JP2002543110A - Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using nanoparticles - Google Patents

Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using nanoparticles

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JP2002543110A
JP2002543110A JP2000614976A JP2000614976A JP2002543110A JP 2002543110 A JP2002543110 A JP 2002543110A JP 2000614976 A JP2000614976 A JP 2000614976A JP 2000614976 A JP2000614976 A JP 2000614976A JP 2002543110 A JP2002543110 A JP 2002543110A
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nanoparticles
target molecule
folate
complex
reacting
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マキュアン，ジョン，ファーガス
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バイオテック・オーストラリア・ピーティーワイ・リミテッド
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Abstract

(57)【要約】 【課題】葉酸塩を介した摂取系を利用する薬剤、ペプチドおよびタンパク性医薬品の送達に関する。 【解決手段】葉酸塩−ナノ粒子複合体を使用する葉酸塩摂取システムを利用する薬剤／医薬品送達の増幅に関する。また、該複合体、これを含む医薬組成物の調製方法、該複合体に関する治療方法、および薬物の製造における該複合体の使用にも関する。   (57) [Summary] The present invention relates to the delivery of drugs, peptides and proteinaceous pharmaceuticals utilizing a folate-mediated uptake system. Amplification of drug / pharmaceutical delivery utilizing a folate uptake system using a folate-nanoparticle complex. It also relates to the complex, a method for preparing a pharmaceutical composition comprising the same, a method for treating the complex, and the use of the complex in the manufacture of a medicament.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 （技術分野） 本発明は葉酸塩を介した摂取系を使用する薬剤、ペプチドおよびタンパク性医
薬品の送達に関する。より詳細には、本発明は葉酸塩−ナノ粒子複合体を使用す
る葉酸塩摂取系における薬剤／医薬品送達の増幅に関する。本発明はまた、該複
合体の調製方法、複合体を含む医薬品組成物、該複合体に関与する治療方法およ
び薬物の製造における該複合体の使用に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to the delivery of drugs, peptides and proteinaceous pharmaceuticals using a folate mediated ingestion system. More specifically, the present invention relates to amplification of drug / pharmaceutical delivery in folate uptake systems using folate-nanoparticle conjugates. The present invention also relates to methods for preparing the conjugate, pharmaceutical compositions containing the conjugate, methods of treatment involving the conjugate, and use of the conjugate in the manufacture of a medicament.

【０００２】 （背景技術） 従来の癌化学療法では、癌細胞の死滅が直線的に増加するためには、システム
中に存在する細胞毒の量を指数関数的に増加させることが必要であることが多い
。一方、体内に共存する健康細胞に対する非特異的細胞毒性の望まれない増加に
もつながる。したがって、比較的少量の細胞毒を繰り返し送達することが必要な
ことが多く、必然的に薬剤耐性細胞の小さい断片を生存させることになる。腫瘍
細胞へ送達する細胞毒性薬剤の量を増加させようとする試みでは、「腫瘍特異的
抗原」へのモノクローナル抗体などの特異的ターゲッティング薬剤が使用されて
いる。多くの場合、得られた抗体−薬品の共役は高度に免疫学的であり、したが
って、共役に対して抗体応答が生じ、それによるさらなる用途を防止する。この
理由から、免疫性が小さく不十分である腫瘍特異的分子が、抗体分子に代わるも
のとして求められている。近年、薬物送達のためのターゲッティング剤として使
用され得る、細胞成長に必須である分子の利用に焦点が向けられている。これら
のうちの１つ、葉酸の使用が本発明の主題である。BACKGROUND OF THE INVENTION Conventional cancer chemotherapy requires that the amount of cytotoxin present in the system increase exponentially in order for cancer cell death to increase linearly. There are many. On the other hand, it also leads to an undesirable increase in non-specific cytotoxicity to healthy cells coexisting in the body. Therefore, it is often necessary to repeatedly deliver relatively small amounts of cytotoxin, necessarily resulting in the survival of small fragments of drug-resistant cells. Attempts to increase the amount of cytotoxic agent delivered to tumor cells have used specific targeting agents, such as monoclonal antibodies to "tumor-specific antigens." In many cases, the resulting antibody-drug conjugate is highly immunological, thus generating an antibody response to the conjugate, thereby preventing further use. For this reason, tumor-specific molecules with small and insufficient immunity are being sought as alternatives to antibody molecules. In recent years, the focus has been on the use of molecules essential for cell growth, which can be used as targeting agents for drug delivery. The use of one of these, folic acid, is the subject of the present invention.

【０００３】 葉酸は、細胞中へ還元型葉酸塩キャリアーと呼ばれるキャリアータンパクを通
って、または葉酸塩受容体によって促進されるエンドサイトーシスの何れかを経
て細胞内に入る。葉酸塩受容体は卵巣、胸部、肺、子宮内膜、腎臓、大腸、およ
び骨髄造血細胞の癌を含むヒト癌細胞の大きな分画上で、有意に過剰発現する。
そこには２つの葉酸塩受容体、ＦＲ−αおよびＦＲ−βが存在する。一般的には
、ＦＲ−αは卵巣癌などの上皮器官の悪性組織で上流制御され、一方、ＦＲ−β
は非上皮器官の悪性組織で過剰発現される。このＦＲはビタミン貯留および摂取
に関与する正常組織において検出されるが、これらの組織は保護部位中に存在す
るので、一般的には葉酸塩共役の血行性輸送によっては接近できない。したがっ
て、脈絡叢、腸刷子縁の頂端膜表面および腎臓の近位尿細管での発現が存在する
。後者の場合、受容体はおそらく***される葉酸塩を除去するために機能してお
り、その結果、大きな分子量の葉酸塩複合体には近づきにくいだろう。葉酸塩仲
介腫瘍標的は、下記分子および分子複合体、（ｉ）タンパク毒、（ii）低分子量
化学療法剤、（iii）放射線画像剤、（iv）ＭＲＩ造影剤、（v）放射線療法剤、
（vi）包括薬剤を有するリポソーム、（vii）遺伝子、（viii）アンチセンスオ
リゴヌクレオチド、（ix）リボザイム、および（x）免疫治療剤の送達に現在ま
で利用されている。[0003] Folic acid enters cells through either a carrier protein called reduced folate carrier or through endocytosis facilitated by folate receptors. Folate receptors are significantly overexpressed on a large fraction of human cancer cells, including ovarian, breast, lung, endometrium, kidney, colon, and bone marrow hematopoietic cell carcinomas.
There are two folate receptors, FR-α and FR-β. Generally, FR-α is up-regulated in malignant tissues of epithelial organs such as ovarian cancer, while FR-β
Is overexpressed in malignant tissues of non-epithelial organs. Although this FR is detected in normal tissues involved in vitamin depot and uptake, these tissues are located in protected sites and are generally inaccessible by folate-conjugated hematogenous transport. Thus, there is expression in the choroid plexus, the apical membrane surface of the intestinal brush border and the proximal tubule of the kidney. In the latter case, the receptor probably functions to remove excreted folate, and as a result, it will be less accessible to large molecular weight folate complexes. Folate-mediated tumor targets include the following molecules and molecular complexes, (i) protein toxins, (ii) low molecular weight chemotherapeutics, (iii) radioimaging agents, (iv) MRI contrast agents, (v) radiotherapy agents,
It has been utilized to date for the delivery of (vi) liposomes with encapsulating agents, (vii) genes, (viii) antisense oligonucleotides, (ix) ribozymes, and (x) immunotherapeutics.

【０００４】 腫瘍細胞を標的とする葉酸塩の利用には、２つの大きな限界がある。それらは
送達できる用量が小さい、すなわち葉酸塩各分子当り、薬剤１分子であること、
および大多数の葉酸塩−薬剤複合体は非常に小さく、その結果、腎臓で排出され
、かつ、近位尿細管中に再吸収されて、腎臓にて葉酸塩−薬剤複合体が蓄積され
、望ましくないことになる。[0004] The use of folate to target tumor cells has two major limitations. They can deliver a small dose, ie one molecule of drug per molecule of folate;
And the majority of the folate-drug complex is very small, so that it is excreted in the kidney and reabsorbed in the proximal tubule, causing accumulation of the folate-drug complex in the kidney, Will not be.

【０００５】 （発明の開示） 本発明の目的は、先行技術の上記した欠点の１つまたはそれ以上を克服あるい
は少なくとも軽減することにある。SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to overcome or at least reduce one or more of the above-mentioned disadvantages of the prior art.

【０００６】 （発明を実施するために最良の形態） おどろくべきことに、本発明者らによって、上記限界の双方が葉酸またはその
類似体で被覆された送達されるべき活性物質をナノ粒子内に導入することによっ
て解決されることが見出された。すなわち、薬剤／医薬品送達の増幅が、葉酸塩
被覆ナノ粒子内に多量の活性物質を導入することによって生じ得る。腎臓での葉
酸塩−薬剤複合体の蓄積もまた、大きなサイズのナノ粒子のために減少される。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Surprisingly, by the present inventors, both of the above limitations have been incorporated into follic acid or its analogs to coat the active substance to be delivered in nanoparticles. It was found to be solved by the introduction. That is, amplification of drug / pharmaceutical delivery can occur by introducing large amounts of actives into folate-coated nanoparticles. The accumulation of folate-drug complexes in the kidney is also reduced due to the large size of the nanoparticles.

【０００７】 本発明の第１態様では、標的分子が結合されているナノ粒子であって、活性分
子を包括するナノ粒子を含む複合体が提供される。その際、該標的分子（以下、
ＴＭと称する）は葉酸または葉酸受容体との結合活性を有するその類似体である
。In a first aspect of the present invention, there is provided a conjugate comprising a nanoparticle to which a target molecule is bound, the nanoparticle comprising an active molecule. At that time, the target molecule (hereinafter, referred to as
TM) is folate or an analog thereof that has binding activity to the folate receptor.

【０００８】 本発明の第２態様では、本発明におけるナノ粒子複合体生成のための方法が提
供される。該方法は下記工程のうち、１つまたはそれ以上の工程を含む。 （ａ）ナノ粒子をＴＭと反応させて、複合体を形成する； （ｂ）ＴＭを化学的に修飾して、化学結合を形成し、かつ、ナノ粒子と修飾ＴＭ
とを反応させることができる少なくとも１つの官能基をもたらし、複合体を形成
する； （ｃ）ナノ粒子を少なくとも１つの架橋剤と反応させて、ＴＭと反応する「活性
化」ナノ粒子を調製して、複合体を形成する； （ｄ）ＴＭを少なくとも１つの架橋剤と反応させ、かつ、反応したＴＭとナノ粒
子を反応させて、複合体を形成する； （ｅ）ナノ粒子およびＴＭを少なくとも１つの架橋剤とともに反応させて、複合
体を形成する； （ｆ）ナノ粒子を少なくとも１つの架橋剤と反応させ、ＴＭを少なくとも１つの
架橋剤と反応させ、かつ、反応したナノ粒子と反応したＴＭを反応させて、複合
体を形成する；または （ｇ）ＴＭを疎水性成分と反応して類似体を調製する少なくとも１つの架橋剤と
反応させて、ＴＭの疎水性誘導体を形成し；次いで、ナノ粒子がＴＭで疎水的に
被覆されるように、ＴＭの疎水性誘導体をナノ粒子とともに加熱する。[0008] In a second aspect of the present invention, there is provided a method for producing a nanoparticle complex according to the present invention. The method includes one or more of the following steps. (A) reacting the nanoparticles with the TM to form a complex; (b) chemically modifying the TM to form a chemical bond and combining the nanoparticles with the modified TM.
(C) reacting the nanoparticles with at least one crosslinking agent to prepare "activated" nanoparticles that react with the TM. (D) reacting the TM with at least one cross-linking agent and reacting the reacted TM with the nanoparticles to form a complex; (e) combining the nanoparticles and the TM with at least Reacting with one crosslinker to form a complex; (f) reacting the nanoparticles with at least one crosslinker, reacting the TM with at least one crosslinker, and reacting with the reacted nanoparticles Reacting the TM to form a complex; or (g) reacting the TM with at least one crosslinker that reacts with the hydrophobic component to prepare an analog to form a hydrophobic derivative of the TM; In, such that the nanoparticles are hydrophobically coated with a TM, a hydrophobic derivative of TM heating with nanoparticles.

【０００９】 本発明の第３態様では、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤および／ま
たは補助剤とともに本発明のナノ粒子複合体を含む薬物を提供する。[0009] In a third aspect of the present invention, there is provided a drug comprising the nanoparticle conjugate of the present invention together with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent and / or adjuvant.

【００１０】 本発明の第４態様では、脊椎動物宿主の疾患、特に癌の治療、予防または回復
方法であって、本発明のナノ粒子複合体の治療上、有効な量を該宿主へ投与する
ことを含む方法を提供する。In a fourth aspect of the present invention, there is provided a method for treating, preventing or ameliorating a disease in a vertebrate host, particularly cancer, wherein a therapeutically effective amount of the nanoparticle complex of the present invention is administered to the host. A method comprising:

【００１１】 本発明の第５態様では、ホルモン、薬剤、プロドラッグ、毒素、細胞毒、免疫
源、またはＤＮＡアナログを投与することによって、脊椎動物宿主の癌を治療、
予防または回復させるための方法を提供する。該方法は該宿主へ本発明のナノ粒
子複合体の治療上、有効な量を非経口投与することを含む。[0011] In a fifth aspect of the invention, treating a vertebrate host cancer by administering a hormone, drug, prodrug, toxin, cytotoxin, immunogen, or DNA analog.
A method for preventing or ameliorating is provided. The method comprises parenterally administering to the host a therapeutically effective amount of the nanoparticle conjugate of the invention.

【００１２】 本発明の第６態様では、疾患、好ましくは癌の治療、予防または回復のための
薬物の調製における本発明のナノ粒子複合体の使用を提供する。In a sixth aspect of the invention there is provided the use of a nanoparticle conjugate of the invention in the preparation of a medicament for the treatment, prevention or amelioration of a disease, preferably cancer.

【００１３】 本発明の第７態様では、腫瘍または癌細胞を標的分子と結合するナノ粒子を含
むナノ粒子複合体と接触させることを含む腫瘍または癌細胞へ活性物質を送達す
る方法であって、該ナノ粒子は活性物質を包括し、該標的分子は葉酸、または葉
酸受容体との結合活性を有するその類似体である方法を提供する。活性物質の送
達方法は、該腫瘍または癌細胞の宿主、好ましくは脊椎動物宿主へナノ粒子複合
体をインビボで投与して行ってもよい。[0013] In a seventh aspect of the present invention, a method for delivering an active agent to a tumor or cancer cell comprising contacting the tumor or cancer cell with a nanoparticle complex comprising a nanoparticle that binds to a target molecule, The method provides a method wherein the nanoparticles comprise an active agent and the target molecule is folate or an analog thereof having binding activity to a folate receptor. The method of delivering the active agent may be performed by administering the nanoparticle conjugate to the tumor or cancer cell host, preferably a vertebrate host, in vivo.

【００１４】 本発明のナノ粒子複合体は、１分子またはそれ以上の送達すべき活性物質を含
み、該ナノ粒子はＴＭと結合して、活性物質の増幅送達の可能性を有する複合体
となる。The nanoparticle conjugates of the present invention comprise one or more molecules of the active agent to be delivered, wherein the nanoparticles bind to the TM to form a conjugate having the potential for amplified delivery of the active agent. .

【００１５】 本明細書および請求の範囲では、特に断りのない限り、「含む(comprise)」と
「含む(comprises)」または「含む(comprising)」などの変化したものは、表記
したもの(integer)または工程またはそれらの群を包含し、他のもの(integer)ま
たは工程またはそれらの群を排除しないことを意味すると解釈される。In this specification and the claims, unless otherwise specified, changes such as “comprise” and “comprises” or “comprising” are referred to as “integer”. ) Or steps or groups thereof are to be interpreted as meaning not to exclude other integers or steps or groups thereof.

【００１６】 本発明はここに実施例のみを用いて、また図面を参照して説明される。 図１は腫瘍を有するマウスにおけるコントロールおよび葉酸塩被覆ＩＢＣＡナ
ノ粒子の生体内分布を示す。葉酸塩被覆Ｆ１２７ＩＢＣＡナノ粒子の再生(recov
ery)は、ハイブリドーマ腫瘍細胞を注射したＢａｌｂ／Ｃマウスから得たコント
ロール葉酸塩ＰＥＧ−Ｃ１８複合体の再生と比較される。そのデータは再生され
た注射カウントの％として示され、かつ、ｓｃ腫瘍を標的とするナノ粒子の量は
、本発明のナノ粒子複合体の表面葉酸塩の存在下に増加したことを示す。The present invention will now be described by way of example only and with reference to the drawings. FIG. 1 shows the biodistribution of control and folate-coated IBCA nanoparticles in tumor-bearing mice. Regeneration of folate-coated F127IBCA nanoparticles (recov
ery) is compared to the regeneration of control folate PEG-C18 conjugate obtained from Balb / C mice injected with hybridoma tumor cells. The data are shown as% of regenerated injection counts and indicate that the amount of nanoparticles targeting sc tumors was increased in the presence of surface folate of the nanoparticle complexes of the invention.

【００１７】[0017]

【発明の実施の態様】DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS

本発明のナノ粒子複合体は、標的成分として葉酸またはその類似体を使用して
、腫瘍および癌細胞を特に標的としている。薬剤はナノ粒子から循環系またはリ
ンパ系排液システム、最も好ましくは宿主の標的組織へ放出され得る。これらの
ナノ粒子複合体は一般的に循環系またはリンパ系排液システムへ薬剤を経口送達
するために使用することが可能であるが、本発明および係属中のポリマー送達発
明（１９９９年５月４日に出願した「ポリマーを使用する腫瘍細胞への葉酸塩仲
介標的の応用」と題するオーストラリア予備特許出願番号ＰＱ０１４７、本明細
書中にその全体を参考に挿入する。）の生成物は、好ましくは腫瘍／癌細胞へ活
性物質を標的することに関する。The nanoparticle conjugates of the present invention specifically target tumors and cancer cells using folate or an analog thereof as a targeting component. The drug can be released from the nanoparticles to the circulatory or lymphatic drainage system, most preferably to the target tissue of the host. These nanoparticle conjugates can generally be used for oral delivery of drugs to the circulatory or lymphatic drainage systems, but the invention and the pending polymer delivery invention (May 4, 1999) The application of Australian Pre-Patent Application No. PQ0147, entitled "Application of Folate-Mediated Targeting to Tumor Cells Using Polymers" It relates to targeting active substances to tumor / cancer cells.

【００１８】 活性物質を包括、保持または含有するために、ナノ粒子の２つの基本形態、ナ
ノカプセル（またはマイクロカプセル）とナノスフェア（またはミクロスフェア
）が開発されている。Two basic forms of nanoparticles, nanocapsules (or microcapsules) and nanospheres (or microspheres) have been developed for entrapping, retaining or containing active substances.

【００１９】 本明細書中に使用される用語「ナノ粒子」は、通常、大きさが１ナノメーター
から１００ミクロメーターの範囲にある小さな球、カプセルまたはペレットを呼
ぶ。The term “nanoparticles” as used herein generally refers to small spheres, capsules or pellets ranging in size from 1 nanometer to 100 micrometers.

【００２０】 本発明に使用する標的分子は、葉酸塩分子、または葉酸受容体、特に腫瘍細胞
上の表面葉酸塩受容体に対して結合活性を有するその類似体である。ここで意図
する類似体とは、葉酸分子の環構造、官能基または側鎖の修飾を含み、保護基お
よび塩および複合体をさらに除去することも含み、類似体が葉酸受容体に対する
結合活性を有する限り、化学的に合成されるか、あるいは天然物スクリーニング
などのスクリーニング法によって同定されるなどして、いかなる材料からも誘導
される複合体を含むが、これらに限定されない。The target molecule for use in the present invention is a folate molecule, or an analog thereof that has binding activity for folate receptors, particularly surface folate receptors on tumor cells. The analogs contemplated herein include modifications of the ring structure, functional groups or side chains of the folate molecule, including further removal of protecting groups and salts and conjugates, wherein the analogs have increased binding activity to the folate receptor. As long as it has, it includes, but is not limited to, complexes derived from any material, such as chemically synthesized or identified by screening methods such as natural product screening.

【００２１】 送達されるべき活性物質は、好ましくはホルモン、薬剤、プロドラッグ、毒素
、薬学的に活性なタンパク、免疫源、またはＤＮＡまたはＲＮＡアナログである
。The active substance to be delivered is preferably a hormone, drug, prodrug, toxin, pharmaceutically active protein, immunogen, or DNA or RNA analog.

【００２２】 本発明の実施態様では、葉酸と、活性物質として毒素または細胞毒性薬剤を包
括した生物分解性ナノ粒子との複合体を提供する。In an embodiment of the present invention, there is provided a conjugate of folic acid and a biodegradable nanoparticle encapsulating a toxin or cytotoxic agent as an active substance.

【００２３】 本発明では、好適な毒素とは、リシン、アブリン、ジフテリア毒、モデシン、
破傷風毒素、マイコトキシン、メリチン、α−アマニチン、アメリカヤマゴボウ
抗ウイルスタンパク、リポソーム阻害タンパク、特に小麦、大麦、トウモロコシ
、ライ麦、ゲロニン、およびメイタンシノイドの毒素を含むが、これらに限定さ
れない。In the present invention, suitable toxins include ricin, abrin, diphtheria venom, modecin,
Including, but not limited to, tetanus toxin, mycotoxin, melittin, α-amanitin, American pokeweed antiviral protein, liposome inhibiting proteins, especially toxins of wheat, barley, corn, rye, gelonin, and maytansinoid.

【００２４】 本発明の好適な細胞毒性薬剤としては、クロランブシル、シクロホスファミド
、メルファラン、シクロプロパンなどのアルキル化剤；ドキソルビシン、ダウノ
マイシン、アドリアマイシン、マイトマシンＣ、[２−（ヒドロキシメチル）ア
ントラキノン]などのアントラサイクリン抗腫瘍抗生物質；メトトレキセート、
ジクロロメタトレキセートなどの抗代謝拮抗剤；シスプラチン、カルボプラチン
、および白金、銅、バナジウム、鉄、コバルト、金、カドミウム、亜鉛およびニ
ッケルを含むメタロペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。他の薬剤
としては、ＤＯＮ、チミジン、ペンタメチルメラミン、ジアンヒドロガラクチト
ール、５−メチル−ＴＨＦ、アングイジン、メイタンシン、ネオカルジノスタチ
ン、クロロゾトシン、ＡＺＱ、２’デオキシコフォルマイシン、ＰＡＬＡ、ＡＤ
−３２、ｍ−ＡＭＳＡおよびミソニダゾールが挙げられる。Suitable cytotoxic agents of the present invention include: alkylating agents such as chlorambucil, cyclophosphamide, melphalan, cyclopropane; doxorubicin, daunomycin, adriamycin, mitomycin C, [2- (hydroxymethyl) anthraquinone ] Anthracycline antitumor antibiotics; methotrexate,
Anti-metabolites such as dichlorometrexate; cisplatin, carboplatin, and metallopeptides including, but not limited to, platinum, copper, vanadium, iron, cobalt, gold, cadmium, zinc and nickel. Other drugs include DON, thymidine, pentamethylmelamine, dianhydrogalactitol, 5-methyl-THF, anguidine, maytansine, neocarzinostatin, chlorozotocin, AZQ, 2 'deoxycoformycin, PALA, AD
-32, m-AMSA and misonidazole.

【００２５】 本発明の葉酸塩ナノ粒子によって送達される他の活性物質としては、当該分野
で公知であるホルモンおよび生物活性ペプチドおよびポリペプチド、抗生物質、
解熱鎮痛剤、鎮痛解熱薬および抗炎症剤、去痰剤、鎮痛薬、筋肉弛緩剤、抗てん
かん剤、抗潰瘍剤、抗鬱剤、抗アレルギー剤、強心剤、抗不整脈剤、血管拡張剤
、降圧剤、抗凝血剤および止血剤が挙げられるが、これらに限定されない。Other actives delivered by the folate nanoparticles of the present invention include hormones and bioactive peptides and polypeptides, antibiotics, and antibiotics known in the art.
Antipyretic analgesic, analgesic antipyretic and anti-inflammatory, expectorant, analgesic, muscle relaxant, antiepileptic, antiulcer, antidepressant, antiallergic, inotropic, antiarrhythmic, vasodilator, antihypertensive, Examples include, but are not limited to, anticoagulants and hemostatic agents.

【００２６】 本質的には、ナノ粒子は多くの方法によって形成され得る。そのうちのいくつ
かは以下に列挙される。 （ｉ）溶媒蒸発 この方法では、１つの溶媒に溶解する化合物が他の混合可能な溶媒中に分散さ
れ、第１溶媒は蒸発する。この方法で形成された粒子は多くの水不溶性化合物を
（非経口にて）投与するために使用されている。このような系の例としては、抗
癌剤、５−フルオロウラシルが包括されたポリアルキルシアノアクリレートナノ
カプセルの形成がある。In essence, nanoparticles can be formed by a number of methods. Some of them are listed below. (I) Solvent evaporation In this method, a compound that is soluble in one solvent is dispersed in another miscible solvent and the first solvent evaporates. The particles formed in this way have been used to administer (parenterally) many water-insoluble compounds. An example of such a system is the formation of polyalkylcyanoacrylate nanocapsules encapsulating the anticancer agent, 5-fluorouracil.

【００２７】 （ii）脱溶媒 この方法では、可溶性である第１液体（溶媒）中にある化合物を溶解させ、第
２液体（第１液体と混合するが、化合物は溶解しない）を該溶媒に添加する。第
２液体を多く添加すれば、該化合物は脱溶媒化される。脱溶媒工程中、化合物に
富む相（コアセルベート）は、化合物に乏しい相中に微小滴として分散する多量
の化合物を含む。この段階で、凝集した物質は、適当な架橋剤で化学的に架橋さ
れて、ゼラチンまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のナノ粒子などのミクロ−
またはナノ−粒子を形成する。これらのタンパク溶液は硫酸ナトリムまたは硫酸
アンモニウム溶液の添加によって脱溶媒される。脱溶媒時には、濁度が増加し、
この時点で、ナノ粒子はグルタルアルデヒドまたはブタンジオンなどの好適な架
橋剤の添加によって形成され得る。または生分解性架橋剤としては、ジスルフィ
ド結合、アゾ結合またはエステラーゼ開裂結合を含むリンカーなどが使用され得
る。(Ii) Desolvation In this method, a compound in a first liquid (solvent) that is soluble is dissolved, and a second liquid (mixed with the first liquid but does not dissolve the compound) is dissolved in the solvent. Added. If more second liquid is added, the compound will be desolvated. During the desolvation step, the compound-rich phase (coacervate) contains a large amount of the compound dispersed as microdroplets in the compound-poor phase. At this stage, the agglomerated material is chemically cross-linked with a suitable cross-linking agent to form micro-particles such as gelatin or bovine serum albumin (BSA) nanoparticles.
Or to form nanoparticles. These protein solutions are desolvated by the addition of sodium sulfate or ammonium sulfate solution. During desolvation, turbidity increases,
At this point, the nanoparticles can be formed by the addition of a suitable crosslinking agent, such as glutaraldehyde or butanedione. Alternatively, a linker containing a disulfide bond, an azo bond or an esterase cleavage bond may be used as the biodegradable cross-linking agent.

【００２８】 （iii）複合体コアセルベーション この方法では、対立する電荷を有する２つの多電解質が水溶性媒体中で混合し
て、自然液体／液体相分離が生じる。この現象は適当なイオン電荷密度と鎖長を
有するポリマーに限られる。通常、これらのナノ粒子は、ゼラチンなどのポリカ
チオンへアラビアゴム、アルギン酸塩、またはポリリン酸塩などのポリアニオン
を添加して形成される。このような複合体から薬剤を放出する速度は、グルタル
アルデヒドまたはブタンジオンなどの適当な架橋剤の添加によって制御され得る
。または、生分解性架橋剤としては、ジスルフィド結合、アゾ−結合またはエス
テラーゼ開裂結合を含むリンカーなどが使用され得る。(Iii) Complex Coacervation In this method, two polyelectrolytes with opposite charges are mixed in an aqueous medium, resulting in natural liquid / liquid phase separation. This phenomenon is limited to polymers with appropriate ionic charge density and chain length. Typically, these nanoparticles are formed by adding a polycation such as gelatin to a polyanion such as gum arabic, alginate, or polyphosphate. The rate of release of the drug from such a conjugate can be controlled by the addition of a suitable cross-linking agent such as glutaraldehyde or butanedione. Alternatively, a linker containing a disulfide bond, an azo-bond or an esterase cleavage bond may be used as the biodegradable cross-linking agent.

【００２９】 （iv）ポリマー／ポリマー不適合 この方法は共通する溶媒に溶解した２つの化学的に異なったポリマーが、通常
、適合しないとの観察に基づく。すなわち、この混合物は２つの相を形成する傾
向にある。この不溶性相は核粒子を被覆するために使用され、マイロカプセルを
形成する。１つの例としては、ポリエチレンの添加によるシクロヘキサンからの
エチルセルロースの沈澱がある。(Iv) Polymer / Polymer Incompatibility This method is based on the observation that two chemically different polymers dissolved in a common solvent are usually incompatible. That is, the mixture tends to form two phases. This insoluble phase is used to coat the core particles, forming mylocapsules. One example is the precipitation of ethylcellulose from cyclohexane by the addition of polyethylene.

【００３０】 （ｖ）界面重合 この技術では、相互に混合することができない液体中に溶解した２つの反応物
、それぞれはそれらが反応する２つの液体間の界面に拡散して、カプセル壁を形
成する。このようなカプセル形成の例は、油相中に溶解したセバコイルクロライ
ドの混合物がエチレンジアミンを含む水性相中に乳化されるときに生じる。(V) Interfacial polymerization In this technique, two reactants dissolved in a liquid that are immiscible with each other, each diffuse to the interface between the two liquids with which they react to form a capsule wall I do. An example of such capsule formation occurs when a mixture of sebacoyl chloride dissolved in an oil phase is emulsified in an aqueous phase containing ethylenediamine.

【００３１】 溶媒蒸発（液体乾燥における）によるナノ粒子の形成において好適なポリマー
としては、とりわけ、ポリ乳酸、ポリ−（ラクチド／コ−グルコリド）、ポリ−
ヒドロキシブチレート、ポリ−ヒドロキシバレレート、ポリ−（ヒドロキシブチ
レート／バレレート）、エチルセルロース、デキストラン、ポリサッカライド、
ポリアルキルシアノアクリレート、ポリ−メチル−メタクリレート、ポリ（ε−
カプロラクトン）およびその種々の組み合わせおよびこれらのコポリマーが挙げ
られる。Suitable polymers for the formation of nanoparticles by solvent evaporation (in liquid drying) include, inter alia, polylactic acid, poly- (lactide / co-glucolide), poly-
Hydroxybutyrate, poly-hydroxyvalerate, poly- (hydroxybutyrate / valerate), ethylcellulose, dextran, polysaccharide,
Polyalkylcyanoacrylate, poly-methyl-methacrylate, poly (ε-
Caprolactone) and various combinations thereof and copolymers thereof.

【００３２】 界面沈澱／重合によるナノ粒子の形成に適したポリマーとしては、とりわけ、
ＥＵＤＲＡＧＩＴTM；ポリ（Ｎα，Ｎε−Ｌ−リジンジルテレフタロイル）；リ
ジン塩酸塩とｐ−フタロイルジクロライドとの反応によって形成されるポリマー
；アクリロイル化マルトデキストリンまたはアクリロイル化ヒドロキシエチルデ
ンプンとアンモニウムパーオキソジサルファイドとＮ，Ｎ，Ｎ，’，Ｎ’−テト
ラメチルエチレンジアミンとの反応によるポリマーが挙げられる。ナノ粒子はま
た、ＥＰＡ858700002.4に充分に記載される方法（本明細書中に参考として挿入
される）を使用して、エチレンジアミン、フェニレンジアミン、トルエンジアミ
ン、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン、またはエチレンジオール、ビスフ
ェノール、レゾルシノール、カテコール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール
、ドデカンジオール、１，４−ブタンジオールなどの種々のジオールとセバコイ
ルクロライドおよびアジポイルクロライドなどの二酸塩化物、またはヘキサメチ
レンジイソシアネートなどのジイソシアネートの重合によって形成され得る。Suitable polymers for forming nanoparticles by interfacial precipitation / polymerization include, among others:
EUDRAGIT ™ ; poly (Nα, Nε-L-lysine terephthaloyl); polymer formed by reaction of lysine hydrochloride with p-phthaloyl dichloride; acryloylated maltodextrin or acryloylated hydroxyethyl starch and ammonium peroxo Polymers obtained by the reaction of disulfide with N, N, N, ', N'-tetramethylethylenediamine. Nanoparticles can also be prepared using methods fully described in EPA 858700002.4 (incorporated herein by reference), such as ethylenediamine, phenylenediamine, toluenediamine, diamine such as hexamethylenediamine, or ethylenediol. Various diols such as bisphenol, resorcinol, catechol, pentanediol, hexanediol, dodecanediol, 1,4-butanediol and diacid chlorides such as sebacoyl chloride and adipoyl chloride, or diisocyanates such as hexamethylene diisocyanate Can be formed by polymerization of

【００３３】 ポリマー相分離によるナノ粒子形成に適したポリマーとしては、コ−ポリ（塩
化ビニル：ビニルアルコール：酢酸ビニル）、セルロース系ポリマー、ポリ酢酸
ビニル、ポリビビルアルコール、ポリ塩化ビニル、天然および合成ゴム、ポリア
クリレート、ポリスチレンなどが挙げられる。このようなナノ粒子などを合成す
る方法は、米国特許4,166,800（本明細書中に参考として挿入する）に充分に記
載されている。Polymers suitable for forming nanoparticles by polymer phase separation include co-poly (vinyl chloride: vinyl alcohol: vinyl acetate), cellulosic polymers, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl chloride, natural and synthetic. Examples include rubber, polyacrylate, and polystyrene. Methods for synthesizing such nanoparticles and the like are fully described in US Pat. No. 4,166,800, which is incorporated herein by reference.

【００３４】 複合体コアセルベーションによるナノ粒子形成に適したポリマーとしては、と
りわけ、アラビアゴム、アルギン酸塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキ
シメチルデンプン、ポリスチレンスルフォン酸、ポリビニルスルフォン酸、ポリ
−Ｄ−グルクロン酸、ポリ−ピルビン酸、カラギーナン、ヘパリン硫酸塩、ポリ
リジン、ゼラチンなどのポリカチオンを有するポリリン酸塩が挙げられる。Polymers suitable for nanoparticle formation by complex coacervation include, among others, gum arabic, alginate, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl starch, polystyrene sulfonic acid, polyvinyl sulfonic acid, poly-D-glucuronic acid, poly -Polyphosphates having a polycation such as pyruvate, carrageenan, heparin sulfate, polylysine, gelatin and the like.

【００３５】 ポリマー／ポリマー不適合によるナノ粒子形成に適したポリマーとしては、と
りわけ、ポリエチレン、シリコン、ポリイソブチレンまたはポリビタジエンなど
のポリマーと混合したエチルセルロース、エチレンビニルアセテートポリマー、
ポリ（ラクチド）、またはポリ（塩化ビニリデン）が挙げられる。Suitable polymers for forming nanoparticles due to polymer / polymer incompatibility include, inter alia, ethyl cellulose, ethylene vinyl acetate polymers, mixed with polymers such as polyethylene, silicon, polyisobutylene or polybitadiene,
Poly (lactide), or poly (vinylidene chloride).

【００３６】 ナノ粒子形成に適した他の物質としては、デンプン、架橋卵白、ポリアクリル
アミド、架橋ゼラチンおよびナノスフェア調製の当業者にとって自明である他の
ものが挙げられる。Other materials suitable for nanoparticle formation include starch, cross-linked egg white, polyacrylamide, cross-linked gelatin, and others that will be apparent to those skilled in the art of preparing nanospheres.

【００３７】 架橋剤はジスルフィド結合を含むか、あるいは酸、塩基または過ヨウ素酸塩に
よって開裂され得る。好適な架橋剤の例としては、Ｎ−（４−アジドフェニルチ
オ）フタルイミド、４，４’−ジチオビスフェニルアジド、ジチオビス（サクシ
ンイミジルプロピオネート）、ジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミ
デート・２ＨＣｌ、３，３’−ジチオビス−（スルフォサクシンイミジルプロピ
オネート）、エチル−４−アジドフェニル−１，３’ジチオプロピオネート、ス
ルフォサクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチ
ル−１，３’−ジチオブチルイミデート・ＨＣｌ、Ｎ−サクシンイミジル−（４
−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオネート、スルフォサクシンイミ
ジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンザミド）−エチル−１，３’−ジチオ
プロピオネート、スルフォサクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリシルアミド
）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−サクシンイミジル−３−（
２−ピリジルチオ）プロピオネート、スルフォサクシンイミジル−（４−アジド
フェニルジチオ）−プロピオネート、２−イミノチオレーン、ジサクシンイミジ
ル酒石酸、およびビス−[２−（サクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）−
エチル]−スルフォンが挙げられる。The crosslinker contains disulfide bonds or can be cleaved by acids, bases or periodates. Examples of suitable crosslinking agents include N- (4-azidophenylthio) phthalimide, 4,4'-dithiobisphenylazide, dithiobis (succinimidyl propionate), dimethyl-3,3'-dithiobispropione Imidate.2HCl, 3,3'-dithiobis- (sulfosuccinimidyl propionate), ethyl-4-azidophenyl-1,3'dithiopropionate, sulfosuccinimidyl-2- (m- Azido-o-nitrobenzamide) -ethyl-1,3'-dithiobutylimidate.HCl, N-succinimidyl- (4
-Azidophenyl) -1,3'-dithiopropionate, sulfosuccinimidyl-2- (m-azido-o-nitrobenzamide) -ethyl-1,3'-dithiopropionate, sulfosuccin Imidyl-2- (p-azidosalicylamido) -ethyl-1,3'-dithiopropionate, N-succinimidyl-3- (
2-pyridylthio) propionate, sulfosuccinimidyl- (4-azidophenyldithio) -propionate, 2-iminothiolane, disuccinimidyltartaric acid, and bis- [2- (succinimidyloxycarbonyloxy)-
Ethyl] -sulfone.

【００３８】 ナノ粒子への好適な担体結合は、担体とカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシ
サクシンイミド（ＮＨＳ）とを反応させ、次いで、ＮＨＳ誘導体をナノ粒子上の
好適な官能基と反応させて行う。Suitable carrier attachment to the nanoparticles is performed by reacting the carrier with carbodiimide and N-hydroxysuccinimide (NHS), and then reacting the NHS derivative with suitable functional groups on the nanoparticles.

【００３９】 本明細書中に使用する用語「葉酸塩(folate)」については、その最も広い意味
で考慮されるべきであり、葉酸のカルボン酸アニオンをいう。また、特に断りの
ない場合には、対イオンは薬学的に許容されるカチオンを含む好適なカチオンで
あって、プロトンを含んでいてもよく、すなわち葉酸(folic acid)であってもよ
い。用語「葉酸塩」は、メトトレキセートなどの葉酸塩分子の類似体に関するも
のを含み、好ましくは、該類似体は葉酸受容体に対してある結合活性を有する。The term “folate” as used herein is to be considered in its broadest sense and refers to the carboxylate anion of folic acid. Also, unless otherwise noted, the counterion is a suitable cation, including a pharmaceutically acceptable cation, and may include a proton, ie, folic acid. The term “folate” includes those relating to analogs of the folate molecule, such as methotrexate, and preferably the analogs have some binding activity at the folate receptor.

【００４０】 本明細書にて「治療」および「予防」に関しては、その最も広い意味で考慮さ
れるべきである。用語「治療」は必ずしも宿主が完全に回復するまで治療される
ことを意味しない。同様に、「予防」は必ずしも被検者が最終的に疾病状態とな
らないことを意味しない。したがって、治療および予防は特定状態の症状の回復
、または特定状態の進行の危険を阻止または別に低下させることを含む。用語「
予防」は特定状態の発症の程度を低下させることと考えてもよい。「治療」はま
た、既存状態の程度を低下させる。As used herein, “treatment” and “prevention” should be considered in their broadest sense. The term "treatment" does not necessarily imply that a host is treated until total recovery. Similarly, "prevention" does not necessarily mean that the subject will not eventually contract a disease condition. Thus, treatment and prevention includes ameliorating the symptoms of a particular condition, or preventing or otherwise reducing the risk of progression of a particular condition. the term"
"Prevention" may be considered to reduce the degree of onset of a particular condition. "Treatment" also reduces the severity of an existing condition.

【００４１】 治療または予防の対象は、好ましくはヒト、霊長類、家畜動物（例、ヒツジ、
ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、ペット動物（例、イヌ、ネコ）、研究用試験動物（
例、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、野生捕獲動物（例、
キツネ、シカ）などの哺乳動物であるが、これらに限定されない。好ましくは、
哺乳動物はヒトまたは霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。The subject to be treated or prevented is preferably a human, primate, livestock animal (eg, sheep,
Cattle, horses, donkeys, pigs), pet animals (eg, dogs, cats), test animals for research (
Eg, mice, rabbits, rats, guinea pigs, hamsters), wild capture animals (eg,
(Fox, deer) and the like. Preferably,
The mammal is a human or a primate. Most preferably, the mammal is a human.

【００４２】 治療されるべき脊椎動物宿主において、所望の生理学的効果を達成する好適な
治療措置にて任意に必要とする他の活性化剤とともに、本発明の葉酸塩複合体を
投与するに適した形態および濃度である好適な薬剤を調製するために、当業者は
当該技術分野で一般的に公知である方法を使用することは可能であることは理解
されるであろう。In the vertebrate host to be treated, the folate conjugates of the present invention are suitable for administration with other activators, optionally required in a suitable therapeutic regimen to achieve the desired physiological effect. It will be understood by those skilled in the art that it is possible to use methods generally known in the art to prepare suitable agents in different forms and concentrations.

【００４３】 これらの方法によれば、ここで定義される薬剤は１種またはそれ以上の他の化
合物または分子とともに共投与されてもよい。例えば、本発明のナノ粒子複合体
は葉酸塩ポリマー複合体、他の化学療法剤、または他の寛解性(ameliorative)活
性物質と組み合わせて投与してもよい。「組み合わせて投与」とは、同じまたは
異なった経路にて、同じ処方剤または２つの異なった処方剤を同時に投与するか
、あるいは同じまたは異なった経路にて連続的に投与することを意味する。「連
続」投与とは、処方剤投与の間の秒、分、時間または日数の時間的差異を意味す
る。これらの薬剤はいかなる順序で投与されてもよい。According to these methods, an agent as defined herein may be co-administered with one or more other compounds or molecules. For example, a nanoparticle conjugate of the invention may be administered in combination with a folate polymer conjugate, another chemotherapeutic agent, or another ameliorative active. By "administered in combination" is meant that the same formulation or two different formulations are administered simultaneously, by the same or different routes, or sequentially by the same or different routes. By "continuous" administration is meant a time difference of seconds, minutes, hours or days between administrations of the formulation. These agents may be administered in any order.

【００４４】 注射用途に適した薬剤形態としては、殺菌水溶液（水溶解性）および殺菌注射
溶液または分散液の即時調製用殺菌性粉末が含まれる。全ての場合、その形態は
殺菌性であって、シリンジで容易に使用できる程度まで液体でなければならない
。それは製造および貯蔵条件下で安定であって、細菌および菌類などの微生物の
汚染作用に対して保護されていなければならない。その担体は水、エタノール、
ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチ
レングリコールなど）を含む溶媒または分散媒体、それらの好適な混合物、およ
び植物油である。適当な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によっ
て、分散液の場合には必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用に
よって維持され得る。微生物の作用の抑制は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例
えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールな
どによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、ショ糖または塩化ナ
トリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は吸収遅延剤、例
えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含む組成物の使用によっ
てもたらされ得る。Pharmaceutical forms suitable for injectable use include sterile aqueous solutions (water soluble) and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. In all cases, the form must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier is water, ethanol,
Solvents or dispersion media, including polyols, such as glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, and the like, suitable mixtures thereof, and vegetable oils. Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion, and by the use of surfactants. Inhibition of the action of microorganisms can be brought about by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sucrose or sodium chloride. Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by the use of compositions containing delaying agents, such as aluminum monostearate and gelatin.

【００４５】 殺菌性注射溶液は、上記列挙した他の種々の成分とともに適当な溶媒中に必要
量の活性化合物を混合し、必要により、続いて濾過殺菌して調製される。一般的
には、分散液は基本的分散媒体と上記列挙したものから選ばれた必要な他の成分
を含む殺菌性担体中へ種々の殺菌性活性成分を混合して調製される。殺菌注射溶
液を調製するための殺菌性粉末の場合には、好ましい調製方法としては活性成分
と前記殺菌濾過溶液から得た別な所望成分との粉末を得る真空乾燥法および凍結
乾燥法がある。A sterile injectable solution is prepared by mixing the active compound in the required amount in the appropriate solvent with various other ingredients enumerated above, if necessary, followed by sterile filtration. Generally, dispersions are prepared by incorporating the various germicidal active ingredients into a germicidal carrier which contains the basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of germicidal powders for preparing sterile injectable solutions, preferred methods of preparation include vacuum drying and freeze-drying to obtain a powder of the active ingredient and another desired ingredient obtained from the sterile filtered solution.

【００４６】 活性成分が好適に保護される場合、これらは、例えば、不活性希釈剤とともに
、または吸収できる可食性担体とともに経口投与されるか、または、それはハー
ドまたはソフト殻のゼラチンカプセル中に包括されるか、あるいは錠剤に打錠さ
れるか、あるいはダイエット食品中とともに直接に混合される。経口治療投与で
は、活性化合物は賦形剤とともに混合され、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ
剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、ゲル、ペースト、種々のコロイド状分散
液、シロップ剤、オブラート剤などの形態で使用される。このような組成物およ
び調製物は少なくとも１重量％の活性化合物を含む。組成物および調製物のパー
セントは勿論、変化してもよく、約５〜約８０重量％の間であることが好ましい
。このような治療上で有用な組成物中の活性化合物の量は、適当な用量が得られ
るような量である。本発明の好ましい組成物または調製物は、１つの経口用量単
位形態が約０．１μｇから２０００ｍｇの間の活性化合物を含むように調製され
る。補助的活性成分を含む組成物の場合、その用量は通常の用量や該成分の投与
方法を参考にして決定される。If the active ingredients are suitably protected, they can be administered orally, for example, with an inert diluent or with an assimilable edible carrier, or it can be enclosed in hard or soft shell gelatin capsules. Or compressed into tablets or mixed directly with the diet food. For oral therapeutic administration, the active compound is mixed with excipients and taken into ingestible tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, gels, pastes, various colloidal dispersions, syrups, oblates It is used in the form of an agent. Such compositions and preparations contain at least 1% by weight of active compound. The percentage of the compositions and preparations may, of course, be varied and is preferably between about 5 to about 80% by weight. The amount of active compound in such therapeutically useful compositions is such that a suitable dosage will be obtained. Preferred compositions or preparations according to the present invention are prepared so that one oral dosage unit form contains between about 0.1 μg and 2000 mg of active compound. In the case of a composition containing the auxiliary active ingredient, the dose is determined by referring to the usual dose and the method of administration of the ingredient.

【００４７】 錠剤、トローチ剤、ピル、カプセルなどは、また、下記のものを含む。トラガ
ントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸ジカ
ルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などの崩
壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；胃酸を中和または緩衝化するた
めの重炭酸ナトリウムなどの緩衝剤；およびショ糖、ラクトースまたは添加して
もよいサッカリンなどの甘味剤あるいはペパーミント、冬緑油または桜芳香など
の芳香剤。用量単位形態がカプセルの場合には、上記した物質のほかに、液体担
体を含んでもよい。種々の他の物質が被覆剤として、あるいは用量単位の物理的
形態を変更するために存在してもよい。例えば、錠剤、ピルまたはカプセルは、
セラック、ショ糖、その両者で被覆されていてもよい。シロップ剤またはエリキ
シル剤は活性化合物、甘味剤としてショ糖、保存剤としてメチルおよびプロピル
パラベン、顔料とチェリーまたはオレンジ芳香などの芳香剤を含んでいてもよい
。勿論、用量単位形態を調製するために使用するいかなる物質も薬学的に純粋で
あり、使用した量では実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は
持続性放出調製物および処方剤中に混合されていてもよい。Tablets, troches, pills, capsules and the like also include the following. Binders such as tragacanth gum, acacia, corn starch or gelatin; excipients such as dicalcium phosphate; disintegrants such as corn starch, potato starch, alginic acid; lubricants such as magnesium stearate; to neutralize or buffer stomach acid Buffering agents such as sodium bicarbonate; and sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin which may be added, or flavoring agents such as peppermint, winter green oil or cherry aroma. When the dosage unit form is a capsule, it may contain, in addition to materials of the above type, a liquid carrier. Various other materials may be present as coatings or to modify the physical form of the dosage unit. For example, tablets, pills or capsules
It may be coated with shellac, sucrose, or both. A syrup or elixir may contain the active compound, sucrose as a sweetening agent, methyl and propylparabens as preservatives, a pigment and flavoring such as cherry or orange aroma. Of course, any material used to prepare a dosage unit form should be pharmaceutically pure and substantially non-toxic in the amounts employed. In addition, the active compound may be incorporated into sustained release preparations and formulations.

【００４８】 薬学的に許容される担体および／または希釈剤としては、いかなるおよびすべ
ての溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤
などが挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の用
途は、当該技術分野で周知である。従来の媒体や薬剤が活性成分と非相溶性であ
る場合を除いて、治療組成物のその用途が期待されている。補助活性成分はまた
、該組成物中に混合され得る。Pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents include any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents and the like. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well-known in the art. Except where conventional vehicles and drugs are incompatible with the active ingredient, their use in therapeutic compositions is expected. Supplementary active ingredients can also be incorporated into the compositions.

【００４９】 投与が容易であって、かつ、用量が均一である用量単位形態に非経口組成物を
調合することが特に有利である。ここで使用する用量単位形態とは、治療される
べき哺乳動物被検者に対する単位用量として適した物理的に個々の単位、すなわ
ち必要な薬学的担体とともに所望の治療効果を奏するように計算された予定量の
活性物質を含む各単位を呼ぶ。本発明の新規な用量単位形態の詳細は、（ａ）活
性物質の特殊な性質および達成されるべき特別な治療効果、および（ｂ）肉体の
健康を損なう疾病状態を有する生体において疾患を治療するために、このような
活性物質を調合する当該技術分野に固有な限界に影響され、かつ直接的に依存す
る。It is especially advantageous to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. Dosage unit form as used herein refers to a physically discrete unit suitable as a unit dose for a mammalian subject to be treated, i.e., calculated to produce the desired therapeutic effect with the required pharmaceutical carrier. Each unit containing a predetermined amount of active substance is called. Details of the novel dosage unit forms of the present invention include the treatment of diseases in living organisms having (a) the particular properties of the active substance and the particular therapeutic effect to be achieved, and (b) disease states that impair physical health. To this end, the limitations inherent in the art of formulating such actives are subject and directly dependent.

【００５０】 医薬組成物の形態での薬剤の投与はいかなる従来の手段で行ってもよい。医薬
組成物の薬剤は特別な事例に依存する量で投与された場合には、治療活性を示す
ことが期待される。その変動は、例えばヒトまたは動物および選択された薬剤に
依存する。投与方式は至適な治療反応をもたらすように調整されていてもよい。
例えば、いくつかに分割した用量は、毎日、毎週、毎月、または他の適当な時間
間隔でもって投与してもよく、または、その用量は状況の緊急性に従って比例し
て減少させてもよい。この薬剤はいかなる好適な方法で投与してもよい。投与経
路としては、呼吸、気管内、鼻咽喉、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、筋
肉内、眼内、くも膜下腔内、脳内、鼻腔内、輸液、経口、直腸、ＩＶ点滴経由、
パッチおよび移植片などが挙げられるが、これらに限定されない。静脈内経路に
おいて、特に好適な経路は、腫瘍や疾病器官を提供する血管中への注射を介する
経路である。ペプチドは窩洞、例えば、胸膜腔または腹膜腔中へ入れるか、ある
いは腫瘍組織中へ直接に注射してもよい。[0050] Administration of the agents in the form of a pharmaceutical composition may be by any conventional means. The drug of the pharmaceutical composition is expected to exhibit therapeutic activity when administered in an amount that depends on the particular case. The variability will depend, for example, on the human or animal and the drug selected. Dosage regime may be adjusted to provide the optimum therapeutic response.
For example, several divided doses may be administered daily, weekly, monthly, or at other appropriate time intervals, or the dose may be proportionally reduced according to the exigencies of the situation. The agent may be administered in any suitable manner. Administration routes include respiratory, intratracheal, nasopharyngeal, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intracranial, intradermal, intramuscular, intraocular, intrathecal, intracerebral, intranasal, infusion, oral, rectal, Via IV drip,
Including but not limited to patches and implants. Among the intravenous routes, a particularly preferred route is via injection into a blood vessel providing a tumor or diseased organ. The peptide may be placed in the cavity, for example, in the pleural or peritoneal cavity, or may be injected directly into the tumor tissue.

【００５１】 本発明はさらに、下記実施例を参考にして説明されるが、これらは本発明の範
囲を何ら制限するものではない。 実施例１ ナノ粒子の調製 ナノ粒子は当業者において共通する、溶媒蒸発、複合体コアセルベーション、
ポリマー／ポリマー不適合、ゲル化、界面重合、および熱変性を含む多くの技術
によって形成され得る。The invention is further described with reference to the following examples, which do not limit the scope of the invention in any way. Example 1 Preparation of Nanoparticles Nanoparticles are common in the art, including solvent evaporation, complex coacervation,
It can be formed by a number of techniques, including polymer / polymer incompatibility, gelling, interfacial polymerization, and heat denaturation.

【００５２】 有効量の複合体は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに調
合されて、本明細書の本文中に概要が記載される症状の治療を必要とする患者へ
投与される薬剤となる。該調合剤は標準的な調剤技術を使用して調製される。[0052] An effective amount of the conjugate is formulated with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient, for treatment of a patient in need of the conditions outlined herein. The drug to be administered. The preparation is prepared using standard dispensing techniques.

【００５３】 多くの要因が、特別な宿主のための適量を決定することに影響すると認識され
ている。このような要因とは年齢、体重、性、通常の健康および宿主の同時発生
疾患状態が挙げられる。特別な宿主の適量濃度の決定は標準的調剤技術によって
達成される。[0053] Many factors have been recognized as affecting the determination of the appropriate dosage for a particular host. Such factors include age, weight, sex, normal health and concurrent disease states of the host. Determination of the proper concentration of a particular host is accomplished by standard pharmaceutical techniques.

【００５４】 実施例２ コアセルベーションによるノナ粒子の調製 ほとんどのタンパクは脱溶媒技術を経て薬剤を包括するマトリックスとして使
用されるが、本発明での好ましいタンパクとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、卵アルブミン（ＯＡ）およびコラーゲンが挙げられる。ナノ粒子はオッペ
ンハイム（Oppenheim）の方法（Oppenheim, 1984, Oppenheimら、1984, 1982）
に従って、ＢＳＡのコアセルベーション、続いての脱溶媒によって調製された。
簡単には、０．５w/w％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１％ＢＳＡ溶液へ４０w/w％硫酸ア
ンモニウム溶液を滴下し、濁度が急速に上昇するまで、クレット(Klett)濁度計
で濁度をモニターした。この点（実験にて測定）で、該溶液をウルトラ・ツラッ
クス（ultra-turrax）中に置いて、６００μｌのグルタルアルデヒドを添加して
ナノ粒子を架橋した。架橋は１２w/w％のメタ重亜硫酸ナトリウム溶液を添加し
て停止した。 次いで、葉酸塩のＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体への結合
に先立って、粒子を蒸留水で繰り返し洗浄した。Example 2 Preparation of Nona Particles by Coacervation Although most proteins are used as drug-encapsulating matrices via desolvation techniques, the preferred protein in the present invention is bovine serum albumin (BS)
A), egg albumin (OA) and collagen. Nanoparticles can be obtained by the method of Oppenheim (Oppenheim, 1984, Oppenheim et al., 1984, 1982).
Was prepared by coacervation of BSA followed by desolvation.
Briefly, a 40% w / w ammonium sulfate solution was added dropwise to a 1% BSA solution containing 0.5% w / w Tween 20, and the turbidity was monitored with a Klett turbidimeter until the turbidity rose rapidly. . At this point (determined experimentally), the solution was placed in ultra-turrax and 600 μl of glutaraldehyde was added to crosslink the nanoparticles. Crosslinking was stopped by adding a 12% w / w sodium metabisulfite solution. The particles were then repeatedly washed with distilled water prior to coupling of the folate to the N-hydroxysuccinimide (NHS) derivative.

【００５５】 実施例３ ５−フルオロウラシルの混合 ５−フルオロウラシルをＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ溶液に１０ｇ／１００ｍｌにて溶
解して、実施例２のナノ粒子中に抗有糸***性５−フルオロウラシルを混合した
。脱溶媒と架橋は実施例２にて記載したようにして実施した。Example 3 Mixing of 5-Fluorouracil 5-Fluorouracil was dissolved in a BSA / Tween solution at 10 g / 100 ml and the antimitotic 5-fluorouracil was mixed into the nanoparticles of Example 2. Desolvation and crosslinking were performed as described in Example 2.

【００５６】 実施例４ ナノ粒子への葉酸塩の結合 タンパク性ナノ粒子（実施例２の方法で調製）は、葉酸塩(folate)と１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）およびＮ
ＨＳとを反応させ、続いて機能性ナノ粒子へ添加して得た葉酸塩分子で表面被覆
した。Example 4 Binding of Folate to Nanoparticles Proteinaceous nanoparticles (prepared by the method of Example 2) were prepared using folate and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide ( EDAC) and N
It was reacted with HS and subsequently surface coated with folate molecules obtained by addition to the functional nanoparticles.

【００５７】 実施例５ ナノ粒子中への疎水基挿入のための葉酸塩−脂質複合体の調製 化学的結合に適した容易に入手可能な化学基を有しないナノ粒子の表面へ葉酸
塩を結合させるためには、ナノ粒子の表面中に非共有結合にて挿入できる疎水性
成分と葉酸塩の複合体を調製することが可能である。このような分子は、ノナ粒
子の形成時に容易に添加される。疎水性会合の強度は、生理学的条件下でノナ粒
子から葉酸塩を非常にゆっくりと解離できるようなものである。 ａ）葉酸塩−ホスファチジルエタノールアミンの調製（葉酸塩−ＰＥＡ） ホスファチジルエタノールアミン（１００ｍｇ）を２ｍｌクロロフォルムクロ
ロフォルム／メタノール（５０：５０、v/v）に溶解した。葉酸塩（１００ｍｇ
）を該混合物へ添加した。葉酸塩は次いで、２００ｍｇのカルボジイミド、１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣまたはＥ
ＤＡＣ）を添加して、ＰＥＡへ架橋結合させた。該反応は葉酸塩−ＰＥＡのナノ
粒子への添加に先立って９０分間進行させることができた。 ｂ）葉酸塩と疎水性成分間の他の複合体の調製 葉酸塩類似体と、結合に適した水可溶性ヘッド基と疎水性環境内で疎水性会合
内に適した脂質可溶性テイル基とを含むほとんどの脂肪族または芳香族鎖または
両親媒性鎖との間に共有複合体が形成され得る。すなわち、オレイン酸、オクタ
ン酸、リノール酸またはグルセロリン酸などのカルボン酸ヘッド基を有するいか
なる脂質（飽和、不飽和またはポリ不飽和）も、直接に適当なカルボジイミド（
例えば、ＥＤＡＣまたはＤＣＣ）を使用してアミノ−葉酸塩誘導体へ結合しても
よい。同様に、アミノ基を有する両親媒性分子（アミノ−ヘキサン、アミノ−デ
カン、アミノ−ドデカン、ホスファチジル−エタノールアミン）を、カルボジミ
イドを使用してカルボキシ−葉酸塩に直接に結合してもよい。Example 5 Preparation of a Folate-Lipid Complex for the Insertion of Hydrophobic Groups into Nanoparticles Binding of Folate to the Surface of Nanoparticles without readily available chemical groups suitable for chemical bonding To do this, it is possible to prepare a complex of a hydrophobic component and folate that can be inserted non-covalently into the surface of the nanoparticles. Such molecules are easily added during the formation of nona particles. The strength of the hydrophobic association is such that, under physiological conditions, folate can dissociate very slowly from nona particles. a) Preparation of folate-phosphatidylethanolamine (folate-PEA) Phosphatidylethanolamine (100 mg) was dissolved in 2 ml of chloroform / methanol (50:50, v / v). Folate (100mg
) Was added to the mixture. The folate was then 200 mg of carbodiimide, 1-
Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC or E
DAC) was added to crosslink to PEA. The reaction was allowed to proceed for 90 minutes prior to the addition of folate-PEA to the nanoparticles. b) Preparation of other conjugates between folate and the hydrophobic component, including folate analogs, suitable water-soluble head groups for binding and lipid-soluble tail groups suitable for hydrophobic association in a hydrophobic environment Covalent complexes can be formed between most aliphatic or aromatic chains or amphiphilic chains. That is, any lipid (saturated, unsaturated or polyunsaturated) having a carboxylic acid head group, such as oleic acid, octanoic acid, linoleic acid or glycerophosphoric acid, is directly converted into the appropriate carbodiimide (
For example, EDAC or DCC) may be used to couple to amino-folate derivatives. Similarly, amphiphilic molecules with amino groups (amino-hexane, amino-decane, amino-dodecane, phosphatidyl-ethanolamine) may be directly linked to carboxy-folate using carbodimides.

【００５８】 実施例６ 溶媒蒸発による葉酸塩−ノナ粒子の調製 ａ）葉酸塩−ＰＥＡ−[ポリメチルメタクリレート]ノナ粒子の調製 ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭ、Polysciences）（分子量１２，０００、
５００ｍｇ）を２ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）中へ溶解した。次いで、ジャ
ンケ・アンド・クンケル・ウルトラツラックス(Janke & Kunkel Ultraturrax)を
使用して、１３，５００ｒｐｍで均質化しながら、２０ｍｌの０．２５％w/wポ
リビニルアルコール（ＰＶＡ）へＤＣＭ中のＰＭＭを滴下した。１分後、２００
μｌの葉酸塩−ＰＥＡを添加し、一夜ゆっくり攪拌した。次いで、ピンク色のナ
ノ粒子を遠心分離によって採取し、水で３回洗浄して、凍結乾燥した。 ｂ）葉酸塩−[ＰＥＡ−ポリ−乳酸]ノナ粒子の調製 ポリ−乳酸（ＰＬＡ、Polyscienses）（分子量５０，０００、５００ｍｇ）を
３ｍｌのＤＣＭ中へ溶解し、次いで、５分間、Ｓ２５Ｆプローブとともにウルト
ラツラックス(Ultraturrax)Ｔ２５を使用して１３，５００ｒｐｍで２０ｍｌの
１％ＰＶＡ中へ均質化した。溶液をゆっくりと攪拌しながら、葉酸塩−ＰＥＡ（
４００μｌ）を添加した。ナノ粒子を上記したように採取した。 ｃ）葉酸塩−ＰＥＡ−[ポリ−ヒドロキシ−酪酸塩／吉草酸塩]ナノ粒子の調製 ポリ−ヒドロキシ−酪酸塩／吉草酸塩（９％吉草酸塩）（ＩＣＩ、５００ｍｇ
）を５ｍｌのＤＣＭ中へ溶解し、５分間、Ｓ２５Ｆプローブとともにウルトラツ
ラックス(Ultraturrax)Ｔ２５を使用して、１３，５００ｒｐｍで２０ｍｌの１
％ＰＶＡ中へ均質化した。葉酸塩−ＰＥＡ（４００μｌ）を添加し、実施例８ｂ
に記載するように、スフェアを加工した。Example 6 Preparation of Folate-Nona Particles by Solvent Evaporation a) Preparation of Folate-PEA- [Polymethylmethacrylate] Nona Particles Polymethylmethacrylate (PMM, Polysciences) (molecular weight 12,000,
(500 mg) was dissolved in 2 ml of dichloromethane (DCM). The PMM in DCM was then added to 20 ml of 0.25% w / w polyvinyl alcohol (PVA) using a Janke & Kunkel Ultraturrax while homogenizing at 13,500 rpm. It was dropped. After one minute, 200
μl folate-PEA was added and slowly stirred overnight. The pink nanoparticles were then collected by centrifugation, washed three times with water and lyophilized. b) Preparation of folate- [PEA-poly-lactic acid] nona particles Poly-lactic acid (PLA, Polyscienses) (molecular weight 50,000, 500 mg) is dissolved in 3 ml of DCM and then ultra-thin with S25F probe for 5 minutes. Homogenized using Ultraturrax T25 at 13,500 rpm into 20 ml 1% PVA. While slowly stirring the solution, folate-PEA (
400 μl) was added. The nanoparticles were collected as described above. c) Preparation of folate-PEA- [poly-hydroxy-butyrate / valerate] nanoparticles poly-hydroxy-butyrate / valerate (9% valerate) (ICI, 500 mg)
) Is dissolved in 5 ml of DCM and 20 ml of 1 ml at 13,500 rpm using Ultraturrax T25 with S25F probe for 5 minutes.
% PVA. Folate-PEA (400 μl) was added and Example 8b
The spheres were processed as described in.

【００５９】 実施例７ 表面カルボシキル基を有するナノ粒子への葉酸塩の共有結合 遊離カルボキシル基を有するポリマーから得たノナ粒子の表面へ葉酸塩を結合
する一般的な方法を以下に記載する。具体的な例は市販の入手可能なカルボキシ
ル基変性ノナ粒子を使用する。 ポリサイエンシズ(Polysciences)のフルオレスブライト(Fluoresbrite)TMカル
ボシキレートナノ粒子（２．５％固体ラテックス）は、大きさ０．０４５μｍ、
０．４９μｍ、２．２μｍおよび９．９７μｍのものをポリサイエンシズ(Polys
ciences)から入手した。１ｍｌの各調製物を蒸留水で広く洗浄し、２００μｌの
蒸留水中に再懸濁した。各調製物へ１．５ｍｇのアミノヘキシル葉酸塩を添加し
、次いで、５ｍｇのＥＤＡＣを添加した。各調製物を一夜反応させた後、未反応
物質を蒸留水で繰り返し洗浄して除去するか、または蒸留水に対する透析によっ
て除去した。Example 7 Covalent Attachment of Folate to Nanoparticles Having Surface Carboxyl Groups A general method for attaching folate to the surface of nona particles obtained from polymers having free carboxyl groups is described below. A specific example uses commercially available carboxyl group-modified nona particles. Polysciences Fluoresbrite ™ carboxylate nanoparticles (2.5% solid latex) are 0.045 μm in size,
0.49 μm, 2.2 μm and 9.97 μm were obtained from Polysciences
ciences). 1 ml of each preparation was washed extensively with distilled water and resuspended in 200 μl of distilled water. To each preparation was added 1.5 mg of aminohexyl folate followed by 5 mg of EDAC. After reacting each preparation overnight, unreacted material was removed by repeated washing with distilled water or by dialysis against distilled water.

【００６０】 実施例８ ナノ粒子の表面誘導体化 溶媒蒸発によるノナ粒子の調製に使用した多くのポリマーは、葉酸塩またはそ
の機能的類似体に直接結合する官能基を有していないが、前以て成形されたノナ
粒子の表面を変性して、葉酸塩への結合に適した官能基を導入することが可能で
ある。 ａ）ポリ乳酸（ＰＬＡ）ナノ粒子の表面誘導体化 前以って成形したノナ粒子（１０ｍｇ）を２時間、回転攪拌機で回転によって
蒸留水（３５０μｌ）中へゆっくりと懸濁した。ヒドラジン水和物（１０μｌ）
を添加し、懸濁液を室温で一夜攪拌した。スフェアが遠心沈澱し、再懸濁および
遠心分離によって水で繰り返し洗浄した。洗浄工程は、上清がヒドラジン試験で
陽性（トリニトロベンゼンスルホネート（ＴＮＢＳ）の溶液との反応で紫色、１
ｍｇ／ｍｌ）を示すことができなくなるまで、繰り返した。スフェアはさらに２
回洗浄し、湿ったペレットを葉酸塩への結合に直接使用した。 ｂ）ヒドラジン変性ＰＬＡナノ粒子への葉酸塩の結合 ヒドラジン変性ＰＬＡナノ粒子（３μｌ湿ペレット）の試料を蒸留水（２５０
μｌ）中へ懸濁した。葉酸塩の水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、４００μｌ）とＥＤＡ
Ｃ（１００ｍｇ／ｍｌ、１００μｌ）を添加し、反応混合物を室温で一夜攪拌し
た。懸濁液を遠心沈澱させ、上清を除去した。ペレットを蒸留水で繰り返して洗
浄した（６回洗浄）。青淡紅色である残りのペレットを真空乾燥した。Example 8 Surface Derivatization of Nanoparticles Many of the polymers used in the preparation of nona particles by solvent evaporation do not have functional groups that bind directly to folate or its functional analogs. It is possible to modify the surface of the molded nona particles to introduce a functional group suitable for binding to folate. a) Surface derivatization of polylactic acid (PLA) nanoparticles Preformed nona particles (10 mg) were slowly suspended in distilled water (350 μl) for 2 hours by rotation on a rotary stirrer. Hydrazine hydrate (10μl)
Was added and the suspension was stirred overnight at room temperature. The spheres were spun down and washed repeatedly with water by resuspension and centrifugation. In the washing step, the supernatant was positive in the hydrazine test (purified by reaction with a solution of trinitrobenzene sulfonate (TNBS),
(mg / ml). 2 more spheres
Washed twice and the wet pellet was used directly for binding to folate. b) Binding of folate to hydrazine-modified PLA nanoparticles. A sample of hydrazine-modified PLA nanoparticles (3 μl wet pellet) was prepared using distilled water (250 μl).
μl). An aqueous solution of folate (10 mg / ml, 400 μl) and EDA
C (100 mg / ml, 100 μl) was added and the reaction mixture was stirred at room temperature overnight. The suspension was spun down and the supernatant was removed. The pellet was washed repeatedly with distilled water (6 washes). The remaining pellets, which were blue-red, were vacuum dried.

【００６１】 比較例 ２つのコントロール反応を上記結合と同時に行った。最初の例では、３ｍｇの
ヒドラジン変性ＰＬＡナノ粒子の試料を上記したように葉酸塩とともに処理した
が、ＥＤＡＣ溶液に代えて、蒸留水を使用した。第２のコントロールでは、２ｍ
ｇの未変性ＰＬＡナノ粒子を上記したように、葉酸塩とＥＤＡＣの双方とともに
処理した。両コントロールでは、繰り返して洗浄した後に残ったペレットはいか
なる会合した葉酸塩の証拠もなく、澄明な白色であった。Comparative Example Two control reactions were performed simultaneously with the above binding. In the first example, a sample of 3 mg of hydrazine-modified PLA nanoparticles was treated with folate as described above, but distilled water was used instead of the EDAC solution. In the second control, 2m
g of native PLA nanoparticles were treated with both folate and EDAC as described above. In both controls, the pellet remaining after repeated washings was clear white without evidence of any associated folate.

【００６２】 実施例９ 葉酸塩で表面被覆したイソブチル−シアノアクリレート（ＩＢＣＡ）
ナノ粒子の調製 体内分布研究に適したナノカプセルは、内部マーカーとして125Ｉ−インシュ
リンを使用して調製した。簡単には、１０ｍｇのインシュリンを０．１Ｍ ＨＣ
ｌ中に１０ｍｇ／ｍｌにて溶解した。125Ｉ−インシュリンの一定分量（１μｌ
）を冷インシュリンへ添加し、これを１００μｌのミグリオール(miglyol)と混
合し、渦動させた。ＥｔＯＨ（１０ｍｌ）をインシュリン／ミグリオール(migly
ol)混合物へ添加し、渦動しながら混合した。イソブチル−シアノアクリレート
ＩＢＣＡ（１００μｌ，Sicomet）を澄明な溶液に添加した。これは６０ｍｌの
０．２５％Ｆ−１２７へ直ちに添加した。３０分後に調製物を分割して２等分し
た。半分を一夜攪拌に付し、一方、他の半分を２７ｍｇの葉酸塩−ＰＥＧオクタ
デカン酸（ＥｔＯＨ中、８０ｍｇ／ｍｌ）へ添加した。該溶液を一夜攪拌させた
。次いで、両溶液を同様にして処理した。大きな凝集物を２０分間、１０Ｋｒｐ
ｍにて遠心分離して除去した。両粒子調製物を濃縮し、分子量３００，０００カ
ットオフ膜を使用して、アミコン(Amicon)陽圧濾過ユニットで洗浄した。粒子は
ジサクシンイミジル−２−アミノエチル−２−アミノ−２−ベンジル−エタノエ
ート（ＤＳＡＢ）で表面架橋して安定化させた。ＤＳＡＢは下記のようにＮＨＳ
−エステルへ変換した。ＤＳＡＢ（４０ｍｇ）は等量のＤＭＦ中へ溶解し、そこ
へＮＨＳ（２４ｍｇ、２４０μｌＤＭＦ）を添加した。ＤＣＣ（ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド、４４ｍｇ、４４０μｌ、新鮮に調製）を次いで、ＤＳＡＢ混
合物へ添加し、急速に攪拌しながら、２０分間、活性化させた。ＤＳＡＢ−ＮＨ
Ｓ−エステルを２．１ｍｇナノ粒子当り０．３２ｍｇにて添加し、一夜攪拌させ
た。次いで、粒子を体内分布研究に使用する前に透析処理に付した。Example 9 Folate Surface Coated Isobutyl-Cyanoacrylate (IBCA)
Preparation of Nanoparticles Nanocapsules suitable for biodistribution studies were prepared using 125 I-insulin as an internal marker. Briefly, 10 mg of insulin is added to 0.1 M HC
Dissolved at 10 mg / ml in l. An aliquot (1 μl) of 125 I-insulin
) Was added to cold insulin, which was mixed with 100 μl of miglyol and vortexed. EtOH (10 ml) was added to insulin / miglyol (migly
ol) added to the mixture and mixed with swirling. Isobutyl-cyanoacrylate IBCA (100 μl, Sicomet) was added to the clear solution. This was added immediately to 60 ml of 0.25% F-127. After 30 minutes the preparation was divided into two equal parts. One half was allowed to stir overnight, while the other half was added to 27 mg of folate-PEG octadecanoic acid (80 mg / ml in EtOH). The solution was allowed to stir overnight. Then, both solutions were treated similarly. Large agglutinates for 10 minutes at 10 Krp
m and removed by centrifugation. Both particle preparations were concentrated and washed on an Amicon positive pressure filtration unit using a 300,000 molecular weight cutoff membrane. The particles were surface cross-linked and stabilized with disuccinimidyl-2-aminoethyl-2-amino-2-benzyl-ethanoate (DSAB). DSAB is NHS as follows
-Converted to ester. DSAB (40 mg) was dissolved in an equal volume of DMF, to which NHS (24 mg, 240 μl DMF) was added. DCC (dicyclohexylcarbodiimide, 44 mg, 440 μl, prepared fresh) was then added to the DSAB mixture and activated with rapid stirring for 20 minutes. DSAB-NH
S-ester was added at 0.32 mg per 2.1 mg nanoparticles and allowed to stir overnight. The particles were then subjected to a dialysis treatment before being used for biodistribution studies.

【００６３】 実施例１０ ナノ粒子の葉酸塩仲介標的の実証 ナノ粒子における標的剤として葉酸塩の潜在的利用性を試験するために、葉酸
塩誘導化ＩＢＣＡナノ粒子を実施例９に記載したように調製した。コントロール
ナノ粒子を葉酸塩を使用しないで調製した。体内分布研究では、Ｂａｌｂ／Ｃマ
ウスに２×１０6個のハイブリドーマ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍注射後、２
週間目に、放射線標識ナノ粒子をマウスに静脈注射した。種々の時間に、マウス
を後方目窩神経叢(retro-orbital plexus)から出血させて、安楽死させ、放射能
測定のためにその組織を除去した。データをマウスへ注射した注射カウントの割
合でもって図１に示す。Example 10 Demonstration of Folate-Mediated Targeting of Nanoparticles To test the potential utility of folate as a targeting agent in nanoparticles, folate-derivatized IBCA nanoparticles were used as described in Example 9. Prepared. Control nanoparticles were prepared without folate. For biodistribution studies, Balb / C mice were injected subcutaneously with 2 × 10 6 hybridoma tumor cells. After tumor injection, 2
At week, mice were injected intravenously with radiolabeled nanoparticles. At various times, mice were bled from the retro-orbital plexus, euthanized, and their tissues removed for radioactivity measurements. The data is shown in FIG. 1 with the percentage of injection counts injected into mice.

【００６４】 腫瘍中への未変性ナノ粒子の吸収は、図１から明らかなように少量であるが低
量であり、腫瘍を標的とするナノ粒子の量は表面葉酸塩の存在において増加した
。The absorption of native nanoparticles into tumors was small but low, as is evident from FIG. 1, and the amount of nanoparticles targeting the tumor increased in the presence of surface folate.

【００６５】 （産業上の利用可能性） 本発明は葉酸塩摂取システムの増幅における簡単で新規な技術を提供する。す
なわち、特に腫瘍および癌細胞への広範囲の活性剤の増幅した送達を可能とする
。Industrial Applicability The present invention provides a simple and novel technique in amplification of a folate intake system. That is, it allows for the amplified delivery of a wide range of active agents, especially to tumor and cancer cells.

【００６６】 参考文献 Oppenheim R.C. (1984) in "Polymeric Microparticles" (Guiot, P and Couvre
ur, P. Eds) CRC Press, Boca Raton. Oppenheim R.C., Gipps, E.M. Forbes, J.F. and Whitehead R.H. (1984) in "N
anoparticles and Drug Therapy" (David, S.S., Illum., L., McVie, J.G. and
Tomlinson, E. Eds) Elsevier Science Publishers B.V. Oppenheime, R.C., Stewart, N.F., Gorden, L. and Patel., H.M. (1982) Drug
Devel. Indust. Pharm. 8:531-546 Allen, R.H. and Majerus, P.W. (1972) J. Biol. Chem. 247:7702-7717 Yamada, R.-H and H.P.C. Hogenkamp. (1972) J. Biol. Chem. 247:6266-6270References Oppenheim RC (1984) in "Polymeric Microparticles" (Guiot, P and Couvre
ur, P. Eds) CRC Press, Boca Raton.Oppenheim RC, Gipps, EM Forbes, JF and Whitehead RH (1984) in "N
anoparticles and Drug Therapy "(David, SS, Illum., L., McVie, JG and
Tomlinson, E. Eds) Elsevier Science Publishers BV Oppenheime, RC, Stewart, NF, Gorden, L. and Patel., HM (1982) Drug
Devel. Indust. Pharm. 8: 531-546 Allen, RH and Majerus, PW (1972) J. Biol. Chem. 247: 7702-7717 Yamada, R.-H and HPC Hogenkamp. (1972) J. Biol. Chem. .247: 6266-6270

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】腫瘍を保持するマウスでのコントロールおよび葉酸塩被覆ＩＢＣＡナノ
粒子の生体内分布を示す図である。FIG. 1 shows the biodistribution of control and folate-coated IBCA nanoparticles in tumor-bearing mice.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/4164 Ａ６１Ｋ 31/4164 ４Ｇ００５ 31/473 31/473 ４Ｈ０４５ 31/513 31/513 31/519 31/519 31/53 31/53 31/5383 31/5383 31/662 31/662 31/675 31/675 31/7036 31/7036 31/704 31/704 31/7072 31/7072 31/708 31/708 33/24 33/24 38/00 39/00 Ｇ 38/22 45/00 39/00 47/22 45/00 47/30 47/22 47/46 47/30 Ａ６１Ｐ 35/00 47/46 Ｃ０７Ｋ 14/195 ＺＮＡ Ａ６１Ｐ 35/00 14/415 Ｂ０１Ｊ 13/10 14/61 // Ｃ０７Ｋ 14/195 ＺＮＡ 14/62 14/415 Ａ６１Ｋ 37/24 14/61 Ｂ０１Ｊ 13/02 Ｇ 14/62 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マキュアン，ジョン，ファーガス オーストラリア国 ニュー・サウス・ウェ ールズ 2221，ブレイクハースト，ウエス トストリート 241エー Ｆターム(参考） 4C076 AA09 AA17 AA22 AA37 AA42 AA49 AA53 AA65 AA95 BB01 BB13 BB15 BB16 BB17 BB24 BB25 BB27 BB29 CC27 EE47L EE56H FF21 FF29 FF34 FF68 GG24 GG25 GG29 GG30 GG37 4C084 AA02 AA03 AA17 AA27 BA44 CA62 DA25 DA27 DA32 MA05 MA17 MA22 MA23 MA28 MA35 MA36 MA38 MA52 MA58 MA59 MA60 MA66 NA13 NA14 NA15 ZB262 ZC412 4C085 AA03 AA05 BA01 GG01 GG08 4C086 AA02 AA03 BC43 MA02 MA05 MA17 MA22 MA23 MA28 MA35 MA36 MA38 MA52 MA58 MA59 MA60 MA66 NA13 NA14 NA15 ZB26 ZC41 4C206 AA01 AA02 BA03 FA31 FA53 NA05 NA11 NA13 ZB26 4G005 AA02 BA02 BA07 BA20 DB12Z DB16Z DB17Z DB21X DD13Z DD16Z DD70Z EA03 EA04 4H045 AA30 BA10 BA52 BA71 BA72 CA10 CA30 CA32 CA40 DA83 EA20 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 31/4164 A61K 31/4164 4G005 31/473 31/473 4H045 31/513 31/513 31/519 31 / 519 31/53 31/53 31/5383 31/5383 31/662 31/662 31/675 31/675 31/7036 31/7036 31/704 31/704 31/7072 31/7072 31/708 31/708 33 / 24 33/24 38/00 39/00 G 38/22 45/00 39/00 47/22 45/00 47/30 47/22 47/46 47/30 A61P 35/00 47/46 C07K 14/195 ZNA A61P 35/00 14/415 B01J 13/10 14/61 // C07K 14/195 ZNA 14/62 14/415 A61K 37/24 14/61 B01J 13/02 G 14/62 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, B) J, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP , KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Macuan, John, Fergus New South Wales 2221, Breakhurst, West Street 241A F-term (reference) 4C076 AA09 AA17 AA22 AA37 AA42 AA49 AA53 AA65 AA95 BB01 BB13 BB15 BB16 BB17 BB24 BB25 BB27 BB29 CC27 EE47L EE56H FF21 FF29 FF34 FF68 GG24 GG25 GG29 GG30 GG37 GG37 GG37 4C084 AA02 MA27 MA27 MA27 MA27 MA27 MA27 NA13 NA14 NA15 ZB262 ZC412 4C085 AA03 AA05 BA01 GG01 GG08 4C086 AA02 AA03 BC43 MA02 MA05 MA17 MA22 MA23 MA28 MA35 MA36 MA38 MA52 MA58 MA59 MA60 MA66 NA13 NA14 NA15 ZB26 ZC41 4C206 AA01 AA02 BA03 FA13 FA53 FA53 DB16Z DB17Z DB21X DD13Z DD16Z DD70Z EA03 EA04 4H045 AA30 BA10 BA52 BA71 BA72 CA10 CA30 CA32 CA40 DA83 EA20

Claims (22)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 標的分子が結合されているナノスフェアまたはナノカプセルを
含む複合体であって、該ナノスフェアまたはナノカプセルは活性物質を包含し、
かつ、該標的分子は葉酸、または葉酸受容体への結合活性を有するその類似物質
である複合体。1. A complex comprising a nanosphere or nanocapsule to which a target molecule is bound, wherein said nanosphere or nanocapsule comprises an active substance,
And a conjugate wherein the target molecule is folate or an analog thereof having binding activity to a folate receptor. 【請求項２】 前記活性物質はホルモン、医薬、プロドラッグ、薬学的に活性
なタンパク、免疫源、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡアナログである、請求項１記
載の複合体。2. The complex according to claim 1, wherein the active substance is a hormone, a drug, a prodrug, a pharmaceutically active protein, an immunogen, or a DNA or RNA analog. 【請求項３】 前記活性物質は毒素、細胞毒性薬剤またはそれらのプロドラッ
グである、請求項２記載の複合体。3. The conjugate according to claim 2, wherein said active substance is a toxin, a cytotoxic drug or a prodrug thereof. 【請求項４】 前記毒素は、リシン、アブリン、ジフテリア毒、モデシン、破
傷風毒素、マイコトキシン、メリチン、α−アマニチン、アメリカヤマゴボウ抗
ウイルスタンパク、およびリボソーム阻害タンパク、特に小麦、大麦、トウモロ
コシ、ライ麦、ゲロニン、メイタンシノイドのタンパクからなる群から選ばれる
、請求項３記載の複合体。4. The toxin is ricin, abrin, diphtheria venom, modecin, tetanus toxin, mycotoxin, melittin, α-amanitin, American pokeweed antiviral protein, and ribosome inhibitory protein, especially wheat, barley, corn, rye, gelonin. 4. The complex according to claim 3, wherein the complex is selected from the group consisting of a protein of maytansinoid. 【請求項５】 前記細胞毒性薬剤は、クロランブシル、シクロホスファミド、
メルファラン、シクロプロパン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、アドリアマ
イシン、マイトマシンＣ、[２−（ヒドロキシメチル）アントラキノン]、メトト
レキセート、ジクロロメトトレキセート、シスプラチン、カルボプラチン、白金
、銅、バナジウム、鉄、コバルト、金、カドミウム、亜鉛およびニッケルを含む
メタロペプチド、ＤＯＮ、チミジン、ペンタメチルメラミン、ジアンヒドロガラ
クチトール、５−メチル−ＴＨＦ、アングイジン、メイタンシン、ネオカルジノ
スタチン、クロロゾトシン、ＡＺＱ、２’デオキシコフォルマイシン、ＰＡＬＡ
、ＡＤ−３２、ｍ−ＡＭＳＡおよびミソニダゾールからなる群から選択される、
請求項３記載の複合体。5. The method of claim 1, wherein the cytotoxic agent is chlorambucil, cyclophosphamide,
Melphalan, cyclopropane, doxorubicin, daunomycin, adriamycin, mitomachine C, [2- (hydroxymethyl) anthraquinone], methotrexate, dichloromethrexate, cisplatin, carboplatin, platinum, copper, vanadium, iron, cobalt, gold, cadmium, zinc And nickel-containing metallopeptides, DON, thymidine, pentamethylmelamine, dianhydrogalactitol, 5-methyl-THF, anguidine, maytansine, neocarzinostatin, chlorozotocin, AZQ, 2 'deoxycoformycin, PALA
, AD-32, m-AMSA and misonidazole.
A composite according to claim 3. 【請求項６】 前記ナノスフェアまたはナノカプセルは、溶媒蒸発、複合体コ
アセルベーション、ポリマー／ポリマー不適合、ゲル化、界面重合または熱変性
によって調製される、請求項１記載の複合体。6. The composite of claim 1, wherein said nanospheres or nanocapsules are prepared by solvent evaporation, composite coacervation, polymer / polymer incompatibility, gelling, interfacial polymerization or heat denaturation. 【請求項７】 前記ナノスフェアまたはナノカプセルは生物分解性である、請
求項６記載の複合体。7. The conjugate of claim 6, wherein said nanospheres or nanocapsules are biodegradable. 【請求項８】 下記工程の１つまたはそれ以上を含む、請求項１記載の複合体
の製造方法。 ａ．ナノ粒子を標的分子と反応させて複合体を形成する； ｂ．標的分子を化学的に修飾して、化学結合を形成し、かつ、ナノ粒子と修飾標
的分子とを反応させることができる少なくとも１つの官能基をもたらし、複合体
を形成する； ｃ．ナノ粒子を少なくとも１つの架橋剤と反応させて、標的分子と反応する「活
性化」ナノ粒子を調製し、複合体を形成する； ｄ．標的分子を少なくとも１つの架橋剤と反応させ、かつ、該反応標的分子とナ
ノ粒子を反応させて、複合体を形成する； ｅ．ナノ粒子および標的分子を少なくとも１つの架橋剤とともに反応させて、複
合体を形成する； ｆ．ナノ粒子を少なくとも１つの架橋剤と反応させ、標的分子を少なくとも１つ
の架橋剤と反応させ、かつ、反応したナノ粒子と反応した標的分子を反応させて
、複合体を形成する；または ｇ．標的分子を疎水性成分と反応して類似体を調製する少なくとも１つの架橋剤
と反応させて、標的分子の疎水性誘導体を形成し、次いで、ナノスフェアが標的
分子で疎水的に被覆されるように、標的分子の疎水性誘導体をナノスフェアとと
もに加熱する。8. The method according to claim 1, comprising one or more of the following steps. a. Reacting the nanoparticles with the target molecule to form a complex; b. Chemically modifying the target molecule to form a chemical bond and providing at least one functional group capable of reacting the nanoparticle with the modified target molecule to form a complex; c. Reacting the nanoparticles with at least one crosslinking agent to prepare "activated" nanoparticles that react with the target molecule to form a complex; d. Reacting the target molecule with at least one crosslinker and reacting the reactive target molecule with the nanoparticles to form a complex; e. Reacting the nanoparticles and the target molecule with at least one cross-linking agent to form a complex; f. Reacting the nanoparticles with at least one crosslinker, reacting the target molecule with at least one crosslinker, and reacting the reacted target molecule with the reacted nanoparticle to form a complex; or g. The target molecule is reacted with at least one crosslinker that reacts with the hydrophobic component to prepare an analog to form a hydrophobic derivative of the target molecule, and then the nanospheres are hydrophobically coated with the target molecule. Heat the hydrophobic derivative of the target molecule with the nanospheres. 【請求項９】 前記架橋剤はジスルフィド結合を有するか、あるいは酸、塩基
または過ヨウ素酸塩で分解し得る、請求項８記載の方法。9. The method according to claim 8, wherein the crosslinking agent has a disulfide bond or is decomposable with an acid, a base or a periodate. 【請求項１０】 前記架橋剤は、Ｎ−（４−アジドフェニルチオ）フタルイミ
ド、４，４’−ジチオビスフェニルアジド、ジチオビス（サクシンイミジルプロ
ピオネート）、ジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート・２ＨＣ
ｌ、３，３’−ジチオビス−（スルフォサクシンイミジルプロピオネート）、エ
チル−４−アジドフェニル−１，３’−ジチオプロピオネート、スルフォサクシ
ンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’
−ジチオブチルイミデート・ＨＣｌ、Ｎ−サクシンイミジル−（４−アジドフェ
ニル）−１，３’−ジチオプロピオネート、スルフォサクシンイミジル−２−（
ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネ
ート、スルフォサクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリシルアミド）−エチル
−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジ
ルチオ）プロピオネート、スルフォサクシンイミジル−（４−アジドフェニルジ
チオ）−プロピオネート、２−イミノチオレーン、ジサクシンイミジル酒石酸お
よびビス−[２−（サクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）−エチル]−スル
フォンからなる群から選択される、請求項８記載の方法。10. The crosslinking agent may be N- (4-azidophenylthio) phthalimide, 4,4′-dithiobisphenylazide, dithiobis (succinimidyl propionate), dimethyl-3,3′-dithiobis. Propion imidate 2HC
l, 3,3'-Dithiobis- (sulfosuccinimidyl propionate), ethyl-4-azidophenyl-1,3'-dithiopropionate, sulfosuccinimidyl-2- (m-azido- o-nitrobenzamide) -ethyl-1,3 '
-Dithiobutyrimidate-HCl, N-succinimidyl- (4-azidophenyl) -1,3'-dithiopropionate, sulfosuccinimidyl-2- (
m-azido-o-nitrobenzamide) -ethyl-1,3'-dithiopropionate, sulfosuccinimidyl-2- (p-azidosalicylamido) -ethyl-1,3'-dithiopropionate , N-succinimidyl-3- (2-pyridylthio) propionate, sulfosuccinimidyl- (4-azidophenyldithio) -propionate, 2-iminothiolane, disuccinimidyl tartaric acid and bis- [2- (succinimidyl) 9. The method of claim 8, wherein the method is selected from the group consisting of: (dyloxycarbonyloxy) -ethyl] -sulfone. 【請求項１１】 前記標的分子は、カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシサク
シンイミド（ＮＨＳ）と担体との反応によって、ナノスフェアまたはナノ粒子と
架橋結合し、次いで、ＮＨＳ誘導体をナノスフェア上の適当な官能基と反応する
、請求項８記載の方法。11. The target molecule is cross-linked to nanospheres or nanoparticles by reacting carbodiimide and N-hydroxysuccinimide (NHS) with a carrier, and then reacting the NHS derivative with appropriate functional groups on the nanosphere. 9. The method of claim 8, wherein the method comprises: 【請求項１２】 前記架橋剤は生物分解性結合を含む、請求項８記載の方法。12. The method of claim 8, wherein said crosslinking agent comprises a biodegradable bond. 【請求項１３】 前記架橋剤はエステラーゼ、グルタチオンまたはアゾ−レダ
クターゼによって開裂される、請求項１２記載の方法。13. The method of claim 12, wherein said crosslinking agent is cleaved by an esterase, glutathione, or azo-reductase. 【請求項１４】 請求項８記載の方法によって調製された複合体。14. A conjugate prepared by the method of claim 8. 【請求項１５】 薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤または補助剤とと
もに、請求項１または請求項１４記載の複合体を含む医薬組成物。15. A pharmaceutical composition comprising the conjugate according to claim 1 together with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent or adjuvant. 【請求項１６】 ヒトを含む脊椎動物宿主の疾患を治療または予防する方法で
あって、該宿主へ治療的有効量の請求項１または１４記載の複合体または請求項
１５記載の医薬組成物を投与することを含む方法。16. A method for treating or preventing a disease in a vertebrate host including human, comprising administering to the host a therapeutically effective amount of the conjugate according to claim 1 or 14 or the pharmaceutical composition according to claim 15. A method comprising administering. 【請求項１７】 前記疾患は癌である、請求項１６記載の方法。17. The method of claim 16, wherein said disease is cancer. 【請求項１８】 前記投与は非経口投与である、請求項１６記載の方法。18. The method of claim 16, wherein said administration is parenteral. 【請求項１９】 前記投与は経口投与である、請求項１６記載の方法。19. The method of claim 16, wherein said administering is oral. 【請求項２０】 疾患の治療、予防または回復のための薬物調製における請求
項１または請求項１４記載のナノ粒子複合体の使用。20. Use of the nanoparticle conjugate according to claim 1 or 14 in the preparation of a medicament for treating, preventing or ameliorating a disease. 【請求項２１】 前記疾患は癌である、請求項２０記載の使用。21. The use according to claim 20, wherein said disease is cancer. 【請求項２２】 標的分子が結合されるナノ粒子を含むナノ粒子複合体であっ
て、該ナノ粒子は活性物質を包括し、かつ、該標的分子は葉酸、または葉酸受容
体との結合活性を有するその類似体であるナノ粒子複合体を腫瘍または癌細胞と
接触させることを含む腫瘍または癌細胞へ活性物質を送達する方法。22. A nanoparticle complex comprising a nanoparticle to which a target molecule is bound, wherein the nanoparticle includes an active substance, and the target molecule has a binding activity with folate or a folate receptor. A method of delivering an active agent to a tumor or cancer cell comprising contacting the nanoparticle conjugate, which is an analog thereof, with the tumor or cancer cell.
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