JP2002543768A - 新規ヒト電位依存性カリウムチャンネル - Google Patents
新規ヒト電位依存性カリウムチャンネルInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体黄斑ジストロフィおよびサラ病に関連した遺伝子を含有する染色体領域内に位置する電位依存性カリウムチャンネルＫＣＮＱ５をコードする新規ヒトＤＮＡ配列に関する。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、電位依存性カリウムチャンネルをコードする新規ヒトＤＮＡ配列に
関する。
関する。
【０００２】 （発明の背景） 電位依存性カリウムチャンネルは、細胞膜電位の変化に応答して開く膜貫通孔
を形成し、該膜にカリウムイオンを選択的に通過させる。多数の電位依存性カリ
ウムチャンネルが同定されている。それらは、発現の組織特異的パターンにより
並びに電気生理学的および薬理学的特性により区別されうる。
を形成し、該膜にカリウムイオンを選択的に通過させる。多数の電位依存性カリ
ウムチャンネルが同定されている。それらは、発現の組織特異的パターンにより
並びに電気生理学的および薬理学的特性により区別されうる。
【０００３】 電位依存性カリウムチャンネルは、多数の細胞（例えば、ニューロン、筋細胞
および膵β細胞）における細胞膜電位の維持および活動電位の再分極の制御に関
与することが示されている。それらは、種々の疾患に関連した薬物発見のための
重要な標的である。
および膵β細胞）における細胞膜電位の維持および活動電位の再分極の制御に関
与することが示されている。それらは、種々の疾患に関連した薬物発見のための
重要な標的である。
【０００４】 機能的電位依存性カリウムチャンネルは、６個の膜貫通伸長セグメントをそれ
ぞれが含有する４個のαサブユニットの四量体であると考えられている。四量体
を構成するαサブユニットは同一であることもあれば（ホモ四量体の場合）、異
なることもある（ヘテロ四量体の場合）。該四量体を構成する膜伸長αサブユニ
ットは、該四量体の挙動を改変しうる追加的なβサブユニットを伴うことがある
。
ぞれが含有する４個のαサブユニットの四量体であると考えられている。四量体
を構成するαサブユニットは同一であることもあれば（ホモ四量体の場合）、異
なることもある（ヘテロ四量体の場合）。該四量体を構成する膜伸長αサブユニ
ットは、該四量体の挙動を改変しうる追加的なβサブユニットを伴うことがある
。
【０００５】 電位依存性カリウムチャンネルの総説としては、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，１９９
７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８：４７４−４８３；Ｊａ
ｎ ＆ Ｊａｎ，１９９７，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０５：２６７−２８２；Ｃ
ａｔｔｅｒａｌｌ，１９９５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：４９３
−５３１を参照されたい。
７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８：４７４−４８３；Ｊａ
ｎ ＆ Ｊａｎ，１９９７，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０５：２６７−２８２；Ｃ
ａｔｔｅｒａｌｌ，１９９５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：４９３
−５３１を参照されたい。
【０００６】 黄斑ジストロフィは、多数の人々における重篤な視力障害の総合的原因である
様々な疾患の一群に用いられる用語である。黄斑ジストロフィの一般的な特徴は
、網膜黄斑の下に位置する色素上皮の変性から生じる中心視の進行性喪失である
。黄斑ジストロフィの多数の形態においては、該疾患の最終段階は法的盲を招く
。２０個を超えるタイプの黄斑ジストロフィ（例えば、老人性黄斑ジストロフィ
、シュタルガルトおよびシュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロ
フィ、非定型卵黄状黄斑ジストロフィ（ＶＭＤ１）、１Ｂ型アッシャー症候群、
常染色体優性血管新生炎症性硝子体網膜症、家族性滲出性硝子体網膜症およびベ
スト黄斑ジストロフィ）が公知である。黄斑ジストロフィの総説としては、Ｓｕ
ｌｌｉｖａｎ ＆ Ｄａｉｇｅｒ，１９９６；Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ ２
：３８０−３８６を参照されたい。
様々な疾患の一群に用いられる用語である。黄斑ジストロフィの一般的な特徴は
、網膜黄斑の下に位置する色素上皮の変性から生じる中心視の進行性喪失である
。黄斑ジストロフィの多数の形態においては、該疾患の最終段階は法的盲を招く
。２０個を超えるタイプの黄斑ジストロフィ（例えば、老人性黄斑ジストロフィ
、シュタルガルトおよびシュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロ
フィ、非定型卵黄状黄斑ジストロフィ（ＶＭＤ１）、１Ｂ型アッシャー症候群、
常染色体優性血管新生炎症性硝子体網膜症、家族性滲出性硝子体網膜症およびベ
スト黄斑ジストロフィ）が公知である。黄斑ジストロフィの総説としては、Ｓｕ
ｌｌｉｖａｎ ＆ Ｄａｉｇｅｒ，１９９６；Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ ２
：３８０−３８６を参照されたい。
【０００７】 錐体杆体ジストロフィは、錐体光受容体の初期喪失およびそれに続く杆体光受
容体の変性を伴う。光受容体のこの喪失は失明につながることがある。錐体杆体
ジストロフィは、複数の染色***置が関与している様々な遺伝性障害の一群であ
るらしい（Ｅｖａｎｓら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：２１０−
２１３；Ｋｅｌｓｅｌｌら，１９９７，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：５９
７−６００）。特に、Ｋｅｌｓｅｌｌら（１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅｔ．６３：２７４−２７９）は、錐体杆体ジストロフィに罹患した英国の４世
代の家系において、染色体６ｑに位置する候補遺伝子（ＣＯＲＤ７）を見出した
。６ｑのマーカーＤ６Ｓ２８０は、３．３１の高いＬＯＤスコア（遺伝距離＝０
）を示した。
容体の変性を伴う。光受容体のこの喪失は失明につながることがある。錐体杆体
ジストロフィは、複数の染色***置が関与している様々な遺伝性障害の一群であ
るらしい（Ｅｖａｎｓら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：２１０−
２１３；Ｋｅｌｓｅｌｌら，１９９７，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：５９
７−６００）。特に、Ｋｅｌｓｅｌｌら（１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅｔ．６３：２７４−２７９）は、錐体杆体ジストロフィに罹患した英国の４世
代の家系において、染色体６ｑに位置する候補遺伝子（ＣＯＲＤ７）を見出した
。６ｑのマーカーＤ６Ｓ２８０は、３．３１の高いＬＯＤスコア（遺伝距離＝０
）を示した。
【０００８】 シュタルガルト様黄斑ジストロフィは遺伝性優性網膜疾患である。罹患個体は
、小児初期には正常な視覚を有するが、小児後期また成人初期には中心視の不全
を示す。最初に観察されうる該疾患の特徴は、黄斑に認められる斑である。この
後、２０／２００以下にまで視力を低下させる中心性萎縮が生じる（Ｓｔｏｎｅ
ら，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１２：７６５−７７２［Ｓｔｏｎｅ］
）。Ｓｔｏｎｅは、シュタルガルト様黄斑ジストロフィの原因遺伝子を染色体６
ｑにマッピングした。マーカーＤ６Ｓ２８０は５．５の高いＬＯＤスコア（遺伝
距離＝０）を有することが、Ｓｔｏｎｅにより観察された。
、小児初期には正常な視覚を有するが、小児後期また成人初期には中心視の不全
を示す。最初に観察されうる該疾患の特徴は、黄斑に認められる斑である。この
後、２０／２００以下にまで視力を低下させる中心性萎縮が生じる（Ｓｔｏｎｅ
ら，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１２：７６５−７７２［Ｓｔｏｎｅ］
）。Ｓｔｏｎｅは、シュタルガルト様黄斑ジストロフィの原因遺伝子を染色体６
ｑにマッピングした。マーカーＤ６Ｓ２８０は５．５の高いＬＯＤスコア（遺伝
距離＝０）を有することが、Ｓｔｏｎｅにより観察された。
【０００９】 臨床的観点からは、錐体杆体ジストロフィとシュタルガルト様黄斑ジストロフ
ィとは異なっているようである。例えば、シュタルガルト様黄斑ジストロフィは
、一般には、小児期に始まり、網膜内に白色／黄色斑を伴い、一方、錐体杆体ジ
ストロフィは、斑が存在しない成人期に始まる障害である。そのような臨床的相
違にもかかわらず、どちらの疾患も、同じ遺伝子中の突然変異により引き起こさ
れうる。単一遺伝子中の異なる突然変異が、臨床的に異なる障害を引き起こすこ
とは、珍しいことではない。例えば、ペリフェリン／ＲＤＳ遺伝子中の突然変異
は、その個々の突然変異に応じて、中心窩の蝶形色素ジストロフィ、網膜色素変
性、模様ジストロフィ、フラブス・マキュラツス（ｆｌａｖｕｓ ｍａｃｕｌａ
ｔｕｓ）、黄斑ジストロフィまたは中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィを引き起こ
しうる（Ｎｉｃｈｏｌｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２０２
−２０７；Ｗｅｌｅｂｅｒら，１９９３，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．１１
１：１５３１−１５４２；Ｗｅｌｌｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ
．３：２１３−２１８；Ｒｅｉｇら，１９９５，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ．Ｇｅｎ
ｅｔ．１６：３９−４４）。
ィとは異なっているようである。例えば、シュタルガルト様黄斑ジストロフィは
、一般には、小児期に始まり、網膜内に白色／黄色斑を伴い、一方、錐体杆体ジ
ストロフィは、斑が存在しない成人期に始まる障害である。そのような臨床的相
違にもかかわらず、どちらの疾患も、同じ遺伝子中の突然変異により引き起こさ
れうる。単一遺伝子中の異なる突然変異が、臨床的に異なる障害を引き起こすこ
とは、珍しいことではない。例えば、ペリフェリン／ＲＤＳ遺伝子中の突然変異
は、その個々の突然変異に応じて、中心窩の蝶形色素ジストロフィ、網膜色素変
性、模様ジストロフィ、フラブス・マキュラツス（ｆｌａｖｕｓ ｍａｃｕｌａ
ｔｕｓ）、黄斑ジストロフィまたは中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィを引き起こ
しうる（Ｎｉｃｈｏｌｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２０２
−２０７；Ｗｅｌｅｂｅｒら，１９９３，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．１１
１：１５３１−１５４２；Ｗｅｌｌｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ
．３：２１３−２１８；Ｒｅｉｇら，１９９５，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ．Ｇｅｎ
ｅｔ．１６：３９−４４）。
【００１０】 黄斑ジストロフィ、例えば錐体杆体ジストロフィまたはシュタルガルト様黄斑
ジストロフィの研究は、それ自体としても重要であるが、そのような研究はまた
、老人性黄斑変性（ＡＭＤ）を解明すると期待される点においても重要である。
ＡＭＤは、老人における重篤な視力障害の主要原因である。ＡＭＤにおいては遺
伝的要因が何らかの役割を果たしているらしい（Ｈｙｍａｎら，１９８３，Ａｍ
．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１１８：２１３−２２７；Ｇａｓｓ，１９７３，Ａ
ｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．９０：２０６−２１７）。錐体杆体ジストロフィ
、シュタルガルト様黄斑ジストロフィなどの早発性疾患の軽い対立遺伝子変異が
ＡＭＤのいくつかの症例を引き起こしている可能性があると考えられている。し
たがって、これらの早発性疾患を理解しそれらの治療方法を開発することは、Ａ
ＭＤに関しても重要となるはずである。
ジストロフィの研究は、それ自体としても重要であるが、そのような研究はまた
、老人性黄斑変性（ＡＭＤ）を解明すると期待される点においても重要である。
ＡＭＤは、老人における重篤な視力障害の主要原因である。ＡＭＤにおいては遺
伝的要因が何らかの役割を果たしているらしい（Ｈｙｍａｎら，１９８３，Ａｍ
．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１１８：２１３−２２７；Ｇａｓｓ，１９７３，Ａ
ｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．９０：２０６−２１７）。錐体杆体ジストロフィ
、シュタルガルト様黄斑ジストロフィなどの早発性疾患の軽い対立遺伝子変異が
ＡＭＤのいくつかの症例を引き起こしている可能性があると考えられている。し
たがって、これらの早発性疾患を理解しそれらの治療方法を開発することは、Ａ
ＭＤに関しても重要となるはずである。
【００１１】 サラ病は、シアル酸のリソソーム輸送の欠損を伴う早発性精神運動遅滞および
運動失調により特徴づけられる劣性状態である。Ｌｅｐｐａｎｅｎら（１９９６
，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３７：６２−６７（Ｌｅｐｐａｎｅｎ））は、サラ病の遺
伝子をマーカーＤ６Ｓ２８０のすぐ近くに位置づけした。Ｌｅｐｐａｎｅｎは、
マーカーＤ６Ｓ２８０でＰＡＣライブラリーをスクリーニングし、ＰＡＣ １４
１Ｂ１およびＰＡＣ ２２４Ｈ２３を含む３個の陽性クローンを得た。このこと
は、サラ病の遺伝子がこれらのＰＡＣ中に存在していることを示唆している。
運動失調により特徴づけられる劣性状態である。Ｌｅｐｐａｎｅｎら（１９９６
，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３７：６２−６７（Ｌｅｐｐａｎｅｎ））は、サラ病の遺
伝子をマーカーＤ６Ｓ２８０のすぐ近くに位置づけした。Ｌｅｐｐａｎｅｎは、
マーカーＤ６Ｓ２８０でＰＡＣライブラリーをスクリーニングし、ＰＡＣ １４
１Ｂ１およびＰＡＣ ２２４Ｈ２３を含む３個の陽性クローンを得た。このこと
は、サラ病の遺伝子がこれらのＰＡＣ中に存在していることを示唆している。
【００１２】 （発明の概要） 本発明は、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体黄斑ジストロフィお
よびサラ病に関連した遺伝子を含有する染色体領域内に位置する電位依存性カリ
ウムチャンネルＫＣＮＱ５をコードする新規ヒトＤＮＡ配列に関する。
よびサラ病に関連した遺伝子を含有する染色体領域内に位置する電位依存性カリ
ウムチャンネルＫＣＮＱ５をコードする新規ヒトＤＮＡ配列に関する。
【００１３】 本発明は、ゲノムＫＣＮＱ５ ＤＮＡ、およびＫＣＮＱ５タンパク質をコード
するｃＤＮＡを含む。ヒトゲノムＫＣＮＱ５ ＤＮＡは、他の核酸を実質的に含
有せず、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する。ＫＣＮＱ５タンパク質を
コードするヒトｃＤＮＡは、他の核酸を実質的に含有せず、配列番号２に示すヌ
クレオチド配列を有する。該新規ＤＮＡ配列にコードされるＫＣＮＱ５タンパク
質も提供する。該ヒトＫＣＮＱ５タンパク質は、他のタンパク質を実質的に含有
せず、配列番号３に示すアミノ酸配列を有する。組換え系内でのＫＣＮＱ５タン
パク質の発現方法、およびＫＣＮＱ５タンパク質の機能のアクチベーターおよび
インヒビターの同定方法を提供する。突然変異ＫＣＮＱ５遺伝子の保持者を検出
する診断方法も提供する。
するｃＤＮＡを含む。ヒトゲノムＫＣＮＱ５ ＤＮＡは、他の核酸を実質的に含
有せず、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する。ＫＣＮＱ５タンパク質を
コードするヒトｃＤＮＡは、他の核酸を実質的に含有せず、配列番号２に示すヌ
クレオチド配列を有する。該新規ＤＮＡ配列にコードされるＫＣＮＱ５タンパク
質も提供する。該ヒトＫＣＮＱ５タンパク質は、他のタンパク質を実質的に含有
せず、配列番号３に示すアミノ酸配列を有する。組換え系内でのＫＣＮＱ５タン
パク質の発現方法、およびＫＣＮＱ５タンパク質の機能のアクチベーターおよび
インヒビターの同定方法を提供する。突然変異ＫＣＮＱ５遺伝子の保持者を検出
する診断方法も提供する。
【００１４】 （図面の簡単な記載） 図１Ａ〜ＡＯは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
下線付きの大文字のヌクレオチドはエキソンを表す。エキソン（Ｅｘｏｎ）１中
の開始ＡＴＧコドンおよびエキソン１４中の終結ＴＡＡコドンは太字のイタリッ
ク体で示されている。Ｄ６Ｄ２８０遺伝的マーカーおよびホスホグリセリン酸偽
遺伝子は下線付きの太字で示されている。エキソン１および２、２および３、１
０および１１、１１および１２、１２および１３、ならびに１３および１４の間
のギャップの厳密な長さは未知である。これらのギャップは、便宜のため、連続
した１０個の太字のｎで表されている。
下線付きの大文字のヌクレオチドはエキソンを表す。エキソン（Ｅｘｏｎ）１中
の開始ＡＴＧコドンおよびエキソン１４中の終結ＴＡＡコドンは太字のイタリッ
ク体で示されている。Ｄ６Ｄ２８０遺伝的マーカーおよびホスホグリセリン酸偽
遺伝子は下線付きの太字で示されている。エキソン１および２、２および３、１
０および１１、１１および１２、１２および１３、ならびに１３および１４の間
のギャップの厳密な長さは未知である。これらのギャップは、便宜のため、連続
した１０個の太字のｎで表されている。
【００１５】 図２Ａ〜Ｅは、ヒトＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
【００１６】 図３Ａは、種々のヒト組織におけるＫＣＮＱ５ ｍＲＮＡの発現のノーザンブ
ロットの結果を示す。図３Ｂは、種々のヒト組織におけるＫＣＮＱ５ ｍＲＮＡ
の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
ロットの結果を示す。図３Ｂは、種々のヒト組織におけるＫＣＮＱ５ ｍＲＮＡ
の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
【００１７】 図４Ａは、ヒトＫＣＮＱ５タンパク質（配列番号３）とヒトＫＣＮＱ４タンパ
ク質（配列番号４）との配列アライメントを示す。示されているコンセンサス（
ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列は配列番号５である。図４Ｂ〜Ｃは、ヒトＫＣＮＱ５
タンパク質（配列番号３）、ヒトＫＣＮＱ１タンパク質（配列番号４３）、ヒト
ＫＣＮＱ２タンパク質（配列番号６）、ヒトＫＣＮＱ３タンパク質（配列番号７
）およびヒトＫＣＮＱ４タンパク質（配列番号４）の間の多配列アライメントを
示す。示されているコンセンサス配列は配列番号８である。
ク質（配列番号４）との配列アライメントを示す。示されているコンセンサス（
ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列は配列番号５である。図４Ｂ〜Ｃは、ヒトＫＣＮＱ５
タンパク質（配列番号３）、ヒトＫＣＮＱ１タンパク質（配列番号４３）、ヒト
ＫＣＮＱ２タンパク質（配列番号６）、ヒトＫＣＮＱ３タンパク質（配列番号７
）およびヒトＫＣＮＱ４タンパク質（配列番号４）の間の多配列アライメントを
示す。示されているコンセンサス配列は配列番号８である。
【００１８】 （発明の詳細な記載） 本発明の目的においては、「他のタンパク質を実質的に含有しない」は、他の
タンパク質から少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、
より一層好ましくは９９．９％フリーである（すなわち、かかる割合分は他のタ
ンパク質を含有しない）ことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的
に含有しないＫＣＮＱ５タンパク質調製物は、その全タンパク質に対する割合と
して、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、より一層好
ましくは０．１％以下の非ＫＣＮＱ５タンパク質を含有するであろう。ある与え
られたＫＣＮＱ５タンパク質調製物が他のタンパク質を実質的に含有しないか否
かは、適当な検出方法（例えば、銀染色または免疫ブロット法）と組合せた例え
ばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）などのタンパク質の純度を評価する通常の技術により判定することができる。
タンパク質から少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、
より一層好ましくは９９．９％フリーである（すなわち、かかる割合分は他のタ
ンパク質を含有しない）ことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的
に含有しないＫＣＮＱ５タンパク質調製物は、その全タンパク質に対する割合と
して、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、より一層好
ましくは０．１％以下の非ＫＣＮＱ５タンパク質を含有するであろう。ある与え
られたＫＣＮＱ５タンパク質調製物が他のタンパク質を実質的に含有しないか否
かは、適当な検出方法（例えば、銀染色または免疫ブロット法）と組合せた例え
ばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）などのタンパク質の純度を評価する通常の技術により判定することができる。
【００１９】 「他の核酸を実質的に含有しない」は、他の核酸から少なくとも９０％、好ま
しくは９５％、より好ましくは９９％、より一層好ましくは９９．９％フリーで
あることを意味する。したがって、他の核酸を実質的に含有しないＫＣＮＱ５
ＤＮＡ調製物は、その全核酸に対する割合として、１０％以下、好ましくは５％
以下、より好ましくは１％以下、より一層好ましくは０．１％以下の非ＫＣＮＱ
５核酸を含有するであろう。ある与えられたＫＣＮＱ５ ＤＮＡ調製物が他の核
酸を実質的に含有しないか否かは、適当な染色方法（例えば、臭化エチジウム染
色）と組合せた例えばアガロースゲル電気泳動などの核酸の純度を評価する通常
の技術により、または配列決定により判定することができる。
しくは９５％、より好ましくは９９％、より一層好ましくは９９．９％フリーで
あることを意味する。したがって、他の核酸を実質的に含有しないＫＣＮＱ５
ＤＮＡ調製物は、その全核酸に対する割合として、１０％以下、好ましくは５％
以下、より好ましくは１％以下、より一層好ましくは０．１％以下の非ＫＣＮＱ
５核酸を含有するであろう。ある与えられたＫＣＮＱ５ ＤＮＡ調製物が他の核
酸を実質的に含有しないか否かは、適当な染色方法（例えば、臭化エチジウム染
色）と組合せた例えばアガロースゲル電気泳動などの核酸の純度を評価する通常
の技術により、または配列決定により判定することができる。
【００２０】 「同類アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、化学的に類似した別のアミノ
酸残基により置換されることを意味する。そのような同類置換の具体例としては
、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）間での置換
、ある極性残基を同じ電荷の別の極性残基で置換すること（例えば、リシンから
アルギニンへの、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換）、芳香族アミノ酸
（トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニン）間での置換が挙げられる
。
酸残基により置換されることを意味する。そのような同類置換の具体例としては
、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）間での置換
、ある極性残基を同じ電荷の別の極性残基で置換すること（例えば、リシンから
アルギニンへの、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換）、芳香族アミノ酸
（トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニン）間での置換が挙げられる
。
【００２１】 あるポリペプチドが「ＫＣＮＱ５と実質的に同じ生物活性」を有するのは、そ
のポリペプチドが、適当な細胞型内で発現された場合に、電位依存性カリウム電
流を伝導し、かつ、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準的なプログラムによ
り測定された場合に配列番号３と少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列を
有する場合である。
のポリペプチドが、適当な細胞型内で発現された場合に、電位依存性カリウム電
流を伝導し、かつ、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準的なプログラムによ
り測定された場合に配列番号３と少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列を
有する場合である。
【００２２】 本発明は、新規電位依存性カリウムチャンネルをコードする遺伝子であるＫＣ
ＮＱ５の同定およびクローニングに関する。該ヒトＫＣＮＱ５遺伝子は、少なく
とも３つの疾患、すなわち、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジス
トロフィおよびサラ病の発生と連関している遺伝子を含有する染色体領域内の染
色体６ｑ１４上に位置する。
ＮＱ５の同定およびクローニングに関する。該ヒトＫＣＮＱ５遺伝子は、少なく
とも３つの疾患、すなわち、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジス
トロフィおよびサラ病の発生と連関している遺伝子を含有する染色体領域内の染
色体６ｑ１４上に位置する。
【００２３】 ヒトＫＣＮＱ５遺伝子は、染色体領域６ｑ１４からのＰＡＣクローン上に存在
する。ＰＡＣ１４１Ｂ１を配列決定し、ＰＡＣ １４１Ｂ１中に存在するＫＣＮ
Ｑ５のゲノム配列と公知カリウムチャンネル遺伝子の配列との間の相同性に基づ
きＫＣＮＱ５が見出された。ＰＡＣ １４１Ｂ１は、ＲＰＣＩ４，５，６ Ｌｉ
ｂｒａｒｙ（カタログ番号ＣＴＬＩ．Ｃ）からの別個のクローンとしてＲｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｅ，ＡＬから入手可
能である。ＫＣＮＱ５配列由来のＰＣＲプライマーを使用して、該コード領域を
代表するｃＤＮＡ配列およびＫＣＮＱ５の３’−ＵＴＲの大部分を、ヒト胎児脳
ｃＤＮＡライブラリーから単離した。このｃＤＮＡクローンと、ＰＡＣ１４１Ｂ
１中に存在するゲノム配列およびＰＡＣ２２４Ｈ２３中に見出されるＫＣＮＱ５
配列との比較は、エキソン３〜１１および隣接イントロン領域部分がＰＡＣ１４
１Ｂ１中に存在することを示した。エキソン２および隣接イントロン領域はＰＡ
Ｃ２２４Ｈ２３中に見出され、ＫＣＮＱ５遺伝子の残部（エキソン１、１２〜１
４および隣接イントロン領域）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
ＡからのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットおよびｃＤＮＡプライマーを使用する
ことにより全ヒトゲノムＤＮＡから回収された。
する。ＰＡＣ１４１Ｂ１を配列決定し、ＰＡＣ １４１Ｂ１中に存在するＫＣＮ
Ｑ５のゲノム配列と公知カリウムチャンネル遺伝子の配列との間の相同性に基づ
きＫＣＮＱ５が見出された。ＰＡＣ １４１Ｂ１は、ＲＰＣＩ４，５，６ Ｌｉ
ｂｒａｒｙ（カタログ番号ＣＴＬＩ．Ｃ）からの別個のクローンとしてＲｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｅ，ＡＬから入手可
能である。ＫＣＮＱ５配列由来のＰＣＲプライマーを使用して、該コード領域を
代表するｃＤＮＡ配列およびＫＣＮＱ５の３’−ＵＴＲの大部分を、ヒト胎児脳
ｃＤＮＡライブラリーから単離した。このｃＤＮＡクローンと、ＰＡＣ１４１Ｂ
１中に存在するゲノム配列およびＰＡＣ２２４Ｈ２３中に見出されるＫＣＮＱ５
配列との比較は、エキソン３〜１１および隣接イントロン領域部分がＰＡＣ１４
１Ｂ１中に存在することを示した。エキソン２および隣接イントロン領域はＰＡ
Ｃ２２４Ｈ２３中に見出され、ＫＣＮＱ５遺伝子の残部（エキソン１、１２〜１
４および隣接イントロン領域）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
ＡからのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットおよびｃＤＮＡプライマーを使用する
ことにより全ヒトゲノムＤＮＡから回収された。
【００２４】 ＰＡＣ１４１Ｂ１およびＰＡＣ２２４Ｈ２３は、サラ病遺伝子の領域内に位置
する（Ｌｅｐｐａｎｅｎら，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３７：６２−６７）
。ＰＡＣ１４１Ｂ１は、エキソン３とエキソン４との間のＫＣＮＱ５遺伝子のイ
ントロン３中に位置する多型性遺伝的マーカーＤ６Ｓ２８０を含有する（図１）
。Ｄ６Ｓ２８０は、シュタルガルト様黄斑ジストロフィの家系において５．５の
最大ＬＯＤスコア（遺伝距離＝０）を検出するマーカーである（Ｓｔｏｎｅら，
Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１２：７６５−７７２）。Ｄ６Ｓ２８０は
また、錐体杆体ジストロフィの家系において３．３１のＬＯＤスコア（遺伝距離
＝０）を検出する（Ｋｅｌｓｅｌｌら，１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
ｔ．６３：２７４−２７９）。これらのＬＯＤスコアは、Ｄ６Ｓ２８０が、シュ
タルガルト様黄斑ジストロフィおよび錐体杆体ジストロフィの遺伝子と非常に密
接に連関しており、そしておそらくは該遺伝子内に存在することを示している。
これらの知見を考慮すると、ＫＣＮＱ５は、サラ病、シュタルガルト様黄斑ジス
トロフィおよび錐体杆体ジストロフィに関与していると考えられる。
する（Ｌｅｐｐａｎｅｎら，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３７：６２−６７）
。ＰＡＣ１４１Ｂ１は、エキソン３とエキソン４との間のＫＣＮＱ５遺伝子のイ
ントロン３中に位置する多型性遺伝的マーカーＤ６Ｓ２８０を含有する（図１）
。Ｄ６Ｓ２８０は、シュタルガルト様黄斑ジストロフィの家系において５．５の
最大ＬＯＤスコア（遺伝距離＝０）を検出するマーカーである（Ｓｔｏｎｅら，
Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１２：７６５−７７２）。Ｄ６Ｓ２８０は
また、錐体杆体ジストロフィの家系において３．３１のＬＯＤスコア（遺伝距離
＝０）を検出する（Ｋｅｌｓｅｌｌら，１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
ｔ．６３：２７４−２７９）。これらのＬＯＤスコアは、Ｄ６Ｓ２８０が、シュ
タルガルト様黄斑ジストロフィおよび錐体杆体ジストロフィの遺伝子と非常に密
接に連関しており、そしておそらくは該遺伝子内に存在することを示している。
これらの知見を考慮すると、ＫＣＮＱ５は、サラ病、シュタルガルト様黄斑ジス
トロフィおよび錐体杆体ジストロフィに関与していると考えられる。
【００２５】 ＫＣＮＱ５がこれらの３つの疾患に関与しているはずであることは、ＫＣＮＱ
５が、骨格筋内で発現されることに加えて主として網膜および脳内で発現される
ことを示すその発現パターン（図３Ａ〜Ｂを参照されたい）と符合する。シュタ
ルガルト様黄斑ジストロフィおよび錐体杆体ジストロフィは遺伝性網膜疾患であ
り、一方、サラ病は、早発性精神運動遅滞および運動失調により特徴づけられる
障害である。
５が、骨格筋内で発現されることに加えて主として網膜および脳内で発現される
ことを示すその発現パターン（図３Ａ〜Ｂを参照されたい）と符合する。シュタ
ルガルト様黄斑ジストロフィおよび錐体杆体ジストロフィは遺伝性網膜疾患であ
り、一方、サラ病は、早発性精神運動遅滞および運動失調により特徴づけられる
障害である。
【００２６】 生物情報科学分析は、一群の電位依存性カリウムチャンネル（ＫＣＮＱ１、Ｋ
ＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ４；図４Ａ〜Ｂを参照されたい）に対する
ＫＣＮＱ５タンパク質の顕著な相同性を示した。これらのカリウムチャンネルの
典型的なアミノ酸モチーフのすべてはＫＣＮＱ５において保存されている。Ｋｙ
ｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅアルゴリズム分析は、このカリウムチャンネル群に典
型的なＫＣＮＱ５の膜貫通組織を予測している。カリウムチャンネルのこのファ
ミリーのメンバーにおける突然変異は遺伝病を引き起こすことが示されている（
ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３、てんかん［Ｂｉｅｒｖｅｒｔら，１９９８，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７９：４０３−４０６；Ｓｉｎｇｈら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔ．１８：２５−２９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ １９
９８，３９６：６８７−６９０］；ＫＣＮＱ４、ある形態の非症候群性優性難聴
［Ｋｕｂｉｓｃｈら，１９９９，Ｃｅｌｌ ９６：４３７−４４６］、ＫＣＮＱ
１、心臓不整脈および突然死を引き起こす先天性ＱＴ延長症候群［Ｓｐｌａｗｓ
ｋｉら，１９９７，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：１５６２−１５６７］）
。
ＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ４；図４Ａ〜Ｂを参照されたい）に対する
ＫＣＮＱ５タンパク質の顕著な相同性を示した。これらのカリウムチャンネルの
典型的なアミノ酸モチーフのすべてはＫＣＮＱ５において保存されている。Ｋｙ
ｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅアルゴリズム分析は、このカリウムチャンネル群に典
型的なＫＣＮＱ５の膜貫通組織を予測している。カリウムチャンネルのこのファ
ミリーのメンバーにおける突然変異は遺伝病を引き起こすことが示されている（
ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３、てんかん［Ｂｉｅｒｖｅｒｔら，１９９８，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７９：４０３−４０６；Ｓｉｎｇｈら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔ．１８：２５−２９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ １９
９８，３９６：６８７−６９０］；ＫＣＮＱ４、ある形態の非症候群性優性難聴
［Ｋｕｂｉｓｃｈら，１９９９，Ｃｅｌｌ ９６：４３７−４４６］、ＫＣＮＱ
１、心臓不整脈および突然死を引き起こす先天性ＱＴ延長症候群［Ｓｐｌａｗｓ
ｋｉら，１９９７，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：１５６２−１５６７］）
。
【００２７】 本発明は、他の核酸を実質的に含有しないＫＣＮＱ５をコードするＤＮＡを提
供する。本発明はまた、ＫＣＮＱ５をコードする組換えＤＮＡ分子を提供する。
本発明は、配列番号１として図１に示すヌクレオチド配列を含む、他の核酸を実
質的に含有しないＤＮＡ分子を提供する。配列番号１の分析は、このゲノム配列
が、１４個のエキソンを有する遺伝子を定めることを示した。これらのエキソン
は、ひとまとめに、８４６アミノ酸のタンパク質をコードするオープンリーディ
ングフレームを有する。
供する。本発明はまた、ＫＣＮＱ５をコードする組換えＤＮＡ分子を提供する。
本発明は、配列番号１として図１に示すヌクレオチド配列を含む、他の核酸を実
質的に含有しないＤＮＡ分子を提供する。配列番号１の分析は、このゲノム配列
が、１４個のエキソンを有する遺伝子を定めることを示した。これらのエキソン
は、ひとまとめに、８４６アミノ酸のタンパク質をコードするオープンリーディ
ングフレームを有する。
【００２８】 本発明は、ＫＣＮＱ５タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。そのようなｃ
ＤＮＡを配列番号２として図２に示す。したがって、本発明は、ヌクレオチド配
列配列番号２を含むＤＮＡを含む。該ＤＮＡは、単離可能であり、あるいは他の
ＤＮＡ配列を実質的に含有しない。
ＤＮＡを配列番号２として図２に示す。したがって、本発明は、ヌクレオチド配
列配列番号２を含むＤＮＡを含む。該ＤＮＡは、単離可能であり、あるいは他の
ＤＮＡ配列を実質的に含有しない。
【００２９】 本発明は、配列番号２のコード領域を含む、他の核酸を実質的に含有しないＤ
ＮＡ分子を含む。したがって、本発明は、配列番号２の１３８〜２，６７５位を
含む配列を有する、他の核酸を実質的に含有しないＤＮＡ分子を含む。また、配
列番号２の１３８〜２，６７５位を含むヌクレオチド配列を有する組換えＤＮＡ
分子、および配列番号２の１３８〜２，６７５位を含むヌクレオチド配列を有す
る単離されたＤＮＡ分子が含まれる。
ＮＡ分子を含む。したがって、本発明は、配列番号２の１３８〜２，６７５位を
含む配列を有する、他の核酸を実質的に含有しないＤＮＡ分子を含む。また、配
列番号２の１３８〜２，６７５位を含むヌクレオチド配列を有する組換えＤＮＡ
分子、および配列番号２の１３８〜２，６７５位を含むヌクレオチド配列を有す
る単離されたＤＮＡ分子が含まれる。
【００３０】 ＫＣＮＱ５をコードする本発明の新規ＤＮＡ配列は、全体的または部分的に、
他のＤＮＡ配列（すなわち、ＫＣＮＱ５が天然では結合していないＤＮＡ配列）
に結合して、ＫＣＮＱ５をコードする「組換えＤＮＡ分子」を形成しうる。その
ような他の配列は、転写または翻訳を制御するＤＮＡ配列、例えば、翻訳開始配
列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーター、転写または翻訳終結配列、エンハ
ンサー配列、微生物における複製を制御する配列、抗生物質耐性を付与する配列
またはポリペプチド「タグ」（例えば、ポリヒスチジン領域またはｍｙｃエピト
ープ）をコードする配列を含みうる。本発明の新規ＤＮＡ配列は、プラスミド、
コスミド、ウイルスベクター、Ｐ１人工染色体、酵母人工染色体などのベクター
内に挿入することができる。
他のＤＮＡ配列（すなわち、ＫＣＮＱ５が天然では結合していないＤＮＡ配列）
に結合して、ＫＣＮＱ５をコードする「組換えＤＮＡ分子」を形成しうる。その
ような他の配列は、転写または翻訳を制御するＤＮＡ配列、例えば、翻訳開始配
列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーター、転写または翻訳終結配列、エンハ
ンサー配列、微生物における複製を制御する配列、抗生物質耐性を付与する配列
またはポリペプチド「タグ」（例えば、ポリヒスチジン領域またはｍｙｃエピト
ープ）をコードする配列を含みうる。本発明の新規ＤＮＡ配列は、プラスミド、
コスミド、ウイルスベクター、Ｐ１人工染色体、酵母人工染色体などのベクター
内に挿入することができる。
【００３１】 本発明には、配列番号１または配列番号２の少なくとも１つにストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列が含まれる。例えば、高いストリン
ジェンシーの条件を用いる方法は、以下のとおりであるが、それらに限定される
ものではない。ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、
６×ＳＳＣ、５×デンハルト液および１００μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡを含
むバッファー中、６５℃で２時間〜一晩行なう。１００μｇ／ｍｌ変性サケ***
ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイ
ブリダイゼーション混合物中、フィルターを６５℃で１２〜４８時間ハイブリダ
イズさせる。２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間
、フィルターの洗浄を行なう。この後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５
０℃で４５分間の洗浄を行ない、ついでオートラジオグラフィーに付す。
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列が含まれる。例えば、高いストリン
ジェンシーの条件を用いる方法は、以下のとおりであるが、それらに限定される
ものではない。ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、
６×ＳＳＣ、５×デンハルト液および１００μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡを含
むバッファー中、６５℃で２時間〜一晩行なう。１００μｇ／ｍｌ変性サケ***
ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイ
ブリダイゼーション混合物中、フィルターを６５℃で１２〜４８時間ハイブリダ
イズさせる。２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間
、フィルターの洗浄を行なう。この後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５
０℃で４５分間の洗浄を行ない、ついでオートラジオグラフィーに付す。
【００３２】 高いストリンジェンシーの条件を用いる他の方法は、５×ＳＳＣ、５×デンハ
ルト液、５０％ホルムアミド中、４２℃で１２〜４８時間行なうハイブリダイゼ
ーション工程、または０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、６５℃で３０〜６
０分間行なう洗浄工程を含むであろう。
ルト液、５０％ホルムアミド中、４２℃で１２〜４８時間行なうハイブリダイゼ
ーション工程、または０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、６５℃で３０〜６
０分間行なう洗浄工程を含むであろう。
【００３３】 高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを行なうための前記方法で
挙げた試薬は当技術分野でよく知られている。これらの試薬の組成の詳細は、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓに記載されている。前記のもの以外の使用しうる他の高いストリンジ
ェンシー条件は当技術分野でよく知られている。
挙げた試薬は当技術分野でよく知られている。これらの試薬の組成の詳細は、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓに記載されている。前記のもの以外の使用しうる他の高いストリンジ
ェンシー条件は当技術分野でよく知られている。
【００３４】 遺伝暗号の縮重性のため、２種のアミノ酸を除く全てのアミノ酸に関しては、
２以上のコドンが特定のアミノ酸をコードする。このため、配列番号２のヌクレ
オチド配列とは有意に異なるが配列番号２と同じＫＣＮＱ５タンパク質を尚もコ
ードする合成ＤＮＡヌクレオチド配列を有するＫＣＮＱ５タンパク質コード化合
成ＤＮＡの構築が可能となる。そのような合成ＤＮＡは本発明の範囲内にあると
意図される。
２以上のコドンが特定のアミノ酸をコードする。このため、配列番号２のヌクレ
オチド配列とは有意に異なるが配列番号２と同じＫＣＮＱ５タンパク質を尚もコ
ードする合成ＤＮＡヌクレオチド配列を有するＫＣＮＱ５タンパク質コード化合
成ＤＮＡの構築が可能となる。そのような合成ＤＮＡは本発明の範囲内にあると
意図される。
【００３５】 配列番号１または配列番号２の突然変異形態は本発明の範囲内にあると意図さ
れる。特に、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ
病または老人性黄斑変性を引き起こす配列番号１または配列番号２の突然変異形
態は本発明の範囲内にあると意図される。
れる。特に、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ
病または老人性黄斑変性を引き起こす配列番号１または配列番号２の突然変異形
態は本発明の範囲内にあると意図される。
【００３６】 本発明のもう１つの態様は、ＫＣＮＱ５タンパク質をコードするＤＮＡ配列を
含有および／または発現するように操作された宿主細胞を含む。ＫＣＮＱ５タン
パク質を産生させるために、そのような組換え宿主細胞を適当な条件下で培養す
ることができる。組換え宿主細胞内でＫＣＮＱ５タンパク質を発現させるために
、ＫＣＮＱ５タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを使用する
ことができる。組換え宿主細胞は、原核性または真核性であることが可能であり
、それらには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト
、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類由来の細胞系を含む（これらに限定されるも
のではない）哺乳類細胞、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞などの両生類
細胞、およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコに由来す
る細胞系を含む（これらに限定されるものではない）昆虫細胞が含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。ＫＣＮＱ５タンパク質の組換え発現に適した広
く入手可能な細胞および細胞系には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−
７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）
、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ １７１）、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜色素上皮（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−
２３０２）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞およびツメガエル（Ｘｅｎ
ｏｐｕｓ）卵母細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
含有および／または発現するように操作された宿主細胞を含む。ＫＣＮＱ５タン
パク質を産生させるために、そのような組換え宿主細胞を適当な条件下で培養す
ることができる。組換え宿主細胞内でＫＣＮＱ５タンパク質を発現させるために
、ＫＣＮＱ５タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを使用する
ことができる。組換え宿主細胞は、原核性または真核性であることが可能であり
、それらには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト
、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類由来の細胞系を含む（これらに限定されるも
のではない）哺乳類細胞、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞などの両生類
細胞、およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコに由来す
る細胞系を含む（これらに限定されるものではない）昆虫細胞が含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。ＫＣＮＱ５タンパク質の組換え発現に適した広
く入手可能な細胞および細胞系には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−
７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）
、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ １７１）、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜色素上皮（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−
２３０２）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞およびツメガエル（Ｘｅｎ
ｏｐｕｓ）卵母細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】 哺乳類細胞内で組換えＫＣＮＱ５を発現させるためには、種々の哺乳類発現ベ
クターを使用することができる。商業的に入手可能な適当な哺乳類発現ベクター
には、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩおよびｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３
．１、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ａ
ＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐ
ｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶ
ｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）お
よびｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）が含まれるが、これらに限定
されるものではない。もう１つの適当なベクターとしては、ＰＴ７ＴＳ卵母細胞
発現ベクターが挙げられる。組換え細胞内での発現後、ＫＣＮＱ５を、通常の技
術により、他のタンパク質を実質的に含有しないレベルにまで精製することがで
きる。
クターを使用することができる。商業的に入手可能な適当な哺乳類発現ベクター
には、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩおよびｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３
．１、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ａ
ＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐ
ｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶ
ｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）お
よびｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）が含まれるが、これらに限定
されるものではない。もう１つの適当なベクターとしては、ＰＴ７ＴＳ卵母細胞
発現ベクターが挙げられる。組換え細胞内での発現後、ＫＣＮＱ５を、通常の技
術により、他のタンパク質を実質的に含有しないレベルにまで精製することがで
きる。
【００３８】 ある種の電位依存性カリウムチャンネルサブユニットは、高レベルで適切に発
現され膜内に挿入されるためには、「シャペロン」としての他の電位依存性カリ
ウムチャンネルサブユニットの発現を要する。例えば、ＫＣＮＱ３の共発現は、
ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫＣＮＱ２の発現を増強するら
しい（Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３）
。また、いくつかの電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１αサブユニットは他の
関連αサブユニットまたはＫｖβ２サブユニットを要する（Ｓｈｉら，１９９５
，Ｎｅｕｒｏｎ １６：８４３−８５２）。したがって、ＫＣＮＱ５タンパク質
の組換え発現は、他の電位依存性カリウムチャンネルタンパク質の共発現から利
益が得られる何らかの条件下であることが可能であり、そのような共発現は本発
明の範囲内と意図される。
現され膜内に挿入されるためには、「シャペロン」としての他の電位依存性カリ
ウムチャンネルサブユニットの発現を要する。例えば、ＫＣＮＱ３の共発現は、
ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫＣＮＱ２の発現を増強するら
しい（Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３）
。また、いくつかの電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１αサブユニットは他の
関連αサブユニットまたはＫｖβ２サブユニットを要する（Ｓｈｉら，１９９５
，Ｎｅｕｒｏｎ １６：８４３−８５２）。したがって、ＫＣＮＱ５タンパク質
の組換え発現は、他の電位依存性カリウムチャンネルタンパク質の共発現から利
益が得られる何らかの条件下であることが可能であり、そのような共発現は本発
明の範囲内と意図される。
【００３９】 本発明は、他のタンパク質を実質的に含有しないＫＣＮＱ５タンパク質を含む
。完全長ＫＣＮＱ５タンパク質のアミノ酸配列を、図２に配列番号３として示す
。したがって、本発明は、アミノ酸配列配列番号３を有し他のタンパク質を実質
的に含有しないＫＣＮＱ５タンパク質を含む。本発明はまた、アミノ酸配列配列
番号３を有する単離されたＫＣＮＱ５タンパク質を含む。
。完全長ＫＣＮＱ５タンパク質のアミノ酸配列を、図２に配列番号３として示す
。したがって、本発明は、アミノ酸配列配列番号３を有し他のタンパク質を実質
的に含有しないＫＣＮＱ５タンパク質を含む。本発明はまた、アミノ酸配列配列
番号３を有する単離されたＫＣＮＱ５タンパク質を含む。
【００４０】 ＫＣＮＱ５タンパク質の突然変異形態は本発明の範囲内にあると意図される。
特に、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病また
は老人性黄斑変性を引き起こす配列番号３の突然変異形態は本発明の範囲内であ
る。
特に、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病また
は老人性黄斑変性を引き起こす配列番号３の突然変異形態は本発明の範囲内であ
る。
【００４１】 多数の受容体タンパク質の場合と同様、ＫＣＮＱ５のアミノ酸の多数を修飾し
、それでもなお、元のタンパク質と実質的に同じ生物活性を保有させることが可
能である。したがって、本発明は、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが
ＫＣＮＱ５と実質的に同じ生物活性を依然として保有する修飾されたＫＣＮＱ５
タンパク質を含む。単一のアミノ酸の置換は通常はタンパク質の生物活性を改変
しないことが、一般に認められている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ，Ｗａｔｓｏｎら，１９８７，第４版，Ｔｈｅ
Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉ
ｎｃ．，ｐ．２２６；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＆ Ｗｅｌｌｓ，１９８９
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５を参照されたい）。したがって
、本発明は、配列番号３において１つのアミノ酸置換が施されておりＫＣＮＱ５
と実質的に同じ生物活性を依然として保有するポリペプチドを含む。本発明はま
た、配列番号３において２以上のアミノ酸置換が施されておりＫＣＮＱ５と実質
的に同じ生物活性を依然として保有するポリペプチドを含む。特に、本発明は、
前記置換が同類置換である実施形態を含む。特に、本発明は、ＫＣＮＱ５中に存
在するアミノ酸がＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３またはＫＣＮＱ４（図４
Ａ〜Ｂを参照されたい）のいずれか１つの対応位置にも存在する位置には前記置
換が存在しない実施形態を含む。
、それでもなお、元のタンパク質と実質的に同じ生物活性を保有させることが可
能である。したがって、本発明は、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが
ＫＣＮＱ５と実質的に同じ生物活性を依然として保有する修飾されたＫＣＮＱ５
タンパク質を含む。単一のアミノ酸の置換は通常はタンパク質の生物活性を改変
しないことが、一般に認められている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ，Ｗａｔｓｏｎら，１９８７，第４版，Ｔｈｅ
Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉ
ｎｃ．，ｐ．２２６；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＆ Ｗｅｌｌｓ，１９８９
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５を参照されたい）。したがって
、本発明は、配列番号３において１つのアミノ酸置換が施されておりＫＣＮＱ５
と実質的に同じ生物活性を依然として保有するポリペプチドを含む。本発明はま
た、配列番号３において２以上のアミノ酸置換が施されておりＫＣＮＱ５と実質
的に同じ生物活性を依然として保有するポリペプチドを含む。特に、本発明は、
前記置換が同類置換である実施形態を含む。特に、本発明は、ＫＣＮＱ５中に存
在するアミノ酸がＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３またはＫＣＮＱ４（図４
Ａ〜Ｂを参照されたい）のいずれか１つの対応位置にも存在する位置には前記置
換が存在しない実施形態を含む。
【００４２】 本発明のＫＣＮＱ５タンパク質は、翻訳後修飾、例えば、共有結合した炭水化
物、リン酸化、ミリストイル化などを含有しうる。
物、リン酸化、ミリストイル化などを含有しうる。
【００４３】 本発明はまた、キメラＫＣＮＱ５タンパク質を含む。キメラＫＣＮＱ５タンパ
ク質は、非ＫＣＮＱ５タンパク質のポリペプチド配列に融合したＫＣＮＱ５タン
パク質の一部の少なくとも１つの連続的ポリペプチド配列よりなる。
ク質は、非ＫＣＮＱ５タンパク質のポリペプチド配列に融合したＫＣＮＱ５タン
パク質の一部の少なくとも１つの連続的ポリペプチド配列よりなる。
【００４４】 本発明はまた、ＫＣＮＱ５タンパク質およびＫＣＮＱ５ ＤＮＡの単離された
形態を含む。「単離（された）」なる語の使用は、ＫＣＮＱ５タンパク質または
ＫＣＮＱ５ ＤＮＡが、その通常の細胞環境から取り出されていることを示す。
したがって、単離されたＫＣＮＱ５タンパク質は無細胞溶液中に存在していたり
、あるいはそれが天然に存在する場合の環境とは異なる細胞環境中に存在しうる
。単離（された）なる語は、単離されたＫＣＮＱ５タンパク質が、存在する唯一
のタンパク質であることを意味するものではなく、単離されたＫＣＮＱ５タンパ
ク質が、該ＫＣＮＱ５タンパク質に天然で付随する非アミノ酸物質（例えば、核
酸、脂質、炭水化物）から少なくとも９５％フリーであることを意味する。例え
ば、ＫＣＮＱ５タンパク質のうち、それを天然（すなわち、ヒトの介入の不存在
下）では発現しない細菌内または更には真核細胞内で組換え手段により発現され
たものは、「単離されたＫＣＮＱ５タンパク質」である。
形態を含む。「単離（された）」なる語の使用は、ＫＣＮＱ５タンパク質または
ＫＣＮＱ５ ＤＮＡが、その通常の細胞環境から取り出されていることを示す。
したがって、単離されたＫＣＮＱ５タンパク質は無細胞溶液中に存在していたり
、あるいはそれが天然に存在する場合の環境とは異なる細胞環境中に存在しうる
。単離（された）なる語は、単離されたＫＣＮＱ５タンパク質が、存在する唯一
のタンパク質であることを意味するものではなく、単離されたＫＣＮＱ５タンパ
ク質が、該ＫＣＮＱ５タンパク質に天然で付随する非アミノ酸物質（例えば、核
酸、脂質、炭水化物）から少なくとも９５％フリーであることを意味する。例え
ば、ＫＣＮＱ５タンパク質のうち、それを天然（すなわち、ヒトの介入の不存在
下）では発現しない細菌内または更には真核細胞内で組換え手段により発現され
たものは、「単離されたＫＣＮＱ５タンパク質」である。
【００４５】 ＫＣＮＱ５が属するカリウムチャンネルのファミリーの他のメンバーは相互作
用してヘテロマー構造を形成し、それにより機能的カリウムチャンネルを与える
ことが公知である。例えば、ＫＣＮＱ２とＫＣＮＱ３とが集合してヘテロマー機
能的カリウムチャンネルを形成しうる（Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２８２：１８９０−１８９３）。したがって、ＫＣＮＱ５も他のタンパク質と
共に、機能的カリウムチャンネルを構成するヘテロマー構造を形成しうる可能性
があると考えられる。したがって、本発明は、ＫＣＮＱ５を含むそのようなヘテ
ロマーを含む。好ましいヘテロマーは、ＫＣＮＱ５がＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ２、
ＫＣＮＱ３またはＫＣＮＱ４の少なくとも１つとヘテロマーを形成しているもの
である。
用してヘテロマー構造を形成し、それにより機能的カリウムチャンネルを与える
ことが公知である。例えば、ＫＣＮＱ２とＫＣＮＱ３とが集合してヘテロマー機
能的カリウムチャンネルを形成しうる（Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２８２：１８９０−１８９３）。したがって、ＫＣＮＱ５も他のタンパク質と
共に、機能的カリウムチャンネルを構成するヘテロマー構造を形成しうる可能性
があると考えられる。したがって、本発明は、ＫＣＮＱ５を含むそのようなヘテ
ロマーを含む。好ましいヘテロマーは、ＫＣＮＱ５がＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ２、
ＫＣＮＱ３またはＫＣＮＱ４の少なくとも１つとヘテロマーを形成しているもの
である。
【００４６】 完全長ＫＣＮＱ５をコードするｃＤＮＡ断片は、適当なプライマー対を使用す
るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより適当なヒト網膜または脳
ｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。そのようなプライマー対は、
図２に配列番号２として示すＫＣＮＱ５のｃＤＮＡ配列に基づいて選択すること
ができる。適当なプライマー対としては、以下のものが挙げられるであろう： ５’−ＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＡＴＧＡＧＣＣ−３’（配列番号９）および ５’−ＧＡＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＡＧＴＴＴＧＡ−３’（配列番号１０）。
るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより適当なヒト網膜または脳
ｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。そのようなプライマー対は、
図２に配列番号２として示すＫＣＮＱ５のｃＤＮＡ配列に基づいて選択すること
ができる。適当なプライマー対としては、以下のものが挙げられるであろう： ５’−ＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＡＴＧＡＧＣＣ−３’（配列番号９）および ５’−ＧＡＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＡＧＴＴＴＧＡ−３’（配列番号１０）。
【００４７】 前記プライマーは例示的なものであるにすぎない。当業者は、配列番号２に基
づき、他の適当なプライマーを容易に設計しうると認識するであろう。そのよう
なプライマーは、当業者によく知られたオリゴヌクレオチド合成方法により製造
されうるであろう。
づき、他の適当なプライマーを容易に設計しうると認識するであろう。そのよう
なプライマーは、当業者によく知られたオリゴヌクレオチド合成方法により製造
されうるであろう。
【００４８】 ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄまたはＶｅｎｔポリメラーゼ
を含む（これらに限定されるものではない）種々の耐熱性酵素でＰＣＲ反応を行
なうことができる。ＡｍｐｌｉＴａｑの場合には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，
ｐＨ８．３、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．２μＭの各プライマー、１０ｎｇのＤＮＡ鋳型、０．０５単位／μｌ
のＡｍｐｌｉＴａｑ中で反応を行なうことができる。該反応を９５℃で３分間加
熱し、ついで９５℃で２０秒間、６２℃で２０秒間、７２℃で３分間のサイクリ
ングパラメーターを用いる３５サイクルに付す。これらの条件に加えて、適当な
種々のＰＣＲプロトコールがＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃ．Ｗ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓ
ｌｅｒ編，１９９５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、またはＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔ ｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ，Ｍｉｃｈａｅｌら編
，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
を含む（これらに限定されるものではない）種々の耐熱性酵素でＰＣＲ反応を行
なうことができる。ＡｍｐｌｉＴａｑの場合には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，
ｐＨ８．３、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．２μＭの各プライマー、１０ｎｇのＤＮＡ鋳型、０．０５単位／μｌ
のＡｍｐｌｉＴａｑ中で反応を行なうことができる。該反応を９５℃で３分間加
熱し、ついで９５℃で２０秒間、６２℃で２０秒間、７２℃で３分間のサイクリ
ングパラメーターを用いる３５サイクルに付す。これらの条件に加えて、適当な
種々のＰＣＲプロトコールがＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃ．Ｗ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓ
ｌｅｒ編，１９９５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、またはＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔ ｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ，Ｍｉｃｈａｅｌら編
，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００４９】 ＫＣＮＱ５をコードするクローンが単離されうる適当なｃＤＮＡライブラリー
としては、ラムダｇｔ１０またはラムダｇｔ１１ベクター中のヒト網膜５’伸長
ｃＤＮＡライブラリー（カタログ番号ＨＬ１１４３ａおよびＨＬ１１３２ｂ，Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）またはヒト胎児脳５’伸長＋ｃＤ
ＮＡライブラリー（カタログ番号ＨＬ５０２４ｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）が挙げられるであろう。そのようなライブラリーの一次クロ
ーンをプールに細分することができ（各プールは約２０，０００個のクローンを
含有する）、各プールを別々に増幅することができる。
としては、ラムダｇｔ１０またはラムダｇｔ１１ベクター中のヒト網膜５’伸長
ｃＤＮＡライブラリー（カタログ番号ＨＬ１１４３ａおよびＨＬ１１３２ｂ，Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）またはヒト胎児脳５’伸長＋ｃＤ
ＮＡライブラリー（カタログ番号ＨＬ５０２４ｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）が挙げられるであろう。そのようなライブラリーの一次クロ
ーンをプールに細分することができ（各プールは約２０，０００個のクローンを
含有する）、各プールを別々に増幅することができる。
【００５０】 この方法により、８４６アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号
３）をコードするｃＤＮＡ断片を得ることができる。このｃＤＮＡ断片を、適当
なクローニングベクターまたは発現ベクター内にクローニングすることができる
。例えば、該断片を、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内にクローニングすることができる。ついで
ＫＣＮＱ５またはその一部をコードする発現ベクターを適当な宿主細胞内に導入
し、該宿主細胞を適当な条件下で増殖させることにより、ＫＣＮＱ５タンパク質
を産生させることができる。ついで、当技術分野でよく知られた方法により、Ｋ
ＣＮＱ５タンパク質を単離することができる。
３）をコードするｃＤＮＡ断片を得ることができる。このｃＤＮＡ断片を、適当
なクローニングベクターまたは発現ベクター内にクローニングすることができる
。例えば、該断片を、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内にクローニングすることができる。ついで
ＫＣＮＱ５またはその一部をコードする発現ベクターを適当な宿主細胞内に導入
し、該宿主細胞を適当な条件下で増殖させることにより、ＫＣＮＱ５タンパク質
を産生させることができる。ついで、当技術分野でよく知られた方法により、Ｋ
ＣＮＱ５タンパク質を単離することができる。
【００５１】 前記ＰＣＲ法に代わる方法としては、オリゴヌクレオチドプローブでｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングするための当技術分野でよく知られた方法を用い
ＫＣＮＱ５に特異的なオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、ＫＣＮＱ
５をコードするｃＤＮＡクローンをｃＤＮＡライブラリーから単離することがで
きる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（編），１９
８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，
ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩに
記載されている。ＫＣＮＱ５に特異的でｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
に使用されうるオリゴヌクレオチドは、図２に配列番号２として示すＫＣＮＱ５
のｃＤＮＡ配列に基づき容易に設計することができ、当技術分野でよく知られた
方法により合成することができる。
ライブラリーをスクリーニングするための当技術分野でよく知られた方法を用い
ＫＣＮＱ５に特異的なオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、ＫＣＮＱ
５をコードするｃＤＮＡクローンをｃＤＮＡライブラリーから単離することがで
きる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（編），１９
８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，
ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩに
記載されている。ＫＣＮＱ５に特異的でｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
に使用されうるオリゴヌクレオチドは、図２に配列番号２として示すＫＣＮＱ５
のｃＤＮＡ配列に基づき容易に設計することができ、当技術分野でよく知られた
方法により合成することができる。
【００５２】 ＫＣＮＱ５遺伝子を含有するゲノムクローンは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから商業的に入手可能なヒトＰＡＣまた
はＢＡＣライブラリーから得ることができる。ＫＣＮＱ５遺伝子を含有するＰＡ
Ｃクローン（例えば、ＰＡＣ１４１Ｂ１、ＰＡＣ２２４Ｈ２３）は、Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから商業的に入手可能
である（個々のＰＡＣクローンのカタログ番号はＲＰＣＩ．Ｃである）。あるい
は、本明細書に開示するＫＣＮＱ５配列に基づくプローブを使用して、ＫＣＮＱ
５含有ゲノムクローンが単離されうるゲノムライブラリー（特に、Ｐ１人工染色
体ベクター中のもの）を調製することができる。そのようなライブラリーの調製
方法は当技術分野で公知である（Ｉｏａｎｎｏｕら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔ．６：８４−８９）。
ｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから商業的に入手可能なヒトＰＡＣまた
はＢＡＣライブラリーから得ることができる。ＫＣＮＱ５遺伝子を含有するＰＡ
Ｃクローン（例えば、ＰＡＣ１４１Ｂ１、ＰＡＣ２２４Ｈ２３）は、Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから商業的に入手可能
である（個々のＰＡＣクローンのカタログ番号はＲＰＣＩ．Ｃである）。あるい
は、本明細書に開示するＫＣＮＱ５配列に基づくプローブを使用して、ＫＣＮＱ
５含有ゲノムクローンが単離されうるゲノムライブラリー（特に、Ｐ１人工染色
体ベクター中のもの）を調製することができる。そのようなライブラリーの調製
方法は当技術分野で公知である（Ｉｏａｎｎｏｕら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔ．６：８４−８９）。
【００５３】 本発明の新規ＤＮＡ配列は、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジ
ストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性に関する種々の診断方法において使用
することができる。本発明は、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジ
ストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性に対する素因を患者に与えるＫＣＮＱ
５遺伝子中の突然変異を該患者が保持するか否かを判定するための診断方法を提
供する。広い意味では、そのような方法は、該患者からのＫＣＮＱ５遺伝子の領
域のＤＮＡ配列を決定し、その配列を、非罹患者（すなわち、シュタルガルト様
黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性を罹患
していない者）からのＫＣＮＱ５遺伝子の対応領域からの配列と比較することを
含み、該患者からのＫＣＮＱ５遺伝子のＤＮＡ配列と該非罹患者からのＫＣＮＱ
５遺伝子のＤＮＡ配列との配列における相違は、該患者がシュタルガルト様黄斑
ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性を有するこ
とを示す。
ストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性に関する種々の診断方法において使用
することができる。本発明は、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジ
ストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性に対する素因を患者に与えるＫＣＮＱ
５遺伝子中の突然変異を該患者が保持するか否かを判定するための診断方法を提
供する。広い意味では、そのような方法は、該患者からのＫＣＮＱ５遺伝子の領
域のＤＮＡ配列を決定し、その配列を、非罹患者（すなわち、シュタルガルト様
黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性を罹患
していない者）からのＫＣＮＱ５遺伝子の対応領域からの配列と比較することを
含み、該患者からのＫＣＮＱ５遺伝子のＤＮＡ配列と該非罹患者からのＫＣＮＱ
５遺伝子のＤＮＡ配列との配列における相違は、該患者がシュタルガルト様黄斑
ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性を有するこ
とを示す。
【００５４】 そのような診断方法は種々の様態で行なうことができる。例えば、１つの実施
形態は、 （ａ）ＫＣＮＱ５遺伝子の領域からのＰＣＲプライマーを準備し、 （ｂ）該患者からのＤＮＡサンプル上でＰＣＲを行なって、該患者からのＰＣ
Ｒ断片を得、 （ｃ）配列番号１および配列番号２よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列
を含む対照ＤＮＡサンプル上でＰＣＲを行なって、対照ＰＣＲ断片を得、 （ｄ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列、および該対照ＰＣＲ断片
のヌクレオチド配列を決定し、 （ｅ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を該対照ＰＣＲ断片のヌク
レオチド配列と比較することを含み、 該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列と該対照ＰＣＲ断片のヌクレオチ
ド配列との相違は、該患者が、ＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を有し従ってシュ
タルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄
斑変性を有するらしいことを示す。
形態は、 （ａ）ＫＣＮＱ５遺伝子の領域からのＰＣＲプライマーを準備し、 （ｂ）該患者からのＤＮＡサンプル上でＰＣＲを行なって、該患者からのＰＣ
Ｒ断片を得、 （ｃ）配列番号１および配列番号２よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列
を含む対照ＤＮＡサンプル上でＰＣＲを行なって、対照ＰＣＲ断片を得、 （ｄ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列、および該対照ＰＣＲ断片
のヌクレオチド配列を決定し、 （ｅ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を該対照ＰＣＲ断片のヌク
レオチド配列と比較することを含み、 該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列と該対照ＰＣＲ断片のヌクレオチ
ド配列との相違は、該患者が、ＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を有し従ってシュ
タルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄
斑変性を有するらしいことを示す。
【００５５】 特定の実施形態においては、該ＰＣＲプライマーは、患者が突然変異を保持す
ると疑われるＫＣＮＱ５遺伝子領域からのものである。特定の実施形態において
は、該ＰＣＲプライマーは、ＫＣＮＱ５遺伝子のコード領域、すなわち、配列番
号１または配列番号２のコード領域からのものである。特定の実施形態において
は、該ＰＣＲプライマーは、マーカーＤ６Ｓ２８０を含む領域を増幅する。
ると疑われるＫＣＮＱ５遺伝子領域からのものである。特定の実施形態において
は、該ＰＣＲプライマーは、ＫＣＮＱ５遺伝子のコード領域、すなわち、配列番
号１または配列番号２のコード領域からのものである。特定の実施形態において
は、該ＰＣＲプライマーは、マーカーＤ６Ｓ２８０を含む領域を増幅する。
【００５６】 特定の実施形態においては、該患者からのＤＮＡサンプルは、該患者からのＲ
ＮＡサンプルから調製されたｃＤＮＡである。もう１つの実施形態においては、
該患者からのＤＮＡサンプルはゲノムＤＮＡである。特定の実施形態においては
、該対照ＤＮＡサンプルは、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジス
トロフィ、サラ病または老人性黄斑変性を有しない者からのＤＮＡである。
ＮＡサンプルから調製されたｃＤＮＡである。もう１つの実施形態においては、
該患者からのＤＮＡサンプルはゲノムＤＮＡである。特定の実施形態においては
、該対照ＤＮＡサンプルは、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジス
トロフィ、サラ病または老人性黄斑変性を有しない者からのＤＮＡである。
【００５７】 特定の実施形態においては、該患者からのＰＣＲ断片および該対照ＰＣＲ断片
のヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により配列決定する。
のヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により配列決定する。
【００５８】 特定の実施形態においては、該患者からのＰＣＲ断片および該対照ＰＣＲ断片
のヌクレオチド配列を、ＤＮＡ配列決定により、直接比較により比較する。もう
１つの実施形態においては、工程（ｄ）を省略し、工程（ｅ）における比較を、
該患者からのＰＣＲ断片と該対照ＰＣＲ断片とをハイブリダイズさせ次いで該ハ
イブリッド中のいずれかのミスマッチ位置では切断するがそれらの２つの断片が
完全にマッチしている場合には該ハイブリッドを切断しないエンドヌクレアーゼ
を使用することを含む方法により行なう。そのようなエンドヌクレアーゼは、例
えば、Ｓ１である。この実施形態においては、該患者からのＰＣＲ断片から、エ
ンドヌクレアーゼ処理後の、より小さな断片への変換は、該患者がＫＣＮＱ５遺
伝子中に突然変異を保持することを示す。そのような実施形態においては、該患
者からのＰＣＲ断片または該対照ＰＣＲ断片を標識（放射能、酵素的、免疫学的
標識など）するのが有利かもしれない。
のヌクレオチド配列を、ＤＮＡ配列決定により、直接比較により比較する。もう
１つの実施形態においては、工程（ｄ）を省略し、工程（ｅ）における比較を、
該患者からのＰＣＲ断片と該対照ＰＣＲ断片とをハイブリダイズさせ次いで該ハ
イブリッド中のいずれかのミスマッチ位置では切断するがそれらの２つの断片が
完全にマッチしている場合には該ハイブリッドを切断しないエンドヌクレアーゼ
を使用することを含む方法により行なう。そのようなエンドヌクレアーゼは、例
えば、Ｓ１である。この実施形態においては、該患者からのＰＣＲ断片から、エ
ンドヌクレアーゼ処理後の、より小さな断片への変換は、該患者がＫＣＮＱ５遺
伝子中に突然変異を保持することを示す。そのような実施形態においては、該患
者からのＰＣＲ断片または該対照ＰＣＲ断片を標識（放射能、酵素的、免疫学的
標識など）するのが有利かもしれない。
【００５９】 本発明は、患者がＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を保持するか否かを診断する
方法であって、 （ａ）該患者からＲＮＡサンプルを得、 （ｂ）ＫＣＮＱ５遺伝子のコード配列の領域に及ぶプライマーを使用して該Ｒ
ＮＡサンプル上で逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なって、該患者からのＰＣ
Ｒ断片を得（該患者からのＰＣＲ断片は一定の長さを有し、その長さは、ＲＴ−
ＰＣＲで使用するプライマーの種類に左右される）、 （ｃ）配列番号１および配列番号２よりなる群から選ばれる配列を含むＤＮＡ
に対して、またはポリアクリルアミドゲル上で認められうるバンドを与えるのに
十分な程度に長い配列番号１または配列番号２の一部に対して、該ＰＣＲ断片を
ハイブリダイズさせて、ハイブリッドを形成させ、 （ｄ）工程（ｃ）で得られたハイブリッドを、該ハイブリッド中のいずれかの
ミスマッチ位置では切断するがそれらの２つの断片が完全にマッチする場合には
該ハイブリッドを切断しないエンドヌクレアーゼで処理し、 （ｅ）エンドヌクレアーゼ処理後の該患者からのＰＣＲ断片の長さを測定する
ことにより、該エンドヌクレアーゼが該ハイブリッドを切断したか否かを判定す
ることを含んでなり、 エンドヌクレアーゼ処理後の該患者からのＰＣＲ断片の長さの減少が、該患者
がＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を保持することを示すことを特徴とする方法を
提供する。
方法であって、 （ａ）該患者からＲＮＡサンプルを得、 （ｂ）ＫＣＮＱ５遺伝子のコード配列の領域に及ぶプライマーを使用して該Ｒ
ＮＡサンプル上で逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なって、該患者からのＰＣ
Ｒ断片を得（該患者からのＰＣＲ断片は一定の長さを有し、その長さは、ＲＴ−
ＰＣＲで使用するプライマーの種類に左右される）、 （ｃ）配列番号１および配列番号２よりなる群から選ばれる配列を含むＤＮＡ
に対して、またはポリアクリルアミドゲル上で認められうるバンドを与えるのに
十分な程度に長い配列番号１または配列番号２の一部に対して、該ＰＣＲ断片を
ハイブリダイズさせて、ハイブリッドを形成させ、 （ｄ）工程（ｃ）で得られたハイブリッドを、該ハイブリッド中のいずれかの
ミスマッチ位置では切断するがそれらの２つの断片が完全にマッチする場合には
該ハイブリッドを切断しないエンドヌクレアーゼで処理し、 （ｅ）エンドヌクレアーゼ処理後の該患者からのＰＣＲ断片の長さを測定する
ことにより、該エンドヌクレアーゼが該ハイブリッドを切断したか否かを判定す
ることを含んでなり、 エンドヌクレアーゼ処理後の該患者からのＰＣＲ断片の長さの減少が、該患者
がＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を保持することを示すことを特徴とする方法を
提供する。
【００６０】 前記方法の変法においては、エンドヌクレアーゼ処理後の該患者からのＰＣＲ
断片の長さを測定する代わりに、配列番号１および配列番号２よりなる群から選
ばれる配列を含むＤＮＡまたはポリアクリルアミドゲル上で認められうるバンド
を与えるのに十分な程度に長い配列番号１または配列番号２の一部を含むＤＮＡ
の長さを、エンドヌクレアーゼ処理後に測定する。そのような変法においては、
配列番号１および配列番号２よりなる群から選ばれる配列を含むＤＮＡまたはポ
リアクリルアミドゲル上で認められうるバンドを与えるのに十分な程度に長い配
列番号１または配列番号２の一部を含むＤＮＡの長さの減少が、該患者がＫＣＮ
Ｑ５遺伝子中に突然変異を保持することを示す。
断片の長さを測定する代わりに、配列番号１および配列番号２よりなる群から選
ばれる配列を含むＤＮＡまたはポリアクリルアミドゲル上で認められうるバンド
を与えるのに十分な程度に長い配列番号１または配列番号２の一部を含むＤＮＡ
の長さを、エンドヌクレアーゼ処理後に測定する。そのような変法においては、
配列番号１および配列番号２よりなる群から選ばれる配列を含むＤＮＡまたはポ
リアクリルアミドゲル上で認められうるバンドを与えるのに十分な程度に長い配
列番号１または配列番号２の一部を含むＤＮＡの長さの減少が、該患者がＫＣＮ
Ｑ５遺伝子中に突然変異を保持することを示す。
【００６１】 本発明は、患者がＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を有するか否かを診断する方
法であって、 （ａ）該患者からのＲＮＡサンプルからｃＤＮＡを調製し、 （ｂ）配列番号１または配列番号２に基づき１組のＰＣＲプライマーを準備し
、 （ｃ）該ｃＤＮＡ上でＰＣＲを行なって、該患者からのＰＣＲ断片を得、 （ｄ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を決定し、 （ｅ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を配列番号１または配列番
号２のヌクレオチド配列と比較することを含んでなり、 該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列と配列番号１または配列番号２の
ヌクレオチド配列との相違が、該患者が該ＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を有す
ることを示すことを特徴とする方法を提供する。
法であって、 （ａ）該患者からのＲＮＡサンプルからｃＤＮＡを調製し、 （ｂ）配列番号１または配列番号２に基づき１組のＰＣＲプライマーを準備し
、 （ｃ）該ｃＤＮＡ上でＰＣＲを行なって、該患者からのＰＣＲ断片を得、 （ｄ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を決定し、 （ｅ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を配列番号１または配列番
号２のヌクレオチド配列と比較することを含んでなり、 該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列と配列番号１または配列番号２の
ヌクレオチド配列との相違が、該患者が該ＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を有す
ることを示すことを特徴とする方法を提供する。
【００６２】 本発明は、患者がＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を有するか否かを診断する方
法であって、 （ａ）該患者からのゲノムＤＮＡを調製し、 （ｂ）配列番号１または配列番号２に基づき１組のＰＣＲプライマーを準備し
、 （ｃ）該ゲノムＤＮＡ上でＰＣＲを行なって、該患者からのＰＣＲ断片を得、 （ｄ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を決定し、 （ｅ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を配列番号１または配列番
号２のヌクレオチド配列と比較することを含んでなり、 該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列と配列番号１または配列番号２の
ヌクレオチド配列との相違が、該患者が該ＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を有す
ることを示すことを特徴とする方法を提供する。
法であって、 （ａ）該患者からのゲノムＤＮＡを調製し、 （ｂ）配列番号１または配列番号２に基づき１組のＰＣＲプライマーを準備し
、 （ｃ）該ゲノムＤＮＡ上でＰＣＲを行なって、該患者からのＰＣＲ断片を得、 （ｄ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を決定し、 （ｅ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を配列番号１または配列番
号２のヌクレオチド配列と比較することを含んでなり、 該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列と配列番号１または配列番号２の
ヌクレオチド配列との相違が、該患者が該ＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を有す
ることを示すことを特徴とする方法を提供する。
【００６３】 本発明はまた、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、
サラ病または老人性黄斑変性に関する診断方法において使用しうる、配列番号１
または配列番号２の配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを提供する。特に
、本発明は、配列番号１および配列番号２よりなる群から選ばれる配列の少なく
とも約１０、１５または１８個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌク
レオチドを含み、該オリゴヌクレオチドプローブは、前記の少なくとも約１０、
１５または１８個の連続したヌクレオチド以外は、配列番号１および配列番号２
よりなる群から選ばれる配列の５個を超える連続したヌクレオチドの伸長を含ま
ない。該オリゴヌクレオチドは、他の核酸を実質的に含有しないことが可能であ
る。本発明はまた、対応ＲＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。該ＤＮＡまたは
ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、キット中にパッケージ化されうる。
サラ病または老人性黄斑変性に関する診断方法において使用しうる、配列番号１
または配列番号２の配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを提供する。特に
、本発明は、配列番号１および配列番号２よりなる群から選ばれる配列の少なく
とも約１０、１５または１８個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌク
レオチドを含み、該オリゴヌクレオチドプローブは、前記の少なくとも約１０、
１５または１８個の連続したヌクレオチド以外は、配列番号１および配列番号２
よりなる群から選ばれる配列の５個を超える連続したヌクレオチドの伸長を含ま
ない。該オリゴヌクレオチドは、他の核酸を実質的に含有しないことが可能であ
る。本発明はまた、対応ＲＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。該ＤＮＡまたは
ＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、キット中にパッケージ化されうる。
【００６４】 前記の診断用途に加えて、本発明は、種々の細胞型におけるＫＣＮＱ５タンパ
ク質の組換え発現を可能にする。そのような組換え発現は、シュタルガルト様黄
斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性における
このタンパク質の生化学的活性およびその役割が解明されうるよう、該タンパク
質の研究を可能にする。
ク質の組換え発現を可能にする。そのような組換え発現は、シュタルガルト様黄
斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性における
このタンパク質の生化学的活性およびその役割が解明されうるよう、該タンパク
質の研究を可能にする。
【００６５】 本発明はまた、ＫＣＮＱ５タンパク質の生物学的活性を測定するアッセイの開
発を可能にする。組換え的に発現されたＫＣＮＱ５タンパク質を使用するそのよ
うなアッセイに特に関心が持たれる。ＫＣＮＱ５タンパク質のアクチベーターま
たはインヒビターである化合物を同定するために、化合物のライブラリーまたは
他の化合物源をスクリーニングするために、ＫＣＮＱ５タンパク質の活性に関す
るアッセイを用いることができる。そのような同定された化合物は、シュタルガ
ルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性
を有する患者を治療するために使用しうる医薬の開発のための「リード体」とし
て使用することができる。前記アッセイの変法においては、突然変異ＫＣＮＱ５
タンパク質を使用し、該突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質のインヒビターまたはア
クチベーターを同定する。
発を可能にする。組換え的に発現されたＫＣＮＱ５タンパク質を使用するそのよ
うなアッセイに特に関心が持たれる。ＫＣＮＱ５タンパク質のアクチベーターま
たはインヒビターである化合物を同定するために、化合物のライブラリーまたは
他の化合物源をスクリーニングするために、ＫＣＮＱ５タンパク質の活性に関す
るアッセイを用いることができる。そのような同定された化合物は、シュタルガ
ルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性
を有する患者を治療するために使用しうる医薬の開発のための「リード体」とし
て使用することができる。前記アッセイの変法においては、突然変異ＫＣＮＱ５
タンパク質を使用し、該突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質のインヒビターまたはア
クチベーターを同定する。
【００６６】 ＫＣＮＱ５の組換え発現のための好ましい細胞系は、内因性カリウムチャンネ
ルを発現しない細胞系（例えば、ＣＶ−１、ＮＩＨ−３Ｔ３）である。そのよう
な細胞系に、カリウムチャンネルを通過しうるイオンである８６Ｒｂをローディ
ングすることができる。８６Ｒｂがローディングされた細胞を物質の集合体（例
えば、組合せライブラリー、天然物）にさらし、８６Ｒｂ流出を改変しうる物質
を同定することができる。そのような物質は、ＫＣＮＱ５のアクチベーターまた
はインヒビターであると考えられる。
ルを発現しない細胞系（例えば、ＣＶ−１、ＮＩＨ−３Ｔ３）である。そのよう
な細胞系に、カリウムチャンネルを通過しうるイオンである８６Ｒｂをローディ
ングすることができる。８６Ｒｂがローディングされた細胞を物質の集合体（例
えば、組合せライブラリー、天然物）にさらし、８６Ｒｂ流出を改変しうる物質
を同定することができる。そのような物質は、ＫＣＮＱ５のアクチベーターまた
はインヒビターであると考えられる。
【００６７】 本発明は、ＫＣＮＱ５のアクチベーターまたはインヒビターを同定する方法で
あって、 （ａ）ＫＣＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質を宿主細胞
内で組換え的に発現させ、 （ｂ）ＫＣＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質のアクチベ
ーターまたはインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在下でＫＣ
ＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質の生物活性を測定するこ
とを含んでなり、 該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下での該ＫＣＮＱ５タンパク
質または該突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質の生物活性における変化が、該物質が
ＫＣＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質のアクチベーターま
たはインヒビターであることを示すことを特徴とする方法を含む。
あって、 （ａ）ＫＣＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質を宿主細胞
内で組換え的に発現させ、 （ｂ）ＫＣＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質のアクチベ
ーターまたはインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在下でＫＣ
ＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質の生物活性を測定するこ
とを含んでなり、 該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下での該ＫＣＮＱ５タンパク
質または該突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質の生物活性における変化が、該物質が
ＫＣＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質のアクチベーターま
たはインヒビターであることを示すことを特徴とする方法を含む。
【００６８】 特定の実施形態においては、該生物活性は電位依存性カリウム電流の生成また
は８６Ｒｂの流出である。
は８６Ｒｂの流出である。
【００６９】 特定の実施形態においては、ＫＣＮＱ５をコードするベクターをツメガエル（
Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内に導入して、該卵母細胞内でＫＣＮＱ５タンパク質
を発現させる。あるいは、ＫＣＮＱ５タンパク質をコードするＲＮＡをインビト
ロで調製し、該卵母細胞内に注入することによっても、該卵母細胞内でＫＣＮＱ
５タンパク質を発現させることができる。該卵母細胞内でのＫＣＮＱ５の発現後
、膜電位を数工程で変化させた後、膜電流を測定する。該ＫＣＮＱ５チャンネル
が開いてカリウムイオンの流動が可能となった場合に、膜電流の変化が認められ
る。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３カリウムチャンネルに関する同様の卵母細胞研
究が、Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３に
報告されている。
Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内に導入して、該卵母細胞内でＫＣＮＱ５タンパク質
を発現させる。あるいは、ＫＣＮＱ５タンパク質をコードするＲＮＡをインビト
ロで調製し、該卵母細胞内に注入することによっても、該卵母細胞内でＫＣＮＱ
５タンパク質を発現させることができる。該卵母細胞内でのＫＣＮＱ５の発現後
、膜電位を数工程で変化させた後、膜電流を測定する。該ＫＣＮＱ５チャンネル
が開いてカリウムイオンの流動が可能となった場合に、膜電流の変化が認められ
る。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３カリウムチャンネルに関する同様の卵母細胞研
究が、Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３に
報告されている。
【００７０】 ＫＣＮＱ５のインヒビターは、ＫＣＮＱ５を発現する卵母細胞を物質の集合体
にさらし、該物質の不存在下で認められる膜電流を遮断または減少させうるか否
かを判定することにより同定することができる。
にさらし、該物質の不存在下で認められる膜電流を遮断または減少させうるか否
かを判定することにより同定することができる。
【００７１】 したがって、本発明は、ＫＣＮＱ５のインヒビターを同定する方法であって、 （ａ）ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内でＫＣＮＱ５タンパク質を発
現させ、 （ｂ）ＫＣＮＱ５のインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在
下で該卵母細胞の膜電位を変化させ、 （ｃ）工程（ｂ）の後に膜カリウム電流を測定することを含んでなり、 工程（ｃ）において測定したカリウム膜電流が、該物質の存在下より不存在下
において大きい場合、該物質がＫＣＮＱ５のインヒビターであることを特徴とす
る方法を提供する。
現させ、 （ｂ）ＫＣＮＱ５のインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在
下で該卵母細胞の膜電位を変化させ、 （ｃ）工程（ｂ）の後に膜カリウム電流を測定することを含んでなり、 工程（ｃ）において測定したカリウム膜電流が、該物質の存在下より不存在下
において大きい場合、該物質がＫＣＮＱ５のインヒビターであることを特徴とす
る方法を提供する。
【００７２】 本発明はまた、第１蛍光色素と第２蛍光色素との間のＦＲＥＴに基づくＫＣＮ
Ｑ５のアクチベーターおよびインヒビターの同定のためのアッセイを含み、この
場合、該第１染料は、ＫＣＮＱ５を発現する細胞の形質膜の一方の側に結合し、
該第２染料は、膜電位の変化に応答して該膜の一方の面から他方の面へ自由に往
復できる。ある実施形態においては、該第１染料は該細胞の形質膜に不透過性で
あり、主に形質膜の細胞外表面に結合する。該第２染料は形質膜内に捕捉される
が、該膜内で自由に拡散できる。該膜の通常の（すなわち、負の）静止電位にお
いては、該第２染料は主に形質膜の細胞外面の内部表面に結合し、したがって該
第２染料は該第１染料に接近して位置する。この接近性は、それらの２つの染料
の間の大量のＦＲＥＴの生成を可能にする。膜の脱分極の後、該第２染料は該膜
の細胞外面から細胞内面に移動し、それらの染料の間の距離が増加する。この距
離の増加は、ＦＲＥＴの減少およびそれに対応した、該第１染料からの蛍光発光
の増加、およびそれに対応した、該第２染料からの蛍光発光の減少につながる。
ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＴｓｉｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ４：２６９−２７７の図１を参照されたい。また、Ｇｏｎｚａｌｅ
ｚおよびＴｓｉｅｎ，１９９５，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９：１２７２−１２８
０および米国特許第５，６６１，０３５号も参照されたい。
Ｑ５のアクチベーターおよびインヒビターの同定のためのアッセイを含み、この
場合、該第１染料は、ＫＣＮＱ５を発現する細胞の形質膜の一方の側に結合し、
該第２染料は、膜電位の変化に応答して該膜の一方の面から他方の面へ自由に往
復できる。ある実施形態においては、該第１染料は該細胞の形質膜に不透過性で
あり、主に形質膜の細胞外表面に結合する。該第２染料は形質膜内に捕捉される
が、該膜内で自由に拡散できる。該膜の通常の（すなわち、負の）静止電位にお
いては、該第２染料は主に形質膜の細胞外面の内部表面に結合し、したがって該
第２染料は該第１染料に接近して位置する。この接近性は、それらの２つの染料
の間の大量のＦＲＥＴの生成を可能にする。膜の脱分極の後、該第２染料は該膜
の細胞外面から細胞内面に移動し、それらの染料の間の距離が増加する。この距
離の増加は、ＦＲＥＴの減少およびそれに対応した、該第１染料からの蛍光発光
の増加、およびそれに対応した、該第２染料からの蛍光発光の減少につながる。
ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＴｓｉｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ４：２６９−２７７の図１を参照されたい。また、Ｇｏｎｚａｌｅ
ｚおよびＴｓｉｅｎ，１９９５，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９：１２７２−１２８
０および米国特許第５，６６１，０３５号も参照されたい。
【００７３】 ある実施形態においては、該第１染料は、蛍光供与体として作用する蛍光性レ
クチンまたは蛍光性リン脂質である。そのような第１染料としては、例えば、ク
マリン標識ホスファチジルエタノールアミン（例えば、Ｎ−（６−クロロ−７−
ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサミドアセチ
ル）−ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン）またはＮ−（７−ニ
トロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン）；蛍光標識レクチン（例えば、フルオレセイン
標識コムギ胚芽凝集素）が挙げられる。ある実施形態においては、該第２染料は
、蛍光受容体として作用するオキソノールである。そのような第２染料としては
、例えば、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）トリメチンオ
キソノール（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ト
リメチンオキソノール）またはペンタメチンオキソノール類似体（例えば、ビス
（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール）
；またはビス（１，３−ジブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキ
ソノール）が挙げられる。本発明での使用に適した種々の染料の合成方法に関し
ては、ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＴｓｉｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆
Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：２６９−２７７を参照されたい。ある実施形態において
は、該アッセイは、一重項酸素による光力学損傷を軽減するための天然カロテノ
イド（例えば、アスタキサンチン）を含みうる。
クチンまたは蛍光性リン脂質である。そのような第１染料としては、例えば、ク
マリン標識ホスファチジルエタノールアミン（例えば、Ｎ−（６−クロロ−７−
ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサミドアセチ
ル）−ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン）またはＮ−（７−ニ
トロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン）；蛍光標識レクチン（例えば、フルオレセイン
標識コムギ胚芽凝集素）が挙げられる。ある実施形態においては、該第２染料は
、蛍光受容体として作用するオキソノールである。そのような第２染料としては
、例えば、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）トリメチンオ
キソノール（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ト
リメチンオキソノール）またはペンタメチンオキソノール類似体（例えば、ビス
（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール）
；またはビス（１，３−ジブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキ
ソノール）が挙げられる。本発明での使用に適した種々の染料の合成方法に関し
ては、ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＴｓｉｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆
Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：２６９−２７７を参照されたい。ある実施形態において
は、該アッセイは、一重項酸素による光力学損傷を軽減するための天然カロテノ
イド（例えば、アスタキサンチン）を含みうる。
【００７４】 前記アッセイは、ＫＣＮＱ５のアクチベーターおよびインヒビターを見出すた
めに用いることができる。そのようなアッセイでは、一般には、例えば、ＫＣＮ
Ｑ５をコードする発現ベクターでのトランスフェクションによりＫＣＮＱ５を発
現する細胞を使用する。インヒビターに関するアッセイにおいては、そのような
細胞は、一般には、ＫＣＮＱ５チャンネルの活性化のための閾値とほぼ等しい静
止膜電位を有する。これは、ほとんどの未トランスフェクト化細胞が、ＫＣＮＱ
５チャンネルの閾値電位に対して脱分極した膜電位を有するからである。したが
って、ＫＣＮＱ５がこれらの細胞内で発現されると、ＫＣＮＱ５チャンネルは開
く。これはＫ＋を細胞から排出させ、それは該膜電位を過分極させる傾向にある
。これは、ＫＣＮＱ５チャンネルのいくつかを閉じて、相対的脱分極を招く。こ
のようにして、ＫＣＮＱ５チャンネルの活性化のための閾値付近での定常状態が
生じる。したがって、ＫＣＮＱ５のインヒビターは、この定常状態を妨げ、該細
胞を脱分極させる。アクチベーターに関するアッセイにおいては、対抗する脱分
極化電流を同様に発現する細胞系内にＫＣＮＱ５をトランスフェクトする。した
がって、これらの細胞における膜電位は、ＫＣＮＱ５チャンネルおよび該内因性
脱分極化電流の両方の寄与により定められ、その結果、より脱分極した静止電位
が生じる。理論的には、該内因性電流は、ＫＣＮＱ５アクチベーターの不存在下
で主要な役割を果たすであろう。ＫＣＮＱ５のアクチベーターはこのチャンネル
を開き、もう一方の電流と比較した場合の膜電位へのＫＣＮＱ５の寄与を増加さ
せ、したがって、ＫＣＮＱ５のアクチベーターに応答して該電位は過分極するで
あろう。ＫＣＮＱ５のアクチベーターおよびインヒビターにより引き起こされる
膜電位の変化（脱分極および過分極）は、前記ＦＲＥＴを用いるアッセイにより
モニターすることができる。
めに用いることができる。そのようなアッセイでは、一般には、例えば、ＫＣＮ
Ｑ５をコードする発現ベクターでのトランスフェクションによりＫＣＮＱ５を発
現する細胞を使用する。インヒビターに関するアッセイにおいては、そのような
細胞は、一般には、ＫＣＮＱ５チャンネルの活性化のための閾値とほぼ等しい静
止膜電位を有する。これは、ほとんどの未トランスフェクト化細胞が、ＫＣＮＱ
５チャンネルの閾値電位に対して脱分極した膜電位を有するからである。したが
って、ＫＣＮＱ５がこれらの細胞内で発現されると、ＫＣＮＱ５チャンネルは開
く。これはＫ＋を細胞から排出させ、それは該膜電位を過分極させる傾向にある
。これは、ＫＣＮＱ５チャンネルのいくつかを閉じて、相対的脱分極を招く。こ
のようにして、ＫＣＮＱ５チャンネルの活性化のための閾値付近での定常状態が
生じる。したがって、ＫＣＮＱ５のインヒビターは、この定常状態を妨げ、該細
胞を脱分極させる。アクチベーターに関するアッセイにおいては、対抗する脱分
極化電流を同様に発現する細胞系内にＫＣＮＱ５をトランスフェクトする。した
がって、これらの細胞における膜電位は、ＫＣＮＱ５チャンネルおよび該内因性
脱分極化電流の両方の寄与により定められ、その結果、より脱分極した静止電位
が生じる。理論的には、該内因性電流は、ＫＣＮＱ５アクチベーターの不存在下
で主要な役割を果たすであろう。ＫＣＮＱ５のアクチベーターはこのチャンネル
を開き、もう一方の電流と比較した場合の膜電位へのＫＣＮＱ５の寄与を増加さ
せ、したがって、ＫＣＮＱ５のアクチベーターに応答して該電位は過分極するで
あろう。ＫＣＮＱ５のアクチベーターおよびインヒビターにより引き起こされる
膜電位の変化（脱分極および過分極）は、前記ＦＲＥＴを用いるアッセイにより
モニターすることができる。
【００７５】 したがって、本発明は、ＫＣＮＱ５のアクチベーターを同定する方法であって
、 （ａ）試験細胞を準備し（該試験細胞は、 （１）該細胞内でのＫＣＮＱ５の発現を指令する発現ベクター、 （２）該形質膜の一方の側に結合している第１蛍光染料、および （３）膜電位の変化に応答して該形質膜の一方の面から他方の面へ自由
に往復できる第２蛍光染料を含む）、 （ｂ）ＫＣＮＱ５のアクチベーターであると疑われる物質に該試験細胞をさ
らし、 （ｃ）該物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲ
ＥＴ）の量を測定し、 （ｄ）該物質にさらされた試験細胞により示されたＦＲＥＴの量を、対照細
胞により示されたＦＲＥＴの量と比較することを含んでなり、 該試験細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該対照細胞により示されたＦＲ
ＥＴの量より多い場合、該物質がＫＣＮＱ５のアクチベーターであり、 該対照細胞が、（１）それが（ａ）（１）〜（３）に記載の事項の少なくと
も１つを含まないこと以外は該試験細胞と実質的に同じであるが、該物質にさら
された細胞、または（２）該物質にさらされていない試験細胞であることを特徴
とする方法を提供する。
、 （ａ）試験細胞を準備し（該試験細胞は、 （１）該細胞内でのＫＣＮＱ５の発現を指令する発現ベクター、 （２）該形質膜の一方の側に結合している第１蛍光染料、および （３）膜電位の変化に応答して該形質膜の一方の面から他方の面へ自由
に往復できる第２蛍光染料を含む）、 （ｂ）ＫＣＮＱ５のアクチベーターであると疑われる物質に該試験細胞をさ
らし、 （ｃ）該物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲ
ＥＴ）の量を測定し、 （ｄ）該物質にさらされた試験細胞により示されたＦＲＥＴの量を、対照細
胞により示されたＦＲＥＴの量と比較することを含んでなり、 該試験細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該対照細胞により示されたＦＲ
ＥＴの量より多い場合、該物質がＫＣＮＱ５のアクチベーターであり、 該対照細胞が、（１）それが（ａ）（１）〜（３）に記載の事項の少なくと
も１つを含まないこと以外は該試験細胞と実質的に同じであるが、該物質にさら
された細胞、または（２）該物質にさらされていない試験細胞であることを特徴
とする方法を提供する。
【００７６】 本発明はまた、ＫＣＮＱ５のインヒビターを同定する方法であって、 （ａ）試験細胞を準備し（該試験細胞は、 （１）該細胞内でのＫＣＮＱ５の発現を指令する発現ベクター、 （２）該形質膜の一方の側に結合している第１蛍光染料、および （３）膜電位の変化に応答して該形質膜の一方の面から他方の面へ自由
に往復できる第２蛍光染料を含む）、 （ｂ）ＫＣＮＱ５のインヒビターであると疑われる物質に該試験細胞をさら
し、 （ｃ）該物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲ
ＥＴ）の量を測定し、 （ｄ）該物質にさらされた試験細胞により示されたＦＲＥＴの量を、対照細
胞により示されたＦＲＥＴの量と比較することを含んでなり、 該試験細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該対照細胞により示されたＦＲ
ＥＴの量より少ない場合、該物質がＫＣＮＱ５のインヒビターであり、 該対照細胞が、（１）それが（ａ）（１）〜（３）に記載の事項の少なくと
も１つを含まないこと以外は該試験細胞と実質的に同じであるが、該物質にさら
された細胞、または（２）該物質にさらされていない試験細胞であることを特徴
とする方法を提供する。
に往復できる第２蛍光染料を含む）、 （ｂ）ＫＣＮＱ５のインヒビターであると疑われる物質に該試験細胞をさら
し、 （ｃ）該物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲ
ＥＴ）の量を測定し、 （ｄ）該物質にさらされた試験細胞により示されたＦＲＥＴの量を、対照細
胞により示されたＦＲＥＴの量と比較することを含んでなり、 該試験細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該対照細胞により示されたＦＲ
ＥＴの量より少ない場合、該物質がＫＣＮＱ５のインヒビターであり、 該対照細胞が、（１）それが（ａ）（１）〜（３）に記載の事項の少なくと
も１つを含まないこと以外は該試験細胞と実質的に同じであるが、該物質にさら
された細胞、または（２）該物質にさらされていない試験細胞であることを特徴
とする方法を提供する。
【００７７】 前記アッセイの変法においては、該トランスフェクト化細胞の膜電位をそれ自
身で定常状態に到達させる代わりに、該膜電位を、ＫＣＮＱ５チャンネルが開く
電位に人工的に設定する。これは、例えば、公知方法で外部Ｋ＋濃度を変化（例
えば増加）させることにより行なうことができる。開いたＫＣＮＱ５チャンネル
を有するそのような細胞をＫＣＮＱ５のインヒビターにさらす場合、該ＫＣＮＱ
５チャンネルは閉じ、該細胞の膜電位は脱分極するであろう。この脱分極はＦＲ
ＥＴの減少として観察される。
身で定常状態に到達させる代わりに、該膜電位を、ＫＣＮＱ５チャンネルが開く
電位に人工的に設定する。これは、例えば、公知方法で外部Ｋ＋濃度を変化（例
えば増加）させることにより行なうことができる。開いたＫＣＮＱ５チャンネル
を有するそのような細胞をＫＣＮＱ５のインヒビターにさらす場合、該ＫＣＮＱ
５チャンネルは閉じ、該細胞の膜電位は脱分極するであろう。この脱分極はＦＲ
ＥＴの減少として観察される。
【００７８】 したがって、本発明は、ＫＣＮＱ５のインヒビターを同定する方法であって、 （ａ）細胞を準備し（該細胞は、 （１）該細胞内でのＫＣＮＱ５の発現を指令する発現ベクター、 （２）該形質膜の一方の側に結合している第１蛍光染料、および （３）膜電位の変化に応答して該形質膜の一方の面から他方の面へ自由
に往復できる第２蛍光染料を含む）、 （ｂ）ＫＣＮＱ５により形成されたイオンチャンネルが開くように該細胞の
膜電位を調節し、 （ｃ）該試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の量を測定
し、 （ｄ）ＫＣＮＱ５のインヒビターであると疑われる物質に該細胞をさらしな
がら、工程（ｂ）および工程（ｃ）を繰返すことを含んでなり、 該物質にされされた細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該物質にさらされ
てない細胞により示されたＦＲＥＴの量より少ない場合、該物質がＫＣＮＱ５の
インヒビターであることを特徴とする方法を提供する。
に往復できる第２蛍光染料を含む）、 （ｂ）ＫＣＮＱ５により形成されたイオンチャンネルが開くように該細胞の
膜電位を調節し、 （ｃ）該試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の量を測定
し、 （ｄ）ＫＣＮＱ５のインヒビターであると疑われる物質に該細胞をさらしな
がら、工程（ｂ）および工程（ｃ）を繰返すことを含んでなり、 該物質にされされた細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該物質にさらされ
てない細胞により示されたＦＲＥＴの量より少ない場合、該物質がＫＣＮＱ５の
インヒビターであることを特徴とする方法を提供する。
【００７９】 前記方法の特定の実施形態においては、該発現ベクターを該試験細胞内にトラ
ンスフェクトする。
ンスフェクトする。
【００８０】 前記方法の特定の実施形態においては、ＫＣＮＱ５は配列番号３のアミノ酸配
列を有する。
列を有する。
【００８１】 前記方法の特定の実施形態においては、該第１蛍光染料は、蛍光性レクチン、
蛍光性リン脂質、クマリン標識ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−（６−ク
ロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサ
ミドアセチル）−ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン）、Ｎ−（
７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−ジパルミト
イルホスファチジルエタノールアミン）およびフルオレセイン標識コムギ胚芽凝
集素よりなる群から選ばれる。
蛍光性リン脂質、クマリン標識ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−（６−ク
ロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサ
ミドアセチル）−ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン）、Ｎ−（
７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−ジパルミト
イルホスファチジルエタノールアミン）およびフルオレセイン標識コムギ胚芽凝
集素よりなる群から選ばれる。
【００８２】 前記方法の特定の実施形態においては、該第２蛍光染料は、蛍光受容体として
作用するオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）
トリメチンオキソノール、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート
）トリメチンオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラー
ト）クワトラ（ｑｕａｔｒａ）メチンオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル
−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、ビス（１，３−ジヘキ
シル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、ビス（１，３−ジ
ブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、およびビス（１
，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）ヘキサメチンオキソノールよりな
る群から選ばれる。
作用するオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）
トリメチンオキソノール、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート
）トリメチンオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラー
ト）クワトラ（ｑｕａｔｒａ）メチンオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル
−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、ビス（１，３−ジヘキ
シル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、ビス（１，３−ジ
ブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、およびビス（１
，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）ヘキサメチンオキソノールよりな
る群から選ばれる。
【００８３】 前記方法の特定の実施形態においては、該細胞は真核細胞である。もう１つの
実施形態においては、該細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態においては、該
細胞は、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａ
ｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯ
Ｓ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６
５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、ツメ
ガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞、またはツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母
細胞である。
実施形態においては、該細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態においては、該
細胞は、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａ
ｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯ
Ｓ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６
５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、ツメ
ガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞、またはツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母
細胞である。
【００８４】 前記方法の特定の実施形態においては、該対照細胞は（ａ）（１）項を含むが
、（ａ）（２）および（ａ）（３）項を含まない。
、（ａ）（２）および（ａ）（３）項を含まない。
【００８５】 ＫＣＮＱ５のアクチベーターまたはインヒビターを同定するためのアッセイに
おいては、機能的ヘテロマーカリウムチャンネルを形成させるために、ＫＣＮＱ
５と共に、または補助サブユニット、例えばＩｓＫタンパク質またはそのホモロ
グの１つと共に、もう１つのカリウムチャンネル、例えばＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ
２、ＫＣＮＱ３またはＫＣＮＱ４を共発現させることが有利かもしれない。
おいては、機能的ヘテロマーカリウムチャンネルを形成させるために、ＫＣＮＱ
５と共に、または補助サブユニット、例えばＩｓＫタンパク質またはそのホモロ
グの１つと共に、もう１つのカリウムチャンネル、例えばＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ
２、ＫＣＮＱ３またはＫＣＮＱ４を共発現させることが有利かもしれない。
【００８６】 前記の方法は、明らかに、ある物質がＫＣＮＱ５のアクチベーターまたはイン
ヒビターであるか否かの試験に関するものであるが、そのような方法は、物質の
集合体（例えば、組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）ライブラリー）を試験
してそのような集合体のいずれかのメンバーがＫＣＮＱ５のアクチベーターまた
はインヒビターであるか否かを判定するのに応用されうることが当業者に明らか
であろう。したがって、前記方法における物質として物質の集合体またはそのよ
うな集合体の個々のメンバーを使用することは本発明の範囲内に含まれる。
ヒビターであるか否かの試験に関するものであるが、そのような方法は、物質の
集合体（例えば、組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）ライブラリー）を試験
してそのような集合体のいずれかのメンバーがＫＣＮＱ５のアクチベーターまた
はインヒビターであるか否かを判定するのに応用されうることが当業者に明らか
であろう。したがって、前記方法における物質として物質の集合体またはそのよ
うな集合体の個々のメンバーを使用することは本発明の範囲内に含まれる。
【００８７】 本発明は、前記方法により同定されたＫＣＮＱ５タンパク質のアクチベーター
またはインヒビターを含んでなる医薬組成物を含む。一般には、該アクチベータ
ーおよびインヒビターを医薬上許容される担体と一緒にして医薬組成物を得る。
アクチベーターまたはインヒビターと担体とを含有する医薬組成物の製剤化のそ
のような担体および方法の具体例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。有効な投与に適した医薬
上許容される組成物を形成させるためには、そのような組成物は、該アクチベー
ターまたはインヒビターの治療的に有効な量を含有するであろう。
またはインヒビターを含んでなる医薬組成物を含む。一般には、該アクチベータ
ーおよびインヒビターを医薬上許容される担体と一緒にして医薬組成物を得る。
アクチベーターまたはインヒビターと担体とを含有する医薬組成物の製剤化のそ
のような担体および方法の具体例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。有効な投与に適した医薬
上許容される組成物を形成させるためには、そのような組成物は、該アクチベー
ターまたはインヒビターの治療的に有効な量を含有するであろう。
【００８８】 治療用または予防用組成物は、ＫＣＮＱ５の活性が異常である状態を治療また
は予防するのに十分な量で個体に投与する。該有効量は、個体の状態、体重、性
別、年齢などの種々の要因によって様々となりうる。他の要因には投与様式が含
まれる。適当な量は、熟練した医師により決定されうる。
は予防するのに十分な量で個体に投与する。該有効量は、個体の状態、体重、性
別、年齢などの種々の要因によって様々となりうる。他の要因には投与様式が含
まれる。適当な量は、熟練した医師により決定されうる。
【００８９】 組成物は、単独で適当な投与量で使用することができる。あるいは、他の物質
の同時投与または連続的投与が望ましいことがある。
の同時投与または連続的投与が望ましいことがある。
【００９０】 該組成物は、通常の投与用ビヒクル中の多種多様な治療用剤形として投与する
ことができる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤（それぞれは時限放出（
ｔｉｍｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）および徐放製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、
エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤などの経口剤形とし
て又は注射により投与することができる。同様に、それらを、静脈内（ボーラス
および注入の両方）、腹腔内、皮下、局所（閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の存在
下または不存在下）または筋肉内形態として投与することも可能であり、それら
はすべて、薬学分野の当業者によく知られた形態を用いることが可能である。
ことができる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤（それぞれは時限放出（
ｔｉｍｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）および徐放製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、
エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤などの経口剤形とし
て又は注射により投与することができる。同様に、それらを、静脈内（ボーラス
および注入の両方）、腹腔内、皮下、局所（閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の存在
下または不存在下）または筋肉内形態として投与することも可能であり、それら
はすべて、薬学分野の当業者によく知られた形態を用いることが可能である。
【００９１】 組成物を単回１日量で投与したり、あるいは合計１日量を、２、３または４分
割量で毎日投与するのが有利かもしれない。さらに、組成物は、適当な鼻腔内ビ
ヒクルの局所的使用により鼻腔内形態で、または当業者によく知られた経皮皮膚
パッチの形態を使用して経皮経路により投与することができる。もちろん、経皮
デリバリーシステムの形態で投与するためには、該投与量の投与は、該投与計画
の全体にわたり、断続的なものではなく連続的なものとなるであろう。
割量で毎日投与するのが有利かもしれない。さらに、組成物は、適当な鼻腔内ビ
ヒクルの局所的使用により鼻腔内形態で、または当業者によく知られた経皮皮膚
パッチの形態を使用して経皮経路により投与することができる。もちろん、経皮
デリバリーシステムの形態で投与するためには、該投与量の投与は、該投与計画
の全体にわたり、断続的なものではなく連続的なものとなるであろう。
【００９２】 該組成物を使用する投与計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および
医学的状態；治療する状態の重症度；投与経路；患者の腎、肝および心臓血管機
能；および使用するその個々の組成物を含む種々の要因に応じて選択される。通
常の技量を有する医師は、該状態の進行の予防、阻止または停止に必要な組成物
の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うことなく効力を与
える範囲内の組成物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に対する該組成
物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは、組成物の
分布、平衡および***に関する考慮を含む。
医学的状態；治療する状態の重症度；投与経路；患者の腎、肝および心臓血管機
能；および使用するその個々の組成物を含む種々の要因に応じて選択される。通
常の技量を有する医師は、該状態の進行の予防、阻止または停止に必要な組成物
の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うことなく効力を与
える範囲内の組成物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に対する該組成
物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは、組成物の
分布、平衡および***に関する考慮を含む。
【００９３】 本発明は、ＫＣＮＱ５タンパク質を含有する電位依存性カリウムチャンネルの
アクチベーターまたはインヒビターである物質の治療的に有効な量を患者に投与
することによる、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、
サラ病、老人性黄斑変性および他の形態の黄斑変性、難聴、てんかん並びに種々
の形態の神経精神科学的、心臓、胃腸および筋肉障害の治療方法を含む。
アクチベーターまたはインヒビターである物質の治療的に有効な量を患者に投与
することによる、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、
サラ病、老人性黄斑変性および他の形態の黄斑変性、難聴、てんかん並びに種々
の形態の神経精神科学的、心臓、胃腸および筋肉障害の治療方法を含む。
【００９４】 標的イオンチャンネルと特異的に相互作用する潜在的医薬を同定するために化
合物をスクリーニングする場合には、同定される化合物が該標的イオンチャンネ
ルに対して可能な限り特異的であることを保証する必要がある。これを行なうた
めには、該標的イオンチャンネルに類似した可能な限り多種多様なイオンチャン
ネルに対して該化合物をスクリーニングする必要がある。例えば、イオンチャン
ネルＡと相互作用する潜在的医薬である化合物を見出すためには、該化合物がイ
オンチャンネルＡ（「プラス標的」）と相互作用しイオンチャンネルＡを介して
所望の薬理学的効果を与えることを保証するだけでは十分ではない。該化合物が
イオンチャンネルＢ、Ｃ、Ｄなど（「マイナス標的」）とは相互作用しないこと
を確認する必要もある。一般に、スクリーニング計画の一部として、可能な限り
多数のマイナス標的を有することが重要である（Ｈｏｄｇｓｏｎ，１９９２，Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：９７３−９８０、９８０頁を参照されたい
）。ＫＣＮＱ５タンパク質、ＫＣＮＱ５タンパク質をコードするＤＮＡ、および
ＫＣＮＱ５タンパク質を発現するように操作された組換え細胞は、他のイオンチ
ャンネルと特異的に相互作用する化合物を同定するように設計されたスクリーニ
ングにおいて「マイナス標的」として使用されうる点で有用である。例えば、Ｗ
ａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３は、ＫＣＮ
Ｑ２およびＫＣＮＱ３が、「Ｍ−チャンネル」として公知のヘテロマーカリウム
イオンチャンネルを形成することを示している。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３に
おける突然変異は、てんかんの原因となるため（Ｂｉｅｒｖｅｒｔら,１９９８
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：４０３−４０６；Ｓｉｎｇｈら，１９９８，Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１８：２５−２９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ
１９９８，３９６：６８７−６９０）、Ｍチャンネルは薬物発見のための重要
な標的である。Ｍチャンネルのアクチベーターまたはインヒビターを同定するよ
うに設計されたスクリーニング計画は、マイナス標的としてのＫＣＮＱ５の使用
により著しい利益を得るであろう。
合物をスクリーニングする場合には、同定される化合物が該標的イオンチャンネ
ルに対して可能な限り特異的であることを保証する必要がある。これを行なうた
めには、該標的イオンチャンネルに類似した可能な限り多種多様なイオンチャン
ネルに対して該化合物をスクリーニングする必要がある。例えば、イオンチャン
ネルＡと相互作用する潜在的医薬である化合物を見出すためには、該化合物がイ
オンチャンネルＡ（「プラス標的」）と相互作用しイオンチャンネルＡを介して
所望の薬理学的効果を与えることを保証するだけでは十分ではない。該化合物が
イオンチャンネルＢ、Ｃ、Ｄなど（「マイナス標的」）とは相互作用しないこと
を確認する必要もある。一般に、スクリーニング計画の一部として、可能な限り
多数のマイナス標的を有することが重要である（Ｈｏｄｇｓｏｎ，１９９２，Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：９７３−９８０、９８０頁を参照されたい
）。ＫＣＮＱ５タンパク質、ＫＣＮＱ５タンパク質をコードするＤＮＡ、および
ＫＣＮＱ５タンパク質を発現するように操作された組換え細胞は、他のイオンチ
ャンネルと特異的に相互作用する化合物を同定するように設計されたスクリーニ
ングにおいて「マイナス標的」として使用されうる点で有用である。例えば、Ｗ
ａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３は、ＫＣＮ
Ｑ２およびＫＣＮＱ３が、「Ｍ−チャンネル」として公知のヘテロマーカリウム
イオンチャンネルを形成することを示している。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３に
おける突然変異は、てんかんの原因となるため（Ｂｉｅｒｖｅｒｔら,１９９８
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：４０３−４０６；Ｓｉｎｇｈら，１９９８，Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１８：２５−２９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ
１９９８，３９６：６８７−６９０）、Ｍチャンネルは薬物発見のための重要
な標的である。Ｍチャンネルのアクチベーターまたはインヒビターを同定するよ
うに設計されたスクリーニング計画は、マイナス標的としてのＫＣＮＱ５の使用
により著しい利益を得るであろう。
【００９５】 本発明はまた、ＫＣＮＱ５タンパク質に対する抗体を含む。そのような抗体は
、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でありうる。本発明の抗体は、
当技術分野でよく知られた方法により、全ＫＣＮＱ５タンパク質に対して、また
は血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンなどの適当な担体と共役
したタンパク質の適当な抗原断片に対して産生させる。タンパク質の適当な抗原
断片を同定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｈｏｐｐ ＆ Ｗｏ
ｏｄｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３
８２４−３８２８およびＪａｍｅｓｏｎ ＆ Ｗｏｌｆ，１９８８，ＣＡＢＩＯ
Ｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）４：１８１−１８６を参照されたい。
、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でありうる。本発明の抗体は、
当技術分野でよく知られた方法により、全ＫＣＮＱ５タンパク質に対して、また
は血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンなどの適当な担体と共役
したタンパク質の適当な抗原断片に対して産生させる。タンパク質の適当な抗原
断片を同定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｈｏｐｐ ＆ Ｗｏ
ｏｄｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３
８２４−３８２８およびＪａｍｅｓｏｎ ＆ Ｗｏｌｆ，１９８８，ＣＡＢＩＯ
Ｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）４：１８１−１８６を参照されたい。
【００９６】 ポリクローナル抗体の産生のためには、ＫＣＮＱ５タンパク質または抗原断片
（適当な担体に共役させたもの）を、適当な非ヒト宿主動物（例えば、ウサギ、
ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス）に定期的に注射する。該動物から定期的に採血
し、得られた血清を、注射された抗原に対する抗体の存在に関して試験する。該
注射は、筋肉内、腹腔内、皮下などに行なうことができ、アジュバントと共に行
なうことができる。
（適当な担体に共役させたもの）を、適当な非ヒト宿主動物（例えば、ウサギ、
ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス）に定期的に注射する。該動物から定期的に採血
し、得られた血清を、注射された抗原に対する抗体の存在に関して試験する。該
注射は、筋肉内、腹腔内、皮下などに行なうことができ、アジュバントと共に行
なうことができる。
【００９７】 モノクローナル抗体の産生のためには、ＫＣＮＱ５タンパク質または抗原断片
（適当な担体に共役させたもの）を、ポリクローナル抗体の産生に関して前記し
たのと同様に適当な非ヒト宿主動物に注射する。モノクローナル抗体の場合には
、該動物は一般にはマウスである。ついで該動物の脾臓細胞を不死化させる。こ
れは、しばしば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２５６：４９５−４９７に記載のとおり、骨髄腫細胞との融合により行なう
。モノクローナル抗体の産生の更に詳しい説明については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ編
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，１９８８を参照されたい。
（適当な担体に共役させたもの）を、ポリクローナル抗体の産生に関して前記し
たのと同様に適当な非ヒト宿主動物に注射する。モノクローナル抗体の場合には
、該動物は一般にはマウスである。ついで該動物の脾臓細胞を不死化させる。こ
れは、しばしば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２５６：４９５−４９７に記載のとおり、骨髄腫細胞との融合により行なう
。モノクローナル抗体の産生の更に詳しい説明については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ編
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，１９８８を参照されたい。
【００９８】 ＫＣＮＱ５ポリペプチドを標的器官（例えば、網膜色素上皮または網膜の他の
部分）の細胞内に導入するために、遺伝子治療を用いることができる。ＫＣＮＱ
５ポリペプチドをコードするヌクレオチドは、受容細胞への感染により該ヌクレ
オチドの導入を媒介するウイルスベクターに連結させることができる。適当なウ
イルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、
ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスおよびポリオウイルス
に基づくベクターが含まれる。あるいは、リガンド−ヌクレオチドコンジュゲー
トを使用する受容体媒介標的化導入（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔ
ａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、リポフェクション、膜融合または直接マ
イクロインジェクションを含む非ウイルス技術により、ＫＣＮＱ５ポリペプチド
をコードするヌクレオチドを遺伝子治療のために細胞内に導入することができる
。これらの方法およびそれらの変法は、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）およびイ
ンビボ遺伝子治療に適している。ＫＣＮＱ５ポリペプチドでの遺伝子治療は、Ｋ
ＣＮＱ５の活性を上昇させることが有益である疾患の治療に特に有用であろう。
部分）の細胞内に導入するために、遺伝子治療を用いることができる。ＫＣＮＱ
５ポリペプチドをコードするヌクレオチドは、受容細胞への感染により該ヌクレ
オチドの導入を媒介するウイルスベクターに連結させることができる。適当なウ
イルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、
ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスおよびポリオウイルス
に基づくベクターが含まれる。あるいは、リガンド−ヌクレオチドコンジュゲー
トを使用する受容体媒介標的化導入（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔ
ａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、リポフェクション、膜融合または直接マ
イクロインジェクションを含む非ウイルス技術により、ＫＣＮＱ５ポリペプチド
をコードするヌクレオチドを遺伝子治療のために細胞内に導入することができる
。これらの方法およびそれらの変法は、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）およびイ
ンビボ遺伝子治療に適している。ＫＣＮＱ５ポリペプチドでの遺伝子治療は、Ｋ
ＣＮＱ５の活性を上昇させることが有益である疾患の治療に特に有用であろう。
【００９９】 本発明は、非ヒト種からヒトＫＣＮＱ５のオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ
）をクローニングするための方法を含む。一般には、そのような方法は、配列番
号１または配列番号２に基づきＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーション
プローブを調製することを含み、これは、非ヒトＫＣＮＱ５を含有する断片を適
当なＤＮＡ調製物から増幅するために（ＰＣＲの場合）または非ヒトＫＣＮＱ５
を含有するｃＤＮＡもしくはゲノムクローンを適当なライブラリーから選択する
ために使用されうる。この方法の好ましい実施形態は、マウスからＫＣＮＱ５遺
伝子をクローニングするための方法である。
）をクローニングするための方法を含む。一般には、そのような方法は、配列番
号１または配列番号２に基づきＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーション
プローブを調製することを含み、これは、非ヒトＫＣＮＱ５を含有する断片を適
当なＤＮＡ調製物から増幅するために（ＰＣＲの場合）または非ヒトＫＣＮＱ５
を含有するｃＤＮＡもしくはゲノムクローンを適当なライブラリーから選択する
ために使用されうる。この方法の好ましい実施形態は、マウスからＫＣＮＱ５遺
伝子をクローニングするための方法である。
【０１００】 本発明は、マウスＫＣＮＱ５をコードするＤＮＡを提供することにより、シュ
タルガルト黄斑変性ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性
黄斑変性のモデル動物の作製を可能にする。そのようなモデル動物は、改変され
たＫＣＮＱ５遺伝子を含有するトランスジェニック「ノックアウト」または「ノ
ックイン」マウスを作ることにより作製することができる。マウスＫＣＮＱ５遺
伝子の部分が欠失したノックアウトマウスを作製することができる。ヒトＫＣＮ
Ｑ５遺伝子中に存在するとシュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジスト
ロフィ、サラ病または老人性黄斑変性を招くことが示されている突然変異がマウ
ス遺伝子内に導入されたノックインマウスを作製することができる。そのような
ノックアウトおよびノックインマウスは、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、
錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性の研究における貴重な手段
であり、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病ま
たは老人性黄斑変性の潜在的医薬または治療方法を試験するための重要なモデル
系を提供するであろう。
タルガルト黄斑変性ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性
黄斑変性のモデル動物の作製を可能にする。そのようなモデル動物は、改変され
たＫＣＮＱ５遺伝子を含有するトランスジェニック「ノックアウト」または「ノ
ックイン」マウスを作ることにより作製することができる。マウスＫＣＮＱ５遺
伝子の部分が欠失したノックアウトマウスを作製することができる。ヒトＫＣＮ
Ｑ５遺伝子中に存在するとシュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジスト
ロフィ、サラ病または老人性黄斑変性を招くことが示されている突然変異がマウ
ス遺伝子内に導入されたノックインマウスを作製することができる。そのような
ノックアウトおよびノックインマウスは、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、
錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑変性の研究における貴重な手段
であり、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病ま
たは老人性黄斑変性の潜在的医薬または治療方法を試験するための重要なモデル
系を提供するであろう。
【０１０１】 したがって、本発明は、 （ａ）マウスＫＣＮＱ５遺伝子をクローニングするのに使用するＰＣＲプライ
マーまたはオリゴヌクレオチドプローブを配列番号１または配列番号２に基づき
設計し、 （ｂ）該ＰＣＲプライマーまたは該オリゴヌクレオチドプローブを使用して、
該マウスＫＣＮＱ５遺伝子の少なくとも一部（該部分は、トランスジェニックマ
ウスを作製するのに十分な程度に大きい）をクローニングし、 （ｃ）天然状態から改変された該マウスＫＣＮＱ５遺伝子の少なくとも１つの
コピーを有するトランスジェニックマウスを製造することを含んでなる、シュタ
ルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑
変性のモデルマウスの製造方法を含む。
マーまたはオリゴヌクレオチドプローブを配列番号１または配列番号２に基づき
設計し、 （ｂ）該ＰＣＲプライマーまたは該オリゴヌクレオチドプローブを使用して、
該マウスＫＣＮＱ５遺伝子の少なくとも一部（該部分は、トランスジェニックマ
ウスを作製するのに十分な程度に大きい）をクローニングし、 （ｃ）天然状態から改変された該マウスＫＣＮＱ５遺伝子の少なくとも１つの
コピーを有するトランスジェニックマウスを製造することを含んでなる、シュタ
ルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サラ病または老人性黄斑
変性のモデルマウスの製造方法を含む。
【０１０２】 ノックアウトおよびノックインマウスの製造方法は当技術分野でよく知られて
いる。１つの方法は、遺伝子ターゲッティッドトランスジェニックノックアウト
マウスの作製における遺伝子ターゲッティッドＥＳ細胞の使用を含み、Ｔｈｏｍ
ａｓら，１９８７，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２に記載されており、種々の
文献に概説されている（Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８９，Ｃｅｌｌ ５６：１４５
−１４７；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．５
：７０−７６；Ｂａｒｉｂａｕｌｔら，１９８９，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．
６：４８１−４９２）。
いる。１つの方法は、遺伝子ターゲッティッドトランスジェニックノックアウト
マウスの作製における遺伝子ターゲッティッドＥＳ細胞の使用を含み、Ｔｈｏｍ
ａｓら，１９８７，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２に記載されており、種々の
文献に概説されている（Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８９，Ｃｅｌｌ ５６：１４５
−１４７；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．５
：７０−７６；Ｂａｒｉｂａｕｌｔら，１９８９，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．
６：４８１−４９２）。
【０１０３】 特定の変化を染色体遺伝子内に挿入するために標的化相同組換えを用いること
により任意の遺伝的領域を不活性化したり所望の実質的に任意の突然変異に改変
するための技術が利用可能である。一般には、「ターゲッティングベクター」、
すなわち、突然変異させたい遺伝的領域の一部を含有するプラスミドを使用する
。該プラスミド上の遺伝的領域のこの部分と該染色体上の対応遺伝的領域との相
同性に基づき、相同組換えを利用して該遺伝的領域内に該プラスミドを挿入して
、該遺伝的領域を破壊することができる。通常、該ターゲッティングベクターは
選択マーカー遺伝子も含有する。
により任意の遺伝的領域を不活性化したり所望の実質的に任意の突然変異に改変
するための技術が利用可能である。一般には、「ターゲッティングベクター」、
すなわち、突然変異させたい遺伝的領域の一部を含有するプラスミドを使用する
。該プラスミド上の遺伝的領域のこの部分と該染色体上の対応遺伝的領域との相
同性に基づき、相同組換えを利用して該遺伝的領域内に該プラスミドを挿入して
、該遺伝的領域を破壊することができる。通常、該ターゲッティングベクターは
選択マーカー遺伝子も含有する。
【０１０４】 １００％に近い頻度で生じる相同染色体外組換えと比較して、相同プラスミド
−染色体組換えは、当初は１０−６〜１０−３の頻度でしか検出されなかったと
報告されている（Ｌｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：１３９１−１３９５；Ｓｍｉｔｈｉｅｓら，１９８５，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１７：２３０−２３４；Ｔｈｏｍａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４４
：４１９−４２８）。非相同プラスミド−染色体相互作用は、比較しうる相同挿
入より頻繁であり、１０２倍（Ｔｈｏｍａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４４：４
１９−４２８）のレベルで生じる。
−染色体組換えは、当初は１０−６〜１０−３の頻度でしか検出されなかったと
報告されている（Ｌｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：１３９１−１３９５；Ｓｍｉｔｈｉｅｓら，１９８５，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１７：２３０−２３４；Ｔｈｏｍａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４４
：４１９−４２８）。非相同プラスミド−染色体相互作用は、比較しうる相同挿
入より頻繁であり、１０２倍（Ｔｈｏｍａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４４：４
１９−４２８）のレベルで生じる。
【０１０５】 マウスＥＳ細胞における標的化組換えのこの低い比率を克服するために、稀有
（ｒａｒｅ）相同組換え体を検出または選択するための種々の方法が開発されて
いる。相同改変事象を検出するための１つのアプローチでは、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を用いて相同挿入に関して形質転換体細胞のプールをスクリーニ
ングし、ついで個々のクローンをスクリーニングする（Ｋｉｍら，１９８８，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８８８７−８９０３；Ｋｉｍら，１
９９１，Ｇｅｎｅ １０３：２２７−２３３）。あるいは、相同挿入が生じた場
合にのみ活性となるマーカー遺伝子を構築してこれらの組換え体が直接的に選択
されるのを可能にするポジティブ遺伝的選択アプローチが開発されている（Ｓｅ
ｄｉｖｙら，１９８９，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
：２２７−２３１）。相同組換え体を選択するために開発された最も効果的なア
プローチの１つは、該改変の直接的選択が存在しない遺伝子用に開発されたポジ
ティブ−ネガティブ選択（ＰＮＳ）法である（Ｍａｎｓｏｕｒら，１９８８，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｔｒｅｎ
ｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．５：７０−７６）。ＰＮＳ法は、高レベルで発現され
ない遺伝子をターゲッティングするのに、より効率的である。なぜなら、該マー
カー遺伝子がそれ自体のプロモーターを有するからである。単純ヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用しガンシクロビル（ＧＡＮＣ
）、ＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ２−フルオロ−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル
）−５−ヨードウラシル）などのヘルペス薬でその非相同挿入に対して選択する
ことにより、非相同組換え体を選択する。この対抗選択により、生存している形
質転換体のうちの相同組換え体の割合を増加させることができる。
（ｒａｒｅ）相同組換え体を検出または選択するための種々の方法が開発されて
いる。相同改変事象を検出するための１つのアプローチでは、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を用いて相同挿入に関して形質転換体細胞のプールをスクリーニ
ングし、ついで個々のクローンをスクリーニングする（Ｋｉｍら，１９８８，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８８８７−８９０３；Ｋｉｍら，１
９９１，Ｇｅｎｅ １０３：２２７−２３３）。あるいは、相同挿入が生じた場
合にのみ活性となるマーカー遺伝子を構築してこれらの組換え体が直接的に選択
されるのを可能にするポジティブ遺伝的選択アプローチが開発されている（Ｓｅ
ｄｉｖｙら，１９８９，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
：２２７−２３１）。相同組換え体を選択するために開発された最も効果的なア
プローチの１つは、該改変の直接的選択が存在しない遺伝子用に開発されたポジ
ティブ−ネガティブ選択（ＰＮＳ）法である（Ｍａｎｓｏｕｒら，１９８８，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｔｒｅｎ
ｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．５：７０−７６）。ＰＮＳ法は、高レベルで発現され
ない遺伝子をターゲッティングするのに、より効率的である。なぜなら、該マー
カー遺伝子がそれ自体のプロモーターを有するからである。単純ヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用しガンシクロビル（ＧＡＮＣ
）、ＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ２−フルオロ−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル
）−５−ヨードウラシル）などのヘルペス薬でその非相同挿入に対して選択する
ことにより、非相同組換え体を選択する。この対抗選択により、生存している形
質転換体のうちの相同組換え体の割合を増加させることができる。
【０１０６】 トランスジェニックマウスを製造するための他の方法は、受精卵の雄性前核を
微量注入することを含む。そのような方法は当技術分野でよく知られている。
微量注入することを含む。そのような方法は当技術分野でよく知られている。
【０１０７】 本発明を更に例示するために、以下に非限定的な実施例を記載する。 実施例１ヒトＫＣＮＱ５遺伝子の同定およびｃＤＮＡクローニング ＰＡＣクローンからのショットガンシークエンシング用のライブラリーの構築
ＫＣＮＱ５ ＰＡＣ（Ｐ１人工染色体）を含有する細菌株をＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌａ，ＡＬ）から受け取った。細胞を、
適当な抗生物質で補足されたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天プレート
上でストリークした。単一のコロニーを使用して、５ｍｌの出発培養物を、つい
で１Ｌの一晩培養物（ＬＢ培地内）を調製した。該細胞を遠心分離によりペレッ
ト化し、ＰＡＣ ＤＮＡを塩化セシウム−臭化エチジウム勾配中の平衡遠心分離
により精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，
１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。精製されたＰＡＣ ＤＮＡを２ｍｌの容積中の５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２および２５％グリセロールに
移し、ＡＥＲＯ−ＭＩＳＴネブライザー（ＣＩＳ−ＵＳ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ
）中に配置した。該ネブライザーを窒素ガス源につなぎ、該ＤＮＡをランダムに
１０ｐｓｉで３０秒間剪断した。該剪断ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ＴＥ（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。それらの末端をマング
マメ・ヌクレアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）での３０℃で３
０分間の処理およびそれに続くフェノール／クロロホルム抽出および４０μＭ
ｄＮＴＰの存在下のマルチコアバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ）中の１６℃におけるＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）での処理により平滑化した。該ＤＮＡ断片のサ
ブクローニングを促進させるために、ＢｓｔＸ Ｉアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を該断片にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で１４℃で一晩連結した。ｃＤＮＡサイジング
カラム（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を該製造業者
から提供された説明書に従い使用するカラムクロマトグラフィーにより、５００
ｂｐ未満のＤＮＡ断片およびアダプターを除去した。１ｋｂを超えるＤＮＡを含
有する画分をプールし、エタノール沈殿により濃縮した。ｐｃＤＮＡ ＩＩ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）からのＢｓｔＸ Ｉ部位をｐＢｌ
ｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＢｓｓ
Ｈ ＩＩ部位にサブクローニングすることにより構築されたｐＳＨＯＴ ＩＩの
ＢｓａＸ Ｉ部位に、ＢｓｔＸ Ｉアダプターを含有するＤＮＡ断片を連結した
。ｐＳＨＯＴ ＩＩは、ＢｓｔＸ Ｉ制限エンドヌクレアーゼでの消化により調
製し、アガロースゲル電気泳動により精製した。Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（Ｂｉ
ｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）プロトコールに従うことにより、該ゲル精
製ベクターＤＮＡを該アガロースから抽出した。該ベクターを自己連結を減少さ
せるために、その消化されたベクターをウシ腸ホスファターゼ（ＧＩＢＣＯ／Ｂ
ＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で処理した。該ＤＮＡ断片と該クロー
ニングベクターとの連結反応物を超（ｕｌｔｒａ）コンピテントＸＬ−２ Ｂｌ
ｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内に形質転換し、
１００μｇ／ｍｌアンピシリンで補足されたＬＢ寒天プレート上でプレーティン
グした。個々のコロニーを、アンピシリンで補足された１００μｌ／ウェルのＬ
Ｂブロスを含有する９６ウェルプレート内に拾い入れ、３７℃で一晩培養した。
約２５μｌの８０％無菌グリセロールを各ウェルに加え、該培養を−８０℃で保
存した。
ＫＣＮＱ５ ＰＡＣ（Ｐ１人工染色体）を含有する細菌株をＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌａ，ＡＬ）から受け取った。細胞を、
適当な抗生物質で補足されたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天プレート
上でストリークした。単一のコロニーを使用して、５ｍｌの出発培養物を、つい
で１Ｌの一晩培養物（ＬＢ培地内）を調製した。該細胞を遠心分離によりペレッ
ト化し、ＰＡＣ ＤＮＡを塩化セシウム−臭化エチジウム勾配中の平衡遠心分離
により精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，
１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。精製されたＰＡＣ ＤＮＡを２ｍｌの容積中の５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２および２５％グリセロールに
移し、ＡＥＲＯ−ＭＩＳＴネブライザー（ＣＩＳ−ＵＳ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ
）中に配置した。該ネブライザーを窒素ガス源につなぎ、該ＤＮＡをランダムに
１０ｐｓｉで３０秒間剪断した。該剪断ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ＴＥ（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。それらの末端をマング
マメ・ヌクレアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）での３０℃で３
０分間の処理およびそれに続くフェノール／クロロホルム抽出および４０μＭ
ｄＮＴＰの存在下のマルチコアバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ）中の１６℃におけるＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）での処理により平滑化した。該ＤＮＡ断片のサ
ブクローニングを促進させるために、ＢｓｔＸ Ｉアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を該断片にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で１４℃で一晩連結した。ｃＤＮＡサイジング
カラム（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を該製造業者
から提供された説明書に従い使用するカラムクロマトグラフィーにより、５００
ｂｐ未満のＤＮＡ断片およびアダプターを除去した。１ｋｂを超えるＤＮＡを含
有する画分をプールし、エタノール沈殿により濃縮した。ｐｃＤＮＡ ＩＩ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）からのＢｓｔＸ Ｉ部位をｐＢｌ
ｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＢｓｓ
Ｈ ＩＩ部位にサブクローニングすることにより構築されたｐＳＨＯＴ ＩＩの
ＢｓａＸ Ｉ部位に、ＢｓｔＸ Ｉアダプターを含有するＤＮＡ断片を連結した
。ｐＳＨＯＴ ＩＩは、ＢｓｔＸ Ｉ制限エンドヌクレアーゼでの消化により調
製し、アガロースゲル電気泳動により精製した。Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（Ｂｉ
ｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）プロトコールに従うことにより、該ゲル精
製ベクターＤＮＡを該アガロースから抽出した。該ベクターを自己連結を減少さ
せるために、その消化されたベクターをウシ腸ホスファターゼ（ＧＩＢＣＯ／Ｂ
ＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で処理した。該ＤＮＡ断片と該クロー
ニングベクターとの連結反応物を超（ｕｌｔｒａ）コンピテントＸＬ−２ Ｂｌ
ｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内に形質転換し、
１００μｇ／ｍｌアンピシリンで補足されたＬＢ寒天プレート上でプレーティン
グした。個々のコロニーを、アンピシリンで補足された１００μｌ／ウェルのＬ
Ｂブロスを含有する９６ウェルプレート内に拾い入れ、３７℃で一晩培養した。
約２５μｌの８０％無菌グリセロールを各ウェルに加え、該培養を−８０℃で保
存した。
【０１０８】プラスミドＤＮＡの調製 グリセロールストックを使用して、１００μｇ／ｍｌアンピシリンで補足され
た５ｍｌのＬＢブロスに接種した。該接種は、手動により、または該９６ウェル
からの５ｍｌのブロスを含有する９６本のチューブに接種するようにプログラム
されたＴｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＲＳＰ １５０ロボット（Ｔｅｃａｎ Ａ
Ｇ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用することに
より行なった。該培養を、通気のために振とうしながら３７℃で一晩培養した。
細菌細胞を遠心分離によりペレット化し、該上清をデカントし、該細胞ペレット
を−２０℃で保存した。ＱＩＡＧＥＮ Ｂｉｏ Ｒｏｂｏｔ ９６００（ＱＩＡ
ＧＥＮ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）をＱｉａｗｅｌｌ Ｕｌｔｒａプロトコ
ールに従い使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。インサートの頻度およびサ
イズを試験するために、プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ Ｉ
Ｉで消化した。該制限エンドヌクレアーゼ産物のサイズをアガロースゲル電気泳
動により調べたところ、平均インサートサイズは１〜２ｋｂであった。
た５ｍｌのＬＢブロスに接種した。該接種は、手動により、または該９６ウェル
からの５ｍｌのブロスを含有する９６本のチューブに接種するようにプログラム
されたＴｅｃａｎ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＲＳＰ １５０ロボット（Ｔｅｃａｎ Ａ
Ｇ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用することに
より行なった。該培養を、通気のために振とうしながら３７℃で一晩培養した。
細菌細胞を遠心分離によりペレット化し、該上清をデカントし、該細胞ペレット
を−２０℃で保存した。ＱＩＡＧＥＮ Ｂｉｏ Ｒｏｂｏｔ ９６００（ＱＩＡ
ＧＥＮ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）をＱｉａｗｅｌｌ Ｕｌｔｒａプロトコ
ールに従い使用して、プラスミドＤＮＡを調製した。インサートの頻度およびサ
イズを試験するために、プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ Ｉ
Ｉで消化した。該制限エンドヌクレアーゼ産物のサイズをアガロースゲル電気泳
動により調べたところ、平均インサートサイズは１〜２ｋｂであった。
【０１０９】ショットガンクローンのＤＮＡ配列分析 ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ダイターミネーターサイクルシークエンシング簡易
反応キットをＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）と共に使用して、ＤＮＡ配列分析を行なった。
Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーでＤＮＡ配列分析を行なった。Ｐｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００中での増幅後、該伸長産物を精製し、ＡＢＩＰ
ＲＩＳＭ ３７７自動シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａ
ｌｋ，ＣＴ）上で分析した。調べるＤＮＡの１ｋｂ当たり約４個のシークエンシ
ング反応（９個のＰＡＣのそれぞれについて３８４個のシークエンシング反応）
を行なった。
反応キットをＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＦＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）と共に使用して、ＤＮＡ配列分析を行なった。
Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーでＤＮＡ配列分析を行なった。Ｐｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００中での増幅後、該伸長産物を精製し、ＡＢＩＰ
ＲＩＳＭ ３７７自動シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａ
ｌｋ，ＣＴ）上で分析した。調べるＤＮＡの１ｋｂ当たり約４個のシークエンシ
ング反応（９個のＰＡＣのそれぞれについて３８４個のシークエンシング反応）
を行なった。
【０１１０】ＤＮＡ配列の集合 ＤＮＡ配列の集合にはＰｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐを使用した。このプログラムは
、Ｄｒ．Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎにより開発されＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から許可されたものである。Ｐｈ
ｒｅｄ／Ｐｈｒａｐは以下のプログラムよりなる：塩基呼出し用のＰｈｒｅｄ、
配列の集合用のＰｈｒａｐ、配列比較用のＣｒｏｓｓｍａｔｃｈ、データの可視
化用のＣｏｎｓｅｄおよびＰｈｒａｐｖｉｅｗ、反復配列のスクリーニング用の
Ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ。ベクターおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ配列
をＣｒｏｓｓｍａｔｃｈにより同定し、該ＤＮＡ配列集合処理から取り出した。
ＤＮＡ配列の集合は、デフォルトＰｈｒａｐパラメーターを使用してＳｏｌａｒ
ｉｓ ２．５１オペレーティング・システム（Ｓｕｎ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を実行するＳＵＮ Ｅｎｔ
ｅｒｐｒｉｓｅ ４０００サーバー上で行なった。該配列の集合を、Ｃｏｎｓｅ
ｄおよびＰｈｒａｐｖｉｅｗを使用して更に解析した。
、Ｄｒ．Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎにより開発されＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から許可されたものである。Ｐｈ
ｒｅｄ／Ｐｈｒａｐは以下のプログラムよりなる：塩基呼出し用のＰｈｒｅｄ、
配列の集合用のＰｈｒａｐ、配列比較用のＣｒｏｓｓｍａｔｃｈ、データの可視
化用のＣｏｎｓｅｄおよびＰｈｒａｐｖｉｅｗ、反復配列のスクリーニング用の
Ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ。ベクターおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ配列
をＣｒｏｓｓｍａｔｃｈにより同定し、該ＤＮＡ配列集合処理から取り出した。
ＤＮＡ配列の集合は、デフォルトＰｈｒａｐパラメーターを使用してＳｏｌａｒ
ｉｓ ２．５１オペレーティング・システム（Ｓｕｎ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を実行するＳＵＮ Ｅｎｔ
ｅｒｐｒｉｓｅ ４０００サーバー上で行なった。該配列の集合を、Ｃｏｎｓｅ
ｄおよびＰｈｒａｐｖｉｅｗを使用して更に解析した。
【０１１１】ＫＣＮＱ５遺伝子のゲノム配列およびそのエキソン／イントロン体制 ＡｃｅＤＢパッケージのＢＬＡＳＴＮＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを使用して、
ＰＡＣ １４１Ｂ１からのゲノムＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋデータベース登録
体と比較した。この比較は最初は、公知カリウムチャンネル遺伝子ＫＣＮＱ１、
ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ４に対する相同性に基づき合計５個のエ
キソン（図１に記載のエキソン３（Ｄ）、４（Ａ）、５（Ｂ）、６（Ｅ）および
７（Ｃ））を示した。実施例２に記載のＲＣＣＡ技術を用いて、完全長ｃＤＮＡ
をヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーのプールからレスキューした。ＰＡＣ１４１
Ｂ１のｃＤＮＡ配列およびゲノム配列の比較は、合計８個のエキソン（図１に記
載のエキソン３〜１０）を示した。エキソン１、２および１１〜１４に対応する
ゲノム領域はＰＡＣ１４１Ｂ１中には存在しなかった。
ＰＡＣ １４１Ｂ１からのゲノムＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋデータベース登録
体と比較した。この比較は最初は、公知カリウムチャンネル遺伝子ＫＣＮＱ１、
ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ４に対する相同性に基づき合計５個のエ
キソン（図１に記載のエキソン３（Ｄ）、４（Ａ）、５（Ｂ）、６（Ｅ）および
７（Ｃ））を示した。実施例２に記載のＲＣＣＡ技術を用いて、完全長ｃＤＮＡ
をヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーのプールからレスキューした。ＰＡＣ１４１
Ｂ１のｃＤＮＡ配列およびゲノム配列の比較は、合計８個のエキソン（図１に記
載のエキソン３〜１０）を示した。エキソン１、２および１１〜１４に対応する
ゲノム領域はＰＡＣ１４１Ｂ１中には存在しなかった。
【０１１２】 エキソン２およびその右隣接イントロンに対応するゲノム領域を同定するため
に、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ
ＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオリ
ゴヌクレオチドＫＣＮ−２Ｌ２（ＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＴＴＧ
ＣＴＴＧ；配列番号１１）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ
，ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増
幅した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（Ａ
ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合された
ネスティドプライマーＫＣＮ−２Ｌ１（ＣＣＴＣＡＡＧＴＴＧＣＣＴＣＴＴＧＡ
ＴＣＣＴＧ；配列番号１３）でのＰＣＲ増幅に付した。
に、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ
ＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオリ
ゴヌクレオチドＫＣＮ−２Ｌ２（ＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＴＴＧ
ＣＴＴＧ；配列番号１１）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ
，ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増
幅した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（Ａ
ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合された
ネスティドプライマーＫＣＮ−２Ｌ１（ＣＣＴＣＡＡＧＴＴＧＣＣＴＣＴＴＧＡ
ＴＣＣＴＧ；配列番号１３）でのＰＣＲ増幅に付した。
【０１１３】 エキソン２およびその左隣接イントロンに対応するゲノム領域を同定するため
に、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ
ＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオリ
ゴヌクレオチドＫＣＮ−２Ｒ１（ＣＡＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＡＡＣＴＴＧＡ
ＧＧ；配列番号１５）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増幅し
た。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（ＡＣＴ
ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合されたネス
ティドプライマーＫＣＮ−２Ｒ２（ＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＧＴＧＣＴＣＡＧＧＧ
ＡＴＧＧＴＡＧＡ；配列番号１６）でのＰＣＲ増幅に付した。
に、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ
ＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオリ
ゴヌクレオチドＫＣＮ−２Ｒ１（ＣＡＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＣＡＡＣＴＴＧＡ
ＧＧ；配列番号１５）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増幅し
た。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（ＡＣＴ
ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合されたネス
ティドプライマーＫＣＮ−２Ｒ２（ＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＧＴＧＣＴＣＡＧＧＧ
ＡＴＧＧＴＡＧＡ；配列番号１６）でのＰＣＲ増幅に付した。
【０１１４】 エキソン１１およびその右隣接イントロンに対応するゲノム領域を同定するた
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１１Ｌ１（ＧＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＣＴ；
配列番号１７）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）か
ら購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増幅した。希
釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（ＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合されたネスティド
プライマーＫＣＮ−１１Ｌ２（ＧＡＴＧＡＴＧＴＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧ
ＧＡＴＧ；配列番号１８）でのＰＣＲ増幅に付した。
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１１Ｌ１（ＧＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＣＴ；
配列番号１７）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）か
ら購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増幅した。希
釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（ＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合されたネスティド
プライマーＫＣＮ−１１Ｌ２（ＧＡＴＧＡＴＧＴＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧ
ＧＡＴＧ；配列番号１８）でのＰＣＲ増幅に付した。
【０１１５】 エキソン１１およびその左隣接イントロンに対応するゲノム領域を同定するた
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１１Ｒ１（ＣＴＧＡＴＡＧＣＴＣＧＡＡＴＧＡＣＡＧ
ＴＴＴＴ；配列番号１９）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ
，ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増
幅した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（Ａ
ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合された
ネスティドプライマーＫＣＮ１１−Ｒ２（ＡＡＧＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＴ
ＣＴＴＣＣＡＣＴＧ；配列番号２０）でのＰＣＲ増幅に付した。
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１１Ｒ１（ＣＴＧＡＴＡＧＣＴＣＧＡＡＴＧＡＣＡＧ
ＴＴＴＴ；配列番号１９）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ
，ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増
幅した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（Ａ
ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合された
ネスティドプライマーＫＣＮ１１−Ｒ２（ＡＡＧＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＴ
ＣＴＴＣＣＡＣＴＧ；配列番号２０）でのＰＣＲ増幅に付した。
【０１１６】 エキソン１２およびその右隣接イントロンに対応するゲノム領域を同定するた
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１２Ｌ１（ＡＧＡ ＡＴＴ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＴＴ
ＣＡＴ ＧＴＴ ＧＣＡ；配列番号２１）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからの
ＤＮＡをＰＣＲ増幅した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープラ
イマーＡＰ２（ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１
４）と組合されたネスティドプライマーＫＣＮ−１２Ｌ２（ＡＡＡ ＣＧＧ Ａ
ＡＧ ＴＴＴ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＴＴ；配列番号２２）でのＰＣＲ増幅
に付した。
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１２Ｌ１（ＡＧＡ ＡＴＴ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＴＴ
ＣＡＴ ＧＴＴ ＧＣＡ；配列番号２１）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからの
ＤＮＡをＰＣＲ増幅した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープラ
イマーＡＰ２（ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１
４）と組合されたネスティドプライマーＫＣＮ−１２Ｌ２（ＡＡＡ ＣＧＧ Ａ
ＡＧ ＴＴＴ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＴＴ；配列番号２２）でのＰＣＲ増幅
に付した。
【０１１７】 エキソン１２およびその左隣接イントロンに対応するゲノム領域を同定するた
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１２Ｒ１（ＡＣＧ ＴＧＴ ＴＴＧ ＴＴＧ ＧＣＴ
ＴＴＴ ＡＡＴ ＴＣ；配列番号２３）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤ
ＮＡをＰＣＲ増幅した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライ
マーＡＰ２（ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４
）と組合されたネスティドプライマーＫＣＮ−１２Ｒ２（ＴＡＣ ＡＣＡ ＡＣ
Ａ ＴＧＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＡＣ；配列番号２４）でのＰＣＲ増幅に付した
。
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１２Ｒ１（ＡＣＧ ＴＧＴ ＴＴＧ ＴＴＧ ＧＣＴ
ＴＴＴ ＡＡＴ ＴＣ；配列番号２３）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤ
ＮＡをＰＣＲ増幅した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライ
マーＡＰ２（ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４
）と組合されたネスティドプライマーＫＣＮ−１２Ｒ２（ＴＡＣ ＡＣＡ ＡＣ
Ａ ＴＧＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＡＣ；配列番号２４）でのＰＣＲ増幅に付した
。
【０１１８】 エキソン１３およびその右隣接イントロンに対応するゲノム領域を同定するた
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１３Ｌ１（ＴＧＡＴＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＧＡＡＡＡ
ＧＧＧ；配列番号２５）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，
ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増幅
した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（ＡＣ
ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合されたネ
スティドプライマーＫＣＮ−１３Ｌ２（ＴＣＡＣＡＴＣＡＧＡＴＡＡＧＡＡＧＡ
ＧＣＣＧＡ；配列番号２６）でのＰＣＲ増幅に付した。
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１３Ｌ１（ＴＧＡＴＣＡＡＡＴＴＣＴＴＧＧＡＡＡＡ
ＧＧＧ；配列番号２５）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，
ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増幅
した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（ＡＣ
ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合されたネ
スティドプライマーＫＣＮ−１３Ｌ２（ＴＣＡＣＡＴＣＡＧＡＴＡＡＧＡＡＧＡ
ＧＣＣＧＡ；配列番号２６）でのＰＣＲ増幅に付した。
【０１１９】 エキソン１３およびその左隣接イントロンに対応するゲノム領域を同定するた
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１３Ｒ１（ＧＴＴＴＴＴＣＡＡＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣ
ＣＣ；配列番号２７）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増幅し
た。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（ＡＣＴ
ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合されたネス
ティドプライマーＫＣＮ−１３Ｒ２（ＡＧＣＡＴＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＴＣＴＧ
ＴＧＧＴ；配列番号２８）でのＰＣＲ増幅に付した。
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−１３Ｒ１（ＧＴＴＴＴＴＣＡＡＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣ
ＣＣ；配列番号２７）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰＣＲ増幅し
た。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ２（ＡＣＴ
ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合されたネス
ティドプライマーＫＣＮ−１３Ｒ２（ＡＧＣＡＴＡＣＴＧＡＧＡＴＣＧＴＣＴＧ
ＴＧＧＴ；配列番号２８）でのＰＣＲ増幅に付した。
【０１２０】 エキソン１４およびその左隣接イントロンに対応するゲノム領域を同定するた
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−２５４３Ｒ（ＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴ
ＣＴＣＴＧＴＣ；配列番号２９）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａ
ｌｔｏ，ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰ
ＣＲ増幅した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ
２（ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合
されたネスティドプライマーＫＣＮ−２５１２Ｒ（ＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＴ
ＣＡＴＣＡＧＴＴＡ；配列番号３０）でのＰＣＲ増幅に付した。
めに、アダプタープライマーＡＰ１（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号１２）と組合されたＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡからのオ
リゴヌクレオチドＫＣＮ−２５４３Ｒ（ＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴ
ＣＴＣＴＧＴＣ；配列番号２９）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａ
ｌｔｏ，ＣＡ）から購入したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤＮＡをＰ
ＣＲ増幅した。希釈されたＰＣＲ産物を、ネスティドアダプタープライマーＡＰ
２（ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ；配列番号１４）と組合
されたネスティドプライマーＫＣＮ−２５１２Ｒ（ＧＧＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＴ
ＣＡＴＣＡＧＴＴＡ；配列番号３０）でのＰＣＲ増幅に付した。
【０１２１】 これらのＰＣＲ増幅から得られた産物を、ＡＢＩ ３７７シークエンサーを標
準的なプロトコールに従い使用して分析した。該完全長ＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡ５
配列とＰＡＣ１４１Ｂ１の配列およびＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤ
ＮＡでのＰＣＲ反応で得られた配列との比較は、該ＫＣＮＱ５遺伝子の全１４個
のエキソンを示した。ＫＣＮＱ５遺伝子内のエキソン／イントロン境界の厳密な
配列をエキソン２〜１４に関して決定した。全イントロンにおけるスプライスシ
グナルは、公開されているコンセンサス配列と一致している。
準的なプロトコールに従い使用して分析した。該完全長ＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡ５
配列とＰＡＣ１４１Ｂ１の配列およびＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットからのＤ
ＮＡでのＰＣＲ反応で得られた配列との比較は、該ＫＣＮＱ５遺伝子の全１４個
のエキソンを示した。ＫＣＮＱ５遺伝子内のエキソン／イントロン境界の厳密な
配列をエキソン２〜１４に関して決定した。全イントロンにおけるスプライスシ
グナルは、公開されているコンセンサス配列と一致している。
【０１２２】 実施例２ＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡのクローニング ＫＣＮＱ５のエキソン３（Ｄ）、４（Ａ）、５（Ｂ）、６（Ｅ）および７（Ｃ
）とマッチするｃＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を、ＰＡＣ １４１Ｂ１のゲノム配列
から推定した。ついで、ＲＣＣＡ反応で得られたＰＣＲ断片を配列決定したとこ
ろ、ヒト胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリー中のこの断片の存在が確認された。
この元のｃＤＮＡ断片は、図２における対応する３６８〜１，００４を有するｃ
ＤＮＡ領域に対応する。
）とマッチするｃＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を、ＰＡＣ １４１Ｂ１のゲノム配列
から推定した。ついで、ＲＣＣＡ反応で得られたＰＣＲ断片を配列決定したとこ
ろ、ヒト胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリー中のこの断片の存在が確認された。
この元のｃＤＮＡ断片は、図２における対応する３６８〜１，００４を有するｃ
ＤＮＡ領域に対応する。
【０１２３】 リデュースト・コンプレクシエティ（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ
）ｃＤＮＡ分析（ＲＣＣＡ）と称されるＰＣＲに基づく技術を用いて、この元の
ｃＤＮＡ断片を伸長させた。ＲＣＣＡは、Ｍｕｎｒｏｅら，１９９５，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：２２０９−２２１３およびＷｉ
ｌｆｉｎｇｅｒら，１９９７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：４８１−４
８６に報告されている方法に類似しており、約２０，０００個のｃＤＮＡクロー
ンのプールであるＰＣＲ鋳型に基づくものである。これは、該鋳型の複雑さを減
少させ、より長いＰＣＲ伸長物が得られる確率を増加させる。
）ｃＤＮＡ分析（ＲＣＣＡ）と称されるＰＣＲに基づく技術を用いて、この元の
ｃＤＮＡ断片を伸長させた。ＲＣＣＡは、Ｍｕｎｒｏｅら，１９９５，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：２２０９−２２１３およびＷｉ
ｌｆｉｎｇｅｒら，１９９７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：４８１−４
８６に報告されている方法に類似しており、約２０，０００個のｃＤＮＡクロー
ンのプールであるＰＣＲ鋳型に基づくものである。これは、該鋳型の複雑さを減
少させ、より長いＰＣＲ伸長物が得られる確率を増加させる。
【０１２４】 プライマーＫＣＮ−ＤＬ（ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＴＧＣＴＣＧ；配列
番号３１）およびＫＣＮ−ＥＲ（ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧ：
配列番号３２）を使用して４８３ｂｐのＰＣＲ産物を増幅することにより、９６
ウェルのヒト胎児脳プラスミドライブラリーをスキャン（１ウェル当たり２０，
０００個のクローン）した。ＰＣＲ分析により、８ウェルが、正しい４８３ｂｐ
断片を含有することが判明した。ついで、ベクター特異的プライマーと遺伝子特
異的プライマーとを使用して、プラスミドｃＤＮＡライブラリーを含有する陽性
ウェル上で５’および３’ＲＡＣＥを行なった。該インサートの配向が未知だっ
たため、該ベクター特異的プライマーＰＢＳ ５４３Ｒ（ＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣ
ＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡ；配列番号３３）およびＰＢＳ ８７３Ｆ（ＣＣＣＡＧＧ
ＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣ；配列番号３４）を共に、遺伝子特異
的プライマーＫＣＮ−ＤＬおよびＫＣＮ−ＥＲと組合せて使用した。該初期ＰＣ
Ｒ増幅の後、ネスティドベクタープライマーＰＢＳ ５７８Ｒ（ＣＣＡＧＧＧＴ
ＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ；配列番号３５）およびＰＢＳ ８３８Ｆ（Ｔ
ＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ；配列番号３６）ならびに
遺伝子特異的プライマーＫＣＮ−ＥＬ（ＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧ
ＣＣ；配列番号３７）およびＫＣＮ−ＤＲ１（ＡＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴ
ＴＣＧＡＧ；配列番号３８）を使用して、ネスティドＰＣＲ反応を行なった。該
ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ，ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製遠心カラムを標準
的なプロトコールで使用して、組込まれなかったｄＮＴＰおよびプライマーから
分離し、３０μｌの水に再懸濁させた。該産物を、標準的なプロトコールに従い
ＡＢＩ ３７７シークエンサー上で分析した。
番号３１）およびＫＣＮ−ＥＲ（ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧ：
配列番号３２）を使用して４８３ｂｐのＰＣＲ産物を増幅することにより、９６
ウェルのヒト胎児脳プラスミドライブラリーをスキャン（１ウェル当たり２０，
０００個のクローン）した。ＰＣＲ分析により、８ウェルが、正しい４８３ｂｐ
断片を含有することが判明した。ついで、ベクター特異的プライマーと遺伝子特
異的プライマーとを使用して、プラスミドｃＤＮＡライブラリーを含有する陽性
ウェル上で５’および３’ＲＡＣＥを行なった。該インサートの配向が未知だっ
たため、該ベクター特異的プライマーＰＢＳ ５４３Ｒ（ＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣ
ＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡ；配列番号３３）およびＰＢＳ ８７３Ｆ（ＣＣＣＡＧＧ
ＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣ；配列番号３４）を共に、遺伝子特異
的プライマーＫＣＮ−ＤＬおよびＫＣＮ−ＥＲと組合せて使用した。該初期ＰＣ
Ｒ増幅の後、ネスティドベクタープライマーＰＢＳ ５７８Ｒ（ＣＣＡＧＧＧＴ
ＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ；配列番号３５）およびＰＢＳ ８３８Ｆ（Ｔ
ＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ；配列番号３６）ならびに
遺伝子特異的プライマーＫＣＮ−ＥＬ（ＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧ
ＣＣ；配列番号３７）およびＫＣＮ−ＤＲ１（ＡＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴ
ＴＣＧＡＧ；配列番号３８）を使用して、ネスティドＰＣＲ反応を行なった。該
ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ，ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製遠心カラムを標準
的なプロトコールで使用して、組込まれなかったｄＮＴＰおよびプライマーから
分離し、３０μｌの水に再懸濁させた。該産物を、標準的なプロトコールに従い
ＡＢＩ ３７７シークエンサー上で分析した。
【０１２５】 図２における対応物２７８〜１，４５６を有するｃＤＮＡ領域に対応する「Ｋ
ＣＮコンセンサス２ １６ ９９」と称されるコンティグに、ＰＣＲ断片を集合
させた。第２ラウンドのＲＣＣＡ分析を行なって、「ＫＣＮコンセンサス２ １
６ ９９」と称されるｃＤＮＡコンティグの３’末端に伸長するクローンを得た
。「ＫＣＮコンセンサス２ １６ ９９」と称されるｃＤＮＡコンティグの３’
配列から誘導されたプライマーＫＣＮ−１１Ｌ１（ＧＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＴＧ
ＧＣＡＣＴ；配列番号１７）およびＫＣＮ−１１Ｒ１（ＣＴＧＡＴＡＧＣＴＣＧ
ＡＡＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴ；配列番号１９）を使用して１１７ｂｐのＰＣＲ産物
を増幅することにより、９６ウェルのヒト胎児脳プラスミドライブラリーをスキ
ャン（１ウェル当たり２０，０００個のクローン）した。ＰＣＲ分析により、多
数のウェルが、正しい１１７ｂｐ断片を含有することが判明した。ついで、ベク
ター特異的プライマーと遺伝子特異的プライマーとを使用して、プラスミドｃＤ
ＮＡライブラリーを含有する陽性ウェル上で３’ＲＡＣＥを行なった。該インサ
ートの配向が未知だったため、ベクター特異的プライマーＰＢＳ ５４３Ｒ（Ｇ
ＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡ；配列番号３３）およびＰＢＳ ８７
３Ｆ（ＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣ；配列番号３４）
を共に、遺伝子特異的プライマーＫＣＮ−１１Ｌ１（ＧＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＴ
ＧＧＣＡＣＴ；配列番号１７）と組合せて使用した。該初期ＰＣＲ増幅の後、ネ
スティドベクタープライマーＰＢＳ ５７８Ｒ（ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡ
ＧＴＣＡＣＧＡＣ；配列番号３５）およびＰＢＳ ８３８Ｆ（ＴＴＧＴＧＴＧＧ
ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ；配列番号３６）ならびに遺伝子特異的プ
ライマーＫＣＮ１１−Ｒ２（ＡＡＧＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
ＣＴＧ；配列番号２０）を使用して、ネスティドＰＣＲ反応を行なった。該ＰＣ
Ｒ産物を、Ｑｉａｇｅｎ，ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製遠心カラムを標準的な
プロトコールで使用して、組込まれなかったｄＮＴＰおよびプライマーから分離
し、３０μｌの水に再懸濁させた。該産物を、標準的なプロトコールに従いＡＢ
Ｉ ３７７シークエンサー上で分析した。
ＣＮコンセンサス２ １６ ９９」と称されるコンティグに、ＰＣＲ断片を集合
させた。第２ラウンドのＲＣＣＡ分析を行なって、「ＫＣＮコンセンサス２ １
６ ９９」と称されるｃＤＮＡコンティグの３’末端に伸長するクローンを得た
。「ＫＣＮコンセンサス２ １６ ９９」と称されるｃＤＮＡコンティグの３’
配列から誘導されたプライマーＫＣＮ−１１Ｌ１（ＧＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＴＧ
ＧＣＡＣＴ；配列番号１７）およびＫＣＮ−１１Ｒ１（ＣＴＧＡＴＡＧＣＴＣＧ
ＡＡＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴ；配列番号１９）を使用して１１７ｂｐのＰＣＲ産物
を増幅することにより、９６ウェルのヒト胎児脳プラスミドライブラリーをスキ
ャン（１ウェル当たり２０，０００個のクローン）した。ＰＣＲ分析により、多
数のウェルが、正しい１１７ｂｐ断片を含有することが判明した。ついで、ベク
ター特異的プライマーと遺伝子特異的プライマーとを使用して、プラスミドｃＤ
ＮＡライブラリーを含有する陽性ウェル上で３’ＲＡＣＥを行なった。該インサ
ートの配向が未知だったため、ベクター特異的プライマーＰＢＳ ５４３Ｒ（Ｇ
ＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡ；配列番号３３）およびＰＢＳ ８７
３Ｆ（ＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣ；配列番号３４）
を共に、遺伝子特異的プライマーＫＣＮ−１１Ｌ１（ＧＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＴ
ＧＧＣＡＣＴ；配列番号１７）と組合せて使用した。該初期ＰＣＲ増幅の後、ネ
スティドベクタープライマーＰＢＳ ５７８Ｒ（ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡ
ＧＴＣＡＣＧＡＣ；配列番号３５）およびＰＢＳ ８３８Ｆ（ＴＴＧＴＧＴＧＧ
ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ；配列番号３６）ならびに遺伝子特異的プ
ライマーＫＣＮ１１−Ｒ２（ＡＡＧＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ
ＣＴＧ；配列番号２０）を使用して、ネスティドＰＣＲ反応を行なった。該ＰＣ
Ｒ産物を、Ｑｉａｇｅｎ，ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製遠心カラムを標準的な
プロトコールで使用して、組込まれなかったｄＮＴＰおよびプライマーから分離
し、３０μｌの水に再懸濁させた。該産物を、標準的なプロトコールに従いＡＢ
Ｉ ３７７シークエンサー上で分析した。
【０１２６】 図２における対応物２７８〜２，５２７を有するｃＤＮＡ領域に対応する「Ｋ
ＣＮコンセンサス２ １６ ９９」と称されるコンティグに、ＰＣＲ断片を集合
させた。第３ラウンドのＲＣＣＡ分析を行なって、「ＫＣＮコンセンサス２ １
６ ９９」と称されるｃＤＮＡコンティグの５’末端に伸長するクローンを得た
。「ＫＣＮコンセンサス２ １６ ９９」と称されるｃＤＮＡコンティグの５’
配列から誘導されたプライマーＫＣＮ−２Ｌ２（ＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴ
ＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＧ；配列番号１１）およびＫＣＮ−ＤＲ１（ＡＡＣＡＣＡ
ＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＡＧ；配列番号３８）を使用して２１４ｂｐのＰＣＲ
産物を増幅することにより、９６ウェルのヒト胎児脳プラスミドライブラリーを
スキャン（１ウェル当たり２０，０００個のクローン）した。ＰＣＲ分析により
、多数のウェルが、正しい２１４ｂｐ断片を含有することが判明した。ついで、
ベクター特異的プライマーと遺伝子特異的プライマーとを使用して、プラスミド
ｃＤＮＡライブラリーを含有する陽性ウェル上で５’ＲＡＣＥを行なった。該イ
ンサートの配向が未知だったため、ベクター特異的プライマーＰＢＳ ５４３Ｒ
（ＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡ；配列番号３３）およびＰＢＳ
８７３Ｆ（ＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣ；配列番号３
４）を共に、遺伝子特異的プライマーＫＣＮ−ＤＲ１（ＡＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧ
ＧＣＴＴＴＣＧＡＧ；配列番号３８）と組合せて使用した。該初期ＰＣＲ増幅の
後、ネスティドベクタープライマーＰＢＳ ５７８Ｒ（ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣ
ＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ；配列番号３５）およびＰＢＳ ８３８Ｆ（ＴＴＧＴＧ
ＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ；配列番号３６）ならびに遺伝子特
異的プライマーＫＣＮ−ＤＲ２（ＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＣ；
配列番号３９）を使用して、ネスティドＰＣＲ反応を行なった。該ＰＣＲ産物を
、Ｑｉａｇｅｎ，ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製遠心カラムを標準的なプロトコ
ールで使用して、組込まれなかったｄＮＴＰおよびプライマーから分離し、３０
μｌの水に再懸濁させた。該産物を、標準的なプロトコールに従いＡＢＩ ３７
７シークエンサー上で分析した。
ＣＮコンセンサス２ １６ ９９」と称されるコンティグに、ＰＣＲ断片を集合
させた。第３ラウンドのＲＣＣＡ分析を行なって、「ＫＣＮコンセンサス２ １
６ ９９」と称されるｃＤＮＡコンティグの５’末端に伸長するクローンを得た
。「ＫＣＮコンセンサス２ １６ ９９」と称されるｃＤＮＡコンティグの５’
配列から誘導されたプライマーＫＣＮ−２Ｌ２（ＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴ
ＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＧ；配列番号１１）およびＫＣＮ−ＤＲ１（ＡＡＣＡＣＡ
ＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＣＧＡＧ；配列番号３８）を使用して２１４ｂｐのＰＣＲ
産物を増幅することにより、９６ウェルのヒト胎児脳プラスミドライブラリーを
スキャン（１ウェル当たり２０，０００個のクローン）した。ＰＣＲ分析により
、多数のウェルが、正しい２１４ｂｐ断片を含有することが判明した。ついで、
ベクター特異的プライマーと遺伝子特異的プライマーとを使用して、プラスミド
ｃＤＮＡライブラリーを含有する陽性ウェル上で５’ＲＡＣＥを行なった。該イ
ンサートの配向が未知だったため、ベクター特異的プライマーＰＢＳ ５４３Ｒ
（ＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡ；配列番号３３）およびＰＢＳ
８７３Ｆ（ＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣ；配列番号３
４）を共に、遺伝子特異的プライマーＫＣＮ−ＤＲ１（ＡＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧ
ＧＣＴＴＴＣＧＡＧ；配列番号３８）と組合せて使用した。該初期ＰＣＲ増幅の
後、ネスティドベクタープライマーＰＢＳ ５７８Ｒ（ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣ
ＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ；配列番号３５）およびＰＢＳ ８３８Ｆ（ＴＴＧＴＧ
ＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ；配列番号３６）ならびに遺伝子特
異的プライマーＫＣＮ−ＤＲ２（ＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＣ；
配列番号３９）を使用して、ネスティドＰＣＲ反応を行なった。該ＰＣＲ産物を
、Ｑｉａｇｅｎ，ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製遠心カラムを標準的なプロトコ
ールで使用して、組込まれなかったｄＮＴＰおよびプライマーから分離し、３０
μｌの水に再懸濁させた。該産物を、標準的なプロトコールに従いＡＢＩ ３７
７シークエンサー上で分析した。
【０１２７】 図２における対応物１〜２，５２７を有するｃＤＮＡ領域に対応する「ＫＣＮ
コンセンサス３ ３ ９９」と称されるコンティグに、ＰＣＲ断片を集合させた
。第４ラウンドのＲＣＣＡ分析を行なって、「ＫＣＮコンセンサス３ ３ ９９
」と称されるｃＤＮＡコンティグの３’末端に伸長するクローンを得た。「ＫＣ
Ｎコンセンサス３ ３ ９９」と称されるｃＤＮＡコンティグの３’配列から誘
導されたプライマーＫＣＮ−２１０６Ｌ（ＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＴＴＴ
ＡＣＡ；配列番号４０）およびＫＣＮ−２２５０Ｒ（ＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＧＧ
ＡＧＧＣＡＡＣＡ；配列番号４１）を使用して１４５ｂｐのＰＣＲ産物を増幅す
ることにより、９６ウェルのヒト胎児脳プラスミドライブラリーをスキャン（１
ウェル当たり２０，０００個のクローン）した。ＰＣＲ分析により、多数のウェ
ルが、正しい２１４ｂｐ断片を含有することが判明した。ついで、ベクター特異
的プライマーと遺伝子特異的プライマーとを使用して、該プラスミドｃＤＮＡラ
イブラリーを含有する陽性ウェル上で５’ＲＡＣＥを行なった。該インサートの
配向が未知だったため、ベクター特異的プライマーＰＢＳ ５４３Ｒ（ＧＧＧＧ
ＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡ；配列番号３３）およびＰＢＳ ８７３Ｆ（
ＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣ；配列番号３４）を共に
、遺伝子特異的プライマーＫＣＮ−２１０６Ｌ（ＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣ
ＴＴＴＡＣＡ；配列番号４０）と組合せて使用した。該初期ＰＣＲ増幅の後、ネ
スティドベクタープライマーＰＢＳ ５７８Ｒ（ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡ
ＧＴＣＡＣＧＡＣ；配列番号３５）およびＰＢＳ ８３８Ｆ（ＴＴＧＴＧＴＧＧ
ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ；配列番号３６）ならびに遺伝子特異的プ
ライマーＫＣＮ−２１６５Ｌ（ＧＣＣＡＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣＴＡ；配
列番号４２）を使用して、ネスティドＰＣＲ反応を行なった。該ＰＣＲ産物を、
Ｑｉａｇｅｎ，ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製遠心カラムを標準的なプロトコー
ルで使用して、組込まれなかったｄＮＴＰおよびプライマーから分離し、３０μ
ｌの水に再懸濁させた。該産物を、標準的なプロトコールに従いＡＢＩ ３７７
シークエンサー上で分析した。図２に示すｃＤＮＡ配列に対応する「ＫＣＮコン
センサス３ １５ ９９」と称されるコンティグに、ＰＣＲ断片を集合させた。
コンセンサス３ ３ ９９」と称されるコンティグに、ＰＣＲ断片を集合させた
。第４ラウンドのＲＣＣＡ分析を行なって、「ＫＣＮコンセンサス３ ３ ９９
」と称されるｃＤＮＡコンティグの３’末端に伸長するクローンを得た。「ＫＣ
Ｎコンセンサス３ ３ ９９」と称されるｃＤＮＡコンティグの３’配列から誘
導されたプライマーＫＣＮ−２１０６Ｌ（ＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＴＴＴ
ＡＣＡ；配列番号４０）およびＫＣＮ−２２５０Ｒ（ＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＧＧ
ＡＧＧＣＡＡＣＡ；配列番号４１）を使用して１４５ｂｐのＰＣＲ産物を増幅す
ることにより、９６ウェルのヒト胎児脳プラスミドライブラリーをスキャン（１
ウェル当たり２０，０００個のクローン）した。ＰＣＲ分析により、多数のウェ
ルが、正しい２１４ｂｐ断片を含有することが判明した。ついで、ベクター特異
的プライマーと遺伝子特異的プライマーとを使用して、該プラスミドｃＤＮＡラ
イブラリーを含有する陽性ウェル上で５’ＲＡＣＥを行なった。該インサートの
配向が未知だったため、ベクター特異的プライマーＰＢＳ ５４３Ｒ（ＧＧＧＧ
ＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡ；配列番号３３）およびＰＢＳ ８７３Ｆ（
ＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣ；配列番号３４）を共に
、遺伝子特異的プライマーＫＣＮ−２１０６Ｌ（ＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣ
ＴＴＴＡＣＡ；配列番号４０）と組合せて使用した。該初期ＰＣＲ増幅の後、ネ
スティドベクタープライマーＰＢＳ ５７８Ｒ（ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡ
ＧＴＣＡＣＧＡＣ；配列番号３５）およびＰＢＳ ８３８Ｆ（ＴＴＧＴＧＴＧＧ
ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ；配列番号３６）ならびに遺伝子特異的プ
ライマーＫＣＮ−２１６５Ｌ（ＧＣＣＡＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣＴＡ；配
列番号４２）を使用して、ネスティドＰＣＲ反応を行なった。該ＰＣＲ産物を、
Ｑｉａｇｅｎ，ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製遠心カラムを標準的なプロトコー
ルで使用して、組込まれなかったｄＮＴＰおよびプライマーから分離し、３０μ
ｌの水に再懸濁させた。該産物を、標準的なプロトコールに従いＡＢＩ ３７７
シークエンサー上で分析した。図２に示すｃＤＮＡ配列に対応する「ＫＣＮコン
センサス３ １５ ９９」と称されるコンティグに、ＰＣＲ断片を集合させた。
【０１２８】 実施例３ＫＣＮＱ５の発現の分析 ＲＴ−ＰＣＲ： Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手可能な「クイック−
クローン（ｑｕｉｃｋ−ｃｌｏｎｅ）」ヒトｃＤＮＡサンプル上でＲＴ−ＰＣＲ
実験を行なった。心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓および網膜由
来のｃＤＮＡサンプルを、以下のＰＣＲ条件中、プライマーＫＣＮ−ＤＬ（ＧＧ
ＡＡＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＴＧＣＴＣＧ；配列番号３１）およびＫＣＮ−ＥＲ（
ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧ；配列番号３２）で増幅した。 １． ９４℃ １０分間 ２． ９４℃ ３０秒間 ３． ７２℃ ２分間（１サイクルごとにこの温度を１．１℃ずつ減少させる
） ４． ７２℃ ２分間 ５． 更に２１回、工程２に移行 ６． ９４℃ ３０秒間 ７． ５５℃ ２分間 ８． ７２℃ ２分間 ９． 更に１９回、工程６に移行 １０． ７２℃ ７分間 １１．４℃
クローン（ｑｕｉｃｋ−ｃｌｏｎｅ）」ヒトｃＤＮＡサンプル上でＲＴ−ＰＣＲ
実験を行なった。心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓および網膜由
来のｃＤＮＡサンプルを、以下のＰＣＲ条件中、プライマーＫＣＮ−ＤＬ（ＧＧ
ＡＡＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＴＧＣＴＣＧ；配列番号３１）およびＫＣＮ−ＥＲ（
ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧ；配列番号３２）で増幅した。 １． ９４℃ １０分間 ２． ９４℃ ３０秒間 ３． ７２℃ ２分間（１サイクルごとにこの温度を１．１℃ずつ減少させる
） ４． ７２℃ ２分間 ５． 更に２１回、工程２に移行 ６． ９４℃ ３０秒間 ７． ５５℃ ２分間 ８． ７２℃ ２分間 ９． 更に１９回、工程６に移行 １０． ７２℃ ７分間 １１．４℃
【０１２９】 ＫＣＮＱ５遺伝子は、ヒト網膜および脳において主に発現されることが判明し
た（図３Ｂ）。
た（図３Ｂ）。
【０１３０】 ノーザンブロット分析： ヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓に由来するポリ（Ａ＋
）−ＲＮＡを含有するノーザンブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ，ＣＡから購入した。プライマーＫＣＮ−ＤＬ（ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＧＴ
ＴＴＧＣＴＣＧ；配列番号３１）およびＫＣＮ−ＥＲ（ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧ
ＣＡＡＡＧＡＡＡＧ；配列番号３２）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡから入手したクイック−クローン・ヒト網膜ｃＤＮＡから４８
３ｂｐのＰＣＲ産物を増幅した。この断片をアガロースゲル上で精製し、該ＤＮ
Ａを抽出し、ノーザンブロットハイブリダイゼーション用のプローブとして使用
した。
）−ＲＮＡを含有するノーザンブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ，ＣＡから購入した。プライマーＫＣＮ−ＤＬ（ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＧＴ
ＴＴＧＣＴＣＧ；配列番号３１）およびＫＣＮ−ＥＲ（ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧ
ＣＡＡＡＧＡＡＡＧ；配列番号３２）を使用して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡから入手したクイック−クローン・ヒト網膜ｃＤＮＡから４８
３ｂｐのＰＣＲ産物を増幅した。この断片をアガロースゲル上で精製し、該ＤＮ
Ａを抽出し、ノーザンブロットハイブリダイゼーション用のプローブとして使用
した。
【０１３１】 該プローブを、５０〜１００μＣｉの３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ［α ３２Ｐ］
ｄＣＴＰ（Ｄｕｐｏｎｔ／ＮＥＴ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）の存在下、Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅキット（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉ
Ｌ）でのランダムプライミングにより標識した。組込まれなかったヌクレオチド
をＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ Ｇ５０遠心カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で除去した。迅速（ｒａｐｉｄ）ハイブリ
ダイゼーションバッファー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中
の１×１０６ｃｐｍ／ｍｌを超える濃度の放射能標識プローブを、６５℃で一晩
インキュベートした。該ブロットを、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ（２０×Ｓ
ＳＣおよび２０％ ＳＤＳストック溶液から調製、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂ
ｕｒｇｈ，ＰＡ）中での室温で２回の１５分間のインキュベーションおよびそれ
に続くに１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での室温で２回の１５分間のインキュ
ベーションおよび０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での６０℃で２回の３０
分間のインキュベーションにより洗浄した。該放射能標識プローブに特異的にハ
イブリダイズしたバンドを可視化するために、該ブロットのオートラジオグラフ
ィーを行なった。
ｄＣＴＰ（Ｄｕｐｏｎｔ／ＮＥＴ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）の存在下、Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅキット（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉ
Ｌ）でのランダムプライミングにより標識した。組込まれなかったヌクレオチド
をＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ Ｇ５０遠心カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で除去した。迅速（ｒａｐｉｄ）ハイブリ
ダイゼーションバッファー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中
の１×１０６ｃｐｍ／ｍｌを超える濃度の放射能標識プローブを、６５℃で一晩
インキュベートした。該ブロットを、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ（２０×Ｓ
ＳＣおよび２０％ ＳＤＳストック溶液から調製、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂ
ｕｒｇｈ，ＰＡ）中での室温で２回の１５分間のインキュベーションおよびそれ
に続くに１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での室温で２回の１５分間のインキュ
ベーションおよび０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での６０℃で２回の３０
分間のインキュベーションにより洗浄した。該放射能標識プローブに特異的にハ
イブリダイズしたバンドを可視化するために、該ブロットのオートラジオグラフ
ィーを行なった。
【０１３２】 該プローブは、脳および網膜において主に発現されるｍＲＮＡ転写産物にハイ
ブリダイズした（図３Ａ）。
ブリダイズした（図３Ａ）。
【０１３３】 本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものではない
。実際のところ、前記の記載から、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々
の修飾が当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は、特許請求の範囲の
範囲内に含まれると意図される。
。実際のところ、前記の記載から、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々
の修飾が当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は、特許請求の範囲の
範囲内に含まれると意図される。
【０１３４】 本明細書には種々の刊行物が引用されているが、それらの開示の全体を、参照
により本明細書に組み入れることとする。
により本明細書に組み入れることとする。
【図１Ａ】 図１Ａ〜ＡＯは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
下線付きの大文字のヌクレオチドはエキソンを表す。エキソン（Ｅｘｏｎ）１中
の開始ＡＴＧコドンおよびエキソン１４中の終結ＴＡＡコドンは太字のイタリッ
ク体で示されている。Ｄ６Ｄ２８０遺伝的マーカーおよびホスホグリセリン酸偽
遺伝子は下線付きの太字で示されている。エキソン１および２、２および３、１
０および１１、１１および１２、１２および１３、ならびに１３および１４の間
のギャップの厳密な長さは未知である。これらのギャップは、便宜のため、連続
した１０個の太字のｎで表されている。
下線付きの大文字のヌクレオチドはエキソンを表す。エキソン（Ｅｘｏｎ）１中
の開始ＡＴＧコドンおよびエキソン１４中の終結ＴＡＡコドンは太字のイタリッ
ク体で示されている。Ｄ６Ｄ２８０遺伝的マーカーおよびホスホグリセリン酸偽
遺伝子は下線付きの太字で示されている。エキソン１および２、２および３、１
０および１１、１１および１２、１２および１３、ならびに１３および１４の間
のギャップの厳密な長さは未知である。これらのギャップは、便宜のため、連続
した１０個の太字のｎで表されている。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｃ】 図１Ｃは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｄ】 図１Ｄは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｅ】 図１Ｅは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｆ】 図１Ｆは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｇ】 図１Ｇは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｈ】 図１Ｈは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｉ】 図１Ｉは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｊ】 図１Ｊは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｋ】 図１Ｋは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｌ】 図１Ｌは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｍ】 図１Ｍは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｎ】 図１Ｎは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｏ】 図１Ｏは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｐ】 図１Ｐは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｑ】 図１Ｑは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｒ】 図１Ｒは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｓ】 図１Ｓは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｔ】 図１Ｔは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｕ】 図１Ｕは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｖ】 図１Ｖは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｗ】 図１Ｗは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｘ】 図１Ｘは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｙ】 図１Ｙは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｚ】 図１Ｚは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＡ】 図１ＡＡは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＢ】 図１ＡＢは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＣ】 図１ＡＣは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＤ】 図１ＡＤは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＥ】 図１ＡＥは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＦ】 図１ＡＦは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＧ】 図１ＡＧは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＨ】 図１ＡＨは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＩ】 図１ＡＩは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＪ】 図１ＡＪは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＫ】 図１ＡＫは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＬ】 図１ＡＬは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＭ】 図１ＡＭは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＮ】 図１ＡＮは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図１ＡＯ】 図１ＡＯは、ヒトＫＣＮＱ５のゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図２Ａ】 図２Ａ〜Ｅは、ヒトＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
【図２Ｂ】 図２Ａ〜Ｅは、ヒトＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
【図２Ｃ】 図２Ａ〜Ｅは、ヒトＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
【図２Ｄ】 図２Ａ〜Ｅは、ヒトＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
【図２Ｅ】 図２Ａ〜Ｅは、ヒトＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
およびコード化アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＡＴＧ開始コドンは１３８
位に存在し、ＴＡＡ終結コドンは２，６７６位に存在する。
【図３Ａ】 図３Ａは、種々のヒト組織におけるＫＣＮＱ５ ｍＲＮＡの発現のノーザンブ
ロットの結果を示す。
ロットの結果を示す。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、種々のヒト組織におけるＫＣＮＱ５ ｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣ
Ｒ分析の結果を示す。
Ｒ分析の結果を示す。
【図４Ａ】 図４Ａは、ヒトＫＣＮＱ５タンパク質（配列番号３）とヒトＫＣＮＱ４タンパ
ク質（配列番号４）との配列アライメントを示す。示されているコンセンサス（
ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列は配列番号５である。
ク質（配列番号４）との配列アライメントを示す。示されているコンセンサス（
ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列は配列番号５である。
【図４Ｂ】 図４Ｂ〜Ｃは、ヒトＫＣＮＱ５タンパク質（配列番号３）、ヒトＫＣＮＱ１タ
ンパク質（配列番号４３）、ヒトＫＣＮＱ２タンパク質（配列番号６）、ヒトＫ
ＣＮＱ３タンパク質（配列番号７）およびヒトＫＣＮＱ４タンパク質（配列番号
４）の間の多配列アライメントを示す。示されているコンセンサス配列は配列番
号８である。
ンパク質（配列番号４３）、ヒトＫＣＮＱ２タンパク質（配列番号６）、ヒトＫ
ＣＮＱ３タンパク質（配列番号７）およびヒトＫＣＮＱ４タンパク質（配列番号
４）の間の多配列アライメントを示す。示されているコンセンサス配列は配列番
号８である。
【図４Ｃ】 図４Ｂ〜Ｃは、ヒトＫＣＮＱ５タンパク質（配列番号３）、ヒトＫＣＮＱ１タ
ンパク質（配列番号４３）、ヒトＫＣＮＱ２タンパク質（配列番号６）、ヒトＫ
ＣＮＱ３タンパク質（配列番号７）およびヒトＫＣＮＱ４タンパク質（配列番号
４）の間の多配列アライメントを示す。示されているコンセンサス配列は配列番
号８である。
ンパク質（配列番号４３）、ヒトＫＣＮＱ２タンパク質（配列番号６）、ヒトＫ
ＣＮＱ３タンパク質（配列番号７）およびヒトＫＣＮＱ４タンパク質（配列番号
４）の間の多配列アライメントを示す。示されているコンセンサス配列は配列番
号８である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/08 25/08 27/02 27/02 27/16 27/16 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 カースキー，シー・トーマス アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 リー，ウエン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 メツカー，マイケル・エル アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 GA11 HA12 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ13 QQ43 QR08 QR32 QR42 QR56 QR77 QS25 QS34 QX02 QX05 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA14 AA17 BA01 BA08 BA23 BA35 BA44 CA53 CA56 CA59 NA13 NA14 ZA062 ZA222 ZA332 ZA342 ZA362 ZA662 ZA942 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74
Claims (21)
- 【請求項１】 ＫＣＮＱ５タンパク質をコードするヌクレオチドを含んでな
る単離されたＤＮＡ。 - 【請求項２】 アミノ酸配列配列番号３を有するポリペプチドをコードする
ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号１、配列番号２および配列番号２の１３８〜２，６
７５位よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＤＮ
Ａ。 - 【請求項４】 配列番号１および配列番号２よりなる群から選ばれるヌクレ
オチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたＤＮＡ
。 - 【請求項５】 請求項１に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
- 【請求項６】 請求項１に記載のＤＮＡを含んでなる組換え宿主細胞。
- 【請求項７】 単離されたＫＣＮＱ５タンパク質。
- 【請求項８】 アミノ酸配列配列番号３を有する、請求項７に記載のＫＣＮ
Ｑ５タンパク質。 - 【請求項９】 単一のアミノ酸置換を含有する、請求項８に記載のＫＣＮＱ
５タンパク質。 - 【請求項１０】 ２以上のアミノ酸置換（該アミノ酸置換は、ＫＣＮＱ５中
で置換されたアミノ酸がＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３またはＫＣＮＱ４のいずれか１
つの対応位置にも存在する位置には存在しない）を含有する、請求項８に記載の
ＫＣＮＱ５タンパク質。 - 【請求項１１】 ＫＣＮＱ５タンパク質（該ＫＣＮＱ５タンパク質はアミノ
酸配列配列番号３を有する）に特異的に結合する抗体。 - 【請求項１２】 患者がシュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジス
トロフィ、サラ病または老人性黄斑変性を有するか否かを診断する方法であって
、該患者からのＫＣＮＱ５遺伝子の領域のＤＮＡ配列を決定し、その配列を、非
罹患者（すなわち、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ
、サラ病または老人性黄斑変性を有さない者）からのＫＣＮＱ５遺伝子の対応領
域からの配列と比較することを含んでなり、該患者からのＫＣＮＱ５遺伝子のＤ
ＮＡ配列と該非罹患者からのＫＣＮＱ５遺伝子のＤＮＡ配列との配列における相
違が、該患者がシュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジストロフィ、サ
ラ病または老人性黄斑変性を有することを示すことを特徴とする方法。 - 【請求項１３】 患者がＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を保持するか否かを
診断する方法であって、 （ａ）該患者からＤＮＡサンプルを準備し、 （ｂ）配列番号１または配列番号２に基づき１組のＰＣＲプライマーを準備し
、 （ｃ）該ＤＮＡサンプル上でＰＣＲを行なって、該患者からのＰＣＲ断片を得
、 （ｄ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を決定し、 （ｅ）該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を配列番号１または配列番
号２のヌクレオチド配列と比較することを含んでなり、 該患者からのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列と配列番号１または配列番号２の
ヌクレオチド配列との相違が、該患者がＫＣＮＱ５遺伝子中に突然変異を保持す
ることを示すことを特徴とする方法。 - 【請求項１４】 該ＤＮＡサンプルがゲノムＤＮＡである、請求項１３に記
載の方法。 - 【請求項１５】 該ＤＮＡサンプルがｃＤＮＡである、請求項１３に記載の
方法。 - 【請求項１６】 配列番号１および配列番号２よりなる群から選ばれる配列
の少なくとも１つの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含んでなるＤＮ
ＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項１７】 物質がＫＣＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タ
ンパク質のアクチベーターまたはインヒビターのいずれであるかを決定するため
の方法であって、 （ａ）ＫＣＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質を宿主細胞
内で組換え的に発現させ、 （ｂ）ＫＣＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質のアクチベ
ーターまたはインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在下でＫＣ
ＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質の生物活性を測定するこ
とを含んでなり、 該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下での該ＫＣＮＱ５タンパク
質または該突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質の生物活性における変化が、該物質が
ＫＣＮＱ５タンパク質または突然変異ＫＣＮＱ５タンパク質のアクチベーターま
たはインヒビターであることを示すことを特徴とする方法。 - 【請求項１８】 ＫＣＮＱ５のインヒビターを同定する方法であって、 （ａ）ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内でＫＣＮＱ５タンパク質を発
現させ、 （ｂ）ＫＣＮＱ５のインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在
下で該卵母細胞の膜電位を変化させ、 （ｃ）工程（ｂ）の後に膜カリウム電流を測定することを含んでなり、 工程（ｃ）において測定したカリウム膜電流が、該物質の存在下より不存在下
において大きい場合、該物質がＫＣＮＱ５のインヒビターであることを特徴とす
る方法。 - 【請求項１９】 ＫＣＮＱ５のアクチベーターを同定する方法であって、 （ａ）試験細胞を準備し（該試験細胞は、 （１）該細胞内でのＫＣＮＱ５の発現を指令する発現ベクター、 （２）該形質膜の一方の側に結合している第１蛍光染料、および （３）膜電位の変化に応答して該形質膜の一方の面から他方の面へ自由
に往復できる第２蛍光染料を含む）、 （ｂ）ＫＣＮＱ５のアクチベーターであると疑われる物質に該試験細胞をさ
らし、 （ｃ）該物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲ
ＥＴ）の量を測定し、 （ｄ）該物質にさらされた試験細胞により示されたＦＲＥＴの量を、対照細
胞により示されたＦＲＥＴの量と比較することを含んでなり、 該試験細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該対照細胞により示されたＦＲ
ＥＴの量より多い場合、該物質がＫＣＮＱ５のアクチベーターであり、 該対照細胞が、（１）それが（ａ）（１）〜（３）に記載の事項の少なくと
も１つを含まないこと以外は該試験細胞と実質的に同じであるが、該物質にさら
された細胞、または（２）該物質にさらされていない試験細胞であることを特徴
とする方法。 - 【請求項２０】 ＫＣＮＱ５のインヒビターを同定する方法であって、 （ａ）試験細胞を準備し（該試験細胞は、 （１）該細胞内でのＫＣＮＱ５の発現を指令する発現ベクター、 （２）該形質膜の一方の側に結合している第１蛍光染料、および （３）膜電位の変化に応答して該形質膜の一方の面から他方の面へ自由
に往復できる第２蛍光染料を含む）、 （ｂ）ＫＣＮＱ５のインヒビターであると疑われる物質に該試験細胞をさら
し、 （ｃ）該物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲ
ＥＴ）の量を測定し、 （ｄ）該物質にさらされた試験細胞により示されたＦＲＥＴの量を、対照細
胞により示されたＦＲＥＴの量と比較することを含んでなり、 該試験細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該対照細胞により示されたＦＲ
ＥＴの量より少ない場合、該物質がＫＣＮＱ５のインヒビターであり、 該対照細胞が、（１）それが（ａ）（１）〜（３）に記載の事項の少なくと
も１つを含まないこと以外は該試験細胞と実質的に同じであるが、該物質にさら
された細胞、または（２）該物質にさらされていない試験細胞であることを特徴
とする方法。 - 【請求項２１】 ＫＣＮＱ５タンパク質を含有する電位依存性カリウムチャ
ンネルのアクチベーターまたはインヒビターである物質の治療的に有効な量を患
者に投与することによる、シュタルガルト様黄斑ジストロフィ、錐体杆体ジスト
ロフィ、サラ病、老人性黄斑変性、他の形態の黄斑変性、難聴、てんかん、種々
の形態の神経精神科学的、心臓、胃腸および筋肉障害の治療方法。
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