JP2002543787A - 白血球免疫グロブリン様受容体（ｌｉｒ）と命名された免疫調節因子のファミリー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫グロブリンスーパーファミリーの免疫受容体分子の新しいファミリー、ＬＩＲポリペプチドを記載する。ＬＩＲファミリーメンバーをコードする配列及びその推定アミノ酸配列、特定されたヌクレオチド配列にハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるポリペプチド、ＬＩＲファミリーのポリペプチドを産生するための方法、並びにＬＩＲポリペプチドに対して作成された特異的抗体が開示される。ＬＩＲファミリーメンバーは、自己免疫疾患、並びに抑制された免疫機能に伴う疾患状態の治療に使用することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 免疫系細胞活性は、細胞表面相互作用及び関連したシグナル伝達過程の複雑な
ネットワークによって調節される。細胞表面受容体がそのリガンドによって活性
化されると、シグナルが細胞に伝達され、連動されるシグナル伝達経路に依存し
て、そのシグナルは阻害的又は活性的となり得る。多くの受容体系について、細
胞活性は、活性シグナルと阻害シグナルとの間の均衡によって制御される。これ
らのいくつかにおいて、細胞表面受容体とそのリガンドの連動に関連した正のシ
グナルは、異なる細胞表面受容体とそのリガンドの連動によって伝達される負の
シグナルによって下方調節又は阻害されることが知られている。

【０００２】 これらの正及び負のシグナル伝達経路の生化学的なメカニズムは、多くの既知
の免疫系受容体−リガンド間相互作用に対して研究されている。正のシグナル伝
達を仲介する多くの受容体は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ｉｍ
ｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉ
ｏｎ ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）として知られるチロシンホスファターゼリン酸
化部位を含む細胞質テールを有する。正のシグナル伝達についての共通の機械論
的な経路は、チロシンキナーゼの活性化に関与し、これは受容体の細胞質ドメイ
ン及び他のシグナル伝達分子上の部位をリン酸化する。ひとたび受容体がリン酸
化されると、シグナル伝達分子の結合部位が創作され、シグナル伝達経路を開始
し、そして、細胞を活性化する。阻害経路は、免疫受容体チロシンベース阻害モ
チーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＩＭ）を有する受容体に関与し、ＩＴＡ
Ｍのように、チロシンキナーゼによってリン酸化される。これらのモチーフを有
する受容体は阻害シグナル伝達に関与し、それは該モチーフがチロシンホスファ
ターゼに対して結合部位を提供し、活性化した受容体又はシグナル伝達分子から
チロシンを除去することによってシグナル伝達を遮蔽するためである。活性化又
は阻害メカニズムの詳細について多くは知られていないが、免疫系において機能
的な均衡が反対の活性及び阻害シグナルに依存することは明らかである。

【０００３】 正及び負のシグナル伝達の均衡によって制御される免疫系活性の一例は、Ｂ細
胞増殖である。Ｂ細胞抗原受容体は、Ｂ細胞表面免疫グロブリンであって、抗原
に結合した場合、正のシグナルを仲介してＢ細胞増殖へと導く。しかしながら、
Ｂ細胞はまた、Ｆｃγ ＲＩＩｂ１という低親和性ＩｇＧ受容体を発現する。抗
原が可溶性免疫グロブリンを有する免疫複合体の一部である場合、免疫複合体は
抗原を介したＢ細胞抗原受容体と可溶性免疫グロブリンを介したＦｃγ ＲＩＩ
ｂ１の両方を連動することによってＢ細胞を結合することができる。Ｆｃγ Ｒ
ＩＩｂ１とＢ細胞受容体複合体の共連動は、活性化シグナルを下方調節し、そし
てＢ細胞増殖を妨げる。Ｆｃγ ＲＩＩｂ１受容体はＩＴＩＭモチーフを含み、
Ｂ細胞受容体との共連動に基づいて、チロシンホスファターゼを有するＩＴＩＭ
の相互作用を介してＢ細胞に阻害シグナルを輸送すると考えられる。

【０００４】 ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞溶解活性は、免疫系活性の別の例であり
、細胞機能を開始する正のシグナルとその活性を妨げる阻害シグナルとの間の均
衡によって制御される。ＮＫの細胞溶解活性を活性化する受容体は、十分に理解
されていない。しかしながら、標的細胞が、ＮＫ細胞が特異的受容体を有するた
めの細胞表面ＭＨＣクラスＩ抗原を発現する場合に、標的細胞はＮＫの殺生から
保護される。これらの特異的受容体は、キラー阻害性受容体（ＫＩＲ）として知
られ、そのＭＨＣリガンドによって連動される場合に負のシグナルを伝達し、Ｎ
Ｋ細胞の細胞溶解活性は下方制御する。

【０００５】 ＫＩＲは免疫グロブリンスーパーファミリー、又はＣタイプレクチンファミリ
ーに属する（Ｌａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
１７：８６−９１，１９９６を参照）。既知のヒトＮＫ ＫＩＲは免疫グロブ
リンスーパーファミリーのメンバーであり、そして細胞外、膜貫通及び細胞質領
域において相違点及び類似点を示す。多くのＫＩＲに共通する細胞質ドメインの
アミノ酸配列は、配列ＹｘｘＬ／Ｖを有するＩＴＩＭモチーフである。いくつか
の場合において、リン酸化されたＩＴＩＭがチロシンホスファターゼを回復させ
、シグナル伝達経路における分子を脱リン酸化し、細胞活性を阻害することが示
されている（Ｂｕｒｓｈｔｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：７７−
８５，１９９６を参照）。ＫＩＲは共通して、２６個のアミノ酸によって間隔を
空けられた２つのこうしたモチーフ［ＹｘｘＬ／Ｖ（ｘ）₂₆ＹｘｘＬ／Ｖ］を有
する。少なくとも２つのＮＫ細胞受容体は、それぞれヒト白血球抗原（ＨＬＡ）
Ｃ対立遺伝子（ＭＨＣクラスＩ分子）に対して特異的であり、阻害性及び活性受
容体として存在する。これらの受容体は細胞外部分において非常に相同的である
が、膜貫通及び細胞質部分においてはより多くの相違点がある。相違点の１つに
は、阻害性受容体におけるＩＴＩＭモチーフの出現と、活性受容体におけるＩＴ
ＩＭモチーフの欠失である（Ｂｉａｓｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：６４５−６５０，１９９６を参照）。

【０００６】 マウス肥満細胞に発現された免疫受容体であるｇｐ４９Ｂ１は、免疫グロブリ
ンファミリーのメンバーでもあり、細胞活性化シグナルを下方制御することで知
られ、そして一対のＩＴＩＭモチーフを含む。ｇｐ４９Ｂ１はヒトＫＩＲと高い
程度の相同性を共有する（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，９３：１０８０９−１０８１４，１９９６）。マウスＮＫ細胞もまた免疫受容
体のファミリーであるＬｙ４９ファミリーを発現し、ＩＴＩＭモチーフを含み、
ヒトＫＩＲと同じように機能する。しかしながら、Ｌｙ４９免疫受容体はヒトＫ
ＩＲと構造的相同性を有さず、細胞外Ｃタイプレクチンドメインを含むことで、
分子のレクチンスーパーファミリーのメンバーとされている（Ｌａｎｉｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １７：８６−９１，１９９６
を参照）。

【０００７】 明らかに、反対のキナーゼとホスファターゼによって仲介された免疫系の活性
及び阻害性シグナルは免疫系における均衡を維持するために非常に重要である。
優勢な活性シグナルを有する系は、自己免疫及び炎症へと導くであろう。優勢な
阻害性シグナルを有する免疫系は、感染した細胞又はガン細胞をほとんど攻撃す
ることができない。新規な活性又は阻害性受容体を単離することは、受容体を仲
介して形質導入された生物学的シグナルを研究するのに非常に望ましい。加えて
、そのような分子を同定することは、自己免疫、炎症及び感染に関連した疾患状
態を制御及び治療する手段を提供する。

【０００８】 例えば、新規に発見されたＩＴＩＭモチーフを有する細胞表面受容体を、アゴ
ニスト抗体又はリガンドと連動することは、免疫系が過剰に活性的となり、過度
の炎症又は免疫病理学が存在する疾患状態において、細胞機能を下方制御するた
めに使用され得る。他方では、受容体又は受容体の可溶体に特異的なアンタゴニ
スト抗体を用いることは、細胞表面受容体と、抑制された免疫機能に関連した疾
患状態における特異的免疫機能を活性化する受容体のリガンドとの相互作用を遮
蔽するために使用され得る。逆に、ＩＴＩＭモチーフを欠失している受容体は、
上述したようにひとたび連動すると活性シグナルを伝達するので、抗体及び可溶
性受容体の効果がちょうど記載したものと反対となる。

【０００９】 発明の概要 本発明は、免疫グロブリンスーパーファミリーの免疫受容体分子の新規ファミ
リーを提供するものであり、本明細書においては白血球免疫グロブリン様受容体
（ＬＩＲ）ポリペプチドと命名する。本明細書に開示されたＬＩＲファミリーメ
ンバーをコードするＤＮＡ配列、及びこれらの推定アミノ酸配列は、本発明の範
囲である。さらに、定義された配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ又は該
プローブに相補的なＤＮＡ若しくはＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡによって
コードされたポリペプチドは、本発明に含まれる。本発明はまた、ＬＩＲファミ
リーメンバーをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターを含む。また、遺伝
子コードの縮重によって、上述した核酸配列、及びそれらのヌクレオチド配列に
相補的な配列によってコードされたポリペプチドに同一であるポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。

【００１０】 さらに、本発明は、ＬＩＲファミリーのポリペプチドを製造するための方法で
あって、ＬＩＲファミリーメンバーをコードするＤＮＡ配列を含む組換え発現ベ
クターを用いて形質転換した宿主細胞を、ＬＩＲポリペプチドファミリーメンバ
ーを発現するために適切な条件下で培養し、そして、培養物から発現したＬＩＲ
ポリペプチドを回収することによる、前記方法を含む。

【００１１】 本発明はまた、ＬＩＲファミリータンパク質に対するアゴニスト及びアンタゴ
ニスト抗体を提供する。 さらになお、ＬＩＲファミリーメンバーの可溶部分とＩｇのＦｃ部分を含む融
合タンパク質は、本発明の範囲内である。

【００１２】 ある種の自己免疫障害は、細胞機能を下方制御する負のシグナル伝達ＬＩＲの
機能不全と関連する。そのような障害は、治療的に有効な量の１又はそれ以上の
ＬＩＲファミリーメンバーに対するアゴニスト抗体又はリガンドを、そのような
障害に苦しむ患者に投与することによって治療してもよい。抑制された免疫機能
に関連した疾患状態によって仲介された障害を、負のシグナル伝達ＬＩＲの可溶
体を投与することによって治療することができる。逆に、活性シグナル伝達ＬＩ
Ｒの機能不全に関連した疾患によって仲介された障害を、活性受容体に対するア
ゴニスト抗体を投与することによって治療することができる。自己免疫機能に関
連した状態によって仲介された障害を、活性受容体の可溶体を投与することによ
って治療することができる。

【００１３】 発明の詳細な説明 ＭＨＣクラスＩ抗原に類似した配列を有するウイルス性糖タンパク質を用いて
、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２と命名された新規なポリペプチド、及びＬＩＲポリペプチド
ファミリーと命名された細胞膜表面ポリペプチドの新規なファミリーのいつかの
メンバーが、単離し同定された。。本発明は、ＬＩＲポリペプチドをコードする
単離された核酸分子を含み、さらに単離されたＬＩＲポリペプチドを含む。代表
的に、本発明に係るＬＩＲポリペプチドをコードする核酸は、配列番号：１、３
、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２９、３１、３３、３５及び
３７に示される核酸配列を含み、そして代表的に、ＬＩＲポリペプチド配列は配
列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、３０、３２
、３４、３６及び３８に示される。

【００１４】 ＬＩＲポリペプチドファミリーメンバーは、免疫グロブリン様ドメインを有す
る細胞外領域をもち、これによりメンバーが免疫グロブリンのスーパーファミリ
ーの新規なサブファミリーに位置する。ＬＩＲファミリーメンバーが非常に類似
した細胞外部分を有するものとして特徴付けられる一方で、該ファミリーはその
膜貫通領域及び細胞質領域によって区別することができるポリペプチドの３つの
群を含む。ＬＩＲポリペプチドの第１群は正に荷電した残基及び短い細胞質テー
ルを含む膜貫通領域を有し、そして第２群は非極性な膜貫通領域及び長い細胞質
テールを有する。第３群は膜貫通領域及び細胞質テールを持たない可溶性タンパ
ク質を発現したポリペプチドを含む。ＬＩＲタンパク質の１つは第１及び第２群
の両方の特徴を有し、第４群を表してもよい。多くの最近の報告では、タンパク
質のＬＩＲファミリーに関係した配列を有する核酸分子が開示されている（Ｈｉ
ｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ
Ｎ９５６８７，Ａｐｒｉｌ ９，１９９６； Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｍ．，Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＡＦ０４１２６１及びＡＦ０４１２６
２，Ｊａｎｕａｒｙ ７，１９９９； Ｌａｍｅｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅ
ｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＣ００６２９３，Ｊａｎｕａｒｙ
６，１９９９； Ｓｔｅｆｆａｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅ
ｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＡＨ００７４６６及びＡＨ００７４６５，Ｍａｒｃｈ ４
，１９９９； Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：２７３−
２８２（１９９７）； Ｂｏｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
５９：５１９２−９６（１９９７）； Ｓａｍａｒｉｄｉｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏ
ｎｎａ， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：６６０−６６５（１９９７）；
Ｃｏｌｏｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１８０９−１
８１８（１９９７）； Ｗａｇｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ
．７：６１５−６１８（１９９７）； Ｒｏｊｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１５８：９−１２（１９９７）； Ａｒｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１５９：２３４２−２３４９（１９９７）； Ｃｅｌｌａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１７４３−５１（１９９７）； Ｔｏｒｋ
ａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３９５９−６７（１
９９８）； Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３
：３５８−６８（１９９８）； ＷＯ９８／３１８０６； ＷＯ９８／２４９０
６； ＷＯ９８／０９６３８）。

【００１５】 本発明によって包含されるＬＩＲポリペプチドは、タンパク質の細胞外領域に
少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含み、好ましくは細胞外領域に２つ又は４つ
のいずれかのＩｇ様ドメインを含む。いくつかのＬＩＲポリペプチドは４つ以上
のＩｇ様ドメインを含んでもよい。Ｉｇドメインは幅広い種類の細胞のタンパク
質において同定されている構造単位である。Ｉｇ様ドメインは、特徴的な鎖内ジ
スルフィド結合によって安定化される２つのβシートのサンドイッチを形成する
共通の折り畳み構造を含む。Ｉｇ様ドメインは、この構造全体に関わる大部分の
知識を参照することにより容易に認識することができる（例えば、Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ ａｎｄ Ｂａｒｃｌａｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１
−４０５（１９９８）を参照）。典型的には、Ｉｇ様ドメインは約１００個のア
ミノ酸を含むが、アミノ酸の数は、例えば約８５ないし１０５個のアミノ酸で変
化してもよい。Ｉｇ様ドメインを提示する分子は、一般に細胞表面で認識の役割
を果たし、しばしば多彩な生物学系において細胞−細胞間相互作用を仲介してい
る。

【００１６】 ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２（配列番号：２）は多種の細胞によって発現され、そしてＨ
ＬＡ−Ｂ４４分子、ＨＬＡ−Ａ２ ＭＨＣ分子及び実施例１４に記載された遺伝
子座を認識する。他のＬＩＲファミリーメンバーは、ＬＩＲ−ｐｂｍ８（配列番
号：９）と命名され、多種の細胞によって発現され、また多くのＭＨＣクラスＩ
分子を認識する。既知分子との類推によって、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２、ＬＩＲ−ｐｂ
ｍ８及びＬＩＲメンバーは免疫的な認識と自己／非自己の識別において役割を有
する。

【００１７】 以下の実施例１−３は、Ｐ３Ｇ２（ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２）及び実質的に同一な１
８Ａ３（ＬＩＲ−１８Ａ３）と命名されるポリペプチドをコードするｃＤＮＡを
単離することについて記載する。簡単には、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２ファミリーメンバ
ーは、最初にクラスＩＭＨＣ様分子であるＵＬ１８を発現し、そしてＵＬ１８を
使用して、Ｐ３Ｇ２及び１８Ａ３を単離し同定することによって、単離された。
該Ｐ３Ｇ２及び１８Ａ３は密接に関係し、おそらくは「ＬＩＲ−１」と命名され
る同じ遺伝子の変異体である。単離されたＰ３Ｇ２ ｃＤＮＡ及び１８Ａ３ ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：１及び配列番号：３に示され
る。配列番号：１及び配列番号：３に示されたｃＤＮＡによってコードされたア
ミノ酸配列は、それぞれ配列番号：２及び配列番号：４に示される。Ｐ３Ｇ２ア
ミノ酸配列（配列番号：２）は、１６個のアミノ酸のシグナルペプチド（アミノ
酸１−１６）を含む予期された４５８個のアミノ酸の細胞外ドメイン（１−４５
８）、２５個のアミノ酸の膜貫通ドメイン（アミノ酸４５９−４８３）、及び１
６７個のアミノ酸の細胞質ドメイン（アミノ酸４８４−６５０）を有する。細胞
外ドメインは４つの免疫グロブリン様ドメインを含む。Ｉｇ様ドメインＩはおお
よそアミノ酸１７−１１８を含み；Ｉｇ様ドメインＩＩはおおよそアミノ酸１１
９−２２０を含み；Ｉｇ様ドメインＩＩＩはおおよそアミノ酸２２１−３１８を
含み；及びＩｇ様ドメインＩＶはおおよそアミノ酸３１９−４１９を含む。有意
には、このポリペプチドの細胞質ドメインは４つのＩＴＩＭモチーフを含み、そ
れぞれ共通配列ＹｘｘＬ／Ｖを有する。第１のＩＴＩＭモチーフ対はアミノ酸５
３３−５３６及び５６２−５６５で見出され、そして第２の対はアミノ酸６１４
−６１７及び６４４−６４７で見出される。この特徴は、ＫＩＲがだだ一対のＩ
ＴＩＭモチーフを含むことを除けば、ＫＩＲにおいて見出されるＩＴＩＭモチー
フに同一である。

【００１８】 １８Ａ３アミノ酸配列（配列番号：４）は、１６個のアミノ酸のシグナルペプ
チド（アミノ酸１−１６）を含む４５９個のアミノ酸の予期された細胞外ドメイ
ン（１−４５９）、２５個のアミノ酸の膜貫通ドメイン（アミノ酸４６０−４８
４）、及び１６８個のアミノ酸の細胞質ドメイン（アミノ酸４８５−６５２）を
有する。１８Ａ３アミノ酸配列（配列番号：４）はＰ３Ｇ２（配列番号：２）の
アミノ酸配列と実質的に同一であるが、但し、１８Ａ３は２つの追加のアミノ酸
（アミノ酸４３８及び５５２）を有し、１８Ａ３がアミノ酸１４２においてＰ３
Ｇ２ではスレオニン残基であるのに対してイソロイシン残基を有する。加えて、
１８Ａ３はアミノ酸１５５においてセリン残基を有し、Ｐ３Ｇ２はアミノ酸１５
５においてイソロイシンを有する。最後に、１８Ａ３ポリペプチドはアミノ酸６
２７においてグルタミン酸を有し、Ｐ３Ｇ２はアミノ酸６２５においてリジンを
有し、これは１８Ａ３ポリペプチドの６２７残基と並ぶ。１８Ａ３の細胞質ドメ
インにおける４つのＩＴＩＭモチーフは、アミノ酸５３４−５３７及び５６４−
５６７、そして６１６−６１９及び６４６−６４９である。糖鎖付加部位は３連
続のアミノ酸Ａｓｎ−Ｘ−Ｙで見出され、ここでＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ
酸であり、及びＹはＳｅｒ又はＴｈｒである。つまり、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２の潜在
的な糖鎖付加部位がアミノ酸１４０−１４２；２８１−２８３；３０２−３０４
；及び３４１−３４３において出現する。コードされたこれらのポリペプチドの
特徴はＩ型膜貫通糖タンパク質と一致する。

【００１９】 実施例８−１０は、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２の細胞外領域をコードするＤＮＡから得
られたプローブにハイブリダイズするプラスミドについてｃＤＮＡライブラリー
を探査することによって、８つのさらなるＬＩＲポリペプチドファミリーメンバ
ーを単離し同定することについて記載する。単離されたＬＩＲファミリーメンバ
ーのヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）は、配列番号：７（ｐｂｍ２５と命名、即ち
ＬＩＲ−４）、配列番号：９（ｐｂｍ８と命名、即ちＬＩＲ−２）、配列番号：
１１（ｐｂｍ３６−２と命名、即ちＬＩＲ−６ｂ）、配列番号：１３（ｐｂｍ３
６−４と命名、即ちＬＩＲ−６ａ）、配列番号：１５（ｐｂｍｈｈと命名、即ち
ＬＩＲ−７）、配列番号：１７（ｐｂｍ２と命名、即ちＬＩＲ−５）、配列番号
：１９（ｐｂｍ１７と命名、即ちＬＩＲ−３）及び配列番号：２１（ｐｂｍｎｅ
ｗと命名、即ちＬＩＲ−８）において示される。それらによってコードされるア
ミノ酸配列は、それぞれ配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列
番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０及び配列番号：
２２において示される。

【００２０】 実施例１５は、ＬＩＲ−９ｍ１（配列番号：２９、３０）、ＬＩＲ−９ｍ２（
配列番号：３１、３２）、ＬＩＲ−９ｓ１（配列番号：３３、３４）、及びＬＩ
Ｒ−９ｓ２（配列番号：３５、３６）の単離について開示し、これらはＬＩＲ−
９の４つの選択的にスプライシングされた変異体であり、ＬＩＲファミリーの別
の新規なメンバーである。これらのクローンのＬＩＲ−９群を同定する第１の工
程は、ヒト樹枝状細胞ライブラリーから得た短いｃＤＮＡクローンを単離するこ
とであり、その配列解析は、それがＬＩＲファミリー、特に配列番号：１１、１
３及び１５に示される配列と有意な相同性を有していることを示した。このクロ
ーンに基づいたＰＣＲプライマーを用いて、さらにクローニングを駆使すること
によって、ＬＩＲ−９ｍ１、−９ｍ２、−９ｓ１及び−９ｓ２に対応する４つの
全長ｃＤＮＡを得た。ＬＩＲ−９ｍ１及びＬＩＲ−９ｍ２は膜貫通タンパク質で
あり、ＬＩＲ−９ｍ１の細胞外領域において見出されるが、ＬＩＲ−９ｍ２では
存在しない１２個のアミノ酸によって異なる。これらの１２個のアミノ酸は配列
番号：３０のアミノ酸２９−４０に対応する。ＬＩＲ−９ｓ１及び−９ｓ２は膜
貫通ドメインを含まず、つまりＬＩＲ−９の可溶バージョンをコードする。ＬＩ
Ｒ−９ｓ１ポリペプチド（配列番号：３４）はＬＩＲ−９ｍ１において示される
１２個のアミノ酸挿入部分を含む。ＬＩＲ−９ｓ１（配列番号：３４）及びＬＩ
Ｒ−９ｍ１（配列番号：３０）のアミノ酸１−２３８は同一であるが、ＬＩＲ−
９ｓ１の残り部分はＬＩＲ−９ｍ１の対応する領域とは同一ではない。ＬＩＲ−
９ｓ２（配列番号：３６）のアミノ酸１−２２６はＬＩＲ−９ｍ２（配列番号：
３２）の最初の２２６個のアミノ酸と同一であるが、ＬＩＲ−９ｓ２の残りのア
ミノ酸配列はＬＩＲ−９ｍ２のそれとは分かれる。

【００２１】 ＬＩＲ−９クローンを単離するために使用された同じＰＣＲプライマーによっ
て、ＬＩＲ−１０（配列番号：３７及び３８）と命名されたさらなるクローンさ
れたＬＩＲ ｃＤＮＡを得た。ＬＩＲ−１０のヌクレオチド配列と、以前に同定
されたもっとも密接に関係したＬＩＲ、即ち配列番号：１３及び１５と比較する
ことによって、ＬＩＲ１０ ｃＤＮＡが対応するｍＲＮＡの５’端に位置した配
列を欠損した不完全なクローンであり、５’未翻訳領域と、ＬＩＲ−１０タンパ
ク質の最初の２６個のアミノ酸をコードするヌクレオチドを含むことが決定され
た。

【００２２】 配列番号：１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、３０、３２、３４、
３６及び３８に示されたＬＩＲファミリーメンバーのポリペプチドに対して単離
された細胞外、膜貫通及び細胞質領域を以下に示す。配列番号：８、３４及び３
６に示されたポリペプチドは、膜貫通及び細胞質領域を持たない可溶性タンパク
質である。当業者によって理解されるであろうが、上述したＰ３Ｇ２及び１８Ａ
３の膜貫通領域及び以下に示されるＬＩＲポリペプチドファミリーメンバーの膜
貫通領域は、そのような領域に関連した疎水性ドメインを同定するための通常の
標準に従って同定される。即ち、任意の選択された膜貫通領域の正確な境目は、
本明細書において示されたそれとは異なっている可能性がある。典型的には、膜
貫通ドメインは、本明細書において開示されるようにドメインのいずれかの端に
おいて５個以上のアミノ酸によって異なることはない。当該技術分野において知
られ、及びタンパク質内のそのような疎水性領域を同定するために有用なコンピ
ュータープログラムが利用できる。

【００２３】 配列番号：８に示されたポリペプチド（ＬＩＲ−ｐｂｍ２５）は、アミノ酸１
−４３９の全アミノ酸配列及びアミノ酸１−１６のシグナルペプチドを含む細胞
外ドメインを有する。配列番号：１０に示されたアミノ酸配列（ＬＩＲ−ｐｂｍ
８）は、１６個のアミノ酸のシグナルペプチド（アミノ酸１−１６）を含む４５
８個のアミノ酸の予期された細胞外ドメイン（１−４５８）；アミノ酸４５９−
４８３を含む膜貫通ドメイン；及びアミノ酸４８４−５９８を含む細胞質ドメイ
ンを有する。細胞外ドメインは４つの免疫グロブリン様ドメインを含み、そして
細胞質ドメインはアミノ酸５３３−５３６及び５６２−５６５でのＩＴＩＭモチ
ーフを含む。

【００２４】 配列番号：１２に示されたアミノ酸配列（ＬＩＲ−ｐｂｍ３６−２）は、アミ
ノ酸１−１６の１６個のアミノ酸のシグナルペプチドを含むアミノ酸の予期され
た細胞外ドメイン；アミノ酸２６２−２８０を含む膜貫通ドメイン、及びアミノ
酸２８１−２８９の細胞質ドメインを有する。膜貫通ドメインは荷電したアルギ
ニン残基を２６４に含み、そして細胞質ドメインは短く、たった９個のアミノ酸
の長さのみを有する。

【００２５】 配列番号：１４に示されたアミノ酸配列（ＬＩＲ−ｐｂｍ３６−４）は、アミ
ノ酸１−１６のシグナルペプチドを含むアミノ酸１−４６１の予期された細胞外
ドメイン；アミノ酸４６２−４８０を含み、アミノ酸４６４で荷電したアルギニ
ン残基を有する膜貫通ドメイン；そしてアミノ酸４８１−４８９を含む細胞質ド
メインを有する。配列番号：１４は配列番号：１２にほとんど同一であるが、配
列番号：１２の細胞外領域に見出された２つの免疫グロブリンドメインとは対照
的に４つのドメインを有する。配列番号：１２及び配列番号：１４に示されるア
ミノ酸配列は、同じ遺伝子から選択的にスプライシングされた転写によってコー
ドされたタンパク質であるらしい。

【００２６】 配列番号：１６に示されたアミノ酸配列（ＬＩＲ−ｐｂｍｈｈ）は、アミノ酸
１−４４９及びアミノ酸１−１６のシグナルペプチドを含む予期された細胞外ド
メイン；アミノ酸４５２で荷電したアルギニン残基を有するアミノ酸４５０−４
６８を含む膜貫通ドメイン；そしてアミノ酸４６９−４８３を含む細胞質ドメイ
ンを有する。細胞質ドメインは長さが１５個のアミノ酸と短い。細胞外ドメイン
は４つの免疫グロブリン様ドメインを含む。

【００２７】 配列番号：１８に示されたアミノ酸配列（ＬＩＲ−ｐｂｍ２）は、アミノ酸１
−２５９及びアミノ酸１−１６のシグナルペプチドを含む予期された細胞外領域
；アミノ酸２６０−２８０を含む膜貫通ドメイン；そしてアミノ酸２８１−４４
８を含む細胞質ドメインを有する。このＬＩＲファミリーメンバーはアミノ酸４
１２−４１５及び４４２−４４５でＩＴＩＭモチーフを含む細胞質ドメインを有
する。細胞外ドメインは２つの免疫グロブリン様ドメインを含む。

【００２８】 配列番号：２０に示されたアミノ酸配列（ＬＩＲ−ｐｂｍ１７）は、アミノ酸
１−１６のシグナルペプチドを含むアミノ酸１−４４３の予期された細胞外ドメ
イン；アミノ酸４４４−４６４を含む膜貫通；及びアミノ酸４６５−６３１の細
胞質ドメインを有する。細胞外ドメインは４つの免疫グロブリン様ドメインを有
する。配列番号：２０は細胞質ドメインに二対のＩＴＩＭ ＹｘｘＬ／Ｖモチー
フを有する。第１の対はアミノ酸５１４−５１７及び５４３−５４６に位置し、
そして第２の対はアミノ酸５９５−５９８及び６２６−６２８に位置する。

【００２９】 配列番号：２２に示されたアミノ酸配列（ＬＩＲ−ｐｂｍｎｅｗ）は、アミノ
酸１−１６のシグナルペプチドを含むアミノ酸１−４５６の予期された細胞外ド
メイン；アミノ酸４５７−５７９を含む膜貫通ドメイン；及びアミノ酸５８０−
５９０の細胞質ドメインを有する。細胞外ドメインは、４つの免疫グロブリン様
ドメインを含む。配列番号：２２はアミノ酸５５４−５５７及び５８４−５８７
にＩＴＩＭモチーフを有する。

【００３０】 ＬＩＲ−９ｍ１タンパク質は、配列番号：３０のアミノ酸１−２６２に位置し
、配列番号：３０のアミノ酸１−３４のシグナルペプチドを含む細胞外ドメイン
を有する。配列番号：３０のアミノ酸２６３−２８４はＬＩＲ−９ｍ１の膜貫通
領域を定め、及びアミノ酸２８５−２９９は細胞質領域を形成する。ＬＩＲ−９
ｍ２については、細胞外領域は配列番号：３２のアミノ酸１−２５０に対応し、
配列番号：３２のアミノ酸１−３５でシグナル配列、配列番号：３２の残基２５
１−２７２で膜貫通領域、及び配列番号：３２のアミノ酸２７３−２８７で細胞
質領域を含む。ＬＩＲ−９ｓ１（配列番号：３４）及びＬＩＲ−９ｓ２（配列番
号：３６）は、それぞれ２６５及び２５３個のアミノ酸からなり、シグナル配列
は配列番号：３４のアミノ酸１−３４、及び配列番号：３６のアミノ酸１−３５
で見出される。

【００３１】 ＬＩＲ−１０については、配列番号：３８のアミノ酸１−３９３はＬＩＲ−１
０タンパク質の細胞外部分の大部分に対応するが、シグナルペプチドを含むこの
タンパク質アミノ末端での約２６個のアミノ酸に対するコードする配列は、本明
細書において記載されたＬＩＲ−１０ ｃＤＮＡクローンから失われていると思
われる。ＬＩＲ−１０の膜貫通領域は配列番号：３８のアミノ酸３９４−４１７
によって定められ、細胞質領域はアミノ酸４１８−４４９によって定められる。
ただ１つのＩＴＩＭモチーフは配列番号：３８のアミノ酸４３８−４４３に位置
する。

【００３２】 配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、３０、
３２、３４、３６及び３８に示されるアミノ酸配列は、ＬＩＲ−１０を除くＬＩ
Ｒファミリーがポリペプチドの３つの群に分類され得ることを示す。第１群は、
配列番号：１２、１４、１６、３０及び３２のポリペプチドを含み、膜貫通領域
での荷電したアルギニン残基と短い細胞質領域によって区別することができる。
第２群は、配列番号：２、４、１０、１８、２０及び２２を含み、疎水性細胞質
ドメイン及び該細胞質領域内の１つ又はそれ以上のＩＴＩＭモチーフの存在によ
って区別することができる。第３の群は、配列番号：８、３４及び３６のポリペ
プチドを含み、可溶性ポリペプチドとして発現し、膜貫通及び細胞質領域を持た
ない。これらの可溶性ポリペプチドは、細胞表面ファミリーと受容体との相互作
用を遮蔽するのに機能してもよい。あるいは、可溶性ポリペプチドは受容体に結
合する場合に活性シグナルとして振舞ってもよい。第１群のメンバーのように、
ＬＩＲ−１０は比較的に短い細胞質ドメイン、及びその膜貫通領域に荷電した残
基を有するが、その荷電した残基はアルギニンの代わりにヒスチジンである。し
かしながら、ＬＩＲ−１０はまた、第２群のように、細胞質ドメインにＩＴＩＭ
モチーフを有する。つまり、ＬＩＲ−１０は第１群と第２群の両方の特徴をいく
つか持ち、ＬＩＲタンパク質の第４群を表すとも言える。ＬＩＲポリペプチドは
、一般的にＰ３Ｇ２の細胞外領域をコードするＤＮＡにハイブイダイズする、該
ポリペプチドをコードするＤＮＡの能力によって特徴付けられる。

【００３３】 本発明が、配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２
２、３０、３２、３４、３６及び３８に示されるアミノ酸配列を有するＬＩＲポ
リペプチドをコードする単離された核酸分子を包含することは理解されるはずで
ある。発明の１つの態様においては、これらの核酸分子が、配列番号：１、３、
７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２９、３１、３３、３５及び３
７に示される核酸配列を有する。

【００３４】 配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、３０、
３２、３４、３６及び３８に示されるＬＩＲファミリーメンバータンパク質の細
胞外領域は、５９−８４％で変化する高い程度の相同性を有する。ＬＩＲ単離体
のいくつかは密接に関係し、つまり遺伝子座変異物又はスプライシング変異体を
示すものにちがいない。例えば、配列番号：１２及び配列番号：１４の細胞外領
域は、１００％に近い配列相同性を共有し、つまりこれらのポリペプチドは同じ
遺伝子に由来することを示す。加えて、配列番号：２及び４は、９５％以上の配
列相同性を共有し、つまりおそらくは同じ遺伝子の２つの対立遺伝子（アリル）
を表している。さらに、上記で検討したように、配列番号：３０、３２、３４及
び３６の細胞外領域はほとんど同一であり、つまりこれら４つのタンパク質はス
プライシング変異体であるｍＲＮＡ由来であることを示す。

【００３５】 免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーといくつかの構造的類似性
を共有する一方で、ＬＩＲファミリーメンバーは、免疫グロブリンスーパーファ
ミリーの他のメンバーと限定された相同性を有する。ＬＩＲに最も近い構造類似
性を有する分子は、ヒトＫＩＲ及びマウスｇｐ４９である。しかしながら、ＬＩ
Ｒ細胞外領域は、ＮＫＡＴ３及びｐ５８ Ｃｌ−３９の細胞外領域それぞれとほ
んの３８−４２％の同一性を共有する。ＬＩＲファミリーメンバーの細胞外領域
はマウスｇｐ４９の領域とほんの３５−４７％の相同性である。対照的に、ＫＩ
Ｒは、一般的に、８１％相同性であるＮＫＡＴ３及びｐ５８ ＣＬ−３９と少な
くとも８０％のアミノ酸同一性を共有する。加えて、既知のＫＩＲ分子のどれも
、ほぼ２つの既知のＬＩＲファミリーメンバーに特徴的である４つの細胞外免疫
グロブリンドメインを有しない。本明細書において開示されたポリペプチドに関
係したＬＩＲのうち高い配列相同性、及びＫＩＲとの比較的に低い相同性の点か
らみて、ＬＩＲポリペプチドは免疫調節因子の新規なファミリーのメンバーであ
る。

【００３６】 ＬＩＲのアミノ酸配列の解析は、ＬＩＲポリペプチドの特異的なひと続きのア
ミノ酸が高度に保存されていることを示す。１つの保存された領域は、配列番号
：２のアミノ酸５−５０で見出される４６個のアミノ酸の配列である。データベ
ース検索は、このＬＩＲの保存領域において最も構造的に類似した出願前のポリ
ペプチドと実質的に異なることを決定した。データベース検索及び構造解析は、
ＢＬＡＳＴ ＮＢ１という、データベースの検索及びアミノ酸配列を並べ、所定
の配列における同一性及び変異性を測定するるための局所的な整列検索手段を用
いて実効された。ＢＬＡＳＴ ＮＢ１ソフトウェアはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．
ｎｃｂ１．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｂｌａｓｔでインターネッ
ト上でアクセス可能である。配列番号：２のアミノ酸５ないし５０の配列に相同
性を有する配列に対するＢＬＡＳＴ ＮＢ１検索は、最も構造的に類似したタン
パク質がＦｃγＩＩＲ、ｇｐ４９Ｂフォーム２及びｇｐ４９Ｂフォーム１であり
、それぞれ配列番号：２のアミノ酸５ないし５０と６３％、６７％及び６７％の
同一性を有することを見出した。これは、配列番号：２のアミノ酸５ないし５０
とＬＩＲファミリーの同一性が約７１％から１００％の範囲であることと対照的
である。具体的には、本発明のＬＩＲファミリーメンバーは、アミノ末端近くで
共通した領域を含み、配列番号：２のアミノ酸５−５０と次の同一性を有する：
配列番号：８は９６％同一性を有する；配列番号：１０は９０％同一性を有する
；配列番号：１２は９６％同一性を有する；配列番号：１４は９１％同一性を有
する；配列番号：１６は９７％同一性を有する；配列番号：１８は７７％同一性
を有する；配列番号：２０は８０％同一性を有する；配列番号：２２は８０％同
一性を有する；配列番号：３０は７８％同一性を有する；配列番号：３２は７１
％同一性を有する；配列番号：３４は７８％同一性を有する；配列番号：３６は
７１％同一性を有する。この保存された領域は、ＬＩＲ−１０（配列番号：３８
）においてもまた存在するようであるが、しかし本明細書において開示されたＬ
ＩＲ−１０ ｃＤＮＡクローンは５’端で切断されているため不完全である。

【００３７】 本明細書において使用される配列の同一性は、同一である並べられた配列の数
であり、２つの配列を比較した場合により短い方におけるアミノ酸の総数で叙し
たものである。多くのコンピュータプログラムが、配列を並べて配列の同一性及
び変異性を決定するために商業的に利用可能である。１つの適したコンピュータ
ープログラムがＧＡＰプログラム（バージョン６．０）であり、Ｄｅｖｅｒｅｕ
ｘら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）によって開示
され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入
手可能である。ＧＡＰプログラムはＮｅｅｄｌｅｍｅｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の整列方法を利用するものであり
、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎによって修正された（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍ
ａｔｈ ２：４８２，１９８１）。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラ
メータには：（１）ヌクレオチド又はアミノ酸に関する単一（ｕｎａｒｙ）比較
マトリックス（同一に対し１及び非同一に対し０の値を含む）、そしてＳｃｈｗ
ａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，１
９７９に記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ（Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６）の加重比較マトリックス；（
２）各ギャップに対する３．０のペナルティ及び各ギャップ中の各記号に対しさ
らに０．１０のペナルティー；及び（３）末端ギャップに対するペナルティなし
、が含まれる。別の類似したプログラムは、配列操作用のＧＣＧコンピューター
パッケージの部分としてウィスコンシン大学から入手できるものでもあり、ＢＥ
ＳＴＦＩＴプログラムである。

【００３８】 別の面において、本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列（配列番号：２８）
： Ｌｅｕ Ｘａａ_a Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｘａａ_b Ｘａａ_c Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔ
ｈｒ Ｘａａ_d Ｘａａ_e Ｇｌｎ Ｘａａ_f Ｇｌｙ Ｘａａ_g Ｘａａ_h Ｐｒ
ｏ Ｘａａ_i Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｘ
ａａ_j Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｘａａ_j Ｘａａ₇₀ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｘａａ_k Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｘａａ_m Ｔｈｒ Ｇｌｙ （ここで、Ｘａａ_aはＧｌｙ又はＡｒｇ；Ｘａａ_bはＬｅｕ又はＶａｌ；Ｘａａ_c
はＧｌｙ又はＡｓｐ；Ｘａａ_dはＨｉｓ Ａｒｇ又はＣｙｓ；Ｘａａ_eはＶａｌ又
はＭｅｔ；Ｘａａ_fはＡｌａ又はＴｈｒ；Ｘａａ_gはＨｉｓ Ｐｒｏ又はＴｈｒ；
Ｘａａ_hはＬｅｕ Ｉｌｅ又はＰｈｅ；Ｘａａ_iはＧｌｙ Ａｓｐ又はＡｌａ；Ｘ
ａａ_jはＴｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ又はＡｌａ；Ｘａａ_kはＧｌｙ又はＶａｌ；Ｘａ
ａ_mはＭｅｔ又はＡｌａ；及びＸａａ₇₀は７０個のアミノ酸の配列である） を有するものとして独自に特徴付けられる保存された配列を有する。

【００３９】 上述したように、ある種のＬＩＲファミリーメンバーは細胞質ドメインにＩＴ
ＩＭモチーフ（ＹｘｘＬ／Ｖ_25-26ＹｘｘＬ／Ｖ）を有する。多くの免疫調節因
子、例えばＫＩＲ、ＣＤ２２、ＦｃγＲＩＩｂ１もまた細胞質ドメインにＩＴＩ
Ｍを有し、細胞機能を下方制御又は阻害する阻害シグナルを伝達するために機能
することは知られている。これらの受容体はＩＴＩＭモチーフへの結合を介して
ＳＨＰ−１ホスファターゼに関連することが示されている。受容体によるＳＨＰ
−１ホスファターゼの回復は、受容体の阻害機能を制御する細胞内シグナル伝達
経路に必要であるらしい。実施例１１に開示された実験は、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及
びＬＩＲ−ｐｂｍ８ポリペプチドがリン酸化に基づくＳＨＰ−１ホスファターゼ
に会合し、単球の活性化経路を通じて阻害シグナルを発生することを示す。多く
の免疫調節因子、例えばＫＩＲ、ＣＤ２２、ＦｃγＲＩＩｂ１は細胞質ドメイン
にＩＴＩＭモチーフを有し、細胞機能を下方制御又は阻害する阻害シグナルを伝
達するために機能することが知られている。つまり、ＫＩＲ、ＣＤ２２及びＦｃ
γＲＩＩｂ１の類推によって、ＩＴＩＭモチーフを有する配列番号：２、４、１
０、１８、２０、２２及び３８に示されたＬＩＲファミリーメンバーは、ＬＩＲ
が適切な受容体と結合される（ｃｏｌｉｇａｔｅ）場合、ＩＴＩＭとＳＨＰ−１
チロシンホスファターゼ又は他のチロシンホスファターゼとの相互作用を介して
阻害シグナルを伝達する。また、ＩＴＩＭを有する免疫調節因子との類推によっ
て、ＬＩＲファミリーメンバーは、体液性、炎症性及びアレルギー性応答に基づ
く調節的な影響を有する。

【００４０】 配列番号：１２、１４、１６、３０及び３２に示されたＬＩＲファミリーメン
バーは比較的に短い細胞質ドメインを有し、少なくとも１つの荷電した残基を持
つ膜貫通領域を有し、そしてＩＴＩＭモチーフを持たない。ＩＴＩＭモチーフを
欠損し、荷電した膜貫通領域を有する膜タンパク質との類推によって、これらの
ファミリーメンバーは細胞に刺激性又は活性シグナルを仲介する。例えば、膜貫
通領域にある荷電した残基を含む膜結合タンパク質は、免疫受容体チロシンベー
ス活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する他の膜結合タンパク質に会合することが
知られている。会合により、ＩＴＡＭはリン酸化されるようになり、及び活性シ
グナルを伝播する。

【００４１】 ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２と命名されるＬＩＲポリペプチドは、トランスフェクトした
又は普通の細胞の表面上に発現される。これは、実施例３及び実施例５に開示さ
れた実験結果によって証明され、フローサイトメトリー及び沈降手法によって、
ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２が単球、ＮＫ細胞の亜集団、及びＢ細胞に見出されることが示
される。Ｐ３Ｇ２はＴ細胞の小さな部分集合に検出された。Ｐ３Ｇ２は１１０−
１２０ｋＤａの糖タンパク質として発現される。Ｐ３Ｇ２は４つの潜在的な糖鎖
付加部位を有するので、このタンパク質の分子サイズは糖鎖付加の程度で変化す
るであろう。糖鎖付加部位は３連続したアミノ酸Ａｓｎ−Ｘ−Ｙで出現し、ここ
でＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり、及びＹはＳｅｒ又はＴｈｒである。
Ｐ３Ｇ２における潜在的な糖鎖付加部位は、アミノ酸１３９−１４１；２８０−
２８２；３０２−３０４；及び３４０−３４２で出現する。

【００４２】 実施例３で開示されたように単離されたＰ３Ｇ２−ＬＩＲは、ＵＬ１８とは区
別する細胞表面リガンドに結合する能力について試験された。実施例７に詳述し
た実験結果によって示されるように、Ｐ３Ｇ２はクラスＩ ＭＨＣ抗原であるＨ
ＬＡ−Ｂ ４４及びＨＬＡ−Ａ２に結合する。同様に、実施例１４に示されたよ
うに、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８は様々なＨＬＡ−Ａ、−Ｂ及び−
Ｃ遺伝子座に結合し、そして幅広い範囲のＭＨＣクラスＩ特異性を認識する。ク
ラスＩ ＭＨＣ分子は免疫監視、自己／非自己識別、感染に対する免疫応答等に
おいて中心的な役割を果たすので、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８ポリ
ペプチドは免疫応答の制御において役割を有する。腫瘍細胞およびウイルスに感
染した細胞を殺生するためのＮＫの細胞溶解活性は、活性及び阻害シグナルの微
妙な変化によって制御されることが知られている。ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ
−ｐｂｍ８が結合する同じＨＬＡクラスＩ分子に特異的な受容体は、それらのき
っかけとなるメカニズムにおいて活性的又は阻害的となり得ることが示されてい
る。類推によって、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８は、ＭＨＣクラスＩ
分子に結合し、免疫系の細胞活性の均衡を図る役割を果たし、免疫系の均衡が崩
壊する疾患状態を治療するために有用である。

【００４３】 本明細書において教示したような中程度ないし高程度のストリンジェントな条
件下でＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２細胞外のＤＮＡプローブにハイブリダイズするＤＮＡに
よってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明の範囲内である
。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡにハイブリダイズするプローブは、
配列番号：１のヌクレオチド３１０−１６８４、又はその断片を包含するプロー
ブを含む。ハイブリダイゼーションプローブとして利用された配列番号：１の断
片は、好ましくは長さが１７個のヌクレオチドより大きく、及びより典型的には
長さが２０個のヌクレオチドより大きく、そしてヌクレオチド３５８−１６８４
；ヌクレオチド３２２−４５９（ＬＩＲ保存配列をコードする）；又は配列番号
：５、６、２３、２４、２７及び１に相補的なＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列、ある
いはその断片を含みことができる。配列番号：５、６、２３、２４及び２７の断
片は、制限部位を持たないこれらの配列を含む。本明細書において開示されたヌ
クレオチド配列はまたＰＣＲプライマーをデザインするために使用することがで
き、ふさわしい長さは約１７−３０ヌクレオチドである。

【００４４】 ハリブリダイゼーションの条件は、例えば、本明細書に援用されるＳａｍｂｒ
ｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,１９８９に記載された中程度のストリンジェン
トな条件であってもよい（例えば、Ｖｏｌ．１，ｐｐ１．１０１−１０４）。中
程度のストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって定義されたよう
に、例えば、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む前洗
浄溶液の使用、及び５×ＳＳＣ中で約５５℃、一晩のインキュベーションのハイ
ブリダイゼーション条件を含む。高程度のストリンジェントな条件は、ハイブリ
ダイゼーション及び洗浄のより高い温度を含む。当業者は、所定の範囲のストリ
ンジェンシーが、当業者に知られた公式に従って、ハイブリダイゼーション若し
くは洗浄温度又はハイブリダイゼーション緩衝液の組成を変化している間にも、
維持され得ることを認識するであろう（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０−９．５
１及び１１．４５−１１．４７を参照）。そのような公式は、プローブの長さ、
プローブのＧ＋Ｃ含量、ハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度のような要素を
考慮に入れている。望むとすれば、ホルムアミドをはハイブリダイゼーション緩
衝液に加えてもよく、より低いハイブリダイゼーション温度の使用を許容する（
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０−９．５１参照）。

【００４５】 好ましい態様は、少なくとも１７個のヌクレオチドを有するＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２
の細胞外領域のプローブにハイブリダイズするＤＮＡによってコードされたアミ
ノ酸配列を含む。好ましいハイブリダイズ条件は、Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、０．０
５Ｍ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ リン酸ナトリ
ウム、１％ ＳＤＳ及び２００μｇ／ｍＬサーモン***ＤＮＡの溶液中で１６時
間６３℃のインキューベーション温度、その後の１時間６３℃で２×ＳＳＣによ
る洗浄、及び次に１時間６３℃で１×ＳＳＣによる洗浄を含む。しかしながら、
上記で説明した通り、当業者は、同程度のストリンジェンシーを生み出す他のハ
イブリダイゼーション条件を案出することができる。一般的に、ストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件は、特異的な、即ち、十分にマッチした二本鎖
の形成を支持する緩衝液及びインキュベーション温度の組み合わせを含み、一方
、受容できる速度で安定な二本鎖を形成することさえできる。低下したストリン
ジェンシーの条件は、よりストリンジェントな条件下で形成し得るよりも高い範
囲のミスマッチ塩基対を含む安定な二本鎖の形成を許容する。

【００４６】 ＰＣＲプライマーに対するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は
、例えば、５×ＳＳＣ又は６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０
．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）を含む水性緩衝液中５０−５５℃で一晩、フ
ィルターに結合した標的核酸に標識プローブをハイブリダイズし、その後、６×
ＳＳＣ中、５０−５５℃で洗浄することによって達成することができる。しかし
ながら、当業者は、オリゴヌクレオチドプローブに対するストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件が、プローブの長さ、塩基組成及び配列に依存して変
化するであろうことを認識するであろう（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１１．
４５−１１．４９を参照）。

【００４７】 本発明は、配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２
２、３０、３２、３４、３６及び３８に示されるアミノ酸配列とは異なり、しか
し高い相同性であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。例としては、こ
れに限定されるものはないが、他の哺乳動物種由来のホモログ、変異体（自然に
発生する突然変異体と組換えＤＮＡ技術によって産生した突然変異体の両方）、
そして所望の生物学的活性を保持するＬＩＲ Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲファミリーメ
ンバー断片を含む。好ましくは、そのようなポリペプチドは、配列番号：２、４
、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、３０、３２、３４、３６及
び３８に記載されたＬＩＲポリペプチドに関連した生物学的活性を提示し、及び
配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、３０、３
２、３４、３６及び３８で示されたポリペプチドのシグナルペプチド及び細胞外
ドメインのアミノ酸配列のいずれかに少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列
を含む。好ましくは、そのようなポリペプチドは、配列番号：２、４、８、１０
、１２、１４、１６、１８、２０、２２、３０、３２、３４、３６及び３８で示
されたポリペプチドのシグナルペプチド及び細胞外ドメインのアミノ酸配列のい
ずれかに少なくとも９０％同一である。ポリペプチド間の同一性の程度を測定す
ることは、タンパク質配列を解析するためにデザインされた任意のアルゴリズム
又はコンピュータープログラムを用いて達成することができる。以下に記載した
商業的に入手可能なＧＡＰプログラムは、そのようなプログラムの１つである。
他のプログラムは、商業的に入手可能でもあるＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＣＧプログ
ラムを含む。

【００４８】 ＬＩＲポリペプチドファミリーメンバーの所望の生物学的特性、例えばＭＨＣ
クラスＩ又は他のリガンドへの結合を保持するＬＩＲポリペプチド断片は、本発
明の範囲内である。そのような態様の１つにおいて、ＬＩＲポリペプチド断片が
、細胞外ドメインの全部又は一部を含み、しかし細胞膜上のポリペプチドの保持
を引き起こすであろう膜貫通領域を欠損している可溶性ＬＩＲポリペプチドであ
る。可溶性ＬＩＲポリペプチドは、それらが発現される細胞から分泌され得る。
都合よくは、可溶性ＬＩＲが発現に基づいて分泌されるように異種性シグナルペ
プチドがＮ−末端に融合される。可溶性ＬＩＲポリペプチドは、シグナルペプチ
ドを組込んでいる細胞外ドメインとシグナルペプチドが切断された細胞外ドメイ
ンを含む。

【００４９】 ＬＩＲファミリーメンバーの可溶体の使用は、ある種の適用に有利である。そ
のような利点の１つは、ある種の組換え宿主細胞から可溶体を精製する容易さで
ある。可溶性タンパク質は細胞から分泌されるため、回収工程を経て細胞からタ
ンパク質を抽出する必要はない。加えて、可溶性タンパク質は一般的に静脈投与
により適していて、細胞表面のＬＩＲファミリーメンバーとそのリガンドとの相
互作用を遮蔽し、所望の免疫機能を仲介するために使用することができる。

【００５０】 さらに、可溶性ＬＩＲポリペプチドであって、全細胞外ドメイン又は任意の所
望なその断片を含んでいてもよく、シグナルペプチドを除いた細胞外ドメインを
含む可溶性ＬＩＲポリペプチドは、本発明に包含される。つまり、例えば、可溶
性ＬＩＲポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸ｘ₁−４５８（ここでｘ₁はア
ミノ酸１又は１７）；配列番号：４のアミノ酸ｘ₂−４５９（ここでｘ₂はアミノ
酸１又は１７）；配列番号：８のアミノ酸ｘ₃−４３９（ここでｘ₃はアミノ酸１
又は１７）；配列番号：１０のアミノ酸ｘ₄−４５８（ここでｘ₄はアミノ酸１又
は１７）；配列番号：１２のアミノ酸ｘ₅−２４１（ここでｘ₅はアミノ酸１又は
１７）；配列番号：１４のアミノ酸ｘ₆−４６１（ここでｘ₆はアミノ酸１又は１
７）；配列番号：１６のアミノ酸ｘ₇−４４９（ここでｘ₇はアミノ酸１又は１７
）；配列番号：１８のアミノ酸ｘ₈−２５９（ここでｘ₈はアミノ酸１又は１７）
；配列番号：２０のアミノ酸ｘ₉−４４３（ここでｘ₉はアミノ酸１又は１７）；
配列番号：２２のアミノ酸ｘ₁₀−４５６（ここでｘ₁₀はアミノ酸１又は１７）；
配列番号：３０のアミノ酸ｘ₁₁−２６２（ここでｘ₁₁はアミノ酸１又は３５）；
配列番号：３２のアミノ酸ｘ₁₂−２５０（ここでｘ₁₂はアミノ酸１又は３６）；
配列番号：３４のアミノ酸ｘ₁₃（ここでｘ₁₃はアミノ酸１又は３５）；配列番号
：３６のアミノ酸ｘ₁₄（ここでｘ₁₄はアミノ酸１又は３６）；及び配列番号：３
８のアミノ酸１−３９３を含む。上記同定した可溶性ＬＩＲポリペプチドは、シ
グナルペプチドを含む、及び除くＬＩＲ細胞外領域を含む。膜貫通及び細胞質領
域を欠損するＬＩＲ、例えば配列番号：８、３４及び３６もまた本明細書に包含
される。さらなる可溶性ＬＩＲは、所望な生物学的活性、例えばＭＨＣクラスＩ
分子を含むリガンドへの結合を保持するファミリーメンバーの細胞外ドメインの
断片を含む。

【００５１】 ＬＩＲファミリーメンバー断片は、可溶性ポリペプチドを含み、多くの慣習的
な手法のいずれかによって調製してもよい。断片をコードする所望のＬＩＲポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＬＩＲポリペプチド断片を製造するための
発現ベクターにサブクローンしてもよい。選択されたコードするＤＮＡ配列は、
都合よく、適切なリーダー又はシグナルペプチドをコードする配列に融合する。
ＤＮＡ断片をコードする所望のＬＩＲメンバーは、既知のＤＮＡ合成手法を用い
て化学的に合成してもよい。ＤＮＡ断片はまた、全長をクローンしたＤＮＡ配列
の制限的エンドヌクレアーゼ消化によって生産してもよく、及び適切なゲル上で
電気泳動によって単離してもよい。必要であれば、５’及び３’端を所望の点ま
で再構築するオリゴヌクレオチドは、制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片に
連結することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、付加的に、所望のコ
ーディング配列の上流の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含み、コーディング
配列のＮ端での開始コドン（ＡＴＧ）の位置を定めてもよい。

【００５２】 所望のタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を得るために有用な別の手法は
、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法である。所望のＤＮＡの末端を定義
するオリゴヌクレオチドは、所望のＤＮＡ鋳型から追加のＤＮＡを合成するため
にプライマーとして使用される。オリゴヌクレオチドはまた、増幅したＤＮＡ断
片を発現ベクターに挿入することを容易にするために、制限エンドヌクレアーゼ
に対する認識部位を含んでもよい。ＰＣＲ手法は、例えば、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ
Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ｗｕら監修、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ
．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９８９），９９．１８９−１９６；及びＰＣＲ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら監修、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ
．（１９９０）に記載される。

【００５３】 本発明のＬＩＲ核酸分子は、単離されたｃＤＮＡ、化学的に合成したＤＮＡ、
ＰＣＲによって単離されたＤＮＡ、クローニングされたゲノムＤＮＡ、及びそれ
らの組み合わせを含む。ゲノムＬＩＲファミリーＤＮＡは、標準的な手法を用い
て、本明細書において開示されたＬＩＲファミリーｃＤＮＡにハイブリダイゼー
ションすることによって単離することができる。ＬＩＲファミリーｃＤＮＡ分子
から転写された単離されたＲＮＡもまた本発明に包含される。

【００５４】 ＬＩＲポリペプチドコーディング領域のようなＤＮＡ断片、及び可溶性ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ断片は、本発明の範囲内である。可溶性ポリペプチド
をコードするＤＮＡ断片の例には、ＬＩＲファミリーメンバーの全細胞外領域を
コードするＤＮＡ、及びシグナルペプチドを欠損している領域のような細胞外領
域断片をコードするＤＮＡが含まれる。より具体的には、本発明は、配列番号：
１のヌクレオチド３１０−２２６２（Ｐ３Ｇ２コーディング領域）；配列番号：
１のヌクレオチドｘ₁−１６８３（ここでｘ₁は３１０又は３５８）（Ｐ３Ｇ２細
胞外ドメインをコードする）；配列番号：３のヌクレオチド１６８−２１２６（
１８Ａ３コーディング領域）及び配列番号：３のヌクレオチドｘ₂−１５４４（
ここでｘ₂は１６８又は２１６）（１８Ａ３細胞外ドメインコーディング領域）
；配列番号：７のヌクレオチドｘ₃−１４１２（ここでｘ₃は９３又は１４１）（
ｐｂｍ２５コーディング領域及び細胞外領域）；配列番号：９のヌクレオチド１
８４−１９８０（ｐｂｍ８コーディング領域）及び配列番号：９のヌクレオチド
ｘ₄−１５５７（ここでｘ₄は１８４又は２３２）（ｐｂｍ８細胞外ドメインコー
ディング領域）；配列番号：１１のヌクレオチド１７１−１０４０（ｐｂｍ３６
−２コーディング領域）及び配列番号：１１のヌクレオチドｘ₅−８７８（ここ
でｘ₅は１７１又は２１９）（ｐｂｍ３６−２細胞外ドメインをコードする）；
配列番号：１３のヌクレオチド１８３−１６５２（ｐｂｍ３６−４に対するコー
ディング領域）及び配列番号：１３のヌクレオチドｘ₆−１５６５（ここでｘ₆は
１８３又は２３１）（ｐｂｍ３６−４細胞外ドメインをコードする）；配列番号
：１５のヌクレオチド４０−１４９１（ｐｂｍｈｈコーディング領域）及び配列
番号：１５のヌクレオチドｘ₇−１３８６（ここでｘ₇は４０又は８８）（ｐｂｍ
ｈｈ細胞外ドメインをコードする）；配列番号：１７のヌクレオチド３０−１３
７６（ｐｂｍ２コーディング領域）及び配列番号：１７のヌクレオチドｘ₈−８
０６（ここでｘ₈は３０又は７８）（ｐｂｍ２細胞外領域をコードする）；配列
番号：１９のヌクレオチド６６−１９６１（ｐｂｍ１７コーディング領域）及び
配列番号：１９のヌクレオチドｘ₉−１３９４（ここでｘ₆は６６又は１１４）（
ｐｂｍ１７細胞外ドメインをコードする）；配列番号：２１のヌクレオチド６７
−１８３９（ｐｂｍｎｅｗコーディング領域）及び配列番号：２１のヌクレオチ
ドｘ₁₀−１４３４（ここでｘ₁₀は６７又は１１５）（ｐｂｍｎｅｗ細胞外ドメイ
ンをコードする）；配列番号：２９のヌクレオチド６９−９６８（ＬＩＲ−９ｍ
１のコーディング領域）及び配列番号：２９のヌクレオチドｘ₁₁−８５４（ここ
でｘ₁₁は６９又は１７０）（ＬＩＲ−９ｍ１細胞外ドメインをコードする）；配
列番号：３１のヌクレオチド９５−９５８（ＬＩＲ−９ｍ２コーディング領域）
及び配列番号：３１のヌクレオチドｘ₁₂−８４４（ここでｘ₁₂は９５又は２００
）（ＬＩＲ−９ｍ２細胞外ドメインをコードする）；配列番号：３３のヌクレオ
チドｘ₁₃−９１２（ここでｘ₁₃は１１５又は２１６）（ＬＩＲ−９ｓ１コーディ
ング領域及び細胞外領域）；配列番号：３５のヌクレオチドｘ₁₄−８３４（ここ
でｘ₁₄は７３又は１７８）（ＬＩＲ−９ｓ２コーディング領域及び細胞外領域）
；配列番号：３７のヌクレオチド１−１３５０（ＬＩＲ−１０コーディング領域
）及び配列番号：３７のヌクレオチド１−１１７９（ＬＩＲ−１０細胞外ドメイ
ンのほぼいくつかのアミノ末端アミノ酸をコードする）を含む。

【００５５】 アミノ酸配列が配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０
、２２、３０、３２、３４、３６及び３８で示されたＬＩＲタンパク質の生物学
的活性な断片をコードするＤＮＡは、本発明に含まれる。

【００５６】 本発明は、遺伝子コードの縮重により、上述した核酸配列によってコードされ
たポリペプチドに同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び
それらに相補的な配列を包含する。加えて、天然のヒトＬＩＲファミリーメンバ
ーｃＤＮＡのコーディング領域を含む生物学的に活性なＬＩＲファミリーメンバ
ーをコードするＤＮＡ又はその断片、及び遺伝子コードの結果として天然のＬＩ
ＲポリペプチドＤＮＡ配列に縮重するＤＮＡ又は本明細書に記載された天然のＬ
ＩＲファミリーメンバーのＤＮＡは、本明細書の範囲内である。

【００５７】 別の面において、本発明は、ＬＩＲの変異体及び誘導体、並びに所望の生物学
的活性を保持するＬＩＲファミリーポリペプチドの変異体及び誘導体であって、
組換え体及び非組換え体の両方を含む。本明細書に言及されるように、ＬＩＲ変
異体は、本明細書に記載されるように、天然のＬＩＲポリペプチドに実質的に相
同なポリペプチドであるが、但し、その変異体のアミノ酸配列が、１つ又はそれ
より多くのの欠失、挿入、置換のために天然のポリペプチドのアミノ酸配列と異
なっているポリペプチドである。

【００５８】 ＬＩＲファミリー変異体は、天然のＬＩＲヌクレオチド配列の突然変異から得
てもよい。ＬＩＲファミリーメンバーの天然のＤＮＡに比べて１つ又はそれ以上
のヌクレオチド付加、ヌクレオチド欠失、又はヌクレオチド置換を有するヌクレ
オチド配列を含むそのようなＤＮＡ突然変異体又は変異体、及び所望の生物学的
活性を有する変異ＬＩＲポリペプチド又は変異ＬＩＲファミリーメンバーをコー
ドするＤＮＡ突然変異体又は変異体は、本発明内である。好ましくは、生物学的
活性は、実質的に天然のＬＩＲポリペプチドの活性と同じである。

【００５９】 本発明の変異のアミノ酸配列及び変異のヌクレオチド配列は、好ましくは、天
然のＬＩＲファミリーメンバー配列に少なくとも８０％同一である。天然のアミ
ノ酸又はヌクレオチド配列と変異アミノ酸又はヌクレオチド配列間の相同性又は
同一性の程度を決定するための１つの方法は、そのような目的のために利用でき
るコンピュータープログラムを用いて配列を比較することである。１つの適した
コンピュータプログラムがＧＡＰプログラム（バージョン６．０）であり、Ｄｅ
ｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）に
よって記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣ
Ｇ）より入手可能である。ＧＡＰプログラムはＮｅｅｄｌｅｍｅｎ及びＷｕｎｓ
ｃｈの整列方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）を利用する
ものであり、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎによって修正された（Ａｄｖ．Ａ
ｐｐｌ．Ｍａｔｈ ２：４８２，１９８１）。簡単には、ＧＡＰプログラムは、
同一である整列した記号（即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数として同一性
を定義し、２つの配列を比べてより短い方にある記号の総数で叙する。ＧＡＰプ
ログラムのための好ましいデフォルトパラメータには：（１）ヌクレオチドに関
する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１及び非同一に対し０の
値を含む）、そしてＳｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修、Ａｔｌａｓ ｏ
ｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ
，ｐｐ．３５３−３５８，１９７９に記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及び
Ｂｕｒｇｅｓｓ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６）
の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティー及び
各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；及び（３）末端ギャ
ップに対するペナルティーなし、が含まれる。

【００６０】 天然のＬＩＲアミノ酸配列の改変体は、多くの公知の手法のいずれかを用いる
ことによって提供することができる。上述のように、突然変異体は、突然変異コ
ーディング配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって選択された配
列部位に導入することができ、天然の配列の断片に連結し得る制限部位によって
近接しうる。合成したオリゴヌクレオチドを天然の配列断片に連結した後、得ら
れた再構築したヌクレオチド配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、又は欠失を
有する類似又は変異ポリペプチドをコードするであろう。変異のポリペプチドを
調製するために適した別の方法は、オリゴヌクレオチド指向部位特異的突然変異
法であり、所望の置換、欠失、又は挿入にしたがって改変した特異的コドンを有
する遺伝子を提供する。そのような改変を作成する手法は次の参考文献に開示さ
れている手法を含む：Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４２：１３３，
１９８６； Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５；
Ｃｒａｉｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２−１９ Ｊａｎｕａｒｙ，１９
８５； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ
，１９８１；そしてＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，５１８，５８４及び４，
７３７，４６２。これらの文献はすべて本明細書中に援用される。

【００６１】 本発明の変異ポリペプチドは、保守的に置換されるアミノ酸配列を有していて
もよく、これは、天然のＬＩＲポリペプチドファミリーメンバーの１つ又はそれ
より多くのアミノ酸残基が異なる残基によって置換されているが、変異ポリペプ
チドが本質的に天然のＬＩＲファミリーメンバーに等しい所望の生物学的活性を
保持することを意味する。一般に、保守的な置換への多くのアプローチは、当該
技術分野において周知であり、本発明の変異体の調製に応用することができる。
例えば、天然のポリペプチド配列のアミノ酸は、ＬＩＲポリペプチドの二次及び
／又は三次構造を改変しないアミノ酸で置換してもよい。他の適切な置換は、関
心のあるリガンド結合ドメインの外側のアミノ酸を含むものを含む。保守的なア
ミノ酸置換への１つのアプローチは、１つ又はそれ以上のアミノ酸を類似した物
理化学的特徴を有するアミノ酸で置換すること、例えば、脂肪族残基を別の残基
（例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＡｌａをお互いに）に置換すること；１
つの極性残基を別の残基（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；又はＧｌ
ｎとＡｓｎ間）に置換すること；又は類似の疎水的又は親水的特徴を有する全領
域を置換することを含む。

【００６２】 ＬＩＲポリペプチド変異体は、実施例５及び６に開示したように、細胞への結
合について、及び生物学的活性を確かめるために実施例１１に開示したように、
ホスファターゼ結合活性について試験することができる。本発明内の他のＬＩＲ
変異体は、選択されたポリペプチドのＣｙｓ残基が削除され、又は１つ又はそれ
以上の選択的アミノ酸で置換されるためにポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を変化することによって改変されるポリペプチドを含む。これらのＬＩＲ
変異体は、再天然化に基づく分子内ジスルフィド架橋を形成しないであろう。Ｃ
ｙｓ残基を削除又は変化することによる改変に対して選択されたＬＩＲポリペプ
チドを自然に発生することは、好ましくは、Ｃｙｓ残基によって形成したジスル
フィド架橋に依存する生物学的活性を有しない。他の可能な変異体は、ＫＥＸ２
プロテアーゼ活性が存在する酵母系において発現を増強するために近接した二塩
基性アミノ酸の変化を引き起こす手法によって調製される。ＥＰ２１２，９１４
は、タンパク質においてＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位を不活性化す
るための部位特異的突然変異手法を開示する。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシ
ング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、及びＬｙｓ−Ａｒｇ対を改変す
る残基を削除、付加又は置換することによって不活性化され、これらの近接した
塩基性残基の出現を推定する。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ及びペアリングはＫＥＸ２切断に
ほとんど影響されず、Ａｒｇ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−ＡｒｇをＬｙｓ−Ｌｙｓへの
変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化する保守的な及び好ましいアプローチを示す。

【００６３】 自然に発生するＬＩＲ変異体もまた本発明によって包含される。そのような変
異体の例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象、及びＬＩＲポリペプチドのタ
ンパク質分解的な切断に起因するタンパク質である。ｍＲＮＡの選択的スプライ
シングは、タンパク質の可溶体を自然に発生するような、切断されているが生物
学的活性なＬＩＲポリペプチドを産生してもよい。タンパク質分解に帰する変異
体は、異なるタイプの宿主細胞においる発現に基づいてＮ−又はＣ−末端に相違
を含み、これはＬＩＲポリペプチドから１つ又はそれ以上の末端アミノ酸のタン
パク質分解的な除去による。自然に発生する他のＬＩＲ変異体は、配列番号：２
、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、３０、３２、３４、３
６及び３８のアミノ酸配列との相違が遺伝子多型に帰するものであり、個々のう
ちのアリルである。

【００６４】 選択された化学分子との結合体を形成するために修飾された天然の又は変異の
ＬＩＲポリペプチドを含むＬＩＲファミリーポリペプチド誘導体は、本発明の範
囲内である。結合体は、別の分子が天然の又は変異のＬＩＲに共有結合すること
、又は他の分子が天然の又は変異のＬＩＲに非共有的に結合することによって形
成することができる。適した化学分子は、グリコシル基、脂質、リン、アセチル
基、及び他のタンパク質又はその断片を含むが、これらに限定されるものではな
い。化学分子をタンパク質に共有結合する手法は、当該技術分野において周知で
あり、一般的にＬＩＲポリペプチド誘導体を調製するために適している。例えば
、アミノ酸側鎖上の活性な又は活性化した機能的な基は、化学分子をＬＩＲポリ
ペプチドに共有結合するための反応部位として使用することができる。同様に、
Ｎ−末端又はＣ−末端は、化学分子のための反応部位を提供することができる。
他のタンパク質又はタンパク質断片と結合するＬＩＲポリペプチド又は断片は、
Ｎ−末端又はＣ−末端融合産物として組換え培養物中に調製することができる。
例えば、結合体又は融合部分は、ＬＩＲ分子にＮ−末端で付着したシグナル又は
リーダー配列を含んでもよい。シグナル又はリーダーペプチドは、合成部位から
細胞の内側又は外側に結合体の移転を指向する。

【００６５】 １つの有用なＬＩＲポリペプチド結合体は、米国特許第５，０１１，９１２号
及びＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１２４，
１９８８に開示されたポリＨｉｓ又は抗原性同定ポリペプチドを取り込んでいる
ものである。例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドであるＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号：３９）は、非常に
抗原的であり、特異的なモノクローナル抗体によって可逆的に結合されるエピト
ープを提供し、発現した組換えタンパク質の急速なアッセイと容易な精製を可能
にする。この配列は、Ａｓｐ−Ｌｙｓ対の直ぐ後に続く残基でウシ粘膜のエンテ
ロキナーゼによって特異的に切断される。このペプチドでキャップした融合タン
パク質は、大腸菌中の細胞内分解に耐性であってもよい。４Ｅ１１と命名された
マウスハイブリドーマは、ある種の二価の金属カチオンの存在下で配列番号：３
９のペプチドを結合するモノクローナル抗体を産生し、受託番号ＨＢ９２５９で
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションで寄託されている。ＦＬＡＧ（
登録商標）ペプチドに融合した組換えタンパク質を製造するための有用な発現系
、及びペプチドに結合し、組換えタンパク質を精製するための有用なモノクロー
ナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔ
ｉｃｕｔより入手できる。

【００６６】 特に適したＬＩＲ融合タンパク質は、ＬＩＲポリペプチドがオリゴマーの形体
であるものである。オリゴマーは、１より多くのＬＩＲポリペプチド上にシステ
イン残基間のジスルフィド結合によって形成されてもよく、又はＬＩＲポリペプ
チド鎖間で非共有的な相互作用によって形成されてもよい。別のアプローチでは
、ＬＩＲオリゴマーは、ＬＩＲポリペプチドに融合したペプチド分子間で共有又
は非共有的な相互作用を介してＬＩＲポリペプチド又はその断片を接合すること
によって形成することができる。適したペプチド分子は、ペプチドリンカー若し
くはスペーサー、又はオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドを含む。ロ
イシンジッパー及び抗体由来のある種のポリペプチドは、これらに付着したＬＩ
Ｒポリペプチドのオリゴマー化を促進し得るペプチド内にある。

【００６７】 オリゴマー形成を促進する他のＬＩＲ融合タンパク質は、抗体由来のポリペプ
チドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した異種ポリペプチドを有する
融合タンパク質である。そのような融合タンパク質を調製する方法は、Ａｓｈｋ
ｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１；
Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７，１９９０；そし
てＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ及びＡｒｕｆｆｏ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４，ｐａｇｅｓ
１０．１９．１−１０．１９．１１，１９９２であり、これらは全て本明細書中
に援用される。実施例１及び実施例５は、それぞれＵＬ１８：Ｆｃ及びＰ３Ｇ２
：Ｆｃ融合タンパク質を調製する方法を開示し、Ｐ３Ｇ２及びＵＬ１８を抗体由
来のＦｃ領域ポリペプチドに融合することによる。これは、Ｐ３Ｇ２：Ｆｃ融合
タンパク質をコードする融合遺伝子を発現ベクターに挿入し、Ｐ３Ｇ２：Ｆｃ融
合タンパク質を発現することによって達成される。融合タンパク質は、ほとんど
抗体分子のように集合することができ、これにより鎖間のジスルフィド結合がＦ
ｃポリペプチド間で形成し、二価のＰ３Ｇ２ポリペプチドを生成することによる
。同様のアプローチのおいて、Ｐ３Ｇ２又は任意のＬＩＲポリペプチドは、抗体
の重鎖又は軽鎖の可変部分と置換してもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖又は
軽鎖を有するものとして作成されれば、４つものＬＩＲ領域を有するＬＩＲオリ
ゴマーを形成することが可能となる。

【００６８】 つまり、本発明は、ＩｇのＦｃ領域を含む融合タンパク質をコードする核酸、
及びＬＩＲファミリーメンバータンパク質のいずれかの細胞外領域を含むアミノ
酸配列を包含する。そのような細胞外領域は、例えば、配列番号：２のアミノ酸
ｘ₁−４５８（ここでｘ₁はアミノ酸１又は１７）；配列番号：４のアミノ酸ｘ₂
−４５９（ここでｘ₂はアミノ酸１又は１７）；配列番号：８のアミノ酸ｘ₃−４
３９（ここでｘ₃はアミノ酸１又は１７）；配列番号：１０のアミノ酸ｘ₄−４５
８（ここでｘ₄はアミノ酸１又は１７）；配列番号：１２のアミノ酸ｘ₅−２６１
（ここでｘ₅はアミノ酸１又は１７）；配列番号：１４のアミノ酸ｘ₆−４６１（
ここでｘ₆はアミノ酸１又は１７）；配列番号：１６のアミノ酸ｘ₇−４４９（こ
こでｘ₇はアミノ酸１又は１７）；配列番号：１８のアミノ酸ｘ₈−２５９（ここ
でｘ₈はアミノ酸１又は１７）；配列番号：２０のアミノ酸ｘ₉−４４３（ここで
ｘ₉はアミノ酸１又は１７）；配列番号：２２のアミノ酸ｘ₁₀−４５６（ここで
ｘ₁₀はアミノ酸１又は１７）；配列番号：３０のアミノ酸ｘ₁₁−２６２（ここで
ｘ₁₁はアミノ酸１又は３５）；配列番号：３２のアミノ酸ｘ₁₂−２５０（ここで
ｘ₁₂はアミノ酸１又は３６）；配列番号：３４のアミノ酸ｘ₁₃−２５６（ここで
ｘ₁₃はアミノ酸１又は３５）；配列番号：３６のアミノ酸ｘ₁₄−２５３（ここで
ｘ₁₄はアミノ酸１又は３６）；及び配列番号：３８のアミノ酸１−３９３を含む
。

【００６９】 本明細書において使用されるように、Ｆｃポリペプチドは天然型及び突然変異
型を含み、並びに二量化を促進するヒンジ領域を含む切断されたＦｃポリペプチ
ドを含む。１つの適したＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１由来の天然Ｆｃ領域
ポリペプチドであって、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１に開示され、本明細書
中に援用される。別の有用なＦｃポリペプチドは米国特許第５，４５７，０３５
号に開示されたＦｃ突然変異体である。突然変異体のアミノ酸配列は、ＷＯ９３
／１０１５１に示された天然Ｆｃ配列と同一であるが、アミノ酸１９はＬｅｕか
らＡｌａに変化し、アミノ酸２０はＬｅｕからＧｌｕに変化し、及びアミノ酸２
２はＧｌｙからＡｌａに変化している。この突然変異Ｆｃは免疫グロブリン受容
体に対して低下したアフィニティーを示す。

【００７０】 あるいは、オリゴマーのＬＩＲポリペプチド変異体は、ペプチドリンカーを介
して接合した２つ又はそれより多くのＬＩＲペプチドを含んでもよい。例には、
米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に援用される）に開示されたペプ
チドリンカーが含まれる。ペプチドリンカーによって分離された多数のＬＩＲポ
リペプチドを含む融合タンパク質は、慣用的な組換えＤＮＡ技術によって製造し
てもよい。

【００７１】 オリゴマーのＬＩＲポリペプチド変異体を調製するための別の方法は、ロイシ
ンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタ
ンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、いく
つかのＤＮＡ結合タンパク質において最初に同定された（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９，１９８８）。既知のロイ
シンジッパーには、二量化又は三量化する天然に発生するペプチド及びペプチド
誘導体がある。可溶性オリゴマーのＬＩＲポリペプチド又はＬＩＲファミリーの
オリゴマーのポリペプチドを製造するために適したロイシンジッパードメインの
例には、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に開示されたものであり、本明細書中
に援用される。溶液中で二量化又は三量化するペプチドに融合した可溶性ＬＩＲ
ポリペプチドを有する組換え融合タンパク質は、適した宿主細胞において発現し
てもよく、及び得られた可溶性オリゴマーのＬＩＲポリペプチドは培養上澄みか
ら回収してもよい。

【００７２】 １つのタンパク質分子を別のタンパク質分子に架橋するために有用な無数の試
薬が知られている。異種二官能性及び同種二官能性リンカーがこの目的のために
、例えばＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ
，Ｉｌｌｉｎｏｉｓより入手可能である。そのようなリンカーは、アミノ酸側鎖
上のある種の官能基と反応して、よって、１つのポリペプチドを別のポリペプチ
ドに連結するあろう、２つの官能基（例えば、エステル及び／又はマレイミド）
を含む。

【００７３】 本発明において使用してもよいペプチドリンカーの１つのタイプは、各ドメイ
ンが所望の生物学的活性に必要な二次及び三次構造内に適切に畳み込むことを確
実にするのに十分な距離によってポリペプチドドメインを分離する。リンカーは
、細胞外部分に、リガンドに対する結合部位を形成するための適切な空間的配向
を呈するようにすべきである。

【００７４】 適したペプチドリンカーは当該技術分野において知られ、慣用的な手法によっ
て使用されてもよい。適したペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１
８０号及び第４，９３５，２３３号に開示されたものもり、これらは本明細書中
に援用される。ペプチドリンカーは、１つのペプチドが別のペプチドに連結する
ために使用される慣用的な方法のいずれかによって、ＬＩＲポリペプチドに連結
させてもよい。上述のように、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎ
ｙより入手可能な架橋試薬は、使用してもよいものである。そのような試薬と反
応する側鎖を有するアミノ酸は、ペプチドリンカー内に、例えばその末端に含ま
れてもよい。好ましくは、ペプチドリンカーを介して形成した融合タンパク質は
、組換えＤＮＡ技術によって調製される。

【００７５】 本発明の融合タンパク質は、あるタンパク質のＣ末端部分が他のタンパク質の
Ｎ末端部分に融合されるリンカーに融合する構造体を含む。そのような方法で連
結したペプチドは、所望の生物学的活性を保持する一本鎖タンパク質を製造する
。融合タンパク質の成分は、それらの出現の順番で列挙される（即ち、Ｎ末端ポ
リペプチドは最初に列挙され、続いてリンカー、次いでＣ末端ポリペプチドとな
る）。

【００７６】 融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、所望のタンパク質をコードする分
離したＤＮＡを適した発現ベクターに挿入するための組換えＤＮＡ手法を用いて
構築される。１つのタンパク質をコードするＤＮＡ断片の３’端は、他のタンパ
ク質をコードするＤＮＡ断片の５’端に、単一の生物学的活性融合タンパク質へ
のｍＲＮＡの翻訳を許容する状態に配列の読み枠を揃えて、（リンカーを介して
）連結される。Ｎ末端の一本鎖配列をコードするＤＮＡ配列は、Ｎ末端のポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列上に保持されてもよく、一方、終止コドンは、第
２の（Ｃ末端）ＤＮＡ配列に読み進むのを妨げるものであり、削除される。逆に
、翻訳を止めるために必要とされる終止コドンは、第２のＤＮＡ配列に保持され
る。シグナル配列をコードするＤＮＡは、好ましくは、Ｃ末端ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列から除去される。

【００７７】 所望のポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、任意の適した慣用的
手法を用いて２つのタンパク質をコードするＤＮＡ配列間、及び同じ読み枠内に
挿入してもよい。例えば、リンカーをコードし、適した制限エンドヌクレアーゼ
切断部位を含む化学的に合成したオリゴヌクレオチドは、Ｆｃ及びＰ３Ｇ２ポリ
ペプチドをコードする配列間で連結されてもよい。

【００７８】 ＬＩＲファミリーのポリペプチドを発現するための組換え発現ベクター、及び
発現ベクターを用いて形質変換される宿主細胞は、本発明の範囲内にある。発明
の発現ベクターは、適した転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列、例えば、哺乳動
物、微生物、ウイルス、又は昆虫遺伝子由来のヌクレオチド配列に実施可能に連
結したＬＩＲファミリーメンバーをコードするＤＮＡを含む。調節配列の例には
、転写プロモーター、オペレータ、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合
部位、及び転写及び翻訳の開始及び終止を制御する適した配列を含む。ヌクレオ
チド配列は、調節配列がＬＩＲ ＤＮＡ配列に機能的に関連する場合、実施可能
に連結される。つまり、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレ
オチド配列がＬＩＲ ＤＮＡ配列の転写を制御する場合にＬＩＲ ＤＮＡ配列に
実施可能に連結される。所望の宿主細胞において複製する能力を授ける複製起源
、及び形質転換体が同定される選択遺伝子は一般的に発現ベクターに組込まれる
。

【００７９】 加えて、適した一本鎖ペプチドをコードする配列は、発現ベクターに取り込む
ことができる。一本鎖ペプチド（分泌性リーダー）に対するＤＮＡ配列は、ＬＩ
Ｒ配列にインフレームで融合してもよく、そのためにＬＩＲは初めは一本鎖ペプ
チドを含む融合タンパク質として翻訳される。所期の宿主細胞において機能的で
ある一本鎖ペプチドは、ＬＩＲポリペプチドの細胞外分泌を促進する。一本鎖ペ
プチドは、細胞からのＬＩＲポリペプチドの分泌時に、ＬＩＲポリペプチドから
切断される。

【００８０】 本発明の組換え発現ベクターは、ＬＩＲポリペプチドをコードする任意のＤＮ
Ａを含んでもよい。そのような発現ベクターに包含するための代表的なＤＮＡは
、配列が配列番号：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２
９、３１、３３、３５及び３７に示される核酸分子を含む。

【００８１】 ＬＩＲポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、原核生物、酵母又はより高度
な真核生物の細胞を含む。細菌、真菌、酵母、及び哺乳類動物の細胞性宿主と共
に使用するための適したクローニング及び発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅ
ｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８５）に記載
されている。無細胞翻訳系も、本明細書において開示されたＤＮＡ由来のＲＮＡ
を用いてＰ３Ｇ２ポリペプチドを製造するために使用することができる。

【００８２】 本発明の実施において適した原核生物の宿主細胞は、グラム陰性又はグラム陽
性有機体、例えば大腸菌又は桿菌を含む。形質転換に適した原核生物の宿主細胞
は、例えば、大腸菌；枯草菌；ネズミチフス菌；並びに、例えば、シュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）、及びスタフィロカッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の様々な他の
多くの種を含む。原核生物の宿主細胞、例えば大腸菌において、Ｐ３Ｇ２ポリペ
プチドは、組換えポリペプチドの発現を促進するためのＮ末端のメチオニン残基
を含む。Ｎ末端のＭｅｔは、発現した組換えＬＩＲポリペプチドから切断されて
もよい。

【００８３】 原核生物の宿主細胞において使用する発現ベクターは、一般に、１つ又はそれ
より多くの表現型の選択可能なマーカー遺伝子を含む。表現型の選択マーカー遺
伝子は、例えば、抗生物質耐性を与えるタンパク質、又は独立栄養素要求を供給
するタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物の宿主細胞に対する有用な
発現ベクターの例には、商業的に入手可能なプラスミド由来のもの、例えばクロ
ーニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）がある。ｐＢＲ３２２は
、アンピリシン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含み、つまり、形質
転換した細胞を同定するための簡単な方法を提供する。適したプロモーター及び
ＬＩＲファミリーＤＮＡはｐＢＲ３２２ベクターに挿入してもよい。他の商業的
に入手可能なベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆ
ｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びｐＧＥＭ１
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を含む。

【００８４】 組換え原核生物の宿主細胞の発現ベクター用に一般的に使用されるプロモータ
ー配列は、β−ラクタマーゼ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｓｅ）、ラクトースプロ
モーターシステム（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ７５：６１５，
１９７８；及びＧｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４
，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｌ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７，１９８０；及
びＥＰ−Ａ−３６７７６）、及びｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４１２，
１９８２）を含む。特に有用な原核生物の宿主細胞発現系は、ファージλＰ_Lプ
ロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性の抑制配列を使用する。λＰ_Lプロモ
ーターの誘導体を取り込んだ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
から入手可能なプラスミドベクターは、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ
９ ＡＴＣＣ ３７０９２中に存在）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１、ＡＴＣ
Ｃ ５３０８２中の存在）を含む。

【００８５】 あるいは、ＬＩＲポリペプチドは酵母の宿主細胞、好ましくはサッカロミセス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から
発現しもよい。他の酵母の属、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）又はクライベロマ
イセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）もまた使用してもよい。酵母ベクターは
しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製配列起点、自己複製配列（ＡＢＳ）、
プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終止用配列、及び選択可
能なマーカー遺伝子を含むであろう。酵母ベクター用に適したプロモーター配列
は、数ある中で、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔ
ｚｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９
８０）又は他の解糖系酵素（Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍ
ｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；及びＨｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデ
ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシ
ラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−
ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラ
ーゼ、ホスホ−グルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのためのプロモー
ターを含む。酵母発現において使用のためのほかの適したベクター及びプロモー
ターは、さらにＨｉｔｚｅｍａｎ，ＥＰＡ−７３，６７５に開示される。別の代
替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９
８２）及びＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４，１９８２）によって
開示されたグルコース抑制的ＡＤＨ２プロモーターである。酵母及び大腸菌の両
方において複製可能なシャトルベクターは、大腸菌（Ａｍｐ^r遺伝子及び複製起
点）において選択及び複製のためのｐＢＲ３２２由来のＤＮＡを上述した酵母ベ
クター内に挿入することによって構築してもよい。

【００８６】 酵母α−因子リーダー配列は、ＬＩＲポリペプチドの分泌を指向するために使
用してもよい。α−因子リーダー配列はしばしば、プロモーター配列と構造遺伝
子配列の間に挿入される。Ｋｕｊａｎら、Ｃｅｌｌ ３０：９３３，１９８２、
及びＢｉｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：
５３３０，１９８４を参照。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進す
るために適した他のリーダー配列が当該技術分野において既知である。リーダー
配列は、３’端近くで、１つ又はそれより多くのの制限部位を含むために改変し
てもよい。これは構造遺伝子にリーダー配列の融合を促進するであろう。

【００８７】 酵母形質転換プロトコールは、当該技術分野において既知である。そのような
プロトコールの１つは、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９，１９７８）によって開示される。Ｈｉｎｎｅらの
プロトーコルは選択培地中のＴｒｐ⁺形質転換体に対して選択し、ここで選択培
地は０．６７％酵母窒素ベース、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μ
ｇ／ｍＬアデニン及び２０μｇ／ｍＬウラシルからなる。

【００８８】 ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターによって形質転換された酵母宿主細
胞は、発現を誘導するために「リッチ」培地中で増殖してもよい。リッチ培地の
例には、１％酵母抽出、２％ペプトン、及び１％グルコースを有し、８０μｇ／
ｍＬウラシルを添加したものがある。ＡＤＨ２プロモーターの脱抑制は、グルコ
ースが培地から枯渇した場合に起こる。

【００８９】 哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養は、組換えＬＩＲポリペプチドを発現するため
に使用してもよい。昆虫細胞中に異種タンパク質を製造するためのバキュロウイ
ルス系は、Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
６：４７（１９８８）によって概説される。哺乳動物起原の樹立細胞株を使用し
てもよい。適した哺乳動物の宿主細胞株の例は、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２３：
１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１
６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、及びＢＨ
Ｋ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）細胞株、及びＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ．１
０：２８２１，１９９１）によって開示されたアフリカミドリザル細胞株ＣＶＩ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）由来のＣＶＩ／ＥＢＮＡ、ＣＯＳ−１を含む。

【００９０】 哺乳動物の宿主細胞の発現ベクター用の転写及び翻訳制御配列はウイルスゲノ
ムから切り出してもよい。共通して使用されるプロモーター及びエンハンサー配
列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４
０）、及びヒトサイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来
のＤＮＡ、例えばＳＶ４０起原、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、ス
プライス、及びポリアデニル化部位は、哺乳動物の宿主細胞において構造遺伝子
配列の発現に対する他の遺伝的要素を提供するために使用してもよい。ウイルス
の初期及び後期プロモーターは、両方が複製のウイルス起点を含む断片としてウ
イルスゲノムから容易に得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３，１９７８）。より小さな又はより大きな
ＳＶ４０断片もまた、複製部位のＳＶ４０ウイルス起点に位置したＨＩＮＤ Ｉ
ＩＩ部位からＢｇ／Ｉ部位まで伸長するおよそ２５０ｂｐの配列が含まれる限り
、使用しうる。

【００９１】 哺乳動物の宿主細胞において使用するために適した発現ベクターは、Ｏｋａｙ
ａｍａ及びＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）に
よって開示されるように構築することができる。Ｃ１２７マウス哺乳動物の上皮
細胞において哺乳動物の受容体のｃＤＮＡの安定な高レベルの発現に有用な１つ
の系は、Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）
によって開示されたように実質的に構築することができる。Ｃｏｓｍａｎら（Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１２：７６８，１９８４）によって開示された高発現ベクターで
あるＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ ３９８９０として寄託されている。
さらなる哺乳動物の発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６及びＷＯ９１／
１８９８２に開示されている。哺乳動物の宿主細胞において使用するためにさら
に付加的な発現ベクターは、ｐＤＣ２０１（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４１：５８５，１９８８）、ｐＤＣ３０２（Ｍｏｓｌｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ ５９：３３５，１９８９）、及びｐＤＣ４０６（ＭｃＭａｈａ
ｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１，１９９１）を含む。レトウ
イルス由来のベクターもまた使用してもよい。１つの好ましい発現系は、以下の
実施例５で検討したようにｐＤＣ４０９を使用する。

【００９２】 ＬＩＲポリペプチドの発現については、発現ベクターは一本鎖又はリーダーペ
プチドをコードするＤＮＡを含んでもよい。負のシグナル配列の場合には、異種
のシグナル配列を添加してもよく、例えば、米国特許４，９６５，１９５に開示
されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列； Ｃｏｓｍａｎら（
Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８，１９８４）に開示されたインターロイキン−２
受容体のためのシグナル配列； ＥＰ３６７，５６６に開示されたインターロイ
キン−４シグナルペプチド； 米国特許４，９６８，６０７に開示されたＩ型イ
ンターロイキン−１受容体シグナルペプチド；及びＥＰ４６０，８４６に開示さ
れたＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドである。

【００９３】 さらに、精製したＬＩＲファミリーポリペプチド、及びそれらの精製の方法は
本発明内に企図される。本発明の精製したポリペプチドは、上述した組換え発現
系から精製してもよく、天然に発生している細胞から精製してもよい。精製の所
望の程度は、タンパク質がインビボ使用に指向された場合に好ましい比較的高程
度の精製を伴ってタンパク質の指向された使用に依存してもよい。好ましくは、
ＬＩＲポリペプチド精製方法は、所望のＬＩＲタンパク質以外のタンパク質に対
応するバンドが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
によって検出できないようなものである。上述のように、差異的糖鎖付加、転写
後のプロセッシングにおける変化等により任意のＬＩＲポリペプチドに対応する
多くのバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出されてもよい。最も好ましくは、
任意の特異的なＬＩＲポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析に基づき一
本のタンパク質のバンドによって支持されるように、実質的に均質になるまで精
製される。タンパク質バンドは、銀染色、クーマシーブルー染色、又はタンパク
質が適当に標識されている場合、オートラジオグラフィー又は蛍光によって視覚
化されてもよい。

【００９４】 精製したＬＩＲポリペプチドを提供するための１つの方法は、最初に、所望の
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細
胞を培養し、続いてＬＩＲポリペプチドを回収することを含む。当業者は認識す
るであろうが、ポリペプチドを回収する手法は、使用される宿主細胞タイプ及び
ポリペプチドが培養液中に分泌されるか、細胞から抽出されるかどうかというよ
うな要因に従って変化するであろう。

【００９５】 発現系がポリペプチドを培地中に分泌する場合、最初に、培地を商業的に入手
可能なタンパク質濃度フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｕｎｉｔを用いて濃
縮してもよい。濃縮工程に続いて、濃縮物をゲル濾過媒体のような適した精製マ
トリックスに適用することができる。あるいは、アニオン交換樹脂を使用するこ
ともでき、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有する樹
脂マトリックス又は樹脂基質がある。マトリックスは、アクリルアミド、アガロ
ース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製において通例使用されてい
る他のタイプであり得る。同様に、カチオン交換基、例えば不溶性マトリックス
上のスルフォプロピル又はカルボキシメチル機能基を有する精製マトリックスが
使用され得る。スルフォプロピル基が好ましい。なお、他の精製マトリックス及
び精製したＬＩＲを提供するために適した方法は、疎水性逆相媒体（ＲＰ−ＨＰ
ＬＣ）を用いる高性能液体クロマトグラフィーである。当業者は、任意の、又は
全部の前述の精製工程を、様々な組み合わせで、精製したＬＩＴポリペプチドに
使用することができる。

【００９６】 あるいは、ＬＩＲポリペプチドはイムノアフィニティークロマトグラフィーに
よって精製され得る。ＬＩＲポリペプチドを結合する抗体を含むアフィニティー
カラムは、通常の方法によって調製してもよく、及びＬＩＲを精製することに使
用してもよい。実施例５は、イムノアフィニティークロマトグラフィーにおいて
利用してもよいＰ３Ｇ２に対して指向されたモノクローナル抗体を生成するため
の方法を開示する。

【００９７】 細菌性培養物中に産生した組換えタンパク質は、最初に、凍結−融解サイクリ
ング、超音波処理、機械的な粉砕、又は細胞溶解試薬の使用を含む任意の便利な
方法によって宿主細胞を粉砕し、次いで、ポリペプチドが不溶性であれば細胞ペ
レットから、又はポリペプチドが溶解性であれば上清からポリペプチドを抽出す
ることによって単離してもよい。最初の単離工程の後、精製工程は、１つ又はそ
れ以上の濃縮、脱塩、イオン交換、アフィニティー又はサイズ排除クロマトグラ
フィー精製工程を含んでもよい。多くの適用のためには、最終的にＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ精製工程が有益である。

【００９８】 ＬＩＲポリペプチド及び精製したＬＩＲポリペプチドを提供するためのさらな
る方法は、分泌タンパク質としてタンパク質を発現する酵母を発酵することを含
む。大量発酵から得られた分泌した組換えタンパク質は、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４）によって開示されたものに類似
した方法によって精製することができ、予備のＨＰＬＣカラム上で組換えタンパ
ク質の精製のための２つの連続的な逆相ＨＰＬＣ工程を含む。

【００９９】 ｐＤＣ４０６ベクター内のＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２ ＤＮＡは、１９９７年４月２２
日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションンで受託され、受託番号９
７９９５が割り当てられた。受託は、ブダベスト条約の条件下でなされた。

【０１００】 上述したように、及び実施例６及び１４で示したように、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及
びＬＩＲ−ｐｂｍ８は、ある種の単球、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞の表面上に見出さ
れたＭＨＣクラスＩ受容体分子である。単球に関しては、ＭＨＣクラスＩ結合タ
ンパク質であるＬＩＲの発現は、単球がＭＨＣクラスＩ分子を認識するためにい
くつかの要件があることを示唆する。ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２、ＬＩＲ−ｐｂｍ８ Ｌ
ＩＲ及びある種の付加的なＬＩＲファミリーメンバーは、細胞質のＩＴＩＭモチ
ーフを含む。既知のＭＨＣクラスＩ受容体分子の構造と機能の類推によって、こ
れらのＬＩＲは負のシグナルを仲介する阻害受容体である。確かに、実施例１１
に示された結果は、ＬＩＲがＳＨＰ−１と会合し、ＦｃＲを仲介した活性事象を
阻害することを表す。つまり、単球は、細胞を介した溶解のメカニズムを抑制す
るためにクラスＩ受容体を発現してもよい。単球は、ＦｃＲを介した細胞外病原
体を容易に貪食し、及び単球−ＦｃＲ連動は、さらに全身性メディエーター、特
にＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−８を製造することによって免疫応答の伝播を
誘導する。つまり、ＬＩＲは、単球及びマクロファージにおいて、自己組織に対
する細胞溶解及び炎症応答の制御としての役割を果たす。ＦｃＲ活性シグナルと
ＬＩＲ阻害応答間の相互作用は、低レベルの自己応答性ＩｇＧが循環系に存在し
、免疫応答の開始を伴って単球の膜に結合するようにしてもよい。例えば、これ
らの阻害受容体の発現は、母方の抗体を介した同種性認識から発生中の胚を保護
することができる。

【０１０１】 ＤＣ連結の細胞上のＬＩＲに関して、実施例１３に記載したように、ＣＤ３３ ⁺ ＣＤ１４^-ＣＤ１６^-ＨＬＡ^-ＤＲ⁺は、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８
を共発現する。ＤＣ ＦｃＲは免疫複合体を結合し、結合に続くＤＣ活性シグナ
ルを引き起こす役割を果たすことが示唆される。つまり、ＤＣ上に発現したＬＩ
Ｒは、ＦｃＲの相互作用を介してＤＣ活性を抑制してもよい。

【０１０２】 多くのＬＩＲファミリーメンバーは、ＩＴＩＭモチーフを欠損し、及びＩＴＩ
Ｍを欠損している既知のＭＨＣクラスＩ受容体の構造と機能の類推によって、該
メンバーは活性受容体である。負のシグナルを仲介する受容体の不存在は、自己
免疫疾患に帰着することができた。つまり、アゴニスト抗体又はリガンドを伴う
ＩＴＩＭモチーフを有するＬＩＲファミリーメンバーを参加させることは、免疫
系が過剰に活性的であり、及び過度の炎症と免疫病理学が存在する疾患状態にお
ける細胞機能を下方制御するために使用することができる。一方、ＩＴＩＭを有
するＬＩＲ受容体、又は受容体の可溶体に特異的なアンタゴニスト抗体を用いる
ことは、抑制された免疫機能と関連した疾患状態において特異的な免疫機能を活
性化する受容体のリガンドと細胞表面受容体の相互作用を遮蔽するために使用す
ることができる。ＩＴＩＭモチーフを欠損している受容体は活性シグナルを伝達
するので、上述のように一度参加されると、活性シグナルを仲介する受容体の不
存在は抑制された免疫機能に帰着することができた。受容体とそのアゴニスト抗
体又はリガンドとの連動は、抑制された免疫機能と関連した疾患を治療するため
に使用することができる。活性ＬＩＲ受容体又は受容体の可溶体に特異的なアン
タゴニスト抗体を使用することは、活性シグナルを下方制御する受容体のリガン
ドと活性受容体との相互作用を遮蔽するために使用することができる。

【０１０３】 ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２は様々な細胞に結合するので、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２は異種の調
製物からこれらの細胞を精製し、又は単離するために使用してもよい。さらに、
Ｐ３Ｇ２は関係した分子を単離し、又は同定するために使用してもよい。

【０１０４】 本発明のＬＩＲポリペプチドは、不完全な又は不十分な量の任意のＬＩＲポリ
ペプチドによって直接的又は間接的に仲介した任意の障害に対する治療の開発に
使用してもよい。治療上有効量の精製したＬＩＲタンパク質は、そのような障害
に苦しめられる患者に投与される。あるいは、ＬＩＲ ＤＮＡはそのような障害
を治療するための遺伝子治療アプローチを開発するために使用されてもよい。天
然のＬＩＲヌクレオチド配列を本明細書に開示することにより、不完全なＬＩＲ
遺伝子の検出、及び通常のＬＩＲをコードする遺伝子でのその置換を可能にする
。不完全な遺伝子はインビトロ診断アッセイ、及び本明細書に開示された天然の
ＬＩＲヌクレオチド配列と、遺伝子上の欠損が潜んでいると疑われる患者由来の
ＬＩＲ遺伝子のヌクレオチド配列との比較により検出してもよい。

【０１０５】 本発明はまたＬＩＲポリペプチド、又はその断片若しくは変異体を含んでもよ
い、薬学的に許容できる担体又は希釈剤を伴う医薬組成物を提供する。そのよう
な担体及び希釈剤は、使用される用量及び濃度で受容者にとって非毒性であろう
。そのような組成物はさらに緩衝液；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子
量（１０残基より小さい）のポリペプチド；タンパク質；アミノ酸；グルコース
、スクロース又はデキストリンを含む炭水化物；キレート試薬、例えばＥＤＴＡ
；グルタチオン；及び医薬組成物において通例使用される他の安定剤や賦形剤を
含んでもよい。本発明の医薬組成物は、希釈剤としての適切な賦形剤溶液を用い
る凍結乾燥物として成形してもよい。医薬組成物は本明細書に開示された任意に
おいてＬＩＲポリペプチドを含んでもよく、活性変異体、断片、及びオリゴマー
を含むがこれらに限定されない。ＬＩＲポリペプチドは、医薬的に有用な組成物
を調製するために使用される既知の方法に従って成形されてもよい。医薬的調剤
に通例使用される成分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｉｎ
ｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０）に開示された成分を含む
。

【０１０６】 本発明の医薬的調製物は、患者、好ましくはヒトに、適応症に適した手法で投
与されてもよい。つまり、例えば、組成物は、静脈注射、局所投与、連続的な点
滴、移植片からの持続的な放出、等によって投与することができる。適切な用量
及び投与頻度は、治療されるべき適応症の性質及びつらさ、所望の応答、患者の
状態等のような因子に依存するであろう。

【０１０７】 好ましい態様においては、本発明の医薬組成物に使用されるＬＩＲポリペプチ
ドは、ＬＩＲポリペプチドが天然の又は内因性起原の他のタンパク質が実質的に
存在せず、望ましくは製造過程の残渣であるタンパク質汚染の量が約１％以下を
含むように精製される。しかしながら、そのような組成物は、安定剤、担体、賦
形剤又は共治療物として添加される他のタンパク質を含むことができる。

【０１０８】 本明細書に開示されたＬＩＲをコードするＤＮＡ及びＤＮＡ断片は、上述のよ
うに、ＬＩＲポリペプチドの生産物における使用を見出す。１つの態様では、そ
のような断片は、少なくとも約１７個の連続的なヌクレオチド、より好ましくは
少なくとも３０個の連続的なヌクレオチドからなる。断片のＤＮＡ及びＲＮＡ相
補体も同様の有用性を有する。ＬＩＲ核酸断片の使用の中には、ポリメラーゼ連
鎖反応でのプローブ又はプライマーのようなものがある。例えば、ＬＩＲの細胞
外ドメインをコードするＤＮＡの断片に対応するプローブは、インビトロアッセ
イ、及びノーザンブロットやサザンブロットアッセイのような他のプロービング
アッセイにおいてＬＩＲ核酸の存在を検出するために使用してもよい。ＬＩＲポ
リペプチドを発現している細胞タイプは、当該技術分野において周知のプロービ
ング方法を用いるＬＩＲファミリー核酸プローブを用いて同定することができる
。当業者は、ＤＮＡ配列を単離し、増幅するために適した長さのプローブを選択
し、慣用されたＰＣＲ手法を適用する知識を有している。

【０１０９】 核酸断片はまた、他の哺乳動物種からＬＩＲ ＤＮＡを単離するために、交差
種ハイブリダイゼーション法におけるプローブとして使用されてもよい。一例と
して、ＬＩＲポリペプチドの細胞外ドメインに対応するプローブが使用されても
よい。プローブは慣用的な手法によって標識（例えば、³²Ｐを用いて）されても
よい。

【０１１０】 ＬＩＲ核酸の他の有用な断片は、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド
であって、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれからなっていてもよく、及びＬＩＲ ｍＲ
ＮＡ（センス）、相補的なＬＩＲ ｍＲＮＡ（アンチセンス）、又は二本鎖ＬＩ
Ｒ ＤＮＡの非コード鎖、例えばＰ３Ｇ２ ＤＮＡ（アンチセンス）に対する配
列に対応する。つまり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ配列とハ
イブリッド二本鎖を形成するであろう。そのようなオリゴヌクレオチドは、一般
的に少なくとも１４個のヌクレオチドであり、及び好ましくは約１４個ないし３
０個のヌクレオチドである。所定のタンパク質に対するｃＤＮＡ配列に基づいて
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを作成する能力は、例えば、Ｓｔｅ
ｉｎ及びＣｏｈｅｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８、及び
ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８，１９
８８に開示される。

【０１１１】 アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、二本
鎖の増強した分解、転写又は翻訳の未成熟な終止を含むいくつかの手段の１つ、
又はその他の手段によって、翻訳（ＲＮＡ）又は転写（ＤＮＡ）を遮蔽する二本
鎖の形成に帰着する。つまり、これらのオリゴヌクレオチドはＬＩＲ発現を遮蔽
するために使用されてもよい。

【０１１２】 １つの態様では、結合方法に使用されるアンチセンス又はセンスＬＩＲオリゴ
ヌクレオチドは、改変した糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖連結、例えば
ＷＯ９１／０６６２９に開示されたもの）を有するオリゴヌクレオチドを包含し
、ここでそのような糖連結は内因性のヌクレアーゼに耐性である。内因性のヌク
レアーゼに耐性な糖連結を有するオリゴヌクレオチドはインビボで安定（即ち、
酵素分解に耐性であり得る）であるが、しかし標的ヌクレオチド配列に結合可能
である配列特異性を保持する。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他
の例には、ＷＯ９０／１０４４８に開示されたような有機分子、及び標的核酸配
列に対するオリゴヌクレオチドのアフィニティーを増加する他の分子、例えばポ
リ−（Ｌ−リジン）に共有結合されるオリゴヌクレオチドが含まれる。さらにな
お、インタカレート試薬、例えばエリプチシン、及びアルカリ化試薬又は金属複
合体を、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、標的ヌクレオ
チド配列に対するセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を改
変してもよい。

【０１１３】 アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ₄を介した
ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子導入
法、又はエプスタイン−バーウイルスのような遺伝子トランスファーベクターを
用いることによって標的核酸配列を含む細胞内に導入することができる。アンチ
センス又はセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、アンチセンス又はセンス
オリゴヌクレオチドを適切なレトロウイルスベクター内に挿入し、次いでインビ
ボ又はエクスビボのいずれかにおいて、挿入された配列を含むレトロウイルスベ
クターで細胞を接触することによって、標的核酸配列を含む細胞内に導入される
。適切なレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２
（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）由来のベクター、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣ
Ｔ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃ（ＰＣＴ出願ＵＳ９０／０２６５６参照）を設計された二
重コピーベクターを含むが、これらに限定されるものではない。

【０１１４】 センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ９１／０４７５３に
開示されたように、リガンド結合分子との結合体形成によって、標的核酸配列を
含む細胞内に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、細胞表面受容体、成
長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面受容体に結合する他のリガンドを含む
が、これらに限定されるものではない。好ましくは、リガンド結合分子を結合す
ることは、リガンド結合分子がその対応する分子若しくは受容体に結合し、又は
アンチセンスオリゴヌクレオチドのセンス若しくはその結合したバージョンを細
胞内に移入することを阻止する能力を実質的に妨げない。

【０１１５】 あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４
４８に開示されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって標的
核酸配列を含む細胞内に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレ
オチド−脂質複合体は好ましくは内因性リパーゼによって細胞内で解離される。

【０１１６】 なおさらなる面では、本発明は、ＬＩＲポリペプチドを特異的に結合する抗体
、即ち、（非特異的結合と反対に）抗体の抗原結合部位を介したＬＩＲポリペプ
チドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、ＬＩＲポリペプチド又はその
免疫原の断片を用いて、製造してもよい。ポリクローナル及びモノクローナル抗
体は、慣用的手法によって調製されてもよい。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉ
ｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ
ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８０
；及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａ
ｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，ＮＹ，１９８８を参照。Ｐ３Ｇ２−ＬＩＲと免疫反応するモノクローナル
抗体を製造するための代表的な方法は、以下の実施例５にさらに説明される。

【０１１７】 ＬＩＲポリペプチドに特異的に結合する抗体の抗原結合断片は、本発明の範囲
内に含まれる。そのような断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、及びＦ（ａｂ’）₂
を含むが、これらに限定されるものではない。遺伝子工学手法によって調製され
た抗体の変異体及び誘導体は、本発明内にあると考えられる。

【０１１８】 本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、例えばマウスモノクローナル抗
体のヒト化バージョンを含む。そのような抗体は既知の手法によって調製されて
もよく、及び抗体がヒトに投与される場合に、低下した抗原性の利点を提供する
。１つの態様では、ヒト化したモノクローナル抗体は、マウスの抗体の可変領域
（又はちょうどその抗原結合部位）とヒト抗体由来の定常領域からなる。あるい
は、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位とヒト抗体由
来の可変領域部位（抗原結合部位が欠損している）からなる。キメラ、及びさら
に手を加えられたモノクローナル抗体の製造方法は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３２：２３２，１９８８； Ｌｉｅら、ＰＮＡＳ ８４：３４３
９，１９８７； Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３
４．１９８９；及びＷｉｎｔｅｒ及びＨａｒｒｉｓ、ＴＩＰＳ １４：１３９，
１９９３に開示された方法を含む。

【０１１９】 上述したように、本発明の抗体は、ＬＩＲポリペプチドの存在を検出するため
にインビトロ又はインビボアッセイ、及びアフィニティークロマトグラフィーに
よるＬＩＲポリペプチドを精製するのに有用である。

【０１２０】 加えて、ＬＩＲを標的細胞への結合から遮蔽できる抗体は、ＬＩＲポリペプチ
ドの生物学的活性を阻害するために使用されてもよい。より具体的には、ＩＴＩ
Ｍモチーフを有する１つ又はより多くのＬＩＲファミリーメンバーにアンタゴニ
ストである抗体の治療的な組成物は、細胞表面のＬＩＲとそのリガンドとの相互
作用を遮蔽するために個体に投与されてもよい。その結果は、免疫機能の活性化
であり、そして、免疫系が減応答的であるか又は抑制される疾患状態において特
に有益である。逆に、ＩＴＩＭモチーフを欠損している１つ又はそれより多くの
ＬＩＲファミリーメンバーに拮抗する抗体の治療的組成物は、反対の効果を得る
ために使用されてもよく、及び免疫系が過剰反応的及び過度の炎症であるが、又
は免疫病理学が存在する疾患状態に有益となる。

【０１２１】 ＬＩＲポリペプチドと免疫反応する少なくとも１つの抗体、及び適切な希釈剤
、賦形剤、又は担体を含む医薬組成物は、本発明であると考えられる。適切な希
釈剤、賦形剤、及び担体は、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物の文脈にお
いて記載される。

【０１２２】 以下の実施例は、本発明のある種の態様を説明するために提供され、及び発明
の範囲を限定するように解釈されるべきではない。

【０１２３】

【実施例】

実施例１ ウイルスタンパク質の単離及び発現 ＨＣＭＶで感染された細胞上で発現することが知られている、ウイルス糖タン
パク質、ＵＬ１８を単離して発現し、そして、ＵＬ１８／Ｆｃ融合タンパク質を
発現させ使用して、ＵＬ１８受容体を検索することによって、本発明のＰ３Ｇ２
ポリペプチドをコードするＤＮＡを同定した。ＵＬ１８をコードするＤＮＡ及び
ＵＬ１８のアミノ酸配列は公知であり、Ｂｅｃｋ，Ｓ．，Ｂ．Ｇ．Ｂａｒｒｅｌ
ｌ，Ｎａｔｕｒｅ３３１：２６９−２７２、１９８８に記載されている。以下は
、ＵＬ１８を単離すること、そしてＵＬ１８／Ｆｃ融合タンパク質を調製するこ
とについて記載する。

【０１２４】 標準的な技術を使用し、ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）で感染されたヒト***線維芽
細胞（Ｈｕｍａｎ Ｆｏｒｅｓｋｉｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）から、３つの異
なる転写段階、極初期（ＩＥ、８ｐ．ｉ．ｈ．）、初期（２４ｐ．ｉ．ｈ．）、
および後期（４８ｐ．ｉ．ｈ．）において、全ＲＮＡを単離した。ＵＬ１８は感
染の初期に転写されることが知られているので、ＩＥ全ＲＮＡをｐｏｌｙＡ＋選
択し、そして、ｃＤＮＡキットを製造業者の指示書(Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＴＩ
ＭＥ ＳＡＶＥＲ ｃＤＮＡキット）に従って使用して、ＨＣＭＶ−ＩＥｃＤＮ
Ａライブラリーを構築するのに使用した。ＵＬ１８遺伝子の全長を単離するため
に、ＵＬ１８配列の末端を含むことが知られている２種のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを合成し、ＨＣＭＶ−ＩＥｃＤＮＡライブラリーからＵＬ１８遺伝子を
単離して増幅するのに使用した。プライマーは以下の配列を有しており、そして
ＰＣＲ産物に取り込まれるＮｏｔＩ制限酵素部位を含んだ。

【０１２５】

【化１】

【０１２６】 ＰＣＲ条件は、９５℃で５分を１回、次いで、９５℃で４５秒、５８℃で４５
秒、そして７２℃で４５秒を３０サイクル、そして、次いで７２℃で５分を１サ
イクル、を含んだ。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、そして、エ
チジウムブロマイドを用いて分離されたＤＮＡ産物を可視化して、サイズを調べ
た。約１．１ｋｂの予測されたサイズを有するＤＮＡの存在が確認された。

【０１２７】 ｐＤＣ４０６（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８
２１、１９９１）に由来するが単一のＢｇｌＩＩ部位を有するベクターである、
ｐＤＣ４０９発現ベクターが、クローニング方法のために選択された。ＰＣＲ産
物を、ＮｏｔＩ部位を介してｐＤＣ４０９発現ベクターにサブクローニングし、
配列決定し、そして、ＤＮＡ配列からアミノ酸配列を推定した。決定されたヌク
レオチド配列及びアミノ酸配列は、以前に公開された配列（ｉｂｉｄ．）と同一
であった。

【０１２８】 先ず、ＵＬ１８の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを、ＵＬ１８の細胞外領域
に近接する（ｆｌａｎｋ）プライマーを用いて単離することによって、ＵＬ１８
の細胞外領域とムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域との融合タン
パク質（ＵＬ１８：Ｆｃ）を調製した。５’及び３’末端にＳａｌＩ及びＢｇｌ
ＩＩ制限酵素部位を挿入してプライマーを合成し、ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡに、５’
及び３’末端に各々ＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩ制限酵素部位を導入した。プライマ
ーは以下の配列を有した：

【０１２９】

【化２】

【０１３０】 ＰＣＲ反応の条件は先に記載されたものと同様であるが、鋳型は直前に記載さ
れたように単離された全長遺伝子であった。 細胞結合研究に使用するための、融合タンパク質ｓＵＬ１８：Ｆｃを発現する
ためのベクター構築物を調製するために、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域をコード
するＤＮＡ断片を、ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩ制限酵素を用いてプラスミドから単
離した。コードされたＦｃ部分は、米国特許第５，４５７，０３５に記載された
免疫グロブリン受容体に対する減少した親和性を有するムテインＦｃである。ｓ
ＵＬ１８遺伝子上のＢｇｌＩＩ部位を使用して、ｓＵＬ１８遺伝子ＤＮＡをＦｃ
遺伝子上のＢｇｌＩＩ部位に結合し、Ｎ末端ＳａｌＩ制限部位及びＣ末端Ｎｏｔ
Ｉ制限部位を有するｓＵＬ１８：Ｆｃ融合ＤＮＡ構築物を形成した。この融合ｓ
ＵＬ１８：Ｆｃ ＤＮＡ構築物を、次いで、ｐＤＣ４０９ベクターのＳａｌＩ部
位及びＮｏｔＩ部位に結合し、４０９／ｓＵＬ１８／Ｆｃ ＤＮＡ構築物を形成
した。

【０１３１】 サルの細胞系ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）を用いて融合タンパ
ク質の発現を確認した。６−ウェルプレート中のＣＯＳ−１細胞（２×１０⁵細
胞／ウェル）を、１ウェルあたり約２μｇのＤＮＡ構築物４０９／ｓＵＬ１８／
Ｆｃでトランスフェクトさせた。細胞を５％ＦＢＳ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢ
ＣＯより入手可能）中で２−３日間培養し、そして、ＰＢＳで２回洗浄し、シス
テイン／メチオニンを枯渇させたＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯよりＲＰＭＩ １６４０
として入手可能）中で１時間欠乏させ、そして、１００μＣｉ／ｍＬの³⁵Ｓ−Ｍ
ｅｔ／Ｃｙｓで４時間代謝的に標識した。上清を回転して綺麗にして（ｓｐｕｎ
ｃｌｅａｒ）遊離した細胞を取り除き、１５０μＬの上清を、１００μＬのＲＩ
ＰＡ（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＳＤＳ、１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸塩）緩衝液及び５０μＬの５０％プ
ロテインＡ−セファロース固体支持体ビーズと４℃で１時間インキュベートした
。プロテインＡ−セファロースは、融合タンパク質のＦｃ部分に結合する、固定
化されたプロテインＡを有するセファロース固体支持体（ファーマシアより入手
可能）である。固体支持体をＲＩＰＡで洗浄して非結合物質を除いた後、プロテ
インＡ−セファロース固体支持体に結合した融合タンパク質を、３５μｌのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ還元試料緩衝液を用いてプロテインＡ−セファロースから溶出し、
そして、次いで１００℃で５分間加熱した。次いで、溶出液を４−２０％ＳＤＳ
ポリアクリルアミド勾配ゲル上で、¹⁴Ｃ標識タンパク質分子量マーカーとともに
電気泳動した。電気泳動の後、ゲルを８％の酢酸で固定化し、そして、Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社から入手可能な増幅剤（Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）で、室温で２０分間増
強させた。真空下でゲルを乾燥した後、それをＸ線フィルムに暴露した。フィル
ム分析の結果、予測されるタンパク質、即ち、ＩｇＧのムテインＦｃ領域及びＦ
ｃに融合したＵＬ１８細胞外ドメインを含む、１００−１２０ｋＤａタンパク質
が発現されていることが確認された。

【０１３２】 ひとたび、融合タンパク質を発現している細胞が同定されると、トランスフェ
クトされた細胞の大量培養が行われ、融合タンパク質を発現している細胞からの
上清が蓄積された。この手法は、Ｔ１７５フラスコ中のＣＯＳ−１細胞を、１フ
ラスコ当たり１５μｇのＵＬ１８／Ｆｃ／４０９融合ＤＮＡでトランスフェクト
することを含んだ。０．５％低免疫グロブリンウシ血清を含む培地中での７日間
の培養後、上清に０．２％アジドの溶液を加え、そして上清を０．２２μｍフィ
ルタを通して濾過した。次いで、約１Ｌの培養上清を、４．６×１００ｍｍプロ
テインＡカラムを用いたＢｉｏＣａｄプロテインＡ ＨＰＬＣタンパク質精製シ
ステム（ＰｅｒＳｐｅｃｔｉｖｅ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＲＯＰＯＳ ２０Ａ
）を、１０ｍＬ／分の速度で通した。プロテインＡカラムは上清中のｓＵＬ１８
／Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分に結合し、融合タンパク質を固定化し、そして
、上清中の他の成分はカラムから通り抜けることを可能にする。カラムを３０ｍ
ＬのＰＢＳ溶液で洗浄し、そして、結合したｓＵＬ１８／Ｆｃを、ｐＨ３．０に
調整したクエン酸でＨＰＬＣカラムから溶出した。溶出した精製ｓＵＬ１８／Ｆ
ｃを溶出の際にｐＨ７．４で１Ｍ Ｈｅｐｅｓ溶液を用いて中性化した。プール
された溶出タンパク質を銀染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、１００
−１２０ｋＤａ ＵＬ１８／Ｆｃ融合タンパク質の発現を確認した。

【０１３３】 実施例２ ＵＬ１８への結合に関する細胞系のスクリーニング 実施例１に記載されたように単離されたｓＵＬ１８／Ｆｃタンパク質を用いて
、標準的なフローサイトメトリー方法論に従った量的結合研究を用いて、それが
結合する細胞系をスクリーニングした。スクリーニングされる各細胞系について
、手法は、ＰＢＳ中の２％ＦＣＳ（胎仔ウシ血清）、５％通常ヤギ血清および５
％ウサギ血清でブロックされた約１００，０００の細胞を１時間インキュベート
することを含んだ。次いで、ブロックされた細胞を、ＰＢＳ中の２％ＦＣＳ、５
％ヤギ血清及び５％ウサギ血清中の５μｇ／ｍＬのｓＵＬ１８／Ｆｃ融合タンパ
ク質と共にインキュベーションした。インキュベーションに続いて、試料をＦＡ
ＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％ＦＣＳ）で２回洗浄し、そして、マウス抗ヒトＦｃ
／ビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈより購入）及びＳＡＰＥ（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓより購入されたストレプトアビジン−フィコエリ
トリン）で処理した。本処理により、抗ヒトＦｃ／ビオチンは結合している任意
の（ａｎｙ）ｓＵＬ１８／Ｆｃに結合し、そしてＳＡＰＥは抗ヒトＦｃ／ビオチ
ンに結合し、これにより、細胞に結合しているｓＵＬ１８／Ｆｃ上の標識を蛍光
同定する結果となる。細胞は、蛍光検出フローサイトメトリーを用いて、任意の
結合しているタンパク質について分析される。結果はＵＬ１８は、Ｂ細胞系のＣ
Ｂ２３、ＲＡＪＩ及びＭＰ−１；単球細胞系のＴｈｐ−１及びＵ９３７；並びに
始原Ｂ細胞及び始原単球によく結合することを示した。ＵＬ１８は、Ｔ細胞系に
は検出可能なほど結合せず、また、始原Ｔ細胞にも結合しない。

【０１３４】 実施例３ Ｐ３Ｇ２ ｃＤＮＡ及びポリペプチドの単離 以下は、ＵＬ１８に結合することが見出された細胞系の一つのｃＤＮＡのスク
リーニング、及び細胞系によって発現される新規ポリペプチドの単離を記載する
。哺乳動物細胞系ベクターｐＤＣ４０６中のＣＢ２３ ｃＤＮＡライブラリーを
米国特許第５，３５０，６８３号（本明細書中に援用される）に記載されている
ように調製して得て、そして、１プールあたり約２，０００クローンからなる（
複数の）プールからプラスミドＤＮＡを単離した。単離されたＤＮＡを、ＤＥＡ
Ｅ−デキストランを用いてＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４７８
）にトランスフェクトし、次いでクロロキニーネ処理を行った。ＣＶ１−ＥＢＮ
Ａ細胞を完全培地（１０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、
５０Ｕ／ｍＬストレプトマイシン及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むダルベッコ
修飾されたイーグル培地）中で維持し、そして、単一ウェルチェンバースライド
（複数）（ｓｉｎｇｌｅ−ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒｅｄ ｓｌｉｄｅｓ）に１
ウェル当たり約２×１０⁵細胞の密度でプレートした。スライドは、１ｍＬのＰ
ＢＳ中の１０μｇ／ｍＬヒトフィブロネクチンの溶液で３０分間前処理しており
、ＰＢＳ１回洗浄してある。層中で増殖している付着した細胞から培地を除去し
、６６．６μＭのクロロキニーネ硫酸塩を含む１．５ｍＬの完全培地と交換した
。約０．２ｍＬのＤＮＡ溶液（クロロキニーネを含む完全培地中の２μｇ ＤＮ
Ａ、０．５ｍｇ／ｍＬ ＤＥＡＥ−デキストラン）を細胞に加え、そして混合物
を３７℃で約５時間インキュベートした。インキュベーションの後培地を除去し
、１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）を含む完全培地の添加によって２
．５分間、細胞にショックを与えた。ショックの後に、溶液を新鮮な完全培地と
交換した。細胞を培養中で２−３日間増殖させ、挿入されたＤＮＡ配列の一過的
な発現を可能にした。この条件は、生存しているＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞中の３０
％ないし８０％のトランスフェクト効率を導いた。

【０１３５】 各スライドを、結合緩衝液（２５ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、２ｍｇ／
ｍＬ アジ化ナトリウム、ｐＨ７．２の２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ及び５０ｍｇ／ｍ
Ｌ 脱脂粉乳を含むＲＰＭＩ１６４０）中の１μｇ／ｍＬの濃度の１ｍＬのＵＬ
１８：Ｆｃと、室温で１時間インキュベーションした。インキュベーションされ
たスライドを結合緩衝液で洗浄し、次いで、Ｆｃ特異的¹²⁵Ｉ−マウス抗−ヒト
ＩｇＧ（Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ｃｅｌｌ ７３：４４７−４５６、１９９３参照）
とインキュベーションした。続いて、緩衝液で２回目の洗浄を行い、その後、２
．５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ溶液を用いてスライドを固定し、ＰＢＳ溶液
で洗浄し、そして、空気乾燥させた。乾燥したスライドをＫｏｄａｋ ＧＴＮＢ
−２ 写真乳剤（水中の６×希釈液）中に浸した。空気乾燥させた後、スライド
を暗箱中に置き、そして冷蔵した。３日後、スライドをＫｏｄａｋ Ｄ１９現像
液中で現像し、水中でリンスし、そしてＡｇｆａ Ｇ４３３Ｃ固定液で固定化し
た。固定化されたスライドを、顕微鏡下で２５−４０×倍率で個別に調べた。ｓ
ＵＬ１８：Ｆｃの結合を示す陽性細胞は、フィルムの背景に対するオートラジオ
グラフ銀粒子の存在によって可視化された。２つの陽性プールが同定された。各
プールからの細菌クローンの力価を測定し、各プレートに約２００コロニーを含
むプレートを提供するようにプレートされた。各プレートを解体し、ＣＶ１−Ｅ
ＢＮＡ細胞にトランスフェクトして、上述したようにスクリーニングするための
プールされたプラスミドＤＮＡを提供した。続く分類分析（ｂｒｅａｋｄｏｎｗ
ｓ）及びスクリーニングの後に、２種の陽性の別個のコロニーが得られた。２つ
の陽性コロニーのｃＤＮＡ挿入物は、自動ＤＮＡ配列決定によって決定されたよ
うに、長さが２９２２および２７７７ヌクレオチドであった。Ｐ３Ｇ２及び１８
Ａ３と名付けられた２つの挿入物のコード領域は、各々１９５３（ヌクレオチド
３１０−２２６２）及び１９５９（ヌクレオチド１６８−２１２６）ヌクレオチ
ドであった。二つのｃＤＮＡクローンは、実質的に類似しており、おそらく同じ
遺伝子の異なる対立遺伝子（アリル）を表すタンパク質をコードする。

【０１３６】 Ｐ３Ｇ２のｃＤＮＡ配列及びコードされるアミノ酸配列は、各々配列番号１及
び配列番号２に表されている。１８Ａ３のｃＤＮＡ配列及びコードされるアミノ
酸配列は、各々配列番号３及び配列番号４に表されている。Ｐ３Ｇ２アミノ酸配
列（配列番号２）は、予測される、１６アミノ酸のシグナルペプチド（アミノ酸
１−１６）；４４２アミノ酸の細胞外ドメイン（アミノ酸１７−４５８）；２５
アミノ酸の膜貫通ドメイン（アミノ酸４５９−４８３）及び１６７アミノ酸の細
胞質ドメイン（アミノ酸４８４−６５０）を有する。細胞外ドメインは４つの免
疫グロブリン様ドメインを含む。Ｉｇ様ドメインＩはおよそアミノ酸１７−１１
８を含み；Ｉｇ様ドメインＩＩはおよそアミノ酸１１９−２２０を含み；Ｉｇ様
ドメインＩＩＩはおよそアミノ酸２２１−３１８を含み；そして、Ｉｇ様ドメイ
ンＩＶはおよそアミノ酸３１９−４１９を含む。重要なことに、このポリペプチ
ドの細胞質ドメインは４つのＩＴＩＭモチーフを含み、各モチーフはＹｘｘＬ／
Ｖの共通配列を有する。第一のＩＴＩＭモチーフ対は、アミノ酸５３３−５３６
及び５６２−５６５に見出され、そして、第二の対はアミノ酸６１４−６１７及
び６４４−６４７に見出される。１８Ａ３のアミノ酸配列は、上述した特徴を有
するほぼ同一のものである。

【０１３７】 これらのコードされたポリペプチドの特徴は、Ｉ型の膜貫通糖タンパク質と一
致する。 実施例４ Ｐ３Ｇ２融合タンパク質の調製 以下は、Ｐ３Ｇ２融合タンパク質を作成するために使用される手法を記載し、
融合タンパク質は次いで、それが結合する細胞系を同定し、そして最終的にＵＬ
１８とは区別される通常の細胞表面Ｐ３Ｇ２リガンドを単離するために使用され
る。Ｐ３Ｇ２の細胞外領域の融合タンパク質及びムテイン ヒトＦｃ領域（ｓＰ
３Ｇ２：Ｆｃ）は、最初に、Ｐ３Ｇ２の細胞外領域に側するプライマーを用いて
Ｐ３Ｇ２の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを単離することによって調製された
。プライマーは、ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡの５’及び３’末端のそれぞれにＳ
ａｌＩ及びＢｇｌＩＩ制限部位が導入されるように、５’及び３’末端にＳａｌ
Ｉ及びＢｇｌＩＩ制限部位を挿入して合成した。プライマーは以下の配列を有す
る：

【０１３８】

【化３】

【０１３９】 ＰＣＲ反応ための条件は、上述したようなものであり、そして鋳型は実施例３に
おいて上述したように単離されたＰ３Ｇ２遺伝子の全長遺伝子であった。 細胞結合研究で使用するための融合タンパク質ｓＰ３Ｇ２：Ｆｃを発現するた
めのベクター構築物を調製するために、ＩｇＧ１のムテイン ヒトＦｃ領域を実
施例１に記載のプラスミドからＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩ制限酵素を用いて切り出
した。ｓＰ３Ｇ２遺伝子上のＢｇｌＩＩ部位を用いて、ｓＰ３Ｇ２遺伝子ＤＮＡ
をヒト ムテインＦｃ遺伝子上のＢｇｌＩＩに結合して、Ｎ−末端ＳａｌＩ制限
部位及び末端ＮｏｔＩ制限部位を有するｓＰ３Ｇ２／Ｆｃ融合ＤＮＡ構築物を形
成した。この融合ｓＰ３Ｇ２：Ｆｃ ＤＮＡ構築物を、次いでｐＤＣ４０９発現
ベクターのＳａｌＩ及びＮｏｔＩ部位に結合させて、４０９／ｓＰ３Ｇ２／Ｆｃ
ＤＮＡ構築物を形成した。

【０１４０】 サル細胞系ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＴＬ−１６５０）を用いて融合タンパク
質の発現を確認した。６−ウェルプレート中のＣＯＳ−１（ウェル当たり２×１
０⁵細胞）を、１ウェル当たり約２μｇのＤＮＡ構築物４０９／ｓＰ３Ｇ２／Ｆ
ｃでトランスフェクトした。細胞を５％のＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣ
Ｏより入手可能）中で培養し、トランスフェクションの２又は３日後、システイ
ン／メチオニンを枯渇させたＲＰＭＩ中で１時間欠乏させ、そして、１００μＣ
ｉ／ｍＬの³⁵Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃｙｓで４時間代謝的に標識した。上清を回転して綺
麗にして遊離した細胞及び残渣を取り除き、１５０μＬの上清を、１００μＬの
ＲＩＰＡ緩衝液及び５０μＬの５０％プロテインＡ−セファロース固体支持体ビ
ーズと４℃で１時間インキュベートした。固体支持体をＲＩＰＡで洗浄して非結
合物質を除いた後、プロテインＡ−セファロース固体支持体に結合した融合タン
パク質を、３０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元試料緩衝液を用いてプロテインＡ−
セファロースから溶出し、そして、次いで１００℃で５分間加熱した。次いで、
溶出液を４−２０％ＳＤＳポリアクリルアミド勾配ゲル上で、¹⁴Ｃ標識タンパク
質分子量マーカーとともに電気泳動した。電気泳動の後、ゲルを８％の酢酸で固
定化し、そして、Ａｍｅｒｓｈａｍ社から入手可能な増幅剤（Ａｍｐｌｉｆｉｅ
ｒ）で、室温で２０分間増強させた。真空下でゲルを乾燥した後、それをＸ線フ
ィルムに暴露した。フィルム分析の結果、１２０−１３０ｋＤａの分子量を有す
る予測されるタンパク質が発現されていることが確認された。

【０１４１】 融合タンパク質の発現がいったん確認されると、トランスフェクトされた細胞
の大量培養を増殖させ、実施例１に上述したように融合タンパク質を発現するＣ
ＯＳ−１細胞由来の上清を集積させた。Ｐ３Ｇ２／Ｆｃ融合タンパク質を実施例
３に上述した手法に従って、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから
のＢｉｏＣａｄシステム及びＰＯＲＯＳ ２０Ａカラムを用いて精製した。プー
ルされた抽出タンパク質を銀染色を伴うＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて分析し、発現
を確認した。

【０１４２】 実施例５ ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２抗体の作成 以下の実施例はＰ３Ｇ２に対するモノクローナル抗体の作成を記載する。これ
は、Ｐ３Ｇ２が発現される細胞を同定するフローサイトメトリー分析において使
用される。精製Ｐ３Ｇ２／Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＯＳ−１細胞発現及びアフ
ィニティー精製を用いて実施例４に記載されたように調製された。精製タンパク
質、又は全長タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた細
胞は、慣用された技術、例えば米国と挙４，４１１，９９３に記載された技術を
用いて、Ｐ３Ｇ２に対するモノクローナル抗体を作成することができる。簡単に
は、ＢＡＬＢ−Ｃマウスを０、２及び６週間時に１０μｇのＰ３Ｇ２／Ｆｃで免
疫化した。一次免疫は、Ｖａｘｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．からのＴＩＴＥＲＭＡＸアジ
ュバントとともに調製し、そして、後の免疫は不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント
（ＩＦＡ）とともに調製した。１１週目に、ＰＢＳ中の３−４μｇのＰ３Ｇ２で
マウスをＩＶ追加免疫した。ＩＶ追加免疫から３日後、脾細胞を回収し、そして
Ａｇ８．６５３ミエローマ融合パートナーと、５０％水性ＰＥＧ１５００溶液を
用いて融合させた。ハイブリドーマ上清を、１ウェル当たり２×１０³細胞のＰ
ＢＳ中のＰ３Ｇ２トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を用いたＥＬＩＳＡに
よってスクリーニングし、そして、ポリスチレン製９６ウェルのマイクロタイタ
ープレートにプレートコート抗原として乾燥させた。陽性上清を、続いて、ＦＡ
ＣＳ分析及びＰ３Ｇ２トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を用いたＲＩＰに
よって確認した。ハイブリドーマをクローニングし、そして、同様の分析を用い
て続いた。モノクローナル培養を拡大し、そして、ＢｉｏＲａｄ プロテインＡ
アガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって上清を精製した
。

【０１４３】 Ｐ３Ｇ２／Ｆｃに対するモノクローナル抗体を用いて、標準フローサイトメト
リー手法によって細胞及び細胞系をスクリーニングし、その上にＰ３Ｇ２が発現
している細胞を同定した。フローサイトメトリー分析においてスクリーニングさ
れた細胞系及び細胞は、ＣＢ２３、ＣＢ３９、ＲＡＪＩ、ＡＫ７７８、Ｋ２２９
、ＰＳ−１、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＪＵＲＫＡＴ及びＨＳＢ２であった。スク
リーニングされる各細胞系について、手法は、ＰＢＳ中の２％ＦＣＳ（胎仔ウシ
血清）、５％通常ヤギ血清および５％ウサギ血清でブロックされた約１００，０
００の細胞を、５μｇのＦＩＴＣ結合マウス抗−Ｐ３Ｇ２抗体と１時間インキュ
ベートすることを含んだ。インキュベーションに続いて、試料をＦＡＣＳ緩衝液
（ＰＢＳ中の２％ＦＣＳ）で２回洗浄した。細胞を、ＦＩＴＣを認識するための
蛍光検出フローサイトメトリーを用いて、任意の結合しているタンパク質につい
て分析した。結果はＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２抗体は、Ｂ細胞系のＣＢ２３及びＲＡＪＩ
；単球細胞系のＴＨＰ−１及びＵ９３７；並びに始原Ｂ細胞及び始原単球によく
結合することを示した。ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２の最も高い発現は、ＣＤ１６に関して
明るく染色され、そして、ＣＤ１４及びＣＤ６４に関しより低い程度に明るく染
色される、単球上で示された。抗体は、Ｔ細胞系には検出可能なほど結合せず、
また、始原Ｔ細胞にも結合しない。

【０１４４】 関連する実験において、上述したように作成されたＰ３Ｇ２抗体は、免疫沈降
実験において使用された。免疫沈降分析は、２．５×１０⁶単球をＰＢＳで細胞
を洗浄し、そして、１０ｍＭのホウ酸ナトリウム及びｐＨ８．８の１５０ｍＭ
ＮａＣｌのビオチニル化緩衝液（ｐＨ８．８）中に細胞を懸濁し、続いてＤＭＳ
Ｏ中のビオチン−ＣＮＨＳ−エステル（Ａｍｅｒｃｈａｍより購入されたＤ−ビ
オチニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の
１０ｍｇ／ｍＬ溶液の５μＬを細胞に加えることによって、先ず表面ビオチニル
化することを含んだ。細胞１ｍＬ当たり１Ｍ 塩化アンモニウムの１０μＬで反
応を終了し、そしてＰＢＳ中で細胞を洗浄した後、当該細胞を１ｍＬの０．５％
ＮＰ４０−ＰＢＳ中に溶解し、そして、溶解物を続く遠心によって回収した。
１５０μＬの溶解物に１００μＬの０．５％ ＮＰ４０−ＰＢＳを加え、得られ
た混合物を２μｇ／ｍＬの抗体とともに４℃で１６時間インキュベーションした
。５０マイクロリットルの５０％ プロテインＡ−セファローススラリーを抗体
混合物に加え、そしてスラリーを４℃で１時間振盪した、スラリーを遠心し、そ
して得られたペレットを０．７５ｍＬのＰＢＳ中の０．５％ ＮＰ４０で６回洗
浄した。プロテインＡ−セファロースに結合したタンパク質を３０μＬのＳＤＳ
−ＰＡＧＥ還元試料緩衝液で溶出し、１００℃で５分間加熱した。

【０１４５】 溶出されたタンパク質を、増強化学発光（ＥＣＬ）タンパク質マーカーを伴っ
た４−２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。次いで、電気泳動試料
をウェスタンブロットにおいてニトロセルロース膜上に転写した。膜をブロック
剤（ＰＢＳ中の０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０及び３％脱脂粉乳）で１時間、室温
で処理し、次いで、ＰＢＳ中の０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で１５分間、１回洗
浄し、続いて５分間、２回洗浄した。洗浄した膜を１０ｍＬの１：１００ ＨＲ
Ｐ−ストレプトアビジンと３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中の０．
１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で１５分間、１回洗浄し、続いて５分間、４回洗浄した
。

【０１４６】 Ａｍｅｒｓｈａｍより購入したＥＣＬ検出用試薬を製造者の指示書に従って使
用して、結合したストレプトアビジンＨＲＰを検出した。展開された膜をＸ線フ
ィルムに暴露し、そして可視化した。結果は、ＣＢ２３細胞及びＰ３Ｇ２トラン
スフェクトＣＯＳ−１細胞からＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２が免疫沈降されたことを示し、
これは、これらの細胞によってＰ３Ｇ２が発現されていることを示唆した。

【０１４７】 実施例６ Ｐ３Ｇ２結合に関する細胞及び細胞系のスクリーニング 以下は、Ｐ３Ｇ２に結合する細胞及び細胞系を同定するために使用されるフロ
ーサイトメトリーを記載する。試験された細胞及び細胞系は、ＣＢ２３，ＨＳＢ
２、ＭＰ−１、ジャーカット、始原Ｔ細胞、始原Ｂ細胞及び始原ＮＫ細胞であっ
た。試験された各細胞及び細胞系について、手法は、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（０
．２％のアジドを伴うＰＢＳ中の２％ＦＣＳ）で３回洗浄し、各試料（１０⁵細
胞）を１００μＬのブロック用緩衝液（ＰＢＳ中の２％ ＦＣＳ、５％ ＮＧＳ
および５％ ウサギ血清）中で１時間インキュベートすることを含んだ。各細胞
系について、１００μＬブロック用緩衝液中のそれぞれ０、２、５又は１０μｇ
のＷ６／３２（ＡＴＣＣ ＨＢ−９５）を各々の試料に加えた、４種類の試験試
料を準備した。Ｗ６／３２は、ＭＨＣクラスＩ重鎖（抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ分
子）に対する抗体である。Ｗ６／３２溶液の添加の後、試料を氷上で１時間イン
キュベートし、そして、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。次いで、
ブロック用緩衝液中の５μｇのＰ３Ｇ２／Ｆｃを各試料に加え、それらを氷上で
１時間インキュベーションした。Ｐ３Ｇ２／Ｆｃは、Ｗ６／３２と細胞上の結合
部位について競合する。

【０１４８】 インキュベーション後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、そ
して、マウス抗ヒトＦｃ／ビオチン及びＳＡＰＥで４５分間処理した。この処理
により、抗ヒトＦｃ／ビオチンが細胞に結合した任意のｓＰ３Ｇ２／Ｆｃに結合
し、そしてＳＡＰＥは抗ヒトＦｃ／ビオチンに結合する。ＳＡＰＥは蛍光化合物
であるので、適当な励起及び放射条件を用いたその検出は、細胞に結合したＰ３
Ｇ２／Ｆｃを陽性に同定する。最後に、処理された細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回
洗浄し、そして、タンパク質に結合した細胞を同定するためにフローサイトメト
リーにかけた。

【０１４９】 結果は、試験された全ての細胞及び細胞系への結合に関して、Ｗ６／３２はＰ
３Ｇ２と競合したことを示した。Ｐ３Ｇ２結合は５μｇ Ｗ６／３２で完全にブ
ロックされたが、これはＷ６／３２とＰ３Ｇ２は、ＭＨＣクラスＩ重鎖上の同一
の又は重複する部位に結合することを示している。

【０１５０】 実施例７ Ｐ３Ｇ２結合リガンドを単離するためのＨＳＢ２ ｃＤＮＡライブ ラリーのスクリーニング 以下は、Ｐ３Ｇ２に結合することが見出された細胞系の一つ、ＨＳＢ−２（Ｔ
リンパ芽球白血病細胞系の一つ）由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、そしてＰ３Ｇ２結合リガンドを同定することを記載する。哺乳動物発現ベク
ターｐＤＣ３０２中のＨＳＢ２ ｃＤＮＡライブラリーを、米国特許第５，５１
６，６５８号に一般的に、そしてＫｏｚｌｏｓｋｙら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０
．ｐ．２９９−３０６、１９９５）に具体的に記載されているように調製した。
簡単には、貯蔵されたＨＳＢ−２細胞からｍＲＮＡを単離し、そして５μｇのｐ
ｏｌｙＡ⁺及びＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅからの逆転写酵素ＡＭＶ ＲＴａｓｅ
を用いて、第一のｃＤＮＡ鎖を合成した。第二のｃＤＮＡ鎖は、ＢＲＬからのＤ
ＮＡポリメラーゼＩを１．５Ｕ／μＬの濃度で使用して合成した。Ｈａｙｍｅｒ
ｌｅら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：８６１５、１９８６）中に記載
されているような標準的な技術を用いて、ｃＤＮＡをｐＤＣ３０２の適当な部位
に結合させた。

【０１５１】 大腸菌株ＤＨ５α細胞をｐＤＣ３０２中のｃＤＮＡライブラリーで形質転換し
た。ライブラリーの増幅後、力価チェックは、全部で１５７，２００クローン存
在することを示した。形質転換された細胞を１５の異なるプレートにプレートし
た。１プール当たり約２，０００クローンからなる（複数の）プールからプラス
ミドＤＮＡを単離した。単離されたＤＮＡをＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １０４７８）にＤＥＡＥ−デキストランを用いてトランスフェクトし、
続いてクロロキニーネ処理を行った。ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞を完全培地（１０％
（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０Ｕ／ｍＬストレプトマ
イシン及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含むダルベッコ修飾されたイーグル培地）
中で維持し、そして、単一ウェルチェンバースライド（複数）（ｓｉｎｇｌｅ−
ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒｅｄ ｓｌｉｄｅｓ）に１ウェル当たり約２×１０⁵
細胞の密度でプレートした。スライドは、１ｍＬのＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬヒ
ト フィブロネクチンの溶液で３０分間前処理しており、ＰＢＳ１回洗浄してあ
る。層中で増殖している付着した細胞から培地を除去し、６６．６μＭのクロロ
キニーネ硫酸塩を含む１．５ｍＬの完全培地と交換した。約０．２ｍＬのＤＮＡ
溶液（クロロキニーネを含む完全培地中の２μｇ ＤＮＡ、０．５ｍｇ／ｍＬ
ＤＥＡＥ−デキストラン）を細胞に加え、そして混合物を３７℃で約５時間イン
キュベートした。インキュベーションの後培地を除去し、１０％ＤＭＳＯを含む
完全培地の添加によって２．５分間、細胞にショックを与えた。ショックの後に
、溶液を新鮮な完全培地と交換し、そして、細胞を培養中で３日間増殖させ、挿
入されたＤＮＡ配列の一過性の発現を可能にした。この条件は、生存しているＣ
Ｖ１−ＥＢＮＡ細胞中の３０％ないし８０％のトランスフェクト効率を導いた。

【０１５２】 各スライドを、結合緩衝液（２５ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、２ｍｇ／
ｍＬ アジ化ナトリウム、ｐＨ７．２の２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ及び５０ｍｇ／ｍ
Ｌ 脱脂粉乳を含むＲＰＭＩ１６４０）中の、０．４５μｇ／ｍＬの濃度の１ｍ
ＬのＰ３Ｇ２：Ｆｃと、室温で１時間インキュベーションした。スライドをイン
キュベーションした後、それを結合緩衝液で洗浄し、次いで、Ｆｃ特異的¹²⁵Ｉ
−マウス抗−ヒトＩｇＧ（Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ｃｅｌｌ ７３：ｐ．４４７−４
５６、１９９３参照）とインキュベーションした。続いて、緩衝液で２回目の洗
浄を行い、その後、２．５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ溶液を用いてスライド
を固定し、ＰＢＳ溶液で洗浄し、そして、空気乾燥させた。乾燥したスライドを
Ｋｏｄａｋ ＧＴＮＢ−２ 写真乳剤（水中の６×希釈液）中に浸した。空気乾
燥させた後、スライドを暗箱中に置き、そして冷蔵した。３日後、スライドをＫ
ｏｄａｋ Ｄ１９現像液中で現像し、水中でリンスし、そしてＡｇｆａ Ｇ４３
３Ｃ固定液で固定化した。固定化されたスライドを、顕微鏡下で２５−４０×倍
率で個別に調べた。ｓＰ３Ｇ２：Ｆｃの結合を示す陽性プールは、フィルムの背
景に対するオートラジオグラフ銀粒子の存在によって可視化された。２つの陽性
プールの力価を測定し、各プレートに約２００コロニーを含むプレートを提供す
るようにプレートされた。各プレートを解体し、ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞にトラン
スフェクトして、上述したようにスクリーニングするためのプールされたプラス
ミドＤＮＡを提供した。続く分類分析（ｂｒｅａｋｄｏｎｗｓ）及びスクリーニ
ングの後に、各プールについて１種の陽性の別個のコロニーが得られた。陽性ク
ローンのｃＤＮＡ挿入物は、クラスＩ ＭＨＣ抗原であるＨＬＡ−Ｂ４４及びＨ
ＬＡ−Ａ２として同定された。

【０１５３】 実施例８ ノザンブロット分析 実施例４に記載の実験の結果、いくつかの細胞系上でＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２表面発
現が検出されたので、慣用されたノザンブロット分析手法を用いて、異なる組織
型でのＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２および任意のＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２関連ｍＲＮＡの発現を研
究した。ノザンブロット分析のために選択された細胞系は、ＲＡＪＩ、ＰＢＴ、
ＰＢＭ、ＹＴ、ＨＥＰ３Ｂ、ＨＥＬＡ、ＫＢ、ＫＧ−１、ＩＭＴＬＨ、ＨＰＴ、
ＨＦＦ、ＴＨＰ−１及びＵ９３７である。以下は、ノザンブロット分析及び分析
結果を記載する。

【０１５４】 Ｐ３Ｇ２の細胞外領域に近接し、以下の配列を有するプライマーを用いて、Ｐ
３Ｇ２の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを単離した：

【０１５５】

【化４】

【０１５６】 ＰＣＲ鋳型は、実施例３において上述したように単離された全長Ｐ３Ｇ２遺伝
子であった。ＰＣＲ反応のための条件は以下のようであった：９５℃で５分間を
１サイクル；９５℃で４５秒、６４℃で４５秒、そして７２℃で４５秒を含む３
０サイクル；並びに、７２℃で５分間を１サイクル。ＰＣＲ産物を、Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎより購入されたＰＣＲ ＩＩベクターに製造者指示書に従ってクロー
ン化した。Ｐ３Ｇ２の細胞外領域をコードする単離されたＤＮＡを用いて、製造
者指示書に従ったＡｍｂｉｏｎ ＭＡＸＩＳＣＲＩＰＴキットで、リボプローブ
を作成した。

【０１５７】 種々のヒト細胞系からのポリＡ＋選択ＲＮＡ又は全ＲＮＡを含むノザンブロッ
トを、ＲＮＡ試料を１．１％アガロースホルムアミド上で分解し、製造者（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって推奨されるようにＨｙｂｏｎ
ｄ−Ｎ上にブロッティングし、そしてメチレンブルーで染色してＲＮＡ濃度をモ
ニターすることによって、調製した。１μｇのポリＡ＋ＲＮＡ又は１０μｇの全
ＲＮＡを用いてブロットを調製し、そして、直前に記載されたように調製された
、１０⁶ｃｐｍ／ｍＬのＲＮＡ細胞外Ｐ３Ｇ２リボプローブで、６３℃、１６時
間各ブロットを探査した。探査されたブロットを、２×ＳＳＣ、６３℃で３０分
間、２回；１×ＳＳＣ、６３℃で３０分間、２回；そして、０．１×ＳＳＣ、６
３℃で５分間、２回洗浄した。

【０１５８】 探査されたブロットを、オートラジオグラフ的に現像した。現像されたブロッ
トは、Ｐ３Ｇ２ ＲＮＡは、ＲＡＪＩ、ＣＢ２３及びＵ９３７によって発現され
る３．５ｋｂのＲＮＡ；ＴＨＰ−２によって発現される約１．５ｋｂのＲＮＡ；
並びに、ＰＢＭによって発現される１．５ｋｂから３．５ｋｂの範囲にわたる多
数のＲＮＡにハイブリダイズしたことを示した。これらの結果は、Ｐ３Ｇ２に構
造が類似する細胞外ドメインを有する異なる複数の遺伝子が、末梢血単球によっ
て発現されるかもしれないことを示唆した。

【０１５９】 実施例９ ＬＩＲポリペプチドを単離するためのＰＢＭ ｃＤＮＡライブラリ ーの探査 以下は、慣用されたサザンブロット方法論を使用してＰ３Ｇ２ポリペプチドに
関連するポリペプチドを単離するために、末梢血単球ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングするのに採用された工程を記載する。末梢血ｃＤＮＡライブラリー
は、実施例７に記載されたのと実質的に同一の手法を用いて調製された。

【０１６０】 １プール当たり１０，０００クローンを有するｃＤＮＡの始めの１５プールか
らのＤＮＡをＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲル上を１０
０Ｖで２時間、電気泳動した。サザンブロットは、０．５５％ ＴＢＥ緩衝液中
の電気泳動されたＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ膜上に電気ブロットすることによって調
製した。ブロットされたＤＮＡを０．６Ｍ ＮａＣｌ溶液中の０．５Ｍ ＮａＯ
Ｈ中で５分間変性し、次いで、１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８中の０．５Ｍ
Ｔｒｉｓで５分間中和した。膜を、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤中に
２０秒間置き、ブロットされたＤＮＡを膜上に架橋した。膜及び架橋されたＤＮ
Ａを、１０×Ｄｅｎｈａｒｄ溶液、ｐＨ７．５の０．０５Ｍ ＴＲＩＳ、０．９
Ｍ ＮａＣｌ、０．１％のピロリン酸ナトリウム、１％ ＳＤＳ及び２００μｇ
／ｍＬのサケ***ＤＮＡからなるプレハイブリダイゼーション溶液中に６３℃で
２時間置き、次いで、シグナルペプチド及びＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩ制限酵素部
位を含む、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２の細胞外領域をコードするＤＮＡの³²Ｐ標識プロー
ブで、結合したＤＮＡを探査した。ハイブリダイゼーション溶液中のＤＮＡプロ
ーブの濃度は、ハイブリダイゼーション溶液１ｍＬ当たり１０⁶ＣＰＭであった
。探査されたブロットを６３℃で１６時間インキュベートし、次いで、２×ＳＳ
Ｃで、６３℃、１時間、１回溶液交換；１×ＳＳＣで、６３℃、１時間、１回溶
液交換；そして、０．１×ＳＳＣで、６８℃、４５分間、１回溶液交換で洗浄し
た。ブロットを乾燥後、それらをオートラジオグラフ的に現像し、そして、Ｐ３
Ｇ２細胞外ＤＮＡプローブにハイブリダイズしたＤＮＡバンドを可視化した。

【０１６１】 オートラジオグラフ可視化の結果は、全てのプールがプローブにハイブリダイ
ズＤＮＡを含んでいることを示した。７個の陽性ＤＮＡバンドを示す一つのプー
ルを選択し、そして、続いて各プール当たり３，０００クローンを有する１０個
のプールにサブ分割した。続く１０プールに対するサザンブロット方法論の適用
の結果、１つのプールがＤＮＡ配列にハイブリダイズする９個の陽性を示した。
標準的なコロニーハイブリダイゼーション技術によって、複数のハイブリダイズ
するシングルコロニーを単離した。

【０１６２】 フィルター状に複製させた細菌コロニーを、上述したＰ３Ｇ２細胞外プローブ
で５００，０００ｃｐｍ／ｍＬの濃度、６３℃で１６時間探査した。ハイブリダ
イズされたフィルターを２×ＳＳＣ、６３℃で３０分間；１×ＳＳＣ、６３℃で
３０分間；そして最後に、０．１×ＳＳＣ、６８℃で１５分間洗浄した。

【０１６３】 複製フィルター上にハイブリダイズしたものとして、オートラジオグラフによ
って、４８のクローンが可視化され、これらのクローンから標準的なＤＮＡ調製
方法論を用いて得られたＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化した。次いで、これらの消化
物のサザンブロットを得て、そして、上述したようにＰ３Ｇ２細胞外プローブで
探査した。７種の異なるサイズの挿入物が、Ｐ３Ｇ２プローブに陽性にハイブリ
ダイズするものとして同定された。各挿入物のヌクレオチド配列を自動化配列決
定技術を用いて得た。８種の異なる挿入物のうち、一つはＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２と配
列が同一であった。他は、新たなＬＩＲファミリーのポリペプチドのポリペプチ
ドをコードするコードするＤＮＡとして同定された。単離されたＬＩＲファミリ
ーメンバーのヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）を、配列番号７（「ｐｂｍ２５」と
称する）、配列番号９（「ｐｂｍ８」と称する）、配列番号１１（「ｐｂｍ３６
−２」と称する）、配列番号１３（「ｐｂｍ３６−４」と称する）、配列番号１
５（「ｐｂｍｈｈ」と称する）、配列番号１７（「ｐｂｍ２」と称する）及び配
列番号１９（「ｐｂｍ１７」と称する）に示してある。それらによってコードさ
れるアミノ酸配列は、配列番号８（「ｐｂｍ２５」と称する）、配列番号１０（
「ｐｂｍ８」と称する）、配列番号１２（「ｐｂｍ３６−２」と称する）、配列
番号１４（「ｐｂｍ３６−４」と称する）、配列番号１６（「ｐｂｍｈｈ」と称
する）、配列番号１８（「ｐｂｍ２」と称する）及び配列番号２０（「ｐｂｍ１
７」と称する）に示してある。

【０１６４】 実施例１０ ＬＩＲ ｃＤＮＡ配列に関するヒト樹状細胞ｃＤＮＡライブラリ ーのスクリーニング 以下は、λＺａｐベクター中のヒト骨髄由来樹状細胞ｃＤＮＡライブラリーを
、放射標識したＨｈ０７７９ｃＤＮＡ断片でスクリーニングすることによる、Ｌ
ＩＲファミリーメンバーの単離及び同定を記載する。Ｈｈ０７７９ｃＤＮＡ断片
は、先にヒト樹状細胞ｃＤＮＡライブラリーより単離され、酵素ＰｓｔＩ及びＳ
ｐｅＩを用いた制限消化によって単離された、Ｈｈ０７７９クローンの０．７ｋ
ｂ挿入物である。Ｈｈ０７７９ｃＤＮＡ断片をＡｍｂｉｏｎより購入されたＤＥ
ＣＡｐｒｉｍｅ ＩＩ ＤＮＡ標識キットを用いて、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰで標
識した。

【０１６５】 λＺａｐ ｃＤＮＡライブラリーを１プレート当たり２０，０００ｐｆｕの密
度でプレートし、最初のスクリーニングのための合計４８０，０００プラークを
提供した。λＺａｐ ｃＤＮＡをＡｍｅｓｈａｍから購入されたＨｙｂｏｎｄ膜
上に二重に（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ブロットし、そして、次いで、０．５
Ｎ ＮａＯＨ及び０．５Ｍ ＮａＣｌの溶液中で５分間変性させた。膜を、０．
５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）及び１．５Ｍ ＮａＣｌの溶液中で５分間中和し
、そして、２×ＳＳＣで３分間洗浄した。自動セッティング中のＳＴＲＡＴＡＬ
ＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤を用いて、ｃＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ膜に架橋した。

【０１６６】 １０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．９Ｍ
ＮａＣｌ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、１％ＳＤＳ及び４ｍｇ／ｍＬの熱変
性サケ***ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６５℃、２．２
５時間、膜をプレハイブリダイゼーションした。プレハイブリダイゼーション後
、放射標識したＨｈ０７７９ ｃＤＮＡをハイブリダイゼーソン溶液中に、最終
濃度０．５４×１０⁶ｃｐｍ／ｍＬとなるように加えた。２４時間のハイブリダ
イゼーション後、膜を０．２５×ＳＳＣ、０．２５％ ＳＤＳで６５℃で１．５
時間洗浄した。次いで、ブロットをオートラジオグラフフィルムに暴露し、陽性
クローンを可視化した。

【０１６７】 ２重セットの双方の膜中にハイブリダイゼーションシグナルを示した全部で１
４６の陽性クローンを同定し、単離し、そして将来の使用のために保存した。１
４６クローンのうち、３５を２次スクリーニングのために選択した。選択された
クローンを低密度でプレートし、上述したハイブリダイゼーション条件を用いた
ＨＨ０７７９へのハイブリダイゼーションののち、単一クローン（複数）を単離
した。次いで、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより購入されたＶＣＳＭ１３ヘルパーファ
ージを用いて、λＺａｐクローンよりプラスミドを単離した。制限消化及びＰＣ
ＲによってプラスミドＤＮＡを分析し、そして２４の最も大きい挿入物を含むク
ローンを選択して配列決定した。２４の配列決定したクローンのうち、６つがＬ
ＩＲ−Ｐ３Ｇ２を、３つがＬＩＲ−ｐｂｍ２を、８つがＬＩＲ−ｐｂｍ３６−４
及びＬＩＲ−ｐｂｍ３６−２を、１つがＬＩＲ−ｐｂｍ８を、２つがＬＩＲ−ｐ
ｂｍｈｈを、そして１つがＬＩＲ−ｐｂｍｎｅｗと称する新規な配列をコードし
た。３つのクローンはＬＩＲポリペプチドファミリーと関係ないアミノ酸配列を
コードするものとして同定された。

【０１６８】 実施例１１ ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８のチロシンホスファター ゼＳＨＰ−１との会合 以下は、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８がＳＨＰ−１と会合すること
を示すために行われた試験を記載する。ヒト単球を、１０％ＦＢＳを添加したＲ
ＰＭＩ培地中で培養し、遠心によって濃縮し、そして最後に２つのアリコートに
分割した。１つのアリコートを、５０ｍＭ／ｍＬの過バナジウム酸ナトリウムの
溶液で５分間刺激した。第２のアリコートは刺激しなかった。刺激後、各アリコ
ート中の細胞を、１％ ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ オルトバナジウ
ム酸ナトリウム、５ｍＭ フッ化ナトリウム、２５ｍＭ β−グリセロールリン
酸、及びプロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液中に、直ちに溶解させた。２
４×１０⁶細胞当量の試料を、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓから購入された５μｇ／ｍＬの抗−ＳＨＰ−１抗体、または５μｇ／ｍＬ
のアイソタイプ適合抗体対照（抗−Ｆｌａｇ−Ｍ５ ＩｇＧ１）のいずれかで２
時間、４℃でインキュベートした。得られた免疫複合体をプロテイン Ｇ−アガ
ロース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とのインキュベーションに
よって沈降させ、洗浄し、そして４０ｍＬの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中
に再懸濁した。各免疫沈降物の２０マイクロリットルを電気泳動ゲル上に装填し
、還元条件下で電気泳動し、そしてＡｍｅｒｓｈａｍより購入されたニトロセル
ロース膜に転写した。ウエスタンブロットを抗−ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２モノクローナ
ル抗体血清及び抗−ＬＩＲ−ｐｂｍ８モノクローナル抗体抗血清で探査し、そし
て免疫複合体を増強された化学発光（ＮＥＮ）によって検出した。

【０１６９】 ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２に対応する約１２０ｋＤａの分子量を有するタンパク質は、
ＳＨＰ−１免疫沈降物中に容易に検出されたが、抗−Ｆｌａｇ−Ｍ５抗体対照と
生成された免疫沈降物中には検出されなかった。同様に、ＬＩＲ−ｐｂｍ８に対
応する９０−１００ｋＤａのタンパク質は、ＳＨＰ−１免疫沈降物中に検出され
たが、対照免疫沈降物中には検出されなかった。ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２バンド、ＬＩ
Ｒ−ｐｂｍ８バンドのいずれも過バナジウム酸ナトリウム処理無しでは観察され
なかった。このことは、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２のチロシンのリン酸化がＬＩＲ−Ｐ３
Ｇ２とＳＨＰ−１との会合に必須であり、そして、ＬＩＲ−ｐｂｍ８のリン酸化
がＬＩＲ−ｐｂｍ８とＳＨＰ−１との会合に必須であることを確認している。

【０１７０】 ＬＩＲ結合（ｃｏｌｌｉｇａｔｉｏｎ）に伴うＦｃγＲＩ−媒介チロシンリン
酸化事象の阻害の研究のために、末梢血単球を、１０μｇ／ｍＬの多数の抗体（
α−ＬＩＲ−１＋α−ＬＩＲ−２、α−ＣＤ１１ｃ、αＣＤ１４、αＣＤ６４、
α−ＣＤ６４＋α−ＬＩＲ−１、α−ＣＤ６４＋α−ＬＩＲ−２、α−ＣＤ６４
＋α−ＬＩＲ−１＋α−ＬＩＲ−２、α−ＣＤ６４＋α−ＣＤ１１ｃ、α−ＣＤ
６４＋α−ＣＤ１４）のＦ（ａｂ）₂版とともに、あるいは無しでインキュベー
トした。続いて、３０μ／ｍＬのポリクローナルＦ（ａｂ）₂ヤギ抗マウスと架
橋した。細胞溶解物を、抗−ホスホチロシン結合アガロースと共に、一晩免疫沈
降し、電気泳動し、そしてニトロセルロース上に転写した。ＰＹ−２０と４Ｇ１
０ ＨＲＰ−結合 抗−ホスホチロシンｍＡｂｓとの組合せを用いてウエスタン
ブロットを行った。このデータは、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８結合
に伴うＦｃγＲＩ−媒介チロシンリン酸化事象の特異的阻害を示す。

【０１７１】 実施例１２ ＬＩＲポリペプチドと免疫反応性の抗体の作成 以下は、ＬＩＲファミリーメンバーと免疫反応性のモノクローナル抗体の作成
を記載する。精製ＬＩＲポリペプチドを実施例４に記載されたように、ＣＯＳ−
１細胞発現及びアフィニティー精製によって調製する。精製タンパク質、又は全
長タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトした細胞は、慣用さ
れた技術、例えば、米国特許第４，４１１，９９３号に記載された技術を用いて
、ＬＩＲポリペプチドに対するモノクローナル抗体を作成することができる。簡
単には、ＢＡＬＢ−Ｃマウスを１０μｇのＬＩＲポリペプチドで０、２及び６週
目に免疫する。一次免疫化はＴＩＴＥＲＭＡＸアジュバントで調製し、続く免疫
化は不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）で調製する。１１週目にマウス
を３−４μｇのＰＢＳ中のＬＩＲポリペプチドでＩＶ追加免疫する。ＩＶ追加免
疫の３日後、脾細胞を回収し、そしてＡｇ８．６５３ミエローマ融合パートナー
と５０％水性ＰＥＧ１５００溶液を用いて融合する。１ウェル当たり７×１０³
細胞のＰＢＳ中のＬＩＲトランスフェクト細胞を用いて、ハイブリドーマ上清を
ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、プレートコート抗原としてポリスチレン
９６ウェルマイクロタイタープレートに乾燥させる。次いで、ＬＩＲトランスフ
ェクト細胞を用いてＦＡＣＳ分析及びＲＩＰによって、陽性上清を確認する。ハ
イブリドーマをクローン化し、次いで、同様のスクリーニングを行う。モノクロ
ーナル培養を増強し、そして、アフィニティークロマトグラフィーによって上清
を精製する。

【０１７２】 実施例１３ リンパ細胞及び骨髄細胞上のＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂ ｍ８の発現に関するフローサイトメトリー分析 リンパ球集団上のＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８の示差的な発現及び
分布を比較するために、新たに単離された末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を、ビオ
チン標識抗−ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２又は抗ＬＩＲ−ｐｂｍ８ ｍＡｂのいずれかの存
在下で、ＰＥ−標識した抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ１９又は抗−ＣＤ５６で染色した
。次いで、染色した細胞をＡＰＣ標識ストレプトアビジンで処理した。５×１０ ⁴ の事象に相当する密度プロットをＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ由来）上に収集した。結果は、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２はＣＤ１９ ⁺ Ｂ細胞の８０％−９５％上に、ＣＤ３⁺ Ｔ細胞の５％−１５％上に、そして
ＣＤ５６⁺ ＮＫ細胞の１０％−３０％上に発現していることを示した。同じ１
２名の供給者からの試験された細胞上で、ＬＩＲ−ｐｂｍ８発現はＣＤ１９⁺
Ｂ細胞上、ＣＤ３⁺ Ｔ細胞上、そしてＣＤ５６⁺ ＮＫ細胞上に検出されなかっ
た。

【０１７３】 高い割合の循環している単球及び樹状細胞（ＤＣ）を含む、向流水簸された画
分（ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ ｅｌｕｔｒｉａｔｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎ
ｓ）が得られた。表現型サブセットＣＤ１４⁺ＣＤ１６^-及びＣＤ１４⁺ＣＤ１６⁺ に従って、単球を特徴付けした。表現型ＣＤ３３⁺ＣＤ１４^-ＣＤ１６^-ＨＬＡ−
ＤＲ⁺に従って、末梢血ＤＣを特徴付けした。単球サブセット及びＤＣを、ＦＩ
ＴＣ−標識抗ＣＤ１４、ＰＥ−標識抗ＣＤ３、ｐｅｒＣｐ−標識抗ＨＬＡ−ＤＲ
、並びに、ビオチン−標識抗−ＣＤ１６、抗−ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２又は抗ＬＩＲ−
ｐｂｍ８のいずれかで染色した。次いで、染色された細胞をＡＰＣ−標識ストレ
プトアビジンで処理した。双方の単球サブセットは同等のレベルのＬＩＲ−Ｐ３
Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８を共発現するが、最も高いＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩ
Ｒ−ｐｂｍ８発現がＣＤ１４⁺ＣＤ１６⁺サブセット上に検出された。血液ＤＣは
単球と比較して低いレベルのＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８を発現する
。これらの事件の結果は、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２はリンパ球、単球及びＤＣ上に発現
し、そして、ＬＩＲ−ｐｂｍ８は単球及びＤＣ上に発現することを示す。

【０１７４】 実施例１４ ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８のＨＬＡクラスＩアリル への結合のスクリーニング 以下は、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８をＨＬＡクラスＩアリルへの
結合に関してスクリーニングするために使用されたフローサイトメトリー分析を
記載する。一団のＨＬＡクラスＩアリルでトランスフェクトさせていない又はト
ランスフェクトさせた、Ｂリンパ芽球クラスＩ−欠損７２１，２２１細胞系を染
色のために使用した。ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２／Ｆｃ及びＬＩＲ−ｐｂｍ８／Ｆｃを結
合研究に用い、両者とも、試験された１１種のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬ
Ａ−Ｃアリルのうち７種に検出可能なように結合した。一般に、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ
２／Ｆｃ及びＬＩＲ−ｐｂｍ８／Ｆｃは、ＨＬＡ−Ａ又はＨＬＡ−Ｃアリルより
もＨＬＡ−Ｂアリルに高い親和性で結合する。ＭＨＣクラスＩ重鎖に対する抗体
（抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ分子）であるＷ６／３２は、全てのクラスＩトランス
フェクタントに対するＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２／Ｆｃ及びＬＩＲ−ｐｂｍ８／Ｆｃの結
合を阻害する。最後に、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂｍ８結合は、ＭＨＣ
クラスＩ発現レベルと相関しない。よって、ＬＩＲ−Ｐ３Ｇ２及びＬＩＲ−ｐｂ
ｍ８は数種のＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣアリルと結合し、そしてＭＨＣクラスＩ特異
性の同様の広いスペクトルを認識する。

【０１７５】 実施例１５ ＬＩＲ−９ｍ１、ＬＩＲ−９ｍ、ＬＩＲ−９ｓ１、ＬＩＲ−９ｓ ２及びＬＩＲ１０の単離 ヒト樹状細胞ｃＤＮＡライブラリーの高スループット配列決定の過程において
、ある不完全なｃＤＮＡ（クローンｓｓ４８９４）の配列がＬＩＲｓ ６ａ、６
Ｂ及び７のヌクレオチド配列と著しく類似していることが注目され、これはｓｓ
４８９４がＬＩＲ遺伝子ファミリーのメンバーであることを示唆した。このｃＤ
ＮＡクローンの残りを得るために、迅速増幅ｃＤＮＡ伸長システム（ＲＡＣＥ）
を用いてヒト白血球ｃＤＮＡライブラリーを増幅した（Ｃｈｅｎｃｈｉｋ ｅｔ
ａｌ．， Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃ
ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｂｙ ＰＣＲ，Ｉｎ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇ
ｕｉｄｅ ｔｏ ＲＮＡ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｅｄ．Ｋｒｅｉｇ，Ｐ．Ａ．（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎ
ｃ．），ｐａｇｅｓ ２７３−３２１）。増幅の第１ラウンドは、ｃＤＮＡの５
’末端のＲＡＣＥアダプターに相当する一つのプライマー、及びｓｓ４８９４の
３’末端近傍の配列に相当する第２のプライマーを採用した。この努力の結果、
ｓｓ４８９４の配列と同一ではないが高い相同性を有し、そして開始メチオニン
コドンを越えた上流まで延びる配列を含んだいくつかのクローンを得た。しかし
ながら、これらのクローンはコード領域の３’末端の配列のいくらかを欠いてい
た。完全なコード領域を得るための努力において、ＲＡＣＥ配列決定の別のラウ
ンドが行われたが、今回は第一ＲＡＣＥ産物の５’末端近傍からの第一プライマ
ー、及び３’アダプターに相当する第２プライマーを使用した。この努力の結果
、ＬＩＲ挿入物を含む５つのクローンが得られたが、そのうち４つは密接に関連
しており、同一の遺伝子の変異体をコードしているように思われる。これらの４
つの関連するｃＤＮＡ配列を、ＬＩＲ−９ｍ１、ＬＩＲ−９ｍ２、ＬＩＲ−９ｓ
１及びＬＩＲ−９ｓ２（配列番号２９、３１、３３及び３５）と名付けた。この
最後のプライマーの組を用いて得られた５番目のクローンは異なる遺伝子を示し
ており、ＬＩＲ−１０（配列番号３７）と名付けられた。

【０１７６】 ＬＩＲ−９クローンの４つは全て同じタンパク質の変異体をコードしており、
選択的スプライシングの産物と推定される。ＬＩＲ−９ｍ１（配列番号３０）及
びＬＩＲ−９ｓ１（配列番号３４）によってコードされるタンパク質は、ＬＩＲ
−９ｍ２（配列番号３２）及びＬＩＲ−９ｓ２（配列番号３６）からは欠けてい
る１２アミノ酸の挿入物を有する。ＬＩＲ−９タンパク質の可溶型、即ち、ＬＩ
Ｒ−９ｓ１及びＬＩＲ−９ｓ２は、膜型、即ちＬＩＲｓ−９ｍ１及び−９ｍ２か
ら、そのカルボキシル末端近傍において異なっている。この相違はおそらく、タ
ンパク質のその領域をコードするために、可溶型と膜型で異なるエクソンが使用
されていることによる。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１４年３月１５日（２００２．３．１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/04 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ボルゲス，ルイス アメリカ合衆国ワシントン州98107，シア トル，ノースウエスト・フィフティセブン ス・ストリート 3008 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA07 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 HA11 4B064 AG20 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA07 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 BA50 CA18 DA38 DA39 MA01 NA14 ZB07 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA50 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＬＩＲポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、前記ＬＩＲポ
   リペプチドが配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３
   ６及び配列番号：３８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記核酸
   分子。
2. 【請求項２】 前記核酸分子が配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号
   ：３５及び配列番号：３７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、
   請求項１の単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 前記核酸分子が配列番号：２９のヌクレオチド６９−９６８を含む、請求項１
   に記載の単離された核酸分子。
4. 【請求項４】 前記核酸分子が配列番号：３１のヌクレオチド９５−９５８を含む、請求項１
   に記載の単離された核酸分子。
5. 【請求項５】 前記核酸分子が配列番号：３３のヌクレオチド１１５−９１２を含む、請求項
   １に記載の単離された核酸分子。
6. 【請求項６】 前記核酸分子が配列番号：３５のヌクレオチド７３−８３４を含む、請求項１
   に記載の単離された核酸分子。
7. 【請求項７】 前記核酸分子が配列番号：３７のヌクレオチド１−１３５０を含む、請求項１
   に記載の単離された核酸分子。
8. 【請求項８】 可溶性ＬＩＲポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、前記Ｌ
   ＩＲポリペプチドが、 配列番号：３０のアミノ酸ｘ₁₁ないし２６２（ここで、ｘ₁₁はアミノ酸１又は
   ３５である）； 配列番号：３２のアミノ酸ｘ₁₂ないし２５０（ここで、ｘ₁₂はアミノ酸１又は
   ３６である）； 配列番号：３４のアミノ酸ｘ₁₃ないし２６５（ここで、ｘ₁₃はアミノ酸１又は
   ３５である）； 配列番号：３６のアミノ酸ｘ₁₄ないし２５３（ここで、ｘ₁₄はアミノ酸１又は
   ３６である）；及び 配列番号：３８のアミノ酸１−３９３ からなる群より選択される、ＬＩＲファミリーメンバーの細胞外ドメイン からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記核酸分子。
9. 【請求項９】 少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含む可溶性ＬＩＲポリペプチドをコードす
   る単離された核酸分子であって、前記ＬＩＲポリペプチドが、 配列番号：３０のアミノ酸ｘ₁₁ないし２６２（ここで、ｘ₁₁はアミノ酸１又は
   ３５である）； 配列番号：３２のアミノ酸ｘ₁₂ないし２５０（ここで、ｘ₁₂はアミノ酸１又は
   ３６である）； 配列番号：３４のアミノ酸ｘ₁₃ないし２６５（ここで、ｘ₁₃はアミノ酸１又は
   ３５である）； 配列番号：３６のアミノ酸ｘ₁₄ないし２５３（ここで、ｘ₁₄はアミノ酸１又は
   ３６である）；及び 配列番号：３８のアミノ酸１−３９３ からなる群より選択される少なくとも８５個のアミノ酸を含む、前記核酸分子。
10. 【請求項１０】 請求項１の核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有する単離されたポ
    リペプチド、またはその免疫原性断片。
11. 【請求項１１】 請求項１０のポリペプチドに特異的に結合し得る抗体。
12. 【請求項１２】 ＩｇのＦｃ領域、並びに 配列番号：３０のアミノ酸ｘ₁₁ないし２６２（ここで、ｘ₁₁はアミノ酸１又は
    ３５である）； 配列番号：３２のアミノ酸ｘ₁₂ないし２５０（ここで、ｘ₁₂はアミノ酸１又は
    ３６である）； 配列番号：３４のアミノ酸ｘ₁₃ないし２６５（ここで、ｘ₁₃はアミノ酸１又は
    ３５である）； 配列番号：３６のアミノ酸ｘ₁₄ないし２５３（ここで、ｘ₁₄はアミノ酸１又は
    ３６である）；及び 配列番号：３８のアミノ酸１−３９３ からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする核酸
    分子。
13. 【請求項１３】 請求項１に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
14. 【請求項１４】 ＬＩＲポリペプチドを調製する方法であって、請求項１３の発現ベクターを用
    いて形質転換した宿主細胞を前記ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し
    、そして、前記ポリペプチドを回収することを含む、前記方法。
15. 【請求項１５】 生理学的に許容される担体及び請求項１０のポリペプチドを含む組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１３に記載の発現ベクターを用いて形質転換された、又はトランスフェ
    クトされた宿主細胞。