JP2002542760A - DNA molecule encoding rhesus monkey melanocortin 3 receptor protein - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、メラノコルチン−３受容体タンパク質をコードするアカゲザルＤＮＡ分子、アカゲザルＭＣ−３ＲをコードするＤＮＡ分子を含む組換えベクター、アカゲザルＭＣ−３Ｒをコードする組換えベクターを含む組換え宿主細胞、そのようなＤＮＡ分子によってコードされるアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質、およびアカゲザルＭＣ−３Ｒの選択的なアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法に関する。   (57) [Summary] The present invention relates to a rhesus monkey DNA molecule encoding a melanocortin-3 receptor protein, a recombinant vector containing a DNA molecule encoding a rhesus monkey MC-3R, a recombinant host cell containing a recombinant vector encoding a rhesus monkey MC-3R, Rhesus MC-3R protein encoded by such a DNA molecule, and methods for identifying selective agonists and antagonists of Rhesus monkey MC-3R.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 （関連出願に対する相互参照） 本出願は、米国特許出願第６０／１０７，７２５号（１９９８年１１月９日出
願：これはここに参照により取込まれる）に対する優先権を主張する。This application claims priority to US patent application Ser. No. 60 / 107,725, filed Nov. 9, 1998, which is hereby incorporated by reference.

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、Ｇタンパク質共役受容体のロドプシンサブファミリーに属するメラ
ノコルチン−３受容体タンパク質をコードするアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕ
ｌａｔｔａ）のＤＮＡ分子、アカゲザルＭＣ−３ＲをコードするＤＮＡ分子を含
む組換えベクター、アカゲザルＭＣ−３Ｒをコードする組換えベクターを含む組
換え宿主細胞、そのようなＤＮＡ分子によってコードされるアカゲザルＭＣ−３
Ｒタンパク質、ならびにアカゲザルＭＣ−３Ｒの選択的なアゴニストおよびアン
タゴニストを同定する方法に関する。FIELD OF THE INVENTION [0002] The present invention relates to rhesus monkeys (Macaca mu) encoding melanocortin-3 receptor proteins belonging to the rhodopsin subfamily of G protein-coupled receptors.
latta) DNA molecule, a recombinant vector comprising a DNA molecule encoding rhesus monkey MC-3R, a recombinant host cell comprising a recombinant vector encoding rhesus monkey MC-3R, a rhesus monkey MC-encoded by such a DNA molecule. 3
The present invention relates to methods for identifying R proteins and selective agonists and antagonists of rhesus monkey MC-3R.

【０００３】 （発明の背景） メラノコルチン受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のロドプシン
サブファミリーに属する。５種の異なるサブタイプが知られている。これらのメ
ラノコルチン受容体は、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）遺伝子から誘導
されるα、βまたはγ−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨま
たはγ−ＭＳＨ）などのペプチドに結合して、そのようなペプチドによって活性
化される。広範囲の生理学的機能がメラノコルチンペプチドおよびその受容体に
よって媒介されていると考えられている。BACKGROUND OF THE INVENTION [0003] Melanocortin receptors belong to the rhodopsin subfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). Five different subtypes are known. These melanocortin receptors bind to peptides such as α, β or γ-melanocyte stimulating hormone (α-MSH, β-MSH or γ-MSH) derived from the pro-opiomelanocortin (POMC) gene and Activated by various peptides. It is believed that a wide range of physiological functions are mediated by melanocortin peptides and their receptors.

【０００４】 ＣｏｎｅおよびＭｏｕｎｔｊｏｙの米国特許第５，５３２，３４７号（１９９
６年７月２日発行）には、ＭＣ−１Ｒ（これはまたα−ＭＳＨ−Ｒとして当分野
では知られている）をコードするヒトおよびマウスのＤＮＡ分子が開示されてい
る。No. 5,532,347 to Cone and Mountjoy (199)
Published July 2, 6), discloses human and mouse DNA molecules that encode MC-1R, which is also known in the art as α-MSH-R.

【０００５】 ＣｏｎｅおよびＭｏｕｎｔｊｏｙ両者の米国特許第５，２８０，１１２号（１
９９４年１月１８日発行）および米国特許第５，５５４，７２９号（１９９６年
９月１０日発行）には、ＭＣ−２Ｒ（これはまたＡＣＴＨ−Ｒとして当分野では
知られている）をコードするヒトおよびマウスのＤＮＡ分子が開示されている。
ヒトＭＣ−２Ｒタンパク質は２９７個のアミノ酸を含む。[0005] US Pat. No. 5,280,112 to both Cone and Mountjoy (1)
U.S. Pat. No. 5,554,729 (issued Sep. 10, 1996) includes MC-2R (also known in the art as ACTH-R). Encoding human and mouse DNA molecules are disclosed.
The human MC-2R protein contains 297 amino acids.

【０００６】 Ｍｏｕｎｔｊｏｙ他（１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７：１２４８〜１２５
１）には、ヒトＭＣ−１ＲおよびヒトＭＣ−２ＲのＤＮＡ分子およびその随伴タ
ンパク質が記載されている。[0006] Mountjoy et al. (1992, Science, 257: 1248-125)
1) describes human MC-1R and human MC-2R DNA molecules and their associated proteins.

【０００７】 Ｃｈｈａｊｌａｎｉ他（１９９２、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３０９：４１
７〜４２０）にも、ヒトＭＣ１−Ｒをコードするオープンリーディングフレーム
を含むヒトＤＮＡ分子が開示されている。[0007] Chajlani et al. (1992, FEBS Letters, 309: 41
7-420) also disclose a human DNA molecule containing an open reading frame encoding human MC1-R.

【０００８】 Ｒｏｓｅｌｌｉ−Ｒｅｈｆｕｓｓ他（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．９０：８８５６〜８８６０）には、ラットＭＣ−３ＲのｃＤＮＡを
コードするｃＤＮＡクローンが開示されている。[0008] Roselli-Rehfuss et al. (1993, Proc. Natl. Aca
d. Sci. 90: 8856-8860) discloses a cDNA clone encoding rat MC-3R cDNA.

【０００９】 ＹａｍａｄａおよびＧａｎｔｚの米国特許第５，６２２，８６０号（１９９７
年４月２２日発行）および米国特許第５，７０３，２２０号（１９９７年１２月
３０日発行）には、ヒトＭＣ−３ＲおよびヒトＭＣ−４ＲをコードするＤＮＡ分
子がそれぞれ開示されている（Ｇａｎｔｚ他、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６８（１）：８２４６〜８２５０もまた参照のこと）。No. 5,622,860 to Yamada and Gantz (1997)
U.S. Pat. No. 5,703,220 (issued on Dec. 30, 1997) discloses DNA molecules encoding human MC-3R and human MC-4R, respectively. Gantz et al., 1993, J. Biol.
m. 268 (1): 8246-8250).

【００１０】 ヒトＭＣ−５ＲをコードするＤＮＡ分子もまた、Ｍｏｕｎｔｊｏｙ他（１９９
４、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．８：１２９８〜１３０８）により開示された。[0010] DNA molecules encoding the human MC-5R have also been described by Mountjoy et al.
4, Mol. Endocrin. 8: 1298-1308).

【００１１】 Ｃｈｈａｊｌａｎｉ他（１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ
．Ｃｏｍｍ．１９５（２）：８６６〜８７３）には、ＭＣ−５Ｒをコードすると
著者らが述べているＤＮＡ分子が開示されている。このクローンは最初にＭＣ２
と名付けられた。[0011] Chajlani et al. (1993, Biochem. Biophys. Res.
. Comm. 195 (2): 866-873) disclose a DNA molecule that the authors have described as encoding MC-5R. This clone was initially MC2
It was named.

【００１２】 Ｆａｔｈｉ他（１９９５、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、
２０（１）：１０７〜１１３）にも、ヒトＭＣ−５Ｒをコードすると考えられる
ＤＮＡ分子が開示されている。Ｃｈｈａｊｌａｎｉ他（同上）により開示された
ＤＮＡ分子と比較すると、配列の不一致がいくつか存在する。[0012] Fathi et al. (1995, Neurochemical Research,
20 (1): 107-113) also disclose a DNA molecule thought to encode human MC-5R. There are some sequence mismatches when compared to the DNA molecule disclosed by Chajlani et al. (Id.).

【００１３】 Ｇｒｉｆｆｏｎ他（１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍ．２００（２）：１００７〜１０１４）には、ＭＣ−５Ｒをコードする、
ヒトおよびラットから得られたＤＮＡクローンが開示されている。ヒトのＤＮＡ
配列は、Ｆａｔｈｉ他（同上）に開示されたヒトＤＮＡ配列と一致している。[0013] Griffin et al. (1994, Biochem. Biophys. Res. C.)
omm. 200 (2): 1007 to 1014) encodes MC-5R,
DNA clones obtained from humans and rats are disclosed. Human DNA
The sequence is consistent with the human DNA sequence disclosed in Fathi et al. (Id.).

【００１４】 Ｇａｎｔｚ他（１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍ．２００（３）：１１２１４〜１１２２０；ＹａｍａｄａおよびＧａｎｔｚの
米国特許第５，７１０，２６５号（１９９８年１月２０日発行））およびＬａｂ
ｂｅ他（１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：４５４３〜４５４９もま
た参照のこと）には、ＭＣ−５ＲをコードするマウスのＤＮＡクローンが開示さ
れている。[0014] Gantz et al. (1994, Biochem. Biophys. Res. Com.
m. 200 (3): 11214-11220; U.S. Patent No. 5,710,265 to Yamada and Gantz, issued January 20, 1998) and Lab.
Be, et al. (1994, also see Biochemistry, 33: 4543-4549) disclose a mouse DNA clone encoding MC-5R.

【００１５】 Ｂａｒｒｅｔｔ他（１９９４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１２：２０３
〜２１３）には、ＭＣ−５ＲをコードするヒツジのＤＮＡクローンが開示されて
いる。[0015] Barrett et al. (1994, J. Mol. Endocrin. 12: 203)
213) disclose a sheep DNA clone encoding MC-5R.

【００１６】 齧歯類において、ＭＣ−４Ｒは、ペプチド性のアゴニストおよびアンタゴニス
トを用いた研究（Ｆａｎ他、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：１６５〜１６８
）およびＭＣ−４Ｒノックアウトマウスを用いた研究（Ｈｕｓｚａｒ他、１９９
７、Ｃｅｌｌ ８８：１３１〜１４１）により、体重を調節する摂食挙動の重要
な調節因子と考えられている。In rodents, MC-4R has been studied using peptidic agonists and antagonists (Fan et al., 1997, Nature, 385: 165-168).
) And MC-4R knockout mice (Huszar et al., 199).
7, Cell 88: 131-141) are considered to be important regulators of feeding behavior that regulate body weight.

【００１７】 そのような受容体に結合する化合物が、ヒトおよび／または齧歯類の受容体に
結合することによって以前に同定され、齧歯類においてその効力について評価さ
れていた。しかし、神経内分泌系プロセスは、齧歯類とヒトとで異なることがあ
る。化合物の中には、同じ受容体の異なる種ホモログに対して異なる結合親和性
を示すものがあることもまた予想される（Ｆｏｎｇ他、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７：２５６６６〜２５６７１；Ｈａｒｔｉｇ他、１９９２、Ｔ
ＩＰＳ １３：１５２〜１５９）。[0017] Compounds that bind to such receptors have been previously identified by binding to human and / or rodent receptors and have been evaluated for their efficacy in rodents. However, neuroendocrine processes can differ between rodents and humans. It is also expected that some compounds will exhibit different binding affinities for different species homologs of the same receptor (Fong et al., 1992, J. Biol).
. Chem. 267: 25666-25671; Hartig et al., 1992, T.
IPS 13: 152-159).

【００１８】 化合物が薬物の候補物として選択され得る前に、候補物は、最初に齧歯類にお
いて、その後、霊長類のアカゲザルにおいて生理学的作用について評価される。
多くの場合、化合物が、１つの動物種では有効であるが、別の動物種では有効で
はないことがある。以前には、そのような不成功が異なる種における変化したメ
ラノコルチン経路のためであるか、または化合物が１つの特定の動物種に対して
より低い親和性を有するためであるかどうかを明らかにすることは不可能であっ
た。従来のプロトコルでは、そのようなプロトコルが問題なく用いることができ
る場合、化合物のインビトロでの生化学的活性を明らかにするためにはアカゲザ
ルの脳膜を使用することが必要とされた。Before a compound can be selected as a drug candidate, the candidate is first evaluated for physiological effects in rodents and then in primate rhesus monkeys.
In many cases, compounds may be effective in one animal species but not in another. Previously, we determine whether such failures are due to altered melanocortin pathways in different species, or because the compounds have a lower affinity for one particular animal species That was impossible. Previous protocols required the use of rhesus monkey brain membranes to demonstrate the in vitro biochemical activity of the compounds, if such a protocol could be used successfully.

【００１９】 インビボでのデータを、化合物のインビトロでの生化学的活性と相関させるこ
とが望ましい。It is desirable to correlate the in vivo data with the in vitro biochemical activity of the compound.

【００２０】 インビトロでアカゲザルの受容体に対して活性である化合物を最初に選択する
こともまた望ましい。It is also desirable to first select compounds that are active on the rhesus monkey receptor in vitro.

【００２１】 アカゲザルにおける受容体標的の妥当性を明らかにして、肥満を処置するため
の新規な薬物の選択を可能にし得る化合物を同定することもまた望ましい。It would also be desirable to validate receptor targets in rhesus monkeys to identify compounds that could allow for the selection of new drugs to treat obesity.

【００２２】 霊長類におけるメラノコルチン活性プロセスを同定するために、アカゲザルに
おいて、その後、ヒトの臨床試験においてその作用を調節することによって病理
生理学的プロセスをもたらす新しい薬物を発見することはさらに望ましい。In order to identify melanocortin activity processes in primates, it is further desirable to find new drugs in rhesus monkeys that subsequently lead to pathophysiological processes by modulating their effects in human clinical trials.

【００２３】 本発明は、アカゲザルのＭＣ−３Ｒの一形態を発現する単離された核酸フラグ
メント、このような核酸フラグメントを収容する組換えベクター、アカゲザルＭ
Ｃ−３Ｒおよび／または生物学的活性等価体を発現する組換え宿主細胞、ならび
にこのアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質の薬理学的性質を開示することによって
このような要求を検討して達成する。The present invention relates to an isolated nucleic acid fragment expressing one form of the rhesus monkey MC-3R, a recombinant vector harboring such a nucleic acid fragment, Rhesus monkey M
Such needs are addressed and achieved by disclosing recombinant host cells expressing C-3R and / or biologically active equivalents, and the pharmacological properties of the rhesus monkey MC-3R protein.

【００２４】 （発明の要旨） 本発明は、新規なアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）メラノコルチ
ン−３受容体（ｒｈＭＣ−３Ｒ）をコードする単離された核酸分子（ポリヌクレ
オチド）に関する。本発明の核酸分子は実質的に他の核酸を含まない。SUMMARY OF THE INVENTION [0024] The present invention relates to an isolated nucleic acid molecule (polynucleotide) encoding a novel macaque monkey (Macaca mulatta) melanocortin-3 receptor (rhMC-3R). The nucleic acid molecules of the present invention are substantially free of other nucleic acids.

【００２５】 本発明は、新規なアカゲザルＭＣ−３Ｒを発現するｍＲＮＡをコードする単離
された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。このＤＮＡ分子は、配列番号１
として本明細書中に開示されているヌクレオチド配列を含む。The present invention relates to an isolated nucleic acid molecule (polynucleotide) encoding an mRNA that expresses a novel rhesus monkey MC-3R. This DNA molecule has SEQ ID NO: 1.
As disclosed herein.

【００２６】 本発明はまた、新規なアカゲザルＭＣ−３Ｒを発現するｍＲＮＡをコードする
配列番号１の生物学的に活性なフラグメントまたは変異体に関する。そのような
生物学的に活性なフラグメントおよび／または変異体のいずれも、配列番号２に
示されているアカゲザルＭＣ−３Ｒ受容体タンパク質（これに限定されない）を
含む野生型ＭＣ−３Ｒタンパク質の薬理学的性質を少なくとも実質的に模倣する
タンパク質またはタンパク質フラグメントのいずれかをコードする。任意のその
ようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切形
およびカルボキシ末端切形（必ずしもこれらに限定されない）を含み、その結果
、このような変異体は、診断、治療または予防に使用されるタンパク質またはタ
ンパク質フラグメントを発現するｍＲＮＡをコードし、ＭＣ−３Ｒ機能のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストに関するスクリーニングに有用である。The present invention also relates to a biologically active fragment or variant of SEQ ID NO: 1 that encodes an mRNA that expresses a novel rhesus monkey MC-3R. Any of such biologically active fragments and / or variants may include drugs of the wild-type MC-3R protein, including but not limited to the rhesus monkey MC-3R receptor protein set forth in SEQ ID NO: 2. Encodes any protein or protein fragment that at least substantially mimics a physical property. Any such polynucleotide includes, but is not limited to, nucleotide substitutions, deletions, additions, amino-terminal truncations and carboxy-terminal truncations, such that such variants may Alternatively, it encodes mRNA that expresses a protein or protein fragment used for prophylaxis and is useful for screening for agonists and / or antagonists of MC-3R function.

【００２７】 本発明のこの部分の好ましい態様は図１に開示され、新規なＭＣ−３Ｒをコー
ドするアカゲザルｃＤＮＡ分子（配列番号１）である。A preferred embodiment of this part of the invention is disclosed in FIG. 1 and is a novel rhesus monkey cDNA molecule encoding MC-3R (SEQ ID NO: 1).

【００２８】 本発明の単離された核酸分子は、ゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ
）などの一本鎖（コード鎖または非コード鎖）または二本鎖であり得るデオキシ
リボ核酸分子（ＤＮＡ）、ならびに合成された一本鎖ポリヌクレオチドなどの合
成ＤＮＡを含むことができる。本発明の単離された核酸分子はまた、リボ核酸分
子（ＲＮＡ）を含むことができる。[0028] The isolated nucleic acid molecules of the present invention comprise genomic DNA and complementary DNA (cDNA).
), Can be single-stranded (coding or non-coding) or double-stranded, as well as synthetic DNA, such as a synthesized single-stranded polynucleotide. An isolated nucleic acid molecule of the present invention can also include a ribonucleic acid molecule (RNA).

【００２９】 本発明はまた、本明細書中に開示されている実質的に精製された核酸分子を含
む組換えベクターおよび組換え宿主（原核生物および真核生物の両方）に関する
。[0029] The present invention also relates to recombinant vectors and recombinant hosts (both prokaryotic and eukaryotic) comprising the substantially purified nucleic acid molecules disclosed herein.

【００３０】 本発明はまた、本発明の核酸によってコードされるタンパク質を含む組換え宿
主細胞（原核生物細胞および真核生物細胞の両方ならびに安定的な形質転換細胞
および一過性の形質転換細胞の両方）の細胞膜画分に関する。この細胞膜画分は
、野生型または変異型のアカゲザルメラノコルチン−３受容体タンパク質を、内
在性レベルを実質的に上回るレベルで含み、従って、本明細書中に記載されてい
る様々なアッセイにおいて有用である。The present invention also relates to recombinant host cells (both prokaryotic and eukaryotic cells as well as stable and transiently transformed cells) containing the proteins encoded by the nucleic acids of the invention. Both) for the cell membrane fraction. The cell membrane fraction contains wild-type or mutant rhesus monkey melanocortin-3 receptor protein at levels substantially above the endogenous levels and is therefore useful in the various assays described herein. is there.

【００３１】 本発明はまた、図２に開示され、かつ配列番号２として示されているアミノ酸
配列を含むアカゲザルメラノコルチン−３受容体タンパク質の実質的に精製され
た形態に関する。本発明の好ましい態様は図２に開示され、配列番号２として示
されている、新規なアカゲザルメラノコルチン−３受容体タンパク質のアミノ酸
配列である。The present invention also relates to a substantially purified form of the rhesus monkey melanocortin-3 receptor protein disclosed in FIG. 2 and comprising the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2. A preferred embodiment of the present invention is the amino acid sequence of a novel rhesus monkey melanocortin-3 receptor protein disclosed in FIG. 2 and shown as SEQ ID NO: 2.

【００３２】 本発明はまた、配列番号２として示されているアミノ酸配列を含むアカゲザル
メラノコルチン−３受容体タンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび／
または変異体に関する。これらは、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切
形およびカルボキシ末端切形（必ずしもこれらに限定されない）を含み、その結
果、これらの変異体は、診断、治療または予防に使用されるタンパク質またはタ
ンパク質フラグメントをもたらし、ＭＣ−３Ｒ機能のアゴニストおよび／または
アンタゴニストに関するスクリーニングに有用である。The present invention also provides a biologically active fragment of a rhesus monkey melanocortin-3 receptor protein comprising the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2 and / or
Or regarding variants. These include, but are not limited to, amino acid substitutions, deletions, additions, amino-terminal truncations, and carboxy-terminal truncations, such that these variants are proteins that are used for diagnosis, treatment or prevention. Alternatively, it results in a protein fragment, which is useful for screening for agonists and / or antagonists of MC-3R function.

【００３３】 本発明はまた、ＭＣ−３Ｒ活性の様々な調節因子をスクリーニングして選択す
るためのアッセイ、本明細書中に開示されているＭＣ−３Ｒタンパク質および生
物学的等価体の発現方法、このような受容体タンパク質を発現するＤＮＡ構築物
を含む組換え宿主細胞、ならびにこのようなアッセイにより同定された化合物で
あって、ＭＣ−３Ｒ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合
物に関する。The present invention also provides assays for screening and selecting various modulators of MC-3R activity, methods of expressing the MC-3R proteins and bioisosteres disclosed herein, Recombinant host cells containing a DNA construct expressing such a receptor protein, as well as compounds identified by such assays, that act as agonists or antagonists of MC-3R activity.

【００３４】 本発明はまた、野生型の脊椎動物ＭＣ−３Ｒ活性を調節する化合物を同定する
アッセイにおいて有用な融合タンパク質を発現する融合構築物である単離された
核酸分子に関する。本発明のこの部分の好ましい態様には、これに限定されない
が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＭＣ−３Ｒ融合構築物が
含まれる。これらの融合構築物は、これらに限定されないが、当業者に知られて
いる方法によって得られる、アカゲザルＭＣ−３Ｒの細胞内ドメインをＧＳＴ遺
伝子のカルボキシ末端にインフレーム融合物として含むか、あるいはＧＳＴのア
ミノ末端に融合されたＭＣ−３Ｒの細胞外および膜貫通リガンド結合ドメイン、
または免疫グロブリン遺伝子に融合されたＭＣ−３Ｒの細胞外および膜貫通ドメ
インのいずれかを含む。可溶性の組換えＧＳＴ−ＭＣ−３Ｒ融合タンパク質は、
バキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用
するＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む様々な発現システムで発現させることができる。The present invention also relates to an isolated nucleic acid molecule that is a fusion construct that expresses a fusion protein useful in assays that identify compounds that modulate wild-type vertebrate MC-3R activity. Preferred embodiments of this portion of the invention include, but are not limited to, a glutathione S-transferase (GST) -MC-3R fusion construct. These fusion constructs include, but are not limited to, including the intracellular domain of the rhesus monkey MC-3R at the carboxy terminus of the GST gene as an in-frame fusion, obtained by methods known to those of skill in the art. An extracellular and transmembrane ligand binding domain of MC-3R fused to the amino terminus;
Alternatively, it comprises either the extracellular and transmembrane domains of MC-3R fused to an immunoglobulin gene. The soluble recombinant GST-MC-3R fusion protein is
Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cell (Inf) using baculovirus expression vector (pAcG2T, Pharmingen)
(vitrogen) in various expression systems.

【００３５】 従って、本発明は、ＭＣ−３Ｒ活性の様々な調節因子をスクリーニングして選
択するためのアッセイ、本明細書中に開示されているアカゲザルＭＣ−３Ｒタン
パク質および生物学的等価体の発現方法、このような受容体タンパク質を発現す
るＤＮＡ構築物を含む組換え宿主細胞、ならびにこのようなアッセイにより同定
された化合物であって、ＭＣ−３Ｒ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとし
て作用する化合物に関する。Thus, the present invention provides assays for screening and selecting various modulators of MC-3R activity, expression of the rhesus monkey MC-3R proteins and bioequivalents disclosed herein. Methods, recombinant host cells containing DNA constructs expressing such receptor proteins, and compounds identified by such assays that act as agonists or antagonists of MC-3R activity.

【００３６】 アカゲザルＭＣ−３Ｒの新規形態、あるいは配列番号２のアカゲザルＭＣ−３
Ｒのフラグメント、変異体または誘導体をコードする単離された核酸分子を提供
することは本発明の目的である。任意のそのようなポリヌクレオチドは、ヌクレ
オチドの置換、欠失、付加、アミノ末端短縮およびカルボキシ末端短縮（必ずし
もこれらに限定されない）を含み、その結果、このような変異体は、診断、治療
または予防に使用されるタンパク質またはタンパク質フラグメントを発現するｍ
ＲＮＡをコードし、脊椎動物のＭＣ−３Ｒ機能のアゴニストおよび／またはアン
タゴニストに関するスクリーニングに有用である。A novel form of rhesus monkey MC-3R, or rhesus monkey MC-3 of SEQ ID NO: 2
It is an object of the present invention to provide an isolated nucleic acid molecule encoding a fragment, variant or derivative of R. Any such polynucleotides include, but are not necessarily limited to, nucleotide substitutions, deletions, additions, amino-terminal and carboxy-terminal truncations, such that such variants are diagnostic, therapeutic or prophylactic. Expressing a protein or protein fragment used for
It encodes RNA and is useful in screening for agonists and / or antagonists of vertebrate MC-3R function.

【００３７】 本発明のさらなる目的は、上記段落において示された核酸分子によってコード
されるアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質またはタンパク質フラグメントを提供す
ることである。A further object of the present invention is to provide a rhesus monkey MC-3R protein or protein fragment encoded by the nucleic acid molecule set forth in the above paragraph.

【００３８】 本発明のさらなる目的は、アカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質またはその生物学
的等価体をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよび組換え宿主細胞を提
供することである。[0038] It is a further object of the present invention to provide a recombinant vector and a recombinant host cell comprising a nucleic acid sequence encoding a rhesus monkey MC-3R protein or a biological equivalent thereof.

【００３９】 本発明の目的は、配列番号２に示されているアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質
の実質的に精製された形態を提供することである。An object of the present invention is to provide a substantially purified form of the rhesus monkey MC-3R protein shown in SEQ ID NO: 2.

【００４０】 本発明の目的は、配列番号２に示されているものなどのアカゲザルＭＣ−３Ｒ
タンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび／または変異体を提供するこ
とである。これらは、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切形およびカル
ボキシ末端切形（必ずしもこれらに限定されない）を含み、その結果、これらの
変異体は、診断、治療または予防に使用されるタンパク質またはタンパク質フラ
グメントを提供する。An object of the present invention is to provide a rhesus monkey MC-3R such as that shown in SEQ ID NO: 2.
It is to provide biologically active fragments and / or variants of the protein. These include, but are not limited to, amino acid substitutions, deletions, additions, amino-terminal truncations, and carboxy-terminal truncations, such that these variants are proteins that are used for diagnosis, treatment or prevention. Alternatively, provide a protein fragment.

【００４１】 本発明の受容体タンパク質の調節因子を選択するために、ＭＣ−３Ｒに基づく
アッセイを提供することもまた本発明の目的である。このようなアッセイは、好
ましくは、ＭＣ−３ＲをコードするＤＮＡ分子が宿主細胞にトランスフェクショ
ンまたは形質転換され、そしてこの組換え宿主細胞が、本明細書中に記載されて
いる様々なアッセイで使用する前にＭＣ−３Ｒを発現させるために十分な時間に
わたって生育させられる、細胞に基づくアッセイである。It is also an object of the present invention to provide an MC-3R based assay for selecting modulators of the receptor protein of the present invention. Such assays are preferably performed by transfecting or transforming a DNA molecule encoding MC-3R into a host cell, and using the recombinant host cell in the various assays described herein. A cell-based assay that is grown for a time sufficient to allow expression of MC-3R prior to expression.

【００４２】 ＭＣ−３Ｒ活性の調節因子を選択するアッセイにおいて使用されるＭＣ−３Ｒ
をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞
から得られる膜調製物を提供することはさらなる目的である。MC-3R used in assays to select modulators of MC-3R activity
It is a further object to provide a membrane preparation obtained from a host cell transfected or transformed with a DNA molecule encoding

【００４３】 ＭＣ−３Ｒに基づくインフレーム融合構築物、このような融合構築物の発現方
法、本明細書中に開示された生物学的等価体、関連するアッセイ、このような構
築物を発現する組換え細胞、ならびに脊椎動物ＭＣ−３Ｒタンパク質をコードす
る核酸および発現タンパク質を使用することによって同定されたアゴニスト化合
物および／またはアンタゴニスト化合物を提供することもまた本発明の目的であ
る。In-frame fusion constructs based on MC-3R, methods of expressing such fusion constructs, bioequivalents disclosed herein, related assays, recombinant cells expressing such constructs It is also an object of the present invention to provide agonist and / or antagonist compounds identified by using nucleic acids encoding vertebrate MC-3R proteins and expressed proteins.

【００４４】 この受容体タンパク質の調節因子を選択するために、ＭＣ−３Ｒに基づくアッ
セイを提供することもまた本発明の目的である。このようなアッセイは、好まし
くは、ｒｈＭＣ−３ＲをコードするＤＮＡが宿主細胞にトランスフェクションま
たは形質転換され、そしてこの組換え宿主細胞が、本明細書中に記載されている
様々なアッセイで使用される前に、ＭＣ−３Ｒを発現させるために十分な時間に
わたって生育させられる、細胞に基づくアッセイである。It is also an object of the present invention to provide an MC-3R based assay for selecting modulators of this receptor protein. Such assays are preferably performed by transfecting or transforming the DNA encoding rhMC-3R into a host cell, and using the recombinant host cells in the various assays described herein. A cell-based assay that is grown for a time sufficient to express MC-3R prior to expression.

【００４５】 ｒｈＭＣ−３ＲをコードするＤＮＡ分子でトランスフェクションまたは形質転
換された宿主細胞から膜調製物を、ＭＣ−３Ｒ活性の調節因子を選択するアッセ
イにおいて使用するために提供することはさらなる目的である。It is a further object to provide membrane preparations from host cells transfected or transformed with a DNA molecule encoding rhMC-3R for use in assays to select modulators of MC-3R activity. is there.

【００４６】 本明細書中で使用されている「ｒｈ」は、「アカゲザル」を示す。“Rh” as used herein refers to “rhesus monkey”.

【００４７】 本明細書中で使用されている「ＭＣ−３Ｒ」は、「メラノコルチン−３受容体
」を示す。“MC-3R” as used herein refers to “melanocortin-3 receptor”.

【００４８】 本明細書中で使用されている「ＧＰＣＲ」は、「Ｇタンパク質共役受容体」を
示す。“GPCR” as used herein refers to “G protein-coupled receptor”.

【００４９】 本明細書中で使用されている場合は常に、用語「哺乳動物宿主」は、ヒトを含
む任意の哺乳動物を示す。[0049] Whenever used herein, the term "mammalian host" refers to any mammal, including humans.

【００５０】 （図面の簡単な説明） 図１Ａおよび図１Ｂは、アカゲザルＭＣ−３Ｒをコードし、配列番号１に示さ
れているヌクレオチド配列を示す。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIGS. 1A and 1B show the nucleotide sequence encoding rhesus monkey MC-3R and shown in SEQ ID NO: 1.

【００５１】 図２は、アカゲザルＭＣ−３Ｒの１文字表記のアミノ酸配列を示す。これはま
た、配列番号２において３文字表記として示されている。FIG. 2 shows the one-letter code amino acid sequence of rhesus monkey MC-3R. This is also shown as a three letter representation in SEQ ID NO: 2.

【００５２】 図３Ａおよび図３ＢはアカゲザルＭＣ−３Ｒの特徴づけを示す。図３Ａは、Ｎ
ＤＰ−α−ＭＳＨ、γ２−ＭＳＨまたはＳｈｕ−９１１９による［１２５］ＮＤ
Ｐ−α−ＭＳＨ結合の阻害を示す。図３Ｂは、ＮＤＰ−α−ＭＳＨまたはγ２−
ＭＳＨに応答したｃＡＭＰ合成の刺激を示す。それぞれの曲線は、二連の測定に
よる典型的な実験を表す。多数の実験から得られる平均データを表２に示す。FIGS. 3A and 3B show the characterization of rhesus monkey MC-3R. FIG.
[125] ND by DP-α-MSH, γ2-MSH or Shu-9119
4 shows inhibition of P-α-MSH binding. FIG. 3B shows NDP-α-MSH or γ2-
Figure 4 shows stimulation of cAMP synthesis in response to MSH. Each curve represents a typical experiment with duplicate measurements. Average data from a number of experiments are shown in Table 2.

【００５３】 図４は、２つの種から得られたＭＣ−３Ｒに対する結合親和性（ＩＣ_５０）お
よび活性化能（ＥＣ_５０）の比較を示す。略号は下記の通りである：Ａ、ヒトＡ
ＣＴＨ（１−２４）；α、α−ＭＳＨ；γ、γ２−ＭＳＨ；Ｍ、ＭＴ−ＩＩ；Ｎ
、ＮＤＰ−α−ＭＳＨ。FIG. 4 shows a comparison of binding affinity (IC ₅₀ ) and activating capacity (EC ₅₀ ) for MC-3R obtained from two species. Abbreviations are as follows: A, human A
CTH (1-24); α, α-MSH; γ, γ2-MSH; M, MT-II; N
, NDP-α-MSH.

【００５４】 （発明の詳細な説明） 本発明は、新規なアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）メラノコルチ
ン−３受容体（ｒｈＭＣ−３Ｒ）をコードする単離された核酸分子（ポリヌクレ
オチド）に関する。本発明の核酸分子は、他の核酸を実質的に含まない。大部分
のクローニング目的のためには、ＤＮＡが好ましい核酸である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to an isolated nucleic acid molecule (polynucleotide) encoding a novel Macaque mulatta melanocortin-3 receptor (rhMC-3R). The nucleic acid molecules of the present invention are substantially free of other nucleic acids. For most cloning purposes, DNA is the preferred nucleic acid.

【００５５】 本発明は、新規なアカゲザルＭＣ−３Ｒを発現するｍＲＮＡをコードする単離
された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。このＤＮＡ分子は、配列番号１
として本明細書中に開示され、本明細書中The present invention relates to an isolated nucleic acid molecule (polynucleotide) encoding an mRNA that expresses a novel rhesus monkey MC-3R. This DNA molecule has SEQ ID NO: 1.
As disclosed herein, and

【００５６】[0056]

【化６】 に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）を含む。Embedded image (SEQ ID NO: 1).

【００５７】 図１Ａ〜図１Ｂに示され、配列番号１として示されている上記に例示される単
離されたＤＮＡ分子は１９０９ヌクレオチドを含む。このＤＮＡ分子は、ヌクレ
オチド１４８〜ヌクレオチド１１１６のオープンリーディングフレームを含み、
ヌクレオチド１１１７〜１１１９に「ＴＡＧ」停止コドンを有する。このオープ
ンリーディングフレームにより、図２に示され、配列番号２に示されているよう
に、長さが３２３アミノ酸のアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質がコードされる。The isolated DNA molecule exemplified above and shown in FIGS. 1A-1B and shown as SEQ ID NO: 1 contains 1909 nucleotides. This DNA molecule comprises an open reading frame from nucleotide 148 to nucleotide 1116;
It has a "TAG" stop codon at nucleotides 1171-1119. This open reading frame encodes a rhesus monkey MC-3R protein having a length of 323 amino acids, as shown in FIG. 2 and as shown in SEQ ID NO: 2.

【００５８】 本発明はまた、新規なアカゲザルＭＣ−３Ｒを発現するｍＲＮＡをコードする
、配列番号１の生物学的に活性なフラグメントまたは変異体に関する。任意のそ
のような生物学的に活性なフラグメントおよび／または変異体は、配列番号２に
示されているアカゲザルＭＣ−３Ｒ受容体タンパク質（これに限定されない）を
含む野生型ＭＣ−３Ｒの薬理学的性質を少なくとも実質的に模倣するタンパク質
またはタンパク質フラグメントのいずれかをコードする。任意のそのようなポリ
ヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切形およびカル
ボキシ末端切形（必ずしもこれらに限定されない）を含み、その結果、そのよう
な変異体は、診断、治療または予防に使用されるタンパク質またはタンパク質フ
ラグメントを発現するｍＲＮＡをコードし、ＭＣ−３Ｒ機能のアゴニストおよび
／またはアンタゴニストに関するスクリーニングに有用である。The present invention also relates to a biologically active fragment or variant of SEQ ID NO: 1, which encodes an mRNA expressing a novel rhesus monkey MC-3R. Any such biologically active fragment and / or variant is a pharmacology of wild-type MC-3R, including, but not limited to, the rhesus monkey MC-3R receptor protein set forth in SEQ ID NO: 2. Encodes either a protein or protein fragment that at least substantially mimics a specific property. Any such polynucleotide includes, but is not limited to, nucleotide substitutions, deletions, additions, amino-terminal truncations, and carboxy-terminal truncations, such that such variants are useful in diagnostic, therapeutic, Alternatively, it encodes mRNA that expresses a protein or protein fragment used for prophylaxis and is useful for screening for agonists and / or antagonists of MC-3R function.

【００５９】 本発明のこの部分の好ましい態様は図１Ａ〜図１Ｂに開示され、新規なＭＣ−
３ＲをコードするアカゲザルｃＤＮＡ分子（配列番号１）である。A preferred embodiment of this part of the invention is disclosed in FIGS.
Rhesus monkey cDNA molecule encoding 3R (SEQ ID NO: 1).

【００６０】 本発明の単離された核酸分子は、ゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ
）などの一本鎖（コード鎖または非コード鎖）または二本鎖であり得るデオキシ
リボ核酸分子（ＤＮＡ）、ならびに合成された一本鎖ポリヌクレオチドなどの合
成ＤＮＡを含むことができる。本発明の単離された核酸分子はまた、リボ核酸分
子（ＲＮＡ）を含むことができる。[0060] The isolated nucleic acid molecules of the present invention comprise genomic DNA and complementary DNA (cDNA).
), Can be single-stranded (coding or non-coding) or double-stranded, as well as synthetic DNA, such as a synthesized single-stranded polynucleotide. An isolated nucleic acid molecule of the present invention can also include a ribonucleic acid molecule (RNA).

【００６１】 特定のアミノ酸をコードする様々なコドンにおいて相当量の重複性が存在する
ことが知られている。従って、本発明はまた、下記に示されているように、同一
アミノ酸の最終的な翻訳物をコードする別のコドンを含むＲＮＡをコードするそ
のようなＤＮＡ配列に関する。 Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵ
Ｕ Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、Ｃ
ＧＵ Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ 従って、本発明は、同一のタンパク質を発現する異なるＤＮＡ分子をもたらし
得るコドン重複性を開示する。本明細書の目的のために、１つまたは複数のコド
ンが置換された配列は、縮重変化体として定義される。発現タンパク質の最終的
な物理的性質を実質的に変化させないＤＮＡ配列または翻訳タンパク質のいずれ
かにおける変異体もまた本発明の範囲に含まれる。例えば、ロイシンのバリンへ
の置換、リジンのアルギニンへの置換、またはグルタミンのアスパラギンへの置
換は、ポリペプチドの機能性における変化を生じさせ得ない。It is known that there is a great deal of redundancy at the various codons encoding a particular amino acid. Accordingly, the present invention also relates to such DNA sequences that encode RNA comprising another codon that encodes a final translation of the same amino acid, as shown below. A = Ala = alanine: codons GCA, GCC, GCG, GCU C = Cys = cysteine: codons UGC, UGU D = Asp = aspartic acid: codon GAC, GAU E = Glu = glutamic acid: codon GAA, GAG F = Phe = phenylalanine : Codons UUC, UUU G = Gly = glycine: codons GGA, GGC, GGG, GGU H = His = histidine: codon CAC, CAU I = Ile = isoleucine: codons AUA, AUC, AUUK = Lys = lysine: codon AAA, AAG L = Leu = leucine: codons UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CU
UM = Met = methionine: codon AUG N = Asp = asparagine: codon AAC, AAU P = Pro = proline: codon CCA, CCC, CCG, CCU Q = Gln = glutamine: codon CAA, CAG R = Arg = arginine: codon AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, C
GU S = Ser = serine: codon AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU T = Thr = threonine: codon ACA, ACC, ACG, ACU V = Val = valine: codon GUA, GUC, GUG, GGU W = Trp = Tryptophan: codon UGG Y = Tyr = tyrosine: codon UAC, UAU Accordingly, the present invention discloses codon duplication that can result in different DNA molecules expressing the same protein. For the purposes of this specification, sequences in which one or more codons have been replaced are defined as degenerate variants. Variants in either the DNA sequence or the translated protein that do not substantially alter the final physical properties of the expressed protein are also within the scope of the invention. For example, substitution of leucine for valine, lysine for arginine, or glutamine for asparagine cannot result in a change in the functionality of the polypeptide.

【００６２】 ペプチドをコードするＤＮＡ配列を変化させて、天然のペプチドの性質とは異
なる性質を有するペプチドをコードするようにできることが知られている。ＤＮ
Ａ配列を変化させる方法には、部位特異的変異誘発が含まれるが、これに限定さ
れない。変化させられる性質の例には、基質の酵素親和性またはリガンドの受容
体親和性の変化が含まれるが、これらに限定されない。It is known that the DNA sequence encoding a peptide can be altered to encode a peptide having properties that are different from those of the native peptide. DN
Methods for altering the A sequence include, but are not limited to, site-directed mutagenesis. Examples of altered properties include, but are not limited to, altering the enzyme affinity of the substrate or the receptor affinity of the ligand.

【００６３】 様々な手法のいずれかを使用して、アカゲザルＭＣ−３Ｒをクローニングする
ことができる。このような方法には、下記の方法が含まれるが、これに限定され
ない。（１）ＲＡＣＥ ＰＣＲクローニング技術（Ｆｒｏｈｍａｎ他、１９８８
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：８９９８〜９００２
）。５’ＲＡＣＥおよび／または３’ＲＡＣＥを、全長のｃＤＮＡ配列を作製す
るために行うことができる。この方法には、アカゲザルＭＣ−３ＲのｃＤＮＡを
ＰＣＲ増幅するために、遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用
することが含まれる。このような遺伝子特異的プライマーは、任意の数の公開さ
れた核酸データーベースおよびタンパク質データベースを検索することにより同
定された発現配列標識（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列を同定することによって設計
される；（２）アカゲザルＭＣ−３Ｒを含有するｃＤＮＡライブラリーを適切な
発現ベクターにおいて構築した後におけるアカゲザルＭＣ−３ＲのｃＤＮＡの直
接的な機能的発現；（３）バクテリオファージまたはプラスミドのシャトルベク
ターにおいて構築されたアカゲザルＭＣ−３Ｒ含有ｃＤＮＡライブラリーの、ア
カゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質のアミノ酸配列から設計された標識縮重オリゴヌ
クレオチドプローブによるスクリーニング；（４）バクテリオファージまたはプ
ラスミドのシャトルベクターにおいて構築されたアカゲザルＭＣ−３Ｒ含有ｃＤ
ＮＡライブラリーの、アカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質をコードする部分ｃＤＮ
Ａによるスクリーニング。この部分ｃＤＮＡは、アカゲザルＭＣ−３Ｒに関連す
る他のキナーゼに関して知られているアミノ酸配列から縮重したオリゴヌクレオ
チドプライマーを設計することによりアカゲザルＭＣ−３ＲのＤＮＡフラグメン
トの特異的なＰＣＲ増幅によって得られる；（５）バクテリオファージまたはプ
ラスミドのシャトルベクターにおいて構築されたアカゲザルＭＣ−３Ｒ含有ｃＤ
ＮＡライブラリーの、哺乳動物ＭＣ−３Ｒタンパク質に相同的な部分ｃＤＮＡま
たはオリゴヌクレオチドによるスクリーニング。この方法には、上記に記載され
ているＥＳＴとして同定されたアカゲザルＭＣ−３ＲのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を
行うために遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用することもまた含
まれる；あるいは（６）テンプレートとして配列番号１を使用して５’および３
’の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計すること。その結果、全長のｃＤＮ
Ａが、知られているＲＡＣＥ技術によって作製され得るか、あるいは、コード領
域の一部が、アカゲザルＭＣ−３Ｒをコードする全長型のヌクレオチド配列を単
離するために、コード領域の一部を作製および単離して、多数のタイプのｃＤＮ
Ａライブラリーおよび／またはゲノムライブラリーのいずれかをスクリーニング
するプローブとして使用するこれらの同じ知られているＲＡＣＥ技術によって作
製され得る。The rhesus monkey MC-3R can be cloned using any of a variety of techniques. Such methods include, but are not limited to, the methods described below. (1) RACE PCR cloning technology (Frohman et al., 1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8998-9002.
). 5'RACE and / or 3'RACE can be performed to generate full length cDNA sequences. The method involves using gene specific oligonucleotide primers to PCR amplify the rhesus monkey MC-3R cDNA. Such gene-specific primers are designed by identifying an expressed sequence tag (EST) nucleotide sequence identified by searching any number of published nucleic acid databases and protein databases; (2) Direct functional expression of rhesus monkey MC-3R cDNA after construction of a rhesus monkey MC-3R containing cDNA library in an appropriate expression vector; (3) Rhesus monkey MC constructed in bacteriophage or plasmid shuttle vector Screening of a -3R-containing cDNA library with a labeled degenerate oligonucleotide probe designed from the amino acid sequence of rhesus monkey MC-3R protein; (4) constructed in bacteriophage or plasmid shuttle vector The rhesus MC-3R containing cD
Partial cDN of rhesus monkey MC-3R protein of NA library
Screening with A. This partial cDNA is obtained by specific PCR amplification of a rhesus monkey MC-3R DNA fragment by designing oligonucleotide primers degenerate from known amino acid sequences for other kinases related to rhesus monkey MC-3R. (5) rhesus monkey MC-3R-containing cDs constructed in bacteriophage or plasmid shuttle vectors;
Screening of NA library with partial cDNA or oligonucleotide homologous to mammalian MC-3R protein. The method also includes using gene-specific oligonucleotide primers to perform PCR amplification of the rhesus monkey MC-3R cDNA identified above as an EST; or (6) as a template 5 'and 3 using SEQ ID NO: 1
'Designing gene-specific oligonucleotides. As a result, the full-length cDN
A can be made by known RACE techniques, or a portion of the coding region can be made to isolate a full-length nucleotide sequence encoding rhesus monkey MC-3R And isolated, numerous types of cDN
These same known RACE techniques can be used as probes to screen either the A library and / or the genomic library.

【００６４】 他のタイプのライブラリー、ならびに他の細胞タイプまたは種タイプから構築
されたライブラリーが、アカゲザルＭＣ−３ＲをコードするＤＮＡまたはアカゲ
ザルＭＣ−３Ｒホモログを単離するために有用であることが当業者には容易に明
らかである。他のタイプのライブラリーには、アカゲザルの他の細胞から得られ
るｃＤＮＡライブラリーが含まれるが、これに限定されない。Other types of libraries, as well as libraries constructed from other cell or species types, are useful for isolating DNA encoding rhesus monkey MC-3R or rhesus monkey MC-3R homologs Will be readily apparent to those skilled in the art. Other types of libraries include, but are not limited to, cDNA libraries obtained from other cells of the rhesus monkey.

【００６５】 好適なｃＤＮＡライブラリーは、ＭＣ−３Ｒ活性を有する細胞または細胞株か
ら調製できることが当業者には容易に明らかである。アカゲザルＭＣ−３Ｒをコ
ードするｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーを調製する際に使用さ
れる細胞または細胞株の選択は、そのような目的のために利用できる任意の知ら
れているアッセイを使用して、細胞に結合したＭＣ−３Ｒの活性を最初に測定す
ることによって行うことができる。It will be readily apparent to one skilled in the art that suitable cDNA libraries can be prepared from cells or cell lines that have MC-3R activity. The selection of cells or cell lines used in preparing a cDNA library for isolating the cDNA encoding rhesus monkey MC-3R may be determined by any known assay available for such purpose. Can be performed by first measuring the activity of MC-3R bound to cells.

【００６６】 ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当分野でよく知られている標準的な技術によ
って行うことができる。よく知られているｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋに見出され得る。相補的ＤＮＡライブラリーはまた、Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（これら
に限定されない）を含む多数の市販元から得ることができる。Preparation of a cDNA library can be performed by standard techniques well known in the art. Well known cDNA library construction techniques are described, for example, in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual; Cold Spring Harb
or Laboratory, Cold Spring Harbor, New
It can be found in York. Complementary DNA libraries are also available from Clontec
h Laboratories, Inc. And from a number of commercial sources, including but not limited to Stratagene.

【００６７】 アカゲザルＭＣ−３ＲをコードするＤＮＡはまた、好適なゲノムＤＮＡライブ
ラリーから単離できることもまた当業者には容易に明らかである。ゲノムＤＮＡ
ライブラリーの構築は、当分野でよく知られている標準的な技術によって行うこ
とができる。よく知られているゲノムＤＮＡライブラリー構築技術はＳａｍｂｒ
ｏｏｋ他（上記）に見出され得る。It is also readily apparent to one skilled in the art that DNA encoding rhesus monkey MC-3R can also be isolated from a suitable genomic DNA library. Genomic DNA
Construction of the library can be performed by standard techniques well known in the art. Well-known genomic DNA library construction technology is Sambr
book et al. (supra).

【００６８】 アカゲザルＭＣ−３Ｒ遺伝子を好ましい方法の１つによって単離するために、
アカゲザルＭＣ−３Ｒまたは相同的なタンパク質のアミノ酸配列またはＤＮＡ配
列が必要となる場合がある。これを達成するために、ＭＣ−３Ｒタンパク質また
は相同的なタンパク質を精製して、部分アミノ酸配列を自動化された配列決定装
置によって決定することができる。全アミノ酸配列を決定することは必要ないが
、６アミノ酸〜８アミノ酸の２つの領域の一次配列を、部分的なアカゲザルＭＣ
−３ＲのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅するために決定することができる。好
適なアミノ酸配列が一旦同定されると、それらをコードし得るＤＮＡ配列が合成
される。遺伝子コードは縮重しているために、２つ以上のコドンを、特定のアミ
ノ酸をコードするために使用することができる。従って、アミノ酸配列は、類似
するＤＮＡオリゴヌクレオチドの集団のいずれかによってコードされ得る。この
集団の１つの成分だけがアカゲザルＭＣ−３Ｒの配列と同一であるが、集団の他
の成分は、ミスマッチを伴うＤＮＡオリゴヌクレオチドが存在する場合でも、ア
カゲザルＭＣ−３ＲのＤＮＡにハイブリダイゼーションすることができる。ミス
マッチしたＤＮＡオリゴヌクレオチドは、アカゲザルＭＣ−３ＲのＤＮＡに対し
て依然として十分にハイブリダイゼーションすることができ、アカゲザルＭＣ−
３ＲをコードするＤＮＡの同定および単離を可能にする。あるいは、発現配列の
一部領域のヌクレオチド配列を、１つまたは複数の利用可能なゲノムデータベー
スを検索することによって同定することができる。遺伝子に特異的なプライマー
を使用して、ｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡ集団のいずれかから目的とす
るｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うことができる。上記に記されているように、アカ
ゲザルＭＣ−３Ｒをコードする全長配列を作製するための重複している５’ＲＡ
ＣＥ産物および３’ＲＡＣＥ産物を単離する目的で、あるいは、１つまたは複数
のｃＤＮＡ型ライブラリーまたはゲノム型ライブラリーをスクリーニングするプ
ローブとして使用されるアカゲザルＭＣ−３Ｒをコードするヌクレオチド配列の
一部を単離して、アカゲザルＭＣ−３ＲまたはアカゲザルＭＣ−３Ｒ様タンパク
質をコードする全長配列を単離する目的で、ＰＣＲに基づく方法で使用される適
切なヌクレオチド配列を配列番号１から得ることができる。To isolate the rhesus monkey MC-3R gene by one of the preferred methods,
An amino acid or DNA sequence of rhesus monkey MC-3R or a homologous protein may be required. To accomplish this, the MC-3R protein or homologous protein can be purified and the partial amino acid sequence determined by an automated sequencer. Although it is not necessary to determine the entire amino acid sequence, the primary sequence of the two regions of 6 to 8 amino acids can be
The DNA fragment of -3R can be determined for PCR amplification. Once suitable amino acid sequences have been identified, DNA sequences capable of encoding them are synthesized. Due to the degeneracy of the genetic code, more than one codon can be used to encode a particular amino acid. Thus, the amino acid sequence can be encoded by any of a population of similar DNA oligonucleotides. While only one component of this population is identical to the sequence of rhesus monkey MC-3R, the other components of the population will hybridize to the DNA of rhesus monkey MC-3R, even in the presence of mismatched DNA oligonucleotides. Can be. The mismatched DNA oligonucleotide can still hybridize well to the rhesus monkey MC-3R DNA,
Allows identification and isolation of DNA encoding 3R. Alternatively, the nucleotide sequence of a partial region of the expressed sequence can be identified by searching one or more available genomic databases. PCR amplification of the cDNA of interest from either a cDNA library or a population of cDNAs can be performed using primers specific to the gene. As noted above, overlapping 5'RAs to generate full length sequences encoding rhesus monkey MC-3R.
A portion of a nucleotide sequence encoding a rhesus monkey MC-3R used to isolate CE and 3 'RACE products or as a probe to screen one or more cDNA or genomic libraries The appropriate nucleotide sequence used in a PCR-based method can be obtained from SEQ ID NO: 1 in order to isolate the full-length sequence encoding a rhesus monkey MC-3R or a rhesus monkey MC-3R-like protein.

【００６９】 本発明には、ストリンジェント条件下で配列番号１にハイブリダイゼーション
するＤＮＡ配列が含まれる。例として、しかし限定としてではなく、高ストリン
ジェントな条件を使用する手法を下記に示す：ＤＮＡを含むフィルターのプレハ
イブリダイゼーションが、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液および１００μｇ／
ｍｌ変性サケ***ＤＮＡから構成される緩衝液中において６５℃で２時間〜一晩
行われる。フィルターは、１００μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡおよび５〜２０
Ｘ１０^６ｃｐｍの^３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混
合物中において６５℃で１２時間〜４８時間ハイブリダイゼーションされる。フ
ィルターの洗浄が、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液において３７℃
で１時間行われる。この後、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄が５
０℃で４５分間行われ、その後、オートラジオグラフィーが行われる。高ストリ
ンジェントな条件を使用する他の手法には、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、
５０％ホルムアミドにおいて４２℃で１２時間〜４８時間行われるハイブリダイ
ゼーション工程、あるいは０．２ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおいて６５℃で
３０分間〜６０分間行われる洗浄工程のいずれかが含まれる。The present invention includes DNA sequences that hybridize under stringent conditions to SEQ ID NO: 1. As an example, but not by way of limitation, the procedure using high stringency conditions is as follows: Prehybridization of filters containing DNA was performed with 6XSSC, 5X Denhardt solution and 100 μg /
Performed at 65 ° C. for 2 hours to overnight in a buffer composed of ml denatured salmon sperm DNA. The filters were 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA and 5-20
Hybridization is performed at 65 ° C. for 12 to 48 hours in a prehybridization mixture containing X10 ⁶ cpm of ³² P-labeled probe. The filter washes at 37 ° C. in a solution containing 2 × SSC, 0.1% SDS.
For one hour. After this, washing with 0.1 × SSC and 0.1% SDS was performed 5 times.
Performed at 0 ° C. for 45 minutes, followed by autoradiography. Other approaches using high stringency conditions include 5X SSC, 5X Denhardt's solution,
Either a hybridization step performed at 42 ° C. for 12 hours to 48 hours in 50% formamide, or a washing step performed at 65 ° C. for 30 minutes to 60 minutes in 0.2XSSPE and 0.2% SDS is included.

【００７０】 高ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うために前記の手法で言及
された試薬は当分野ではよく知られている。これらの試薬の詳しい組成は、例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋに見出され得る。前記に加えて、使用され得る高ストリンジェントな他
の条件が当分野ではよく知られている。The reagents referred to in the above procedure for performing high stringency hybridization are well known in the art. The detailed composition of these reagents is described, for example, in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual; Cold Spring Harbo
r Laboratory, Cold Spring Harbor, New
It can be found in York. In addition to the foregoing, other highly stringent conditions that can be used are well known in the art.

【００７１】 メラノコルチン受容体は、ＧＰＣＲのロドプシンサブファミリーに属する。し
かし、ｒｈＭＣ−３Ｒは、すべての他の受容体と共通したいくつかの特徴を有し
、大部分の他のＧＰＣＲには存在していないいくつかの特徴を有する。この様な
特徴には、ＴＭ１におけるＥＮモチーフ、ＴＭ２とＴＭ３との間またはＴＭ４と
ＴＭ５との間のループにＣｙｓが存在しないこと、ＴＭ５におけるＭｘｘｘｘｘ
ｘｘＹモチーフ、およびＴＭ７におけるＤＰｘｘＹモチーフが含まれる。すべて
のメラノコルチン受容体は、ロドプシンサブファミリーの他のメンバーに存在す
る細胞外ループにＣｙｓ残基を有していないため、らせん間のジスルフィド結合
（例えば、ＴＭ３およびＴＭ５の頂部付近のＣｙｓ残基間）は、大部分の他のＧ
ＰＣＲにおけるループ間ジスルフィド結合と同じ機能を果たしていると考えられ
る。[0071] Melanocortin receptors belong to the rhodopsin subfamily of GPCRs. However, rhMC-3R has some features in common with all other receptors and some features that are not present in most other GPCRs. These features include the EN motif in TM1, the absence of Cys in the loop between TM2 and TM3 or the loop between TM4 and TM5, Mxxxxxx in TM5.
xxY motif, and the DPxxY motif in TM7. Because all melanocortin receptors do not have Cys residues in the extracellular loop present in other members of the rhodopsin subfamily, disulfide bonds between the helices (eg, between the Cys residues near the top of TM3 and TM5). ) Is most other G
It is thought that it has the same function as the inter-loop disulfide bond in PCR.

【００７２】 本発明はまた、アカゲザルのメラノコルチン−３受容体タンパク質の実質的に
精製された形態に関する。これは、図２に開示され、配列番号２として示される
アミノ酸配列を含む。The present invention also relates to a substantially purified form of the rhesus monkey melanocortin-3 receptor protein. This includes the amino acid sequence disclosed in FIG. 2 and shown as SEQ ID NO: 2.

【００７３】 本発明はまた、配列番号２として示されているアミノ酸配列を含むアカゲザル
のメラノコルチン−３受容体タンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび
／または変異体に関する。これらは、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端
切形およびカルボキシ末端切形（必ずしもこれらに限定されない）を含み、その
結果、これらの変異体は、診断、治療または予防に使用されるタンパク質または
タンパク質フラグメントをもたらし、ＭＣ−３Ｒ機能のアゴニストおよび／また
はアンタゴニストに関するスクリーニングに有用である。The present invention also relates to a biologically active fragment and / or variant of a rhesus monkey melanocortin-3 receptor protein comprising the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2. These include, but are not limited to, amino acid substitutions, deletions, additions, amino-terminal truncations, and carboxy-terminal truncations, such that these variants are proteins that are used for diagnosis, treatment or prevention. Alternatively, it results in a protein fragment, which is useful for screening for agonists and / or antagonists of MC-3R function.

【００７４】 本発明の好ましい態様は、図２に開示され、配列番号２として示され、本明細
書中においてA preferred embodiment of the present invention is disclosed in FIG. 2, shown as SEQ ID NO: 2, and

【００７５】[0075]

【化７】 （配列番号２） に示され、これは、野生型のアカゲザルのメラノコルチン−３受容体タンパク質
のアミノ酸配列を含む。Embedded image (SEQ ID NO: 2), which contains the amino acid sequence of the wild-type rhesus monkey melanocortin-3 receptor protein.

【００７６】 ＭＣ−３Ｒを宿主細胞において発現させた後、ＭＣ−３Ｒタンパク質を回収し
て、活性形態のＭＣ−３Ｒタンパク質を得ることができる。いくつかのＭＣ−３
Ｒタンパク質精製手法を利用することができ、使用に適している。組換えＭＣ−
３Ｒタンパク質は、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマ
トグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水相互
作用クロマトグラフィーの様々な組合せによって、あるいはそれらを個々に適用
することによって細胞溶解物および細胞抽出物から精製することができる。さら
に、組換えＭＣ−３Ｒタンパク質は、全長のＭＣ−３Ｒタンパク質またはＭＣ−
３Ｒタンパク質のポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体を用いて作製された免疫アフィニティーカラムを使用して
他の細胞タンパク質から分離することができる。After expressing MC-3R in a host cell, the MC-3R protein can be recovered to obtain an active form of the MC-3R protein. Some MC-3
R protein purification techniques are available and suitable for use. Recombinant MC-
3R proteins can be isolated from cell lysates and cell extracts by various fractions of salt fractionation, ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, hydroxylapatite adsorption chromatography and hydrophobic interaction chromatography, or by applying them individually. Can be purified. Furthermore, the recombinant MC-3R protein is a full-length MC-3R protein or MC-R
It can be separated from other cellular proteins using an immunoaffinity column created using a monoclonal or polyclonal antibody specific for a polypeptide fragment of the 3R protein.

【００７７】 本発明はまた、野生型の脊椎動物ＭＣ−３Ｒ活性を調節する化合物を同定する
アッセイにおいて有用な融合タンパク質を発現する融合構築物である単離された
核酸分子に関する。本発明のこの部分の好ましい態様には、グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＭＣ−３Ｒ融合構築物が含まれるが、これに限定
されない。この融合構築物は、業者に知られている方法によって、ＧＳＴ遺伝子
のカルボキシ末端におけるインフレーム融合物としてのアカゲザルＭＣ−３Ｒの
細胞内ドメイン、あるいはＧＳＴ遺伝子または免疫グロブリン遺伝子に融合させ
たＭＣ５Ｒの細胞外リガンド結合ドメインおよび膜貫通リガンド結合ドメインの
いずれかを含むが、これらに限定されない。組換えＧＳＴ−ＭＣ−３Ｒ融合タン
パク質は、バキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇ
ｅｎ）を使用するＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆
虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む様々な発現システムで発現させることが
できる。The present invention also relates to an isolated nucleic acid molecule that is a fusion construct that expresses a fusion protein useful in an assay to identify compounds that modulate wild-type vertebrate MC-3R activity. Preferred embodiments of this part of the invention include, but are not limited to, glutathione S-transferase (GST) -MC-3R fusion construct. This fusion construct can be prepared by methods known to those skilled in the art, using the intracellular domain of rhesus monkey MC-3R as an in-frame fusion at the carboxy terminus of the GST gene, or the extracellular domain of MC5R fused to the GST gene or immunoglobulin gene. Includes, but is not limited to, either a ligand binding domain or a transmembrane ligand binding domain. Recombinant GST-MC-3R fusion protein was obtained from a baculovirus expression vector (pAcG2T) (Pharming
en) can be expressed in a variety of expression systems, including Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells (Invitrogen).

【００７８】 本発明はまた、本発明の核酸を含む組換え宿主細胞（原核生物細胞および真核
生物の両方、ならびに安定的な形質転換細胞および一過性の形質転換細胞の両方
）から得られる細胞膜画分に関する。このような細胞膜画分は、野生型または変
異型のいずれかのアカゲザルメラノコルチン−３受容体タンパク質を、内在性レ
ベルを実質的に上回るレベルで含み、従って、本明細書中に記載されている様々
なアッセイにおいて有用である。The present invention is also obtained from recombinant host cells (both prokaryotic and eukaryotic, as well as both stable and transiently transformed cells) containing the nucleic acids of the invention. It relates to the cell membrane fraction. Such cell membrane fractions contain either wild-type or mutant rhesus monkey melanocortin-3 receptor protein at levels substantially above the endogenous levels, and thus are not described herein. Useful in sensitive assays.

【００７９】 本発明はまた、本明細書中に開示されている実質的に精製された核酸分子を含
む組換えベクターおよび組換え宿主（原核生物および真核生物の両方）に関する
。ｒｈＭＣ−３Ｒの全体または一部をコードする本発明の核酸分子は、受容体を
含む「組換えＤＮＡ分子」を得るために、他のＤＮＡ分子と、すなわち、ｒｈＭ
Ｃ−３Ｒが本来結合していないＤＮＡ分子と結合させることができる。本発明の
新規なＤＮＡ配列は、ｒｈＭＣ−３Ｒまたは機能的等価体をコードする核酸を含
むベクターに挿入することができる。このようなベクターはＤＮＡまたはＲＮＡ
から構成され得る。大部分のクローニング目的のためには、ＤＮＡベクターが好
ましい。代表的なベクターには、ｒｈＭＣ−３Ｒをコードし得るプラスミド、改
変されたウイルス、バクテリオファージおよびコスミド、酵母人工染色体、なら
びにエピソームまたは組み込み型ＤＮＡの他の形態が含まれる。特定の遺伝子移
動または他の使用に適切なベクターを決定することは十分に当業者の範囲内であ
る。[0079] The present invention also relates to recombinant vectors and recombinant hosts (both prokaryotic and eukaryotic) that include the substantially purified nucleic acid molecules disclosed herein. The nucleic acid molecule of the invention encoding all or part of rhMC-3R may be combined with other DNA molecules, ie, rhM-3, to obtain a "recombinant DNA molecule" containing the receptor.
C-3R can be bound to DNA molecules that are not naturally bound. The novel DNA sequences of the present invention can be inserted into a vector containing a nucleic acid encoding rhMC-3R or a functional equivalent. Such vectors are DNA or RNA
Can be composed of For most cloning purposes, DNA vectors are preferred. Representative vectors include plasmids capable of encoding rhMC-3R, modified viruses, bacteriophage and cosmids, yeast artificial chromosomes, and other forms of episomal or integrated DNA. It is well within the skill of the art to determine an appropriate vector for a particular gene transfer or other use.

【００８０】 例えば、様々な哺乳動物発現ベクターを、組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒを哺乳
動物細胞において発現させるために使用することができる。発現ベクターは、本
明細書中では、適切な宿主におけるクローニングされたＤＮＡの転写およびその
ｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列として定義される。そのようなベクタ
ーを使用して、細菌、らん藻、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞などの様々な
宿主において真核生物ＤＮＡを発現させることができる。特別に設計されたベク
ターは、細菌−酵母または細菌−動物細胞などの宿主間でＤＮＡを移動させるこ
とができる。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律的な複製
に必要な複製起点、選択マーカー、一定数の有用な制限酵素部位、高コピー数に
関する能力、および活性なプロモーターを含まなければならない。プロモーター
は、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させて、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ
配列として定義される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡを高頻度に開始させる
ものである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変されたクローニン
グベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスが含まれ得るが、これ
らに限定されない。組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒの発現に好適と考えられる市販
の哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐ
ＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏａｂｓ）、ｐｃＤＮＡ
Ｉ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅ
ｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、
ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶ
ｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳ
Ｖ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）
およびλＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が含まれるが、これらに限定されない
。For example, various mammalian expression vectors can be used to express recombinant rhesus monkey MC-3R in mammalian cells. An expression vector is defined herein as a DNA sequence required for transcription of the cloned DNA and translation of its mRNA in a suitable host. Such vectors can be used to express eukaryotic DNA in various hosts such as bacteria, cyanobacteria, plant cells, insect cells and animal cells. Specially designed vectors are capable of transferring DNA between hosts such as bacteria-yeast or bacteria-animal cells. A properly constructed expression vector must contain the origin of replication necessary for autonomous replication in the host cell, a selectable marker, a number of useful restriction enzyme sites, a capacity for high copy number, and an active promoter. A promoter is a DNA that binds RNA polymerase to DNA and initiates RNA synthesis.
Defined as an array. Strong promoters are those that initiate mRNA frequently. Expression vectors can include, but are not limited to, cloning vectors, modified cloning vectors, specially designed plasmids or viruses. Commercially available mammalian expression vectors considered suitable for the expression of recombinant rhesus monkey MC-3R include pcDNA3. neo (Invitrogen)
, PcDNA3.1 (Invitrogen), pCI-neo (Promega)
a), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 and p
LITMUS39 (New England Biolabs), pcDNA
I, pcDNAIamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invit
rogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Strata)
tag, pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-ne
o (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110),
pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSV
gpt (ATCC37199), pRSVneo (ATCC37198), pS
V2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460)
And λZD35 (ATCC 37565), but are not limited thereto.

【００８１】 また、様々な細菌発現ベクターを、組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒを細菌細胞に
おいて発現させるために使用することができる。組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒの
発現に好適と考えられる市販の細菌発現ベクターには、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、λｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）およびｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これ
らに限定されない。[0081] A variety of bacterial expression vectors can also be used to express recombinant rhesus monkey MC-3R in bacterial cells. Commercially available bacterial expression vectors considered suitable for the expression of recombinant rhesus monkey MC-3R include pCR2.1 (Invi
trogen), pET11a (Novagen), λgt11 (Invitr)
ogen) and pKK223-3 (Pharmacia).

【００８２】 さらに、様々な菌類細胞発現ベクターを、組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒを菌類
細胞において発現させるために使用することができる。組換えアカゲザルＭＣ−
３Ｒの発現に好適と考えられる市販の菌類細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）が含まれるが、これらに限定されない。In addition, various fungal cell expression vectors can be used to express recombinant rhesus monkey MC-3R in fungal cells. Recombinant rhesus monkey MC-
Commercially available fungal cell expression vectors considered suitable for 3R expression include pYES2 (
Invitrogen) and Pichia expression vectors (Invitrogen)
n), but is not limited thereto.

【００８３】 また、様々な昆虫細胞発現ベクターを、組換え受容体を昆虫細胞において発現
させるために使用することができる。アカゲザルＭＣ−３Ｒの組換え発現に好適
と考えられる市販の昆虫細胞発現ベクターには、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩおよび
ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されない。[0083] Various insect cell expression vectors can also be used to express the recombinant receptor in insect cells. Commercially available insect cell expression vectors considered suitable for recombinant expression of rhesus monkey MC-3R include pBlueBacIII and pBlueBacHis2 (Invitrogen) and pAcG2T (P
harmingen), but is not limited thereto.

【００８４】 アカゲザルＭＣ−３ＲＤＮＡの発現はまた、インビトロで産生させた合成ｍＲ
ＮＡを使用して行うことができる。合成ｍＲＮＡは、カエルの卵母細胞へのマイ
クロ注入（これに限定されない）を含む細胞型システムにおいて効率的に翻訳さ
れるだけでなく、小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物（これらに限定されな
い）を含む様々な無細胞システムで効率的に翻訳することができる。カエルの卵
母細胞へのマイクロ注入が好ましい。The expression of rhesus monkey MC-3R DNA was also determined by in vitro produced synthetic mR
This can be done using NA. Synthetic mRNA is efficiently translated in cell-type systems, including, but not limited to, microinjection into frog oocytes, as well as, but not limited to, wheat germ extracts and reticulocyte extracts. Can be efficiently translated in various cell-free systems, including: Microinjection into frog oocytes is preferred.

【００８５】 最適なレベルのアカゲザルＭＣ−３ＲをもたらすアカゲザルＭＣ−３ＲのｃＤ
ＮＡ配列を決定するために、アカゲザルＭＣ−３Ｒの全長のオープンリーディン
グフレームを含むｃＤＮＡフラグメント、ならびにタンパク質の特定のドメイン
のみまたはタンパク質の再配置されたドメインをコードするｃＤＮＡ部分を含む
様々な構築物（これらに限定されない）を含むｃＤＮＡ分子を構築することがで
きる。すべての構築物は、アカゲザルＭＣ−３ＲのｃＤＮＡの５’非翻訳領域お
よび／または３’非翻訳領域を含まないように、あるいはそのような非翻訳領域
のすべてまたは一部を含むように設計することができる。アカゲザルＭＣ−３Ｒ
の発現レベルおよび活性は、このような構築物を単独または組み合わせて適切な
宿主細胞に導入した後で測定することができる。一過性のアッセイで最適な発現
をもたらすアカゲザルＭＣ−３ＲのｃＤＮＡカセットを決定した後、このＭＣ−
３ＲのｃＤＮＡ構築物は、（組換えウイルスを含む）様々な発現ベクターに移さ
れる。このような発現ベクターには、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母
細胞、細菌および酵母細胞に対する発現ベクターが含まれるが、これらに限定さ
れない。Rhesus monkey MC-3R cD yielding optimal levels of rhesus monkey MC-3R
To determine the NA sequence, a cDNA fragment containing the full length open reading frame of rhesus monkey MC-3R, as well as various constructs containing only specific domains of the protein or portions of the cDNA encoding the rearranged domains of the protein (these constructs). CDNA molecules, including, but not limited to, All constructs should be designed so as not to contain the 5 'and / or 3' untranslated region of the rhesus monkey MC-3R cDNA, or to contain all or part of such untranslated region. Can be. Rhesus monkey MC-3R
Can be measured after introducing such constructs, alone or in combination, into appropriate host cells. After determining the rhesus monkey MC-3R cDNA cassette that yields optimal expression in a transient assay,
The 3R cDNA construct is transferred to various expression vectors (including recombinant viruses). Such expression vectors include, but are not limited to, expression vectors for mammalian cells, plant cells, insect cells, oocytes, bacteria and yeast cells.

【００８６】 多くの受容体タンパク質の場合のように、多くのアミノ酸を改変することがで
き、特に、リガンド結合ドメイン内に見出されず、そして元の受容体と実質的に
同じ生物学的活性を依然として保持するアミノ酸を改変することができる。従っ
て、本発明には、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが、ｒｈＭＣ−３Ｒ
と実質的に同じ活性を依然として保持している改変されたｒｈＭＣ−３Ｒポリペ
プチドが含まれる。一アミノ酸の置換は、通常、タンパク質の生物学的活性を変
化させないことが一般には受け入れられている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｗａｔｓｏｎ他、１９８７、第４版
、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、２２６頁
；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ＆Ｗｅｌｌｓ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１
０８１〜１０８５を参照のこと）。従って、本発明には、一アミノ酸の置換が生
じ、そしてこのタンパク質が野生型のｒｈＭＣ−３Ｒと実質的に同じ生物学的活
性を保持している単離された核酸分子および発現したＭＣ−３Ｒタンパク質が含
まれる。本発明にはまた、２個以上のアミノ酸の置換が生じ、そしてこのタンパ
ク質が野生型のｒｈＭＣ−３Ｒと実質的に同じ生物学的活性を保持している単離
された核酸分子および発現したＭＣ−３Ｒタンパク質も含まれる。特に、本発明
には、上記に記載される置換が保存的な置換である実施形態が含まれる。特に、
本発明には、上記に記載される置換がｒｈＭＣ−３Ｒのリガンド結合ドメインに
おいて生じていない実施形態が含まれる。As with many receptor proteins, many amino acids can be modified, particularly those that are not found in the ligand binding domain and still retain substantially the same biological activity as the original receptor The amino acids retained can be modified. Thus, the present invention includes amino acid deletions, additions or substitutions, but without the rhMC-3R.
And modified rhMC-3R polypeptides that still retain substantially the same activity. It is generally accepted that single amino acid substitutions generally do not alter the biological activity of the protein (eg, Molecular
Biology of the Gene, Watson et al., 1987, 4th edition, The Benjamin / Cummings Co. , Inc. 226, Cunningham & Wells, 1989, Science, 244: 1.
081-1085). Thus, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule and an expressed MC-3R wherein a single amino acid substitution has occurred and the protein retains substantially the same biological activity as wild-type rhMC-3R. Proteins. The present invention also provides isolated nucleic acid molecules and expressed MCs in which two or more amino acid substitutions have occurred and wherein the protein retains substantially the same biological activity as wild-type rhMC-3R. Also included is the -3R protein. In particular, the present invention includes embodiments where the above-described substitutions are conservative substitutions. In particular,
The invention includes embodiments in which the above-described substitutions have not occurred in the ligand binding domain of rhMC-3R.

【００８７】 従って、本発明にはまた、ｒｈＭＣ−３Ｒ遺伝子を含むベクター、そのような
ベクターを含む宿主細胞、ならびにｒｈＭＣ−３Ｒ遺伝子を宿主細胞に導入する
工程、およびｒｈＭＣ−３Ｒが産生されるような適切な条件下でその宿主細胞を
培養する工程を含む実質的に純粋なｒｈＭＣ−３Ｒタンパク質を作製する方法も
含まれる。そのようにして産生されたｒｈＭＣ−３Ｒは、従来の方法で宿主細胞
から集めることができる。従って、本発明はまた、本明細書中に開示されている
アカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質および生物学的等価体の発現方法、この遺伝子
産物を用いるアッセイ、このような受容体タンパク質を発現するＤＮＡ構築物を
含む組換え宿主細胞、ならびにそのようなアッセイにより同定された化合物であ
って、ＭＣ−３Ｒ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物
に関する。Thus, the present invention also provides a vector containing the rhMC-3R gene, a host cell containing such a vector, and a step of introducing the rhMC-3R gene into the host cell, and producing rhMC-3R. Also included is a method of producing a substantially pure rhMC-3R protein comprising culturing the host cell under suitable conditions. The rhMC-3R so produced can be collected from host cells in a conventional manner. Accordingly, the present invention also provides methods for expressing the rhesus monkey MC-3R protein and bioisosteres disclosed herein, assays using this gene product, DNA constructs expressing such receptor proteins. As well as compounds identified by such assays that act as agonists or antagonists of MC-3R activity.

【００８８】 上記に記載された方法で得られ、クローニングされたアカゲザルＭＣ−３Ｒの
ｃＤＮＡは、好適なプロモーターおよび他の適切な転写調節エレメントを含む発
現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌ
ｕｅＢａｃＨｉｓ２またはｐＬＩＴＭＵＳ２８など）に分子クローニングによっ
て組換え発現して、組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒを産生させるために原核生物ま
たは真核生物の宿主細胞に移すことができる。そのような操作に関する技術は、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（上記）に記載されており、実施例の節に詳しく議論され、
そして当業者にはよく知られ、容易に利用することができる。従って、本発明の
別の態様には、ｒｈＭＣ−３ＲをコードするＤＮＡ配列を含有または発現するよ
うに操作された宿主細胞が含まれる。そのような組換え宿主細胞は、ｒｈＭＣ−
３Ｒまたは生物学的等価形態を産生するのに好適な条件下で培養することができ
る。組換え宿主細胞は原核生物または真核生物であり得る。これには、大腸菌な
どの細菌、酵母などの菌類細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類を起源と
する細胞株（これらに限定されない）を含む哺乳動物細胞、ならびにショウジョ
ウバエおよびカイコから得られる細胞株（これらに限定されない）を含む昆虫細
胞が含まれるが、これらに限定されない。従って、アカゲザルＭＣ−３Ｒ様タン
パク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、アカゲザルＭＣ−３Ｒを組換
え宿主細胞において発現させるために使用することができる。組換え宿主細胞は
原核生物または真核生物であり得る。これには、大腸菌などの細菌、酵母などの
菌類細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類を起源とする細胞株（これらに
限定されない）を含む哺乳動物細胞、ならびにショウジョウバエおよびカイコか
ら得られる細胞株（これらに限定されない）を含む昆虫細胞が含まれるが、これ
らに限定されない。例えば、昆虫発現システムの１つは、バキュロウイルス発現
ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と組み合わせたＳｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）を利用する。また、好適と考えられる市販の哺乳動物種には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（
ＴＫ⁻）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１．２
）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８５）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５
７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０
）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７１）およびＣＰＡＥ（
ＡＴＣＣ ＣＣＬ２０９）が含まれるが、これらに限定されない。The rhesus monkey MC-3R cDNA obtained and cloned by the method described above can be used for expression vectors (pcDNA3.neo, pcDNA3.1, pCR2. 1, pBl
ueBacHis2 or pLITMUS28) can be recombinantly expressed by molecular cloning and transferred to prokaryotic or eukaryotic host cells to produce recombinant rhesus monkey MC-3R. The technology for such operations is
Described in Sambrook et al. (Supra) and discussed in detail in the Examples section,
It is well known to those skilled in the art and can be easily used. Accordingly, another aspect of the present invention includes a host cell engineered to contain or express a DNA sequence encoding rhMC-3R. Such a recombinant host cell comprises rhMC-
Culture can be performed under conditions suitable to produce 3R or a bioequivalent form. Recombinant host cells can be prokaryotic or eukaryotic. This includes bacteria from E. coli, fungal cells such as yeast, mammalian cells, including but not limited to cell lines of human, bovine, porcine, monkey and rodent origin, and from Drosophila and silkworm. Insect cells, including, but not limited to, the following cell lines: Thus, an expression vector comprising a DNA encoding a rhesus monkey MC-3R-like protein can be used to express rhesus monkey MC-3R in a recombinant host cell. Recombinant host cells can be prokaryotic or eukaryotic. This includes bacteria from E. coli, fungal cells such as yeast, mammalian cells, including but not limited to cell lines of human, bovine, porcine, monkey and rodent origin, and from Drosophila and silkworm. Insect cells, including, but not limited to, the following cell lines: For example, one of the insect expression systems is Spodop in combination with a baculovirus expression vector (pAcG2T, Pharmingen).
tera frugiperda (Sf21) insect cells (Invitrogen)
). Commercially available mammalian species that are considered suitable include L-cell LM (
TK ⁻ ) (ATCC CCL1.3), L cell LM (ATCC CCL1.2)
), Saos-2 (ATCC HTB-85), 293 (ATCC CRL15).
73), Raji (ATCC CCL86), CV-1 (ATCC CCL70)
), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL)
1651), CHO-K1 (ATCC CCL61), 3T3 (ATCC CC
L92), NIH / 3T3 (ATCC CRL1658), HeLa (ATCC
CCL2), C1271 (ATCC CRL1616), BS-C-1 (AT
CC CCL26), MRC-5 (ATCC CCL171) and CPAE (
ATCC CCL 209).

【００８９】 本明細書中に記載されているアッセイは、タンパク質精製スキームと同様に、
ＭＣ−３Ｒの発現を導く発現ベクターで一過性または安定的にトランスフェクシ
ョンまたは形質転換された細胞を用いて行うことができる。発現ベクターは、形
質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポレーシ
ョン（これらに限定されない）を含む多数の技術のいずれかによって宿主細胞に
導入することができる。形質転換は、ＤＮＡの取り込みから生じる標的細胞に対
する遺伝子的変化を包含することを意味する。トランスフェクションは、ＭＣ−
３Ｒを試験細胞に導入するために当分野で知られている任意の方法を含むことを
意味する。例えば、トランスフェクションには、リン酸カルシウムまたは塩化カ
ルシウムによって媒介されるトランスフェクション、リポフェクション、ＭＣ−
３Ｒを含むレトロウイルス構築物による感染、およびエレクトロポレーションが
含まれる。発現ベクターを含む細胞は、ヒトＭＣ−３Ｒタンパク質を産生してい
るかどうかを明らかにするために個々に分析される。ヒトＭＣ−３Ｒを発現する
細胞の同定は、抗ヒトＭＣ−３Ｒ抗体との免疫学的反応性、標識されたリガンド
の結合、および宿主細胞に結合するヒトＭＣ−３Ｒ活性の存在（これらに限定さ
れない）を含むいくつかの手段によって行うことができる。The assay described herein, as well as the protein purification scheme,
It can be performed using cells transiently or stably transfected or transformed with an expression vector that directs the expression of MC-3R. Expression vectors can be introduced into host cells by any of a number of techniques, including, but not limited to, transformation, transfection, protoplast fusion, and electroporation. Transformation is meant to encompass a genetic change to a target cell that results from the incorporation of DNA. Transfection was performed using MC-
It is meant to include any method known in the art for introducing a 3R into a test cell. For example, transfection includes transfection mediated by calcium phosphate or calcium chloride, lipofection, MC-
Includes infection with a retroviral construct containing the 3R, and electroporation. Cells containing the expression vector are individually analyzed to determine if they are producing human MC-3R protein. Identification of cells expressing human MC-3R includes immunological reactivity with anti-human MC-3R antibodies, binding of labeled ligand, and the presence of human MC-3R activity binding to host cells, including but not limited to these. (Not done).

【００９０】 ｒｈＭＣ−３Ｒに対して親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングさ
れた受容体を発現する組換え細胞またはこのような細胞から得られる膜に対する
化合物の親和性を測定することによって明らかにされる。クローニングされた受
容体の発現、およびｒｈＭＣ−３Ｒに結合する化合物のスクリーニング、または
このような細胞もしくはこのような細胞から調製された膜に対するｒｈＭＣ−３
Ｒの知られている放射能標識されたリガンドの結合を阻害する化合物のスクリー
ニングにより、ｒｈＭＣ−３Ｒに対して大きな親和性を有する化合物を迅速に選
択する方法が得られる。そのようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要は
なく、結合した放射能標識化合物と置換させるために使用され得るか、または機
能アッセイにおける活性化因子として使用され得る非放射性の化合物でもあり得
る。上記の方法で同定された化合物は、ｒｈＭＣ−３Ｒのアゴニストまたはアン
タゴニストであると考えられ、ペプチド、タンパク質または非タンパク質性有機
分子であり得る。The binding specificity of a compound exhibiting affinity for rhMC-3R can be determined by measuring the affinity of the compound for recombinant cells expressing the cloned receptor or membranes obtained from such cells. Will be revealed. Expression of the cloned receptor and screening for compounds that bind rhMC-3R, or rhMC-3 against such cells or membranes prepared from such cells
Screening for compounds that inhibit the binding of radiolabeled ligands of known R provides a way to rapidly select compounds with high affinity for rhMC-3R. Such ligands need not necessarily be radiolabeled, but can also be non-radioactive compounds that can be used to displace bound radiolabeled compounds or can be used as activators in functional assays. Compounds identified by the above methods are considered to be rhMC-3R agonists or antagonists and may be peptides, proteins or non-proteinaceous organic molecules.

【００９１】 従って、本発明は、ＭＣ−３Ｒタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの
発現を調節する化合物、ならびにＭＣ−３Ｒタンパク質の機能をもたらす化合物
のスクリーニング方法に関する。他の受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト
を同定する方法が当分野ではよく知られており、そのような方法はＭＣ−３Ｒの
アゴニストおよびアンタゴニストを同定するために適合させることができる。例
えば、Ｃａｓｃｉｅｒｉ他（１９９２、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１
：１０９６〜１０９９）は、ラットのニューロキニン受容体に対するアゴニスト
結合を阻害する物質、従って、ニューロキニン受容体の潜在的なアゴニストまた
はアンタゴニストである物質を同定するための方法を記載している。この方法は
、ラットのニューロキニン受容体を含む発現ベクターでＣＯＳ細胞をトランスフ
ェクションすること、ニューロキニン受容体を発現させるために十分な時間にわ
たってトランスフェクション細胞を生育させること、トランスフェクション細胞
を集めて、ニューロキニン受容体の知られている放射能標識されたアゴニストを
含むアッセイ緩衝液に細胞をそのような物質の存在下または非存在下のいずれか
で再懸濁すること、その後、ニューロキニン受容体の放射能標識された知られて
いるアゴニストのニューロキニン受容体に対する結合を測定することを含む。知
られているアゴニストの結合量が、そのような物質の存在下において、そのよう
な物質の非存在下よりも少ない場合、その物質は、ニューロキニン受容体の潜在
的なアゴニストまたはアンタゴニストである。ＭＣ−３Ｒに対するアゴニストま
たはアンタゴニストなどの物質の結合が測定される場合、そのような結合は、標
識された物質またはアゴニストを用いることによって測定することができる。そ
のような物質またはアゴニストは、当分野で知られている都合のよい方法のいず
れかで、例えば、放射能的に、蛍光的に、酵素的に標識することができる。Accordingly, the present invention relates to a compound that regulates the expression of DNA or RNA encoding the MC-3R protein, and a method for screening a compound that brings about the function of the MC-3R protein. Methods for identifying agonists and antagonists of other receptors are well known in the art, and such methods can be adapted to identify MC-3R agonists and antagonists. For example, Cascieri et al. (1992, Molec. Pharmacol. 41
: 1096-1099) describe methods for identifying substances that inhibit agonist binding to the rat neurokinin receptor, and thus are potential agonists or antagonists of the neurokinin receptor. This method involves transfecting COS cells with an expression vector containing the rat neurokinin receptor, growing the transfected cells for a sufficient time to express the neurokinin receptor, collecting the transfected cells, Resuspending the cells in an assay buffer containing a known radiolabeled agonist of the neurokinin receptor, either in the presence or absence of such a substance, followed by neurokinin receptor Measuring the binding of the body's radiolabeled known agonist to the neurokinin receptor. If the binding of a known agonist is less in the presence of such a substance than in the absence of such a substance, the substance is a potential agonist or antagonist of the neurokinin receptor. Where binding of a substance such as an agonist or antagonist to MC-3R is measured, such binding can be measured by using a labeled substance or agonist. Such agents or agonists can be labeled in any convenient manner known in the art, for example, radioactively, fluorescently, enzymatically.

【００９２】 従って、ＭＣ−３Ｒに対する親和性を有する化合物の結合親和性は、クローニ
ングされた受容体を発現する組換え細胞またはこのような細胞から得られる膜に
対する化合物の親和性を測定することによって明らかにされる。クローニングさ
れた受容体の発現、およびｒｈＭＣ−３Ｒに結合する化合物のスクリーニング、
またはこのような細胞もしくはこのような細胞から調製された膜に対するＭＣ−
３Ｒの知られている放射能標識されたリガンドの結合を阻害する化合物のスクリ
ーニングにより、ＭＣ−３Ｒに対して大きな親和性を有する化合物を迅速に選択
する効果的な方法が得られる。そのようなリガンドは、必ずしも放射能標識する
必要はなく、結合した放射能標識化合物と置換させるために使用され得るか、ま
たは機能アッセイにおける活性化因子として使用され得る非放射性の化合物でも
あり得る。上記の方法で同定された化合物は、ＭＣ−３Ｒのアゴニストまたはア
ンタゴニストであると考えられ、ペプチド、タンパク質または非タンパク質性有
機分子であり得る。化合物は、ＭＣ−３ＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発
現を増大または弱めることによって、あるいはＭＣ−３Ｒ受容体タンパク質のア
ゴニストまたはアンタゴニストとして作用することによって調節する。ＭＣ−３
ＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現またはその生物学的機能を調節するこ
のような化合物は、様々なアッセイによって検出することができる。そのような
アッセイは、発現または機能の変化が存在するかどうかを測定する単純な「ｙｅ
ｓ／ｎｏ」アッセイであってもよい。アッセイは、試験サンプルの発現または機
能を、基準サンプルにおける発現または機能のレベルと比較することによって定
量化することができる。ＭＣ−３Ｒ、ＭＣ−３Ｒに対する抗体、または改変され
たＭＣ−３Ｒを含むキットを、そのような使用に関して知られている方法によっ
て作製することができる。Thus, the binding affinity of a compound having affinity for MC-3R can be determined by measuring the affinity of the compound for recombinant cells expressing the cloned receptor or membranes obtained from such cells. Will be revealed. Expression of the cloned receptor, and screening for compounds that bind to rhMC-3R;
Or MC- for such cells or membranes prepared from such cells.
Screening for compounds that inhibit the binding of a known radiolabeled ligand of 3R provides an effective way to rapidly select compounds with high affinity for MC-3R. Such ligands need not necessarily be radiolabeled, but can also be non-radioactive compounds that can be used to displace bound radiolabeled compounds or can be used as activators in functional assays. Compounds identified by the above methods are considered to be agonists or antagonists of MC-3R and may be peptides, proteins or non-proteinaceous organic molecules. The compounds modulate by increasing or decreasing the expression of DNA or RNA encoding MC-3R, or by acting as agonists or antagonists of the MC-3R receptor protein. MC-3
Such compounds that modulate the expression of DNA or RNA encoding R or its biological function can be detected by various assays. Such an assay is a simple "yes" that measures whether an expression or function change is present.
"s / no" assays. Assays can be quantified by comparing the expression or function of a test sample to the level of expression or function in a reference sample. Kits containing MC-3R, antibodies to MC-3R, or modified MC-3R can be made by methods known for such uses.

【００９３】 従って、本発明は、組換えシステムにおけるｒｈＭＣ−３Ｒの発現方法、なら
びにｒｈＭＣ−３Ｒのアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法に関する。標
的受容体と特異的に相互作用する潜在的な薬物を同定するために化合物がスクリ
ーニングされる場合、同定された化合物が標的受容体に対してできる限り特異的
であることを確保しなければならない。このためには、標的受容体と類似する、
できる限り広範囲の受容体に対して化合物をスクリーニングすることが必要であ
る。従って、受容体Ａと相互作用する潜在的な薬物である化合物を同定するため
には、その化合物が受容体Ａ（「プラス標的」）と相互作用して、受容体Ａを介
して望ましい薬理学的作用をもたらすことを確実にすることが必要であるだけで
なく、その化合物が、受容体Ｂ、Ｃ、Ｄなど（「マイナス標的」）と相互作用し
ないことを明らかにすることもまた必要である。一般に、スクリーニングプログ
ラムの一部として、できる限り多くのマイナス標的を有することが重要である（
Ｈｏｄｇｓｏｎ、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：９７３〜９
８０を参照のこと）。アカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質およびこの受容体タンパ
ク質をコードするＤＮＡ分子は、他のＧタンパク質共役受容体と特異的に相互作
用する化合物を同定することを目的とするスクリーニングにおいて「マイナス標
的」として使用できる点でさらなる有用性を有している。ＧＰＣＲに対する相同
性のために、本発明のｒｈＭＣ−３Ｒは、ＧＰＣＲと同じように機能して、類似
した生物学的活性を有すると考えられる。それらは、霊長類において、その後、
ヒトの臨床試験においてメラノコルチン活性プロセスを同定するために、アカゲ
ザルにおける生物学的および生理学的な作用を理解する際に有用である。より注
目され得ることに、霊長類において効果的な新規な抗肥満剤を同定するために、
ｒｈＭＣ−３Ｒのアゴニストが同定され、食物摂取、体重増加および代謝速度に
対するその作用について評価されている。それらはまた、特に、同定されたリガ
ンドの特異性を試験することに関して、アカゲザルメラノコルチンのアゴニスト
およびアンタゴニストを調べるために使用することができる。Accordingly, the present invention relates to a method for expressing rhMC-3R in a recombinant system and a method for identifying rhMC-3R agonists and antagonists. When compounds are screened to identify potential drugs that interact specifically with the target receptor, we must ensure that the identified compounds are as specific as possible to the target receptor . For this, it is similar to the target receptor,
It is necessary to screen compounds against as wide a range of receptors as possible. Thus, to identify a compound that is a potential drug that interacts with receptor A, the compound interacts with receptor A (the “plus target”) to produce the desired pharmacology through receptor A It is not only necessary to ensure that the compound has a positive effect, but also to demonstrate that the compound does not interact with receptors B, C, D, etc. ("minus target"). is there. In general, it is important to have as many negative targets as possible as part of a screening program (
Hodgson, 1992, Bio / Technology, 10: 973-9.
80). The rhesus monkey MC-3R protein and the DNA molecule encoding this receptor protein can be used as a "minus target" in screening aimed at identifying compounds that specifically interact with other G protein-coupled receptors. Has further utility. Due to homology to GPCRs, the rhMC-3Rs of the present invention are believed to function similarly to GPCRs and have similar biological activities. They, in primates, then
Useful in understanding the biological and physiological effects in rhesus monkeys to identify melanocortin activation processes in human clinical trials. More noticeably, in order to identify new anti-obesity agents effective in primates,
RhMC-3R agonists have been identified and evaluated for their effects on food intake, weight gain and metabolic rate. They can also be used to examine rhesus monkey melanocortin agonists and antagonists, especially with respect to testing the specificity of the identified ligand.

【００９４】 この目的のために、本発明は、一部が、ＭＣ−３Ｒ受容体の活性を調節する物
質の同定方法に関し、この方法は、 （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＭＣ−３Ｒ受容体タンパク質
の存在下および非存在下で試験物質と一緒にすること；および （ｂ）ＭＣ−３Ｒ受容体タンパク質の存在下および非存在下における試験物質
の作用を測定して比較すること を含む。To this end, the present invention relates, in part, to a method for identifying a substance that modulates the activity of an MC-3R receptor, the method comprising: (a) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 Combining with the test substance in the presence and absence of the MC-3R receptor protein; and (b) measuring and comparing the effect of the test substance in the presence and absence of the MC-3R receptor protein Including.

【００９５】 さらに、いくつかの具体的な実施形態が、ＭＣ−３Ｒ受容体タンパク質の発現
を導く発現ベクターと組み合わせて当業者によって利用され得る様々なタイプの
スクリーニングアッセイまたは選択アッセイを明らかにするために本明細書中に
開示されている。他の受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するため
の方法が当分野でよく知られており、そのような方法は、ＭＣ−３Ｒのアゴニス
トおよびアンタゴニストを同定するために適合させることができる。従って、こ
れらの実施形態は、限定としてではなく、例として示される。この目的のために
、本発明には、ＭＣ−３Ｒの調節因子（アゴニストおよびアンタゴニストなど）
が同定され得るアッセイが含まれる。従って、本発明には、物質がＭＣ−３Ｒの
潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを明らかにする方法が
含まれる。この方法は、 （ａ）細胞内におけるＭＣ−３Ｒの発現を導く発現ベクターで細胞をトランス
フェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）ＭＣ−３Ｒを発現させるために十分な時間にわたって試験細胞を生育さ
せること； （ｃ）細胞を物質の存在下および非存在下においてＭＣ−３Ｒの標識されたリ
ガンドに曝すこと； （ｄ）ＭＣ−３Ｒに対する標識リガンドの結合を測定すること を含み、この場合、標識リガンドの結合量が、物質の存在下において、物質の非
存在下のときよりの少ない場合、その物質は、ＭＣ−３Ｒの潜在的なアゴニスト
またはアンタゴニストである。In addition, some specific embodiments are provided to demonstrate various types of screening or selection assays that can be utilized by those of skill in the art in combination with expression vectors that direct the expression of the MC-3R receptor protein. Is disclosed herein. Methods for identifying agonists and antagonists of other receptors are well known in the art, and such methods can be adapted to identify MC-3R agonists and antagonists. Accordingly, these embodiments are shown by way of example, and not by way of limitation. To this end, the present invention provides for MC-3R modulators (such as agonists and antagonists)
Are included. Accordingly, the invention includes a method of determining whether a substance is a potential agonist or antagonist of MC-3R. The method comprises the steps of: (a) transfecting or transforming the cell with an expression vector that directs the expression of MC-3R in the cell to obtain a test cell; (b) a time sufficient for expressing the MC-3R. (C) exposing the cells to a labeled ligand of MC-3R in the presence and absence of the substance; (d) measuring the binding of the labeled ligand to MC-3R. In this case, if the amount of the labeled ligand bound in the presence of the substance is less than in the absence of the substance, the substance is a potential agonist or antagonist of MC-3R.

【００９６】 この方法の工程（ｃ）が行われる条件は、タンパク質−リガンド相互作用の研
究のために当分野で典型的に使用されている条件である：例えば、生理学的ｐＨ
；ＰＢＳのような広く使用されている緩衝液により、あるいは組織培養培地にお
いて表される条件などの塩条件；約４℃〜約５５℃の温度。試験細胞は集められ
、物質および標識リガンドの存在下で再懸濁することができる。上記方法の改変
において、工程（ｃ）は、細胞を集めて再懸濁するのではなく、むしろ、細胞を
基体（例えば、組織培養プレート）に結合させたまま、放射能標識された知られ
ているアゴニストおよびそのような物質を細胞と接触させる点で改変される。The conditions under which step (c) of the method is performed are those conditions typically used in the art for studying protein-ligand interactions: for example, physiological pH
Salt conditions, such as with widely used buffers such as PBS or in tissue culture media; at a temperature of about 4 ° C to about 55 ° C. Test cells can be collected and resuspended in the presence of the substance and the labeled ligand. In a modification of the above method, step (c) does not involve collecting and resuspending the cells, but rather, leaving the cells attached to a substrate (eg, a tissue culture plate), And modified in that such agonists and such substances are contacted with the cells.

【００９７】 本発明はまた、物質がＭＣ−３Ｒに結合し得るかどうか、すなわち、その物質
がＭＣ−３Ｒの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを明ら
かにする方法に関する。この方法は、 （ａ）細胞内におけるＭＣ−３Ｒの発現を導く発現ベクターで細胞をトランス
フェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）試験細胞を物質に曝すこと； （ｃ）ＭＣ−３Ｒに対する物質の結合量を測定すること； （ｄ）試験細胞におけるＭＣ−３Ｒに対する物質の結合量を、ＭＣ−３Ｒでト
ランスフェクションされていないコントロール細胞に対する物質の結合量と比較
すること を含み、 この場合、物質の結合量が、コントロール細胞と比較して試験細胞において大
きい場合、その物質はＭＣ−３Ｒに結合し得る。その後、その物質が実際にアゴ
ニストまたはアンタゴニストであるかどうかの決定が、例えば、下記に記載され
るプロミスカスＧタンパク質の使用を含むアッセイなどの機能アッセイを使用す
ることによって行われる。The present invention also relates to a method of determining whether a substance is capable of binding MC-3R, ie, whether the substance is a potential agonist or antagonist of MC-3R. The method comprises: (a) transfecting or transforming a cell with an expression vector that directs the expression of MC-3R in the cell to obtain a test cell; (b) exposing the test cell to a substance; (c) Measuring the amount of binding of the substance to MC-3R; (d) comparing the amount of binding of the substance to MC-3R in the test cells with the amount of binding of the substance to control cells not transfected with MC-3R. In this case, the substance can bind to MC-3R if the amount of binding of the substance is greater in the test cells compared to the control cells. Thereafter, a determination of whether the substance is in fact an agonist or antagonist is made, for example, by using a functional assay, such as an assay involving the use of a promiscuous G protein described below.

【００９８】 この方法の工程（ｂ）が行われる条件は、タンパク質−リガンド相互作用の研
究のために当分野で典型的に使用されている条件である：例えば、生理学的ｐＨ
；ＰＢＳのような広く使用されている緩衝液により、あるいは組織培養培地にお
いて表される条件などの塩条件；約４℃〜約５５℃の温度。試験細胞は集められ
、物質の存在下で再懸濁することができる。The conditions under which step (b) of the method is performed are those conditions typically used in the art for studying protein-ligand interactions: eg, physiological pH
Salt conditions, such as with widely used buffers such as PBS or in tissue culture media; at a temperature of about 4 ° C to about 55 ° C. Test cells can be collected and resuspended in the presence of the substance.

【００９９】 Ｃｈｅｎ他（１９９５、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
２２６：３４９〜３５４）は、Ｇタンパク質共役受容体をコードする発現ベクタ
ー、およびＬａｃＺ遺伝子に融合させたｃＡＭＰ応答エレメントを有するプロモ
ーターを含む別の発現ベクターでトランスフェクションされた組換え細胞を利用
する比色測定アッセイを記載している。過剰発現させたＧタンパク質共役受容体
の活性が、β−Ｇａｌの発現およびＯＤ測定として測定される。従って、本発明
のこの部分の別の態様には、物質がＭＣ−３Ｒの潜在的なアゴニストまたはアン
タゴニストであるかどうかを明らかにするための非放射能的な方法が含まれ、こ
の方法は、 （ａ）ＭＣ−３Ｒをコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクションま
たは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）ＬａｃＺのような比色測定用遺伝子に融合させたｃＡＭＰ誘導プロモー
ターを含む発現ベクターで工程（ａ）の試験細胞をトランスフェクションまたは
形質転換すること； （ｃ）ＭＣ−３Ｒを発現させるために十分な時間にわたってトランスフェクシ
ョン細胞を生育させること； （ｄ）トランスフェクション細胞を集めて、ＭＣ−３Ｒの知られているアゴニ
ストの存在下ならびに／または試験化合物の存在下および非存在下の両方で細胞
を再懸濁すること； （ｅ）知られているアゴニストおよび試験化合物の過剰発現させたＭＣ−３Ｒ
に対する結合を、ｃＡＭＰ誘導プロモーターからの発現を測定する比色測定アッ
セイによって測定して、知られているアゴニストの存在下、ならびに未知の物質
の存在下および非存在下における発現レベルを比較し、その結果、未知の物質が
ＭＣ−３Ｒの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうか
を明らかにすることを含む。[0099] Chen et al. (1995, Analytical Biochemistry,
226: 349-354) describe a ratio utilizing recombinant cells transfected with an expression vector encoding a G protein-coupled receptor and another expression vector containing a promoter having a cAMP response element fused to the LacZ gene. A colorimetric assay is described. The activity of the overexpressed G protein-coupled receptor is measured as β-Gal expression and OD measurement. Accordingly, another aspect of this portion of the invention includes a non-radioactive method for determining whether a substance is a potential agonist or antagonist of MC-3R, comprising: (A) transfecting or transforming cells with an expression vector encoding MC-3R to obtain test cells; (b) expression containing a cAMP-inducible promoter fused to a colorimetric gene such as LacZ. Transfecting or transforming the test cells of step (a) with the vector; (c) growing the transfected cells for a time sufficient to express MC-3R; (d) collecting the transfected cells In the presence of a known agonist of MC-3R and / or in the presence and absence of a test compound Resuspending cells in both; (e) overexpressed MC-3R of known agonist and test compound
Is measured by a colorimetric assay that measures expression from a cAMP-inducible promoter to compare expression levels in the presence of a known agonist, and in the presence and absence of an unknown substance. The results include determining whether the unknown substance acts as a potential agonist or antagonist of MC-3R.

【０１００】 アゴニストまたはアンタゴニストを同定するさらなる方法は下記を含むが、そ
れらに決して限定されない： Ｉ．（ａ）ＭＣ−３Ｒの発現を導く第１の発現ベクター、プロミスカスＧタン
パク質の発現を導く第２の発現ベクターで細胞をトランスフェクションまたは形
質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）試験細胞を、ＭＣ−３Ｒのアゴニストと考えられる物質に曝すこと； （ｃ）細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定すること、 この場合、アゴニストと考えられる物質の非存在下における細胞内のイノシトー
ルリン酸レベルと比較して、細胞内のイノシトールリン酸レベルの増大は、その
物質がＭＣ−３Ｒのアゴニストであることを示す。Further methods of identifying an agonist or antagonist include, but are not limited to, the following: (A) transfecting or transforming cells with a first expression vector that directs the expression of MC-3R, a second expression vector that directs the expression of promiscuous G protein, to obtain test cells; (b) testing Exposing the cell to a substance considered to be an agonist of MC-3R; (c) measuring the level of inositol phosphate in the cell, wherein the inositol phosphate in the cell in the absence of the substance considered to be an agonist An increase in the level of inositol phosphate in the cell as compared to the level indicates that the substance is an agonist of MC-3R.

【０１０１】 ＩＩ．（ａ）ＭＣ−３Ｒの発現を導く請求項３の第１の発現ベクターおよびプ
ロミスカスＧタンパク質の発現を導く第２の発現ベクターで細胞をトランスフェ
クションまたは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）試験細胞を、ＭＣ−３Ｒのアゴニストと考えられる物質に曝すこと； （ｃ）工程（ｂ）に引き続き、あるいは工程（ｂ）と同時に、試験細胞を、Ｍ
Ｃ−３Ｒのアンタゴニストと考えられる物質に曝すこと； （ｄ）細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定すること； この場合、アンタゴニストと考えられる物質の非存在下における細胞内のイノシ
トールリン酸レベルと比較して、アンタゴニストと考えられる物質の存在下にお
ける細胞内のイノシトールリン酸レベルの低下は、その物質がＭＣ−３Ｒのアン
タゴニストであることを示す。II. (A) transfecting or transforming a cell with the first expression vector of claim 3, which directs the expression of MC-3R, and the second expression vector, which directs the expression of promiscuous G protein, to obtain a test cell; (B) exposing the test cells to a substance considered to be an agonist of MC-3R; (c) following or simultaneously with step (b), the test cells are treated with M
(D) measuring the level of inositol phosphate in the cell; in this case, the level of inositol phosphate in the cell in the absence of the substance considered to be an antagonist. In comparison, a decrease in inositol phosphate levels in a cell in the presence of a substance that is considered an antagonist indicates that the substance is an antagonist of MC-3R.

【０１０２】 ＩＩＩ．工程（ａ）の第１および第２の発現ベクターが、ＭＣ−３Ｒタンパク
質のＣ末端においてプロミスカスＧタンパク質に融合したキメラＭＣ−３Ｒタン
パク質を発現する単一の発現ベクターに置換されているＩＩの方法。III. II wherein the first and second expression vectors of step (a) are replaced by a single expression vector expressing a chimeric MC-3R protein fused to a promiscuous G protein at the C-terminus of the MC-3R protein Method.

【０１０３】 上記の方法は、試験細胞を物質に曝すよりもむしろ、膜を試験細胞から調製す
ることができ、そのような膜を物質に曝すことができる点で改変することができ
る。細胞ではなく、膜を利用するそのような改変は当分野ではよく知られており
、例えば、Ｈｅｓｓ他、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍ．１８４：２６０〜２６８に記載されている。従って、本発明の別の実
施形態には、物質がＭＣ−３Ｒに結合し、かつ／またはＭＣ−３Ｒの潜在的なア
ゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを明らかにする方法であって、試
験細胞から得られる膜調製物が試験細胞の代わりに利用される方法が含まれる。
そのような方法は下記を含み、上記に記されているような生理学的条件を使用す
ることができる： （ａ）細胞内におけるＭＣ−３Ｒの発現を導く発現ベクターで細胞をトランス
フェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）試験細胞からＭＣ−３Ｒを含む膜を調製して、リガンドが膜内のＭＣ−
３Ｒに結合するような条件のもとで膜をＭＣ−３Ｒのリガンドに曝すこと； （ｃ）工程（ｂ）に引き続き、あるいは工程（ｂ）と同時に、試験細胞から得
られた膜を物質に曝すこと； （ｄ）物質の存在下および非存在下において膜内のＭＣ−３Ｒに対するリガン
ドの結合量を測定すること； （ｅ）物質の存在下および非存在下において膜内のＭＣ−３Ｒに対するリガン
ドの結合量を比較し、この場合、物質の存在下における膜内のＭＣ−３Ｒに対す
るリガンドの結合量の減少は、その物質がＭＣ−３Ｒに結合し得ることを示す。The above methods can be modified in that rather than exposing test cells to a substance, a membrane can be prepared from the test cells and such a membrane can be exposed to the substance. Such modifications that utilize membranes rather than cells are well known in the art and are described, for example, in Hess et al., 1992, Biochem. Biophys. Res.
Comm. 184: 260-268. Accordingly, another embodiment of the present invention provides a method of determining whether a substance binds to MC-3R and / or is a potential agonist or antagonist of MC-3R, comprising the steps of: Included are methods in which the resulting membrane preparation is utilized in place of test cells.
Such methods can include using physiological conditions as described above, including: (a) transfecting or transforming cells with an expression vector that directs the expression of MC-3R in the cells. (B) preparing a membrane containing MC-3R from the test cells, so that the ligand has MC-R in the membrane.
Exposing the membrane to a ligand of MC-3R under conditions that bind to 3R; (c) following or simultaneously with step (b), transforming the membrane obtained from the test cells into a substance (D) measuring the amount of ligand binding to MC-3R in the membrane in the presence and absence of the substance; (e) binding to MC-3R in the membrane in the presence and absence of the substance The amount of ligand bound is compared, where a decrease in the amount of ligand bound to MC-3R in the membrane in the presence of the substance indicates that the substance can bind to MC-3R.

【０１０４】 本発明はまた、物質がＭＣ−３Ｒに結合し得るかどうかを明らかにする方法に
関する。この方法は、 （ａ）細胞内におけるＭＣ−３Ｒの発現を導く発現ベクターで細胞をトランス
フェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）試験細胞からＭＣ−３Ｒを含む膜を調製して、試験細胞から得られた膜
を物質に曝すこと； （ｃ）試験細胞から得られた膜内のＭＣ−３Ｒに対する物質の結合量を測定す
ること； （ｄ）試験細胞から得られた膜内のＭＣ−３Ｒに対する物質の結合量を、ＭＣ
−３Ｒでトランスフェクションされていないコントロール細胞から得られた膜に
対する物質の結合量と比較すること を含み、この場合、試験細胞から得られた膜内のＭＣ−３Ｒに対する物質の結合
量が、コントロール細胞から得られた膜に対する物質の結合量よりも大きい場合
、その物質はＭＣ−３Ｒに結合し得る。The present invention also relates to a method for determining whether a substance can bind to MC-3R. This method comprises: (a) transfecting or transforming a cell with an expression vector that directs the expression of MC-3R in the cell to obtain a test cell; (b) preparing a membrane containing MC-3R from the test cell And exposing the membrane obtained from the test cells to the substance; (c) measuring the amount of the substance bound to MC-3R in the membrane obtained from the test cells; and (d) obtaining the substance from the test cells. The amount of the substance bound to MC-3R in the membrane was determined by MC
Comparing the amount of substance bound to the membrane obtained from control cells not transfected with -3R with the amount of substance bound to MC-3R in the membrane obtained from the test cells. If the amount of binding of the substance to the membrane obtained from the cells is greater than that of the substance, the substance can bind to MC-3R.

【０１０５】 本発明の好ましい実施形態は、様々な濃度の未標識リガンドの存在下、^１２５ Ｉで標識されたＮＤＰ−α−ＭＳＨを標識リガンドとして使用して様々なリガン
ドの結合親和性を決定することである。第２メッセンジャー経路の活性化を、様
々な濃度のアゴニストによって誘発された細胞内ｃＡＭＰを測定することによっ
て明らかにすることができる。A preferred embodiment of the present invention uses ¹²⁵ I-labeled NDP-α-MSH as a labeled ligand in the presence of various concentrations of unlabeled ligand to determine the binding affinity of the various ligands That is. Activation of the second messenger pathway can be revealed by measuring intracellular cAMP evoked by various concentrations of agonist.

【０１０６】 本発明はまた、ＭＣ−３Ｒのアカゲザル形態またはその生物学的に活性なフラ
グメントのいずれかに応答して惹起されたポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体に関する。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、アカゲザ
ルＭＣ−３Ｒ、または配列番号２に開示されているアカゲザルＭＣ−３Ｒの一部
に由来する合成ペプチド（通常は、長さが約９アミノ酸〜約２５アミノ酸）に対
して惹起させることができる。アカゲザルＭＣ−３Ｒに対する単一特異性抗体が
、アカゲザルＭＣ−３Ｒに反応し得る抗体を含有する哺乳動物の抗血清から精製
され、あるいはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ
、２５６：４９５〜４９７）の技術を使用して、アカゲザルＭＣ−３Ｒと反応し
得るモノクローナル抗体として調製される。本明細書中で使用される単一特異性
抗体は、アカゲザルＭＣ−３Ｒに対する一様な結合特性を有する単一抗体種また
は多重抗体種として定義される。本明細書中で使用される一様な結合は、上記に
記載されているように、特異的な抗原またはエピトープに結合する抗体種（アカ
ゲザルＭＣ−３Ｒと結合する抗体など）の能力をいう。アカゲザルＭＣ−３Ｒに
特異的な抗体は、免疫アジュバントを用いて、あるいは免疫アジュバントを用い
ることなく、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどの動物を、
適切な濃度のアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質またはアカゲザルＭＣ−３Ｒの一
部から作製された合成ペプチドで免疫化することにより惹起される。The present invention also relates to polyclonal and monoclonal antibodies raised in response to either the rhesus monkey form of MC-3R or a biologically active fragment thereof. Polyclonal and monoclonal antibodies are directed against a rhesus monkey MC-3R, or a synthetic peptide derived from a portion of the rhesus monkey MC-3R disclosed in SEQ ID NO: 2 (typically about 9 amino acids to about 25 amino acids in length). Can be triggered. Monospecific antibodies to rhesus monkey MC-3R were purified from mammalian antisera containing antibodies capable of reacting with rhesus monkey MC-3R, or were obtained from Kohler and Milstein (1975, Nature).
256: 495-497) as monoclonal antibodies capable of reacting with rhesus monkey MC-3R. As used herein, a monospecific antibody is defined as a single antibody species or multiple antibody species having uniform binding characteristics to rhesus monkey MC-3R. Uniform binding, as used herein, refers to the ability of an antibody species (such as an antibody to bind rhesus monkey MC-3R) to bind to a specific antigen or epitope, as described above. Antibodies specific to rhesus monkey MC-3R can be used to immunize animals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats and horses with or without an immunological adjuvant.
It is caused by immunization with an appropriate concentration of rhesus monkey MC-3R protein or a synthetic peptide made from a portion of rhesus monkey MC-3R.

【０１０７】 免疫前の血清が、最初の免疫化の前に採取される。各動物に、アカゲザルＭＣ
−３Ｒタンパク質が、約０．１μｇ〜約１０００μｇの間で許容可能な免疫アジ
ュバントとともに投与される。そのような許容可能なアジュバントには、フロイ
ント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、アルム沈殿物、Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍおよびｔＲＮＡを含む油中水型エマル
ションが含まれるが、これらに限定されない。最初の免疫化は、皮下（ＳＣ）、
腹腔内（ＩＰ）またはその両方のいずれかによる多数部位における、好ましくは
フロイント完全アジュバントにおけるアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質またはそ
のペプチドフラグメントからなる。各動物は、抗体力価を測定するために、定期
的（好ましくは、毎週）に採血される。動物には、最初の免疫化の後、追加免疫
注射を施すことができ、あるいは施さなくてもよい。追加免疫注射を受けるその
ような動物は、一般に、等量のアカゲザルＭＣ−３Ｒを含むフロイント不完全ア
ジュバントが同じ経路で投与される。追加免疫注射は、最大の力価が得られるま
で約３週間の間隔で行われる。各追加免疫による免疫化の約７日後、または一回
の免疫化後のほぼ毎週、動物は採血され、血清が採取され、一部が約−２０℃で
保管される。[0107] Pre-immune serum is collected prior to the first immunization. Rhesus monkey MC
The -3R protein is administered with between about 0.1 μg to about 1000 μg of an acceptable immune adjuvant. Such acceptable adjuvants include Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, alum precipitate, Corm
Includes, but is not limited to, water-in-oil emulsions including ynebacterium parvum and tRNA. The first immunization is subcutaneous (SC),
It consists of the rhesus monkey MC-3R protein or a peptide fragment thereof at multiple sites, either intraperitoneally (IP) or both, preferably in complete Freund's adjuvant. Each animal is bled periodically (preferably weekly) to determine antibody titers. Animals may or may not receive a booster injection after the initial immunization. Such animals that receive a booster injection are generally given the same route of incomplete Freund's adjuvant containing an equal amount of rhesus monkey MC-3R. Booster injections are given at approximately 3 week intervals until maximal titers are obtained. Approximately 7 days after each booster immunization, or approximately every week after a single immunization, animals are bled, serum is collected, and some are stored at approximately -20 ° C.

【０１０８】 アカゲザルＭＣ−３Ｒと反応し得るモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系交
配マウス（好ましくは、Ｂａｌｂ／ｃ）をアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質で免
疫化することによって調製される。マウスは、約１μｇ〜約１００μｇ（好まし
くは、約１０μｇ）のアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を含む、上記に議論され
た許容可能なアジュバントの等容量に配合された約０．５ｍｌの緩衝液または生
理食塩水を用いてＩＰ経路またはＳＣ経路で免疫化される。フロイント完全アジ
ュバントが好ましい。マウスは、０日目に最初の免疫化が行われ、約３週間〜約
３０週間そのままにされる。免疫化されたマウスは、約１μｇ〜約１００μｇの
アカゲザルＭＣ−３Ｒを含む緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水など）の１回また
は複数回の追加免疫による免疫化が静脈内（ＩＶ）経路によって行われる。抗体
陽性マウスから得られるリンパ球、好ましくは脾臓のリンパ球が、当分野で知ら
れている標準的な手法により脾臓を免疫化マウスから摘出することによって得ら
れる。ハイブリドーマ細胞が、安定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下
で脾臓のリンパ球を適切な融合パートナー（好ましくは、メラノーマ細胞）と混
合することによって得られる。融合パートナーには、マウスのメラノーマである
Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０が含ま
れるが、これらに限定されず、Ｓｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞およびメラ
ノーマ細胞は、約３０％〜約５０％の濃度のポリエチレングリコール（約１００
０の分子量）において融合させられる。融合したハイブリドーマ細胞は、当分野
で知られている手法により、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンが
補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）における成長によって選択
される。上清液が、約１４日目、１８日目および２１日目の生育陽性ウエルから
採取され、アカゲザルＭＣ−３Ｒを抗原として使用する固相免疫放射アッセイ（
ＳＰＩＲＡ）などの免疫アッセイによって抗体産生についてスクリーニングされ
る。培養液もまた、ｍＡｂのイソ型を決定するためにウフタロニー沈殿アッセイ
で試験される。抗体陽性ウエルから得られるハイブリドーマ細胞は、ＭａｃＰｈ
ｅｒｓｏｎの軟寒天技術（１９７３、軟寒天技術、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰ
ａｔｅｒｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）などの技術によってクロー
ニングされる。A monoclonal antibody (mAb) capable of reacting with rhesus monkey MC-3R is prepared by immunizing inbred mice (preferably Balb / c) with rhesus monkey MC-3R protein. Mice are treated with about 0.5 ml of buffer or saline containing about 1 μg to about 100 μg (preferably about 10 μg) of the rhesus monkey MC-3R protein in equal volumes of the acceptable adjuvants discussed above. Immunized by IP or SC route with water. Complete Freund's adjuvant is preferred. Mice receive an initial immunization on day 0 and are left for about 3 to about 30 weeks. Immunized mice may be immunized by one or more boosts with a buffer (eg, phosphate buffered saline) containing about 1 μg to about 100 μg of rhesus monkey MC-3R by the intravenous (IV) route. Done by Lymphocytes obtained from antibody-positive mice, preferably spleen lymphocytes, are obtained by removing spleens from immunized mice by standard techniques known in the art. Hybridoma cells are obtained by mixing splenic lymphocytes with a suitable fusion partner, preferably melanoma cells, under conditions that allow for the formation of stable hybridomas. Fusion partners include, but are not limited to, the mouse melanomas P3 / NS1 / Ag4-1; MPC-11; S-194 and Sp2 / 0, with Sp2 / 0 being preferred. Antibody-producing cells and melanoma cells have a concentration of about 30% to about 50% polyethylene glycol (about 100%).
0 molecular weight). Fused hybridoma cells are selected by growth in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with hypoxanthine, thymidine and aminopterin by techniques known in the art. Supernatants were collected from growth positive wells on days 14, 18, and 21 and solid-phase immunoradiometric assays using rhesus monkey MC-3R as antigen (
Screened for antibody production by immunoassays such as SPIRA). Cultures are also tested in a uphthalony precipitation assay to determine the mAb isoform. The hybridoma cells obtained from the antibody-positive wells were MacPh
erson's soft agar technology (1973, soft agar technology, Tissue Culture)
e Methods and Applications, Kruse and P
(Aterson edition, Academic Press).

【０１０９】 モノクローナル抗体は、抗原刺激した４日後に約２ｘ１０^６個〜約６ｘ１０^６ 個のハイブリドーマ細胞を初期の抗原刺激Ｂａｌｂ／ｃマウスに注射（マウスあ
たり約０．５ｍｌ）することによってインビボで産生される。腹水が細胞移入の
約８日後〜１２日後に採取され、モノクローナル抗体が当分野で知られている技
術によって精製される。[0109] Monoclonal antibodies are produced in vivo by about 2x10 ⁶ to about 6x10 ⁶ hybridoma cells 4 days after challenge is injected into the initial antigen stimulation Balb / c mice (approximately per mouse 0.5ml) Is done. Ascites fluid is collected about 8 to 12 days after cell transfer and monoclonal antibodies are purified by techniques known in the art.

【０１１０】 抗アカゲザルＭＣ−３ＲｍＡｂのインビトロ産生は、約２％ウシ胎児血清を含
むＤＭＥＭにおいてハイブリドーマを生育させて、十分な量の特異的なｍＡｂを
得ることによって行われる。ｍＡｂは、当分野で知られている技術によって精製
される。In vitro production of anti-rhesus monkey MC-3R mAbs is performed by growing hybridomas in DMEM containing about 2% fetal calf serum to obtain sufficient quantities of specific mAbs. mAbs are purified by techniques known in the art.

【０１１１】 腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、沈殿、受動的凝集、酵素結合
免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）技術および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）技術（これ
らに限定されない）を含む様々な血清学的アッセイまたは免疫学的アッセイによ
って測定される。同様のアッセイを使用して、体液または組織抽出物および細胞
抽出物におけるアカゲザルＭＣ−３Ｒの存在が検出される。[0111] Antibody titers of ascites or hybridoma cultures can be measured by a variety of serologic techniques including, but not limited to, precipitation, passive agglutination, enzyme-linked immunosorbent antibody (ELISA) and radioimmunoassay (RIA) techniques. It is measured by an assay or an immunological assay. A similar assay is used to detect the presence of rhesus monkey MC-3R in body fluids or tissue extracts and cell extracts.

【０１１２】 単一特異性抗体の上記に記載された産生方法は、アカゲザルＭＣ−３Ｒのペプ
チドフラグメントまたは全長のアカゲザルＭＣ−３Ｒに特異的な抗体を作製する
ために使用できることは当業者には容易に明らかである。It will be readily apparent to those skilled in the art that the above described method of producing monospecific antibodies can be used to generate antibodies specific for peptide fragments of rhesus monkey MC-3R or full length rhesus MC-3R. Is obvious.

【０１１３】 アカゲザルＭＣ−３Ｒ抗体のアフィニティーカラムは、例えば、抗体がアガロ
ースゲルビーズ支持体との共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルで事前に活性化されたゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂ
ｉｏｒａｄ）に抗体を付加することによって作製される。次いで、抗体を、スペ
ーサーアームとのアミド結合を介してゲルに結合させる。その後、残存する活性
化エステルを１ＭのエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で処理する。カラムは、
非結合抗体または外来タンパク質を除くために、水で洗浄され、続いて０．２３
ＭのグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄される。その後、カラムはリン酸緩衝
化生理食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化され、全長のアカゲザルＭＣ−３Ｒまたは
アカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質フラグメントを含む細胞培養上清または細胞抽
出物がゆっくりカラムに流される。その後、カラムは、光学密度（Ａ_２８０）が
バックグラウンドにまで低下するまでリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄され、その
後、タンパク質が０．２３Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出される。
精製されたアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質は、その後、リン酸緩衝化生理食塩
水に対して透析される。The affinity column for the rhesus monkey MC-3R antibody may be, for example, Affigel-10, a gel support pre-activated with N-hydroxysuccinimide ester such that the antibody forms a covalent bond with the agarose gel bead support. (B
iorad). The antibody is then bound to the gel via an amide bond with the spacer arm. Thereafter, the remaining activated ester is treated with 1 M ethanolamine HCl (pH 8). The column is
Washed with water to remove unbound antibodies or foreign proteins, followed by 0.23
Washed with M glycine HCl (pH 2.6). Thereafter, the column is equilibrated with phosphate-buffered saline (pH 7.3) and the cell culture supernatant or cell extract containing the full-length rhesus monkey MC-3R or rhesus monkey MC-3R protein fragment is slowly flowed through the column. . The column is then washed with phosphate buffered saline until the optical density (A ₂₈₀ ) drops to background, after which the protein is eluted with 0.23 M glycine-HCl (pH 2.6). .
The purified rhesus monkey MC-3R protein is then dialyzed against phosphate buffered saline.

【０１１４】 上記に記載されるアッセイは、ｒｈＭＣ−３Ｒで一過性または安定的にトラン
スフェクションまたは形質転換された細胞を用いて行うことができる。トランス
フェクションは、ｒｈＭＣ−３Ｒを試験細胞に導入するためにこの分野で知られ
ている任意の方法を含むことを意味する。例えば、トランスフェクションには、
リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムによって媒介されるトランスフェクショ
ン、リポフェクション、ｒｈＭＣ−３Ｒを含むレトロウイルス構築物による感染
、およびエレクトロポレーションが含まれる。形質転換は、ＤＮＡの取り込みか
ら生じる標的細胞に対する遺伝子的変化を包含することを意味する。The assays described above can be performed using cells transiently or stably transfected or transformed with rhMC-3R. Transfection is meant to include any method known in the art for introducing rhMC-3R into a test cell. For example, for transfection,
Includes calcium phosphate or calcium chloride mediated transfection, lipofection, infection with a retroviral construct containing rhMC-3R, and electroporation. Transformation is meant to encompass a genetic change to a target cell that results from the incorporation of DNA.

【０１１５】 ｒｈＭＣ−３Ｒに対する物質またはアンタゴニストの結合が測定される場合、
そのような結合は、標識された物質またはアゴニストを用いることによって測定
することができる。そのような物質またはアゴニストは、この分野で知られてい
る都合のよい方法のいずれかで、例えば、放射能的に、蛍光的に、酵素的に標識
することができる。When the binding of a substance or antagonist to rhMC-3R is measured,
Such binding can be measured by using a labeled substance or agonist. Such agents or agonists can be labeled in any convenient manner known in the art, for example, radioactively, fluorescently, enzymatically.

【０１１６】 本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体を使用して、
アカゲザルＭＣ−３Ｒのレベルをスクリーニングして測定することができる。組
換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、アカゲザルＭＣ−３Ｒ
の検出およびタイプ型決定に適したキットを組み立てることに役立つ。そのよう
なキットは、少なくとも１つの容器をしっかり閉じ込めて保持するために適した
区分けられた担体を含む、担体は、アカゲザルＭＣ−３Ｒを検出することに適し
た組換えＭＣ−３Ｒまたは抗ＭＣ−３Ｒ抗体などの試薬をさらに含む。担体はま
た、標識抗原または酵素基質などの検出に必要な手段を含むことができる。Using the DNA molecules, RNA molecules, recombinant proteins and antibodies of the invention,
Rhesus monkey MC-3R levels can be screened and measured. Recombinant proteins, DNA molecules, RNA molecules and antibodies are available from Rhesus monkey MC-3R.
To help assemble a kit suitable for detection and typing. Such a kit comprises a compartmentalized carrier suitable for securely enclosing and holding at least one container, wherein the carrier is a recombinant MC-3R or anti-MC- suitable for detecting rhesus monkey MC-3R. It further includes a reagent such as a 3R antibody. The carrier can also include the means necessary for the detection of the labeled antigen or enzyme substrate and the like.

【０１１７】 アカゲザルＭＣ−３Ｒの調節因子を含む薬学的に有用な組成物を、薬学的に許
容可能なキャリアを混合することなどによる知られている方法に従って配合する
ことができる。そのようなキャリアおよび配合方法の多数の例が、Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出され得る
。効果的な投与に適した薬学的に許容可能な組成物を作製するために、そのよう
な組成物は、効果的な量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変されたアカゲザル
ＭＣ−３Ｒ、あるいはチロシンキナーゼの活性化因子または阻害剤を含むＭＣ−
３Ｒのアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかを含有する。A pharmaceutically useful composition comprising a modulator of rhesus monkey MC-3R can be formulated according to known methods, such as by admixing a pharmaceutically acceptable carrier. Numerous examples of such carriers and compounding methods are described in Reming
can be found in ton's Pharmaceutical Sciences. In order to make a pharmaceutically acceptable composition suitable for effective administration, such compositions comprise an effective amount of a protein, DNA, RNA, modified rhesus MC-3R, or tyrosine kinase. MC- containing an activator or inhibitor of
Contains either a 3R agonist or antagonist.

【０１１８】 本発明の治療用組成物または診断用組成物は、疾患を処置または診断するため
に十分な量で個体に投与される。効果的な量は、個体の状態、体重、性別および
年齢などの様々な要因に従って変化し得る。他の要因には投与様式が含まれる。The therapeutic or diagnostic compositions of the present invention are administered to an individual in an amount sufficient to treat or diagnose a disease. An effective amount can vary according to various factors such as the condition, weight, sex and age of the individual. Other factors include the mode of administration.

【０１１９】 薬学的組成物は、皮下、局所、経口および筋肉内などの様々な経路で個体に投
与することができる。The pharmaceutical compositions can be administered to an individual by a variety of routes, including subcutaneous, topical, oral and intramuscular.

【０１２０】 用語「化学的誘導体」は、通常は親分子の一部ではない化学的残基をさらに含
む分子を表す。そのような残基によって、親分子の溶解性、半減期、吸収などを
改善することができる。あるいは、そのような残基は、親分子の望ましくない副
作用を弱めることができ、または親分子の毒性を低下させることができる。その
ような残基の例が様々な書籍（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓなど）に記載されている。The term “chemical derivative” refers to a molecule that further contains a chemical residue that is not normally part of the parent molecule. Such residues can improve the solubility, half-life, absorption, etc. of the parent molecule. Alternatively, such residues can reduce the undesirable side effects of the parent molecule or reduce the toxicity of the parent molecule. Examples of such residues are found in various books (Remington's Pharmaceutical
ical Sciences).

【０１２１】 本明細書中に開示された方法に従って同定された化合物は、適切な投薬量で単
独で使用することができる。あるいは、他の薬剤の同時投与または連続投与が望
ましいと考えられる。The compounds identified according to the methods disclosed herein can be used alone at appropriate dosages. Alternatively, simultaneous or sequential administration of other agents may be desirable.

【０１２２】 本発明はまた、本発明の新規な処置方法において使用される局所用、経口用、
全身用および非経口用の好適な薬学的配合物を提供するという目的を有する。本
発明に従って同定された化合物を有効成分として含有する組成物は、投与用の従
来の賦形剤における広範囲の治療投薬形態で投与することができる。例えば、そ
のような化合物は、錠剤、カプセル剤（それぞれが徐放性配合物および持続放出
性配合物を含む）、ピル剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液剤、
懸濁剤、シロップ剤および乳剤のような経口投薬形態で、あるいは注射によって
投与することができる。同様に、化合物はまた、静脈内形態（ボーラスおよび注
入の両方）、腹腔内形態、皮下形態、閉塞を伴うかまたは伴わない局所形態、あ
るいは筋肉内形態で投与することができる。これらはすべて、製薬分野の当業者
によく知られた形態を使用している。The present invention also relates to the topical, oral or oral use in the novel methods of treatment of the present invention.
It has the purpose of providing suitable pharmaceutical formulations for systemic and parenteral use. Compositions containing a compound identified according to the present invention as an active ingredient can be administered in a wide variety of therapeutic dosage forms in conventional excipients for administration. For example, such compounds include tablets, capsules (each including sustained release and sustained release formulations), pills, powders, granules, elixirs, tinctures, solutions,
It can be administered in oral dosage forms such as suspensions, syrups and emulsions, or by injection. Similarly, the compounds can also be administered in intravenous form (both bolus and infusion), intraperitoneal form, subcutaneous form, topical form with or without obstruction, or intramuscular form. They all use forms well known to those skilled in the pharmaceutical arts.

【０１２３】 都合よいことに、本発明の化合物は単回の日用量で投与することができ、ある
いは総日用量を、１日あたり２回、３回または４回の分割された用量で投与する
ことができる。さらに、本発明の化合物は、好適な鼻腔内賦形剤の局所的使用に
よる鼻腔内形態で、あるいは当業者によく知られている経皮的な皮膚パッチのそ
のような形態を使用して経皮的経路を介して投与することができる。経皮的送達
システムの形態で投与するために、投薬は、当然のことではあるが、投薬期間を
通して断続的ではなく連続的に行われる。Advantageously, the compounds of the present invention can be administered in a single daily dose, or the total daily dose is administered in two, three or four divided doses per day be able to. In addition, the compounds of the present invention may be administered in intranasal form by topical use of suitable intranasal excipients, or using such forms of transdermal skin patches well known to those skilled in the art. Administration can be via the transdermal route. To be administered in the form of a transdermal delivery system, the dosage administration will, of course, be continuous rather than intermittent throughout the dosage period.

【０１２４】 活性薬剤が異なる投薬配合物である２つ以上の活性薬剤を用いた混合処置の場
合、活性薬剤は同時に投与することができ、あるいはそれぞれを独立した交互の
時期に投与することができる。For mixed treatments with two or more active agents, where the active agents are in different dosage formulations, the active agents can be administered simultaneously, or each can be administered at an independent, alternating time. .

【０１２５】 本発明の化合物を利用する投薬処方は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別
および医学的状態を含む様々な要因；処置すべき状態の重篤度；投与経路；患者
の腎機能、肝機能および心臓血管機能；および用いられるその特定の化合物に従
って選択される。通常の医師または獣医は、症状の予防、処置または治療に必要
とされる薬物の効果的な量を容易に決定して処方することができる。毒性を伴う
ことなく効き目をもたらす範囲内の薬物濃度を達成する際の最適な処方は、標的
部位に対する薬物利用性の動力学に基づく処置計画を必要とする。これには、薬
物の分布、平衡および排出の検討が含まれる。Dosage regimens utilizing the compounds of the present invention may vary with a variety of factors, including the type, species, age, weight, sex and medical condition of the patient; the severity of the condition to be treated; the route of administration; Function, liver function and cardiovascular function; and the particular compound used. A physician or veterinarian will readily be able to determine and prescribe the effective amount of the drug required to prevent, treat or treat the condition. Optimal prescribing in achieving drug concentrations in the range that yields efficacy without toxicity requires a treatment regimen based on the kinetics of drug availability to the target site. This includes consideration of drug distribution, equilibrium and elimination.

【０１２６】 下記の実施例は、本発明を例示するために示されているが、本発明を実施例に
限定するものではない。The following examples are provided to illustrate the present invention, but do not limit the invention to the examples.

【０１２７】 実施例１ アカゲザルＭＣ−３Ｒ遺伝子の単離 アカゲザル（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ）のゲノムＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）を、テンプレートとしてのヒトＭＣ−３Ｒ（Ｇａｎｔｚ他、１９９３、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８２４６〜８２５０）およびプライマーとし
てのランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｆｒｉｔｓｃ
ｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、１３１頁、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９８２
年）を使用して、ランダムプライムプローブを用いてスクリーニングした。１個
の陽性λファージクローンを同定した。このファージクローンをＢｓｔＸＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化して、アカゲザルＭＣ−３ＲのＣ末端配列および３’Ｕ
ＴＲをコードする１．６ｋｂフラグメントを得た。ＢａｍＨＩを用いたλクロー
ンの別の消化により、ＡＴＧコドンの１０９ヌクレオチド上流にＸｂａＩ部位を
有し、停止コドンの５９２ヌクレオチド下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する全長
のアカゲザルＭＣ−３Ｒをコードする５ｋｂフラグメントが得られた。λファー
ジクローンから得られたＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩとのフラグメントを、発現研
究のためにｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏにサブクローニングした。Example 1 Isolation of Rhesus Monkey MC-3R Gene Rhesus Monkey (M. mulatta) Genomic DNA Library (Clont)
ech) using human MC-3R as a template (Gantz et al., 1993;
J. Biol. Chem. 268: 8246-8250) and random hexamer oligonucleotides as primers (Maniatis, Fritsc)
h and Sambrook, Molecular Cloning, page 131,
Cold Spring Harbor Laboratories, 1982
Year) using a random primed probe. One positive λ phage clone was identified. This phage clone was digested with BstXI and HindIII and the C-terminal sequence of rhesus monkey MC-3R and 3′U
A 1.6 kb fragment encoding TR was obtained. Another digestion of the λ clone with BamHI yielded a 5 kb fragment encoding full length rhesus monkey MC-3R with an XbaI site 109 nucleotides upstream of the ATG codon and a HindIII site 592 nucleotides downstream of the stop codon. Was. XbaI and HindIII fragments obtained from the λ phage clone were cloned into pcDNA3. Neo was subcloned.

【０１２８】 実施例２ アカゲザルＭＣ−３Ｒの安定的発現 受容体プラスミドを、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ）を使用してＣＨＯｄｈ
ｆｒ−細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション細胞をＧ４１８
で少なくとも２週間〜３週間選択し、その後、結合アッセイおよび機能アッセイ
を行った。ペプチドの見かけの結合親和性を測定するために、１２ウエルプレー
ト内のトランスフェクション細胞をＰＢＳで１回洗浄して、結合を、２５ｍＭの
Ｈｅｐｅｓ、０．５％のＮａＮ_３、０．１％のＢＳＡ、およびプロテアーゼ阻害
剤カクテル（４ｕｇ／ｍｌロイペプチン、４０ｕｇ／ｍｌバシトラシン、５ｕｇ
／ｍｌアプロチニン、１０ｕＭホスホラミドンおよび１００ｕＭのＡＥＢＳＦ）
を含むＨＢＳＳにおいて行った。^１２５Ｉ−ＮＤＰ−α−ＭＳＨ（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）を０．０１ｎＭの濃度で使用し、非特異的な結合を１ｕＭの未標識ＮＤＰ
−α−ＭＳＨの存在下で測定した。室温で３時間インキュベーションした後、ウ
エルをＰＢＳで３回洗浄し、０．５ｍｌの０．０５％ＳＤＳ中で溶解し、ガンマ
カウンターにより計数した。あるいは、同じ結果が、細胞懸濁物を使用し、その
後、ＧＦ／Ｃフィルターでろ過して得られた（Ｈｕａｎｇ他、１９９４、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：３００７〜３０１３）。Example 2 Stable Expression of Rhesus Monkey MC-3R Receptor plasmids were isolated from CHOdh using
fr-cells were transfected. Transfected cells into G418
For at least two to three weeks, followed by binding and functional assays. To measure the apparent binding affinity of the peptide, 12 transfected cells in the wells in the plate were washed once with PBS, and binding the, Hepes of 25 mM, 0.5% of _NaN 3, 0.1% BSA, and protease inhibitor cocktail (4 ug / ml leupeptin, 40 ug / ml bacitracin, 5 ug
/ Ml aprotinin, 10 uM phosphoramidone and 100 uM AEBSF)
Performed in HBSS containing ¹²⁵ I-NDP-α-MSH (Amersh
am) at a concentration of 0.01 nM and non-specific binding to 1 uM unlabeled NDP
Measured in the presence of -α-MSH. After incubation at room temperature for 3 hours, the wells were washed three times with PBS, dissolved in 0.5 ml of 0.05% SDS, and counted with a gamma counter. Alternatively, the same results were obtained using a cell suspension followed by filtration through a GF / C filter (Huang et al., 1994, Bio.
chemistry, 33: 3007-3013).

【０１２９】 受容体の機能的活性化を明らかにするために、安定的にトランスフェクション
されたＣＨＯ細胞を、Ｃａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋を含まないＰＢＳで１回洗浄し、非酵
素的解離培地（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ．）により３７℃で１
０分間解離した。解離した細胞を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２ 、０．１％のＢＳＡおよび５０ｍＭのＩＢＭＸを含むＥＢＳＳに再懸濁して、ア
ゴニストとともに室温で４５分間インキュベーションした。アゴニストの活性化
を、４分間煮沸することによって停止させた。細胞内の環状ＡＭＰ濃度をＡｍｅ
ｒｓｈａｍ社のＳＰＡアッセイシステムによって測定した（Ｈｕａｎｇ他、１９
９７、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃ．Ｒｅｓ．１７
：５９９〜６０７）。To demonstrate the functional activation of the receptor, stably transfected CHO cells were washed once with Ca ⁺⁺ / Mg ⁺⁺ -free PBS and treated with non-enzymatic dissociation medium (Specialty). Media, Inc.) at 37 ° C.
Dissociated for 0 minutes. Dissociated cells, Hepes of 25 mM, MgCl in 5 mM _2, and resuspended in EBSS containing 0.1% BSA and IBMX of 50 mM, and incubated for 45 minutes at room temperature with agonists. Agonist activation was stopped by boiling for 4 minutes. Intracellular cyclic AMP concentration
Rham's SPA assay system (Huang et al., 19
97, J.A. Receptor Signal Transduc. Res. 17
: 599-607).

【０１３０】 実施例３ アカゲザルＭＣ−３Ｒの薬理学的性質 ヒトＭＣ−３ＲをＩｒａ Ｇａｎｔｚ博士（Ｇａｎｔｚ他、１９９３、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８２４６〜８２５０）から得て、ｐＩＲＥＳ１ｎｅ
ｏ発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングし、ＣＨＯ細胞に安定
的にトランスフェクションした。ヒトＭＣ−３ＲをアカゲザルＭＣ−３Ｒの薬理
学的性質に対する参照として使用する。単一コロニーを、上記に記載されるすべ
ての薬理学的研究において使用した。ｒｈＭＣ−３Ｒの機能的性質をＣＨＯ細胞
における異種発現によって調べた。モックトランスフェクションＣＨＯ細胞は、
［^１２５Ｉ］ＮＤＰ−α−ＭＳＨの結合を何ら示さず、またα−ＭＳＨに対する
ｃＡＭＰ応答を何ら示さなかった。ｒｈＭＣ−３ＲがＣＨＯ細胞にトランスフェ
クションされた場合、［^１２５Ｉ］ＮＤＰ−α−ＭＳＨの特異的な結合が検出さ
れたが、この特異的な結合は様々なペプチドによって阻害された（図３Ａ）。ア
ゴニストによって誘発されたｃＡＭＰの蓄積もまた、トランスフェクション細胞
で検出することができる（図３Ｂ）。大部分のペプチドは、類似した強さ（１０
倍以内）で、アカゲザルＭＣ−３ＲまたはヒトＭＣ−３Ｒに結合して、それらを
活性化する。Ｓｈｕ−９１１９はＭＣ−３Ｒを活性化せず、その結合親和性は、
アカゲザルＭＣ−３Ｒにおいて、ヒトＭＣ−３Ｒの場合よりも著しく強い（表１
）。試験したすべてのアゴニストの中で、ＭＴ−ＩＩのみがアカゲザルおよびヒ
トの両方のＭＣ−３Ｒの部分アゴニストである。Ｓｈｕ−９１１９は、アカゲザ
ルおよびヒトの両方のＭＣ−３Ｒのアンタゴニストであることがこの実施例の節
で示されている。アカゲザルＭＣ−３Ｒは、すべての試験したアゴニストについ
て、ヒトＭＣ−３Ｒと薬理学的に類似していることが明らかにされる。Example 3 Pharmacological Properties of Rhesus Monkey MC-3R Human MC-3R was purified by Dr. Ira Gantz (Gantz et al., 1993, J.B.
iol. Chem. 268: 8246-8250) and obtained from pIRES1ne
oSubcloned into an expression vector (Clontech) and stably transfected into CHO cells. Human MC-3R is used as a reference to the pharmacological properties of rhesus monkey MC-3R. Single colonies were used in all pharmacological studies described above. The functional properties of rhMC-3R were examined by heterologous expression in CHO cells. Mock transfected CHO cells
It showed no binding of [ ¹²⁵ I] NDP-α-MSH and no cAMP response to α-MSH. When rhMC-3R was transfected into CHO cells, specific binding of [ ¹²⁵ I] NDP-α-MSH was detected, but this specific binding was inhibited by various peptides (FIG. 3A). . Agonist-induced cAMP accumulation can also be detected in transfected cells (FIG. 3B). Most peptides have similar strengths (10
Bind to and activate rhesus monkey MC-3R or human MC-3R. Shu-9119 does not activate MC-3R and its binding affinity is
Rhesus monkey MC-3R is significantly stronger than human MC-3R (Table 1).
). Of all agonists tested, only MT-II is a partial agonist of MC-3R in both rhesus monkeys and humans. Shu-9119 is shown in this example section as an antagonist of both rhesus monkey and human MC-3R. Rhesus monkey MC-3R is shown to be pharmacologically similar to human MC-3R for all agonists tested.

【０１３１】[0131]

【表１】 [Table 1]

【０１３２】 本発明は、本明細書中に記載されている特定の実施形態によって範囲が限定さ
れるものではない。実際に、本明細書中に記載されている改変に加えて、本発明
の様々な改変が、上記の記載から当業者には明らかになる。そのような改変は、
添付された請求項の範囲に含まれるものとする。The present invention is not to be limited in scope by the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the invention in addition to those described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description. Such modifications are
It is intended to fall within the scope of the appended claims.

【０１３３】 様々な刊行物が本明細書中に引用されているが、それらの開示は、その全体が
参照により取込まれる。Various publications are cited herein, the disclosures of which are incorporated by reference in their entirety.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１Ａ】 図１Ａは、アカゲザルＭＣ−３Ｒをコードし、配列番号１に示されているヌク
レオチド配列（部分）を示す。FIG. 1A shows the nucleotide sequence (part) encoding rhesus monkey MC-3R and shown in SEQ ID NO: 1.

【図１Ｂ】 図１Ｂは、アカゲザルＭＣ−３Ｒをコードし、配列番号１に示されているヌク
レオチド配列（部分）を示す。FIG. 1B shows the nucleotide sequence (part) encoding rhesus monkey MC-3R and shown in SEQ ID NO: 1.

【図２】 図２は、アカゲザルＭＣ−３Ｒの１文字表記のアミノ酸配列を示す。FIG. 2 shows the one-letter code amino acid sequence of rhesus monkey MC-3R.

【図３Ａ】 図３Ａは、ＮＤＰ−α−ＭＳＨ、γ２−ＭＳＨまたはＳｈｕ−９１１９による
［１２５］ＮＤＰ−α−ＭＳＨ結合の阻害実験の結果を示す。FIG. 3A shows the results of inhibition experiments of [125] NDP-α-MSH binding by NDP-α-MSH, γ2-MSH or Shu-9119.

【図３Ｂ】 図３Ｂは、ＮＤＰ−α−ＭＳＨまたはγ２−ＭＳＨに応答したｃＡＭＰ合成の
刺激実験の結果を示す。FIG. 3B shows the results of a stimulation experiment of cAMP synthesis in response to NDP-α-MSH or γ2-MSH.

【図４】 図４は、２つの種から得られたＭＣ−３Ｒに対する結合親和性（ＩＣ５０）お
よび活性化能（ＥＣ５０）の比較結果を示す。略号は下記の通りである：Ａ、ヒ
トＡＣＴＨ（１−２４）；α、α−ＭＳＨ；γ、γ２−ＭＳＨ；Ｍ、ＭＴ−ＩＩ
；Ｎ、ＮＤＰ−α−ＭＳＨ。FIG. 4 shows comparison results of binding affinity (IC50) and activation ability (EC50) for MC-3R obtained from two species. Abbreviations are as follows: A, human ACTH (1-24); α, α-MSH; γ, γ2-MSH; M, MT-II.
N, NDP-α-MSH.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/531 Ａ 33/53 33/566 33/531 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (72)発明者 フアン・デル・プルーフ，レオナルドス・ ハー・テー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 ホアン，ルエイ−ルエイ・シー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 CB17 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA54 DA80 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA43 BA63 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ08 QR41 QS02 QS33 4B064 AG20 AG26 CA10 CC24 DA01 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 AC20 BA02 CA24 CA44 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA50 DA75 EA20 FA74 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/21 C12P 21/02 C 4H045 5/10 C12Q 1/02 C12P 21/02 G01N 33/15 Z C12Q 1/02 33/50 Z G01N 33/15 33/53 D 33/50 33/531 A 33/53 33/566 33/531 C12N 15/00 ZNAA 33/566 5/00 A (72) Inventor Juan Del Proof, Leonardos Herte United States, New Jersey 07065-0907, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Juan, Rui-Ray Sea United States, New Jersey 07065- 0907, Lowway, East Rinkan Avenue, 126 F-term (reference) 2G045 AA40 CB01 CB17 CB2 1 DA12 DA13 DA14 DA36 DA54 DA80 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA43 BA63 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ08 QR41 QS02 QS33 4B064 AG20 AG26 CA10 CC24 DA01 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 AC20 BA02 A24 CA24 A40 CA24 A10

Claims (39)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 【化１】 のヌクレオチド配列（配列番号１）を含むアカゲザルのメラノコルチン３受容体
タンパク質をコードする精製された核酸分子。[Claim 1] A purified nucleic acid molecule encoding a rhesus monkey melanocortin 3 receptor protein comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1). 【請求項２】 アカゲザルのメラノコルチン３受容体タンパク質をコードす
る精製されたＤＮＡ分子であって、配列番号２において３文字表記で示されてい
るように、 【化２】 のアミノ酸配列から実質的になるタンパク質をコードするＤＮＡ分子。2. A purified DNA molecule encoding a rhesus monkey melanocortin 3 receptor protein, as shown in three-letter code in SEQ ID NO: 2. A DNA molecule encoding a protein consisting essentially of the amino acid sequence of 【請求項３】 組換え宿主細胞においてアカゲザルのＭＣ−３Ｒタンパク質
を発現させるための発現ベクターであって、請求項２に記載されるアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクター。3. An expression vector for expressing a rhesus monkey MC-3R protein in a recombinant host cell, which comprises a DNA molecule encoding the amino acid sequence according to claim 2. 【請求項４】 真核生物の発現ベクターである、請求項３に記載の発現ベク
ター。4. The expression vector according to claim 3, which is a eukaryotic expression vector. 【請求項５】 原核生物の発現ベクターである、請求項３に記載の発現ベク
ター。5. The expression vector according to claim 3, which is a prokaryotic expression vector. 【請求項６】 組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を発現する宿主細胞
であって、請求項３に記載される発現ベクターを含む宿主細胞。6. A host cell that expresses a recombinant rhesus monkey MC-3R protein, comprising the expression vector according to claim 3. 【請求項７】 組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を発現する宿主細胞
であって、請求項４に記載される発現ベクターを含む宿主細胞。7. A host cell that expresses a recombinant rhesus monkey MC-3R protein, comprising the expression vector according to claim 4. 【請求項８】 組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を発現する宿主細胞
であって、請求項５に記載される発現ベクターを含む宿主細胞。8. A host cell expressing a recombinant rhesus monkey MC-3R protein, comprising the expression vector according to claim 5. 【請求項９】 前記アカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質が前記発現ベクターか
ら過剰発現される、請求項６に記載の宿主細胞。9. The host cell of claim 6, wherein said rhesus monkey MC-3R protein is overexpressed from said expression vector. 【請求項１０】 前記アカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質が前記発現ベクター
から過剰発現される、請求項７に記載の宿主細胞。10. The host cell of claim 7, wherein said rhesus monkey MC-3R protein is overexpressed from said expression vector. 【請求項１１】 前記アカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質が前記発現ベクター
から過剰発現される、請求項８に記載の宿主細胞。11. The host cell of claim 8, wherein said rhesus monkey MC-3R protein is overexpressed from said expression vector. 【請求項１２】 組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を含み、請求項９
に記載される宿主細胞から得られる細胞膜画分。12. The method according to claim 9, which comprises a recombinant rhesus monkey MC-3R protein.
A cell membrane fraction obtained from the host cell described in 1. 【請求項１３】 組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を含み、請求項１
０に記載される宿主細胞から得られる細胞膜画分。13. The method of claim 1, comprising a recombinant rhesus monkey MC-3R protein.
A cell membrane fraction obtained from the host cell described in 0. 【請求項１４】 組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を含み、請求項１
１に記載される宿主細胞から得られる細胞膜画分。14. The method according to claim 1, comprising a recombinant rhesus monkey MC-3R protein.
A cell membrane fraction obtained from the host cell according to 1. 【請求項１５】 【化３】 のヌクレオチド配列（配列番号１）からなる精製されたＤＮＡ分子。(15) A purified DNA molecule consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1). 【請求項１６】 配列番号２において３文字表記で示されているように、 【化４】 のアミノ酸配列からなるアカゲザルの精製されたＭＣ−３Ｒタンパク質。16. As shown in three-letter notation in SEQ ID NO: 2, A purified rhesus monkey MC-3R protein comprising the amino acid sequence of 【請求項１７】 配列番号１のヌクレオチド１４８〜ヌクレオチド１１９の
ヌクレオチド配列からなる、請求項１５に記載の精製されたＤＮＡ分子。17. The purified DNA molecule of claim 15, consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 from nucleotide 148 to nucleotide 119. 【請求項１８】 組換え宿主細胞においてアカゲザルのＭＣ−３Ｒタンパク
質を発現させるための発現ベクターであって、請求項１７に記載されるＤＮＡ分
子を含む発現ベクター。18. An expression vector for expressing a rhesus monkey MC-3R protein in a recombinant host cell, comprising the DNA molecule according to claim 17. 【請求項１９】 真核生物の発現ベクターである、請求項１８に記載の発現
ベクター。19. The expression vector according to claim 18, which is a eukaryotic expression vector. 【請求項２０】 原核生物の発現ベクターである、請求項１８に記載の発現
ベクター。20. The expression vector according to claim 18, which is a prokaryotic expression vector. 【請求項２１】 組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を発現する宿主細
胞であって、請求項１９に記載される発現ベクターを含む宿主細胞。21. A host cell expressing a recombinant rhesus monkey MC-3R protein, comprising the expression vector according to claim 19. 【請求項２２】 組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を発現する宿主細
胞であって、請求項２０に記載される発現ベクターを含む宿主細胞。22. A host cell expressing a recombinant rhesus monkey MC-3R protein, comprising the expression vector according to claim 20. 【請求項２３】 組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を発現する宿主細
胞であって、請求項２１に記載される発現ベクターを含む宿主細胞。23. A host cell expressing a recombinant rhesus monkey MC-3R protein, comprising the expression vector according to claim 21. 【請求項２４】 組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を含み、請求項２
２に記載される宿主細胞から得られる細胞膜画分。24. The method according to claim 2, comprising a recombinant rhesus monkey MC-3R protein.
A cell membrane fraction obtained from the host cell described in 2. 【請求項２５】 組換えアカゲザルＭＣ−３Ｒタンパク質を含み、請求項２
３に記載される宿主細胞から得られる細胞膜画分。25. The method of claim 2, comprising a recombinant rhesus monkey MC-3R protein.
A cell membrane fraction obtained from the host cell described in 3. 【請求項２６】 組換え宿主細胞においてカゲザルのＭＣ−３Ｒタンパク質
を発現させる方法であって、 （ａ）請求項３に記載される発現ベクターを好適な宿主細胞にトランスフェク
ションすること；および （ｂ）前記発現ベクターからのアカゲザルのＭＣ−３Ｒタンパク質の発現を可
能にする条件下で工程（ａ）の宿主細胞を培養すること を含む方法。26. A method for expressing a rhesus monkey MC-3R protein in a recombinant host cell, comprising: (a) transfecting the expression vector of claim 3 into a suitable host cell; and (b) C) culturing the host cells of step (a) under conditions allowing expression of the rhesus monkey MC-3R protein from the expression vector. 【請求項２７】 配列番号２において３文字表記で示されているように、 【化５】 のアミノ酸配列を含むアカゲザルの精製されたメラノコルチン３受容体タンパク
質。27. As shown in three-letter notation in SEQ ID NO: 2, A purified rhesus monkey melanocortin 3 receptor protein comprising the amino acid sequence of 【請求項２８】 配列番号２に示されているアミノ酸配列からなるアカゲザ
ルの精製されたメラノコルチン３受容体タンパク質。28. A purified rhesus monkey melanocortin 3 receptor protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. 【請求項２９】 物質がｒｈＭＣ−３Ｒに結合し得るかどうかを明らかにす
る方法であって、 （ａ）細胞内におけるｒｈＭＣ−３Ｒの発現を導く発現ベクターで細胞をトラ
ンスフェクションすることによって試験細胞を提供すること； （ｂ）前記試験細胞を前記物質に曝すこと； （ｃ）ｒｈＭＣ−３Ｒに対する前記物質の結合量を測定すること； （ｄ）前記試験細胞におけるｒｈＭＣ−３Ｒに対する前記物質の結合量を、ｒ
ｈＭＣ−３Ｒでトランスフェクションされていないコントロール細胞に対する前
記物質の結合量と比較すること を含む方法。29. A method for determining whether a substance can bind to rhMC-3R, comprising: (a) transfecting the cell with an expression vector that directs the expression of rhMC-3R in the cell. (B) exposing the test cell to the substance; (c) measuring the amount of the substance bound to rhMC-3R; (d) binding of the substance to rhMC-3R in the test cell. The quantity, r
comparing the amount of the substance bound to control cells not transfected with hMC-3R. 【請求項３０】 物質がｒｈＭＣ−３Ｒを活性化し得るかどうかを明らかに
する方法であって、 （ａ）細胞内におけるｒｈＭＣ−３Ｒの発現を導く発現ベクターで細胞をトラ
ンスフェクションすることによって試験細胞を提供すること； （ｂ）前記試験細胞に前記物質を曝すこと； （ｃ）蓄積した細胞内ｃＡＭＰの量を測定すること； （ｄ）前記物質に応答した前記試験細胞におけるｃＡＭＰの結合量を、前記物
質に曝されていない試験細胞におけるｃＡＭＰの量と比較すること を含む方法。30. A method for determining whether a substance is capable of activating rhMC-3R, comprising: (a) transfecting the cell with an expression vector that directs the expression of rhMC-3R in the cell. (B) exposing the test cell to the substance; (c) measuring the amount of accumulated intracellular cAMP; (d) measuring the amount of cAMP bound to the test cell in response to the substance. Comparing to the amount of cAMP in the test cells not exposed to said substance. 【請求項３１】 ＭＣ−３Ｒ受容体活性を調節する物質を同定する方法であ
って、 （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＭＣ−３Ｒ受容体タンパク質
の存在下および非存在下で試験物質と一緒にすること；および （ｂ）ＭＣ−３Ｒ受容体タンパク質の存在下および非存在下における前記試験
物質の作用を測定して比較すること を含む方法。31. A method for identifying a substance that regulates MC-3R receptor activity, comprising: (a) in the presence or absence of an MC-3R receptor protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 Combining with a test substance; and (b) measuring and comparing the effect of said test substance in the presence and absence of the MC-3R receptor protein. 【請求項３２】 物質がＭＣ−３Ｒの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニ
ストであるかどうかを明らかにする方法であって、 （ａ）細胞内におけるＭＣ−３Ｒの発現を導く請求項３に記載される発現ベク
ターで細胞をトランスフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）ＭＣ−３Ｒを発現させるために十分な時間にわたって前記試験細胞を生
育させること； （ｃ）前記物質の存在下および非存在下でＭＣ−３Ｒの標識リガンドに前記細
胞を曝すこと； （ｄ）ＭＣ−３Ｒに対する前記標識リガンドの結合を測定すること を含む方法であって、この場合、前記標識リガンドの結合量が、前記物質の存在
下において、前記物質の非存在下のときよりも少ない場合、前記物質は、ＭＣ−
３Ｒの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストである、方法。32. A method for determining whether a substance is a potential agonist or antagonist of MC-3R, comprising: (a) directing the expression of MC-3R in a cell. Transfecting or transforming cells with an expression vector to obtain test cells; (b) growing said test cells for a time sufficient to express MC-3R; (c) in the presence of said substance And exposing the cells to a labeled ligand of MC-3R in the absence of the compound; and (d) measuring the binding of the labeled ligand to MC-3R, in which case the amount of the labeled ligand bound Is less in the presence of the substance than in the absence of the substance, the substance is MC-
A method, wherein the method is a potential agonist or antagonist of 3R. 【請求項３３】 物質がＭＣ−３Ｒに結合し得るかどうかを明らかにする方
法であって、 （ａ）細胞内におけるＭＣ−３Ｒの発現を導く請求項３に記載される発現ベク
ターで細胞をトランスフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）前記試験細胞を前記物質に曝すこと； （ｃ）ＭＣ−３Ｒに対する前記物質の結合量を測定すること； （ｄ）前記試験細胞におけるＭＣ−３Ｒに対する前記物質の結合量を、ＭＣ−
３Ｒでトランスフェクションされていないコントロール細胞に対する前記物質の
結合量と比較すること を含む方法であって、この場合、前記物質の結合量が、コントロール細胞と比較
して前記試験細胞において大きい場合、前記物質はＭＣ−３Ｒに結合し得る、方
法。33. A method for determining whether a substance is capable of binding to MC-3R, comprising: (a) directing the expression of MC-3R in a cell; (B) exposing the test cells to the substance; (c) measuring the amount of the substance bound to MC-3R; (d) the test cells The binding amount of the substance to MC-3R in MC-
Comparing the amount of binding of the substance to control cells that have not been transfected with 3R, wherein the amount of binding of the substance is greater in the test cells as compared to control cells. The method, wherein the agent is capable of binding to MC-3R. 【請求項３４】 物質がＭＣ−３Ｒに結合し得るかどうかを明らかにする方
法であって、 （ａ）細胞内におけるＭＣ−３Ｒの発現を導く請求項３に記載される発現ベク
ターで細胞をトランスフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）前記試験細胞からＭＣ−３Ｒを含む膜を調製して、リガンドが前記膜内
のＭＣ−３Ｒに結合するような条件下で前記膜をＭＣ−３Ｒのリガンドに曝すこ
と； （ｃ）工程（ｂ）に引き続き、あるいは工程（ｂ）と同時に、前記試験細胞か
ら得られた膜を物質に曝すこと； （ｄ）前記物質の存在下および非存在下において前記膜内のＭＣ−３Ｒに対す
る前記リガンドの結合量を測定すること； （ｅ）前記物質の存在下および非存在下において前記膜内のＭＣ−３Ｒに対す
る前記リガンドの結合量を比較すること を含む方法であって、この場合、前記物質の存在下における前記膜内のＭＣ−３
Ｒに対する前記リガンドの結合量の減少は、前記物質がＭＣ−３Ｒに結合し得る
ことを示す、方法。34. A method for clarifying whether a substance can bind to MC-3R, comprising: (a) directing the expression of MC-3R in a cell; Transfecting or transforming to obtain test cells; (b) preparing a membrane containing MC-3R from said test cells, and preparing said membrane under conditions such that a ligand binds to MC-3R in said membrane. Exposing the membrane to a ligand of MC-3R; (c) exposing the membrane obtained from said test cells to a substance following or simultaneously with step (b); (d) presence of said substance Measuring the amount of binding of the ligand to MC-3R in the membrane in the presence and absence of (e) binding of the ligand to MC-3R in the membrane in the presence and absence of the substance. A method comprising comparing the amount, in this case, MC-3 in said film in the presence of the substance
A method wherein a decrease in the amount of the ligand bound to R indicates that the substance is capable of binding to MC-3R. 【請求項３５】 物質がＭＣ−３Ｒに結合し得るかどうかを明らかにする方
法であって、 （ａ）細胞内におけるＭＣ−３Ｒの発現を導く請求項３に記載される発現ベク
ターで細胞をトランスフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）前記試験細胞からＭＣ−３Ｒを含む膜を調製して、前記試験細胞から得
られた膜を前記物質に曝すこと； （ｃ）前記試験細胞から得られた膜内のＭＣ−３Ｒに対する前記物質の結合量
を測定すること； （ｄ）前記試験細胞から得られた膜内のＭＣ−３Ｒに対する前記物質の結合量
を、ＭＣ−３Ｒでトランスフェクションされていないコントロール細胞から得ら
れた膜に対する前記物質の結合量と比較すること を含む方法であって、この場合、前記試験細胞から得られた膜内のＭＣ−３Ｒに
対する前記物質の結合量が、前記コントロール細胞から得られた膜に対する前記
物質の結合量よりも大きい場合、前記物質はＭＣ−３Ｒに結合し得る、方法。35. A method for determining whether a substance can bind to MC-3R, comprising the steps of: (a) directing the expression of MC-3R in a cell; Transfection or transformation to obtain a test cell; (b) preparing a membrane containing MC-3R from the test cell, and exposing the membrane obtained from the test cell to the substance; (c) Measuring the amount of binding of the substance to MC-3R in the membrane obtained from the test cells; (d) determining the amount of binding of the substance to MC-3R in the membrane obtained from the test cells by MC- Comparing the amount of the substance bound to a membrane obtained from a control cell not transfected with 3R, wherein the MC-3R in the membrane obtained from the test cell is used. Against binding of the substance is greater than the amount of binding of the substance to membranes obtained from the control cells, the substance capable of binding to MC-3R, method. 【請求項３６】 ＭＣ−３Ｒのアゴニストを同定する方法であって、 （ａ）ＭＣ−３Ｒの発現を導く請求項３に記載される第１の発現ベクターおよ
びプロミスカスＧタンパク質の発現を導く第２の発現ベクターで細胞をトランス
フェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）前記試験細胞を、ＭＣ−３Ｒのアゴニストと考えられる物質に曝すこと
； （ｃ）細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定すること を含む方法であって、この場合、アゴニストと考えられる前記物質の非存在下に
おける細胞内のイノシトールリン酸レベルと比較して、細胞内のイノシトールリ
ン酸レベルの増大は、前記物質がＭＣ−３Ｒのアゴニストであることを示す、方
法。36. A method for identifying an agonist of MC-3R, comprising: (a) the first expression vector according to claim 3, which directs the expression of MC-3R; (B) exposing the test cells to a substance considered to be an agonist of MC-3R; and (c) exposing the test cells to intracellular inositol phosphorus. Measuring the level of the acid, wherein the increase in the level of inositol phosphate in the cell compared to the level of inositol phosphate in the cell in the absence of the substance considered to be an agonist, , Wherein the agent is an agonist of MC-3R. 【請求項３７】 ＭＣ−３Ｒのアンタゴニストを同定する方法であって、 （ａ）ＭＣ−３Ｒの発現を導く請求項３に記載される第１の発現ベクターおよ
びプロミスカスＧタンパク質の発現を導く第２の発現ベクターで細胞をトランス
フェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること； （ｂ）前記試験細胞を、ＭＣ−３Ｒのアンタゴニストと考えられる物質に曝す
こと； （ｃ）工程（ｂ）に引き続き、あるいは工程（ｂ）と同時に、前記試験細胞を
、ＭＣ−３Ｒのアンタゴニストと考えられる物質に曝すこと； （ｄ）細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定すること を含む方法であって、この場合、アンタゴニストと考えられる前記物質の非存在
下における細胞内のイノシトールリン酸レベルと比較して、アンタゴニストと考
えられる前記物質の存在下における細胞内のイノシトールリン酸レベルの低下は
、前記物質がＭＣ−３Ｒのアンタゴニストであることを示す、方法。37. A method for identifying an antagonist of MC-3R, comprising: (a) the first expression vector according to claim 3, which directs the expression of MC-3R, and (B) exposing the test cells to a substance that is considered to be an antagonist of MC-3R; (c) subjecting the cells to a step (b). Subsequently or simultaneously with step (b), exposing the test cell to a substance considered to be an antagonist of MC-3R; (d) measuring the level of inositol phosphate in the cell, In this case, the inositol phosphate level in the cell in the absence of the substance considered as an antagonist is compared with the inositol phosphate level. That reduction in inositol phosphate levels in cells in the presence of the substance indicates that the substance is an antagonist of MC-3R, method. 【請求項３８】 工程（ａ）における前記第１および第２の発現ベクターが
、ＭＣ−３Ｒタンパク質のＣ末端においてプロミスカスＧタンパク質に融合した
キメラＭＣ−３Ｒタンパク質を発現する単一の発現ベクターに置換されている、
請求項３７に記載されるＭＣ−３Ｒのアンタゴニストを同定する方法。38. The single expression vector expressing the chimeric MC-3R protein fused to the promiscuous G protein at the C-terminus of the MC-3R protein, wherein the first and second expression vectors in the step (a) are combined. Has been replaced,
A method for identifying an antagonist of MC-3R according to claim 37. 【請求項３９】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＭＣ−３Ｒ受容
体タンパク質に特異的に結合する抗体。39. An antibody which specifically binds to an MC-3R receptor protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.