JP2003000293A - Method for reducing 4-cyanoacetoacetate compound - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for reducing the carbonyl group on the 3-position of a 4-cyanoacetoacetate compound. SOLUTION: This method for reducing the carbonyl group on the 3-position of the 4-cyanoacetoacetate compound comprises contacting the 4- cyanoacetoacetate compound of formula (1) (where, R is a 1-8C alkyl) with an enzyme (a), or (b) described below: (a) using an enzyme having a specific amino acid sequence, or (b) using an enzyme comprising an amino acid sequence where at least one amino acid is deleted from, substituted in or added to the above specific amino acid sequence and having the enzymatic activity to reduce the carbonyl group on the 3-position of the 4-cyanoacetoacetate compound of formula (1).

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は４−シアノアセト酢
酸エステル化合物の還元方法、詳しくは４−シアノアセ
ト酢酸エステル化合物の３位のカルボニル基の還元方法
に関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】４−
シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステル化合物は医農
薬中間体として有用であり（例えば特表平５−３３１１
２８号公報）、該化合物を製造するために４−シアノア
セト酢酸エステル化合物の３位のカルボニル基を還元す
る反応の開発が望まれている。 【０００３】 【課題を解決するための手段】本発明者等は、４−シア
ノアセト酢酸エステル化合物の３位のカルボニル基を還
元する方法を鋭意検討した結果、後記一般式（１）で示
される４−シアノアセト酢酸エステル化合物に配列番号
１で示されるアミノ酸配列を有する酵素又は配列番号１
において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式
（１）で示されるで示される４−シアノアセト酢酸エス
テル化合物の３位のカルボニル基を還元する酵素活性を
有する酵素を作用させることにより目的を達することを
見出し、本発明を完成した。 【０００４】即ち、本発明は以下の発明を提供する。 一般式（１） 【化２】 （式中、ＲはＣ１−Ｃ８アルキル基を表す。） で示される４−シアノアセト酢酸エステル化合物に下記
ａ）またはｂ）を作用させることを特徴とする一般式
（１）で示される４−シアノアセト酢酸エステル化合物
の３位のカルボニル基の還元方法（以下、本発明方法と
記す。）。 ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素。 ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ、一般式（１）で示される４−シアノアセト酢酸エス
テル化合物の３位のカルボニル基を還元する酵素活性を
有する酵素。（以下、ａ）およびｂ）をあわせて本酵素
と総称する。） 【０００５】 【発明の実施の形態】本発明方法に用いられる一般式
（１）で示される４−シアノアセト酢酸エステル化合物
においてＲで示されるＣ１−Ｃ８アルキル基としては、
例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル
基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基が
挙げられる。 【０００６】本発明方法に用いられる配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子配列
は配列番号２で示される（Appl. Microbiol. Biotechno
l (1999)52,386-392）。該酵素のアミノ酸配列をコード
する塩基配列を有する遺伝子は、天然に存在する遺伝子
であっても、天然に存在する遺伝子を変異処理（部分変
異導入法、突然変異処理等）を行ったものであってもよ
い。 【０００７】本酵素は、例えば配列番号２で示される遺
伝子を含有し、該遺伝子が発現することによって配列番
号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素を産生する微
生物を培養することにより製造することができる。配列
番号２で示される遺伝子を含有し、該遺伝子が発現する
ことによって配列番号１で示されるアミノ酸配列を有す
る酵素を産生する微生物は、天然に存在する微生物で
も、配列番号２で示される塩基配列を有する遺伝子を導
入した形質転換微生物であっても良い。 【０００８】ここで、配列番号２で示される塩基配列を
有する遺伝子を導入した形質転換微生物の作成法につい
て説明する。配列番号２で示される塩基配列を有する遺
伝子を導入する宿主細胞としては、例えば、Escherichi
a、Bacillus、Corynebacterium、Staphylococcus、Stre
ptomyces、Saccharomyces、Kluyveromyces及びAspergil
lus属に属する微生物があげられる。該遺伝子を宿主細
胞へ導入する方法は、宿主となる細胞に応じて通常用い
られる方法であれば特に限定されるものではなく、例え
ば、「Molecular Cloning: ALaboratory Manual 2^nd ed
ition」（1989）, Cold Spring Harbor LaboratoryPres
s、「Current Protocols in Molecular Biology」(198
7), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に
記載される塩化カルシウム法や、「Methods inElectrop
oration:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Ra
d Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレ
ーション法が挙げられる。 【０００９】該遺伝子が導入された形質転換微生物は、
遺伝子を宿主細胞に導入する際に用いられるベクターに
含まれる選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選
抜することができる。形質転換微生物が該遺伝子を保有
していることは、該形質転換微生物からベクターＤＮＡ
を調製した後、調製されたＤＮＡについて、例えば「モ
レキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コールド
・スプリング・ハーバー、1989年）等に記載される通常
の方法（制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザン
ハイブリダイゼーション等）を行うことにより確認する
ことができる。 【００１０】次に、本発明製造法に用いられる本酵素を
製造するために配列番号２で示される遺伝子を含有し、
該遺伝子が発現することによって配列番号１で示される
アミノ酸配列を有する酵素を産生する微生物を培養する
方法について説明する。 【００１１】該微生物を培養する為の培地としては、微
生物の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や
無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。 【００１２】炭素源としては、例えばグルコース、デキ
ストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の
糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有
機酸、動植物油、糖蜜が挙げられる。これら炭素源の培
地への添加量は、培地全量に対し通常、０．１〜２０％
（ｗ／ｖ）程度とするとよい。 【００１３】窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵
母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・
リカー（Corn Steep Liquor ）、綿実粉、乾燥酵母、カ
ザミノ酸等の天然有機窒素源やアミノ酸類、硝酸ナトリ
ウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩や硝酸塩、フマ
ル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸の
アンモニウム塩、尿素などの有機または無機窒素源等が
挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天
然有機窒素源、アミノ酸類等は、多くの場合、炭素源と
しても使用することができる。窒素源の添加量は培地全
量に対し通常、０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度とすると
よい。 【００１４】有機塩や無機塩としては、カリウム、ナト
リウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛
等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩類およびリン酸塩
類を挙げることができ、具体的には、塩化ナトリウム、
塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マ
ンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリ
ウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素一
カリウム、リン酸水素二カリウム等を挙げることができ
る。有機塩や無機塩の添加量は培地全量に対し通常、
０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。 【００１５】さらに、tacプロモーター、trcプロモータ
ー、lacプロモーター等のアロラクトースで誘導される
タイプのプロモーターと本酵素をコードする遺伝子とが
機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入された宿主
細胞の場合には、該酵素の生産を誘導するための誘導剤
として、例えばisopropyl thio-β-D-galactoside（IPT
G）を培地中に少量加えてもよい。 【００１６】培養は、微生物の培養に通常使用される方
法に準じて行うことができ、例えば試験管振盪式培養、
往復式振盪培養、ジャーファーメンター(Jar Fermente
r)培養、タンク培養等の液体培養、固体培養等の方法が
可能である。ジャーファーメンターを用いる場合には、
ジャーファーメンター内に無菌空気を導入する必要があ
り、通常、培養液容量の約０．１〜約２倍／分の通気条
件を用いる。培養温度は、３５〜４２℃の範囲が好まし
く、培地のｐＨとしては、約６〜約８の範囲が好まし
い。 培養時間は、培養条件によって異なるが、通常約
1日間〜約5日間が望ましい。 【００１７】本発明製造法には、例えばこのようにして
得られた本酵素を含有する菌体、菌体処理物、または本
酵素の精製物を用いることができる。 【００１８】ここで菌体処理物としては、例えば、凍結
乾燥菌体、有機溶媒処理菌体、乾燥菌体、菌体摩砕物、
菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、
菌体のアルカリ処理物を挙げることができ、さらにこれ
ら通常用いられる方法で固定化したものがあげられる。 【００１９】本酵素の精製物は例えば本酵素を有する微
生物の培養物から本酵素を精製することにより製造する
ことができきる。本酵素を有する微生物の培養物から本
酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製
において使用される方法を適用することができ、例えば
次のような方法を挙げることができる。まず、微生物の
培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超
音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物
理的破砕方法、または界面活性剤もしくはリゾチーム等
の菌体溶菌酵素を用いる化学的破砕方法等によって破砕
する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィル
ターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製
し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン
交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲ
ルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分
画することによって本還元酵素を精製することができ
る。クロマトグラフィーに使用する担体としては、例え
ば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ＤＥＡＥ基、フェニ
ル基もしくはブチル基等を導入したセルロース、デキス
トランまたはアガロース等の樹脂担体が挙げられる。市
販の担体充填済みカラムを用いることもでき、例えば、
Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いず
れもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、Ｔ
ＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）
等が挙げられる。 【００２０】続いて、本発明方法について説明する。本
発明方法の一般式（１）で示される４−シアノアセト酢
酸エステル化合物の３位のカルボニル基を還元する反応
は一般式（１）で示される４−シアノアセト酢酸エステ
ル化合物に本酵素を作用させることによって達成され
る。該反応は通常、水の存在下で行われ、水は緩衝液の
形態であってもよく、この場合に用いられる緩衝剤とし
ては、例えばリン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリ
ン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等
の酢酸のアルカリ金属塩が挙げられる。この場合のｐＨ
は反応が進行する範囲内で適宜変化させることができ
る。 【００２１】緩衝液を溶媒として用いる場合、その量は
一般式（１）で示される４−シアノアセト酢酸エステル
化合物１重量部に対して、通常１００重量部以下であ
る。 【００２２】反応温度は、本酵素の安定性、反応速度の
点から０〜７０℃であり、好ましくは１０〜４０℃であ
る。 【００２３】該反応は、水の他に有機溶媒の共存下に行
うこともできる。この場合の有機溶媒としては、例え
ば、テトラヒドロフラン、ｔ−ブチルメチルエーテル、
イソプロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、ヘ
キサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、デ
カンなどの炭化水素類、ｔ−ブタノール、メタノール、
エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールなどの
アルコール類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキ
サイド類、アセトンなどのケトン類、アセトニトリルな
どのニトリル類およびこれらの混合物が挙げられる。反
応に使用する有機溶媒の量は、一般式（１）で示される
４−シアノアセト酢酸エステル化合物１重量部に対して
通常は１００重量部以下であり、好ましくは５０重量部
以下である。 【００２４】該反応はさらに、補酵素（例えばＮＡＤ
Ｈ、ＮＡＤＰＨ）を加えて行うこともできる。反応に用
いられる補酵素の量は一般式（１）で示される４−シア
ノアセト酢酸エステル化合物に対して通常０．５重量倍
以下、好ましくは０．１重量倍以下である。反応に補酵
素を加える場合、補酵素の効率を高めるために、さらに
以下のものを加えることが好ましい。 １）ギ酸、グルコース、イソプロパノ−ル、２−ブタノ
ール、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプ
タノール、２−オクタノール等の化合物 この場合に用いられるこれらの化合物の量は一般式
（１）で示される４−シアノアセト酢酸エステル化合物
に対して１００重量倍以下、好ましくは１０重量倍以下
である。 ２）ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素等の脱水素
酵素 この場合に用いられる脱水素酵素の量は、一般式（１）
で示される４−シアノアセト酢酸エステル化合物に対し
て０．１重量倍以下、好ましくは０．０５重量倍以下で
ある。 【００２５】該反応は、例えば、水、一般式（１）で示
される４−ブロモアセト酢酸エステル化合物、本酵素、
必要に応じて補酵素、有機溶媒を混合し、攪拌、振盪す
ることにより行うことができる。 【００２６】反応の終点は例えば反応液中の原料化合物
の存在量を液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラ
フィー等により追跡することにより決定することができ
る。反応時間の範囲は、通常５分間〜４日間の範囲であ
る。 【００２７】反応終了後は、必要に応じて反応液をヘキ
サン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢
酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機層を乾
燥した後、濃縮することにより還元生成物を単離するこ
とができる。還元生成物は、必要によりカラムクロマト
グラフィー等により精製することができる。 【００２８】本発明方法に用いる４−シアノアセト酢酸
エステル化合物は、例えば４−ブロモアセト酢酸エステ
ル化合物とシアン化カリウムをメタノール中で反応させ
ることにより製造することができる。 【００２９】本発明製造法には、ａ）配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列を有する酵素の代わりに、ｂ）配列番
号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式
（１）で示される４−シアノアセト酢酸エステル化合物
を一般式（２）で示される光学活性４−シアノ−３−ヒ
ドロキシブタン酸エステル化合物に還元する酵素活性を
有する酵素を用いることもできる。この場合は、例え
ば、配列番号２で示されるＤＮＡに、例えばＤＮＡに点
変異等を生じさせるための周知技術である、部位特定変
異誘導法；ＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択された
ヌクレオチドを除去又は付加し、ＤＮＡを連結する方
法；又はオリゴヌクレオチド変異誘導体法を施すことに
より作成できる、配列番号１において１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ、一般式（１）で示される４−シアノア
セト酢酸エステル化合物を一般式（２）で示される光学
活性４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステル化合
物に還元する酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子
を作成し、前記と同様に形質転換体の作成、培養、反応
等を行い本発明製造法を行うことができる。 【００３０】 【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではな
い。 【００３１】実施例 フラスコに液体培地（水１０００ｍｌにトリプトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ及び塩化ナトリウム５ｇを溶解し、
１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下することにより、ｐ
Ｈ７．０としたもの。）９００ｍｌを入れて滅菌した
後、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ、isopropyl thio
-β-D-galactoside（IPTG）を０．４ｍＭになるように
加え、ここに配列番号２で示されるＤＮＡを含有するプ
ラスミドｐＵＡＲ（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２
７）でE. coli JM109株を常法により形質転換した形質
転換体E. coli JM109/pUAR株を前記組成の液体培地で培
養した培養液１ｍｌを接種し、３７℃で１４時間振盪培
養した。この培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５
分、４℃）して得られた菌体を５０ｍＭリン酸１カリウ
ム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍ
ｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、
１５分、４℃）して洗浄菌体を得た。４−シアノアセト
酢酸エチル２１ｍｇ、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン
酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０、ＮＡＤ⁺ １ｍ
Ｍを溶解）１ｍｌを混合し、ここに２−プロパノール７
５μｌ、デカン１．５ｍｌを加えた。ここに上記洗浄菌
体２００ｍｇをリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバ
ッファー（ｐＨ７．０）０．５ｍｌに懸濁したものを注
加して、室温で２４時間攪拌した。その後、反応液に酢
酸エチル３ｍｌを加え、激しく攪拌した。この液を遠心
分離（３５００ｒｐｍ、１０分）し、得られた有機層を
ガスクロマトグラフィー分析に付した。４−シアノ−３
−ヒドロキシブタン酸エチルの標品と保持時間が一致す
ること、およびマススペクトルのデータより、４−シア
ノアセト酢酸エチルの３位のカルボニル基が還元された
化合物である４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エチ
ルの生成を確認した。 ＭＳ：（ｍ／ｚ） １５７（Ｍ⁺）、１３０、１１７、
１１２ 【００３２】ガスクロマトグラフィー分析条件 カラム：ＤＢ−１（Ｊ＆Ｗサイエンス社製）０．５３ｍ
ｍφ×３０ｍ、膜厚１．５μｍ 注入口温度：１２０℃ カラム室温度：５０℃→（４℃／分）→１７０℃ ＦＩＤ検出器温度：３００℃ キャリアガス：ヘリウム 流速：１０ｍｌ／分 ４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エチルの保持時間
１４分 【００３３】 【発明の効果】本発明の還元方法により４−シアノアセ
ト酢酸エステル化合物の３位のカルボニル基を還元する
ことができる。 【００３４】 【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Chemical Co., Ltd. <120> Reduction method of 4-cyanoacetoacetic acid ester <130> P153363 <150> JP 2000-372705 <151> 2000-12-07 <160> 2 <210> 1 <211> 385 <212> PRT <213> Corynebacterium sp. <400> 1 Met Lys Ala Ile Gln Tyr Thr Arg Ile Gly Ala Glu Pro Glu Leu Thr 1 5 10 15 Glu Ile Pro Lys Pro Glu Pro Gly Pro Gly Glu Val Leu Leu Glu Val 20 25 30 Thr Ala Ala Gly Val Cys His Ser Asp Asp Phe Ile Met Ser Leu Pro 35 40 45 Glu Glu Gln Tyr Thr Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly 50 55 60 Ala Gly Lys Val Ala Ala Val Gly Glu Gly Val Glu Gly Leu Asp Ile 65 70 75 80 Gly Thr Asn Val Val Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Asn Cys Trp 85 90 95 His Cys Ser Gln Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Gln Glu Leu 100 105 110 Gly Ile Asn Pro Pro Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ala Leu Ala Glu Phe 115 120 125 Met Ile Val Asp Ser Pro Arg His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp 130 135 140 Pro Val Lys Thr Val Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His 145 150 155 160 Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro Lys Leu Arg Gly Gly Ser Tyr Ala Val 165 170 175 Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu Gly His Val Ala Ile Gln Leu Leu Arg 180 185 190 His Leu Ser Ala Ala Thr Val Ile Ala Leu Asp Val Ser Ala Asp Lys 195 200 205 Leu Glu Leu Ala Thr Lys Val Gly Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp 210 215 220 Lys Asp Ala Ala Glu Asn Val Arg Lys Ile Thr Gly Ser Gln Gly Ala 225 230 235 240 Ala Leu Val Leu Asp Phe Val Gly Tyr Gln Pro Thr Ile Asp Thr Ala 245 250 255 Met Ala Val Ala Gly Val Gly Ser Asp Val Thr Ile Val Gly Ile Gly 260 265 270 Asp Gly Gln Ala His Ala Lys Val Gly Phe Phe Gln Ser Pro Tyr Glu 275 280 285 Ala Ser Val Thr Val Pro Tyr Trp Gly Ala Arg Asn Glu Leu Ile Glu 290 295 300 Leu Ile Asp Leu Ala His Ala Gly Ile Phe Asp Ile Gly Gly Gly Asp 305 310 315 320 Leu Gln Ser Arg Gln Arg Cys Arg Ser Val Ser Thr Thr Gly Cys Arg 325 330 335 Asn Ala Gln Arg Pro Cys Gly Cys Gly Pro Trp Ser Val Val Pro Thr 340 345 350 Ala Val Glu Arg Gln Arg Lys Asn Thr Asp Ala Arg Pro Asn Ser Ile 355 360 365 Arg Pro Gly Ile Ser Val Arg Asn Ser Val Cys Ala Ser Cys Thr Pro 370 375 380 Arg 385 <210> 2 <211> 1158 <212> DNA <213> Corynebacterium sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1158) <400> 2 atg aag gcg atc cag tac acg cga atc ggc gcg gaa ccc gaa ctc acg 48 Met Lys Ala Ile Gln Tyr Thr Arg Ile Gly Ala Glu Pro Glu Leu Thr 1 5 10 15 gag att ccc aaa ccc gag ccc ggt cca ggt gaa gtg ctc ctg gaa gtc 96 Glu Ile Pro Lys Pro Glu Pro Gly Pro Gly Glu Val Leu Leu Glu Val 20 25 30 acc gct gct ggc gtc tgc cac tcg gac gac ttc atc atg agc ctg ccc 144 Thr Ala Ala Gly Val Cys His Ser Asp Asp Phe Ile Met Ser Leu Pro 35 40 45 gaa gag cag tac acc tac ggc ctt ccg ctc acg ctc ggc cac gaa ggc 192 Glu Glu Gln Tyr Thr Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly 50 55 60 gca ggc aag gtc gcc gcc gtc ggc gag ggt gtc gaa ggt ctc gac atc 240 Ala Gly Lys Val Ala Ala Val Gly Glu Gly Val Glu Gly Leu Asp Ile 65 70 75 80 gga acc aat gtc gtc gtc tac ggg cct tgg ggt tgc ggc aac tgt tgg 288 Gly Thr Asn Val Val Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Asn Cys Trp 85 90 95 cac tgc tca caa gga ctc gag aac tat tgc tct cgc gcc caa gaa ctc 336 His Cys Ser Gln Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Gln Glu Leu 100 105 110 gga atc aat cct ccc ggt ctc ggt gca ccc ggc gcg ttg gcc gag ttc 384 Gly Ile Asn Pro Pro Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ala Leu Ala Glu Phe 115 120 125 atg atc gtc gat tct cct cgc cac ctt gtc ccg atc ggt gac ctc gac 432 Met Ile Val Asp Ser Pro Arg His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp 130 135 140 ccg gtc aag acg gtg ccg ctg acc gac gcc ggt ctg acg ccg tat cac 480 Pro Val Lys Thr Val Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His 145 150 155 160 gcg atc aag cgt tct ctg ccg aaa ctt cgc gga ggc tcg tac gcg gtt 528 Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro Lys Leu Arg Gly Gly Ser Tyr Ala Val 165 170 175 gtc att ggt acc ggc ggt ctc ggc cac gtc gct att cag ctc ctc cgc 576 Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu Gly His Val Ala Ile Gln Leu Leu Arg 180 185 190 cac ctc tcg gcg gca acg gtc atc gct ttg gac gtg agc gcg gac aag 624 His Leu Ser Ala Ala Thr Val Ile Ala Leu Asp Val Ser Ala Asp Lys 195 200 205 ctc gaa ctg gca acc aag gta ggc gct cac gaa gtg gtt ctg tcc gac 672 Leu Glu Leu Ala Thr Lys Val Gly Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp 210 215 220 aag gac gcg gcc gag aac gtc cgc aag atc act gga agt caa ggc gcc 720 Lys Asp Ala Ala Glu Asn Val Arg Lys Ile Thr Gly Ser Gln Gly Ala 225 230 235 240 gca ttg gtt ctc gac ttc gtc ggc tac cag ccc acc atc gac acc gcg 768 Ala Leu Val Leu Asp Phe Val Gly Tyr Gln Pro Thr Ile Asp Thr Ala 245 250 255 atg gct gtc gcc ggc gtc gga tca gac gtc acg atc gtc ggg atc ggg 816 Met Ala Val Ala Gly Val Gly Ser Asp Val Thr Ile Val Gly Ile Gly 260 265 270 gac ggc cag gcc cac gcc aaa gtc ggg ttc ttc caa agt cct tac gag 864 Asp Gly Gln Ala His Ala Lys Val Gly Phe Phe Gln Ser Pro Tyr Glu 275 280 285 gct tcg gtg aca gtt ccg tat tgg ggt gcc cgc aac gag ttg atc gaa 912 Ala Ser Val Thr Val Pro Tyr Trp Gly Ala Arg Asn Glu Leu Ile Glu 290 295 300 ttg atc gac ctc gcc cac gcc ggc atc ttc gac atc ggc ggt gga gac 960 Leu Ile Asp Leu Ala His Ala Gly Ile Phe Asp Ile Gly Gly Gly Asp 305 310 315 320 ctt cag tct cga caa cgg tgc cga agc gta tcg acg act ggc tgc cgg 1008 Leu Gln Ser Arg Gln Arg Cys Arg Ser Val Ser Thr Thr Gly Cys Arg 325 330 335 aac gct cag cgg ccg tgc ggt tgt ggt ccc tgg tct gta gta ccg aca 1056 Asn Ala Gln Arg Pro Cys Gly Cys Gly Pro Trp Ser Val Val Pro Thr 340 345 350 gcg gta gaa cga cag cgg aaa aac act gat gcc cgg ccg aat tcg att 1104 Ala Val Glu Arg Gln Arg Lys Asn Thr Asp Ala Arg Pro Asn Ser Ile 355 360 365 cgg ccg ggc atc agt gtc aga aat tcg gtg tgc gct agc tgc acg cct 1152 Arg Pro Gly Ile Ser Val Arg Asn Ser Val Cys Ala Ser Cys Thr Pro 370 375 380 cga tga 1158 Arg 385 Description: BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for reducing a 4-cyanoacetoacetate compound, and more particularly to a method for reducing a carbonyl group at the 3-position of a 4-cyanoacetoacetate compound. 2. Description of the Related Art
The cyano-3-hydroxybutanoate compound is useful as an intermediate for medical and agricultural chemicals (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 5-3311).
No. 28), the development of a reaction for reducing the carbonyl group at the 3-position of a 4-cyanoacetoacetate compound to produce the compound is desired. The inventors of the present invention have conducted intensive studies on a method for reducing the carbonyl group at the 3-position of a 4-cyanoacetoacetate compound, and as a result, have found that a compound represented by the following general formula (1): An enzyme having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in a cyanoacetoacetic acid ester compound or SEQ ID NO: 1
Wherein the enzyme comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and reduces the 3-position carbonyl group of a 4-cyanoacetoacetate compound represented by the general formula (1): It has been found that the objective is achieved by the action of an enzyme having activity, and the present invention has been completed. That is, the present invention provides the following inventions. General formula (1) (Wherein, R represents a C1-C8 alkyl group.) 4-cyanoacetoacetate represented by the general formula (1), wherein the following a) or b) is allowed to act on a 4-cyanoacetoacetate compound represented by the following formula: A method for reducing the carbonyl group at the 3-position of an acetate compound (hereinafter, referred to as the method of the present invention). a) An enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and the carbonyl group at the 3-position of the 4-cyanoacetoacetate compound represented by the general formula (1) is reduced An enzyme having an enzymatic activity. (Hereinafter a) and b) are collectively referred to as the present enzyme. The C1-C8 alkyl group represented by R in the 4-cyanoacetoacetate compound represented by the general formula (1) used in the method of the present invention includes:
Examples include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, and an octyl group. The gene sequence encoding the enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 used in the method of the present invention is shown in SEQ ID NO: 2 (Appl. Microbiol. Biotechno.
l (1999) 52,386-392). The gene having the base sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme may be a naturally occurring gene obtained by subjecting a naturally occurring gene to a mutation treatment (partial mutation introduction method, mutation treatment, etc.). You may. The present enzyme can be produced, for example, by culturing a microorganism containing the gene represented by SEQ ID NO: 2 and producing an enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 when the gene is expressed. it can. A microorganism containing the gene represented by SEQ ID NO: 2 and producing an enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 when the gene is expressed is a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 even in a naturally occurring microorganism. May be a transformed microorganism into which a gene having Here, a method for preparing a transformed microorganism into which a gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 has been introduced will be described. As a host cell into which a gene having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is introduced, for example, Escherichi
a, Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Stre
ptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces and Aspergil
Microorganisms belonging to the genus lus can be mentioned. Method for introducing the gene into a host cell is not particularly limited as long as the normal methods used depending on the cell as a host, for example, "Molecular Cloning: ALaboratory Manual 2 ^nd ed
ition "(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, `` Current Protocols in Molecular Biology '' (198
7), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X, etc.
oration: Gene Pulser /E.coli Pulser System '' Bio-Ra
d Laboratories, (1993) and the like. The transformed microorganism into which the gene has been introduced is
Selection can be performed using the phenotype of the selectable marker gene contained in the vector used when introducing the gene into the host cell as an index. The fact that the transformed microorganism has the gene means that the transformed microorganism
Is prepared, and the prepared DNA is subjected to a conventional method (confirmation of restriction enzyme site, nucleotide sequence, etc.) described in, for example, "Molecular cloning" (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor, 1989). Analysis, Southern hybridization, etc.). Next, in order to produce the present enzyme used in the production method of the present invention, it contains the gene represented by SEQ ID NO: 2,
A method for culturing a microorganism that produces an enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 when the gene is expressed will be described. As a medium for culturing the microorganism, various media containing a carbon source, a nitrogen source, an organic salt, an inorganic salt and the like which are usually used for culturing a microorganism can be used. Examples of the carbon source include sugars such as glucose, dextrin and sucrose, sugar alcohols such as glycerol, organic acids such as fumaric acid, citric acid and pyruvic acid, animal and vegetable oils, and molasses. The amount of these carbon sources added to the medium is usually 0.1 to 20% based on the total amount of the medium.
(W / v). [0013] Nitrogen sources include meat extract, peptone, yeast extract, malt extract, soy flour, corn steep,
Natural organic nitrogen sources and amino acids such as liquor (Corn Steep Liquor), cottonseed flour, dried yeast and casamino acid, ammonium salts and nitrates of inorganic acids such as sodium nitrate, ammonium chloride, ammonium sulfate and ammonium phosphate, and ammonium fumarate And ammonium salts of organic acids such as ammonium citrate, and organic or inorganic nitrogen sources such as urea. Of these, ammonium salts of organic acids, natural organic nitrogen sources, amino acids and the like can often be used as carbon sources. The amount of addition of the nitrogen source may be usually about 0.1 to 30% (w / v) based on the total amount of the medium. Examples of the organic and inorganic salts include chlorides, sulfates, acetates, carbonates and phosphates such as potassium, sodium, magnesium, iron, manganese, cobalt and zinc. Is sodium chloride,
Examples thereof include potassium chloride, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, cobalt chloride, zinc sulfate, copper sulfate, sodium acetate, calcium carbonate, sodium carbonate, monopotassium hydrogen phosphate, and dipotassium hydrogen phosphate. The amount of organic or inorganic salt added is usually
It is good to be about 0.0001-5% (w / v). Further, a host cell into which a gene obtained by operably connecting a promoter of the type induced by allolactose such as a tac promoter, a trc promoter, a lac promoter and a gene encoding the present enzyme is introduced. In some cases, as an inducer for inducing the production of the enzyme, for example, isopropyl thio-β-D-galactoside (IPT
G) may be added in a small amount to the medium. The cultivation can be carried out according to a method usually used for culturing microorganisms.
Reciprocating shaking culture, Jar Fermente
r) Methods such as liquid culture such as culture and tank culture, and solid culture are possible. When using a jar fermenter,
It is necessary to introduce sterile air into the jar fermenter, and usually aeration conditions of about 0.1 to about 2 times / min of the volume of the culture solution are used. The culture temperature is preferably in the range of 35 to 42 ° C, and the pH of the medium is preferably in the range of about 6 to about 8. The culturing time varies depending on the culturing conditions, but is usually about
1 day to about 5 days is desirable. In the production method of the present invention, for example, the cells containing the present enzyme thus obtained, processed cells thereof, or purified products of the present enzyme can be used. Examples of the treated cells include freeze-dried cells, organic solvent-treated cells, dried cells, ground cells,
Autolysed cells of the cells, sonicated cells, cell extracts,
Alkali-treated cells can be mentioned, and those immobilized by these commonly used methods can also be mentioned. The purified product of the present enzyme can be produced, for example, by purifying the present enzyme from a culture of a microorganism having the present enzyme. As a method for purifying the present enzyme from a culture of a microorganism having the present enzyme, a method used in ordinary protein purification can be applied, and examples thereof include the following methods. First, cells are collected from the culture of the microorganism by centrifugation or the like, and then subjected to ultrasonic treatment, dynomill treatment, a physical crushing method such as French press treatment, or a cell lysing enzyme such as a surfactant or lysozyme. Crushing is performed according to the chemical crushing method used. Insoluble matter is removed from the obtained crushed liquid by centrifugation, filtration with a membrane filter, etc. to prepare a cell-free extract, which is then subjected to cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel chromatography, etc. The present reductase can be purified by fractionation using the separation and purification method described above as appropriate. Examples of the carrier used for chromatography include resin carriers such as cellulose, dextran, and agarose, into which a carboxymethyl (CM) group, a DEAE group, a phenyl group, a butyl group, or the like has been introduced. A commercially available carrier-packed column can also be used, for example,
Q-Sepharose FF, Phenyl-Sepharose HP (trade names, all manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), T
SK-gel G3000SW (trade name, manufactured by Tosoh Corporation)
And the like. Next, the method of the present invention will be described. In the method of the present invention, the reaction of reducing the carbonyl group at the 3-position of the 4-cyanoacetoacetate compound represented by the general formula (1) comprises reacting the 4-cyanoacetoacetate compound represented by the general formula (1) with the present enzyme. Achieved by The reaction is usually performed in the presence of water, and water may be in the form of a buffer. In this case, examples of the buffer include alkali metal phosphates such as sodium phosphate and potassium phosphate. And alkali metal salts of acetic acid such as sodium acetate and potassium acetate. PH in this case
Can be appropriately changed within a range in which the reaction proceeds. When a buffer is used as a solvent, the amount is usually 100 parts by weight or less based on 1 part by weight of the 4-cyanoacetoacetic ester compound represented by the general formula (1). The reaction temperature is from 0 to 70 ° C, preferably from 10 to 40 ° C, in view of the stability and reaction rate of the enzyme. The reaction can be carried out in the presence of an organic solvent in addition to water. As the organic solvent in this case, for example, tetrahydrofuran, t-butyl methyl ether,
Ethers such as isopropyl ether, hydrocarbons such as toluene, hexane, cyclohexane, heptane, isooctane and decane, t-butanol, methanol,
Examples thereof include alcohols such as ethanol, isopropanol and n-butanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ketones such as acetone, nitriles such as acetonitrile, and mixtures thereof. The amount of the organic solvent used in the reaction is usually 100 parts by weight or less, preferably 50 parts by weight or less, based on 1 part by weight of the 4-cyanoacetoacetate compound represented by the general formula (1). The reaction further comprises a coenzyme (eg, NAD
H, NADPH). The amount of the coenzyme used in the reaction is usually 0.5 times by weight or less, preferably 0.1 times by weight or less, based on the 4-cyanoacetoacetate compound represented by the general formula (1). When a coenzyme is added to the reaction, it is preferable to further add the following in order to increase the efficiency of the coenzyme. 1) Compounds such as formic acid, glucose, isopropanol, 2-butanol, 2-pentanol, 2-hexanol, 2-heptanol and 2-octanol The amount of these compounds used in this case is represented by the general formula (1). It is 100 times by weight or less, preferably 10 times by weight or less, based on the 4-cyanoacetoacetic acid ester compound shown. 2) Dehydrogenases such as formate dehydrogenase and glucose dehydrogenase The amount of dehydrogenase used in this case is determined by the general formula (1)
Is 0.1 times by weight or less, preferably 0.05 times by weight or less with respect to the 4-cyanoacetoacetate compound represented by the formula: The reaction is carried out by, for example, water, a 4-bromoacetoacetic ester compound represented by the general formula (1), the present enzyme,
If necessary, the reaction can be carried out by mixing a coenzyme and an organic solvent, stirring and shaking. The end point of the reaction can be determined, for example, by following the amount of the starting compound in the reaction solution by liquid chromatography, gas chromatography or the like. The range of the reaction time is usually from 5 minutes to 4 days. After completion of the reaction, if necessary, the reaction solution is extracted with an organic solvent such as hexane, heptane, tert-butyl methyl ether, ethyl acetate, toluene, and the like, and the organic layer is dried and concentrated to reduce the product. Can be isolated. The reduction product can be purified by column chromatography or the like, if necessary. The 4-cyanoacetoacetate compound used in the method of the present invention can be produced, for example, by reacting a 4-bromoacetoacetate compound with potassium cyanide in methanol. In the production method of the present invention, a) an amino acid sequence having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 instead of b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 1 And an enzyme having an enzymatic activity for reducing a 4-cyanoacetoacetate compound represented by the general formula (1) to an optically active 4-cyano-3-hydroxybutanoate compound represented by the general formula (2) It can also be used. In this case, for example, a site-specific mutagenesis method, which is a well-known technique for causing a point mutation or the like in the DNA shown in SEQ ID NO: 2, for example; A DNA sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 wherein one or several amino acids have been deleted, substituted or added; A gene encoding an enzyme having an enzymatic activity for reducing a 4-cyanoacetoacetic ester compound represented by the general formula (1) to an optically active 4-cyano-3-hydroxybutanoate compound represented by the general formula (2). The method of the present invention can be carried out by preparing, culturing, reacting, etc. in the same manner as described above. EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited to these examples. EXAMPLE A liquid medium (tryptone 10 in 1000 ml of water) was added to a flask.
g, 5 g of yeast extract and 5 g of sodium chloride,
By dropping a 1N aqueous solution of sodium hydroxide, p
H7.0. ) 900 ml was added and sterilized, then 100 μg / ml ampicillin, isopropyl thio
-β-D-galactoside (IPTG) was added to 0.4 mM, and the plasmid pUAR containing the DNA shown in SEQ ID NO: 2 (Accession number: FERM P-1812)
The transformant E. coli JM109 / pUAR obtained by transforming the E. coli JM109 strain by the conventional method in 7) was inoculated with 1 ml of a culture solution cultured in a liquid medium having the above composition, and cultured with shaking at 37 ° C. for 14 hours. The culture was centrifuged (15000 × g, 15
For 30 minutes at 4 ° C.), and the obtained cells are treated with a 50 mM monopotassium phosphate-dipotassium phosphate buffer (pH 7.0) 30 m
l, and the suspension is centrifuged (15000 xg,
(15 minutes, 4 ° C.) to obtain washed cells. 21 mg of ethyl 4-cyanoacetoacetate, 50 mM monopotassium phosphate-dipotassium phosphate buffer (pH 7.0, NAD ⁺ 1 m
M was dissolved) and 1 ml of 2-propanol 7 was added thereto.
5 μl and 1.5 ml of decane were added. A suspension obtained by suspending 200 mg of the washed cells in 0.5 ml of a potassium phosphate-dipotassium phosphate buffer (pH 7.0) was added thereto, followed by stirring at room temperature for 24 hours. Thereafter, 3 ml of ethyl acetate was added to the reaction solution, followed by vigorous stirring. This solution was centrifuged (3500 rpm, 10 minutes), and the obtained organic layer was subjected to gas chromatography analysis. 4-cyano-3
From the fact that the retention time is the same as that of the sample of ethyl-hydroxybutanoate, and from the mass spectrum data, it is found that 4-cyano-3-hydroxybutanoic acid is a compound in which the carbonyl group at the 3-position of ethyl 4-cyanoacetoacetate has been reduced. The formation of ethyl was confirmed. MS: (m / z) 157 (M ^<+> ), 130, 117,
112 Gas chromatography analysis column: DB-1 (manufactured by J & W Science) 0.53 m
mφ × 30 m, film thickness 1.5 μm Inlet temperature: 120 ° C. Column chamber temperature: 50 ° C. → (4 ° C./min)→170° C. FID detector temperature: 300 ° C. Carrier gas: Helium flow rate: 10 ml / min 4-cyano The retention time of ethyl 3-hydroxybutanoate is 14 minutes. According to the reduction method of the present invention, the carbonyl group at the 3-position of the 4-cyanoacetoacetate compound can be reduced. [Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Chemical Co., Ltd. <120> Reduction method of 4-cyanoacetoacetic acid ester <130> P153363 <150> JP 2000-372705 <151> 2000-12-07 <160> 2 <210> 1 <211> 385 <212> PRT <213> Corynebacterium sp. <400> 1 Met Lys Ala Ile Gln Tyr Thr Arg Ile Gly Ala Glu Pro Glu Leu Thr 1 5 10 15 Glu Ile Pro Lys Pro Glu Pro Gly Pro Gly Glu Val Leu Leu Glu Val 20 25 30 Thr Ala Ala Gly Val Cys His Ser Asp Asp Phe Ile Met Ser Leu Pro 35 40 45 Glu Glu Glu Gln Tyr Thr Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly 50 55 60 Ala Gly Lys Val Ala Ala Val Gly Glu Gly Val Glu Gly Leu Asp Ile 65 70 75 80 Gly Thr Asn Val Val Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Asn Cys Trp 85 90 95 His Cys Ser Gln Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Gln Glu Leu 100 105 110 Gly Ile Asn Pro Pro Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ala Leu Ala Glu Phe 115 120 125 Met Ile Val Asp Ser Pro Arg His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp 130 135 140 Pro Val Lys Thr Val Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His 14 5 150 155 160 Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro Lys Leu Arg Gly Gly Ser Tyr Ala Val 165 170 175 Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu Gly His Val Ala Ile Gln Leu Leu Arg 180 185 190 His Leu Ser Ala Ala Thr Val Ile Ala Leu Asp Val Ser Ala Asp Lys 195 200 205 Leu Glu Leu Ala Thr Lys Val Gly Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp 210 215 220 Lys Asp Ala Ala Glu Asn Val Arg Lys Ile Thr Gly Ser Gln Gly Ala 225 230 235 240 Ala Leu Val Leu Asp Phe Val Gly Tyr Gln Pro Thr Ile Asp Thr Ala 245 250 255 Met Ala Val Ala Gly Val Gly Ser Asp Val Thr Ile Val Gly Ile Gly 260 265 270 Asp Gly Gln Ala His Ala Lys Val Gly Phe Phe Gln Ser Pro Tyr Glu 275 280 285 Ala Ser Val Thr Val Val Pro Tyr Trp Gly Ala Arg Asn Glu Leu Ile Glu 290 295 300 Leu Ile Asp Leu Ala His Ala Gly Ile Phe Asp Ile Gly Gly Gly Asp 305 310 315 320 Leu Gln Ser Arg Gln Arg Cys Arg Ser Val Ser Thr Thr Gly Cys Arg 325 330 335 Asn Ala Gln Arg Pro Cys Gly Cys Gly Pro Trp Ser Val Val Pro Thr 340 345 350 Ala Val Glu Arg Gln Arg Lys Asn Thr Asp Ala Arg Pro Asn Ser Ile 35 5 360 365 Arg Pro Gly Ile Ser Val Arg Asn Ser Val Cys Ala Ser Cys Thr Pro 370 375 380 Arg 385 <210> 2 <211> 1158 <212> DNA <213> Corynebacterium sp. <220><221> CDS <222> (1) .. (1158) <400> 2 atg aag gcg atc cag tac acg cga atc ggc gcg gaa ccc gaa ctc acg 48 Met Lys Ala Ile Gln Tyr Thr Arg Ile Gly Ala Glu Pro Glu Leu Thr 1 5 10 15 gag att ccc aaa ccc gag ccc ggt cca ggt gaa gtg ctc ctg gaa gtc 96 Glu Ile Pro Lys Pro Glu Pro Gly Pro Gly Glu Val Leu Leu Glu Val 20 25 30 acc gct gct ggc gtc tgc cac tcg gac gac ttc atc agc ctg ccc 144 Thr Ala Ala Gly Val Cys His Ser Asp Asp Phe Ile Met Ser Leu Pro 35 40 45 gaa gag cag tac acc tac ggc ctt ccg ctc acg ctc ggc cac gaa ggc 192 Glu Glu Glu Tln Thr Tyr Gly Leu Prou Thr Leu Gly His Glu Gly 50 55 60 gca ggc aag gtc gcc gcc gtc ggc gag ggt gtc gaa ggt ctc gac atc 240 Ala Gly Lys Val Ala Ala Val Gly Glu Gly Val Glu Gly Leu Asp Ile 65 70 75 80 gga acc aat gtc gtc gtc tac ggg cct tgg ggt tgc ggc aac tgt tgg 288 Gly Thr Asn Val Val Val Tyr Gly Pr o Trp Gly Cys Gly Asn Cys Trp 85 90 95 cac tgc tca caa gga ctc gag aac tat tgc tct cgc gcc caa gaa ctc 336 His Cys Ser Gln Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Gln Glu Leu 100 105 110 gga atc aat cct ccc ggt ctc ggt gca ccc ggc gcg ttg gcc gag ttc 384 Gly Ile Asn Pro Pro Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ala Leu Ala Glu Phe 115 120 125 atg atc gtc gat tct cct cgc cac ctt gtc ccg atc ggt gac Met Ile Val Asp Ser Pro Arg His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp 130 135 140 ccg gtc aag acg gtg ccg ctg acc gac gcc ggt ctg acg ccg tat cac 480 Pro Val Lys Thr Val Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His 145 150 155 160 gcg atc aag cgt tct ctg ccg aaa ctt cgc gga ggc tcg tac gcg gtt 528 Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro Lys Leu Arg Gly Gly Ser Tyr Ala Val 165 170 175 gtc att ggt acc ggc ggt cac gtc gct att cag ctc ctc cgc 576 Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu Gly His Val Ala Ile Gln Leu Leu Arg 180 185 190 cac ctc tcg gcg gca acg gtc atc gct ttg gac gtg agc gcg gac Aag Ala Ala His 624 His Thr V al Ile Ala Leu Asp Val Ser Ala Asp Lys 195 200 205 ctc gaa ctg gca acc aag gta ggc gct cac gaa gtg gtt ctg tcc gac 672 Leu Glu Leu Ala Thr Lys Val Gly Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp 210 215 220 aag gac gcg gcc gag aac gtc cgc aag atc act gga agt caa ggc gcc 720 Lys Asp Ala Ala Glu Asn Val Arg Lys Ile Thr Gly Ser Gln Gly Ala 225 230 235 240 gca ttg gtt ctc gac ttc gtc ggc tac cag ccc acc acc gcg 768 Ala Leu Val Leu Asp Phe Val Gly Tyr Gln Pro Thr Ile Asp Thr Ala 245 250 255 atg gct gtc gcc ggc gtc gga tca gac gtc acg atc gtc ggg atc ggg 816 Met Ala Val Ala Gly Val Gly Ser Asp Val Thr Ile Val Gly Ile Gly 260 265 270 gac ggc cag gcc cac gcc aaa gtc ggg ttc ttc caa agt cct tac gag 864 Asp Gly Gln Ala His Ala Lys Val Gly Phe Phe Gln Ser Pro Tyr Glu 275 280 285 gct tcg gtg aca g tat tgg ggt gcc cgc aac gag ttg atc gaa 912 Ala Ser Val Thr Val Pro Tyr Trp Gly Ala Arg Asn Glu Leu Ile Glu 290 295 300 ttg atc gac ctc gcc cac gcc ggc atc ttc gac atc ggc ggt gga gac 960 Le L eu Ala His Ala Gly Ile Phe Asp Ile Gly Gly Gly Asp 305 310 315 320 ctt cag tct cga caa cgg tgc cga agc gta tcg acg act ggc tgc cgg 1008 Leu Gln Ser Arg Gln Arg Cys Arg Ser Val Ser Thr Thr Gly Cys Arg 325 330 335 aac gct cag cgg ccg tgc ggt tgt ggt ccc tgg tct gta gta ccg aca 1056 Asn Ala Gln Arg Pro Cys Gly Cys Gly Pro Trp Ser Val Val Pro Thr 340 345 350 gcg gta gaa cga cag cgg aaa aac act gat gcc cgg ccg aat tcg att 1104 Ala Val Glu Arg Gln Arg Lys Asn Thr Asp Ala Arg Pro Asn Ser Ile 355 360 365 cgg ccg ggc atc agt gtc aga aat tcg gtg tgc gct agc tgc acg cct 1152 Arg Pro Gly Asle Ser Val Ser Val Cys Ala Ser Cys Thr Pro 370 375 380 cga tga 1158 Arg 385

Claims (1)

【特許請求の範囲】 【請求項１】一般式（１） 【化１】 （式中、ＲはＣ１−Ｃ８アルキル基を表す。） で示される４−シアノアセト酢酸エステル化合物に下記
ａ）またはｂ）を作用させることを特徴とする一般式
（１）で示される４−シアノアセト酢酸エステル化合物
の３位のカルボニル基の還元方法。 ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素。 ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ、一般式（１）で示される４−シアノアセト酢酸エス
テル化合物の３位のカルボニル基を還元する酵素活性を
有する酵素。[Claim 1] The general formula (1) (Wherein, R represents a C1-C8 alkyl group.) 4-cyanoacetoacetate represented by the general formula (1), wherein the following a) or b) is allowed to act on a 4-cyanoacetoacetate compound represented by the following formula: A method for reducing a carbonyl group at the 3-position of an acetate compound. a) An enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and the carbonyl group at the 3-position of the 4-cyanoacetoacetate compound represented by the general formula (1) is reduced An enzyme having an enzymatic activity.