がないためにトリチル基が脱離しやす
く、また過去の知見からグアニン塩基は副反応をおこさ
ないことがわかっていて塩基部位をプロトン化する必要
がないため、活性化剤はアミダイトユニットと当量の20
当量しか用いていない。以下に切り出し直後・未精製の
ApA、CpC、GpTの逆相HPLCチャートを図６に示す。The solid phase synthesis cycle is basically the ApT
Same as during synthesis but this time only nitrobenzimidazolinium triflate is used as activator.
In addition, in the condensation using dG amidite, the trityl group is easily eliminated because the guanine base has almost no basicity, and it has been known from past knowledge that the guanine base does not cause a side reaction and the base site is protonated. Therefore, the activator is equivalent to 20% of the amidite unit.
Only the equivalent is used. Immediately after cutting out, unrefined
The reverse phase HPLC chart of ApA, CpC, and GpT is shown in FIG.

【００８１】どの場合においても、高い縮合率でまた副
反応をおこすことなく、目的物を合成することができ
た。In all cases, the desired product could be synthesized with a high condensation rate and without causing side reactions.

【００８２】実施例３NBTを活性化剤として用いるDNA四量体の合成検討 本実施例において、NBTを活性化剤として用いるDNA四量
体の合成検討を行った。縮合反応ステップでは二量体合
成時と同様に、dA、dCの場合はユニット20当量とNBT40
当量を用い、またdGにおいてはユニット20当量とNBT 20
当量を用いて一分間反応させた。合成サイクルも前述し
た二量体の合成と同じで、酸化にはヨウ素処理を行い固
相からの切り出しはアンモニア処理を行った。図７に切
り出し直後・未精製のAAAT、CCCT、GGGTの逆相HPLCを示
す。図８にＮＢＴを用いたＧＧＧＴの固相上での合成結
果を示す。Example 3 Synthesis study of DNA tetramer using NBT as activator In this example, synthesis study of DNA tetramer using NBT as activator was conducted. In the condensation reaction step, as in dimer synthesis, in the case of dA and dC, 20 equivalent units and NBT40
Equivalents are used, and in dG 20 units and NBT 20
Reaction was carried out for 1 minute using an equivalent amount. The synthesis cycle was the same as the above-described synthesis of the dimer, and the oxidation was treated with iodine, and the cleavage from the solid phase was treated with ammonia. Fig. 7 shows reverse-phase HPLC of unpurified AAAT, CCCT, and GGGT immediately after cutting. FIG. 8 shows the synthesis result of GGGT using NBT on a solid phase.

【００８３】この結果、四量体の合成でも、高い縮合効
率で鎖長の伸長を行うことができ、また塩基部への副反
応はほとんど観測されなかった。これらのピークの確認
は、massスペクトルによりおこなっている。エントリー
6、9−15で見てきたように、活性化剤としてNBTを用い
た場合、塩基部位が無保護の条件下でも四量体まで全く
問題なく鎖伸長を行うことができた。これは塩基部位無
保護ホスホロアミダイト法では初めてのことであり、従
来までの手法に必要だった、副反応の結果生じるP-N結
合を開裂除去するステップを省略し、DNAオリゴマーを
合成するという目標にことができたと言っても過言では
ない。As a result, even in the synthesis of the tetramer, the chain length could be extended with high condensation efficiency, and the side reaction to the base part was hardly observed. These peaks are confirmed by the mass spectrum. entry
As seen in Sections 6 and 9-15, when NBT was used as the activator, chain extension could be performed on the tetramer without any problem even under conditions where the base moiety was unprotected. This is the first time for the phosphoramidite method without base site protection, and the goal of synthesizing a DNA oligomer is to omit the step of cleaving and removing the PN bond resulting from a side reaction, which was required in conventional methods. It's no exaggeration to say that I was able to do it.

【００８４】実施例４NBTを活性化剤として用いるDNAオリゴヌクレオチドの合
成検討 本実施例では、より長い鎖長のDNA合成検討のために、
(CAA)₃9量体を合成している。合成条件は前述した固相
合成サイクル（表１）を用い、また、5’水酸基の保護
基がDMTr基でリン部位の保護基がシアノエチル基である
アミダイトユニットを使用している。その時の切り出し
直後、未精製の陰イオン交換HPLCをエントリー16に示
す。Example 4 Synthesis of DNA oligonucleotides using NBT as activator
In this example, in order to study longer chain length DNA synthesis,
(CAA) are synthesized ₃ 9-mer. As the synthesis conditions, the solid-phase synthesis cycle described above (Table 1) is used, and an amidite unit in which the 5'-hydroxyl protecting group is DMTr group and the phosphorus moiety protecting group is cyanoethyl group is used. Immediately after excision at that time, crude anion exchange HPLC is shown in entry 16.

【００８５】目的の9量体のピークはメインに観測され
るものの、4量体までのDNA合成では観測されていなかっ
た目的物より鎖長の長い副反応生成物が今回の合成では
問題となった。この副反応は、(CAA)₃という配列に限っ
てあらわれるものではなく、以下に示すC₆Tの合成にお
いても観測される。Although the target 9-mer peak was mainly observed, a side reaction product having a longer chain length than the target product, which was not observed in the DNA synthesis up to the tetramer, became a problem in this synthesis. It was This side reaction is not limited to the sequence (CAA) ₃ and is also observed in the following C ₆ T synthesis.

【００８６】ここでC₆Tの合成を行ったのは、目的化合
物の塩基の種類と鎖長を減らすことで、反応の解析をよ
り簡単にするためである。合成条件は前述した固相合成
サイクル（表１）を用い、また、5’水酸基の保護基がD
MTr基でリン部位の保護基がシアノエチル基であるアミ
ダイトユニットを使用している。この場合においても(C
AA)₃のときと同様、目的の7量体のピークはメインに観
測されるものの、目的物より鎖長の長い副反応生成物が
みられた。C ₆ T was synthesized here in order to simplify the analysis of the reaction by reducing the type of base and the chain length of the target compound. The solid-phase synthesis cycle (Table 1) described above was used as the synthesis condition, and the 5'-hydroxyl protecting group was D.
An amidite unit whose MTr group is a cyanoethyl group as the phosphorus group protecting group is used. Even in this case (C
Similar to the case of AA) ₃ , the target 7-mer peak was mainly observed, but a side reaction product with a longer chain length than the target was observed.

【００８７】そこで、この副反応を抑制するために今回
は2つの操作を行っている。一つめの操作では、アミダ
イトユニットの5’水酸基の保護基をDMTr基からMMTr基
にかえて、縮合反応を行った。もう一つは、リン部位の
保護基をシアノエチル基からメチル基に変えたアミダイ
トユニットを使用して縮合反応をおこなっている。アミ
ダイトユニットの5’水酸基の保護基をDMTr基からMMTr
基にかえた操作を行ったのは、縮合反応中にDMTr基の脱
離が起きため目的物よりも鎖長の長い副反応生成物が観
測されたのではないかという懸念からである。この時の
合成条件は、後述する固相合成サイクル（表２）を用い
ているが、これは今まで用いてきた合成サイクルと比較
して脱トリチル化の反応時間を長めに設定している。Therefore, in order to suppress this side reaction, two operations are performed this time. In the first operation, the protecting group for the 5'hydroxyl of the amidite unit was changed from the DMTr group to the MMTr group, and the condensation reaction was performed. The other is a condensation reaction using an amidite unit in which the protecting group at the phosphorus moiety is changed from a cyanoethyl group to a methyl group. Protecting the 5'hydroxyl group of the amidite unit from DMTr to MMTr
The reason why the operation was changed to the group was that there was concern that a side reaction product with a longer chain length than the target product was observed due to the elimination of the DMTr group during the condensation reaction. As the synthesis conditions at this time, the solid-phase synthesis cycle (Table 2) described later is used, but this sets a longer reaction time for detritylation as compared with the synthesis cycles used so far.

【表２】 [Table 2]

【００８８】この合成サイクルを用いて合成したC₆Tの
切り出し直後、未精製の陰イオン交換HPLCをエントリー
18に示す。図１１のチャートが示すように、副反応物は
以前と全く変わらずメインピークより後ろに観測され
る。このことから、この副反応がトリチル基の脱離によ
っておこっていたのではないことがわかった。Immediately after excision of C ₆ T synthesized using this synthesis cycle, an unpurified anion exchange HPLC was entered.
Shown in 18. As shown in the chart of FIG. 11, the side reaction product is observed after the main peak without any change. From this, it was found that this side reaction was not caused by elimination of the trityl group.

【００８９】以前、Letsingerら( S. M. Gryaznov, R.
L. Letsinger, J. Am. Chem. Soc.,113, 5876(1991).、
S. M. Gryaznov, R. L. Letsinger, Ncleic Acids Re
s., 20, 1879(1992). )は、リン部位の保護基がメチル
基であるアミダイトユニットを活性化し、イミダゾリド
体に変換してもアルコールとは反応しないことを³¹P-NM
Rで確認している。一方、リン部位の保護基がシアノエ
チル基であるアミダイトユニットを活性化したイミダゾ
リド体は、アルコールと反応しホスファイトを形成する
こともわかっている。[化２１]は、リン部位の保護基が
ホスフィチル化反応に与える影響を示す。Previously, Letsinger et al. (SM Gryaznov, R.
L. Letsinger, J. Am. Chem. Soc., 113, 5876 (1991).,
SM Gryaznov, RL Letsinger, Ncleic Acids Re
s., 20, 1879 (1992 ).) is a phosphoramidite unit protecting group of phosphoric site is a methyl group and activation, ³¹ P-NM that does not react with the alcohol be converted into imidazolide body
I'm checking with R. On the other hand, it is also known that the imidazolide derivative in which the amidite unit whose protecting group at the phosphorus moiety is a cyanoethyl group is activated reacts with alcohol to form a phosphite. [Chemical Formula 21] shows the effect of the protecting group at the phosphorus moiety on the phosphitylation reaction.

【化２１】 [Chemical 21]

【００９０】つまり、リン部位の保護基がホスフィチル
化反応に与える影響は大きく、アミダイトユニットの反
応性をずいぶんと変えてしまう。そこで、このような知
見をもとに塩基部位への副反応を抑制するためのもう一
つ操作として、リン部位の保護基をシアノエチル基から
メチル基に変えたアミダイトユニットを使用して縮合反
応をおこなった。アミダイトユニットの反応性を低くし
て、塩基部位への反応を抑制することが目的である。That is, the protecting group at the phosphorus moiety has a great influence on the phosphitylation reaction, and considerably changes the reactivity of the amidite unit. Therefore, based on these findings, as another operation to suppress side reactions at the base site, the condensation reaction was performed using an amidite unit in which the protecting group at the phosphorus site was changed from a cyanoethyl group to a methyl group. I did it. The purpose is to lower the reactivity of the amidite unit and suppress the reaction to the base site.

【００９１】今まで用いてきた、シアノエチル基はアン
モニア処理でβ脱離し脱保護をされるが、ここでは脱メ
チル化のため、[化２２]に示すように固相上でベンゼン
チオール処理を行っている。この処理を1時間行った
後、通常の切り出し操作をおこなって、反応生成物を得
た。化２２は、固相上での脱メチル化の反応を示す。The cyanoethyl group, which has been used so far, is β-eliminated by ammonia treatment for deprotection, but here, for demethylation, benzenethiol treatment is performed on the solid phase as shown in [Chemical Formula 22]. ing. After this treatment was performed for 1 hour, a normal cutting operation was performed to obtain a reaction product. Chemical formula 22 represents a demethylation reaction on a solid phase.

【化２２】 このときの、合成サイクルを表３に示す。[Chemical formula 22] Table 3 shows the synthesis cycle at this time.

【表３】 NBTを用いたC₆Tの固相上での合成（陰イオン交換HPLC）
を図12に示す。[Table 3] Solid-phase synthesis of C ₆ T using NBT (anion exchange HPLC)
Is shown in FIG.

【００９２】[0092]

【発明の効果】本発明の核酸の合成法によれば、より迅
速、かつ正確に所望の核酸を合成しうるという有利な効
果を奏する。According to the method of synthesizing a nucleic acid of the present invention, there is an advantageous effect that a desired nucleic acid can be synthesized more rapidly and accurately.

【００９３】また、本発明の核酸の合成法によれば、合
成の工程を短縮化することができるため、より簡便に核
酸を合成し得るという有利な効果を奏する。Further, according to the method for synthesizing a nucleic acid of the present invention, the process of synthesis can be shortened, so that the advantageous effect that the nucleic acid can be synthesized more easily is exhibited.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 S-エチルテトラゾールを用いたTpC二量体の
合成を示す。FIG. 1 shows the synthesis of TpC dimers using S-ethyltetrazole.

【図２】 BIT、NBT、NT-HOBt、及びTRTを用いたTpC二
量体の合成を示す。FIG. 2 shows the synthesis of TpC dimers using BIT, NBT, NT-HOBt, and TRT.

【図３】 ApTの逆相HPLC（条件A）とUVを示す。FIG. 3 shows reverse phase HPLC (condition A) and UV of ApT.

【図４】 固相上でのApT合成の逆相HPLC（条件A）の結
果を示す。FIG. 4 shows the results of reverse phase HPLC (Condition A) of ApT synthesis on solid phase.

【図５】 CpT二量体の固相合成の逆相HPLC（条件B）の
結果を示す。FIG. 5 shows the results of reverse phase HPLC (condition B) of solid phase synthesis of CpT dimer.

【図６】 NBTを用いたCpC、ApA、GpTの固相上での合成
（逆相HPLC・条件A）の結果を示す。FIG. 6 shows the results of CpC, ApA and GpT synthesis using NBT on a solid phase (reverse phase HPLC / condition A).

【図７】 NBTを用いたCCCT、AAATの固相上での合成
（逆相HPLC・条件B）の結果を示す。FIG. 7 shows the results of synthesis of CCCT and AAAT using NBT on a solid phase (reverse phase HPLC / condition B).

【図８】 NBTを用いたGGGTの固相上での合成（逆相HPL
C・条件A）の結果を示す。FIG. 8: Synthesis of GGGT on solid phase using NBT (reverse phase HPL
The results of C and condition A) are shown.

【図９】 NBIを用いた(CAA)₃の固相上での合成（陰イ
オン交換HPLC）の結果を示す。FIG. 9 shows the result of synthesis (anion exchange HPLC) of (CAA) _{3 on} a solid phase using NBI.

【図１０】 NBTを用いたC₆Tの固相上での合成（陰イオ
ン交換HPLC）の結果を示す。FIG. 10 shows the results of synthesis (anion exchange HPLC) of C ₆ T on a solid phase using NBT.

【図１１】 NBTを用いたC₆Tの固相上での合成（陰イオ
ン交換HPLC）の結果を示す。FIG. 11 shows the results of synthesis (anion exchange HPLC) of C ₆ T on a solid phase using NBT.

【図１２】 NBTを用いたC₆Tの固相上での合成（陰イオ
ン交換HPLC）の結果を示す。FIG. 12 shows the results of C ₆ T solid phase synthesis (anion exchange HPLC) using NBT.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大窪 章寛 東京都町田市小川１−10−５−202 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA11 HA20 4C057 AA21 BB02 BB05 DD01 MM04   ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (72) Inventor Akihiro Okubo             1-10-5-202 Ogawa, Machida, Tokyo F term (reference) 4B024 AA20 CA01 CA11 HA20                 4C057 AA21 BB02 BB05 DD01 MM04

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 核酸の塩基部分を保護せずに当該核酸を
合成する方法であって、プロトン供与体の存在下、ヌク
レオチド同士を縮合反応させてリン酸エステル結合させ
ることを特徴とする核酸の合成法。1. A method for synthesizing a nucleic acid without protecting the base portion of the nucleic acid, which comprises subjecting nucleotides to a condensation reaction in the presence of a proton donor to form a phosphate ester bond. Synthetic method. 【請求項２】 前記プロトン供与体のpKaが、3.6以下で
あることを特徴とする請求項1記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the pKa of the proton donor is 3.6 or less. 【請求項３】 前記プロトン供与体が、４−ニトロベン
ズイミダゾールトリフラート、4−ニトロ−６−(トリフ
ルオロメチル)ベンゾトリアゾール−１−オール、又は
トリアゾールトリフラートからなる群から選択される少
なくとも1種であることを特徴とする請求項1又は2項に
記載の方法。3. The proton donor is at least one selected from the group consisting of 4-nitrobenzimidazole triflate, 4-nitro-6- (trifluoromethyl) benzotriazol-1-ol, or triazole triflate. The method according to claim 1 or 2, characterized in that: 【請求項４】 前記縮合反応を液相で行うことを特徴と
する請求項1〜3項のいずれか1項に記載の方法。4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the condensation reaction is carried out in a liquid phase. 【請求項５】 前記縮合反応を固相で行うことを特徴と
する請求項1〜3項のいずれか1項に記載の方法。5. The method according to claim 1, wherein the condensation reaction is performed in a solid phase.