JP2002542299A - Composition for regenerating neurons, comprising myelin-specific antibody and complement protein - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 血清補体タンパク質の補体固定抗体との組み合わせた投与を含む新規な組成物を記載する。抗体は、ミエリンおよび補体タンパク質の１種または２種以上のエピトープに特異的に結合する。これらの組成物は、哺乳類対象のＣＮＳにおけるニューロンの再成長、回復および再生を促進するのに有用である。組成物および方法を、即時のまたは慢性の傷害の後に用いることができる。   (57) [Summary] A novel composition comprising administration of serum complement proteins in combination with a complement-fixing antibody is described. The antibodies specifically bind to one or more epitopes of myelin and complement proteins. These compositions are useful for promoting neuronal regrowth, recovery and regeneration in the CNS of a mammalian subject. The compositions and methods can be used after an immediate or chronic injury.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】発明の分野 本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）内の神経組織の成長および／または再生を促
進する組成物およびこれらの使用方法に関する。[0001] Field of the Invention The present invention relates to compositions and methods for their use to promote growth and / or regeneration of nerve tissue in the central nervous system (CNS).

【０００２】背景 ＣＮＳ損傷 約１，１００の新たな脊髄傷害が、毎年カナダで発生し；年あたり１０，００
０以上が米国において発生している。これらの数は、外傷的脳傷害に続くニュー
ロン成長への阻害を伴う脳損傷を患う患者をも含む場合には、５倍高い。北アメ
リカにおける慢性脊髄傷害を患っている患者の数は、約３００，０００である。
再び、この数は、外傷的脳傷害に続くニューロン成長への阻害を伴う脳損傷を患
う患者をも含む場合には、５倍高い。 [0002] CNS damage about 1,100 new spinal cord injury is, every year occur in Canada; per year 10,00
Zero or more occur in the United States. These numbers are five-fold higher when also including patients suffering from brain injury with inhibition to neuronal growth following traumatic brain injury. The number of patients suffering from chronic spinal cord injury in North America is about 300,000.
Again, this number is five-fold higher when also including patients suffering from brain injury with inhibition to neuronal growth following traumatic brain injury.

【０００３】 脊髄傷害は、しばしば損傷の部位の下方の自発的な移動の永久的損失を生じる
。ほとんど、若いおよび他の健康なヒトは、脊髄傷害のために、対麻痺または四
肢麻痺になる。米国には、四肢麻痺患者が２００，０００であると概算される。
必要な注意の量が与えられて、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷を有する患者をケアす
ることに関するヘルスケア費用がいかにして北アメリカで一年に１００億ドルを
十分超えるかを見通すことは、困難ではない。[0003] Spinal cord injury often results in permanent loss of spontaneous movement below the site of injury. Most, young and other healthy humans become paraplegic or quadriplegic due to spinal cord injury. In the United States, it is estimated that there are 200,000 quadriplegic patients.
Given the amount of attention needed, seeing how health care costs associated with caring for patients with central nervous system (CNS) injuries well over $ 10 billion annually in North America Not difficult.

【０００４】 ＣＮＳ（脳および脊髄）は、ニューロンおよび膠、例えば星状細胞、小膠細胞
および希突起膠細胞から構成される。ニューロンは、代表的には、２つのタイプ
のプロセスを有する：他のニューロンの軸索からのシナプスの接触を受ける樹状
突起；および、これを通して各々のニューロンが他のニューロンおよびエフェク
ターと連絡する軸索。ＣＮＳニューロンの軸索は、ミエリン鞘中に包囲されてい
る。[0004] The CNS (brain and spinal cord) is composed of neurons and glia, such as astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Neurons typically have two types of processes: dendrites that receive synaptic contact from the axons of other neurons; and the axis through which each neuron communicates with other neurons and effectors Rope. The axons of CNS neurons are surrounded by a myelin sheath.

【０００５】 高等脊椎動物において、ＣＮＳ内の軸索は、傷害後の回復の能力が限定されて
いる。成体の哺乳類ＣＮＳの軸索切断したニューロンは、胚のまたは新生児のＣ
ＮＳ内の、あるいは成体の末梢神経系（ＰＮＳ）内のニューロンとは対照的に、
実質的な軸索再生を示さない(Saunders et al., (1992) Proc. R. Soc. Lond. B
. Biol. 250:171-180; SchwabおよびBartoldi (1996) Physiol. Rev. 76:319-37
0; Steeves et al., (1994) Prog. Brain Res. 103:243-262)。実際、完全なＣ
ＮＳ軸索崩壊は、回復を妨げる傾向がある。ニューロン細胞体に隣接する軸索切
断された線維が、再生成長を開始するが、これは、その後、短い距離（１〜２ｍ
ｍ）内で発育が停止し、しばしば逆行性変性が続く。ＣＮＳ軸索は、成体の脊髄
の環境において再び成長しないが、ＣＮＳ中への末梢神経移植片は、ＣＮＳ軸索
が解剖学的に再生する好ましい環境を提供する(769におけるMay et al., Cajal'
s Degeneration and Regeneration of the Nervous System, History of Neuros
cience Series #5(NY and Oxford: Oxford Univ. Press, 1991))。これらの発見
は、成体のＣＮＳニューロンが、本質的な成長特性を保持し、好ましい環境条件
が与えられると、成長プログラムをうまく再活性化することが可能であることを
示す。[0005] In higher vertebrates, axons within the CNS have a limited ability to recover after injury. Axotomized neurons of the adult mammalian CNS are capable of
In contrast to neurons in the NS or in the adult peripheral nervous system (PNS)
No substantial axonal regeneration (Saunders et al., (1992) Proc.R. Soc. Lond.B
Biol. 250: 171-180; Schwab and Bartoldi (1996) Physiol. Rev. 76: 319-37.
0; Steeves et al., (1994) Prog. Brain Res. 103: 243-262). In fact, complete C
NS axonal collapse tends to impede recovery. Axotomized fibers adjacent to the neuronal cell body begin regenerative growth, which then evolves for a short distance (1-2 m).
Development stops in m), often with retrograde degeneration. Although CNS axons do not regrow in the adult spinal cord environment, peripheral nerve grafts into the CNS provide a favorable environment for CNS axons to regenerate anatomically (May et al., Cajal in 769). '
s Degeneration and Regeneration of the Nervous System, History of Neuros
cience Series # 5 (NY and Oxford: Oxford Univ. Press, 1991)). These findings indicate that adult CNS neurons retain essential growth characteristics and are capable of successfully reactivating the growth program when given favorable environmental conditions.

【０００６】脊髄傷害の現在の治療 多くの現在の治療が、脊髄傷害の治療のために存在する。アヘンアンタゴニス
ト、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、局所的索冷却、デキストラン注入、アド
レナリン作動性遮断、コルチコステロイドおよび高圧酸素を含む介入治療が用い
られているが、疑問のある臨床的値である。 Current Treatments for Spinal Cord Injuries Many current treatments exist for treating spinal cord injuries. Interventional treatments including opiate antagonists, thyrotropin-releasing hormone, local cord cooling, dextran infusion, adrenergic blockade, corticosteroids and hyperbaric oxygen have been used, but with questionable clinical values.

【０００７】 末梢神経移植片は、ＣＮＳ損傷を交差する架橋として示唆された(Davidおよび
Aguayo (1981) Science 214:931-933; Houle (1991) Exp. Neurol. 113:1-9; Ri
chardson et al., (1984) J. Neurocytol. 13:165-182; Richardson et al., (1
980) Nature 284:264-265; Xu et al., (1995) Exp. Neurol. 138:261-276; Ye
およびHoule (1997) Exp. Neurol. 143:70-81)。嗅覚鞘被覆細胞移植片は、最近
、ラットにおける傷害を受けた皮質脊髄突出の再生を促進するために用いられた
(Li et al., (1997) Science 277:2000-2002)。最近の研究(Cheng et al., (199
6) Science 273:510-513)は、前の作業(Siegal et al., (1990) Exp. Neurol. 1
09:90-97)を拡張した組み合わせ方法を用いた：成体ラット脊髄の横断の後に、
末梢移植片を用いて、白質路を中心の灰白質に、再生する線維を阻害環境の外に
および一層可能にする灰白質中に向けるようにして接続した。[0007] Peripheral nerve grafts have been suggested as a bridge crossing CNS injury (David and
Aguayo (1981) Science 214: 931-933; Houle (1991) Exp. Neurol. 113: 1-9; Ri
chardson et al., (1984) J. Neurocytol. 13: 165-182; Richardson et al., (1
980) Nature 284: 264-265; Xu et al., (1995) Exp. Neurol. 138: 261-276; Ye
And Houle (1997) Exp. Neurol. 143: 70-81). Olfactory sheath-coated cell grafts were recently used to promote regeneration of damaged corticospinal protrusion in rats
(Li et al., (1997) Science 277: 2000-2002). Recent studies (Cheng et al., (199
6) Science 273: 510-513) is a previous work (Siegal et al., (1990) Exp.
09: 90-97) using an extended combination method: after transection of the adult rat spinal cord,
Peripheral grafts were used to connect the white matter tract to the central gray matter so that the regenerating fibers were directed out of the inhibitory environment and into the gray matter, which allowed for more.

【０００８】 米国特許第５６５０１４８号および５７６２９２６号には、分子、例えばニュ
ーロトロフィンを生成するように変更された、ＣＮＳ中にドナー細胞を移植する
ことによる、ＣＮＳに対する損傷を治療する方法が記載されている。 移植された神経細胞の使用はまた、臨床的値が限定されている：軸索が、移植
された組織中に成長することができるが、これらは、ＣＮＳ中の阻害物のために
、移植された組織から、ＣＮＳ中に戻って成長することができない。 脊髄傷害を治療する現在の方法のこの概観は、急性および慢性状態の両方にお
いて、哺乳類ＣＮＳにおけるニューロンの再成長、回復および再生を促進する手
段について、必要性が残ることを示す。[0008] US Pat. Nos. 5,650,148 and 5,762,926 describe methods for treating damage to the CNS by transplanting donor cells into the CNS that have been modified to produce molecules such as neurotrophins. ing. The use of transplanted nerve cells is also of limited clinical value: axons can grow into the transplanted tissue, but these have been transplanted due to inhibitors in the CNS. Cannot grow back into the CNS. This overview of current methods of treating spinal cord injury indicates that there remains a need for means to promote neuronal regrowth, recovery and regeneration in the mammalian CNS, both in acute and chronic conditions.

【０００９】ミエリン 傷害後にＣＮＳ軸索が再生しないことが、ミエリンの存在と関連することが示
唆された。軸索を被覆するミエリン鞘は、シュヴァン細胞および希突起膠細胞の
圧縮された細胞質膜から構成される。この組成は、任意の他の細胞質膜のものと
、これが、脂質、タンパク質および水を含み、これらの構成成分の相対的割合お
よび配置がミエリンに対して独特であるという点で類似する。ＣＮＳにおけるミ
エリンは、希突起膠細胞により生成し、ミエリン基礎タンパク質（ＭＢＰ）の発
現により特徴づけされる。ＭＢＰは、ミエリンに関連するに過ぎず、ＣＮＳ軸索
線維の髄鞘形成の開始において発現される第１のタンパク質の１つである。ガラ
クトセレブロシド（ＧａｌＣ）は、希突起膠細胞により生成する主要なスフィン
ゴ脂質である。ＧａｌＣは、ヒトミエリンにおける合計の脂質の約１５％を含み
、種間で高度に保存される。ＧａｌＣが、希突起膠細胞の細胞体の表面上で発現
されるが、これは、ミエリン膜の表面上で一層大きい濃度で発現される(Ranscht
et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2709-2713)。It has been suggested that the failure of CNS axons to regenerate following myelin injury is associated with the presence of myelin. The myelin sheath that covers the axon is composed of the compressed cytoplasmic membrane of Schwann cells and oligodendrocytes. This composition is similar to that of any other cytoplasmic membrane in that it contains lipids, proteins and water, and that the relative proportions and arrangement of these components are unique to myelin. Myelin in the CNS is produced by oligodendrocytes and is characterized by the expression of myelin-based protein (MBP). MBP is only related to myelin and is one of the first proteins expressed at the onset of myelination of CNS axonal fibers. Galactocerebroside (GalC) is the major sphingolipid produced by oligodendrocytes. GalC contains approximately 15% of the total lipids in human myelin and is highly conserved among species. Although GalC is expressed on the surface of oligodendrocyte cell bodies, it is expressed at higher concentrations on the surface of the myelin membrane (Ranscht
et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2709-2713).

【００１０】 広範囲の脊椎動物族からの多くの例(Schwegler et al., (1995) J. Neurosci.
15:2756-2767; Steeves et al., (1994) Prog. Brain Res. 103:243-262)を含
めて、ＣＮＳミエリンの存在により、いくつかの切断されたＣＮＳ軸索の再生的
成長が遅延または阻害される(SchwabおよびBartoldi (1996) Physiol. Rev. 76:
319-370)という成長する証拠がある。低級脊椎動物ＣＮＳ（例えばヤツメウナギ
）および高等脊椎動物（例えば鳥類および哺乳類）の発育しているＣＮＳの両方
は、傷害後の実質的な軸索再生を示す(DavisおよびMcClellan (1994) J. Comp.
Neurol. 344:65-82; Hasan et al., (1993) J. Neurosci. 13:492-507; Hasan e
t al., (1991) Restor. Neurol. Neurosci. 2:137-154; Iwashita et al., (199
4) Nature 367:167-170; Saunders et al., (1992) Proc. R. Soc. Lond. B. Bi
ol. 250:171-180; Treherne et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4
31-434; Varga et al., (1995) Eur. J. Neurosci. 7:2119-2129)。再生のこれ
らの陽性の例すべてについての共通の表現型は、傷害の時点において、コンパク
トミエリンを欠くＣＮＳ（ヤツメウナギ）または不完全なミエリン発育（胚ニワ
トリ、新生児のオポッサムおよびラット）のいずれかである。ミエリンの発育の
外観は、時間的に、傷害を受けたＣＮＳ軸索による再生の損失と整合する。さら
に、成体のＣＮＳにおける移植された胎児ニューロンの強い成長(Bregman et al
., (1993) Exp. Neurol. 123:3-16; LiおよびRaisman (1993) Brain Res. 629:1
15-127; Yakovleff et al., (1995) Exp. Brain Res. 106:69-78)は、これらの
分化の段階におけるミエリン阻害のための受容体の欠如および／またはミエリン
からのすべての阻害シグナルを消失させる能力のいずれかに部分的に寄与し得る
。[0010] Many examples from a wide range of vertebrate families (Schwegler et al., (1995) J. Neurosci.
15: 2756-2767; Steeves et al., (1994) Prog. Brain Res. 103: 243-262), the presence of CNS myelin slows the regenerative growth of some truncated CNS axons. Or inhibited (Schwab and Bartoldi (1996) Physiol. Rev. 76:
319-370). Both the lower vertebrate CNS (eg, lamprey) and the developing CNS of higher vertebrates (eg, birds and mammals) exhibit substantial axonal regeneration following injury (Davis and McClellan (1994) J. Comp.
Neurol. 344: 65-82; Hasan et al., (1993) J. Neurosci. 13: 492-507; Hasan e.
tal., (1991) Restor. Neurol. Neurosci. 2: 137-154; Iwashita et al., (199
4) Nature 367: 167-170; Saunders et al., (1992) Proc. R. Soc. Lond. B. Bi
ol. 250: 171-180; Treherne et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4.
31-434; Varga et al., (1995) Eur. J. Neurosci. 7: 2119-2129). The common phenotype for all these positive cases of regeneration is at the time of injury, either the CNS lacking compact myelin (lamps) or incomplete myelin development (embryonic chickens, neonatal opossum and rats) . The appearance of myelin development is temporally consistent with the loss of regeneration by injured CNS axons. Furthermore, the strong growth of transplanted fetal neurons in the adult CNS (Bregman et al.
., (1993) Exp. Neurol. 123: 3-16; Li and Raisman (1993) Brain Res. 629: 1.
15-127; Yakovleff et al., (1995) Exp. Brain Res. 106: 69-78) describe the lack of a receptor for myelin inhibition at these stages of differentiation and / or all inhibitory signals from myelin. Can partially contribute to any of the abilities to dissipate.

【００１１】 ミエリンに関連する特定的な分子は、この阻害活性の推定的なメディエイター
として同定され、これには、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）(McKerracher
et al., (1994) Neuron. 13:805-811; Mukhopadhyay et al., (1994) Neuron.
13:757-767)およびＮＩ３５／２５０、未だ同定されていないミエリン誘導タン
パク質(BandtlowおよびSchwab (1991) Soc, Neurosci. Abstr. 17:1495; Caroni
およびSchwab (1988) J. Cell Biol. 106:1281-1288; CaroniおよびSchwab (198
8) Neuron 1:85; Crutcher (1989) Exp. Neurol. 104:39-54; SavioおよびSchwa
b (1989) J. Neurosci. 9:1126-1133; SchwabおよびCaroni (1988) J. Neurosci
. 8:2381-2393)；ＩＮ−１(Brosamle, et al., (1998) Abst. Soc. Neurosci.,
24:1559)；ＮＩ−３５／２５０(Huber et al., (1998) Abst. Soc Neurosci., 2
4:1559)；ＮＩ−２２０／２５０(van der Haar et al., (1998) Abst.Soc. Neur
osci., 24:1559)；アレチン(arretin)(Janani et al., (1998) Abst. Soc. Neur
osci., 24:1560)およびＮＯＧＯ(Chen et al., (1998) Abst. Soc. Neurosci.,
24:1776)が含まれる。[0011] Specific molecules related to myelin have been identified as putative mediators of this inhibitory activity, including myelin-associated glycoprotein (MAG) (McKerracher).
et al., (1994) Neuron. 13: 805-811; Mukhopadhyay et al., (1994) Neuron.
13: 757-767) and NI 35/250, an unidentified myelin-derived protein (Bandtlow and Schwab (1991) Soc, Neurosci. Abstr. 17: 1495; Caroni
And Schwab (1988) J. Cell Biol. 106: 1281-1288; Caroni and Schwab (198
8) Neuron 1:85; Crutcher (1989) Exp. Neurol. 104: 39-54; Savio and Schwa
b (1989) J. Neurosci. 9: 1126-1133; Schwab and Caroni (1988) J. Neurosci.
8: 2381-2393); IN-1 (Brosamle, et al., (1998) Abst. Soc. Neurosci.,
24: 1559); NI-35 / 250 (Huber et al., (1998) Abst. Soc Neurosci., 2
4: 1559); NI-220 / 250 (van der Haar et al., (1998) Abst. Soc. Neur
osci., 24: 1559); arretin (Janani et al., (1998) Abst. Soc. Neur
osci., 24: 1560) and NOGO (Chen et al., (1998) Abst. Soc. Neurosci.,
24: 1776).

【００１２】 抗ＮＩ３５／２５０抗体、ＩＮ−１を用いることによる、ＮＩ３５／２５０を
伴うミエリン関連阻害を機能的に遮断する実験的試行により、皮質脊髄軸索のあ
る解剖学的再生が促進された(Bregman et al., (1995) Nature 378:498-501; Ca
roniおよびSchwab (1988) Neuron. 1:85-96; SchnellおよびSchwab (1990) Natu
re 343:269-272)。[0012] Experimental attempts to functionally block myelin-related inhibition with NI35 / 250 by using the anti-NI35 / 250 antibody, IN-1, promoted some anatomical regeneration of corticospinal axons (Bregman et al., (1995) Nature 378: 498-501; Ca
roni and Schwab (1988) Neuron. 1: 85-96; Schnell and Schwab (1990) Natu.
re 343: 269-272).

【００１３】 鳥類脊髄内の成熟ミエリンの免疫学的崩壊(Keirstead et al., (1995) J. Neu
rosci. 15:6963-6974)および正常な鳥類または哺乳類神経発育の間のＣＮＳ髄鞘
形成の開始の遅延(Keirstead et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 8
9:11664-11668; Keirstead et al., (1997) Brain. Res. Bull. 44:727-734; Va
rga et al., (1995) Eur. J. Neurosci. 7:2119-2129)により、また、ＣＮＳ軸
索再成長および／または成長が促進された。[0013] Immunological disruption of mature myelin in the avian spinal cord (Keirstead et al., (1995) J. Neu
rosci. 15: 6963-6974) and a delay in the initiation of CNS myelination during normal avian or mammalian nerve development (Keirstead et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 8
9: 11664-11668; Keirstead et al., (1997) Brain. Res. Bull. 44: 727-734; Va
rga et al., (1995) Eur. J. Neurosci. 7: 2119-2129) also promoted CNS axonal regrowth and / or growth.

【００１４】 傷害後の軸索成長の再生を阻害するミエリン中に位置するかまたは包埋された
ある成分の存在により、ミエリンおよびこの阻害成分を一時的に除去して、傷害
を受けた成体の脊髄の回復を促進することが望ましくなる。成体の脊髄を、薬剤
（例えばエチジウムブロミド）によりインビボで脱髄することができる；しかし
、これらの薬剤は、中枢神経系（例えば星状細胞）における他の細胞のタイプに
対して非特異的な悪影響を有する。さらに、マウスおよびラットのミエリン欠乏
株は、容易に入手可能であるが、短縮された寿命のために実験的値が限定されて
いる：ほとんどは、生後数週間を超えて生存しない。[0014] Due to the presence of certain components located or embedded in myelin that inhibit the regeneration of axonal growth following injury, the myelin and its inhibitory components are temporarily removed, resulting in the injury of adult humans. It would be desirable to promote spinal cord recovery. The adult spinal cord can be demyelinated in vivo by drugs (eg, ethidium bromide); however, these drugs are non-specific for other cell types in the central nervous system (eg, astrocytes). Has adverse effects. In addition, mouse and rat myelin-deficient strains are readily available but have limited experimental values due to their shortened life span: most do not survive beyond the first few weeks of life.

【００１５】 従って、神経学的組織の再生を増強するためのインビボでミエリンを崩壊させ
る改善された方法に対する必要性がある。本発明は、この必要性に向けられた方
法を提供する。[0015] Therefore, there is a need for improved methods of disrupting myelin in vivo to enhance neurological tissue regeneration. The present invention provides a method that addresses this need.

【００１６】補体 補体系は、抗原抗体反応の一次的な体液性メディエイターである。これは、互
いに、抗体とおよび細胞膜と相互作用することができる少なくとも２０種の化学
的および免疫学的に別個の血清タンパク質からなる（例えば310_346においてJ.
Klein, Immunology: The Science of Self_Nonself Discrimination (New York:
John Wiley & Sons, 1982)参照）。この系における原理的な作用物は、Ｃ１〜
Ｃ９、ＢおよびＤと示す１１種のタンパク質であり、これらは、通報血漿タンパ
ク質中に存在する。これらのタンパク質は、通常不活性であるが、これらは、２
種の別個の方法において活性化することができる：古典的(classical)経路また
は代替的(alternate)経路。The complement system is a primary humoral mediator of antigen-antibody reactions. It consists of at least 20 chemically and immunologically distinct serum proteins capable of interacting with each other, with antibodies and with cell membranes (for example in J.
Klein, Immunology: The Science of Self_Nonself Discrimination (New York:
John Wiley & Sons, 1982). The principal agents in this system are C1-
Eleven proteins, designated C9, B and D, are present in the signaling plasma proteins. Although these proteins are usually inactive, they
Species can be activated in a separate way: the classical pathway or the alternative pathway.

【００１７】 古典的経路は、抗原抗体反応により活性化される：抗体が抗原と結合する際に
、抗体の不変部における特異的反応性部位は活性化され、これは、次に、補体系
のＣ１分子と直接結合する。これにより、連続的反応のカスケードが移動し、Ｃ
１プロ酵素の活性化で開始する。少数の抗原抗体組み合わせのみが、補体系のこ
の第１の段階において、多くの分子を活性化するために必要である。次に、Ｃ１
酵素は、補体系の後者の段階において、増大する量の酵素を連続的に活性化する
。複数の末端生成物が生成し、これは、オプソニン作用およびファゴサイトーシ
ス、溶解、凝集、ウイルスの中性化、化学走性、肥満細胞および好塩基細胞の活
性化並びに炎症効果を含む、侵襲性（invading）生物または毒素による損傷を防
止するのを助ける重要な効果を生じる。The classical pathway is activated by an antigen-antibody reaction: when an antibody binds an antigen, a specific reactive site in the constant part of the antibody is activated, which in turn leads to the complement system It binds directly to the C1 molecule. This shifts the cascade of continuous reactions to C
1. Start with activation of the proenzyme. Only a few antigen-antibody combinations are needed to activate many molecules in this first stage of the complement system. Next, C1
The enzyme continuously activates increasing amounts of the enzyme in the latter stages of the complement system. Multiple terminal products are produced, which include opsonization and invasiveness, including phagocytosis, lysis, aggregation, virus neutralization, chemotaxis, mast cell and basophil activation and inflammatory effects. (Invading) Produces important effects that help prevent damage by organisms or toxins.

【００１８】 補体系はまた、抗原抗体反応の仲介なしに代替的経路により活性化することが
できる。ある物質は、補体因子ＢおよびＤと反応し、因子Ｃ３を活性化する活性
化生成物を生成し、補体カスケードの残りを除去し；従って系の本質的にすべて
の同一の最終生成物が、古典的経路におけると同様に生成し、同一の効果を生じ
る。代替的経路が、抗原抗体反応を伴わないため、これは、侵襲性微生物に対す
る防御の最前線の１つである。[0018] The complement system can also be activated by alternative routes without mediation of an antigen-antibody reaction. Certain substances react with complement factors B and D to produce an activation product that activates factor C3, removing the remainder of the complement cascade; thus, essentially all of the same end product of the system Generate as in the classical pathway, producing the same effect. This is one of the first lines of defense against invasive microorganisms because the alternative pathway does not involve an antigen-antibody reaction.

【００１９】 補体系の古典的経路と代替的経路との両方の成分が、局所的に作用してＣ３を
活性化するため、これは、補体の重要な成分である。Ｃ３は、１９５ｋＤタンパ
ク質であり、これは、１０５および７５ｋＤの２つのジスルフィド架橋鎖を含む
。Ｃ１ｑの抗原抗体複合体への結合により古典的経路において活性化された、酵
素的に活性なＣ４−Ｃ２複合体は、Ｃ３を２つのフラグメント、Ｃ３ａおよびＣ
３ｂに開裂させる。大きい方のフラグメントであるＣ３ｂは、標的細胞の表面に
共有結合し、ここで、これは、補体カスケードにおけるその後の段階を触媒する
プロテアーゼとして作用する。これはまた、これらの細胞が標的細胞をファーゴ
サイトーシスする能力を高めるマクロファージおよび好中球における特異的受容
体タンパク質により認識される。特に、膜に固定化されたＣ３ｂは、反応のさら
なるカスケードを誘発し、これにより、後の成分からの膜攻撃複合体のアセンブ
リが生じる。This is an important component of complement because components of both the classical and alternative pathways of the complement system act locally to activate C3. C3 is a 195 kD protein, which contains two 105 and 75 kD disulfide bridges. The enzymatically active C4-C2 complex, activated in the classical pathway by binding of C1q to the antigen-antibody complex, converts C3 into two fragments, C3a and C3a.
Cleavage to 3b. The larger fragment, C3b, covalently binds to the surface of the target cell, where it acts as a protease that catalyzes a subsequent step in the complement cascade. It is also recognized by specific receptor proteins on macrophages and neutrophils that enhance the ability of these cells to phagocytose target cells. In particular, C3b immobilized on the membrane triggers a further cascade of reactions, resulting in assembly of the membrane attack complex from later components.

【００２０】 細胞表面結合抗体による補体固定は、少数の活性化内のインビトロでの多くの
種々の細胞のイオン性ホメオスタシスを弱めることが示された(Mayer (1972) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2954-2958; Morgan (1989) Biochem. J. 264:1-1
4)。Complement fixation with cell surface-bound antibodies has been shown to attenuate the ionic homeostasis of many different cells in vitro within a small number of activations (Mayer (1972) Pr.
oc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2954-2958; Morgan (1989) Biochem. J. 264: 1-1.
Four).

【００２１】ミエリン特異性抗体との補体の使用 特異的な補体固定抗体のミエリン表面抗原への付着の後に、血清補体は、酵素
カスケードを介して膜攻撃補体を形成し、細胞外カルシウムの迅速な流入(Dyer
およびBenjamins (1990) J. Cell Biol. 111:625-633)およびその後の細胞骨格
の再配列(DyerおよびMatthieu (1994) J. Neurochem. 62:777-787)を生じる。イ
ンビボにおいて、これにより、崩壊したミエリンが、その後の小膠による、およ
びすべての侵襲性マクロファージによるファゴサイトーシスの標的を加工する。 Use of Complement with Myelin-Specific Antibodies After attachment of the specific complement-fixing antibody to the myelin surface antigen, serum complement forms a membrane-attacked complement via an enzyme cascade, Rapid calcium influx (Dyer
And Benjamins (1990) J. Cell Biol. 111: 625-633) and subsequent rearrangement of the cytoskeleton (Dyer and Matthieu (1994) J. Neurochem. 62: 777-787). In vivo, this causes the disrupted myelin to process targets for phagocytosis by subsequent microglia and by all invasive macrophages.

【００２２】 ミエリン特異性抗体との血清補体のインビトロ適用は、精製した希突起膠細胞
培養におけるミエリン製作物を抑制することが示された(Dorfman et al., (1979
) Brain Res. 177:105-114; Dubios-Dalcq et al., (1970) Pathol. Eur. 5:331
-347; DyerおよびBenjamins (1990) J. Cell Biol. 111:625-633; Fry et al.,
(1974) Science 183:540-542; Hruby et al., (1977) Science 195:173-175)。 インビボミエリン崩壊は、抗ＧａｌＣ血清および補体を用いて、テンジクネズ
ミ視神経において示された(Sergott et al., (1984) J. Neurol. Sci. 64:297-3
03)；ミエリン崩壊は、処理の１〜２時間内に観察された。In vitro application of serum complement with myelin-specific antibodies has been shown to inhibit myelin production in purified oligodendrocyte cultures (Dorfman et al., (1979)
) Brain Res. 177: 105-114; Dubios-Dalcq et al., (1970) Pathol.Eur. 5: 331.
-347; Dyer and Benjamins (1990) J. Cell Biol. 111: 625-633; Fry et al.,
(1974) Science 183: 540-542; Hruby et al., (1977) Science 195: 173-175). In vivo myelin disruption has been demonstrated in the guinea pig optic nerve using anti-GalC serum and complement (Sergott et al., (1984) J. Neurol. Sci. 64: 297-3).
03); Myelin disruption was observed within 1-2 hours of treatment.

【００２３】ニワトリモデル 鳥類モデルにおいて、Ｅ１３における胚ニワトリ脊髄における髄鞘形成の開始
は、横断された脊髄の機能的回復についての制限期間の可能化からの遷移と一致
する。発育の１０〜１１胚日（Ｅ１０〜Ｅ１１）におけるニワトリ希突起膠細胞
の最初の出現は、２〜３胚日のミエリンの最初の形成を進行させ、ガラクトセレ
ブロシド（ＧａｌＣ）、即ち希突起膠細胞により生成した主要なスフィンゴ脂質
の発現により特徴づけされる。In the chicken model avian model, the onset of myelination in the embryonic chicken spinal cord at E13 is consistent with a transition from enabling a restricted period for functional recovery of the traversed spinal cord. The first appearance of chicken oligodendrocytes at 10-11 embryonic days of development (E10-E11) promotes the initial formation of myelin at 2-3 embryonic days, resulting in galactocerebroside (GalC), or oligodendrocytes. Characterized by the expression of major sphingolipids produced by

【００２４】 成熟した鳥類の脊髄において、脊髄横断の後に、局所的な脊髄ミエリンの免疫
学的崩壊により、脳幹脊椎ニューロンによる再生が促進された(Keirstead et al
., (1995) J. Neurosci. 15:6963-6974; Keirstead et al., (1997) Brain Res.
Bull., 44:727-734)。ミエリンの免疫学的崩壊は、一時的なものであり、血清
補体とミエリン特異性補体固定抗体（例えばＧａｌＣ抗体）との両方の脊椎内注
入により生成した。このような処理の結果、成熟脳幹脊椎軸索の２０％までが再
生した。In the spinal cord of adult birds, after spinal cord transection, local spinal cord myelin immunodestruction promoted regeneration by brainstem spinal neurons (Keirstead et al.
., (1995) J. Neurosci. 15: 6963-6974; Keirstead et al., (1997) Brain Res.
Bull., 44: 727-734). The immunological disruption of myelin was transient and was generated by intraspinal injection of both serum complement and a myelin-specific complement-fixing antibody (eg, a GalC antibody). As a result of such treatment, up to 20% of mature brainstem vertebral axons regenerated.

【００２５】 この背景情報は、既知の情報を、本出願人が本発明の可能な同等物であると考
える目的で提供する。前の情報のすべてが本発明に対して従来技術を構成する同
意は、必然的に意図されず、解釈されるべきではない。本明細書を通して言及す
る刊行物は、本出願中に全体を参考として組み込まれる。This background information is provided for the purpose of considering the known information as possible equivalents of the present invention. The consent that all of the preceding information constitutes prior art to the present invention is not necessarily intended and should not be construed. Publications mentioned throughout this specification are incorporated by reference in their entirety in this application.

【００２６】発明の要約 本発明の目的は、哺乳類ＣＮＳにおけるニューロンの再成長、回復および再生
を促進する手段を提供することにある。従って、本発明は、慢性障害および急性
障害の両方において、哺乳類対象、例えばヒトのＣＮＳにおけるニューロンの再
成長、回復および／または再生を促進するための組成物および使用方法を提供す
る。It is an object of the Summary of the Invention The invention is to provide a means of promoting regrowth of neurons in the mammalian CNS, the recovery and regeneration. Accordingly, the present invention provides compositions and methods for promoting neuronal regrowth, recovery and / or regeneration in the CNS of a mammalian subject, eg, a human, in both chronic and acute disorders.

【００２７】 本発明の１つの態様は、治療的に有効な量で以下のもの： （ａ）ミエリンのエピトープと特異的に結合する、１種または２種以上の補体固
定抗体またはそのフラグメント；および （ｂ）１種または２種以上の補体タンパク質またはそのフラグメント を含み、ここで、該抗体のミエリンへの結合が、ミエリンの一時的崩壊（transi
ent disruption）および／または一時的脱髄（transient demyelination）を生
じる組成物を提供する。抗体は、モノクローナルおよび／またはポリクローナル
であることができる。補体タンパク質またはそのフラグメントは、これが投与さ
れる種とは異なる種から誘導することができる。好ましい態様において、補体タ
ンパク質またはそのフラグメントは、ヒトである。補体成分は、抗体成分とは物
理的に別個の成分であることができるかまたは、これは、抗体成分に直接共有ま
たは非共有で付着して、ミエリンの表面への抗体の結合が内生免疫系攻撃を誘発
するようにすることができる。１種または２種以上の成長因子を加えて（適切な
順序で）、再成長および再生を促進することができる。One aspect of the invention is a therapeutically effective amount of: (a) one or more complement-fixing antibodies or fragments thereof that specifically bind to an epitope of myelin; And (b) one or more complement proteins or fragments thereof, wherein the binding of the antibody to myelin is caused by the transient breakdown of myelin (transi).
Compositions that cause ent disruption and / or transient demyelination are provided. Antibodies can be monoclonal and / or polyclonal. The complement protein or a fragment thereof can be derived from a different species than the species to which it is administered. In a preferred embodiment, the complement protein or fragment thereof is human. The complement component can be a physically separate component from the antibody component, or it can be covalently or non-covalently attached directly to the antibody component, resulting in endogenous binding of the antibody to the surface of myelin. Can trigger an immune system attack. One or more growth factors can be added (in the proper order) to promote regrowth and regeneration.

【００２８】 特定的な態様において、ミエリンのエピトープは、ミエリン鞘エピトープ、例
えばガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、Ｏ４、ミエリン希突起膠細胞糖タンパ
ク質（ＭＯＧ）またはミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ＮＯＧＯ、Ｎ１２
２０、ＮＩ−３５／２５０またはアレチンあるいはそのフラグメントである。好
ましい態様において、ミエリンのエピトープは、ＧａｌＣである。他の好ましい
態様は、ＭＯＧである。In a particular embodiment, the epitope of myelin is a myelin sheath epitope, such as galactocerebroside (GalC), O4, myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) or myelin-associated glycoprotein (MAG), NOGO, N12.
20, NI-35 / 250 or aretin or a fragment thereof. In a preferred embodiment, the myelin epitope is GalC. Another preferred embodiment is MOG.

【００２９】 好ましい態様において、補体タンパク質またはそのフラグメントは、Ｃ３成分
またはフラグメント、変種、類似体またはこの化学的誘導体を含む。好ましい態
様において、成分Ｃ３ｂを用いる。 本発明の他の態様において、組成物はさらに、ニューロトロフィンおよび成長
因子、例えばＮＴ−３、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ−１、ＢＤＮＦ、ＰＤＧＦ、ＧＤＮＦ
、ＣＴ−１またはＢＭＰを含む。In a preferred embodiment, the complement protein or fragment thereof comprises a C3 component or fragment, variant, analog or chemical derivative thereof. In a preferred embodiment, component C3b is used. In another embodiment of the present invention, the composition further comprises a neurotrophin and a growth factor such as NT-3, CNTF, FGF-1, BDNF, PDGF, GDNF.
, CT-1 or BMP.

【００３０】 本発明はまた、ミエリンの一時的崩壊および／または一時的脱髄による、対象
におけるニューロンの再成長、回復および／または再生を促進するこれらの組成
物の使用に関する。 本発明の１つの態様において、組成物を、ニューロン機能障害によるニューロ
ン回復および／または再生を必要とする対象において用いる。このニューロン機
能障害は、ＣＮＳに対する急性のまたは慢性の傷害の結果であることができる。
これはまた、変性疾患、例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病の結果で
あることができる。 本発明の他の態様において、組成物を対象において用いて、移植された細胞の
成長を相対的に可能にするＣＮＳ内の環境を生じる。The present invention also relates to the use of these compositions to promote the regrowth, recovery and / or regeneration of neurons in a subject by the temporary breakdown and / or temporary demyelination of myelin. In one aspect of the invention, the composition is used in a subject in need of neuronal recovery and / or regeneration due to neuronal dysfunction. This neuronal dysfunction can be the result of acute or chronic injury to the CNS.
This can also be the result of a degenerative disease, such as Alzheimer's disease or Parkinson's disease. In another aspect of the invention, the composition is used in a subject to create an environment within the CNS that relatively allows the growth of transplanted cells.

【００３１】 本発明はまた、哺乳類ＣＮＳにおけるニューロンの再成長、回復および再生を
促進する方法に関し、ここで、損傷は、慢性障害または急性障害のいずれかの結
果である。本発明は、ミエリンのエピトープに特異的に結合する１種または２種
以上の補体固定抗体またはそのフラグメントの送達および、再生を必要とするニ
ューロン領域におけるミエリンの一時的崩壊および／または一時的脱髄を実施す
るために一緒にまたは個別に送達された、１種または２種以上の補体タンパク質
またはそのフラグメントの送達を必要とする。 本発明の種々の他の目的および利点は、本発明の詳細な記載から明らかになる
。The present invention also relates to a method of promoting neuronal regrowth, recovery and regeneration in the mammalian CNS, wherein the damage is a result of either a chronic or acute disorder. The present invention relates to the delivery of one or more complement-fixing antibodies or fragments thereof that specifically bind to an epitope of myelin, and the temporary disruption and / or transient destruction of myelin in areas of the neuron that require regeneration. It requires the delivery of one or more complement proteins or fragments thereof, delivered together or separately to perform the marrow. Various other objects and advantages of the invention will be apparent from the detailed description of the invention.

【００３２】表および図面 表１は、成体のラットの腰部の索からの逆行性フルオロ金標識を有する個別の
対照および実験動物から得られた赤核脊髄ニューロン細胞計数を示す。 Tables and Figures Table 1 shows nucleus spinal cord neuron cell counts obtained from individual control and experimental animals with retrograde fluorogold labeling from the lumbar cord of adult rats.

【００３３】 図１は、以下のものを示す。（Ａ）クレシルバイオレットで染色したＴ１０左
側ヘミセクション損傷のレベルにおける成体ラットの脊髄の横断面の顕微鏡写真
である。すべての損傷を評価し、常に赤核脊髄路が横断する索の切断に至る。反
対側性背（ｄｈ）および前（ｖｈ）角は、常に、損傷されないままであった；中
心管（ｃｃ）を、配向について標識する。（Ｂ）処理した対照および免疫学的に
崩壊したヘミセクションした脊髄における視覚可能なフルオロ金拡散の評価であ
る。逆行性トレーサーの拡散を、腰部の脊髄中への注射の後に示した時点におい
て、光学顕微鏡レベルにおいて測定した（詳細について方法を参照）。免疫学的
脱髄は、トレーサーの拡散に顕著に影響しなかった。FIG. 1 shows the following: (A) Photomicrograph of a cross section of the adult rat spinal cord at the level of T10 left hemisection injury stained with cresyl violet. Assess all damage and always lead to amputation of the cord that the nucleus pulposus traverses. The contralateral dorsal (dh) and anterior (vh) angles always remained intact; the central canal (cc) is labeled for orientation. (B) Evaluation of visible fluorogold diffusion in treated controls and immunologically disrupted hemisectioned spinal cord. Retrograde tracer diffusion was measured at the light microscopic level at the time indicated after injection into the lumbar spinal cord (see methods for details). Immunological demyelination did not significantly affect tracer spread.

【００３４】 図２は、７日間の免疫学的試薬の連続的脊椎内注入の後の側背索を通しての横
断面の電子顕微鏡写真を示す。（Ａ）注入部位の１つの脊椎セグメント（＜２ｍ
ｍ）内で、露出した脱髄した軸索の大きい領域が、視覚可能であった。いくつか
の軸索を観察して、単球細胞（Ｍ、例えば浸潤マクロファージ）およびまたは内
因性小膠細胞と関連させ、これらのいくつかは、ミエリン卵形（矢印）またはミ
エリン残骸を含んでいた。（Ｂ）他の格子において、単球および侵襲性多形核球
(polymorphonucleocyte)（ＰＭＮ）もまた、脱髄した軸索と密接に関連して見る
ことができた。マクロファージおよび／または小膠細胞は、これらの高密度の小
胞体（矢印先頭）および「指状（finger-like）」プロセスに基づいて同定され
た。いくつかの単球は、基底層成分、例えばコラーゲン（Ｃｏｌ）を降下させ、
これは、これらを星状細胞から区別する。多葉核は、ＰＭＮに特有であり、これ
らの同定を促進する。（Ｃ）ミエリン崩壊の例である。これは、しばしば、軸索
が尚ミエリンと関連する免疫学的注入部位から４〜８ｍｍ（１〜２脊椎セグメン
ト）において観察される；しかし、ミエリンラメラは、崩壊した（葉裂した）。
ミエリン被覆における密着のいくつかの領域は、持続した（矢印）。（Ｄ）テン
ジクネズミ補体のみの対照注入後の側背索内の軸索の外観の例である。ミエリン
鞘のいくつかの非特異性損傷が、特に注入部位の１つの脊椎セグメント内に生じ
た；しかし、ミエリンのコンパクト本質は、無傷のままであった。最初の拡大×
４０００（Ａ、Ｂ、Ｄ）、×１００００（Ｃ）。FIG. 2 shows an electron micrograph of a cross section through the dorsal dorsal cord after 7 days of continuous intraspinal injection of immunological reagents. (A) One spinal segment at the injection site (<2 m
Within m), a large area of exposed demyelinated axons was visible. Some axons were observed and associated with monocytes (M, eg, infiltrating macrophages) and or endogenous microglia, some of which contained myelin ovoids (arrows) or myelin remnants . (B) Monocytes and invasive polymorphonuclear cells in other lattices
(polymorphonucleocyte) (PMN) could also be seen in close association with demyelinated axons. Macrophages and / or microglia were identified based on these dense ERs (head of arrow) and "finger-like" processes. Some monocytes lower basal layer components, such as collagen (Col),
This distinguishes them from astrocytes. Multilobular nuclei are unique to PMNs and facilitate their identification. (C) An example of myelin breakdown. This is often observed at 4-8 mm (1-2 vertebral segments) where axons are still associated with myelin; however, the myelin lamella has collapsed (leaved lobes).
Some areas of adhesion in the myelin coating persisted (arrows). (D) is an example of the appearance of axons in the dorsal dorsal cord after control injection of guinea pig complement alone. Some non-specific damage of the myelin sheath occurred, particularly within one spinal segment at the injection site; however, the compact nature of myelin remained intact. First magnification ×
4000 (A, B, D), × 10000 (C).

【００３５】 図３は、左側胸ヘミセクションおよびその後の免疫学的ミエリン抑制処理の後
の赤核脊髄ニューロンの再生の例示を示す。パネルＡおよびＢは、同一の実験的
に処理した動物（抗ＧａｌＣとの血清補体の１４日の注入）からの赤核脊髄ニュ
ーロンの顕微鏡写真である；Ａは、傷害を受けていない赤色核からであり、一方
Ｂは、傷害を受けた赤色核からである。パネルＣおよびＤはまた、同一の対照処
理した動物（血清補体のみの１４日間の注入）からである：Ｃは、傷害を受けて
いない赤色核であり、Ｄは、傷害を受けた赤色核である。損傷後２８日の吻腰部
索内のフルオロ金注入の結果、傷害を受けていない赤核脊髄ニューロン（Ａおよ
びＣ）の逆行性標識および傷害を受けた赤色核から再生した赤核脊髄ニューロン
のもの（ＢおよびＤ）が生じた。（Ｅ）および（Ｆ）軸索切断した赤核脊髄ニュ
ーロンは、第１の標識ＲＤＡ（黒塗り矢印先頭）およびその後の２８日後の第２
の標識ＦＧ（白抜き矢印先頭）での傷害の時点において逆行性標識した。二重標
識した（ＲＤＡ＋ＦＧ）細胞を、アステアリスクで示し、免疫学的ミエリン抑制
処理の後に再生した赤核脊髄ニューロンを示す。スケールバー＝１００μｍ。FIG. 3 shows an illustration of the regeneration of red nucleus spinal cord neurons after left breast hemisection and subsequent immunological myelin suppression treatment. Panels A and B are micrographs of red nucleus spinal cord neurons from the same experimentally treated animal (14 day injection of serum complement with anti-GalC); While B is from the injured red nucleus. Panels C and D are also from the same control-treated animals (14 days infusion of serum complement alone): C is the uninjured red nucleus and D is the injured red nucleus. It is. Retrograde labeling of uninjured red nucleus spinal cord neurons (A and C) as a result of fluorogold injection in the rostral lumbar cord 28 days post injury and of red nucleus spinal cord neurons regenerated from damaged red nuclei (B and D) occurred. (E) and (F) Axotomized red nucleus spinal cord neurons were labeled with the first labeled RDA (leading black arrow) and the second 28 days later.
Was retrogradely labeled at the time of injury with labeled FG (open arrow head). Double-labeled (RDA + FG) cells are indicated by an asteria risk, showing red nucleus spinal cord neurons regenerated after immunological myelin suppression treatment. Scale bar = 100 μm.

【００３６】 図４は、胸の傷害および免疫学的処理の後の赤核脊髄ニューロンの再生の相対
的定量的評価を示す。再生は、交互の組織セクションにおいてＦＧ標識細胞の計
数により評価した：多極ニューロン形態およびＦＧ標識の両方のものを、陽性で
あるとみなした。再生の百分率を、傷害を受けた赤色核からの逆行性標識した細
胞計数の、同一の動物内の対照の傷害を受けていない赤色核との比較により計算
した。各々の動物について、損傷の程度を評価した。黒塗り棒：抑制されたミエ
リン；ハッチ(hatched)棒：プールした対照処理した群。データを±ｓ．ｄ．で
示す。FIG. 4 shows a relative quantitative assessment of nucleus spinal cord neuron regeneration following breast injury and immunological treatment. Regeneration was assessed by counting FG-labeled cells in alternating tissue sections: both multipolar neuronal morphology and FG-label were considered positive. The percentage of regeneration was calculated by comparing retrogradely labeled cell counts from injured red nuclei with control uninjured red nuclei in the same animal. For each animal, the extent of damage was assessed. Filled bars: suppressed myelin; hatched bars: pooled control treated group. Data ± s. d. Indicated by

【００３７】 図５は、免疫学的脱髄に対する単一の補体タンパク質の除去の効果を例証する
。（Ａ）対照の傷害を受けていない脊髄。成体ミエリン鞘の超構造を示す側背索
を通っての横断面の電子顕微鏡写真。（Ｂ）ミエリン特異性抗体およびヒト補体
血清での７日注入の結果、顕著なミエリン抑制が生じる。（Ｃ）補体のＣ３成分
の除去の結果、ミエリン除去の欠乏が生じ、これは、（ｉ）オプソニン作用また
は（ｉｉ）溶解膜攻撃複合体（ＭＡＣ）、最終的溶解経路複合体へのカスケード
の増殖のいずれかにおけるこのタンパク質の基本的な役割を示す。これは、有効
な一時的脱髄のための古典的補体経路を活性化するための、ミエリン特異性細胞
表面結合抗体の基本的なおよび必須の要件であると考えられている。FIG. 5 illustrates the effect of removing a single complement protein on immunological demyelination. (A) Uninjured spinal cord of control. Electron micrograph of a cross section through the dorsal cord showing the ultrastructure of the adult myelin sheath. (B) 7-day injection with myelin-specific antibody and human complement serum results in significant myelin suppression. (C) Removal of the C3 component of complement results in a deficiency in myelin removal, which is either (i) opsonizing or (ii) lytic membrane attack complex (MAC), a cascade to the ultimate lytic pathway complex. Shows the fundamental role of this protein in any of the growth of E. coli. This is believed to be a basic and essential requirement of myelin-specific cell surface binding antibodies to activate the classical complement pathway for effective transient demyelination.

【００３８】 図６は、胸の傷害および遅延された免疫学的処理の後の側方の前庭脊髄ニュー
ロンの再生の相対的定量的評価を示す。免疫学的脱髄処理は、示すように、傷害
の後１または２か月遅延した。再生を、交互組織セクションにおいてＦＧ標識し
た細胞を計数することにより、評価した：多極ニューロン形態およびＦＧ標識の
両方についてのものを、陽性であるとみなした。再生の百分率を、傷害を受けた
側方の前庭脊髄核からの逆行性標識した細胞計数の、同一の動物内の対照の傷害
を受けていない側方の前庭脊髄核との比較により計算した。各々の動物について
、損傷の程度を評価した。黒塗り棒：抑制されたミエリン；白抜き棒：プールし
た対照処理した群。データを±ｓ．ｄ．で示す。FIG. 6 shows a relative quantitative assessment of the regeneration of lateral vestibular spinal neurons after chest injury and delayed immunological treatment. Immunological demyelination was delayed one or two months after injury as indicated. Regeneration was assessed by counting FG-labeled cells in the alternating tissue section: both multipolar neuronal morphology and FG-label were considered positive. The percentage of regeneration was calculated by comparing the retrograde labeled cell count from the injured lateral vestibular nucleus with the uninjured lateral vestibular nucleus of the control in the same animal. For each animal, the extent of damage was assessed. Solid bars: suppressed myelin; open bars: pooled control-treated group. Data ± s. d. Indicated by

【００３９】 図７は、以下のものを示す。Ａ）ラット中枢神経系の背図であり、赤核脊髄路
（ＲＮ）および側方前庭路（ＬＶｅ）の相対的起源および経過を示す。また、左
側胸ヘミセクション損傷（〜Ｔ１０、線）、免疫学的注入部位（〜Ｔ１１、垂直
ハッチ）およびフルオロ金注射の部位（〜Ｌ１、対角線ハッチ）をも示す（実線
）。Ｂ）下方の胸および吻腰部脊髄索を通しての傍矢状セクションの複合顕微鏡
写真である（Ｔ９−Ｌ１、吻が上）。いくらかのフルオロ金拡散は、明らかに強
い白色の「かさ」としての注入部位から発することができるが、この染色は、注
射の部位からの距離に伴って急速に減少し、いずれも、Ｔ１１、免疫学的注入部
位に対する視覚可能な吻ではなかった（即ち、Ｔ１０に対する、またはこの上の
拡散はなく、従って脳幹脊椎突出の任意の「偽の」陽性逆行性標識について証拠
はなかった）。Ｃ）クレシルバイオレットで染色したＴ１０左側ヘミセクション
損傷のレベルにおける脊髄の横断面の顕微鏡写真である。すべての損傷を評価し
、常に赤核脊髄および側方前庭脊髄路が横断する索の切断に至った。反対側性背
（ｄｈ）および前（ｖｈ）角は、常に、損傷されないままであった；中心管（ｃ
ｃ）を、配向について標識する。ＤおよびＥ）損傷およびポンプ移植部位内の血
球に関連する非特異的蛍光であり、それぞれ、損傷およびカニューレ移植に関連
する損傷の程度を示す。特異的フルオロ金蛍光標識は、カニューレ移植またはヘ
ミセクション傷害のレベルにおいては、決して観察されなかった。FIG. 7 shows the following: A) Dorsal view of the rat central nervous system, showing the relative origin and course of the red nucleus spinal tract (RN) and the lateral vestibular tract (LVe). Also shown are left chest hemisection injury (~ T10, line), immunological injection site (~ T11, vertical hatch) and site of fluorogold injection (~ L1, diagonal hatch) (solid line). B) Composite micrograph of parasagittal section through lower thoracic and rostral lumbar spinal cords (T9-L1, snout up). Some fluorogold diffusion can originate from the injection site as a clearly intense white "bulk", but this staining decreases rapidly with distance from the site of injection, both T11, immune There was no visible snout to the biological injection site (ie, no diffusion to or above T10, and thus no evidence for any "false" positive retrograde labeling of the basal stem spine protrusion). C) Photomicrograph of a cross section of the spinal cord at the level of T10 left hemisection injury stained with cresyl violet. All injuries were assessed and always resulted in amputation of the cord across the nucleus pulposus and lateral vestibulospinal tract. The contralateral dorsal (dh) and anterior (vh) angles always remained intact; the central canal (c
c) is labeled for orientation. D and E) Non-specific fluorescence associated with injury and blood cells within the site of pump implantation, indicating the extent of injury and injury associated with cannula implantation, respectively. Specific fluorogold fluorescent labeling was never observed at the level of cannula implantation or hemisection injury.

【００４０】 図８は、左側胸ヘミセクションおよびその後の免疫学的ミエリン抑制処理の後
の、側方前庭脊髄ニューロンの再生を示す。パネルＡおよびＢは、同一の実験的
に処理した動物（抗ＧａｌＣとの血清補体の１４日の注入）からの側方前庭脊髄
ニューロンの顕微鏡写真である；Ａは、傷害を受けた側方前庭核のものであり、
Ｂは、傷害を受けていない側方前庭核からであり、パネルＣおよびＤはまた、同
一の対照処理した動物（血清補体のみの１４日間の注入）からである；ここでＣ
は、傷害を受けた側方前庭脊髄核であり、Ｄは、傷害を受けていない側方前庭脊
髄核である。傷害後２８日の吻腰部索内のフルオロ金注入の結果、傷害を受けて
いない側方前庭脊髄ニューロン（ＢおよびＤ）の逆行性標識および傷害を受けた
側方前庭脊髄核から再生した側方前庭脊髄ニューロンのもの（ＡおよびＣ）が生
じた。さらなる詳細については、結果を参照されたい。パネルＥは、中脳を通っ
ての横断面の図であり、側方前庭核（ＬＶｅ）、ＳｐＶｅ＝脊椎前庭核、ＭＶｅ
＝中央前庭核、４Ｖ＝第４の室、ＦＮ＝顔面神経路、７＝第７の頭の（顔面神経
）核、ＰＦｌ＝旁片葉の位置を示す。スケールバー＝１００μｍ。FIG. 8 shows regeneration of lateral vestibular spinal cord neurons after left chest hemisection and subsequent immunological myelin suppression treatment. Panels A and B are micrographs of lateral vestibular spinal cord neurons from the same experimentally treated animal (14 day injection of serum complement with anti-GalC); Of the vestibular nucleus,
B is from the uninjured lateral vestibular nucleus and panels C and D are also from the same control-treated animals (14-day infusion of serum complement alone); where C
Is the injured lateral vestibular nucleus and D is the uninjured lateral vestibular nucleus. Retrograde labeling of uninjured lateral vestibular spinal neurons (B and D) and lateral regeneration from injured lateral vestibular spinal nucleus as a result of fluorogold injection in the rostral lumbar cord 28 days after injury Vestibular spinal neurons (A and C) resulted. See the results for further details. Panel E is a cross-sectional view through the midbrain, lateral vestibular nucleus (LVe), SpVe = vertebral vestibular nucleus, MVe.
= Central vestibular nucleus, 4V = fourth chamber, FN = facial nerve tract, 7 = seventh head (facial nerve) nucleus, PFl = position of paralateral lobe. Scale bar = 100 μm.

【００４１】 図９は、胸の傷害および免疫学的処理の後の赤核脊髄および側方前庭脊髄ニュ
ーロンの再生の相対的定量的評価を示す。再生は、交互の組織セクションにおい
てＦＧ標識細胞の計数により評価した：多極ニューロン形態およびＦＧ標識の両
方のものを、陽性であるとみなした。再生の百分率を、傷害を受けた核と同一の
動物内の反対側性の（傷害を受けていない）核との比較により計算した。各々の
動物について、損傷の程度を評価した。黒塗り棒：実験；白抜き棒：プールした
対照群。FIG. 9 shows the relative quantitative assessment of red cell spinal cord and lateral vestibular spinal cord neuron regeneration following chest injury and immunological treatment. Regeneration was assessed by counting FG-labeled cells in alternating tissue sections: both multipolar neuronal morphology and FG-label were considered positive. The percentage of regeneration was calculated by comparing the injured nucleus with the contralateral (uninjured) nucleus in the same animal. For each animal, the extent of damage was assessed. Solid bars: experiments; open bars: pooled control group.

【００４２】 図１０は、慢性側方ヘミセクションおよび遅延された免疫学的処理の後の下行
性脳幹脊椎軸索の再生の定量的評価を示す。対照（ＰＢＳ、Ａｂ、ＧｐＣ）、処
理（白抜き棒）または免疫学的崩壊／脱髄（黒塗り棒）の後の、逆行性的に標識
した赤色核（赤）および側方前庭（緑）ニューロン対反対側性核の百分率。傷害
を受けた核対傷害を受けていない反対側性における標識した細胞の百分率として
表現した。 図１１は、免疫学的脱髄に伴う古典的および代替の経路に伴うと知られている
因子を示す。FIG. 10 shows a quantitative assessment of the regeneration of descending brainstem vertebral axons after chronic lateral hemisection and delayed immunological treatment. Retrogradely labeled red nuclei (red) and lateral vestibule (green) after control (PBS, Ab, GpC), treatment (open bars) or immunological disruption / demyelination (solid bars). Percentage of neurons versus contralateral nuclei. Injured nuclei versus uninjured contralateral expressed as a percentage of labeled cells. FIG. 11 shows factors known to be involved in classical and alternative pathways associated with immunological demyelination.

【００４３】 図１２は、免疫学的脱髄に対する組成物からの単一の補体タンパク質の除去の
効果を示す。電子顕微鏡写真は、成体のミエリン鞘の超構造を示す側背索を通っ
ての横断面のものである。（Ａ）は、顕著なミエリン抑制を生じるミエリン特異
性抗体およびヒト補体血清での７日間の注入の効果を例証する。（Ｂ）補体のＣ
３成分の除去の結果、ミエリン除去が欠乏する。（Ｃ）補体からの因子Ｂの除去
は、代替の経路が免疫学的脱髄に伴っていないことを示す。（Ｄ）補体のＣ４成
分の除去の結果、ミエリン除去が欠乏し、古典的経路が、免疫学的脱髄に必要で
あることを示す。（Ｅ）Ｃ６成分の除去は、この成分が、免疫学的脱髄のための
成分に必ずしも含まれるべきではないことを示す。FIG. 12 shows the effect of removing a single complement protein from a composition on immunological demyelination. Electron micrographs are cross-section through the dorsal dorsal cord showing the superstructure of the adult myelin sheath. (A) illustrates the effect of a 7-day infusion with myelin-specific antibodies and human complement serum resulting in significant myelin suppression. (B) Complement C
Removal of the three components results in a lack of myelin removal. (C) Removal of factor B from complement indicates that an alternative pathway is not associated with immunological demyelination. (D) Removal of the C4 component of complement results in a lack of myelin depletion, indicating that the classical pathway is required for immunological demyelination. (E) Removal of the C6 component indicates that this component should not necessarily be included in components for immunological demyelination.

【００４４】 図１３は、免疫学的脱髄に対する組成物からの単一の補体タンパク質Ｃ５の除
去の効果を示す。電子顕微鏡写真は、成体のミエリン鞘の超構造を示す側背索を
通っての横断面のものである。Ｃ５成分の除去は、この成分が、免疫学的脱髄の
ための成分に必ずしも含まれるべきではないことを示す。FIG. 13 shows the effect of removing a single complement protein C5 from a composition on immunological demyelination. Electron micrographs are cross-section through the dorsal dorsal cord showing the superstructure of the adult myelin sheath. Removal of the C5 component indicates that this component should not necessarily be included in components for immunological demyelination.

【００４５】発明の詳細な説明 明細書および特許請求の範囲を通して、以下の用語および略語を用いる。 用語「抗体またはそのフラグメント」は、業界において十分知られている分子
生物の手法により作成される、組換え、キメラおよびアフィニティー変性形態を
含む。 「ＣＮＳ」は、中枢神経系をいう。 用語「補体タンパク質またはそのフラグメント」（Ｃ）は、１３種の全血清タ
ンパク質の任意または２０種を超える補体系の中間体および複合体の任意、抗原
抗体反応の一次体液性メディエイターをいい、この変種、類似体および化学的誘
導体を含む。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The following terms and abbreviations are used throughout the description and the claims. The term "antibody or fragment thereof" includes recombinant, chimeric and affinity modified forms made by molecular biology techniques well known in the art. "CNS" refers to the central nervous system. The term "complement protein or fragment thereof" (C) refers to any of the thirteen total serum proteins or any of more than twenty complement system intermediates and complexes, a primary humoral mediator of antigen-antibody reactions, Includes variants, analogs and chemical derivatives.

【００４６】 用語「組成物」は、１種より多い成分を示すのに用いる。組成物の要素を、一
緒に混合することができるが、これらが同一の溶液中に混ぜ合わせられることは
、必要ではない。他の態様において、これらは、包装、貯蔵またはさらに一緒に
混合する必要はない。要素（抗体タイプおよび補体タイプ）を、神経損傷の部位
に連続的にまたは同時に送達することができる。治療的に有効な時間的順序の必
要性は、当業者により理解されている。少なくとも１種の補体固定抗体またはそ
のフラグメントおよび少なくとも補体タンパク質またはこの活性フラグメントの
概念は、組成物の概念に相当する。これらの要素は、損傷の部位に送達されて、
一時的に脱髄されるべきミエリン中に存在する適切なエピトープと複合体を形成
する。従って、最初の２種のタイプの要素（各々のタイプの要素、例えば２種ま
たは３種以上の抗体または成分タンパク質またはフラグメントの１種より多い要
素があり得る）を、一時的脱髄のために標的された部位に送達して、ミエリンの
エピトープとインサイチュで、インビボで複合体を形成する。The term “composition” is used to indicate more than one component. The components of the composition can be mixed together, but it is not necessary that they be mixed in the same solution. In other embodiments, they need not be packaged, stored, or even mixed together. The components (antibody type and complement type) can be delivered sequentially or simultaneously to the site of nerve injury. The need for a therapeutically effective chronological order is understood by those skilled in the art. The concept of at least one complement-fixing antibody or a fragment thereof and at least the complement protein or an active fragment thereof corresponds to the concept of a composition. These elements are delivered to the site of injury,
It forms a complex with the appropriate epitope present in myelin to be temporarily demyelinated. Thus, the first two types of elements (each type of element may be more than one of two or more antibodies or component proteins or fragments, for example) may be used for temporary demyelination. It is delivered to the targeted site to form a complex in vivo with myelin epitopes in vivo.

【００４７】 用語「脱髄」は、神経学的組織におけるミエリンの除去または崩壊をいう。脱
髄は、ミエリン鞘、例えばニューロンまたはニューロン突出（例えば軸索）を包
囲するものの除去からなる。このプロセスは、実験的および病理学的状態の両方
において化学的または免疫学的であることができる。本発明は、回復および再成
長を促進するための一時的脱髄をもたらす。 用語「崩壊」は、ミエリンの三次元構成の葉裂または崩壊をいう。The term “demyelination” refers to the removal or disruption of myelin in neurological tissue. Demyelination consists of the removal of myelin sheaths, for example, those surrounding neurons or neuronal protrusions (eg, axons). This process can be chemical or immunological in both experimental and pathological conditions. The present invention provides temporary demyelination to promote recovery and regrowth. The term "disintegration" refers to leaf fissure or disintegration of the three-dimensional organization of myelin.

【００４８】 用語「機能障害」は、本発明の治療的使用を記載するのに用いる際には、神経
系に対するすべてのタイプの外傷およびその結果の機能の損失を包含する。この
ような外傷は、物理的傷害または疾患のいずれかにより生じ得る。 用語「Ｆａｂ」は、各々がＦｃ領域と共に抗体のＨ鎖およびＬ鎖領域を有する
２つのＦａｂフラグメントを生じるヒンジ部において抗体を開裂させることによ
り得られる抗体フラグメントを意味する。The term “dysfunction” when used to describe the therapeutic use of the present invention encompasses all types of trauma to the nervous system and consequent loss of function. Such trauma can result from either physical injury or disease. The term "Fab" refers to an antibody fragment obtained by cleaving an antibody at the hinge region, which results in two Fab fragments each having the antibody H and L chain regions together with an Fc region.

【００４９】 用語「Ｆｃ」は、補体を活性化し得る抗体の不変部を意味する。 用語「Ｆｖフラグメント」は、抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変ドメインのヘテロ二
量体を意味する。これらの可変ドメインは、ペプチドリンカーにより、または操
作されたジスルフィド結合により接合することができる。The term “Fc” refers to the constant part of an antibody that can activate complement. The term "Fv fragment" refers to the heterodimer of the heavy and light chain variable domains of an antibody. These variable domains can be joined by a peptide linker or by an engineered disulfide bond.

【００５０】 成長因子は、細胞を刺激して成長または増殖させる細胞外プリペプチドシグナ
ル化分子である。例は、上皮成長因子（ＥＧＦ）および血小板由来成長因子（Ｐ
ＤＧＦ）である。ほとんどの成長因子は、細胞成長または増殖の誘発以外の他の
作用を有する。成長因子は、広および狭特異性群に分けることができる。ＰＤＧ
ＦおよびＥＧＦのような広特異性因子は、すべての群の細胞に影響する。反対側
の極端に、狭特異性因子がある。無傷の動物において、ほとんどの細胞のタイプ
の増殖は、単一の成長因子よりもむしろ成長因子の特定の組み合わせに依存する
。従って、かなり少数の成長因子ファミリーが、異なる組み合わせにおいて、高
等動物において多くのタイプの細胞の各々の増殖を選択的に調節する作用を有し
得る。[0050] Growth factors are extracellular pre-peptide signaling molecules that stimulate cells to grow or proliferate. Examples are epidermal growth factor (EGF) and platelet-derived growth factor (P
DGF). Most growth factors have other effects besides inducing cell growth or proliferation. Growth factors can be divided into broad and narrow specificities. PDG
Broad specificity factors such as F and EGF affect all groups of cells. At the other extreme is a narrow specificity factor. In intact animals, the growth of most cell types depends on a particular combination of growth factors rather than a single growth factor. Thus, a fairly small number of growth factor families, in different combinations, may have the effect of selectively regulating the growth of each of many types of cells in higher animals.

【００５１】 線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、重要な脈管形成機能を有し、創傷治癒およ
び組織回復を増強する、通常は細胞内のタンパク質の群の任意の１つである。こ
れらの因子の過剰活性は、新形成と関連した。 神経栄養因子は、ニューロンの成長および再生を促進する物質のファミリーで
ある。体中の他の箇所における成長因子が、細胞分割を促進し、支持する一方、
ニューロンは分割することができず、これらは、傷害および神経栄養因子がこの
再生を促進する後に再生することができる。これらはまた、他のニューロンとの
接続を形成する軸索および樹状突起、ニューロン分枝の成長を促進する。[0051] Fibroblast growth factor (FGF) is any one of a group of proteins, usually intracellular, that have important angiogenic functions and enhance wound healing and tissue recovery. Overactivity of these factors has been associated with neoplasia. Neurotrophic factors are a family of substances that promote neuronal growth and regeneration. Growth factors elsewhere in the body promote and support cell division,
Neurons cannot divide and they can regenerate after injury and neurotrophic factors promote this regeneration. They also promote the growth of axons and dendrites, neuronal branches, which form connections with other neurons.

【００５２】 「ＧａｌＣ」は、ガラクトセレブロシドをいう。 「ＭＡＧ」は、ミエリン関連糖タンパク質をいう。 「ＭＢＰ」は、ミエリン基礎タンパク質をいう。 「ＭＯＧ」は、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質をいう。 用語「神経組織」は、代表的には神経系の領域、例えばＣＮＳの脊髄中に位置
するニューロンおよび他の細胞をいう。 「ＰＮＳ」は、末梢神経系をいう。“GalC” refers to galactocerebroside. "MAG" refers to myelin-related glycoprotein. "MBP" refers to myelin base protein. "MOG" refers to myelin oligodendrocyte glycoprotein. The term "nerve tissue" refers to neurons and other cells typically located in a region of the nervous system, such as the spinal cord of the CNS. "PNS" refers to the peripheral nervous system.

【００５３】 用語「組換え抗体またはそのフラグメント」は、Ｆｃドメインが他の種または
イソタイプのＦｃドメインで置換された、抗体またはそのフラグメントのキメラ
または組換え形態、結合部位が変化した、抗体またはそのフラグメントのアフィ
ニティー変性形態、ヒンジ領域が変化した、抗体またはそのフラグメントのアビ
ディティ変性形態、この免疫反応性フラグメントおよびこの組み合わせを集合的
に含む。 用語「神経組織の再生」は、解剖学的におよび／または機能的に神経接続の再
形成に至るニューロンの再成長を含む。The term “recombinant antibody or fragment thereof” refers to a chimeric or recombinant form of an antibody or fragment thereof, wherein the Fc domain has been replaced by an Fc domain of another species or isotype, Collectively includes affinity modified forms of the fragments, avidity modified forms of the antibody or fragment thereof, wherein the hinge region has been altered, the immunoreactive fragments and combinations thereof. The term "neural tissue regeneration" includes the re-growth of neurons anatomically and / or functionally leading to the re-establishment of neural connections.

【００５４】 本発明は、ミエリン生成膠細胞上でエピトープに結合する抗体と補体との両方
の組み合わせを、ミエリン鞘の崩壊および脱髄に用いて、哺乳類神経組織の回復
および再生が増強されるようにすることができるという予期されない発見に帰す
る。本発明の組成物は、ニューロン柔軟性およびニューロン接続の再成長を促進
する必要があるように、哺乳類神経系の傷害または疾患がある場合において、治
療剤として有用である。神経組織は、本発明において、傷害、外傷または疾患の
後に可能な限り直ちにミエリン崩壊組成物に暴露される。The present invention uses the combination of both an antibody that binds to an epitope on myelin-producing glial cells and complement for disruption and demyelination of the myelin sheath to enhance recovery and regeneration of mammalian neural tissue Attributable to the unexpected discovery that it can be done. The compositions of the present invention are useful as therapeutic agents in the presence of an injury or disease of the mammalian nervous system, as necessary to promote neuronal flexibility and regrowth of neuronal connections. Nerve tissue is exposed in the present invention to the myelin-disintegrating composition as soon as possible after injury, trauma or disease.

【００５５】 本発明は、ミエリンに結合する補体固定抗体および補体を含む治療的に有効な
量の組成物に神経組織を接触させることにより、神経系機能障害を有する哺乳類
対象、例えばヒトにおける神経組織の再生を促進するための組成物およびこの使
用方法を提供する。獣医学的薬の分野における組成物の使用もまた、本発明の態
様である。The present invention provides a method for treating a mammalian subject with nervous system dysfunction, such as a human, by contacting nervous tissue with a therapeutically effective amount of a composition comprising complement-fixing antibodies that bind to myelin and complement. Provided are compositions for promoting neural tissue regeneration and methods of using the same. The use of the composition in the field of veterinary medicine is also an aspect of the present invention.

【００５６】 本発明の組成物は、ミエリンに結合する１種または２種以上の抗体またはその
フラグメントおよび１種または２種以上の血清補体タンパク質またはそのフラグ
メントから構成される。The compositions of the invention are composed of one or more antibodies or fragments thereof that bind to myelin and one or more serum complement proteins or fragments thereof.

【００５７】抗体 本発明において用いる抗体は、ミエリンに特異的に結合するすべての抗体また
はそのフラグメントであることができ、ここで、該抗体は、補体系を活性化する
。本発明の好ましい抗体は、ミエリン鞘エピトープ、例えばガラクトセレブロシ
ド（ＧａｌＣ）、Ｏ４、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）またはミ
エリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）に特異的に結合する。他の好ましいエピトー
プは、ＮＯＧＯ（先にＮＩ３５／２５０）およびＮＩ２２０およびアレチンであ
る。 Antibodies The antibodies used in the present invention can be any antibody that specifically binds to myelin or a fragment thereof, wherein the antibody activates the complement system. Preferred antibodies of the invention specifically bind to a myelin sheath epitope such as galactocerebroside (GalC), O4, myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) or myelin-associated glycoprotein (MAG). Other preferred epitopes are NOGO (previously NI35 / 250) and NI220 and aretin.

【００５８】抗体の生成 本発明の抗体またはそのフラグメントは、 ａ）天然に存在し、 ｂ）疾患状態、例えば多発性硬化症患者からのＢ細胞から得られる抗体であり、 ｃ）組換えＤＮＡ技術から生成し、 ｄ）比較的大きい分子の生化学的または酵素的断片化により生成し、 ｅ）ａ）〜ｃ）の組み合わせから得られる方法により生成し、または ｆ）抗体を生成する任意の他の手段により生成する ことができる。 Production of Antibodies The antibodies or fragments thereof of the present invention are: a) naturally occurring, b) antibodies obtained from B cells from a patient with a disease state, eg, multiple sclerosis, c) recombinant DNA technology. D) produced by biochemical or enzymatic fragmentation of a relatively large molecule; e) produced by a method resulting from the combination of a) to c); or f) any other antibody produced It can be generated by the following means.

【００５９】 ヒト抗体は、当業者に知られている多くの手法により生成することができ、こ
れには、昆虫細胞およびトランスジェニック植物、例えばタバコまたはトウモロ
コシ種子の使用が含まれる(Cramer, C. L., CropTech Development Corp; Reno,
J., NeoRx-IVC's IV Annual Conference: Sept 9-12, S.F., U.S.A.)。Human antibodies can be produced by a number of techniques known to those skilled in the art, including the use of insect cells and transgenic plants such as tobacco or corn seeds (Cramer, CL, CropTech Development Corp; Reno,
J., NeoRx-IVC's IV Annual Conference: Sept 9-12, SF, USA).

【００６０】 本発明の抗体はまた、伝統的な手法、例えばモノクローナルまたはポリクロー
ナルにより作成することができるが、モノクローナル抗体が好ましい。一般的に
、抗体は、従来の手法により広範囲の脊椎動物または無脊椎動物中に所望の免疫
原を注射することにより得ることができる。齧歯動物、特にマウスが好ましい一
方、他の種、例えばウシ、ヒツジ、ウマ、ブタまたは鳥類族の要素を用いること
ができる。これらの動物の免疫感作を容易に実施することができ、これらのリン
パ球、特に脾細胞を融合のために得ることができる。The antibodies of the present invention can also be made by traditional techniques, for example, monoclonal or polyclonal, although monoclonal antibodies are preferred. Generally, antibodies can be obtained by injecting the desired immunogen into a wide range of vertebrates or invertebrates by conventional techniques. While rodents, particularly mice, are preferred, elements of other species, such as cows, sheep, horses, pigs, or birds can be used. Immunization of these animals can be easily performed and these lymphocytes, especially splenocytes, can be obtained for fusion.

【００６１】 免疫感作プロトコルは、十分知られており、顕著に変化し得るが有効なままで
ある(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed.))(A
cademic Press, 1986)。ミエリン分子の抗原性フラグメントを含む単離されたタ
ンパク質、合成ペプチドおよび細菌融合タンパク質を、免疫抗原として用いるこ
とができる。好ましくは、ペプチドまたは組換えタンパク質の免疫原は、抗体生
成Ｂ細胞または脾細胞が望ましいエピトープを含むタンパク質またはそのフラグ
メントに富む。The immunization protocol is well known and can vary significantly but remains effective (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed.)) (A
cademic Press, 1986). Isolated proteins, including antigenic fragments of the myelin molecule, synthetic peptides and bacterial fusion proteins can be used as immunizing antigens. Preferably, the immunogen of the peptide or recombinant protein is enriched in a protein or fragment thereof containing an epitope for which antibody-producing B cells or splenocytes are desired.

【００６２】 タンパク質またはこのペプチドを所望の程度に精製した後、これらを、免疫感
作のための適切な生理学的担体中に懸濁させるかまたは希釈することができるか
、あるいはアジュバントに結合させることができる。ミエリンまたはこの抗原部
に富む免疫原性量の抗原性調製物を、一般的には宿主の１ｕｇ〜１００ｍｇ／ｋ
ｇの範囲内の濃度で注射する。投与は、注射、例えば筋肉内、腹膜、皮下または
静脈内によることができる。投与は、１回または複数回、通常は１〜４週間間隔
とすることができる。After purifying the protein or its peptide to the desired extent, they can be suspended or diluted in a suitable physiological carrier for immunization, or bound to an adjuvant. Can be. Myelin or an immunogenic amount of the antigenic preparation enriched in the antigenic portion is generally administered in an amount of 1 ug-100 mg / k of the host.
Inject at a concentration in the range of g. Administration can be by injection, for example, intramuscular, peritoneal, subcutaneous or intravenous. Administration can be one or more times, usually at 1 to 4 week intervals.

【００６３】 免疫感作した動物を、所望の抗原に対する抗体の生成について監視し、次に脾
臓を除去し、脾臓性Ｂリンパ球を単離し、ミエローマ細胞系と融合させるかまた
は形質転換する。Ｂリンパ球はまた、血液から単離することができる。形質転換
または融合を、有利な方法において実施することができ、融合手法は、多数の特
許明細書、例えば米国特許第４，１７２，１２４；４，３５０，６８３；４，３
６３，７９９；４，３８１，２９２および４，４２３，１４７号に記載されてい
る。不死化の方式は臨界的ではなく、最も一般的な方法は、ミエローマ融合パー
トナーとの融合である。不死化の他の手法には、ＥＢＶ形質転換、露出したＤＮ
Ａ、例えば腫瘍遺伝子またはレトロウイルスでの形質転換、あるいは細胞系の安
定な維持およびモノクローナル抗体の生成を提供する任意の他の方法が含まれる
。モノクローナル抗体を得るための一般的なプロセスは、記載されている(Kohle
rおよびMilstein (1975) Nature 256:495-497)。ヒトモノクローナル抗体を、脾
臓細胞と適切なヒト融合パートナー、例えば欧州特許出願第８２．３０１１０３
．６号に記載されたＷＩ−Ｌ２との融合により得ることができる。マウスＸ−マ
ウスモノクローナル抗体を生成するための詳細な手法は、教示されている(Oiお
よびHerzenberg (1980) in MishellおよびShiigl（編） Selected Methods in C
ellular Immunology 351-372)。得られたハイブリドーマをスクリーニングして
、個別のクローンを単離し、これらの各々は、抗原に対する単一の抗体種を分泌
する。The immunized animals are monitored for the production of antibodies against the desired antigen, and then the spleen is removed and splenic B lymphocytes are isolated and fused or transformed with a myeloma cell line. B lymphocytes can also be isolated from blood. Transformation or fusion can be performed in an advantageous manner, and fusion techniques are described in numerous patent specifications, for example, U.S. Patent Nos. 4,172,124; 4,350,683;
63,799; 4,381,292 and 4,423,147. The mode of immortalization is not critical, the most common being fusion with a myeloma fusion partner. Other techniques for immortalization include EBV transformation, exposed DN
A, eg, transformation with an oncogene or retrovirus, or any other method that provides for stable maintenance of the cell line and production of monoclonal antibodies. The general process for obtaining monoclonal antibodies has been described (Kohle
r and Milstein (1975) Nature 256: 495-497). Human monoclonal antibodies can be combined with spleen cells and a suitable human fusion partner, such as European Patent Application No. 82.301103.
. No. 6 can be obtained by fusion with WI-L2. Detailed techniques for generating mouse X-mouse monoclonal antibodies are taught (Oi and Herzenberg (1980) in Mishell and Shiigl (eds.) Selected Methods in C
ellular Immunology 351-372). The resulting hybridomas are screened to isolate individual clones, each of which secretes a single antibody species to the antigen.

【００６４】 不死化した細胞系を、従来の手法に従ってクローン化し、スクリーニングする
ことができ、ミエリンに結合することができる細胞上清液中の抗体が検出される
。次に、適切な不死化細胞系を、インビトロで成長させるかまたは腹水を生成す
るための適切な宿主の腹膜腔中に注射することができる。不死化したハイブリド
ーマ細胞系は、種々の給源から容易に生成することができる。あるいはまた、こ
れらの細胞系を、他の腫瘍性Ｂ細胞と融合させることができ、ここでこのような
他のＢ細胞は、抗体をコードするゲノムＤＮＡについての受容者として作用し得
る。[0065] Immortalized cell lines can be cloned and screened according to conventional techniques, and antibodies in the cell supernatant that can bind to myelin are detected. The appropriate immortalized cell line can then be injected into the peritoneal cavity of a suitable host to grow in vitro or generate ascites. Immortalized hybridoma cell lines can be readily produced from a variety of sources. Alternatively, these cell lines can be fused with other neoplastic B cells, where such other B cells can act as recipients for the genomic DNA encoding the antibody.

【００６５】 形質転換したかまたはハイブリッドの細胞系により分泌されたモノクローナル
抗体は、免疫グロブリンのクラスまたはサブクラス、例えばＩｇＭ、ＩｇＤ、Ｉ
ｇＡ、ＩｇＧ_１−４またはＩｇＥの任意であることができる。ＩｇＧが、診断ア
ッセイにおいて用いられる最も一般的なイソタイプであるため、これはしばしば
好ましい。The monoclonal antibodies which have been transformed or secreted by the hybrid cell lines may be of the immunoglobulin class or subclass, eg, IgM, IgD, Id.
It can be any of gA, IgG _1-4 or IgE. This is often preferred because IgG is the most common isotype used in diagnostic assays.

【００６６】 ヒト以外の動物から由来するモノクローナル抗体のヒト宿主における可能な抗
原性を遮断するために、キメラ抗体を構成することができる。例えば、免疫グロ
ブリン分子の抗原結合フラグメント（可変部）を、ペプチド結合により、少なく
ともヒトにより異物として認識されない他のタンパク質の部分、例えばヒト免疫
グロブリン分子の不変部に結合させることができる。このことは、動物可変部エ
クソンをヒトカッパまたはガンマ不変部エクソンと融合させることにより、達成
することができる。種々の手法、例えばＰＣＴ８６／０１５３３、ＥＰ１７１４
９６およびＥＰ１７３４９４に記載されているものが、当業者に知られている。To block the potential antigenicity of a monoclonal antibody from a non-human animal in a human host, chimeric antibodies can be constructed. For example, an antigen-binding fragment (variable region) of an immunoglobulin molecule can be linked by a peptide bond to at least a portion of another protein that is not recognized as foreign by a human, such as the constant portion of a human immunoglobulin molecule. This can be achieved by fusing an animal variable region exon with a human kappa or gamma constant region exon. Various approaches, for example PCT 86/01533, EP 1714
96 and EP 173494 are known to those skilled in the art.

【００６７】 抗体を生成する代替的方法として、米国特許第５６２７０５２号には、特定の
抗体の結合特性および所望の機能を複製するタンパク質を生成する方法が記載さ
れている。この方法の適用の例には、特定の抗ミエリン抗体を、例えば多発性硬
化症を患っている患者のブロックから生成する、ヒトＢリンパ球細胞の単離およ
び特徴づけが含まれる。As an alternative method of producing antibodies, US Pat. No. 5,627,052 describes a method of producing a protein that replicates the binding characteristics and desired function of a particular antibody. Examples of applications of this method include the isolation and characterization of human B lymphocyte cells that produce specific anti-myelin antibodies, for example, from blocks of a patient suffering from multiple sclerosis.

【００６８】抗体技術 抗体を、無傷のままで、または、補体に結合するＦｃ領域が存在する限りは、
フラグメント、例えばＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２として用いることがで
きる。このような抗体フラグメントは、これらの一層小さい大きさのために、イ
ンビボで抗体全体よりも良好な拡散特性を提供する。組換えＤＮＡおよび化学的
修飾方法による抗体の操作の手段は、業界において十分知られていると考えられ
る。 Antibody Technology Antibodies can be used intact or as long as there is an Fc region that binds complement.
Fragments such as Fv, Fab and F (ab ') ₂ can be used. Such antibody fragments, due to their smaller size, provide better diffusion properties in vivo than whole antibodies. Means for engineering antibodies by recombinant DNA and chemical modification methods are considered well known in the art.

【００６９】 抗体を断片化して、高度に免疫反応性のＦ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ’）および
Ｆａｂフラグメントを、業界において十分知られている方法により酵素ペプシン
を用いて得ることができる（Colcher et al., (1983) Cancer Res. 43:736-742
参照）。 分子クローニング手法の開発のために、現在では、ファージディスプレイライ
ブラリーを所定の抗原特異性に対してはめることにより、ヒトモノクローナル抗
体フラグメントを迅速に生成することができる。例示的な手法について、Pistil
lo et al., Human Immunology, 57(1):19-26, 1997 Sep 15参照。Antibodies can be fragmented to obtain highly immunoreactive F (ab ′) ₂ , F (ab ′) and Fab fragments using the enzyme pepsin by methods well known in the art. (Colcher et al., (1983) Cancer Res. 43: 736-742
reference). For the development of molecular cloning techniques, human monoclonal antibody fragments can now be rapidly generated by fitting phage display libraries to a given antigen specificity. For an example approach, Pistil
See lo et al., Human Immunology, 57 (1): 19-26, 1997 Sep 15.

【００７０】 抗体またはそのフラグメントはまた、業界において十分知られている分子生物
学の手法により、組換え形態にする（Rice et al., (1982) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79:7862-7865; Kurokawa et al., (1983) Nucleic Acids Res. 11:307
7-3085; Oi et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:825-829; Boss et
al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:3791-3806; Boulianne et al., (1984) N
ature (London) 312:643-646; Cabily et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81:3273-3277; Kenten et al., (1984) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81:29
55-2959; Liu et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5369-5373; Mor
rison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger
et al., (1984) Nature (London) 312:604-608; Potter et al., (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81:7161-7165; Neuberger et al., (1985) Nature (Lond
on) 314:268-270; Jones et al., (1986) Nature (London) 321: 522-525; Oi-e
t al., (1986) BioTechniques, 4:214-221; Sahagan et al., (1986) J. Immuno
l. 137:1066-1074; Sun et al., (1986) Hybridoma 5 (Supp. 1):S17-S20;およ
びSun et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218参照）。Antibodies or fragments thereof can also be made into recombinant forms by molecular biology techniques well known in the art (Rice et al., (1982) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79: 7862-7865; Kurokawa et al., (1983) Nucleic Acids Res. 11: 307
7-3085; Oi et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 825-829; Boss et.
al., (1984) Nucleic Acids Res. 12: 3791-3806; Boulianne et al., (1984) N
ature (London) 312: 643-646; Cabily et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81: 3273-3277; Kenten et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:29
55-2959; Liu et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5369-5373; Mor
rison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Neuberger
et al., (1984) Nature (London) 312: 604-608; Potter et al., (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81: 7161-7165; Neuberger et al., (1985) Nature (Lond
on) 314: 268-270; Jones et al., (1986) Nature (London) 321: 522-525; Oi-e
t al., (1986) BioTechniques, 4: 214-221; Sahagan et al., (1986) J. Immuno.
l. 137: 1066-1074; Sun et al., (1986) Hybridoma 5 (Supp. 1): S17-S20; and Sun et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214- 218).

【００７１】 さらに特に、抗体およびそのフラグメントを、他の種の抗体フラグメント、例
えばヒト不変部（Ｆｃドメイン）をマウス不変部で、前に列挙した参考文献に記
載されたように業界で知られている組換えＤＮＡ手法により置換することにより
、キメラ形態に変化させることができる。これらのＦｃドメインは、種々のヒト
イソタイプ、即ちＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４またはＩｇＭである
ことができる。More particularly, antibodies and fragments thereof are known in the art, as described in the references listed above, using antibody fragments of other species, such as the human constant (Fc domain) in the mouse constant. It can be changed to a chimeric form by substitution using a recombinant DNA technique. These Fc domains can be of a variety of human isotypes, namely _{IgG 1, IgG 2, IgG 3} , IgG 4 , or IgM.

【００７２】 さらに、抗体およびそのフラグメントを、前に列挙した参考文献に記載された
ように業界で十分知られている組換えＤＮＡ手法を用いて結合部位を変化させる
かまたはヒンジ部を変化させることにより、アフィニティー修飾形態、アビディ
ティ修飾形態または両方に変化させることができる。 また、組換え抗体形態を、前記と同一の方式において断片化して、免疫反応性
フラグメントＦ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ’）およびＦａｂを得ることができる。In addition, antibodies and fragments thereof may be modified at the binding site or at the hinge using recombinant DNA techniques well known in the art, as described in the references listed above. Can be changed to an affinity modified form, an avidity modified form, or both. Alternatively, the recombinant antibody form can be fragmented in the same manner as described above to obtain immunoreactive fragments F (ab ') ₂ , F (ab') and Fab.

【００７３】 抗体フラグメントはまた、Ｆｖフラグメント、抗体全体の結合および特異性を
維持するのに必要な抗体の最も小さい機能的モジュールを含むことができる。Ｆ
ｖフラグメントは、可変Ｈ鎖および可変Ｌ鎖ドメインから構成されるヘテロ二量
体である。抗体のタンパク質分解消化により、単離されたＦｖフラグメントを得
ることができるが、Ｆｖを得る好ましい方法は、組換え技術による（Skerraおよ
びPluckthun (1988) Science 240:1038-1041参照）。Antibody fragments can also include Fv fragments, the smallest functional module of an antibody necessary to maintain binding and specificity of the whole antibody. F
V fragments are heterodimers composed of variable heavy and light chain domains. Although isolated Fv fragments can be obtained by proteolytic digestion of antibodies, the preferred method of obtaining Fv is by recombinant techniques (see Skerra and Pluckthun (1988) Science 240: 1038-1041).

【００７４】 Ｆｖは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインに非共有的に関連することができるが、これ
らは、互いに解離する傾向がある。安定なＦｖは、組換え体分子を作成すること
により生成することができ、ここで、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、ペプチドリン
カーにより接続して、抗原結合部位が、単一のタンパク質により再生される。こ
れらの組換え分子を、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ぶ。ｓｃＦｖを得るための手
段は、業界において知られている（RangおよびWhitlow (1995) FASEB 9:73; Bir
d et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照）。あるいはまた、２つの可変ドメインを、
操作されたジスルフィド結合により接合し、安定化することができる；これらを
、ジスルフィドＦｖ（ｄｓＦｖ）と呼ぶ(ReiterおよびPastan (1996) Clin. Can
cer Res. 2:245-252)。Although Fvs can be non-covalently related to the V _H and V _L domains, they tend to dissociate from each other. Stable Fvs can be produced by making recombinant molecules, where the _VH and _VL domains are connected by a peptide linker so that the antigen binding site is regenerated by a single protein. You. These recombinant molecules are called single-chain Fv (scFv). Means for obtaining scFv are known in the art (Rang and Whitlow (1995) FASEB 9:73; Bir
d et al., (1988) Science 242: 423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Alternatively, the two variable domains are
It can be conjugated and stabilized by engineered disulfide bonds; these are called disulfide Fvs (dsFv) (Reiter and Pastan (1996) Clin. Can.
cer Res. 2: 245-252).

【００７５】 抗体のＦｃドメインは、補体の活性化に必要である。Ｆｃドメインを欠くＦｖ
フラグメントは、補体を活性化することができない。Ｆｖフラグメントを本発明
において有用にするために、これらを、補体カスケードの新規なアクティベータ
ーで設計しなければならない。例として、Ｆｖフラグメントを、ＩｇＧ抗体のＣ _Ｈ ２ドメインを含むように設計することができる。他の例において、完全に合成
の分子を、Ｆｖフラグメントに結合して、補体を活性化するか、または当該分野
におけるものと類似する補体のアクティベーターを、Ｆｖフラグメントに結合す
ることができる。The Fc domain of an antibody is required for complement activation. Fv lacking Fc domain
Fragments are unable to activate complement. Fv fragments according to the invention
In order to make them useful in the
Must be designed with By way of example, the Fv fragment is replaced with the C antibody of an IgG antibody. _H It can be designed to include two domains. In other cases, fully synthetic
Can be linked to an Fv fragment to activate complement or
Binds an activator of complement similar to that in
Can be

【００７６】 抗体をまた、ポリエチレングリコールのような分子（米国特許第５７６６８９
７号に記載された）を加えてこの生物学的半減期、有効性またはインサイチュで
の分子の拡散を延長することにより、修飾することができる（米国特許第５７４
７４４６号、Chinol et al., 98 Brit. J. Cancer, 78:189-197; Francis et al
., 98. Intl J. Hematol. 68:1-18）。Antibodies can also be used in molecules such as polyethylene glycol (US Pat.
No. 7 (described in US Pat. No. 574) by extending the biological half-life, efficacy or diffusion of the molecule in situ.
No. 7446, Chinol et al., 98 Brit. J. Cancer, 78: 189-197; Francis et al.
., 98. Intl J. Hematol. 68: 1-18).

【００７７】 抗体またはフラグメントの標識 本発明の抗体またはそのフラグメントを、修飾せずに用いることができるか、
または種々の方法、例えば標識により修飾することができる。標識は、抗体の検
出の手段を直接的に、または間接的に提供する標識を、共有的にまたは非共有的
に接合して、組成物を用いる治療的処置の進行を監視することを可能にすること
を意味することを意図する。Labeling of Antibodies or Fragments The antibodies or fragments thereof of the present invention can be used without modification,
Alternatively, it can be modified by various methods such as labeling. The label can be covalently or non-covalently conjugated to a label that provides, directly or indirectly, a means of detecting the antibody, allowing the progress of a therapeutic treatment using the composition to be monitored. It is intended to mean to.

【００７８】 標識は、検出可能な化学的または物理的特性を有するすべての物質を含むこと
ができる。広範囲の標識が知られており、これには、放射性核種、酵素、酵素基
質、酵素コファクター、酵素阻害剤、リガンド（特にハプテン）、フルオレッサ
ー(fluorescer)、発色団、発光体および磁性粒子が含まれる。これらの標識は、
これら自体の物理的特性（例えばフルオレッサー、発色団および放射性同位体）
あるいはこれらの反応性または結合特性（例えば酵素、基質、コファクターおよ
び阻害剤）のいずれかに基づいて検出可能である。これらの物質は、当業者に十
分知られている。米国特許第４，６７１，９５８号には、抗体を標識するかまた
は補体を抗体に付着させるのに用いることができる方法が教示されている。Labels can include any substance that has a detectable chemical or physical property. A wide range of labels are known, including radionuclides, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, ligands (especially haptens), fluorescers, chromophores, luminophores and magnetic particles. included. These signs are
Their own physical properties (eg fluorescers, chromophores and radioisotopes)
Alternatively, detection is possible based on any of these reactivity or binding properties (eg, enzymes, substrates, cofactors and inhibitors). These materials are well known to those skilled in the art. U.S. Pat. No. 4,671,958 teaches methods that can be used to label antibodies or attach complement to the antibodies.

【００７９】補体 組成物の補体部分は、１種または２種以上の補体タンパク質、フラグメント、
変種、類似体および／または化学的誘導体から構成されることができる。 補体タンパク質のフラグメントは、Ｃ分子の任意のサブセットをいう。例えば
、Ｃ３のフラグメントは、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ａ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄｇおよび
Ｃ３ｄを含む。The complement portion of the complement composition may comprise one or more complement proteins, fragments,
It can be composed of variants, analogs and / or chemical derivatives. A fragment of a complement protein refers to any subset of the C molecule. For example, fragments of C3 include C3b, iC3b, C3a, C3c, C3dg and C3d.

【００８０】 補体タンパク質またはそのフラグメントの「変種」は、タンパク質全体または
そのフラグメントのいずれかに実質的に類似する分子をいい、これは、補体タン
パク質またはそのフラグメントの生物学的活性に実質的に類似する生物学的活性
を有する。分子は、両方の分子が実質的に類似する構造を有する場合、または両
方の分子が類似する生物学的活性を有する場合に、他の分子に「実質的に類似す
る」という。A “variant” of a complement protein or a fragment thereof refers to a molecule that is substantially similar to either the whole protein or a fragment thereof, which has a substantial effect on the biological activity of the complement protein or a fragment thereof. Has a biological activity similar to A molecule is said to be "substantially similar" to another molecule if both molecules have a substantially similar structure, or if both molecules have similar biological activities.

【００８１】 Ｃ３ｂの変種は、例えばＣ３ｂ二量体および高級オリゴマーを含む。Ｃ活性化
が細胞表面において生じる際には、酵素反応の複数のサイクルの結果、多量体形
態でＣ３ｂの表面上への堆積が生じる。Ｃ３ｂ二量体または高級オリゴマーは、
実際にＣ３ｂ単量体よりも細胞について高い親和性を有する。Variants of C3b include, for example, C3b dimers and higher oligomers. When C activation occurs at the cell surface, multiple cycles of the enzymatic reaction result in deposition of C3b on the surface in multimeric form. The C3b dimer or higher oligomer is
In fact it has a higher affinity for cells than C3b monomer.

【００８２】 補体タンパク質またはそのフラグメントの変種を、業界において十分知られて
いる化学的または組換え体手段により生成する。このような変種には、例えば、
アミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、あるいは挿入または置換が含まれる。例
えば、少なくとも１つのアミノ酸残基を除去し、異なる残基をこの場所に挿入す
ることができる。機能的または免疫学的特性の実質的な変化は、比較的保存的で
ない、即ち（ａ）例えばシート状またはらせん状構成としての、置換の領域にお
けるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性ある
いは（ｃ）側鎖のバルク（bulk）の維持に対するこれらの効果において一層顕著
に異なる置換を選択することによりなされる。一般的に一層大きい変化を誘発す
ると予測される置換は、（ａ）グリシンおよび／またはプロリンが、実質的に他
のアミノ酸により置換されているかあるいは欠失または挿入されている；（ｂ）
親水性残基、即ちセリルまたはトレオニルが、疎水性残基、例えばロイシル、イ
ソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルと（またはこれにより）
置換されている；（ｃ）システイン残基が、任意の他の残基と（またはこれによ
り）置換されている；（ｄ）電気的陽性側鎖を有する残基、例えばリシル、アル
ギニルまたはヒスチジルが、電気的陰性電荷を有する残基、例えばグルタミルま
たはアスパラチルと（またはこれにより）置換されている；あるいは（ｅ）バル
クの高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、このような側鎖を有し
ない残基、例えばグリシンと（またはこれにより）置換されているものである。Variants of complement proteins or fragments thereof are produced by chemical or recombinant means well known in the art. Such variants include, for example,
This includes deletion, insertion or substitution of amino acid residues in the amino acid sequence. For example, at least one amino acid residue can be removed and a different residue inserted at this location. Substantial changes in functional or immunological properties are relatively non-conservative, ie (a) the structure of the peptide backbone in the region of substitution, eg, as a sheet or helical configuration, (b) the molecule at the target site. By selecting substitutions that differ significantly in their effect on the charge or hydrophobicity or (c) maintenance of the bulk of the side chains. Substitutions that would generally induce larger changes include (a) glycine and / or proline have been substantially replaced by another amino acid or have been deleted or inserted; (b)
A hydrophilic residue, ie, seryl or threonyl, is (or thereby) replaced with a hydrophobic residue, eg, leucyl, isoleucyl, phenylalanyl, valyl or alanyl.
(C) a cysteine residue has been (or is) replaced by any other residue; (d) a residue having an electropositive side chain, such as lysyl, arginyl or histidyl. Is substituted with (or thereby) a residue having an electronegative charge, such as glutamyl or asparatyl; or (e) a residue having a bulky high side chain, such as phenylalanine, having such a side chain. Residues that are not (eg) replaced by (or with) glycine.

【００８３】 ほとんどの欠失、挿入および置換は、タンパク質分子の特性における基の変化
を誘発するとは予測されないが、置換、欠失または挿入の正確な効果を予測する
ことが、このようにすることに先んじて困難である場合には、当業者は、効果が
ルーチンのスクリーニングアッセイにより評価されることを理解する。例えば、
タンパク質分子の免疫学的特性の変化、例えば所定の抗体への結合を、イムノア
ッセイ、例えば競合型イムノアッセイにより測定する。 補体タンパク質またはそのフラグメントの「類似体」は、全体のタンパク質ま
たはそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する非天然分子をいう。Although most deletions, insertions and substitutions are not expected to elicit a group change in the properties of the protein molecule, predicting the exact effect of the substitution, deletion or insertion will do so. In the case of difficulty prior to this, those skilled in the art will appreciate that the effect is assessed by routine screening assays. For example,
Changes in the immunological properties of the protein molecule, eg, binding to a given antibody, are measured by an immunoassay, eg, a competitive immunoassay. An "analog" of a complement protein or fragment thereof refers to a non-natural molecule that is substantially similar to either the whole protein or a fragment thereof.

【００８４】 補体タンパク質またはそのフラグメントの「化学的誘導体」は、通常はタンパ
ク質またはフラグメントの一部ではない追加の化学的部分を含む。ペプチドの共
有的修飾は、本発明の範囲内に包含される。このような修飾を、業界において十
分知られているように、分子中に、ペプチドの標的したアミノ酸残基を、選択さ
れた側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させるこ
とにより、導入することができる(70-86においてT. E. Creighton Proteins: St
ructure and Molecule Properties (San Francisco: W. H. Freeman,1983))。“Chemical derivatives” of a complement protein or fragment thereof include additional chemical moieties that are not normally part of the protein or fragment. Covalent modifications of the peptide are included within the scope of the present invention. Such modifications, as is well known in the art, can be achieved by reacting the targeted amino acid residues of the peptide with an organic derivatizing agent capable of reacting with selected side chains or terminal residues in the molecule. Can be introduced (at 70-86 TE Creighton Proteins: St.
ructure and Molecule Properties (San Francisco: WH Freeman, 1983).

【００８５】 組成物の補体部分は、抗体成分とは物理的に別個の成分であることができる。
あるいはまた、補体タンパク質またはそのフラグメントは、抗体成分に共有また
は非共有で直接付着して、ミエリンの表面への抗体の結合が内生免疫系攻撃を誘
発するようにすることができる。The complement portion of the composition can be a component that is physically separate from the antibody component.
Alternatively, the complement protein or fragment thereof can be covalently or non-covalently attached directly to the antibody component, such that binding of the antibody to the surface of myelin triggers an endogenous immune system attack.

【００８６】 補体成分は、精製されたフラクション並びに補体系を含むタンパク質に富んだ
ものであることができる。このような調製は、補体の相対的不安定性を考慮し、
補体カスケードの完全な活性化を可能にし、一時的脱髄が生じるのに十分な因子
の組み合わせを提供しなければならない。The complement components can be purified fractions as well as protein-rich, including the complement system. Such preparations take into account the relative instability of complement,
It must allow full activation of the complement cascade and provide a combination of factors sufficient to cause transient demyelination.

【００８７】 組成物の補体部分は、１種または２種以上の補体タンパク質、フラグメント、
変種、類似体および／または化学的誘導体で構成されていることができる。しか
し、補体のＣ３成分は、オプソニン作用またはカスケードの溶解性ＭＡＣへの増
殖のいずれかにおいて基本的な役割を奏することに注意するべきである。好まし
い態様において、Ｃ３成分またはフラグメント、変種、類似体またはこの化学的
誘導体を、成分の補体部分に含めなければならない。脱髄について標的される状
態において、Ｃ３成分は、最適な結果のために確実に存在しなければならない。
再生を標的する状態において、これは、比較的確実でなく要求される。The complement portion of the composition may comprise one or more complement proteins, fragments,
It can be made up of variants, analogs and / or chemical derivatives. It should be noted, however, that the C3 component of complement plays a fundamental role in either opsonization or growth of the cascade into soluble MAC. In a preferred embodiment, the C3 component or fragment, variant, analog or chemical derivative thereof must be included in the complement portion of the component. In conditions targeted for demyelination, the C3 component must be reliably present for optimal results.
In situations where regeneration is targeted, this is relatively unreliable and required.

【００８８】 本発明はまた、補体タンパク質の修飾をも含む。修飾（通常は一次配列を変化
させない）には、ポリペプチドのインビボまたはインビトロ化学的誘導体化、例
えばアセチル化またはカルボキシル化が含まれる。また、グリコシル化の修飾、
例えばグリコシル化パターンの変化、例えばこの合成および加工の間または他の
加工工程においてポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによる、
例えばポリペプチドをグリコシル化に影響する酵素、例えば哺乳類グリコシル化
または脱グリコシル化酵素に暴露することによりなされるものが含まれる。この
ような修飾を用いて、例えば本発明の組成物において用いるための補体タンパク
質の生物有用性および安定性を改善することができる。The present invention also includes the modification of complement proteins. Modifications (which do not normally alter primary sequence) include in vivo or in vitro chemical derivatization of the polypeptide, such as acetylation or carboxylation. Glycosylation modifications,
For example, by altering the glycosylation pattern, e.g., by modifying the glycosylation pattern of the polypeptide during this synthesis and processing or at other processing steps.
For example, include those made by exposing the polypeptide to enzymes that affect glycosylation, such as mammalian glycosylation or deglycosylation enzymes. Such modifications can be used, for example, to improve the bioavailability and stability of complement proteins for use in the compositions of the present invention.

【００８９】 組成物の補体部分を、対象自身の血清から、ドナーの血清から、または多くの
ドナー、例えば整合する承認された標準を生成する市場で入手できるもののプー
ルした血清から誘導することができる。 補体成分を、組成物が直接神経組織に（例えば鞘内に）導入されるという事実
により、これが投与される種とは異なる種から誘導することができる。The complement portion of the composition can be derived from the subject's own serum, from the serum of the donor, or from pooled sera of many donors, such as those available on the market that produce matching approved standards. it can. The complement component can be derived from a different species than the species to which it is administered due to the fact that the composition is introduced directly into neural tissue (eg, intrathecally).

【００９０】 本発明の１つの態様において、補体部分は、正常な補体の１種または２種以上
の成分が除去された、欠乏した補体である。例Ｖは、ある成分の除去により、組
成物の補体部分が、本発明において作用することが可能になることを例証する。
Ｃ３タンパク質またはＣ４タンパク質の除去の結果、低減した効率を有する組成
物が得られる一方、因子Ｂ、Ｃ５またはＣ６が欠乏した補体の使用の結果、有効
な脱髄が生じた。各々の場合において、補体成分の除去の後に、得られた組成物
を、有効な脱髄能力についてインビボで試験する。補体全体よりむしろ欠乏した
補体の使用の利点は、有力な副作用および各々の状態に対する組成物を製作する
能力の減少である。このようにして、本発明の組成物を、種々の障害および個体
の治療の要求に適合するように設計することができる。In one aspect of the invention, the complement portion is a deficient complement in which one or more components of normal complement have been removed. Example V illustrates that removal of certain components allows the complement portion of the composition to work in the present invention.
Removal of the C3 or C4 protein resulted in a composition with reduced efficiency, while the use of complement deficient in factor B, C5 or C6 resulted in effective demyelination. In each case, after removal of complement components, the resulting composition is tested in vivo for effective demyelination capacity. The advantage of using deficient complement rather than whole complement is the potential side effects and reduced ability to make compositions for each condition. In this way, the compositions of the present invention can be designed to meet the requirements of a variety of disorders and the treatment of individuals.

【００９１】 本発明の関連する態様において、補体部分は、正常な補体の１種または２種以
上の成分の１種または２種以上の阻害剤との組み合わせで調製される。例えば、
補体系のいくつかの調節タンパク質が同定された。これらの一次的な機能は、Ｃ
３／Ｃ５転換酵素の活性を、宿主組織の過剰な補体活性化および自己分解的崩壊
の防止について調節することである。これらの補体レギュレーターは、可溶性血
漿タンパク質または種々の細胞タイプにおいて発現する統合された膜タンパク質
のいずれかである。前者は、Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）およびＨ因子を
含む。後者は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体（補体受容体１、ＣＲ１、ＣＤ３５）、膜
コファクタータンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）および崩壊促進因子（ＤＡＦ、Ｃ
Ｄ５５）を含む。これらのタンパク質は、多くの構造的類似点を有する。各々は
、保存されたシステイン、グリシンおよびプロリン残基を有する長さが約６０ア
ミノ酸の複数の短コンセンサス繰り返し（ＳＣＲ）から構成される。これらのタ
ンパク質をコードする遺伝子は、染色体１に局在し、集合的に補体活性化（ＲＣ
Ａ）遺伝子クラスターのレギュレーターとして知られている(Hourcade, D. et a
l., 1989, Adv. Immunol. 45:381)。補体活性化の調節におけるこの作用に加え
て、赤血球ＣＲ１はまた、これらの血漿からのクリアランスを促進する免疫複合
体を循環させるための受容体として機能する(Cornscoff, J. et al., 1983, J.
Clin. Invest. 71:236)。In a related aspect of the invention, the complement portion is prepared in combination with one or more inhibitors of one or more components of normal complement. For example,
Several regulatory proteins of the complement system have been identified. These primary functions are:
To modulate the activity of 3 / C5 convertase for preventing excessive complement activation and autolytic breakdown of host tissues. These complement regulators are either soluble plasma proteins or integrated membrane proteins expressed in various cell types. The former includes C4b binding protein (C4bp) and factor H. The latter include C3b / C4b receptors (complement receptor 1, CR1, CD35), membrane cofactor proteins (MCP, CD46) and decay accelerating factors (DAF, C
D55). These proteins have many structural similarities. Each is composed of multiple short consensus repeats (SCRs) of about 60 amino acids in length with conserved cysteine, glycine and proline residues. The genes encoding these proteins are located on chromosome 1 and collectively activate complement (RC
A) Known as regulators of gene clusters (Hourcade, D. et a
l., 1989, Adv. Immunol. 45: 381). In addition to this effect in regulating complement activation, erythrocyte CR1 also functions as a receptor for circulating immune complexes that promote clearance from these plasmas (Cornscoff, J. et al., 1983). , J.
Clin. Invest. 71: 236).

【００９２】 米国特許第５，８５１，５２８号には、補体活性化を阻害する第１のポリペプ
チドが、補体活性化を阻害する第２のポリペプチドに結合し、ポリヌクレオチド
がこのようなキメラタンパク質をコードする、キメラタンパク質が開示されてい
る。本発明はまた、本発明のキメラタンパク質をこのような症状を患っている患
者に投与することにより、過剰の補体活性化により特徴づけられる炎症を低減す
る方法を特徴とする。業界に精通する作業者は、米国特許第５，８５１，５２８
号のキメラタンパク質を本発明の組成物中に導入して、１種または２種以上の補
体成分を選択的に阻害することができる。[0092] US Patent No. 5,851,528 states that a first polypeptide that inhibits complement activation binds to a second polypeptide that inhibits complement activation and that the polynucleotide is Chimeric proteins encoding novel chimeric proteins have been disclosed. The invention also features a method of reducing inflammation, which is characterized by excessive complement activation, by administering a chimeric protein of the invention to a patient suffering from such a condition. Industry savvy workers are disclosed in US Patent No. 5,851,528.
The chimeric protein can be introduced into the compositions of the invention to selectively inhibit one or more complement components.

【００９３】他の因子 組成物は、随意に、他の化学物質または薬剤、例えば成長因子および好中球を
含むことができる。軸索再生に対するＣＮＳミエリン関連阻害剤の遮断の有益な
影響は、ニューロトロフィン、例えばＮＴ−３の付随する適用により増大するこ
とができることは、知られている(Bregman et al., (1995) Nature 378:498-501
; Schnell et al., (1994) Nature 367:170-173)。ＦＧＦ−１もまた用いること
ができる(Chang et al., 1996, 前記)。[0093] Other factor compositions can optionally include other chemicals or agents, such as growth factors and neutrophils. It is known that the beneficial effects of blocking CNS myelin-related inhibitors on axonal regeneration can be increased by the concomitant application of neurotrophins, such as NT-3 (Bregman et al., (1995)). Nature 378: 498-501
Schnell et al., (1994) Nature 367: 170-173). FGF-1 can also be used (Chang et al., 1996, supra).

【００９４】 ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０６１１６号には、神経損傷および神経関連疾患、例
えばパーキンソン病を防止し、治療するための、ＧＤＮＦを分泌する患者の脳、
細胞中への移植による、ＧＤＮＦの使用が示唆されている。ＰＣＴ公開第ＷＯ９
３／０８８２８号には、虚血、低酸素症または神経変性に関連するニューロン損
傷の治療におけるある神経成長因子の静脈内投与が教示されている。ＰＣＴ公開
第ＷＯ９０／０７３４１号には、神経成長因子（ＮＧＦ）が、アルツハイマー病
の間に死滅する前脳コリン作動性神経細胞のための神経栄養因子であると例証さ
れたことが述べられている。ＮＧＦは、培養において前述の神経細胞の成長を増
大させる。さらに、動物における実験により、ＮＧＦが、外傷的傷害の後の前脳
のコリン作動性神経細胞の死滅を防止することおよび、ＮＧＦが、老化と共に生
じる認識的損失を逆転させることが例証される。欧州特許出願第ＥＰ ０４５０
３８６ Ａ２号には、組換え的に誘導された生物学的に活性な形態からの脳誘導
神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の、アルツハイマー病の治療への使用が示唆されてい
る。ＢＤＮＦは、いくつかの種において運動ニューロンの生存を促進し(Henders
on, et al., (1993) Nature 363:266-270)、また、フリンブリアル(frimbrial)
横断に続く基底前脳のコリン作動性ニューロンの生存を促進する(Knusel, et al
., (1992) J. Neurosci. 12:4391-4402)。[0094] PCT Publication No. WO 93/06116 discloses the brain of a patient who secretes GDNF to prevent and treat nerve damage and nerve-related diseases such as Parkinson's disease.
Use of GDNF by transplantation into cells has been suggested. PCT Publication No. WO9
3/08828 teaches the intravenous administration of certain nerve growth factors in the treatment of neuronal damage associated with ischemia, hypoxia or neurodegeneration. PCT Publication No. WO 90/07341 states that nerve growth factor (NGF) was exemplified as a neurotrophic factor for forebrain cholinergic neurons that die during Alzheimer's disease. . NGF increases the growth of the aforementioned neurons in culture. Furthermore, experiments in animals demonstrate that NGF prevents the death of forebrain cholinergic neurons following traumatic injury and that NGF reverses the cognitive loss that occurs with aging. European Patent Application No. EP 0450
386 A2 suggests the use of brain derived neurotrophic factor (BDNF) from a recombinantly derived biologically active form for the treatment of Alzheimer's disease. BDNF promotes motor neuron survival in some species (Henders
on, et al., (1993) Nature 363: 266-270), and frimbrial
Promotes the survival of basal forebrain cholinergic neurons following crossing (Knusel, et al.
., (1992) J. Neurosci. 12: 4391-4402).

【００９５】 前述の従来技術には、神経成長因子の投与が、神経変性障害のための有効な治
療であることができることが、教示されている。しかし、これらは、これらのニ
ューロン成長因子の効果に拮抗する傾向がある、ＣＮＳの非支持的または阻害的
環境と関連する困難を取り扱わない。本発明の組成物を、ＣＮＳの阻害成分を低
減して、これにより、軸索成長を容易にするように設計する。従って、前述のよ
うに、栄養因子を本発明の組成物と組み合わせて加えることは、神経組織の疾患
または外傷的損傷による神経変性障害を治療するための一層有効な手段である。
従って、他の態様は、当業者に周知の方式における神経学的疾患の治療に有効で
あると見なされる任意の量、濃度またはレベルにおける本発明の組成物の神経栄
養因子との組み合わせの調製である。The above prior art teaches that administration of nerve growth factor can be an effective treatment for neurodegenerative disorders. However, they do not address the difficulties associated with the unsupportive or inhibitory environment of the CNS, which tend to antagonize the effects of these neuron growth factors. The compositions of the present invention are designed to reduce the inhibitory components of the CNS, thereby facilitating axonal growth. Thus, as described above, adding trophic factors in combination with the compositions of the present invention is a more effective means for treating neurodegenerative disorders due to nervous tissue disease or traumatic injury.
Thus, another aspect is the preparation of a combination of a composition of the present invention with a neurotrophic factor in any amount, concentration or level considered to be effective in treating a neurological disorder in a manner well known to those of skill in the art. is there.

【００９６】 細胞、例えば末梢神経シュヴァン細胞の移植(Keirstead et al., (1999) Exp.
Neurol. 159:225-236)が、傷害を受けた脊髄および脳における軸索の再生およ
び軸索の自然成長を増大することは、知られている(LiおよびRaisman (1994) J.
Neurosci. 14:4050-4063; Montero-Menei et al., (1992) Brain Res. 570:198
-208)。この手法は、再生するＣＮＳ軸索の内方成長および伸張を誘発する成長
および支持および細胞充填案内チャネルのための骨格を提供することにより、傷
害を受けた脊髄軸索の再生を増強する(SmithおよびStevenson (1988), Exp. Bra
in Res.; Xu et al., (1995) Exp. Neurol. 134:261-272)。さらに、当業者には
、シュヴァン細胞が、Ｎ−ＣＡＭ、Ｌ１およびＮ−カドヘリンを含む広範囲の細
胞接着分子を発現し、細胞外マトリックス分子を合成し、ニューロトロフィンＮ
ＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ３を含む栄養因子を放出する(VenstromおよびReichar
dt (1993) FASEB J. 7:996-1003; Guenard et al., (1993) 5:401-411)ことは、
知られている。従って、一層高いレベルの軸索再生は、神経栄養支持および移植
を組み合わせた療法の結果生じることができる(Keirstead et al., (1999) Expt
. Neurol.)。Transplantation of cells, such as peripheral nerve Schwann cells (Keirstead et al., (1999) Exp.
Neurol. 159: 225-236) is known to increase axonal regeneration and spontaneous axonal growth in injured spinal cord and brain (Li and Raisman (1994) J.
Neurosci. 14: 4050-4063; Montero-Menei et al., (1992) Brain Res. 570: 198
-208). This approach enhances regeneration of injured spinal cord axons by providing a scaffold for growth and support and cell-filling guide channels that induces ingrowth and extension of regenerating CNS axons (Smith And Stevenson (1988), Exp. Bra
in Res .; Xu et al., (1995) Exp. Neurol. 134: 261-272). In addition, one of skill in the art will recognize that Schwann cells express a wide range of cell adhesion molecules, including N-CAM, L1 and N-cadherin, synthesize extracellular matrix molecules,
Release trophic factors including GF, BDNF and NT3 (Venstrom and Reichar
dt (1993) FASEB J. 7: 996-1003; Guenard et al., (1993) 5: 401-411)
Are known. Thus, higher levels of axonal regeneration can result from a combination of neurotrophic support and transplantation therapy (Keirstead et al., (1999) Expt.
Neurol.).

【００９７】 他の態様において、本発明の組成物は、さらに、神経栄養因子を含むことがで
き、随意に、シュヴァン細胞移植の前に、これと同時に、またはこの後に投与す
ることができる。脱髄により、シュヴァン細胞の移植の後の細胞成長を一層可能
にする環境が得られる。組成物を、当業者に前に知られている方法、例えば注射
、移植または灌流により調製し、送達する。In other embodiments, the compositions of the present invention can further include a neurotrophic factor, and can optionally be administered before, concurrently with, or after Schwann cell transplantation. Demyelination provides an environment that allows for more cell growth after transplantation of Schwann cells. The composition is prepared and delivered by methods previously known to those skilled in the art, for example, by injection, implantation or perfusion.

【００９８】 他の態様において、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む本発明の組成物を調製する
ことができ、これは、哺乳類、特にヒトにおいてＣＮＳ軸索の再生を容易にする
のに十分な量および純度で用いられる。 他の態様において、単核食細胞を含む本発明の組成物を調製することができる
。米国特許第５，８００，８１２号には、同種異系の単核食細胞が、ＣＮＳの傷
害または疾患の後の軸索再生の促進に有効であり得ることが例証されている。In another embodiment, a composition of the invention comprising tumor necrosis factor (TNF) can be prepared, which is in an amount sufficient to facilitate regeneration of CNS axons in mammals, especially humans. And purity. In another embodiment, a composition of the invention comprising a mononuclear phagocyte can be prepared. U.S. Patent No. 5,800,812 illustrates that allogeneic mononuclear phagocytes may be effective in promoting axonal regeneration following CNS injury or disease.

【００９９】 本発明の組成物を、細胞移植手法、例えば米国特許第５，７５０，１０３号に
教示されている手法と組み合わせて用いることができ、該米国特許において、好
ましくは細胞をマトリックスと共に培養して、細胞がマトリックスによりカプセ
ル封入されないようにすることにより、細胞をインビトロで支持マトリックスの
表面に付着させ、支持マトリックスを付着した細胞と共に脳中に移植することを
含む、哺乳類対象の脳中に細胞を移植する方法が提供される。この手法は、ガラ
スまたは他の酸化ケイ素、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ
アクリルアミド、ポリカーボネート、ポリペンテン、アクリロニトリル重合体、
ナイロン、アミラーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デキストランおよびセルロース
（例えばニトロセルロース）を含む天然のまたは修飾した多糖類、ヒアルロン酸
、細胞外マトリックス、寒天またはマグネタイト製の支持マトリックスを含む。
好ましい支持マトリックスは、多孔質または無孔質ビーズ、特に約９０〜約１５
０μｍの直径を有するミクロビーズである。The compositions of the present invention can be used in combination with cell transplantation techniques, such as those taught in US Pat. No. 5,750,103, in which cells are preferably cultured with a matrix. Thereby preventing the cells from being encapsulated by the matrix, thereby allowing the cells to attach to the surface of the support matrix in vitro and implanting the support matrix with the attached cells into the brain. Methods for implanting cells are provided. This technique involves the use of glass or other silicon oxide, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyacrylamide, polycarbonate, polypentene, acrylonitrile polymers,
Supporting matrices include natural or modified polysaccharides, including nylon, amylase, gelatin, collagen, dextran and cellulose (eg, nitrocellulose), hyaluronic acid, extracellular matrix, agar or magnetite.
Preferred support matrices are porous or non-porous beads, especially from about 90 to about 15
Microbeads having a diameter of 0 μm.

【０１００】 本発明の組成物を、多くの種々のタイプの細胞、好ましくは神経または神経傍
起源のいずれかの細胞、例えば副腎クロム親和細胞を用いる方法で用いることが
できる。また有用なのは、インビトロで成長する細胞系である。神経または神経
傍起源でない細胞、例えば線維芽細胞もまた、神経ペプチドあるいは神経伝達物
質の生成に至る酵素または酵素のセット、あるいは神経成長因子をコードするＤ
ＮＡでのトランスフェクションの後に用いることができる。The compositions of the present invention can be used in a method that employs many different types of cells, preferably cells of either neural or paraneural origin, such as adrenal chromaffin cells. Also useful are cell lines growing in vitro. Cells that are not of neural or paraneural origin, such as fibroblasts, may also be enzymes or sets of enzymes that lead to the production of neuropeptides or neurotransmitters, or Ds that encode nerve growth factors.
It can be used after transfection with NA.

【０１０１】 多くの種々の細胞タイプが有用である。代表的には、細胞を、受容者の脳に欠
乏している物質を提供するこの能力に基づいて選択する。欠乏している物質は、
神経伝達物質または他の神経的に活性な分子であることができ、この欠乏の結果
、神経学的疾患または機能障害が生じる。移植された細胞が、これを受容者中に
挿入した後に腫瘍として成長しないことが重要である。Many different cell types are useful. Typically, cells are selected based on their ability to provide a deficient substance to the recipient's brain. The missing substance is
It can be a neurotransmitter or other neuroactive molecule, and this deficiency results in a neurological disease or dysfunction. It is important that the implanted cells do not grow as a tumor after insertion into the recipient.

【０１０２】 ドナー細胞の１つの給源は、確立された神経細胞系である。発育のモデル系と
して広範囲に用いられている多くのニューロンクローンが存在する。その理由は
、これらが、適切な表面受容体と電気的に活性であり、特定の神経伝達物質、シ
ナプス形成特性並びに形態的におよび生化学的に正常なニューロンに分化する能
力であるからである。ニューロン系は、ＣＮＳニューロン中に見られる遺伝子発
現に相当する極めて大量の遺伝情報を発現し得る。このような細胞は、以下の参
考文献中に記載されている：Kimhi, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
3: 462-466 (1976); In: Excitable Cells in Tissur Culture, Nelson, P. G.
et al., 編、Plenum Press, New York, 1977, pp. 173-245; Prasad, K. M. et
al., In: Control of Proliferation of Animal Cells, Clarkson, B. et al.,
編、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1974,
pp. 581-594; Puro, D. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3544-354
8 (1976); Notter, M. F. et al., Devel. Brain Res. 26:59-68 (1986); Schub
ert, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67:247-254 (1970); Kaplan, B.
B. et al., In: Basic and Clinical Aspects of Molecular Neurobiology, Gu
ffrida-Stella, A. M. et al., 編、Milano Fondozione International Manarin
i, 1982。One source of donor cells is an established neuronal cell line. There are many neuronal clones that are widely used as model systems for development. The reason is that they are electrically active with the appropriate surface receptors, specific neurotransmitters, synaptic properties and the ability to differentiate into morphologically and biochemically normal neurons. . The neuronal system can express a very large amount of genetic information corresponding to the gene expression found in CNS neurons. Such cells are described in the following references: Kimhi, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
3: 462-466 (1976); In: Excitable Cells in Tissur Culture, Nelson, PG
et al., Ed., Plenum Press, New York, 1977, pp. 173-245; Prasad, KM et.
al., In: Control of Proliferation of Animal Cells, Clarkson, B. et al.,
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1974,
pp. 581-594; Puro, DG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 3544-354.
8 (1976); Notter, MF et al., Devel. Brain Res. 26: 59-68 (1986); Schub
ert, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67: 247-254 (1970); Kaplan, B.
B. et al., In: Basic and Clinical Aspects of Molecular Neurobiology, Gu
ffrida-Stella, AM et al., Ed., Milano Fondozione International Manarin
i, 1982.

【０１０３】 本発明の組成物を、体細胞ハイブリダイゼーション、単一のニューロンを不死
化することができるプロセスにより操作された細胞である有効な移植物質の他の
重要な給源と共に用いることができる。特定の遺伝子の発現において異なる融合
細胞は、遺伝子発現を制御する機構の調査を可能にする一方、染色体変化は、遺
伝学的に異なる細胞系を発生する速度で生じる。分化した細胞の特性を維持する
ハイブリッド細胞を、生成することができる。交感神経節および神経芽細胞腫細
胞の融合から誘導されたハイブリッドは、ドーパミンを合成することができる(G
reene, L. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4923-4927 (1975))一方
、脳細胞ハイブリッドは、コリンアセチルトランスフェラーゼを発現する(Minna
, J. D. et al., Genetics 79: 373-383 (1975))。従って、ＣＮＳからのドーパ
ミン作動性ニューロンへの胚前駆体を、有糸***細胞と融合させて、両方の遺伝
子を、時間経過と共に余分の染色体を失う単一のものの中に導入し、新たなハイ
ブリッド系を得ることができる。過度の実験を伴わずにこのようなハイブリッド
神経細胞または神経傍細胞を生成し、これらを所望の特性、例えばドーパミン分
泌についてスクリーニングし、移植のために最良の効能を有するものを選択する
ことは、当業者の範囲内である。The compositions of the present invention can be used in conjunction with somatic cell hybridization, another important source of effective transplant material that is a cell that has been manipulated by a process capable of immortalizing a single neuron. Fusion cells that differ in the expression of a particular gene allow the investigation of mechanisms that control gene expression, while chromosomal changes occur at the rate at which genetically different cell lines develop. Hybrid cells that maintain the properties of the differentiated cells can be generated. Hybrids derived from the fusion of sympathetic ganglia and neuroblastoma cells can synthesize dopamine (G
Natl. Acad. Sci. USA 82: 4923-4927 (1975)), whereas brain cell hybrids express choline acetyltransferase (Minna
, JD et al., Genetics 79: 373-383 (1975)). Thus, embryonic progenitors from the CNS to dopaminergic neurons are fused with mitotic cells to introduce both genes into a single one that loses extra chromosomes over time, creating a new hybrid A system can be obtained. Generating such hybrid neurons or paraneural cells without undue experimentation, screening them for desired properties, such as dopamine secretion, and selecting those with the best efficacy for transplantation is It is within the purview of those skilled in the art.

【０１０４】 本発明の組成物を、副腎髄質である他の細胞の給源から由来する移植用の細胞
と共に用いることができる。神経堤由来組織を、臨床的試験に伴わせて、パーキ
ンソン病を治療した。成体のサル副腎髄質を、単一の細胞として少なくとも約３
週間インビトロで培養することができる(Notter, M. F. et al., Cell Tiss. Re
s. 244: 69-76 (1986))。同様に、網膜色素上皮細胞は、ドーパミンおよび他の
因子を分泌し、本発明において、脳移植片に用いることができる(Li, L. et al.
, Exp. Eye Res. 47: 771-785 (1988); Lui, G. M. et al., Proc. Int'l. Soc.
Eye Res. 6:172 (1990); Li, L. et al., Inv. Ophthal. Vis. Sci. 31 (Suppl
): 595 (1990, abstr. 2915-13); Sheedlo. H. J. et al., 同上、abstr. 2916-
14; Fektorovich, E. G. et al., 同上、(abstr. 2917-15); Song, M-K et al.,
前記)。The compositions of the present invention can be used with cells for transplantation derived from other sources of cells that are adrenal medulla. Neural crest-derived tissues were treated for Parkinson's disease in conjunction with clinical trials. Adult monkey adrenal medulla has at least about 3 cells as a single cell.
For a week in vitro (Notter, MF et al., Cell Tiss. Re.
s. 244: 69-76 (1986)). Similarly, retinal pigment epithelial cells secrete dopamine and other factors and can be used in the present invention in brain grafts (Li, L. et al.
, Exp. Eye Res. 47: 771-785 (1988); Lui, GM et al., Proc. Int'l. Soc.
Eye Res. 6: 172 (1990); Li, L. et al., Inv.Ophthal.Vis.Sci. 31 (Suppl
): 595 (1990, abstr. 2915-13); Sheedlo. HJ et al., Ibid., Abstr. 2916-
14; Fektorovich, EG et al., Ibid., (Abstr. 2917-15); Song, MK et al.,
Above).

【０１０５】 哺乳類脳中に移植された細胞は、加えられた成長因子の欠乏において生存を示
した。しかし、追加の態様は、適切な成長／分化因子および本発明の組成物と共
に、移植前にインビトロで、移植後にインビボで、または両方の処理と組み合わ
せた支持マトリックスに付着した細胞の移植に向けられる。Cells transplanted into mammalian brain showed survival in the absence of added growth factors. However, additional embodiments are directed to the transplantation of cells attached to a support matrix in vitro before transplantation, in vivo after transplantation, or in combination with both treatments, with appropriate growth / differentiation factors and compositions of the present invention. .

【０１０６】 移植した膠細胞は、ニューロンの機能的な回復において重要な役割を奏するこ
とができ、栄養因子の重要な給源であり得る(Doering, L. C. et al., J. Neuro
log. Sci. 63:183-196(1984); Gumple, J. et al., Neurosci. Lett. 37:307-31
1 (1984))。従って、他の態様は、神経または神経傍細胞と膠細胞との同時培養
、支持マトリックスとのこれらの同時インキュベーション、続いて両方の細胞の
タイプを担持する支持マトリックスのＣＮＳ中への移植、これに続いてまたはこ
れと同時の本発明の組成物の使用を含む。Transplanted glial cells can play an important role in the functional recovery of neurons and can be an important source of trophic factors (Doering, LC et al., J. Neuro.
log.Sci. 63: 183-196 (1984); Gumple, J. et al., Neurosci. Lett. 37: 307-31.
1 (1984)). Thus, other embodiments include co-culture of neurons or paraneural cells with glial cells, their co-incubation with a support matrix, followed by implantation of a support matrix carrying both cell types into the CNS, Subsequent or concurrent use of the composition of the present invention.

【０１０７】 本発明の追加の態様において、脳の臭気感覚を伝達する神経においてのみ見い
だされるヘルパー細胞である嗅覚鞘被覆膠(Ramon-Cueto, et al., (1998) J Neu
rosci., 18:3803-15)との組成物の使用を含む。嗅覚鞘被覆膠は、いくつかのこ
れらの成長促進特性を含むシュヴァン細胞といくつかの特性を共有するが、これ
らはまた、星状細胞、即ち軸索成長を阻害し得るＣＮＳにおけるヘルパー細胞に
類似する特性を発現する。いずれの細胞タイプとも異なり、ＥＧはまた、ＣＮＳ
内に広範囲に移動する。In an additional embodiment of the invention, olfactory sheath-coated glue (Ramon-Cueto, et al., (1998) J Neu, a helper cell found only in nerves that transmit odor sensations in the brain.
rosci., 18: 3803-15). Although the olfactory sheath-coated glue shares some properties with Schwann cells, including some of these growth-promoting properties, they also resemble astrocytes, helper cells in the CNS that can inhibit axonal growth Express the characteristics of Unlike any cell type, EG also
Move extensively within.

【０１０８】 本発明の追加の態様において、神経または神経傍起源ではなく、神経学的関連
の物質を生成するように変更された細胞との組成物の使用を含む。好ましい細胞
のタイプは、容易に得られ、培養され、本発明の方法を用いてラット脳中に移植
する際に生存するヒト***線維芽細胞である。本発明において用いるために、細
胞を、業界において知られている方法を用いて遺伝学的に変化させて、ニューロ
ン成長因子、神経伝達物質、神経ペプチドまたは脳代謝に伴われる酵素を発現さ
せる。（例えばGage, F. H. et al., Neuroscience 23:795-807 (1987); Rosenb
erg, M. B. et al., Science 242: 1575-1578 (1988); Shimohama, S. et al.,
Mol. Brain Res. 5: 271-278 (1989)参照。）An additional embodiment of the present invention involves the use of a composition with cells that are not of neural or paraneural origin but have been modified to produce a neurologically relevant substance. A preferred cell type is human foreskin fibroblasts, which are easily obtained, cultured, and survive upon transplantation into rat brain using the methods of the present invention. For use in the present invention, cells are genetically altered using methods known in the art to express neuronal growth factors, neurotransmitters, neuropeptides or enzymes involved in brain metabolism. (Eg Gage, FH et al., Neuroscience 23: 795-807 (1987); Rosenb
erg, MB et al., Science 242: 1575-1578 (1988); Shimohama, S. et al.,
Mol. Brain Res. 5: 271-278 (1989). )

【０１０９】 組換えＤＮA技術および細胞生物学の一般的な原理を述べる標準的な参考実験
は、Watson, J. D., et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I and
II, Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, Calif. (1987); D
arnell, J. E. et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books,
Inc., New York, N.Y. (1986); Lewin, B. M., Genes II, John Wiey & Sons,
New York, N.Y. (1985); Old, R. W. et al., Principles of Gene Manipulatio
n: An Introduction to Genetic Engineering, 2nd Ed., University of Califo
rnia Press, Berkeley, Calif. (1981); Maniatis, T., et al., (Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor
, N.Y. (1982)); Sambrook, J. et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1
989)およびAlberts, B. et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd Ed., Ga
rlandPublishing, Inc., New York, N.Y. (1989))を含む。Standard reference experiments describing the general principles of recombinant DNA technology and cell biology can be found in Watson, JD, et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I and
II, Benjamin / Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, Calif. (1987); D
arnell, JE et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books,
Inc., New York, NY (1986); Lewin, BM, Genes II, John Wiey & Sons,
New York, NY (1985); Old, RW et al., Principles of Gene Manipulatio
n: An Introduction to Genetic Engineering, 2nd Ed., University of Califo
rnia Press, Berkeley, Calif. (1981); Maniatis, T., et al., (Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor
, NY (1982)); Sambrook, J. et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1
989) and Alberts, B. et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd Ed., Ga.
rlandPublishing, Inc., New York, NY (1989)).

【０１１０】 移植された細胞を、支持マトリックスに付着させるかまたはこれと混合するこ
とができ、これを業界において十分知られている方法を用いて凍結させ、凍結状
態で貯蔵する。融解に続いて、マトリックス結合細胞を、受容体の脳中に移植す
る。 細胞は、組織移植片に関して異種（＝異種、即ち受容者とは異なる種から由来
する）、同種異系（＝同種、即ち受容者と同一の種の遺伝学的に異なる要素から
由来する）または受容者がドナーとしても作用する自己由来であることができる
。The transplanted cells can be attached to or mixed with a support matrix, which is frozen using methods well known in the art and stored frozen. Following thawing, the matrix-bound cells are implanted into the recipient's brain. The cells may be xenogeneic (= heterologous, ie, from a different species than the recipient), allogeneic (= derived from a genetically distinct element of the same species as the recipient), or The recipient can be autologous, which also acts as a donor.

【０１１１】 支持マトリックスを構成することができる物質は、細胞がインビトロインキュ
ベーションの後に付着する、および細胞が成長することができる、および有毒反
応、あるいは移植された細胞を破壊するかまたは他の方法でこれらの生物学的ま
たは治療的活性に干渉する炎症性または神経膠症反応を生じずに、哺乳類脳中に
移植することができる物質を含む。このような物質は、合成のまたは天然の化学
物質あるいは生物学的起源を有する物質であることができる。マトリックス材料
は、ガラスおよび他の酸化ケイ素、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレ
ン、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、ポリアルギネート、ポリスルホン、
ポリビニルアルコール、アクリロニトリル重合体、ポリアクリルアミド、ポリカ
ーボネート、ポリペンテン、ナイロン、アミラーゼ、ゼラチン、コラーゲン、デ
キストランおよびセルロース（例えばニトロセルロース）を含む天然のまたは修
飾した多糖類、寒天およびマグネタイトを含むが、これらには限定されない。分
解吸収可能な、または分解吸収不可能な材料を用いることができる。また、業界
において十分知られている細胞外マトリックス材料を意図する（以下参照）。細
胞外マトリックス材料を、市場で入手するか、またはこのようなマトリックスを
分泌する細胞を成長させ、分泌細胞を除去し、移植されるべき細胞をマトリック
スと相互作用させ、これに付着させることにより調製することができる。The materials that can constitute the support matrix are such that the cells can adhere after in vitro incubation, and that the cells can grow, and that toxic reactions, or destroy the implanted cells or otherwise. Includes substances that can be implanted into the mammalian brain without producing an inflammatory or gliotic response that interferes with these biological or therapeutic activities. Such substances can be synthetic or natural chemicals or substances of biological origin. Matrix materials include glass and other silicon oxides, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyvinylidene fluoride, polyurethane, polyalginate, polysulfone,
Includes natural or modified polysaccharides, including polyvinyl alcohol, acrylonitrile polymers, polyacrylamide, polycarbonate, polypentene, nylon, amylase, gelatin, collagen, dextran, and cellulose (eg, nitrocellulose), agar and magnetite, including Not limited. A material that can be decomposed and absorbed or that cannot be decomposed and absorbed can be used. Also contemplated are extracellular matrix materials well known in the art (see below). Extracellular matrix material is prepared commercially, or by growing cells secreting such a matrix, removing secretory cells, and allowing the cells to be transplanted to interact with and attach to the matrix. can do.

【０１１２】 細胞接着、生存および機能を改善するために、固体マトリックスの外面を、随
意に、業界において知られている因子で被覆して、細胞接着、成長または生存を
促進することができる。このような因子には、細胞接着分子、細胞外マトリック
ス、例えばフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、グリコサミ
ノグリカンまたはプロテオグリカン（Albers, B. 前記、pp. 802-834参照）また
は成長因子、例えばＮＧＦが含まれる。あるいはまた、移植された細胞が付着す
る固体マトリックスを、多孔質材料、成長または生存促進因子で構成するか、ま
たは因子を、マトリックス材料中に導入することができ、ここからこれらをイン
ビボでの移植後にゆっくりと放出する。To improve cell attachment, survival and function, the outer surface of the solid matrix can be optionally coated with factors known in the art to promote cell attachment, growth or survival. Such factors include cell adhesion molecules, extracellular matrices such as fibronectin, laminin, collagen, elastin, glycosaminoglycans or proteoglycans (Albers, B. supra, pp. 802-834) or growth factors such as NGF Is included. Alternatively, the solid matrix to which the implanted cells adhere can be composed of a porous material, a growth or survival promoting factor, or the factor can be introduced into the matrix material from which they can be implanted in vivo. Release slowly later.

【０１１３】 あるいはまた、分解吸収可能なマトリックス、例えばコラーゲン上で成長した
かまたはこれと混合した細胞を、脳以外の神経学的関連の部位中に移植して、ニ
ューロン再成長または再生を促進することができる。例えば、本発明のマトリッ
クスに付着した細胞を、脊髄中に移植するか、あるいは視神経中またはこれに隣
接して配置することができる。[0113] Alternatively, cells grown or mixed with a resorbable matrix, such as collagen, may be implanted into a neurologically relevant site other than the brain to promote neuron regrowth or regeneration. be able to. For example, cells attached to a matrix of the invention can be implanted into the spinal cord or placed in or adjacent to the optic nerve.

【０１１４】 移植されるべき細胞が成長するかまたは細胞を混合するマトリックス材料は、
移植された細胞自体の内因性生成物であることができる。従って、例えば、マト
リックス材料を、まさに移植されるべき細胞により生成し、分泌された細胞外マ
トリックスまたは基底膜材料とすることができる。The matrix material on which the cells to be implanted grow or mix cells,
It can be an endogenous product of the implanted cells themselves. Thus, for example, the matrix material can be just the extracellular matrix or basement membrane material produced and secreted by the cells to be transplanted.

【０１１５】 本発明の組成物を、種々のヒト神経学的疾患の治療のための多くの方法と共に
用いることができ、ここで、これは、ＣＮＳ中への移植細胞に有用である。組成
物を、細胞移植の前に、またはこれと同時に用いることができる。例えば、パー
キンソン病を、本発明において、ドーパミン生成細胞を受容者の線条体中に、組
成物の使用と同時に、またはこの後に移植することにより、治療することができ
る。アルツハイマー病は、基底核中のコリン作動性細胞における不足を伴う。従
って、本発明において、アルツハイマー病を患っているかまたはこの危険にある
対象に、アセチルコリンを生成する細胞を移植することができる。ハンチントン
舞踏病は、通常は回の中程度の疾患を伴う、尾状核および被殻の頭部の総計の消
耗を伴う。ハンチントン舞踏病を患っている対象を、神経伝達物質であるガンマ
アミノブチル酸（ＧＡＢＡ）、アセチルコリンまたはこの混合物を生成する細胞
を移植することにより、治療することができる。本発明において、このような細
胞が付着する支持マトリックス材料を、好ましくは、尾および被殻中に移植する
。The compositions of the present invention can be used with a number of methods for the treatment of various human neurological disorders, where they are useful for transplanting cells into the CNS. The composition can be used prior to or concurrent with cell transplantation. For example, Parkinson's disease can be treated in the present invention by transplanting dopaminergic cells into the striatum of the recipient, either simultaneously with or after the use of the composition. Alzheimer's disease is associated with a deficiency in cholinergic cells in the basal ganglia. Thus, in the present invention, acetylcholine-producing cells can be transplanted into a subject suffering from or at risk of Alzheimer's disease. Huntington's chorea involves a total depletion of the caudate nucleus and putamen's head, usually with moderate illness. A subject suffering from Huntington's chorea can be treated by transplanting cells that produce the neurotransmitters gamma aminobutyric acid (GABA), acetylcholine, or a mixture thereof. In the present invention, the support matrix material to which such cells adhere is preferably implanted in the tail and putamen.

【０１１６】 てんかんは、真実には単一の疾患ではなく、むしろ、下にある異常により生じ
る症状である。当業者は、各々のてんかんの対象が、個体について独特である損
傷またはてんかん病巣を有することを理解する。このような病巣を、業界におい
て十分知られている診断方法の組み合わせを用いて局在させることができ、これ
には、脳波記録法、コンピューター化軸方向断層撮影法および磁気共鳴造影が含
まれる。てんかんを患っている患者を、本発明において、ＧＡＢＡ生成細胞を罹
患している部位中に付着させる支持マトリックス材料を移植することにより、治
療することができる。脳中のグルタミン受容体およびＮＭＤＡ受容体のブロッカ
ーが、実験てんかんを制御するのに用いられているため、刺激性アミノ酸経路を
遮断する分子を生成する細胞を、本発明において用いることができる。従って、
本明細書中に記載したように、ポリアミン、例えばスペルミジンを正常な量より
多量に生成するように改変された細胞の移植は、てんかんを治療するのに有用で
あり得る。[0116] Epilepsy is not really a single disease, but rather a condition caused by an underlying abnormality. One skilled in the art will understand that each epileptic subject has an injury or epileptic focus that is unique for the individual. Such lesions can be localized using a combination of diagnostic methods well known in the art, including electroencephalography, computerized axial tomography and magnetic resonance imaging. Patients suffering from epilepsy can be treated in the present invention by implanting a support matrix material that allows GABA-producing cells to adhere to the affected area. Since glutamine and NMDA receptor blockers in the brain have been used to control experimental epilepsy, cells that produce molecules that block the stimulatory amino acid pathway can be used in the present invention. Therefore,
As described herein, transplantation of cells that have been modified to produce polyamines, such as spermidine, in greater than normal amounts, can be useful for treating epilepsy.

【０１１７】 本発明の組成物は、本発明の方法の有益な効果を受けることができる任意の哺
乳類についての使用を意図している。このような哺乳類の中で主要なものは、ヒ
トであるが、本発明は、このように限定されることを意図するものではなく、獣
医学的使用にも適用できる。The compositions of the present invention are intended for use with any mammal that can benefit from the methods of the present invention. The predominant among such mammals is the human, but the invention is not intended to be so limited and is also applicable to veterinary use.

【０１１８】 この組成物はまた、本明細書中で「ＣＮＳ神経成長モジュレーター」（ＣＮＧ
Ｍ）および特に本明細書中に定義した神経細胞接着分子の群として同定されてい
るある剤と共に用いて、中枢神経系（ＣＮＳ）における神経突起外方成長を促進
することができる。一般的に、成体の中枢神経系におけるニューロンは、膠細胞
上に存在する阻害分子キューのために、再成長することができないと考えられて
いた。本発明の剤および方法を用いて、この阻害を克服し、ＣＮＳ神経突起外方
成長を促進することができる。The composition is also referred to herein as a “CNS nerve growth modulator” (CNG
M) and particularly with certain agents identified as a group of neuronal adhesion molecules as defined herein can promote neurite outgrowth in the central nervous system (CNS). It was generally believed that neurons in the adult central nervous system were unable to regrow due to inhibitory molecular cues present on glial cells. The agents and methods of the present invention can be used to overcome this inhibition and promote CNS neurite outgrowth.

【０１１９】 このような剤を、ＣＮＳ神経突起外方成長を調節するかまたは促進することが
できる任意の細胞接着分子から、特に、免疫グロブリンスーパーファミリーに属
する分子に選択することができる。さらに特に、分子を、Ｌ１、Ｎ−ＣＡＭおよ
びミエリン関連糖タンパク質を含む、Ｃａ^２＋依存性ニューロン細胞接着を媒介
する免疫グロブリンスーパーファミリーの要素から選択する。本発明はまた、こ
れらの分子のフラグメント、並びに神経突起促進活性を有するこれらの分子の類
似体、同族、同種および模擬を意図する。これらのフラグメントおよび類似体の
ための特に好ましい構造モチーフには、フィブロネクチンＩＩＩ型同種繰り返し
、特に繰り返し１−２）に類似するドメインおよび免疫グロブリン状ドメイン（
特にドメインＩ−ＩＩ、ＩＩＩ−ＩＶおよびＶ−ＶＩ）が含まれる。[0119] Such agents can be selected from any cell adhesion molecule that can regulate or promote CNS neurite outgrowth, especially those belonging to the immunoglobulin superfamily. More particularly, the molecule is selected from members of the immunoglobulin superfamily that mediate Ca2 ⁺ -dependent neuronal cell adhesion, including L1, N-CAM and myelin-related glycoprotein. The invention also contemplates fragments of these molecules, as well as analogs, cognate, homologs, and mimics of these molecules that have neurite-promoting activity. Particularly preferred structural motifs for these fragments and analogs include domains resembling fibronectin type III homologous repeats, especially repeats 1-2) and immunoglobulin-like domains (
In particular, domains I-II, III-IV and V-VI) are included.

【０１２０】 本発明の組成物を、ＣＮＳ神経成長モジュレーター（ＣＮＧＭ）または神経細
胞接着分子のインビボでの分化した星状細胞上での異所発現と共に用いることが
できる。アストログリア細胞およびオリゴデンドログリア細胞の阻害作用は、少
なくとも部分的に、本明細書中で定義した剤の神経突起外方成長促進特性により
、および異所的に発現したＬ１の活性により特に例示されたように、克服するこ
とができる。星状細胞によるＬ１の発現はまた、希突起膠細胞によりなされた阻
害効果を補うと考えられる。The compositions of the present invention can be used with in vivo ectopic expression of CNS nerve growth modulators (CNGM) or neuronal adhesion molecules on differentiated astrocytes. The inhibitory effect of astroglia and oligodendroglia is particularly exemplified, at least in part, by the neurite outgrowth promoting properties of the agents as defined herein, and by the activity of ectopically expressed L1. As you can, you can overcome. Expression of L1 by astrocytes is also believed to complement the inhibitory effect made by oligodendrocytes.

【０１２１】 前に示したように、本発明は、傷害または疾患により失われた構造並びに、不
完全なまたは未成熟形成を示す構造および組織を再生することが望ましいような
成長を含む、ＣＮＳにおける神経成長の促進にわたる。 本発明の組成物を、ＣＮＳにおける神経外方成長、再生および神経生存の調節
のためのＣＮＧＭ分泌細胞と組み合わせて用いることができる。このようにして
、ある可溶性ＣＮＧＭおよびそのフラグメント、並びにこの同族分子もまた、本
発明の範囲内にある。As indicated earlier, the present invention is directed to the CNS, including growth that is desirable to regenerate structures lost by injury or disease, as well as structures and tissues that exhibit incomplete or immature formation. Spans the promotion of nerve growth. The compositions of the present invention can be used in combination with CNGM-secreting cells for regulating neuronal outgrowth, regeneration and neuronal survival in the CNS. Thus, certain soluble CNGMs and fragments thereof, and their cognate molecules are also within the scope of the invention.

【０１２２】 本発明の組成物の他の態様において、髄鞘形成の阻害剤、例えばメタロプロテ
アーゼ（米国特許第６，０２５，３３３号）、アポトーシスおよび／または壊死
の阻害剤（米国特許第６，００４，５７９号、６，０１５，６６５号および６，
０４６，００７号）、炎症性サイトカイン、アクティベーター抗炎症性サイトカ
インの阻害（米国特許第５，６５０，３９６号）、抗炎症性サイトカイン、アク
ティベーターおよび抗酸化剤の発生剤（米国特許第５，７４７，５３２号、５，
７４７，４５９号および５，６６７，７７６号）またはこの任意の組み合わせと
組み合わせて調製することができる。また、本発明の組成物を、ファゴサイトー
シスの生成を増大させる方法と組み合わせて投与することができる（米国特許第
５，８００，８１２号）。In other embodiments of the compositions of the present invention, inhibitors of myelination, such as metalloproteases (US Pat. No. 6,025,333), inhibitors of apoptosis and / or necrosis (US Pat. 004,579, 6,015,665 and 6,
046,007), pro-inflammatory cytokines, activators Inhibition of anti-inflammatory cytokines (US Patent No. 5,650,396), anti-inflammatory cytokines, activators and agents for generating antioxidants (US Patent No. 5,747, 532, 5,
747,459 and 5,667,776) or any combination thereof. Also, the compositions of the present invention can be administered in combination with a method of increasing the production of phagocytosis (US Pat. No. 5,800,812).

【０１２３】 好ましい態様において、組成物は、ＧａｌＣ特異性モノクローナル抗体および
ヒト血清補体から構成される。 他の好ましい態様において、組成物は、ＭＯＧ特異性モノクローナル抗体およ
びヒト血清補体から構成される。In a preferred embodiment, the composition is comprised of a GalC specific monoclonal antibody and human serum complement. In another preferred embodiment, the composition is comprised of a MOG specific monoclonal antibody and human serum complement.

【０１２４】 使用 本発明の組成物を用いて、ミエリンの一時的な免疫学的崩壊または軸索の一時
的脱髄を刺激することにより、対象のＣＮＳにおけるニューロンの再成長、回復
および／または再生を促進することができる。好ましくは、本発明の一時的な脱
髄プロセスは、ＣＮＳにおいて、最も好ましくは脊髄において生じる。 対象は、任意の哺乳類であることができる。好ましい態様において、対象はヒ
トである。Use The compositions of the present invention are used to stimulate the transient immunological breakdown of myelin or the transient demyelination of axons to regenerate, regenerate and / or regenerate neurons in the CNS of a subject. Can be promoted. Preferably, the temporary demyelination process of the present invention occurs in the CNS, most preferably in the spinal cord. The subject can be any mammal. In a preferred embodiment, the subject is a human.

【０１２５】 本発明の組成物を用いて、傷害、例えば脊髄傷害の結果損傷を受けたＣＮＳに
おける機能障害ニューロンの再成長、回復および／または再生を促進することが
できる。この組成物を、即時のまたは慢性の傷害の後に用いることができる。 また、本発明の組成物を用いて、疾患、例えばアルツハイマー病およびパーキ
ンソン病を含む逆行性疾患の結果損傷を受けたＣＮＳにおける機能障害ニューロ
ンの再成長、回復および／または再生を促進することができる。The compositions of the present invention can be used to promote the regrowth, recovery and / or regeneration of dysfunctional neurons in the CNS that have been damaged as a result of injury, eg, spinal cord injury. This composition can be used after an immediate or chronic injury. The compositions of the present invention can also be used to promote the regrowth, recovery and / or regeneration of dysfunctional neurons in the CNS that have been damaged as a result of diseases such as retrograde diseases including Alzheimer's disease and Parkinson's disease. .

【０１２６】 また、本発明の組成物を用いて、移植された細胞の成長を比較的可能にする哺
乳類ＣＮＳ内の環境を生じることができる。例えば、ＰＮＳ細胞を、損傷を受け
たＣＮＳにおける部位中に移植する場合には、軸索は、ミエリンの移植効果のた
めに、移植された組織中に成長することができるが、ＣＮＳ中に戻ってこの組織
から成長することはできない。本発明の組成物を用いて、ＣＮＳ中のミエリンを
崩壊させて、軸索がこの領域中に延在するようにすることができる。[0126] The compositions of the present invention can also be used to create an environment within the mammalian CNS that relatively allows for the growth of transplanted cells. For example, if PNS cells are implanted into a site in the injured CNS, axons can grow into the implanted tissue but return to the CNS due to the engraftment effect of myelin. You cannot grow from leverage. The compositions of the present invention can be used to disrupt myelin in the CNS such that axons extend into this area.

【０１２７】調製および投与 本発明の組成物を用いる方法は、このような組成物の治療的に有効な量を対象
に投与することを含む。本明細書中で用いる、用語「治療的に有効な量」は、Ｃ
ＮＳを有効かつ一時的に崩壊および／または脱髄させて、神経学的組織およびニ
ューロン接続の回復および再生が増強されるようにするのに十分な組成物の量を
いう。一般的に、治療組成物を、体重１ｋｇあたり２０％〜３０％の補体溶液に
おいて約０．０３ｍｇの抗体〜約０．６ｍｇの抗体の範囲において投与する。好
ましくは、この範囲は、体重１ｋｇあたり２０％〜３０％の補体溶液において０
．０５ｍｇの抗体〜０．４ｍｇの抗体である。最も好ましくは、この範囲は、体
重１ｋｇあたり２０％〜３０％の補体溶液において０．１ｍｇの抗体〜０．３ｍ
ｇの抗体である。抗体対補体の正確な比率は、環境に依存して変化する；しかし
、活性化された補体の量が、結合した抗体分子の数に正比例するため、過剰の抗
体の相対的濃度で比較的高い濃度の補体を投与することができる。さらに、投与
された抗体の特定的な濃度は、特定の機能障害およびこの重篤度並びに因子、例
えば患者の年齢、性別および医学的履歴に伴って変化する。臨床的当業者は、こ
のような因子および従っていかにして組成物の投与量範囲を補うかを知る。 Preparation and Administration Methods of using the compositions of the invention include administering to a subject a therapeutically effective amount of such a composition. As used herein, the term "therapeutically effective amount" refers to C
Refers to an amount of the composition sufficient to effectively and temporarily disrupt and / or demyelinate the NS to enhance the recovery and regeneration of neurological tissue and neuronal connections. Generally, the therapeutic compositions will be administered in a range of about 0.03 mg antibody to about 0.6 mg antibody in a 20% -30% complement solution per kg body weight. Preferably, this range is between 0% and 30% of complement solution per kg body weight.
. 05 mg antibody to 0.4 mg antibody. Most preferably, this range is from 0.1 mg antibody to 0.3 m in 20% -30% complement solution per kg body weight.
g antibody. The exact ratio of antibody to complement varies depending on the environment; however, since the amount of activated complement is directly proportional to the number of antibody molecules bound, the relative concentrations of excess antibody are compared. Extremely high concentrations of complement can be administered. In addition, the particular concentration of antibody administered will vary with the particular dysfunction and its severity and factors, such as the patient's age, gender and medical history. The person skilled in the clinical art knows such factors and thus how to supplement the dosage range of the composition.

【０１２８】 脊髄傷害の大部分は、脊髄を包囲する脊柱の損傷に起因する。この損傷には、
骨折、脱臼または両方が含まれる。脊髄に対する損傷の多くは、傷害の後数時間
以内に生じる二次的現象による。この時点において、生じた損傷は、可逆的であ
り得る；従って、回復可能なＣＮＳ機能のための臨界的に重要な因子は、傷害と
治療の慣例との間に生じる時間の量である。最も好ましくは、神経系機能障害が
、傷害の結果である際には、対象への組成物の投与は、可能な限り傷害の時点に
近くする。Most spinal cord injuries result from damage to the spinal column surrounding the spinal cord. This damage includes
Fractures, dislocations or both are included. Much of the damage to the spinal cord is due to secondary phenomena that occur within hours after the injury. At this point, the resulting damage can be reversible; therefore, a critical factor for reversible CNS function is the amount of time that occurs between injury and treatment practice. Most preferably, when the nervous system dysfunction is the result of an injury, administration of the composition to the subject is as close as possible to the time of the injury.

【０１２９】 本発明の方法による組成物を、対象に、注射または時間経過的な次第の注入に
より、非経口的に投与することができる。例えば、組成物を、鞘内に投与するか
または脊髄中に直接注射することができる。The compositions according to the methods of the present invention can be administered parenterally to a subject, by injection or by gradual infusion over time. For example, the composition can be administered intrathecally or injected directly into the spinal cord.

【０１３０】 本発明の組成物を、治療的に有効な成分を、再生するべき傷害を受けた軸索の
近辺に到達させるように計算された任意の方式において投与することができる。
好ましくは、組成物を、薬学的に許容し得る液体担体中で直接部位に注射する。
あるいはまた、組成物の成分を担持する移植片を、外科的に挿入することができ
る。このような移植片は、これらの成分を吸収し、移植の部位においてこれをゆ
っくりと放出することができる任意の材料、例えばニトロセルロースからなるこ
とができる。The compositions of the present invention can be administered in any manner calculated to allow the therapeutically active ingredient to reach the vicinity of the injured axon to be regenerated.
Preferably, the compositions are injected directly into the site in a pharmaceutically acceptable liquid carrier.
Alternatively, an implant carrying the components of the composition can be surgically inserted. Such an implant can consist of any material that can absorb these components and release it slowly at the site of implantation, such as nitrocellulose.

【０１３１】 中枢神経系への薬剤の送達を妨げる物理的障壁のいくつかを克服する最も一般
的な方法の１つは、ポンプを用いることによるものであった。種々のポンプが、
外側に取り付けられた貯蔵器から小さい管を介して中枢神経系中に薬剤を送達す
るために設計された。[0131] One of the most common ways to overcome some of the physical barriers that prevent delivery of drugs to the central nervous system has been by using pumps. Various pumps,
Designed to deliver drugs into the central nervous system via small tubes from externally mounted reservoirs.

【０１３２】 うまくするためには、中枢神経系内に薬剤を送達するのみでは十分ではない。
薬剤は、所要の投与速度において、および適切な治療用量で、意図された作用部
位に送達されなければならない。市場では、バオロフェンを鞘内に投与するため
に知られているメドトロニック(Medtronic)ポンプシステムおよびアルゼット(Al
zet)浸透圧ミニポンプが、中枢神経内に長期間にわたり制御された速度および用
量で薬剤を送達する入手可能、極めて有用および好都合な手段になった。To be successful, it is not enough to deliver the drug into the central nervous system.
The drug must be delivered to the intended site of action at the required rate of administration and at an appropriate therapeutic dose. On the market, Medtronic pump systems and Alzet (Al) are known for administering baolofen intrathecally.
zet) Osmotic minipumps have become an available, extremely useful and convenient means of delivering drugs at controlled rates and doses over a prolonged period in the central nervous system.

【０１３３】 開発された尚他の手法は、例えば、米国特許第５，３６０，６１０号に開示さ
れており、ここでは、重合体微小球を、生物学的に活性な剤をＣＮＳ内の部位に
送達するために用いるための注射可能な薬剤送達系として用いている。特に、生
物学的に活性な剤は、適合性の生物分解可能な重合体中に含まれ、これを次に、
治療を必要としている患者に投与する。本発明の組成物を、傷害または障害の部
位に移植して、これにより治療学的に活性な成分の持続された放出を可能にする
ことができる一連の微小球中に調製することができる。米国特許第４，８８３，
６６６号および５，６０１，８３５号にはまた、任意の物質のＣＮＳ中への制御
された放出のための重合体薬剤送達系が開示されている。業界において精通した
作業者は、このような重合体薬剤送達系を、このような療法を必要としている患
者への本発明の組成物の投与が容易になるように容易に適合することができる。Yet another approach that has been developed is disclosed, for example, in US Pat. No. 5,360,610, in which polymeric microspheres are treated with biologically active agents at sites within the CNS. As an injectable drug delivery system for use in delivering to a patient. In particular, the biologically active agent is contained in a compatible biodegradable polymer, which is then
Administer to patients in need of treatment. The compositions of the invention can be prepared in a series of microspheres that can be implanted at the site of the injury or disorder, thereby allowing sustained release of the therapeutically active ingredient. U.S. Pat.
666 and 5,601,835 also disclose polymeric drug delivery systems for controlled release of any substance into the CNS. Those skilled in the art can readily adapt such polymeric drug delivery systems to facilitate administration of the compositions of the present invention to patients in need of such therapy.

【０１３４】 他の送達手段は、当業者に明らかであり、本発明の範囲内であると理解される
ことを意図する。Other delivery vehicles will be apparent to those skilled in the art and are intended to be understood to be within the scope of the present invention.

【０１３５】 非経口投与用の組成物は、組成物の成分と患者との両方に適合性である薬学的
に許容し得る担体中に含有される。このような担体には、無菌水性または非水性
溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコ
ール、ポリエチレングリコール、代謝可能な油、例えばオリーブオイルまたはス
クアラン、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる
。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液および、生理的食塩水および緩衝
媒体を含む乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウ
ム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳
酸化リンガーまたは固定油が含まれる。また、保存剤および他の添加剤、例えば
抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガス等が存在することができる
。好ましい担体は、人工的な脳脊髄液である。Compositions for parenteral administration are contained in a pharmaceutically acceptable carrier that is compatible with both the components of the composition and the patient. Such carriers include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. Examples of non-aqueous solvents include propylene glycol, polyethylene glycol, metabolizable oils such as olive oil or squalane, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Aqueous carriers include water, alcoholic / aqueous solutions and emulsions or suspensions, including saline and buffered media. Parenteral vehicles include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer's or fixed oils. In addition, preservatives and other additives may be present, such as antimicrobial agents, antioxidants, chelating agents and inert gases and the like. A preferred carrier is artificial cerebrospinal fluid.

【０１３６】キット 本発明の方法において用いるための物質は、理想的にはキットの調製物に適合
する。このようなキットは、１つまたは２つ以上の容器手段、例えばビン、管な
どを密接な制限において受けるように区分された担体手段を含み、容器手段の各
々は、方法において用いられる個別の要素の１つを含む。例えば、容器手段の１
つは、ＧａｌＣ特異性抗体を含むことができる。あるいはまた、抗体および補体
は、同一の容器中に存在することができる。構成成分は、所望のように液体また
は凍結乾燥した形態で存在することができる。 Kits Materials for use in the methods of the present invention are ideally suited to the preparation of the kit. Such kits include one or more container means, e.g., a carrier means partitioned to receive, in close confinement, bottles, tubes, etc., each of the container means being a separate element used in the method. Including one of the following. For example, one of the container means
One can include a GalC specific antibody. Alternatively, the antibody and complement can be in the same container. The components can be in liquid or lyophilized form as desired.

【０１３７】 損傷の部位への補体および抗体の送達を容易にする針および／または他の装置
は、以下のものを含むことができる： ａ）シラスチック、ポリエチレン、チゴン(Norton Performance Plastics)管系
； ｂ）皮下ポンプ、（例えばバクロフェンを鞘内に投与するために知られているメ
ドトロニックポンプシステム）； ｃ）直接脊椎内投与または短期間鞘内投与のための脊椎針。[0137] Needles and / or other devices that facilitate the delivery of complement and antibodies to the site of injury can include: a) Silastic, polyethylene, tigone (Norton Performance Plastics) tubing. B) a subcutaneous pump, such as the Medtronic pump system known for intrathecal administration of baclofen; c) a spinal needle for direct intraspinal or short-term intrathecal administration.

【０１３８】 このようなキットを用いる方法の１つの例は、１４ゲージツオヒ(Tuohy)ニー
ドルを、腰部のクモ膜下腔中に挿入することとして記載することができる。５−
Ｆカテーテルを、Ｌ１０の先端と同軸に配置し、側方（または適切な位置）に穴
あけする。このタイプの指示は、この手法に精通した者により理解される。管系
を、鞘内に配置し、ポンプに接続する。有限の容積の試薬を含むポンプを、皮膚
の下に配置し、これを、ポンプの隔壁中に挿入された針を介して、医師の研究室
において再充填することができる。または、インフューセド(Infusaid)ポンプを
、代替として用いることができる。One example of a method using such a kit can be described as inserting a 14 gauge Tuohy needle into the lumbar subarachnoid space. 5-
The F catheter is placed coaxially with the tip of L10 and punctured laterally (or in an appropriate location). This type of instruction is understood by those familiar with this technique. The tubing is placed inside the sheath and connected to a pump. A pump containing a finite volume of reagent can be placed beneath the skin and refilled in the physician's lab via a needle inserted into the septum of the pump. Alternatively, an Infusaid pump can be used as an alternative.

【０１３９】現在の方法にまさる利点 本発明の組成物およびこの使用は、ＣＮＳにおけるニューロン成長の再生につ
いて、現在有用である方法にまさる多くの利点を有する。 アヘンアンタゴニスト、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、局所的髄冷却、デ
キストラン注入、アドレナリン遮断、コルチコステロイドおよび高圧酸素を含む
介入治療は、脊髄に対する外傷的傷害の後の減少する二次的な炎症損傷において
標的されて、損傷の傷害を受けていないニューロンへの拡散を防止する。しかし
、本発明とは異なり、これらは、損傷を受けたニューロンの再生を促進しない。 Advantages over Current Methods The compositions of the present invention and their use have many advantages over currently useful methods for regenerating neuronal growth in the CNS. Interventional therapies, including opiate antagonists, thyrotropin-releasing hormone, topical medullary cooling, dextran infusion, adrenergic blockade, corticosteroids and hyperbaric oxygen, are targeted in diminished secondary inflammatory injury following traumatic injury to the spinal cord Being able to prevent the damage from spreading to undamaged neurons. However, unlike the present invention, they do not promote regeneration of damaged neurons.

【０１４０】 末梢神経移植片およびドナー細胞のＣＮＳ中への移植は、軸索が、これらの中
に成長する点で有用である；しかし、軸索は、阻害ミエリンが存在するために、
これから包囲ＣＮＳ中には成長することができない。対照的に、本発明は、阻害
ミエリンを崩壊させて、ＣＮＳにおけるニューロンの再成長を可能にする。Transplantation of peripheral nerve grafts and donor cells into the CNS is useful in that axons grow into them; however, because of the presence of inhibitory myelin
From now on, it cannot grow into the surrounding CNS. In contrast, the present invention disrupts inhibitory myelin, allowing neurons to regrow in the CNS.

【０１４１】 本発明を、以下の非限定的例においてさらに詳細に記載する。以下に記載する
例は、本発明の範囲を限定することを意味しないと理解するべきである。多くの
変法が、本発明が関与する業界の当業者に、本発明の精神を何ら逸脱せずに明ら
かであることが予測される。適切に解釈される添付した特許請求の範囲は、本発
明の範囲に対する唯一の限定を形成する。The present invention is described in further detail in the following non-limiting examples. It should be understood that the examples described below are not meant to limit the scope of the invention. It is anticipated that many variations will be apparent to those skilled in the art to which the invention pertains without departing from the spirit of the invention. The appended claims, as properly construed, form the only limitations on the scope of the invention.

【０１４２】 例Ｉ：脳幹脊椎軸索の再生 以下の例は、補体固定ミエリン特異性抗体と共に、血清補体タンパク質の局所
的な脊椎内注入による、髄鞘形成の一時的な発育抑制または成熟ミエリンの崩壊
が、哺乳類対象における脊椎横断の後の脳幹脊椎軸索再生を容易にすることを例
示する。Example I: Regeneration of Brainstem Spinal Axons The following example demonstrates the transient stunting or maturation of myelination by local intraspinal injection of serum complement proteins with complement-fixing myelin-specific antibodies. 10 illustrates that disruption of myelin facilitates brainstem vertebral axon regeneration after spinal transection in a mammalian subject.

【０１４３】材料および方法： 外科的脊椎横断および一時的な免疫学的ミエリン崩壊： 体重約２００ｇの１０〜１２週齢成体雌ラット(Sprague-Dawley)を、ケタミン
／キシラジン（それぞれ６０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。
Ｔ１０における限定された側背の椎弓切除の後に、左側脊髄ヘミセクション損傷
を、微小はさみで作成した。次に、損傷の程度を、鋭利な小刀を損傷部位を通し
て３回貫通させることにより、確認した（図１Ａ）。損傷の直後に、脊椎内カニ
ューレを、Ｔ１１（合計ｎ＝２２）において移植し、アルゼット浸透圧ポンプに
接続して（１４日間）、その後血清補体（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，＃１９１９５−
０１５，３３％ｖ／ｖ）の連続的脊椎内注入（０．５μｌ／時において）を、ガ
ラクトセレブロシドに対する補体固定ＩｇＧ抗体（本発明者等自身のポリクロー
ナル抗体またはChemicon Intl. Ltd., ＃ＡＢ１４２，２５％ｖ／ｖ）と共に送
達した。カニューレを、椎骨に適用した歯科用アクリルにより、一定の位置に保
持した。次に、筋肉層を、歯科用アクリルで縫合し、表面組織および皮膚を閉じ
た。ヘミセクション損傷の程度を、常に、５週間の処理および回復期間の終了時
に組織学的に確認した。 Materials and Methods: Surgical Transverse Spine and Transient Immunological Myelin Disruption: Adult female rats, 10-12 weeks old (Sprague-Dawley) weighing approximately 200 g, were treated with ketamine / xylazine (60 mg / kg and 7 mg, respectively). (0.5 mg / kg).
After limited dorsal laminectomy at T10, left spinal cord hemisection injury was made with micro scissors. Next, the extent of damage was confirmed by penetrating a sharp knife through the damaged site three times (FIG. 1A). Immediately after injury, an intravertebral cannula was implanted at T11 (total n = 22) and connected to an Alzette osmotic pump (14 days) before serum complement (GIBCO BRL, # 19195-).
015, 33% v / v) (at 0.5 μl / hr), using complement-fixed IgG antibodies to galactocerebroside (our own polyclonal antibody or Chemicon Intl. Ltd., # AB142). , 25% v / v). The cannula was held in place by dental acrylic applied to the vertebrae. The muscle layers were then sutured with dental acrylic to close the surface tissue and skin. The extent of hemisection damage was always checked histologically at the end of the 5 week treatment and recovery period.

【０１４４】 すべての対照動物は、同一のヘミセクション損傷を受け、次に、同一の時間期
間、ビヒクルのみ（０．１Ｍリン酸緩衝生理的食塩水、ＰＢＳ、ｎ＝５）、抗体
のみ（２５％ｖ／ｖ、ｎ＝２）または血清補体のみ（３３％ｖ／ｖ、ｎ＝６）の
いずれかで、浸透圧ポンプを通して脊椎内注入した。すべての外科的手順および
その後の動物ケアプロトコルは、カナダおよび英国コロンビア大学動物ケア委員
会(Canadian and University of British Columbia Animal Care Committee)の
ガイドラインに従った。All control animals received the same hemisection injury, and then for the same time period, vehicle alone (0.1 M phosphate buffered saline, PBS, n = 5), antibody alone (25 % V / v, n = 2) or serum complement alone (33% v / v, n = 6), injected intraspine through an osmotic pump. All surgical procedures and subsequent animal care protocols followed Canadian and University of British Columbia Animal Care Committee guidelines.

【０１４５】電子顕微鏡： 超構造の分析のための組織を、浸透圧ポンプでＧａｌＣ（詳細は上記参照）に
対する補体固定ＩｇＧ抗体と共に血清補体を注入した後７日目に屠殺した、１０
〜１２週齢の成体の雌Sprague-Dawleyラットから得た。動物を、ケタミン／キシ
ラジン（それぞれ１２０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ）で致死的に麻酔し、
次に２００ｍｌの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、次いで１００ｍｌの０．１
Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中の４％グルタルアルデヒドで心臓内灌流し、その後
同一の固定液で一夜後固定した。注入部位および包囲索を、１ｍｍの横断ブロッ
クに切断し、加工して、吻−尾配列で保存した。ブロックを、０．１Ｍカコジル
酸ナトリウム緩衝液で洗浄し（２４時間）、２％ＯｓＯ_４中で後固定し、上昇す
るアルコールを通して脱水し、標準のプロトコルに従ってスプーア(Spurr)の樹
脂中に包埋した。実験および未処理対照動物からの組織ブロックを、平行して加
工した。薄い切片（１μｍ）を、各々のブロックから切断し、アルカリ性トルイ
ジンブルーで染色し、光学顕微鏡下で試験した。電子顕微鏡試験のために、ブロ
ックを切り取り、次に、切片を、８０〜１００ｎｍに切断し、銅格子上に載置し
、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、ジース(Ziess)ＥＭ１０Ｃ電子顕微
鏡下で観察した（８０ｋＶにおいて）。 Electron microscopy: Tissues for ultrastructural analysis were sacrificed 7 days after infusion of serum complement with complement-fixed IgG antibody to GalC (see above for details) by osmotic pump.
Obtained from adult female Sprague-Dawley rats, １２12 weeks of age. Animals were lethally anesthetized with ketamine / xylazine (120 mg / kg and 15 mg / kg, respectively)
Next, 200 ml of 0.1 M PBS (pH 7.4), and then 100 ml of 0.1 M PBS.
Intracardiac perfusion with 4% glutaraldehyde in M PBS (pH 7.3) was followed by overnight fixation with the same fixative. The injection site and surrounding cord were cut into 1 mm transverse blocks, processed and stored in a rostral-tail arrangement. Blocks are washed with 0.1 M sodium cacodylate buffer (24 h), post-fixed in 2% OsO ₄ , dehydrated through rising alcohol, and embedded in resin in Spurr according to standard protocols. did. Tissue blocks from experimental and untreated control animals were processed in parallel. Thin sections (1 μm) were cut from each block, stained with alkaline toluidine blue, and examined under a light microscope. For electron microscopy examination, blocks were cut, then sections were cut to 80-100 nm, mounted on copper grids, stained with uranyl acetate and lead citrate, and run under a Ziess EM10C electron microscope. (At 80 kV).

【０１４６】逆行性ニューロン標識： 逆行性トレーサー（単一の標識）を、吻の腰部索中に注入する（傷害部位に対
して１ｃｍ後方）場合に、これを、両方の無傷の軸索並びに再生した突出により
、起源の細胞体に戻して導入および輸送しなければならない。従って、逆行性ト
レーサーが、すべてでなければほとんどの下行性脊椎突出ニューロンを確実かつ
広範囲に標識することが必須である。同様に重要なパラメーターは、トレーサー
を、脊椎傷害の十分後方の距離で、制御された再現性のある方式で注入して、ヘ
ミセクション傷害のレベルへのトレーサーのすべての直接的な拡散を防止しなけ
ればならないことである。これらの条件すべてを最良に満たす逆行性標識は、フ
ルオロ金である(Sahibzada, et al., (1987) Brain Res. 415:242-256)。蛍光デ
キストランアミン、例えばＲＤＡは、軸索取り込みを容易にするために最近の軸
索傷害を必要とし(HeimerおよびZaborszky Neuroanatomical Tract-tracing Met
hods 2: Recent Progress (New York: Plenum, 1989))、従って二重標識逆行性
トレーシング研究において用いるのに一層良好に適する。 Retrograde neuronal labeling: If retrograde tracer (single label) is injected into the rostral lumbar cord (1 cm posterior to the injury site), it will be transferred to both intact axons as well as regeneration. The resulting protrusion must be introduced and transported back to the cell body of origin. It is therefore essential that the retrograde tracer reliably and extensively labels most, if not all, descending spinal protrusion neurons. An equally important parameter is to inject the tracer in a controlled and reproducible manner at a distance well behind the spinal injury to prevent any direct spread of the tracer to the level of the hemisection injury. That is something that must be done. The retrograde label that best meets all these conditions is fluorogold (Sahibzada, et al., (1987) Brain Res. 415: 242-256). Fluorescent dextranamines, such as RDA, require recent axonal injury to facilitate axonal uptake (Heimer and Zaborszky Neuroanatomical Tract-tracing Met
hods 2: Recent Progress (New York: Plenum, 1989)) and thus are better suited for use in double-label retrograde tracing studies.

【０１４７】単一標識研究： ヘミセクション損傷の後２８日および従って免疫学的試薬の脊椎内注入の完了
の後１４日において、各々の成体ラットを、ケタミン／キシラジン（それぞれ６
０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。フルオロ金（ＦＧ、合計体
積１００〜１５０ｎｌ、無菌ｄＨ_２Ｏ中で５％ｗ／ｖ；Fluorochrome Inc. Engl
ewood, CO, USA）を、脊椎組織の中央中に両側に、Ｌ１レベルにおいて、損傷部
位の約１ｃｍ後方に注入した（５０〜７５ｎｌ）。 Single label study: At 28 days after hemisection injury and thus 14 days after completion of the intravertebral injection of immunological reagents, each adult rat was treated with ketamine / xylazine (6 each).
0 mg / kg and 7.5 mg / kg). Fluorophlogopite (FG, total volume 100～150Nl, with sterile dH ₂ O in 5% w / v; Fluorochrome Inc. Engl
ewood, CO, USA) were injected bilaterally into the center of the spinal tissue, at the L1 level, approximately 1 cm posterior to the injury site (50-75 nl).

【０１４８】 ＦＧの拡散の程度に対する脱髄プロトコルの特定の効果もまた評価した。ラッ
ト（ｎ＝８）を、前述のように実験的に処理した；しかし、動物を、Ｌ１索中に
ＦＧを注入した後１２、２４、７２および１２０時間後に屠殺した。８匹の他の
ラットを、対照とし、ここでポンプはビヒクルのみを含んでおり、実験的に処理
した動物と平行して加工した。クリオスタット切片（厚さ２５μｍ）を、各々の
注射部位からのＦＧ拡散の程度について分析した（図１Ｂ）。光学顕微鏡レベル
において検出して、実験的に処理した動物と対照処理した動物との間に、視覚可
能なＦＧ拡散の程度における有意な差異はなかった。すべての場合において、Ｆ
Ｇ拡散の範囲は、注射部位から４〜６ｍｍ（１〜１．５脊椎セグメント）または
損傷部位に少なくとも１．５脊椎セグメント後方であった。The specific effect of the demyelination protocol on the extent of FG diffusion was also evaluated. Rats (n = 8) were treated experimentally as described above; however, animals were sacrificed 12, 24, 72 and 120 hours after injection of FG into the L1 cord. Eight other rats served as controls, where the pump contained vehicle only and was processed in parallel with the experimentally treated animals. Cryostat sections (25 μm thick) were analyzed for the extent of FG diffusion from each injection site (FIG. 1B). There was no significant difference in the degree of visible FG diffusion between experimentally treated and control treated animals, detected at the light microscopic level. In all cases, F
The extent of G diffusion was 4-6 mm (1-1.5 vertebral segments) from the injection site or at least 1.5 vertebral segments posterior to the injury site.

【０１４９】二重標識研究： 損傷の時点において、ヘミセクション部位を、１２％（無菌ｄＨ_２Ｏにおいて
ｗ／ｖ）ローダミン共役デキストランアミン（ＲＤＡ、１０，０００ＭＷ、Fluo
roRuby, Molecular Probes）に３０分間浸漬したゲルフォームでパックした。次
にゲルフォームを除去し、残りの外科的手順を完了した（前に概説したように）
。２８日の生存の後、すべての動物を、ケタミン／キシラジン（それぞれ６０ｍ
ｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。ＦＧ（合計体積１００〜１５０
ｎｌ、無菌ｄＨ_２Ｏにおいて５％ｗ／ｖ）を、脊椎のＬ１レベルにおいて脊椎実
質中に両側に注射した（５０〜７５ｎｌ）（ｎ＝６）。 Double labeling study: At the time of injury, hemisection sites were replaced with 12% (w / v in sterile dH ₂ O) rhodamine-conjugated dextranamine (RDA, 10,000 MW, Fluo
roRuby, Molecular Probes) for 30 minutes. The gel foam was then removed and the remaining surgical procedure was completed (as outlined above)
. After 28 days of survival, all animals were treated with ketamine / xylazine (60 m each)
g / kg and 7.5 mg / kg). FG (total volume 100 to 150
nl, a 5% w / v) in sterile dH ₂ O, was injected to both sides in the spine substantially at L1 level of the spine (50~75nl) (n = 6) .

【０１５０】軸索再生の分析： 腰部索中へのＦＧトレーサーの注射の７日後に、動物を、ケタミン／キシラジ
ン（それぞれ１２０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ）で致死的に麻酔し、次に
２００ｍｌの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、次いで１００ｍｌの０．１Ｍ
ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中の４％パラホルムアルデヒドで心臓内灌流した。次に、
脳および脊髄を取り出し、同一の固定液で一夜後固定した。その後、脳および脊
髄各々から、固定液を除去し、組織を一連のスクロース溶液（１５％、次いで２
１％）中に配置することにより、凍結保存した。冠または傍矢状切片を、クリオ
スタットで厚さ２５μｍに切断した。脳幹および脊髄組織切片を、１００Ｗ水銀
球（励起／発光波長：ＦＧ、３６５／４２０ｎｍ；ＲＤＡ、５４６／５９０ｎｍ
）で、ジースアキシオスコップ(Zeiss Axioskop)の下に試験した。 Analysis of axonal regeneration: Seven days after injection of the FG tracer into the lumbar cord, animals were lethally anesthetized with ketamine / xylazine (120 mg / kg and 15 mg / kg, respectively) and then 200 ml. 0.1 M PBS (pH 7.4), then 100 ml of 0.1 M
Intracardiac perfusion with 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7.3). next,
The brain and spinal cord were removed and fixed with the same fixative overnight. The fixative was then removed from each of the brain and spinal cord, and the tissue was removed from a series of sucrose solutions (15%, then 2%).
1%). Crown or parasagittal sections were cut with a cryostat to a thickness of 25 μm. Brain stem and spinal cord tissue sections were prepared using 100 W mercury bulb (excitation / emission wavelength: FG, 365/420 nm; RDA, 546/590 nm).
) Was tested under Zeiss Axioskop.

【０１５１】 実験的に処理した動物の軸索再生能力を評価するのに用いた脳幹脊椎核は、赤
色核（ＲＮ、起源はヘミセクションとは反対側性である）であった。各々のＲＮ
からの脊椎突出軸索は、中脳の反対側に横断し、反対側性側背索内に脊髄を通じ
て下降する。この反対側性脊椎突出通路は、軸索の２〜５％の可能な例外で、完
全に横を向いた路であることが知られており、これは、同側の経路により索に突
出することができる(Brown (1974) J. Comp. Neurol. 154:169-188; Huisman et
al., (1981) Brain Res. 209:217-286; Shieh et al., (1983) J. Comp. Neuro
l. 214:79-86; WaldronおよびGwyn (1969) J. Comp. Neurol. 137:143-154)。The brainstem vertebral nucleus used to evaluate the axonal regeneration capacity of experimentally treated animals was the red nucleus (RN, originating opposite to the hemisection). Each RN
The spinal protruding axons from the traverse across the spinal cord into the contralateral dorsal cord, traversing the opposite side of the midbrain. This contralateral spinal protruding passage is known to be a completely lateral tract, with the possible exception of 2-5% of axons, which protrude into the cord by the ipsilateral path. (Brown (1974) J. Comp. Neurol. 154: 169-188; Huisman et.
al., (1981) Brain Res. 209: 217-286; Shieh et al., (1983) J. Comp.
l. 214: 79-86; Waldron and Gwyn (1969) J. Comp. Neurol. 137: 143-154).

【０１５２】 単一盲目プロトコルを用いて、赤色核（ＲＮ）内の逆行性標識したニューロン
の数を、核を通して１つおきの組織切片において計数して、同一のニューロンを
２回計数するのを防止した。核およびニューロン形態（即ち外見が多極である）
を示し、近位のプロセス中に延在するＦＧ（即ち、他の蛍光フィルターを用いて
視覚可能でない；上記参照）で特異的に標識した細胞のみを、陽性に標識した脊
椎突出ニューロンであると見なした。次に、再生ニューロンの百分率を、同一の
動物内の反対側性（傷害を受けていない）対照核内の標識したニューロンの数と
の比較において決定した。Using a single blind protocol, the number of retrogradely labeled neurons in the red nucleus (RN) is counted in every other tissue section through the nucleus to count the same neuron twice. Prevented. Nuclear and neuronal morphology (ie, multipolar in appearance)
And that only cells specifically labeled with FG extending during the proximal process (ie, not visible using other fluorescent filters; see above) are positively labeled spinous protruding neurons. Considered. Next, the percentage of regenerating neurons was determined in comparison to the number of labeled neurons in the contralateral (undamaged) control nucleus in the same animal.

【０１５３】結果： 免疫学的処理の後の脊髄脱髄およびミエリン崩壊の程度 ７日にわたるＰＢＳ中のＧａｌＣ（２５％）に対するポリクローナル抗体との
３３％異種（テンジクネズミ）血清補体の直接脊椎内注入（０．５μｌ／時にお
いて）の結果、注入カニューレからの２ｍｍまでの広範囲の脱髄が生じた（合計
の吻尾距離は、４ｍｍまたは約１脊椎セグメントであった（図２Ａ））。脱髄の
この領域を、崩壊したミエリン（即ち、ほどけた外見を有する広範囲に葉裂した
ミエリン、図２Ｃ）により特徴づけされる、さらに８ｍｍまたは脊髄の２セグメ
ントにより、いずれかの側に結合した。前の研究において示されるように(Keirs
tead et al., (1995) J. Neurosci. 15:6963-6974; Keirstead et al., (1992)
Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 89:11664-11668; Keirstead et al., (1997) Bra
in. Res. Bull. 44:727-734)、異種血清補体のみ、ミエリン特異性抗体のみまた
はＰＢＳのみの対照注入の結果、カニューレ部位の周囲のすぐ中心にある限定さ
れた非特異性損傷のみが生じた。脱髄またはミエリン崩壊の包囲領域はなかった
（図２Ｄ）。 Results: Degree of spinal cord demyelination and myelin breakdown after immunological treatment Direct intravertebral of 33% xenogeneic (guinea pig) serum complement with polyclonal antibody against GalC (25%) in PBS over 7 days Infusion (at 0.5 μl / hr) resulted in extensive demyelination up to 2 mm from the infusion cannula (total rostral distance was 4 mm or about 1 vertebral segment (FIG. 2A)). This area of demyelination was bound on either side by an additional 8 mm or two segments of the spinal cord, characterized by disrupted myelin (ie, extensively lobulated myelin with an unfolded appearance, FIG. 2C). . As shown in a previous study (Keirs
tead et al., (1995) J. Neurosci. 15: 6963-6974; Keirstead et al., (1992)
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 11664-11668; Keirstead et al., (1997) Bra.
in. Res. Bull. 44: 727-734), control injections of heterologous serum complement only, myelin-specific antibody only or PBS only, resulting in only limited non-specific damage immediately centered around the cannula site Occurred. There was no surrounding area of demyelination or myelin disruption (FIG. 2D).

【０１５４】 実験的に処理した成体ラットの脊髄内の免疫学的脱髄およびミエリンの崩壊は
、索の全体的断面プロフィル全体にわたる活性プロセスである。免疫学的ミエリ
ン崩壊は、１日以内に開始し、マクロファージまたは内在小膠および多形核細胞
（例えば白血球、例えば好中球、好酸球および好塩基球）の侵襲と関連する。多
くのマクロファージ／小膠は、ミエリンフラグメントを含み、これらの食細胞活
性を７日以内に完成する（図２Ｂ）。脱髄およびミエリン崩壊のこのパターンを
、血清補体およびミエリン特異性抗体を注入する限り維持することができる。最
近の証拠は、免疫学的注入が終了した後、再髄鞘形成が、２週間以内に開始し(K
eirsteadおよびBlakemore (1997) Glia (In Press); Dyer, BourqueおよびSteev
es（刊行されていない観察）)；新たなミエリンが、分化する希突起膠細胞前駆
体から発生するが、侵襲性シュヴァン細胞および生存する「成熟した」希突起膠
細胞がまた、再髄鞘形成に寄与し得ることを示唆する。Immunological demyelination and myelin breakdown in the spinal cord of experimentally treated adult rats is an active process throughout the entire cross-sectional profile of the cord. Immunological myelin disruption begins within one day and is associated with the invasion of macrophages or endogenous microglia and polymorphonuclear cells (eg, leukocytes such as neutrophils, eosinophils and basophils). Many macrophages / microglia contain myelin fragments and complete their phagocytic activity within 7 days (FIG. 2B). This pattern of demyelination and myelin breakdown can be maintained as long as serum complement and myelin-specific antibodies are injected. Recent evidence shows that after the end of immunological infusion, remyelination begins within two weeks (K
eirstead and Blakemore (1997) Glia (In Press); Dyer, Bourque and Steev
es (unpublished observation)); new myelin develops from differentiating oligodendrocyte precursors, but invasive Schwann cells and surviving "mature" oligodendrocytes also remyelinate Suggest that it can contribute to

【０１５５】 逆行性トレーサーの選択および注射部位からのこの拡散距離 この研究において、成体ラットのヘミセクションしたおよび免疫学的にミエリ
ン抑制された脊髄内の軸索再生についての主要な解剖学的証拠は、脳幹−脊椎核
の同質の対内の逆行性標識したニューロンの数の間の比較に依存する。これらの
比較を有効にするために、脳幹脊椎核の候補は、すべてのレベルにおいて脊髄の
一方の側に限定された高度に片側性の突出を有しなければならない。左側胸ヘミ
セクション（図１Ａ）は、右側赤色核（ＲＮ）の反対側性に突出する大型細胞ニ
ューロンを切断したが、左側ＲＮからの突出を、損傷を受けないままとした（こ
れらが、胸索の無傷の右側側背索を通して突出するため）。Selection of retrograde tracer and this diffusion distance from injection site In this study, the main anatomical evidence for axonal regeneration in the hemisectioned and immunologically myelin-suppressed spinal cord of adult rats was , Depending on the comparison between the number of retrogradely labeled neurons within the homogenous pair of brainstem-spinal nuclei. For these comparisons to be valid, brainstem spinal nucleus candidates must have a highly unilateral protrusion confined to one side of the spinal cord at all levels. The left chest hemisection (FIG. 1A) cut large cell neurons protruding contralateral to the right red nucleus (RN), but left the protrusion from the left RN undamaged (these Cord to protrude through the intact right dorsal cord).

【０１５６】 すべての場合において、フルオロ金標識（１００〜１５０ｎｌ）を、吻腰部索
（ヘミセクション傷害部位に対して１ｃｍまたは３脊椎セグメント後方）内に両
側に注射した。本発明者等は、正常な髄鞘形成した（対照の）動物および実験的
に処理したラット（即ち、脱髄およびミエリン崩壊条件下で）の腰部および胸脊
髄内でのフルオロ金の吻尾拡散の時間経過および程度を評価した。実験的および
対照処理した脊髄の無秩序な２５μｍの切片（Ｌ２〜Ｔ８まで延在する）を、１
００Ｗ水銀ランプの最高の強度設定を用いて蛍光顕微鏡下で試験した。脊椎組織
を、１２時間（ｎ＝４）、２４時間（ｎ＝４）、３日（ｎ＝４）および５日（ｎ
＝４）を含む、注射後の変化する生存間隔において、フルオロ金拡散の程度につ
いて試験した。観察された最大の吻拡散距離は、４〜６ｍｍ（または１〜１．５
脊椎セグメント）であり、２４時間の時間間隔内に生じた。腰部索内のフルオロ
金拡散の程度は、試験したその後の時点にわたり変化しなかった（図１Ｂ）。In all cases, fluorogold labeling (100-150 nl) was injected bilaterally into the rostral cord (1 cm or 3 spine segments posterior to the hemisection injury site). We have found that roso-tail diffusion of fluorogold in the lumbar and thoracic spinal cords of normal myelinated (control) animals and experimentally treated rats (ie, under demyelination and myelin disruption conditions). Was evaluated over time and degree. Disordered 25 μm sections of the experimental and control treated spinal cord (extending from L2 to T8) were
Tested under a fluorescence microscope using the highest intensity setting of a 00W mercury lamp. Spine tissue was treated for 12 hours (n = 4), 24 hours (n = 4), 3 days (n = 4) and 5 days (n = 4).
= 4) were tested for the extent of fluorogold diffusion at varying survival intervals after injection. The maximum rostral diffusion distance observed was 4-6 mm (or 1-1.5 mm).
Vertebral segment) and occurred within a 24 hour time interval. The extent of fluorogold diffusion in the lumbar cord did not change over the subsequent time points tested (FIG. 1B).

【０１５７】 要するに、いずれの動物（実験的または対照）も、ヘミセクション損傷（Ｔ１
０）のレベルにおいて脊髄内のフルオロ金標識の証拠を何も示さなかった；従っ
て、この基準により、いずれの動物も、この研究から除外する必要はなかった。
入手可能な証拠は、逆行性標識が、Ｔ１０傷害部位に対して後方の軸索突出を有
する無傷のおよび再生する脳幹脊椎ニューロンを標識することに限定されたこと
を示す。In short, any animal (experimental or control) had a hemisection injury (T1
At level 0), there was no evidence of fluorogold labeling in the spinal cord; therefore, by this criterion, no animals needed to be excluded from this study.
Available evidence indicates that retrograde labeling was limited to labeling intact and regenerating brainstem spinal neurons with posterior axonal protrusion to the site of T10 injury.

【０１５８】逆行性ニューロン標識による脳幹脊椎軸索再生についての証拠 ２８匹の動物（実験的１２匹（逆行性単一標識９匹および二重標識３匹）並び
に対照１６匹（逆行性単一標識１３匹および二重標識３匹））に、Ｔ１０脊髄の
左側側方ヘミセクションを施した。ヘミセクションの直後に、注入カニューレ（
１４ｄ浸透圧ポンプに接続した）を、脊髄中に、傷害部位に対して４〜５ｍｍ（
１脊椎セグメント）後方に直接挿入した。浸透圧ポンプは、多数の３種の異なる
対照溶液または実験的処理の１つを含んでいた（即ち、それぞれＰＢＳビヒクル
のみ、血清補体のみ、抗ガラクトセレブロシド抗体のみまたは抗ＧａｌＣ抗体と
の血清補体）。次に、動物を２８日間回復させ、次にフルオロ金を、吻腰部中に
、損傷部位の１ｃｍ（即ち３脊椎セグメント）後方に注射した。さらに７日間生
存させた後、各々の動物を屠殺し、脳および脊髄を、実験および分析用に取り出
した（標識したニューロンを決定するために用いた基準について材料および方法
参照）。 Evidence for Brainstem Spinal Axon Regeneration by Retrograde Neuron Labeling 28 animals (12 experimental (9 retrograde single label and 3 double label) and 16 controls (retrograde single label) 13 and 3 double-labeled)) received a left lateral hemisection of the T10 spinal cord. Immediately after the hemisection, the injection cannula (
14d osmotic pump) into the spinal cord 4-5 mm (
One spine segment) was inserted directly posteriorly. The osmotic pump contained one of a number of three different control solutions or experimental treatments (ie, PBS vehicle only, serum complement only, anti-galactocerebroside antibody alone or serum supplementation with anti-GalC antibody, respectively). body). The animals were then allowed to recover for 28 days and then fluorogold was injected into the rostral lumbar region 1 cm (ie, 3 spine segments) posterior to the site of injury. After an additional 7 days of survival, each animal was sacrificed and the brain and spinal cord were removed for experimentation and analysis (see Materials and Methods for criteria used to determine labeled neurons).

【０１５９】 ヘミセクション損傷の程度を、各動物において評価した。１匹の実験的および
１匹の対照処理した動物を除くすべてにおいて、左側胸脊髄をヘミセクションし
た（図１Ａ）。最も重要なことに、赤核脊髄路の領域（側背索）を切断した。右
側白質路は、常に無傷および損傷を受けないままであった；通常反対側性側の灰
白質もまた、損傷を受けなかった。The extent of hemisection damage was assessed in each animal. In all but one experimental and one control treated animal, the left thoracic spinal cord was hemisectioned (FIG. 1A). Most importantly, the area of the nucleus pulposus (lateral dorsal cord) was severed. The right white matter tract always remained intact and undamaged; the gray matter, usually on the contralateral side, was also undamaged.

【０１６０】 各ＲＮ（図３Ａ〜Ｂ、表１）内の標識したニューロンの数の「盲目の」計数を
比較して、データは、傷害を受けた大型細胞ＲＮニューロンの３１．８％±１３
．３８％（ｎ＝９、範囲１０〜５０％）が、尾部の腰部索中に十分な距離で再生
して、フルオロ金を導入し、逆行性に輸送したことを示した（図４）。対照的に
、ＰＢＳビヒクルのみ、ＧａｌＣ抗体のみまたは血清補体のみのいずれかを受け
た、対照処理した動物は、ＲＮ標識の顕著な量を示さなかった：１．４９％±０
．８４％（図３Ｃ〜Ｄ；図４、ｎ＝１３、範囲０〜３、表１）。傷害を受けた右
側ＲＮ核内のいくつかのニューロンの標識は、中脳の反対側に突出しない少数の
ＲＮを示し、同側の（傷害を受けていない）索内に下降し得る(Shieh et al., (
1983) J. Comp. Neurol. 214:79-86)。細胞の逆行性標識は、ＲＮの小細胞性領
域内で観察されなかった。このことは、このＲＮ領域が、主に、索の頸部領域ま
でのみ突出しているため、予測された。Comparing the “blind” counts of the number of labeled neurons within each RN (FIGS. 3A-B, Table 1), the data show that 31.8% ± 13% of injured large cell RN neurons.
. 38% (n = 9, range 10-50%) showed that they had regenerated a sufficient distance into the tail lumbar cord to introduce fluorogold and transported retrograde (Figure 4). In contrast, control treated animals that received either PBS vehicle only, GalC antibody only, or serum complement only showed no significant amount of RN labeling: 1.49% ± 0.
. 84% (FIGS. 3C-D; FIG. 4, n = 13, range 0-3, Table 1). Labeling of some neurons in the injured right RN nucleus indicates a small number of RNs that do not protrude to the other side of the midbrain and may descend into ipsilateral (undamaged) cords (Shieh et al. al., (
1983) J. Comp. Neurol. 214: 79-86). Retrograde labeling of the cells was not observed in the small cellular area of the RN. This was expected because this RN region mainly protrudes only to the cervical region of the cord.

【０１６１】 また、傷害を受けた、およびミエリン抑制された赤核脊髄路の二重逆行性標識
を、定性的に評価した（図３ＥおよびＦ）。多数のＲＤＡ陽性（第１の標識）大
型細胞ＲＮニューロンが、胸脊髄に対するヘミセクション傷害の時間における損
傷部位の直接の標識の後に観察された。脊椎内ミエリン抑制および損傷部位の後
方のフルオロ金のその後の注射の後、ＦＧ陽性ニューロンの小さい重複集団が観
察された（即ち、いくつかのニューロンは、ＲＤＡおよびＦＧの両方で標識され
た）。専ら第１のまたは第２のトレーサーにより標識された細胞はまた、分析し
たすべての脳幹において存在した。少数の二重標識した脳幹脊椎ニューロンは、
部分的に、切断された軸索が切断端部の密封の前にＲＤＡを取り込まないためで
あることができる、即ち新たに傷害を受けなければならない(HeimerおよびZabor
azky Neuroanatomical tract-tracing methods 2: Recent Progress(New York:
Plenum, 1989))。また、脳幹を横断しない赤核脊髄ニューロンの集団はまた、「
傷害を受けた」核においてＦＧ陽性細胞として出現する。評価した動物の数が少
ないため、本発明者等は、これらの結果を定量することを試みなかった。しかし
、これらはおそらく、免疫学的脱髄およびミエリン崩壊により容易にされた軸索
再生の下方評価を示すが、明らかに、ミエリン抑制の後の脳幹脊椎再生の程度の
上方評価を示さない。[0161] Double retrograde labeling of the injured and myelin-suppressed nucleus pulposus tract was also qualitatively evaluated (Figures 3E and F). Numerous RDA-positive (first labeled) large cell RN neurons were observed following direct labeling of the injury site at the time of hemisection injury to the thoracic spinal cord. Following intraspinal myelin suppression and subsequent injection of fluorogold behind the site of injury, a small overlapping population of FG positive neurons was observed (ie, some neurons were labeled with both RDA and FG). Cells exclusively labeled by the first or second tracer were also present in all brain stems analyzed. A small number of double-labeled brainstem spinal neurons
In part, the severed axons can be due to not taking up RDA prior to sealing the severed end, i.e. they must be newly injured (Heimer and Zabor
azky Neuroanatomical tract-tracing methods 2: Recent Progress (New York:
Plenum, 1989)). Also, populations of red nucleus spinal cord neurons that do not cross the brain stem also
Appears as FG positive cells in the "injured" nucleus. Due to the small number of animals evaluated, we did not attempt to quantify these results. However, they probably show a lower assessment of axonal regeneration facilitated by immunological demyelination and myelin disruption, but clearly do not show an upper assessment of the degree of brainstem spine regeneration following myelin suppression.

【０１６２】 脊椎横断を用いる従来技術(Keirstead et al., (1995) J. Neurosci. 15:6963
-6974; Keirstead et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:11664-11
668)と比較して、本発明は、各々の動物をそれ自体の内部対照とすることができ
るように、この試験のためのヘミセクションモデルを用いて例証された（即ち、
傷害を受けた脳幹脊椎突出からの軸索再生を、傷害を受けていない反対側性の相
同体と容易に比較することができる）。さらに、本発明は、しばしは一層大きい
脊椎損傷と共に生じる嚢腔形成の程度およびこの研究に必要な比較的長い回復期
間にわたる動物不快の量を最小にするように努めた。Prior Art Using Transverse Spine (Keirstead et al., (1995) J. Neurosci. 15: 6963
-6974; Keirstead et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 11664-11.
668), the present invention has been illustrated using the hemisection model for this test so that each animal can be its own internal control (ie,
Axon regeneration from injured brainstem spinal protrusions can be easily compared to uninjured contralateral homologues). In addition, the present invention sought to minimize the extent of cavitation that often accompanies greater spinal injury and the amount of animal discomfort over the longer recovery period required for this study.

【０１６３】 実験的処理の後の５週間の回復期間の間のすべての機能的または挙動の差異に
ついての試験は、傷害を受けた動物と傷害を受けていない動物との間のロコモー
ターパターンにおいて、記録可能な差異を示さなかった（即ち、すべての動物は
移動し、すべての動物は基礎的な反射機能に関して同等であった）。これらの観
察は、ヘミセクション傷害の後に脊椎内に注入した処理（例えば、ＰＢＳのみ、
ＧａｌＣ抗体のみ、血清補体のみまたは血清補体とＧａｌＣ抗体）にかかわらず
真実であった。Testing for all functional or behavioral differences during the 5-week recovery period following experimental treatment indicates that the locomotor pattern between injured and uninjured animals Showed no recordable differences (ie, all animals moved and all animals were equivalent with respect to basal reflex function). These observations indicate that treatments injected into the spine after hemisection injury (eg, PBS only,
(GalC antibody alone, serum complement alone or serum complement and GalC antibody).

【０１６４】 これらの発見は、ミエリンの免疫学的抑制（脱髄およびミエリン崩壊）が、傷
害を受けた成体のラット脊髄内の脳幹脊椎軸索の解剖学的再生を容易にすること
を示す。These findings indicate that immunological suppression of myelin (demyelination and myelin breakdown) facilitates the anatomical regeneration of brainstem vertebral axons in the injured adult rat spinal cord.

【０１６５】 例ＩＩ：免疫学的脱髄に対する単一の補体タンパク質の除去の効果 材料および方法： 外科的脊椎横断および一時的な免疫学的ミエリン崩壊： 体重約２００ｇの１０〜１２週齢成体雌ラット(Sprague-Dawley)を、ケタミン
／キシラジン（それぞれ６０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。
限定された側背の椎弓切除を、Ｔ１０において実施し、アルゼット浸透圧ポンプ
に接続して（１４日）、その後ガラクトセレブロシドに対する補体固定ＩｇＧ抗
体（本発明者等自身のポリクローナル抗体またはChemicon Intl. Ltd., ＃ＡＢ
１４２，２５％ｖ／ｖ）と共に、Ｃ３欠乏血清補体（Sigma S8788、３３％ｖ／
ｖ）の連続的脊椎内注入（０．５μｌ／時において）を送達した。カニューレを
、椎骨に適用した歯科用アクリルにより、一定の位置に保持した。次に、筋肉層
を、歯科用アクリルで縫合し、表面組織および皮膚を閉じた。Example II: Effect of the removal of a single complement protein on immunological demyelination Materials and methods: Surgical transvertebral and transient immunological myelin disruption: Adults weighing about 200 g and 10-12 weeks old Female rats (Sprague-Dawley) were anesthetized with ketamine / xylazine (60 mg / kg and 7.5 mg / kg, respectively).
Limited dorsal laminectomy was performed at T10, connected to an Alzette osmotic pump (14 days), and then complement-fixed IgG antibodies to galactocerebroside (our own polyclonal or Chemicon Intl. . Ltd., #AB
142, 25% v / v) together with C3-deficient serum complement (Sigma S8788, 33% v / v).
v) Continuous intraspinal infusion (at 0.5 μl / hr) was delivered. The cannula was held in place by dental acrylic applied to the vertebrae. The muscle layers were then sutured with dental acrylic to close the surface tissue and skin.

【０１６６】 すべての対照動物に、浸透圧ポンプにより、同一の時間期間、ガラクトセレブ
ロシドに対する補体固定ＩｇＧ抗体（本発明者等自身のポリクローナル抗体また
はChemicon Intl. Ltd., ＃ＡＢ１４２，２５％ｖ／ｖ）と共に、全体のヒト血
清補体（Sigma S1764、３３％ｖ／ｖ）を脊椎内に注入した。すべての外科的手
順およびその後の動物ケアプロトコルは、カナダおよび英国コロンビア大学動物
ケア委員会のガイドラインに従った。 電子顕微鏡を、例Ｉに記載したように実施した。All control animals were given an osmotic pump for the same period of time for complement-fixed IgG antibodies to galactocerebroside (our own polyclonal antibodies or Chemicon Intl. Ltd., # AB142, 25% v / Along with v), whole human serum complement (Sigma S1764, 33% v / v) was injected into the spine. All surgical procedures and subsequent animal care protocols were in accordance with the guidelines of the Animal Care Commission of Columbia University of Canada and the United Kingdom. Electron microscopy was performed as described in Example I.

【０１６７】 結果： 図５において見られるように、補体のＣ３成分の除去の結果、ミエリン除去が
欠乏する。このことは、このタンパク質が、（ｉ）オプソニン作用または（ｉｉ
）溶解性膜攻撃複合体（ＭＡＣ）、最終的な溶解性経路複合体に対するカスケー
ドの増殖のいずれかにおいて基本的な役割を有することを示す。Results: As seen in FIG. 5, removal of the C3 component of complement results in a lack of myelin removal. This indicates that the protein is (i) opsonized or (ii)
) Shows that lytic membrane attack complex (MAC) has a fundamental role in any of the cascade proliferation to the ultimate lytic pathway complex.

【０１６８】 例ＩＩＩ：慢性的に傷害を受けたニューロンの再生 材料および方法： １１匹の動物（実験的６匹および対照５匹）に、以下のようにしてＴ１０脊髄
の左側側方ヘミセクションを施した：体重約２００ｇの１０〜１２週齢成体雌ラ
ット(Sprague-Dawley)を、ケタミン／キシラジン（それぞれ６０ｍｇ／ｋｇおよ
び７．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。Ｔ１０における限定された側背の椎弓切除の
後に、左側脊髄ヘミセクション損傷を、微小はさみで作成した。次に、損傷の程
度を、鋭利な小刀を損傷部位を通して３回貫通させることにより、確認した。Example III: Regeneration of Chronicly Injured Neurons Materials and Methods: Eleven animals (6 experimental and 5 controls) were given a left lateral hemisection of the T10 spinal cord as follows. Performed: 10-12 week old adult female rats (Sprague-Dawley) weighing approximately 200 g were anesthetized with ketamine / xylazine (60 mg / kg and 7.5 mg / kg, respectively). After limited dorsal laminectomy at T10, left spinal cord hemisection injury was made with micro scissors. Next, the degree of damage was confirmed by penetrating a sharp knife into the damaged site three times.

【０１６９】 ヘミセクションの１か月後（５匹の動物）または２か月後（６匹の動物）に、
注入カニューレ（１４ｄ浸透圧ポンプに接続した）を、脊髄中に傷害部位から４
〜５ｍｍ（１脊椎セグメント）後方に直接挿入した。カニューレを、椎骨に適用
した歯科用アクリルにより、一定の位置に保持した。次に、筋肉層を、歯科用ア
クリルで縫合し、表面組織および皮膚を閉じた。浸透圧ポンプは、ガラクトセレ
ブロシドに対する補体固定ＩｇＧ抗体（本発明者等自身のポリクローナル抗体ま
たはChemicon Intl. Ltd., ＃ＡＢ１４２，０．２５ｍｇ／ｍｌ）と共にテンジ
クネズミ血清補体（３３％ｖ／ｖ）の連続的脊椎内注入（０．５μｌ／時）を送
達した。One month (5 animals) or 2 months (6 animals) after the hemisection,
An infusion cannula (connected to a 14d osmotic pump) was placed 4 times from the site of injury in the spinal cord.
Inserted directly ５5 mm (one vertebral segment) posterior. The cannula was held in place by dental acrylic applied to the vertebrae. The muscle layers were then sutured with dental acrylic to close the surface tissue and skin. The osmotic pump was supplemented with guinea pig serum complement (33% v / v) together with complement-fixed IgG antibodies against galactocerebroside (our own polyclonal antibody or Chemicon Intl. Ltd., # AB142, 0.25 mg / ml). ) Was delivered (0.5 μl / hr).

【０１７０】 すべての対照動物は、同一のヘミセクション損傷を受け、次に全体のテンジク
ネズミ血清補体（３３％ｖ／ｖ）のみで同一の時間期間浸透圧ポンプにより脊椎
内注入した。All control animals underwent the same hemisection injury and were then injected intravertebralally by osmotic pump with whole guinea pig serum complement alone (33% v / v) for the same period of time.

【０１７１】 次に、動物を、２８日間回復させ、その後、例Ｉに記載したように、フルオロ
金を、吻腰部中に、損傷部位から１ｃｍ（即ち３脊椎セグメント）後方に注入し
た。さらに７日間生存させた後に、各々の動物を屠殺し、脳および脊髄を、例Ｉ
に記載したように実験および分析用に取り出した。The animals were then allowed to recover for 28 days, after which fluorogold was injected into the rostral lumbar 1 cm (ie, 3 vertebral segments) posterior to the injury site as described in Example I. After a further 7 days of survival, each animal was sacrificed and the brain and spinal cord were
Removed for experimentation and analysis as described in.

【０１７２】 ヘミセクション損傷の程度を、５週間の処理および回復期間の両方の終了時に
、組織学的に確認した。すべての外科的手順およびその後の動物ケアプロトコル
は、カナダおよび英国コロンビア大学動物ケア委員会のガイドラインに従った。The extent of hemisection damage was confirmed histologically at the end of both the 5 week treatment and recovery period. All surgical procedures and subsequent animal care protocols were in accordance with the guidelines of the Animal Care Commission of Columbia University of Canada and the United Kingdom.

【０１７３】 結果： ヘミセクション損傷の程度を、すべての動物において評価した。すべての動物
において、前庭脊髄路の領域を切断した。右側白質路は、常に無傷のおよび損傷
を受けないままであり、一方反対側性側の灰白質は通常損傷を受けないままであ
った。Results: The extent of hemisection damage was assessed in all animals. In all animals, the area of the vestibulospinal tract was cut. The right white matter tract always remained intact and undamaged, while the contralateral gray matter usually remained undamaged.

【０１７４】 各々のＬＶｅ内の標識したニューロンの数の「盲目」計数を比較して（図６）
、データは、１か月慢性的に傷害を受けた動物において、傷害を受けた側方前庭
脊髄ニューロンの３１．５％±５％（ｎ＝３）が、フルオロ金を導入および逆行
性的に輸送するのに十分な距離で後方の腰部索中に再生した。対照的に、血清補
体のみを受けた、対照処理した動物は、顕著な量のＬＶｅ標識を示さなかった：
３．６％±２．７％（ｎ＝２）。処理を開始する前に２ヶ月処理を遅延させたこ
れらの動物の中で、２６．８％±１３％（ｎ＝３）の傷害を受けた側方前庭脊髄
ニューロンが、フルオロ金を導入および逆行性的に輸送するのに十分な距離で後
方の腰部索中に再生した。対照的に、血清補体のみを受けた、対照処理した動物
は、顕著な量のＬＶｅ標識を示さなかった：５．４％±１．８％（ｎ＝２）。こ
れらの結果は、本発明の組成物が、哺乳類対象のＣＮＳにおいて慢性的に傷害を
受けたニューロンの再成長、回復および再生を促進するのに有用であることを示
す。Comparing the “blind” counts of the number of labeled neurons in each LVe (FIG. 6)
Data show that in one month chronically injured animals, 31.5% ± 5% (n = 3) of injured lateral vestibular spinal cord neurons introduced fluorogold and retrogradely Regenerated into the posterior lumbar cord long enough to transport. In contrast, control treated animals that received only serum complement did not show significant amounts of LVe labeling:
3.6% 2.7% (n = 2). Among those animals that delayed treatment for 2 months before beginning treatment, 26.8% ± 13% (n = 3) of the injured lateral vestibular spinal cord neurons transduced and retrograde fluorogold. Regenerated in the posterior lumbar cord at a distance sufficient to transport sexually. In contrast, control treated animals that received only serum complement did not show significant amounts of LVe labeling: 5.4% ± 1.8% (n = 2). These results indicate that the compositions of the invention are useful for promoting the regrowth, recovery and regeneration of chronically injured neurons in the CNS of a mammalian subject.

【０１７５】 例ＩＶ：外科的脊椎横断および一時的免疫学的ミエリン崩壊 体重約２００ｇの１０〜１２週齢成体雌ラット(Sprague-Dawley)を、ケタミン
／キシラジン（それぞれ６０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。
Ｔ１０における限定された椎弓切除の後に、左側脊髄ヘミセクション損傷を、微
小はさみで作成し、次に、損傷の程度を、鋭利な小刀を損傷部位を通して貫通さ
せることにより、確認した（図７）。損傷の直後に、脊椎内カニューレを、Ｔ１
１（合計ｎ＝２２）において移植し、アルゼット浸透圧ポンプに接続して（１４
日間）、その後血清補体（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，＃１９１９５−０１５，３３％
ｖ／ｖ）の連続的脊椎内注入（０．５μｌ／時において）を、ガラクトセレブロ
シドに対する補体固定ＩｇＧ抗体（本発明者等自身のポリクローナル抗体または
Chemicon Intl. Ltd., ＃ＡＢ１４２，２５％ｖ／ｖ）と共に送達した。カニュ
ーレを、椎骨に適用した歯科用アクリルにより、一定の位置に保持した。次に、
筋肉層を、歯科用アクリルで縫合し、表面組織および皮膚を閉じた。ヘミセクシ
ョン損傷の程度を、常に、５週間の処理および回復期間の終了時に組織学的に確
認した。Example IV: Surgical Transverse Spine and Transient Immunological Myelin Disruption Adult female rats (Sprague-Dawley) weighing about 200 g were treated with ketamine / xylazine (60 mg / kg and 7.5 mg / kg, respectively). kg).
After limited laminectomy at T10, a left spinal cord hemisection injury was made with micro scissors, and the extent of the injury was confirmed by penetrating a sharp scalpel through the injury site (FIG. 7). . Immediately after injury, the intravertebral cannula is
Implanted at 1 (total n = 22) and connected to an Alzette osmotic pump (14
Days), followed by serum complement (GIBCO BRL, # 19195-015, 33%
v / v) (at 0.5 μl / hr), using complement-fixed IgG antibodies to galactocerebroside (our own polyclonal antibody or
Chemicon Intl. Ltd., # AB142, 25% v / v). The cannula was held in place by dental acrylic applied to the vertebrae. next,
The muscle layers were sutured with dental acrylic to close the surface tissue and skin. The extent of hemisection damage was always checked histologically at the end of the 5 week treatment and recovery period.

【０１７６】 すべての対照動物は、同一のヘミセクション損傷を受け、次に、同一の時間期
間、ビヒクルのみ（０．１Ｍリン酸緩衝生理的食塩水、ＰＢＳ、ｎ＝５）、抗体
のみ（２５％ｖ／ｖ、ｎ＝２）または血清補体のみ（３３％ｖ／ｖ、ｎ＝６）で
、浸透圧ポンプを通して脊椎内注入した。すべての外科的手順およびその後の動
物ケアプロトコルは、カナダおよびＵＢＣ動物ケア委員会のガイドラインに従っ
た。All control animals underwent the same hemisection injury, followed by vehicle only (0.1 M phosphate buffered saline, PBS, n = 5), antibody only (25 % V / v, n = 2) or serum complement alone (33% v / v, n = 6) and injected intravertebrally through an osmotic pump. All surgical procedures and subsequent animal care protocols followed Canadian and UBC Animal Care Commission guidelines.

【０１７７】 電子顕微鏡： 超構造の分析のための組織を、浸透圧ポンプでＧａｌＣ（詳細は上記参照）に
対する補体固定ＩｇＧ抗体と共に血清補体を注入した後７日目に屠殺した、１０
〜１２週齢の成体の雌Sprague-Dawleyラットから得た。動物を、ケタミン／キシ
ラジン（それぞれ１２０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ）で致死的に麻酔し、
次に２００ｍｌの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、次いで１００ｍｌの０．１
Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中の４％グルタルアルデヒドで心臓内灌流し、その後
同一の固定液で一夜後固定した。注入部位および包囲索を、１ｍｍの横断ブロッ
クに切断し、加工して、吻−尾配列で保存した。ブロックを、０．１Ｍカコジル
酸ナトリウム緩衝液で洗浄し（２４時間）、２％ＯｓＯ_４中で後固定し、上昇す
るアルコールを通して脱水し、標準のプロトコルに従ってスプーアの樹脂中に包
埋した。実験および未処理対照動物からの組織ブロックを、平行して加工した。
薄い切片（１μｍ）を、各々のブロックから切断し、アルカリ性トルイジンブル
ーで染色し、光学顕微鏡下で試験した。電子顕微鏡試験のために、ブロックを切
り取り、切片を、８０〜１００ｎｍに切断し、銅格子上に載置し、酢酸ウラニル
およびクエン酸鉛で染色し、ジースＥＭ１０Ｃ電子顕微鏡下で観察した（８０ｋ
Ｖにおいて）。Electron microscopy: Tissues for ultrastructural analysis were sacrificed on day 7 after injection of serum complement with complement-fixed IgG antibodies to GalC (see above for details) by osmotic pump.
Obtained from adult female Sprague-Dawley rats, １２12 weeks of age. Animals were lethally anesthetized with ketamine / xylazine (120 mg / kg and 15 mg / kg, respectively)
Next, 200 ml of 0.1 M PBS (pH 7.4), and then 100 ml of 0.1 M PBS.
Intracardiac perfusion with 4% glutaraldehyde in M PBS (pH 7.3) was followed by overnight fixation with the same fixative. The injection site and surrounding cord were cut into 1 mm transverse blocks, processed and stored in a rostral-tail arrangement. Blocks were washed with 0.1 M sodium cacodylate buffer (24 h), post-fixed in 2% OsO ₄ , dehydrated through rising alcohol, and embedded in spooler resin according to standard protocols. Tissue blocks from experimental and untreated control animals were processed in parallel.
Thin sections (1 μm) were cut from each block, stained with alkaline toluidine blue, and examined under a light microscope. For electron microscopy testing, blocks were cut, sections cut to 80-100 nm, mounted on copper grids, stained with uranyl acetate and lead citrate, and viewed under a Jes EM10C electron microscope (80k
V).

【０１７８】 逆行性ニューロン標識： １．単一標識研究： ヘミセクション損傷の後２８日および従って免疫学的試薬の脊椎内注入の完了
の後１４日において、各々の成体ラットを、ケタミン／キシラジン（それぞれ６
０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。フルオロ金（ＦＧ、合計体
積１００〜１５０ｎｌ、無菌ｄＨ_２Ｏ中で５％ｗ／ｖ；Fluorochrome Inc. Engl
ewood, CO, USA）を、脊椎組織の中央中に両側に、Ｌ１レベルにおいて、損傷部
位の約１ｃｍ後方に注入した（５０〜７５ｎｌ）（図７）。Retrograde neuron labeling: Single label study: At 28 days after hemisection injury and thus 14 days after completion of the intravertebral injection of immunological reagent, each adult rat was treated with ketamine / xylazine (6 each).
0 mg / kg and 7.5 mg / kg). Fluorophlogopite (FG, total volume 100～150Nl, with sterile dH ₂ O in 5% w / v; Fluorochrome Inc. Engl
ewood, CO, USA) were injected bilaterally into the center of spinal tissue, at the L1 level, approximately 1 cm posterior to the injury site (50-75 nl) (FIG. 7).

【０１７９】 ２．二重標識研究： 損傷の時点において、ヘミセクション部位を、１２％（無菌ｄＨ_２Ｏにおいて
ｗ／ｖ）ローダミン共役デキストランアミン（ＲＤＡ、１０，０００ＭＷ、Fluo
roRuby, Molecular Probes）に３０分間浸漬したゲルフォームでパックした。次
にゲルフォームを除去し、残りの外科的手順を完了した（前に概説したように）
。２８日の生存の後、すべての動物を、ケタミン／キシラジン（それぞれ６０ｍ
ｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、ＦＧ（合計体積１００〜１５０ｎ
ｌ、無菌ｄＨ_２Ｏにおいて５％ｗ／ｖ）を、脊椎のＬ１レベルにおいて脊椎実質
中に両側に注射した（５０〜７５ｎｌ）（ｎ＝６）。[0179] 2. Double labeling studies: At the time of the injury, the hemisection site, 12% (in sterile dH ₂ O w / v) rhodamine-conjugated dextran amine (RDA, 10,000 MW, Fluo
roRuby, Molecular Probes) for 30 minutes. The gel foam was then removed and the remaining surgical procedure was completed (as outlined above)
. After 28 days of survival, all animals were treated with ketamine / xylazine (60 m each)
g / kg and 7.5 mg / kg) and an FG (total volume 100-150 n).
l, a 5% w / v) in sterile dH ₂ O, was injected to both sides in the spine substantially at L1 level of the spine (50~75nl) (n = 6) .

【０１８０】 再生の分析： 腰部索中へのＦＧトレーサーの注射の７日後に、動物を、ケタミン／キシラジ
ン（それぞれ１２０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ）で致死的に麻酔し、次に
２００ｍｌの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、次いで１００ｍｌの０．１Ｍ
ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中の４％パラホルムアルデヒドで心臓内灌流した。次に、
脳および脊髄を取り出し、同一の固定液で一夜後固定した。その後、脳および脊
髄各々から、固定液を除去し、組織を一連のスクロース溶液（１５％、次いで２
１％）中に配置することにより、凍結保存した。冠または傍矢状切片を、クリオ
スタットで厚さ２５μｍに切断した。脳幹および脊髄組織切片を、１００Ｗ水銀
球（励起／発光波長：ＦＧ、３６５／４２０ｎｍ；ＲＤＡ、５４６／５９０ｎｍ
；蛍光、４９０／５１５ｎｍにおいて）で、ジースアキシオスコップの下に試験
した。Analysis of regeneration: Seven days after injection of the FG tracer into the lumbar cord, the animals are lethally anesthetized with ketamine / xylazine (120 mg / kg and 15 mg / kg, respectively) and then 200 ml of 0. 1 M PBS (pH 7.4), then 100 ml of 0.1 M
Intracardiac perfusion with 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7.3). next,
The brain and spinal cord were removed and fixed with the same fixative overnight. The fixative was then removed from each of the brain and spinal cord, and the tissue was removed from a series of sucrose solutions (15%, then 2%).
1%). Crown or parasagittal sections were cut with a cryostat to a thickness of 25 μm. Brain stem and spinal cord tissue sections were prepared using 100 W mercury bulb (excitation / emission wavelength: FG, 365/420 nm; RDA, 546/590 nm).
Fluorescence, at 490/515 nm).

【０１８１】 実験的に処理した動物の軸索再生能力を評価するのに用いた２種の脳幹脊椎核
は、赤色核（ＲＮ）（起源はヘミセクションとは反対側性である）および側方前
庭（ＬＶｅ）核（起源はヘミセクションと同側である）であった。各々のＲＮか
らの脊椎突出軸索は、中脳の反対側に横断し、反対側性側背索内に脊髄を通じて
下降する。この反対側性脊椎突出通路は、軸索の２〜５％の可能な例外で、完全
に横を向いた路であることが知られており、これは、同側の経路により索に突出
することができる(WaldronおよびGwyn 1969; Brown, 1974; Huisman et al., 19
81; Shieh et al., 1983)。ＬＶｅ路は、側背橋菱脳から突出しており、脊髄の
脳幹および腹側外側白質を通して排他的な同側経路を維持する(Zemlan et al.,
1979; Shamboul, 1980)。The two brainstem vertebral nuclei used to evaluate the axonal regeneration capacity of experimentally treated animals were the red nucleus (RN) (originated contralateral to the hemisection) and lateral It was the vestibular (LVe) nucleus (origin ipsilateral to the hemisection). Spinal protruding axons from each RN cross the opposite side of the midbrain and descend through the spinal cord into the contralateral dorsal chord. This contralateral spinal protruding passage is known to be a completely lateral tract, with the possible exception of 2-5% of axons, which protrude into the cord by the ipsilateral path. (Waldron and Gwyn 1969; Brown, 1974; Huisman et al., 19
81; Shieh et al., 1983). The LVe tract protrudes from the dorsal bridge, and maintains an exclusive ipsilateral pathway through the brainstem and ventral lateral white matter of the spinal cord (Zemlan et al.,
1979; Shamboul, 1980).

【０１８２】 単一盲目プロトコルを用いて、赤色核（ＲＮ）（ヘミセクションと反対側性）
および側方前庭（ＬＶｅ）核（ヘミセクションと同側）内の逆行性標識したニュ
ーロンの数を、１つおきの組織切片において計数して（これらの脳幹核を通して
）、同一のニューロンを２回計数するのを防止した。核、ニューロン形態（即ち
外見が多極である）を示し、近位のプロセス中にわたるＦＧ（即ち、他の蛍光フ
ィルターを用いて視覚可能でない；上記参照）で特異的に標識した細胞のみを、
陽性に標識した脊椎突出ニューロンであると見なした。次に、各脳幹脊椎突出に
ついての再生ニューロンの百分率を、同一の動物内の反対側性（傷害を受けてい
ない）対照核内の標識したニューロンの数との比較において決定した。Using a single blind protocol, the red nucleus (RN) (contralateral to hemisection)
The number of retrogradely labeled neurons in the lateral vestibular (LVe) nucleus (i.e., ipsilateral to the hemisection) was counted in every other tissue section (through these brainstem nuclei) and the same neuron was duplicated. Prevented counting. Only cells that show nuclear, neuronal morphology (ie, multipolar in appearance) and are specifically labeled with FG (ie, not visible using other fluorescent filters; see above) throughout the proximal process,
Positively labeled spinal protrusion neurons were considered. Next, the percentage of regenerating neurons for each brainstem spine protrusion was determined in comparison to the number of labeled neurons in the contralateral (undamaged) control nucleus in the same animal.

【０１８３】 免疫学的処理の後の脊髄脱髄およびミエリン崩壊の程度 ＰＢＳ中のＧａｌＣ（２５％）に対するポリクローナル抗体との３３％異種（
テンジクネズミ）血清補体の７日にわたる直接脊椎内注入（０．５μｌ／時にお
いて）の結果、注入カニューレからの２ｍｍまでの広範囲の脱髄が生じた（合計
の吻尾距離は、４ｍｍまたは約１脊椎セグメントであった（図２Ａ））。脱髄の
この領域を、崩壊したミエリン（即ち、ほどけた外見を有する広範囲に葉裂した
ミエリン、図２Ｂ）により特徴づけされる、さらに８ｍｍまたは脊髄の２セグメ
ントにより、いずれかの側に結合した。前の研究において示されるように(Keirs
tead et al., 1992, 1995)、異種血清補体のみ、ミエリン特異性抗体のみまたは
ＰＢＳのみの対照注入の結果、カニューレ部位の周囲のすぐ中心にある限定され
た非特異性損傷のみが生じた。脱髄またはミエリン崩壊の包囲領域はなかった（
図２Ｃ）。Degree of spinal cord demyelination and myelin breakdown after immunological treatment 33% heterologous to polyclonal antibody against GalC (25%) in PBS (
(Guinea pig) Direct intravertebral injection (at 0.5 μl / h) of serum complement over 7 days resulted in extensive demyelination up to 2 mm from the injection cannula (total rostral-to-tail distance of 4 mm or about One spine segment (FIG. 2A)). This area of demyelination was bound to either side by an additional 8 mm or two segments of the spinal cord, characterized by collapsed myelin (ie, extensively lobulated myelin with an unfolded appearance, FIG. 2B). . As shown in a previous study (Keirs
tead et al., 1992, 1995), control injections of heterologous serum complement only, myelin-specific antibody only, or PBS only resulted in only limited nonspecific damage centered immediately around the cannula site . There was no surrounding area for demyelination or myelin breakdown (
(FIG. 2C).

【０１８４】 実験的に処理した成体ラットの脊髄内の免疫学的脱髄およびミエリンの崩壊は
、索の全体的断面プロフィルを通じて延在する活性プロセスであった。免疫学的
ミエリン崩壊は、１日以内に開始し、マクロファージまたは内在小膠および多形
核細胞（例えば白血球、例えば好中球、好酸球および好塩基球）の侵襲と関連し
た。多くのマクロファージ／小膠は、ミエリンフラグメントを含み、これらの食
細胞活性を７日以内に完成する（図２Ｄ）。脱髄およびミエリン崩壊のこのパタ
ーンを、血清補体およびミエリン特異性抗体を注入する限り維持することができ
た。最近の証拠は、免疫学的注入が終了した後、再髄鞘形成が、２週間以内に開
始し(KeirsteadおよびBlakemore 1997; Dyer, BourqueおよびSteeves（刊行され
ていない観察）)；新たなミエリンが、分化する希突起膠細胞前駆体から発生す
るが、侵襲性シュヴァン細胞および生存する「成熟した」希突起膠細胞がまた、
再髄鞘形成に寄与し得ることを示唆する。Immunological demyelination and myelin disruption in the spinal cord of experimentally treated adult rats was an active process extending through the overall cross-sectional profile of the cord. Immunological myelin disruption started within one day and was associated with invasion of macrophages or endogenous microglia and polymorphonuclear cells such as leukocytes such as neutrophils, eosinophils and basophils. Many macrophages / microglia contain myelin fragments and complete their phagocytic activity within 7 days (FIG. 2D). This pattern of demyelination and myelin breakdown could be maintained as long as serum complement and myelin-specific antibodies were injected. Recent evidence suggests that after the immunological infusion has ended, remyelination begins within two weeks (Keirstead and Blakemore 1997; Dyer, Bourque and Steeves (unpublished observations)); Invasive Schwann cells arising from differentiating oligodendrocyte precursors, but also surviving "mature" oligodendrocytes also
It suggests that it may contribute to remyelination.

【０１８５】 逆行性トレーサーの選択および注射部位からのこの拡散距離 この研究において、成体ラットのヘミセクションしたおよび免疫学的にミエリ
ン抑制された脊髄内の軸索再生についての主要な解剖学的証拠は、脳幹−脊椎核
の同質の対内の逆行性標識したニューロンの数の間の比較に依存する。これらの
比較を有効にするために、脳幹脊椎核の候補は、すべてのレベルにおいて脊髄の
一方の側に限定された高度に片側性の突出を有しなければならない。図７Ａにま
とめるように、左側胸ヘミセクションは、右側赤色核（ＲＮ）の反対側性に突出
する大型細胞ニューロンを切断したが、左側ＲＮからの突出を、損傷を受けない
ままとした（これらが、胸索の無傷の右側側背索を通して突出するため）。同様
に、左側胸ヘミセクションは、左側側方前庭脊髄核（ＬＶｅ）の同側の突出する
ニューロンを切断したが、右側ＬＶｅ核からの軸索を、損傷を受けないままとし
た（これらがまた、腹側外側白質を介して胸索の無傷の右側を通して突出するた
め）。Selection of retrograde tracer and this diffusion distance from the injection site In this study, the main anatomical evidence for axonal regeneration in the hemisectioned and immunologically myelin-suppressed spinal cord of adult rats was , Depending on the comparison between the number of retrogradely labeled neurons within the homogenous pair of brainstem-spinal nuclei. For these comparisons to be valid, brainstem spinal nucleus candidates must have a highly unilateral protrusion confined to one side of the spinal cord at all levels. As summarized in FIG. 7A, the left thoracic hemisection cut large cell neurons projecting contralaterally to the right red nucleus (RN), but left the protrusion from the left RN intact. But projecting through the intact right dorsal cord of the thorax). Similarly, the left thoracic hemisection cut the ipsilateral protruding neurons of the left lateral vestibular nucleus pulposus (LVe) but left axons from the right LVe nucleus intact. To protrude through the intact right side of the thorax through the ventral lateral white matter).

【０１８６】 逆行性トレーサー（単一標識）を、吻腰部（傷害部位の１ｃｍ後方）中に注入
する場合には、これを、両方の無傷の軸索並びに再生した突出により、起源の細
胞体に戻して導入および輸送しなければならない。従って、逆行性トレーサーが
、すべてでなければほとんどの下行性脊椎突出ニューロンを確実かつ広範囲に標
識することが必須である。同様に重要なパラメーターは、トレーサーを、脊椎傷
害の十分後方の距離で、制御された再現性のある方式で注入して、ヘミセクショ
ン傷害のレベルへのトレーサーのすべての直接的な拡散を防止しなければならな
いことである。これらの条件すべてを最良に満たす逆行性標識は、フルオロ金で
ある(Sahibzada, et al., 1987)。蛍光デキストランアミン、例えばＲＤＡは、
軸索取り込みを容易にするために最近の軸索傷害を必要とし(HeimerおよびZabor
szky, 1989参照)、従って二重標識逆行性トレーシング研究において用いるのに
一層良好に適する（以下の記載参照）。When retrograde tracer (single label) is injected into the rostral lumbar region (1 cm posterior to the site of injury), it is transferred to the cell body of origin by both intact axons as well as regenerated protrusions. Must be returned and introduced and transported. It is therefore essential that the retrograde tracer reliably and extensively labels most, if not all, descending spinal protrusion neurons. An equally important parameter is to inject the tracer in a controlled and reproducible manner at a distance well behind the spinal injury to prevent any direct spread of the tracer to the level of the hemisection injury. That is something that must be done. The retrograde label that best meets all these conditions is fluorogold (Sahibzada, et al., 1987). A fluorescent dextranamine, such as RDA,
Requires recent axonal injury to facilitate axonal uptake (Heimer and Zabor
szky, 1989) and thus are better suited for use in double-label retrograde tracing studies (see description below).

【０１８７】 すべての場合において、フルオロ金標識（１００〜１５０ｎｌ）を、吻腰部索
（ヘミセクション傷害部位に対して１ｃｍまたは２〜３脊椎セグメント後方、図
７）内に両側に注射した。本発明者等は、正常な髄鞘形成した（対照の）動物お
よび実験的に処理したラット（即ち、脱髄およびミエリン崩壊条件下で）の腰部
および胸脊髄内でのフルオロ金の吻尾拡散の時間経過および程度を評価した。実
験的および対照処理した脊髄の無秩序な２５μｍの切片（Ｌ２〜Ｔ８まで延在す
る）を、１００Ｗ水銀ランプの最高の強度設定を用いて蛍光顕微鏡下で試験した
。脊椎組織を、１２時間（ｎ＝６）、２４時間（ｎ＝６）、３日（ｎ＝６）、５
日（ｎ＝６）および７日（ｎ＝２２）を含む、注射後の変化する生存間隔におい
て、フルオロ金拡散の程度について試験した。観察された最大の吻拡散距離は、
４〜６ｍｍ（または１〜１．５脊椎セグメント）であり、２４時間の時間間隔内
に生じた。腰部索内のフルオロ金拡散の程度は、試験したその後の時点にわたり
変化しなかった（図７）。In all cases, fluorogold labeling (100-150 nl) was injected bilaterally into the rostral lumbar cord (1 cm or 2-3 spine segments posterior to hemisection injury site, FIG. 7). We have found that roso-tail diffusion of fluorogold in the lumbar and thoracic spinal cords of normal myelinated (control) animals and experimentally treated rats (ie, under demyelination and myelin disruption conditions). Was evaluated over time and degree. Disordered 25 μm sections of the experimental and control-treated spinal cord (extending from L2 to T8) were examined under a fluorescence microscope using the highest intensity setting of a 100 W mercury lamp. Spinal tissue was subjected to 12 hours (n = 6), 24 hours (n = 6), 3 days (n = 6), 5 hours
The extent of fluorogold diffusion was tested at varying survival intervals after injection, including days (n = 6) and 7 (n = 22). The maximum observed snout diffusion distance is
4-6 mm (or 1-1.5 vertebral segments) and occurred within a 24 hour time interval. The extent of fluorogold diffusion in the lumbar cord did not change over the subsequent time points tested (FIG. 7).

【０１８８】 逆行性ニューロン標識による脳幹脊椎軸索再生についての証拠 要するに、２８匹の動物；実験的１２匹（逆行性単一標識９匹および二重標識
３匹）並びに対照１６匹（逆行性単一標識１３匹および二重標識３匹）に、Ｔ１
０脊髄の左側側方ヘミセクションを施した。ヘミセクションの直後に、注入カニ
ューレ（１４ｄ浸透圧ポンプに接続した）を、脊髄中に、傷害部位に対して４〜
５ｍｍ（１脊椎セグメント）後方に直接挿入した。浸透圧ポンプは、多数の３種
の異なる対照溶液または実験的処理の１つを含んでいた（即ち、それぞれＰＢＳ
ビヒクルのみ、血清補体のみ、抗ガラクトセレブロシド抗体のみまたは抗Ｇａｌ
Ｃ抗体との血清補体）。次に、動物を２８日間回復させ、次にフルオロ金を、吻
腰部中に、損傷部位の１ｃｍ（即ち少なくとも２脊椎セグメント）後方に注射し
た。さらに７日間生存させた後、各々の動物を屠殺し、脳および脊髄を、実験お
よび分析用に取り出した（標識したニューロンを決定するために用いた基準につ
いて前記参照）。Evidence for Brainstem Spinal Axon Regeneration by Retrograde Neuron Labeling Briefly, 28 animals; 12 experimental (9 retrograde single-labeled and 3 double-labeled) and 16 controls (retrograde single-labeled). T1 (13 single label and 3 double label)
A left hemisection of the 0 spinal cord was applied. Immediately after the hemisection, an infusion cannula (connected to a 14d osmotic pump) was placed in the spinal cord 4 to 5 minutes into the injury site.
It was inserted directly behind 5 mm (one vertebral segment). The osmotic pump contained one of a number of three different control solutions or experimental treatments (ie, PBS each
Vehicle only, serum complement only, anti-galactocerebroside antibody only or anti-Gal
Serum complement with C antibody). The animals were then allowed to recover for 28 days and then fluorogold was injected into the rostral lumbar 1 cm posterior to the site of injury (ie, at least two vertebral segments). After an additional 7 days of survival, each animal was sacrificed and the brain and spinal cord were removed for experimentation and analysis (see above for the criteria used to determine labeled neurons).

【０１８９】 ヘミセクション損傷の程度を、各動物において評価した。１匹の実験的および
１匹の対照処理した動物を除くすべてにおいて、左側胸脊髄をヘミセクションし
た（図７）。最も重要なことに、赤核脊髄路の領域（側背索）および側方前庭脊
髄路（腹側外側索）を切断した。右側白質路は、常に無傷および損傷を受けない
ままであり、通常傷害を受けていない側の灰白質もまた、損傷を受けなかった。The extent of hemisection damage was assessed in each animal. In all but one experimental and one control-treated animal, the left thoracic spinal cord was hemisectioned (FIG. 7). Most importantly, the area of the red nucleus spinal tract (lateral dorsal cord) and the lateral vestibular spinal tract (ventral lateral cord) were cut. The right white matter tract remained always intact and undamaged, and the gray matter on the normally uninjured side was also undamaged.

【０１９０】 前に討議したように、逆行性標識（脊髄ヘミセクションおよび免疫学的ミエリ
ン抑制の後）の証拠について試験した２対の脳幹−脊椎核は、ＲＮおよびＬＶｅ
であった。これらの脳幹−脊椎核を、胸および腰部索内のこれらの片側性突出パ
ターンについて選択し、傷害を受けた核内の逆行性標識と傷害を受けていない反
対側性相同体との比較を実施するのを可能にした。各ＲＮ（図３Ａ〜Ｂ）内の標
識したニューロンの数の「盲目の」計数を比較して、データは、傷害を受けた大
型細胞ＲＮニューロンの３１．８％±４．７％（ｎ＝８、範囲１０〜５０％）が
、フルオロ金を導入し、逆行性的に輸送するのに十分な距離で尾部の腰部索中に
再生したことを示した（図９）。対照的に、ＰＢＳビヒクルのみ、ＧａｌＣ抗体
のみまたは血清補体のみのいずれかを受けた、対照処理した動物は、ＲＮ標識の
顕著な量を示さなかった：１．４９％±０．２３％（図３Ｃ〜Ｄ；図９、ｎ＝１
３、範囲０〜３）。傷害を受けた右側ＲＮ核内のいくつかのニューロンの標識は
、中脳の反対側に突出しない少数のＲＮを示し、同側の（傷害を受けていない）
索内に下降し得る(Shieh et al., 1983)。細胞の逆行性標識は、ＲＮの小細胞性
領域内で観察されなかった。As previously discussed, two pairs of brainstem-spinal nuclei tested for evidence of retrograde labeling (after spinal cord hemisection and immunological myelin suppression) showed that RN and LVe
Met. These brainstem-vertebral nuclei were selected for their unilateral protrusion pattern in the thoracic and lumbar cords and a comparison was made between retrograde markers in the injured nucleus and uninjured contralateral homologues. Made it possible to do so. Comparing the “blind” counts of the number of labeled neurons within each RN (FIGS. 3A-B), the data show that 31.8% ± 4.7% of injured large cell RN neurons (n = 8, range 10-50%) showed that the fluorogold was introduced and regenerated in the tail lumbar cord at a distance sufficient for retrograde transport (FIG. 9). In contrast, control treated animals that received either PBS vehicle only, GalC antibody only, or serum complement only showed no significant amount of RN labeling: 1.49% ± 0.23% ( 3C-D; FIG. 9, n = 1
3, range 0-3). Labeling of some neurons in the injured right RN nucleus indicates a small number of RNs that do not project to the other side of the midbrain, and the ipsilateral (undamaged)
It can descend into the cord (Shieh et al., 1983). Retrograde labeling of the cells was not observed in the small cellular area of the RN.

【０１９１】 ＬＶｅニューロンを再生する逆行性標識もまた観察されたが、脊髄ミエリンの
実験的脱髄および崩壊の後のみであった（図８）。８匹の実験的動物において、
傷害を受けていない反対側性対照核と比較したＬＶｅ標識の再生の平均の百分率
は、４１．８％±３．１％（ｎ＝８、範囲３３〜４９％）であった。対照的に処
理した動物（上記参照）において、ＬＶｅ標識の百分率は、２．２４％±０．５
５％であった（図５、ｎ＝１３、範囲０〜６）。Retrograde labeling that regenerates LVe neurons was also observed, but only after experimental demyelination and disruption of spinal cord myelin (FIG. 8). In eight experimental animals,
The average percentage of regeneration of the LVe label compared to the uninjured contralateral control nucleus was 41.8% ± 3.1% (n = 8, range 33-49%). In animals treated in contrast (see above), the percentage of LVe label was 2.24% ± 0.5.
5% (FIG. 5, n = 13, range 0-6).

【０１９２】 また、傷害を受けた、およびミエリン抑制された赤核脊髄路の二重逆行性標識
を、定性的に評価した（図９ＥおよびＦ）。多数のＲＤＡ陽性（第１の標識）大
型細胞ＲＮニューロンが、胸脊髄に対するヘミセクション傷害の時間における損
傷部位の直接の標識の後に観察された。脊椎内ミエリン抑制および損傷部位の後
方のフルオロ金のその後の注射（詳細については上記参照）の後、ＦＧ陽性ニュ
ーロンの小さい重複集団が観察された（即ち、いくつかのニューロンは、ＲＤＡ
およびＦＧの両方で標識された）。専ら第１のまたは第２のトレーサーにより標
識された細胞はまた、分析したすべての脳幹において存在した。Also, double retrograde labeling of injured and myelin-suppressed erythrospinal tract was assessed qualitatively (FIGS. 9E and F). Numerous RDA-positive (first labeled) large cell RN neurons were observed following direct labeling of the injury site at the time of hemisection injury to the thoracic spinal cord. After intravertebral myelin suppression and subsequent injection of fluorogold behind the site of injury (see above for details), a small overlapping population of FG-positive neurons was observed (i.e., some neurons had RDA
And FG). Cells exclusively labeled by the first or second tracer were also present in all brain stems analyzed.

【０１９３】 実験的処理の後の５週間の回復期間の間のすべての機能的または挙動の差異に
ついての試験は、傷害を受けた動物と傷害を受けていない対照動物との間のロコ
モーターパターンにおいて、記録可能な差異を示さなかった（即ち、すべての動
物は移動し、すべての動物は基礎的な反射機能に関して同等であった）。これら
は、ヘミセクション傷害の後に脊椎内に注入した処理（例えば、ＰＢＳのみ、Ｇ
ａｌＣ抗体のみ、血清補体のみまたは血清補体とＧａｌＣ抗体）にかかわらず生
じた。従って、微妙な差異は、観察または定量するのが極めて困難であり、「総
計の」移動パターンは、実質的に同一であった。Testing for all functional or behavioral differences during the 5-week recovery period after experimental treatment revealed the locomotor pattern between injured and uninjured control animals. Did not show any recordable differences (ie, all animals moved and all animals were equivalent with respect to basal reflex function). These are treatments injected into the spine following hemisection injury (eg, PBS only, G
It occurred irrespective of alC antibody alone, serum complement alone or serum complement and GalC antibody). Thus, subtle differences were extremely difficult to observe or quantify, and the "gross" migration patterns were virtually identical.

【０１９４】 脊椎横断を用いる従来技術(Keirstead et al., 1992, 1995)と比較して、本発
明は、各々の動物をそれ自体の内部対照とするように、ヘミセクションモデルを
用いて例証された（即ち、傷害を受けた脳幹脊椎突出からの軸索再生を、傷害を
受けていない反対側性の相同体と容易に比較することができる）。さらに、本発
明は、しばしは一層大きい脊椎損傷と共に生じる嚢腔形成の程度および必要な比
較的長い回復期間にわたる動物不快の量を最小にするように努めた。As compared to the prior art using transvertebral transection (Keirstead et al., 1992, 1995), the present invention is illustrated using the hemisection model so that each animal serves as its own internal control. (Ie, axon regeneration from injured brainstem spinal protrusions can be easily compared to uninjured contralateral homologues). Further, the present invention sought to minimize the degree of sac formation that often accompanies greater spinal injury and the amount of animal discomfort over the relatively long recovery period required.

【０１９５】 本発明はまた、血清補体およびミエリン特異性抗体（例えばＧａｌＣ）の脊椎
内注入により生じた脱髄が、注入部位のいずれかの側において、さらに２セグメ
ント延在するミエリン崩壊と共に、索の１〜２セグメントにわたり迅速かつ活性
な脱髄を生じたことを例示する。滞留する小膠および／または侵襲性マクロファ
ージは、ミエリン残骸を含むことが観察された。胸ヘミセクションを包囲する脊
髄ミエリンの免疫学的抑制は、２つの片側性に突出する脳幹−脊椎経路、赤核脊
髄および側方の前庭脊髄（それぞれＲＮおよびＬＶｅ）路により、顕著な軸索再
生を容易にした。対照処理した動物（ヘミセクション傷害およびＰＢＳのみ、Ｇ
ａｌＣ抗体のみまたは血清補体のみの局所的脊椎内注入）は、傷害を受けたＲＮ
およびＬＶｅ内の逆行性標識をほとんどまたは全く示さなかった。The present invention also provides that demyelination resulting from intravertebral injection of serum complement and myelin-specific antibodies (eg, GalC), along with myelin disruption extending two additional segments on either side of the injection site, FIG. 7 illustrates that rapid and active demyelination occurred over one or two segments of the cord. Retaining microglia and / or invasive macrophages were observed to contain myelin debris. Immunosuppression of spinal cord myelin surrounding the breast hemisection is marked by axonal regeneration by two unilaterally projecting brainstem-spinal pathways, the red nucleus spinal cord and the lateral vestibular spinal cord (RN and LVe, respectively) tracts Made it easier. Control-treated animals (Hemisection injury and PBS only, G
Local intraspinal injection of only alC antibody or serum complement alone)
And showed little or no retrograde labeling in LVe.

【０１９６】 例Ｖ：免疫学的脱髄に対する単一補体タンパク質の除去の効果 組成物中の種々の補体タンパク質の相対的必要性を例示するために、本発明者
等は、特定の補体タンパク質（例えばＣ３、Ｃ４、Ｃ６および因子Ｂ）が欠乏し
た血清注入の効果を評価した。本発明者等は、脊椎処理組織を、透過型電子顕微
鏡を用いて超構造的に、および間接的免疫蛍光により表現型的に評価した。Example V: Effect of the removal of a single complement protein on immunological demyelination In order to illustrate the relative need for various complement proteins in the composition, the inventors The effect of serum infusion deficient in body proteins (eg, C3, C4, C6 and factor B) was evaluated. We evaluated spinal processed tissue ultrastructurally using transmission electron microscopy and phenotypically by indirect immunofluorescence.

【０１９７】 材料および方法： 外科的脊椎横断および一時的な免疫学的ミエリン崩壊： 体重約２００ｇの１０〜１２週齢成体雌ラット(Sprague-Dawley)を、ケタミン
／キシラジン（それぞれ６０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。
限定された側背の椎弓切除を、Ｔ１０において実施し、アルゼット浸透圧ポンプ
に接続して（１４日）、その後ガラクトセレブロシドに対する補体固定ＩｇＧ抗
体（本発明者等自身のポリクローナル抗体またはChemicon Intl. Ltd., ＃ＡＢ
１４２，２５％ｖ／ｖ）と共に、欠乏血清補体（Sigma S8788、３３％ｖ／ｖ）
の連続的脊椎内注入（０．５μｌ／時において）を送達した。カニューレを、椎
骨に適用した歯科用アクリルにより、一定の位置に保持した。次に、筋肉層を、
歯科用アクリルで縫合し、表面組織および皮膚を閉じた。Materials and Methods: Surgical Transverse Spine and Transient Immunological Myelin Disruption: Adult female rats (Sprague-Dawley), weighing approximately 200 g, were treated with ketamine / xylazine (60 mg / kg and 7 mg, respectively). (0.5 mg / kg).
Limited dorsal laminectomy was performed at T10, connected to an Alzette osmotic pump (14 days), and then complement-fixed IgG antibodies to galactocerebroside (our own polyclonal or Chemicon Intl. . Ltd., #AB
Deficient serum complement (Sigma S8788, 33% v / v) along with 142, 25% v / v)
Was delivered (at 0.5 μl / hr). The cannula was held in place by dental acrylic applied to the vertebrae. Next, the muscle layer
Suture was made with dental acrylic and the surface tissue and skin were closed.

【０１９８】 すべての対照動物に、浸透圧ポンプにより、同一の時間期間、ガラクトセレブ
ロシドに対する補体固定ＩｇＧ抗体（本発明者等自身のポリクローナル抗体また
はChemicon Intl. Ltd., ＃ＡＢ１４２，２５％ｖ／ｖ）と共に、全体のヒト血
清補体（Sigma S1764、３３％ｖ／ｖ）を脊椎内に注入した。すべての外科的手
順およびその後の動物ケアプロトコルは、カナダおよび英国コロンビア大学動物
ケア委員会のガイドラインに従った。 電子顕微鏡を、例Ｉに記載したように実施した。All control animals were given an osmotic pump for the same time period, complement-fixed IgG antibodies against galactocerebroside (our own polyclonal antibodies or Chemicon Intl. Ltd., # AB142, 25% v / Along with v), whole human serum complement (Sigma S1764, 33% v / v) was injected into the spine. All surgical procedures and subsequent animal care protocols were in accordance with the guidelines of the Animal Care Commission of Columbia University of Canada and the United Kingdom. Electron microscopy was performed as described in Example I.

【０１９９】 結果： 結果を、図１２および１３に例証する。 古典的および代替的経路の両方に共通するＣ３タンパク質（図１１参照）また
はＣ４タンパク質、即ち古典的経路のタンパク質の除去により、正常なミエリン
が観察された。因子Ｂ、即ち代替的経路タンパク質における血清欠乏を用いて、
脱髄が観察された；さらに、ミエリン残骸を含む多数のマクロファージが、これ
らの領域中に存在した。これらの結果は、古典的血清補体経路が、この免疫学的
プロトコルにおいて基本的な役割を有することを示唆する。Ｃ６、即ち膜攻撃複
合体タンパク質の除去により、露出した軸索の比較的広範囲でない斑状の分布が
、再び、多くのマクロファージを伴って観察され、いくらかの脱髄が、補体誘導
アナフィラトキシンおよび膜受容体を伴うマクロファージ媒介事象により生じ得
ることを示唆する。Results: The results are illustrated in FIGS. Removal of the C3 protein (see FIG. 11) or C4 protein, a protein of the classical pathway, which is common to both the classical and alternative pathways, resulted in normal myelin being observed. Using serum deficiency in factor B, an alternative pathway protein,
Demyelination was observed; moreover, numerous macrophages, including myelin debris, were present in these areas. These results suggest that the classical serum complement pathway has a fundamental role in this immunological protocol. With the removal of C6, a membrane attack complex protein, a relatively less extensive patchy distribution of exposed axons was again observed with many macrophages, and some demyelination was observed with complement-induced anaphylatoxins and membranes. Suggests that macrophage-mediated events involving the receptor can result.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】図１（Ａ）は、クレシルバイオレットで染色したＴ１０左側ヘミセ
クション損傷のレベルにおける成体ラットの脊髄の横断面の顕微鏡写真である。
図１（Ｂ）は、処理した対照および免疫学的に崩壊したヘミセクションした脊髄
における視覚可能なフルオロ金拡散の評価を示すグラフである。FIG. 1A is a photomicrograph of a cross section of the adult rat spinal cord at the level of T10 left hemisection injury stained with cresyl violet.
FIG. 1 (B) is a graph showing the assessment of visible fluorogold diffusion in treated controls and immunologically disrupted hemisectioned spinal cord.

【図２】図２（Ａ）〜（Ｄ）は、７日間の免疫学的試薬の連続的脊椎内注入
の後の側背索を通しての横断面の電子顕微鏡写真を示す。2 (A)-(D) show electron micrographs of cross sections through the dorsal dorsal chord after 7 days of continuous intraspinal injection of immunological reagents.

【図３】図３（Ａ）〜（Ｇ）は、左側胸ヘミセクションおよびその後の免疫
学的ミエリン抑制処理の後の赤核脊髄ニューロンの再生の例示を示す。FIGS. 3 (A)-(G) show an illustration of the regeneration of red nucleus spinal cord neurons after left breast hemisection and subsequent immunological myelin suppression treatment.

【図４】胸の傷害および免疫学的処理の後の赤核脊髄ニューロンの再生の相
対的定量的評価を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the relative quantitative assessment of nucleus spinal cord neuron regeneration following breast injury and immunological treatment.

【図５】図５（Ａ）〜（Ｃ）は、免疫学的脱髄に対する単一の補体タンパク
質の除去の効果を例証する電子顕微鏡写真である。FIGS. 5 (A)-(C) are electron micrographs illustrating the effect of removing a single complement protein on immunological demyelination.

【図６】胸の傷害および遅延された免疫学的処理の後の側方の前庭脊髄ニュ
ーロンの再生の相対的定量的評価を示すグラフである。FIG. 6 is a graph showing the relative quantitative assessment of lateral vestibular spinal cord neuron regeneration following chest injury and delayed immunological treatment.

【図７】図７Ａ）は、ラット中枢神経系の背図を示す。図７Ｂ）は、下方の
胸および吻腰部脊髄索を通しての傍矢状セクションの複合顕微鏡写真である。図
７Ｃ）は、クレシルバイオレットで染色したＴ１０左側ヘミセクション損傷のレ
ベルにおける脊髄の横断面の顕微鏡写真である。図７ＤおよびＥ）は、損傷およ
びポンプ移植部位内の血球に関連する非特異的蛍光であり、それぞれ、損傷およ
びカニューレ移植に関連する損傷の程度を示す。FIG. 7A) shows a dorsal view of the rat central nervous system. FIG. 7B) is a composite micrograph of a parasagittal section through the lower thoracic and rostral lumbar spinal cords. FIG. 7C) is a micrograph of a cross section of the spinal cord at the level of T10 left hemisection injury stained with cresyl violet. FIGS. 7D and E) are non-specific fluorescence associated with blood cells within the site of injury and pump implantation, indicating the extent of injury and injury associated with cannula implantation, respectively.

【図８】図８（Ａ）〜（Ｅ）は、左側胸ヘミセクションおよびその後の免疫
学的ミエリン抑制処理の後の、側方前庭脊髄ニューロンの再生を示す。FIGS. 8 (A)-(E) show regeneration of lateral vestibular spinal cord neurons after left chest hemisection and subsequent immunological myelin suppression treatment.

【図９】胸の傷害および免疫学的処理の後の赤核脊髄および側方前庭脊髄ニ
ューロンの再生の相対的定量的評価を示すグラフである。FIG. 9 is a graph showing the relative quantitative assessment of nucleus spinal cord and lateral vestibular spinal cord neuron regeneration following chest injury and immunological treatment.

【図１０】慢性側方ヘミセクションおよび遅延された免疫学的処理の後の下
行性脳幹脊椎軸索の再生の定量的評価を示すグラフである。FIG. 10 is a graph showing the quantitative assessment of the regeneration of descending brainstem vertebral axons after chronic lateral hemisection and delayed immunological treatment.

【図１１】免疫学的脱髄に伴う古典的および代替の経路に伴うと知られてい
る因子を示す図である。FIG. 11 shows factors known to be involved in classical and alternative pathways associated with immunological demyelination.

【図１２】図１２（Ａ）〜（Ｅ）は、免疫学的脱髄に対する組成物からの単
一の補体タンパク質の除去の効果を示す電子顕微鏡写真である。FIGS. 12 (A)-(E) are electron micrographs showing the effect of removing a single complement protein from a composition on immunological demyelination.

【図１３】免疫学的脱髄に対する組成物からの単一の補体タンパク質Ｃ５の
除去の効果を示す電子顕微鏡写真である。FIG. 13 is an electron micrograph showing the effect of removing a single complement protein C5 from a composition on immunological demyelination.

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment

【提出日】平成１３年７月４日（２００１．７．４）[Submission date] July 4, 2001 (2001.7.4)

【手続補正１】[Procedure amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【特許請求の範囲】[Claims]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/28 Ａ６１Ｋ 37/02 43/00 １０５ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スティーブズ，ジョン ディー． カナダ国 ブリティッシュ コロンビア ブイ６ティー １ゼット４、バンクーバ ー、ユニバーシティー ブルバード 6270、アナトミー アンド サージェリ ー、ズーロジー、デパートメンツ、コード (72)発明者 ダイアー，ジェーソン ケー． カナダ国 ブリティッシュ コロンビア ブイ６ティー １ゼット４、バンクーバ ー、ユニバーシティー ブルバード 6270、アナトミー アンド サージェリ ー、ズーロジー、デパートメンツ、コード (72)発明者 キーステッド，ハンス エス． アメリカ合衆国 カリフォルニア州92697、 アーヴィン、ジレスピー ニューロサイエ ンス リサーチ ファシリティー 2111、 ユニバーシティー オブ カリフォルニア アット アーヴィン、リーブ−アーヴィ ン リサーチ センター (72)発明者 ブルク，ジェーソン カナダ国 ブリティッシュ コロンビア ブイ５エー ２ティー７、バーナビー、カ ーディナル ドライブ 3355 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA44 CA18 CA36 DB52 MA02 NA14 ZA02 ZA16 ZB21 4C085 AA13 AA14 BB41 BB43 CC13 CC21 CC23 EE03 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 25/28 A61K 37/02 43/00 105 37/24 (81) Designated country EP (AT, BE, CH) , CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN) , GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, (KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ , LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Steves, John Dee. Canada British Columbia Buoy 6 Tea 1 Set 4, Vancouver, University Boulevard 6270, Anatomy and Surgery, Zoology, Departments, Code (72) Inventor Dyer, Jason K. Canadian British Columbia Buoy 6 Tea 1 Set 4, Vancouver, University Boulevard 6270, Anatomy and Surgery, Zoology, Departments, Code (72) Inventor Keisted, Hans S.S. United States 92497, California, Irvine, Gillespie Neuroscience Research Facility 2111, University of California at Irvine, Leave-Irvine Research Center (72) Inventor Burg, Jason British Columbia Buoy 5A 2tee 7, Burnaby, Canada Cardinal drive 3355 F term (reference) 4C084 AA02 BA44 CA18 CA36 DB52 MA02 NA14 ZA02 ZA16 ZB21 4C085 AA13 AA14 BB41 BB43 CC13 CC21 CC23 EE03

Claims (27)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 治療的に有効な量で以下のもの： （ａ）ミエリンのエピトープと特異的に結合する、１種または２種以上の補体固
定抗体またはそのフラグメント；および （ｂ）１種または２種以上の補体タンパク質またはそのフラグメント を含み、ここで、該抗体のミエリンへの結合が、ミエリンの一時的崩壊および／
または一時的脱髄を生じる組成物。1. A therapeutically effective amount of: (a) one or more complement-fixing antibodies or fragments thereof that specifically bind to an epitope of myelin; and (b) one Or two or more complement proteins or fragments thereof, wherein the binding of the antibody to myelin is associated with the transient breakdown of myelin and / or
Or a composition that causes temporary demyelination. 【請求項２】 組成物が、さらに、１種または２種以上の成長因子を含む、
請求項１に記載の組成物。2. The composition further comprises one or more growth factors.
The composition according to claim 1. 【請求項３】 抗体がモノクローナルおよび／またはポリクローナルである
、請求項１に記載の組成物。3. The composition according to claim 1, wherein the antibody is monoclonal and / or polyclonal. 【請求項４】 いくつかの抗体が標識されている、請求項１に記載の組成物
。4. The composition of claim 1, wherein some antibodies are labeled. 【請求項５】 抗体が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラ
グメントからなる群から選択される免疫反応性フラグメントである、請求項１に
記載の組成物。5. The composition according to claim 1, wherein the antibody is an immunoreactive fragment selected from the group consisting of Fv, Fab, Fab ′ or F (ab ′) 2 fragment. 【請求項６】 Ｆｖフラグメントの可変部が、ジスルフィド結合により、ま
たはペプチドリンカーにより結合されている、請求項５に記載の組成物。6. The composition according to claim 5, wherein the variable regions of the Fv fragment are connected by a disulfide bond or by a peptide linker. 【請求項７】 ミエリンのエピトープが、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ
）、Ｏ４、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン関連糖タン
パク質（ＭＡＧ）、ＮＯＧＯ、ＮＩ２２０、ＮＩ−３５／２５０またはアレチン
を含む列挙から選択されるミエリン鞘エピトープである、請求項１に記載の組成
物。7. The method according to claim 7, wherein the epitope of myelin is galactocerebroside (GalC).
), O4, myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), myelin-associated glycoprotein (MAG), NOGO, NI220, NI-35 / 250, or a myelin sheath epitope selected from the list comprising aretin. A composition according to claim 1. 【請求項８】 補体タンパク質またはそのフラグメントが、Ｃ３成分または
フラグメント、変種、類似体またはこの化学的誘導体を含む、請求項１に記載の
組成物。8. The composition of claim 1, wherein the complement protein or fragment thereof comprises a C3 component or fragment, variant, analog or chemical derivative thereof. 【請求項９】 補体タンパク質またはそのフラグメントが、これが投与され
る種とは異なる種から誘導されている、請求項１に記載の組成物。9. The composition of claim 1, wherein the complement protein or a fragment thereof is derived from a species different from the species to which it is administered. 【請求項１０】 補体タンパク質またはそのフラグメントが、抗体成分とは
物理的に別個の成分である、請求項１に記載の組成物。10. The composition of claim 1, wherein the complement protein or a fragment thereof is a physically separate component from the antibody component. 【請求項１１】 補体タンパク質またはそのフラグメントが、抗体成分に直
接共有または非共有で付着して、ミエリンの表面への該抗体の結合が内生免疫系
攻撃を誘発するようにした、請求項１に記載の組成物。11. The complement protein or a fragment thereof is attached directly or covalently to an antibody component such that binding of the antibody to the surface of myelin elicits an endogenous immune system attack. The composition of claim 1. 【請求項１２】 さらに、成長因子および神経栄養因子を含む、請求項１に
記載の組成物。12. The composition of claim 1, further comprising a growth factor and a neurotrophic factor. 【請求項１３】 ニューロトロフィンがＮＴ−３である、請求項１２に記載
の組成物。13. The composition according to claim 12, wherein the neurotrophin is NT-3. 【請求項１４】 ニューロトロフィンがＦＧＦ−１である、請求項１２に記
載の組成物。14. The composition according to claim 12, wherein the neurotrophin is FGF-1. 【請求項１５】 さらに生理学的に許容し得る担体を含む、請求項１に記載
の医薬組成物。15. The pharmaceutical composition according to claim 1, further comprising a physiologically acceptable carrier. 【請求項１６】 一時的に崩壊させ、および／または一時的に脱髄して、対
象におけるニューロン回復および／または再生を促進するための、請求項１に記
載の組成物の使用。16. Use of a composition according to claim 1 for temporarily disrupting and / or temporarily demyelinating to promote neuronal recovery and / or regeneration in a subject. 【請求項１７】 対象が哺乳類である、請求項１６に記載の使用。17. The use according to claim 16, wherein the subject is a mammal. 【請求項１８】 対象がヒトである、請求項１７に記載の使用。18. The use according to claim 17, wherein the subject is a human. 【請求項１９】 対象が、ニューロン機能障害によるニューロン回復および
／または再生を必要としている、請求項１８に記載の使用。19. The use according to claim 18, wherein the subject is in need of neuronal recovery and / or regeneration due to neuronal dysfunction. 【請求項２０】 ニューロン機能障害が、ＣＮＳへの傷害または外傷により
生じる、請求項１９に記載の使用。20. The use according to claim 19, wherein the neuronal dysfunction results from injury or trauma to the CNS. 【請求項２１】 傷害が脊髄傷害である、請求項１９に記載の使用。21. The use according to claim 19, wherein the injury is a spinal cord injury. 【請求項２２】 ニューロン機能障害が、疾患により生じる、請求項１９に
記載の使用。22. The use according to claim 19, wherein the neuronal dysfunction is caused by a disease. 【請求項２３】 疾患が、アルツハイマー病およびパーキンソン病からなる
群から選択される、請求項２２に記載の使用。23. The use according to claim 22, wherein the disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease and Parkinson's disease. 【請求項２４】 機能障害が慢性である、請求項２０または２２のいずれか
に記載の使用。24. The use according to claim 20, wherein the dysfunction is chronic. 【請求項２５】 移植された細胞の成長を可能にする哺乳類ＣＮＳ内の環境
を生じるための、請求項１に記載の組成物の使用。25. Use of a composition according to claim 1 to create an environment within the mammalian CNS that allows for the growth of transplanted cells. 【請求項２６】 ミエリンのエピトープに特異的に結合し、標識されて、請
求項１に記載の組成物の使用を検出および監視することを可能にする、１種また
は２種以上の補体固定抗体またはそのフラグメントの使用。26. One or more complement fixation, which specifically binds to an epitope of myelin and is labeled, allowing the use of the composition according to claim 1 to be detected and monitored. Use of antibodies or fragments thereof. 【請求項２７】 請求項１に記載の組成物を含むキット。27. A kit comprising the composition of claim 1.