JP2002542303A - 特異的に標的化された触媒性アンタゴニストおよびその使用 - Google Patents

特異的に標的化された触媒性アンタゴニストおよびその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、標的分子の触媒性アンタゴニストであるキメラ分子を提供する。本発明のこの触媒性アンタゴニストは、好ましくは、標的化部分によって特異的に結合される分子を分解する酵素に付着された標的化部分を含む。従って、本発明のこの触媒性アンタゴニストは、標的化部分（例えば、レセプター）によって認識される標的に結合する。次いで、キメラの酵素成分は、標的のすべてまたは一部を分解する。このことは、代表的には、標的の活性の減少または喪失、およびキメラ分子の放出を生じる。次いで、このキメラ分子は、別の標的分子を攻撃または分解できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の引用） 本願は、米国特許法第１１９条および／または同第１２０条の下で適切である
として提供される、１９９９年４月２８日に出願されたＵＳＳＮ６０／１３１，
３６２の優先権および利益を主張する。ＵＳＳＮ６０／１３１，３６２は、すべ
ての目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】 （連邦政府によって資金援助された研究開発の下でなされた発明に対する権利
に関する言及） ［適用なし］ （発明の分野） 本発明は、キメラ分子の分野に関する。詳細には、本発明は、標的の触媒性ア
ンタゴニスト（例えば、レセプター、酵素、レクチンなど）として作用する新規
なキメラ分子を提供する。
【０００３】 （発明の背景） キメラ分子において、そのネイティブな状態で別々に存在する２以上の分子は
、互いに結合してその構成分子のすべての所望の機能を有する単一の分子を形成
する。しばしば、キメラ分子の構成分子の１つは「標的化分子」である。この標
的化分子は、その対応する標的に特異的に結合する抗体のような分子であり、そ
してこの標的化分子によって、キメラ分子は、標的化分子が指向される標的（例
えば、エピトープ）を有する細胞および組織に特異的に結合（これらを特異的に
標的化）する。
【０００４】 キメラ分子の別の成分は、「エフェクター分子」であり得る。このエフェクタ
ー分子とは、キメラ分子が特異的に指向される標的に特異的に輸送される分子を
いう。
【０００５】 エフェクター部分に付着された標的化部分を含むキメラ分子は、広範な種々の
状況において使用されてきた。従って、例えば、細胞毒性の「エフェクター分子
」に結合された標的化部分を含むキメラ分子は、しばしば、腫瘍細胞を標的化お
よび殺傷するために使用されてきた（例えば、Ｐａｓｔａｎら、Ａｎｎ Ｒｅｖ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３３１−３５４（１９９２）を参照のこと）。血管形
成インヒビターに付着された標的化部分を含む他のキメラ分子は、腫瘍増殖およ
び／または増殖を阻害するために使用されてきた。逆に、血管形成インデューサ
ーは、アテローム性動脈硬化症の処置のために提案されてきた。キメラ分子の他
の用途には、イントラボディーの送達、細胞内で発現され、次いで細胞内タンパ
ク質に結合する抗体、ベクターの特異的送達（例えば、遺伝子治療）、または組
織特異的リポソームの作製が含まれてきた。
【０００６】 代表的には、標的化部分によって認識される標的は、エフェクター分子の作用
の所望の部位ではない。従って、例えば、癌を処置するために使用されるキメラ
サイトトキシンの場合において（例えば、ＩＬ４−ＰＥ、Ｂ１ＦｖＰＥ３８など
、例えば、ＢｅｎｈａｒおよびＰａｓｔａｎ（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．
Ｒｅｓ．、１：１０２３−１０２９、Ｔｈｒｕｓｈら（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：４９−７１などを参照のこと）、標的化部分は、特
異的に、細胞の表面上の標的に結合する。次いで、このキメラ分子は細胞中に内
部移行し、そしてエフェクター分子（例えば、リシン、アブリン、ジフテリア毒
素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素）が細胞の細胞質に輸送され、ここでそれは
その特徴的な活性を発揮する（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素の場合に
おけるＡＤＰリボシル化）。
【０００７】 同様に、標的化されたリポソームは、代表的には、レセプター媒介プロセスを
通してかまたは脂質の作用を通して内部移行する。標的化されたイントラボディ
ーベクターおよび遺伝子治療ベクターもまた、細胞内での発現のために内部移行
される。さらに、標的化されたキメラ分子の設計における共通の目的は、結合特
異性およびアビディティーの増大であった。アビディティーおよび特異性を増大
させることによって、所定の結果を達成するためのキメラ分子の濃度が減少する
と一般的に考えられている。従って、その標的からのキメラ分子の放出は、一般
的には、望ましくないと見られている。
【０００８】 キメラ分子は、代表的には、内部移行され（標的化細胞の場合において）、そ
してエフェクター分子の活性は、特異的に認識される標的以外の分子に指向され
るので、キメラ分子は、代表的には、「化学量論的」な様式で作用する。すなわ
ち、各キメラ分子は、本質的に、その「基質」との相互作用に際して消費され、
そしてキメラ分子の活性は、引き続く反応のためには利用可能ではない。結果と
して、キメラ分子は、効力のために比較的高レベルで維持されなければならない
。そして、再び発生するキメラ部分の問題（特に、インビボ適用において）は、
治療的に有意な時間にわたって上昇したキメラ分子のレベルを維持することが不
可能なこと、および利用されなければならない高度な投薬量によって引き起こさ
れる毒性（例えば、非特異的）の増大である。
【０００９】 これらの問題を解決する際の試みは、キメラの免疫原性を減少させること（例
えば、ヒト化抗体、抗体フラグメント、小さな融合タンパク質などを使用するこ
とによって）またはキメラ分子を「マスキング」すること（例えば、「ステルス
」リポソーム）に焦点を合わせてきた。特に、免疫原性の減少に対する起動力、
腫瘍浸透の改善などは、キメラ分子における化学的にカップリングした部分の代
わりに融合タンパク質の使用の増加をもたらした（例えば、Ｐａｓｔａｎ（１９
９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３３１−３５４；Ｔｈｒｕｓｈ
（１９９６）Ａｎｎ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：４９−７１；Ｂｒｉｎｋ
ｍａｎｎおよびＰａｓｔａｎ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ．１１９８：２７−４５などを参照のこと）が、キメラの実際の化学量論
または反応速度論には取り組んでいない。
【００１０】 （発明の要旨） 本発明は、キメラ分子の設計に対する新規なアプローチを提供する。１つの実
施形態において、本発明の分子は、標的分子に特異的に結合し、そして結合した
分子を分解する。好ましい実施形態において、このことは、標的分子の活性（例
えば、生物学的活性）の損失を生じ、そしてまた、キメラ分子の放出を生じ、そ
の結果、別の標的を見つけてかつそれを分解することができる。この様式におい
て、キメラ分子は「再生され」、そして本質的に触媒性である。単一のキメラ分
子は、本質的に無限の数の標的を攻撃および分解し得るので、本発明のいわゆる
「触媒性アンタゴニスト」は、比較的低い投薬量で高度に有効である。
【００１１】 従って、１つの実施形態において、本発明は、標的分子（例えば、酵素、レセ
プターなど）の触媒性アンタゴニストを提供する。このアンタゴニストは、標的
分子に特異的に結合する標的化部分を含み、そしてその標的化部分は、標的分子
を分解して、そのコグネイトリガンドに対する標的分子の結合を減少させる酵素
に付着されている。特定の好ましい実施形態において、標的分子の分解はまた、
標的分子へのアンタゴニストの結合を減少させる。従って、これらの実施形態に
おいて、アンタゴニストは、標的から放出されて、それによってそのアンタゴニ
ストが別の標的分子に結合およびそれを分解することを可能にする。
【００１２】 特に好ましい実施形態において、その標的化部分は、システインの硫黄基を通
して酵素と結合されており、そしてそのシステインは、酵素中に天然に存在する
システインであるか、または酵素中に導入されたシステインである（例えば、酵
素中ではシステイン以外のネイティブなアミノ酸で置換されている）。特定の好
ましい実施形態において、そのシステインは、酵素の基質結合部位を含むサブ部
位において、またはその近傍でシステイン以外のネイティブなアミノ酸で置換さ
れているシステインである。いくつかの実施形態において、そのシステインは、
基質結合部位を形成するアミノ酸で置換されているシステインである。
【００１３】 好ましい酵素には、プロテアーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ペプチダーゼ
、ラクタマーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクダ
ーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リパーゼ
、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、スルファターゼ、リゾチーム、
グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、リアーゼ、シクラ
ーゼ、逆転写酵素、ヒアルロニダーゼ、アミラーゼ、セレブロシダーゼ、および
キチナーゼが含まれるがこれらに限定されない。特に好ましい実施形態において
、この酵素はセリンヒドロラーゼである。なおさらに好ましい実施形態において
、この酵素はサブチリシンタンパク質型セリンヒドロラーゼ（例えば、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）であり、このシステインは、
Ｓ１サブ部位、Ｓ１’サブ部位、およびＳ２サブ部位からなる群より選択される
サブ部位中またはその部位の近傍のアミノ酸で置換される。
【００１４】 特に好ましい実施形態において、この酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕ
ｓサブチリシンである。好ましい実施形態において、このシステインは、サブチ
リシン中のアミノ酸で置換され、ここでそのアミノ酸は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌ
ｅｎｔｕｓサブチリシン中の参照残基に対応し、ここで、その参照残基は、残基
１５６、残基１６６、残基２１７、残基２２２、残基６２、残基９６、残基１０
４、残基１０７、残基１８９、および残基２０９からなる群より選択される残基
、またはその残基の近傍にある。
【００１５】 別の実施形態において、酵素はキモトリプシンタイプのセリンプロテアーゼで
あり、システインは成熟トリプシン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｅ
ｎｔｒｙ １ＴＰＰ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されている。ここ
で、参照残基はＴｙｒ９４、Ｌｅｕ９９、Ｇｌｎ１７５、Ａｓｐ１８９、Ｓｅｒ
１９０、Ｇｌｎ１９２、Ｐｈｅ４１、Ｌｙｓ６０、Ｔｙｒ１５１、Ｓｅｒ２１４
、およびＬｙｓ２２４からなる群より選択される残基にあるかまたはその近傍に
ある。
【００１６】 なお別の実施形態においては、酵素はα／βタイプのセリンヒドロラーゼであ
り、システインはＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｔｉｃａリパーゼ（Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｅｎｔｒｙ １ＴＣＡ）中の参照残基に対応するアミ
ノ酸で置換されている。ここで、参照残基はＴｒｐ１０４、Ｌｅｕ１４０、Ｌｅ
ｕ１４４、Ｖａｌ１５４、Ｇｌｕ１８８、Ａｌａ２２５、Ｌｅｕ２７８、および
Ｉｌｅ２８５からなる群より選択される残基にあるかまたはその近傍にある。
【００１７】 なお別の実施形態において、酵素はアスパルチルプロテアーゼである。より好
ましくは、酵素はペプシンタイプのプロテアーゼであり、システインは成熟ヒト
ペプシン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｅｎｔｒｙ １ＰＳＮ）中の
参照残基に対応するアミノ酸で置換されている。ここで、参照残基はＴｙｒ９、
Ｍｅｔ１２、Ｇｌｕ１３、Ｇｌｙ７６、Ｔｈｒ７７、Ｐｈｅ１１１、Ｐｈｅ１１
７、Ｉｌｅ１２８、Ｓｅｒ１３０、Ｔｙｒ１８９、Ｉｌｅ２１３、Ｇｌｕ２３９
、Ｍｅｔ２４５、Ｇｌｎ２８７、Ｍｅｔ２８９、Ｌｅｕ２９１、およびＧｌｕ２
９４からなる群より選択される残基にあるかまたはその近傍にある。
【００１８】 さらになお別の実施形態において、酵素はシステインプロテアーゼである。よ
り好ましくは、酵素はパパインであり、システインは成熟パパイン（Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｅｎｔｒｙ １ＢＱＩ）中の参照残基に対応するア
ミノ酸で置換されている。ここで、参照残基はＡｓｎ１８、Ｓｅｒ２１、Ａｓｎ
６４、Ｔｙｒ６７、Ｔｒｐ６９、Ｇｌｎ１１２、Ｇｌｎ１４２、Ａｓｐ１５８、
Ｔｒｐ１７７、およびＰｈｅ２０７からなる群より選択される残基にあるかまた
はその近傍にある。
【００１９】 特定の実施形態において、酵素はメタロプロテアーゼであり、システインは成
熟ヒトマトリクスメタロプロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ
ｅｎｔｒｙ ８３０Ｃ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されている。こ
こで、参照残基はＬｅｕ１１１、Ｐｈｅ１７５、Ｔｙｒ１７６、Ｓｅｒ１８２、
Ｌｅｕ１８４、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１４、Ａｓｐ２３１、Ｌｙｓ２３４、お
よびＩｌｅ２４３からなる群より選択される残基にあるかまたはその近傍にある
。
【００２０】 特定の実施形態において、触媒アンタゴニスト標的化部分は標的を指向してい
る。標的は細胞の表面上の分子（例えば、レセプター、リガンド、細胞壁の成分
、細胞膜の成分などを形成する分子）である。特定の実施形態において、標的化
部分は、抗原、炭水化物、核酸、脂質、配位複合体、糖、ビタミン、デンドリマ
ー、およびクラウンエーテルを含むが、これらに限定されない。特に好ましい実
施形態において、標的化部分はレセプターまたは酵素の同族リガンドである。別
の特に好ましい実施形態において、標的化部分はレセプターまたは酵素のインヒ
ビターである。
【００２１】 特定の好ましい実施形態において、酵素はプロテアーゼ（例えば、パパイン、
サブチリシン、ペプシン、トリプシン、メタロプロテアーゼなど）であり、標的
化部分は、炭水化物、ビタミンまたはビタミンアナログ、酵素インヒビター、ペ
プチド、小さな有機分子である薬剤、およびビオチンからなる群より選択される
リガンドである。別の実施形態において、酵素はプロテアーゼであり、標的化部
分はレセプターである。
【００２２】 特定の好ましい実施形態において、酵素はプロテアーゼ（例えば、パパイン、
サブチリシン、ペプシン、トリプシン、メタロプロテアーゼなど）であり、標的
化部分は、ピラゾールである酵素インヒビター、ビオチン、レクチンに結合する
リガンド（例えば、コンカナバリンＡ）、炭水化物（例えば、チオエチルＤ−マ
ンノピラノシド）である。１つの特に好ましい実施形態において、標的化部分は
土壌に特異的に結合し、酵素はその土壌の成分を分解する。
【００２３】 別の実施形態において、本発明は標的分子を分解する方法を提供する。この方
法は、標的分子を、その標的分子に特異的に結合する標的化部分を含む触媒アン
タゴニストと接触させる工程を包含する。ここで、標的化部分は標的分子を分解
する酵素に付着されている。好ましい実施形態において、標的分子の分解がアン
タゴニストを遊離させ、これによりアンタゴニストが別の標的分子に結合しそし
て分解することが可能になる。好ましい実施形態において、標的化部分はシステ
イン上のイオウ基を介して酵素に結合されている。好ましいアンタゴニスト分子
は、上記の触媒アンタゴニスト分子を含むがこれらに限定されない。
【００２４】 なお別の実施形態において、本発明は、変化した基質特異性を有する酵素（す
なわち、再指向化酵素）を提供する。この酵素は好ましくは、その酵素の基質結
合部位を含むサブサイトに付着している標的化部分を含む。好ましい実施形態に
おいて、標的化部分は、酵素のサブ部位中のシステインのイオウを介してその酵
素に結合している。システインはネイティブのシステインであってもよく、また
はシステインは、酵素のサブ部位中のシステインではないネイティブのアミノ酸
で置換されている。好ましい酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ
、ペプチダーゼ、ラクタマーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクタ
ーゼ、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガ
ーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、スルファターゼ、リソザイ
ム、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラ
ーゼ、ケトラーゼ、リアーゼ、シクラーゼ、逆転写酵素、ヒアルロニダーゼ、ア
ミラーゼ、セレブロシダーゼ、およびキチナーゼを含むが、これらに限定されな
い。
【００２５】 特に好ましい実施形態において、酵素はセリンヒドロラーゼ（例えば、サブチ
リシン）である。サブチリシンにおいて、システインは好ましくは、Ｓ１サブ部
位、Ｓ１’サブ部位およびＳ２サブ部位からなる群より選択されるサブ部位にあ
るかまたはその近傍にあるアミノ酸で置換されている。種々の酵素においてシス
テインの置換に特に好ましい部位は、上記のものであるがこれらに限定されない
。同様に、特に好ましい標的および標的化部分は、上記のものを含むがこれらに
限定されない。特定の実施形態において、標的化部分はレセプターまたは酵素の
インヒビターであり、他の実施形態において、標的化部分は成長因子、サイトカ
インおよびレセプターリガンドからなる群より選択される。特定の実施形態にお
いて、酵素はプロテアーゼであり、標的化部分は炭水化物、ビタミンまたはビタ
ミンアナログ、酵素インヒビター、ペプチド、小さな誘起分子である薬剤、およ
びビオチンからなる群より選択されるリガンドである。１つの特に好ましい実施
形態において、酵素はプロテアーゼ（例えば、サブチリシン、パパイン、ペプシ
ンなど）であり、標的化部分はレセプター、ピラゾールである酵素インヒビター
、ビオチン、レクチンに結合するリガンド（例えば、コンカナバリンＡ）、また
は炭水化物（例えば、チオエチルＤ−マンノピラノシド）である。１つの実施形
態において、標的化部分は土壌に特異的に結合し、酵素はその土壌の成分を分解
する。
【００２６】 なお別の実施形態において、本発明は特定の標的に酵素の活性を指向させる方
法を提供する。この方法は、変化した基質特異性を有する酵素を提供する工程で
あって、この酵素は、その酵素の基質結合領域内のサブ部位に付着している標的
化部分を含む、工程；および標的を酵素と接触させ、それにより酵素が標的に特
異的に結合し、これにより標的にその酵素の活性が限局される工程を包含する。
好ましい酵素は、上記の「再指向化」酵素を含むがこれらに限定されない。
【００２７】 本発明はまた、レセプターまたは酵素のインヒビターとして作用する薬物の活
性を増強させる方法を提供する。この方法は、ヒドロラーゼをその薬物に、その
薬物がレセプターまたは酵素に結合したときヒドロラーゼがそのレセプターまた
は酵素を分解するように付着させり工程を包含する。好ましい実施形態において
、この方法は薬物の投与治療ウインドウを増大させる。１つの特に好ましい実施
形態において、ヒドロラーゼはセリンヒドロラーゼ（例えば、サブチリシン）で
ある。特定の好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはメタロプロテアーゼ、
システインプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼなどである。
【００２８】 本発明はまた、酵素またはレセプターを阻害する方法を提供する。この方法は
、酵素またはレセプターを、その酵素またはレセプターの同族リガンドを分解す
る酵素に付着しているリガンドであって、その酵素またはレセプターに結合する
リガンドを含むキメラ分子と接触させる工程を包含する。したがって、リガンド
は酵素またはレセプターに連結し、そこで同族リガンドを自由に分解し、それに
より、同族リガンドがレセプターを活性化することもその酵素の基質として作用
することも妨げる。好ましい実施形態において、キメラ分子は、酵素またはレセ
プターのインヒビターに付着したヒドロラーゼ（例えば、プロテアーゼ）を含む
。好ましいヒドロラーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、ア
スパルチルプロテアーゼ、ペプシンタイププロテアーゼ、およびメタロプロテア
ーゼを含むがこれらに限定されない。
【００２９】 特定の実施形態において、本発明は、例えばＨｉｆｕｍｉら（１９９９）Ｊ．
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８８：３２３
により記載されるような触媒抗体を含まない。
【００３０】 （定義） 本明細書中で使用する場合、用語「触媒性アンタゴニスト」とは、特定の生物
学的活性を有する分子の活性を阻害し得、かつ／または特定の生物学的活性を有
さない分子を単に分解し得る酵素をいう。この阻害は、「標的」分子の機能の遮
断または破壊であり得る。好ましい実施形態において、この阻害または妨害物は
、標的分子の部分的または完全な分解によるものであり得る。「触媒性アンタゴ
ニスト」は、アンタゴニストが、標的細胞との相互作用によってそれ自体消耗さ
れないか、または有意に変化（すなわち、永久的変化）されない事実の長所によ
って、触媒性である。従って、好ましい実施形態において、標的分子の分解は、
究極的に、別の標的分子を自由に攻撃できるような触媒性アンタゴニストの放出
を生じる。この反応は、好ましくは、化学量論以下（ｓｕｂｓｔｏｉｃｈｉｏｍ
ｅｔｒｉｃ）（触媒性アンタゴニストと標的の比が１未満）であり、そして単一
の触媒性アンタゴニストは、多数の標的分子を自由に分解する。
【００３１】 「標的分子」とは、触媒性アンタゴニストまたは本明細書中に記載される特異
的に指向された酵素によって特異的に結合される分子をいう。触媒性アンタゴニ
ストが使用される場合、標的分子は、このアンタゴニストによって部分的または
完全に分解される。
【００３２】 「標的化部位」とは、化学分子において標的分子に特異的に結合する部分をい
う。標的化部位を酵素に結合する前は、この標的化部位は標的化分子である。好
ましい実施形態において、この標的化部位は、同族の結合パートナー対の１つで
ある。
【００３３】 用語「特異的に結合する」は、標的化部位およびその同族の結合パートナーの
相互作用を言及する場合、分子（例えば、タンパク質および他の生物製剤）の異
種集団の存在下での標的化部位または同族分子の存在の決定因である結合反応を
いう。従って、例えばレセプター／リガンド結合対の場合、リガンドは、分子の
複合体混合物からそのレセプターを特異的および／または優先的に選択し、また
逆も同様である。この結合は、イオン性相互作用、共有結合的相互作用、疎水性
相互作用、ファンデルワールス相互作用などが挙げられるが、これらに限定され
ない種々の機構の１つ以上によるものであり得る。
【００３４】 用語「結合パートナー」、または「結合パートナー」のメンバー、あるいは「
同族のリガンド」とは、他の分子に特異的に結合し、抗体／抗原、レクチン／炭
水化物、核酸／核酸、レセプター／レセプターリガンド（例えば、ＩＬ−４レセ
プターおよびＩＬ−４）、アビジン／ビオチンなどのような結合複合体を形成す
る分子をいう。
【００３５】 用語リガンドは、別の分子に特異的に結合する分子をいうように使用される。
一般に、リガンドは、レセプターに結合する可溶性分子（例えば、ホルモンまた
はサイトカイン）である。レセプターのより広い意味が使用される場合（例えば
、シグナル伝達の意味が存在しない場合）、結合対のどのメンバーがリガンドお
よびその「レセプター」であるかに関する決定は、しばしば、ある程度恣意的で
ある。これらの場合、代表的には、この結合対の２つのメンバーのうち、より小
さなものがリガンドと呼ばれる。従って、レクチン−糖相互作用において、糖が
リガンドである（これが遥かに大きな分子に結合していたとしても、糖類という
認識である）。
【００３６】 用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク
質」は、本明細書中で交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーをいう。こ
の用語は、その１つ以上のアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸に対応する
人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミ
ノ酸ポリマーにあてはまる。この用語はまた、ポリペプチドを作製するアミノ酸
に結合する伝統的なペプチド結合における改変体を含む。タンパク質はまた、糖
タンパク質（例えば、富ヒスチジン糖タンパク質（ＨＲＧ）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ
抗原（ＬｅY）など）を含む。
【００３７】 用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または本明細書の文法上同意義な
ものは、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドをいう。本発明の核
酸は、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、そして一般にリン酸ジエステル結
合を含むが、以下に概略が説明されるように、いくつかの場合において、含まれ
る核酸アナログは、交替性の幹を有し得、これは例えばホスホルアミド（Ｂｅａ
ｕｃａｇｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）：１９２５お
よびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ
．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌら（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉら（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５
，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４
４７０；およびＰａｕｗｅｌｓら（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ
２６：１４１９）、ホスホロチオエート（Ｍａｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７；および米国特許第５，６４４，０４
８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．１１１：２３２１）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔ
ｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、ならびにペプチド核酸の幹および結合（Ｅｇｈ
ｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅ
ｒら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅ
ｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら（１
９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：２０７を参照のこと）を含む。他のアナログ核
酸は、以下を含むものが挙げられる：陽性の幹（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｋｂ
ｏｎｅｓ）（Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７）；非イオン性幹（米国特許第５，３８６，０２３
号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，
１４１号および同第４，４６９，８６３号；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９
９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７；第２章
および第３章，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，「Ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編
；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４），Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎ
ａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ
．３７：７４３（１９９６））ならびに非リボース幹（米国特許第５，２３５，
０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびに第６章および第７章，ＡＣ
Ｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編、に記載されるものを含
む）。１つ以上の炭素環式糖を含む核酸はまた、核酸の定義内に含まれる（Ｊｅ
ｎｋｉｎｓら（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．１６９−１７６頁を参
照のこと）。いくつかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ，Ｃ＆Ｅ Ｎｅｗｓ Ｊｕ
ｎｅ ２，１９９７，３５頁に記載される。リボース−ホスフェート幹の改変は
、標識のような追加部分の追加を容易にするために、またはこのような分子の生
理学的環境における安定性および半減期を増加するために、行われ得る。
【００３８】 本明細書中で使用される場合、用語「残基」は、天然の、合成の、または改変
されたアミノ酸をいう。
【００３９】 用語酵素は、それ自体が永久的に変化されることなく、他の物質における化学
的変化を触媒し得るタンパク質を含む。この酵素は、野生型の酵素または改変体
酵素であり得る。本発明の範囲内の酵素としては、以下が挙げられるがこれらに
限定されない：プロテアーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ペプチダーゼ、ラク
タマーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクターゼ、
トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リパーゼ、ホス
ホリパーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、スルファターゼ、リゾチーム、グリコ
シダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ケト
ラーゼ、リアーゼ、シクラーゼ、逆トランスクリプターゼ、ヒアルロニダーゼ、
アミラーゼ、セレブロシダーゼ（ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅｓ）、キチナーゼ
など。
【００４０】 「変異体酵素」は、アミノ酸残基をシステイン（または他の）残基で置換する
ことによって、変化された酵素である。
【００４１】 「化学的に修飾された」酵素は、酵素中の部位で普通は見出されない置換基を
有するように誘導された酵素である。誘導体化は、代表的には翻訳後の修飾であ
り、時折インビボで行われるが、より代表的にはエキソビボで行われる。
【００４２】 「化学的に修飾された変異体酵素」または「ＣＭＭ」は、そのアミノ酸残基が
別のアミノ酸残基（好ましくはシステイン）で置換され、そしてこの置換残基が
、この残基において普通は見出されない置換基を有するように化学的に誘導され
た、酵素である。
【００４３】 用語「チオール側鎖基」、「チオール含有基」、および「チオール側鎖」は、
交換可能に使用され得る用語であり、そしてシステインのチオール水素を置換す
るために使用される基を含む。通常、このチオール側鎖基は硫黄原子を含み、こ
の原子を介して、このチオール側鎖基はシステインのチオール硫黄に結合する。
用語「置換基」は、代表的には、システインと本明細書中に記載されるメタンス
ルホン酸試薬との反応によって形成されたジスルフィド結合を通して、システイ
ンに結合したままである基をいう。この用語置換基は、好ましくは、まさに結合
したまま残っている基（そのチオール基を除く）をいうが、この置換基はまた、
チオール側鎖基全体もいい得る。この違いは、文脈により明らかである。
【００４４】 「酵素の結合部位」は、酵素の基質結合表面を横切る一連のサブ部位からなる
（ＢｅｒｇｅｒおよびＳｃｈｅｃｈｔｅｒ（１９７０）Ｐｈｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ
ｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ ２５７：２４９−２６４）。サブ部位に対応する
基質残基は標識されたＰであり、そしてそのサブ部位は標識されたＳである。慣
習によって、サブ部位は、標識されたＳ1、Ｓ2、Ｓ3、Ｓ4、Ｓ1’、およびＳ2’
である。サブ部位の議論は、Ｓｉｅｚｅｎら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎ
ｇｅｅｒｉｎｇ，４：７１９−７３７、およびＦｅｒｓｈｔ（１９８５）Ｅｎｚ
ｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、第２版、Ｆｒｅｅ
ｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２９−３０において見出され得る。好ましいサブ部
位は、Ｓ1、Ｓ1’、およびＳ2’を含む。
【００４５】 句「アミノ酸＃＃」または「ＸＸサブ部位中のアミノ酸＃＃」は、参照される
位置（例えば、Ｓ1サブ部位にあるＢ．ｌｅｎｔｕｓサブチリシンのアミノ酸１
５６）におけるアミノ酸、および関連する酵素における対応する（相同な）位置
のアミノ酸を含む。
【００４６】 酵素の残基（アミノ酸）は、それが相同であるか（すなわち、三次構造または
四次構造のいずれかにおける位置に対応する）またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ
ｆａｃｉｅｎｓサブチリシン中の残基の特定の残基もしくは一部と類似である（
すなわち、化学的に化合させるか、反応させるか、または相互作用させるための
同じかまたは類似の官能基の能力を有する）場合に、参照される酵素（例えば、
Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシン）の残基に等価である。
【００４７】 一次構造に対する相同性を確立するために、対象酵素（例えば、セリンヒドロ
ラーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラチルプロテアーゼ、メタロプロテア
ーゼなど）のアミノ酸配列は、参照酵素（例えば、サブチリシン型セリンプロテ
アーゼの場合においては、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシ
ン）の一次配列、および特に、配列が既知のそのファミリー（例えば、サブチリ
シン）のすべての酵素において不変であることが知られている一連の残基と、直
接比較される。保存された残基を整列させた後に、アラインメントを維持するた
めに、必要な挿入および欠失を可能にし（すなわち、任意の欠失および挿入を通
して保存性残基の除去を避ける）、参照酵素（例えば、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシン）の一次構造における特定のアミノ酸残基に等価
な残基が規定される。保存された残基のアラインメントは、好ましくは、このよ
うな残基を１００％保存するべきである。しかし、７５％より高いアラインメン
トまたは５０％程度の低い保存性残基もまた、等価な残基を規定するために適切
である。触媒性の三つ組の保存性（例えば、Ａｓｐ３２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２
２１）は、セリンヒドロラーゼについて維持されるべきである。
【００４８】 保存された残基は、他の関連する酵素において対応する等価なアミノ酸残基を
規定するために使用され得る。例えば、２つ（参照および「標的」）の配列が、
保存された残基の最大の相同性を産生するために整列される。参照配列と比較し
て、「標的」配列には、多数の挿入および欠失が存在し得る。従って、例えば、
Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシンと比較して、サーミター
ゼ（ｔｈｅｒｍｉｔａｓｅ）配列中に多数の欠失が見られる（例えば、米国特許
第５，９７２，６８２号を参照のこと）。従って、サーミターゼにおける、Ｂ．
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシンのＴｙｒ２１７の等価なアミ
ノ酸は、５，９７２，６８２特許の図５Ｂ−２中のＴｙｒ２１７の下に示される
特定のリジンである。
【００４９】 特定の「等価な」残基は、異なるアミノ酸によって置換されて、変異カルボニ
ルヒドロラーゼを生じ得る。なぜなら、それらは、一次構造において等価である
からである。
【００５０】 三次構造がＸ線結晶解析によって決定された特定の酵素についての三次構造の
レベルでの相同な等価な残基は、参照配列（例えば、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ
ｆａｃｉｅｎｓサブチリシン）および問題の配列（標的配列）の特定のアミノ酸
残基の２以上の主鎖の原子の原子配位（ＮとＮ、ＣＡとＣＡ、ＣとＣ、およびＯ
とＯ）が、アラインメント後に０．１３ｎｍ以内、好ましくは０．１ｎｍ以内で
あると規定される。アラインメントは、最良のモデルが、参照配列に対して問題
の酵素の非水素タンパク質原子の原子配位の最大の重複を与えるように配向され
かつ位置決めされた後に達成される。最良のモデルは、利用可能な最高の分解能
で実験的な回折データについて最小のＲ因子を与える結晶学的モデルである。
【００５１】
【数１】 参照配列（例えば、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシン）の
特定の残基と機能的に類似である等価な残基は、問題のアミノ酸配列（例えば、
関連するサブチリシン）の残基として規定される。この問題のアミノ酸配列は、
本明細書中に記載されるような参照配列の特定の残基に規定され、そしてそれに
起因する様式で、タンパク質構造、基質結合、または触媒を変化させるか、修飾
するか、またはそれに寄与するように、コンホメーションを採用し得る。さらに
、これらは、問題の配列（その三次構造がｘ線結晶解析によって得られた）の残
基であり、ここで、所定の残基の主鎖の原子が、相同な位置を占めることに基づ
く等価性の判断基準を満たさないかもしれないが、その残基の主鎖の原子の少な
くとも２つの原子配位が、参照配列の残基の対応する側鎖の原子の０．１３ｎｍ
であるという程度で類似の位置を占める。三次元構造は、上記に概説したように
整列される。この手順の例示については、米国特許第５，９７２，６８２号を参
照のこと。
【００５２】 「参照残基」とは、特定の酵素において特定され、そして、例えば、以下に記
載するように、参照酵素がそのメンバーであるようなファミリーの他のメンバー
において等価な残基を同定するための「参照点」として働く残基をいう。従って
、句「成熟ヒトタンパク質Ｘにおける参照残基に対応するアミノ酸」とは、同じ
タンパク質ファミリーの他のメンバーにおけるタンパク質Ｘの参照残基に等価な
（または相同な）残基をいう。さらに、対象配列がタンパク質Ｘである場合には
、この句は参照残基それ自体をいう。
【００５３】 「セリンヒドロラーゼ」は、加水分解反応において求核試薬として働く活性セ
リン側鎖を利用する加水分解酵素である。この用語は、ネイティブのおよび合成
のセリンヒドロラーゼ、ならびに、例えば、合成目的のために逆反応を行うよう
に操作された酵素を包含する。セリンペプチダーゼのファミリーは、Ｂａｒｔｌ
ｅｔｔおよびＲａｗｌｉｎｇｓ（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２４
４：１９−６１、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓ．Ｄ．によって特徴付けら
れている。
【００５４】 「α／βセリンヒドロラーゼ」は、コムギ胚芽カルボキシペプチダーゼＩＩを
含む、酵素に対する構造的相同性に基づくセリンヒドロラーゼのファミリーをい
う（例えば、Ｌｉａｍら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：９７９
６−９８１２；Ｏｌｌｉｓら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ、５：１９７−２１１を参照のこと）。
【００５５】 用語「アスパルチルプロテアーゼ」（アスパラギン酸プロテアーゼとしてもま
た知られる）は、触媒活性にアスパラギン酸に直接依存しているプロテアーゼで
ある。アスパルチルプロテアーゼのファミリーは、当業者に公知の多くの刊行物
によって特徴付けられている（例えば、ＲａｗｌｉｎｇｓおよびＢａｒｒｅｔｔ
（１９９５）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２４８：１０５−１２０、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓ．Ｄ．を参照のこと）。
【００５６】 用語「システインプロテアーゼ」は、当業者の慣用的な用法を伴って、一貫し
て本明細書中で使用され得る。システインプロテアーゼのファミリーは、当業者
に公知の多くの刊行物によって特徴付けられている（例えば、Ｒａｗｌｉｎｇｓ
およびＢａｒｒｅｔｔ（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２２４：
４６１−４８６、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓ．Ｄ．を参照のこと）。
【００５７】 用語「メタロプロテアーゼ」は、当業者の慣用的な用法を伴って、一貫して本
明細書中で使用され得る。メタロプロテアーゼのファミリーは、当業者に公知の
多くの刊行物によって特徴付けられている（例えば、ＲａｗｌｉｎｇｓおよびＢ
ａｒｒｅｔｔ（１９９５）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２４８：１８３−
２２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓ．Ｄ．を参照のこと）。
【００５８】 「サブチリシン型セリンプロテアーゼ」とは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ由来の酵素との構造的な相同性に基づくセリンヒドロラーゼのファミリー
をいい、これには、サブチリシンＢＰＮ’が含まれる（Ｂｏｔｔら（１９８８）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７８９５−７９０６；ＳｉｅｚｅｎおよびＬ
ｏｕｉｓｅ（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：５０１−５２３
；ＢａｒｔｌｅｔｔおよびＲａｗｌｉｎｇｓ（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．２４４：１９−６１、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓ．Ｄ．）。サブ
チリシンは、細菌または真菌のプロテアーゼであり、これは、一般的には、タン
パク質またはペプチドのペプチド結合を切断するように作用する。本明細書中で
使用される場合、「サブチリシン」は、天然に存在するサブチリシンおよび組換
えサブチリシンを意味する。一連の天然に存在するサブチリシンは、種々の微生
物種によって産生され、そしてしばしば分泌されることが知られている。このシ
リーズのメンバーのアミノ酸配列は、完全に相同なわけではない。しかし、この
シリーズのサブチリシンは、同じかまたは類似の型のタンパク質分解活性を示す
。このクラスのセリンプロテアーゼは、触媒性の三つ組として規定される共通の
アミノ酸配列を共有する。このことは、キモトリプシン関連セリンプロテアーゼ
のクラスからこのクラスを区別するものである。サブチリシンおよびキモトリプ
シン関連セリンプロテアーゼは、触媒性の三つ組（アスパラギン酸、ヒスチジン
、およびセリンを含む）を有する。サブチリシン関連プロテアーゼにおいては、
これらのアミノ酸の相対的な順番は、アミノ末端からカルボキシ末端に読まれ、
アスパラギン酸−ヒスチジン−セリンである。しかし、キモトリプシン関連プロ
テアーゼにおいては、その相対的な順番は、ヒスチジン−アスパラギン酸−セリ
ンである。従って、本明細書中のサブチリシンは、サブチリシン関連プロテアー
ゼの触媒性三つ組を有するセリンプロテアーゼをいう。
【００５９】 「キモトリプシンセリンプロテアーゼファミリー」とは、γキモトリプシンを
含む酵素に対する構造的な相同性に基づくセリンヒドロラーゼのファミリーをい
う（ＢｉｒｋｔｏｆｔおよびＢｌｏｗ（１９７２）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ６８：１８７−２４０）。
【００６０】 「樹状ポリマー」は、規則的な樹状分枝を示すポリマーであり、コアへのまた
はコアからの、連続的または世代的な、分枝の層の付加によって形成される。用
語樹状ポリマーは、「デンドリマー」を含み、これは、コア、少なくとも１つの
内部分枝層、および表面分枝層によって特徴付けられる（例えば、Ｐｅｔａｒら
、６４１−６４５頁、Ｃｈｅｍ．（ｉｎ Ｂｒｉｔａｉｎ）（１９９４年８月）
を参照のこと）。デンドロンは、焦点から発する分枝を有するデンドリマーの種
であり、これは、直接的にまたは連結部分を通してのいずれかで、コアに結合さ
れるかまたはコアに結合され得、デンドリマーを形成する。多くのデンドリマー
は、共通のコアに結合された２以上のデンドロンを含む。しかし、用語デンドリ
マーは、単一のデンドロンを包含するために広く用いられる。
【００６１】 樹状ポリマーには、対称的および非対称的な分枝デンドリマー、カスケード分
子、アルボロール、デンススターポリマーなどが含まれるがこれらに限定されな
い。ＰＡＭＡＭデンススターデンドリマー（米国特許第５，７１４，１６６号に
開示される）は、分枝アームが等しい長さであるという点で対称的である。分枝
は、先行する世代の分枝上の末端アミン基の窒素原子に存在する。リジンに基づ
くデンドリマーは、分枝アームが異なる長さであるという点で非対称的である。
１つの分枝はリジン分子のε窒素に存在し、一方、別の分枝はα窒素に存在する
。これは、先の世代の分枝に分枝を結合させる反応性カルボキシル基に隣接する
。
【００６２】 分枝層の規則的な連続的付加によって形成されないとしても、過剰分枝ポリマ
ー（例えば、過剰分枝ポリオール）は、樹状ポリマーと等価であり得、ここで、
その分枝パターンは、デンドリマーのパターンの規則的なアプローチの程度を示
す。
【００６３】 本明細書中で使用される場合、「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免
疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１以上のポリ
ペプチドからなるタンパク質または糖タンパク質をいう。認識される免疫グロブ
リン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに
無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれ
かとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これ
は次には、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩ
ｇＥをそれぞれ規定する。代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラ
マーを含むことが知られている。各テトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖
の対からなり、各対は１つの「軽鎖（約２５ｋＤ）」および１つの「重鎖（約５
０〜７０ｋＤ）」を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識の原因である約１０
０〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖（ＶＬ）および
可変重鎖（ＶＨ）とは、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれいう。
【００６４】 抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして存在するか、または種々のペプチ
ダーゼを用いる消化によって産生される、多数の十分に特徴付けられたフラグメ
ントとして存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中で、ジスルフ
ィド結合の下（すなわち、Ｆｃドメインに向かって）で抗体を消化し、Ｆ（ａｂ
）’２を生成し、Ｆａｂのダイマーそれ自体は、ジスルフィド結合によってＶH
−ＣH１に結合された軽鎖である。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元さ
れて、ヒンジ領域中のジスルフィド結合を切断し得、それによって（Ｆａｂ’）
２ダイマーをＦａｂ’モノマーに転換する。Ｆａｂ’モノマーは、実質的に、ヒ
ンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な記載
については、Ｐａｕｌ（１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。種々の抗体フラグメ
ントがインタクトな抗体の消化によって規定されるが、当業者は、このようなフ
ラグメントが、化学的に、組換えＤＮＡ技術を利用することによって、または「
ファージディスプレイ」法（例えば、Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）：３０９−３１４およびＰＣＴ／
ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）によってのいずれかで、デノボ合成され得
ることを理解する。好ましい抗体には、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ
）抗体）が含まれ、ここで可変重鎖および可変軽鎖が互いに結合されて（直接的
にまたはペプチドリンカーを介して）、連続的なポリペプチドを形成する。
【００６５】 用語「炭水化物」とは、モノ−、オリゴ−、およびポリ−サッカリド、ならび
に、カルボニル基の還元による（アルジトール）か、１以上の末端基のカルボン
酸への酸化によるか、または水素原子、アミノ基、チオール基、もしくは類似の
ヘテロ原子基による１以上のヒドロキシ基の置換による、モノサッカリド由来の
物質を含む。これはまた、これらの化合物の誘導体を含む。用語「糖」が、しば
しば、モノサッカリドおよび低級オリゴサッカリドに適用される。親のモノサッ
カリドは、３以上の炭素原子を有する、ポリヒドロキシアルデヒドＨ−［ＣＨＯ
Ｈ］n−ＣＨＯまたはポリヒドロキシケトンＨ−［ＣＨＯＨ］ｎ−ＣＯ−［ＣＨ
ＯＨ］m−Ｈである。総称「モノサッカリド」（オリゴサッカリドまたはポリサ
ッカリドに対するものとして）は、他のこのような単位へのグリコシド結合のな
い、単一の単位をいう。これには、アルドース、ジアルドース、アルドケトース
、ケトース、およびジケトース、ならびにジオキシ糖およびアミノ糖、およびそ
れらの誘導体もまた含まれるが、但し、親の化合物が（潜在的な）カルボニル基
を有することが条件である（例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔ（１９９６）Ｐｕｒｅ
Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６８：１９１９−２００８を参照のこと）。最も小さいも
のは、グルコース、リボース、およびトレオースのようなモノサッカリドである
。炭水化物には、オリゴサッカリドおよびポリサッカリド（例えば、デンプン、
セルロース、グリコーゲン）および炭水化物アナログ（例えば、ＯＨがＨ、Ｆ、
ＮＨ2、またはＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ3）が含まれるがこれらに限定されない。
【００６６】 用語「汚れ（ｓｏｉｌ）」または「染み（ｓｔａｉｎ）」とは、目的の物質（
例えば、織物）上の外来性の物質の蓄積をいう。「汚れ」または「染み」は、生
物学的活性を有し得ないが、下にある物質を変色および／または分解するように
働き得る。「汚れ」は、裸眼に見える必要はない。裸眼には見えないが、臭いを
引き起こすかまたは細菌増殖を支持する外来性物質の沈着もまた、本願の状況に
おいては、「汚れ」として見なされる。代表的な染みまたは汚れには、草の染み
、血液の染み、ミルクの染み、卵、卵白などが含まれるがこれらに限定されない
。
【００６７】 用語「低有機分子」とは、製薬で一般的に使用される有機分子に匹敵するサイ
ズの分子をいう。この用語は、生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸など
）を除外する。好ましい低有機分子は、そのサイズが約５０００Ｄａまでであり
、より好ましくは約２０００Ｄａまで、そして最も好ましくは約１０００Ｄａま
でである。
【００６８】 用語「の近く」または「に隣接して」とは、特定のアミノ酸残基についての位
置を示すために使用される場合（例えば、残基１４９に隣接して）、その残基に
先行するかもしくはその残基の後でのいずれかで「参照残基」に共有結合してい
るか、または参照残基とファンデルワールス接触している残基をいう。
【００６９】 （詳細な説明） （触媒性アンタゴニスト） 本発明は、基本的には異なるモードの活性を利用して、キメラ分子の活性にし
ばしば関連する投薬量の問題、活性および持続性の問題を回避する、新規なキメ
ラ分子を提供する。１つの実施形態において、そのキメラ分子は、標的分子の触
媒性アンタゴニストである。本発明の触媒性アンタゴニストは、好ましくは、標
的化部分によって特異的に結合された分子を分解する酵素に付着された標的化部
分を含む。従って、本発明の触媒性アンタゴニストは、標的化部分（例えば、レ
セプター）によって認識される標的に結合し、次いで、キメラの酵素成分は、標
的のすべてまたは一部を分解する。これは、好ましくは、標的の活性の減少また
は損失を生じ、そしてキメラ分子の放出を生じる。次いで、このキメラ分子は、
別の標的分子を攻撃および分解できる。
【００７０】 従って、キメラ分子が１回のみ有効である（例えば、エフェクター活性の消費
および／または内部移行および／またはキメラの溶解に起因する）代表的なキメ
ラ分子と違って、本発明のキメラ分子は、本質的に無限の数の標的を攻撃および
分解できる。好ましい実施形態において、本発明のアンタゴニストは、従って、
各基質分子（標的）の分解後に事実上、効果的に再生された（再度利用可能にさ
れた）触媒である。従って、本発明の触媒性アンタゴニストは、実質的に化学量
論以下である。
【００７１】 結果として、本発明の触媒性アンタゴニストは、キメラ分子または伝統的なイ
ンヒビターよりもはるかに低い濃度で有効である。結果的に、本発明の触媒性イ
ンヒビターを含む処方物（例えば、界面活性剤）は、有意に低い濃度のインヒビ
ターを利用し得、そしてより低いコストで作られ得る。インビボ適用において、
本発明の触媒性インヒビターは、より低い濃度でより高い活性を提供するので、
「伝統的な」キメラ分子よりもよりも、より長い有効な血清半減期およびより低
い毒性を示すことが期待される。
【００７２】 本発明の触媒性アンタゴニストは、標的分子を分解し、そして／またはその標
的分子の活性を阻害することが望まれる場合の、広範な種々の状況において有用
である。従って、例えば、エキソビボ適用において触媒性アンタゴニストは、特
定の分子を特異的に標的化および分解するために使用され得る。従って、例えば
、清掃作業において、本発明のキメラ分子は、汚れの成分（例えば、タンパク質
成分、脂質成分など）を特異的に標的化および分解するために利用され得る。化
学合成プロセスまたは生化学的合成プロセスにおいては（例えば、分析的または
工業的調製物において、バイオリアクターにおいてなど）、あらかじめ選択され
た分子が特異的に分解される。従って、例えば、バイオリアクター中の特定の酵
素活性（例えば、グリコシル化）を除去することが所望される場合、本発明の触
媒性アンタゴニストは、標的化部分として、活性（例えば、グリコシルトランス
フェラーゼ）を媒介する酵素についての基質を含む。リアクター中の酵素（レセ
プター）は、標的化部分に結合し、そしてキメラの酵素成分（例えば、ヒドロラ
ーゼ）は、酵素を分解してその活性を減少させるかまたは除去し、そしてまた、
それ自体が酵素結合部位から離れて、それによって、別の標的酵素を攻撃するこ
とができる。
【００７３】 例えば、リパーゼまたはヒドロラーゼに結合した細菌表面に存在するレクチン
に対して指向される、例えば、標的化部分を有する本発明のキメラ分子は、有効
な抗微生物薬剤であり、おして広範な種々の殺菌剤において使用され得る。
【００７４】 生物学的系（例えば、インビトロまたなインビボ）において、本発明のキメラ
分子は、広範な種々のレセプターおよび／または酵素、および／または中間体の
シグナル伝達物質に結合およびアンタゴナイズ／阻害するために使用され得る。
広範な種々の薬物は、細胞のレセプターの活性を阻害することによって作用する
。従って、例えば、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）は、エストロ
ゲンレセプターに結合しこれをブロックし、β遮断薬（例えば、ジゴキシン）は
、高血圧および心筋梗塞後の管理において使用され、ヒスタミンＨ２レセプター
アンタゴニスト（シメチジン、ラニチジン）は、食道逆流疾患の処置において使
用され、選択的セロトニン（５−ＨＴ）再取り込みインヒビター（例えば、Ｐｒ
ｏｚａｃ、Ｚｏｌｏｆｔ、Ｐａｘｉｌなど）は、鬱病の治療において使用される
、などである。本発明のキメラアンタゴニストは、有効なレセプターアンタゴニ
ストとして作用する、レセプターを分解し得る酵素に結合された標的化部分とし
て、例えば、標的レセプターまたは非コグネイトリガンドによって結合されたコ
グネイトリガンド（例えば、レセプターによる模倣または薬物結合）を含む。
【００７５】 「一時的に」標的レセプターをブロックする、単純な「競合的」インヒビター
とは異なり、本発明の触媒性アンタゴニストは、レセプターを有効に分解する。
従って、一旦結合し分解すると、そのレセプターは、何らかの修復機構を欠き、
再度機能するようではない。従って、等しい濃度においては、本発明の触媒性ア
ンタゴニストは、「伝統的な」競合的インヒビターよりも、はるかに高い活性の
程度、および／または活性の持続時間を生じる。この状況において、酵素（例え
ば、細胞内酵素）もまた、そのコグネイト基質についてのレセプターとして見な
され得ることもまた、理解される。従って、本発明の触媒性アンタゴニストは、
標的酵素を同様に分解するために使用され得る。この例において、標的化部分と
して、標的酵素によって分解または変化されない分子を使用することが好ましい
。酵素の既知の競合的インヒビターは、この状況において良好な標的化部分であ
る。
【００７６】 なお別の実施形態において、本発明は、化学的アンタゴニスト（例えば、レセ
プターおよび／または酵素の）を含み、これには、その酵素および／またはレセ
プターに結合するコグネイトリガンドを分解する酵素に付着されたレセプターま
たは酵素に結合する標的化部分を含む。酵素またはレセプターのインヒビターは
、その標的酵素またはレセプターに、キメラ分子を含む酵素を結合またはアンカ
ーさせる。レセプターまたは酵素のコグネイトリガンドが接近した場合、酵素が
分解を行いそれによってそのレセプター上の活性をブロックする。再度、キメラ
分子には永続的な変化がないので、このプロセスは、「触媒性」である。
【００７７】 好ましい実施形態において、本発明の触媒性アンタゴニストは、化学的にカッ
プリングされたキメラ分子である。その標的化部分は、好ましくは、酵素の両端
のいずれか（アミノ末端もしくはカルボキシ末端または末端アミノ酸のＲ基を通
して）に、直接的に、またはリンカーを介してカップリングされるか、またはよ
り好ましくは、酵素中の非末端アミノ酸に、直接的に、またはリンカーを介して
カップリングされる。特定の好ましい実施形態において、本発明の触媒性アンタ
ゴニストは、化学修飾した変異体（ＣＭＭ）酵素を含む。化学修飾した変異体酵
素は、ネイティブなアミノ酸残基が異なるアミノ酸（例えば、標的化部分のカッ
プリングのために適切な反応部位を生じるシステイン）で置換されている酵素で
ある。従って、本発明の好ましいキメラ分子は、融合タンパク質よりはむしろ、
化学的にカップリングされる。
【００７８】 本発明における化学的にカップリングされた標的化部分の使用は、多数の利点
を生じる。標的化部分は、ペプチドまたはタンパク質に限定されないが、むしろ
多数のリガンドにいずれかであり得、これらには、既知の薬物、ビタミン、炭水
化物、レクチンなどが含まれるがこれらに限定されない。標的化部分は、代表的
には、タンパク質よりも小さいので、これらは、免疫原性がより弱く、そしてよ
り高い組織浸透性を有する。さらに、標的化部分は、しばしば、種々の低有機分
子であるので、それらは、生理学的な状況においてそれらのコンホメーションお
よび特異性を保持し、そして代表的には、インビボでの分解をより受けにくい。
本発明のキメラ分子は、多数の他の利点を提供する。それらは、「標準的な」化
学を用いて化学的に結合体化されるので、より容易に作製および／または変化さ
れる。さらに、その分子は、代表的な「治療的」融合タンパク質（例えば、イム
ノトキシン）よりも小さく、そしてより増加した血清半減期を有することが期待
される。さらに、特定の実施形態において、その分子は、存在するレセプターお
よび／または酵素を実際に破壊／分解するので、単回の投薬がより長時間持続す
る効果を有することが期待される。なぜなら、被験体生物は、その機能を回復さ
せるために、レセプターおよび／または酵素を実際に置換させなければならない
からである。
【００７９】 （ＩＩ．再標的化酵素活性） 多くの適用において、本発明の触媒性アンタゴニストは、ネイティブではない
物質（酵素的成分に対して）に作用するようにか、またはより代表的には、酵素
活性が標的分子の部位に局在化するようにかのいずれかで「再指向」された酵素
とみなされ得る。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、変化した物
質特異性を有する酵素を提供し、ここで、この酵素は、酵素の基質結合部位を含
む副部位（ｓｕｂｓｉｔｅ）に付着した標的化部分を含む、キメラ分子の成分で
ある。
【００８０】 伝統的に、標的化されたキメラ分子は、標的化部分／ドメインをエフェクター
部分の目的の活性部位からいくらか離して位置させるよう設計される。エフェク
ター部分の活性部位にあまりに近く位置する標的化部分は、このエフェクターの
適切な機能を妨害する（例えば、立体障害により）と、一般的に考えられた。
【００８１】 本発明のキメラ分子を含む標的化部分が、酵素の基質結合部位を含むアミノ酸
残基に結合し得ることは、本発明の驚くべき発見であった。さらに、標的化部分
を酵素の基質結合部位のアミノ酸残基に付着させることにより、この基質結合部
位が、標的化部分により結合される標的に近く隣接する。
【００８２】 本発明の方法に従って、化学的に結合した変異体を使用し、化学的部分を単に
変化させることにより単一の酵素を任意の標的に指向する、用途の広い方法が提
供される。このことは、特定の標的特異的酵素を作製するために過剰の改変（例
えば、変異誘発技術による）が必要とされた伝統的な方法より有意に有利である
。
【００８３】 従って、酵素の活性は、以下の２つの方法の一方または両方により、「再指向
」される：第一に、酵素の活性が、標的化部分を特定の予め選択した標的に結合
させることにより、「特異的に局在化」され得る。従って、この酵素は、特定の
細胞型、特定の酵素、特定のレセプターなどに、特異的に指向され得る。第二に
、標的化部分の存在により生成される酵素における変更を利用し、そして／また
は標的化分子が基質結合部位を標的に近く近接させるという事実を利用して、酵
素は、その通常の基質ではない標的に対して、有意な活性を示し得る。
【００８４】 再指向された酵素は、広範な種々の観点で有用である。例えば、標的化部分は
、選択的な分解のために、酵素を特定の標的に再指向／局在化させるように選択
され得る。例えば、界面活性剤の場合には、標的化部分は、「土壌」（例えば、
卵）の特定のクラスに特異的に結合するよう選択され得、これによって、適切な
分解酵素（例えば、プロテアーゼ）をその基質に指向する。
【００８５】 薬学的適用において、いくつかの実施形態において、再標的化された酵素は、
酵素を特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に指向させる標的化部分を含み得、
ここで、この再標的化された酵素（例えば、チミジンキナーゼ（ｔｋ））は、特
定の薬物（例えば、ガンシクロビル（ｇａｎｃｌｏｖｉｒ）のようなサイトトキ
シン）を活性化させる。他の実施形態において、酵素は、アバンダンスを越える
特定の代謝産物（例えば、テイ−サックス病のような保存疾患におけるように）
を含む細胞に、再標的化され得る。新たな部位において、再指向された酵素は、
「誤った（ｍｉｓｓｉｎｇ）」酵素活性を与え、これによって状態を処置する。
これらの例は、単に例示的であり、そして他のものとともに、以下にさらに詳細
に議論される。
【００８６】 本明細書中に提供される教示の観点から、触媒性アンタゴニストは、再標的化
された酵素であり得るが、そうである必要はないことが明らかである。対照的に
、再標的化された酵素は、触媒性アンタゴニストとして作用し得るが、必ずしも
触媒性アンタゴニストとは限らない、再標的化された酵素が存在する。
【００８７】 いかなる場合においても、好ましい実施形態において、再標的化された酵素お
よび触媒性アンタゴニストは、標的化部分を選択すること、酵素（エフェクター
部分）を選択すること、およびこれら２つを化学的に結合体化させてキメラ分子
を形成することにより、作製される。
【００８８】 標的化部分および酵素の選択、ならびにこれらの結合体化は、以下に詳細に記
載される。
【００８９】 （ＩＩ．標的および標的化部分の選択） 好ましい実施形態において、標的の事実上あらゆる同種の結合パートナー（例
えば、レセプターおよび／または酵素および／またはレクチン）が、本発明の分
子の標的化部分として使用され得る。さらに、同種の結合パートナーではないが
標的分子により特異的に結合される分子（例えば、レセプターまたは酵素）もま
た、本発明のキメラ分子の標的化部分として使用され得る。
【００９０】 標的化部分の選択は、そのキメラ分子（例えば、触媒性アンタゴニスト）が利
用されるべき適用に依存する。標的化部分は、広範な種々の分類スキームに従っ
て、グループ化および／または同定され得る。従って、例えば、これらは、分子
の型（例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ペプチド模倣物、抗体、ハプテン、
エピトープ、炭水化物、単糖類、寡糖類、多糖類、糖模倣物、核酸、遺伝子、脂
質、配位錯体、金属、糖、酵素、酵素原、補酵素、補因子、補酵素アナログ、補
因子アナログ、ビタミン、ビタミンアナログ、クラウンエーテル、クラウンエー
テルアナログ、単環式リガンドおよび多環式リガンド、複素環式リガンド、キラ
ルリガンド、エナンチオマー濃縮したリガンド、ならびに上記のものの任意の多
価またはデンドリマー改変体）に従ってグループ化され得るか、あるいはこれら
は、標的の性質に従ってグループ化され得る。
【００９１】 好ましい標的としては、レセプター、酵素、およびレクチンが挙げられるが、
これらに限定されない。いくつかの例においては、これらの標的のうちの１つに
結合する標的化部分をいうことが簡単である。従って、例えば、セロトニンまた
はセロトニンアナログは、標的化部分であり得る。同様に、標的化部分は、これ
らが結合する標的により参照され／同定され得る。従って、標的化部分としての
セロトニンアナログは、セロトニンレセプターに特異的に結合する薬物または化
合物に含まれる。
【００９２】 例示により、上記カテゴリーのいくつかの好ましい標的を、以下に議論する。
しかし、記載される実施形態は、本質的に例示的であり、限定するとは意図され
ない。
【００９３】 （Ａ）レセプターのための標的化部分） レセプターは、特に本発明の触媒性アンタゴニストのための、非常に効果的な
標的を提供する。レセプターは、代表的に、同種のリガンドを特異的に結合し、
そして広範な種々の生物学的プロセスに関与する。代表的に、レセプターは、細
胞からの信号伝達、あるいは細胞からの分子の流入または流出を媒介する。特に
、信号伝達の変換器として、レセプターは、広範な種々のプロセス（増殖および
形質／分化の調節、遺伝子発現および特定の分子の生成、細胞増殖、免疫応答の
エレメント、種々の生物学的カスケード（例えば、炎症性応答、凝固応答など）
などが挙げられるが、これらに限定されない）に関与する。
【００９４】 その結果として、レセプターは、長期にわたって、薬物のための良好な標的で
あると認識されており、そして広範な種々の薬物は、特定のレセプター活性のア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストである（例えば、表１を参照のこと）。
代表的に、これらの薬物は、比較的小さな有機分子であり、そしてそれ自体で、
本発明のキメラ分子のための標的化部分として良好な候補である。
【００９５】
【表１】 しかし、標的化部分は、公知の医薬品である必要はない。インヒビターまたはア
ゴニストが公知であり、そのインヒビターまたはアゴニストが承認された医薬品
ではない、多数のレセプターが存在する。
【００９６】 今までのところは、レセプターのための均一な分類が存在しない。しかし、上
に示したように、非常に多くのレセプターがシグナル伝達レセプターであり、そ
してこの群において、シグナル伝達レセプターは、以下の３つの一般的クラスに
入る： 第一のクラスは、形質膜を貫通し、そして内因性の酵素活性を有する、レセプ
ターを含む。このようなレセプターとしては、チロシンキナーゼ（例えば、ＰＤ
ＧＦ、インスリン、ＥＧＦおよびＦＧＦレセプター）、チロシンホスファターゼ
（例えば、Ｔ細胞およびマクロファージのＣＤ４５［クラスター決定基−４５］
タンパク質）、グアニル酸シクラーゼ（例えば、ナトリウム配設増加性ペプチド
レセプター）、ならびにセリン／スレオニンキナーゼ（例えば、ｃＡＭＰ依存性
プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ＭＡＰキナ
ーゼ、アクチビンおよびＴＧＦ−βレセプター）であるものが挙げられるが、こ
れらに限定されない。さらに、レセプターのいくつかのファミリーは、内因性の
酵素活性を欠くが、直接のタンパク質−タンパク質相互作用により、細胞内チロ
シンキナーゼに結合する。
【００９７】 タンパク質をコードするレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、代表的に
、以下の４つの主要なドメインを含む：細胞外リガンド結合ドメイン、細胞内チ
ロシンキナーゼドメイン、細胞内調節ドメイン、および膜貫通ドメイン。ＲＴＫ
のチロシンキナーゼドメインのアミノ酸配列は、ＡＴＰ結合領域および基質結合
領域において、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）のアミノ酸配列に
、非常に保存される。いくつかのＲＴＫは、キナーゼドメイン内への非キナーゼ
ドメインアミノ酸の挿入を有し、キナーゼインサートと称される。ＲＴＫタンパ
ク質は、これらの細胞外部分における構造的特徴（これには、システインリッチ
ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、ロイシンリッチドメイン、クリングルド
メイン、カドヘリンドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型反復、ジスコイジン（
ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ）Ｉ様ドメイン、酸性ドメイン、およびＥＧＦ様ドメインが
挙げられる）（ならびにキナーゼインサートの存在または非存在）に基づいて、
ファミリーに分類される。これらの種々の細胞外ドメインの存在に基づいて、Ｒ
ＴＫは、少なくとも１４の異なるファミリーに副分割された。代表的なＲＴＫと
しては、Ｉ ＥＧＦレセプター、ＮＥＵ／ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、インスリンレセ
プター、ＩＧＦ−１レセプター、ＰＤＧＦレセプター、ｃ−Ｋｉｔ、ＦＧＦレセ
プター、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター、肝細胞増殖因子（ＨＧ
Ｆ）および散乱因子（ＳＣ）レセプター、ニューロトロフィンレセプターファミ
リー（ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ）およびＮＧＦレセプターなどが挙げられ
るが、これらに限定されない。
【００９８】 第二のクラスは、細胞の内側で、ＧＴＰ結合タンパク質およびＧＴＰ加水分解
タンパク質（Ｇ−タンパク質と称する）に結合するレセプターを含む。Ｇ−タン
パク質に結合したレセプター（ＧＰＣＲ）は、形質膜にまたがるために十分な長
さ（代表的に、２０〜２８アミノ酸残基）である、７つの疎水性ドメインにより
代表的に特徴付けられる、内在性膜タンパク質のスーパーファミリーである。こ
のクラスの例としては、−アドレナリン作用性レセプター、臭気物質レセプター
およびペプチドホルモンのためのレセプター（例えば、グルカゴン、アンギオテ
ンシン、バソプレシンおよびブラジキニン）が挙げられるが、これらに限定され
ない。
【００９９】 第三のクラスは、細胞内に見られ、そしてリガンド結合の際に、リガンド−レ
セプター複合体が遺伝子転写に直接影響を与える核に移動するレセプターを含む
。これらのレセプターとしては、ステロイド／甲状腺ホルモンレセプタースーパ
ーファミリー（例えば、糖質コルチコイド、ビタミンＤ、レチン酸および甲状腺
ホルモンレセプター）が挙げられるが、これらに限定されない。これは、細胞質
内に存在し、そして親油性ステロイド／甲状腺ホルモンを結合する、タンパク質
のクラスである。リガンドの結合の際に、ホルモン−レセプター複合体は、核に
転座し、そしてホルモンレセプターエレメント（ＨＲＥ）と呼ばれる特定のＤＮ
Ａ配列に結合する。この複合体の、ＨＲＥへの結合は、会合した遺伝子の変更さ
れた転写速度を生じる。
【０１００】 このようなレセプターを結合するリガンドは、当業者に周知である。これらと
しては、Ａ2レセプターアゴニスト（例えば、米国特許第６，０２６，３１７号
を参照のこと）、５ＨＴ１レセプターアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば
、米国特許第６，０２５，３７４号および同第６，０２５，３６７号を参照のこ
と）、アテローム性動脈硬化症の予防のための、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテー
ト（ＮＭＤＡ）レセプターブロッカー（例えば、米国特許第６，０２５，３６９
号を参照のこと）、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター−γのモジュレ
ーター（例えば、米国特許第６，０２２，８９７号を参照のこと）、エンドセリ
ンレセプターアンタゴニスト（例えば、米国特許第６，０２２，８８６号および
同第６，０２０，３４８号を参照のこと）、部位１におけるヒト成長ホルモンレ
セプターに対する増加した親和性を有する、ヒト成長ホルモン改変体（例えば、
米国特許第６，０２２，７１１号を参照のこと）、ヒトニューロンニコチン性ア
セチルコリンレセプターのアンタゴニスト（例えば、米国特許第６，０２０，３
３５号を参照のこと）、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターアンタゴニスト
（例えば、米国特許第６，０２２，５２３号を参照のこと）、アデノシンレセプ
ターアゴニスト（例えば、米国特許第６，０２０，３２１号を参照のこと）、イ
ンターロイキンレセプター（例えば、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、Ｉ
Ｌ−８Ｒ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１３Ｒなど）アンタゴニスト、増殖因子レセプ
ターに特異的な結合薬剤（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦおよびそのアナログまたは模
倣物）、ＩｇＡレセプターに特異的な結合薬剤（例えば、米国特許第６，０１８
，０３１号を参照のこと）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテートレセプター複合体
のストリキニーネ非感受性グリシン調節部位のアゴニスト（例えば、米国特許第
６，０１７，９５７号を参照のこと）、インテグリンレセプターアンタゴニスト
（例えば、米国特許第６，０１７，９２６号を参照のこと）、アンドロゲンレセ
プターモジュレーター化合物（例えば、米国特許第６，０１７，９２４号を参照
のこと）、ＰＣＰレセプターリガンド（例えば、米国特許第６，０１７，９１０
号を参照のこと）、トロンビンレセプターアンタゴニストとしてのアゾールペプ
チド模倣物（例えば、米国特許第６，０１７，８９０号を参照のこと）、ＮＰＹ
Ｙ２レセプターアゴニスト（例えば、米国特許第６，０１７，８７９号を参照
のこと）、ＮＦ−κＢのレセプターアクチベーター（例えば、米国特許第６，０
１７，７２９号を参照のこと）、ＴＮＦレセプターのアンタゴニスト、ソマトス
タチンレセプター結合薬剤（例えば、米国特許第６，０１７，５０９号を参照の
こと）、ヒトヒスタミンＨ2レセプター、ブラジキニン結合薬剤（例えば、米国
特許第６，０１５，８１２号を参照のこと）、グルタメートレセプターアンタゴ
ニスト（例えば、米国特許第６，０１５，８００号を参照のこと）、イミダゾリ
ンレセプター、トランスフェリンレセプター、ベンゾジアゼピンレセプター結合
薬剤（例えば、米国特許第６，０１５，５４４号を参照のこと）、ｇａｂａ脳レ
セプターリガンド（例えば、米国特許第６，０１３，７９９号を参照のこと）、
ニューロテンシンＮＴ１およびＮＴ２レセプター、ＣＸＣＲ２レセプター、ＣＣ
Ｒ５レセプター、マクロファージマンノースレセプターなどが挙げられるが、こ
れらに限定されない。
【０１０１】 本発明のキメラ分子のための良好な標的を提供する他のレセプターとしては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＰ−Ｋレセプター、基質Ｋレセ
プター、タキキニン２レセプター、α１−アドレナリンレセプター亜型Ａ、α１
−アドレナリンレセプター亜型Ｂ、α２−アドレナリンレセプター亜型Ａ、β１
−、β２−、β３−アドレナリンレセプターδレセプター、κレセプター、μレ
セプター、ＡＣＴＨレセプター、アンギオテンシンレセプター、アデノシンレセ
プター、ボンベシンレセプター、ガストリン放出ペプチドレセプター、ブラジキ
ニンレセプター、Ｃ５ａレセプター、カルシトニン遺伝子関連ペプチドレセプタ
ー、カルシトニンレセプター、ＣＣＫ−Ａレセプター、コルトコトロピン放出因
子レセプター、ドパミンレセプター、ＥＰ２レセプター、ＥＰ３レセプター、Ｅ
ＴＡレセプター、ＥＴＢレセプター、ＦＳＨレセプター、ＧＡＢＡレセプター、
ガラニンレセプター、グルカゴンレセプター、グルカゴン様ペプチド−１レセプ
ター、性腺刺激ホルモンレセプター、成長ホルモン放出ホルモンレセプター、ヒ
スタミンＨ１レセプター、ヒスタミンＨ２レセプター、ロイコトリエンＢ４レセ
プター、メラトニンレセプター、ＭＳＨレセプター、ムスカリン様Ｍ１、Ｍ２、
Ｍ３、およびＭ４レセプター、ニューロテンシンレセプター、甲状腺傍ホルモン
レセプター、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプター、血
小板活性化因子レセプター、プロスタサイクリンレセプター、Ｐ２Ｕプリノセプ
ター（ｐｕｒｉｎｏｃｅｐｔｏｒ）、Ｐ２Ｙプリノセプター、ロドプシン、セク
レチンレセプター、ソマトスタチンレセプター、ＳＳＴＲレセプター、ＶＩＰレ
セプター、バソプレシンレセプター、エストロゲンレセプター、神経ペプチドレ
セプター、Ｔ細胞レセプターなど。
【０１０２】 （Ｂ）酵素および抗体のための標的化部分） 他の実施形態において、本発明のキメラ分子において使用される標的化部分は
、酵素または抗体により特異的に結合される部分である。広範な種々の酵素、こ
れらの基質およびその相補的インヒビターは、当業者に公知である。さらに、こ
れらの酵素の多くは、広範な種々の病理における薬物のための、良好な標的を提
供する。
【０１０３】 例えば、カスパーゼは、酵母およびぜん虫からヒトまでの動物において細胞自
殺を誘発し得る、酵素の顕著な、そして複雑に調節される網目構造である。カス
パーゼは、多数の疾患（虚血性脳傷害、または発作を含む）における、プログラ
ムされた細胞死を媒介することが公知である。心臓「発作」の間に生じる心臓細
胞死は、いくつかのカスパーゼの活性化により起こると考えられる。さらに、Ｙ
ＶＡＤ−ｃｍｋとして公知の実験的なカスパーゼインヒビターの投与は、この生
化学的カスケードをブロックし、そしてまた心臓組織を保護し、心筋死の量を３
０％を超えて劇的に減少させることが、実証されている。プロテアーゼ（酵素）
に付着したカスパーゼ特異的薬剤を標的化部分として含む、本発明の触媒性アン
タゴニストは、カスパーゼを特異的に標的化および分解し得る。これは、心筋亀
裂骨折の間および後の心臓組織、ならびに発作の間および後の脳組織の保護を与
えることが、予測される。カスパーゼに特異的に結合する薬剤（例えば、ＹＶＡ
Ｄ−ｃｍｋ、および種々の保護されたカスパーゼ基質）は、当業者に公知である
。
【０１０４】 別の例においては、酵素ＧＡＲＦＴ（グリシンアミド−リボヌクレオチド−ホ
ルミル−トランスフェラーゼ）は、腫瘍細胞がＤＮＡの必須の構成要素であるプ
リンを合成する生化学経路における酵素である。ＧＡＲＦＴの作用のブロッキン
グは、プリンの合成および引き続く腫瘍ＤＮＡ分子の構築を阻害する。肝臓細胞
を例外として、すべての通常のヒト組織は、代替的な経路（プリン回収経路）を
経由してプリンを獲得し得る。ＧＡＲＦＴのインヒビターは腫瘍細胞に対して選
択性を示し、他の化学療法剤よりも骨髄に対する毒性がより顕著ではない。ＧＡ
ＲＦＴを分解し得るプロテアーゼに付着した部分を標的化するＧＡＲＦＴを含有
する本発明の触媒アンタゴニストは、同様の腫瘍選択性を示すと予想される。一
つの適した標的化部分はＡＧ２０３７（Ａｇｏｕｒｏｎによって製造される）で
あり、これは前臨床研究において用いられる。ＡＧ２０３７は構造に基づいた設
計を用いて作られて、強力かつ選択的なＧＡＲＦＴの阻害を示したが、初期ＧＡ
ＲＦＴインヒビターの副作用において重要であると考えられている膜タンパクで
あるｍＦＢＰに対する結合を妨げた。ＡＧ２０３７は種々のマウス癌モデル中で
十分に耐性があり、マウスにおいて増殖させた同じ腫瘍で研究した場合、広範囲
なスペクトルの抗腫瘍効力を示し、これは、パクリタキセルの効力と少なくとも
同等であった。
【０１０５】 なお別の例において、細胞間酵素であるジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ
（ＤＨＯＤＨ）は良好な標的を提供する。ＤＨＯＤＨは、ウリジレート（ＵＭＰ
）のデノボの生合成に関与する４番目の連続した酵素である。活性化したＴ細胞
は迅速なデノボのピリミジン生合成を必要とするので、この酵素は免疫応答の活
性化に重要であることが知られており、このことは、この酵素を移植および自己
免疫疾患の介入のための良好な標的にしている。この酵素を標的化する１つの化
合物である、レフルノミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ）は、大人のレフルノミドの活性な
慢性関節リウマチの治療のために米国食品医薬品（ＦＤＡ）によって承認されて
おり、または、関連したＤＨＯＤＨ特異的薬剤は、ＤＨＯＤＨ酵素を分解し同様
の治療結果を提供する酵素に付着した標的化部分として使用され得る。別の公知
のインヒビターである、ブレキナルナトリウムが免疫抑制の多くの動物モデル中
で効力を示しているが、狭い治療的有効血中濃度投与量のために、移植について
の臨床試験では成功していない。本発明の触媒性アンタゴニスト中で標的化部分
として使用される場合、治療的有効血中濃度投与量が改善することが期待される
。なぜなら、この分子は低い濃度でも有効であるからである。概して、本発明に
従って、触媒性アンタゴニストに競合インヒビターとして働く薬剤の転換は、よ
り低い濃度でのより高い効力のために改善した治療的有効血中濃度投与量を示す
と考えられる。
【０１０６】 なおさらに別の例においては、本発明の触媒性アンタゴニストは、遺伝性の気
腫の処置において有用である。気腫の遺伝形はα−１プロテイナーゼインヒビタ
ー欠損または略して「α−１」と呼ばれる。この疾患を有する人々は主要なタン
パク質、α−１プロテイナーゼインヒビターに欠損がある。α−１プロテイナー
ゼインヒビターは血中の主要なタンパク質であり、おもに肝細胞で作られるが、
いくつかの白血球においてもまた作られる。それはエラスターゼと呼ばれる強力
な酵素の効果をブロックすることによって肺を保護する。エラスターゼは通常は
白血球によって運搬され、細菌を殺傷することおよび肺に吸い込まれた小さな小
片を中和化することによって、肺の繊細な組織を保護する。一旦この酵素の保護
的な作業が終わると、更なる行動がα−１プロテイナーゼインヒビターによって
ブロックされる。α−１プロテイナーゼインヒビターなしでは、エラスターゼは
肺の気嚢を破壊し得る。
【０１０７】 このように、例えばプロテアーゼに付着した（例えば、プロラスチンと呼ばれ
る薬物）α−１プロテイナーゼインヒビター結合部分を含有する本発明の触媒性
アンタゴニストは、同様のまたはより良好な治療的利点を与えるα−１プロテイ
ナーゼを分解する。
【０１０８】 抗体はまた、本発明の触媒性アンタゴニストについての有用な標的を提供する
。このように例えば、αＧａｌエピトープ特異的な抗体を標的化しかつ、拮抗す
る（例えば、分解する）触媒性アンタゴニストは免疫応答（例えば、異種移植片
に対して）を有意に減少させることが期待されている。次いで、１つの実施形態
ではαＧａｌエピトープは、本発明のキメラにおける標的化部分として使用され
得る。それはプロテアーゼ（例えば、サブチリシン、ペプシンなど）に付着し得
、そして抗体によって結合される場合、その抗体を分解し、それによって抗体媒
介性の免疫応答を阻害する。
【０１０９】 同様に、特に、異種移植片が異なる種に由来する場合、触媒性アンタゴニスト
は標的化部分として異種移植片としてＭＨＣ（またはその構成成分）を使用し得
る。もし酵素成分がヒドロラーゼ（例、プロテアーゼ）である場合、触媒性イン
ヒビターは特異的に免疫系のエフェクター細胞のレセプターを消化する（例えば
、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）が異種移植片に対して特異的に指向された細
胞でのみ）。触媒性アンタゴニストは、一般的に宿主の免疫系を損なうことなし
に、特異的な耐性を異種移植片に付与する。
【０１１０】 本発明の触媒性アンタゴニストについて良好な標的である他の抗体は、自己免
疫応答および／または他のアレルギー反応において産生される抗体である。これ
らの例においては、標的化部分は、自己免疫またはアレルギー応答を媒介する抗
体によって認識されるエピトープを有する分子である。標的化部分に付着した、
例えば、ヒドロラーゼによる抗体の分解は、自己免疫応答に関連した病理的症状
を減少させる。種々の自己免疫応答において抗体によって認識される特定のアレ
ルゲンおよび基質は、当業者に周知であり、容易に本発明のキメラ分子に組み込
まれ得る。
【０１１１】 上記に提供された例示の多くは、インビボでの適用を指向しているが、本発明
はそのようには限定されていない。広範な種々のエキソビボの適用において酵素
およびまたは抗体を、阻害するのは望ましいことが認識されている。これらの適
用には、種々の細胞培養、バイオリアクターもしくは発酵技術、または種々のエ
キソビボ合成プロセス（例えば、研究室プロセスおよび／または商業的プロセス
）、抗微生物剤／殺菌剤などを含むが、これらに限定されない。
【０１１２】 （Ｃ レクチンおよび糖の標的化部分） 別の実施形態では、特定のレクチンに結合する標的化部分を選択する。レクチ
ンは特異的な単糖またはオリゴ糖に特異的な結合部位を有する、多数の植物、動
物および細菌の供給源から得られるタンパク質である。例えば、コンカナバリン
Ａおよび小麦胚芽のアグルチニンは、糖タンパクの研究の分析用および調製薬剤
として広範に使用されている。
【０１１３】 レクチンはまた、真核細胞および細菌細胞の表面にも存在する。真核細胞にお
いて、レクチンは、しばしば細胞−細胞の相互作用に関与する。細菌細胞におい
ては、レクチンはしばしば細菌の標的／宿主への接着を媒介し、多くの場合では
、そのような接着が、細菌が宿主細胞に感染するのに必要とされる。
【０１１４】 さらに、細菌の接着および非生物学的表面の汚染が、医学、歯科および食料科
学分野での重大な問題となっている。最も有害な効果は医学で生じており、そこ
では移植または経皮性の医療機器の不全がおもに表面に結合した細菌感染から生
じている。細菌の表面との相互作用／吸着はしばしばレクチンによって媒介され
る（しばしば付着因子といわれる）。表面に吸着する細菌は、それ自体を表面に
結合させるために、頻繁に外部多糖類（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）
マトリックスを分泌する。外部多糖類マトリックスに固定された、このねばねば
した細菌層はバイオフィルムとして知られている。現在、インビボでのバイオフ
ィルム感染に対して治療法は存在しない。なぜなら、細菌はどんな抗菌剤または
抗生物質処理に対しても耐性であるからである。
【０１１５】 バイオフィルムの形成はまた、広範な種々の商業的合成系においても問題であ
る。しばしば発酵容器およびほかのバイオリアクターは、バイオフィルムによっ
て汚染される。バイオフィルムはまた、多くの化学プロセス（特に「消化しうる
」有機試薬を含むプロセス）のために使用される装置中で増殖し、そしてこの装
置を汚染する。このようにして、バイオフィルムは、しばしばフィルター、導管
、分離器および他の装置を汚染する。
【０１１６】 特定の実施形態において、本発明の触媒性アンタゴニストは、種々のレクチン
を抑制／分解するために用いられる。従って、例えば、ヒドロラーゼに付着した
糖および多糖類を含有する触媒性アンタゴニストは、特異的に標的分子に結合す
るレクチンを標的化しかつ分解する。そのような触媒性アンタゴニストは、実施
例において例証される。
【０１１７】 細菌表面のレクチン／付着因子を分解することは、細菌の表面に結合する能力
に干渉し、それによって、細菌が宿主細胞に侵入することまたはバイオフィルム
を生成することを妨げる。
【０１１８】 関連した実施形態において、多くの細菌および細菌毒素がガングリオシド、酸
スフィンゴ糖脂質に結合し、そして宿主細胞に侵入することが知られている。こ
れらの中で最も知られているのは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅによって生
成されるエンテロトキシンであるコレラ毒素であり、これは、ガングリオシドＧ
Ｍ１に結合することが知られている。他のガングリオシド結合細菌毒素には、破
傷風毒素（ＧＤ１ｂ）、ボツリヌス毒素（ＧＴ１ｂおよびＧＱ１ｂ）およびＣｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＧＭ２）によって生成されるデ
ルタ毒素を含まれる。Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅによって生成
されるシガ毒素、および腸出血性大腸菌によって生成されるベロ毒素は、例えば
、ガラビオシド（Ｇａ２Ｃｅｒ）およびセラミドトリへキソサイド（Ｇｂ３Ｃｅ
ｒ）のような糖鎖にα−１，４ガラビオース部分を有する中性の酸スフィンゴ糖
脂質に結合する。
【０１１９】 多くの病原菌もまた、コロニー形成および感染のために宿主細胞表面の酸スフ
ィンゴ糖脂質に結合する。従って、***を起こす尿路疾患病原性大腸菌は、
糖鎖の非還元末端にα−１，４ガラビオース部分を有する酸スフィンゴ糖脂質に
結合し得る（Ｇｂ３Ｃｅｒなど）。尿路疾患の病原性大腸菌はまたグロボシド（
Ｇｂ４Ｃｅｒ）およびフォッサマン糖脂質に結合し得、その両方が糖鎖の内側に
α−１，４ガラビオース部分を有する。大腸菌は細菌の細胞表面に存在する線毛
によって酸スフィンゴ糖脂質に結合し、それは繊維や毛髪に似ている。線毛の１
番上にはレクチンによって特徴づけられる付着因子がある。付着因子のいくつか
の種類は、それらの糖特異性に関して、確認されてきた。それらはマンノースに
特異的な大腸菌のＩ型付着因子、これもまたα−１，４ガラビオース部分に特異
的な大腸菌であるＰ型付着因子、およびシアリルガラクトース部分に特異的であ
る大腸菌のＳ型付着因子である。Ｐ型付着因子のアミノ酸配列はシガ毒素の配列
に類似していると報告された。なぜなら、両方ともが酸スフィンゴ糖脂質のα−
１，４ガラビオース部分を認識するからである。皮膚病を引き起こすＰｒｏｐｉ
ｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍは、結合エピトープとして、酸スフィンゴ糖脂質のラ
クトシル部分を認識する。これらの細菌はラクトシルセラミドに強く結合し、例
えば、アシアロＧＭ１（ＧＡ１）およびアシアロＧＭ２（ＧＡ２）のようなアイ
ソレセプターにもまた結合する。ほとんど全ての酸スフィンゴ糖脂質が共通のラ
クトシル部分を有しているので、Ｐｕｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｕｍはほとん
ど全ての酸スフィンゴ糖脂質に結合すると想定され得る。しかし、細菌は、これ
らがラクトシル部分を有していても、セラミド中の２ヒドロキシ基および１ヒド
ロキシ脂肪酸からなるどの酸スフィンゴ糖脂質に対しても結合するというわけで
はない。この事実は細菌の結合エピトープがまた、糖鎖のラクトシル部分に加え
て、セラミド構造に依存していることを示している。淋病を起こすＮｅｉｓｓｅ
ｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅもまたラクトシル部分を有した酸スフィンゴ糖
脂質に結合する。
【０１２０】 前述を考慮すると、酸スフィンゴ糖脂質（例えば、グリコシダーゼ、セレブロ
シダーセなど）を分解する酵素に付着した、種々の酸スフィンゴ糖脂質および／
または種々の付着因子（例えば、マンノースに特異的な大腸菌のＩ型付着因子、
α−１，４ガラビオース部分に特異的な大腸菌のＰ型付着因子およびサイアリル
ガラクトースに特異的な大腸菌のＳ型付着因子）に特異的に結合する標的化部分
を有する触媒性アンタゴニストは、細菌感染を妨げ、細菌の生産した毒素（例え
ば、コレラ毒素）の急性効果をブロックするために、効果的な治療法を提供する
ことが期待される。
【０１２１】 レクチン、特に膜糖タンパク質もまた、種々の炎症プロセスに関わっている（
例えば、慢性関節リウマチ、関節炎敗血症ショック、心筋梗塞などに関連した炎
症プロセス）。例えば、Ｌｅｃ−ＣＡＭまたはセレクチンは内皮、白血球および
血小板の表面に発現され、炎症の部位の白血球の内皮の接着に影響を及ぼす。内
皮細胞および血小板顆粒のヴァイデル−パラーデ体に貯蔵されたＧＭＰ−１４０
（Ｐ−セレクチン）は、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１によって刺激されたとき数分以内
に細胞の表面に輸送され、内皮、血小板、白血球の間の相互作用に関与する。Ｅ
ＬＡＭ−１（Ｅ−セレクチン）は、刺激された内皮、例えば、ＴＮＦ−α／ＩＬ
−１によって、デノボ合成され、その後、白血球の補充を増強する。ＬＡＭ−１
（Ｌ−セレクチン）はリンパ球が高内皮リンパ節細静脈に結合するのを調節し、
好中球およびリンパ球の表面にこれらの細胞が局在し傷害を起こすのを調節する
。
【０１２２】 さらに、インテグリン、αおよびβサブユニットのへテロダイマーから成る接
着分子のファミリー；細胞−マトリックスおよび細胞−細胞の接着の調節に作用
する。これらの分子は構造では膜貫通であり、従って外部の／表面の刺激を細胞
内細胞骨格に繋げるまたは「統合する」。β２インテグリン：ＣＤ１１／ＣＤ１
８分子としてもまた知られている、は接着特異性を与え、化学走性の刺激による
食細胞の活性化を媒介する。
【０１２３】 インテグリン（例えば、ＭＯ−１、白血球機能抗原−１（ＬＦＡ−１）および
ｇｐ１５０，９５）の表面での発現は；食細胞の損傷部位への局在を援助し；欠
損状態は細胞の感染に対する感受性の増強を生じる。
【０１２４】 細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）は：白血球が組織を傷害するための局在
を補助する；サイトカイン刺激の内皮および白血球の表面に発現され；好中球お
よびマクロファージの細胞膜に存在するＬＦＡ−１およびＭＯ−１に結合する。
血管細胞の接着因子−１（ＶＣＡＭ−１）は：リンパ球、単球、好酸球、好塩基
球のＶＬＡ−４白血球レセプターに結合する。
【０１２５】 これら全ての分子はまた、本発明の触媒性アンタゴニストに適した標的を提供
する。前述の本発明のレクチン標的の触媒性アンタゴニストの例証は示例的なも
のであり、制限することを意図しない。多くの他のレクチン標的が当業者に周知
である。
【０１２６】 本明細書中に記載された（および他の）標的および標的化部分が逆転し得るこ
とは理解される。従って、糖の代わりに標的化部分が、特に触媒性アンタゴニス
ト（あるいは再標的化された酵素）を糖または糖負荷の標的に指向させるレクチ
ンであり得る。このように、分子は特定の細菌に存在し、かつその細菌に特徴的
な糖に標的化される。１つの実施形態では、糖指向の触媒性アンタゴニストは効
果的な微生物殺菌剤となる。
【０１２７】 上述のように、そのような分子は、本発明のキメラ分子の単糖またはオリゴサ
ッカリドなどを標的化部分を用いることによって標的化され得る。さらに、デン
ドリマーもまた標的化部分として使用され得る。このように酵素の多機能化（例
えば、触媒性アンタゴニストまたは再標的化された酵素のいずれか）はデンドリ
マー標的化部分を用いることにより達成され得、それによって、多機能酵素（キ
メラ分子）を作製するために分岐した結合構造が利用され得る。
【０１２８】 例えば、複数マンノースを含有するキメラおよび修飾した糖部分を含む、多グ
リコシル化が行なわれ得る。このことはレクチンと標的化酵素（例えば、ヒドロ
ラーゼ）との間の親和性の増加および結合親和性の利点を付与し得る。これはま
た、例えば、複数のビオチン分子を複数同時発生的なビオチン−アビジン作用を
誘導する標的化部分に取り込むことによって、複数同時発生的な部位の標的化を
可能にする。デンドリマー標的化部分（酵素にカップリングする前）は、好まし
くは、ペンタエリトリトールに由来する単純な分枝を有するメタンチオスルホネ
ート、例えば：
【０１２９】
【化１】 図１に例示されているような非常に複雑な分枝デンドリマー試薬までを含む。高
度に分枝した分枝またはデントリマーは１９７８年にＶｏｇｔｌｅによって最初
に合成された（Ｂｕｈｌｅｉｅｒら、１９７８、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１７８）
。中心核に対して多岐部位を含む同一のビルディングブロックの付着は、高度の
均質性および制御を用いて成され得る。それぞれの分枝は官能基を含んでいるが
、化学変化の後に、なお別の分枝ビルディングブロックに連結され得る。この様
式において、分枝化の層ごとに迅速に高度に機能化した分子を生成する（Ｂｏｓ
ｍａｎら、１９９９、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９９：１６６５−１６８８）。
【０１３０】 （Ｄ 他の多方面にわたるリガンドの標的化） 本明細書中で提供された教示を用いて、本発明のキメラ分子による標的化のた
めの広範な種々の他の部分は、当業者に明らかである。例えば、本明細書中に記
載された再指向された酵素は、種々の薬物送達ストラテジーにおいて使用され得
る。標的化部分は特定の細胞種または組織（例えば、癌細胞）に特異的に結合す
るように指向され得る。酵素成分は、不活性型（例えば、無毒性プロドラッグ）
を活性化型（例えば、サイトトキシン）に転換する活性から選択され得る。本発
明の再標的化された酵素は、従って、キメラ分子によって結合された細胞に対す
るプロドラッグ／ドラッグの活性を局在化する。多数の細胞特異的マーカーが当
業者に公知である。これらには、ＬｅｗｉｓＹ抗原（腫瘍細胞）、Ｇ２５０抗原
（腎臓細胞癌細胞）、ＩＬ−１３レセプター（腫瘍細胞）などが含まれるが、そ
れらに限定されない。この適用での使用のための適切な酵素の一つの例は、チミ
ジンキナーゼである（例えば、Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘチミジンキナーゼ
（ＨＳＶＴＫ）またはＶａｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒチミジンキナーゼ（Ｖ
ＺＶＴＫ））。チミジンキナーゼは、抗ウイルスヌクレオシドアナログをその活
性型に代謝する際に補助し、従って、ヌクレオシドアナログ前駆体（例えば、Ａ
ＺＴまたはｄｄＣ）をそれらの活性型に活性化する際に有用である。さらにｔｋ
含有細胞はガンシクロビル（ｇａｎｃｌｏｖｉｒ）と接触させた場合に死滅する
。
【０１３１】 従って、１つの実施形態では、本発明の再指向された酵素はチミジンキナーゼ
標的になり得る、例えば、ＣＣＲ５レセプターおよび／またはＣＣＲ３レセプタ
ーを発現する細胞に対して（および従ってＨＩＶ感染に対して感受性となる傾向
にある）。これらの細胞に対するｔｋ再指向は、ＡＺＴまたはｄｄＣの前駆体を
活性型に活性化させる。
【０１３２】 別の実施形態では、ｔｋ酵素は腫瘍細胞を標的し得る（例えば、腫瘍特異的抗
原を介して）。次いで、ガンシクロビルの治療は腫瘍細胞の死を生じる。
【０１３３】 本発明の再標的された酵素を用いて活性型へと転換され得る他のプロドラッグ
の例には、５−ＦＵまたはジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）のイ
ンヒビター（ＧＷ７７６Ｃ８５）を含むが、それらに限定されない。
【０１３４】 さらに別の例は、プロドラッグホスフェニトイン（比較的溶解しやすいプロド
ラッグ）であり、これはホスファターゼによって比較的不溶性のフェニトイン（
活性な鎮痙薬に変化される。同様に、デピベフリン（ｄｅｐｉｖｅｆｒｉｎ）は
エステラーゼによって、アドレナリン作用性の、緑内障の治療において有用なエ
ピネフィリンに転換される。
【０１３５】 本発明の再標的化した酵素はまた、特にインビボの治療剤として利用される場
合、「自己防衛」のポリペプチドとして作用する。そのような実施形態では、キ
メラ分子の有機分子（例えば、標的化部分）の構成成分は、キメラ分子のエフェ
クター（酵素）成分を立体的に遮蔽しかつ保護し得る。この考えは、キメラ分子
の重要な位置の近くに付着したかさ高い基が、例えば、キメラの残りの切断部位
上での別の試薬の攻撃を妨げて、従って寿命が延びるということである。例えば
、タンパク質の糖はプロテイナーゼに対する安定性を増加させ、例えば、糖が阻
害するので、そのプロテイナーゼは好ましいアミド結合に裂け目を切断できない
（例えば、Ｒｕｄｄら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：１７−２
２を参照のこと）。特定の実施形態においては、有機分子は防御的機能だけでな
く機能性を標的化することの両方を提供する「２つの任務」を行ない得る。
【０１３６】 さらに別の実施形態においては、本発明の再標的化酵素は酵素置換治療で、特
に、蓄積症の治療において、利用され得る。蓄積病は、代謝産物を分解させる酵
素の不活性または代謝産物を創造する酵素の過度の活性のいずれかに起因して、
代謝産物（例えば、脂質、タンパク質、複雑な炭化水素）の増加した蓄積によっ
て起こる。蓄積症には、グリコーゲン蓄積病Ｉ、ＧＭ１ガングリオシドーシス（
ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ）、ＭＰＳ ＩＶ Ｂ（Ｍｏｒｑｕｉｏ Ｂ）、
ＧＭ２ガングリオシドーシス（Ｏ，Ｂ，ＡＢ，Ｂ１改変体）、ニーマン−ピック
病（Ａ，ＢおよびＣ）、異染性白質萎縮症（アリールスルファターゼＡおよびＳ
ＡＰ−１欠損）、クラッベ病、ファブリー病、ゴシェ病、ウォルマン病（コレス
トロールエステル蓄積症）、ＭＰＳＩ（ハーラーおよびシェイエ症候群）、ＭＰ
ＳＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳＩＩＩＡ，Ｃ，およびＤ（サンフィリポＡ，
ＣおよびＤ）、ＰＳＩＩＩＢ（サンフィリポＢ）、ＭＰＳＩＶ Ａ（モルキオＡ
）、ＭＰＳＶＩ（マロトー−ラミー症候群）、ＭＰＳＶＩＩ（β−グルクロニダ
ーゼ欠損）、多発性スルファターゼ欠損症、ムコリピドーシスＩ（シアリドーシ
ス）、ムコリピドシスＩＩおよびＩＩＩ、α−マンノシドーシス、β−マンノシ
ドーシス、フコース蓄積症、シアリン酸蓄積症、ガラクトシアリドーシス、アス
パチルグリコサミン尿シスチン症が含まれるがこれらに限定されない。蓄積症は
、「失われた」酵素活性を補充することによって処置され得る。
【０１３７】 例えば、ゴシェ病は脾臓細胞に指向したグルコセレブロシダーゼの使用によっ
て治療され得る。同様にスーパーオキシドジスムターゼは抗酸化剤などとして肝
臓に指向され得る。
【０１３８】 （ＩＩＩ．酵素の選択（エフェクター分子）） 事実上どの酵素も本発明のキメラ分子中で利用され得る。キメラ分子が触媒性
アンタゴニストである場合、酵素は標的化部分によって特異的に結合される基質
を分解する能力のある酵素から選択される。そのような酵素にはプロテアーゼ、
セルラーゼ、ヌクレアーゼ（エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ）、
アミラーゼ、リパーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、グリコシダーゼなどを含む
がそれらに限定されない。
【０１３９】 キメラ分子が、その活性が新しい場所および／または基質に指向される酵素で
ある場合、酵素はその基質を分解する酵素であり得るが、必ずしもそうである必
要はない。このように、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヌクレアーゼ（エクソヌク
レアーゼおよびエンドヌクレアーゼ）、アミラーゼ、リパーゼ、アルドラーゼ、
ケトラーゼ、グリコシダーゼなどに加えて、再指向された酵素もまた、例えば、
イソメラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、リガーゼ、トランスフェ
ラーゼなどの酵素を含み得る。
【０１４０】 本発明の触媒性アンタゴニスト中での使用のために好ましい酵素は、ヒドロラ
ーゼである。本発明の触媒性アンタゴニスト中での使用のために特に好ましい酵
素は、セリンヒドロラーゼである。セリンヒドロラーゼは、ヒドロラーゼの１種
であり、セリン、ヒスチジンおよびカルボキシル基の付いたアミノ酸（アスパラ
ギン酸またはグルタミン酸のいずれか）からなる触媒性の三つ組構造を有するヒ
ドロラーゼによって特徴付けられる。この酵素はカルボン酸の誘導体（エステル
、ペプチドおよびアミドを含むがそれに限定されない）の加水分解およびその微
視的な逆反応をも触媒する。
【０１４１】 本発明に含有される好ましいセリンヒドロラーゼには、トリプシン−キモトリ
プシンプロテアーゼ、サブチリシンプロテアーゼおよびα／βヒドロラーゼを含
まれる。特に好ましい実施形態では、酵素はプロテアーゼであり、より好ましく
はサブチリシンである（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｉｓのサブチリシ
ン）。サブチリシンはセリンエンドプロテアーゼ（分子量約２７，５００）であ
り、これは、広範な種々のＢａｃｉｌｌｕｓ種から大量に分泌される。サブスチ
リシンのタンパク質配列を少なくとも４つの異なるＢａｃｉｌｌｕｓ種から決定
した（例えば、Ｍａｒｋｌａｎｄら（１９７１）５６１−６０８頁、Ｔｈｅ Ｅ
ｎｚｙｍｅｓ，Ｂｏｙｅｒ Ｐ．Ｄ．編、Ａｃａｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，第ＩＩＩ巻、頁；Ｎｅｄｋｏｖら（１９８３）Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ
’ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６４：１５３７−１５４０を参照のこ
と）。サブスチリシンＢＰＮ’（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｇｏｅｆａｃｉｅｎｓ由来
）の２．５Åの分解能までの三次元結晶解析構造もまた報告されている（Ｗｒｉ
ｇｈｔら（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ ２２１、２３５−２４２；Ｄｒｅｎｔｈら
（１９７２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：１７７−１８１）。これらの
研究は、サブスチリシンは遺伝的に哺乳動物のセリンプロテアーゼには関係して
いないが、同様の活性部位構造を有することを示す。共有結合したペプチドイン
ヒビター（Ｒｏｂｅｒｔｕｓら（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：
２４３９−２４４９）、生成物複合体（Ｒｏｂｅｒｔｕｓら（１９７２）Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：４２９３−４３０３）および遷移状態アナログ（Ｍ
ａｔｔｈｅｗｓら（１９７５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：７１２０−７
１２６；Ｐｏｕｌｏｓら（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１、１０９
７−１１０３）を含有する、報告されたサブスチリシンのＸ線結晶構造はまた、
サブスチリシンの活性部位および推定の基質結合裂溝（ｃｌｅｆｔ）に関しての
情報を提供してきた。さらに、サブスチリシンの２２２番目のメチオニンの側鎖
が過酸化水素によってメチオニンスルホキシドに転換されたという少なくとも１
つの報告（Ｓｔａｕｆｆｅｒら（１９６５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：
５３３３−５３３８）と同様に、サブスチリシンに関する多数の反応速度論的研
究および化学修飾的研究が報告されてきた（Ｐｈｉｌｉｐｐら（１９８３）Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１：５−３２；Ｓｖｅｎｄｓｅｎ（１９７６
）Ｃａｒｌｓｂｅｒａ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．４１：２３７−２９１；Ｍａｒｋｌ
ａｎｄ，同書）。
【０１４２】 本発明における他の特に好ましいヒドロラーゼの使用は、α／βヒドロラーゼ
、セリンヒドロラーゼ酵素のトリプシン／キモトリプシンファミリー、アスパル
チルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、リゾチーム
、および他のグリコシダーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】 （ＩＶ．キメラ分子の構築） 好ましい実施形態において、キメラの触媒性アンタゴニストおよび／または本
発明の再指向された酵素は、所望の酵素を化学的に標的化部分に結合体化するこ
とによって（直接的にまたはリンカーを介して）作製した。化学的に結合体化し
たキメラ分子を調製するための多数の方法が知られているが（例えば、欧州特許
出願番号１８８、２５６号；米国特許第４，６７１，９５８；同第４，６５９，
８３９号；同第４，４１４，１４８号；同第４，６９９，７８４号；同第４，６
８０，３３８号；同第４，５６９，７８９号；同第４，５８９，０７１号；同第
４，５４５，９８５号；および同第４，８９４，４４３号；Ｂｏｒｌｉｎｇｈａ
ｕｓら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：４０７１−４０７５；Ｔｈｏ
ｒｐｅら（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ
Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｉｍｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｇｉｃ Ｂｕｌｌｅｔ，Ｔ
ｈｏｒｐｅら（１９８２）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１６
８−１９０頁；Ｗａｌｄｍａｎｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５
７などを参照のこと）、好ましい実施形態において、酵素を含有するアミノ酸残
基上の利用可能なＲ基（例えば、ＮＨ2、Ｎ、ＮＨ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＨなど
）と反応し得る反応基を用いて、標的化部分を誘導体化／機能化した。特に好ま
しい実施形態において、標的化部分は、メタンチオスルホネート試薬として誘導
体化され、これは、次いで、システインのＳＨ基と反応して、システイン上のチ
オール水素の代わりにカップリングされた標的化部分を提供し得る。連結は直接
的にまたはリンカー介してであり得る。
【０１４４】 特定の実施形態において、標的化部分が付着するシステインは、酵素中のネイ
ティブなシステインであるが、しかし、より好ましい実施形態では、このシステ
インは、酵素中で異なるネイティブなアミノ酸残基の代わりに置換されたシステ
インである。このように修飾された酵素は、必要に応じて、変異体酵素といわれ
る。標的化部分が化学的に変異体酵素にカップリングされた本発明のキメラ分子
は、必要に応じて、化学的修飾変異体（ＣＭＭ）といわれる。
【０１４５】 代表的には、一旦連結されるべき標的化部分と酵素が選択されると、例えば、
上記のように、標的化部分の付着のための酵素の中の位置（残基）が同定される
。この残基がすでにシステインではないところでは、システインはネイティブな
残基と置換される。標的化部分またはそこに付着するリンカーは、メタンチオス
ルホメートとして誘導体化され、これは、次いで、本明細書中に記載されるよう
に、システインのＳＨ基と反応し得る。変異体酵素の調製および標的化部分のカ
ップリングについての詳細なプロトコールは、以下および実施例中に提供された
。
【０１４６】 （Ａ）化学修飾変異体酵素の生成） （１）修飾残基の選択） 概して、修飾が対象酵素の活性の望ましいレベルを保持している限り、酵素の
事実上どの残基も、標的化部分を誘導するための突然変異誘発（例えば、システ
インの置換）および化学修飾のために選択され得る。代表的には、このことは、
決定的な基質相互作用をブロックしないかまたは対象酵素のフォールディング／
コンホメーションを劇的に変化させない位置での置換を行なうことによって達成
される。
【０１４７】 標的化部分の導入のための適当な部位は、置換システイン、そして必要に応じ
て、付着した標的化部分、および所望の活性の酵素をアッセイすることによって
決定され得る。コンビナトリアル化学および高処理能力スクリーニングシステム
における現在の進歩によって、そのような修飾およびスクリーニングは、単なる
慣用的な実験によって達成され得る。
【０１４８】 しかしより好ましい実施形態では、酵素中（例えば、セリンヒドロラーゼ）の
修飾／置換のための残基は合理的に選択される。好ましい部位は、酵素のサブ部
位から離れて配置した領域および部位を決定する、重要なコンホメーションには
ない、部位を含む。しかし、他の好ましい実施形態において、特に基質特異性お
よび／または活性を強化するかまたはさもなくば変化させることが望まれる場合
、修飾のために選択された好ましいアミノ酸残基は、酵素の基質結合領域の近く
またはその中の重要な差別的部位であることが予想される残基を含む。そのよう
な残基は、サブ部位残基が系統的に変異誘発され、そしてそのような変異誘発の
結合特異性および／または酵素活性に対する効果が決定される、変異誘発実験か
ら決定される。さらに、酵素単独、または基質、基質複合体、もしくはインヒビ
ターとの複合体中での結晶構造の調査から、および／あるいは予測されるタンパ
ク質の折りたたみまたは、タンパク質モデリングソフトウェア（例えば、Ｑｕａ
ｎｔａ，Ｃｅｒｉｕｓ，Ｉｎｓｉｇｈｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔ
ｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）およびＦｒｏｄｏ（ａｃａｄｅｍｉｃ ｓｏｆｔｗｅｒｅ
））を用いて決定したタンパク質−タンパク質相互作用から、重要な残基を同定
し得る。ＢｅｒｇｅｒおよびＳｃｈｅｃｈｔｅｒによって定義されたサブ部位で
の相互作用を変化させるように配置された側鎖は、酵素の結晶学的モデルに基づ
いて選択され得、必要であれば、特定の酵素の構造の情報が入手できない場合に
、相同な酵素が外挿され得る。Ｂ．ｌｅｎｔｕｓのサブチリシンにおいて、部位
６２、部位１５６、部位１６６、部位２１７、および部位２２２は重要な基質特
異性を決定する部位である。さらなる関連部位は、サブチリシンの位置９６，位
置１０４、位置１０７、位置１８９、および位置２０９部分を含み、関連酵素で
の相同位置を含む。好ましい実施形態において、特定の場合において、他のサブ
部位の残基の変化はまた劇的な効果を生じ得ることが理解されるが、このような
残基は、代表的には、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ４、Ｓ１’、Ｓ２’、またはＳ３’サブ部
位に存在する。
【０１４９】 １つの特に好ましい実施形態において、そこではセリンヒドロラーゼはサブチ
リシン型セリンヒドロラーゼであり、変異のために好ましい残基は、Ｓ１サブ部
位の残基１５６および残基１６６、Ｓ１’サブ部位の残基２１７および残基２２
２、Ｓ２サブ部位の残基６２、ならびに、Ｌｅｕ９６、Ｖａｌ１０４、Ｉｌｅ１
０７、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２０９または他のサブチリシン型セリンプロテナー
ゼの相同位置またはその近傍の残基（好ましくはサブ部位中の位置）を含むがこ
れらに限定されない。
【０１５０】 他の好ましい実施形態としては、そこではセリンヒドロラーゼはトリプシン−
キモトリプシン型セリンヒドロラーゼであり、変異に好まれる残基は、トリプシ
ン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ Ｅｎｔｒｙ １ＴＰＰ）のチロシン９
４、ロイシン９９、グルタミン１７５、アスパラギン１８９、セリン１９０、グ
ルタミン１９２、ロイシン１１１、フェニルアラニン１７５、チロシン１７６、
セリン１８２、ロイシン１８４、フェニルアラニン１８９、チロシン２１４、ア
スパラギン酸２３１、リシン２３４、およびイソロイシン２４３、または他のキ
モトリプシン型（トリプシン−キモトリプシン型）セリンプロテナーゼの相同部
位またはその近くの残基（好ましくはサブ部位中の部位）、を含むがそれらに限
定されない。
【０１５１】 さらに別の好ましい実施形態において、そこではセリンヒドロラーゼがα／β
セリンヒドロラーゼであり、変異のために好ましい残基は、次の残基またはその
近くを含むがそれに限定されない：トリプシン１０４、スレオニン１３４、ロイ
シン１４４、バリン１５４、イソロイシン１８９、アラニン２２５、ロイシン２
７８およびイソロイシン１８５、ここでこれらはＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｉ
ｃａリパーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ Ｅｎｔｒｙ １ｔｃａ）の
残基またはα／β型セリンヒドロラーゼの相同位置（好ましくは、サブ部位中の
位置）の残基である。
【０１５２】 好ましくは、システインによって置換された酵素中のアミノ酸はアスパラギン
、ロイシン、メチオニン、またはセリンから成る群より選択される。より好まし
くは、置換されるアミノ酸は、酵素のサブ部位（好ましくは、Ｓ１，Ｓ１’また
はＳ２サブ部位）にまたはその近くに存在する。より好ましくは、サブチリシン
中の置換されるアミノ酸は、Ｎ６２、Ｌ２１７、Ｍ２２２、Ｓ１５６、Ｓ１６６
、部位１０４、部位１０７（Ｓ４）、部位９６（Ｓ２）、部位１８９（Ｓ２’）
および部位２０９（Ｓ１’／Ｓ３’）またはそれらのホモログであり、ここで数
字のついた位置は、Ｂａｃｉｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓから
天然に生じるサブチリシンに、または例えばＢａｃｉｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓのサ
ブチリシンのような他のサブチリシンの等価なアミノ酸残基に対応する。
【０１５３】 本発明のキメラ分子は、セリンヒドロラーゼに限られるものではない。特に好
ましい実施形態では、他の酵素に加えて、本発明は他のキメラプロテナーゼを含
む。そのようなプロテナーゼはアスパチルプロテナーゼ、システインプロテナー
ゼ、メタロプロテナーゼなどを含むが、それらに制限されない。
【０１５４】 プロテアーゼが、例えば、ペプシンなどのアスパチルプロテナーゼであるとき
は、好ましい残基は、次の残基またはその残基の近くに相当するアミノ酸（例え
ば、相同する部位で）を含むがそれに限定されない。チロシン９、メチオニン１
２、グルタミン１３、グリシン７６、スレオニン７７、フェニルアラニン１１１
、フェニルアラニン１１７、セリン１２７、イソロイシン１２８、セリン１３０
、チロシン１８９、イソロイシン２１３、グルタミン酸２３９、メチオニン２４
５、グルタミン２８７、メチオニン２８９、アスパラギン２９０、ロイシン２９
１、およびグルタミン酸２９４。ここではこれらの「参照」の残基は成熟したヒ
トのペプシンの残基である（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｅｎｔｒｙ
１ＰＳＮ）。
【０１５５】 プロテアーゼが、システインプロテナーゼであるときは、変異に好ましい残基
は、次の残基または近くの残基に相当するアミノ酸（例えば、相同する部位で）
を含むがそれに限定されない。アスパラギン１８、セリン２１、アスパラギン６
４、チロシン６７、トリプシン６９、グルタミン１１２、グルタミン１４２、ア
スパラギン酸１５８、トリプシン１７７およびフェニルアラニン２０７。ここで
は、これらの参照残基は成熟したパパインの残基である（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａ
ｔａ Ｂａｎｋ ｅｎｔｒｙ １ＢＱＩ）。
【０１５６】 プロテアーゼが、メタロプロテナーゼであるときは、変異に好ましい残基は、
次の残基または近くの残基に相当するアミノ酸（例えば、相同する部位で）を含
むがそれに限定されない。ロイシン１１１、フェニルアラニン１７５、チロシン
１７６、セリン１８２、ロイシン１８４、フェニルアラニン１８９、チロシン２
１４、アスパラギン酸２３１、リシン２３４およびイソロイシン２４３。ここで
はこれらの「参照」の残基は成熟したヒト基質メタロプロテナーゼの残基である
（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｅｎｔｒｙ ８３０Ｃ）。
【０１５７】 （２）システインの導入） 酵素（例えば、セリンヒドロラーゼ）の１以上の本来の残基をシステインと交
換することは、当業者に周知の慣用的な方法を用いて、なされ得る。１つの好ま
しい実施形態では、本明細書中に記載される変異体は、目的の野生型の酵素をコ
ードするＤＮＡの部位特異的変異誘発によって最も効率的に調製された（例えば
、Ｂａｔｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｉｓサブチリシン）。部位特異的変異誘発または
非ランダム変異誘発は、当業者に公知である。そのような方法は、アラニンスキ
ャニング変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２４４，１０８１−１０８５）、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発（
Ａｄｅｌｌｍａｎら、１９８３、ＤＮＡ、２，１８３）、カセット変異誘発（Ｗ
ｅｌｌｅｓら、１９８５、Ｇｅｎｅ，３４４：３１５）および結合変異誘発（Ｌ
ａｎｄｎｅｒら、ＷＯ ８８／０６６３０）を含むがそれに限定されない。
【０１５８】 本発明の１つの実施形態では、置換したアミノ酸残基（例えば、システイン）
を、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発によ
って、選択した位置へ導入した。このアプローチでは、所望のネイティブな酵素
（例えば、サブチリシン）をコードした遺伝子は適切なプラスミドによって運搬
される。さらに好ましくは、プラスミドは発現ベクターである（例えば、ｐＢＲ
、ｐＵＣ、ｐＵＢ、ｐＥＴ、ｐＨＹ４のシリーズからのプラスミド）。プラスミ
ドは当業者によって、利便性のためまたは所望通りに選択され得る。
【０１５９】 部位特異的変異誘発のために、選択した変異部位を含むフラグメントを制限エ
ンドヌクレアーゼによって対象酵素をコードした遺伝子から切断して、修飾ＰＣ
Ｒ法における鋳型として使用する（Ｈｉｇｕｃｔｉら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１６，７３５１−７３６７を参照のこと）。各標的置
換のために所望の変異を含むオリゴヌクレオチドを、５’および３’ＰＣＲ隣接
プライマー間の鎖伸長を開始するために、ミスマッチプライマーとして使用した
。この方法は２つのＰＣＲ反応を含んでいる。最初のＰＣＲでは所望の塩基置換
を含むＤＮＡフラグメントを生成するために、ミスマッチプライマーおよび５’
プライマーを使用した。このフラグメントを電気泳動によって、プライマーから
分離した。精製後、所望の塩基置換を含む完全なＤＮＡ画分を生成するために、
新しい５’プライマーとして、２回目のＰＣＲで、３’プライマーと一緒に使用
した。変異を配列決定によって確認した後、次いで、変異フラグメントをもとも
とのフラグメントの位置に挿入して戻した。
【０１６０】 別のアプローチにおいて、カセット変異誘発が、本発明のシステイン変異の構
築および確認を容易にするために使用され得る。まず、セリンヒドロラーゼをコ
ードした遺伝子を獲得し、全体または一部を配列決定した。次いで、発現された
酵素での１以上のアミノ酸の変異を作製することが望まれしい点を同定する。遺
伝子の短いセグメントを、発現される場合に所望の変異をコードするオリゴヌク
レオチドと置換するための制限部位の存在のために、これらの点に隣接する配列
を評価する。そのような制限部位は、好ましくはセリンヒドロラーゼ遺伝子中に
ある、遺伝子断片の置換を容易にするための独特な部位である。しかし、制限消
化によって生成した遺伝子フラグメントは適切な配列で再び組み立てられ得るな
らば、ヒドロラーゼ遺伝子において過度に重複しない任意の便利な制限部分が用
いられ得る。もし制限部位が選択された点から便利な距離内の位置に存在しない
場合（例えば、１０〜１５ヌクレオチド）、そのような部位は、最終構築で読み
枠およびコードアミノ酸のどちらも変化しないようなやり方で、遺伝子のヌクレ
オチドを置換することによって生成される。適切な隣接領域の位置を決定するこ
と、および２つの便利な制限部位配列に到達するための必要な変化を評価する仕
事は、余剰な遺伝子コード、遺伝子の制限酵素地図および多くの異なる制限酵素
によって、慣用的に行なわれる。もし便利な隣接制限部位が利用可能である場合
、上記の方法は、部位を含んでいない隣接領域と関連においてのみ、使用される
必要がある。
【０１６１】 所望の配列に一致させるためにその配列を変化させるために、遺伝子の変異を
行なった。例えば、一般的に周知の方法に従って、Ｍ１３プライマー伸長をおこ
なった。一旦遺伝子がクローニングされると、変異される配列に隣接する制限部
位を同種の制限酵素で消化し、エンド終末相補性オリゴヌクレオチドカセットを
遺伝子に連結した。突然変異生成は、この方法によって大いに単純化された。な
ぜなら、全てのオリゴヌクレオチドは同じ制限部位を有するように合成され得る
こと、および制限部分を作製するのにどの合成リンカーも必要がないからである
。
【０１６２】 適当なＤＮＡ配列コンピューター検索プログラムは、潜在的な５’および３’
の便利な隣接部位を発見する仕事を単純化する。より望ましい実施形態において
、制限部位の作製において導入されるどの変異でも最終構造のアミノ酸コード配
列に対して、影響がない（ｓｉｌｅｎｔ）。標的コドンの５’側の制限部位の候
補としては、配列は、好ましくは、候補酵素の切断の５’側の認識配列の１つを
除く、少なくとも全てのヌクレオチドを含む遺伝子の中に存在する。例えば、平
滑切断の酵素ＳｍａＩ（ＣＣＣ／ＧＧＧ）は、もし近くの５’側配列がＮＣＣ、
ＣＮＣまたはＣＣＮを含んでいれば、良好な５’側候補となる。さらに、もしＮ
がＣに代えられる必要がある場合、この変化は好ましくは、アミノ酸配列をイン
タクトに保つ。制限部分を導入するのに、永続的にサイレントな変異が必要な場
合において、滅多に使用されないコドンの導入は避けたほうが良い。同様の状況
のＳｍａＩが、ＮＧＧ、ＧＮＧまたはＧＧＮ配列が存在しなければならないとい
う点を除き、３’側側面部位に適用し得る。候補酵素の位置決定のための判断基
準は、平滑切断の酵素で最も緩く、４塩基突出酵素は最も厳しい。概して、多く
の候補部位が手に入る。
【０１６３】 特に好ましい、目的酵素にシステイン変異を導入する方法は、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｌｅｎｔｕｓ（ＳＢＬ）のサブチリシン遺伝子に関して例示されている。好
ましい実施形態では、ＳＢＬ遺伝子を変異誘発（例えば、米国特許５，１８５，
２５８号を参照のこと）のためにバクテリオファージベクター（例えば、Ｍ１３
ｍｐ１９ベクター）にクローニングした。オリゴヌクレオチド指向変異誘発をＺ
ｏｌｌｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１００：４６８−５０
０に記載された方法に従って行なった。変異配列を、次いでクローニングし、切
断し、そして、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ宿主の発現プラスミド（例えば、プラスミ
ドＧＧ２７４）に再導入した。ＰＥＧ（５０％）を安定剤として加えた。
【０１６４】 このように得られた粗タンパク質濃縮物を、小さい分子量のコンタミナントを
除去するために、ｐＨ ５．２緩衝液（例えば、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、５
ｍＭ ＣａＣｌ2）を用いてＳｅｐｈａｄｅｘTMＧ−２５ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ
ｍａｔｒｉｘを通して純化した。ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎからの集
めた画分を次いで、上に記載の酢酸ナトリウム緩衝液中の強陽イオン交換コラム
（例えば、ＳＰ ＳｅｐｈａｒｏｓｅTMＦＦ）にアプライし、ＳＢＬをもう１段
階の勾配０−２００ｍＭ 塩化ナトリウム酢酸緩衝液ｐＨ ５．２で溶解した。
塩を含まない酵素粉末を、次の溶解液のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ純水に対する透析お
よび後に凍結乾燥して得た。
【０１６５】 変異型および野生型酵素の純度は、０℃、３０分間、０．１Ｍ ＨＣｌでイン
キュベートすることによって変性させ、均一ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確
かめた（例えば、ＰｈａｓｔTMｓｙｓｔｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａ
ｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。ＳＢＬの濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２：２４８−２５４に基づいたＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅ
ｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）色素試薬キットを用いて決定した。酵素の比活性を以下お
よび実施例中に記載されたように決定した。当業者は、必要であれば、上記のプ
ロトコルを他の酵素との使用のために慣用的に修飾し得ることを理解する。部位
特異的なタンパク質修飾の他のプロトコルは当事者に周知であり、例えば、米国
特許第５，９３２，４１９号および同第５，７８９，１６６号；同第５，７０５
，４７９号；同第５，６３５，４７５号；同第５，５５６，７４７号；同第５，
３５４，６７０号；同第５，３５２，７７９号；同第５，２８４，７６０号およ
び同第５，０７１，７４３号に記載されている。
【０１６６】 さらに、部位特異的変異誘発のためのキットは市販されている（例えば、Ｔｒ
ａｎｓｆｏｍｅｒTMＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋ
ｉｔ、Ｔｏｙｏｂｏを参照のこと）。
【０１６７】 （３）連結部分の最大活用） シトシンの導入および標的化部分のカップリングのために、多数の特に好まし
い部位が本明細書中に示される。位置は、「参照」酵素に関して示され、同じフ
ァミリー中の関連する酵素中の「相同の」部位（例えば、本明細書中に記載され
たように）が決定され得る。しかし、特定の酵素のためのカップリング部位、標
的化部分の組み合わせを最大化することが望ましくあり得る。
【０１６８】 本発明は、化学的にカップリングしたした標的化部分を利用するので、これは
、比較的簡単に、最大で慣用的な実験で達成され得る。システインは、例えば、
目的参照部位の近くの位置に、導入され、次いで、標的化部分を本明細書中で記
載したように容易に結合体化され得る。得られたキメラは次いで、望ましい活性
のために試験され得る。
【０１６９】 タンパク質全体はそれぞれの変化のために再操作する必要はない。なぜなら、
特に好ましい部位はすでに本明細書中で教示されており、比較的少数の部位がど
の特定のキメラ分子を最大化するのか検索しなければならない。
【０１７０】 （４）他の連結方法） 好ましい実施形態では、標的化部分の化学カップリングは、対象の酵素におい
て天然に存在するかまたは導入されたか（例えば、部位特異的変異誘発によって
）のいずれかで。システインに向けられたものである。しかし、本発明のキメラ
分子はシステインを通して結合した分子に制限される必要はない。特定の実施形
態において、結合は事実上どの他のアミノ酸を通してもし得る（例えば、セリン
、グリシン、チロシンなど）。結合体化は、存在するＲ基（他のカップリング化
学を用いて）を通してなされ得るか、または別のスルフヒドリル基（ＳＨ）がＲ
基および標的化部分に導入され（連結され）得、例えば、実施例に例示されたよ
うに、メタンチオスルホネート試薬とてで誘導体化された標的化部分がカップリ
ングされ得る。
【０１７１】 （５）変異酵素の発現） 好ましい実施形態では、変異酵素は宿主細胞の異種核酸より発現される。発現
された酵素は、次いで単離され、必要であれば精製する。宿主細胞および発現ベ
クターの選択はかなり酵素の選択とその供給源にかなり依存する。
【０１７２】 有用な発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの安定した統合、また
は宿主細胞のゲノムから独立して宿主細胞中でのベクターの自律的複製を可能と
する要素を含有しており、および好ましくは、形質転換した宿主細胞の容易な選
択を可能にする１以上の表現型マーカーを含んでいる。発現ベクターはまた、プ
ロモーター、リボソーム結合部分、翻訳開始シグナル、および必要に応じて、リ
プレッサー遺伝子、選択マーカーまたは種々のアクチベーター遺伝子コードする
制御配列を含み得る。発現されたタンパク質の分泌を可能にするため、シグナル
配列を含んだヌクレオチドが遺伝子のコード配列の前に挿入され得る。コントロ
ール配列の向きでの発現のために、本発明に従って、使用される変異酵素をコー
ドする遺伝子またはｃＤＮＡを、適切な読み枠のコントロール配列に作動可能な
ように連結した。
【０１７３】 部位特異的変異誘発によって得た変異遺伝子を含むベクターは、次いで、それ
ぞれ適当な宿主細胞を形質転換し、発現するために使用した。適当な宿主細胞は
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓのような細菌、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅのようなイースト菌、マウス線維芽細胞のような哺乳動物細胞または昆
虫細胞を含む。好ましくは、細菌の発現系を用いる。最も好ましくは、宿主はＢ
ａｃｉｌｌｕｓである。タンパク質の発現は、外来プラスミドの高レベル発現の
ために好ましい条件下で形質転換宿主細胞を培養するために、選択した宿主細胞
および発現ベクターなどの要因に従って、当業者に周知の方法で行なう。
【０１７４】 ペプチドのクローニングおよび発現の方法は当業者に周知である。例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ（第２版、１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，１
９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２：Ｇｕ
ｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，またはＡｕｓｕ
ｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌ
ｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１７５】 上に示されたように、１つの特定の好ましい発現系は、プラスミドＧＧ２７４
であり、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ宿主中で発現される。
【０１７６】 （Ｂ）標的化部分の酵素への結合） （１）変異残基の修飾のための置換基の選択） 広範囲の標的化部分はシトシンに連結され、対象の酵素（例えば、セリンヒド
ロラーゼ）に導入され得る。上に示されたように、標的化部分は酵素の望ましい
使用に依存して選択される。さらに上に示されたように、適当な標的化部分は、
レセプターによって結合された部分、抗体および酵素によって結合された標的化
部分、レクチンによって結合された標的化部分、および種々の他の標的化部分を
含むがそれに限定されない。特定の特に好ましい実施形態では、標的化部分は特
異的にレセプターおよび／または酵素によって結合される薬剤およびプロドラッ
グである。
【０１７７】 （２）標的化部分のシステインへの結合） システインのＲ基は便利な比較的反応性のあるチオール基（−ＳＨ）を提供し
、望ましい標的化部分をシステインに連結させるのに利用される。より好ましい
実施形態では、目的の標的化部分が提供され、メタンチオスルホネート試薬とし
て誘導体化される。それはシステインと反応すると、ジスルフィド結合（−Ｓ−
Ｓ−）によってシステインに共有結合される目的の置換基を生じる。
【０１７８】 好ましい実施形態では、メタンチオスルホネート試薬を用いた化学修飾は、Ｂ
ｅｒｇｌｕｎｄら（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：５２６
５−５２５５およびＤｅＳａｎｔｉｓら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，３７：５９６８−５９７３によって記載されたように行なわれる。手短には、
メタンチオスルホネート（ＭＴＳ）試薬の１Ｍ溶液を２００μＬの、７０ｍＭ
ＣＨＥＳ，５ｍＭ ＭＥＳ，２ｍＭ ＣａＣｌ2，ｐＨ ９．５中のシステイン
変異体溶液（５−１０ ｍｇ／ｍＬ，３．５ｍＬ）に加えた。ＭＴＳ試薬は３０
分間にわたって２分割して加えた。反応溶液は２０℃で、上下逆にして連続的に
混合した。反応は次の比活性（例えば、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを用いて）に
よって、または無残渣チオールの試験（例えば、Ｅｌｌｍａｎ試薬）によってモ
ニターした。一旦反応が完了すると、反応液は、５ｍＭ ＭＥＳおよび２ｍＭ
ＣａＣｌ2，ｐＨ ６．５を用いて、ＳｅｐｈａｄｅｘTMＰＤ−１０ Ｇ２５カ
ラムにローディングした。タンパク質画分を次いで、１ｍＭ ＣａＣｌ2に対し
て透析し、透析液を透析乾燥した。特に好ましい実施形態では、この画分はｐＨ
６．５ ＭＥＳに対して透析され、次いで、瞬時に凍結を行う。
【０１７９】 特定の例では、システインに結合される標的化部分が反応基を負っているとこ
ろでは、反応基は、結合の間、望まない反応を避けるために、適当な阻害／保護
基で誘導体化され得る。同様に、セリンヒドロラーゼが１以上の誘導体化されて
いないシステインを含むときは、システインは他のアミノ酸（例えば、突然変異
生成を標的とした部分を通って）と置換され、そして／またはこれらのシステイ
ンのチオール基は適当な保護基で誘導される（例えば、ベンジル、トリチル、ｔ
ｅｒｔ−ブチル、ＭＯＭ、アセチル、チオカルボネート、チオカルバメートおよ
びその他の基）。阻害／保護基の使用は当業者にとって周知である（例えば、Ｐ
ｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ
第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，１９９９
，４５４−４９３頁を参照のこと）。
【０１８０】 特に好ましい実施形態では、システインは酵素に導入／置換されるが、ある実
施形態では、他のアミノ酸（例えば、リシン、ヒスチジンなど）が導入され得、
そしてある実施形態では、標的化部分はこれらの残基に結合し得る。
【０１８１】 多くの標的化部分の誘導体化およびそれらの変異体酵素への結合は、本明細書
中に提供される実施例によって例示される。
【０１８２】 （Ｃ）望ましい活性のための化学的にキメラな分子のスクリーニング） 本発明のキメラ分子は典型的に、活性や目的の活性についてスクリーニングさ
れる。目的の活性は、キメラ分子の望ましい使用に依存する。従って、例えば、
本発明の触媒性アンタゴニストの場合では、キメラ分子は２つの機能でアッセイ
される：１）標的の活性を減少させるかまたは除去する能力（例えば、標的が生
物学的に活性な場合）、または、単純に部分的にまたは完全に標的を分解する能
力（例えば、標的が生物学的に活性でない場合）；および２）標的が分解された
後、標的から放出され、他の標的を分解する能力。あるいは、キメラ分子は、単
に活性（例えば、分解を行なう能力）について、化学量論以下の様式でアッセイ
され得る。
【０１８３】 特定のアッセイの詳細は、キメラ分子の標的によって変化する。種々の分子（
例えば、タンパク質、炭水化物、核酸など）の分解および／または種々のレセプ
ターおよび／または抗体の阻害のための多くのアッセイが当業者に周知である。
例えば、ある実施形態では、細胞表面レセプター上の分子活性は、レセプターを
発現する細胞を提供する工程、およびキメラ分子の存在下または非存在下でレセ
プターの活性をを測定することによって決定され得る。レセプターアッセイは、
一般的に、対象のレセプターをコードするＲＮＡを組み込んだ卵母細胞（例えば
、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）で行われる。レセプター活性は電子化学的
活性の測定（例えば、パッチクランプを通してなど）、レセプター基質の取りこ
み、などによってモニターされる。そのような方法は当業者に周知であり、例え
ば、Ｒａｃｋｅら（１９９３）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３３３（１，２）：
１３２−１３６に詳細に記載されている。リガンド結合、酵素活性の変化などに
ついてのアッセイもまた、当業者に周知である。さらに、多くの適切なアッセイ
が実施例に提供されている。
【０１８４】 （Ｖ．触媒性アンタゴニストおよび／または再方向付け（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅ
ｄ）酵素の例示的な用途） 前述の考察から、本発明のキメラ分子の多数の適用／用途が当業者に明らかで
ある。さらに、多数の特定の実施形態および適用が、標的化部分の考察において
記載される。しかし、さらに例示するために、多数の特定の特に好ましい実施形
態を以下で考察する。
【０１８５】 （（Ａ）標的化された破壊に基づく治療剤） 上記に示すように、本発明の触媒性アンタゴニストは、広範な数の病理におい
て治療剤として用いられ得る。このような触媒性アンタゴニストとしては、以下
が挙げられるがこれらに限定されない：ウイルスの感染および／または複製のイ
ンヒビター、細菌の感染および／またはバイオフィルム形成のインヒビター、免
疫応答のモジュレーター、自己免疫応答のモジュレーター、炎症応答のインヒビ
ターなど。より一般的に、上記に示すように、本発明の触媒性アンタゴニストを
用いて、薬剤がレセプターを阻害および／または拮抗することによって作用する
場合、既存の薬剤を置換し得る。
【０１８６】 上記では、広範な種々の薬剤が、レセプターまたはレセプター媒介活性のアン
タゴニストとして作用することが説明された。これらの薬剤は代表的に、特定の
レセプターおよび／または酵素を特異的に結合する。本発明の触媒性アンタゴニ
ストにおける、このような薬剤の、標的化部分としての使用は、これらが、標的
のレセプターおよび／または酵素を分解する酵素（例えば、セリンヒドロラーゼ
）に付着している場合、薬物を本質的に触媒性にする。従って、化学量論様式で
作用する（単一の薬物分子が単一のレセプターをブロック／拮抗する）代わりに
、触媒性アンタゴニストへと変換された場合、新たな薬物は、化学量論以下の様
式（ｓｕｂｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｉｃ ｍａｎｎｅｒ）で作用する（単一の分
子が、本質的に無限の数のレセプターを拮抗し得る）。さらに、薬物単独（ここ
で、このレセプターはしばしば、薬物が遊離された場合に活性を回復する）とは
対照的に、本発明の触媒性アンタゴニストによって結合されたレセプターは、分
解される（それゆえ、この触媒性アンタゴニストを遊離して別のレセプターへと
作用させる）。このレセプターは分解されるので、このレセプターはその活性を
回復しない。従って、この触媒性アンタゴニストは、より低い投与量でさらに高
い効力を提供し、そして特定の投与量で、より長期に持続する活性を提供すると
期待される。
【０１８７】 従って、１つの実施形態では、本発明は、薬物の活性を改善する方法を提供す
る。この方法は、薬物が結合する標的（例えば、レセプター）を分解し得る酵素
へとこの薬物を付着させる工程を含む。この状況において好ましい酵素としては
、ヒドロラーゼが挙げられ、さらにより好ましくは、プロテアーゼ（例えば、セ
リンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルチ
ルプロテアーゼなど）が挙げられる。
【０１８８】 しかし、標的化部分は薬物に制限される必要はないことが上記で説明された。
広範な種々の他の標的化部分もまた適切であり、そして広範な種々の治療状況に
おいて有用な触媒性アンタゴニストを提供する。従って、例えば、１つの実施形
態では、標的化部分は、通常、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）に見出される、ＣＣ
Ｒ５レセプターおよび／またはＣＸＣＲ２レセプターに特異的に結合する分子で
あり得る。ＣＣＲ５レセプターおよびＣＸＣＲ２レセプターはＨＩＶによる細胞
の感染に関与し、そしてこれらのレセプターのうちの１以上が欠損したヒトは代
表的に、ＨＩＶ感染に対する耐性を示す。例えば、適切なヒドロラーゼ（例えば
、サブチリシン）に付着されたＣＣＲ５特異的標的化剤および／またはＣＸＣＲ
２特異的標的化剤を含む触媒性アンタゴニストによる、これらのレセプターのう
ちのいずれかまたは両方の標的化された破壊／阻害は、ＨＩＶ感染に対する標的
細胞の耐性を増加させる。
【０１８９】 別の実施形態では、Ｎ結合型タンパク質グリコシル化に関与するグリコシダー
ゼは、適切なヒドロラーゼ（例えば、サブチリシン、ペプシンなど）に付着され
て（例えば、Ａｚａ−糖標的化部分を用いて）特異的に標的化され得る。このよ
うな触媒性アンタゴニストは、ＨＩＶ、ヘルペス、他のウイルス、および種々の
癌の処置において有用なものである。
【０１９０】 適切なヒドロラーゼ（例えば、サブチリシン、ペプシンなど）に付着された糖
標的化部分を含む触媒性アンタゴニストは、広範な種々の状態（炎症応答（例え
ば、関節炎、敗血症性ショック、心筋梗塞などに関連する）、細胞に対する細菌
結合およびその後の感染（例えば、潰瘍に関連するＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染）を含
む）の処置において有用である。標的化部分がＧａｌα（１，４）Ｇａｌである
場合、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ感染がブロックされ得る。さらに、レクチン指向性触
媒性アンタゴニストを用いて、バイオフィルム形成をインビボまたはエキソビボ
で阻害し得る。
【０１９１】 なお別の実施形態では、標的化部分は、シアル酸糖（または模倣物（例えば、
Ｒｉｌｅｎｚａ（Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ））など）であり得る。適切な
ヒドロラーゼ（例えば、サブチリシン）に付着された場合、触媒性アンタゴニス
トは、ウイルス（例えば、インフルエンザ）のシアリダーゼ活性を特異的に標的
化し得る。
【０１９２】 本発明のキメラ触媒性アンタゴニストをまた用いて、過剰増殖性細胞および／
または侵襲性細胞（例えば、転移細胞）を特異的に標的化し得る。種々の酵素（
例えば、特に、マトリックスメタロプロテアーゼ）は、侵襲性細胞において非常
に活性が高いことが公知である。これらの酵素は、多数の標的化部分（例えば、
クラウンエーテル）を用いて特異的に標的化され得る。適切なヒドロラーゼ（例
えば、サブチリシン）に付着された場合、触媒性アンタゴニストは、標的酵素（
例えば、メタロプロテアーゼ）を分解し、それにより、細胞が、例えば、基底膜
を侵襲する能力を妨害または除去し、それによって癌の進行を遅くする。
【０１９３】 本発明の触媒性アンタゴニストをまた用いて、種々の免疫プロセスを標的化お
よび変更し得る。従って、例えば、異種移植由来のＭＨＣ複合体を用いることに
よって、例えば、Ｔ細胞レセプターに指向された標的を用いて、その抗原に対し
て指向された免疫応答を開始する免疫細胞を阻害することが可能である。関連の
実施形態では、α−Ｇａｌエピトープ二糖（Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌ）を標的
化部分として用い得、そして（例えば、サブチリシンに付着された場合）α−Ｇ
ａｌエピトープ特異的抗体に結合してこの抗体を特異的に阻害し、それによって
異種移植片の宿主拒絶を緩和し得る。同様に、公知のアレルゲン（例えば、種々
の花粉またはこのようなアレルゲンに存在するエピトープ）は、標的に対する標
的化部分として用いられ得、このような抗原を特異的に認識するＴ細胞および／
または抗体を阻害し得る。このことは、このようなアレルゲンに対するアレルギ
ー反応を緩和する。
【０１９４】 （（Ｂ）薬物送達ストラテジー） 上記で示したように、キメラ分子は、種々の薬物送達ストラテジーにおいて用
いられて、治療的活性を目的の細胞、器官または組織に特異的に標的化し得る。
特定の実施形態では、上記のように、プロドラッグをそれらの活性な形態へと変
換し得る酵素は、これらの酵素を所望の活性部位（例えば、腫瘍細胞）へと局在
させる標的化部分（例えば、腫瘍細胞特異的部分）へと付着され、種々のプロド
ラッグが当業者に公知であり、そしてこれらとしては以下が挙げられるがこれら
に限定されない：チミジンキナーゼによって活性化されるガンシクロビル、ホス
ファターゼによってフェニトインへと変換されるホスフェニトイン（ｐｈｏｓｐ
ｈｅｎｙｔｏｉｎ）、エステラーゼによってエピネフリンへと変換されるデピベ
フリン（ｄｅｐｉｖｅｆｒｉｎ）など。
【０１９５】 別の例の「薬物送達」ストラテジーは、存在しない、代表的には内因性活性を
補充する活性を有する酵素を送達するために標的化キメラ分子を使用する。従っ
て、例えば、グルコセレブロシダーゼが、ゴシェ病またはテイ−サックス病の処
置において例えば、脾細胞に対して指向され得る。同様に、スーパーオキシドジ
スムターゼは、肝組織へと標的化されてそこで抗酸化活性を提供し得るように、
肝細胞特異的標的化部分へと付着され得る。
【０１９６】 （（Ｃ）他の実施形態） 他の特に好ましい実施形態では、本発明のキメラ分子を用いて、予め選択した
特定の分子を、その分子が生物学的活性を有そうが有さまいが、標的化および破
壊し得る。従って、例えば、種々の土壌またはよごれ（ｓｔａｉｎ）の成分（例
えば、乳汁、血液、卵、ガラスよごれ、油よごれなど）が特異的に標的化され得
る。例えば、アビジン／卵タンパク質は、例えば、その部位へとプロテアーゼを
特異的に指向させるためにビオチンを標的化部分として用いることによって特異
的に標的化され得る。このよごれは、分解／消化され、それにより、基礎となる
基質から遊離される。このような特異的標的化キメラは、種々の洗浄処方物にお
いて格別である。
【０１９７】 （ＶＩ．薬学的処方物） 本発明の治療的キメラ分子（例えば、治療的触媒性アンタゴニスト）は、静脈
内投与、非経口投与、局所投与、経口投与、または（例えば、エアゾールまたは
経皮による）局部投与に有用である。特に好ましい投与形態としては、動脈内注
射、より好ましくは腹腔内肝臓動脈内注射、または脳へと組成物を送達すること
が所望される場合（例えば、脳腫瘍の処置のため）、頸動脈または頸動脈系の動
脈（例えば、後頭動脈、耳介動脈、側頭動脈、大脳動脈、顎動脈など）が挙げら
れる。キメラ分子は代表的に、薬学的に受容可能なキャリア（賦形剤）と合わさ
れて、薬理学的組成物を形成する。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、組
成物を安定化するように作用するか、または薬剤の吸収を増加もしくは減少させ
るように作用する、生理学的に受容可能な化合物を含み得る。生理学的に受容可
能な化合物としては、例えば、以下が挙げられ得る：炭水化物（例えば、グルコ
ース、スクロースまたはデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸ま
たはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、抗有糸***剤のクリア
ランスもしくは加水分解を減少させる組成物、または賦形剤もしくは他の安定剤
および／もしくは緩衝剤。
【０１９８】 他の生理学的に受容可能な化合物としては、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または
微生物の増殖もしくは作用を妨げるために特に有用である保存剤が挙げられる。
種々の保存剤が周知であり、そしてこれらとしては、例えば、フェノールおよび
アスコルビン酸が挙げられる。当業者は、生理学的に受容可能な化合物を含む、
薬学的に受容可能なキャリアの選択が、例えば、キメラ分子の投与経路およびそ
の薬剤の特定の物理化学的特徴に依存することを認識する。
【０１９９】 薬学的組成物は、投与方法に依存して種々の単位投薬形態で投与され得る。例
えば、経口投与に適した単位投薬形態としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤
および菓子錠剤が挙げられる。経口投与される場合、キメラ分子は、好ましくは
、消化から保護されることが認識される。これは代表的に、対象分子を組成物と
複合体化してこの分子を酸性および酵素的加水分解に耐性にすることによるか、
またはキメラ分子薬剤を適切な耐性キャリア（例えば、リポソーム）中にパッケ
ージングすることによるかのいずれかによって達成される。消化から化合物を防
御する手段は当該分野で周知である（例えば、治療的薬剤の経口送達のための脂
質組成物を記載する米国特許第５，３９１，３７７号を参照のこと）。
【０２００】 本発明の特定のキメラ分子は、水溶液中にごくわずかに可溶性であり得る。好
ましい実施形態では、これらの組成物は、所望の部位へと直接送達される（例え
ば、外科手順の間の注射、カニューレ挿入または直接適用による）か、これらは
受容可能な賦形剤中に可溶化されるかのいずれかである。
【０２０１】 本発明の薬学的組成物は、薬剤を例えば、外科的創傷に局所投与して、初期腫
瘍、新生物性および転移性の細胞ならびにそれらの前駆体を処置するために有用
である。別の実施形態では、この組成物は、非経口投与（例えば、静脈内投与ま
たは体腔もしくは器官腔への投与）のために有用である。投与のための組成物は
通常、薬学的に受容可能なキャリア（好ましくは、水溶性キメラ分子についての
水性キャリア）に溶解されたキメラ分子薬剤の溶液を含む。種々のキャリア（例
えば、緩衝化生理食塩水など）が用いられ得る。これらの溶液は無菌であり、そ
して一般には望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の、周知の
滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、生理学的条件に近似させるために必
要に応じて薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整および緩衝化剤、張
度調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
カルシウム、乳酸ナトリウムなど））を含み得る。
【０２０２】 これらの処方物中のキメラ分子の濃度は、広範に変化し得、そして主に流体の
容量、粘度、体重などに基づいて、選択される特定の投与形態および患者の必要
性に従って選択される。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業
者に公知であるかまたは明らかであり、そしてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８
０）のような刊行物に、より詳細に記載される。
【０２０３】 代表的な化学治療についての投薬量は、当業者に周知である。さらに、このよ
うな投薬量は代表的に、性質が補助的（ａｄｖｉｓｏｒｉａｌ）であり、そして
特定の治療状況、患者の寛容性などに依存して調整され得る。組成物の単一また
は複数の投与は、必要に応じて、そして患者によって寛容化される、投薬量およ
び頻度に依存して投与され得る。いずれにせよ、この組成物は、患者を効果的に
処置するために充分な量の本発明のタンパク質を提供すべきである。
【０２０４】 治療的キメラ分子の場合、静脈内投与のための代表的な薬学的組成物について
の投薬量は、１日に患者１人あたり約０．０１である。特に、薬物が閉鎖部位（
例えば、体腔または器官の腔）へと投与され、そして血流中には投与されない場
合、１日に患者１人あたり０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇの投薬量が使用され得る
。
【０２０５】 （ＶＩＩ．キット） ある実施形態において、本発明は本発明のキメラ分子の創造および／または使
用のためのキットを提供する。１つの実施形態において、このキットは、酵素に
おけるシステインにカップリングするためのメタンスルホネートとして誘導体化
された１以上の標的化部分を含む１以上の容器を含む。さらに、またはその代わ
りに、キットは、メタンスルホネート誘導体化標的化部分へのカップリングのた
めに用意された挿入されたシステインを有する、１以上の酵素、より好ましくは
変異酵素を含み得る。このような様式で提供される場合、キットは、特定の用途
のために所望のキメラ分子を当業者が組み立てるのを可能にする。従って、例え
ば、１つの代表的なキットは、複数のメタンスルホネート誘導体化標的化部分お
よびカップリングに適した１以上の酵素を含み得る。次いで、所望の酵素は、所
望の標的化部分と（本明細書中に記載されるように）反応させられて、所望のキ
メラ分子を産生する。このようなキットはさらに、代表的なカップリング反応に
おいて利用される１以上の試薬を含み得る。
【０２０６】 別の実施形態では、本発明は、本発明の１以上のキメラ分子（例えば、触媒性
アンタゴニストおよび／または再方向付け酵素）を提供する。このキメラ分子は
、乾燥物（例えば、凍結乾燥粉末）として、または溶液中におよび／またはエマ
ルジョンとして提供され得る。特定の実施形態では、キメラ分子は、薬理学的賦
形剤中に、または薬理学的賦形剤と共に提供され得、そして必要に応じて単位投
薬形式で提供され得る。
【０２０７】 キットは、必要に応じて、本明細書中で記載される用途を促進するための任意
の試薬および／または装置を含み得る。このような試薬としては、緩衝剤、有機
溶媒、標識、標識抗体、バイオリアクター、細胞などが挙げられるがこれらに限
定されない。
【０２０８】 さらに、キットは、本発明のキメラ分子の組み立てのための、および／または
それらの使用のための指示（すなわち、プロトコル）を含む説明書を含み得る。
説明書は代表的に、記載物または印刷物を含むが、これらはそのようなものには
限定されない。このような指示を記憶し得、そして一般使用者にそれを通信し得
る任意の媒体は、本発明によって意図される。このような媒体としては、電子記
憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（
例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられるがこれらに限定されない。このような
媒体としては、このような説明書を提供するインターネットサイトに対するアド
レスが挙げられ得る。
【０２０９】 （実施例） 以下の実施例は、請求された本発明を例示するために提供され、限定するため
ではない。以下の実施例は、本発明の多数のキメラ分子の構築および評価を詳述
する。特に、実施例１〜４は、本発明の触媒性アンタゴニストの高度な特異的選
択性を証明し、ここで標的部分は公知の酵素インヒビターである。実施例５〜７
は、キメラ分子が結合タンパク質レクチンコンカナバリンＡに対して標的化され
るキメラ分子の構築および評価を詳述する。実施例８〜１０は、キメラ分子が結
合タンパク質アビジンに対して標的化されるキメラ分子の構築および評価を詳述
する。実施例１１および１２は、キメラ分子がモノクローナル抗ビオチン抗体Ｉ
ｇＧに対して標的化されるキメラ分子の構築および評価を詳述する。実施例１３
は、これらの実施例のそれぞれの化学量論を詳述する。
【０２１０】 （インヒビターによる酵素の標的化：合成およびＳＢＬへのＨＬＡＤＨインヒ
ビターの結合および得られるＳＢＬ−Ｓ−ピラゾールＣＭＭのキャラクタリゼー
ション） 種々の酵素標的の分解のために種々の酵素標的にＳＢＬを指向するために、本
発明者らは、本発明者らの組み合わせた部位に指向された変異誘発化学修飾によ
って、ＳＢＬにそれらの酵素のための特異的なインヒビターを結合することを決
定した（（ＣＭＭ）アプローチ表２）。
【０２１１】 好ましい実施形態において、このアプローチのための標的部分として選択され
たインヒビターは、標的酵素の強力なインヒビター／分解剤であるが、ＣＭＭの
弱いインヒビターである。この実施例において、４−ピラゾール誘導体によって
強力に阻害されるアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を、標的酵素として選
択し、標的として選択されたインヒビターはＡＤＨを阻害することで公知のピラ
ゾールであった。この場合の修飾されたＣＭＭは、サブチリシン（ＳＢＬ）であ
った。
【０２１２】 １実施形態において、ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＬＡＤＨ）を
、標的酵素として選択した。幾つかの四置換ピラゾールは、ＨＬＡＤＨの合理的
な選択的インヒビターとして記載される（ＴｈｅｏｒａｌｌおよびＹｏｎｅｔａ
ｎｉ（１９６３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｚ．，３８８：５３７−５５３；Ｔｈｅｏｒ
ｅｌｌら（１９６９）Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，２３：２５５−２６
０；Ｔｏｌｆら（１９７９）Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．Ｂ ３３：４８
３−４８７；Ｔｏｌｆら（１９８２）Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．Ｂ，１
０１−１０７）。４位に長鎖の疎水性アルキル置換基を有するピラゾール誘導体
は、ＨＬＡＤＨ活性を特に強力に阻害する。この置換基の結合親和性、従って４
−ピラゾールの阻害力は、アルキル鎖長が６個の炭素原子まで増加するにつれて
増加する。４−ヘキシルピラゾールは、ＫI＝０．５ｎｍを有するウマ肝臓アル
コールデヒドロゲナーゼ（ＬＡＤＨ）を阻害することが公知である。それ故に、
本発明者らは、４位にメタンスルホニル−ヘキシル側鎖を有するピラゾール−Ｍ
ＴＳ試薬を合成することを決定した。このＭＴＳ−ピラゾール試薬の合成は、ス
キーム１１（図３）によって例示される。
【０２１３】 （ＭＴＳ−ピラゾールの合成） ４−ヨードピラゾール（１）のｎ−ＢｕＬｉによる水素−金属交換、および過
剰の１，６−ジブロモヘキサン（２）とのカップリングは、４−（６−ブロモ）
−ヘキシルピラゾール（３）を提供した。化合物３を精製する試みは、部分的に
のみ成功した。粗ブロミド３のメタンチオ硫酸ナトリウムとの反応は、１６％の
全体収率でＭＴＳ−ピラゾール４を提供した。全収率が低いにもかかわらず、最
適化に向けた試みがなされなかった。なぜなら、これはおそらく保護基の使用を
必要とするからであった。従って、ＭＴＳ−ピラゾール４は、スキーム１１（図
３）に概略されるように、簡単な二工程の反応順序で合成され得る。
【０２１４】 （ピラゾールによるＳＢＬ−ＷＴの阻害） ピラゾールを用いる修飾がどのくらいＳＢＬの触媒活性に影響をおよぼすかを
決定するため、本研究者は、本研究者らの標準基質ｓｕｃ−ＡＡＰＦｐＮＡおよ
び標準条件（ｐＨ８．６、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、１％ＤＭＳＯを含有す
る０．１Ｍ Ｔｒｉｓ）を用いるＷａｌｅｙ（Ｗａｌｅｙ（１９８２）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，Ｊ．，２０５：６３１）の方法を使用して、ＳＢＬ−ＷＴについてＫ I 測定を実施した。非置換のピラゾールは、有意にＳＢＬ−ＷＴを阻害しなかっ
た（ＫM＝０．７３±０．０５ｍＭ、ｋcat＝１５３±４ｓ-1、ｋcat／ＫM＝２０
９±１５ｍＭｓ-1、ＫI＝９７．２±７．２ｍＭ）。ＭＴＳ−ピラゾール４を用
いるＳＢＬ−ＷＴのＫIの決定のための同じ方法を使用する試みは、ピラゾール
化合物の不溶性のため失敗した。
【０２１５】 （ピラゾール−ＣＭＭの修飾およびキャラクタリゼーション） Ｎ６２Ｃ、Ｌ２１７Ｃ、Ｓ１６６ＣおよびＳ１５６Ｃを、ＭＴＳ−ピラゾール
試薬４を用いて、ｐＨ９．５での反応、次いで標準プロトコルによって修飾した
。全ての場合において、得られる酵素は、修飾後活性であり、アミダーゼ速度論
（基質ｓｕｃ−ＡＡＰＦｐＮＡ）およびＥＳＭＳのついてのデータを表２に示す
。
【０２１６】 （表２．ピラゾール−ＣＭＭについてのｖ速度論的定数）
【０２１７】
【表２】 a測定問題により、現在まで得られなかった。 ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．６、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、１％Ｄ
ＭＳＯ中の初期速度の方法によって複製中で決定された速度定数。［Ｓ］＝０．
０１２５ｍＭ〜３ｍＭ、［Ｅ］＝１．５×１０-8Ｍ〜９．０×１０-8Ｍ。
【０２１８】 それは全てのピラゾール−ＣＭＭの中で最も小さなＫM値を有するが、Ｓ１６
６Ｃ−Ｓ−ピラゾールＣＭＭは、ＳＢＬ−ＷＴの場合より約９倍小さく、最も低
いｋcat／ＫMを示す。
【０２１９】 Ｓ１５６−およびＬ２１７−Ｓ−ピラゾールＣＭＭのｋcatは、両方とも非常
に似ており、ＷＴ酵素の場合より約２．５倍小さかった。しかし、これらの基質
結合特性は、わずかに異なっていた：Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ピラゾールは、ＳＢＬ−
ＷＴより良好に結合した。一方でＬ２１７Ｃ−Ｓ−ピラゾールのＫMは、ＷＴ酵
素のＫMより大きい。
【０２２０】 Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ピラゾールは、他のピラゾールＣＭＭに比べてわずかにより活
性であり、そのｋcatは、ＳＢＬ−ＷＴと比較してちょうど１．５倍小さい。し
かし、それは、全てのピラゾール−ＣＭＭの中で最も大きなＫMを有し、そのｋc at ／ＫM値は、ＳＢＬ−ＷＴと比較して約２倍小さかった。
【０２２１】 （実験的詳細） （４−（６−メタンチオスルホニル）ヘキシルピラゾール（ＭＴＳ−ピラゾー
ル）（４）） Ｎ2下、−７８℃において、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の４−ヨードピラゾール（
１）（２．００ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサ
ン中の２．５Ｍ溶液、１２．４ｍＬ、３０．９ｍｍｏｌ）を滴下した。０．５時
間後、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の１，６−ジブロモヘキサン（２）（５．０３ｇ、
２０．６ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくり加えた。添加を完了した際、この反応混合
物を室温まで加温し、一晩撹拌した。水（５０ｍＬ）を加え、層を分離し、水層
をＡｃＯＥｔ（４×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（５０ｍ
Ｌ）で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ4）。溶媒のエバポレーションおよび減圧下
での後の乾燥によって、褐色油状物として５．０３ｇの粗生成物を得た。フラッ
シュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン：ＡｃＯＥｔ、勾配溶出、９５
：５〜５５：４５）による分離によって、０．８１０ｇ（３４％）の４−（６−
ブロモ）−ヘキシルピラゾール（３）を黄色油状物として得た。
【０２２２】
【数２】 ＊シグナルは二重の強度を有する。両方のＮＭＲスペクトルは不純物によるさら
なるシグナルを含む。ブロモ−化合物３は、さらに精製されず、特徴付けした。
さらに２．４１ｇ（４８％）のジブロミド２は再単離され得る。
【０２２３】 ＮａＳＳＯ2Ｍｅ（０．３１９ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）
中の粗ブロミド２（０．４００ｇ、ｍａｘ．１．７３ｍｍｏｌ）の溶液に加え、
得られる溶液を窒素下５０℃で加熱した。１６時間後、水（１０ｍＬ）およびＡ
ｃＯＥｔ（１０ｍＬ）を加え、これらの層を分離し、水層をＡｃＯＥｔ（４×１
０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し
た（ＭｇＳＯ4）。溶媒をエバポレートし、後に減圧下で乾燥し、０．３５０ｇ
の粗生成物を黄色油状物として得た。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲ
ル、ヘキサン：ＡｃＯＥｔ、勾配溶出、８：２〜０：１）により分離して、０．
２１５ｇ（２工程にわたって１６％）の４−（６−メタンチオスルホニル）−ヘ
キシルピラゾール（４）を無色の固体として得た。
【０２２４】
【数３】 （標準修飾プロトコール） フラッシュ凍結溶液として保存されたＳＢＬ変異体の修飾のための一般的手順
： 約２５ｍｇの酵素を含有する変異体酵素（Ｎ６２Ｃ、Ｌ２１７ＣまたはＳ１６
６Ｃ）の１．２５ｍＬの凍結されたアリコートを解凍し、ポリプロピレン試験管
中の１．２５ｍＬの修飾緩衝液（以下を参照のこと）に加えた。この溶液に、１
００μＬの０．２Ｍ ＭＴＳ試薬溶液を加えた。この混合物をシールし、撹拌し
、そして室温でエンドオーバーエンド（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）回転子上に
置いた。修飾が完了した際（スクシニル−ＡｌａＡｌａＰｒｏＰｈｅ−ｐ−ニト
ロアニリド［ε410＝８８００Ｍ-1ｃｍ-1］（Ｂｏｎｎｅａｕら（１９９１）Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：１０２６−１０３０）を、一定の活性を示
す０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、１％ＤＭＳＯ、ｐＨ８．６を含有する０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の基質として使用する特異的活性アッセイ、および
溶液中に遊離のチオールが存在しないことを示すＥｌｌｍａｎ試薬（Ｅｌｌｍａ
ｎら（１９６１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７：８８−９５）（ε 412 ＝１３６００Ｍ-1ｃｍ-1）を用いる滴定によって決定した）、追加の５０μ
Ｌの修飾試薬溶液を加え、この混合物をさらに１０分間エンドオーバーエンド回
転子上に戻した。この反応溶液を、事前に充填し、事前に平衡化したＧ−２５Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＰＤ１０カラムに注入し、３．５ｍＬのＱｕｅｎｃ
ｈ Ｂｕｆｆｅｒで溶出した（以下を参照のこと）。この溶出液を４℃で、１０
ｍＭ ＭＥＳ，１ｍＭ ＣａＣｌ2 ｐＨ５．８（２＿１Ｌ、２＿４５分）に対
して透析した。得られる透析液を液体窒素中でフラッシュ凍結させ、−１８℃で
保存した。
【０２２５】
【化２】 全てのＣＭＭの遊離チオール含量を、０．２５Ｍ、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液
中のＥｌｌｍａｎ試薬を用いる滴定によって分光学的に決定した。全ての場合に
おいて、遊離チオールは検出されなかった。修飾した酵素を、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｐｈｓｔ−システムで、カソードに向かって泳動するｐＨ４．２の非変性勾
配（８−２５％）ゲルによって分析し、単一のバンドとして現れた。ＥＳ−ＭＳ
分析の前に、５％アセトニトリル、ランニング緩衝液としての０．０１％ＴＦＡ
を有するＳｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣマトリクス（Ｐｈａｒｍａｃｉａからの１７−
０７２７−２０）上のＦＰＬＣ（ＢｉｏＲａｄ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｓｙｓｔｅ
ｍ）によってＣＭＭを精製し、１段階勾配の８０％アセトニトリル、０．０１％
ＴＦＡで溶出した。
【０２２６】 （凍結乾燥した粉末として保存されたＳＢＬ変異体の修飾のための一般的手順
） この手順を、Ｓ１５６Ｃにのみ使用し、これを二量化を防止するために凍結乾
燥した粉末として保存した。ポリプロピレン試験管内に、約２５〜３０ｍｇの凍
結乾燥したＳ１５６Ｃを秤量した。これを以下の修飾緩衝液（２．５ｍＬ）中に
溶解した。
【０２２７】
【化３】 ＭＴＳ試薬を加え、次いで適切なクエンチ緩衝液を使用して、フラッシュ凍結
変異体溶液に関して反応を続けた。
【０２２８】 （ＳＢＬ結合体のアミダーゼ速度論分析のための一般的方法） ０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、１％ＤＭＳＯ、ｐＨ８．６（ε410＝８８００
Ｍ-1ｃｍ-1）（Ｂｏｎｎｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１
１９：１０２６−１０３０）を含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の
９個の濃度（０．１２５ｍＭ−３．０ｍＭ）のスクシニル−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基
質で決定した初期速度データのカーブフィッティング（ＧｒａＦｉｔ（登録商標
３．０３））によって２５（±０．２）℃で、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅ
ｎ定数を測定した。
【０２２９】 （ＳＢＬ結合体のエステラーゼ速度論分析のための一般的方法） 低い基質近似を使用して決定された特異性定数を、０．００５ｖｏｌ％Ｔｗｅ
ｅｎ−８０、ＤＭＳＯ中の１ｖｏｌ％３７．５ｍＭ Ｅｌｌｍａｎ試薬を含有す
る０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．６中の基質として、１５μＭまたは３
０μＭのスクシニル−ＡＡＰＦ−ＳＢｎを使用して、Ｅｌｌｍａｎ試薬（ε４１
２＝１３６００Ｍ−１ｃｍ−１）を使用して、間接的に測定した。
【０２３０】 ０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、ＤＭＳＯ中の１ｖｏｌ％３７．５ｍＭ Ｅｌｌ
ｍａｎ試薬を含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．６中のＥｌｌｍａ
ｎ試薬を間接的に使用して、スクシニル−ＡＡＰＦ−ＳＢｎ基質の８個の濃度（
３１．２５μＭ−２．０ｍＭ）で決定した初期速度データのカーブフィッティン
グ（Ｇｒａｆｉｔ（登録商標）３．０３）によって２５℃で、Ｍｉｃｈａｅｌｉ
ｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定数を測定した。
【０２３１】 （実施例２） （初期ＨＬＡＤＨ標的化アッセイ：超化学量論（ｓｕｐｒａｓｔｏｉｃｈｉｏ
ｍｅｔｒｉｃ）ピラゾール−ＣＭＭによるＨＬＡＤＨの標的化そして次ぐ分解の
評価） ピラゾール−ＣＭＭのＨＬＡＤＨに対する標的化は、ＣＭＭのピラゾール部分
による阻害に起因したＡＤＨ活性における減少から明白である。
【０２３２】 それゆえ、ピラゾール−ＣＭＭの非存在および存在におけるＨＬＡＤＨの触媒
活性を調査した。コントロールは、ＳＢＬ−ＷＴを用いて実行した。使用したＣ
ＭＭおよびＷＴの量は、ＰＭＳＦ滴定によって測定する場合、等量の活性な酵素
に対して計算した。シクロヘキサノールを、ＨＬＡＤＨ基質として、そしてＮＡ
Ｄ+を補因子として使用した。図４は、この「標的化アッセイ」の結果を示す。
【０２３３】 予想されるように、ＳＢＬ−ＷＴは、ＨＬＡＤＨの活性に有意に影響与えず、
ところが全てのピラゾール−ＣＭＭは、ＨＬＡＤＨを阻害した。ほとんど有効な
阻害は、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ピラゾール（表面曝露される側鎖を有する唯一のＣＭ
Ｍ）によって生じた。Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ピラゾールおよびＬ２１７Ｃ−Ｓ−ピラゾ
ールは、非常に類似した阻害力を示した。驚くべきことに、Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ピ
ラゾールは、ＨＬＡＤＨを非常に強力に阻害したが、その修飾された側鎖は、Ｓ 1 ポケットに埋もれている。これは、ピラーゾール部分がその結合ポケットの外
側に結合するコンフォメーションを採るという点から、合理的に説明され得る。
これらの結果は、本発明者らの修飾された酵素がインヒビターを介して別の酵素
を標的化する能力を明らかに証明する。
【０２３４】 ピラゾールインヒビターを介したＣＭＭとＨＬＡＤＨの標的化された結合は、
選択的加水分解を導くべきである。ＨＬＡＤＨの加水分解が起こる場合、ＨＬＡ
ＤＨのオキシドレダクターゼ活性は、本発明者らのＣＭＭを用いたあるインキュ
ベーション時間の後に、減少されるか、または根絶されるべきである。これを証
明するために、上記のような「標的化活性」が、４時間のインキュベーション後
に再び実行された。残存するＨＬＡＤＨ活性は、シクロヘキサノールを基質とし
て添加することによって決定された。この結果は、図５に示す。
【０２３５】 （ＨＬＡＤＨ標的化アッセイのための実験） ６つのキュベットを表３に示すように充填した。
【０２３６】 表３．ＨＬＡＤＨ標的化アッセイのための設定
【０２３７】
【表３】 aアッセイ緩衝液：０．１Ｍ グリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ９．０。b アッセイ緩衝液中の溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）。c アッセイ緩衝液中の溶液（３３．２ｍｇ／ｍＬ）。d ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（０．０５Ｍ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．４）中の溶液（１
０ｍｇ／ｍＬ、５２．４％活性）。e この量は、等濃度の活性な酵素に関して計算している（ｓｕｃｃ−ＡＡＰＦｐ
ＮＡを用いた初期運動速度によって測定した場合）。f ＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８）中に溶解
された凍結乾燥された酵素。
【０２３８】 ＨＬＡＤＨの添加の前に、このキュベットを２分間、分光光度計中で平衡化し
た。ＨＬＡＤＨを添加し、そしてＡ340を３００秒間に渡って２０秒毎に測定し
た。この測定は、２重で実行した。結果は、表４に示す。
【０２３９】 表４．ＨＬＡＤＨ標的化アッセイに関する結果。
【０２４０】
【表４】 （ＨＬＡＤＨ標的化アッセイに関する実験） ６つのエッペンドルフバイアルを、表５に示すように充填した。
【０２４１】 表５．ＨＬＡＤＨ標的化アッセイのための設定
【０２４２】
【表５】 aアッセイ緩衝液：０．１Ｍ グリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ９．０。b アッセイ緩衝液中の溶液（３３．２ｍｇ／ｍＬ）。c ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（０．０５Ｍ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．４）中の溶液（１
０ｍｇ／ｍＬ）。d Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中のスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ジスルフィド結合
有するリボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液。e この量は、等濃度の活性な酵素に関して計算された（ＰＭＳＦ滴定によって測
定された場合）。f ＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８）中に溶解
された凍結乾燥された酵素。
【０２４３】 これらの溶液は、サーモスタット制御された温浴中、３５℃で４時間インキュ
ベートされた。各エッペンドルフバイアルの６５０μＬ溶液を、キュベット中、
２ｍＬのアッセイ緩衝液と混合した。分光光度計における２分間の平衡化、そし
てオートゼロにした後、シクロヘキサノール（３００μＬ）を添加し、そして３
００秒間に渡って２０秒毎にＡ340を測定した。測定は、２重で実施し、そして
表６に示す。
【０２４４】 表６．ＨＬＡＤＨ標的化アッセイに関する結果
【０２４５】
【表６】 aデコイタンパク質の無しおよび有りでのコントロール測定の平均。b デコイタンパク質なし。c デコイタンパク質あり。
【０２４６】 （実施例３） （アルカリホスファターゼの存在下におけるＨＬＡＤＨの標的化およびＨＬＡ
ＤＨの破壊） 種々の酵素標的の分解のためにサブチリシン（例えば、ＳＢＬ）をそれらに配
向させるために、本発明者らは、図３に示されるような本発明者らの結合部位指
向型変異誘発化学修飾（ＣＭＭ）手段によって、サブチリシンに対するこれらの
酵素に特異的なインヒビターを添付させることを決定した。
【０２４７】 本発明者らの予備的な標的は、ピラゾールによって阻害されるＨＬＡＤＨであ
る。デコイタンパク質（スクランブルＲＮａｓｅ Ａ）の存在および非存在下で
、ＨＬＡＤＨを選択的に破壊するピラゾール−ＣＭＭの能力をまた、探索した（
以下の実施例を参照のこと）。
【０２４８】 本実施例は、強力なデコイタンパク質としての活性な酵素（アルカリホスファ
ターゼ（ＡＰ））の存在下におけるさらなる実験を記載する。これは、細胞中で
いくつかの酵素が存在するインビボ刺激を模倣し、そして、ここで、本発明者ら
は、１つの酵素（ＨＬＡＤＨ）の破壊は標的化するが他（例えば、ＡＰ）は影響
されないままにする。
【０２４９】 消化実験は、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールを代表的なＣＭＭとして使用して実施し
た。消化混合物中の種類の濃度は（存在する場合）、以下： ＨＬＡＤＨ ２．６２μＭ（１．０当量の活性部位*） ＡＰ ２．７４μＭ（１．０５当量の活性部位*） Ｓ１６６Ｃ−ピラゾール ３．４０μＭ（１．３当量の活性部位） であった。ＨＬＡＤＨおよびＡＰが、両方とも二量体であることに注意する。Ｍ
Ｗ：ＨＬＡＤＨ：３９４９２Ｄａ／サブユニットＡＰ：５７０９９Ｄａ／サブユ
ニット］。
【０２５０】 ＨＬＡＤＨ活性は、定期的に消化混合物の一部を取り除き、そしてシクロヘキ
サノールをシクロヘキサノンに酸化するそのアリコートの能力を評価することに
よってモニターした。反応コースは、シクロヘキサノールが酸化されたとして３
４０ｎｍにおいて、ＮＡＤ+のＮＡＤＨへの変化を観察することによってモニタ
ーした。
【０２５１】 アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性は、定期的に消化混合物の一部を取り除
き、そしてｐ−ニトロフェニルホスフェートを無機ホスフェートおよびｐ−ニト
ロフェノレートに加水分解するそのアリコートの能力を評価することによってモ
ニターした。反応コースは、４０５ｎｍにおいて、ｐ−ニトロフェノレートの出
現を観察することによってモニターした。
【０２５２】 （結果） Ｓ１６６Ｃ−ピラゾール、ＡＰおよび／またはＨＬＡＤＨを含む６つのバイア
ルを調製した。各バイアルのＨＬＡＤＨ（表７）およびＡＰ（表８）の活性は（
適用可能な場合）、定期的に評価した（実験を参照のこと）。
【０２５３】 表７．初期活性に対するインキュベーション後のＨＬＡＤＨ活性
【０２５４】
【表７】 *ＨＬＡＤＨ活性は、シクロヘキサノールが酸化されたとして３４０ｎｍにおけ
るＮＡＤ+のＮＡＤＨへの変換をモニターすることによって評価した（実験を参
照のこと）。３５℃でのインキュベーション。
【０２５５】 表８．初期値に対するインキュベーション後のアルカリホスファターゼ活性
【０２５６】
【表８】 *ＡＰ活性は、４０５ｎｍにおけるｐ−ニトロフェニルホスフェートからｐ−ニ
トロフェノレート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｌｏａｔｅ）放出をモニターすること
によって評価した（実験を参照のこと）。３５℃でのインキュベーション。＃Ａ
ＰおよびＡＰ＋Ｓ１６６Ｃ−ピラゾール実験は、３時間および７２時間の時点で
実施した。
【０２５７】 このデータはまた、図６、図７、図８および図９にグラフで示す。
【０２５８】 データ（表７）、図６および図８は、ＨＬＡＤＨ活性が、ＡＰ単独またはＡＰ
の存在下でアッセイされた場合に定常なままであることを示す。また、ＡＰ活性
は、基本的には、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールＣＭＭの存在下で影響されなかった（
予想されたように；表２、図３および図５）。しかし、Ｓ１６６ＣピラゾールＣ
ＭＭの存在下におけるＨＬＡＤＨの活性は、急速かつ全体的に失われる（表１、
図２および図４）。
【０２５９】 さらに、ＡＰおよびＨＬＡＤＨは、活性または触媒機能を互いに妨害しなかっ
た（表７、表８、図６、図７、図８および図９）。
【０２６０】 （実験の詳細） （材料） １ｍＭ Ｍｇ2+および０．１ｍＭ Ｚｎ2+を含有するｐＨ９．０ １Ｍグリシ
ン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０アッセイ緩衝液）： グリシン（０．１モル）は、水（約８００ｍＬ）に溶解し、そしてＭｇＣｌ2
（ＭＱ水中の１ｍＬの１Ｍ溶液）およびＺｎＣｌ2（ＭＱ水中の１ｍＬの０．１
Ｍ溶液）を添加した。ｐＨを、約５Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて９．０に調整し、
そして混合物を１Ｌにした。
【０２６１】 ｐＨ７．４ ０．０５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４ ＴＲＩＳ）
： ＴＲＩＳの溶液は、ｐＨ７．４に中和し、次いで０．０５Ｍに希釈した。
【０２６２】 ３Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ Ｍｇ2+および０．０１ｍＭ Ｚｎ2+を含有する
、ｐＨ７．８ ０．０５Ｍ トリエタノールアミン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８
緩衝液）： トリエタノールアミン（０．０５モル、７．５ｇ）、ＮａＣｌ（３モル、１７
５．５ｇ）、ＭｇＣｌ２（０．１ｍＬの１Ｍ溶液）およびＺｎＣｌ２（０．１ｍ
Ｌの１Ｍ溶液）を、ＭＱ水（約９００ｍＬ）に溶解した。ｐＨを、約２Ｎ ＨＣ
ｌを用いて７．４に調整し、そして生じた溶液を１Ｌにした。
【０２６３】 ０．０５％Ｔｗｅｅｎ、１ｍＭ Ｍｇ2+および０．１ｍＭ Ｚｎ2+を含有する
ｐＨ８．６の約０．１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６緩衝液）： ＭｇＣｌ2（ＭＱ水中の０．１ｍＬの１Ｍ溶液）およびＺｎＣｌ2（ＭＱ水中の
０．１ｍＬの０．１Ｍ溶液）を、１００ｍＬ容量フラスコに添加し、このフラス
コを０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むｐＨ８．６ ０．１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝
液を用いて印まで作製した。
【０２６４】 ＨＬＡＤＨ溶液： ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａ−９５８９、ＥＣ１．
１．１．１、８ｍｇの約５０％ｗ／ｗタンパク質）を、ｐＨ７．４ ＴＲＩＳ（
０．８ｍＬ）に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０２６５】 アルカリホスファターゼ（ＡＰ）溶液： アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ７１３
０２３、ＥＣ３．１．３．１、５０％ｗ／ｖグリセロール：緩衝液中に受け入れ
られた場合約９５０μＬ）を、ｐＨ７．８緩衝液（約１５ｍＬ）を用いて希釈し
、そしてセントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）濃縮機を用いてその本来の
体積の１０〜２０％に４℃で濃縮した。さらなる１５ｍＬのｐＨ７．８緩衝液を
添加し、そしてそのサンプルをもう１回濃縮した。この工程は、希釈のために、
ｐＨ９．０アッセイ緩衝液を用いてさらに３回繰り返した。３回目の濃縮の後、
この濃縮物（約１．８５ｍＬ）を集め、そして氷上で保存した。この手順は、Ｈ
ＬＡＤＨに対する基質であるグリセロールを除去するために必要であった。
【０２６６】 ＮＡＤ+溶液： ３３．２ｍｇ／ｍＬのＮＡＤ+をｐＨ９．０のアッセイ緩衝液に溶解した。
【０２６７】 シクロヘキサノール溶液： ｐＨ９．０アッセイ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍＬのシクロヘキサノール。
【０２６８】 ｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液（ＰＮＰＰ溶液）： ２０ｍｇのｐ−ニトロフェニルホスフェートを含有する錠剤（Ｓｉｇｍａ Ｎ
−２７６５）を、ｐＨ８．６緩衝液（２０ｍＬ）に溶解した。
【０２６９】 ピラゾール−ＣＭＭ： ＭＥＳ保存緩衝液（ｐＨ５．８ １０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ2）中
のＳ１６６Ｃ−ピラゾール（１．７６ｍｇ／ｍＬ）。
【０２７０】 （ＨＬＡＤＨ活性のアッセイ） ６つのエッペンドルフバイアルを、表９に示すように充填した。
【０２７１】 表９．ＨＬＡＤＨ活性アッセイのための設定。
【０２７２】
【表９】 ＣＭＭは、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールであった。
【０２７３】 バイアルは、以下の表に示される時間に対して３５℃でインキュベートした。
時間が進行するにつれてＨＬＡＤＨおよびホスファターゼ活性をアッセイするた
めに、アリコートを定期的に取り除いた。
【０２７４】 溶液の一部（６５μＬ）を、インキュベーションバイアルから取り除き、次い
で、ｐＨ９．０アッセイ緩衝液（２００μＬ）を含むマイクロキュベットに注入
した。このキュベットを２５℃で２分間インキュベートし、次いで、シクロヘキ
サノール溶液（３０μＬ）を添加した。次いで、３４０ｎｍにおける吸光度を３
００秒間モニターし、そして０．２吸光度単位まで秒当たりのＯ．Ｄ．変化を記
録した。
【０２７５】 （アルカリホルファターゼ活性のアッセイ） 一部（２０μＬ）をインキュベーションバイアルから取り除き、次いでｐＨ８
．６緩衝液（９８０μＬ）に注入した。この混合物をボルテックスした。１０μ
Ｌをその混合物から取り除き、そして２５℃でインキュベートした９９０μＬの
ＰＮＰＰ溶液を含むキュベットに注入した。４０５ｎｍにおける吸光度変化を１
５０秒間モニターし、そして１吸光度単位までの秒当たりのＯ．Ｄ．変化を記録
した。
【０２７６】 （実施例４） （化学量論以下のピラゾール−ＣＭＭを用いたＨＬＡＤＨの標的化） 化学量論： 実験は、表１０に例示されるように、２当量のＨＬＡＤＨ二量体（４当量の活
性部位）を１当量のピラゾール−ＣＭＭまたはＷＴ−ＳＢＬに用いることによっ
て実施した。
【０２７７】 表１０．化学量論
【０２７８】
【表１０】 条件： 反応は、ｐＨ９．０、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０を含有する０．１Ｍ グリ
シン−ＮａＯＨ、３５℃で実施した。
【０２７９】 結果： ＨＬＡＤＨ溶液を、ＷＴ−ＳＢＬ、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールまたはＳ１５６Ｃ
−ピラゾールの存在下でインキュベートした。コントロール実験は、任意のＳＢ
Ｌベースの酵素の非存在下（ＨＬＡＤＨ単独）で実施した。４つの混合物のＨＬ
ＡＤＨ活性は、定期的にアッセイした（実験を参照のこと）−表１１を参照のこ
と。
【０２８０】 表１１．ピラゾール−ＣＭＭの有りまたは無しでのインキュベーション後のＨ
ＬＡＤＨ活性。
【０２８１】
【表１１】 *ＨＬＡＤＨ活性は、シクロヘキサノールが２５℃、ｐＨ９．０で酸化されたと
して３４０ｎｍでＮＡＤ+のＮＡＤＨへの変換をモニターすることによって評価
した（実験を参照のこと）。
【０２８２】 考察： ピラゾール−ＣＭＭの添加によって生じるＨＬＡＤＨ活性における最初の低下
は、ＣＭＭがＨＬＡＤＨを標的化し、それゆえＨＬＡＤＨを阻害する能力を反映
している。Ｓ１５６Ｃ−ピラゾール、そしてより少ない程度でＳ１６６Ｃ−ピラ
ゾールは、明らかに、インキュベーションの際にＨＬＡＤＨ活性に劇的な減少を
引き起こす。ピラゾール−ＣＭＭは、ＨＬＡＤＨに関して化学量論の量よりも少
なく使用された−４当量のＨＬＡＤＨ活性部位：１当量のピラゾール−ＣＭＭ。
しかし、これらは、２５％より多くのＨＬＡＤＨ活性の減少を素早く引き起こし
た。確かに、Ｓ１５６Ｃ−ピラゾールの場合、ＨＬＡＤＨ活性は、２０時間に渡
って６７％から５％へ減少することが見出され、これは、ピラゾール部分の最大
阻害効果に加えた１３．５倍のＨＬＡＤＨ活性の減少を示す。ＷＴ−ＳＢＬは、
ピラゾール−ＣＭＭと比較した場合の増強されたアミダーゼ特異的活性にもかか
わらず、同じ２０時間に渡って単に１．４倍のＨＬＡＤＨ活性の減少しか引き起
こさない。
【０２８３】 要約： ピラゾール−ＣＭＭは、ＨＬＡＤＨを標的化し、そしてＨＬＡＤＨを触媒的に
破壊することが見出される。
【０２８４】 実験材料： ｐＨ９．０ ０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０を含有する０．１Ｍ グリシン−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０アッセイ緩衝液）： グリシン（０．１モル）を、水（約８００ｍＬ）に溶解した。Ｔｗｅｅｎ８０
の溶液（ＭＱ水中に５０ｍＬの０．１％ｖ／ｖ）を添加し、そしてｐＨを約５Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて９．０に調整した。この混合物をＭＱ水を用いて１Ｌに
した。
【０２８５】 ｐＨ７．４ ０．０５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４ ＴＲＩＳ）
： ＴＲＩＳ（３０２．９ｍｇ、２．５ｍモル）を、ＭＱ水（約４０ｍＬ）に溶解
した。ｐＨを、約１Ｍ ＨＣｌ溶液を用いて７．４に調整し、そして混合物の体
積をＭＱ水を用いて５０ｍＬにした。
【０２８６】 ＨＬＡＤＨ溶液： ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａ−９５８９、ロット５
８Ｈ７００４、ＥＣ１．１．１．１、８．４５ｍｇの５２．４％ｗ／ｗタンパク
質−製造者らのＢｉｕｒｅｔ滴定に従う）を、ｐＨ７．４ ＴＲＩＳ（０．８４
５ｍＬ）に溶解し、活性タンパク質の５．２４ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０２８７】 ＨＬＡＤＨ濃度の確認： ＨＬＡＤＨ（５０μＬ）溶液をｐＨ７．４ ＴＲＩＳ（４５０μＬ）に添加し
、１０倍希釈溶液を得た。ブラッドフォード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質測定
は、この２重サンプルで実施し、そして０．６１６ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度
を得た。これを最初のＨＬＡＤＨ保存液中の６．１６ｍｇ／ｍＬの濃度に変換し
た。本発明者らは、タンパク質濃度が過大評価されるよりも、むしろ下であるこ
とを確実にするために、５．２４ｍｇ／ｍＬのより低い値が正確であると考える
。
【０２８８】 ＮＡＤ+溶液： ＮＡＤ+（３３２ｍｇ）を、ｐＨ９．０ アッセイ緩衝液（１０ｍＬ）に溶解
し、３３．２ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０２８９】 シクロヘキサノール溶液： シクロヘキサノール（１００ｍｇ）をｐＨ９．０ アッセイ緩衝液（１０ｍＬ
）に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０２９０】 （サブチリシン溶液：） ＷＴ−ＳＢＬ（１．８８ｍｇの乾燥粉末、７３％ ｗ／ｗの活性なタンパク質
）をｐＨ５．８の１０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ2「保存緩衝液」（５０
０μＬ）に溶解して、活性なＷＴ−ＳＢＬの２．７４ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。Ｓ
１５６Ｃ−ピラゾールおよびＳ１６６Ｃ−ピラゾールをＰＭＳＦで予め滴定した
：これらの濃度はそれぞれ、２．５ｍｇ／ｍＬおよび３．６２ｍｇ／ｍＬであっ
た。
【０２９１】 （実験の詳細：） （ＨＬＡＤＨ加水分解アッセイ：） ４本の５ｍＬのファルコンチューブを、表１２に従って充填した。
【０２９２】
【表１２】 このチューブを、各チューブについて「時間０」の値を得るために各チューブ
のＨＬＡＤＨ活性がアッセイされるまで氷上で保持した（アッセイプロトコルに
ついて以下を参照のこと）。次いで、このチューブを、水浴で３５℃にてインキ
ュベートした。定期的に、７００μＬの反応混合物を各ファルコンチューブから
取り出し、そのアリコートを個々のエッペンドルフチューブ中に入れ、そしてこ
のエッペンドルフチューブを氷上で保存した。次いで、各エッペンドルフチュー
ブの内容物をＨＬＡＤＨ活性についてアッセイした（以下を参照のこと）。
【０２９３】 （ＨＬＡＤＨ活性のアッセイ：） 反応混合物の一部（６５０μＬ）を、ｐＨ９．０のアッセイ緩衝液（２．００
ｍＬ）を含むキュベット中に注入した。このキュベットを２５℃にて２分間イン
キュベートし、次いで、シクロヘキサノール溶液（３００μＬ）を添加した。１
０秒間の遅延後、３４０ｎｍでの吸光度を３００秒間モニターした。０．２吸光
度単位までの１秒あたりのＯ．Ｄ．変化を用いて、初速度を算出した。
【０２９４】 （結果） 結果を表１３にまとめる。
【０２９５】
【表１３】 （実施例５：化学量論以下のレベルのＣＭＭでＳ１５６Ｃ−ピラゾール−ＣＭ
ＭおよびＳ１６６Ｃ−ピラゾール−ＣＭＭを用いたアルカリホスファターゼの存
在下でのＨＬＡＤＨの標的化） （化学量論） 実験を、１当量のピラゾール−ＣＭＭまたはＷＴ−ＳＢＬに対して２当量のＨ
ＬＡＤＨダイマー（４当量の活性部位）を用いて行った；仔ウシ腸由来のアルカ
リホスファターゼを、全ての実験において「活性な酵素」デコイ（ｄｅｃｏｙ）
タンパク質として用いた。仔ウシ腸由来のアルカリホスファターゼは、１つのサ
ブユニットあたり分子量６６ｋＤおよび６８ｋＤという２つのアイソザイムから
構成される。両方のアイソザイムは、ダイマーであり、従って、本発明者らは、
本発明者らの計算において各ダイマーについておよその分子量は１３４ｋＤであ
ると仮定する。用いた化学量論を表１４に示す。
【０２９６】
【表１４】 （条件） （０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、１ｍＭ ＭｇＣｌ2および０．１ｍＭ
ＺｎＣｌ2、３５℃を有する、ｐＨ９．０の０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ） ４つの実験を同時に行った：４つ全ての実験を、４本のバイアルの各々の中に
存在するＨＬＡＤＨおよびＡＰを用いて行った（すなわち、これらは、加水分解
についての基質として直接競合する）。さらに、各バイアルは、以下のうちの１
つを含んでいた：緩衝液（ＳＢＬを添加せず）、ＷＴ−ＳＢＬ、Ｓ１５６Ｃ−ピ
ラゾールまたはＳ１６６Ｃ−ピラゾール。
【０２９７】 （結果：） ＨＬＡＤＨとアルカリホスファターゼとの混合物を各々含むバイアルを、ＷＴ
−ＳＢＬ、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールまたはＳ１５６Ｃ−ピラゾールの存在下でイ
ンキュベートした。コントロール実験を、ＳＢＬベースの酵素（ＳＢＬなし）の
全くの非存在下で行った。４つの混合物のＨＬＡＤＨ活性およびアルカリホスフ
ァターゼ活性を、定期的にアッセイして、ＨＬＡＤＨに対するＣＭＭ 対 アル
カリホスファターゼの信頼性を決定した（実験を参照のこと）−表１５、表１６
、図１１および図１２を参照のこと。（データをまた、付録における「ＳＢＬを
添加せず」時間＝０ｈの値と比較して示して、ＨＬＡＤＨに対するピラゾールＣ
ＭＭの阻害効果を実証する）。
【０２９８】
【表１５】
【０２９９】
【表１６】 （考察） アルカリホスファターゼは明らかに、ＷＴ−ＳＢＬまたはピラゾール−ＣＭＭ
による加水分解に対して非常に感受性というわけではない。ＨＬＡＤＨ活性は、
ＳＢＬの非存在下またはＷＴ−ＳＢＬの存在下でインキュベーションしたとき顕
著に減少するわけではない。しかし、Ｓ１５６Ｃ−ピラゾールまたはＳ１６６Ｃ
−ピラゾールの存在下では、ＨＬＡＤＨ活性は迅速に減少することが見られる。
【０３００】 （まとめ） ピラゾール−ＣＭＭは、アルカリホスファターゼの存在下でＨＬＡＤＨを標的
化し、そして触媒的に破壊することが見られる。アルカリホスファターゼは、Ｗ
Ｔ−ＳＢＬおよびピラゾール−ＣＭＭの加水分解作用によって影響を受けない。
【０３０１】 （実験） （材料） （０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、１ｍＭ Ｍｇ2+および０．１ｍＭ Ｚｎ 2+ を有するｐＨ９．０の０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ、Ｍｅ 2+ およびＺｎ2+を有するｐＨ９．０アッセイ緩衝液）：） グリシン（０．１ｍｏｌ）を、水（約８００ｍＬ）中に溶解した。塩化マグネ
シウム溶液（１ｍＬの１Ｍ溶液）および塩化亜鉛溶液（１ｍＬの０．１Ｍ溶液）
を、グリシン溶液に対して添加した。Ｔｗｅｅｎ ８０の溶液（ＭＱ水中の０．
１％ ｖ／ｖ、５０ｍＬ）をこの混合物に添加し、そしてｐＨを約５Ｍ ＮａＯ
Ｈ溶液で９．０に調整した。この混合物をＭＱ水で１Ｌにした。
【０３０２】 （１ｍＭ Ｍｇ2+および０．１ｍＭ Ｚｎ2+を有するｐＨ９．０の０．１Ｍグ
リシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０透析緩衝液）） グリシン（０．１ｍｏｌ）を、水（約８００ｍＬ）に溶解した。塩化マグネシ
ウム溶液（１ｍＬの１Ｍ溶液）および塩化亜鉛溶液（１ｍＬの０．１Ｍ溶液）を
、このグリシン溶液に添加し、そしてこの混合物のｐＨを約５Ｍ ＮａＯＨ溶液
で９．０に調整した。この混合物をＭＱ水で１Ｌにした。
【０３０３】 （ｐＨ７．４の０．０５Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４ ＴＲＩＳ
）） ＴＲＩＳ（３０２．９ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）をＭＱ水（約４０ｍＬ）に溶解
した。ｐＨを約１Ｍ ＨＣｌ溶液で７．４に調整し、そしてこの混合物の容量を
ＭＱ水で５０ｍＬにした。
【０３０４】 （１ｍＭ Ｍｇ2+および０．１ｍＭ Ｚｎ2+を有するｐＨ７．４の０．０５Ｍ
ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４透析緩衝液）） ＴＲＩＳ（６．０５７ｇ、０．０５ｍｏｌ）をＭＱ水（約８００ｍＬ）に溶解
した。塩化マグネシウム溶液（１ｍＬの１Ｍ溶液）および塩化亜鉛溶液（１ｍＬ
の０．１Ｍ溶液）をこのＴＲＩＳ溶液に添加し、そしてこの混合物のｐＨを約１
Ｍ ＨＣｌ溶液で７．４に調整した。この混合物をＭＱ水で１Ｌにした。
【０３０５】 （０．０５％ Ｔｗｅｅｎ、１ｍＭ Ｍｇ2+および０．１ｍＭ Ｚｎ2+を有す
るｐＨ８．６の約０．１Ｍ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６緩衝液）） ＭｇＣｌ2（ＭＱ水中の１Ｍ溶液、０．１ｍＬ）およびＺｎＣｌ2（ＭＱ水中の
０．１Ｍ溶液、０．１ｍＬ）を１００ｍＬメスフラスコに添加し、そしてこのフ
ラスコを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎを含むｐＨ８．６の０．１Ｍ ＴＲＩＳ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液でその印までにした（標準的なアミダーゼ反応速度緩衝液）。
【０３０６】 （ＨＬＡＤＨ溶液） ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａ−９５８９、ロット５
８Ｈ７００４、ＥＣ１．１．１．１、３．７７ｍｇの５２．４％ ｗ／ｗタンパ
ク質（製造業者のビウレット滴定による））をｐＨ７．４ ＴＲＩＳ（０．３７
７ｍＬ）中に溶解して、活性なタンパク質の５．２４ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３０７】 （ＮＡＤ+溶液） ＮＡＤ+（３９．１５ｍｇ）をｐＨ９．０アッセイ緩衝液（１．１７９ｍＬ）
に溶解して３３．２ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３０８】 （シクロヘキサノール溶液） シクロヘキサノール（１００ｍｇ）をｐＨ９．０アッセイ緩衝液（１０ｍＬ）
に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３０９】 （サブチリシン溶液） ＷＴ−ＳＢＬ（１．８８ｍｇの乾燥粉末、７３％ ｗ／ｗ活性なタンパク質）
をｐＨ５．８の１０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ2の「貯蔵緩衝液」（５０
０μＬ）に溶解して活性なＷＴ−ＳＢＬの２．７４ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。この
溶液をｐＨ５．８の１０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ2の「貯蔵緩衝液」で
４倍希釈して、０．６８５ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３１０】 Ｓ１５６Ｃ−ピラゾールおよびＳ１６６Ｃ−ピラゾールをＰＭＳＦで予め滴定
した：それらの濃度はそれぞれ、２．５ｍｇ／ｍＬおよび３．６２ｍｇ／ｍＬで
あった。これらのストック溶液をｐＨ５．８の１０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2の「貯蔵緩衝液」で４倍希釈して、それぞれ、Ｓ１５６Ｃ−ピラゾールお
よびＳ１６６Ｃ−ピラゾールの０．６３ｍｇ／ｍＬおよび０．９１ｍｇ／ｍＬ溶
液を得た。
【０３１１】 （ｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液（ＰＮＰＰ溶液）） ２つの錠剤（各々２０ｍｇのｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ
Ｎ−２７６５）を含む）を、ｐＨ８．６緩衝液（４０ｍＬ）に溶解した。この溶
液を氷上で保存した。
【０３１２】 （アルカリホスファターゼの透析） 仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ Ｐ−７９２３、ロット１２８
Ｈ１２１０および１７Ｈ０２０４）の２本のバイアルを、ｐＨ７．４の透析緩衝
液（０．５ｍＬ）と混合した。この混合物を、２×５００ｍＬのｐＨ７．４の透
析緩衝液（１×４ｈ、次いで１×一晩）、次いで２×５００ｍＬのｐＨ９．０の
透析緩衝液（２×２ｈ）に対して透析した。次いで、総タンパク質濃度をＢｒａ
ｄｆｏｒｄ技術（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて決定し、そして２．３６ｍｇ／ｍＬ
であることがわかった。
【０３１３】 （実験の詳細） ４本の１．５ｍＬエッペンドルフチューブを表２２に従って充填した。
【０３１４】
【表１７】 各チューブからアリコートを取り出して最初のＨＬＡＤＨ活性およびアルカリ
ホスファターゼ活性を確立するまではこれらのチューブを氷上で保持した。これ
らの活性を用いて、各チューブについて「時間０」の値を得た（アッセイプロト
コルについては以下を参照のこと）。次いで、これらのチューブを３５℃にて水
浴でインキュベートした。定期的に、反応混合物のアリコートを、ＨＬＡＤＨ活
性およびアルカリホスファターゼ活性をアッセイするために各エッペンドルフチ
ューブから取り出した。
【０３１５】 （ＨＬＡＤＨ活性のアッセイ） 溶液の一部（６５μＬ）をインキュベーションバイアルから取り出し、次いで
、ｐＨ９．０のアッセイ緩衝液（２００μＬ）を含むマイクロキュベット中に注
入した。このキュベットを２５℃にて２分間インキュベートし、次いで、シクロ
ヘキサノール溶液（３０μＬ）を添加した。次いで、３４０ｎｍでの吸光度を１
２０秒間モニターし、そして０．２吸光度単位までの１秒間あたりのＯ．Ｄ．の
変化を記録した。
【０３１６】 （アルカリホスファターゼ活性のアッセイ） 一部（１０μＬ）をインキュベーションバイアルから取り出し、次いで、ｐＨ
８．６の緩衝液（４９０μＬ）に注入した。この混合物をボルテックスした。１
０μＬを混合物から取り出し、そして２５℃にインキュベートした９９０μＬの
ＰＮＰＰ溶液を含むキュベットに注入した。４０５ｎｍでの吸光度の変化を１２
０秒間モニターし、そして１．０吸光度単位までの１秒間あたりのＯ．Ｄ．の変
化を記録した。
【０３１７】 （結果） 結果を表１８および表１９に例示する。
【０３１８】
【表１８】
【０３１９】
【表１９】 （実施例５：炭水化物で修飾されたセリンヒドロラーゼの合成） 特定のレクチンを給餌した動物の混入は、その栄養価をかなり低下させる（Ｇ
ａｔｅｌ（１９９４）Ａｎｉｍａｌ Ｆｅｅｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｌ ４５：
３１７−３４８；Ｍｏｇｒｉｄｇｅら（１９９６）Ｊ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉ．
７４：１８９７−１９０４；Ｐｕｓｚｔａｉら（１９９７）Ｇ．Ｂｒｉｔ．Ｊ．
Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ７７，９３３−９４５）。特に、ダイズベースの給餌への
マンノース結合レクチンの混入は、実質的な精製を伴わない粗給餌の効果的使用
を妨げる。
【０３２０】 有用なグリコシル化ＣＭＭの調製を目的として、本発明者らは、例えば、レク
チンに指向されたプロテアーゼとして用いるための多数のグリコシル化ＣＭＭの
調製を可能にする異なる炭水化物を保有する１１の単糖および二糖メタンチオス
ルホネートを調製した（図１３）。化学的に結合体化された炭水化物部分を有す
る多数の化学的に修飾された酵素は、「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｍｏｉｅｔ
ｙ」との発明の名称のＰＣＴ出願ＷＯ ００００１７１２に記載される。
【０３２１】 （実施例６：マンノシル化ＳＢＬを用いた標的化レクチン分解アッセイ） 本実施例は、糖が修飾されたＣＭＭがレクチンコンカナバリンＡを以下に模式
的に示す様式で分解する能力のスクリーニングを、本発明者らが開始することを
可能にした、非常に効果的なレクチンアッセイを記載する（図１４Ａ、図１４Ｂ
および図１４Ｃ）。
【０３２２】 表面に露出した糖基を含むＳ１５６Ｃ−糖ＣＭＭを最初に選択した。各アッセ
イについて、ビオチン化レクチンを、ｇｌｙｃｏ−ＣＭＭと共にインキュベート
し、そしてＧＧ３６−ＷＴと共にインキュベートしたサンプルと比較した。比較
を可能にするために、等量の活性な酵素を用いた。これらのサンプルをまた、デ
コイに対するレクチンについてのこれらの酵素の選択性を測定するために、デコ
イタンパク質であるジスルフィド結合スクランブルＲＮａｓｅＡ（ｄｉｓｕｌｆ
ｉｄｅ ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＲＮａｓｅＡ）を伴ってまたは伴わずにの両方で
インキュベートした。
【０３２３】 小さなタンパク質フラグメント（＜３０００Ｄａ）（タンパク質分解産物）を
、サイズ排除膜を用いて、より大きなタンパク質から分離した。レクチンのフラ
グメントをビオチンを用いて標識し、一方、非レクチンフラグメントを標識しな
い。遊離されるビオチン化フラグメントのレベルをＨＡＢＡ／アビジン試験を用
いて、そして総タンパク質フラグメント濃度のレベルをＡ280を用いての両方で
モニタリングすることによって、本発明者らは、レクチン分解の量およびデコイ
に対するレクチンの選択性を定性的に判断し得る。最初のスクリーニングの結果
を図１５Ａおよび図１５Ｂ、図１５Ｃおよび図１５Ｄに示す。
【０３２４】 ＧＧ３６−ＷＴおよび２つのＣＭＭであるＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎ（図１
５Ａおよび図１５Ｂ）およびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎ（Ａｃ）4（図１５Ｃ
および図１５Ｄ）の両方が、レクチンコンカナバリンＡを迅速に分解し得ること
は明白である。ＧＧ３６−ＷＴによる、より速い加水分解速度は、Ｓｕｃ−ＡＡ
ＰＦ−ｐＮＡ（Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−Ｅｔ−ＭａｎおよびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａ
ｎ（Ａｃ）4についてのそれぞれ１１２ｓ-1ｍＭ-1および８５ｓ-1ｍＭ-1と比較
した、２０９ｓ-1ｍＭ-1というＧＧ３６についてのｋcat／ＫM）に対する、より
高いｋcat／ＫM値と一致する。
【０３２５】 図１５Ａ〜図１５Ｄのより詳細な実験は、以下を示す： ａ）遊離したビオチンレベル（レクチン分解を示す）は、互いに類似する。デ
コイの存在は、ＧＧ３６−ＷＴ分解およびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎ分解の両
方のレベルをわずかに低下させる。
【０３２６】 ｂ）デコイの存在下でＧＧ３６−ＷＴは、２１０分後に、デコイなしよりもさ
らに１８％多い総タンパク質を産生する。対照的に、デコイの存在下でのＳ１６
６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎは、さらにほんの７％多い総タンパク質を産生する−それ
ゆえ、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎのより高い選択性は、総タンパク質吸光度の
変化を１１％低下させた。
【０３２７】 ｃ）さらに、放出されたビオチンレベル（レクチン分解を示す）は互いに類似
する。
【０３２８】 ｄ）ＧＧ３６−ＷＴおよびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎＡｃは両方とも、デコ
イなしよりもデコイの存在下でより多くの総タンパク質を２１０分後に産生する
（これらの条件下では、ＷＴについてはさらに７％多く、そしてＳ１５６Ｃ−Ｓ
−ＥｔＭａｎＡｃについてはさらに５％多い）。これらの類似のレベルは、Ｓ１
５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎＡｃの選択性がコンカナバリンＡについてほとんどまた
は全くないことを示す。
【０３２９】 このわずかな、しかし刺激的な、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎの選択性の作製
は、保護されていないマンノース基の導入と一致する。なぜなら、マンノース基
は、コンカナバリンＡの天然のリガンドであるからである。充分に保護されたＳ
１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎ（Ａｃ）4によって示される選択性がより低いこと／
ないことは、レクチンによる正確な認識のための、マンノースの、保護されてい
ないヒドロキシル基の重要性と一致する。
【０３３０】 （実験） １０個の使い捨てエッペンドルフバイアルを表２０に示すように充填する。
【０３３１】
【表２０】 これらの溶液を、サーモスタットによって制御された水浴中で３５℃に温めた
。示されたインキュベーション時間の後、適切なバイアルの内容物を各々、Ｃｅ
ｎｔｒｉｃｏｎ−ＳＲ３ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ、ＭＷＣＯ
３０００、２ｍＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水によって予め清浄にし、３７５０ｒｐｍ
で９０分間遠心分離した）の頂部に置き、３７５０ｒｐｍで６０分間遠心分離し
た。次いで、得られた濾液を表２１および表２２に示すようにアッセイした。
【０３３２】
【表２１】
【０３３３】
【表２２】 （実施例７） （他のグリコシル化ＣＭＭを使用するレクチン分解アッセイおよびより高いお
とりタンパク質濃度を有するマンノシル化ＳＢＬのレクチン分解アッセイ） 以前に報告されたＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎおよびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭ
ａｎ（Ａｃ）4に加えて、レクチンアッセイを他のグリコシル化ＣＭＭに対して
実施した。さらに、より高いレベルのおとり濃度でのＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａ
ｎの選択性を調べた。データは、Ｓ−ＥｔＭａｎＡｃについてと同様に、他の糖
グルコース、ガラクトースおよびラクトースは、ほとんどまたは全く選択性を示
さないことを示した。５倍レベルの高いおとり濃度を有するＳ１５６Ｃ−Ｓ−Ｅ
ｔＭａｎに挑戦することによって、このマンノシル化ＣＭＭの選択性は、おとり
を有する、および有しない総タンパク質レベルにおいて、約１２％の差異に減少
した。
【０３３４】 （実験：） （レクチンアッセイ方法） １０の使い捨てエッペンドルフバイアルを、表２３に示されるように満たした
。
【０３３５】
【表２３】 aレクチン−アッセイ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ2 ，ｐＨ８．６。b Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中でのビオチニル化コンカナバリンＡ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の５ｍｇ／ｍＬ。c Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中でのＳｃｒａｍｂｌｅｄ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄ
ｓ（Ｓｉｇｍａ）を有するリボヌクレアーゼＡの５ｍｇ／ｍＬ。d ２０ｍＭ，１ｍＭ ＣａＣｌ2，ｐＨ５．５中のグリコ−ＣＭＭ（ＰＭＳＦによ
って決定される）と同じ濃度に希釈された、凍結乾燥されたＧＧ３６−ＷＴの溶
液。
【０３３６】 これらの溶液は、サーモスタッド制御水浴中で３５℃に加温された。示された
インキュベーション時間の後、適切なバイアルの内容物を、それぞれ、Ｃｅｎｔ
ｒｉｃｏｎ−ＳＲ３ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ，ＭＷＣＯ ３
０００，３７５０ｒｐｍで９０分間遠心分離されたＭｉｌｌｉ Ｑ水の２ｍＬで
先に洗浄された）に配置し、そして３７５０ｒｐｍで６０分間遠心分離した。得
られた濾液を、次いで、表２４、表２５および表２６に示されるようにアッセイ
した。
【０３３７】
【表２４】 a１ｍＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水を用いて調製された８００μＬのＨＡＢＡ／Ａｖｉ
ｄｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）。b ２００μＬのレクチン−アッセイ濾液の添加後c Ｍｉｌｌｉ Ｑ水ブランク（１ｍＬ）と比較された、７００μＬのＭｉｌｌｉ
Ｑで希釈された３００μＬのレクチン−アッセイ濾液に対する値。d サンプルに対する吸光度におけるＨＡＢＡ／ドロップと希釈のみによって引き
起こされる吸光度のドロップ（コントロール）との間の計算値。
【０３３８】
【表２５】 a,b,c,dは上記の通り。
【０３３９】
【表２６】 a,b,c,dは上記の通り。
【０３４０】 （レクチンのないコントロール） コンカナバリンの１００μＬアリコートを１００μＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水で置
き換えること以外、方法１のように、アッセイを実施した。結果を表２７に示す
。
【０３４１】
【表２７】 a,b,c,dは上記の通り。
【０３４２】 （レクチンアッセイ方法２） １０の使い捨てエッペンドルフバイアルを表２８に示されるように満たした。
【０３４３】
【表２８】 aレクチン−アッセイ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ2 ，ｐＨ８．６。b Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中でのビオチニル化コンカナバリンＡ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の５ｍｇ／ｍＬ。c Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中でのＳｃｒａｍｂｌｅｄ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄ
ｓ（Ｓｉｇｍａ）を有するリボヌクレアーゼＡの５ｍｇ／ｍＬ。d ２０ｍＭ，１ｍＭ ＣａＣｌ2，ｐＨ５．５中のグリコ−ＣＭＭ（ＰＭＳＦによ
って決定される）と同じ濃度に希釈された、凍結乾燥されたＧＧ３６−ＷＴの溶
液。
【０３４４】 全てのさらなる決定を、方法１のように実施し、そして結果を表２９に示す。
【０３４５】
【表２９】 a,b,c,dは方法１の通り。
【０３４６】 （実施例８） （ビオチン−ＭＴＳの合成） 標的化ステラテジーを明確に実証するためのモデル系としてビオチンのアビジ
ンへの強力な結合を開発するために、ビオチン−ＭＴＳ試薬１を合成した。
【０３４７】 選択した合成ストラテジーにおいて（図１６、スキーム７）、本発明者らは、
以前の研究が、分子のこの部分の機能化が、アビジンに対する親和性を保存する
ことを示したように（Ｇｒｅｅｎ（１９７５）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅ
ｍ．２９：８５−１３３；Ｇｒｅｅｎ（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．
１８４：５１−６７）、メタンチオスルホネートを導入するポイントとしてビオ
チンのカルボン酸基を選択する。
【０３４８】 ＮａＢＨ4を使用するＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステル（３）（文献の
方法（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら（１９８４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２７：１
４０６−１４１０）に従って６１％の収率で（＋）−ビオチン（２）から合成さ
れた）を還元する最初の試みは、乏しい１５％の収率の（＋）−ビオチノール（
４）を与えたのみであった。対照的に、（＋）−ビオチン（２）のＬｉＡｌＨ４
での直接的な還元は、４を適切な収率で与えた（ＦｌａｓｔｅｒおよびＫｏｈｎ
（１９８１）Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．１８：１４２５−１４３６）。
ＴＨＦが（＋）−ビオチンの非常に低い収率を与えるのみであるので、溶媒とし
てのエーテルの使用は、この完全の成功に対して重要である。
【０３４９】 ビオチノール（４）は、本発明者らの確立された調製手順に従って、対応する
第１級メシレートおよびブロミドを介して標的ビオチン−ＭＴＳに合成された。
ＭｓＣｌの使用は、第１級クロリドの競合形成の結果として、メシレートの中程
度の収率に導くのみであった。結果的に、ビオチノール（４）は、ピリジン／Ｄ
ＣＭ中のメシル無水物（ｍｅｓｙｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、次いで、還流
アセトン中のＬｉＢｒおよび最終的に、ＤＭＦ中のＮａＳＳＯ2Ｍｅで処理され
て、３工程で５４％の収率で、標的ビオチン−ＭＴＳ１をえた（（＋）−ビオチ
ン（２）からの３７％の全収率）。この合成をスケールアップする試みは、収率
の減少を与えた。
【０３５０】 （実験：） （ヒドロキシスクシンアミドエステル（３）を介する（＋）−ビオチノール） １，１’−ジカルボニルイミダゾール（３６０ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）を、
ＤＭＦ（１０ｍＬ）の（＋）−ビオチン（２）（５４０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）
の攪拌溶液にＮ2下で添加し、そして得られた溶液をＣＯ2の展開（ｅｖｏｌｕｔ
ｉｏｎ）が中断するまで（約３０分）、加熱した。この溶液を、室温に冷却し、
さらに２時間攪拌し、その時間の間に、固体が、溶液から沈澱した。ＤＭＦ（１
０ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２６０ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）
の溶液を添加し、そしてこの混合物を攪拌した。さらなる６時間後、反応溶媒を
除去し、そして残渣を最初にプロパン−２−オール（ｍｐ１８７〜１８７℃）か
ら再結晶し、次いで、ＤＭＦ／プロパン−２−オールから再結晶して、３（４５
７ｍｇ、６１％）を白色固体として得た；ｍｐ１９７〜２０１℃（ＤＭＦ／プロ
パン−２−オール）［文献、Ｂｅｃｋｅｒら（１９７１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６８：２６０４−２６０７；文献、Ｐａｒａｍｅ
ｓｗａｒａｎ（１９９０）Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｌ．２２：１１
９−１２１，ｍｐ２１０℃］；
【０３５１】
【数４】 ＮａＢＨ４（５０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を、窒素下、ＴＨＦ／ＨＭＰＡ（
４０：１，４１ｍＬ）中で攪拌された３（１７０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の懸濁
液に添加した。４．５時間後、反応溶媒の体積を減少させ、そして得られた残渣
を水でクエンチした。残渣をさらに真空下で乾燥し、フラッシュクロマトグラフ
ィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3，１：１９）により精製して、４（１７ｍｇ、１５
％）を白色固体として得た。
【０３５２】 （５−（［３ａＳ−（３ａα，４β，６ａα］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−
１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンチルメタンチオスル
ホネート［（＋）−ビオチンＭＴＳ］（１）） （＋）−ビオチン（２）（１９６ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を、窒素下で、８０
℃に注意深く加温することによって、ピリジン（５ｍＬ）に溶解した。得られた
溶液を、窒素下で、新たに蒸留した乾燥エーテル（２５ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ4
（１９６ｍｇ、５．１５ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴下した。３０分後、得られた混
合物を加熱して還流した。さらなる４０分後、ｔｌｃ（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3，
１：９）は、出発物質（Ｒｆ０．４５）からの主生成物（Ｒｆ０．３５）の形成
を示した。この反応系を冷却し、そして残るＬｉＡｌＨ4を水の滴下によってク
エンチした。発泡が消えた後、さらなる水（１００ｍＬ）を添加し、そして溶媒
を除去した。残渣を、真空下で一晩乾燥し、次いで、フラッシュクロマトグラフ
ィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3、１：１９）により精製して、（＋）−ビオチノー
ル［３ａＳ−（３ａα，４β，６ａα］−テトラヒドロ−４−（５−ヒドロキシ
ペンチル）−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−２（３Ｈ）−オン（４
）（１２８ｍｇ、６９％）［５３９０６−３６−８］を白色固体としてえた；ｍ
ｐ １６８−１７２［文献、米国特許第２，４８９，２３７号、ｍｐ １７４．
５−１７５．５（ＭｅＯＨ）］；［α］２８Ｄ＝＋９１．２（ｃ０．４３，Ｍｅ
ＯＨ）［文献、［α］２８Ｄ＝＋８４．７（ｃ１、ＭｅＯＨ）］；
【０３５３】
【数５】 Ｍｓ2Ｏ（７８ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）がピリジン／ＤＣＭ（１：１、４ｍ
Ｌ）中の４（８０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下で添加した。１４
時間後、溶媒を除去した。残渣をＣＨＣ１3（３０ｍＬ）に溶解し、洗浄し（水
（１０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ））、乾燥し（ＭｇＳ０4）、濾過し、そし
て、溶媒を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣ
１3，１：５０）によって精製し、メシレート［３ａＳ−（３ａα，４β，６ａ
α）］−テトラヒドロ−４−［５−（メタンスルホニル）ペンチル］−１Ｈ−チ
エノ［３，４−ｄ］イミダゾール−２（３Ｈ）−オン（８３ｍｇ，７７％）を黄
色の油状物として得た；スケールアップは、メシレートを薄黄色の固体として提
供した；ｍｐ１３４−１３６；ＩＲ（フィルム）３４３２（ＮＨ），１７０２
（アミドＩ），１６３６（アミドＩＩ）ｃｍ-1；
【０３５４】
【数６】 ＬｉＢｒ（８０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を、アセトン（２ｍＬ）中のメシレ
ート（４０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下で添加し、そして得られ
た溶液を還流下で加熱した。１４時間後、ｔｌｃ（ＭｅＯＨ：ＣＨＣ１3，１：
９）は、出発物質（Ｒｆ ０．４５）の生成物への転換を示した。溶媒を除去し
、そして残渣をエーテル（３０ｍＬ）と水（１０ｍＬ ）との間に分配した。水
分画をさらに、臭化物がより可溶性であるＣＨＣｌ3（３０ｍＬ ２）で抽出し
た。有機分画を合わせ、乾燥し（ＭｇＳ０4）、濾過し、そして溶媒を除去して
、粗臭化物［３ａＳ−（３ａα，４β，６ａα）］−テトラヒドロ−４−（５−
ブロモペンチル）−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−２（３Ｈ）−オ
ン（２８ ｍｇ、７４％）を黄色の油状物として得、これを次の行程で直接使用
した。スケールアップは、生成物を薄黄色の固体として提供した；ｍｐ １５７
〜１５９。
【０３５５】 ＮａＳＳＯ2Ｍｅ（１５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）中の
粗臭化物（２４ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、得られた溶液を５０
℃で窒素下で加熱した。１９時間後、ｔｌｃ（ＭｅＯＨ：ＣＨＣ１3，１：９）
は、出発物質（Ｒｆ ０．４５）からの主生成物（Ｒｆ ０．３５）の形成を示
した。溶媒を除去し、そして残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：
ＣＨＣ１3、１：１９、次いで３：９７）の繰り返しによって、１（２５ｍｇ，
９４％，（＋）−ビオチン（２）から３７％）をアモルファスな固体として得た
；スケールアップは、１を薄黄色の固体として提供した；［α］D 26＋４２．１
（ｃ，ＣＨＣ１3中０．６２）；ＩＲ（フィルム）３２１５ （ＮＨ），１６９
９（Ｃ＝Ｏ），１３１０，１１２９（Ｓ−ＳＯ2）ｃｍ-1；
【０３５６】
【数７】 （実施例９） （ビオチン−ＣＭＭの調製および特徴付け） Ｂｉｏｔｉｎ−ＭＴＳ試薬１を使用して、Ｎ６２Ｃ、Ｌ２１７Ｃ、Ｓ１６６Ｃ
、およびＳ１５６Ｃ変異体のビオチニル化ＣＭＭを、標準的なプロトコルに続い
てｐＨ９．５での反応によって、調製した。全ての場合において、得られた酵素
は、修飾後活性であった。
【０３５７】 （ビオチン−ＣＭＭのアミダーゼ速度論） アミダーセ速度論およびＥＳＭＳについてのデータが、表３０に示される。
【０３５８】
【表３０】 ０．１Ｍ ＴＲＩＳ緩衝液，ｐＨ ８．６，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ８０，
１％ ＤＭＳＯ中の初期速度の方法によって、２連で決定した速度定数。 ［Ｓ］＝０．１２５ｍＭ〜３ｍＭ、［Ｅ］＝１．４ １０-8Ｍ〜２．４ １０-8 Ｍ。
【０３５９】 全てのビオチン−ＣＭＭは、ＳＢＬ−ＷＴ（ｋcat／ＫM＝２０９ １５）より
小さい触媒活性を有した。
【０３６０】 Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭおよびＬ２１７Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭに対
する値は、類似し、そしてＳＢＬ−ＷＴと比較してｋcatの減少を示し、ここで
、ｋMの変化は無視できる。
【０３６１】 Ｓ１６６Ｃ変異体のビオチン−ＭＴＳ試薬を用いる修飾は、ＳＢＬ−ＷＴと比
較して、４倍低いｋcat／ＫMを与えた。Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭはまた
、全てのビオチニル化ＣＭＭｓの最も低いｋcat／ＫMを有した。ｋcatおよびＫM の両方は、このＣＭＭについて変更される。
【０３６２】 Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭは、ＳＢＬ−ＷＴと比較して、わずかに減少し
たｋcatを有し、そして全てのビオチン−ＣＭＭの最も高いＫMを有するが、それ
は、これらビオチニル化ＣＭＭのなおも最も活性なものである。
【０３６３】 （ビオチン−ＣＭＭのエステラーゼ速度論） エステラーゼ速度論動力学を、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ＳＢｎを基質として用いる
標準のプロトコルに従って、ビオチン−ＣＭＭについて実行した。結果を、表３
１に示す。
【０３６４】
【表３１】 ０．１Ｍ ＴＲＩＳ緩衝液，ｐＨ ８．６，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ８０，
１％ ＤＭＳＯ中の初期速度の方法によって、２連で決定した速度定数。［Ｓ］
＝０．０１５ｍＭ〜３ｍＭ、［Ｅ］＝０．８×１０-9Ｍ〜１．２×１０-9Ｍ。
【０３６５】 エステラーゼ活性についてのｋcat／ＫM結果が、アミダーゼ速度論と比較して
同じ傾向につづく。
【０３６６】 Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭは、最も小さいｋcat／ＫMを示し、これは、
ＳＢＬ−ＷＴに対して約４倍低い。
【０３６７】 ビオチン−ＣＭＭは、唯一の例外としてＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭを有
するＳＢＬ−ＷＴ比較して、約４倍低いｋcatを有する。Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオ
チンＣＭＭのｋｃａｔは、ＳＢＬ−ＷＴに対して約２倍小さく、そして従って、
他のビオチン−ＣＭＭと比較して２倍高い。しかし、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン
ＣＭＭは、全てのビオチニル化ＣＭＭの最も活性なのもではない。なぜなら、そ
れは、最も高いＫM値を有するからである。Ｓ１５６-Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭお
よびＬ２１７Ｃ−Ｓ−ビオチンは、非常に類似しており、ＳＢＬ−ＷＴに対して
約３倍小さいが、ｋcatおよびＫMは、大きな差異を示す。
【０３６８】 ビオチン−ＣＭＭのＫM値は、ＳＢＬ−ＷＴと比較して、Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビ
オチンＣＭＭおよびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭに対してより高かった。と
ころが、Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭおよびＬ２１７Ｃ−Ｓ−ビオチンに対す
る値は、ＳＢＬ−ＷＴと比較して、約２倍小さい。
【０３６９】 Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭは、全てのビオチニル化ＣＭＭの最も小さいＫ M を有し、そしてＳＢＬ−ＷＴより２．６倍小さい。それはまた、ビオチン−Ｃ
ＭＭの最も小さいｋcatを有するが、それは、最も高い触媒活性を有し、この活
性は、ＳＢＬ−ＷＴよりなお１．８倍小さい。
【０３７０】 （実施例１０） （結合タンパク質の標的化−アビジンのビオチン-ＣＭＭを用いる標的かおよ
び加水分解） ビオチニル化タンパク質は、ビオチンが、高分子の表面から分離される場合の
みに、アビジンに結合することが文献から公知であり、ビオチンは少なくとも５
つのメチレン基によって共有結合されている（Ｇｒｅｅｎ（１９７０）Ｍｅｔｈ
．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８Ａ：４１８４２４）。さらに、Ｗｉｌｃｈｅｋらは、蛋
白分解性酵素が、アビジンを切断し得ないことを観測した。プロテアーゼが、ビ
オチニル化されていない場合でさえ、アビジンは切断されない（Ｂａｙｅｒら（
１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：１１２７４−１１２７９）。
【０３７１】 このプロジェクトにおける本発明者らのゴールは、ただそれを論証しもするた
めに、本発明者らの新しいビオチン−ＣＭＭのアビジンへの標的化を確立するこ
とだけでなく、ＣＭＭが、アビジン蛋白分解を触媒し得ることを立証するとこで
ある。ＳＢＬ−ＷＴ（これは、アビジンを複合体化し得ないが、非選択的なプロ
セスにおいてアビジンを加水分解し得る）を、比較のために使用する。
【０３７２】 グリコシル化ＣＭＭでのレクチン分解を立証するために、以前に使用された比
色定量法が、標的アビジンへの合成ビオチン−ＣＭＭのアビジンを標的化する能
力をアッセイするために使用された。本発明者らは、ＨＡＢＡ／アビジン試薬か
らのＨＡＢＡの放出（これは、５００ｎｍでの吸光度の増加によって検出された
）を測定した。全てのビオチニル化ＣＭＭを試験し、そして使用したＣＭＭの量
を、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを用いて、ｋcat／ＫMに基づいて互いに比較して
等しい触媒活性について補正した。それゆえ、アビジンを標的化する、本発明者
らのビオチン−ＣＭＭの能力の差異が議論され得る。
【０３７３】 アビジンを標的化するだけでなく、加水分解する本発明者らのビオチン−ＣＭ
Ｍの能力を調べるために、本発明者らは、本発明者らのビオチニル化ＣＭＭを用
いるアビジンの標的化についてのアッセイおよびアビジンの加水分解についての
アッセイを分離することに決定した。
【０３７４】 上記のように、標的化は、ＨＡＢＡ／アビジン溶液からのＨＡＢＡの放出を、
５００ｎｍで測定することによって、明確に証明され得る。ここで、本発明者ら
は、この方法をアビジンについての標的化アッセイのために使用することに興味
があるのみであるので、本発明者らは、ＨＡＢＡ放出を５分間にわたって測定し
た。Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンについてのみ、導入されたビオチン側鎖は、表面
曝露され、従って、アビジンの結合に対して容易にアクセス可能であるという事
実に関わらず、驚くべきことに、全てのビオチン−ＣＭＭは、ＨＡＢＡ／アビジ
ンの緩衝化溶液に添加され場合、即座のＨＡＢＡ放出を引き起こす。その表面曝
露のために、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン他のＣＭＭと比較して、最も高いＨＡＢ
Ａ放出を生じた。
【０３７５】 本発明者らは、ＳＢＬ−ＷＴの溶液（同じ触媒活性について計算された濃度）
との比較および（＋）−ビオチンの添加［（ＰＭＳＦ−値の決定によって）ビオ
チン−ＣＭＭの各々の１つにおいて期待される濃度と同じ濃度に希釈された］に
よって、標的化プロセスを制御した。
【０３７６】 立体配置の理由のために、（＋）−ビオチンは、本発明者らのＣＭＭのビオチ
ン化側鎖より、アビジンに結合するためにより利用しやすいので、本発明者らは
、ビオチン／ＷＴ混合物と比較して、全てのビオチン−ＣＭＭについてのより小
さな、または最良の場合には、同じＨＡＢＡ放出を予測した。
【０３７７】 Ｓ１６６Ｃ−、Ｎ６２Ｃ−およびＬ２１７Ｃ−Ｓ−ビオチンにより、本発明者
らの予測が確かになったが、Ｓ１５６Ｃ ＣＭＭは、強烈により高いＨＡＢＡ放
出を与えた。
【０３７８】 従って、本発明者らは、凍結乾燥によりＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン溶液の全タ
ンパク質量を決定し、そして再びビオチン量を決定した（Ｂ２ａ）。この場合、
ビオチン／ＷＴ混合物についてのＨＡＢＡ放出がＳ１５６Ｃ ＣＭＭより高く、
そして本発明者らは、ＣＭＭ溶液中にビオチン基を有する不活性酵素があり得る
ことを示唆する。
【０３７９】 ＳＢＬ−ＷＴおよびビオチン−ＣＭＭによりそれぞれ触媒されたアビジン加水
分解の決定のために、本発明者らは、レクチンアッセイ法を採用し、そして３０
００Ｄａ未満の加水分解フラグメントについてＡ280で測定した。このＣＭＭは
標的化アッセイにおいて最良の酵素であることが判明したので、このレクチンア
ッセイをＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンについて行った。比較を可能にし、そして非
選択的加水分解を実証するために、ＳＢＬ−ＷＴを、ビオチン−ＣＭＭ溶液と同
じ触媒活性に希釈した溶液として使用した。
【０３８０】 ＨＡＢＡ／アビジンおよび酵素を用いた最初の測定により、おそらくＨＡＢＡ
により生じた異常が明らかになり、従って、本発明者らは、アビジン単独でこの
アッセイを行うことを決定した。アビジン加水分解の選択性を決定するために、
上記のレクチンアッセイと同様に、デコイタンパク質、ジスルフィドスクランブ
ルＲＮＡｓｅＡ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ＲＮＡｓｅＡ）を
使用した。溶液をそれぞれ１時間および４時間インキュベートし、そして加水分
解産物である小さなタンパク質フラグメント（３０００Ｄａ未満）をサイズ排除
膜を用いてにより分離した。Ａ２８０の測定により、総タンパク質フラグメント
濃度が与えられ、従って、これは、アビジン加水分解の指標である。
【０３８１】 ＳＢＬ−ＷＴおよびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンの両方もまたアビジンを加水分
解し得る。酵素濃度は、標準的アミダーゼ基質であるｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ
を用いて等しい触媒活性に対して計算されるので、加水分解値は直接比較され得
る。従って、本発明者らは、アビジンがＳＢＬ−プロテアーゼにより加水分解さ
れるのみならず、ビオチン化プロテアーゼによってより効率的に加水分解される
こともまた実証し得る。Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンは、ＧＧ３６−ＷＴより、２
４０分後に４５％を超えるタンパク質フラグメントを生じる。デコイタンパク質
の存在下で［０．０５ｍｇ，デコイ（１）］、生成された総タンパク質の量は、
ＷＴ酵素に関して強烈に増加した（２４０分後に２７％）。それに対して、総タ
ンパク質の産生量は、ビオチン−ＣＭＭに関しては有意に変化しなかった。しか
し３倍高いレベルのデコイタンパク質［０．１５ｍｇ，デコイ（２）］が、総タ
ンパク質の産生量を増大させることにおいてＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンについて
生じた（２４０分後に３８％）。このことは、アビジンについての選択性の減少
を示す。異なる量のビオチンを添加したＧＧ３６−ＷＴについてのコントロール
とともに行った研究において、差異はかなり小さかった。
【０３８２】 （実験） （アビジン標的化アッセイ（ＨＡＢＡの置換）） １２の使い捨てキュベットを表３２に示すように満たした（ビオチンおよび酵
素添加測定（Ａ500）の前）：
【０３８３】
【表３２】 a アッセイ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８
．６。b １０ｍＬのミリＱ水で調製したＨＡＢＡ／アビジン試薬（Ｓｉｇｍａ）。c ２００μＬのＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ５
．８）。d アッセイ緩衝液中の活性Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．３２９ｍｇ／ｍＬ
）２００μＬと同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ
）の溶液。e １０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８（ＰＭＳＦ較正した）中
で凍結乾燥したＧＧ３６−ＷＴの溶液。f アッセイ緩衝液中の活性Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．５３４ｍｇ／ｍＬ
）２００μＬと同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ
）の溶液。g アッセイ緩衝液中の活性Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．２６０ｍｇ／ｍＬ）
２００μＬと同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）
の溶液。h アッセイ緩衝液中の活性Ｌ２１７Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．３５９ｍｇ／ｍＬ
）２００μＬと同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ
）の溶液。i アッセイ緩衝液中のＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン２００μＬのタンパク質量（
凍結乾燥により決定された）と同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチ
ン（Ｓｉｇｍａ）の溶液。
【０３８４】 ビオチンおよび酵素を添加する前に、Ａ500が安定化するまで（５〜１０分）
キュベットを分光光度計中で平衡化した。ビオチンおよび酵素をそれぞれ添加し
、Ａ500を５分間測定した。表３３は、アッセイ結果を示す：
【０３８５】
【表３３】 a 酵素（およびビオチン）を添加する前のＨＡＢＡ／アビジンおよび緩衝液の
混合物。b 酵素（およびビオチン）を添加して５分後の値。c サンプルに対する吸光度におけるＨＡＢＡ／アビジン低下と希釈単独により
生じた吸光度（コントロール）の低下との間の差異から計算した。
【０３８６】 （Ｓ１５６Ｃ−ビオチンのみに対して測定した（Ａ280測定を介した）アビジ
ン加水分解アッセイ） ２０の使い捨てエッペンドルフバイアルを表３４に示すように満たした。
【０３８７】
【表３４】 a アッセイ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８
．６。b ミリＱ水中のアビジン（Ｓｉｇｍａ）の５ｍｇ／ｍＬ溶液。c ミリＱ水中のを含有するＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ ｗｉｔｈ Ｓｃｒ
ａｍｂｌｅｄ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ（Ｓｉｇｍａ）の０．５ｍｇ／
ｍＬ溶液。d ２００μＬのＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ
５．８）。e １０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８中のビオチン−ＣＭＭと
同じ触媒活性（ｓＡＡＰＦＮＡでの初期速度論により決定された）に希釈した凍
結乾燥ＧＧ３６−ＷＴの溶液。f アッセイ緩衝液中の活性Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．３２９ｍｇ／ｍＬ
）２００μＬと同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ
）の溶液。g アッセイ緩衝液中のＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン２００μＬのタンパク質量（
凍結乾燥により決定された）と同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチ
ン（Ｓｉｇｍａ）の溶液。
【０３８８】 サーモスタット制御水浴中で、示された時間の間、これらの溶液を３５℃でイ
ンキュベートした。次いで、適切なバイアルの内容物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−Ｓ
Ｒ３ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ，ＭＷＣＯ ３０００、２ｍＬ
のミリＱ水により３７５０ｒｐｍで９０分間遠心分離して予めきれいにした）の
上に各々配置し、そして３７５０ｒｍで６０分間遠心分離した。次いで、得られ
た濾液を表３５に示すようにアッセイした。
【０３８９】
【表３５】 a ミリＱ水ブランク（１ｍＬ）と比較して、３００μＬのミリＱ水で希釈した
アビジン加水分解アッセイ濾液７００μＬについての値。
【０３９０】 （アビジンなしのコントロール） アビジンの１００μＬのアリコートを１００μＬのミリＱ水で置き換えたこと
を除いて、アビジン加水分解アッセイのようにアッセイを行った；Ｓ１５６Ｃ−
Ｓ−ビオチンおよびより多量のデコイタンパク質［０．１５ｍｇ、デコイ（２）
］についての測定をアビジンなしのコントロールのように反復しなかった（表３
６を参照のこと）。
【０３９１】
【表３６】 a 上記のとおり。
【０３９２】 （Ｓ１６６Ｃ−ビオチン、Ｌ２１７Ｃ−ビオチンおよびＮ６２Ｃ−ビオチンを
用いた（Ａ280測定を介した）アビジン加水分解アッセイ） アビジン加水分解アッセイを、以前に報告したＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンに加
えて、Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンおよびＳ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチンについても行っ
た。比較のために、本発明者らは、Ｓ１５６Ｃ ＣＭＭについての結果を再び報
告する。
【０３９３】 Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンは、ＳＢＬ−ＷＴより、２４０分後に７２％を超え
るタンパク質フラグメントを生じる。デコイタンパク質［０．０５ｍｇ］の存在
下で生成された総タンパク質の量はＷＴ酵素に関して強烈に増加する（２４０分
後に２３％）に対して、ビオチン ＣＭＭに関しては、総タンパク質の産生量は
、有意に変化しない。
【０３９４】 Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンは、２４０分後にＳＢＬ−ＷＴとほぼ同じ量のタンパ
ク質フラグメントを提供する。しかし、デコイの存在下では、Ｎ６２Ｃ ＣＭＭ
は、２４０分後に５％を超えるタンパク質放出を与えるに過ぎず、従って、ＳＢ
Ｌ−ＷＴ（２４０分後に２３％を超えるタンパク質フラグメント）より明らかに
より選択的である。この結果は、ビオチン部分に曝された表面を含むＳ１５６Ｃ
ＣＭＭと比較して、Ｎ６２Ｃ ＣＭＭによるタンパク質加水分解全体があまり
効率的でないので、Ｎ６２Ｃ ＣＭＭのビオチン側鎖が利用しにくいことを示唆
する。しかし、Ｎ６２ ＣＭＭにおいてビオチン側鎖が触媒中心に隣接している
ので、そのアビジン加水分解選択性は、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンとほぼ同じく
らい効率的である。
【０３９５】 Ｓ１６６Ｃ ＣＭＭは、ＳＢＬ−ＷＴと比較して７％を超えるタンパク質放出
を与えるが、デコイタンパク質の存在下ではかなり非選択的である［２４０分後
のＳＢＬ−ＷＴに関して２３％と比較すると、１８％タンパク質フラグメント］
。この酵素は、「アビジン標的化アッセイ」において二番目に最良なビオチン−
ＣＭＭであることが判明したが、「アビジン加水分解アッセイ」に対してはＮ６
２Ｃ ＣＭＭよりあまり選択的でない。おそらくＳ1ポケットに埋没したビオチ
ン側鎖は、アビジン標的化には利用可能であるが、アビジン加水分解の有効性お
よび選択的触媒についてはコンホメーション的にあまり都合が良くない。
【０３９６】 （実験） １４の使い捨てエッペンドルフバイアルを表３７に示すように満たした。
【０３９７】
【表３７】 a アッセイ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８
．６。b ミリＱ水中のアビジン（Ｓｉｇｍａ）の５ｍｇ／ｍＬ溶液。c ミリＱ水中のｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ ｗｉｔｈ Ｓｃｒａｍｂｌｅ
ｄ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ（Ｓｉｇｍａ）の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液。 d ２００μＬのＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ５
．８）。e １０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８中のビオチン−ＣＭＭと
同じ触媒活性（ｓｕｃｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡでの初期速度論により決定された）
に希釈した凍結乾燥ＧＧ３６−ＷＴの溶液（ビオチン−ＣＭＭの濃度はｆを参照
のこと）。f Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．３２９ｍｇ／ｍＬ）、Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオ
チン（０．２６０ｍｇ／ｍＬ）、Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．５３４ｍｇ／
ｍＬ）；ビオチン−ＣＭＭの濃度は、同じ触媒活性（ｓｕｃｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮ
Ａでの初期速度論により決定された）に対して計算した；１０ｍＭ ＭＥＳ、１
ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８中の溶液。g 活性ビオチン−ＣＭＭの２００μＬ（Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンについては
、０．０６０ｍｇ／ｍＬ ビオチン、Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンについては、０．
０４７ｍｇ／ｍＬ ビオチン、Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチンについては０．０９７
ｍｇ／ｍＬ ビオチン）と、またはアッセイ緩衝液中のＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチ
ン２００μＬのタンパク質量（凍結乾燥により決定された；０．６４９ｍｇ／ｍ
Ｌ ビオチン）と同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍ
ａ）の溶液。
【０３９８】 サーモスタット制御水浴中で、示された時間の間、これらの溶液を３５℃でイ
ンキュベートした。次いで、適切なバイアルの内容物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｓ
Ｒ３またはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−ＹＭ−３ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉ
ｃｏｎ，ＭＷＣＯ ３０００、２ｍＬのミリＱ水により３７５０ｒｐｍで９０分
間遠心分離して予めきれいにした）の上に各々配置し、そして３７５０ｒｐｍで
６０分間遠心分離した。次いで、得られた濾液をアッセイし、そして結果を表３
８、表３９、表４０、表４１、および表４２に示す。
【０３９９】
【表３８】 a ミリＱ水ブランク（１ｍＬ）と比較して、アビジン加水分解アッセイ濾液の
７００μＬ（３００μＬのミリＱ水で希釈した）に対して三連で決定した値。
【０４００】
【表３９】 a ミリＱ水ブランク（１ｍＬ）と比較して、アビジン加水分解アッセイ濾液の
７００μＬ（３００μＬのミリＱ水で希釈した）に対する値。b １００μＬのデコイタンパク質の代わりに３００μＬを使用した。
【０４０１】
【表４０】 a 上記の通り。
【０４０２】
【表４１】 a 上記の通り。
【０４０３】
【表４２】 a 上記の通り。b 活性Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンと同じビオチン量。c 活性Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンと同じビオチン量。d 活性Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチンと同じビオチン量。e 総タンパク質量（活性および不活性酵素）について計算した活性Ｓ１５６Ｃ
−Ｓ−ビオチンと同じビオチン量。
【０４０４】 （実施例１１：ハプテン修飾サブチリシンを使用する標的化抗体） 酵素の標的化分解の延長として、本発明者らは、ＳＢＬによる抗体のハプテン
特異的分解（ｈａｐｔｅｎ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｅｇｒａｄｅａｔｉｏｎ）に
焦点を当てた。この実施例は、抗ビオチン抗体／ビオチン系を用いた抗体標的化
を示す。
【０４０５】 （ビオチンＭＴＳおよびビオチン化ＣＭＭの調製） 抗ビオチンをＳＢＬで標的化するために、本発明者らは、本発明者らの変異酵
素にビオチン−ＭＴＳ試薬を結合させた。ビオチン−ＭＴＳの合成を、実施例８
に概説されるように行った。ＣＭＭの各々を、標準的プロトコルに従って調製し
た（例えば、実施例９に記載）。全てのＣＭＭをＭＡＬＤＩ技術を用いて特徴付
けした。この技術は、±０．２〜０．５％の大きさで方法依存性誤差を有する。
結果を表４３および表４４に示す。
【０４０６】
【表４３】 新たなビオチン化ＣＭＭのアミダーゼ活性を決定した。そしてこの活性は、上
記の実施例９に記載のように同じ傾向を示す。この結果を表４４に示す。
【０４０７】
【表４４】 （ビオチン化ＣＭＭについての抗ビオチンに対する標的化アッセイ） ビオチンに対する（抗ビオチン）抗体は、何も結合していない（ｆｒｅｅ）抗
体または酵素結合体のいずれかとして市販されている。本発明者らは、本発明者
らのモデル標的抗体として、アルカリホスファターゼに結合体化した抗ビオチン
を選択した。標準的な酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術を
用いて、本発明者らは、本発明者らのＣＭＭが抗体を標的化する能力を示し得た
。実験を、図１７に模式的に概説する。
【０４０８】 本発明者らの最初のアッセイシリーズを、ポリスチレン９６ウェルプレートで
（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡ，５６４〜５９７頁）、ＥＬＩＳＡ技術を用いて行っ
た（図１７）。ＣＭＭをプレート表面に４℃で一晩固定化した［ポリスチレンプ
レートに対するタンパク質の代表的な結合は、約１００ｎｇ／ウェル（３００ｎ
ｇ／ｃｍ2）である］。本発明者らの場合、酵素溶液で各ウェルを十分に満たさ
なかったので、あまり多くのタンパク質は結合していない。プレート上の残りの
結合部位をＢＳＡでブロックした後、非結合タンパク質（緩く結合した抗体およ
びＢＳＡ）をＴｗｅｅｎを含むリン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．２（ＰＢＳＴ
）で２回洗い流した。（Ｔｗｅｅｎをこの緩衝液において使用して、結合してい
ないポリスチレン表面に抗体が結合することを妨げた）。次いで、抗ビオチンを
各ウェルに添加し、そして４℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ
Ｔで（４回）洗浄して、緩い、結合していないタンパク質を除去し、次いで、グ
リシン緩衝液、ｐＨ１０．４で（２回）洗浄して、リン酸緩衝化生理食塩水を洗
い流し、そしてアルカリホスファターゼ活性のためにｐＨを最適化した。ビオチ
ン−ＣＭＭ／抗ビオチン結合をアッセイするために、抗体に結合体化したアルカ
リホスファターゼの酵素活性を使用した。ホスファターゼ基質［グリシン緩衝液
（ｐＨ１０．４）中のｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（ＰＮＰＰ）の
溶液]を添加し、そして反応を４℃で行った。ｐ−ニトロフェノレートの放出を
９６ウェルプレートを用いて視覚的に決定した（図１７）。
【０４０９】 ９６ウェルの結果から、本発明者らは、ＰＮＰＰ基質の量が、本発明者のビオ
チン−ＣＭＭの抗ビオチンに対する標的化能力の差異を実証するために非常に重
要であることを見い出した。多量の基質を使用して、本発明者らは、異なるＣＭ
Ｍ間を区別することが出来なかった。なぜなら、全て、３０分以内に明黄色を生
じたからである。しかし、この色の変化が、この場合において非常に迅速であっ
たので、本発明者らは、プレート上のＳ１５６Ｃ−ビオチンの位置をなお識別し
得た。
【０４１０】 本発明者らはまた、ＷＴ−ＳＢＬおよびＣＭＭ−ＳＢＬに対するインヒビター
としてＰＭＳＦを使用して（ＳＢＬは、抗ビオチンを加水分解して、ネガティブ
な結果を導き得るので）、コントロール反応を行った。ＰＭＳＦを含む反応とＰ
ＭＳＦを含まない反応との間には、差異が見い出されなかった。従って、本発明
者らは、以下の実験からこの試薬を除外した。
【０４１１】 ９６ウェルプレート実験についてのプロトコールおよび条件と、同じプロトコ
ルおよび条件を使用して、後者の実験を、ポリスチレンキュベット中で行い、そ
してＰＮＰＰ（１ｍＬ中、１５０μＬ）から放出されたｐ−ニトロフェノレート
の吸収（Ａ405）を、分光光度的にモニターした（表４５）。高い希釈度のＰＮ
ＰＰを使用したので、この反応を、長時間モニターした。キュベットを使用する
このアッセイの結果は、９６ウェルプレートからの結果と必ずしも一致しないこ
とに留意すべきである。これは、おそらく、９６ウェルプレートが、タンパク質
結合用に開発されているという事実に起因した。このアッセイの結果を、表３７
に示す。
【０４１２】
【表４５】 全てのＣＭＭは、ＷＴと比較した場合に、ｐ−ニトロフェノレートのより高い
放出を生じた。Ｓ１５６Ｃ−ビオチンが、最も高いｐ−ニトロフェノレート放出
（３０時間後で、ＷＴよりも８６．５％高い）を誘導することが見い出され、こ
れは、Ｓ１５６Ｃ−ビオチンが、抗ビオチンＩｇＧ標的化について最も有能なＣ
ＭＭであることを示す。
【０４１３】 さらなる実験は、ＰＮＰＰの濃度を増加して（１ｍＬ中、３００μＬ）、観察
時間を短縮し得るということを示唆した。ｐ−ニトロフェノレート放出の傾向は
、低いＰＮＰＰ濃度のアッセイの場合と同じである。この結果を、表４６に示す
。
【０４１４】
【表４６】 全てのビオチン化ＣＭＭは、ＷＴと比較して、ｐ−ニトロフェノレート放出の
増加を生じた。従って、ビオチン−ＣＭＭの抗ビオチンに対する結合は、生じた
はずである。これらのアッセイの結果（表３７および表３８）は、本発明者らの
ビオチン化ＣＭＭがビオチン−抗体を標的化する能力を、明らかに実証する。
【０４１５】 （ビオチン化ＣＭＭによる抗ビオチンの「加水分解」アッセイ） 次に、本発明者らは、本発明者らのＣＭＭが抗ビオチンを選択的に加水分解す
る能力を実証することに取り組んだ。本発明者らは、ＳＢＬ媒介アビジン加水分
解の間のタンパク質フラグメントの放出をモニターするために、首尾よく使用さ
れるアプローチを採用した。等濃度の活性酵素（ＰＭＳＦ力価測定によって決定
されるように）を、これらの実験において使用したことに留意すべきである。こ
れらの酵素および抗ビオチンＩｇＧを、Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ８．６）中、３５℃で、６０分間および２４
０分間インキュベートした。以前に報告されたように、サイズ排除膜を使用して
、タンパク質フラグメントを粗加水分解物から分離した。２８０ｎｍでの吸収の
測定によって、これらの放出されたタンパク質フラグメントの濃度が与えられた
。この結果を、表４７に示す。
【０４１６】
【表４７】 これらの結果（１つ（Ｌ２１７Ｃ−ビオチン）を除く）は、本発明者らのＣＭ
Ｍが、抗ビオチンをＷＴよりも良好に加水分解し得ることを明確に実証する。こ
れらの結果はまた、全てのビオチン化ＣＭＭが抗ビオチンを標的化することを示
す標的化の結果（ｐ−ニトロフェノレート放出についてのＡ405アッセイ）に対
応し、従って、ＷＴよりも高いｐ−ニトロフェノレート放出を生じた。
【０４１７】 加水分解が、抗ビオチンに特異的に対するものであったか否かを決定するため
に、本発明者らは、ＲＮＡａｓｅをデコイ（おとり）タンパク質として使用する
、ビオチンアッセイ実験を再度採用した。ＷＴと比較した各ＣＭＭ加水分解につ
いての結果を、表４８、表４９、表５０および表５１に示す。
【０４１８】
【表４８】
【０４１９】
【表４９】
【０４２０】
【表５０】
【０４２１】
【表５１】 a表中の数は、バックグラウンド反応のＡ２８０で補正する。
【０４２２】 これらの実験は、ＣＭＭ触媒反応についての、デコイタンパク質の存在下と非
存在下で行われた反応の間の加水分解の程度における差異が、ＷＴ触媒反応につ
いての差異よりはるかに小さいことを示す。従って、予期されたように、本発明
者らのビオチン化ＣＭＭは、ＷＴよりも、より特異的に抗ビオチンを加水分解す
る。抗ビオチンを含まない（ＳＢＬ−ＣＭＭおよびＲＮＡａｓｅのみ）、ならび
にＳＢＬ−ＣＭＭおよびＴｒｉｓ緩衝液単独を含む（ＲＮＡａｓｅおよび抗ビオ
チンを含まない）、コントロール実験を行った。バックグラウンド吸収は、全て
の場合において有意ではなかった。
【０４２３】 （実験：） （５−（［３ａＳ−（３ａα，４β，６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ
−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンチルメタンチオス
ルホネート［（＋）−ビオチン−ＭＴＳ］） このビオチン−ＭＴＳを、実施例８に記載の手順に従って調製した。
【０４２４】 （材料） リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を、１Ｌの水中、８ｇのＮａＣｌ、０
．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０．２４ｇのＫＨ2ＰＯ4から調製
し、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．２に調整し、そして室温で保存した。１０％のアジ
化ナトリウム溶液を、１００ｍＬ水中、１０ｇのＮａＮ3から調製し、室温で保
存した。ＰＢＳ溶液中の３％ ＢＳＡを、１００ｍＬ水中、３ｇのウシ血清アル
ブミン（フラクションＶ）から調製し、次いで、０．２ｍＬの１０％ＮａＮ3溶
液を添加し、４℃で保存した。Ｔｗｅｅｎを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
ＳＴ）溶液を、１ＬのＰＢＳ溶液中、０．５ｍＬのＴｗｅｅｎ ８０から調製し
た。抗ビオチン溶液（１：３０，０００）溶液を、５０ｍＬの３％ ＢＳＡ／Ｐ
ＢＳ中、１６．６７μＬの抗ビオチン（Ｓｉｇｍａ Ａ−６５６１クローンＢＮ
−３４、濃度１．１５ｍｇ／ｍＬ）から調製し、４℃で保存した。０．１Ｍグリ
シン緩衝溶液（ｐＨ１０．４）を、１Ｌの水中、７．５１ｇのグリシン、２０３
ｍｇの ＭｇＣｌ2 Ｈ2Ｏ、１３６ｍｇのＺｎＣｌ2から調製した。このｐＨを
、１０ＮのＮａＯＨでｐＨ１０．４に調整した。ｐ−ニトロフェニルホスフェー
トの１ｍｇ／ｍＬ溶液を、２０ｍＬの０．１Ｍグリシン緩衝液中、１錠のＰＮＰ
Ｐ（Ｓｉｇｍａ Ｎ−２７６５）（２０ｍｇ）から調製し、４℃で保存した。０
．０６ＭのＰＭＳＦ溶液を、４４９．２μＬのＥｔＯＨ中、４７．２ｍｇのαー
トルエンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）から調製し、０℃で保存した。以下
の酵素を使用した：ＷＴ（１ｍｇ／ｍＬ）、Ｎ６２Ｃ−ビオチン（０．９７ｍｇ
／ｍＬ）、Ｓ１５６Ｃ−ビオチン（０．７１ｍｇ／ｍＬ）、Ｓ１６６Ｃ−ビオチ
ン（１．０９ｍｇ／ｍＬ）、およびＬ２１７Ｃ−ビオチン（１．０ｍｇ／ｍＬ）
。全ての酵素を、ＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ
５．８）に溶解した。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．６）は、１００ｍＬ
水中、１．２１ｍｇのＴｒｉｓからなった。このｐＨを、濃ＨＣｌでｐＨ８．６
に調整した。リボヌクレアーゼＡ（５ｍｇ／ｍＬ）は、１ｍＬ水中、５ｍｇのリ
ボヌクレアーゼＡ（乱雑された（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ジスルフィド結合を有す
る。Ｓｉｇｍａ Ｒ−２６３８）からなる。
【０４２５】 （ポリスチレン９６ウェルプレートを使用する、抗ビオチンに対するＣＭＭ−
ＳＢＬの標的化アッセイ） ５０μＬの各酵素溶液を、図１８に示されるように、ポリスチレン９６ウェル
プレートの各ウェルに添加した。全ての反応を２回行って、結果の再現性を確か
めた。
【０４２６】 このプレートを、４℃で一晩インキュベートした。残存する酵素溶液を、ピペ
ットを使用して除去した。次いで、ＢＳＡ／ＰＢＳ（３％、１００μＬ）を、各
ウェルに添加し、そしてプレートを、ＲＴで１時間インキュベートした。ＢＳＡ
溶液を除去し、そしてプレートをペーパータオルの層上に振り打ちつけて、プレ
ートを乾燥させた。ＰＭＳＦ（１０μＬ）を、１、３、５、７、９、１１列のＡ
およびＢ行に添加した。この手順の後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し（２×）、
そして上記のように乾燥させた。抗ビオチン溶液（３０μＬ）を、１、３、５、
７、９、１１列のＣおよびＤ行を除く、各ウェルに添加し、プレートを、４℃で
２時間維持して、酵素による抗体のタンパク質分解を最小化した。抗ビオチン溶
液を除去し、プレートを、ＰＢＳＴで洗浄して（４×）、結合されていない抗体
を除去し、そして結合されていない抗体を除去するために乾燥させた。このリン
酸緩衝液を除去し、グリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ１０．４）でプレートを洗
浄し（２×）、そしてその後乾燥させることによって、ｐＨをアルカリホスファ
ターゼ活性について調整した。次いで、グリシン緩衝液およびＰＮＰＰ溶液を、
以下の様式でウェルに添加した： １．１、３、５、７、９、１１列のＡ行およびＢ行（すでに、１０μＬのＰＭＳ
Ｆ溶液で処理されている）を、４０μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＰＮＰＰで満たした。
２．２、４、６、８、１０、１２列のＡ行およびＢ行を、５０μＬの１ｍｇ／ｍ
Ｌ ＰＮＰＰで満たした。 ３．２、４、６、８、１０、１２列のＣ行およびＤ行を、２５μＬの１ｍｇ／ｍ
Ｌ ＰＮＰＰ＋２５μＬのグリシン緩衝液で満たした。 ４．２、４、６、８、１０、１２列のＥ行およびＦ行を、１２．５μＬの１ｍｇ
／ｍＬ ＰＮＰＰ＋３７．５μＬのグリシン緩衝液で満たした。 ５．２、４、６、８、１０、１２列のＧ行およびＨ行を、６μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＰＮＰＰ＋４４μＬのグリシン緩衝液で満たした。 ６．１、３、５、７、９、１１列のＣ行およびＤ行を、５０μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＰＮＰＰで満たした。
【０４２７】 アッセイの結果を、以下のように要約し得る： １、２および３行における反応物は、全ての酵素についてほぼ瞬時に黄色に変
わった。１５分後、Ｓ１５６Ｃ−ビオチンについての４行における反応物が、薄
黄色に明らかに変色し始めた。Ｓ１６６Ｃ−は、２０分後に変色し始めた。Ｎ６
２Ｃ−は、１時間後に変色し始めた。１．５時間後、ＷＴおよびＬ２１７Ｃ−に
ついては変色は見られなかった。Ｓ１５６Ｃ−についての６行における反応物は
、２時間後に変色を生じた。全ての反応物が、４℃で一晩のインキュベーション
後に強い黄色を有した。
【０４２８】 （ポリスチレンキュベットを使用する、抗ビオチンに対するＣＭＭ−ＳＢＬの
標的化アッセイ） 酵素および抗ビオチンの固定およびキュベットの洗浄工程は、９６ウェルプレ
ートについて記載された様式と類似の様式で行った。２つの異なる濃度のＰＮＰ
Ｐを使用した。実験は２連で行い、以下の表５２に示すデータは、平均の結果で
ある：
【０４２９】
【表５２】 aグリシン緩衝液は使用して、バックグラウンド吸収をオートゼロにした。
【０４３０】 （ビオチン−ＣＭＭおよびＷＴでの抗ビオチンの「加水分解アッセイ」） エッペンドルフバイアルを、表４３に従って満たした。次いで、これらのバイ
アルを、サーモスタット制御水浴中、３５℃で、６０分間および２４０分間イン
キュベートした。次いで、各バイアルの内容物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ＹＭ−
３フィルター（Ａｍｉｃｏｎ，ＭＷＣＯ ３０００（２ｍＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水
を用いて、３７５０ｒｐｍで９０分間遠心して予めリンスした））の上に配置し
、３７５０ｒｐｍで６０分間遠心分離した。次いで、濾液を、Ａ280（Ｍｉｌｌ
ｉ−Ｑ水を用いて０点調節した）を測定することによってアッセイした。結果を
、表５３に示す。
【０４３１】
【表５３】 a １ｍｇの活性酵素を、各実験に使用した（ＷＴ＝１１．５μＬ、Ｎ６２Ｃ−
＝１１．８μＬ、Ｓ１５６Ｃ−＝１６．２μＬ、Ｓ１６６Ｃ−＝１０．６μＬ、
Ｌ２１７Ｃ−＝１１．５μＬ）。ＰＭＳＦ力価測定によって決定されるような各
酵素の濃度は、「材料選択」に記載される。b データは、実際の吸収を示す（データは、対応するバックグラウンド吸収か
ら実際の吸収を差し引くことによって補正する）。
【０４３２】 （実施例１２） （ビオチン化ＣＭＭへの曝露後の抗ビオチンの残留結合能力についてのアッセ
イ） （抗ビオチン分解） Ｓ１５６Ｃ−ビオチンが抗ビオチンＩｇＧを破壊する能力を、微小分配（ｍｉ
ｃｒｏ−ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）実験を使用して試験した。２つのコントロール実
験もまた、データを検証するために実施した。
【０４３３】 抗体−ＣＭＭ（１：１、分子：分子）混合物のアリコートを、インキュベート
したバイアル（ｐＨ８．６、３５℃）から定期的に回収し、そしてビオチン溶液
を、このアリコートに添加した。ＣＭＭの立体的なかさ高さが、この抗体の他の
利用可能な結合部位への第２のＣＭＭ分子の接近をブロックするので、ただ１つ
のＣＭＭ分子のみが、各抗体分子に結合することが予測された。しかし、分子ビ
オチンは、これが第２の抗体結合部位への結合を可能にするほどに十分に小さい
はずである。抗体結合部位が分解されるにつれて、利用可能な結合部位がより少
なくなり、より多くの結合されないビオチンを生じる。３０００ ＭＷＣＯ膜を
使用して、結合されていないビオチンを、この高分子から分離し、そしてこのビ
オチン濃度を、ＨＡＢＡ／アビジンシステムを使用してアッセイした。
【０４３４】 さらに、ビオチン（ハプテン）のみを含む、コントロール実験を行った。ＣＭ
Ｍの添加前に、抗体をビオチン（ハプテン）と共にプレインキュベートする場合
の実験もまた、研究した。Ａ500の観察された値の減少は、この抗体の結合能力
の減少に対応する（図１９）。
【０４３５】 （抗ビオチン結合部位の破壊を証明するためのアッセイ） （実験：） アルカリホスファターゼに結合体化されたモノクローナル抗ビオチンＩｇＧ（
クローンＢＮ−３４、Ｓｉｇｍａ、免疫グロブリン濃度１．３ｍｇ／ｍＬ）を、
全ての研究について使用した。これらの研究に使用したＴＲＩＳ緩衝液は、本発
明者らのアミダーゼ反応速度論研究で使用した標準緩衝液であった（０．１Ｍ、
ｐＨ８．６、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ）。
【０４３６】 ＴＲＩＳ（ｐＨ８．６）中のビオチン（１．９４ｍｇ／ｍＬ）溶液を、調製し
た。この溶液の１０μＬを、７７９．５μＬのＴＲＩＳに添加した（この溶液は
、本明細書を通してＢ／７９と称する）。ＴＲＩＳ（７００．５μＬ）および抗
ビオチン（３７．５μＬ、１．３ｍｇ／ｍＬ免疫グロブリン、アルカリホスファ
ターゼ標識した）を含む、エッペンドルフバイアルを調製した。Ｓ１５６Ｃ−ビ
オチン（１２．１５μＬ、０．７１ｍｇ／ｍＬ）を、このバイアルに添加した。
このバイアルをボルテックスし、そして水浴中（３５℃）に配置した。アリコー
ト（１７０μＬ）を、このバイアルから周期的に回収し、Ｂ／７９（２０μＬ）
を、各アリコートに添加し、次いで、この混合物を、予めリンスしたＣｅｎｔｒ
ｉｃｏｎフィルターに移した。このフィルターを遠心分離し（１時間、３７５０
ｒｐｍ、４℃、２×）、そして濾液を収集した。以下のＨＡＢＡ／アビジンシス
テムを使用して、この濾液を、ビオチン含量についてアッセイした：７０μＬの
濾液を、７０μＬのＨＡＢＡ／アビジン試薬に添加し、そしてこの混合物のＡ50 0 の読取り値を、１３０μＬキュベットを使用して観察した。結果を、以下の表
５４に作表した。
【０４３７】
【表５４】 （コントロール実験） ＴＲＩＳ（ｐＨ８．６）中のビオチン（１．９４ｍｇ／ｍＬ）溶液を、調製し
た。この溶液を、２０倍希釈した（本明細書を通してＢ／２０と称する）。エッ
ペンドルフバイアルを、表５５に従って満たし、３５℃で種々の時間でインキュ
ベートした。
【０４３８】
【表５５】 インキュベーション後、各バイアルの内容物を、予めリンスしたＣｅｎｔｒｉ
ｃｏｎフィルター（ＭＷＣＯ ３０００）に移し、そしてこれらのフィルターを
遠心分離した。濾液を、ＨＡＢＡ／アビジン試薬を使用して分光光度的にアッセ
イした：５００μＬの濾液を、５００μＬのＨＡＢＡ／アビジン試薬に添加し、
Ａ500値を、１ｍＬキュベットを使用して測定した。結果を、表５６に示す。
【０４３９】
【表５６】 （実施例１３） （上記の標的化された分解の実施例の化学量論） 種々の実験において、以下の触媒アンタゴニストが、化学量論的に機能するこ
とが見い出された：ピラゾールＣＭＭ−ＨＬＡＤＨ（実施例２）、ＡＰの存在下
のピラゾールＣＭＭ−ＨＬＡＤＨ（実施例３）、化学量論以下の（ｓｕｂｓｔｏ
ｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）ピラゾールＣＭＭ−ＨＬＡＤＨ（実施例４）、糖ＣＭ
Ｍ−ビオチン化Ｃｏｎ Ａ（実施例７および８）、ビオチンＣＭＭ−アビジン、
およびビオチンＣＭＭ−抗ビオチンＩｇＧ。
【０４４０】 本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示目的のためのみである
こと、およびこれらの観点における種々の改変または変更が当業者に示唆され、
そして本出願の精神および本文、ならびに特許請求の範囲内に含まれることが理
解されるべきである。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出
願は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書によって援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、標的化部分としてデンドリマーを使用する、本明細書の種々のキメラ
分子を図示する。
【図２】 図２は、インヒビターを用いて酵素を標的化するＳＢＬを図示する。
【図３】 図３は、ＭＴＳ−ピラゾール４の合成のためのスキーム１１を図示する。
【図４】 図４は、ＳＢＬ−ピラゾールキメラ分子についてのＨＬＡＤＨ標的化アッセイ
の結果を図示する。
【図５Ａ】 図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、ＳＢＬ−ピラゾールキメラ分子に
ついてのＨＬＡＤＨ分解アッセイの結果を図示する。
【図５Ｂ】 図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、ＳＢＬ−ピラゾールキメラ分子に
ついてのＨＬＡＤＨ分解アッセイの結果を図示する。
【図５Ｃ】 図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、ＳＢＬ−ピラゾールキメラ分子に
ついてのＨＬＡＤＨ分解アッセイの結果を図示する。
【図５Ｄ】 図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、ＳＢＬ−ピラゾールキメラ分子に
ついてのＨＬＡＤＨ分解アッセイの結果を図示する。
【図６】 図６は、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールのありまたはなしでのＨＬＡＤＨ／ＡＰ混合
物についてのＨＬＡＤＨ活性を示す。
【図７】 図７は、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールのありまたはなしでのＨＬＡＤＨ／ＡＰ混合
物についてのＡＰ活性を示す。
【図８】 図８は、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールありまたはなしでのＨＬＡＤＨ／ＡＰ混合物
についてのＨＬＡＤＨ活性を示す。
【図９】 図９は、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールありまたはなしでのＨＬＡＤＨ／ＡＰ混合物
についてのＡＰ活性を示す。
【図１０】 図１０は、化学量論以下のピラゾール−ＣＭＭによるＨＬＡＤＨ分解を示す。
【図１１】 図１１は、アルカリホスファターゼの存在下におけるピラゾール−ＣＭＭによ
るＨＬＡＤＨ分解を示す。
【図１２】 図１２は、ＨＬＡＤＨの存在下におけるピラゾール−ＣＭＭによるアルカリホ
スファターゼ分解を図示する。
【図１３】 図１３は、調製された１１のモノ−およびジサッカリドメタンチオスルホネー
トを示す。
【図１４Ａ】 図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃは、糖によって修飾されたＧＧ３６−Ｗ
Ｔによる選択的レクチン分解を図示する。
【図１４Ｂ】 図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃは、糖によって修飾されたＧＧ３６−Ｗ
Ｔによる選択的レクチン分解を図示する。
【図１４Ｃ】 図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃは、糖によって修飾されたＧＧ３６−Ｗ
Ｔによる選択的レクチン分解を図示する。
【図１５Ａ】 図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、レクチンアッセイの間の
＜３０００ＭＷタンパク質フラグメントの形成の時間経過のプロットを図示する
。
【図１５Ｂ】 図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、レクチンアッセイの間の
＜３０００ＭＷタンパク質フラグメントの形成の時間経過のプロットを図示する
。
【図１５Ｃ】 図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、レクチンアッセイの間の
＜３０００ＭＷタンパク質フラグメントの形成の時間経過のプロットを図示する
。
【図１５Ｄ】 図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、レクチンアッセイの間の
＜３０００ＭＷタンパク質フラグメントの形成の時間経過のプロットを図示する
。
【図１６】 図１６は、ビオチン−ＭＴＳ試薬１の合成のための合成スキーム７を図示する
。
【図１７】 図１７は、ビオチン化ＣＭＭの抗ビオチンに対する標的化をアッセイするため
の標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術を図示する。
【図１８】 図１８は、９６ウェルプレートにおける、ハプテン修飾したサブチリシンを使
用する、抗ビオチンについての標的化アッセイを図示する。
【図１９】 図１９は、時間の関数としてのビオチン−ＣＭＭによる抗ビオチン分解のプロ
ットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 5/28 5/26 5/30 5/28 7/02 5/30 9/06 7/02 9/10 9/06 9/12 9/10 11/02 9/12 11/08 11/02 21/02 11/08 25/04 21/02 25/08 25/04 25/16 25/08 25/18 25/16 25/24 25/18 29/00 25/24 31/12 29/00 43/00 １１１ 31/12 Ｃ１２Ｎ 9/50 43/00 １１１ 9/54 Ｃ１２Ｎ 9/50 Ａ６１Ｋ 37/64 9/54 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジョーンズ， ジョン ブライアン カナダ国 ケー01 ２エイチ０ オンタリ オ， レイクフィールド， アールアール ３， シーフォース クレシェント 1275 (72)発明者 ボット， リチャード アール． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， バーリンガム， ヒルサイド ドライブ 3032 (72)発明者 サンフォード， カール ジョン アメリカ合衆国 カリフォルニア 95014， キュパーティーノ アリシア コート 10434 (72)発明者 エステル， デイビッド アーロン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94403， サン マテオ， ウッドブリッジ サー クル 248 Ｆターム(参考） 4B050 CC07 DD02 LL01 4C076 CC41 4C084 AA01 BA41 BA42 BA44 BA50 CA59 DC02 MA05 NA13 NA14 ZA02 ZA05 ZA06 ZA08 ZA12 ZA18 ZA29 ZA36 ZA40 ZA51 ZA54 ZA62 ZA68 ZA69 ZA83 ZA86 ZA94 ZB11 ZB13 ZB15 ZB33 ZC03 ZC10 ZC11 ZC22 ZC33 ZC35 ZC43 ZC44 ZC45

Claims (145)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的分子の触媒性アンタゴニストであって、該アンタゴニス
    トは、該標的分子に特異的に結合する標的化部分を備え、該標的部分は、概標的
    分子を分解する酵素に付着されて、該標的分子のそのコグネイトリガンドに対す
    る結合および該標的化部分への結合を減少させ、それによって、該アンタゴニス
    トの放出を生じ、それによって該アンタゴニストが別の標的分子を結合および分
    解することを可能にする、アンタゴニスト。
  2. 【請求項２】 前記標的化部分がシステインの硫黄基を通して前記酵素と結
    合されている、請求項１に記載のアンタゴニスト。
  3. 【請求項３】 前記システインが、前記酵素中のシステイン以外のネイティ
    ブなアミノ酸で置換されるシステインである、請求項２に記載のアンタゴニスト
    。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載のアンタゴニストであって、前記システイン
    が前記酵素の基質結合部位を含むサブ部位中またはその近傍においてシステイン
    以外のネイティブなアミノ酸で置換されるシステインである、アンタゴニスト。
  5. 【請求項５】 前記システインが、基質結合部位を形成するアミノ酸で置換
    されるシステインである、請求項４に記載のアンタゴニスト。
  6. 【請求項６】 請求項３に記載のアンタゴニストであって、ここで前記酵素
    が、プロテアーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ペプチダーゼ、ラクタマーゼ、
    セルラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクダーゼ、トランスフ
    ェラーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ
    、ホスファターゼ、キナーゼ、スルファターゼ、リゾチーム、グリコシダーゼ、
    ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、リアーゼ、シクラーゼ、逆転写酵素
    、ヒアルロニダーゼ、アミラーゼ、セレブロシダーゼ、およびキチナーゼからな
    る群より選択される酵素である、アンタゴニスト。
  7. 【請求項７】 前記酵素がセリンヒドロラーゼである、請求項６に記載のア
    ンタゴニスト。
  8. 【請求項８】 前記酵素がサブチリシン型セリンヒドロラーゼであり、前記
    システインが、Ｓ１サブ部位、Ｓ１’サブ部位、およびＳ２サブ部位からなる群
    より選択されるサブ部位中またはその部位の近傍においてアミノ酸で置換される
    、請求項５に記載のアンタゴニスト。
  9. 【請求項９】 前記酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓサブチリシンで
    ある、請求項８に記載のアンタゴニスト。
  10. 【請求項１０】 請求項８に記載のアンタゴニストであって、前記システイ
    ンが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓサブチリシン中の参照残基に対応するア
    ミノ酸で置換され、ここで、該参照残基は、残基１５６、残基１６６、残基２１
    ７、残基２２２、残基６２、残基９６、残基１０４、残基１０７、残基１８９、
    および残基２０９からなる群より選択される残基、またはその残基の近傍にある
    、アンタゴニスト。
  11. 【請求項１１】 請求項６に記載のアンタゴニストであって、前記酵素がキ
    モトリプシン型セリンプロテアーゼであり、そして前記システインが、成熟トリ
    プシン（タンパク質データバンクエントリー１ＴＰＰ）中の参照残基に対応する
    アミノ酸で置換されており、ここで、該参照残基が、Ｔｙｒ９４、Ｌｅｕ９９、
    Ｇｌｎ１７５、Ａｓｐ１８９、Ｓｅｒ１９０、Ｇｌｎ１９２、Ｐｈｅ４１、Ｌｙ
    ｓ６０、Ｔｙｒ１５１、Ｓｅｒ２１４、およびＬｙｓ２２４からなる群より選択
    される残基、またはその残基の近傍にある、アンタゴニスト。
  12. 【請求項１２】 請求項７に記載のアンタゴニストであって、前記酵素がα
    ／β型セリンヒドロラーゼであり、そして前記システインが、Ｃａｎｄｉｄａ
    ａｎｔａｒｔｉｃａリパーゼ（タンパク質データバンクエントリー１ＴＣＡ）中
    の参照残基に対応するアミノ酸で置換されており、ここで、該参照残基は、Ｔｒ
    ｐ１０４、Ｌｅｕ１４０、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ１５４、Ｇｌｕ１８８、Ａｌａ
    ２２５、Ｌｅｕ２７８、およびＩｌｅ２８５からなる群より選択される残基、ま
    たはその残基の近傍にある、アンタゴニスト。
  13. 【請求項１３】 前記酵素がアスパルチルプロテアーゼである、請求項７に
    記載のアンタゴニスト。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載のアンタゴニストであって、前記酵素が
    ペプシン型プロテアーゼであり、そして前記システインは成熟ヒトペプシン（タ
    ンパク質データバンクエントリー１ＰＳＮ）中の参照残基に対応するアミノ酸で
    置換されており、ここで該参照残基は、Ｔｙｒ９、Ｍｅｔ１２、Ｇｌｕ１３、Ｇ
    ｌｙ７６、Ｔｈｒ７７、Ｐｈｅ１１１、Ｐｈｅ１１７、Ｉｌｅ１２８、Ｓｅｒ１
    ３０、Ｔｙｒ１８９、Ｉｌｅ２１３、Ｇｌｕ２３９、Ｍｅｔ２４５、Ｇｌｎ２８
    ７、Ｍｅｔ２８９、Ｌｅｕ２９１、およびＧｌｕ２９４からなる群より選択され
    る残基、またはその残基の近傍にある、アンタゴニスト。
  15. 【請求項１５】 前記酵素がシステインプロテアーゼである、請求項６に記
    載のアンタゴニスト。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載のアンタゴニストであって、前記酵素が
    パパインであり、そして前記システインは成熟パパイン（タンパク質データバン
    クエントリー１ＢＱＩ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されており、こ
    こで該参照残基は、Ａｓｎ１８、Ｓｅｒ２１、Ａｓｎ６４、Ｔｙｒ６７、Ｔｒｐ
    ６９、Ｇｌｎ１１２、Ｇｌｎ１４２、Ａｓｐ１５８、Ｔｒｐ１７７、およびＰｈ
    ｅ２０７からなる群より選択される残基、またはその残基の近傍にある、アンタ
    ゴニスト。
  17. 【請求項１７】 前記酵素がメタロプロテアーゼである、請求項６に記載の
    アンタゴニスト。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のアンタゴニストであって、前記酵素が
    メタロプロテアーゼであり、そして前記システインは成熟ヒトマトリックスメタ
    ロプロテアーゼ（タンパク質データバンクエントリー８３０Ｃ）中の参照残基に
    対応するアミノ酸で置換されており、ここで該参照残基は、Ｌｅｕ１１１、Ｐｈ
    ｅ１７５、Ｔｙｒ１７６、Ｓｅｒ１８２、Ｌｅｕ１８４、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ
    ２１４、Ａｓｐ２３１、Ｌｙｓ２３４、およびＩｌｅ２４３からなる群より選択
    される残基、またはその残基の近傍にある、アンタゴニスト。
  19. 【請求項１９】 前記標的が細胞の表面に存在する分子である、請求項１に
    記載のアンタゴニスト。
  20. 【請求項２０】 前記細胞の表面に存在する分子がレセプターを形成する分
    子である、請求項１９に記載のアンタゴニスト。
  21. 【請求項２１】 前記細胞の表面に存在する分子がリガンドである、請求項
    １９に記載のアンタゴニスト。
  22. 【請求項２２】 前記細胞の表面に存在する分子が細胞壁の成分である、請
    求項１９に記載のアンタゴニスト。
  23. 【請求項２３】 前記細胞の表面に存在する分子が細胞膜の成分である、請
    求項１９に記載のアンタゴニスト。
  24. 【請求項２４】 請求項１に記載のアンタゴニストであって、前記標的化部
    分は、タンパク質、抗原、炭水化物、核酸、脂質、錯化合物、糖、ビタミン、デ
    ンドリマー、およびクラウンエーテルからなる群より選択される、アンタゴニス
    ト。
  25. 【請求項２５】 前記標的化部分が、レセプターまたは酵素についてのコグ
    ネートリガンドである、請求項２４に記載のアンタゴニスト。
  26. 【請求項２６】 前記標的化部分が、レセプターまたは酵素についてのイン
    ヒビターである、請求項２４に記載のアンタゴニスト。
  27. 【請求項２７】 請求項１に記載のアンタゴニストであって、前記酵素がプ
    ロテアーゼであり、そして前記標的化部分は、炭水化物、ビタミンもしくはビタ
    ミンアナログ、酵素インヒビター、ペプチド、低分子量有機分子である医薬品、
    およびビオチンからなる群より選択されるリガンドである、アンタゴニスト。
  28. 【請求項２８】 前記酵素がプロテアーゼであり、かつ前記標的化部分がレ
    セプターである、請求項１に記載のアンタゴニスト。
  29. 【請求項２９】 前記酵素がサブチリシンである、請求項２７に記載のアン
    タゴニスト。
  30. 【請求項３０】 前記標的化部分が酵素インヒビターであり、ピラゾールで
    ある、請求項２９に記載のアンタゴニスト。
  31. 【請求項３１】 前記標的化部分がビオチンである、請求項２９に記載のア
    ンタゴニスト。
  32. 【請求項３２】 前記標的化部分が、レクチンを結合するリガンドである、
    請求項２９に記載のアンタゴニスト。
  33. 【請求項３３】 前記レクチンがコンカナバリンＡである、請求項３２に記
    載のアンタゴニスト。
  34. 【請求項３４】 前記標的化部分が炭水化物である、請求項３３に記載のア
    ンタゴニスト。
  35. 【請求項３５】 前記標的化部分が−チオエチルＤ−マンノピラノシドであ
    る、請求項３４に記載のアンタゴニスト。
  36. 【請求項３６】 前記標的化部分が土壌に特異的に結合し、そして前記酵素
    が該土壌の成分を分解する、請求項３３に記載のアンタゴニスト。
  37. 【請求項３７】 標的分子を分解する方法であって、該方法は、該標的分子
    を、該標的分子に特異的に結合する標的化部分を含む触媒性アンタゴニストと接
    触させる工程を包含し、該標的化部分は、該標的分子を分解する酵素に付着され
    ており、該アンタゴニストの放出を生じ、それによって、該アンタゴニストが別
    の標的分子を結合および分解することを可能にする、方法。
  38. 【請求項３８】 前記標的化部分がシステインの硫黄基を通して前記酵素と
    結合されている、請求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記システインが、前記酵素中のシステイン以外のネイテ
    ィブなアミノ酸で置換されるシステインである、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 請求項３９に記載の方法であって、前記システインが前記
    酵素の基質結合部位を含むサブ部位中またはその近傍においてシステイン以外の
    ネイティブなアミノ酸で置換されるシステインである、方法。
  41. 【請求項４１】 請求項３９に記載の方法であって、ここで前記酵素が、プ
    ロテアーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ペプチダーゼ、ラクタマーゼ、セルラ
    ーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクダーゼ、トランスフェラー
    ゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ホス
    ファターゼ、キナーゼ、スルファターゼ、リゾチーム、グリコシダーゼ、グリコ
    シルトランスフェラーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、リアーゼ
    、シクラーゼ、逆転写酵素、ヒアルロニダーゼ、アミラーゼ、セレブロシダーゼ
    、およびキチナーゼからなる群より選択される酵素である、方法。
  42. 【請求項４２】 前記酵素がセリンヒドロラーゼである、請求項４１に記載
    の方法。
  43. 【請求項４３】 前記酵素がサブチリシンである、請求項４２に記載の方法
    。
  44. 【請求項４４】 前記システインが、基質結合部位を形成するアミノ酸で置
    換されるシステインである、請求項３９に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記酵素がサブチリシン型セリンヒドロラーゼであり、前
    記システインが、Ｓ１サブ部位、Ｓ１’サブ部位、およびＳ２サブ部位からなる
    群より選択されるサブ部位中またはその部位の近傍においてアミノ酸で置換され
    る、請求項４４に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓサブチリシン
    である、請求項４５に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 請求項４５に記載の方法であって、前記システインが、Ｂ
    ａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓサブチリシン中の参照残基に対応するアミノ酸で
    置換され、ここで、該参照残基は、残基１５６、残基１６６、残基２１７、残基
    ２２２、残基６２、残基９６、残基１０４、残基１０７、残基１８９、および残
    基２０９からなる群より選択される残基、またはその残基の近傍にある、方法。
  48. 【請求項４８】 請求項４１に記載の方法であって、前記酵素がキモトリプ
    シン型セリンプロテアーゼであり、そして前記システインが、成熟トリプシン（
    タンパク質データバンクエントリー１ＴＰＰ）中の参照残基に対応するアミノ酸
    で置換されており、ここで、該参照残基が、Ｔｙｒ９４、Ｌｅｕ９９、Ｇｌｎ１
    ７５、Ａｓｐ１８９、Ｓｅｒ１９０、Ｇｌｎ１９２、Ｐｈｅ４１、Ｌｙｓ６０、
    Ｔｙｒ１５１、Ｓｅｒ２１４、およびＬｙｓ２２４からなる群より選択される残
    基、またはその残基の近傍にある、方法。
  49. 【請求項４９】 請求項４１に記載の方法であって、前記酵素がα／β型セ
    リンヒドロラーゼであり、そして前記システインが、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａ
    ｒｔｉｃａリパーゼ（タンパク質データバンクエントリー１ＴＣＡ）中の参照残
    基に対応するアミノ酸で置換されており、ここで、前記参照残基は、Ｔｒｐ１０
    ４、Ｌｅｕ１４０、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ１５４、Ｇｌｕ１８８、Ａｌａ２２５
    、Ｌｅｕ２７８、およびＩｌｅ２８５からなる群より選択される残基、またはそ
    の残基の近傍にある、方法。
  50. 【請求項５０】 前記酵素がアスパルチルプロテアーゼである、請求項４１
    に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 請求項５０に記載の方法であって、前記酵素がペプシン型
    プロテアーゼであり、そして前記システインは成熟ヒトペプシン（タンパク質デ
    ータバンクエントリー１ＰＳＮ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されて
    おり、ここで該参照残基は、Ｔｙｒ９、Ｍｅｔ１２、Ｇｌｕ１３、Ｇｌｙ７６、
    Ｔｈｒ７７、Ｐｈｅ１１１、Ｐｈｅ１１７、Ｉｌｅ１２８、Ｓｅｒ１３０、Ｔｙ
    ｒ１８９、Ｉｌｅ２１３、Ｇｌｕ２３９、Ｍｅｔ２４５、Ｇｌｎ２８７、Ｍｅｔ
    ２８９、Ｌｅｕ２９１、およびＧｌｕ２９４からなる群より選択される残基、ま
    たはその残基の近傍にある、方法。
  52. 【請求項５２】 前記酵素がシステインプロテアーゼである、請求項４１に
    記載の方法。
  53. 【請求項５３】 請求項５２に記載の方法であって、前記酵素がパパインで
    あり、そして前記システインは成熟パパイン（タンパク質データバンクエントリ
    ー１ＢＱＩ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されており、ここで該参照
    残基は、Ａｓｎ１８、Ｓｅｒ２１、Ａｓｎ６４、Ｔｙｒ６７、Ｔｒｐ６９、Ｇｌ
    ｎ１１２、Ｇｌｎ１４２、Ａｓｐ１５８、Ｔｒｐ１７７、およびＰｈｅ２０７か
    らなる群より選択される残基、またはその残基の近傍にある、方法。
  54. 【請求項５４】 前記酵素がメタロプロテアーゼである、請求項４１に記載
    の方法。
  55. 【請求項５５】 請求項５４に記載の方法であって、前記酵素がメタロプロ
    テアーゼであり、そして前記システインは成熟ヒトマトリックスメタロプロテア
    ーゼ（タンパク質データバンクエントリー８３０Ｃ）中の参照残基に対応するア
    ミノ酸で置換されており、ここで該参照残基は、Ｌｅｕ１１１、Ｐｈｅ１７５、
    Ｔｙｒ１７６、Ｓｅｒ１８２、Ｌｅｕ１８４、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１４、Ａ
    ｓｐ２３１、Ｌｙｓ２３４、およびＩｌｅ２４３からなる群より選択される残基
    、またはその残基の近傍にある、方法。
  56. 【請求項５６】 前記標的が細胞の表面に存在する分子である、請求項３７
    に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 前記細胞の表面に存在する分子がレセプターを形成する分
    子である、請求項５６に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記細胞の表面に存在する分子がリガンドである、請求項
    ５６に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 前記細胞の表面に存在する分子が細胞壁の成分である、請
    求項５６に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 前記細胞の表面に存在する分子が細胞膜の成分である、請
    求項５６に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 請求項３７に記載の方法であって、前記標的化部分は、タ
    ンパク質、抗原、炭水化物、核酸、脂質、錯化合物、糖、ビタミン、デンドリマ
    ー、およびクラウンエーテルからなる群より選択される、方法。
  62. 【請求項６２】 前記標的化部分が、レセプターまたは酵素についてのコグ
    ネートリガンドである、請求項６１に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 前記標的化部分が、レセプターまたは酵素についてのイン
    ヒビターである、請求項６１に記載の方法。
  64. 【請求項６４】 請求項３７に記載の方法であって、前記酵素がプロテアー
    ゼであり、そして前記標的化部分は、炭水化物、ビタミンもしくはビタミンアナ
    ログ、酵素インヒビター、ペプチド、低分子量有機分子である医薬品、およびビ
    オチンからなる群より選択されるリガンドである、方法。
  65. 【請求項６５】 前記酵素がプロテアーゼであり、かつ前記標的化部分がレ
    セプターである、請求項３７に記載の方法。
  66. 【請求項６６】 前記酵素がサブチリシンである、請求項６４に記載の方法
    。
  67. 【請求項６７】 前記標的化部分が酵素インヒビターであり、ピラゾールで
    ある、請求項６６に記載の方法。
  68. 【請求項６８】 前記標的化部分がビオチンである、請求項６６に記載の方
    法。
  69. 【請求項６９】 前記標的化部分が、レクチンを結合するリガンドである、
    請求項６６に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記レクチンがコンカナバリンＡである、請求項６９に記
    載の方法。
  71. 【請求項７１】 前記標的化部分が炭水化物である、請求項７０に記載の方
    法。
  72. 【請求項７２】 前記標的化部分が−チオエチルＤ−マンノピラノシドであ
    る、請求項７０に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記標的化部分が土壌に特異的に結合し、そして前記酵素
    が該土壌の成分を分解する、請求項６６に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 変化した基質特異性を有する酵素であって、該酵素は、該
    酵素の基質結合部位を含むサブ部位に付着された標的化部分を含む、酵素。
  75. 【請求項７５】 前記標的化部分が、前記酵素の前記サブ部位中のシステイ
    ンの硫黄を通して該酵素と結合されている、請求項７４に記載の酵素。
  76. 【請求項７６】 請求項７５に記載の酵素であって、前記システインが、該
    酵素の前記サブ部位中のシステインではないネイティブなアミノ酸で置換されて
    いる、酵素。
  77. 【請求項７７】 請求項７５に記載の酵素であって、ここで該酵素が、プロ
    テアーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ペプチダーゼ、ラクタマーゼ、セルラー
    ゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクダーゼ、トランスフェラーゼ
    、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ホスフ
    ァターゼ、キナーゼ、スルファターゼ、リゾチーム、グリコシダーゼ、グリコシ
    ルトランスフェラーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、リアーゼ、
    シクラーゼ、逆転写酵素、ヒアルロニダーゼ、アミラーゼ、セレブロシダーゼ、
    およびキチナーゼからなる群より選択される酵素である、酵素。
  78. 【請求項７８】 前記酵素がセリンヒドロラーゼである、請求項７７に記載
    の酵素。
  79. 【請求項７９】 前記酵素がサブチリシンである、請求項７８に記載の酵素
    。
  80. 【請求項８０】 前記システインが、基質結合部位を形成するアミノ酸で置
    換されるシステインである、請求項７６に記載の酵素。
  81. 【請求項８１】 前記酵素がサブチリシン型セリンヒドロラーゼであり、前
    記システインが、Ｓ１サブ部位、Ｓ１’サブ部位、およびＳ２サブ部位からなる
    群より選択されるサブ部位中またはその部位の近傍においてアミノ酸で置換され
    る、請求項８０に記載の酵素。
  82. 【請求項８２】 前記酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓサブチリシン
    である、請求項８１に記載の酵素。
  83. 【請求項８３】 請求項８１に記載の酵素であって、前記システインが、Ｂ
    ａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓサブチリシン中の参照残基に対応するアミノ酸で
    置換され、ここで、該参照残基は、残基１５６、残基１６６、残基２１７、残基
    ２２２、残基６２、残基９６、残基１０４、残基１０７、残基１８９、および残
    基２０９からなる群より選択される残基、またはその残基の近傍にある、酵素。
  84. 【請求項８４】 請求項７７に記載の酵素であって、前記酵素がキモトリプ
    シン型セリンプロテアーゼであり、そして前記システインが、成熟トリプシン（
    タンパク質データバンクエントリー１ＴＰＰ）中の参照残基に対応するアミノ酸
    で置換されており、ここで、該参照残基が、Ｔｙｒ９４、Ｌｅｕ９９、Ｇｌｎ１
    ７５、Ａｓｐ１８９、Ｓｅｒ１９０、Ｇｌｎ１９２、Ｐｈｅ４１、Ｌｙｓ６０、
    Ｔｙｒ１５１、Ｓｅｒ２１４、およびＬｙｓ２２４からなる群より選択される残
    基、またはその残基の近傍にある、酵素。
  85. 【請求項８５】 請求項７７に記載の酵素であって、前記酵素がα／β型セ
    リンヒドロラーゼであり、そして前記システインが、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａ
    ｒｔｉｃａリパーゼ（タンパク質データバンクエントリー１ＴＣＡ）中の参照残
    基に対応するアミノ酸で置換されており、ここで、該参照残基は、Ｔｒｐ１０４
    、Ｌｅｕ１４０、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ１５４、Ｇｌｕ１８８、Ａｌａ２２５、
    Ｌｅｕ２７８、およびＩｌｅ２８５からなる群より選択される残基、またはその
    残基の近傍にある、酵素。
  86. 【請求項８６】 前記酵素がアスパルチルプロテアーゼである、請求項７７
    に記載の酵素。
  87. 【請求項８７】 請求項８６に記載の酵素であって、前記酵素がペプシン型
    プロテアーゼであり、そして前記システインは成熟ヒトペプシン（タンパク質デ
    ータバンクエントリー１ＰＳＮ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されて
    おり、ここで該参照残基は、Ｔｙｒ９、Ｍｅｔ１２、Ｇｌｕ１３、Ｇｌｙ７６、
    Ｔｈｒ７７、Ｐｈｅ１１１、Ｐｈｅ１１７、Ｉｌｅ１２８、Ｓｅｒ１３０、Ｔｙ
    ｒ１８９、Ｉｌｅ２１３、Ｇｌｕ２３９、Ｍｅｔ２４５、Ｇｌｎ２８７、Ｍｅｔ
    ２８９、Ｌｅｕ２９１、およびＧｌｕ２９４からなる群より選択される残基、ま
    たはその残基の近傍にある、酵素。
  88. 【請求項８８】 前記酵素がシステインプロテアーゼである、請求項７７に
    記載の酵素。
  89. 【請求項８９】 請求項８８に記載の酵素であって、前記酵素がパパインで
    あり、そして前記システインは成熟パパイン（タンパク質データバンクエントリ
    ー１ＢＱＩ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されており、ここで該参照
    残基は、Ａｓｎ１８、Ｓｅｒ２１、Ａｓｎ６４、Ｔｙｒ６７、Ｔｒｐ６９、Ｇｌ
    ｎ１１２、Ｇｌｎ１４２、Ａｓｐ１５８、Ｔｒｐ１７７、およびＰｈｅ２０７か
    らなる群より選択される残基、またはその残基の近傍にある、酵素。
  90. 【請求項９０】 前記酵素がメタロプロテアーゼである、請求項７７に記載
    の酵素。
  91. 【請求項９１】 請求項９０に記載の酵素であって、前記酵素がメタロプロ
    テアーゼであり、そして前記システインは成熟ヒトマトリックスメタロプロテア
    ーゼ（タンパク質データバンクエントリー８３０Ｃ）中の参照残基に対応するア
    ミノ酸で置換されており、ここで該参照残基は、Ｌｅｕ１１１、Ｐｈｅ１７５、
    Ｔｙｒ１７６、Ｓｅｒ１８２、Ｌｅｕ１８４、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１４、Ａ
    ｓｐ２３１、Ｌｙｓ２３４、およびＩｌｅ２４３からなる群より選択される残基
    、またはその残基の近傍にある、酵素。
  92. 【請求項９２】 前記標的が細胞の表面に存在する分子である、請求項３７
    に記載の酵素。
  93. 【請求項９３】 請求項７５に記載の酵素であって、前記標的化部分は、タ
    ンパク質、抗原、炭水化物、核酸、脂質、錯化合物、糖、ビタミン、デンドリマ
    ー、およびクラウンエーテルからなる群より選択される、酵素。
  94. 【請求項９４】 前記標的化部分が、レセプターまたは酵素についてのコグ
    ネートリガンドである、請求項７５に記載の酵素。
  95. 【請求項９５】 前記標的化部分が、レセプターまたは酵素についてのイン
    ヒビターである、請求項７５に記載の酵素。
  96. 【請求項９６】 前記標的化部分が、増殖因子、サイトカイン、およびレセ
    プターリガンドからなる群より選択される、請求項７５に記載の酵素。
  97. 【請求項９７】 請求項７５に記載の酵素であって、前記酵素がプロテアー
    ゼであり、そして前記標的化部分は、炭水化物、ビタミンもしくはビタミンアナ
    ログ、酵素インヒビター、ペプチド、低分子量有機分子である医薬品、およびビ
    オチンからなる群より選択されるリガンドである、酵素。
  98. 【請求項９８】 前記酵素がプロテアーゼであり、かつ前記標的化部分がレ
    セプターである、請求項７５に記載の酵素。
  99. 【請求項９９】 前記酵素がサブチリシンである、請求項９７に記載の酵素
    。
  100. 【請求項１００】 前記標的化部分が酵素インヒビターであり、ピラゾール
    である、請求項９９に記載の酵素。
  101. 【請求項１０１】 前記標的化部分がビオチンである、請求項９９に記載の
    酵素。
  102. 【請求項１０２】 前記標的化部分が、レクチンを結合するリガンドである
    、請求項９９に記載の酵素。
  103. 【請求項１０３】 前記レクチンがコンカナバリンＡである、請求項１０２
    に記載の酵素。
  104. 【請求項１０４】 前記標的化部分が炭水化物である、請求項１０３に記載
    の酵素。
  105. 【請求項１０５】 前記標的化部分が−チオエチルＤ−マンノピラノシドで
    ある、請求項１０３に記載の酵素。
  106. 【請求項１０６】 前記標的化部分が土壌に特異的に結合し、そして前記酵
    素が該土壌の成分を分解する、請求項９９に記載の酵素。
  107. 【請求項１０７】 酵素の活性を特定の標的に指向させる方法であって、該
    方法は、以下： 変化した基質特異性を有する酵素を提供する工程であって、該酵素は、該酵素
    の基質結合領域内に、サブ部位に付着させた標的化部分を含む、工程；および 該標的を該酵素と接触させる工程であって、それによって、該酵素は該標的に
    特異的に結合し、それによって、該標的における該酵素の活性を局在化させる、
    工程、を包含する、方法。
  108. 【請求項１０８】 前記標的化部分が、前記酵素のサブ部位中のシステイン
    の硫黄を通して該酵素と結合されている、請求項１０７に記載の方法。
  109. 【請求項１０９】 前記システインが、前記酵素の前記サブ部位中のシステ
    イン以外のネイティブなアミノ酸で置換される、請求項１０８に記載の方法。
  110. 【請求項１１０】 請求項１０８に記載の方法であって、該方法は、前記サ
    ブ部位中のアミノ酸をシステインで置き換える工程、および前記標的化部分を該
    システインに化学カップリングする工程をさらに含む、方法。
  111. 【請求項１１１】 請求項１０７に記載の方法であって、ここで前記酵素が
    、プロテアーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ペプチダーゼ、ラクタマーゼ、セ
    ルラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクダーゼ、トランスフェ
    ラーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、
    ホスファターゼ、キナーゼ、スルファターゼ、リゾチーム、グリコシダーゼ、グ
    リコシルトランスフェラーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、リア
    ーゼ、シクラーゼ、逆転写酵素、ヒアルロニダーゼ、アミラーゼ、セレブロシダ
    ーゼ、およびキチナーゼからなる群より選択される酵素である、方法。
  112. 【請求項１１２】 前記酵素がセリンヒドロラーゼである、請求項１１１に
    記載の方法。
  113. 【請求項１１３】 前記酵素がサブチリシンである、請求項１１２に記載の
    方法。
  114. 【請求項１１４】 前記システインが、基質結合部位を形成するアミノ酸で
    置換されているシステインである、請求項１０９に記載の方法。
  115. 【請求項１１５】 前記酵素がサブチリシン型セリンヒドロラーゼであり、
    前記システインが、Ｓ１サブ部位、Ｓ１’サブ部位、およびＳ２サブ部位からな
    る群より選択されるサブ部位中またはその部位の近傍のアミノ酸で置換される、
    請求項１１４に記載の方法。
  116. 【請求項１１６】 前記酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓサブチリシ
    ンである、請求項１１２に記載の方法。
  117. 【請求項１１７】 請求項１１２に記載の方法であって、前記システインが
    、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓサブチリシン中の参照残基に対応するアミノ
    酸で置換され、ここで、該参照残基は、残基１５６、残基１６６、残基２１７、
    残基２２２、残基６２、残基９６、残基１０４、残基１０７、残基１８９、およ
    び残基２０９からなる群より選択される残基、またはその残基の近傍にある、方
    法。
  118. 【請求項１１８】 請求項１１１に記載の方法であって、前記酵素がキモト
    リプシン型セリンプロテアーゼであり、そして前記システインが、成熟トリプシ
    ン（タンパク質データバンクエントリー１ＴＰＰ）中の参照残基に対応するアミ
    ノ酸で置換されており、ここで、該参照残基が、Ｔｙｒ９４、Ｌｅｕ９９、Ｇｌ
    ｎ１７５、Ａｓｐ１８９、Ｓｅｒ１９０、Ｇｌｎ１９２、Ｐｈｅ４１、Ｌｙｓ６
    ０、Ｔｙｒ１５１、Ｓｅｒ２１４、およびＬｙｓ２２４からなる群より選択され
    る残基、またはその残基の近傍にある、方法。
  119. 【請求項１１９】 請求項１１１に記載の方法であって、前記酵素がα／β
    型セリンヒドロラーゼであり、そして前記システインが、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎ
    ｔａｒｔｉｃａリパーゼ（タンパク質データバンクエントリー１ＴＣＡ）中の参
    照残基に対応するアミノ酸で置換されており、ここで、該参照残基は、Ｔｒｐ１
    ０４、Ｌｅｕ１４０、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ１５４、Ｇｌｕ１８８、Ａｌａ２２
    ５、Ｌｅｕ２７８、およびＩｌｅ２８５からなる群より選択される残基、または
    その残基の近傍にある、方法。
  120. 【請求項１２０】 前記酵素がアスパルチルプロテアーゼである、請求項１
    １１に記載の方法。
  121. 【請求項１２１】 請求項１２０に記載の方法であって、前記酵素がペプシ
    ン型プロテアーゼであり、そして前記システインは成熟ヒトペプシン（タンパク
    質データバンクエントリー１ＰＳＮ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換さ
    れており、ここで該参照残基は、Ｔｙｒ９、Ｍｅｔ１２、Ｇｌｕ１３、Ｇｌｙ７
    ６、Ｔｈｒ７７、Ｐｈｅ１１１、Ｐｈｅ１１７、Ｉｌｅ１２８、Ｓｅｒ１３０、
    Ｔｙｒ１８９、Ｉｌｅ２１３、Ｇｌｕ２３９、Ｍｅｔ２４５、Ｇｌｎ２８７、Ｍ
    ｅｔ２８９、Ｌｅｕ２９１、およびＧｌｕ２９４からなる群より選択される残基
    、またはその残基の近傍にある、方法。
  122. 【請求項１２２】 前記酵素がシステインプロテアーゼである、請求項１１
    １に記載の方法。
  123. 【請求項１２３】 請求項１２２に記載の方法であって、前記酵素がパパイ
    ンであり、そして前記システインは成熟パパイン（タンパク質データバンクエン
    トリー１ＢＱＩ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されており、ここで該
    参照残基は、Ａｓｎ１８、Ｓｅｒ２１、Ａｓｎ６４、Ｔｙｒ６７、Ｔｒｐ６９、
    Ｇｌｎ１１２、Ｇｌｎ１４２、Ａｓｐ１５８、Ｔｒｐ１７７、およびＰｈｅ２０
    ７からなる群より選択される残基、またはその残基の近傍にある、方法。
  124. 【請求項１２４】 前記酵素がメタロプロテアーゼである、請求項１１１に
    記載の方法。
  125. 【請求項１２５】 請求項１２４に記載の方法であって、前記酵素がメタロ
    プロテアーゼであり、そして前記システインは成熟ヒトマトリックスメタロプロ
    テアーゼ（タンパク質データバンクエントリー８３０Ｃ）中の参照残基に対応す
    るアミノ酸で置換されており、ここで該参照残基は、Ｌｅｕ１１１、Ｐｈｅ１７
    ５、Ｔｙｒ１７６、Ｓｅｒ１８２、Ｌｅｕ１８４、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１４
    、Ａｓｐ２３１、Ｌｙｓ２３４、およびＩｌｅ２４３からなる群より選択される
    残基、またはその残基の近傍にある、方法。
  126. 【請求項１２６】 請求項７５に記載の方法であって、前記標的化部分は、
    タンパク質、抗原、炭水化物、核酸、脂質、錯化合物、金属、糖、ビタミン、デ
    ンドリマー、およびクラウンエーテルからなる群より選択される、方法。
  127. 【請求項１２７】 前記標的化部分が、レセプターまたは酵素についてのコ
    グネートリガンドである、請求項１０７に記載の方法。
  128. 【請求項１２８】 前記標的化部分が、レセプターまたは酵素についてのイ
    ンヒビターである、請求項１０７に記載の方法。
  129. 【請求項１２９】 前記標的化部分が、増殖因子およびサイトカインからな
    る群より選択される、請求項１０７に記載の酵素。
  130. 【請求項１３０】 請求項１０７に記載の方法であって、前記酵素がプロテ
    アーゼであり、そして前記標的化部分は、炭水化物、ビタミンもしくはビタミン
    アナログ、酵素インヒビター、ペプチド、低分子量有機分子である医薬品、およ
    びビオチンからなる群より選択されるリガンドである、方法。
  131. 【請求項１３１】 前記酵素がプロテアーゼであり、かつ前記標的化部分が
    レセプターである、請求項１０７に記載の方法。
  132. 【請求項１３２】 前記酵素がサブチリシンである、請求項１３０に記載の
    方法。
  133. 【請求項１３３】 前記標的化部分が酵素インヒビターであり、ピラゾール
    である、請求項１３２に記載の方法。
  134. 【請求項１３４】 前記標的化部分がビオチンである、請求項１３２に記載
    の方法。
  135. 【請求項１３５】 前記標的化部分が、レクチンを結合するリガンドである
    、請求項１３２に記載の方法。
  136. 【請求項１３６】 前記レクチンがコンカナバリンＡである、請求項１３５
    に記載の方法。
  137. 【請求項１３７】 前記標的化部分が炭水化物である、請求項１３６に記載
    の方法。
  138. 【請求項１３８】 前記標的化部分が−チオエチルＤ−マンノピラノシドで
    ある、請求項１３６に記載の方法。
  139. 【請求項１３９】 前記標的化部分が土壌に特異的に結合し、そして前記酵
    素が該土壌の成分を分解する、請求項１３２に記載の方法。
  140. 【請求項１４０】 レセプターまたは酵素のインヒビターとして作用する薬
    物の活性を増強する方法であって、該方法は、 該薬物が該レセプターまたは酵素に結合する場合に、セリンヒドロラーゼが該
    レセプターまたは酵素を分解するように、該セリンヒドロラーゼを該薬物と結合
    させる工程、を包含する、方法。
  141. 【請求項１４１】 前記薬物の治療的な有効血中濃度投与量を増大させる、
    請求項１４０に記載の方法。
  142. 【請求項１４２】 前記セリンヒドロラーゼがサブチリシンである、請求項
    １４０に記載の方法。
  143. 【請求項１４３】 酵素またはレセプターを阻害する方法であって、該方法
    は、酵素またはレセプターをキメラ分子と接触させる工程をを包含し、該キメラ
    分子は、該酵素またはレセプターのコグネイトリガンドを分解する酵素に結合さ
    せた該酵素またはレセプターを結合するリガンドを含む、方法。
  144. 【請求項１４４】 前記キメラ分子が、前記酵素またはレセプターのインヒ
    ビターに結合したプロテアーゼを含む、請求項１４３に記載の方法。
  145. 【請求項１４５】 前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、システイン
    プロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、ペプシン型プロテアーゼ、およびメ
    タロプロテアーゼからなる群より選択される、請求項１４４に記載の方法。
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