JP2002541832A - Galectin 11 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、新規ガレクチンに関する。より詳細には、ヒトガレクチン１１をコードする、単離された核酸分子を提供する。ガレクチン１１ポリペプチドはまた、ベクター、宿主細胞、それらを産生する組換え方法、およびガレクチン１１ポリペプチドに対する抗体と同様に提供される。本発明はさらに、ガレクチン１１活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。自己免疫疾患、癌および炎症性疾患を含む細胞増殖障害を検出するための診断方法および細胞増殖障害の治療方法もまた提供される。 (57) [Summary] The present invention relates to novel galectins. More particularly, an isolated nucleic acid molecule encoding human galectin 11 is provided. Galectin-11 polypeptides are also provided, as are vectors, host cells, recombinant methods of producing them, and antibodies to galectin-11 polypeptides. The invention further relates to screening methods for identifying agonists and antagonists of galectin 11 activity. Also provided are diagnostic methods for detecting cell proliferative disorders, including autoimmune diseases, cancer and inflammatory diseases, and methods of treating cell proliferative disorders.
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新規ガレクチンに関する。より詳細には、ヒトガレクチン１１をコ
ードする、単離された核酸分子を提供する。ガレクチン１１ポリペプチドはまた
、ベクター、宿主細胞、それらを産生する組換え方法、およびガレクチン１１ポ
リペプチドに対する抗体と同様に提供される。本発明はさらに、ガレクチン１１
活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に
関する。自己免疫疾患、癌および炎症性疾患を含む細胞増殖障害を検出するため
の診断方法および細胞増殖障害の治療方法もまた提供される。[0001] The present invention relates to novel galectins. More specifically, an isolated nucleic acid molecule encoding human galectin 11 is provided. Galectin-11 polypeptides are also provided, as are vectors, host cells, recombinant methods of producing them, and antibodies to galectin-11 polypeptides. The present invention further provides galectin 11
Screening methods for identifying agonists and antagonists of activity. Also provided are diagnostic methods for detecting cell proliferative disorders, including autoimmune diseases, cancer and inflammatory diseases, and methods of treating cell proliferative disorders.
【０００２】 （発明の背景） レクチンは、特定の糖質構造に結合し、それ故、特定の糖結合体を認識し得る
タンパク質である。Ｂａｒｏｎｄｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３
３）：２０８０７〜２０８１０（１９９４）。ガレクチンは、関連するアミノ酸
配列を有するβ−ガラクトシド結合レクチンのファミリーのメンバーである（総
説については、Ｂａｒｏｎｄｅｓら、Ｃｅｌｌ ７６：５９７〜５９８（１９９
４）；Ｂａｒｏｎｄｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（３３）２０８０
７〜２０８１０（１９９４）を参照のこと）。β−ガラクトシド糖を含む糖タン
パク質の多くは、細胞により産生されるが、ごくわずかが公知のガレクチンとイ
ンビトロで結合する。このような明らかな結合特異性は、ガレクチンについての
高度に特異的な機能的役割を示唆する。BACKGROUND OF THE INVENTION Lectins are proteins that bind to specific carbohydrate structures and therefore can recognize specific glycoconjugates. Barondes et al. Biol. Chem. 269 (3
3): 20807-20810 (1994). Galectins are members of a family of β-galactoside binding lectins with related amino acid sequences (for a review, see Barondes et al., Cell 76: 597-598 (199).
4); Barondes et al. Biol. Chem. 269 (33) 2080
7-20810 (1994)). Many glycoproteins, including β-galactoside sugars, are produced by cells, but only a few bind in vitro to known galectins. Such apparent binding specificity suggests a highly specific functional role for galectin.
【０００３】 ガレクチン１（レクチン、ガラクトシド結合可溶性−１、について従来はＬＧ
ＡＬＳ１と呼ばれるが、これはまた、Ｌ−１４−１、Ｌ−１４、ＲＬ−１４．５
、ガラプチン、ＭＧＢＰ、ＧＢＰ、ＢＨＬ、ＣＨＡ、ＨＢＰ、ＨＰＬ、ＨＬＢＰ
１４、ｒＩＭＬ−１としてもまた公知である）は、分子量１４，５００ダルト
ンのサブユニットを有するホモダイマーである。ガレクチン１は、平滑筋および
骨格筋において豊富に発現され、そしてより少ない程度で多くの他の細胞型にお
いて発現される（Ｃｏｕｒａｕｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３１
０〜１３１６（１９８９））。ガレクチン１は、ラミニン、高度にポリラクトサ
ミン化された細胞性糖タンパク質、および高度にポリラクトサミン化されたリソ
ソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）に、特異的に結合すると考えられている。
ガレクチン１はまた、嗅覚のニューロン上で見出されるラクトサミン含有糖脂質
、および骨格筋細胞上のインテグリンａ7ｂ1と特異的に結合することが示されて
いる。[0003] Galectin 1 (lectin, galactoside-bound soluble-1) has been conventionally known as LG
Called ALS1, this is also referred to as L-14-1, L-14, RL-14.5.
, Galactin, MGBP, GBP, BHL, CHA, HBP, HPL, HLBP
14, also known as rIML-1) is a homodimer with a subunit of molecular weight 14,500 daltons. Galectin 1 is abundantly expressed in smooth and skeletal muscle and to a lesser extent in many other cell types (Couraud et al., J. Biol. Chem. 264: 131).
0-1316 (1989)). Galectin 1 is thought to specifically bind laminin, highly polylactosamined cellular glycoproteins, and highly polylactosamined lysosomal binding membrane protein (LAMP).
Galectin 1 also lactosamine containing glycolipids found on neurons olfactory, and that specifically binds to integrin a 7 b 1 on skeletal muscle cells are shown.
【０００４】 ガレクチンファミリーの他のメンバーもまた、報告されている。ガレクチン２
は、肝細胞癌中に元々見出され、そして分子量１４，６５０ダルトンのサブユニ
ットを有するホモダイマーである（Ｇｉｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
７：１０６０１〜１０６０６（１９９２））。ガレクチン３（Ｍａｃ−２、ＥＰ
Ｂ、ＣＢＰ−３５、ＣＢＰ−３０およびＬ−２９としても公知）は、活性化マク
ロファージおよび上皮細胞中で豊富であり、そして２６，３２０〜３０，３００
ダルトンの間の見かけの分子量を有するモノマーである（Ｃｈｅｒａｙｉｌら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：７３２４〜７３２６（
１９９０））。ガレクチン３は、ラミニン、免疫グロブリンＥおよびそのレセプ
ター、ならびに細菌性リポポリサッカライドに特異的に結合することが認められ
ている。ガレクチン４は、３６，３００ダルトンの分子量を有し、そして単一の
ポリペプチド鎖内で２つの糖質結合ドメインを含む（Ｏｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６８：５９２９〜５９３９（１９９３））。ガレクチン５および６
は、Ｂａｒｏｎｄｅｓら、Ｃｅｌｌ ７６：５９７〜５９８（１９９４）におい
て議論される。ヒトガレクチン７は、１５，０７３ダルトンの分子量を有し、そ
して主に重層扁平上皮において見出される（Ｍａｄｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７０（１１）：５８２３〜５８２９（１９９５））。[0004] Other members of the galectin family have also been reported. Galectin 2
Is a homodimer originally found in hepatocellular carcinoma and having a subunit of molecular weight 14,650 daltons (Gitt et al., J. Biol. Chem. 26).
7: 10601 to 10606 (1992)). Galectin 3 (Mac-2, EP
B, also known as CBP-35, CBP-30 and L-29) are abundant in activated macrophages and epithelial cells, and 26,320-30,300
Is a monomer with an apparent molecular weight between daltons (Cheryil et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7324-7326 (
1990)). Galectin 3 has been found to specifically bind laminin, immunoglobulin E and its receptors, and bacterial lipopolysaccharide. Galectin 4 has a molecular weight of 36,300 daltons and contains two carbohydrate binding domains within a single polypeptide chain (Oda et al., J. Biol.
Chem. 268: 5929-5939 (1993)). Galectins 5 and 6
Are discussed in Barondes et al., Cell 76: 597-598 (1994). Human galectin 7 has a molecular weight of 15,073 daltons and is found primarily in stratified squamous epithelium (Madsen et al., J. Biol. C
hem. 270 (11): 5823-5829 (1995)).
【０００５】 動物のレクチンは、概して、しばしば細胞間および細胞−マトリクス間の相互
作用の調節の際に機能する。ガレクチン１は、それが存在する細胞型に依存して
、細胞接着を促進するかまたは阻害するかのいずれかであることが示されている
。ガレクチン１は、おそらくラミニン−インテグリンａ7ｂ1相互作用のガレクチ
ン１が媒介する崩壊により、骨格筋における細胞−マトリクス相互作用を阻害す
る（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５：１４３７〜１４４８（
１９９１））。いくつかの非骨格筋細胞型において、ガレクチン１は、おそらく
細胞表面と基質糖結合体との架橋により、細胞−マトリクスの接着を促進する（
Ｚｈｏｕら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３００：６〜１７（１９
９３）；Ｓｋｒｉｎｃｏｓｋｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２６６７〜２
６７５（１９９３））。[0005] Animal lectins generally function in regulating cell-cell and cell-matrix interactions often. Galectin 1 has been shown to either promote or inhibit cell adhesion, depending on the cell type in which it resides. Galectin 1, probably laminin - by decay galectin 1 mediated integrin a 7 b 1 interaction, cells in skeletal muscle - inhibiting matrix interaction (Cooper et al., J.Cell.Biol.115: 1437~1448 (
1991)). In some non-skeletal muscle cell types, galectin 1 promotes cell-matrix adhesion, presumably by cross-linking the cell surface with the substrate glycoconjugate (
Zhou et al., Arch. Bioch. Biophys. 300: 6-17 (19
93); Skrincosky et al., Cancer Res. 53: 2667-2
675 (1993)).
【０００６】 ガレクチン１はまた、細胞増殖（Ｗｅｌｌｓら、Ｃｅｌｌ ６４：９１〜９７
（１９９１））およびいくつかの免疫機能（Ｏｆｆｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉ
ｍｍｕｎｏｌ．２８：１７７〜１８４（１９９０））の調節に関与する。ガレク
チン１は、マクロファージからの腫瘍壊死因子の放出を誘導する（Ｋａｊｉｋａ
ｗａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３９：１１７７〜１１８１（１９８６））。ガレク
チン１はまた、実験的重症筋無力症、および実験的自己免疫脳脊髄炎についての
動物モデルにおいて、自己免疫疾患に対する治療活性を有することが実証されて
いる（それぞれ、Ｌｅｖｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５００〜５
０７（１９８３）；およびＯｆｆｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２
８：１７７〜１８５（１９９０））。さらに、ガレクチン１は、Ｔ細胞のアポト
ーシスを媒介することによって免疫応答を調節することが示されている（Ｐｅｒ
ｉｌｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３７８：７３６〜７３９（１９９５））。[0006] Galectin 1 is also involved in cell proliferation (Wells et al., Cell 64: 91-97).
(1991)) and some immune functions (Offner et al., J. Neuroi).
mmunol. 28: 177-184 (1990)). Galectin 1 induces the release of tumor necrosis factor from macrophages (Kajika
wa et al., Life Sci. 39: 1177-1181 (1986)). Galectin 1 has also been demonstrated to have therapeutic activity against autoimmune diseases in animal models for experimental myasthenia gravis and experimental autoimmune encephalomyelitis (Levi et al., Eur. J., respectively). Immunol.13: 500-5
07 (1983); and Offner et al. Neuroimmunol. 2
8: 177-185 (1990)). Furthermore, galectin 1 has been shown to modulate the immune response by mediating T cell apoptosis (Per
Illo et al., Nature 378: 736-739 (1995)).
【０００７】 ガレクチン３は、制限的培養条件下で培養される細胞の増殖を促進する（Ｙａ
ｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：６７３７〜６
７４２（１９９６年６月））。細胞中のガレクチン３の発現は、アポトーシスに
対する耐性を付与し、これはガレクチン３がアポトーシスの共通経路に干渉する
細胞死サプレッサーであり得ることを示す。同書。ガレクチン３はまた、細胞接
着の調節において、ならびにＩｇＥおよびＩｇＥレセプターを架橋することによ
る特定の免疫細胞の活性化において機能することが観察されている。[0007] Galectin 3 promotes the growth of cells cultured under restrictive culture conditions (Ya
ng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6737-6
742 (June 1996)). Expression of galectin 3 in cells confers resistance to apoptosis, indicating that galectin 3 may be a cell death suppressor that interferes with a common pathway of apoptosis. Ibid. Galectin 3 has also been observed to function in regulating cell adhesion and in activating certain immune cells by cross-linking IgE and IgE receptors.
【０００８】 近年、ＨＯＭ−ＨＤ−２１と称するガレクチン様抗原が、ホジキン病ｃＤＮＡ
ライブラリーにおいて高度に発現されることが見出され、そしてＰＣＴＡ−１と
称する別のガレクチンが、ヒト前立腺癌細胞株および患者由来の癌腫上で特異的
な細胞表面マーカーとして同定された。In recent years, a galectin-like antigen called HOM-HD-21 has been identified as a Hodgkin's disease cDNA
Another galectin, found to be highly expressed in the library and designated PCTA-1, was identified as a specific cell surface marker on human prostate cancer cell lines and carcinomas from patients.
【０００９】 従って、ガレクチンは、免疫細胞活性の調節、ならびに細胞接着、増殖、炎症
、自己免疫、および腫瘍細胞の転移のような多様な過程に関与することが観察さ
れている。従って、免疫応答、炎症性疾患および癌を調節するための治療および
診断の開発において有用なツールとして作用し得る新規ガレクチンの同定につい
て、当該分野における必要性が存在する。Thus, galectins have been observed to be involved in the regulation of immune cell activity and in various processes such as cell adhesion, proliferation, inflammation, autoimmunity, and tumor cell metastasis. Thus, there is a need in the art for the identification of novel galectins that can serve as useful tools in the development of therapeutics and diagnostics for modulating immune responses, inflammatory diseases and cancer.
【００１０】 （発明の要旨） 本発明は、図１に示されるアミノ酸配列（配列番号２）、ＡＴＣＣ受託番号第
２０９０５３号として、１９９７年５月１６日に細菌宿主において寄託されたｃ
ＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列、ならびにそれらのフラグメン
ト、改変体、誘導体およびアナログを有するガレクチン１１ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを含む、あるいはこれらからなる単離された核酸分子を
提供する。(Summary of the Invention) The present invention relates to the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), ATCC Accession No. 209053, deposited on May 16, 1997 in a bacterial host.
Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising or consisting of a polynucleotide encoding a galectin-11 polypeptide having an amino acid sequence encoded by a DNA clone, and fragments, variants, derivatives and analogs thereof.
【００１１】 本発明はまた、図６に示されるアミノ酸配列（配列番号１４）を有するガレク
チン１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書中でときおり「
ガレクチン１１α」といわれる）、ならびにそれらのフラグメント、改変体、誘
導体およびアナログを含む単離された核酸分子を提供する。The present invention also provides a polynucleotide encoding a galectin-11 polypeptide having the amino acid sequence shown in FIG. 6 (SEQ ID NO: 14) (sometimes referred to herein as “
Galectin 11α), and fragments, variants, derivatives and analogs thereof.
【００１２】 本発明はまた、図６および８に示されるアミノ酸配列（配列番号１６）を有す
るガレクチン１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書中でと
きおり「ガレクチン１１β」といわれる）、ならびにそれらのフラグメント、改
変体、誘導体およびアナログを含む単離された核酸分子を提供する。The present invention also relates to polynucleotides encoding galectin-11 polypeptides having the amino acid sequence shown in FIGS. 6 and 8 (SEQ ID NO: 16) (sometimes referred to herein as “galectin-11β”), and Isolated nucleic acid molecules comprising fragments, variants, derivatives and analogs of
【００１３】 図１のガレクチン１１（配列番号１および２）、図６のガレクチン１１α（配
列番号２４および２５）、図６〜８のガレクチン１１β（配列番号２６および２
７）は、しばしば、本明細書中で、例えば、まとめて「ガレクチン１１」といわ
れる。Galectin 11 in FIG. 1 (SEQ ID NOS: 1 and 2), galectin 11α in FIG. 6 (SEQ ID NOs: 24 and 25), galectin 11β in FIGS.
7) is often referred to herein, for example, collectively as "galectin 11".
【００１４】 図１のガレクチン１１ポリヌクレオチド（配列番号１）、図６のガレクチン１
１αポリヌクレオチド（配列番号２４）および図７のガレクチン１１βポリヌク
レオチド（配列番号２６）は、しばしば、本明細書中で、例えば、まとめて「ガ
レクチン１１ポリヌクレオチド」といわれる。The galectin 11 polynucleotide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and the galectin 1 of FIG.
The 1α polynucleotide (SEQ ID NO: 24) and the galectin-11β polynucleotide of FIG. 7 (SEQ ID NO: 26) are often referred to herein, for example, collectively as “galectin-11 polynucleotide”.
【００１５】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにそのようなベクターおよび宿主細胞
の作製方法、ならびに組換え技法によるガレクチン１１ポリペプチドの産生のた
めのそれらの使用方法に関する。The present invention also relates to recombinant vectors containing the isolated nucleic acid molecules of the present invention, and host cells containing the recombinant vectors, methods of making such vectors and host cells, and recombinant techniques. To their use for the production of galectin-11 polypeptides.
【００１６】 本発明はさらに、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによりコードされ
るアミノ酸配列を有する単離されたガレクチン１１ポリペプチド（配列番号２の
ガレクチン１１ならびにガレクチン１１αおよびβを含む）、およびこれらのポ
リペプチドを結合する抗体を提供する。図１のガレクチン１１ポリペプチド（配
列番号２）、図６のガレクチン１１αポリペプチド（配列番号２５）、図７のガ
レクチン１１βポリペプチド（配列番号２７）は、しばしば、本明細書中で、例
えば、まとめて「ガレクチン１１ポリペプチド」といわれる。The present invention further provides an isolated galectin-11 polypeptide having an amino acid sequence encoded by a polynucleotide described herein, including galectin 11 of SEQ ID NO: 2 and galectins 11α and β. And antibodies that bind these polypeptides. The galectin 11 polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), the galectin 11α polypeptide of FIG. 6 (SEQ ID NO: 25), and the galectin 11β polypeptide of FIG. 7 (SEQ ID NO: 27) are often referred to herein as, for example, Collectively referred to as "galectin 11 polypeptide".
【００１７】 本発明はまた、ガレクチン１１により誘導される細胞性応答（例えば、アポト
ーシス）を増強または阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を
提供する。一般に、これらの方法は、ガレクチン１１、候補化合物、およびガレ
クチン１１リガンドを発現する細胞を接触させる工程、そのリガンドとガレクチ
ン１１との結合により生じる細胞性応答をアッセイする工程、そして標準（ガレ
クチン１１とガレクチン１１リガンドとの接触が候補化合物の非存在下でなされ
る場合にアッセイされた標準）とこの細胞性応答を比較する工程を包含し、これ
らによって、標準に対して増大した細胞性応答は、その化合物がアゴニストであ
ることを示し、そして標準に対して減少した細胞性応答は、その化合物がアンタ
ゴニストであることを示す。The present invention also provides a screening method for identifying a compound capable of enhancing or inhibiting a cellular response (eg, apoptosis) induced by galectin-11. In general, these methods involve contacting cells expressing galectin 11, a candidate compound, and a galectin 11 ligand, assaying the cellular response resulting from binding of the ligand to galectin 11, and a standard (galectin 11 and galectin 11). A standard assayed when contact with a galectin-11 ligand is made in the absence of the candidate compound) and the cellular response increased against the standard. A decreased cellular response to the standard indicates that the compound is an agonist, and indicates that the compound is an antagonist.
【００１８】 別の局面において、アゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニン
グアッセイが提供される。このアッセイは、β−ガラクトシド糖に結合するガレ
クチン１１に対して候補化合物が有する効果を決定する工程を含む。詳細には、
この方法は、β−ガラクトシド糖をガレクチン１１ポリペプチドおよび候補化合
物と接触させる工程、ならびにβ−ガラクトシド糖に結合するガレクチン１１が
、候補化合物の存在に起因して増大するか、または減少するか否かを決定する工
程を包含する。[0018] In another aspect, screening assays for agonists and antagonists are provided. This assay involves determining the effect of the candidate compound on galectin 11 binding to β-galactoside sugar. For details,
The method comprises contacting a β-galactoside sugar with a galectin 11 polypeptide and a candidate compound, and determining whether galectin 11 binding to the β-galactoside sugar increases or decreases due to the presence of the candidate compound. Deciding whether or not it is.
【００１９】 本発明はまた、ガレクチン１１の高められた、減少した、または他の様式で異
常な発現と関連する障害の診断の間に有用な診断方法を提供する。[0019] The present invention also provides diagnostic methods useful during the diagnosis of disorders associated with increased, decreased, or otherwise abnormal expression of galectin-11.
【００２０】 本発明はさらに、身体中のガレクチン１１活性のレベルを増大させる必要のあ
る個体を処置するための方法を提供し、この方法は、治療有効量の、本発明の単
離されたガレクチン１１ポリペプチド、フラグメント、改変体、誘導体もしくは
アナログ、またはそれらのアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する
工程を包含する。The present invention further provides a method for treating an individual in need of increasing the level of galectin-11 activity in the body, comprising a therapeutically effective amount of an isolated galectin of the present invention. Administering a composition comprising 11 polypeptides, fragments, variants, derivatives or analogs, or agonists thereof, to such individuals.
【００２１】 別の実施形態において、本発明は、身体中のガレクチン１１活性のレベルを減
少させる必要のある個体を処置するための方法を提供し、この方法は、治療有効
量の、本発明のガレクチン１１フラグメント、改変体、誘導体、アナログもしく
は抗体、またはガレクチン１１アンタゴニストを含む組成物をそのような個体に
投与する工程を包含する。[0021] In another embodiment, the present invention provides a method for treating an individual in need of reducing the level of galectin-11 activity in the body, the method comprising a therapeutically effective amount of a subject of the present invention. Administering to such an individual a composition comprising a galectin-11 fragment, variant, derivative, analog or antibody, or a galectin-11 antagonist.
【００２２】 （詳細な説明） 本発明は、図１に示されるアミノ酸配列（配列番号２）、図６に示されるアミ
ノ酸配列（配列番号２５）、図６および８に示されるアミノ酸配列（配列番号２
７）を有するガレクチン１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
、単離された核酸分子を提供し、これらのアミノ酸配列は、クローニングされた
ｃＤＮＡを配列決定することによって決定された。図１に示されるヌクレオチド
配列（配列番号１）は、ＨＪＡＣＥ５４プラスミドを配列決定することにより得
られた。このプラスミドは、１９９７年５月１６日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａに寄託され、
受託番号２０９０５３を受けた。本発明のガレクチン１１ポリペプチドは、ラッ
トガレクチン５、ニワトリガレクチン３、およびヒトガレクチン８の遺伝子産物
（例えば、図２；配列番号３〜４を参照のこと）と配列相同性を共有する。(Detailed Description) The present invention relates to the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), the amino acid sequence shown in FIG. 6 (SEQ ID NO: 25), and the amino acid sequence shown in FIGS. 2
An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding a galectin-11 polypeptide having 7) is provided, the amino acid sequence of which was determined by sequencing the cloned cDNA. The nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) was obtained by sequencing the HJACE54 plasmid. This plasmid was purchased by American Ty on May 16, 1997.
pe Culture Collection, 10801 Universi
ty Boulevard, Manassas, Virginia,
Accession number 209053 was received. The galectin 11 polypeptides of the present invention share sequence homology with rat galectin 5, chick trigger lectin 3, and human galectin 8 gene products (see, eg, FIG. 2; see SEQ ID NOs: 3-4).
【００２３】 本発明はさらに、ガレクチン１１ポリヌクレオチドのフラグメント、改変体、
誘導体およびアナログ、ならびにそれらによりコードされるポリペプチド、なら
びにこれらのポリペプチドに結合する抗体を提供する。[0023] The present invention further provides fragments, variants,
Derivatives and analogs, and polypeptides encoded by them, and antibodies that bind to these polypeptides are provided.
【００２４】 （定義） 以下の定義が、本明細書中で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にする
ために提供される。Definitions The following definitions are provided to facilitate understanding of certain terms used frequently herein.
【００２５】 「機能的活性」または「生物学的活性」とは、ガレクチン１１のポリペプチド
、フラグメント、誘導体、改変体、およびアナログであって、ガレクチン１１ポ
リペプチドの活性に類似の（しかし、この活性と同一である必要はない）活性を
示す（用量依存性に拘わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるよう
に、成熟形態が挙げられる）。用量依存性が存在する場合、ガレクチン１１ポリ
ペプチドの用量依存性に同一である必要はなく、むしろガレクチン１１ポリペプ
チドと比較して、所定の活性において用量依存性に実質的に類似であることが必
要である（すなわち、候補ポリペプチドが、ガレクチン１１ポリペプチドに対し
て、約２５分の１以下の活性、好ましくは約１０分の１以下の活性、そして最も
好ましくは約３分の１以下の活性を示す）。このような機能的活性としては、以
下が挙げられるが、これらに限定されない：生物学的活性（例えば、β−ガラク
トシド糖に結合する能力、トリプシン処理したウサギ赤血球を凝集させる能力お
よび／またはアポトーシスを誘導する能力）、抗原性（ガレクチン１１ポリペプ
チドと結合する能力、または抗ガレクチン１１抗体への結合についてガレクチン
１１ポリペプチドと競合する能力）、免疫原性（ガレクチン１１ポリペプチドに
結合する抗体を生成する能力）、本発明のガレクチン１１ポリペプチドとダイマ
ーを形成する能力、ならびに他のガレクチン、および／またはガレクチン１１の
レセプターもしくはガレクチン１１のリガンドに結合する能力。ガレクチン１１
の機能的活性または生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドの相補鎖もまた、本発明により包含
される。“Functional activity” or “biological activity” refers to polypeptides, fragments, derivatives, variants and analogs of galectin 11 that are similar (but not identical) to the activity of galectin 11 polypeptide. (Needs to be the same as the activity) (including the mature form as determined in a particular biological assay, regardless of dose dependence). If there is a dose dependence, it need not be the same as the galectin-11 polypeptide, but rather be substantially similar to the galectin-11 polypeptide in a given activity as compared to the galectin-11 polypeptide. Required (i.e., the candidate polypeptide has less than about 25 times less activity, preferably less than about 10 times less activity, and most preferably less than about 1/3 less galactin 11 polypeptide). Activity). Such functional activities include, but are not limited to: biological activity, such as the ability to bind to β-galactoside sugars, the ability to aggregate trypsinized rabbit erythrocytes and / or apoptosis. Ability to induce), antigenicity (ability to bind to galectin-11 polypeptide, or ability to compete with galectin-11 polypeptide for binding to anti-galectin-11 antibody), immunogenicity (to produce antibodies that bind to galectin-11 polypeptide) Ability to form dimers with the galectin-11 polypeptides of the invention, and to bind to other galectins and / or galectin-11 receptors or galectin-11 ligands. Galectin 11
Polynucleotides encoding polypeptides having the functional or biological activity of, as well as the complementary strands of these polynucleotides, are also encompassed by the present invention.
【００２６】 「ポリヌクレオチド」とは、一般的に、任意のポリヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドをいい、これは、未改変のＲＮＡまたはＤＮＡであって
も、あるいは改変されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチ
ド」としては、限定ではないが、以下が挙げられる：一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖
ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二
本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡと
ＲＮＡを含むハイブリッド分子（このＤＮＡとＲＮＡは、一本鎖であっても、ま
たはより代表的には二本鎖であっても、あるいは一本鎖領域と二本鎖領域の混合
物であってもよい）。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡ
あるいはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。用語ポリヌクレオチド
とはまた、１つ以上の改変された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに安定
性のためかまたは他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡ
を含む。「改変された」塩基とは、例えば、トリチル化された塩基、およびイノ
シンのような通常でない塩基を含む。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対し
てなされている；従って、「ポリヌクレオチド」とは、代表的には事実上見出さ
れる、化学的、酵素学的または代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、な
らびにウイルスおよび細胞に特徴的な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含す
る。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短いポリヌクレオチド（しばしばオリ
ゴヌクレオチドと呼ばれる）を包含する。“Polynucleotide” generally refers to any polynucleotide or polydeoxyribonucleotide, whether unmodified RNA or DNA or modified RNA or DNA. Good. "Polynucleotides" include, but are not limited to: single-stranded and double-stranded DNA, DNA that is a mixture of single- and double-stranded regions, single-stranded RNA and double-stranded RNA, as well as RNA, a mixture of single-stranded and double-stranded regions, a hybrid molecule comprising DNA and RNA, wherein the DNA and RNA may be single-stranded or more typically double-stranded. Or a mixture of a single-stranded region and a double-stranded region). Further, “polynucleotide” refers to RNA or DNA
Alternatively, it refers to a triple-stranded region containing both RNA and DNA. The term polynucleotide also refers to DNA or RNA comprising one or more modified bases, as well as DNA or RNA having backbones modified for stability or for other reasons
including. "Modified" bases include, for example, tritylated bases and unusual bases such as inosine. Various modifications have been made to DNA and RNA; thus, a "polynucleotide" is a chemically, enzymatically or metabolically modified form of a polynucleotide typically found in nature And chemical forms of DNA and RNA characteristic of viruses and cells. "Polynucleotide" also embraces relatively short polynucleotides (often called oligonucleotides).
【００２７】 「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合（すなわ
ち、ペプチド同配体）により互いが結合された２つ以上のアミノ酸を含む、任意
のペプチドまたはタンパク質をいう。「ポリペプチド」とは、短い鎖（一般的に
ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる）とより長い鎖（一般に
タンパク質と呼ばれる）の両方をいう。ポリペプチドは、２０個の遺伝子コード
アミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポリペプチド」は、天然のプロセス（例
えば、翻訳後プロセシング）または当該分野で周知の化学的改変技術のいずれか
によって改変されたアミノ酸配列を含む。このような改変は、基本書およびより
詳細な研究論文、ならびに多量の研究文献に十分記載されている。改変は、ポリ
ペプチドのどの部分でも（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端または
カルボキシ末端を含む）生じ得る。同じ型の改変が、所定のガレクチン１１ポリ
ペプチド中のいくつかの部位で、同じ程度または種々の程度で存在し得ることが
理解される。また、所定のガレクチン１１ポリペプチドは、多くの型の改変を含
み得る。ガレクチン１１ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝し得、
そして分枝してかまたは分枝せずに環状であり得る。環状の分枝型ポリペプチド
および分枝型の環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセスから生じ得るか、
または合成法によって作製され得る。改変としては、以下が挙げられる：アセチ
ル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部
分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または
脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙ
ｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メ
チル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、
ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化
、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング
、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏ
ｎ）、硫酸化、タンパク質への転移ＲＮＡ媒介性アミノ酸付加（例えば、アルギ
ニル化）、およびユビキチン化（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲ
Ｅ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃ
ｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９３、ならびにＷｏｌｄ，Ｆ．、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉ
ｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉ
ｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、１〜１２頁、ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴ
ＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥ
ＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏ
ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）ならびにＲａｔｔａ
ｎら「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
ａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ」、Ａｎｎ ＮＹ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８〜６２を参照のこと）。“Polypeptide” refers to any peptide or protein comprising two or more amino acids joined to each other by peptide bonds or modified peptide bonds (ie, peptide isosteres). "Polypeptide" refers to both short chains (commonly referred to as peptides, oligopeptides or oligomers) and longer chains (commonly referred to as proteins). Polypeptides may contain amino acids other than the 20 genetically encoded amino acids. "Polypeptides" include amino acid sequences that have been modified by either natural processes (eg, post-translational processing) or by chemical modification techniques well known in the art. Such modifications are well described in basic books and more detailed monographs, as well as in a large body of research literature. Modifications can occur in any portion of the polypeptide, including the peptide backbone, amino acid side chains and the amino or carboxy terminus. It is understood that the same type of modification may be present at the same or varying degrees at several sites in a given galectin-11 polypeptide. Also, a given galectin-11 polypeptide may contain many types of modifications. Galectin-11 polypeptides can branch as a result of ubiquitination,
And may be cyclic, branched or unbranched. Cyclic branched polypeptides and branched cyclic polypeptides can result from post-translation natural processes,
Or they can be made by synthetic methods. Modifications include: acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, covalent attachment of flavin, covalent attachment of a heme moiety, covalent attachment of nucleotides or nucleotide derivatives, covalent attachment of lipids or lipid derivatives, Phosphatidylinositol (phosphotidy)
linositol) covalent bond, crosslink, cyclization, disulfide bond formation, demethylation, formation of covalent crosslinks, formation of cysteine, formation of pyroglutamate,
Formylation, γ-carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, hydroxylation, iodination, methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation (selenoylatio)
n), sulfation, transfer RNA-mediated amino acid addition to proteins (eg, arginylation), and ubiquitination (eg, PROTEINS-STRUCTUR)
E AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd edition, T.E. E. FIG. C
reighton, W.C. H. Freeman and Company, New
York, 1993; , Posttranslati
onal Protein Modifications: Perspecti
ves and Products, pages 1-12, POSTTRANSLAT
IONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTE
INS, B. C. Edited by Johnson, Academic Press, New
York, 1983; Seifter et al., "Analysis for pro.
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factors ", Meth Enzymol (1990) and Ratta
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al Modifications and Aging ", Ann NY A
cad Sci (1992) 663: 48-62).
【００２８】 「改変体」とは、この用語が本明細書中で使用される場合、それぞれ参照ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、ガレクチン１１の機能的活性ま
たは生物学的活性を保持する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポ
リヌクレオチドの代表的改変体は、別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド
配列が異なる。改変体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによ
りコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化してもよいし、または変化し
なくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下に記載のように、参照配列によりコ
ードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸の置換、付加、欠失、融合および短
縮を生じ得る。ポリペプチドの代表的改変体は、別の参照ポリペプチドとは、ア
ミノ酸配列が異なる。一般的には、差異は、参照ポリペプチドとその改変体の配
列が、全体にわたり密接に類似し、そして多くの領域で同一であるように制限さ
れる。改変体ポリペプチドおよび参照ポリペプチドは、任意の組合せの１つ以上
の置換、付加、欠失によって、アミノ酸配列が異なり得る。置換されるアミノ酸
残基または挿入されるアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるもので
あってもよいし、またはそうでなくてもよい。ポリヌクレオチドの改変体または
ポリペプチドの改変体は、対立遺伝子改変体のように天然に存在し得るか、また
は天然に生じることが公知でない改変体であり得る。ポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの天然に存在しない改変体は、変異誘発技術または直接合成によって
作製され得る。A “variant,” as the term is used herein, is different from the reference polynucleotide or polypeptide, respectively, but retains the functional or biological activity of galectin-11. It is a polynucleotide or a polypeptide. Representative variants of a polynucleotide differ in nucleotide sequence from another, reference polynucleotide. Changes in the nucleotide sequence of the variant may or may not change the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the reference polynucleotide. Nucleotide changes may result in amino acid substitutions, additions, deletions, fusions and truncations in the polypeptide encoded by the reference sequence, as described below. Representative variants of a polypeptide differ in amino acid sequence from another, reference polypeptide. Generally, differences are limited so that the sequences of the reference polypeptide and its variants are closely similar throughout and, in many regions, identical. A variant polypeptide and a reference polypeptide may differ in amino acid sequence by one or more substitutions, additions, deletions in any combination. The substituted or inserted amino acid residue may or may not be one encoded by the genetic code. A variant of a polynucleotide or a variant of a polypeptide can be naturally occurring, such as an allelic variant, or can be a variant that is not known to occur naturally. Non-naturally occurring variants of polynucleotides and polypeptides can be made by mutagenesis techniques or by direct synthesis.
【００２９】 本明細書で用いられる場合、「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクロ
ーナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグ
メントを含む。Ｆａｂフラグメントとしては、Ｆａｂ発現ライブラリーの産物ま
たは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含む。As used herein, “antibody” includes polyclonal and monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, and humanized antibodies, and Fab fragments. Fab fragments include the products of a Fab expression library or other immunoglobulin expression libraries.
【００３０】 （核酸分子） 配列番号１として同定されたガレクチン１１ヌクレオチド配列は、寄託された
クローンから得られた部分的に相同な（「重複する」）配列からアセンブルされ
た。重複する配列は、配列番号１として同定された最終的な配列を生じる高重複
性の単一の連続するヌクレオチド配列にアセンブルされた。Galectin 11 nucleotide sequence identified as SEQ ID NO: 1 was assembled from partially homologous ("overlapping") sequences obtained from the deposited clone. The overlapping sequence was assembled into a single highly contiguous nucleotide sequence that resulted in the final sequence identified as SEQ ID NO: 1.
【００３１】 従って、配列番号１および翻訳された配列番号２は十分にに正確であり、そし
て他の状態では、当該分野で周知の種々の使用に適切であり、そして以下にさら
に詳述される。例えば、配列番号１は、配列番号１に含まれる核酸配列または寄
託されたクローンに含まれるｃＤＮＡを検出する核酸ハイブリダイゼーションプ
ローブを設計するために有用である。これらのプローブはまた、生物学的サンプ
ル中で核酸分子にハイブリダイズし、それによって本発明の種々の法医学的方法
および診断方法が可能になる。同様に、配列番号２から同定されたポリペプチド
は、例えば、タンパク質ガレクチン１１に特異的に結合する抗体を生成するため
に使用され得る。Thus, SEQ ID NO: 1 and translated SEQ ID NO: 2 are sufficiently accurate and otherwise suitable for various uses well known in the art, and are described in further detail below. . For example, SEQ ID NO: 1 is useful for designing a nucleic acid hybridization probe that detects the nucleic acid sequence contained in SEQ ID NO: 1 or the cDNA contained in the deposited clone. These probes also hybridize to nucleic acid molecules in a biological sample, thereby enabling the various forensic and diagnostic methods of the present invention. Similarly, the polypeptide identified from SEQ ID NO: 2 can be used, for example, to generate an antibody that specifically binds to the protein galectin-11.
【００３２】 さらに、他に示されなければ、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することに
よって決定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例え
ば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，からのＭｏｄｅｌ ３
７３）を用いて決定され、そして本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によってコ
ードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されたＤ
ＮＡ配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化アプローチによって決
定された任意のＤＮＡ配列について当該分野で公知のように、本明細書中で決定
される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤差を含み得る。自動化によって決
定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド
配列に対して、代表的には少なくとも約９０％同一、より代表的には少なくとも
約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野にお
いて周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってさらに正確に
決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決
定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列
の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチ
ド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、配列決定されるＤＮＡ分子に
よって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。このような差異は、
このような挿入または欠失の点にて始まる。Further, unless otherwise indicated, all nucleotide sequences determined herein by sequencing DNA molecules are from an automated DNA sequencer (eg, from Applied Biosystems, Inc.). Model 3
73), and all amino acid sequences of the polypeptides encoded by the DNA molecules determined herein are determined by D, as determined above.
Inferred by translation of the NA sequence. Thus, as is known in the art for any DNA sequence determined by this automated approach, any nucleotide sequence determined herein may contain some errors. The nucleotide sequence determined by automation is typically at least about 90% identical to the actual nucleotide sequence of the DNA molecule being sequenced, more typically at least about 95% to at least about 99.9%. Are identical. The actual sequence can be more accurately determined by other approaches, including manual DNA sequencing methods well known in the art. As is also known in the art, a single insertion or deletion in the determined nucleotide sequence, as compared to the actual sequence, causes a frameshift in translation of the nucleotide sequence, such that the determined nucleotide sequence The predicted amino acid sequence encoded is completely different from the amino acid sequence actually encoded by the DNA molecule to be sequenced. These differences are
It begins at the point of such an insertion or deletion.
【００３３】 従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列において正確さが必要である適
用については、本発明は、配列番号１として同定される生成されたヌクレオチド
配列および配列番号２として同定された推定翻訳アミノ酸配列のみならず、ＡＴ
ＣＣに寄託されたガレクチン１１のヒトｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡのサン
プルもまた提供する。寄託されたガレクチン１１クローンのヌクレオチド配列は
、公知の方法に従って、寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決
定され得る。次いで、推定ガレクチン１１アミノ酸配列は、このような寄託物か
ら確認され得る。さらに寄託されたクローンによりコードされるタンパク質のア
ミノ酸配列は、ペプチド配列決定または寄託されたヒトガレクチン１１ ｃＤＮ
Ａを含む適切な宿主細胞においてタンパク質を発現し、タンパク質を収集し、そ
してその配列を決定することにより直接決定され得る。Thus, for applications where accuracy is required in the nucleotide or amino acid sequence, the present invention relates only to the generated nucleotide sequence identified as SEQ ID NO: 1 and the deduced translated amino acid sequence identified as SEQ ID NO: 2. Not AT
Also provided is a sample of plasmid DNA containing the human cDNA for galectin 11 deposited with the CC. The nucleotide sequence of the deposited galectin 11 clone can be readily determined by sequencing the deposited clone, according to known methods. The putative galectin-11 amino acid sequence can then be confirmed from such a deposit. In addition, the amino acid sequence of the protein encoded by the deposited clone can be determined by peptide sequencing or the deposited human galectin 11 cDN.
It can be determined directly by expressing the protein in a suitable host cell containing A, collecting the protein, and determining its sequence.
【００３４】 本明細書中に提供される情報、例えば、図１におけるヌクレオチド配列を使用
して、ガレクチン１１ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的ク
ローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを使用
してｃＤＮＡをクローニングする手順）を使用して得られ得る。本発明の実例と
して、図１に記載される核酸分子（配列番号１）は、Ｇ１期のＪｕｒｋａｔ Ｔ
細胞由来のｃＤＮＡライブラリー中に発見された。この遺伝子はまた、ヒト好中
球およびヒト胎児副腎腺から生成されたｃＤＮＡライブラリー中で同定された。
本発明のポリヌクレオチドはまた、当該分野で公知の技術を用いてｍＲＮＡまた
はゲノムＤＮＡのような天然の供給源から獲得され得るか、または当該分野で公
知の技術を用いて化学的に合成され得る。Using the information provided herein, eg, the nucleotide sequence in FIG. 1, a nucleic acid molecule of the invention encoding a galectin-11 polypeptide can be prepared using standard cloning and screening procedures (eg, starting material Procedure for cloning cDNA using mRNA as a primer). As an illustration of the present invention, the nucleic acid molecule set forth in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) is a G1 phase Jurkat T
Found in a cell-derived cDNA library. This gene has also been identified in a cDNA library generated from human neutrophils and human fetal adrenal glands.
Polynucleotides of the invention can also be obtained from natural sources, such as mRNA or genomic DNA, using techniques known in the art, or can be chemically synthesized using techniques known in the art. .
【００３５】 ヒトガレクチン１１遺伝子は、第１１染色体に位置し、そして５つのエキソン
を含む（例えば、図４を参照のこと）。図１のガレクチン１１ ｃＤＮＡのヌク
レオチド配列（配列番号１）は、８６５ヌクレオチド長（ｃＤＮＡのポリＡテー
ルを差し引く８３０ヌクレオチド）であり、１３３アミノ酸残基の推定オープン
リーディングフレームをコードする。図１に示すヌクレオチド配列（配列番号１
）のヌクレオチドの４９〜５１に推定開始コドン（この遺伝子の第２のエキソン
に位置する）が存在する。図１に示されるガレクチン１１タンパク質（配列番号
２）は、ラットガレクチン５、ニワトリガレクチン３、およびヒトガレクチン８
の翻訳産物と相同性を共有する（例えば、図２を参照のこと）。さらに、以下に
さらに考察されるように、ガレクチン１１は、トランスフェクトされたＴ細胞の
アポトーシスを誘導する（例えば、実施例５ならびに図５Ａおよび５Ｂを参照の
こと）。これらの知見は、ガレクチン１１が他の以前に特徴付けられたガレクチ
ンと類似の様式で機能すること、従って、ガレクチン１１が細胞増殖障害、自己
免疫疾患、癌および炎症性疾患の調節において重要であることを示す。The human galectin 11 gene is located on chromosome 11 and contains five exons (see, eg, FIG. 4). The nucleotide sequence of the galectin-11 cDNA of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) is 865 nucleotides long (830 nucleotides minus the polyA tail of the cDNA) and encodes a predicted open reading frame of 133 amino acid residues. The nucleotide sequence shown in FIG.
) Has a putative start codon at nucleotides 49-51 (located in the second exon of this gene). Galectin 11 protein (SEQ ID NO: 2) shown in FIG. 1 comprises rat galectin 5, chick trigger lectin 3, and human galectin 8
(See, eg, FIG. 2). In addition, as further discussed below, galectin 11 induces apoptosis of transfected T cells (see, eg, Example 5 and FIGS. 5A and 5B). These findings indicate that galectin 11 functions in a manner similar to other previously characterized galectins, and therefore that galectin 11 is important in regulating cell proliferation disorders, autoimmune diseases, cancer and inflammatory diseases It indicates that.
【００３６】 図６のガレクチン１１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２４）は、１
３３７ヌクレオチド長である。これは、ガレクチン１１の２つの選択的スプライ
シング形態のうちの１つであり、そしてガレクチン１１αといわれる。他の形態
（ガレクチン１１β）は、７ヌクレオチドのみ喪失していることが異なる（図６
（配列番号２４）に示されるように、ヌクレオチド１３６〜１４２）。図７を参
照のこと。ガレクチン１１βの配列は、配列番号２６として配列表に示される。
これらのスプライシング改変体の得られる翻訳産物は、Ｎ末端のみが異なると考
えられる。ガレクチン１１αおよびβのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２
５および２７として配列表に示される。２つのタンパク質間の差異を、図８で強
調する。The nucleotide sequence of the galectin 11 cDNA of FIG.
It is 337 nucleotides long. It is one of two alternative splicing forms of galectin-11 and is called galectin 11α. Other forms (galectin 11β) differ in that only 7 nucleotides have been lost (FIG. 6).
(Nucleotides 136 to 142, as shown in (SEQ ID NO: 24)). See FIG. The sequence of galectin 11β is shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 26.
The resulting translation products of these splicing variants are likely to differ only at the N-terminus. The amino acid sequences of galectins 11α and β are, respectively, SEQ ID NO: 2
5 and 27 are shown in the sequence listing. The differences between the two proteins are highlighted in FIG.
【００３７】 ガレクチン１１ポリペプチドは、リンカー配列により分離された２つの糖質結
合ドメイン（ＣＡＲＤドメイン）を含む。第１の糖質結合ドメインは、ガレクチ
ン１１α（配列番号２５）の最初の１２１アミノ酸残基およびガレクチン１１β
（配列番号２７）の最初の１４２アミノ酸からなる。第１のＣＡＲＤドメインの
後ろの２９アミノ酸残基は、リンカー配列である。最後に、各タンパク質におけ
る最後の１２５アミノ酸残基は、Ｃ末端ＣＡＲＤドメインである。本発明の好ま
しいポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端いずれかのＣＡＲＤドメインを含む。
このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。[0037] Galectin-11 polypeptide contains two carbohydrate binding domains (CARD domains) separated by a linker sequence. The first carbohydrate binding domain comprises the first 121 amino acid residues of galectin 11α (SEQ ID NO: 25) and galectin 11β
(SEQ ID NO: 27) consists of the first 142 amino acids. The 29 amino acid residues after the first CARD domain are the linker sequence. Finally, the last 125 amino acid residues in each protein are the C-terminal CARD domain. Preferred polypeptides of the invention comprise a CARD domain, either N-terminal or C-terminal.
Polynucleotides encoding such polypeptides are also provided.
【００３８】 対立遺伝子改変体、オルソログ、および／または種ホモログもまた、本発明に
おいて提供される。当該分野で公知の手順を用いて、配列番号１〜２、２４〜２
５、２６〜２７、または寄託されたクローンに対応する遺伝子の全長遺伝子、対
立遺伝子改変体、スプライス改変体、全長コード部分、オルソログ、および／ま
たは種ホモログを、本明細書中に開示される配列からの情報またはＡＴＣＣに寄
託されたクローンを用いて獲得し得る。例えば、対立遺伝子改変体および／また
は種ホモログは、本明細書中に提供された配列から適切なプローブまたはプライ
マーを作製し、そして対立遺伝子改変体および／または所望のホモログについて
の適切な核酸供給源をスクリーニングすることにより単離および同定され得る。[0038] Allelic variants, orthologs, and / or species homologs are also provided herein. SEQ ID NOs: 1-2, 24-2 using procedures known in the art.
5, 26-27, or the full length gene, allelic variant, splice variant, full length coding portion, ortholog, and / or species homolog of the gene corresponding to the deposited clone may be sequenced as disclosed herein. Or the clones deposited with the ATCC. For example, allelic variants and / or species homologs make appropriate probes or primers from the sequences provided herein, and appropriate nucleic acid sources for allelic variants and / or desired homologs Can be isolated and identified by screening.
【００３９】 当業者が認識するように、上記で議論した配列決定誤差の可能性および異なる
公知のタンパク質のプロセシング部位の可変性に起因して、寄託されたｃＤＮＡ
によりコードされる推定ガレクチン１１ポリペプチドは約１３３アミノ酸残基を
含むが、１２５〜１５０アミノ酸の範囲のいずれかであり得る。As the skilled artisan will appreciate, due to the potential for sequencing errors discussed above and the variability in processing sites of different known proteins, the deposited cDNA
The putative galectin-11 polypeptide encoded by contains approximately 133 amino acid residues, but can be anywhere from 125 to 150 amino acids.
【００４０】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えばｍＲＮＡ）で、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより得られるかまたは合成的に生
産される、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮＡは二本
鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても知
られるコード鎖であり得、または相補鎖もしくはアンチセンス鎖とも呼ばれる非
コード鎖であり得る。As indicated, the nucleic acid molecules of the invention may be in the form of RNA (eg, mRNA)
Alternatively, it can be in the form of DNA, including, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning or produced synthetically. The DNA can be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand, also known as the sense strand, or the non-coding strand, also called the complementary or antisense strand.
【００４１】 「単離された」核酸分子とは、そのネイティブな環境（例えば、核酸が天然に
存在している場合、その天然の環境）から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたは
ＲＮＡを意図する。従って、その天然の状態から「人間の手により」改変されて
いる。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のため
には、単離されていると考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例として
は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（部
分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分
子としては、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物
が挙げられる。本発明に従う単離された核酸分子としては、合成的に生成された
ような分子がさらに挙げられる。特定の実施形態において、本発明の「単離され
た」核酸分子としては、図１（配列番号１）に開示されるガレクチン１１、図６
（配列番号２４）に開示されるガレクチン１１α、または配列番号２６に開示さ
れるガレクチン１１βのコード領域の全てまたは一部が挙げられる。用語「単離
された」は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーも、完全細胞全体または
ｍＲＮＡ調製物も、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳動により分離され、そしてブロ
ットに転写されたものを含む）も、剪断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物も、技
術により本発明のポリヌクレオチド／配列の識別特徴が示されない他の組成物も
いわない。An “isolated” nucleic acid molecule intends a nucleic acid molecule, DNA or RNA that has been removed from its native environment (eg, if the nucleic acid is naturally occurring, its natural environment). It has therefore been modified "by the hand of man" from its natural state. For example, a recombinant DNA molecule contained in a vector is considered isolated for the purposes of the present invention. Further examples of isolated DNA molecules include recombinant DNA molecules that are maintained in a heterologous host cell, or (partially or substantially) purified DNA molecules in solution. Isolated RNA molecules include in vivo or in vitro RNA transcripts of a DNA molecule of the present invention. Isolated nucleic acid molecules according to the present invention further include those molecules that have been produced synthetically. In a specific embodiment, the “isolated” nucleic acid molecule of the invention includes galectin 11, disclosed in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), FIG.
All or a part of the coding region of galectin 11α disclosed in (SEQ ID NO: 24) or galectin 11β disclosed in SEQ ID NO: 26. The term "isolated" refers to both genomic DNA or cDNA libraries, whole whole cell or mRNA preparations, genomic DNA preparations (including those separated by electrophoresis and transcribed into blots) Neither the prepared whole cell genomic DNA preparation nor the other compositions for which the techniques do not show the distinguishing characteristics of the polynucleotide / sequence of the invention.
【００４２】 本発明の単離された核酸分子は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ま
たは図１もしくは６（配列番号：１、２４もしくは２６）に示されるＯＲＦの一
部を含むＤＮＡ分子；および上記のＤＮＡ分子とは実質的に異なる配列を含むが
、遺伝子コードの縮重に起因し、なおもガレクチン１１タンパク質をコードする
ＤＮＡ分子を含む。もちろん、この遺伝子コードは、当該分野において周知であ
る。従って、そのような縮重改変体を作製することは、当業者に対して慣用的で
ある。An isolated nucleic acid molecule of the invention is a DNA molecule comprising an open reading frame (ORF) or a portion of the ORF shown in FIG. 1 or 6 (SEQ ID NO: 1, 24 or 26); It includes sequences substantially different from DNA molecules, but still includes DNA molecules that encode the galectin 11 protein due to the degeneracy of the genetic code. Of course, this genetic code is well known in the art. Thus, making such degenerate variants is routine for those skilled in the art.
【００４３】 特定の実施形態において、本発明は、図１（配列番号：２）に示される全長の
ガレクチン１１ポリペプチドをコードする単離された核酸分子および１９９７年
５月１６日にＡＴＣＣ寄託番号２０９０５３として寄託されたプラスミドに含ま
れるｃＤＮＡクローンによってコードされるガレクチン１１ポリペプチド配列を
コードするガレクチン１１核酸分子を提供する。さらなる実施形態において、Ｎ
末端メチオニンを欠失する全長ガレクチン１１ポリペプチドをコードする核酸分
子が提供される。本発明はさらに、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド
配列もしくは上記の寄託されたクローンに含まれるガレクチン１１ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列を有する単離された核酸分子、または上記の配列の１つに相補的
な配列を有する核酸分子を提供する。そのような単離された核酸分子（特にＤＮ
Ａ分子）は、染色体を用いるインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子
地図作製のためのプローブ、およびヒト組織におけるガレクチン１１遺伝子の発
現を検出するためのプローブ（例えば、ノーザンブロット分析によって）を含む
が、それらに限定されない使用を有する。本発明はさらに、Ｎ末端メチオニンを
伴うか、または伴わない、配列番号２５もしくは２７として示される全長アミノ
酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。In certain embodiments, the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule encoding the full-length galectin-11 polypeptide shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and an ATCC deposit number on May 16, 1997. A galectin-11 nucleic acid molecule encoding a galectin-11 polypeptide sequence encoded by a cDNA clone contained in a plasmid deposited as 209053 is provided. In a further embodiment, N
A nucleic acid molecule encoding a full-length galectin-11 polypeptide lacking a terminal methionine is provided. The present invention further provides an isolated nucleic acid molecule having the nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or the nucleotide sequence of a galectin-11 cDNA contained in the above deposited clone, or complementary to one of the above sequences Nucleic acid molecule having a specific sequence. Such isolated nucleic acid molecules (particularly DN
A) include, but are not limited to, probes for generating a genetic map by in situ hybridization using chromosomes and probes for detecting the expression of the galectin-11 gene in human tissues (eg, by Northern blot analysis). Have no use. The invention further provides a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the full length amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 25 or 27, with or without an N-terminal methionine.
【００４４】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５、少
なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも５００または
少なくとも１０００個の連続したヌクレオチドであるが、長さにおいて、３００
ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、７．５ｋｂ、
５ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂまたは１ｋｂ以下である。さらなる実施形態に
おいて、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されるように、コード
配列の一部を含むが、任意のイントロンの全てまたは一部も含まない。別の実施
形態において、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノム隣接遺伝子（すな
わち、第２染色体上の目的のガレクチン１１遺伝子に対して５’または３’）の
コード配列を含まない。他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、
１０００、５００、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、
３、２、または１個のゲノム隣接遺伝子よりも多くのコード配列を含まない。In certain embodiments, the polynucleotides of the present invention are at least 15, at least 50, at least 100, at least 125, at least 500 or at least 1000 contiguous nucleotides, but have a length of 300
kb, 200 kb, 100 kb, 50 kb, 15 kb, 10 kb, 7.5 kb,
5 kb, 2.5 kb, 2.0 kb or 1 kb or less. In a further embodiment, a polynucleotide of the invention comprises a portion of a coding sequence, but does not comprise all or a portion of any introns, as disclosed herein. In another embodiment, a polynucleotide comprising a coding sequence does not include a coding sequence for a genomic flanking gene (ie, 5 'or 3' to the galectin 11 gene of interest on chromosome 2). In another embodiment, the polynucleotide of the invention comprises:
1000, 500, 250, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 5, 4,
It does not contain more coding sequences than 3, 2, or 1 genomic flanking genes.
【００４５】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に指向される。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、図１および６（配列番
号１、２４、および２６）において示されるヌクレオチド配列、またはその相補
鎖を有する単離された核酸分子のフラグメントによって、長さにおいて、少なく
ともおよそ１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくともおよそ２０ｎｔ、またよ
り好ましくは少なくともおよそ３０ｎｔ、およびさらにより好ましくは少なくと
もおよそ４０ｎｔのフラグメントが意図される。例えば、長さにおいて少なくと
も２０ｎｔのフラグメントによって、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列ま
たは図１（配列番号１）もしくは図６（配列番号２４および２６）に示されるｃ
ＤＮＡに示されるようなヌクレオチド配列またはそれに対する相補鎖に由来する
２０個以上の連続する塩基を含むフラグメントが意図される。また、本発明によ
って、図１（配列番号１）に示される配列の５０、１００、１５０、２００、２
５０、３００、３５０、３６５、３７０、３７５、３８０、４００、４５０、５
００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０個の連続した
ヌクレオチド、その相補鎖、または寄託されたクローン内に含まれるＤＮＡフラ
グメントが包含される。本発明はまた、寄託されたｃＤＮＡもしくは図１（配列
番号１）に示されるようなほとんど（全てではないにしても）のヌクレオチド配
列またはその相補鎖に対応するフラグメントを含む。さらなる実施形態において
、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、図１（配列番号２）に示されるア
ミノ酸配列のアミノ酸１〜１４、１〜２０、１〜４０、１〜６６、２〜６７、３
〜８、３〜６７、５〜１０８、５〜１２８、１０〜１７、１０〜２０、１２〜１
６、１３〜２０、１３〜６８、１４〜６７、 ２３〜４０、２０〜５０、４０〜
１０８、４１〜６０、４７〜６１、４７〜１０８、４７〜１２８、５０〜１００
、６１〜８０、６５〜１０８、６５〜１２８、６６〜１０８、７６〜８８、８１
〜１００、８８〜１０８、８８〜１２８、９５〜１０１、１０１〜１３３、１０
８〜１２０、１１４〜１２８および／または１１４〜１２８をコードする配列を
含む。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、
ガレクチン１１の機能活性を実証するポリペプチドをコードする。本発明のフラ
グメントは、本明細書中に議論されるような診断プローブおよびプライマーを含
むが、これらに限定されない多くの使用を有する。The present invention is further directed to fragments of the isolated nucleic acid molecules described herein. The nucleotide sequence of the deposited cDNA, the nucleotide sequence shown in FIGS. 1 and 6 (SEQ ID NOS: 1, 24, and 26), or a fragment of the isolated nucleic acid molecule having the complement thereof, is at least about Fragments of 15 nt, and more preferably at least about 20 nt, and more preferably at least about 30 nt, and even more preferably at least about 40 nt are contemplated. For example, by a fragment of at least 20 nt in length, the nucleotide sequence of the deposited cDNA or c shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or FIG.
Fragments containing 20 or more contiguous bases from the nucleotide sequence as set forth in the DNA or its complement are contemplated. Also, according to the present invention, 50, 100, 150, 200, 2 of the sequence shown in FIG.
50, 300, 350, 365, 370, 375, 380, 400, 450, 5
00, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 contiguous nucleotides, their complements, or DNA fragments contained within the deposited clone. The invention also includes the deposited cDNA or fragments corresponding to most, if not all, of the nucleotide sequence as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or its complement. In a further embodiment, a polynucleotide fragment of the invention comprises amino acids 1-14, 1-20, 1-40, 1-66, 2-67, 3 of the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
-8, 3-67, 5-108, 5-128, 10-17, 10-20, 12-1
6, 13-20, 13-68, 14-67, 23-40, 20-50, 40-
108, 41-60, 47-61, 47-108, 47-128, 50-100
, 61-80, 65-108, 65-128, 66-108, 76-88, 81
-100, 88-108, 88-128, 95-101, 101-133, 10
8 to 120, 114 to 128 and / or 114 to 128. In a preferred embodiment, the polynucleotide fragment of the invention comprises:
Encodes a polypeptide that demonstrates galectin-11 functional activity. The fragments of the invention have many uses, including but not limited to diagnostic probes and primers as discussed herein.
【００４６】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、ガレクチン１１タンパク質のエピトー
プ保有部分をコードする核酸分子を含む。詳細には、本発明のそのような核酸フ
ラグメントは、図１（配列番号２）のおよそ６５〜７０および１１８〜１２４に
由来するアミノ酸残基を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。本発明
者らは、上記のポリペプチドフラグメントがガレクチン１１タンパク質の抗原性
領域であることを決定した。ガレクチン１１タンパク質の他のそのようなエピト
ープ保有部分を決定するための方法が、以下に詳細に記載される。Preferred nucleic acid fragments of the present invention include nucleic acid molecules encoding the epitope-bearing portion of the galectin 11 protein. In particular, such nucleic acid fragments of the invention include nucleic acid molecules encoding polypeptides comprising amino acid residues from about 65-70 and 118-124 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). The present inventors have determined that the above polypeptide fragment is an antigenic region of the galectin 11 protein. Methods for determining other such epitope-bearing portions of the galectin-11 protein are described in detail below.
【００４７】 他の実施形態において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下で、本明細書中に記載されるガレクチン１１ポリヌクレオチド（フラグ
メントを含む）の全てまたは一部とハイブリダイズするポリヌクレオチド、その
相補鎖、ＡＴＣＣ寄託番号２０９０５３（１９９７年５月１６日）に含まれるｃ
ＤＮＡクローン、またはそのフラグメントを含むか、あるいはそれらから構成さ
れる、単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、
７５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６
）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性
剪断サケ***ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーション、次
いで０．１×ＳＳＣ中で６５℃にてフィルターを洗浄することをいう。In another embodiment, the present invention provides polynucleotides that hybridize under stringent hybridization conditions to all or a portion of a galectin-11 polynucleotide (including fragments) described herein. , Its complementary strand, c included in ATCC Deposit No. 209053 (May 16, 1997)
Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising or consisting of a DNA clone, or a fragment thereof. “Stringent hybridization conditions” refers to 50% formamide, 5 × SSC (750 mM NaCl,
75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6)
)) Overnight incubation at 42 ° C in a solution containing 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 µg / ml denatured sheared salmon sperm DNA, then filter at 65 ° C in 0.1x SSC. It means washing.
【００４８】 より低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でガレクチン１１
ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意図される。ハイブリダ
イゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出のおける変化は、主に、
ホルムアミド濃度（ホルムアミドの低いパーセンテージは、弱められたストリン
ジェンシーを生じる）；塩条件または温度の操作によって達成される。例えば、
低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣ
ｌ；０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％
ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ***ブロッキングＤＮＡを
含む溶液中で３７℃にて一晩インキュベーションし、次いで、１×ＳＳＰＥ、０
．１％ＳＤＳを用いて５０℃において洗浄する。さらに、より低いストリンジェ
ンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に実行
される洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）にてなされ得る。[0048] Galectin 11 under lower stringency hybridization conditions
Nucleic acid molecules that hybridize to the polynucleotide are also contemplated. Changes in hybridization stringency and signal detection are mainly due to
Formamide concentration (lower percentage of formamide results in reduced stringency); achieved by manipulation of salt conditions or temperature. For example,
Low stringency conditions were 6 × SSPE (20 × SSPE = 3M NaC
1; 0.2M NaH 2 PO 4 ; 0.02M EDTA, pH 7.4), 0.5%
Incubate overnight at 37 ° C. in a solution containing SDS, 30% formamide, 100 μg / ml salmon sperm blocking DNA, then 1 × SSPE, 0
. Wash at 50 ° C. with 1% SDS. Further, to achieve lower stringency, washes performed after stringent hybridization can be done at higher salt concentrations (eg, 5 × SSC).
【００４９】 上記の条件におけるバリエーションが、ハイブリダイゼーション実験において
バックグラウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の含有
および／または置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッ
キング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ***
ＤＮＡ、および市販の専売処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の含有
は、適合性の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要
とし得る。Note that variations on the above conditions can be achieved by the inclusion and / or replacement of alternative blocking reagents used to suppress background in hybridization experiments. Representative blocking reagents include Denhardt's reagent, BLOTTO, heparin, denatured salmon sperm DNA, and commercial proprietary formulations. The inclusion of specific blocking reagents may require modification of the above hybridization conditions due to compatibility issues.
【００５０】 ポリヌクレオチドの一部とハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、お
よそ１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好ましくは少なくともおよそ２０、
さらにより好ましくは少なくともおよそ３０、５０、６０、７５、１００、１５
０、１７５、２００、２５０、３００、３５０ｎｔ、好ましくはおよそ３０〜７
０ｎｔ、もしくは８０〜１５０ヌクレオチド、または参照ポリヌクレオチドの全
長とハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が
意図される。少なくとも「２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの一部によって、例
えば、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に由来する２０個以上の連続す
るヌクレオチドが意図される（例えば、寄託されたｃＤＮＡまたは図１（配列番
号１）に示されるようなヌクレオチド配列）。特定の実施形態において、このポ
リヌクレオチドは、図１（配列番号１）に開示されるヌクレオチド配列のヌクレ
オチド０〜２０、０〜２５、０〜３０、０〜５０、５１〜１００、８０〜１００
、１０１〜２００、２０１〜３００、３０１〜４００、４０１〜４５０、４５１
〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６０１〜７００、７０１〜７５０
、７５１〜７８０、および／または７８０〜８２０とハイブリダイズする。他の
特定の実施形態において、このポリヌクレオチドは、図１（配列番号２）に示さ
れるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１４、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１
００、１００〜１３３をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズする。特
定の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号２４に開示されるヌ
クレオチド配列のヌクレオチド１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜５０、５１
〜１００、８０〜１００、１０１〜２００、２０１〜３００、３０１〜４００、
４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６０１〜
７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８０１〜８５０、８５１〜９００、
９０１〜９５０、９５１〜１，０００、１，００１〜１０５０、１，０５１〜１
，１００、１，１０１〜１，１５０、１，１５１〜１，２００、１，２０１〜１
，２５０、および／または１，２５１〜１，３３７とハイブリダイズする。他の
特定の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号２５に示されるア
ミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１４、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１００、
１００〜１３０、１３０〜１６０、１６０〜２１０、２１０〜２４０および／ま
たは２４０〜２７５をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズする。特定
の実施形態において、このポリヌクレオチドは、図配列番号２６に開示されるヌ
クレオチド配列のヌクレオチド１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜５０、５１
〜１００、８０〜１００、１０１〜２００、２０１〜３００、３０１〜４００、
４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６０１〜
７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８０１〜８５０、８５１〜９００、
９０１〜９５０、９５１〜１，０００、１，００１〜１０５０、１，０５１〜１
，１００、１，１０１〜１，１５０、１，１５１〜１，２００、１，２０１〜１
，２５０、および／または１，２５１〜１，３３０とハイブリダイズする。他の
特定の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号２７に示されるア
ミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１４、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１００、
１００〜１３０、１３０〜１６０、１６０〜２１０、２１０〜２４０、２４０〜
２７０および／または２７０〜２９６をコードするヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズする。これらのポリヌクレオチドは、上記および以下により詳細に議論さ
れるような診断プローブおよびプライマーを含むが、これらに限定されない使用
を有する。[0050] Depending on the polynucleotide that hybridizes to a portion of the polynucleotide, approximately 15 nucleotides (nt), and more preferably at least approximately 20,
Even more preferably at least about 30, 50, 60, 75, 100, 15
0, 175, 200, 250, 300, 350 nt, preferably about 30-7
A polynucleotide (either DNA or RNA) that hybridizes to 0 nt, or 80-150 nucleotides, or the full length of the reference polynucleotide is contemplated. By a portion of the polynucleotide that is at least "20 nt long", for example, 20 or more contiguous nucleotides from the nucleotide sequence of the reference polynucleotide are contemplated (eg, the deposited cDNA or FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)). Nucleotide sequences as shown in In certain embodiments, the polynucleotide comprises nucleotides 0-20, 0-25, 0-30, 0-50, 51-100, 80-100 of the nucleotide sequence disclosed in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
, 101-200, 201-300, 301-400, 401-450, 451
~ 500, 501-550, 551-600, 601-700, 701-750
, 751-780, and / or 780-820. In other specific embodiments, the polynucleotide comprises amino acid residues 1-14, 10-20, 20-50, 50-1 of the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
Hybridizes with the nucleotide sequence encoding 00, 100-133. In certain embodiments, the polynucleotide comprises nucleotides 1-20, 1-25, 1-30, 1-50, 51 of the nucleotide sequence disclosed in SEQ ID NO: 24.
-100, 80-100, 101-200, 201-300, 301-400,
401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 601-
700, 701-750, 751-800, 801-850, 851-900,
901-950, 951-1,000, 1,001-1050, 1,051-1
, 100, 1, 101 to 1, 150, 1, 151 to 1, 200, 1, 201 to 1
, 250, and / or 1,251-1,337. In other specific embodiments, the polynucleotide comprises amino acid residues 1-14, 10-20, 20-50, 50-100, of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25.
Hybridizes with a nucleotide sequence encoding 100-130, 130-160, 160-210, 210-240 and / or 240-275. In certain embodiments, the polynucleotide comprises nucleotides 1-20, 1-25, 1-30, 1-50, 51 of the nucleotide sequence disclosed in SEQ ID NO: 26.
-100, 80-100, 101-200, 201-300, 301-400,
401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 601-
700, 701-750, 751-800, 801-850, 851-900,
901-950, 951-1,000, 1,001-1050, 1,051-1
, 100, 1, 101 to 1, 150, 1, 151 to 1, 200, 1, 201 to 1
, 250, and / or 1,251 to 1,330. In other specific embodiments, the polynucleotide comprises amino acid residues 1-14, 10-20, 20-50, 50-100, of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27.
100-130, 130-160, 160-210, 210-240, 240-
Hybridizes with the nucleotide sequence encoding 270 and / or 270-296. These polynucleotides have uses, including but not limited to diagnostic probes and primers as discussed above and in more detail below.
【００５１】 もちろん、ポリＡ配列（例えば、図１（配列番号１）、図６（配列番号２４）
もしくは配列番号２６またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的ストレッチに示され
るガレクチン１１ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）領域（ｔｒａｃｔ））にのみハ
イブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部とハイブリダイズさ
せるために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、その
ようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補鎖を含む任意
の核酸分子（例えば、特に、オリゴｄＴプライマーを使用して作製される任意の
二本鎖ｃＤＮＡクローン）とハイブリダイズするからである。Of course, the poly A sequence (eg, FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), FIG. 6 (SEQ ID NO: 24)
Alternatively, a polynucleotide that hybridizes only to the 3 ′ terminal poly (A) region (tract) of galectin-11 cDNA shown in SEQ ID NO: 26 or the complementary stretch of T (or U) residue is a part of the nucleic acid of the present invention. Not included in the polynucleotide of the present invention used for hybridization with Because such a polynucleotide hybridizes to any nucleic acid molecule comprising a poly (A) stretch or its complement, such as, in particular, any double-stranded cDNA clone created using an oligo dT primer. Because you do.
【００５２】 示されるように、ガレクチン１１ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子
は、そのポリペプチドのアミノ酸配列それ自体をコードする核酸分子；そのポリ
ペプチドについてのコード配列およびさらなる配列（例えば、アミノ酸リーダー
配列または分泌配列をコードする配列（例えば、プレタンパク質配列、もしくは
プロタンパク質配列、もしくはプレプロタンパク質配列）；さらなる非コード配
列（例えば、イントロンおよび非コード５’および３’配列（例えば、転写、ｍ
ＲＮＡプロセシング（スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル（
例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性のために）の際に役割を果たす
、転写されて翻訳されない配列）を含むが、これらに限定されない）と共に上述
のさらなるコード配列を伴うか、もしくは伴わないポリペプチドのコード配列、
；さらなるアミノ酸（例えば、さらなる機能性を提供するアミノ酸）をコードす
るさらなるコード配列、を含み得るが、これらに限定されない。従って、このポ
リペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精
製を促進するペプチドをコードする配列）と融合され得る。本発明のこの局面の
特定の好ましい実施形態において、そのマーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒス
チジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．）において
提供されるタグ、とりわけ、これらの多くは商業的に入手可能である）である。
例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
：８２１〜８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、そ
の融合タンパク質の簡便な精製を提供する。この「ＨＡ」タグは、インフルエン
ザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する、精製のために有用な
別のペプチドであり、これは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７
８（１９８４）によって記載されている。以下に議論されるように、他のそのよ
うな融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端において、Ｆｃに融合されるガレク
チン１１を含む。As indicated, a nucleic acid molecule of the invention that encodes a galectin 11 polypeptide is a nucleic acid molecule that encodes the amino acid sequence of the polypeptide itself; the coding sequence and additional sequences (eg, amino acids) for the polypeptide. A sequence encoding a leader or secretory sequence (eg, a preprotein sequence, or a proprotein sequence, or a preproprotein sequence); additional non-coding sequences (eg, introns and non-coding 5 ′ and 3 ′ sequences (eg,
RNA processing (splicing signal and polyadenylation signal (
For example, for ribosome binding and mRNA stability, including but not limited to transcribed and untranslated sequences) with or without the additional coding sequences described above. Peptide coding sequence,
An additional coding sequence that encodes an additional amino acid (eg, an amino acid that provides additional functionality); Thus, the sequence encoding the polypeptide can be fused to a marker sequence, such as a sequence encoding a peptide that facilitates purification of the fusion polypeptide. In certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the marker amino acid sequence is a tag provided in a hexa-histidine peptide (e.g., a pQE vector (Qiagen, Inc.), especially many of which are commercially available. Is possible).
See, for example, Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86
: 821-824 (1989), hexa-histidine provides for convenient purification of the fusion protein. The "HA" tag is another peptide useful for purification, corresponding to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein, which is described in Wilson et al., Cell 37: 767-77.
8 (1984). As discussed below, other such fusion proteins include galectin 11 fused to Fc at the N-terminus or C-terminus.
【００５３】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメントに
指向される。本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、核酸配
列を有する短いポリヌクレオチドをいい、その核酸配列は、寄託されたクローン
ン内（すなわち、寄託されたクローン内のｃＤＮＡによってコードされるそのポ
リペプチドをコードする）に含まれる核酸配列の一部であり、配列番号１、２４
、もしくは２６に示される核酸配列の一部またはその相補鎖であるか、あるいは
配列番号２、２５もしくは２７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列の一部である。本発明のヌクレオチドフラグメントは、長さにおいて、好まし
くは、少なくともおよそ１５ｎｔ、およびより好ましくは少なくともおよそ２０
ｎｔ、またより好ましくは少なくともおよそ３０ｎｔ、およびさらにより好まし
くは少なくともおよそ４０ｎｔ、少なくともおよそ５０ｎｔ、少なくともおよそ
７５ｎｔ、または少なくともおよそ１５０ｎｔである。例えば、フラグメント「
長さにおいて、少なくとも２０ｎｔ」は、寄託されたクローン内に含まれるｃＤ
ＮＡ配列または配列番号１、２４、もしくは２６において示されるヌクレオチド
配列に由来する２０個以上連続する塩基を含むことが意図される。この文脈にお
いて「およそ」とは、特に列挙された値およびいずれかの末端または両方の末端
において、いくつかのヌクレオチド（５、４、３、２、もしくは１）まで大きい
かまたは小さい値を含む。これらのヌクレオチドフラグメントは、本明細書中に
議論されるような診断プローブおよびプライマーとしての使用を含むが、それら
に限定されない。もちろん、より大きなフラグメント（例えば、５０、１５０、
５００、６００、２０００ヌクレオチド）が好ましい。[0053] The present invention is also directed to polynucleotide fragments of the polynucleotides of the present invention. In the present invention, "polynucleotide fragment" refers to a short polynucleotide having a nucleic acid sequence, which nucleic acid sequence is located within the deposited clone (ie, the polypeptide encoded by the cDNA within the deposited clone). Encode), a portion of the nucleic acid sequence contained in SEQ ID NOs: 1, 24
Or a part of the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 25 or 27, or a part of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2, 25 or 27. The nucleotide fragments of the present invention preferably have a length of at least about 15 nt, and more preferably at least about 20 nt.
nt, and more preferably at least about 30 nt, and even more preferably at least about 40 nt, at least about 50 nt, at least about 75 nt, or at least about 150 nt. For example, the fragment "
At least 20 nt in length "is the cD contained in the deposited clone.
It is intended to include 20 or more contiguous bases from the NA sequence or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 24, or 26. “Approximately” in this context includes the values specifically recited and values that are larger or smaller by several nucleotides (5, 4, 3, 2, or 1) at either or both termini. These nucleotide fragments include, but are not limited to, use as diagnostic probes and primers as discussed herein. Of course, larger fragments (eg, 50, 150,
(500, 600, 2000 nucleotides).
【００５４】 さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例としては、例え
ば、およそヌクレオチド番号１〜４８、４９〜９９、１００〜１５０、１５１〜
２０１、２０２〜２５２、２５３〜３０３、３０４〜３５４、３５５〜４０５、
４０６〜４５０、４５１〜５０１、および５０２から配列番号１の末端までの配
列もしくはその相補鎖、または寄託されたクローン内に含まれるｃＤＮＡ、を含
むか、あるいはそれらから構成されるフラグメントが挙げられる。この文脈にお
いて、「およそ」とは、特に列挙された範囲およびいずれかの末端または両方の
末端において、いくつかのヌクレオチド（５、４、３、２、もしくは１）まで大
きいかまたは小さい範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、生物学
的活性を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、これらのポリヌク
レオチドは、本明細書中で議論されるようなプローブまたはプライマーとして使
用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件またはより低いス
トリンジェンシーな条件下において、これらの核酸分子とハイブリダイズするポ
リヌクレオチドはまた、本発明に包含され、同様に、これらのポリヌクレオチド
によってコードされるポリペプチドもまた本発明に包含される。Further, typical examples of the polynucleotide fragment of the present invention include, for example, about nucleotide numbers 1-48, 49-99, 100-150, 151-
201, 202-252, 253-303, 304-354, 355-405,
Fragments containing or consisting of the sequences from 406 to 450, 451 to 501, and 502 to the end of SEQ ID NO: 1 or the complement thereof, or the cDNA contained in the deposited clone. In this context, “approximately” includes the greater or lesser range up to a few nucleotides (5, 4, 3, 2, or 1), particularly at the recited range and either or both termini. . Preferably, these fragments encode a polypeptide having biological activity. More preferably, these polynucleotides may be used as probes or primers as discussed herein. Polynucleotides that hybridize to these nucleic acid molecules under stringent hybridization conditions or lower stringency conditions are also encompassed by the present invention, as are the polypeptides encoded by these polynucleotides. Included in the present invention.
【００５５】 正確な処方物、投与経路および投与されるべき本発明の化合物の投薬量は、患
者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌら、
１９７５、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．」Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。他の方法が当業
者に公知であり、そして本発明の範囲内である。The exact formulation, route of administration, and dosage of the compound of the present invention to be administered can be chosen by the individual physician in view of the condition of the patient (eg, Fingl et al.,
1975, "The Pharmacological Basis of T
herapeutics. "Ch. 1 p. 1). Other methods are known to those skilled in the art and are within the scope of the present invention.
【００５６】 しかし、多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可
能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列
のいくつかは、配列番号１に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能で
あったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本
発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従
って、好ましくは、本発明から、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配
列（ここで、ａ1は配列番号１の１〜８５１の任意の整数であり、ｂは配列番号
１の１５〜８６５の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号１に示され
るヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を
含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。[0056] However, many polynucleotide sequences (eg, EST sequences) are publicly available and accessible through sequence databases. Some of these sequences are related to SEQ ID NO: 1 and may have been publicly available prior to conception of the present invention. Preferably, such related polynucleotides are specifically excluded from the scope of the present invention. Listing all related sequences is cumbersome. Therefore, preferably, the present invention is the nucleotide sequence described by the general formula a-b (where, a 1 is any integer of from 1 to 851 of SEQ ID NO: 1, b 15-865 is SEQ ID NO: 1 Wherein both a and b correspond to the nucleotide residue positions set forth in SEQ ID NO: 1 and where b is a + 14 or greater), excluding one or more polynucleotides .
【００５７】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、この改変体は、ガレクチ
ン１１タンパク質のタンパク質（すなわち、フラグメント）、アナログまたは誘
導体をコードする。改変体は、例えば天然の対立遺伝子改変体として、天然に存
在し得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物体の染色体上の所定の遺伝子座
を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つが意図される。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、
Ｌｅｗｉｎ、Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野に公知の変異誘発技術を使
用して作製され得る。The present invention further relates to variants of the nucleic acid molecules of the invention, which variants encode a protein (ie, a fragment), analog or derivative of the galectin 11 protein. Variants can occur naturally, for example, as natural allelic variants. By "allelic variant" is intended one of several alternative forms of a gene occupying a given locus on the chromosome of an organism. Genes II,
Lewin, B .; Hen, John Wiley & Sons, New York
(1985). Non-naturally occurring variants can be made using mutagenesis techniques known in the art.
【００５８】 そのような改変体は、１つ以上のヌクレオチドを含み得るヌクレオチド置換、
欠失または付加によって作製される改変体を含む。本発明のポリペプチドのアミ
ノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４ １
５、２０、２５、３０、３５、４０、５０または２０〜１５、１５〜１０、１０
〜５ １〜５、１〜３、または１〜２をコードするヌクレオチド配列が、任意の
組み合わせにおいて、置換されるか、欠失されるか、または付加される、改変体
が特に好ましい。この改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方の
領域において改変され得る。コード領域内の改変は、保存的または非保存的アミ
ノ酸置換、欠失または付加を産生し得る。これらの中でも、特にサイレント置換
、付加および欠失が好ましく、それらはガレクチン１１タンパク質またはその部
分の特性および活性を変更しない。また、この点においては保存的置換が特に好
ましい。[0058] Such variants include nucleotide substitutions, which may include one or more nucleotides,
Includes variants made by deletion or addition. Amino acids 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 141 of the polypeptide of the invention
5, 20, 25, 30, 35, 40, 50 or 20 to 15, 15 to 10, 10
Particularly preferred are variants in which the nucleotide sequence encoding -51-5, 1-3, or 1-2 is substituted, deleted or added in any combination. The variants can be modified in the coding region, the non-coding region, or both regions. Modifications in the coding region may produce conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions or additions. Among these, silent substitutions, additions and deletions are particularly preferred, which do not alter the properties and activities of the galectin-11 protein or a portion thereof. In this respect, conservative substitution is particularly preferred.
【００５９】 本発明のさらなる実施形態は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１３３をコー
ドするヌクレオチド：（ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜１３３をコードするヌク
レオチド：（ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９０５３内に含まれるｃＤＮＡによりコ
ードされるガレクチン１１ポリペプチドのヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号２
５のアミノ酸１〜２７５をコードするヌクレオチド：（ｅ）配列番号２７のアミ
ノ酸１〜２９６をコードするヌクレオチド：（ｆ）配列番号２５のアミノ酸残基
１〜１２１をコードするヌクレオチド：（ｇ）配列番号２７のアミノ酸残基１〜
１４２をコードするヌクレオチド：（ｈ）配列番号２５のアミノ酸２〜２７５を
コードするヌクレオチド：（ｉ）配列番号２７のアミノ酸残基２〜２９６をコー
ドするヌクレオチド：（ｊ）配列番号２５のアミノ酸１５１〜２７５をコードす
るヌクレオチド：または（ｋ）本明細書中に記載されるような本発明のフラグメ
ントおよび他のポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８
５％、または９０％同一、およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９
７％、９８％または９９％あるいは９８〜９９％同一であるヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件またはより低いストリンジェンシーな条件下におい
て、これらの核酸分子とハイブリダイズするポリヌクレオチドはまた、本発明に
包含され、同様に、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチ
ドもまた本発明に包含される。A further embodiment of the present invention provides (a) nucleotides encoding amino acids 1-133 of SEQ ID NO: 2: (b) nucleotides encoding amino acids 2-133 of SEQ ID NO: 2: (c) ATCC Deposit No. 209053 The nucleotide sequence of the galectin-11 polypeptide encoded by the cDNA contained therein: (d) SEQ ID NO: 2
5 nucleotides encoding amino acids 1-275: (e) nucleotides encoding amino acids 1-296 of SEQ ID NO: 27: (f) nucleotides encoding amino acid residues 1-121 of SEQ ID NO: 25: (g) SEQ ID NO: 27 amino acid residues 1 to
Nucleotides encoding 142: (h) Nucleotides encoding amino acids 2-275 of SEQ ID NO: 25: (i) Nucleotides encoding amino acid residues 2-296 of SEQ ID NO: 27: (j) Amino acids 151-151 of SEQ ID NO: 25 Nucleotides encoding 275: or (k) at least 75%, 80%, 8% relative to fragments and other polynucleotide sequences of the invention as described herein.
5%, or 90% identical, and more preferably at least 95%, 96%, 9
Includes an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence that is 7%, 98% or 99% or 98-99% identical. Polynucleotides that hybridize to these nucleic acid molecules under stringent hybridization conditions or lower stringency conditions are also encompassed by the present invention, as are the polypeptides encoded by these polynucleotides. Included in the present invention.
【００６０】 例えば、本発明のガレクチン１１ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド
配列に対して少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有するポリヌ
クレオチドによって、このポリヌクレオチド配列が、ガレクチン１１ポリペプチ
ドをコードする参照ヌクレオチド配列の各々１００ヌクレオチド当たり５つまで
のヌクレオチドの不一致を含み得るということを除いて、ポリヌクレオチドのヌ
クレオチド配列が、参照配列と同一であるということが意図される。言い換える
と、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの５％までが、欠
失され得るか、または別のヌクレオチドで置換されるか、あるいは、参照配列に
おける総ヌクレオチドの５％まで、多数のヌクレオチドがその参照配列内に挿入
され得る。参照配列のこれらの変異は、その参照ヌクレオチド配列の５’もしく
は３’末端位置またはそれらの末端位置の間のどこかで生じ得、参照配列または
参照配列内の１つ以上の連続する群におけるヌクレオチドの間に個々に分散され
る。問い合わせ配列は、配列番号１に示される配列全体、ＯＲＦ（オープンリー
ディングフレーム）、または本明細書中に記載されるような特定された任意のフ
ラグメントであり得る。For example, a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% “identical” to a reference nucleotide sequence that encodes a galectin-11 polypeptide of the invention, wherein the polynucleotide sequence encodes a galectin-11 polypeptide. It is intended that the nucleotide sequence of the polynucleotide be identical to the reference sequence, except that it may contain up to 5 nucleotide mismatches for every 100 nucleotides of the reference nucleotide sequence. In other words, up to 5% of the nucleotides of the reference sequence can be deleted or replaced with another nucleotide to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% identical to the reference nucleotide sequence, Alternatively, as many as 5% of the total nucleotides in a reference sequence can be inserted into the reference sequence. These mutations of the reference sequence may occur at the 5 ′ or 3 ′ terminal position of the reference nucleotide sequence or anywhere between those terminal positions, and may result in nucleotides in the reference sequence or in one or more contiguous groups within the reference sequence. Are individually dispersed between The query sequence can be the entire sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the ORF (open reading frame), or any of the fragments identified as described herein.
【００６１】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１、２４および
２６に示されるヌクレオチド配列または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオ
チド配列に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９
６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、例えば、Ｂｅｓｔｆ
ｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐ
ａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７
１１）のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得
る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９ （１
９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最適の
セグメントを見出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使
用して、特定の配列が、例えば本発明による参照配列に９５％同一であるか否か
を決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチ
ド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数
の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。As a practical matter, any particular nucleic acid molecule may have, for example, at least 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 9
Whether it is 6%, 97%, 98%, or 99% identical is determined, for example, by Bestf
it program (Wisconsin Sequence Analysis)
Package, Version 8 for Unix, Genetics
Computer Group, University Research P
ark, 575 Science Drive, Madison, WI 537.
It can be determined conventionally using known computer programs such as 11). Bestfit is described in Smith and Waterman, Advances.
in Applied Matrices 2: 482-489 (1
981) using the local homology algorithm to find the best segment of homology between the two sequences. When using Bestfit or any other sequence alignment program to determine whether a particular sequence is 95% identical to, for example, a reference sequence according to the present invention, the parameters, of course, are: It is set to be calculated over the entire length of the reference nucleotide sequence and to allow for gaps in homology up to 5% of the total nucleotide number of the reference sequence.
【００６２】 問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最も良好な全体的な適合
性（全体的配列整列としてもまた言及される）を決定するための好ましい方法は
、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（
１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを
使用して決定される。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両
方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵからＴに変換することによって比
較され得る。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセント（％）で示され
る。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において
使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕ
ｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎ
ａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０
、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉ
ｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象
ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）である。A preferred method for determining the best overall match (also referred to as an overall sequence alignment) between a query sequence (a sequence of the invention) and a subject sequence is described in Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (
1990)) using the FASTDB computer program based on the algorithm. In sequence alignment, the query and subject sequences are both DNA sequences. RNA sequences can be compared by converting U to T. The results of the above overall sequence alignment are given as percent identity (%). Preferred parameters used in FASTDB alignment of DNA sequences to calculate percent identity are: Matrix = Unitary, k-tu
ple = 4, Mismatch Penalty = 1, Joining Pen
alty = 30, Randomization Group Length = 0
, Cutoff Score = 1, Gap Penalty = 5, Gap Si
ze Penalty 0.05, Window Size = 500 or the length of the nucleotide sequence of interest (whichever is shorter).
【００６３】 本実施形態に従って、対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失の
ためではなく）問い合わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされ
なけらばならない。これは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢ
プログラムが対象配列の５’および３’切断を考慮しないからである。５’末端
または３’末端で切断される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一
性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されな
い対象配列の５’および３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することに
よって補正される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配
列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセン
トから差し引かれ、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラム
によって算定され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正さ
れたスコアが、本発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によっ
て示されるように、問い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’およ
び３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目
的で算定される。According to this embodiment, if the subject sequence is shorter than the query sequence due to a 5 ′ or 3 ′ deletion (not due to an internal deletion), a manual correction must be made to the result . This is equivalent to FASTDB when calculating percent identity.
This is because the program does not consider the 5 'and 3' truncations of the subject sequence. For a subject sequence truncated at the 5 'end or 3' end, the percent identity to the query sequence is the query sequence, which is 5 'and 3' of the subject sequence that are not matched / aligned as a percentage of the total bases of the query sequence. Is corrected by calculating the number of bases Whether nucleotides are matched / aligned is determined by the result of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then subtracted from the percent identity and calculated by the FASTDB program described above using the specified parameters to arrive at the final percent identity score. This corrected score is used for the purpose of the present invention. Only those bases outside of the 5 'and 3' bases of the subject sequence that are not matched / aligned with the query sequence, as indicated by FASTDB alignment, are calculated for the purpose of manually adjusting the percent identity score.
【００６４】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。For example, a 90 base subject sequence is aligned with a 100 base query sequence to determine percent identity. The deletion occurs at the 5 'end of the subject sequence, so the FASTDB alignment does not show a match / alignment at the first 10 bases at the 5' end. 1
Zero unpaired bases represent 10% of the sequence (number of bases at the unmatched 5 'and 3' ends / total number of bases in the query sequence), so that 10% is FASTD
It is subtracted from the percent identity score calculated by the B program.
If the remaining 90 bases match exactly, the final percent identity is 90%. In another example, a 90 base subject sequence is compared to a 100 base query sequence. In this case, the deletion is an internal deletion, so that no base is present 5 'or 3' of the subject sequence which does not match / align with the query. In this case, FASTD
The percent identity calculated by B is not manually corrected. Again, only the 5 'and 3' bases of the subject sequence that do not match / align with the query sequence are manually corrected. Other manual corrections are not made for the purposes of this embodiment.
【００６５】 ガレクチン１１改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方におけ
る改変を含み得る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失
を生成するが、コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない改変
を含むポリヌクレオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレント
な置換によって生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組
合せにおいて５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、または
付加される改変体もまた、好ましい。ガレクチン１１ポリヌクレオチド改変体は
、種々の理由（例えば、特定の宿主についてのコドン発現を最適化する（ヒトｍ
ＲＮＡにおけるコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコド
ンに変化させる））のために、生成され得る。さらなる実施形態において、改変
体は、保存されたドメインの外側に位置する配列における配列の変化を含み得る
。 天然に存在するガレクチン１１改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、
そして生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形
態のうちの１つをいう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編 Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立
遺伝子改変体は、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルの
いずれかで変化し得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改
変体は、変異誘発技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。[0065] Galectin-11 variants may include alterations in the coding region, non-coding region, or both. Particularly preferred are polynucleotide variants that contain modifications that produce silent substitutions, additions, or deletions, but do not alter the properties or activities of the encoded polypeptide. Nucleotide variants generated by silent substitutions due to the degeneracy of the genetic code are preferred. Further, variants in which 5 to 10, 1 to 5, or 1 to 2 amino acids are substituted, deleted, or added in any combination are also preferable. Galectin-11 polynucleotide variants may be used for various reasons, such as optimizing codon expression for a particular host (human
Codons in RNA are E. coli, which is changed to a preferred codon by a bacterial host such as E. coli). In further embodiments, variants may include sequence changes in sequences located outside of the conserved domain. A naturally occurring galectin-11 variant is called an "allelic variant"
And refers to one of several alternative forms of a gene occupying a given locus on the chromosome of an organism. (Genes II, Lewin, B., edited by John
Wiley & Sons, New York (1985)). These allelic variants can vary at either the polynucleotide and / or polypeptide level and are included in the present invention. Alternatively, non-naturally occurring variants may be produced by mutagenesis techniques or by direct synthesis.
【００６６】 タンパク質操作および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
ガレクチン１１ポリぺプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る
。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な欠損を伴わずに、分
泌ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）の著者らは、３、８、
または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後でさえもヘパリン結合
活性を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγ
は、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させ
た後、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。Using known methods of protein engineering and recombinant DNA technology, variants are
It can be made to improve or alter the properties of galectin-11 polypeptide. For example, one or more amino acids can be deleted from the N-terminus or C-terminus of a secreted polypeptide without substantial loss of biological function. Ron et al. Bio
l. Chem. 268: 2984-2988 (1993).
Alternatively, a modified KGF protein having heparin binding activity was reported even after deletion of the 27 amino-terminal amino acid residues. Similarly, interferon γ
Showed up to 10-fold higher activity after deleting 8-10 amino acid residues from the carboxy terminus of this protein (Dobeli et al., J. Biotec).
hnology 7: 199-216 (1988)).
【００６７】 さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する生物学的活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌ
ｅおよび共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５−２２１
１１（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析
を行った。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変
体当たり平均２．５アミノ酸の変化である、３，５００個を超える個々のＩＬ−
１ａ変異体を作製した。複数の変異が、全ての可能なアミノ酸の位置で試験され
た。この研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のい
ずれに対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要
約を参照のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列の
うち、わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタン
パク質を生成した。Furthermore, a wealth of evidence demonstrates that variants often retain biological activity similar to that of a naturally occurring protein. For example, Gayl
e and coworkers (J. Biol. Chem 268: 22105-221).
11 (1993)) performed an extensive mutational analysis of the human cytokine IL-1a. They used random mutagenesis to generate more than 3,500 individual IL-
The 1a mutant was created. Multiple mutations were tested at all possible amino acid positions. The researchers found that "most of the molecules can be changed with little effect on either [binding activity or biological activity]." (See summary). In fact, of the more than 3,500 nucleotide sequences tested, only 23 unique amino acid sequences produced proteins with significantly different activities than the wild type.
【００６８】 さらに、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的
活性はなお保持され得る。例えば、分泌される形態を認識する抗体を誘導および
／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌される形態の大多数より少ない残
基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持されるようである。タンパ
ク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免
疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、および
そうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得
る。In addition, deletion of one or more amino acids from the N-terminus or C-terminus of a polypeptide may result in alteration or deletion of one or more biological functions, but not other biological functions. Activity may still be retained. For example, the ability of a deletion variant to induce and / or bind an antibody that recognizes a secreted form is determined when fewer than the majority of residues in the secreted form are removed from the N-terminus or C-terminus. Seems to be retained. Whether a particular polypeptide lacking the N- or C-terminal residue of a protein retains such immunogenic activity depends on the conventional methods described herein, and If not, it can be easily determined by a conventional method known in the art.
【００６９】 従って、本発明はさらに、実質的な生物学的活性を示すガレクチン１１ポリぺ
プチド改変体を含む。このような改変体としては、活性に対する影響をほとんど
有さないように、当該分野において公知の一般的な法則に従って選択される、欠
失、挿入、逆位、反復、および置換が挙げられる。Accordingly, the present invention further includes galectin-11 polypeptide variants that exhibit substantial biological activity. Such variants include deletions, insertions, inversions, repeats, and substitutions that are selected according to general rules known in the art, with little effect on activity.
【００７０】 本適用は、本明細書中に開示される核酸配列（例えば、図１もしくは６（配列
番号１、２４、もしくは２６に示される核酸配列）、寄託されたｃＤＮＡクロー
ンの核酸配列、および配列番号２、２５、または２７のｍ−ｎとして以下に開示
されるＮおよび／またはＣ末端欠失のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドする核酸配列と少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５
％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に指向され、これ
らが、ガレクチン１１機能活性を有するポリペプチドをコードするか否とは無関
係である。なぜなら、これはたとえ、特定の核酸分子がガレクチン１１機能活性
を有するポリペプチドをコードしない場合でも、当業者は、その核酸分子を使用
するための方法（例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして）をさらに知っているからである。ガレク
チン１１機能活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用
としては、特に、（１）ｃＤＮＡライブラリーにおいて、ガレクチン１１遺伝子
またはその対立遺伝子改変体もしくはスプライス（ｓｐｌｉｃｅ）改変体を単離
すること；（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されような、ガレクチン１１遺
伝子の正確な染色***置を提供するために中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ
）に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（３
）染色体１１についてのマーカーとして連鎖解析における使用；および（４）特
定組織におけるガレクチン１１のｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロッ
ト分析が挙げられる。This application relates to the nucleic acid sequences disclosed herein (eg, the nucleic acid sequences shown in FIG. 1 or 6 (SEQ ID NO: 1, 24, or 26), the nucleic acid sequence of the deposited cDNA clone, and A nucleic acid sequence encoding a polypeptide having an N- and / or C-terminally deleted amino acid sequence disclosed below as mn of SEQ ID NO: 2, 25, or 27 and at least 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95
%, 96%, 97%, 98% or 99% identical nucleic acid molecules, regardless of whether they encode a polypeptide having galectin 11 functional activity. This is because even if a particular nucleic acid molecule does not encode a polypeptide having galectin-11 functional activity, one of skill in the art will recognize methods for using that nucleic acid molecule (eg, hybridization probes or polymerase chain reaction (PCR) ) As a primer). The use of the nucleic acid molecule of the present invention which does not encode a polypeptide having a galectin-11 functional activity includes, in particular, (1) isolating a galectin-11 gene or an allelic or splice variant thereof in a cDNA library. (2) Verma et al., Human Chromosomes: AM
annual of Basic Technologies, Pergamon P
metaphase chromosomal spread (spread) to provide the exact chromosomal location of the galectin 11 gene, as described in the Res., New York (1988).
In situ hybridization (eg, "FISH") to (3)
A) use in linkage analysis as a marker for chromosome 11; and (4) Northern blot analysis to detect galectin 11 mRNA expression in specific tissues.
【００７１】 しかし、図１もしくは６（配列番号１、２４、もしくは２６）に示されるよう
な本明細書中に開示される核酸配列、寄託されたｃＤＮＡクローンの核酸配列、
図１もしくは６（配列番号２、２５もしくは２７）に示されるポリペプチドをコ
ードする核酸、およびそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８
５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であ
る配列を有する核酸分子が好ましく、これは、実際に、ガレクチン１１機能活性
を有するポリペプチドをコードする。「ガレクチン１１機能活性を有するポリペ
プチド」によって、特定のアッセイにおいて測定された場合、本発明のガレクチ
ン１１タンパク質（例えば、完全（全長）ガレクチン１１および成熟ガレクチン
１１）の機能活性に類似（かならずしも同一であるとは限らない）活性を示すポ
リペプチドが意図される。ガレクチン１１タンパク質活性は、例えば、以下にさ
らに記載されるような、β−ガラクトシド糖（例えば、チオジガラクトシドまた
はラクトース）結合アッセイ、アポトーシスについてのアッセイおよび／または
トリプシン処理されたウサギ赤血球の凝集についてのアッセイを使用して測定さ
れ得る。However, the nucleic acid sequence disclosed herein as shown in FIG. 1 or 6 (SEQ ID NO: 1, 24 or 26), the nucleic acid sequence of the deposited cDNA clone,
At least 75%, 80%, 8% of the nucleic acid encoding the polypeptide shown in FIG. 1 or 6 (SEQ ID NO: 2, 25 or 27), and fragments thereof.
Preferred are nucleic acid molecules having a sequence that is 5%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical, which in fact encodes a polypeptide having galectin 11 functional activity I do. By a "polypeptide having galectin-11 functional activity", the functional activity of a galectin-11 protein of the invention (e.g., the same as, but not necessarily identical to, the full (full-length) galectin-11 and mature galectin-11) as measured in a particular assay. Polypeptides that exhibit (although not necessarily) activity are contemplated. Galectin-11 protein activity can be measured, for example, by a β-galactoside sugar (eg, thiodigalactoside or lactose) binding assay, an assay for apoptosis, and / or an aggregation of trypsinized rabbit erythrocytes, as further described below. It can be measured using an assay.
【００７２】 もちろん、遺伝子コードの縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤＮＡの
核酸配列、図１もしくは６（配列番号１、２４もしくは２６）に示される核酸配
列、図１もしくは６（配列番号２、２５もしくは２７）に示されるポリペプチド
をコードする核酸、またはそのフラグメントに対して、少なくとも７５％、８０
％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同
一である配列を有する、多数の核酸分子が、「ガレクチン１１機能活性を有する
ポリペプチド」をコードするということをすぐに理解する。実際、これらのヌク
レオチド配列の多数の縮重改変体は、同じポリペプチドをコードするので、この
ことは、たとえ上記の比較アッセイを実施しなくとも、当業者に対して明らかで
ある。さらに、縮重改変体ではないそのような核酸分子について、合理的な数が
、ガレクチン１１活性を有するポリペプチドをもコードするということが認識さ
れる。なぜならこれは、以下にさらに記載されるように、当業者が、タンパク質
の機能にあまり有意に影響しないか、またはおそらく有意に影響しないアミノ酸
置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸で置換すること）
を十分に認識しているからである。Of course, due to the degeneracy of the genetic code, one skilled in the art will appreciate the nucleic acid sequence of the deposited cDNA, the nucleic acid sequence shown in FIG. 1 or 6 (SEQ ID NO: 1, 24 or 26), FIG. At least 75%, 80% of the nucleic acid encoding the polypeptide shown in SEQ ID NO: 2, 25 or 27, or a fragment thereof.
Numerous nucleic acid molecules having a sequence that is%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical encode a "polypeptide having galectin 11 functional activity" Understand right away. Indeed, since many degenerate variants of these nucleotide sequences encode the same polypeptide, this will be apparent to one of skill in the art, even without performing the above-described comparative assays. Further, it is recognized that for such nucleic acid molecules that are not degenerate variants, a reasonable number will also encode a polypeptide having galectin-11 activity. This is because, as described further below, one skilled in the art will recognize that amino acid substitutions that do not significantly or possibly significantly affect the function of a protein (eg, replacing one aliphatic amino acid with a second aliphatic amino acid) Substitution with amino acid)
Because they are fully aware of
【００７３】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は
、Ｂｏｗｉｅら、Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−
１３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者らは、タンパク質は、ア
ミノ酸置換について驚くほど寛容性であることを示す。For example, guidance on how to make phenotypically silent amino acid substitutions can be found in Bowie et al., Deciphering the Message in P.
protein Sequences: Tolerance to Amino
Acid Substitutions, Science 247: 1306-
1310 (1990), where the authors show that the protein is surprisingly tolerant of amino acid substitutions.
【００７４】 第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の寛
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較して、保存されるアミノ酸
が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機能について重
要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容されたアミノ酸
の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って
、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生物学的活性を
なおも維持する。The first strategy exploits the tolerance of amino acid substitutions by natural selection during the course of evolution. By comparing amino acid sequences in different species, conserved amino acids can be identified. These conserved amino acids appear to be important for protein function. In contrast, amino acid positions where substitutions have been tolerated by natural selection indicate that these positions are not critical to protein function. Thus, positions that tolerate amino acid substitutions can be modified, but still maintain the biological activity of the protein.
【００７５】 第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中の各残基で１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎｎｉ
ｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（
１９８９））。次いで、得られた変異体分子は生物学的活性について試験され得
る。A second strategy uses genetic engineering to introduce amino acid changes at specific positions in the cloned gene to identify regions important for protein function. For example, site-directed mutagenesis or alanine scanning mutagenesis (
Introducing one alanine mutation at each residue in the molecule) can be used. (Cunni
ngham and Wells, Science 244: 1081-1085 (
1989)). The resulting mutant molecules can then be tested for biological activity.
【００７６】 著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴としては、一般にほとんど保存
されない。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性ア
ミノ酸のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳ
ｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基の
ＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換
；芳香族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズの
アミノ酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換があげられる
。As the authors mention, these two strategies have revealed that proteins are surprisingly tolerant of amino acid substitutions. The authors further indicate which amino acid changes appear to be tolerated at specific amino acid positions in the protein. For example, amino acid residues that are mostly buried (within the tertiary structure of the protein) require nonpolar side chains, but are generally poorly conserved as features of surface side chains. In addition, conservative conservative amino acid substitutions include substitutions of Ala, Val, Leu, and Ile for aliphatic or hydrophobic amino acids;
er and Thr substitutions; acidic residues Asp and Glu substitutions; amide residues Asn and Gln substitutions, basic residues Lys, Arg, and His substitutions; aromatic residues Phe, Tyr, and Trp substitutions and small size amino acid substitutions for Ala, Ser, Thr, Met, and Gly.
【００７７】 例えば、図１（配列番号２）のガレクチン１１のアミノ酸レベルでの部位特異
的変異は、特定のアミノ酸を保存的アミノ酸と置換することによりなされ得る。
好ましい保存的変異としては、以下が挙げられる：Ｍ１と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶ；Ｓ２と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｒ
４と置換したＨ、またはＫ；Ｌ５と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ
；Ｅ６と置換したＤ；Ｖ７と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ；Ｓ１
０と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｈ１１と置換したＫ、または
Ｒ；Ａ１２と置換したＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｌ１３と置換したＡ
、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｑ１５と置換したＮ；Ｇ１６と置換したＡ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｌ１７と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶ；Ｓ１８と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｇ２０と置換し
たＡ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｑ２１と置換したＮ；Ｖ２２と置換した
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ；Ｉ２３と置換したＡ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、またはＶ；Ｉ２４と置換したＡ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｖ２５と置
換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ；Ｒ２６と置換したＨ、またはＫ；Ｇ
２７と置換したＡ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｌ２８と置換したＡ、Ｇ、
Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｖ２９と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、または
Ｍ；Ｌ３０と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｑ３１と置換したＮ
；Ｅ３２と置換したＤ；Ｋ３４と置換したＨ、またはＲ；Ｈ３５と置換したＫ、
またはＲ；Ｆ３６と置換したＷ、またはＹ；Ｔ３７と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｍ、またはＶ；Ｖ３８と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ；Ｓ３
９と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｌ４０と置換したＡ、Ｇ、Ｉ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｒ４１と置換したＨ、またはＫ；Ｄ４２と置換したＥ
；Ｑ４３と置換したＮ；Ａ４４と置換したＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；
Ａ４５と置換したＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｈ４６と置換したＫ、ま
たはＲ；Ａ４７と置換したＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｖ４９と置換し
たＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ；Ｔ５０と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｍ、またはＶ；Ｌ５１と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｒ５２と
置換したＨ、またはＫ；Ａ５３と置換したＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；
Ｓ５４と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｆ５５と置換したＷ、ま
たはＹ；Ａ５６と置換したＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｄ５７と置換し
たＥ；Ｒ５８と置換したＨ、またはＫ；Ｔ５９と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｍ、またはＶ；Ｌ６０と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ａ６１と
置換したＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｗ６２と置換したＦ、またはＹ；
Ｉ６３と置換したＡ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｓ６４と置換したＡ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｒ６５と置換したＨ、またはＫ；Ｗ６６と置換し
たＦ、またはＹ；Ｇ６７と置換したＡ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｑ６８
と置換したＮ；Ｋ６９と置換したＨ、またはＲ；Ｋ７０と置換したＨ、またはＲ
；Ｌ７１と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｉ７２と置換したＡ、
Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｓ７３と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶ；Ａ７４と置換したＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｆ７６と置換し
たＷ、またはＹ；Ｌ７７と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｆ７８
と置換したＷ、またはＹ；Ｙ７９と置換したＦ、またはＷ；Ｑ８１と置換したＮ
；Ｒ８２と置換したＨ、またはＫ；Ｆ８３と置換したＷ、またはＹ；Ｆ８４と置
換したＷ、またはＹ；Ｅ８５と置換したＤ；Ｖ８６と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、またはＭ；Ｌ８７と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｌ８
８と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｌ８９と置換したＡ、Ｇ、Ｉ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｆ９０と置換したＷ、またはＹ；Ｑ９１と置換したＮ
；Ｅ９２と置換したＤ；Ｇ９３と置換したＡ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；
Ｇ９４と置換したＡ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｌ９５と置換したＡ、Ｇ
、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｋ９６と置換したＨ、またはＲ；Ｌ９７と置換し
たＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ａ９８と置換したＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、またはＶ；Ｌ９９と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｎ１００
と置換したＱ；Ｇ１０１と置換したＡ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｑ１０
２と置換したＮ；Ｇ１０３と置換したＡ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｌ１
０４と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｇ１０５と置換したＡ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ａ１０６と置換したＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ま
たはＶ；Ｔ１０７と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍ、またはＶ；Ｓ１０８と置
換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｍ１０９と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、またはＶ；Ｎ１１０と置換したＱ；Ｑ１１１と置換したＮ；Ｑ１１２
と置換したＮ；Ａ１１３と置換したＧ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｌ１１
４と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｅ１１５と置換したＤ；Ｑ１
１６と置換したＮ；Ｌ１１７と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｒ
１１８と置換したＨ、またはＫ；Ｅ１１９と置換したＤ；Ｌ１２０と置換したＡ
、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｒ１２１と置換したＨ、またはＫ；Ｉ１２２
と置換したＡ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｓ１２３と置換したＡ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｇ１２４と置換したＡ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖ；Ｓ１２５と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｖ１２６と置換し
たＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ；Ｑ１２７と置換したＮ；Ｌ１２８と置換
したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、またはＶ；Ｙ１２９と置換したＦ、またはＷ；Ｖ
１３１と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＭ；Ｈ１３２と置換したＫ、
またはＲ；ａｎｄ／またはＳ１３３と置換したＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ、または
Ｖ。For example, a site-specific mutation at the amino acid level of galectin 11 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) can be made by replacing a specific amino acid with a conservative amino acid.
Preferred conservative mutations include: A, G, I, substituted for M1.
L, S, T, or V; A, G, I, L, T, M, or V substituted for S2; R;
H or K substituted with 4; A, G, I, S, T, M or V substituted with L5
D substituted with E6; A, G, I, L, S, T or M substituted with V7; S1
A, G, I, L, T, M or V substituted with 0; K or R substituted with H11; G, I, L, S, T, M or V substituted with A12; substituted with L13 A
, G, I, S, T, M, or V; N substituted with Q15; A substituted with G16;
I, L, S, T, M, or V; A, G, I, S, T, M, or V substituted for L17; A, G, I, L, T, M, or V substituted for S18 A, I, L, S, T, M or V substituted with G20; N substituted with Q21; A, G, I, L, S, T or M substituted with V22; A substituted with I23 , G, L, S, T, M
A, G, L, S, T, M or V substituted with I24; A, G, I, L, S, T or M substituted with V25; H or K substituted with R26 G
A, I, L, S, T, M, or V substituted with 27; A, G, substituted with L28
I, S, T, M, or V; A, G, I, L, S, T, or M substituted for V29; A, G, I, S, T, M, or V substituted for L30; Q31 N replaced with
D substituted with E32; H substituted with K34, or R; K substituted with H35;
Or R; W substituted for F36, or Y; A, G, I, L substituted for T37;
S, M, or V; A, G, I, L, S, T, or M substituted for V38; S3
A, G, I, L, T, M, or V substituted with 9; A, G, I substituted with L40
, S, T, M, or V; H substituted with R41, or K; E substituted with D42.
N substituted with Q43; G, I, L, S, T, M or V substituted with A44;
G, I, L, S, T, M or V substituted with A45; K or R substituted with H46; G, I, L, S, T, M or V substituted with A47; substituted with V49 A, G, I, L, S, T, or M; A, G, I, L, S,
M, or V; A, G, I, S, T, M, or V substituted with L51; H, or K substituted with R52; G, I, L, S, T, M, or substituted with A53 V;
A, G, I, L, T, M, or V substituted with S54; W substituted with F55, or Y; G, I, L, S, T, M, or V substituted with A56; substituted with D57 E; H substituted with R58, or K; A, G, I, L, S substituted with T59.
M, or V; A, G, I, S, T, M, or V substituted for L60; G, I, L, S, T, M, or V substituted for A61; F, substituted for W62, or Y;
A, G, L, S, T, M, or V substituted for I63; A, G substituted for S64
, I, L, T, M, or V; H substituted with R65, or K; F substituted with W66, or Y; A, I, L, S, T, M, or V substituted with G67; Q68.
N substituted with K; H substituted with K69, or R; H substituted with K70, or R
A, G, I, S, T, M, or V substituted for L71; A substituted for I72;
G, L, S, T, M, or V; A, G, I, L, T, M, or V substituted for S73; G, I, L, S, T, M, or V substituted for A74. W substituted for F76, or Y; A, G, I, S, T, M, or V substituted for L77; F78;
W substituted with Y or F; F substituted with Y79 or W; N substituted with Q81
H substituted with R82, or K; W substituted with F83, or Y; W substituted with F84, or Y; D substituted with E85; A, G, I, L substituted with V86;
S, T, or M; A, G, I, S, T, M, or V substituted for L87; L8
A, G, I, S, T, M, or V substituted with 8; A, G, I substituted with L89
, S, T, M, or V; W substituted for F90, or Y; N substituted for Q91
D substituted with E92; A, I, L, S, T, M or V substituted with G93;
A, I, L, S, T, M, or V substituted for G94; A, G substituted for L95
, I, S, T, M, or V; H substituted with K96, or R; A, G, I, S, T, M, or V substituted with L97; G, I, L, substituted with A98. S, T,
M, or V; A, G, I, S, T, M, or V substituted for L99; N100
Q substituted with G; A, I, L, S, T, M or V substituted with G101; Q10
N substituted with 2; A, I, L, S, T, M or V substituted with G103; L1
A, G, I, S, T, M, or V substituted with G04; A, I substituted with G105
, L, S, T, M, or V; G, I, L, S, T, M, or V substituted for A106; A, G, I, L, S, M, or V substituted for T107. A, G, I, L, T, M, or V substituted for S108; A, G, I, L substituted for M109
, S, T, or V; Q substituted with N110; N substituted with Q111; Q112
N substituted with; G, I, L, S, T, M, or V substituted with A113; L11
A, G, I, S, T, M, or V substituted with 4; D substituted with E115; Q1
N substituted with 16; A, G, I, S, T, M or V substituted with L117; R
H substituted for 118, or K; D substituted for E119; A substituted for L120
, G, I, S, T, M, or V; H substituted with R121, or K;
A, G, L, S, T, M, or V substituted with S; A, G, I substituted with S123
, L, T, M, or V; A, I, L, S, T, M, or V substituted with G124; A, G, I, L, T, M, or V substituted with S125; A substituted for A, G, I, L, S, T or M; N substituted for Q127; A, G, I, S, T, M or V substituted for L128; F or W substituted for Y129 V
A, G, I, L, S, T, or M substituted with 131; K substituted with H132,
Or R; A, G, I, L, T, M, or V substituted with and / or S133.
【００７８】 これらと同じ原理を用いて、類似の保存的置換が配列番号２５または２７のポ
リペプチドにおいてなされ得る。Using these same principles, similar conservative substitutions can be made in the polypeptide of SEQ ID NO: 25 or 27.
【００７９】 得られた構築物は、本明細書を通じて記載されるおよび当該分野で公知の活性
または機能について、慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、得られた
構築物は、増大したおよび／または低下したガレクチン１１の活性または機能を
有するが、残りのガレクチン１１の活性または機能は維持される。より好ましく
は、得られた構築物は、１を超える増大したおよび／または低下したガレクチン
１１の活性または機能を有するが、残りのガレクチン１１の活性または機能は維
持される。The resulting constructs can be routinely screened for activities or functions described throughout this specification and known in the art. Preferably, the resulting construct has increased and / or decreased galectin-11 activity or function, while retaining the remaining galectin-11 activity or function. More preferably, the resulting construct has more than one increased and / or reduced galectin 11 activity or function, while retaining the remaining galectin 11 activity or function.
【００８０】 保存的なアミノ酸置換に加えて、ガレクチン１１の改変体は、（ｉ）１つ以上
の非保存的なアミノ酸残基との置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝
コードによってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなく
てもよい、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、ま
たは（ｉｉｉ）別の化合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは可
溶性を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポ
リぺプチドの融合、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融
合領域ペプチド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配
列のような）とのポリぺプチドの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは
、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。In addition to conservative amino acid substitutions, variants of galectin 11 may include (i) substitutions with one or more non-conservative amino acid residues, wherein the substituted amino acid residues are May or may not be an encoded amino acid residue, or (ii) substitution with one or more amino acid residues having a substituent, or (iii) another compound (eg, Fusion of the mature polypeptide with a compound (eg, polyethylene glycol) to increase the stability and / or solubility of the peptide, or (iv) additional amino acids (eg, an IgG Fc fusion region peptide, or leader or secretion) Sequence, or a sequence that facilitates purification). Such variant polypeptides are considered to be within the purview of those skilled in the art given the teachings herein.
【００８１】 例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電されたアミノ
酸のアミノ酸置換を含むガレクチン１１ポリぺプチド改変体は、改善された特性
（例えば、より少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物
の凝集は、凝集体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増
加の両方をもたらす。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ
３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３
０７−３７７（１９９３））。For example, a galectin-11 polypeptide variant comprising an amino acid substitution of a charged amino acid with another charged or neutral amino acid has improved properties (eg, less aggregation) Protein can be produced. Aggregation of a pharmaceutical formulation results in both reduced activity and increased clearance due to the immunogenic activity of the aggregate. (Pinkard et al., Clin. Exp. Immuno.
l. 2: 331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes.
36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev .. T
herapeutic Drug Carrier Systems 10: 3
07-377 (1993)).
【００８２】 例えば、図１（配列番号２）のガレクチン１１の好ましい非保存的置換として
は、以下が挙げられる：Ｍ１と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｓ２と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣ；Ｐ３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣ；Ｒ４と置換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ５と置換したＤ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｅ６と置換したＨ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｖ
７と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｐ８と
置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＣ；Ｃ９と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰ；Ｓ１０と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｈ１１と置換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ａ１２と置換し
たＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ１３と置換した
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｐ１４と置換したＤ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ま
たはＣ；Ｑ１５と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｇ１６と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ１７と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｓ１８と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｐ１９と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣ；Ｇ２０と置換したＤ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｑ２１と置換したＤ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｖ
２２と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｉ２
３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｉ２４
と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｖ２５と
置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｒ２６と置
換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣ；Ｇ２７と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣ；Ｌ２８と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃ；Ｖ２９と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
；Ｌ３０と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；
Ｑ３１と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｅ３２と置換したＨ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｐ３３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣ；Ｋ
３４と置換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣ；Ｈ３５と置換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｆ３６と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ；Ｔ３７と置換したＤ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｖ３８と置換したＤ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｓ３９と置換したＤ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ４０と置換したＤ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｒ４１と置換したＤ、Ｅ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｄ４２と置
換したＨ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣ；Ｑ４３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ａ４４と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ａ４５と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｈ４６と置換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ａ４７と置換したＤ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｐ４８と置換したＤ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣ；
Ｖ４９と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｔ
５０と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ５
１と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｒ５２
と置換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣ；Ａ５３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣ；Ｓ５４と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣ；Ｆ５５と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ；Ａ５６と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｄ５７と置換したＨ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｒ５８と置換したＤ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｔ５９と
置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ６０と置
換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ａ６１と置換
したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｗ６２と置換し
たＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、または
Ｃ；Ｉ６３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
；Ｓ６４と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；
Ｒ６５と置換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｗ６６と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ；Ｇ６７と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｑ６８と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｋ６９と置換した
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
；Ｋ７０と置換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ７１と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｉ７２と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣ；Ｓ７３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣ；Ａ７４と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣ；Ｐ７５と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣ；Ｆ７６と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ；Ｌ７７と置換した
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｆ７８と置換したＤ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ；
Ｙ７９と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｐ、またはＣ；Ｐ８０と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣ；Ｑ８１と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｒ８２
と置換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣ；Ｆ８３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ；Ｆ８４と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ；Ｅ８５と置換したＨ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｖ
８６と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ８
７と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ８８
と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ８９と
置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｆ９０と置
換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、ま
たはＣ；Ｑ９１と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｅ９２と置換したＨ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｇ９３と置換したＤ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｇ９４と置換したＤ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ９５と置換したＤ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｋ９６と置換したＤ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ９７と
置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ａ９８と置
換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ９９と置換
したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｎ１００と置換
したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣ；Ｇ１０１と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣ；Ｑ１０２と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｇ１０３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ１０４と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｇ１０５と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ａ１０６と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｔ１０７と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｓ１０８と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｍ１０９と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｎ１１０と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｑ１１１と置換
したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣ；Ｑ１１２と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ａ１１３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ１１４と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｅ１１５と置換したＨ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｑ１１６と置換
したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣ；Ｌ１１７と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣ；Ｒ１１８と置換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｅ１１９と置換したＨ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ１２０と置換した
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｒ１２１と置換した
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
；Ｉ１２２と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
；Ｓ１２３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
；Ｇ１２４と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
；Ｓ１２５と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
；Ｖ１２６と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
；Ｑ１２７と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｌ１２８と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；Ｙ１２９と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ；Ｃ１３０と置換したＤ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰ
；Ｖ１３１と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
；Ｈ１３２と置換したＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ；ａｎｄ Ｓ１３３と置換したＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ。これらと同じ原理を用いて、類似の非保存的置
換が配列番号２５または２７のポリペプチドにおいてなされ得る。For example, preferred non-conservative substitutions for galectin 11 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) include: D, E, H, K, R, N, Q, F, W substituted for M1. ,
Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y,
P or C; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T,
M, V, N, Q, F, W, Y, or C; D, E, A, G, I,
L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; D substituted for L5,
E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; H, K,
R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; V
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with 7; D, E, H, K, R, A, G, I, L substituted with P8 , S, T, M, V, N, Q, F,
W, Y, or C; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, substituted for C9
T, M, V, N, Q, F, W, Y, or P; D, E, H, K substituted for S10
, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, A, G,
I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y substituted for A12 , P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with L13; D substituted with P14
, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, or C; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M,
V, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q substituted for G16
, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q,
F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F substituted for S18
, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, A, G, I,
L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, or C; D, E substituted for G20
, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E,
H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, or C; V
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with 22;
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with 3;
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with V; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, substituted with V25 Y, P, or C; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with R26; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P substituted for L28 Or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with V29
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with L30;
D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F,
W, Y, P, or C; H, K, R, A, G, I, L, S, T substituted for E32.
, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H,
K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, or C; K
34, D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y
, P, or C; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V,
N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N substituted for F36
, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, or C; D substituted for T37,
E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E substituted for V38
, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E,
H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H substituted for L40
, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, A,
G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; H, K, R, A, G, I, L, S, T substituted with D42 , M, V, N, Q, F, W, Y, P
Or C; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T,
M, V, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N substituted for A44
, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N,
Q, F, W, Y, P, or C; D, E, A, G, I, L, S substituted for H46
, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E,
H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H substituted for P48
, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, or C;
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P or C substituted with V49; T
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with 50; L5
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with 1; R52
D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P
Or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P,
Or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with S54; or D, E, H, K, R, N, Q, substituted with F55. A, G, I, L, S,
T, M, V, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F substituted for A56
, W, Y, P, or C; H, K, R, A, G, I, L, S,
T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, A substituted for R58
, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted for L60; D, E, H, K, substituted for A61. R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V substituted with W62. , P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with I63
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted for S64;
D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W,
Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I substituted for W66
, L, S, T, M, V, P, or C; D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, A substituted for Q68
, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, or C; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C
D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W substituted for K70
, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W,
Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y substituted with I72
, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y,
P or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P substituted for A74
Or C; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T,
M, V, N, Q, F, W, Y, or C; D, E, H, K, R substituted for F76
, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P or C; D substituted with F78
, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, or C;
D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M,
V, P, or C; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S substituted for P80
, T, M, V, N, Q, F, W, Y, or C; D, E, H,
K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, or C; R82
D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P
Or C; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L,
S, T, M, V, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q substituted for F84
, A, G, I, L, S, T, M, V, P, or C; H, K,
R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; V
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with 86; L8
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with 7; L88
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with L89; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, substituted with L89 Y, P or C; D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P or C substituted with F90; substituted with Q91 D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M,
V, F, W, Y, P, or C; H, K, R, A, G, I, L substituted for E92
, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; D substituted for G93,
E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E substituted for G94
, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E,
H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, A substituted for K96
, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted for A98; D, E, H, K, substituted for L99. R, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W substituted for N100 , Y, P,
Or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P,
Or C; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T,
M, V, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R,
A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S substituted for Q111 , T, M, V, F, W, Y, P,
Or C; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T,
M, V, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R,
N, Q, F, W, Y, P, or C; H, K, R, A, G,
I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, A, G, I, L, S substituted for Q116 , T, M, V, F, W, Y, P,
Or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P,
Or C; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N,
Q, F, W, Y, P, or C; H, K, R, A, G, I,
L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P substituted for L120 Or C; D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with R121
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted for I122;
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted for S123;
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted for G124;
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted for S125;
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted for V126;
D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V,
F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q,
F, W, Y, P, or C; D, E, H, K, R, N, Q,
A, G, I, L, S, T, M, V, P, or C; D, E, substituted for C130
H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, or P
D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, or C substituted with V131
D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F,
W, Y, P, or C; and D, E, H, K, R, N, substituted with S133.
Q, F, W, Y, P, or C. Using these same principles, similar non-conservative substitutions can be made in the polypeptide of SEQ ID NO: 25 or 27.
【００８３】 得られた構築物は、本明細書を通じて記載されるおよび当該分野で公知の活性
または機能について、慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、得られた
構築物は、増大したおよび／または低下したガレクチン１１の活性または機能を
有するが、残りのガレクチン１１の活性または機能は維持される。より好ましく
は、得られた構築物は、１を超えるの増大したおよび／または低下したガレクチ
ン１１の活性または機能を有するが、残りのガレクチン１１の活性または機能は
維持される。[0083] The resulting constructs can be routinely screened for activities or functions described throughout this specification and known in the art. Preferably, the resulting construct has increased and / or decreased galectin-11 activity or function, while retaining the remaining galectin-11 activity or function. More preferably, the resulting construct has more than one increased and / or reduced galectin-11 activity or function, while retaining the remaining galectin-11 activity or function.
【００８４】 さらに、１を超えるアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、お
よび１０）は、上記のような（保存的かまたは非保存的のいずれかの）置換アミ
ノ酸と置換され得る。置換アミノ酸は、ガレクチン１１タンパク質の全長、成熟
、またはプロプロテイン、ならびに一般式ｍ−ｎ［ｍ1−ｎ1、ｍ1−ｎ2、ｍ1−
ｎ3、ｍ2−ｎ1、ｍ2−ｎ2、ｍ2−ｎ3、ｍ3−ｎ1、ｍ3−ｎ2、およびｍ3−ｎ3］
を有する、Ｎ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体において生じ得る。Further, more than one amino acid (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10) may be as described above (either conservative or non-conservative). It can be replaced with a substituted amino acid. Substituted amino acids, galectin 11 full-length protein, mature, or proprotein and formula m-n [m 1 -n 1 ,, m 1 -n 2, m 1 -
n 3, m 2 -n 1, m 2 -n 2, m 2 -n 3, m 3 -n 1, m 3 -n 2, and m 3 -n 3]
Can occur in N-terminal deletion mutants and C-terminal deletion mutants having
【００８５】 本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つアミノ酸置換を含むが、５０を
超えないアミノ酸置換、なおより好ましくは、４０を超えないアミノ酸置換、さ
らにより好ましくは、３０を超えないアミノ酸置換、およびなおさらにの好まし
くは、２０を超えないアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を有するガレクチン１
１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。もちろん、増え続
ける優先順に、少なくとも１つ、しかし１０、９、８、７、６、５、４、３、２
、または１を超えないアミノ酸置換を含む、ガレクチン１１ポリペプチドのアミ
ノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することは、ポリペプチドに非常に好ましい。
特定の実施形態では、配列番号２、２５、または２７、あるいはそのフラグメン
ト（例えば、成熟形態および／または本明細書中に記載される他のフラグメント
）のアミノ酸配列における、付加、置換、および／または欠失の数は、１〜５、
５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、または５０〜１５０であり、保存
的アミノ酸置換が好ましい。A further embodiment of the invention comprises at least one amino acid substitution, but no more than 50 amino acid substitutions, even more preferably no more than 40 amino acid substitutions, even more preferably no more than 30 amino acid substitutions. And even more preferably a galectin 1 having an amino acid sequence comprising no more than 20 amino acid substitutions
A polypeptide comprising the amino acid sequence of one polypeptide. Of course, at least one, but 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 in increasing priority order
It is highly preferred for polypeptides to have an amino acid sequence that comprises the amino acid sequence of a galectin-11 polypeptide, including no more than one amino acid substitution.
In certain embodiments, additions, substitutions, and / or amino acid sequences of SEQ ID NO: 2, 25, or 27, or fragments thereof (eg, the mature form and / or other fragments described herein) are provided. The number of deletions is 1-5,
5-10, 5-25, 5-50, 10-50, or 50-150, with conservative amino acid substitutions being preferred.
【００８６】 （ベクター、宿主細胞、およびタンパク質産生） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、本発明のポリ
ヌクレオチドおよび／または組換えベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞
、および組換え技術によるガレクチン１１ポリペプチドおよびそのフラグメント
、変異体、改変体、誘導体、およびアナログの産生に関連する。(Vector, Host Cell, and Protein Production) The present invention also relates to a vector containing the isolated DNA molecule of the present invention, a host genetically engineered using the polynucleotide and / or the recombinant vector of the present invention. It relates to the production of galectin-11 polypeptides and fragments, variants, variants, derivatives, and analogs thereof by cells and recombinant techniques.
【００８７】 ガレクチン１１ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカー
を含むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシ
ウム沈澱物のような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベ
クターがウイルスである場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を
使用してインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質導入され得る
。[0087] The galectin-11 polynucleotide can be ligated to a vector containing a selectable marker for propagation in a host. Generally, a plasmid vector is introduced in a precipitate, such as a calcium phosphate precipitate, or in a complex with a charged lipid. If the vector is a virus, it can be packaged in vitro using a suitable packaging cell line and then transduced into host cells.
【００８８】 １つの実施形態では、本発明のＤＮＡは、適切な異種制御エレメント（例えば
、プロモーターまたはエンハンサー）（いくつか挙げれば、例えば、ファージλ
ＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーターお
よびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモ
ーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結され
る。他の適切なプロモーターおよびエンハンサーは当業者に公知である。In one embodiment, the DNA of the present invention comprises a suitable heterologous control element (eg, a promoter or enhancer) (eg, phage λ, to name a few).
PL promoter, E. E. coli lac promoter, trp promoter and tac promoter, SV40 early promoter and SV40 late promoter, and the promoter of the retroviral LTR. Other suitable promoters and enhancers are known to those skilled in the art.
【００８９】 発現構築物を含むベクターにおける実施形態では、これらの発現構築物はさら
に、転写開始、転写終結のための部位、および転写領域において、翻訳のための
リボソーム結合部位を含む。この構築物によって発現される転写物のコード部分
は、好ましくは、始めに翻訳開始コドン、および翻訳されるべきポリペプチドの
末端に適切に配置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。In embodiments in vectors containing expression constructs, these expression constructs further include sites for transcription initiation, termination, and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the transcript expressed by this construct preferably includes a translation initiation codon first and a termination codon (UAA, UGA or UAG) appropriately positioned at the end of the polypeptide to be translated.
【００９０】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼまたはＧ４１８ネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌に
おいて培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性
遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞；昆虫細胞（例え
ばＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；
動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｃ１２７細胞、３
Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）
；ならびに植物細胞を含むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための
適切な培養培地および条件は、当該分野で公知である。As indicated, the expression vectors preferably include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or G418 neomycin resistance for eukaryotic cell culture, and E. coli. Includes a tetracycline, kanamycin or ampicillin resistance gene for culturing in E. coli and other bacteria. Representative examples of suitable hosts include bacterial cells (eg, E. coli,
Streptococcus staphylococci, Bacillus
subtilis, Streptomyces and Salmonella
typhimurium cells); fungal cells (eg, yeast cells); insect cells (eg, Drosophilia S2 and Spodoptera Sf9 cells);
Animal cells (for example, CHO cells, COS cells, Hela cells, C127 cells,
T3 cells, BHK cells, HEK293 cells, and Bowes melanoma cells)
As well as, but not limited to, plant cells. Suitable culture media and conditions for the above-described host cells are known in the art.
【００９１】 宿主細胞における発現のために適切なベクターおよびプロモーターの選択は、
周知手順であり、そして発現ベクター構築、宿主へのベクターの導入、および宿
主における発現のために必須の技術は、当該分野において慣用的技術である。非
常に多様な発現ベクターが、本発明のガレクチン１１ポリペプチドおよびフラグ
メント、改変体、誘導体、ならびにアナログを発現させるために使用され得る。
このようなベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウ
イルス誘導ベクター（例えば、細菌プラスミド由来ベクター、バクテリオファー
ジ由来ベクター、酵母エピソーム由来ベクター、酵母染色体エレメントベクター
、ウイルス由来ベクター（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス（例えば
、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬
病ウイルス、およびレトロウイルス）、ならびにこれらの組み合わせに由来する
ベクター（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント（例
えば、コスミドおよびファージミド）に由来するベクター）が挙げられ、これら
はすべて、本発明のこの局面に従う発現のために使用され得る。一般的に、宿主
においてポリペプチドを発現させるようにポリヌクレオチドを維持、増殖、また
は発現させるのに適切な任意のベクターが使用され得る。適切なヌクレオチド配
列は、任意の種々の公知技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８９、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪ
ｏｈｎ ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｙｅｗ Ｙｏｒｋに示される技術）
によって、発現ベクター系に挿入され得る。Selection of suitable vectors and promoters for expression in a host cell
Techniques that are well known and essential for expression vector construction, introduction of the vector into the host, and expression in the host are routine in the art. A wide variety of expression vectors can be used to express the galectin-11 polypeptides and fragments, variants, derivatives, and analogs of the present invention.
Such vectors include chromosomal vectors, episomal vectors, and virus-derived vectors (eg, bacterial plasmid-derived vectors, bacteriophage-derived vectors, yeast episome-derived vectors, yeast chromosome element vectors, and virus-derived vectors (eg, baculovirus, papovavirus). (Eg, SV40), vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus, and retrovirus), and vectors (eg, plasmids and bacteriophage genetic elements (eg, cosmids and phagemids)) derived from combinations thereof. And vectors that can be used for expression in accordance with this aspect of the invention. Maintaining the polynucleotide to express the growth, or any suitable vectors for expression can be used. The appropriate nucleotide sequence may be any of a variety of known techniques (see, eg, Ausubel et al., Eds., 1989, Cur
Rent Protocols in Molecular Biology,
Green Publishing Associates, Inc. And J
ohn Wiley & Sons, Inc. , A technology shown in New York)
Can be inserted into an expression vector system.
【００９２】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢＳベクター
、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８
Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ
、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａから入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬ
ＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶ
Ｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切なベクターは当業者に
容易に明らかである。Among the preferred vectors for use in bacteria are pQE70, pQE6
0 and pQE-9 (available from QIAGEN, Inc.); pBS vector, Phasescript vector, Bluescript vector, pNH8
A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene Cl
oning Systems, Inc. And ptrc99a
, PKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Phar
macia.). Among preferred eukaryotic vectors are pWL
NEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG (Stratag
and pSVK3, pBPV, pMSG and pSV
L (available from Pharmacia). Other suitable vectors will be readily apparent to one skilled in the art.
【００９３】 本発明はまた、本明細書中で議論されたベクター構築物を含む宿主細胞に関し
、そしてさらに、当該分野における公知技術を使用して、１つ以上の異種制御領
域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と作動可能に連結され
た本発明のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を含む。上記で議論されたように、
宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞））
、もしくは下等真核細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は
、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。挿入された遺伝子配列の発現
を調節するか、または所望される特定の様式において遺伝子産物を改変およびプ
ロセスする宿主株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘
発因子の存在下で上昇され得る；従って、遺伝子操作されたポリペプチドの発現
は制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後の
プロセシングおよび修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、切断）について特
徴および特異的な機構を有する。適切な細胞株は、発現される外来タンパク質の
所望される修飾およびプロセシングを保証するように選択され得る。[0093] The present invention also relates to host cells containing the vector constructs discussed herein, and further using one of the techniques known in the art, for one or more heterologous control regions (eg, promoters and / or Or a host cell comprising a nucleotide sequence of the invention operably linked to an enhancer). As discussed above,
The host cell is a higher eukaryotic cell (eg, a mammalian cell (eg, a human-derived cell)).
Or lower eukaryotic cells (eg, yeast cells) or host cells can be prokaryotic cells (eg, bacterial cells). Host strains may be chosen which modulate the expression of the inserted gene sequences, or modify and process the gene product in the specific fashion desired. Expression from a particular promoter can be elevated in the presence of a particular inducer; thus, expression of the engineered polypeptide can be controlled. In addition, different host cells have characteristic and specific mechanisms for the translation and post-translational processing and modification of proteins (eg, glycosylation, phosphorylation, cleavage). Appropriate cell lines can be chosen to ensure the desired modification and processing of the foreign protein expressed.
【００９４】 小胞体の内腔、ペリプラズム空間、または細胞外環境への翻訳されたタンパク
質の分泌のために、適切な分泌シグナルが、当該分野において公知の技術を使用
して、所望のポリペプチド内に組込まれ得る。これらのシグナルは、ポリペプチ
ドに対して内因性であり得るか、または異種シグナルであり得る。For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space, or into the extracellular milieu, appropriate secretion signals are generated within the desired polypeptide using techniques known in the art. Can be incorporated into These signals can be endogenous to the polypeptide or they can be heterologous signals.
【００９５】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような多くの標
準的実験室マニュアルに記載されている。ガレクチン１１ポリペプチドは、実際
、組換えベクターを欠く宿主細胞により発現され得る。The introduction of the construct into the host cell can be performed by calcium phosphate transfection, DE
It can result from AE-dextran-mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such a method is described in Davis et al., Basic Method.
It is described in many standard laboratory manuals, such as s In Molecular Biology (1986). Galectin-11 polypeptides can, in fact, be expressed by host cells that lack the recombinant vector.
【００９６】 ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態（（異なるタンパク
質の）異種タンパク質配列にペプチド結合を介して連結されたポリペプチドを含
む）で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、付加的な異種の機能的領域
も含み得る。例えば、付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、精製の
間の、または続く操作および保存の間の、宿主細胞内での安定性および持続性を
改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が
、精製を容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポ
リペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じさ
せるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分
のポリペプチドへの付加は、当該分野でよく知られており、そして慣用的な技術
である。あるいは、そのような融合タンパク質は、タンパク質合成技術によって
（例えば、ペプチド合成機の使用によって）、作製され得る。The polypeptide may be expressed in a modified form, such as a fusion protein, including a polypeptide linked via a peptide bond to a heterologous protein sequence (of a different protein), and may contain not only secretion signals but also May also include additional heterogeneous functional domains. For example, the region of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be used to improve stability and persistence in a host cell during purification or during subsequent manipulation and storage, such that the N-terminal Can be added to Also, peptide moieties can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. In particular, the addition of peptide moieties to polypeptides to cause secretion or excretion, improve stability, and to facilitate purification is well known in the art, and is well known in the art. is there. Alternatively, such fusion proteins can be made by protein synthesis techniques (eg, by use of a peptide synthesizer).
【００９７】 好ましい融合タンパク質は、タンパク質の可溶化に有用な免疫グロブリン由来
の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ対応出願２
０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン
分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融
合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり
、従って、例えば、改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２
２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有
利な様式で、発現され、検出され、そして精製された後にＦｃ部分が欠失され得
ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用の妨害で
あると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用さ
れるべき場合）である。創薬において、例えば、ｈＩＬ５−のようなヒトタンパ
ク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニン
グアッセイの目的でＦｃ部分と融合されている。Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｄ．
Ｒｅｃｏｇ．８：５２−５８（１９９５）、およびＪｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１６）：９４５９−９４７１頁（１９９５）を参照
のこと。[0097] Preferred fusion proteins contain a heterologous region from an immunoglobulin that is useful for solubilizing the protein. For example, EP-A-O 464 533 (Canadian correspondence application 2)
No. 045869) discloses a fusion protein comprising various portions of the constant region of an immunoglobulin molecule together with another human protein or portion thereof. In many cases, the Fc portion in a fusion protein is sufficiently advantageous for use in therapy and diagnosis, thus resulting, for example, in improved pharmacokinetic properties (EP-A 0232).
262). On the other hand, for some uses, it is desirable that the Fc portion can be deleted after the fusion protein has been expressed, detected and purified in the advantageous manner described. This is when the Fc moiety proves to be an obstacle to its use in therapy and diagnosis (eg, when the fusion protein is to be used as an antigen for immunization). In drug discovery, for example, human proteins such as hIL5- have been fused to Fc portions for the purpose of high-throughput screening assays to identify antagonists of hIL-5. Bennett et al. Md.
Recog. 8: 52-58 (1995), and Johanson et al. B
iol. Chem. 270 (16): 9449-9471 (1995).
【００９８】 ガレクチン１１タンパク質は、硫安沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イ
オンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ
ィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィ
ーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得
る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のた
めに用いられる。Galectin-11 protein can be prepared by ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography, and lectin chromatography. It can be recovered from recombinant cell culture and purified by well-known methods, including chromatography. Most preferably, high performance liquid chromatography ("HPLC") is used for purification.
【００９９】 本発明のポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核
生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細
胞、真骨魚類細胞、鳥類細胞および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によっ
て産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、
本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され
得る。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセ
スの結果として、改変された開始メチオニン残基を含み得るか、または開始メチ
オニン残基を失い得る。従って、一般に、翻訳開始コドンによってコードされる
Ｎ末端メチオニンが、すべての真核生物細胞における翻訳後の任意のタンパク質
から高い効率で除去されることは当該分野において周知である。ほとんどのタン
パク質においてＮ末端メチオニンもまた、ほとんどの原核生物において効果的に
除去されるが、いくつかのタンパク質について、この原核生物除去プロセスは、
Ｎ末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存しており、非効率的であ
る。The polypeptides of the present invention can be obtained from natural purified products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, plant cells, insect cells, teleost cells, (Including bird cells and mammalian cells) by recombinant techniques. Depending on the host used in the recombinant production procedure,
The polypeptides of the invention can be glycosylated or non-glycosylated. In addition, the polypeptides of the invention may also contain, or in some cases lose, an altered starting methionine residue as a result of a host-mediated process. Thus, it is well known in the art that, in general, the N-terminal methionine encoded by the translation initiation codon is removed with high efficiency from any protein after translation in all eukaryotic cells. Although the N-terminal methionine in most proteins is also effectively removed in most prokaryotes, for some proteins this prokaryotic removal process involves:
It is inefficient, depending on the nature of the amino acid to which the N-terminal methionine is covalently attached.
【０１００】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の初代（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、２代目（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞
を含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、ガレクチン１１コー
ド配列）を欠失または置換するように操作されており、そして／または本発明の
ガレクチン１１ポリヌクレオチドと作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異
種ポリヌクレオチド配列）を含むように操作され、そして内因性のガレクチン１
１ポリヌクレオチドを活性化、変更、および／または増幅する。例えば、当該分
野で公知の技術は、相同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーター
および／またはエンハンサー）ならびに内因性ガレクチン１１ポリヌクレオチド
配列を作動可能に連結して、新規の転写ユニットの形成を生じさせるために使用
され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，
６７０号；１９９８年３月３１日に公開された米国特許第５，７３３，７６１号
；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ ９６／２９４１１号；１
９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌ
ｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８
９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３
５−４３８（１９８９）を参照のこと。これらの開示の各々は、それら全体にお
いて参考として援用される）。In addition to including host cells containing the vector constructs discussed herein, the present invention also provides primar of vertebrate (particularly mammalian) origin.
y) Including host cells, secondary host cells, and immortalized host cells. These host cells have been engineered to delete or replace endogenous genetic material (eg, galectin-11 coding sequences) and / or have been genetically operably linked to a galectin-11 polynucleotide of the invention. Engineered to contain a substance (eg, a heterologous polynucleotide sequence) and endogenous galectin 1
Activate, alter, and / or amplify one polynucleotide. For example, techniques known in the art include operably linking, via homologous recombination, a heterologous control region (eg, promoter and / or enhancer) and an endogenous galectin-11 polynucleotide sequence to form a novel transcription unit. (See, for example, US Pat. No. 5,641, issued June 24, 1997)
No. 670; U.S. Pat. No. 5,733,761 published Mar. 31, 1998; International Publication No. WO 96/29411 published Sep. 26, 1996;
International Publication No. WO 94/12650 published Aug. 4, 994; Koll
er et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8
935 (1989); and Zijlstra et al., Nature 342: 43.
See 5-438 (1989). Each of these disclosures is incorporated by reference in their entirety).
【０１０１】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、ガレ
クチン１１ポリペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合
成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または
化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのガレクチン１１ポリペプ
チド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれ
らに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−ア
ミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａ
ｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピ
オン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコ
シン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−
ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、
フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ
−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ。さ
らに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。In addition, polypeptides of the invention can be chemically synthesized using techniques known in the art (eg, Creighton, 1983, Proteins: Stru.
cultures and Molecular Principles, W.C. H.
Freeman & Co. , N .; Y. And Hunkapiller et al., Na
cure, 310: 105-111 (1984)). For example, a polypeptide corresponding to a fragment of a galectin-11 polypeptide can be synthesized by use of a peptide synthesizer. In addition, if desired, nonclassical amino acids or chemical amino acid analogs can be introduced as a substitution or addition into the galectin-11 polypeptide sequence. Non-classical amino acids include, but are not limited to, the D isomer of a normal amino acid, 2,4-diaminobutyric acid, a-aminoisobutyric acid, 4-aminobutyric acid, Abu, 2-aminobutyric acid, g -Abu, e-A
hx, 6-aminohexanoic acid, Aib, 2-aminoisobutyric acid, 3-aminopropionic acid, ornithine, norleucine, norvaline, hydroxyproline, sarcosine, citrulline, homocitrulline, cysteic acid, t-butylglycine, t-
Butylalanine, phenylglycine, cyclohexylalanine, b-alanine,
Fluoroamino acids, designer amino acids (eg, b-methyl amino acids), Ca
-Methyl amino acids, Na-methyl amino acids, and common amino acid analogs. Further, the amino acid can be D (dextrorotary) or L (levorotary).
【０１０２】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質
分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改
変されるガレクチン１１ポリペプチドを含む。任意の多数の化学的改変は、以下
を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、
トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による
特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存
在下での代謝合成；など。The present invention relates to methods for, for example, glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization with known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, antibody molecules or other cellular activities during or after translation. Includes galectin-11 polypeptides that are differentially modified, such as by binding to a ligand. Any of a number of chemical modifications can be performed by known techniques, including but not limited to: cyanogen bromide,
Trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, specific chemical cleavage by NaBH 4; acetylation, formylation, oxidation, reduction; metabolic synthesis in the presence of tunicamycin; like.
【０１０３】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖質鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシ
ング）、アミノ酸バックボーンへの化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型
の糖質鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオ
ニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例え
ば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、こ
のタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。Additional post-translational modifications included by the present invention include, for example: N-linked or O-linked carbohydrate chains (N- or C-terminal processing), chemical moieties to the amino acid backbone , Chemical modification of N- or O-linked carbohydrate chains, and addition or deletion of N-terminal methionine residues as a result of prokaryotic host cell expression. The polypeptide may also be modified with a detectable label (eg, an enzymatic, fluorescent, isotopic or affinity label) to allow for detection and isolation of the protein.
【０１０４】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、本発明のポ
リペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を
参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエ
チレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選
択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置で、またはこの
分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を
含み得る。The present invention also provides chemically modified derivatives of the polypeptides of the present invention that may provide additional advantages, such as increased solubility, stability and circulation time, or reduced immunogenicity of the polypeptide. (See US Pat. No. 4,179,337). The chemical moiety for derivatization can be selected from water-soluble polymers such as polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymer, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, and the like. The polypeptide can be modified at random positions in the molecule or at predetermined positions in the molecule, and can include one, two, three or more attached chemical moieties.
【０１０５】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、ある場
合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原
性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリ
コールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例えば、ポ
リエチレングリコールは、約２００；５００；１０００；１５００；２０００；
２５００；３０００；３５００；４０００；４５００；５０００；５５００；６
０００；６５００；７０００；７５００；８０００；８５００；９０００；９５
００；１０，０００；１０，５００；１１，０００；１１，５００；１２，００
０；１２，５００；１３，０００；１３，５００；１４，０００；１４，５００
；１５，０００；１５，５００；１６，０００；１６，５００；１７，０００；
１７，５００；１８，０００；１８，５００；１９，０００；１９，５００：２
０，０００ ；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，０００；５
０，０００；５５，０００；６０，０００；６５，０００；７０，０００；７５
，０００；８０，０００；８５，０００；９０，０００；９５，０００；または
１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。The polymer can be of any molecular weight and can be branched or unbranched. For polyethylene glycol, the preferred molecular weight is between about 1 kDa and about 100 kDa for ease of handling and manufacture (the term "about" means that in the preparation of polyethylene glycol, some molecules may have higher molecular weights than indicated). Heavy and some are lighter than the indicated molecular weight). The desired therapeutic profile (eg, the desired duration of sustained release, in some cases effects on biological activity, ease of handling, degree of antigenicity or lack of antigenicity, and Other sizes may be used, depending on other known effects of polyethylene glycol). For example, polyethylene glycol is about 200; 500; 1000; 1500; 2000;
2500; 3000; 3500; 4000; 4500; 5000; 5500;
000; 6500; 7000; 7500; 8000; 8500; 9000; 95
00; 10,000; 10,500; 11,000; 11,500; 12,000
0; 12,500; 13,000; 13,500; 14,000; 14,500
15,000; 15,000; 16,000; 16,500; 17,000;
17,500; 18,000; 18,500; 19,000; 19,500: 2
0,000; 25,000; 30,000; 35,000; 40,000; 5
0,000; 55,000; 60,000; 65,000; 70,000; 75
8,000; 80,000; 85,000; 90,000; 95,000; or 100,000 kDa.
【０１０６】 上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝鎖を有していてもよい。分枝
ポリエチレングリコールは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，６４３
，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓ
ｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：２７４５− ２７５０（１９９９）
；およびＣａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−
６４６（１９９９）（これらの各々の開示は、参考として援用される）。As described above, polyethylene glycol may have a branched chain. Branched polyethylene glycols are described, for example, in: US Pat. No. 5,643.
Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotech
nol. 56: 59-72 (1996); Vorovjev et al., Nucleos.
ids Nucleotides 18: 2745-2750 (1999)
And Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10: 638-
646 (1999), the disclosure of each of which is incorporated by reference.
【０１０７】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰ
ＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−
１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコ
ールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってア
ミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコ
ール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレン
グリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のため
に好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合で
ある。A polyethylene glycol molecule (or other chemical moiety) should be attached to a protein in view of its effect on the functional or antigenic domains of the protein. There are a number of conjugation methods available to those of skill in the art (see, for example, EP 0 401 384 (P in G-CSF, incorporated herein by reference).
EG), Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028-
1035 (1992) (pegylation of GM-CSF using tresyl chloride)
report)) also see)). For example, polyethylene glycol can be covalently linked via an amino acid residue by a reactive group (eg, a free amino or carboxyl group). Reactive groups are groups to which activated polyethylene glycol molecules can bind. Amino acid residues having a free amino group may include lysine residues and N-terminal amino acid residues; amino acid residues having a free carboxyl group include aspartic acid residues, glutamic acid residues and C-terminal amino acid residues Residues may be mentioned. Sulfhydryl residues can also be used as a reactive group for attaching polyethylene glycol molecules. Preferred for therapeutic purposes is attachment at an amino group, such as attachment at the N-terminus or lysine group.
【０１０８】 上記に示唆されるように、ポリエチレングリコールは、任意の多数のアミノ酸
残基に対する結合を介してタンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレング
リコールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸
残基、またはシステイン残基に対する共有結合を介してタンパク質に結合され得
る。１つ以上の反応化学を用いて、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、
リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）また
は、タンパク質のアミノ酸残基のひとつより多い型（例えば、リジン、ヒスチジ
ン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびそれらの組み合わせ）に
対してポリエチレングリコールを結合し得る 特にＮ末端で化学的に改変されたタンパク質が所望され得る。本発明の組成物
の例示としてポリエチレングリコールを用いて、種々のポリエチレングリコール
分子（分子量、分枝などによる）、反応混合物中のタンパク質（ポリペプチド）
分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、実行されるべきペグ化（ｐｅ
ｇｙｌａｔｉｏｎ）反応物の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質を得
る方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化調製物を得る方法（すなわち、必要な場合、
他のモノペグ化部分からこの部分を分離する工程）は、ペグ化タンパク質分子の
集団からのＮ末端ペグ化材料の精製により得られ得る。Ｎ末端改変で化学的に改
変された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能で
ある異なる型の一次アミノ酸基の異なる反応性（Ｎ末端に対するリジン）を活用
する還元的アルキル化により達成され得る。適切な反応条件下では、ポリマーを
含むカルボニル基でのＮ末端のタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成さ
れる。As suggested above, polyethylene glycol can be attached to proteins via linkage to any of a number of amino acid residues. For example, polyethylene glycol can be attached to a protein via a covalent bond to a lysine residue, a histidine residue, an aspartic acid residue, a glutamic acid residue, or a cysteine residue. Using one or more reaction chemistry, certain amino acid residues of a protein (eg,
Conjugated polyethylene glycol to lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, or cysteine) or to more than one type of amino acid residue of the protein (eg, lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, cysteine and combinations thereof) Obtaining It may be desirable to obtain a protein that has been chemically modified, especially at the N-terminus. Using polyethylene glycol as an example of a composition of the invention, various polyethylene glycol molecules (depending on molecular weight, branching, etc.), proteins (polypeptides) in the reaction mixture
The ratio of polyethylene glycol molecules to molecules, the PEGylation to be performed (pe
gylation) reaction types and methods of obtaining the selected N-terminally pegylated protein. A method for obtaining an N-terminal PEGylated preparation (ie, if necessary,
Separating this moiety from other monoPEGylated moieties) can be obtained by purification of the N-terminal pegylated material from a population of pegylated protein molecules. Selective proteins chemically modified with N-terminal modifications can be obtained by reductive alkylation utilizing the different reactivity (lysine to N-terminal) of different types of primary amino acid groups available for derivatization in a particular protein. Can be achieved. Under the appropriate reaction conditions, substantially selective derivatization of the N-terminal protein at the carbonyl group containing polymer is achieved.
【０１０９】 上記のように、本発明のタンパク質のペグ化は、多数の意味で達成され得る。
例えば、ポリエチレングリコールは、直接かまたはリンカーを介在してのいずれ
かでタンパク質に結合され得る。タンパク質に対してポリエチレングリコールを
結合するためのリンカーなしのシステムは、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅ
ｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９〜３０４（１
９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６
８：１〜１８（１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，
３４９，０５２号；ＷＯ ９５／０６０５８；およびＷＯ ９８／３２４６６（
その各々は参考として本明細書において援用されている）に記載されている。As described above, pegylation of the proteins of the invention can be achieved in a number of ways.
For example, polyethylene glycol can be attached to the protein either directly or through a linker. A linkerless system for attaching polyethylene glycol to proteins is described in Delgado et al., Crit. Re
v. Thera. Drug Carrier Sys. 9: 249-304 (1
992); Francis et al. , Intern. J. of Hematol. 6
8: 1-18 (1998); U.S. Pat. No. 4,002,531; U.S. Pat.
No. 349,052; WO 95/06058; and WO 98/32466 (
Each of which is incorporated herein by reference).
【０１１０】 介在リンカーなしに、タンパク質のアミノ酸残基に直接ポリエチレングリコー
ルを結合するためのシステムの１つは、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）Ｍ
ＰＥＧを使用する。これは、トレシルクロライド（ｔｒｅｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄ
ｅ）（ＣｌＳＯ2ＣＨ2ＣＦ3）を用いたモノメトキシポリエチレングリコール（
ＭＰＥＧ）の改変により生成される。トレシル化ＭＰＥＧとのタンパク質の反応
の際、ポリエチレングリコールをタンパク質のアミノ基に直接結合する。従って
、本発明は、本発明のタンパク質と、２，２，２−トリフルオロエタンスルホニ
ル基を有するポリエチレングリコール分子との反応により生成されるタンパク質
−ポリエチレングリコール結合体を包含する。One of the systems for attaching polyethylene glycol directly to amino acid residues of a protein without an intervening linker is a tresylated M
Use PEG. This is tresylchloride
e) Monomethoxypolyethylene glycol (ClSO 2 CH 2 CF 3 )
MPEG). Upon reaction of the protein with the tresylated MPEG, the polyethylene glycol is directly attached to the amino groups of the protein. Accordingly, the present invention includes a protein-polyethylene glycol conjugate produced by reacting the protein of the present invention with a polyethylene glycol molecule having a 2,2,2-trifluoroethanesulfonyl group.
【０１１１】 ポリエチレングリコールはまた、多数の異なる介在リンカーを用いてタンパク
質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この開示の全体
は、参考として本明細書において援用される）は、タンパク質に対してポリエチ
レングリコールを接続するためのウレタンリンカーを開示する。タンパク質−ポ
リエチレングリコール結合体（ここで、このポリエチレングリコールは、リンカ
ーによりタンパク質に結合される）はまた、タンパク質の、化合物（例えば、Ｍ
ＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾール
、で活性化したＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニルカルボネ
ート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカルボネート、および種々のＭＰＥＧ−
スクシネート誘導体）との反応により生成され得る。タンパク質にポリエチレン
グリコールを結合するための多数のさらなるポリエチレングリコール誘導体およ
び反応化学は、ＷＯ ９８／３２４６６（その全体が、参考として本明細書に援
用されている）に記載されている。本明細書において記載されている反応化学を
用いて生成されるペグ化タンパク質産物は、本発明の範囲内に包含される。[0111] Polyethylene glycol can also be attached to proteins using a number of different intervening linkers. For example, U.S. Patent No. 5,612,460, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference, discloses a urethane linker for connecting polyethylene glycol to a protein. The protein-polyethylene glycol conjugate, where the polyethylene glycol is attached to the protein by a linker, is also a compound of the protein (eg, M
MPEG activated with PEG-succinimidyl succinate, 1,1'-carbonyldiimidazole, MPEG-2,4,5-trichlorophenyl carbonate, MPEG-p-nitrophenol carbonate, and various MPEGs −
Succinate derivative). Numerous additional polyethylene glycol derivatives and reaction chemistries for attaching polyethylene glycol to proteins are described in WO 98/32466, which is incorporated herein by reference in its entirety. PEGylated protein products produced using the reaction chemistry described herein are included within the scope of the present invention.
【０１１２】 本発明の各タンパク質に結合されたポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）はまた、変化し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０
以上のポリエチレングリコール分子に連結され得る。同様に、置換の平均程度は
、タンパク質１分子あたり、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８
、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜
１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９または１８〜２０のポ
リエチレングリコール部分のような範囲内である。置換の程度を決定する方法は
、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａ
ｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９〜３０４（１９９２）において、考察されてい
る。[0112] The number of polyethylene glycol moieties attached to each protein of the invention (ie, the degree of substitution) can also vary. For example, a PEGylated protein of the invention
On average 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20
It can be linked to the above polyethylene glycol molecules. Similarly, the average degree of substitution per protein molecule is 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8
, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-
15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19 or 18-20 within such ranges as polyethylene glycol moieties. Methods for determining the degree of substitution are described, for example, in Delgado et al., Crit. Rev .. Thera. Drug Ca
rrer Sys. 9: 249-304 (1992).
【０１１３】 本発明のガレクチン１１ポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわ
ち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより多量体のマルチマー）であり得
る。従って、本発明は、本発明のガレクチン１１ポリペプチドのモノマーおよび
マルチマー、それらの調製物、およびそれらを含む組成物（好ましくは、治療剤
）に関する。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダ
イマー、トリマー、またはテトラマーである。さらなる実施形態において、本発
明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくと
もテトラマーである。[0113] Galectin-11 polypeptides of the present invention can be monomeric or multimeric (ie, dimers, trimers, tetramers and higher multimers). Accordingly, the present invention relates to monomers and multimers of the galectin 11 polypeptides of the present invention, their preparation, and compositions containing them (preferably, therapeutic agents). In certain embodiments, a polypeptide of the invention is a monomer, dimer, trimer, or tetramer. In a further embodiment, the multimer of the invention is at least a dimer, at least a trimer, or at least a tetramer.
【０１１４】 本発明により包含されるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書において用いる場合、用語ホモマーは、配列番号２、または、配列番
号２５または配列番号２７のアミノ酸配列、あるいは寄託されたクローン中に含
まれるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列に対応するポリペプチドのみを
含むマルチマーをいう（これには、フラグメント、改変体、スプライシング改変
体、および融合タンパク質（本明細書において記載されるこれらに対応する）が
挙げられる）。これらのホモマーは、同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸
配列を有するガレクチン１１ポリペプチドを含み得る。特定の実施形態において
、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有するガレクチン１１ポリペプチ
ドのみを含むマルチマーである。別の特定の実施形態において、本発明のホモマ
ーは、異なるアミノ酸配列を有するガレクチン１１ポリペプチドを含むマルチマ
ーである。特定の実施形態において、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（例
えば、同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有するガレクチン１１ポ
リペプチドを含む）、またはホモトリマー（例えば、同一のアミノ酸配列および
／または異なるアミノ酸配列を有するガレクチン１１ポリペプチドを含む）であ
る。さらなる実施形態において、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくとも
ホモダイマー、少なくともホモトリマー、または少なくともホモテトラマーであ
る。The multimers encompassed by the present invention can be homomers or heteromers. As used herein, the term homomer refers to only the polypeptide corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27, or the amino acid sequence encoded by the cDNA contained in the deposited clone. (Including fragments, variants, splicing variants, and fusion proteins (corresponding to those described herein)). These homomers can include galectin-11 polypeptides having the same or different amino acid sequences. In certain embodiments, a homomer of the invention is a multimer comprising only galectin-11 polypeptides having the same amino acid sequence. In another specific embodiment, a homomer of the invention is a multimer comprising a galectin-11 polypeptide having a different amino acid sequence. In certain embodiments, a multimer of the invention is a homodimer (eg, comprising a galectin 11 polypeptide having the same or a different amino acid sequence), or a homotrimer (eg, an identical and / or different amino acid sequence). (Including galectin 11 polypeptide having). In a further embodiment, the homomeric multimer of the invention is at least a homodimer, at least a homotrimer, or at least a homotetramer.
【０１１５】 本明細書において用いる場合、用語ヘテロマーは、本発明のガレクチン１１ポ
リペプチドに加えて、１つ以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク
質のポリペプチド）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態において、本発明
のマルチマーは、ヘテロダイマー、ヘテロトリマー、またはヘテロテトラマーで
ある。さらなる実施形態において、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なく
ともヘテロダイマー、少なくともヘテロトリマー、または少なくともヘテロテト
ラマーである。As used herein, the term heteromer refers to a multimer comprising one or more heterologous polypeptides (ie, polypeptides of different proteins) in addition to a galectin-11 polypeptide of the invention. In certain embodiments, a multimer of the invention is a heterodimer, heterotrimer, or heterotetramer. In a further embodiment, the heteromeric multimer of the invention is at least a heterodimer, at least a heterotrimer, or at least a heterotetramer.
【０１１６】 本発明のマルチマーは、疎水性結合、親水性結合、イオン結合および／または
共有結合の結果であり得、そして／または、例えば、リポソーム処方物により直
接結合され得る。従って、１つの実施形態において、本発明のマルチマー（例え
ば、ホモダイマーまたはホモトリマーのような）は、本発明のポリペプチドが、
溶液中で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態において、本発明のヘ
テロマルチマー（例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーのような）は
、本発明のポリペプチドが、溶液中で、本発明のポリペプチドに対する抗体（本
発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触す
る場合に形成される。他の実施形態において、本発明のマルチマーは、本発明の
ガレクチン１１ポリペプチドとの共有結合および／またはそのポリペプチド間の
共有結合により形成される。このような共有結合は、このポリペプチド配列（例
えば、配列番号２、２５、または２７に記載されるかまたは、クローンＨＪＡＣ
Ｅ５４によりコードされるポリペプチドに含まれる）に含まれる１つ以上のアミ
ノ酸残基を含み得る。１つの場合、共有結合は、ポリペプチド配列内に配置され
るシステイン残基間の架橋である。これは、ネイティブな（すなわち、天然に存
在する）ポリペプチド中で相互作用する。別の場合、この共有結合は、化学的操
作または組換え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、ガレクチ
ン１１融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に含まれる１つ以上のアミノ酸
残基を含み得る。１つの例において、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含
まれる異種配列の間である（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照の
こと）。特定の例において、共有結合は、（本明細書において記載されるように
）本発明のガレクチン１１−Ｆｃ融合タンパク質に含まれる異種配列の間である
。別の特定の例において、本発明の融合タンパク質の共有結合は、例えば、オス
テオプロテゲリンのような、共有結合したマルチマーを形成し得る別のタンパク
質由来の異種ポリペプチド配列の間である（例えば、内容が全体として本明細書
において参考として援用されている、国際公開番号：ＷＯ９８／４９３０５を参
照のこと）。別の実施形態において、本発明の２つ以上のポリペプチドは、ペプ
チドリンカーを介して結合される。例としては、米国特許第５，０７３，６２７
号（参考として援用される）に記載されるリンカーのようなペプチドリンカーが
挙げられる。ペプチドリンカーにより分離される、本発明の複数のポリペプチド
を含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。The multimers of the present invention can be the result of hydrophobic, hydrophilic, ionic and / or covalent bonds, and / or can be bound directly, for example, by a liposome formulation. Thus, in one embodiment, a multimer of the invention (such as, for example, a homodimer or homotrimer) is a polypeptide of the invention comprising:
Formed when in contact with each other in solution. In another embodiment, a heteromultimer of the invention (such as, for example, a heterotrimer or heterotetramer) is an antibody against a polypeptide of the invention (such as a fusion protein of the invention) in solution. (Including antibodies to a heterologous polypeptide sequence of the same). In other embodiments, the multimers of the invention are formed by covalent binding to and / or between the galectin-11 polypeptides of the invention. Such covalent linkages are described in the polypeptide sequence (eg, as set forth in SEQ ID NOs: 2, 25, or 27, or clone HJAC
(Contained in the polypeptide encoded by E54). In one case, the covalent bond is a bridge between cysteine residues located within the polypeptide sequence. It interacts in the native (ie, naturally occurring) polypeptide. In other cases, the covalent bond is the result of a chemical or recombinant operation. Alternatively, such a covalent bond can include one or more amino acid residues contained in a heterologous polypeptide sequence in a galectin-11 fusion protein. In one example, a covalent bond is between heterologous sequences contained in a fusion protein of the invention (see, eg, US Pat. No. 5,478,925). In certain instances, a covalent bond is between heterologous sequences contained in a galectin 11-Fc fusion protein of the invention (as described herein). In another specific example, the covalent linkage of a fusion protein of the invention is between heterologous polypeptide sequences from another protein that can form a covalently linked multimer, such as, for example, osteoprotegerin (eg, (See International Publication No. WO 98/49305, the contents of which are hereby incorporated by reference in its entirety). In another embodiment, two or more polypeptides of the invention are linked via a peptide linker. For example, see US Pat. No. 5,073,627.
And peptide linkers such as those described in US Pat. Proteins comprising multiple polypeptides of the invention, separated by a peptide linker, can be produced using conventional recombinant DNA techniques.
【０１１７】 本発明のマルチマーポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッ
パーまたはイソロイシンジッパーのポリペプチド配列に融合した本発明のポリペ
プチドの使用を包含する。ロイシンジッパーおよびイソロイシンジッパーのドメ
インは、タンパク質のマルチマー化（ここでそれらは見出される）を促進するポ
リペプチドである。ロイシンジッパーは、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質にお
いてもともと同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１
７５９、（１９８８））、そして以来、種々の異なるタンパク質において見出さ
れてきた。公知のロイシンジッパーの中でも、ダイマー化するか、またはトリマ
ー化するペプチド、および誘導体が天然に存在する。本発明の可溶性マルチマー
タンパク質を生成するために適切なロイシンジッパードメインの例は、本明細書
において参考として援用される、ＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３０８に記載され
るドメインである。溶液中でダイマー化するかまたはトリマー化するポリペプチ
ド配列に融合された本発明のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切
な宿主細胞において発現される。そして得られた可溶性マルチマー融合タンパク
質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収される。Another method for preparing a multimeric polypeptide of the invention involves the use of a polypeptide of the invention fused to a leucine zipper or isoleucine zipper polypeptide sequence. Leucine zipper and isoleucine zipper domains are polypeptides that facilitate multimerization of proteins, where they are found. Leucine zippers were originally identified in several DNA binding proteins (Landschulz et al., Science 240: 1).
759, (1988)), and has since been found in a variety of different proteins. Among the known leucine zippers, peptides and derivatives that naturally dimerize or trimer exist naturally. Examples of suitable leucine zipper domains for producing the soluble multimeric proteins of the invention are those described in PCT application WO 94/10308, which is incorporated herein by reference. Recombinant fusion proteins comprising a polypeptide of the invention fused to a polypeptide sequence that dimerizes or trimers in solution are expressed in a suitable host cell. The resulting soluble multimer fusion protein is recovered from the culture supernatant using techniques known in the art.
【０１１８】 本発明のトリマー性ポリペプチドは、強化された生物学的活性の利点を提供し
得る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、優先的にトリ
マーを形成するものである。例の１つは、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（Ｓ
ＰＤ）から誘導されるロイシンジッパーである。これは、Ｈｏｐｐｅら（ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１、（１９９４））および米国特許出願連続
番号０８／４４６，９２２号（参考として援用される）に記載されている。天然
に存在するトリマータンパク質から誘導される他のペプチドは、本発明のトリマ
ーポリペプチドを調製するのに用いられ得る。[0118] Trimeric polypeptides of the invention may provide the advantage of enhanced biological activity. Preferred leucine zipper and isoleucine moieties preferentially form trimers. One example is pulmonary surfactant protein D (S
Leucine zipper derived from PD). This is because Hoppe et al. (FEB)
S Letters 344: 191, (1994)) and U.S. Patent Application Serial No. 08 / 446,922, which is incorporated by reference. Other peptides derived from naturally occurring trimeric proteins can be used to prepare the trimeric polypeptides of the invention.
【０１１９】 さらなる好ましい実施形態において、本発明のガレクチン１１ポリヌクレオチ
ドは、「ＦＬＡＧ」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに融合される。
従って、ガレクチン１１−ＦＬＡＧ融合タンパク質は、本発明に包含される。Ｆ
ＬＡＧ抗原性ポリペプチドは、アミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかま
たは両方において、本発明のガレクチン１１ポリペプチドに融合され得る。好ま
しい実施形態において、ガレクチン１１−ＦＬＡＧ融合タンパク質は、ｐＦＬＡ
Ｇ−ＣＭＶ−５ａ発現ベクターまたはｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１発現ベクター（Ｓ
ｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから入手可能）から発現される。Ａ
ｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８２２２〜２９
（１９８９）；Ｔｈｏｍｓｅｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６５９〜６３（１９８４）；およびＫｏｚａｋ，Ｍ，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３０８：２４１（１９８４）（それぞれ、本明細書において参考と
して援用される）を参照のこと。さらに好ましい実施形態において、ガレクチン
１１−ＦＬＡＧ融合タンパク質は、抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体（これも、
Ｓｉｇｍａから入手可能）により検出可能である。In a further preferred embodiment, a Galectin-11 polynucleotide of the invention is fused to a polynucleotide encoding a “FLAG” polypeptide.
Thus, galectin 11-FLAG fusion proteins are encompassed by the present invention. F
The LAG antigenic polypeptide can be fused to the galectin 11 polypeptide of the invention at either the amino terminus or the carboxy terminus or both. In a preferred embodiment, the galectin 11-FLAG fusion protein is pFLA
G-CMV-5a expression vector or pFLAG-CMV-1 expression vector (S
igma, St .; (Available from Louis, MO, USA). A
ndersson S.A. J. et al. Biol. Chem. 264: 8222-29
(1989); Thomsen, D .; R. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 81: 659-63 (1984); and Kozak, MN.
308: 241 (1984), each of which is incorporated herein by reference. In a further preferred embodiment, the galectin 11-FLAG fusion protein is an anti-FLAG monoclonal antibody (also
(Available from Sigma).
【０１２０】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例
えば、本発明のマルチマーに含まれることが望ましいポリペプチドは、リンカー
分子、および当該分野で公知のリンカー分子長至適化技術を用いて化学的に架橋
され得る（例えば、その全体が参考として、本明細書において援用される、米国
特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、
マルチマー中に含まれることが所望されるポリペプチドの配列内に配置されるシ
ステイン残基の間に１つ以上の分子内架橋を形成するため、当該分野で公知の技
術を用いて生成され得る（例えば、その全体が参考として本明細書において援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポ
リペプチドは、慣用的に、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインの
付加、またはビオチンの付加により改変され得る。そして、当該分野で公知の技
術が適用され、これらの改変ポリペプチドの１つ以上を含むマルチマーが生成さ
れ得る（例えば、その全体が参考として本明細書において援用される、米国特許
第５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術が適用
され、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチド成分を含む
リポソームを生成し得る（例えば、その全体が本明細書において参考として援用
される米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。The multimers of the present invention can be generated using chemical techniques known in the art. For example, a polypeptide that is desirably included in a multimer of the present invention can be chemically cross-linked using linker molecules, and linker molecule length optimization techniques known in the art (e.g., See U.S. Patent No. 5,478,925, incorporated herein by reference). Further, the multimer of the present invention
It can be generated using techniques known in the art to form one or more intramolecular crosslinks between cysteine residues located within the sequence of the polypeptide desired to be included in the multimer ( See, for example, US Pat. No. 5,478,925, which is incorporated herein by reference in its entirety). Further, the polypeptides of the present invention can be modified conventionally by the addition of cysteine to the C-terminus or N-terminus of the polypeptide, or the addition of biotin. Techniques known in the art can then be applied to generate multimers containing one or more of these modified polypeptides (eg, US Pat. No. 5,478, incorporated herein by reference in its entirety). 925). In addition, techniques known in the art can be applied to generate liposomes containing the polypeptide components desired to be included in the multimers of the invention (eg, US Pat. See patent 5,478,925).
【０１２１】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態において、本発明のマルチマーに含まれるポリペ
プチドは、本明細書において記載されるかまたは当該分野で公知の融合タンパク
質技術を用いて組換え的に生成される（例えば、その全体が本明細書において参
考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の
実施形態において、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本
発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチ
ドをコードする配列に、次いでさらにもとのＣ末端からＮ末端方向と逆方向に、
ポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠
く）に、連結することにより、生成される（例えば、その全体が本明細書におい
て参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別
の実施形態において、本明細書において記載されるかまたは当該分野で公知の組
換え技術を適用して、本発明の組換えポリペプチドを生成する。これは、膜貫通
ドメイン（または疎水性ペプチドもしくはシグナルペプチド）を含み、そして膜
再構成技術によりリポソーム中に組み込まれ得る（例えば、その全体が本明細書
において参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと
）。Alternatively, the multimers of the present invention can be generated using genetic engineering techniques known in the art. In one embodiment, the polypeptides comprised in the multimers of the invention are recombinantly produced using fusion protein techniques described herein or known in the art (eg, in their entirety). See U.S. Patent No. 5,478,925, which is incorporated herein by reference). In certain embodiments, the polynucleotide encoding the homodimer of the invention comprises a polynucleotide sequence encoding a polypeptide of the invention, wherein the polynucleotide sequence encoding the polypeptide of the invention is replaced by a sequence encoding the linker polypeptide, and then further from the original C-terminus to the N-terminal direction. And in the opposite direction,
It is produced by linking to a synthetic polynucleotide (lacking the leader sequence) encoding the translation product of the polypeptide (eg, US Pat. No. 5,478, incorporated herein by reference in its entirety). 925). In another embodiment, recombinant techniques described herein or known in the art are applied to produce a recombinant polypeptide of the invention. It contains a transmembrane domain (or hydrophobic or signal peptide) and can be incorporated into liposomes by membrane reconstitution techniques (see, eg, US Pat. , 478, 925).
【０１２２】 （ガレクチン１１ポリペプチドおよびフラグメント） 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有す
る、単離したガレクチン１１のポリペプチド、図１に示されるアミノ酸配列（配
列番号２のアミノ酸残基１〜１３３）、アミノ末端メチオニンを欠く、図１に示
されるアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸残基２〜１３３）、図１に示される
アミノ酸（配列番号２）か、および／または寄託されたクローンに含まれるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドによりコードされるポリペプチド、ならびに、これらのポリペプチドのフラグ
メント、改変体、誘導体およびアナログを提供する。Galectin 11 Polypeptides and Fragments The present invention further provides an isolated galectin 11 polypeptide having the amino acid sequence encoded by the deposited cDNA, the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) Amino acid residues 1-133), the amino acid sequence shown in FIG. 1 lacking the amino-terminal methionine (amino acid residues 2-133 of SEQ ID NO: 2), the amino acid shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), and / or A polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent hybridization conditions to a polynucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence contained in the deposited clone; and fragments of these polypeptides. Variants, derivatives and To provide a log.
【０１２３】 本発明のポリペプチドは、単離形態において好ましくは提供される。「単離さ
れたポリペプチド」とは、そのネイティブな環境から除去されたポリペプチドを
意図する。従って、組み換え宿主細胞内で産生され、そして／またはその細胞内
に含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。ま
た、「単離されたポリペプチド」は、組換え宿主細胞から、部分的にまたは実質
的に精製されたポリペプチドを意図する。例えば、組換え的に産生されたバージ
ョンのガレクチン１１のポリペプチドは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇ
ｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に記載される一工程方法により実質的に
精製され得る。The polypeptides of the present invention are preferably provided in an isolated form. An "isolated polypeptide" intends a polypeptide that has been removed from its native environment. Thus, a polypeptide produced in and / or contained within a recombinant host cell is considered isolated for the purposes of the present invention. Also, "isolated polypeptide" intends a polypeptide that has been partially or substantially purified from a recombinant host cell. For example, a recombinantly produced version of the galectin-11 polypeptide is described by Smith and Johnson, G.
ene 67: 31-40 (1988).
【０１２４】 ガレクチン１１のポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、このタンパク質
の構造または機能に有意に影響することなく改変され得ることが、当該分野で認
識される。配列内のこのような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク
質の重要な領域が存在することを覚えておくべきである。It is recognized in the art that the amino acid sequence of some of the Galectin-11 polypeptides can be altered without significantly affecting the structure or function of the protein. If such differences in sequence are contemplated, it should be remembered that there are important regions of the protein that determine activity.
【０１２５】 従って、本発明は、さらに、実質的なガレクチン１１のポリペプチドの機能的
活性を示すか、または下記に考察されるタンパク質部分のようなガレクチン１１
のタンパク質の領域を含むガレクチン１１のポリペプチドの改変体を含む。この
ような変異体は、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換を含む。Accordingly, the present invention further provides a galectin-11 polypeptide that exhibits substantial galectin-11 polypeptide functional activity or a protein moiety as discussed below.
And a variant of the galectin-11 polypeptide containing the protein region of Such variants include deletions, insertions, inversions, repeats, and type substitutions.
【０１２６】 上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントで
ありそうかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅ
ｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉ
ｏｎｓ（タンパク質配列中のメッセージを解読すること：アミノ酸置換に対する
寛容）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出さ
れ得る。As set forth in detail above, guidance on which amino acid changes are likely to be phenotypically silent is provided by Bowie, J. et al. U. "Deciphe
ring the Message in Protein Sequence
s: Tolerance to Amino Acid Substitti
ons (decoding messages in protein sequences: tolerance to amino acid substitutions) ", Science 247: 1306-1310 (1990).
【０１２７】 従って、図１または６（配列番号２、配列番号２５または配列番号２７）のポ
リペプチドのフラグメント、改変体、誘導体またはアナログ、あるいは寄託され
たｃＤＮＡによってコードされたポリペプチドのフラグメント、改変体、誘導体
またはアナログは、（ｉ）少なくとも１以上のアミノ酸残基が、保存性または非
保存性アミノ酸残基（好ましくは、保存性アミノ酸残基、およびより好ましくは
少なくとも１個であるが、１０個未満の保存性アミノ酸残基）で置換され、かつ
このような置換されたアミノ酸残基が、遺伝コードによってコードされているア
ミノ酸残基であってもそうではなくともよいもの、あるいは、（ｉｉ）１以上の
アミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、こ
のポリペプチドの半減期を増大させる化合物のような別の化合物（例えば、ポリ
エチレングリコール）と融合されるもの、あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が
、成熟ポリペプチド（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配
列もしくは分泌配列または成熟ポリペプチドの精製に用いられる配列またはプロ
タンパク質配列）に融合されるもの、を含む。このようなフラグメント、改変体
、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であると考
えられる。Accordingly, fragments, variants, derivatives or analogs of the polypeptide of FIG. 1 or 6 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27), or fragments of the polypeptide encoded by the deposited cDNA, modifications The body, derivative or analog may comprise (i) at least one amino acid residue having a conservative or non-conservative amino acid residue (preferably a conservative amino acid residue, and more preferably at least one amino acid residue; (Conserved amino acid residues) and such substituted amino acid residues may or may not be the amino acid residues encoded by the genetic code, or (ii) ) One or more amino acid residues containing a substituent, or (iii) a mature polypeptide comprising the polypeptide. One that is fused to another compound, such as a compound that increases the half-life of the peptide (eg, polyethylene glycol), or (iv) the additional amino acid is a mature polypeptide (eg, an IgG Fc fusion region peptide or leader sequence or secretion) Sequence or sequence used for purification of the mature polypeptide or proprotein sequence). Such fragments, variants, derivatives and analogs are deemed to be within the skill of the art in light of the teachings herein.
【０１２８】 他の荷電したアミノ酸、および中性または負に荷電したアミノ酸での、１以上
の荷電したアミノ酸の置換は、特に興味深い。後者は、減少した正の電荷を有す
るタンパク質を生じ、ガレクチン１１タンパク質の特徴を改良する。凝集の防止
が、非常に所望される。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるのみではなく
、薬学的処方物を調製する場合にもまた問題であり得る。なぜなら、それらは、
免疫原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．２：３３１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅ
ｔｅｓ ３６：８３８〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒ
ｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ
１０：３０７〜３７７（１９９３））。Of particular interest is the replacement of one or more charged amino acids with other charged amino acids, and neutral or negatively charged amino acids. The latter results in a protein with a reduced positive charge and improves the characteristics of the galectin 11 protein. Prevention of agglomeration is highly desirable. Aggregation of proteins not only results in a loss of activity, but can also be a problem when preparing pharmaceutical formulations. Because they are
Because it can be immunogenic (Pinkard et al., Clin. Exp. Im.
munol. 2: 331-340 (1967); Robbins et al., Diabe.
tes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. R
ev. Therapeutic Drug Carrier Systems
10: 307-377 (1993)).
【０１２９】 示されるように、重要ではない性質の変化（例えば、タンパク質の折り畳みま
たは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換）が好ましい（表２を参照のこ
と）。As indicated, changes in insignificant properties (eg, conservative amino acid substitutions that do not significantly affect protein folding or activity) are preferred (see Table 2).
【０１３０】[0130]
【表１】 特定の実施態様において、図１または図６のアミノ酸配列（配列番号２、２５
または２７）中の付加、置換および／または欠失、ならびに／あるいは本明細書
中に記載される、任意のポリペプチドフラグメントの数は、５０、４０、３５、
３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５
、４、３、２、または１、あるいは１５〜２０、１５〜１０、５〜１０、１〜５
、１〜３、または１〜２である。[Table 1] In certain embodiments, the amino acid sequence of FIG. 1 or FIG.
Or 27) the number of additions, substitutions and / or deletions, and / or any of the polypeptide fragments described herein are 50, 40, 35,
30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5
, 4, 3, 2, or 1, or 15 to 20, 15 to 10, 5 to 10, 1 to 5
, 1-3, or 1-2.
【０１３１】 機能に必須である、本発明のガレクチン１１のポリペプチド、フラグメント、
改変体、誘導体、またはアナログのアミノ酸残基は、当該分野において公知の方
法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発（ａｌａｎｉ
ｎｅ−ｓｃａｎｎｉｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍおよ
びＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１〜１０８５（１９８９））に
よって同定され得る。後者の手順は、分子中の各残基に１個のアラニン変異を導
入する。次いで、得られた変異分子は、生物学的活性または機能的活性（例えば
、レセプター結合、β−ガラクトシダーゼ（例えば、チオジガラクトシドまたは
ラクトース）結合、トリプシン処理したウサギ赤血球を凝集する能力、またはイ
ンビトロもしくはインビボでアポトーシスを誘導する能力）について試験される
。リガンド−レセプター結合に重要である部位はまた、結晶化、核磁気共鳴また
は光親和性標識のような構造分析（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２
４：８９９〜９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
５：３０６〜３１２（１９９２））によって決定され得る。A galectin 11 polypeptide, fragment or the like of the present invention, which is essential for function;
Amino acid residues of the variants, derivatives or analogs can be obtained by methods known in the art (eg, site-directed mutagenesis or alanine scan mutagenesis (alani
ne-scanning mutagenesis) (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). The latter procedure introduces one alanine mutation at each residue in the molecule. The resulting mutant molecule may then have a biological or functional activity (eg, receptor binding, β-galactosidase (eg, thiodigalactoside or lactose) binding, the ability to aggregate trypsinized rabbit erythrocytes, or Ability to induce apoptosis in vivo). Sites important for ligand-receptor binding can also be determined by structural analysis such as crystallization, nuclear magnetic resonance or photoaffinity labeling (Smith et al., J. Mol. Biol. 22).
4: 899-904 (1992) and de Vos et al., Science 25.
5: 306-312 (1992)).
【０１３２】 本発明はまた、上記のポリペプチドに少なくとも７５％、８０％、８５％、９
０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９７〜９９％
同一であるポリペプチドを包含する。ガレクチン１１ポリペプチドの参照アミノ
酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドとは、このポリペプチドのアミノ酸配列は、このポリペプチド配列が、
ガレクチン１１ポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸当たり５個まで
のアミノ酸変更を含み得ることを除いて、参照配列に同一であることを意図する
。換言すれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを得るために、参照配列中のアミノ酸残基の５％までが、欠失さ
れ得るか、または別のアミノ酸で置換され得、あるいは参照配列中のアミノ酸残
基全体の５％までの数のアミノ酸が、参照配列中に挿入され得る。参照配列中の
これらの変更は、参照配列中の残基の中で個々に、または参照配列内の１以上の
隣接した群のいずれかで分散して、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくは
カルボキシ末端位置、あるいはそれらの末端位置の間の至るところで生じ得る。The present invention also relates to polypeptides as described above, wherein at least 75%, 80%, 85%, 9%
0%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, or 97-99%
Includes polypeptides that are identical. For example, a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% "identical" to the reference amino acid sequence of a galectin 11 polypeptide is that the amino acid sequence of the polypeptide is
It is intended to be identical to the reference sequence, except that it can contain up to 5 amino acid changes for each 100 amino acids of the reference amino acid of the galectin 11 polypeptide. In other words, to obtain a polypeptide having an amino acid sequence at least 95% identical to the reference amino acid sequence, up to 5% of the amino acid residues in the reference sequence can be deleted or replaced with another amino acid. Amino acids of up to 5% of the total amino acid residues obtained or in the reference sequence can be inserted into the reference sequence. These alterations in the reference sequence may be distributed individually within the residues in the reference sequence, or in one or more contiguous groups within the reference sequence, at the amino-terminal or carboxy-terminal positions of the reference amino acid sequence. It can occur anywhere between positions, or between their terminal positions.
【０１３３】 現実的な問題として、例えば、任意の特定のポリペプチドが、図１または図６
に示されるアミノ酸配列（配列番号２、２５または２７）、寄託されたｃＤＮＡ
クローンによりコードされるアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントに、少
なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％ま
たは９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムのような公知のコン
ピュータープログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ
５３７１１）を使用して慣習的に決定され得る。例えば、特定の配列が本発明に
従う参照配列に９５％同一であるか否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまた
は任意の他の配列アライメントプログラムを使用する場合、パラメータは、当然
、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長に対して算定され、そして
参照配列中のアミノ酸残基の総数の５％までの、相同性におけるギャップが許容
されるように設定される。[0133] As a practical matter, for example, if any particular polypeptide is
(SEQ ID NO: 2, 25 or 27), the deposited cDNA
Whether the amino acid sequence encoded by the clone, or a fragment thereof, is at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical is Bestfit A known computer program such as a program (Wisconsin Sequence Analysis)
is Package, Version 8 for Unix, Geneti
cs Computer Group, University Research
h Park, 575 Science Drive, Madison, WI
53711) can be routinely determined. For example, if Bestfit or any other sequence alignment program is used to determine whether a particular sequence is 95% identical to a reference sequence according to the present invention, the parameters will, of course, have a percentage identity of It is calculated relative to the total length of the reference amino acid sequence and is set to allow for gaps in homology of up to 5% of the total number of amino acid residues in the reference sequence.
【０１３４】 別の実施態様において、全体的な配列アライメントともいわれる、参照（問合
せ）配列（本発明の配列）と対象配列との間の同一性は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃ
ｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））のアルゴリ
ズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定される。ＦＡ
ＳＴＤＢアミノ酸アライメントにおいて使用される好ましいパラメータは、以下
である：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ
Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉ
ｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１
、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ
Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００また
は対象アミノ酸配列の長さ（いずれかの短い方）。この実施態様に従うと、対象
配列が、内部の欠失のためではなく、Ｎ末端またはＣ末端の欠失に起因して問合
せ配列よりも短い場合、全体的なパーセント同一性を算定する場合に、ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムが対象配列のＮ末端およびＣ末端の短縮型を説明しない事実を考
慮に入れて、手動の補正が、結果に対してなされる。問合せ配列に対してＮ末端
およびＣ末端にて短縮した対象配列について、パーセント同一性は、対応する対
象残基と適合／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問合せ配列の
残基数を、問合せ配列の総塩基のパーセントとして算定することによって補正さ
れる。残基が適合／整列されるか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメント
の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメータを使
用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定されるパーセント同一性から
差し引かれ、最終的なパーセント同一性スコアに至る。この最終パーセント同一
性スコアは、この実施態様の目的のために使用されるものである。問合せ配列と
適合／整列されない、対象配列のＮ末端およびＣ末端の残基のみが、パーセント
同一性スコアを手動で調整する目的のために考慮される。すなわち、対象配列の
最も遠いＮ末端残基およびＣ末端残基の外側の問合せ残基位置のみである。例え
ば、９０アミノ酸残基の対象配列が、パーセント同一性を決定するために、１０
０残基の問合せ配列と整列される。この欠失は、対象配列のＮ末端にて生じ、従
って、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端の最初の１０残基に適合／アライメ
ントを示さない。１０個の非対残基は、１０％の配列（適合されないＮ末端およ
びＣ末端の残基数／問合せ配列中の残基の総数）を表す。その結果、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定されるパーセント同一性スコアから、１０％が差し引
かれる。残りの９０残基が、完全に適合された場合に、最終的なパーセント同一
性は、９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問
合せ配列と比較される。今回この欠失が内部欠失であり、対象配列のＮ末端また
はＣ末端に、この問合せと適合／整列しない残基が存在しない。この場合、ＦＡ
ＳＴＤＢによって算定されるパーセント同一性が手動で補正されない。もう一度
、ＦＡＳＴＤＢアライメントにおいて示されるような、問合せ配列と適合／整列
しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側の残基位置のみが、手動で補正さ
れる。他の手動の補正が、この実施態様の目的のためになされることはない。In another embodiment, the identity between a reference (query) sequence (a sequence of the invention) and a subject sequence, also referred to as an overall sequence alignment, is determined by the method of Brutlag et al.
omp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990)). FA
Preferred parameters used in the STDB amino acid alignment are: Matrix = PAM 0, k-tuple = 2, Mismatch
Penalty = 1, Joining Penalty = 20, Randomi
zation Group Length = 0, Cutoff Score = 1
, Window Size = length of array, Gap Penalty = 5, Gap
Size Penalty = 0.05, Window Size = 500 or the length of the amino acid sequence of interest (whichever is shorter). According to this embodiment, when calculating the overall percent identity, if the subject sequence is shorter than the query sequence due to N- or C-terminal deletions, not due to internal deletions, FAST
Manual corrections are made to the results, taking into account the fact that the DB program does not account for the N-terminal and C-terminal truncations of the subject sequence. For subject sequences truncated at the N- and C-termini to the query sequence, the percent identity is the number of residues in the query sequence that are N- and C-terminal to the subject sequence that do not match / align with the corresponding subject residue. Is calculated as a percentage of the total bases of the query sequence. The determination of whether residues are matched / aligned is determined by the result of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then subtracted from the percent identity calculated by the above FASTDB program using the specified parameters, leading to a final percent identity score. This final percent identity score is what is used for the purposes of this embodiment. Only N- and C-terminal residues of the subject sequence that do not match / align with the query sequence are considered for the purpose of manually adjusting the percent identity score. That is, only the query residue positions outside the farthest N- and C-terminal residues of the subject sequence. For example, a subject sequence of 90 amino acid residues can be used to determine percent identity.
Aligned with 0 residue query sequence. This deletion occurs at the N-terminus of the subject sequence, so the FASTDB alignment shows no match / alignment for the first 10 residues at the N-terminus. Ten unpaired residues represent 10% of the sequence (number of unmatched N- and C-terminal residues / total number of residues in query sequence). As a result, FASTD
10% is subtracted from the percent identity score calculated by the B program. If the remaining 90 residues were perfectly matched, the final percent identity is 90%. In another example, a 90 residue subject sequence is compared to a 100 residue query sequence. This deletion is now an internal deletion and there are no residues at the N- or C-terminus of the subject sequence that do not match / align with the query. In this case, FA
The percent identity calculated by the STDB is not manually corrected. Once again, only residue positions outside the N- and C-termini of the subject sequence that do not match / align with the query sequence, as shown in the FASTDB alignment, are manually corrected. No other manual corrections are made for the purposes of this embodiment.
【０１３５】 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ル上の、または分子ふるいゲル濾過カラム上の分子量マーカーを含むがこれらに
限定されない用途を有する。The polypeptides of the present invention have uses, including but not limited to molecular weight markers on SDS-PAGE gels or on molecular sieve gel filtration columns, using methods well known to those skilled in the art.
【０１３６】 本発明はまた、上記の本発明のポリペプチドのフラグメントを包含する。特定
の実施態様において、これらのフラグメントは、少なくとも２０、２５、３０、
４０、５０、７５、９０、１００、１１０、１２０、１２５または１３０アミノ
酸残基長である。The present invention also includes fragments of the polypeptides of the present invention described above. In certain embodiments, these fragments are at least 20, 25, 30,
40, 50, 75, 90, 100, 110, 120, 125 or 130 amino acid residues long.
【０１３７】 本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２、２５もし
くは２７に含まれるか、または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによりコ
ードされるアミノ酸配列の一部である、アミノ酸配列をいう。タンパク質（ポリ
ペプチド）フラグメントは、「独立している（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」
であってもよいし、またはより大きいポリペプチド内に含まれても良い（そのフ
ラグメントは、一部または領域、最も好ましくは単一連続領域として形成する）
。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、コード領
域の末端に対して、１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１
００、１０１〜１２０もしくは１２１のおよそのアミノ酸数を含むか、またはこ
れから構成されるフラグメントが挙げられる。さらに、ポリペプチドフラグメン
トは、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、
１２０、または１３０のアミノ酸長であり得る。この文脈において、「約」とは
、特に記載された範囲または値、ならびにいくつか（５、５、３、２、または１
）のアミノ酸まで大きいかまたは小さい範囲または値（いずれかの極値または両
方の極値で）を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもま
た本発明に包含される。In the context of the present invention, a “polypeptide fragment” is an amino acid sequence contained in SEQ ID NO: 2, 25 or 27 or a part of the amino acid sequence encoded by the cDNA contained in the deposited clone. Say. Protein (polypeptide) fragments are “free-standing”.
Or may be comprised within a larger polypeptide (the fragment forming a part or region, most preferably as a single continuous region)
. Representative examples of the polypeptide fragment of the present invention include, for example, 1 to 20, 21 to 40, 41 to 60, 61 to 80, 81 to 1 with respect to the end of the coding region.
Fragments containing or consisting of about the number of amino acids from 00, 101 to 120 or 121 are included. Further, the polypeptide fragment may be about 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110,
It can be 120 or 130 amino acids long. In this context, “about” includes the specifically recited ranges or values, as well as some (5, 5, 3, 2, or 1).
A) greater or lesser ranges or values (at either extreme or both extremes). Polynucleotides encoding these polypeptides are also encompassed by the present invention.
【０１３８】 タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失がタンパク質の１つ以上
の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でさえ、他の機能的活性（例えば、生
物学的活性、多量体化する能力、ガレクチン１１リガンドに結合する能力）は、
なお保持され得る。例えば、短縮型ガレクチン１１ムテインが、ポリペプチドの
完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導するか、および／またはそれに
結合する能力は、この完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の大部分
より少ない部分がＮ末端から取り除かれている場合、保持される。完全ポリペプ
チドのＮ末端残基を欠失する特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保
持するか否かは、本明細書中に記載される、そうでなければ、当該分野で公知で
ある慣用的な方法によって容易に決定され得る。より多数のＮ末端アミノ酸残基
を欠失したガレクチンム１１テインが、いくつかの生物学的活性または免疫学的
活性を保持し得ることはありそうである。実際、６つ程度の少ないガレクチン１
１アミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば免疫応答を誘発し得る。[0138] Even when deletion of one or more amino acids from the N-terminus of a protein results in an alteration in the loss of one or more biological functions of the protein, other functional activities (eg, biological activities) , The ability to multimerize, the ability to bind to galectin-11 ligand)
It can still be retained. For example, the ability of a truncated galectin-11 mutein to induce and / or bind to an antibody that recognizes a complete or mature form of a polypeptide is determined by the majority of the residues of the complete or mature polypeptide. If less is removed from the N-terminus, it is retained. Whether a particular polypeptide lacking the N-terminal residue of a complete polypeptide retains such immunological activity is described herein or otherwise known in the art. Can be readily determined by conventional methods. It is likely that galectin ll-tein lacking a greater number of N-terminal amino acid residues may retain some biological or immunological activity. In fact, as few as 6 galectins 1
Peptides composed of one amino acid residue can often elicit an immune response.
【０１３９】 従って、ポリペプチドフラグメントは、分泌されたガレクチン１１タンパク質
ならびに成熟形態を含む。さらに好ましいポリペプチドフラグメントとしては、
分泌型ガレクチン１１タンパク質、あるいはアミノ酸末端もしくはカルボキシ末
端、またはその両方から連続的な一連の残基を欠失している成熟型が挙げられる
。例えば、任意の数のアミノ酸（１〜６０にわたる）が、分泌型ガレクチン１１
ポリペプチドまたは成熟形態のいずれかのアミノ酸末端から欠失され得る。同様
に、任意の数のアミノ酸（１〜３０にわたる）が、分泌型ガレクチン１１タンパ
ク質または成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、上記のアミノ
末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合わせが好ましい。同様に、こ
れらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドがまた好ましい
。Thus, polypeptide fragments include the secreted galectin-11 protein as well as the mature form. More preferred polypeptide fragments include
The secreted galectin 11 protein, or the mature form lacking a continuous series of residues from the amino acid terminus or the carboxy terminus, or both, may be mentioned. For example, any number of amino acids (ranging from 1 to 60) may contain secreted galectin 11
It can be deleted from the amino acid terminus of either the polypeptide or the mature form. Similarly, any number of amino acids (ranging from 1 to 30) can be deleted from the carboxy terminus of the secreted galectin 11 protein or the mature form. Further, any combination of the above amino terminal deletion and carboxy terminal deletion is preferred. Similarly, polynucleotides encoding these polypeptide fragments are also preferred.
【０１４０】 １つに実施態様において、本発明はさらに、図１または図６に示される（配列
番号２、２５または２７）か、または寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコ
ードされる、ガレクチン１１ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端から１つ
以上の残基が欠失されたポリペプチドを提供する。特に、１つの実施態様におい
て、ガレクチン１１ポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ〜１３３によって記
載され得る。ここで、ｍは、配列番号２において同定されるアミノ酸配列の位置
に対応する１〜１２８の整数であり、そして好ましくは、本明細書中に特定され
るＮ末端欠失において同定されるＮ末端アミノ酸残基の１つに対応する。特定の
実施態様において、本発明のガレクチン１１ポリペプチドのＮ末端欠失は、配列
番号２の以下のアミノ酸残基を含むか、またはそれらからなる：In one embodiment, the present invention further provides a galectin-11 polypeptide as shown in FIG. 1 or FIG. 6 (SEQ ID NO: 2, 25 or 27), or encoded by the cDNA of the deposited clone. A polypeptide in which one or more residues have been deleted from the amino terminus of the amino acid sequence of In particular, in one embodiment, the N-terminal deletion of a galectin-11 polypeptide may be described by the general formula m-133. Where m is an integer from 1 to 128 corresponding to the position of the amino acid sequence identified in SEQ ID NO: 2, and preferably the N-terminus identified in the N-terminal deletion identified herein Corresponds to one of the amino acid residues. In certain embodiments, the N-terminal deletion of a Galectin-11 polypeptide of the invention comprises or consists of the following amino acid residues of SEQ ID NO: 2:
【０１４１】[0141]
【化１】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含され
る。Embedded image Polynucleotides encoding these polypeptides are also encompassed by the present invention.
【０１４２】 上記のように、たとえタンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が
このタンパク質の１以上の生物学的機能の改変を生じたとしても、他の機能的活
性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、ガレクチン１１リガンドを結合
する能力）は、なお保持され得る。例えば、短縮型ガレクチン１１ムテインが、
そのポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導するか、およ
び／またはそれに結合するの能力は、その完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプ
チドの大多数未満の残基がＣ末端から除去される場合には、一般に保持される。
完全タンパク質のＣ末端残基を欠失する特定のポリペプチドがこのような免疫学
的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載されるか、そうでなければ、当該
分野で公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数のＣ末端アミノ酸
残基が欠失されたガレクチン１１ムテインが、いくつかの生物学的活性または免
疫学的活性を保持し得ることはなくはないようである。実際、６個ほどの少ない
ガレクチン１１アミノ酸残基から構成されるペプチドが、免疫応答をしばしば誘
発し得る。As noted above, even if deletion of one or more amino acids from the C-terminus of a protein results in alteration of one or more biological functions of the protein, other functional activities (eg, Biological activity, the ability to multimerize, the ability to bind galectin-11 ligand) can still be retained. For example, truncated galectin 11 mutein
The ability to induce and / or bind to an antibody that recognizes the complete or mature form of the polypeptide is such that less than the majority of residues of the complete or mature polypeptide are removed from the C-terminus. The case is generally kept.
Whether a particular polypeptide lacking the C-terminal residue of a complete protein retains such immunological activity is described herein or otherwise known in the art. Can be easily determined by conventional methods. It is not unlikely that a galectin-11 mutein with a number of C-terminal amino acid residues deleted could retain some biological or immunological activity. In fact, peptides composed of as few as 6 galectin 11 amino acid residues can often elicit an immune response.
【０１４３】 従って、本発明のさらなる実施形態は、一般式１〜ｎで記載される、ガレクチ
ン１１ポリペプチドのＣ末端欠失に関する。ここで、ｎは、配列番号２において
同定されるアミノ酸残基の位置に対応する６〜１３２の整数であり、そして好ま
しくは、本明細書中に特定化されるＣ末端欠失において同定されるＣ末端アミノ
酸残基の１つに対応する。特定の実施態様において、本発明のガレクチン１１ポ
リペプチドのＣ末端欠失は、配列番号２の以下のアミノ酸残基を含むか、または
それらからなる：Ｍ−１〜Ｈ−１３２；Ｍ−１〜Ｖ−１３１；Ｍ−１〜Ｃ−１３
０；Ｍ−１〜Ｙ−１２９；Ｍ−１〜Ｌ−１２８；Ｍ−１〜Ｑ−１２７；Ｍ−１〜
Ｖ−１２６；Ｍ−１〜Ｓ−１２５；Ｍ−１〜Ｇ−１２４；Ｍ−１〜Ｓ−１２３；
Ｍ−１〜Ｉ−１２２；Ｍ−１〜Ｒ−１２１；Ｍ−１〜Ｌ−１２０；Ｍ−１〜Ｅ−
１１９；Ｍ−１〜Ｒ−１１８；Ｍ−１〜Ｌ−１１７；Ｍ−１〜Ｑ−１１６；Ｍ−
１〜Ｅ−１１５；Ｍ−１〜Ｌ−１１４；Ｍ−１〜Ａ−１１３；Ｍ−１〜Ｑ−１１
２；Ｍ−１〜Ｑ−１１１；Ｍ−１〜Ｎ−１１０；Ｍ−１〜Ｍ−１０９；Ｍ−１〜
Ｓ−１０８；Ｍ−１〜Ｔ−１０７；Ｍ−１〜Ａ−１０６；Ｍ−１〜Ｇ−１０５；
Ｍ−１〜Ｌ−１０４；Ｍ−１〜Ｇ−１０３；Ｍ−１〜Ｑ−１０２；Ｍ−１〜Ｇ−
１０１；Ｍ−１〜Ｎ−１００；Ｍ−１〜Ｌ−９９；Ｍ−１〜Ａ−９８；Ｍ−１〜
Ｌ−９７；Ｍ−１〜Ｋ−９６；Ｍ−１〜Ｌ−９５；Ｍ−１〜Ｇ−９４；Ｍ−１〜
Ｇ−９３；Ｍ−１〜Ｅ−９２；Ｍ−１〜Ｑ−９１；Ｍ−１〜Ｆ−９０；Ｍ−１〜
Ｌ−８９；Ｍ−１〜Ｌ−８８；Ｍ−１〜Ｌ−８７；Ｍ−１〜Ｖ−８６；Ｍ−１〜
Ｅ−８５；Ｍ−１〜Ｆ−８４；Ｍ−１〜Ｆ−８３；Ｍ−１〜Ｒ−８２；Ｍ−１〜
Ｑ−８１；Ｍ−１〜Ｐ−８０；Ｍ−１〜Ｙ−７９；Ｍ−１〜Ｆ−７８；Ｍ−１〜
Ｌ−７７；Ｍ−１〜Ｆ−７６；Ｍ−１〜Ｐ−７５；Ｍ−１〜Ａ−７４；Ｍ−１〜
Ｓ−７３；Ｍ−１〜Ｉ−７２；Ｍ−１〜Ｌ−７１；Ｍ−１〜Ｋ−７０；Ｍ−１〜
Ｋ−６９；Ｍ−１〜Ｑ−６８；Ｍ−１〜Ｇ−６７；Ｍ−１〜Ｗ−６６；Ｍ−１〜
Ｒ−６５；Ｍ−１〜Ｓ−６４；Ｍ−１〜Ｉ−６３；Ｍ−１〜Ｗ−６２；Ｍ−１〜
Ａ−６１；Ｍ−１〜Ｌ−６０；Ｍ−１〜Ｔ−５９；Ｍ−１〜Ｒ−５８；Ｍ−１〜
Ｄ−５７；Ｍ−１〜Ａ−５６；Ｍ−１〜Ｆ−５５；Ｍ−１〜Ｓ−５４；Ｍ−１〜
Ａ−５３；Ｍ−１〜Ｒ−５２；Ｍ−１〜Ｌ−５１；Ｍ−１〜Ｔ−５０；Ｍ−１〜
Ｖ−４９；Ｍ−１〜Ｐ−４８；Ｍ−１〜Ａ−４７；Ｍ−１〜Ｈ−４６；Ｍ−１〜
Ａ−４５；Ｍ−１〜Ａ−４４；Ｍ−１〜Ｑ−４３；Ｍ−１〜Ｄ−４２；Ｍ−１〜
Ｒ−４１；Ｍ−１〜Ｌ−４０；Ｍ−１〜Ｓ−３９；Ｍ−１〜Ｖ−３８；Ｍ−１〜
Ｔ−３７；Ｍ−１〜Ｆ−３６；Ｍ−１〜Ｈ−３５；Ｍ−１〜Ｋ−３４；Ｍ−１〜
Ｐ−３３；Ｍ−１〜Ｅ−３２；Ｍ−１〜Ｑ−３１；Ｍ−１〜Ｌ−３０；Ｍ−１〜
Ｖ−２９；Ｍ−１〜Ｌ−２８；Ｍ−１〜Ｇ−２７；Ｍ−１〜Ｒ−２６；Ｍ−１〜
Ｖ−２５；Ｍ−１〜Ｉ−２４；Ｍ−１〜Ｉ−２３；Ｍ−１〜Ｖ−２２；Ｍ−１〜
Ｑ−２１；Ｍ−１〜Ｇ−２０；Ｍ−１〜Ｐ−１９；Ｍ−１〜Ｓ−１８；Ｍ−１〜
Ｌ−１７；Ｍ−１〜Ｇ−１６；Ｍ−１〜Ｑ−１５；Ｍ−１〜Ｐ−１４；Ｍ−１〜
Ｌ−１３；Ｍ−１〜Ａ−１２；Ｍ−１〜Ｈ−１１；Ｍ−１〜Ｓ−１０；Ｍ−１〜
Ｃ−９；Ｍ−１〜Ｐ−８；Ｍ−１〜Ｖ−７；およびＭ−１〜Ｅ−６。これらのポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。Accordingly, a further embodiment of the present invention relates to the C-terminal deletion of a galectin 11 polypeptide as described in general formulas 1-n. Where n is an integer from 6 to 132 corresponding to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 2, and preferably is identified in the C-terminal deletion specified herein. Corresponds to one of the C-terminal amino acid residues. In certain embodiments, the C-terminal deletion of a Galectin-11 polypeptide of the invention comprises or consists of the following amino acid residues of SEQ ID NO: 2: M-1 to H-132; V-131; M-1 to C-13
0; M-1 to Y-129; M-1 to L-128; M-1 to Q-127;
V-126; M-1 to S-125; M-1 to G-124; M-1 to S-123;
M-1 to I-122; M-1 to R-121; M-1 to L-120; M-1 to E-
119; M-1 to R-118; M-1 to L-117; M-1 to Q-116;
M-1 to L-114; M-1 to A-113; M-1 to Q-11
2; M-1 to Q-111; M-1 to N-110; M-1 to M-109;
S-108; M-1 to T-107; M-1 to A-106; M-1 to G-105;
M-1 to L-104; M-1 to G-103; M-1 to Q-102; M-1 to G-
101; M-1 to N-100; M-1 to L-99; M-1 to A-98;
L-97; M-1 to K-96; M-1 to L-95; M-1 to G-94;
G-93; M-1 to E-92; M-1 to Q-91; M-1 to F-90;
L-89; M-1 to L-88; M-1 to L-87; M-1 to V-86;
E-85; M-1 to F-84; M-1 to F-83; M-1 to R-82;
Q-81; M-1 to P-80; M-1 to Y-79; M-1 to F-78;
L-77; M-1 to F-76; M-1 to P-75; M-1 to A-74;
S-73; M-1 to I-72; M-1 to L-71; M-1 to K-70;
K-69; M-1 to Q-68; M-1 to G-67; M-1 to W-66;
R-65; M-1 to S-64; M-1 to I-63; M-1 to W-62;
A-61; M-1 to L-60; M-1 to T-59; M-1 to R-58;
D-57; M-1 to A-56; M-1 to F-55; M-1 to S-54;
A-53; M-1 to R-52; M-1 to L-51; M-1 to T-50;
V-49; M-1 to P-48; M-1 to A-47; M-1 to H-46;
A-45; M-1 to A-44; M-1 to Q-43; M-1 to D-42;
R-41; M-1 to L-40; M-1 to S-39; M-1 to V-38;
T-37; M-1 to F-36; M-1 to H-35; M-1 to K-34;
P-33; M-1 to E-32; M-1 to Q-31; M-1 to L-30;
V-29; M-1 to L-28; M-1 to G-27; M-1 to R-26;
V-25; M-1 to I-24; M-1 to I-23; M-1 to V-22;
Q-21; M-1 to G-20; M-1 to P-19; M-1 to S-18;
L-17; M-1 to G-16; M-1 to Q-15; M-1 to P-14;
L-13; M-1 to A-12; M-1 to H-11; M-1 to S-10;
C-9; M-1 to P-8; M-1 to V-7; and M-1 to E-6. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.
【０１４４】 さらに、上記に列挙された任意のＮ末端欠失またはＣ末端欠失は、Ｎ末端欠失
ガレクチン１１ポリペプチドまたはＣ末端欠失ガレクチン１１ポリペプチドを生
成するために組み合わせられ得る。本発明はまた、配列番号２の残基ｍ〜ｎを有
するものとして一般的に記載され得る、アミノ末端およびカルボキシル末端の両
方から１以上のアミノ酸欠失を有するポリペプチドを提供し、ここで、ｎおよび
ｍは、上記のような整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドもまた、本発明に含まれる。In addition, any of the N-terminal or C-terminal deletions listed above can be combined to produce an N-terminal deleted galectin-11 polypeptide or a C-terminal deleted galectin-11 polypeptide. The present invention also provides polypeptides having one or more amino acid deletions from both the amino and carboxyl termini, which can be generally described as having residues mn of SEQ ID NO: 2, n and m are integers as described above. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.
【０１４５】 好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２の以下のア
ミノ酸残基を含むか、またはそれらからなる：Ｍ−１〜Ｌ−４０；Ｍ−１〜Ｗ−
６６；Ｐ−３〜Ｌ−４０；Ｌ−５〜Ｌ−４０；Ｌ−５〜Ｓ−１０８；Ｌ−５〜Ｌ
−１２８；Ｐ−３〜Ｌ−１２８；Ｌ−５〜Ｌ−１２８；Ｌ−５〜Ｇ−１２４；Ｃ
−９〜Ｃ−１３０；Ｌ−１３〜Ｌ−４０；Ｐ−１４〜Ｌ−４０；Ｌ−４０〜Ｓ−
１０８；Ａ−４７〜Ｓ−１０８；Ａ−４７〜Ｌ−１２８；Ｒ−６５〜Ｓ−１０８
；Ｒ−６５〜Ｌ−１２８；Ｌ−８８〜Ｓ−１０８；Ｌ−８８〜Ｌ−１２８；Ｓ−
１０８〜Ｌ−１２０；またはＬ−１１４〜Ｌ−１２８。これらのポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。In a preferred embodiment, a polypeptide of the invention comprises or consists of the following amino acid residues of SEQ ID NO: 2: M-1 to L-40; M-1 to W-
66; P-3 to L-40; L-5 to L-40; L-5 to S-108; L-5 to L
-128; P-3 to L-128; L-5 to L-128; L-5 to G-124; C
-9 to C-130; L-13 to L-40; P-14 to L-40; L-40 to S-.
108; A-47 to S-108; A-47 to L-128; R-65 to S-108
R-65 to L-128; L-88 to S-108; L-88 to L-128;
108-L-120; or L-114-L-128. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.
【０１４６】 ＡＴＣＣ登録番号２０９０５３に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードさ
れる完全ガレクチン１１アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列もまた含まれ、ここで、この部分は、ＡＴＣＣ登録番号２０９
０５３に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列のア
ミノ末端から１〜約１２３アミノ酸の任意の数のアミノ酸残基、あるいは、ＡＴ
ＣＣ登録番号２０９０５３に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完
全アミノ酸配列の、そのカルボキシ末端から１〜約１２３アミノ酸の任意の数の
アミノ酸残基、または上記アミノ末端欠失およびカルボキシル末端欠失の任意の
組み合わせを排除する。上記の欠失変異体ポリペプチド形態の全てをコードする
ポリヌクレオチドもまた提供される。Also included is a nucleotide sequence that encodes a polypeptide consisting of a portion of the complete galectin 11 amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 209053, wherein this portion corresponds to ATCC Accession No. 209
053 to any number of amino acid residues from 1 to about 123 amino acids from the amino terminus of the complete amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in
Any number of amino acid residues from 1 to about 123 amino acids from the carboxy terminus of the complete amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in CC Accession No. 209053, or any of the above amino and carboxyl terminal deletions Eliminate combinations. Polynucleotides encoding all of the above deletion mutant polypeptide forms are also provided.
【０１４７】 本発明はまた、本明細書中にｍ〜ｎで示される、ガレクチン１１ポリペプチド
配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、
９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドを含むタンパク質に関する
。好ましい実施形態において、本出願は、本明細書中に引用される特定のガレク
チン１１Ｎの末端欠失およびＣ末端欠失のアミノ酸配列を有するポリペプチドに
、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８
％または９９％同一であるポリペプチドを含むタンパク質に関する。これらのポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。[0147] The present invention also provides at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 96%,
A protein comprising polypeptides that are 97%, 98% or 99% identical. In a preferred embodiment, the present application provides that at least 80%, 85%, 90%, 92% %, 95%, 96%, 97%, 98
% Or 99% identical polypeptides. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.
【０１４８】 さらなる好ましいポリペプチドフラグメントは、配列番号２の以下のアミノ酸
残基を含むか、またはそれらからなる：Ｍ−１〜Ｑ−１５；Ｓ−２〜Ｇ−１６；
Ｐ−３〜Ｌ−１７；Ｒ−４〜Ｓ−１８；Ｌ−５〜Ｐ−１９；Ｅ−６〜Ｇ−２０；
Ｖ−７〜Ｑ−２１；Ｐ−８〜Ｖ−２２；Ｃ−９〜Ｉ−２３；Ｓ−１０〜Ｉ−２４
；Ｈ−１１〜Ｖ−２５；Ａ−１２〜Ｒ−２６；Ｌ−１３〜Ｇ−２７；Ｐ−１４〜
Ｌ−２８；Ｑ−１５〜Ｖ−２９；Ｇ−１６〜Ｌ−３０；Ｌ−１７〜Ｑ−３１；Ｓ
−１８〜Ｅ−３２；Ｐ−１９〜Ｐ−３３；Ｇ−２０〜Ｋ−３４；Ｑ−２１〜Ｈ−
３５；Ｖ−２２〜Ｆ−３６；Ｉ−２３〜Ｔ−３７；Ｉ−２４〜Ｖ−３８；Ｖ−２
５〜Ｓ−３９；Ｒ−２６〜Ｌ−４０；Ｇ−２７〜Ｒ−４１；Ｌ−２８〜Ｄ−４２
；Ｖ−２９〜Ｑ−４３；Ｌ−３０〜Ａ−４４；Ｑ−３１〜Ａ−４５；Ｅ−３２〜
Ｈ−４６；Ｐ−３３〜Ａ−４７；Ｋ−３４〜Ｐ−４８；Ｈ−３５〜Ｖ−４９；Ｆ
−３６〜Ｔ−５０；Ｔ−３７〜Ｌ−５１；Ｖ−３８〜Ｒ−５２；Ｓ−３９〜Ａ−
５３；Ｌ−４０〜Ｓ−５４；Ｒ−４１〜Ｆ−５５；Ｄ−４２〜Ａ−５６；Ｑ−４
３〜Ｄ−５７；Ａ−４４〜Ｒ−５８；Ａ−４５〜Ｔ−５９；Ｈ−４６〜Ｌ−６０
；Ａ−４７〜Ａ−６１；Ｐ−４８〜Ｗ−６２；Ｖ−４９〜Ｉ−６３；Ｔ−５０〜
Ｓ−６４；Ｌ−５１〜Ｒ−６５；Ｒ−５２〜Ｗ−６６；Ａ−５３〜Ｇ−６７；Ｓ
−５４〜Ｑ−６８；Ｆ−５５〜Ｋ−６９；Ａ−５６〜Ｋ−７０；Ｄ−５７〜Ｌ−
７１；Ｒ−５８〜Ｉ−７２；Ｔ−５９〜Ｓ−７３；Ｌ−６０〜Ａ−７４；Ａ−６
１〜Ｐ−７５；Ｗ−６２〜Ｆ−７６；Ｉ−６３〜Ｌ−７７；Ｓ−６４〜Ｆ−７８
；Ｒ−６５〜Ｙ−７９；Ｗ−６６〜Ｐ−８０；Ｇ−６７〜Ｑ−８１；Ｑ−６８〜
Ｒ−８２；Ｋ−６９〜Ｆ−８３；Ｋ−７０〜Ｆ−８４；Ｌ−７１〜Ｅ−８５；Ｉ
−７２〜Ｖ−８６；Ｓ−７３〜Ｌ−８７；Ａ−７４〜Ｌ−８８；Ｐ−７５〜Ｌ−
８９；Ｆ−７６〜Ｆ−９０；Ｌ−７７〜Ｑ−９１；Ｆ−７８〜Ｅ−９２；Ｙ−７
９〜Ｇ−９３；Ｐ−８０〜Ｇ−９４；Ｑ−８１〜Ｌ−９５；Ｒ−８２〜Ｋ−９６
；Ｆ−８３〜Ｌ−９７；Ｆ−８４〜Ａ−９８；Ｅ−８５〜Ｌ−９９；Ｖ−８６〜
Ｎ−１００；Ｌ−８７〜Ｇ−１０１；Ｌ−８８〜Ｑ−１０２；Ｌ−８９〜Ｇ−１
０３；Ｆ−９０〜Ｌ−１０４；Ｑ−９１〜Ｇ−１０５；Ｅ−９２〜Ａ−１０６；
Ｇ−９３〜Ｔ−１０７；Ｇ−９４〜Ｓ−１０８；Ｌ−９５〜Ｍ−１０９；Ｋ−９
６〜Ｎ−１１０；Ｌ−９７〜Ｑ−１１１；Ａ−９８〜Ｑ−１１２；Ｌ−９９〜Ａ
−１１３；Ｎ−１００〜Ｌ−１１４；Ｇ−１０１〜Ｅ−１１５；Ｑ−１０２〜Ｑ
−１１６；Ｇ−１０３〜Ｌ−１１７；Ｌ−１０４〜Ｒ−１１８；Ｇ−１０５〜Ｅ
−１１９；Ａ−１０６〜Ｌ−１２０；Ｔ−１０７〜Ｒ−１２１；Ｓ−１０８〜Ｉ
−１２２；Ｍ−１０９〜Ｓ−１２３；Ｎ−１１０〜Ｇ−１２４；Ｑ−１１１〜Ｓ
−１２５；Ｑ−１１２〜Ｖ−１２６；Ａ−１１３〜Ｑ−１２７；Ｌ−１１４〜Ｌ
−１２８；Ｅ−１１５〜Ｙ−１２９；Ｑ−１１６〜Ｃ−１３０；Ｌ−１１７〜Ｖ
−１３１；Ｒ−１１８〜Ｈ−１３２；およびＥ−１１９〜Ｓ−１３３。これらの
ポリペプチドフラグメントは、本発明のガレクチン１１ポリペプチドの生物学的
活性を保持するか、そして／またはさらに以下に記載されるように、抗体を生成
またはスクリーニングするために有用であり得る。これらのポリペプチドフラグ
メントをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。Further preferred polypeptide fragments comprise or consist of the following amino acid residues of SEQ ID NO: 2: M-1 to Q-15; S-2 to G-16;
P-3 to L-17; R-4 to S-18; L-5 to P-19; E-6 to G-20;
V-7 to Q-21; P-8 to V-22; C-9 to I-23; S-10 to I-24.
H-11 to V-25; A-12 to R-26; L-13 to G-27;
L-28; Q-15 to V-29; G-16 to L-30; L-17 to Q-31; S
-18 to E-32; P-19 to P-33; G-20 to K-34;
35; V-22 to F-36; I-23 to T-37; I-24 to V-38; V-2
5-S-39; R-26 to L-40; G-27 to R-41; L-28 to D-42
V-29 to Q-43; L-30 to A-44; Q-31 to A-45;
H-46; P-33 to A-47; K-34 to P-48; H-35 to V-49; F
-36 to T-50; T-37 to L-51; V-38 to R-52; S-39 to A-.
53; L-40 to S-54; R-41 to F-55; D-42 to A-56;
3-D-57; A-44 to R-58; A-45 to T-59; H-46 to L-60.
A-47 to A-61; P-48 to W-62; V-49 to I-63;
S-64; L-51 to R-65; R-52 to W-66; A-53 to G-67; S
-54 to Q-68; F-55 to K-69; A-56 to K-70; D-57 to L-.
R-58 to I-72; T-59 to S-73; L-60 to A-74; A-6
1-P-75; W-62-F-76; I-63-L-77; S-64-F-78
R-65 to Y-79; W-66 to P-80; G-67 to Q-81;
R-82; K-69 to F-83; K-70 to F-84; L-71 to E-85;
-72 to V-86; S-73 to L-87; A-74 to L-88; P-75 to L-.
89; F-76 to F-90; L-77 to Q-91; F-78 to E-92; Y-7
9-G-93; P-80-G-94; Q-81-L-95; R-82-K-96
F-83 to L-97; F-84 to A-98; E-85 to L-99;
N-100; L-87 to G-101; L-88 to Q-102; L-89 to G-1
03; F-90 to L-104; Q-91 to G-105; E-92 to A-106;
G-93 to T-107; G-94 to S-108; L-95 to M-109; K-9
6-N-110; L-97-Q-111; A-98-Q-112; L-99-A
-113; N-100 to L-114; G-101 to E-115; Q-102 to Q
-116; G-103 to L-117; L-104 to R-118; G-105 to E
-119; A-106 to L-120; T-107 to R-121; S-108 to I
-122; M-109 to S-123; N-110 to G-124;
-125; Q-112 to V-126; A-113 to Q-127; L-114 to L
-128; E-115 to Y-129; Q-116 to C-130; L-117 to V
-131; R-118 to H-132; and E-119 to S-133. These polypeptide fragments retain the biological activity of the Galectin-11 polypeptides of the invention and / or may be useful for generating or screening antibodies, as described further below. Polynucleotides encoding these polypeptide fragments are also included in the present invention.
【０１４９】 別の実施形態において、本発明はさらに、配列番号２５に示されるか、または
寄託クローンのｃＤＮＡによってコードされるガレクチン１１ポリペプチドのア
ミノ酸配列のアミノ末端から、１以上の残基が欠失されたポリペプチドを提供す
る。特に、１つの実施形態において、ガレクチン１１ポリペプチドのＮ末端欠失
は、一般式ｍ〜２７５によって記載され、ここで、ｍは、配列番号２５において
同定されるアミノ酸残基の位置に対応する２〜２７０の整数であり、そして好ま
しくは、本明細書中に特定化されるＮ末端欠失において同定されるＮ末端アミノ
酸残基の１つに対応する。特定の実施態様において、本発明のガレクチン１１ポ
リペプチドのＮ末端欠失は、配列番号２５の以下のアミノ酸残基を含むか、また
はそれらからなる：Ｖ−２〜Ｓ−２７５；Ｍ−３〜Ｓ−２７５；Ｌ−４〜Ｓ−２
７５；Ｑ−５〜Ｓ−２７５；Ｇ−６〜Ｓ−２７５；Ｖ−７〜Ｓ−２７５；Ｖ−８
〜Ｓ−２７５；Ｐ−９〜Ｓ−２７５；Ｌ−１０〜Ｓ−２７５；Ｄ−１１〜Ｓ−２
７５；Ａ−１２〜Ｓ−２７５；Ｈ−１３〜Ｓ−２７５；Ｒ−１４〜Ｓ−２７５；
Ｆ−１５〜Ｓ−２７５；Ｑ−１６〜Ｓ−２７５；Ｖ−１７〜Ｓ−２７５；Ｄ−１
８〜Ｓ−２７５；Ｆ−１９〜Ｓ−２７５；Ｑ−２０〜Ｓ−２７５；Ｃ−２１〜Ｓ
−２７５；Ｇ−２２〜Ｓ−２７５；Ｃ−２３〜Ｓ−２７５；Ｓ−２４〜Ｓ−２７
５；Ｌ−２５〜Ｓ−２７５；Ｃ−２６〜Ｓ−２７５；Ｐ−２７〜Ｓ−２７５；Ｒ
−２８〜Ｓ−２７５；Ｐ−２９〜Ｓ−２７５；Ｄ−３０〜Ｓ−２７５；Ｉ−３１
〜Ｓ−２７５；Ａ−３２〜Ｓ−２７５；Ｆ−３３〜Ｓ−２７５；Ｈ−３４〜Ｓ−
２７５；Ｆ−３５〜Ｓ−２７５；Ｎ−３６〜Ｓ−２７５；Ｐ−３７〜Ｓ−２７５
；Ｒ−３８〜Ｓ−２７５；Ｆ−３９〜Ｓ−２７５；Ｈ−４０〜Ｓ−２７５；Ｔ−
４１〜Ｓ−２７５；Ｔ−４２〜Ｓ−２７５；Ｋ−４３〜Ｓ−２７５；Ｐ−４４〜
Ｓ−２７５；Ｈ−４５〜Ｓ−２７５；Ｖ−４６〜Ｓ−２７５；Ｉ−４７〜Ｓ−２
７５；Ｃ−４８〜Ｓ−２７５；Ｎ−４９〜Ｓ−２７５；Ｔ−５０〜Ｓ−２７５；
Ｌ−５１〜Ｓ−２７５；Ｈ−５２〜Ｓ−２７５；Ｇ−５３〜Ｓ−２７５；Ｇ−５
４〜Ｓ−２７５；Ｒ−５５〜Ｓ−２７５；Ｗ−５６〜Ｓ−２７５；Ｑ−５７〜Ｓ
−２７５；Ｒ−５８〜Ｓ−２７５；Ｅ−５９〜Ｓ−２７５；Ａ−６０〜Ｓ−２７
５；Ｒ−６１〜Ｓ−２７５；Ｗ−６２〜Ｓ−２７５；Ｐ−６３〜Ｓ−２７５；Ｈ
−６４〜Ｓ−２７５；Ｌ−６５〜Ｓ−２７５；Ａ−６６〜Ｓ−２７５；Ｌ−６７
〜Ｓ−２７５；Ｒ−６８〜Ｓ−２７５；Ｒ−６９〜Ｓ−２７５；Ｇ−７０〜Ｓ−
２７５；Ｓ−７１〜Ｓ−２７５；Ｓ−７２〜Ｓ−２７５；Ｆ−７３〜Ｓ−２７５
；Ｌ−７４〜Ｓ−２７５；Ｉ−７５〜Ｓ−２７５；Ｌ−７６〜Ｓ−２７５；Ｆ−
７７〜Ｓ−２７５；Ｌ−７８〜Ｓ−２７５；Ｆ−７９〜Ｓ−２７５；Ｇ−８０〜
Ｓ−２７５；Ｎ−８１〜Ｓ−２７５；Ｅ−８２〜Ｓ−２７５；Ｅ−８３〜Ｓ−２
７５；Ｖ−８４〜Ｓ−２７５；Ｋ−８５〜Ｓ−２７５；Ｖ−８６〜Ｓ−２７５；
Ｓ−８７〜Ｓ−２７５；Ｖ−８８〜Ｓ−２７５；Ｎ−８９〜Ｓ−２７５；Ｇ−９
０〜Ｓ−２７５；Ｑ−９１〜Ｓ−２７５；Ｈ−９２〜Ｓ−２７５；Ｆ−９３〜Ｓ
−２７５；Ｌ−９４〜Ｓ−２７５；Ｈ−９５〜Ｓ−２７５；Ｆ−９６〜Ｓ−２７
５；Ｒ−９７〜Ｓ−２７５；Ｙ−９８〜Ｓ−２７５；Ｒ−９９〜Ｓ−２７５；Ｌ
−１００〜Ｓ−２７５；Ｐ−１０１〜Ｓ−２７５；Ｌ−１０２〜Ｓ−２７５；Ｓ
−１０３〜Ｓ−２７５；Ｈ−１０４〜Ｓ−２７５；Ｖ−１０５〜Ｓ−２７５；Ｄ
−１０６〜Ｓ−２７５；Ｔ−１０７〜Ｓ−２７５；Ｌ−１０８〜Ｓ−２７５；Ｇ
−１０９〜Ｓ−２７５；Ｉ−１１０〜Ｓ−２７５；Ｆ−１１１〜Ｓ−２７５；Ｇ
−１１２〜Ｓ−２７５；Ｄ−１１３〜Ｓ−２７５；Ｉ−１１４〜Ｓ−２７５；Ｌ
−１１５〜Ｓ−２７５；Ｖ−１１６〜Ｓ−２７５；Ｅ−１１７〜Ｓ−２７５；Ａ
−１１８〜Ｓ−２７５；Ｖ−１１９〜Ｓ−２７５；Ｇ−１２０〜Ｓ−２７５；Ｆ
−１２１〜Ｓ−２７５；Ｌ−１２２〜Ｓ−２７５；Ｎ−１２３〜Ｓ−２７５；Ｉ
−１２４〜Ｓ−２７５；Ｎ−１２５〜Ｓ−２７５；Ｐ−１２６〜Ｓ−２７５；Ｆ
−１２７〜Ｓ−２７５；Ｖ−１２８〜Ｓ−２７５；Ｅ−１２９〜Ｓ−２７５；Ｇ
−１３０〜Ｓ−２７５；Ｓ−１３１〜Ｓ−２７５；Ｒ−１３２〜Ｓ−２７５；Ｅ
−１３３〜Ｓ−２７５；Ｙ−１３４〜Ｓ−２７５；Ｐ−１３５〜Ｓ−２７５；Ａ
−１３６〜Ｓ−２７５；Ｇ−１３７〜Ｓ−２７５；Ｈ−１３８〜Ｓ−２７５；Ｐ
−１３９〜Ｓ−２７５；Ｆ−１４０〜Ｓ−２７５；Ｌ−１４１〜Ｓ−２７５；Ｌ
−１４２〜Ｓ−２７５；Ｍ−１４３〜Ｓ−２７５；Ｓ−１４４〜Ｓ−２７５；Ｐ
−１４５〜Ｓ−２７５；Ｒ−１４６〜Ｓ−２７５；Ｌ−１４７〜Ｓ−２７５；Ｅ
−１４８〜Ｓ−２７５；Ｖ−１４９〜Ｓ−２７５；Ｐ−１５０〜Ｓ−２７５；Ｃ
−１５１〜Ｓ−２７５；Ｓ−１５２〜Ｓ−２７５；Ｈ−１５３〜Ｓ−２７５；Ａ
−１５４〜Ｓ−２７５；Ｌ−１５５〜Ｓ−２７５；Ｐ−１５６〜Ｓ−２７５；Ｑ
−１５７〜Ｓ−２７５；Ｇ−１５８〜Ｓ−２７５；Ｌ−１５９〜Ｓ−２７５；Ｓ
−１６０〜Ｓ−２７５；Ｐ−１６１〜Ｓ−２７５；Ｇ−１６２〜Ｓ−２７５；Ｑ
−１６３〜Ｓ−２７５；Ｖ−１６４〜Ｓ−２７５；Ｉ−１６５〜Ｓ−２７５；Ｉ
−１６６〜Ｓ−２７５；Ｖ−１６７〜Ｓ−２７５；Ｒ−１６８〜Ｓ−２７５；Ｇ
−１６９〜Ｓ−２７５；Ｌ−１７０〜Ｓ−２７５；Ｖ−１７１〜Ｓ−２７５；Ｌ
−１７２〜Ｓ−２７５；Ｑ−１７３〜Ｓ−２７５；Ｅ−１７４〜Ｓ−２７５；Ｐ
−１７５〜Ｓ−２７５；Ｋ−１７６〜Ｓ−２７５；Ｈ−１７７〜Ｓ−２７５；Ｆ
−１７８〜Ｓ−２７５；Ｔ−１７９〜Ｓ−２７５；Ｖ−１８０〜Ｓ−２７５；Ｓ
−１８１〜Ｓ−２７５；Ｌ−１８２〜Ｓ−２７５；Ｒ−１８３〜Ｓ−２７５；Ｄ
−１８４〜Ｓ−２７５；Ｑ−１８５〜Ｓ−２７５；Ａ−１８６〜Ｓ−２７５；Ａ
−１８７〜Ｓ−２７５；Ｈ−１８８〜Ｓ−２７５；Ａ−１８９〜Ｓ−２７５；Ｐ
−１９０〜Ｓ−２７５；Ｖ−１９１〜Ｓ−２７５；Ｔ−１９２〜Ｓ−２７５；Ｌ
−１９３〜Ｓ−２７５；Ｒ−１９４〜Ｓ−２７５；Ａ−１９５〜Ｓ−２７５；Ｓ
−１９６〜Ｓ−２７５；Ｆ−１９７〜Ｓ−２７５；Ａ−１９８〜Ｓ−２７５；Ｄ
−１９９〜Ｓ−２７５；Ｒ−２００〜Ｓ−２７５；Ｔ−２０１〜Ｓ−２７５；Ｌ
−２０２〜Ｓ−２７５；Ａ−２０３〜Ｓ−２７５；Ｗ−２０４〜Ｓ−２７５；Ｉ
−２０５〜Ｓ−２７５；Ｓ−２０６〜Ｓ−２７５；Ｒ−２０７〜Ｓ−２７５；Ｗ
−２０８〜Ｓ−２７５；Ｇ−２０９〜Ｓ−２７５；Ｑ−２１０〜Ｓ−２７５；Ｋ
−２１１〜Ｓ−２７５；Ｋ−２１２〜Ｓ−２７５；Ｌ−２１３〜Ｓ−２７５；Ｉ
−２１４〜Ｓ−２７５；Ｓ−２１５〜Ｓ−２７５；Ａ−２１６〜Ｓ−２７５；Ｐ
−２１７〜Ｓ−２７５；Ｆ−２１８〜Ｓ−２７５；Ｌ−２１９〜Ｓ−２７５；Ｆ
−２２０〜Ｓ−２７５；Ｙ−２２１〜Ｓ−２７５；Ｐ−２２２〜Ｓ−２７５；Ｑ
−２２３〜Ｓ−２７５；Ｒ−２２４〜Ｓ−２７５；Ｆ−２２５〜Ｓ−２７５；Ｆ
−２２６〜Ｓ−２７５；Ｅ−２２７〜Ｓ−２７５；Ｖ−２２８〜Ｓ−２７５；Ｌ
−２２９〜Ｓ−２７５；Ｌ−２３０〜Ｓ−２７５；Ｌ−２３１〜Ｓ−２７５；Ｆ
−２３２〜Ｓ−２７５；Ｑ−２３３〜Ｓ−２７５；Ｅ−２３４〜Ｓ−２７５；Ｇ
−２３５〜Ｓ−２７５；Ｇ−２３６〜Ｓ−２７５；Ｌ−２３７〜Ｓ−２７５；Ｋ
−２３８〜Ｓ−２７５；Ｌ−２３９〜Ｓ−２７５；Ａ−２４０〜Ｓ−２７５；Ｌ
−２４１〜Ｓ−２７５；Ｎ−２４２〜Ｓ−２７５；Ｇ−２４３〜Ｓ−２７５；Ｑ
−２４４〜Ｓ−２７５；Ｇ−２４５〜Ｓ−２７５；Ｌ−２４６〜Ｓ−２７５；Ｇ
−２４７〜Ｓ−２７５；Ａ−２４８〜Ｓ−２７５；Ｔ−２４９〜Ｓ−２７５；Ｓ
−２５０〜Ｓ−２７５；Ｍ−２５１〜Ｓ−２７５；Ｎ−２５２〜Ｓ−２７５；Ｑ
−２５３〜Ｓ−２７５；Ｑ−２５４〜Ｓ−２７５；Ａ−２５５〜Ｓ−２７５；Ｌ
−２５６〜Ｓ−２７５；Ｅ−２５７〜Ｓ−２７５；Ｑ−２５８〜Ｓ−２７５；Ｌ
−２５９〜Ｓ−２７５；Ｒ−２６０〜Ｓ−２７５；Ｅ−２６１〜Ｓ−２７５；Ｌ
−２６２〜Ｓ−２７５；Ｒ−２６３〜Ｓ−２７５；Ｉ−２６４〜Ｓ−２７５；Ｓ
−２６５〜Ｓ−２７５；Ｇ−２６６〜Ｓ−２７５；Ｓ−２６７〜Ｓ−２７５；Ｖ
−２６８〜Ｓ−２７５；Ｑ−２６９〜Ｓ−２７５；およびＬ−２７０〜Ｓ−２７
５。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含
まれる。In another embodiment, the present invention further relates to a deletion of one or more residues from the amino terminus of the amino acid sequence of galectin-11 polypeptide set forth in SEQ ID NO: 25 or encoded by the cDNA of the deposited clone. Provide the lost polypeptide. In particular, in one embodiment, the N-terminal deletion of the galectin-11 polypeptide is described by the general formula m-275, where m is 2 to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 25. Is an integer of ２270, and preferably corresponds to one of the N-terminal amino acid residues identified in the N-terminal deletion specified herein. In certain embodiments, the N-terminal deletion of a Galectin 11 polypeptide of the invention comprises or consists of the following amino acid residues of SEQ ID NO: 25: V-2-S-275; S-275; L-4 to S-2
75; Q-5 to S-275; G-6 to S-275; V-7 to S-275; V-8
P-9 to S-275; L-10 to S-275; D-11 to S-2.
75; A-12 to S-275; H-13 to S-275; R-14 to S-275;
F-15 to S-275; Q-16 to S-275; V-17 to S-275; D-1
8-S-275; F-19-S-275; Q-20-S-275; C-21-S
-275; G-22 to S-275; C-23 to S-275; S-24 to S-27
5; L-25 to S-275; C-26 to S-275; P-27 to S-275; R
-28 to S-275; P-29 to S-275; D-30 to S-275; I-31
A-32-S-275; F-33-S-275; H-34-S-
275; F-35 to S-275; N-36 to S-275; P-37 to S-275
R-38 to S-275; F-39 to S-275; H-40 to S-275;
41-S-275; T-42-S-275; K-43-S-275; P-44-
S-275; H-45 to S-275; V-46 to S-275; I-47 to S-2
75; C-48 to S-275; N-49 to S-275; T-50 to S-275;
L-51 to S-275; H-52 to S-275; G-53 to S-275; G-5
4-S-275; R-55-S-275; W-56-S-275; Q-57-S
-275; R-58 to S-275; E-59 to S-275; A-60 to S-27
5; R-61 to S-275; W-62 to S-275; P-63 to S-275; H
-64 to S-275; L-65 to S-275; A-66 to S-275; L-67
-S-275; R-68 to S-275; R-69 to S-275; G-70 to S-
275; S-71 to S-275; S-72 to S-275; F-73 to S-275
L-74 to S-275; I-75 to S-275; L-76 to S-275;
77-S-275; L-78-S-275; F-79-S-275; G-80-
S-275; N-81 to S-275; E-82 to S-275; E-83 to S-2
75; V-84 to S-275; K-85 to S-275; V-86 to S-275;
S-87 to S-275; V-88 to S-275; N-89 to S-275; G-9
0-S-275; Q-91-S-275; H-92-S-275; F-93-S
-275; L-94 to S-275; H-95 to S-275; F-96 to S-27
5; R-97 to S-275; Y-98 to S-275; R-99 to S-275; L
-100 to S-275; P-101 to S-275; L-102 to S-275; S
-103 to S-275; H-104 to S-275; V-105 to S-275; D
-106 to S-275; T-107 to S-275; L-108 to S-275; G
-109 to S-275; I-110 to S-275; F-111 to S-275; G
-112 to S-275; D-113 to S-275; I-114 to S-275; L
-115 to S-275; V-116 to S-275; E-117 to S-275; A
-118 to S-275; V-119 to S-275; G-120 to S-275; F
-121 to S-275; L-122 to S-275; N-123 to S-275; I
-124 to S-275; N-125 to S-275; P-126 to S-275; F
-127 to S-275; V-128 to S-275; E-129 to S-275; G
-130 to S-275; S-131 to S-275; R-132 to S-275; E
-133 to S-275; Y-134 to S-275; P-135 to S-275; A
-136 to S-275; G-137 to S-275; H-138 to S-275; P
-139 to S-275; F-140 to S-275; L-141 to S-275; L
-142 to S-275; M-143 to S-275; S-144 to S-275; P
-145 to S-275; R-146 to S-275; L-147 to S-275; E
-148 to S-275; V-149 to S-275; P-150 to S-275; C
-151 to S-275; S-152 to S-275; H-153 to S-275; A
-154 to S-275; L-155 to S-275; P-156 to S-275; Q
-157 to S-275; G-158 to S-275; L-159 to S-275; S
-160 to S-275; P-161 to S-275; G-162 to S-275; Q
-163 to S-275; V-164 to S-275; I-165 to S-275; I
-166 to S-275; V-167 to S-275; R-168 to S-275; G
-169 to S-275; L-170 to S-275; V-171 to S-275; L
-172 to S-275; Q-173 to S-275; E-174 to S-275; P
-175 to S-275; K-176 to S-275; H-177 to S-275; F
-178 to S-275; T-179 to S-275; V-180 to S-275; S
-181 to S-275; L-182 to S-275; R-183 to S-275; D
-184 to S-275; Q-185 to S-275; A-186 to S-275; A
-187 to S-275; H-188 to S-275; A-189 to S-275; P
-190 to S-275; V-191 to S-275; T-192 to S-275; L
-193 to S-275; R-194 to S-275; A-195 to S-275; S
-196 to S-275; F-197 to S-275; A-198 to S-275; D
-199 to S-275; R-200 to S-275; T-201 to S-275; L
-202 to S-275; A-203 to S-275; W-204 to S-275; I
-205 to S-275; S-206 to S-275; R-207 to S-275; W
-208 to S-275; G-209 to S-275; Q-210 to S-275; K
K-212 to S-275; L-213 to S-275; I
-214 to S-275; S-215 to S-275; A-216 to S-275; P
-217 to S-275; F-218 to S-275; L-219 to S-275; F
-220 to S-275; Y-221 to S-275; P-222 to S-275; Q
-223 to S-275; R-224 to S-275; F-225 to S-275; F
-226 to S-275; E-227 to S-275; V-228 to S-275; L
-229 to S-275; L-230 to S-275; L-231 to S-275; F
-232 to S-275; Q-233 to S-275; E-234 to S-275; G
-235 to S-275; G-236 to S-275; L-237 to S-275; K
-238 to S-275; L-239 to S-275; A-240 to S-275; L
-241 to S-275; N-242 to S-275; G-243 to S-275; Q
-244 to S-275; G-245 to S-275; L-246 to S-275; G
-247 to S-275; A-248 to S-275; T-249 to S-275; S
-250 to S-275; M-251 to S-275; N-252 to S-275; Q
-253 to S-275; Q-254 to S-275; A-255 to S-275; L
-256 to S-275; E-257 to S-275; Q-258 to S-275; L
-259 to S-275; R-260 to S-275; E-261 to S-275; L
-262 to S-275; R-263 to S-275; I-264 to S-275; S
-265 to S-275; G-266 to S-275; S-267 to S-275; V
-268 to S-275; Q-269 to S-275; and L-270 to S-27.
5. Polynucleotides encoding such polypeptides are also included in the present invention.
【０１５０】 本発明のさらなる実施形態は、一般式１〜ｎで記載される、ガレクチン１１ポ
リペプチドのＣ末端欠失に関する。ここで、ｎは、配列番号２５において同定さ
れるアミノ酸残基の位置に対応する６〜２７５の整数であり、そして好ましくは
、本明細書中に特定化されるＣ末端欠失において同定されるＣ末端アミノ酸残基
の１つに対応する。特定の実施態様において、本発明のガレクチン１１ポリペプ
チドのＣ末端欠失は、配列番号２５の以下のアミノ酸残基を含むか、またはそれ
らからなる：Ｍ−１〜Ｈ−２７４；Ｍ−１〜Ｖ−２７３；Ｍ−１〜Ｃ−２７２；
Ｍ−１〜Ｙ−２７１；Ｍ−１〜Ｌ−２７０；Ｍ−１〜Ｑ−２６９；Ｍ−１〜Ｖ−
２６８；Ｍ−１〜Ｓ−２６７；Ｍ−１〜Ｇ−２６６；Ｍ−１〜Ｓ−２６５；Ｍ−
１〜Ｉ−２６４；Ｍ−１〜Ｒ−２６３；Ｍ−１〜Ｌ−２６２；Ｍ−１〜Ｅ−２６
１；Ｍ−１〜Ｒ−２６０；Ｍ−１〜Ｌ−２５９；Ｍ−１〜Ｑ−２５８；Ｍ−１〜
Ｅ−２５７；Ｍ−１〜Ｌ−２５６；Ｍ−１〜Ａ−２５５；Ｍ−１〜Ｑ−２５４；
Ｍ−１〜Ｑ−２５３；Ｍ−１〜Ｎ−２５２；Ｍ−１〜Ｍ−２５１；Ｍ−１〜Ｓ−
２５０；Ｍ−１〜Ｔ−２４９；Ｍ−１〜Ａ−２４８；Ｍ−１〜Ｇ−２４７；Ｍ−
１〜Ｌ−２４６；Ｍ−１〜Ｇ−２４５；Ｍ−１〜Ｑ−２４４；Ｍ−１〜Ｇ−２４
３；Ｍ−１〜Ｎ−２４２；Ｍ−１〜Ｌ−２４１；Ｍ−１〜Ａ−２４０；Ｍ−１〜
Ｌ−２３９；Ｍ−１〜Ｋ−２３８；Ｍ−１〜Ｌ−２３７；Ｍ−１〜Ｇ−２３６；
Ｍ−１〜Ｇ−２３５；Ｍ−１〜Ｅ−２３４；Ｍ−１〜Ｑ−２３３；Ｍ−１〜Ｆ−
２３２；Ｍ−１〜Ｌ−２３１；Ｍ−１〜Ｌ−２３０；Ｍ−１〜Ｌ−２２９；Ｍ−
１〜Ｖ−２２８；Ｍ−１〜Ｅ−２２７；Ｍ−１〜Ｆ−２２６；Ｍ−１〜Ｆ−２２
５；Ｍ−１〜Ｒ−２２４；Ｍ−１〜Ｑ−２２３；Ｍ−１〜Ｐ−２２２；Ｍ−１〜
Ｙ−２２１；Ｍ−１〜Ｆ−２２０；Ｍ−１〜Ｌ−２１９；Ｍ−１〜Ｆ−２１８；
Ｍ−１〜Ｐ−２１７；Ｍ−１〜Ａ−２１６；Ｍ−１〜Ｓ−２１５；Ｍ−１〜Ｉ−
２１４；Ｍ−１〜Ｌ−２１３；Ｍ−１〜Ｋ−２１２；Ｍ−１〜Ｋ−２１１；Ｍ−
１〜Ｑ−２１０；Ｍ−１〜Ｇ−２０９；Ｍ−１〜Ｗ−２０８；Ｍ−１〜Ｒ−２０
７；Ｍ−１〜Ｓ−２０６；Ｍ−１〜Ｉ−２０５；Ｍ−１〜Ｗ−２０４；Ｍ−１〜
Ａ−２０３；Ｍ−１〜Ｌ−２０２；Ｍ−１〜Ｔ−２０１；Ｍ−１〜Ｒ−２００；
Ｍ−１〜Ｄ−１９９；Ｍ−１〜Ａ−１９８；Ｍ−１〜Ｆ−１９７；Ｍ−１〜Ｓ−
１９６；Ｍ−１〜Ａ−１９５；Ｍ−１〜Ｒ−１９４；Ｍ−１〜Ｌ−１９３；Ｍ−
１〜Ｔ−１９２；Ｍ−１〜Ｖ−１９１；Ｍ−１〜Ｐ−１９０；Ｍ−１〜Ａ−１８
９；Ｍ−１〜Ｈ−１８８；Ｍ−１〜Ａ−１８７；Ｍ−１〜Ａ−１８６；Ｍ−１〜
Ｑ−１８５；Ｍ−１〜Ｄ−１８４；Ｍ−１〜Ｒ−１８３；Ｍ−１〜Ｌ−１８２；
Ｍ−１〜Ｓ−１８１；Ｍ−１〜Ｖ−１８０；Ｍ−１〜Ｔ−１７９；Ｍ−１〜Ｆ−
１７８；Ｍ−１〜Ｈ−１７７；Ｍ−１〜Ｋ−１７６；Ｍ−１〜Ｐ−１７５；Ｍ−
１〜Ｅ−１７４；Ｍ−１〜Ｑ−１７３；Ｍ−１〜Ｌ−１７２；Ｍ−１〜Ｖ−１７
１；Ｍ−１〜Ｌ−１７０；Ｍ−１〜Ｇ−１６９；Ｍ−１〜Ｒ−１６８；Ｍ−１〜
Ｖ−１６７；Ｍ−１〜Ｉ−１６６；Ｍ−１〜Ｉ−１６５；Ｍ−１〜Ｖ−１６４；
Ｍ−１〜Ｑ−１６３；Ｍ−１〜Ｇ−１６２；Ｍ−１〜Ｐ−１６１；Ｍ−１〜Ｓ−
１６０；Ｍ−１〜Ｌ−１５９；Ｍ−１〜Ｇ−１５８；Ｍ−１〜Ｑ−１５７；Ｍ−
１〜Ｐ−１５６；Ｍ−１〜Ｌ−１５５；Ｍ−１〜Ａ−１５４；Ｍ−１〜Ｈ−１５
３；Ｍ−１〜Ｓ−１５２；Ｍ−１〜Ｃ−１５１；Ｍ−１〜Ｐ−１５０；Ｍ−１〜
Ｖ−１４９；Ｍ−１〜Ｅ−１４８；Ｍ−１〜Ｌ−１４７；Ｍ−１〜Ｒ−１４６；
Ｍ−１〜Ｐ−１４５；Ｍ−１〜Ｓ−１４４；Ｍ−１〜Ｍ−１４３；Ｍ−１〜Ｌ−
１４２；Ｍ−１〜Ｌ−１４１；Ｍ−１〜Ｆ−１４０；Ｍ−１〜Ｐ−１３９；Ｍ−
１〜Ｈ−１３８；Ｍ−１〜Ｇ−１３７；Ｍ−１〜Ａ−１３６；Ｍ−１〜Ｐ−１３
５；Ｍ−１〜Ｙ−１３４；Ｍ−１〜Ｅ−１３３；Ｍ−１〜Ｒ−１３２；Ｍ−１〜
Ｓ−１３１；Ｍ−１〜Ｇ−１３０；Ｍ−１〜Ｅ−１２９；Ｍ−１〜Ｖ−１２８；
Ｍ−１〜Ｆ−１２７；Ｍ−１〜Ｐ−１２６；Ｍ−１〜Ｎ−１２５；Ｍ−１〜Ｉ−
１２４；Ｍ−１〜Ｎ−１２３；Ｍ−１〜Ｌ−１２２；Ｍ−１〜Ｆ−１２１；Ｍ−
１〜Ｇ−１２０；Ｍ−１〜Ｖ−１１９；Ｍ−１〜Ａ−１１８；Ｍ−１〜Ｅ−１１
７；Ｍ−１〜Ｖ−１１６；Ｍ−１〜Ｌ−１１５；Ｍ−１〜Ｉ−１１４；Ｍ−１〜
Ｄ−１１３；Ｍ−１〜Ｇ−１１２；Ｍ−１〜Ｆ−１１１；Ｍ−１〜Ｉ−１１０；
Ｍ−１〜Ｇ−１０９；Ｍ−１〜Ｌ−１０８；Ｍ−１〜Ｔ−１０７；Ｍ−１〜Ｄ−
１０６；Ｍ−１〜Ｖ−１０５；Ｍ−１〜Ｈ−１０４；Ｍ−１〜Ｓ−１０３；Ｍ−
１〜Ｌ−１０２；Ｍ−１〜Ｐ−１０１；Ｍ−１〜Ｌ−１００；Ｍ−１〜Ｒ−９９
；Ｍ−１〜Ｙ−９８；Ｍ−１〜Ｒ−９７；Ｍ−１〜Ｆ−９６；Ｍ−１〜Ｈ−９５
；Ｍ−１〜Ｌ−９４；Ｍ−１〜Ｆ−９３；Ｍ−１〜Ｈ−９２；Ｍ−１〜Ｑ−９１
；Ｍ−１〜Ｇ−９０；Ｍ−１〜Ｎ−８９；Ｍ−１〜Ｖ−８８；Ｍ−１〜Ｓ−８７
；Ｍ−１〜Ｖ−８６；Ｍ−１〜Ｋ−８５；Ｍ−１〜Ｖ−８４；Ｍ−１〜Ｅ−８３
；Ｍ−１〜Ｅ−８２；Ｍ−１〜Ｎ−８１；Ｍ−１〜Ｇ−８０；Ｍ−１〜Ｆ−７９
；Ｍ−１〜Ｌ−７８；Ｍ−１〜Ｆ−７７；Ｍ−１〜Ｌ−７６；Ｍ−１〜Ｉ−７５
；Ｍ−１〜Ｌ−７４；Ｍ−１〜Ｆ−７３；Ｍ−１〜Ｓ−７２；Ｍ−１〜Ｓ−７１
；Ｍ−１〜Ｇ−７０；Ｍ−１〜Ｒ−６９；Ｍ−１〜Ｒ−６８；Ｍ−１〜Ｌ−６７
；Ｍ−１〜Ａ−６６；Ｍ−１〜Ｌ−６５；Ｍ−１〜Ｈ−６４；Ｍ−１〜Ｐ−６３
；Ｍ−１〜Ｗ−６２；Ｍ−１〜Ｒ−６１；Ｍ−１〜Ａ−６０；Ｍ−１〜Ｅ−５９
；Ｍ−１〜Ｒ−５８；Ｍ−１〜Ｑ−５７；Ｍ−１〜Ｗ−５６；Ｍ−１〜Ｒ−５５
；Ｍ−１〜Ｇ−５４；Ｍ−１〜Ｇ−５３；Ｍ−１〜Ｈ−５２；Ｍ−１〜Ｌ−５１
；Ｍ−１〜Ｔ−５０；Ｍ−１〜Ｎ−４９；Ｍ−１〜Ｃ−４８；Ｍ−１〜Ｉ−４７
；Ｍ−１〜Ｖ−４６；Ｍ−１〜Ｈ−４５；Ｍ−１〜Ｐ−４４；Ｍ−１〜Ｋ−４３
；Ｍ−１〜Ｔ−４２；Ｍ−１〜Ｔ−４１；Ｍ−１〜Ｈ−４０；Ｍ−１〜Ｆ−３９
；Ｍ−１〜Ｒ−３８；Ｍ−１〜Ｐ−３７；Ｍ−１〜Ｎ−３６；Ｍ−１〜Ｆ−３５
；Ｍ−１〜Ｈ−３４；Ｍ−１〜Ｆ−３３；Ｍ−１〜Ａ−３２；Ｍ−１〜Ｉ−３１
；Ｍ−１〜Ｄ−３０；Ｍ−１〜Ｐ−２９；Ｍ−１〜Ｒ−２８；Ｍ−１〜Ｐ−２７
；Ｍ−１〜Ｃ−２６；Ｍ−１〜Ｌ−２５；Ｍ−１〜Ｓ−２４；Ｍ−１〜Ｃ−２３
；Ｍ−１〜Ｇ−２２；Ｍ−１〜Ｃ−２１；Ｍ−１〜Ｑ−２０；Ｍ−１〜Ｆ−１９
；Ｍ−１〜Ｄ−１８；Ｍ−１〜Ｖ−１７；Ｍ−１〜Ｑ−１６；Ｍ−１〜Ｆ−１５
；Ｍ−１〜Ｒ−１４；Ｍ−１〜Ｈ−１３；Ｍ−１〜Ａ−１２；Ｍ−１〜Ｄ−１１
；Ｍ−１〜Ｌ−１０；Ｍ−１〜Ｐ−９；Ｍ−１〜Ｖ−８；Ｍ−１〜Ｖ−７；およ
びＭ−１〜Ｇ−６。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもま
た、本発明に含まれる。A further embodiment of the present invention relates to a C-terminal deletion of a galectin 11 polypeptide described by general formulas 1-n. Where n is an integer from 6 to 275 corresponding to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 25, and preferably is identified in the C-terminal deletion specified herein. Corresponds to one of the C-terminal amino acid residues. In certain embodiments, the C-terminal deletion of a Galectin-11 polypeptide of the invention comprises or consists of the following amino acid residues of SEQ ID NO: 25: M-1 to H-274; V-273; M-1 to C-272;
M-1 to Y-271; M-1 to L-270; M-1 to Q-269; M-1 to V-
268; M-1 to S-267; M-1 to G-266; M-1 to S-265;
M-1 to R-263; M-1 to L-262; M-1 to E-26
1; M-1 to R-260; M-1 to L-259; M-1 to Q-258;
E-257; M-1 to L-256; M-1 to A-255; M-1 to Q-254;
M-1 to Q-253; M-1 to N-252; M-1 to M-251; M-1 to S-
250; M-1 to T-249; M-1 to A-248; M-1 to G-247;
1 to L-246; M-1 to G-245; M-1 to Q-244; M-1 to G-24
M-1 to N-242; M-1 to L-241; M-1 to A-240;
L-239; M-1 to K-238; M-1 to L-237; M-1 to G-236;
M-1 to G-235; M-1 to E-234; M-1 to Q-233; M-1 to F-
M-1 to L-231; M-1 to L-230; M-1 to L-229; M-
M-1 to E-227; M-1 to F-226; M-1 to F-22
5; M-1 to R-224; M-1 to Q-223; M-1 to P-222;
Y-221; M-1 to F-220; M-1 to L-219; M-1 to F-218;
M-1 to P-217; M-1 to A-216; M-1 to S-215; M-1 to I-
214; M-1 to L-213; M-1 to K-212; M-1 to K-211;
M-1 to G-209; M-1 to W-208; M-1 to R-20
7; M-1 to S-206; M-1 to I-205; M-1 to W-204;
A-203; M-1 to L-202; M-1 to T-201; M-1 to R-200;
M-1 to D-199; M-1 to A-198; M-1 to F-197; M-1 to S-
196; M-1 to A-195; M-1 to R-194; M-1 to L-193;
M-1 to V-191; M-1 to P-190; M-1 to A-18
9; M-1 to H-188; M-1 to A-187; M-1 to A-186;
Q-185; M-1 to D-184; M-1 to R-183; M-1 to L-182;
M-1 to S-181; M-1 to V-180; M-1 to T-179; M-1 to F-
178; M-1 to H-177; M-1 to K-176; M-1 to P-175;
M-1 to Q-173; M-1 to L-172; M-1 to V-17
1; M-1 to L-170; M-1 to G-169; M-1 to R-168;
V-167; M-1 to I-166; M-1 to I-165; M-1 to V-164;
M-1 to Q-163; M-1 to G-162; M-1 to P-161; M-1 to S-
160; M-1 to L-159; M-1 to G-158; M-1 to Q-157;
M-1 to L-155; M-1 to A-154; M-1 to H-15
M-1 to S-152; M-1 to C-151; M-1 to P-150;
V-149; M-1 to E-148; M-1 to L-147; M-1 to R-146;
M-1 to P-145; M-1 to S-144; M-1 to M-143; M-1 to L-
142; M-1 to L-141; M-1 to F-140; M-1 to P-139;
M-1 to G-137; M-1 to A-136; M-1 to P-13
5; M-1 to Y-134; M-1 to E-133; M-1 to R-132;
S-131; M-1 to G-130; M-1 to E-129; M-1 to V-128;
M-1 to F-127; M-1 to P-126; M-1 to N-125; M-1 to I-
124; M-1 to N-123; M-1 to L-122; M-1 to F-121; M-
M-1 to V-119; M-1 to A-118; M-1 to E-11
7; M-1 to V-116; M-1 to L-115; M-1 to I-114;
D-113; M-1 to G-112; M-1 to F-111; M-1 to I-110;
M-1 to G-109; M-1 to L-108; M-1 to T-107; M-1 to D-
106; M-1 to V-105; M-1 to H-104; M-1 to S-103;
M-1 to P-101; M-1 to L-100; M-1 to R-99
M-1 to Y-98; M-1 to R-97; M-1 to F-96; M-1 to H-95;
M-1 to L-94; M-1 to F-93; M-1 to H-92; M-1 to Q-91.
M-1 to G-90; M-1 to N-89; M-1 to V-88; M-1 to S-87;
M-1 to V-86; M-1 to K-85; M-1 to V-84; M-1 to E-83;
M-1 to E-82; M-1 to N-81; M-1 to G-80; M-1 to F-79;
M-1 to L-78; M-1 to F-77; M-1 to L-76; M-1 to I-75;
M-1 to L-74; M-1 to F-73; M-1 to S-72; M-1 to S-71;
M-1 to G-70; M-1 to R-69; M-1 to R-68; M-1 to L-67;
M-1 to A-66; M-1 to L-65; M-1 to H-64; M-1 to P-63;
M-1 to W-62; M-1 to R-61; M-1 to A-60; M-1 to E-59;
M-1 to R-58; M-1 to Q-57; M-1 to W-56; M-1 to R-55;
M-1 to G-54; M-1 to G-53; M-1 to H-52; M-1 to L-51;
M-1 to T-50; M-1 to N-49; M-1 to C-48; M-1 to I-47;
M-1 to V-46; M-1 to H-45; M-1 to P-44; M-1 to K-43;
M-1 to T-42; M-1 to T-41; M-1 to H-40; M-1 to F-39;
M-1 to R-38; M-1 to P-37; M-1 to N-36; M-1 to F-35;
M-1 to H-34; M-1 to F-33; M-1 to A-32; M-1 to I-31;
M-1 to D-30; M-1 to P-29; M-1 to R-28; M-1 to P-27;
M-1 to C-26; M-1 to L-25; M-1 to S-24; M-1 to C-23;
M-1 to G-22; M-1 to C-21; M-1 to Q-20; M-1 to F-19;
M-1 to D-18; M-1 to V-17; M-1 to Q-16; M-1 to F-15;
M-1 to R-14; M-1 to H-13; M-1 to A-12; M-1 to D-11.
M-1 to L-10; M-1 to P-9; M-1 to V-8; M-1 to V-7; and M-1 to G-6. Polynucleotides encoding such polypeptides are also included in the present invention.
【０１５１】 本発明のさらなる実施形態は、一般式ｍ〜ｎによって示されるアミノ酸配列を
含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドフラグメントに関し、ここで、ｍ
およびｎは、それぞれ、これらの記号について上記で特定化されたアミノ酸残基
の任意の１つに対応する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
もまた、本発明に含まれる。A further embodiment of the present invention relates to a polypeptide fragment comprising or consisting of an amino acid sequence represented by the general formulas m to n, wherein m
And n each correspond to any one of the amino acid residues specified above for these symbols. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.
【０１５２】 なお別の実施形態において、本発明はさらに、配列番号２７に示されるガレク
チン１１ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端から、１以上の残基が欠失さ
れたポリペプチドを提供する。特に、１つの実施形態において、ガレクチン１１
ポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ〜２９６によって記載され得、ここで、
ｍは、配列番号２７において同定されるアミノ酸残基の位置に対応する２〜２９
１の整数であり、そして好ましくは、本明細書中に特定化されるＮ末端欠失にお
いて同定されるＮ末端アミノ酸残基の１つに対応する。特定の実施態様において
、本発明のガレクチン１１ポリペプチドのＮ末端欠失は、配列番号２７の以下の
アミノ酸残基を含むか、またはそれらからなる：Ｓ−２〜Ｓ−２９６；Ｆ−３〜
Ｓ−２９６；Ｆ−４〜Ｓ−２９６；Ｓ−５〜Ｓ−２９６；Ｃ−６〜Ｓ−２９６；
Ｓ−７〜Ｓ−２９６；Ｇ−８〜Ｓ−２９６；Ｇ−９〜Ｓ−２９６；Ｓ−１０〜Ｓ
−２９６；Ｌ−１１〜Ｓ−２９６；Ｃ−１２〜Ｓ−２９６；Ｈ−１３〜Ｓ−２９
６；Ｄ−１４〜Ｓ−２９６；Ｄ−１５〜Ｓ−２９６；Ｆ−１６〜Ｓ−２９６；Ｗ
−１７〜Ｓ−２９６；Ｒ−１８〜Ｓ−２９６；Ｐ−１９〜Ｓ−２９６；Ａ−２０
〜Ｓ−２９６；Ｃ−２１〜Ｓ−２９６；Ｒ−２２〜Ｓ−２９６；Ｑ−２３〜Ｓ−
２９６；Ｄ−２４〜Ｓ−２９６；Ｇ−２５〜Ｓ−２９６；Ｈ−２６〜Ｓ−２９６
；Ａ−２７〜Ｓ−２９６；Ａ−２８〜Ｓ−２９６；Ｒ−２９〜Ｓ−２９６；Ｓ−
３０〜Ｓ−２９６；Ｇ−３１〜Ｓ−２９６；Ｐ−３２〜Ｓ−２９６；Ｓ−３３〜
Ｓ−２９６；Ｒ−３４〜Ｓ−２９６；Ｃ−３５〜Ｓ−２９６；Ｔ−３６〜Ｓ−２
９６；Ｑ−３７〜Ｓ−２９６；Ｖ−３８〜Ｓ−２９６；Ｄ−３９〜Ｓ−２９６；
Ｆ−４０〜Ｓ−２９６；Ｑ−４１〜Ｓ−２９６；Ｃ−４２〜Ｓ−２９６；Ｇ−４
３〜Ｓ−２９６；Ｃ−４４〜Ｓ−２９６；Ｓ−４５〜Ｓ−２９６；Ｌ−４６〜Ｓ
−２９６；Ｃ−４７〜Ｓ−２９６；Ｐ−４８〜Ｓ−２９６；Ｒ−４９〜Ｓ−２９
６；Ｐ−５０〜Ｓ−２９６；Ｄ−５１〜Ｓ−２９６；Ｉ−５２〜Ｓ−２９６；Ａ
−５３〜Ｓ−２９６；Ｆ−５４〜Ｓ−２９６；Ｈ−５５〜Ｓ−２９６；Ｆ−５６
〜Ｓ−２９６；Ｎ−５７〜Ｓ−２９６；Ｐ−５８〜Ｓ−２９６；Ｒ−５９〜Ｓ−
２９６；Ｆ−６０〜Ｓ−２９６；Ｈ−６１〜Ｓ−２９６；Ｔ−６２〜Ｓ−２９６
；Ｔ−６３〜Ｓ−２９６；Ｋ−６４〜Ｓ−２９６；Ｐ−６５〜Ｓ−２９６；Ｈ−
６６〜Ｓ−２９６；Ｖ−６７〜Ｓ−２９６；Ｉ−６８〜Ｓ−２９６；Ｃ−６９〜
Ｓ−２９６；Ｎ−７０〜Ｓ−２９６；Ｔ−７１〜Ｓ−２９６；Ｌ−７２〜Ｓ−２
９６；Ｈ−７３〜Ｓ−２９６；Ｇ−７４〜Ｓ−２９６；Ｇ−７５〜Ｓ−２９６；
Ｒ−７６〜Ｓ−２９６；Ｗ−７７〜Ｓ−２９６；Ｑ−７８〜Ｓ−２９６；Ｒ−７
９〜Ｓ−２９６；Ｅ−８０〜Ｓ−２９６；Ａ−８１〜Ｓ−２９６；Ｒ−８２〜Ｓ
−２９６；Ｗ−８３〜Ｓ−２９６；Ｐ−８４〜Ｓ−２９６；Ｈ−８５〜Ｓ−２９
６；Ｌ−８６〜Ｓ−２９６；Ａ−８７〜Ｓ−２９６；Ｌ−８８〜Ｓ−２９６；Ｒ
−８９〜Ｓ−２９６；Ｒ−９０〜Ｓ−２９６；Ｇ−９１〜Ｓ−２９６；Ｓ−９２
〜Ｓ−２９６；Ｓ−９３〜Ｓ−２９６；Ｆ−９４〜Ｓ−２９６；Ｌ−９５〜Ｓ−
２９６；Ｉ−９６〜Ｓ−２９６；Ｌ−９７〜Ｓ−２９６；Ｆ−９８〜Ｓ−２９６
；Ｌ−９９〜Ｓ−２９６；Ｆ−１００〜Ｓ−２９６；Ｇ−１０１〜Ｓ−２９６；
Ｎ−１０２〜Ｓ−２９６；Ｅ−１０３〜Ｓ−２９６；Ｅ−１０４〜Ｓ−２９６；
Ｖ−１０５〜Ｓ−２９６；Ｋ−１０６〜Ｓ−２９６；Ｖ−１０７〜Ｓ−２９６；
Ｓ−１０８〜Ｓ−２９６；Ｖ−１０９〜Ｓ−２９６；Ｎ−１１０〜Ｓ−２９６；
Ｇ−１１１〜Ｓ−２９６；Ｑ−１１２〜Ｓ−２９６；Ｈ−１１３〜Ｓ−２９６；
Ｆ−１１４〜Ｓ−２９６；Ｌ−１１５〜Ｓ−２９６；Ｈ−１１６〜Ｓ−２９６；
Ｆ−１１７〜Ｓ−２９６；Ｒ−１１８〜Ｓ−２９６；Ｙ−１１９〜Ｓ−２９６；
Ｒ−１２０〜Ｓ−２９６；Ｌ−１２１〜Ｓ−２９６；Ｐ−１２２〜Ｓ−２９６；
Ｌ−１２３〜Ｓ−２９６；Ｓ−１２４〜Ｓ−２９６；Ｈ−１２５〜Ｓ−２９６；
Ｖ−１２６〜Ｓ−２９６；Ｄ−１２７〜Ｓ−２９６；Ｔ−１２８〜Ｓ−２９６；
Ｌ−１２９〜Ｓ−２９６；Ｇ−１３０〜Ｓ−２９６；Ｉ−１３１〜Ｓ−２９６；
Ｆ−１３２〜Ｓ−２９６；Ｇ−１３３〜Ｓ−２９６；Ｄ−１３４〜Ｓ−２９６；
Ｉ−１３５〜Ｓ−２９６；Ｌ−１３６〜Ｓ−２９６；Ｖ−１３７〜Ｓ−２９６；
Ｅ−１３８〜Ｓ−２９６；Ａ−１３９〜Ｓ−２９６；Ｖ−１４０〜Ｓ−２９６；
Ｇ−１４１〜Ｓ−２９６；Ｆ−１４２〜Ｓ−２９６；Ｌ−１４３〜Ｓ−２９６；
Ｎ−１４４〜Ｓ−２９６；Ｉ−１４５〜Ｓ−２９６；Ｎ−１４６〜Ｓ−２９６；
Ｐ−１４７〜Ｓ−２９６；Ｆ−１４８〜Ｓ−２９６；Ｖ−１４９〜Ｓ−２９６；
Ｅ−１５０〜Ｓ−２９６；Ｇ−１５１〜Ｓ−２９６；Ｓ−１５２〜Ｓ−２９６；
Ｒ−１５３〜Ｓ−２９６；Ｅ−１５４〜Ｓ−２９６；Ｙ−１５５〜Ｓ−２９６；
Ｐ−１５６〜Ｓ−２９６；Ａ−１５７〜Ｓ−２９６；Ｇ−１５８〜Ｓ−２９６；
Ｈ−１５９〜Ｓ−２９６；Ｐ−１６０〜Ｓ−２９６；Ｆ−１６１〜Ｓ−２９６；
Ｌ−１６２〜Ｓ−２９６；Ｌ−１６３〜Ｓ−２９６；Ｍ−１６４〜Ｓ−２９６；
Ｓ−１６５〜Ｓ−２９６；Ｐ−１６６〜Ｓ−２９６；Ｒ−１６７〜Ｓ−２９６；
Ｌ−１６８〜Ｓ−２９６；Ｅ−１６９〜Ｓ−２９６；Ｖ−１７０〜Ｓ−２９６；
Ｐ−１７１〜Ｓ−２９６；Ｃ−１７２〜Ｓ−２９６；Ｓ−１７３〜Ｓ−２９６；
Ｈ−１７４〜Ｓ−２９６；Ａ−１７５〜Ｓ−２９６；Ｌ−１７６〜Ｓ−２９６；
Ｐ−１７７〜Ｓ−２９６；Ｑ−１７８〜Ｓ−２９６；Ｇ−１７９〜Ｓ−２９６；
Ｌ−１８０〜Ｓ−２９６；Ｓ−１８１〜Ｓ−２９６；Ｐ−１８２〜Ｓ−２９６；
Ｇ−１８３〜Ｓ−２９６；Ｑ−１８４〜Ｓ−２９６；Ｖ−１８５〜Ｓ−２９６；
Ｉ−１８６〜Ｓ−２９６；Ｉ−１８７〜Ｓ−２９６；Ｖ−１８８〜Ｓ−２９６；
Ｒ−１８９〜Ｓ−２９６；Ｇ−１９０〜Ｓ−２９６；Ｌ−１９１〜Ｓ−２９６；
Ｖ−１９２〜Ｓ−２９６；Ｌ−１９３〜Ｓ−２９６；Ｑ−１９４〜Ｓ−２９６；
Ｅ−１９５〜Ｓ−２９６；Ｐ−１９６〜Ｓ−２９６；Ｋ−１９７〜Ｓ−２９６；
Ｈ−１９８〜Ｓ−２９６；Ｆ−１９９〜Ｓ−２９６；Ｔ−２００〜Ｓ−２９６；
Ｖ−２０１〜Ｓ−２９６；Ｓ−２０２〜Ｓ−２９６；Ｌ−２０３〜Ｓ−２９６；
Ｒ−２０４〜Ｓ−２９６；Ｄ−２０５〜Ｓ−２９６；Ｑ−２０６〜Ｓ−２９６；
Ａ−２０７〜Ｓ−２９６；Ａ−２０８〜Ｓ−２９６；Ｈ−２０９〜Ｓ−２９６；
Ａ−２１０〜Ｓ−２９６；Ｐ−２１１〜Ｓ−２９６；Ｖ−２１２〜Ｓ−２９６；
Ｔ−２１３〜Ｓ−２９６；Ｌ−２１４〜Ｓ−２９６；Ｒ−２１５〜Ｓ−２９６；
Ａ−２１６〜Ｓ−２９６；Ｓ−２１７〜Ｓ−２９６；Ｆ−２１８〜Ｓ−２９６；
Ａ−２１９〜Ｓ−２９６；Ｄ−２２０〜Ｓ−２９６；Ｒ−２２１〜Ｓ−２９６；
Ｔ−２２２〜Ｓ−２９６；Ｌ−２２３〜Ｓ−２９６；Ａ−２２４〜Ｓ−２９６；
Ｗ−２２５〜Ｓ−２９６；Ｉ−２２６〜Ｓ−２９６；Ｓ−２２７〜Ｓ−２９６；
Ｒ−２２８〜Ｓ−２９６；Ｗ−２２９〜Ｓ−２９６；Ｇ−２３０〜Ｓ−２９６；
Ｑ−２３１〜Ｓ−２９６；Ｋ−２３２〜Ｓ−２９６；Ｋ−２３３〜Ｓ−２９６；
Ｌ−２３４〜Ｓ−２９６；Ｉ−２３５〜Ｓ−２９６；Ｓ−２３６〜Ｓ−２９６；
Ａ−２３７〜Ｓ−２９６；Ｐ−２３８〜Ｓ−２９６；Ｆ−２３９〜Ｓ−２９６；
Ｌ−２４０〜Ｓ−２９６；Ｆ−２４１〜Ｓ−２９６；Ｙ−２４２〜Ｓ−２９６；
Ｐ−２４３〜Ｓ−２９６；Ｑ−２４４〜Ｓ−２９６；Ｒ−２４５〜Ｓ−２９６；
Ｆ−２４６〜Ｓ−２９６；Ｆ−２４７〜Ｓ−２９６；Ｅ−２４８〜Ｓ−２９６；
Ｖ−２４９〜Ｓ−２９６；Ｌ−２５０〜Ｓ−２９６；Ｌ−２５１〜Ｓ−２９６；
Ｌ−２５２〜Ｓ−２９６；Ｆ−２５３〜Ｓ−２９６；Ｑ−２５４〜Ｓ−２９６；
Ｅ−２５５〜Ｓ−２９６；Ｇ−２５６〜Ｓ−２９６；Ｇ−２５７〜Ｓ−２９６；
Ｌ−２５８〜Ｓ−２９６；Ｋ−２５９〜Ｓ−２９６；Ｌ−２６０〜Ｓ−２９６；
Ａ−２６１〜Ｓ−２９６；Ｌ−２６２〜Ｓ−２９６；Ｎ−２６３〜Ｓ−２９６；
Ｇ−２６４〜Ｓ−２９６；Ｑ−２６５〜Ｓ−２９６；Ｇ−２６６〜Ｓ−２９６；
Ｌ−２６７〜Ｓ−２９６；Ｇ−２６８〜Ｓ−２９６；Ａ−２６９〜Ｓ−２９６；
Ｔ−２７０〜Ｓ−２９６；Ｓ−２７１〜Ｓ−２９６；Ｍ−２７２〜Ｓ−２９６；
Ｎ−２７３〜Ｓ−２９６；Ｑ−２７４〜Ｓ−２９６；Ｑ−２７５〜Ｓ−２９６；
Ａ−２７６〜Ｓ−２９６；Ｌ−２７７〜Ｓ−２９６；Ｅ−２７８〜Ｓ−２９６；
Ｑ−２７９〜Ｓ−２９６；Ｌ−２８０〜Ｓ−２９６；Ｒ−２８１〜Ｓ−２９６；
Ｅ−２８２〜Ｓ−２９６；Ｌ−２８３〜Ｓ−２９６；Ｒ−２８４〜Ｓ−２９６；
Ｉ−２８５〜Ｓ−２９６；Ｓ−２８６〜Ｓ−２９６；Ｇ−２８７〜Ｓ−２９６；
Ｓ−２８８〜Ｓ−２９６；Ｖ−２８９〜Ｓ−２９６；Ｑ−２９０〜Ｓ−２９６；
Ｌ−２９１〜Ｓ−２９６。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた、本発明に含まれる。In yet another embodiment, the present invention further provides a polypeptide in which one or more residues have been deleted from the amino terminus of the amino acid sequence of galectin 11 polypeptide set forth in SEQ ID NO: 27. In particular, in one embodiment, galectin 11
The N-terminal deletion of a polypeptide can be described by the general formula m-296, wherein:
m is 2 to 29 corresponding to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 27.
Is an integer of 1 and preferably corresponds to one of the N-terminal amino acid residues identified in the N-terminal deletion specified herein. In certain embodiments, the N-terminal deletion of a Galectin-11 polypeptide of the invention comprises or consists of the following amino acid residues of SEQ ID NO: 27: S-2 to S-296;
S-296; F-4 to S-296; S-5 to S-296; C-6 to S-296;
S-7 to S-296; G-8 to S-296; G-9 to S-296; S-10 to S
-296; L-11 to S-296; C-12 to S-296; H-13 to S-29
6; D-14 to S-296; D-15 to S-296; F-16 to S-296; W
R-17 to S-296; R-18 to S-296; P-19 to S-296; A-20
-S-296; C-21 to S-296; R-22 to S-296;
296; D-24 to S-296; G-25 to S-296; H-26 to S-296
A-27 to S-296; A-28 to S-296; R-29 to S-296;
30-S-296; G-31-S-296; P-32-S-296; S-33-
S-296; R-34 to S-296; C-35 to S-296; T-36 to S-2
96; Q-37 to S-296; V-38 to S-296; D-39 to S-296;
F-40 to S-296; Q-41 to S-296; C-42 to S-296; G-4
3-S-296; C-44-S-296; S-45-S-296; L-46-S
-296; C-47 to S-296; P-48 to S-296; R-49 to S-29.
6; P-50 to S-296; D-51 to S-296; I-52 to S-296;
-53 to S-296; F-54 to S-296; H-55 to S-296; F-56
N-57 to S-296; P-58 to S-296; R-59 to S-.
296; F-60 to S-296; H-61 to S-296; T-62 to S-296.
T-63 to S-296; K-64 to S-296; P-65 to S-296;
66-S-296; V-67-S-296; I-68-S-296; C-69-
S-296; N-70 to S-296; T-71 to S-296; L-72 to S-2
H-73 to S-296; G-74 to S-296; G-75 to S-296;
R-76 to S-296; W-77 to S-296; Q-78 to S-296; R-7
9-S-296; E-80-S-296; A-81-S-296; R-82-S
-296; W-83 to S-296; P-84 to S-296; H-85 to S-29
6; L-86 to S-296; A-87 to S-296; L-88 to S-296; R
-89 to S-296; R-90 to S-296; G-91 to S-296; S-92
S-93 to S-296; F-94 to S-296; L-95 to S-
296; I-96 to S-296; L-97 to S-296; F-98 to S-296.
L-99 to S-296; F-100 to S-296; G-101 to S-296;
N-102 to S-296; E-103 to S-296; E-104 to S-296;
V-105 to S-296; K-106 to S-296; V-107 to S-296;
S-108 to S-296; V-109 to S-296; N-110 to S-296;
G-111 to S-296; Q-112 to S-296; H-113 to S-296;
F-114 to S-296; L-115 to S-296; H-116 to S-296;
F-117 to S-296; R-118 to S-296; Y-119 to S-296;
R-120 to S-296; L-121 to S-296; P-122 to S-296;
L-123 to S-296; S-124 to S-296; H-125 to S-296;
V-126 to S-296; D-127 to S-296; T-128 to S-296;
L-129 to S-296; G-130 to S-296; I-131 to S-296;
F-132 to S-296; G-133 to S-296; D-134 to S-296;
I-135 to S-296; L-136 to S-296; V-137 to S-296;
E-138 to S-296; A-139 to S-296; V-140 to S-296;
G-141 to S-296; F-142 to S-296; L-143 to S-296;
N-144 to S-296; I-145 to S-296; N-146 to S-296;
P-147 to S-296; F-148 to S-296; V-149 to S-296;
E-150 to S-296; G-151 to S-296; S-152 to S-296;
R-153 to S-296; E-154 to S-296; Y-155 to S-296;
P-156 to S-296; A-157 to S-296; G-158 to S-296;
H-159 to S-296; P-160 to S-296; F-161 to S-296;
L-162 to S-296; L-163 to S-296; M-164 to S-296;
S-165 to S-296; P-166 to S-296; R-167 to S-296;
L-168 to S-296; E-169 to S-296; V-170 to S-296;
P-171 to S-296; C-172 to S-296; S-173 to S-296;
H-174 to S-296; A-175 to S-296; L-176 to S-296;
P-177 to S-296; Q-178 to S-296; G-179 to S-296;
L-180 to S-296; S-181 to S-296; P-182 to S-296;
G-183 to S-296; Q-184 to S-296; V-185 to S-296;
I-186 to S-296; I-187 to S-296; V-188 to S-296;
R-189 to S-296; G-190 to S-296; L-191 to S-296;
V-192 to S-296; L-193 to S-296; Q-194 to S-296;
E-195 to S-296; P-196 to S-296; K-197 to S-296;
H-198 to S-296; F-199 to S-296; T-200 to S-296;
V-201 to S-296; S-202 to S-296; L-203 to S-296;
R-204 to S-296; D-205 to S-296; Q-206 to S-296;
A-207 to S-296; A-208 to S-296; H-209 to S-296;
A-210 to S-296; P-211 to S-296; V-212 to S-296;
T-213 to S-296; L-214 to S-296; R-215 to S-296;
A-216 to S-296; S-217 to S-296; F-218 to S-296;
A-219 to S-296; D-220 to S-296; R-221 to S-296;
T-222 to S-296; L-223 to S-296; A-224 to S-296;
W-225 to S-296; I-226 to S-296; S-227 to S-296;
R-228 to S-296; W-229 to S-296; G-230 to S-296;
Q-231 to S-296; K-232 to S-296; K-233 to S-296;
L-234 to S-296; I-235 to S-296; S-236 to S-296;
A-237 to S-296; P-238 to S-296; F-239 to S-296;
L-240 to S-296; F-241 to S-296; Y-242 to S-296;
P-243 to S-296; Q-244 to S-296; R-245 to S-296;
F-246 to S-296; F-247 to S-296; E-248 to S-296;
V-249 to S-296; L-250 to S-296; L-251 to S-296;
L-252 to S-296; F-253 to S-296; Q-254 to S-296;
E-255-S-296; G-256-S-296; G-257-S-296;
L-258 to S-296; K-259 to S-296; L-260 to S-296;
A-261 to S-296; L-262 to S-296; N-263 to S-296;
G-264 to S-296; Q-265 to S-296; G-266 to S-296;
L-267 to S-296; G-268 to S-296; A-269 to S-296;
T-270 to S-296; S-271 to S-296; M-272 to S-296;
N-273 to S-296; Q-274 to S-296; Q-275 to S-296;
A-276 to S-296; L-277 to S-296; E-278 to S-296;
Q-279 to S-296; L-280 to S-296; R-281 to S-296;
E-282 to S-296; L-283 to S-296; R-284 to S-296;
I-285 to S-296; S-286 to S-296; G-287 to S-296;
S-288 to S-296; V-289 to S-296; Q-290 to S-296;
L-291-S-296. Polynucleotides encoding such polypeptides are also included in the present invention.
【０１５３】 本発明のさらなる実施形態は、一般式１〜ｎで記載される、ガレクチン１１ポ
リペプチドのＣ末端欠失に関する。ここで、ｎは、配列番号２７において同定さ
れるアミノ酸残基の位置に対応する６〜２９５の整数であり、そして好ましくは
、本明細書中に特定化されるＣ末端欠失において同定されるＣ末端アミノ酸残基
の１つに対応する。特定の実施態様において、本発明のガレクチン１１ポリペプ
チドのＣ末端欠失は、配列番号２７の以下のアミノ酸残基を含むか、またはそれ
らからなる：Ｍ−１〜Ｈ−２９５；Ｍ−１〜Ｖ−２９４；Ｍ−１〜Ｃ−２９３；
Ｍ−１〜Ｙ−２９２；Ｍ−１〜Ｌ−２９１；Ｍ−１〜Ｑ−２９０；Ｍ−１〜Ｖ−
２８９；Ｍ−１〜Ｓ−２８８；Ｍ−１〜Ｇ−２８７；Ｍ−１〜Ｓ−２８６；Ｍ−
１〜Ｉ−２８５；Ｍ−１〜Ｒ−２８４；Ｍ−１〜Ｌ−２８３；Ｍ−１〜Ｅ−２８
２；Ｍ−１〜Ｒ−２８１；Ｍ−１〜Ｌ−２８０；Ｍ−１〜Ｑ−２７９；Ｍ−１〜
Ｅ−２７８；Ｍ−１〜Ｌ−２７７；Ｍ−１〜Ａ−２７６；Ｍ−１〜Ｑ−２７５；
Ｍ−１〜Ｑ−２７４；Ｍ−１〜Ｎ−２７３；Ｍ−１〜Ｍ−２７２；Ｍ−１〜Ｓ−
２７１；Ｍ−１〜Ｔ−２７０；Ｍ−１〜Ａ−２６９；Ｍ−１〜Ｇ−２６８；Ｍ−
１〜Ｌ−２６７；Ｍ−１〜Ｇ−２６６；Ｍ−１〜Ｑ−２６５；Ｍ−１〜Ｇ−２６
４；Ｍ−１〜Ｎ−２６３；Ｍ−１〜Ｌ２６２；Ｍ−１〜Ａ−２６１；Ｍ−１〜Ｌ
−２６０；Ｍ−１〜Ｋ−２５９；Ｍ−１〜Ｌ−２５８；Ｍ−１〜Ｇ−２５７；Ｍ
−１〜Ｇ−２５６；Ｍ−１〜Ｅ−２５５；Ｍ−１〜Ｑ−２５４；Ｍ−１〜Ｆ−２
５３；Ｍ−１〜Ｌ−２５２；Ｍ−１〜Ｌ−２５１；Ｍ−１〜Ｌ−２５０；Ｍ−１
〜Ｖ−２４９；Ｍ−１〜Ｅ−２４８；Ｍ−１〜Ｆ−２４７；Ｍ−１〜Ｆ−２４６
；Ｍ−１〜Ｒ−２４５；Ｍ−１〜Ｑ−２４４；Ｍ−１〜Ｐ−２４３；Ｍ−１〜Ｙ
−２４２；Ｍ−１〜Ｆ−２４１；Ｍ−１〜Ｌ−２４０；Ｍ−１〜Ｆ−２３９；Ｍ
−１〜Ｐ−２３８；Ｍ−１〜Ａ−２３７；Ｍ−１〜Ｓ−２３６；Ｍ−１〜Ｉ−２
３５；Ｍ−１〜Ｌ−２３４；Ｍ−１〜Ｋ−２３３；Ｍ−１〜Ｋ−２３２；Ｍ−１
〜Ｑ−２３１；Ｍ−１〜Ｇ−２３０；Ｍ−１〜Ｗ−２２９；Ｍ−１〜Ｒ−２２８
；Ｍ−１〜Ｓ−２２７；Ｍ−１〜Ｉ−２２６；Ｍ−１〜Ｗ−２２５；Ｍ−１〜Ａ
−２２４；Ｍ−１〜Ｌ−２２３；Ｍ−１〜Ｔ−２２２；Ｍ−１〜Ｒ−２２１；Ｍ
−１〜Ｄ−２２０；Ｍ−１〜Ａ−２１９；Ｍ−１〜Ｆ−２１８；Ｍ−１〜Ｓ−２
１７；Ｍ−１〜Ａ−２１６；Ｍ−１〜Ｒ−２１５；Ｍ−１〜Ｌ−２１４；Ｍ−１
〜Ｔ−２１３；Ｍ−１〜Ｖ−２１２；Ｍ−１〜Ｐ−２１１；Ｍ−１〜Ａ−２１０
；Ｍ−１〜Ｈ−２０９；Ｍ−１〜Ａ−２０８；Ｍ−１〜Ａ−２０７；Ｍ−１〜Ｑ
−２０６；Ｍ−１〜Ｄ−２０５；Ｍ−１〜Ｒ−２０４；Ｍ−１〜Ｌ−２０３；Ｍ
−１〜Ｓ−２０２；Ｍ−１〜Ｖ−２０１；Ｍ−１〜Ｔ−２００；Ｍ−１〜Ｆ−１
９９；Ｍ−１〜Ｈ−１９８；Ｍ−１〜Ｋ−１９７；Ｍ−１〜Ｐ−１９６；Ｍ−１
〜Ｅ−１９５；Ｍ−１〜Ｑ−１９４；Ｍ−１〜Ｌ−１９３；Ｍ−１〜Ｖ−１９２
；Ｍ−１〜Ｌ−１９１；Ｍ−１〜Ｇ−１９０；Ｍ−１〜Ｒ−１８９；Ｍ−１〜Ｖ
−１８８；Ｍ−１〜Ｉ−１８７；Ｍ−１〜Ｉ−１８６；Ｍ−１〜Ｖ−１８５；Ｍ
−１〜Ｑ−１８４；Ｍ−１〜Ｇ−１８３；Ｍ−１〜Ｐ−１８２；Ｍ−１〜Ｓ−１
８１；Ｍ−１〜Ｌ−１８０；Ｍ−１〜Ｇ−１７９；Ｍ−１〜Ｑ−１７８；Ｍ−１
〜Ｐ−１７７；Ｍ−１〜Ｌ−１７６；Ｍ−１〜Ａ−１７５；Ｍ−１〜Ｈ−１７４
；Ｍ−１〜Ｓ−１７３；Ｍ−１〜Ｃ−１７２；Ｍ−１〜Ｐ−１７１；Ｍ−１〜Ｖ
−１７０；Ｍ−１〜Ｅ−１６９；Ｍ−１〜Ｌ−１６８；Ｍ−１〜Ｒ−１６７；Ｍ
−１〜Ｐ−１６６；Ｍ−１〜Ｓ−１６５；Ｍ−１〜Ｍ−１６４；Ｍ−１〜Ｌ−１
６３；Ｍ−１〜Ｌ−１６２；Ｍ−１〜Ｆ−１６１；Ｍ−１〜Ｐ−１６０；Ｍ−１
〜Ｈ−１５９；Ｍ−１〜Ｇ−１５８；Ｍ−１〜Ａ−１５７；Ｍ−１〜Ｐ−１５６
；Ｍ−１〜Ｙ−１５５；Ｍ−１〜Ｅ−１５４；Ｍ−１〜Ｒ−１５３；Ｍ−１〜Ｓ
−１５２；Ｍ−１〜Ｇ−１５１；Ｍ−１〜Ｅ−１５０；Ｍ−１〜Ｖ−１４９；Ｍ
−１〜Ｆ−１４８；Ｍ−１〜Ｐ−１４７；Ｍ−１〜Ｎ−１４６；Ｍ−１〜Ｉ−１
４５；Ｍ−１〜Ｎ−１４４；Ｍ−１〜Ｌ−１４３；Ｍ−１〜Ｆ−１４２；Ｍ−１
〜Ｇ−１４１；Ｍ−１〜Ｖ−１４０；Ｍ−１〜Ａ−１３９；Ｍ−１〜Ｅ−１３８
；Ｍ−１〜Ｖ−１３７；Ｍ−１〜Ｌ−１３６；Ｍ−１〜Ｉ−１３５；Ｍ−１〜Ｄ
−１３４；Ｍ−１〜Ｇ−１３３；Ｍ−１〜Ｆ−１３２；Ｍ−１〜Ｉ−１３１；Ｍ
−１〜Ｇ−１３０；Ｍ−１〜Ｌ−１２９；Ｍ−１〜Ｔ−１２８；Ｍ−１〜Ｄ−１
２７；Ｍ−１〜Ｖ−１２６；Ｍ−１〜Ｈ−１２５；Ｍ−１〜Ｓ−１２４；Ｍ−１
〜Ｌ−１２３；Ｍ−１〜Ｐ−１２２；Ｍ−１〜Ｌ−１２１；Ｍ−１〜Ｒ−１２０
；Ｍ−１〜Ｙ−１１９；Ｍ−１〜Ｒ−１１８；Ｍ−１〜Ｆ−１１７；Ｍ−１〜Ｈ
−１１６；Ｍ−１〜Ｌ−１１５；Ｍ−１〜Ｆ−１１４；Ｍ−１〜Ｈ−１１３；Ｍ
−１〜Ｑ−１１２；Ｍ−１〜Ｇ−１１１；Ｍ−１〜Ｎ−１１０；Ｍ−１〜Ｖ−１
０９；Ｍ−１〜Ｓ−１０８；Ｍ−１〜Ｖ−１０７；Ｍ−１〜Ｋ−１０６；Ｍ−１
〜Ｖ−１０５；Ｍ−１〜Ｅ−１０４；Ｍ−１〜Ｅ−１０３；Ｍ−１〜Ｎ−１０２
；Ｍ−１〜Ｇ−１０１；Ｍ−１〜Ｆ−１００；Ｍ−１〜Ｌ−９９；Ｍ−１〜Ｆ−
９８；Ｍ−１〜Ｌ−９７；Ｍ−１〜Ｉ−９６；Ｍ−１〜Ｌ−９５；Ｍ−１〜Ｆ−
９４；Ｍ−１〜Ｓ−９３；Ｍ−１〜Ｓ−９２；Ｍ−１〜Ｇ−９１；Ｍ−１〜Ｒ−
９０；Ｍ−１〜Ｒ−８９；Ｍ−１〜Ｌ−８８；Ｍ−１〜Ａ−８７；Ｍ−１〜Ｌ−
８６；Ｍ−１〜Ｈ−８５；Ｍ−１〜Ｐ−８４；Ｍ−１〜Ｗ−８３；Ｍ−１〜Ｒ−
８２；Ｍ−１〜Ａ−８１；Ｍ−１〜Ｅ−８０；Ｍ−１〜Ｒ−７９；Ｍ−１〜Ｑ−
７８；Ｍ−１〜Ｗ−７７；Ｍ−１〜Ｒ−７６；Ｍ−１〜Ｇ−７５；Ｍ−１〜Ｇ−
７４；Ｍ−１〜Ｈ−７３；Ｍ−１〜Ｌ−７２；Ｍ−１〜Ｔ−７１；Ｍ−１〜Ｎ−
７０；Ｍ−１〜Ｃ−６９；Ｍ−１〜Ｉ−６８；Ｍ−１〜Ｖ−６７；Ｍ−１〜Ｈ−
６６；Ｍ−１〜Ｐ−６５；Ｍ−１〜Ｋ−６４；Ｍ−１〜Ｔ−６３；Ｍ−１〜Ｔ−
６２；Ｍ−１〜Ｈ−６１；Ｍ−１〜Ｆ−６０；Ｍ−１〜Ｒ−５９；Ｍ−１〜Ｐ−
５８；Ｍ−１〜Ｎ−５７；Ｍ−１〜Ｆ−５６；Ｍ−１〜Ｈ−５５；Ｍ−１〜Ｆ−
５４；Ｍ−１〜Ａ−５３；Ｍ−１〜Ｉ−５２；Ｍ−１〜Ｄ−５１；Ｍ−１〜Ｐ−
５０；Ｍ−１〜Ｒ−４９；Ｍ−１〜Ｐ−４８；Ｍ−１〜Ｃ−４７；Ｍ−１〜Ｌ−
４６；Ｍ−１〜Ｓ−４５；Ｍ−１〜Ｃ−４４；Ｍ−１〜Ｇ−４３；Ｍ−１〜Ｃ−
４２；Ｍ−１〜Ｑ−４１；Ｍ−１〜Ｆ−４０；Ｍ−１〜Ｄ−３９；Ｍ−１〜Ｖ−
３８；Ｍ−１〜Ｑ−３７；Ｍ−１〜Ｔ−３６；Ｍ−１〜Ｃ−３５；Ｍ−１〜Ｒ−
３４；Ｍ−１〜Ｓ−３３；Ｍ−１〜Ｐ−３２；Ｍ−１〜Ｇ−３１；Ｍ−１〜Ｓ−
３０；Ｍ−１〜Ｒ−２９；Ｍ−１〜Ａ−２８；Ｍ−１〜Ａ−２７；Ｍ−１〜Ｈ−
２６；Ｍ−１〜Ｇ−２５；Ｍ−１〜Ｄ−２４；Ｍ−１〜Ｑ−２３；Ｍ−１〜Ｒ−
２２；Ｍ−１〜Ｃ−２１；Ｍ−１〜Ａ−２０；Ｍ−１〜Ｐ−１９；Ｍ−１〜Ｒ−
１８；Ｍ−１〜Ｗ−１７；Ｍ−１〜Ｆ−１６；Ｍ−１〜Ｄ−１５；Ｍ−１〜Ｄ−
１４；Ｍ−１〜Ｈ−１３；Ｍ−１〜Ｃ−１２；Ｍ−１〜Ｌ−１１；Ｍ−１〜Ｓ−
１０；Ｍ−１〜Ｇ−９；Ｍ−１〜Ｇ−８；Ｍ−１〜Ｓ−７；Ｍ−１〜Ｃ−６。こ
のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる
。A further embodiment of the present invention relates to a C-terminal deletion of a galectin 11 polypeptide described by general formulas 1-n. Here, n is an integer from 6 to 295 corresponding to the position of the amino acid residue identified in SEQ ID NO: 27, and is preferably identified at the C-terminal deletion specified herein. Corresponds to one of the C-terminal amino acid residues. In certain embodiments, the C-terminal deletion of a Galectin-11 polypeptide of the invention comprises or consists of the following amino acid residues of SEQ ID NO: 27: M-1 to H-295; V-294; M-1 to C-293;
M-1 to Y-292; M-1 to L-291; M-1 to Q-290; M-1 to V-
289; M-1 to S-288; M-1 to G-287; M-1 to S-286;
M-1 to R-284; M-1 to L-283; M-1 to E-28
2; M-1 to R-281; M-1 to L-280; M-1 to Q-279;
E-278; M-1 to L-277; M-1 to A-276; M-1 to Q-275;
M-1 to Q-274; M-1 to N-273; M-1 to M-272; M-1 to S-
271; M-1 to T-270; M-1 to A-269; M-1 to G-268;
1 to L-267; M-1 to G-266; M-1 to Q-265; M-1 to G-26
4; M-1 to N-263; M-1 to L262; M-1 to A-261; M-1 to L
-260; M-1 to K-259; M-1 to L-258; M-1 to G-257; M
M-1 to E-255; M-1 to Q-254; M-1 to F-2
53; M-1 to L-252; M-1 to L-251; M-1 to L-250; M-1
M-1 to E-248; M-1 to F-247; M-1 to F-246.
M-1 to R-245; M-1 to Q-244; M-1 to P-243; M-1 to Y
-242; M-1 to F-241; M-1 to L-240; M-1 to F-239; M
M-1 to A-237; M-1 to S-236; M-1 to I-2
M-1 to L-234; M-1 to K-233; M-1 to K-232; M-1
M-1 to G-230; M-1 to W-229; M-1 to R-228
M-1 to S-227; M-1 to I-226; M-1 to W-225;
-224; M-1 to L-223; M-1 to T-222; M-1 to R-221; M
M-1 to A-219; M-1 to F-218; M-1 to S-2
17; M-1 to A-216; M-1 to R-215; M-1 to L-214; M-1
M-1 to V-212; M-1 to P- 211; M-1 to A-210.
M-1 to H-209; M-1 to A-208; M-1 to A-207;
-206; M-1 to D-205; M-1 to R-204; M-1 to L-203; M
M-1 to V-201; M-1 to T-200; M-1 to F-1
M-1 to H-198; M-1 to K-197; M-1 to P-196; M-1
M-1 to Q-194; M-1 to L-193; M-1 to V-192.
M-1 to L-191; M-1 to G-190; M-1 to R-189; M-1 to V
-188; M-1 to I-187; M-1 to I-186; M-1 to V-185; M
M-1 to G-183; M-1 to P-182; M-1 to S-1
81; M-1 to L-180; M-1 to G-179; M-1 to Q-178; M-1
M-1 to L-176; M-1 to A-175; M-1 to H-174.
M-1 to S-173; M-1 to C-172; M-1 to P-171;
-170; M-1 to E-169; M-1 to L-168; M-1 to R-167; M
M-1 to S-165; M-1 to M-164; M-1 to L-1
63; M-1 to L-162; M-1 to F-161; M-1 to P-160; M-1
M-1 to G-158; M-1 to A-157; M-1 to P-156.
M-1 to Y-155; M-1 to E-154; M-1 to R-153; M-1 to S
-152; M-1 to G-151; M-1 to E-150; M-1 to V-149; M
-1 to F-148; M-1 to P-147; M-1 to N-146; M-1 to I-1
M-1 to N-144; M-1 to L-143; M-1 to F-142; M-1
M-1 to V-140; M-1 to A-139; M-1 to E-138.
M-1 to V-137; M-1 to L-136; M-1 to I-135;
-134; M-1 to G-133; M-1 to F-132; M-1 to I-131; M
M-1 to L-129; M-1 to T-128; M-1 to D-1
27; M-1 to V-126; M-1 to H-125; M-1 to S-124; M-1
M-1 to P-122; M-1 to L-121; M-1 to R-120.
M-1 to Y-119; M-1 to R-118; M-1 to F-117;
-116; M-1 to L-115; M-1 to F-114; M-1 to H-113; M
M-1 to G-111; M-1 to N-110; M-1 to V-1
09; M-1 to S-108; M-1 to V-107; M-1 to K-106; M-1
M-1 to E-104; M-1 to E-103; M-1 to N-102.
M-1 to G-101; M-1 to F-100; M-1 to L-99; M-1 to F-;
M-1 to L-97; M-1 to I-96; M-1 to L-95; M-1 to F-
94; M-1 to S-93; M-1 to S-92; M-1 to G-91; M-1 to R-
90; M-1 to R-89; M-1 to L-88; M-1 to A-87; M-1 to L-
86; M-1 to H-85; M-1 to P-84; M-1 to W-83; M-1 to R-
82; M-1 to A-81; M-1 to E-80; M-1 to R-79; M-1 to Q-
78; M-1 to W-77; M-1 to R-76; M-1 to G-75; M-1 to G-
74; M-1 to H-73; M-1 to L-72; M-1 to T-71; M-1 to N-
70; M-1 to C-69; M-1 to I-68; M-1 to V-67; M-1 to H-.
66; M-1 to P-65; M-1 to K-64; M-1 to T-63;
62; M-1 to H-61; M-1 to F-60; M-1 to R-59; M-1 to P-.
M-1 to N-57; M-1 to F-56; M-1 to H-55; M-1 to F-
M-1 to A-53; M-1 to I-52; M-1 to D-51; M-1 to P-
M-1 to R-49; M-1 to P-48; M-1 to C-47; M-1 to L-
46; M-1 to S-45; M-1 to C-44; M-1 to G-43;
42; M-1 to Q-41; M-1 to F-40; M-1 to D-39;
M-1 to Q-37; M-1 to T-36; M-1 to C-35; M-1 to R-
34; M-1 to S-33; M-1 to P-32; M-1 to G-31;
M-1 to R-29; M-1 to A-28; M-1 to A-27; M-1 to H-
26; M-1 to G-25; M-1 to D-24; M-1 to Q-23;
22; M-1 to C-21; M-1 to A-20; M-1 to P-19;
M-1 to W-17; M-1 to F-16; M-1 to D-15; M-1 to D-
14; M-1 to H-13; M-1 to C-12; M-1 to L-11; M-1 to S-.
M-1 to G-9; M-1 to G-8; M-1 to S-7; M-1 to C-6. Polynucleotides encoding such polypeptides are also included in the present invention.
【０１５４】 本発明のさらなる実施形態は、一般式ｍ〜ｎによって示されるアミノ酸配列を
含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドフラグメントに関し、ここで、ｍ
およびｎは、それぞれ、これらの記号について上記で特定化されたアミノ酸残基
の任意の１つに対応する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
もまた、本発明に含まれる。A further embodiment of the present invention relates to a polypeptide fragment comprising or consisting of an amino acid sequence represented by the general formulas mn, wherein m
And n each correspond to any one of the amino acid residues specified above for these symbols. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.
【０１５５】 図２は、ガレクチン１１ポリペプチドの、他のガレクチンとの比較を提供する
。ガレクチン間で共有される同一のアミノ酸には影をつけ、一方、保存的アミノ
酸変化は囲まれる。影をつけたおよび／または囲まれたアミノ酸の領域を試験す
ることによって、当業者は、２つのポリペプチド間の保存されたドメインを容易
に同定し得る。これらの保存され、影をつけたおよび／または囲まれたドメイン
内に存在するアミノ酸配列は、本発明の好ましいポリペプチドフラグメントに包
含される。全長のガレクチン１１αおよびガレクチン１１βの類似の分析は、本
明細書中に提供される教示を考慮して、当業者の範囲内であると考えられる。FIG. 2 provides a comparison of Galectin-11 polypeptide with other galectins. Identical amino acids shared between galectins are shaded, while conservative amino acid changes are boxed. By examining the shaded and / or boxed regions of amino acids, one of skill in the art can readily identify conserved domains between the two polypeptides. Amino acid sequences present within these conserved, shaded and / or enclosed domains are encompassed by preferred polypeptide fragments of the present invention. Similar analyzes of full-length galectin 11α and galectin 11β are considered to be within the skill of the art in light of the teachings provided herein.
【０１５６】 本発明のポリペプチド残基フラグメントの代表的な例には、例えば、図１（配
列番号２）に示されるガレクチン１１ポリペプチドのおよそアミノ酸番号１〜２
０、１〜６６、５〜１０８、５〜１２８、２１〜４０、４０〜１０８、４１〜６
０、４７〜１０８、４７〜１２８、６１〜８０、６５〜１０８、６５〜１２８、
８１〜１００、８８〜１０８、８８〜１２８、１０８〜１２０；１１４〜１２８
；および１０１〜末端のフラグメントが挙げられる。この状況において、「およ
そ」は、いずれか一端または両端で、いくつかの、５、４、３、２、または１ア
ミノ酸分より大きなまたはより小さい、特に列挙される範囲を含む。本発明のポ
リペプチド残基フラグメントの代表的な例としては、例えば、配列番号２５のお
よそアミノ酸番号１〜２０、１〜６６、５〜１０８、５〜１２８、２１〜４０、
４０〜１０８、４１〜６０、４７〜１０８、４７〜１２８、６１〜８０、６５〜
１０８、６５〜１２８、８１〜１００、８８〜１０８、８８〜１２８、１０８〜
１２０；１１４〜１２８；１２９〜１５０；１４５〜１７５；１７０〜２００；
１９５〜２２５；２２０〜２５０；および２４５〜２７５のフラグメントが挙げ
られる。本発明のポリペプチド残基フラグメントのさらなる代表的な例としては
、例えば、配列番号２７のおよそアミノ酸番号１〜２０、１〜６６、５〜１０８
、５〜１２８、２１〜４０、４０〜１０８、４１〜６０、４７〜１０８、４７〜
１２８、６１〜８０、６５〜１０８、６５〜１２８、８１〜１００、８８〜１０
８、８８〜１２８、１０８〜１２０；１１４〜１２８；１２９〜１５０；１４５
〜１７５；１７０〜２００；１９５〜２２５；２２０〜２５０；２４５〜２７５
；および２７０〜２９６のフラグメントが挙げられる。このようなアミノ酸配列
を含むポリペプチドが、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
と同様に提供される。Representative examples of polypeptide residue fragments of the present invention include, for example, approximately amino acids 1-2 of the galectin-11 polypeptide shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
0, 1-66, 5-108, 5-128, 21-40, 40-108, 41-6
0, 47-108, 47-128, 61-80, 65-108, 65-128,
81-100, 88-108, 88-128, 108-120; 114-128
And 101-terminal fragments. In this context, “approximately” includes the particularly recited range, at either or both ends, that is greater or less than 5, 5, 3, 3, 2, or 1 amino acid. Representative examples of polypeptide residue fragments of the present invention include, for example, about amino acid numbers 1-20, 1-66, 5-108, 5-128, 21-40,
40-108, 41-60, 47-108, 47-128, 61-80, 65
108, 65-128, 81-100, 88-108, 88-128, 108-
120; 114-128; 129-150; 145-175; 170-200;
195-225; 220-250; and 245-275. Further representative examples of polypeptide residue fragments of the present invention include, for example, about amino acids 1-20, 1-66, 5-108 of SEQ ID NO: 27.
, 5-128, 21-40, 40-108, 41-60, 47-108, 47-
128, 61-80, 65-108, 65-128, 81-100, 88-10
8, 88-128, 108-120; 114-128; 129-150; 145
-175; 170-200; 195-225; 220-250; 245-275.
And 270-296 fragments. A polypeptide comprising such an amino acid sequence is provided, as well as a polynucleotide encoding such a polypeptide.
【０１５７】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ガレクチン１１の機
能的活性を示すポリペプチドをコードする。「機能的に活性」なガレクチン１１
を示すポリペプチドとは、全長（完全）ガレクチン１１タンパク質に関連する１
つ以上の機能的活性を提示し得るポリペプチドを意味する。このような機能的活
性としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：生物学的活性、抗原
性［抗ガレクチン１１抗体に結合する（または、その結合についてガレクチン１
１ポリペプチドと競合）能力］、免疫原性（ガレクチン１１ポリペプチドに結合
する抗体を生成する能力）、本発明のガレクチン１１ポリペプチドと多量体を形
成する能力。Preferably, the polynucleotide fragment of the present invention encodes a polypeptide exhibiting galectin 11 functional activity. "Functionally active" galectin 11
Is a polypeptide related to the full-length (complete) galectin-11 protein.
A polypeptide capable of displaying one or more functional activities is meant. Such functional activities include, but are not limited to: biological activity, antigenicity [binding to anti-galectin 11 antibody (or galectin 1 for binding thereof).
1 compete with the polypeptide), immunogenicity (ability to generate an antibody that binds to the galectin 11 polypeptide), and ability to form a multimer with the galectin 11 polypeptide of the present invention.
【０１５８】 本発明の特に好ましいフラグメントは、ガレクチン１１の構造的または機能的
特性によって特徴付けられるフラグメントである。このようなフラグメントとし
ては、ガレクチン１１のαへリックスおよびαへリックス形成領域（「α領域」
）、βシートおよびβシート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成
領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親
水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域、およ
び高抗原性指数領域（すなわち、１．５以上の抗原性指数を各々有する３つ以上
の連続するアミノ酸残基の抗原性領域を有する）を含む、アミノ酸残基が挙げら
れる。特定の好ましい領域は、図３に示される領域であり、そして図１（配列番
号２）に示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上述の型の領域が挙げ
られるが、これらに限定されない。このような好ましい領域には、以下が挙げら
れる：Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ予測α領域、β領域、ターン領域、および
コイル領域；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ予測α領域、β領域、ターン領域、および
コイル領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ予測親水性領域および疎水性領域；
Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのαおよびβ両親媒性領域；Ｅｍｉｎｉの表面形成領域；な
らびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指数領域。これらは、これらのコンピ
ュータープログラムのデフォルトパラメーターを使用して予測される。これらの
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。Particularly preferred fragments of the present invention are fragments characterized by the structural or functional properties of Galectin-11. Such fragments include the α-helix of galectin 11 and the α-helix forming region (“α region”).
), Β sheet and β sheet forming region (“β region”), turn and turn forming region (“turn region”), coil and coil forming region (“coil region”), hydrophilic region, hydrophobic region, α parents Amphiphilic region, β-amphiphilic region, surface-forming region, and high antigenic index region (ie, having an antigenic region of three or more consecutive amino acid residues each having an antigenic index of 1.5 or more) And amino acid residues. Certain preferred regions are those shown in FIG. 3 and include, but are not limited to, regions of the type described above identified by analysis of the amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Such preferred regions include: Garnier-Robson predicted α, β, turn, and coil regions; Chou-Fasman predicted α, β, turn, and coil regions; Kyte-Doolittle Predicted hydrophilic and hydrophobic regions;
Eisenberg α and β amphipathic regions; Emini surface-forming regions; and Jameson-Wolf high antigenic index regions. These are predicted using the default parameters of these computer programs. Polynucleotides encoding these polypeptides are also included in the present invention.
【０１５９】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ガレクチン１１の
機能的特性をコードする。この点における本発明の好ましい実施形態としては、
ガレクチン１１のαへリックスおよびαへリックス形成領域（「α領域」）、β
シートおよびβシート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（
「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領
域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域
、および高抗原性指数領域を含む、フラグメントが挙げられる。In a further embodiment, a polynucleotide of the invention encodes a functional property of Galectin-11. Preferred embodiments of the present invention in this regard include:
Α-helix and α-helix forming region (“α region”) of galectin 11, β
Sheet and beta sheet formation region ("beta region"), turn and turn formation region (
"Turn regions"), coils and coil-forming regions ("coil regions"), hydrophilic regions, hydrophobic regions, alpha amphiphilic regions, beta amphiphilic regions, flexible regions, surface forming regions, and high antigens Fragments, including the sex index region, are included.
【０１６０】 上記のように、図１および／または表Ｉに示されるガレクチン１１の構造的ま
たは機能的特性を表すデータは、デフォルトパラメーター上に設定されるＤＮＡ
＊ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して生成される。好ま
しい実施形態において、表１の列ＶＩＩＩ、ＸＩＩおよびＸＩＩＩに提示される
データは、抗原性について高程度の能力を示す、ガレクチン１１の領域を決定す
るために使用され得る。高い抗原性の領域は、列ＶＩＩＩ、ＸＩＩおよびＸＩＩ
Ｉに提示されるデータから、抗原認識が免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ
得る環境下で、このポリペプチドの表面上に露出されそうであるこのポリペプチ
ドの領域を示す値を選択することによって決定される。As described above, the data representing the structural or functional properties of galectin 11 shown in FIG. 1 and / or Table I are based on the DNA set on the default parameters.
* Generated using various modules and algorithms of STAR. In a preferred embodiment, the data presented in columns VIII, XII and XIII of Table 1 can be used to determine regions of galectin 11 that exhibit a high degree of potency for antigenicity. Highly antigenic regions are listed in columns VIII, XII and XII
Determined by selecting values from the data presented in I that indicate the region of the polypeptide that is likely to be exposed on the surface of the polypeptide in circumstances where antigen recognition can occur in the process of initiating an immune response Is done.
【０１６１】 これらの点における特定の好ましい領域は、図３に示されるが、表１に示され
るように、図３に提示されるデータの表示を使用することによって、提示または
同定してもよい。図３を生成するために使用されるＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピュー
ターアルゴリズム（元のデフォルトパラメーター上に設定される）を使用して、
表形式で図３のデータを表した（表１を参照のこと）。図３のデータのこの表形
式を使用して、好ましい領域の特定の境界を容易に決定し得る。Certain preferred regions at these points are shown in FIG. 3, but may be presented or identified by using the representation of the data presented in FIG. 3, as shown in Table 1. . Using the DNA * STAR computer algorithm (set on the original default parameters) used to generate FIG.
The data of FIG. 3 was presented in tabular form (see Table 1). Using this tabular form of the data of FIG. 3, the specific boundaries of the preferred area can be easily determined.
【０１６２】 図３および表Ｉに示される上記の好ましい領域としては、図１に示されるアミ
ノ酸配列の分析によって同定される上記の型の領域が挙げられるが、これらに限
定されない。図３および表Ｉに示されるように、このような好ましい領域として
は、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ予測α領域、β領域、ターン領域、およびコ
イル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ予測α領域、β領域、およびターン領域、Ｋ
ｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのαおよびβ両
親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形
成領域；ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指数領が挙げられる。The preferred regions shown in FIG. 3 and Table I include, but are not limited to, regions of the above type identified by analysis of the amino acid sequence shown in FIG. As shown in FIG. 3 and Table I, such preferred regions include Garnier-Robson predicted α, β, turn, and coil regions, Chou-Fasman predicted α, β, and turn regions, K
the hydrophilic region of yte-Doolittle, the α and β amphipathic regions of Eisenberg, the flexible region of Karplus-Schulz, the surface forming region of Emini; and the Jameson-Wolf high antigenic index region.
【０１６３】[0163]
【表２】 図２は、他のガレクチンとのこのガレクチン１１ポリペプチドの比較を提供す
る。これらガレクチン間で共有される同一のアミノ酸に影を付けており、同時に
保存的アミノ酸変化を四角で囲んでいる。影を付けたかそして／または四角で囲
んでいるアミノ酸の領域を試験することにより、当業者は、その２つのポリペプ
チド間の保存ドメインを容易に同定し得る。これら保存され、影を付けられそし
て／または四角で囲まれたドメイン間にあるアミノ酸配列は、本発明の好ましい
ポリペプチドフラグメントに含まれる。[Table 2] FIG. 2 provides a comparison of this galectin-11 polypeptide with other galectins. The same amino acids shared between these galectins are shaded, while conservative amino acid changes are boxed. By examining the shaded and / or boxed region of amino acids, one of skill in the art can readily identify conserved domains between the two polypeptides. Amino acid sequences between these conserved, shaded and / or boxed domains are included in preferred polypeptide fragments of the invention.
【０１６４】 この点で非常に好ましいフラグメントのうちにあるのは、いくつかの構造的特
徴（例えば、上記に示される特徴のうちのいくつか）を組み合わせるガレクチン
１１の領域を含むものである。Among the highly preferred fragments in this regard are those that include a region of galectin 11 that combines several structural features (eg, some of the features set forth above).
【０１６５】 他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なガレクチン１１
フラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、そのガレクチン１１ポ
リペプチドの活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示す、フラグメント
である。それらフラグメントの生物学的活性は、改善した所望の活性または減少
した望まない活性を含み得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドもまた、本発明により包含される、 本発明のポリペプチド残基フラグメントの代表的例は、例えば、図１に示され
るガレクチン１１ポリペプチド（配列番号２）およそのアミノ酸番号１〜２０、
１〜６６、５〜１０８、５〜１２８、２１〜４０、４０〜１０８、４１〜６０、
４７〜１０８、４７〜１２８、６１〜８０、６５〜１０８、６５〜１２８、８１
〜１００、８８〜１０８、８８〜１２８、１０８〜１２０；１１４〜１２８；お
よび１０１〜最後のフラグメントを含む。この文脈において、「およそ」とは、
いずれかの末端または両方の末端で、特に言及される範囲より数アミノ酸、５ア
ミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、または１アミノ酸だけ大きいか
または小さいものを含む。Other preferred polypeptide fragments include biologically active galectin 11
It is a fragment. Biologically active fragments are fragments that exhibit an activity similar, but not necessarily identical, to that of the galectin-11 polypeptide. The biological activity of the fragments may include an improved desired activity or a reduced unwanted activity. Polynucleotides encoding these polypeptides are also encompassed by the present invention. Representative examples of polypeptide residue fragments of the present invention include, for example, the galectin-11 polypeptide (SEQ ID NO: 2) shown in FIG. Amino acid numbers 1 to 20,
1-66, 5-108, 5-128, 21-40, 40-108, 41-60,
47-108, 47-128, 61-80, 65-108, 65-128, 81
-100, 88-108, 88-128, 108-120; 114-128; and 101-last fragment. In this context, "approximately"
At either or both termini, include those that are several amino acids, five amino acids, four amino acids, three amino acids, two amino acids, or one amino acid larger or smaller than the range specifically mentioned.
【０１６６】 当業者が理解するように、本発明のガレクチン１１ポリペプチド（例えば、ガ
レクチン１１のエピトープ保有フラグメントなど）を、免疫グロブリン（ＩｇＧ
）の定常ドメインの一部と結合させて、キメラポリペプチドを生じ得る。ＩｇＧ
部分によるジスルフィド連結ダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、他の
分子の結合および中和において、モノマーのガレクチン１１タンパク質またはタ
ンパク質フラグメント単独よりも効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。As those skilled in the art will appreciate, galectin-11 polypeptides of the present invention (eg, epitope-bearing fragments of galectin-11, etc.) can be used to bind immunoglobulins (IgG
) Can be combined with a portion of the constant domain to produce a chimeric polypeptide. IgG
Fusion proteins with disulfide-linked dimer structures by moieties may also be more efficient at binding and neutralizing other molecules than the monomeric galectin-11 protein or protein fragment alone (Funtoulakis
J. et al. Biochem. 270: 3958-3964 (1995)).
【０１６７】 当業者が理解するように、そして上記で議論されたように、免疫原性エピトー
プまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド配
列と融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ
、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはその部分（ＣＨ１、ＣＨ２、
ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせおよびそれらの部分）と融合されて、
キメラポリペプチドを生じ得る。このような融合タンパク質は、精製を容易にし
得、そしてインビボでの半減期を増加し得る。これは、ヒトＣＤ４−ポリペプチ
ドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定
常領域の種々のドメインからなる、キメラタンパク質について示されている。例
えば、ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１
：８４−８６（１９８８）を参照のこと。上皮障壁を横切って免疫系への抗原の
増強した送達が、ＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＩｇＧフラグメントまたは
Ｆｃフラグメント）に結合した抗原（例えば、インスリン）について示されてい
る（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ ９６／２２０２４およびＷＯ ９９／０４８１３
を参照のこと）。ＩｇＧ部分ジスルフィド結合に起因するジスルフィド連結ダイ
マー構造を有するＩｇＧ融合タンパク質もまた、他の分子の結合および中和にお
いて、モノマーのポリペプチドまたはそのフラグメント単独よりも有効であるこ
とが見出されている。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープ
をコードする核酸もまた、エピトープタグ（例えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）
タグまたはフラッグタグ）として目的の遺伝子と組み合わされて、発現されるポ
リペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによ
り記載される系により、ヒト細胞株にて発現される非変性融合タンパク質の容易
な精製が可能である（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２〜８９７）。この系において、目的
の遺伝子が、その遺伝子のオープンリーディングフレームが翻訳により６個のヒ
スチジン残基からなるアミノ末端タグに融合されるように、ワクシニア組換えプ
ラスミドにサブクローニングされる。このタグは、その融合タンパク質について
のマトリックス結合ドメインとして作用する。この組換えワクシニアウイルスに
感染した細胞由来の抽出物が、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラムにロー
ドされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質が、イミダゾール含有緩衝液で選択
的に溶出され得る。As will be appreciated by those skilled in the art, and as discussed above, the polypeptides of the present invention that include an immunogenic or antigenic epitope can be fused to other polypeptide sequences. For example, a polypeptide of the invention may comprise an immunoglobulin (IgA
, IgE, IgG, IgM) or portions thereof (CH1, CH2,
CH3, or any combination thereof and portions thereof)
A chimeric polypeptide can result. Such fusion proteins can facilitate purification and increase half-life in vivo. This is shown for a chimeric protein consisting of the first two domains of the human CD4-polypeptide and various domains of the constant regions of the heavy or light chains of a mammalian immunoglobulin. See, for example, EP 394,827; Traunecker et al., Nature 331.
: 84-86 (1988). Enhanced delivery of antigen across the epithelial barrier to the immune system has been demonstrated for antigens (eg, insulin) bound to FcRn binding partners (eg, IgG or Fc fragments) (eg, PCT Publication WO 96 /). 22024 and WO 99/04813
checking). IgG fusion proteins having a disulfide-linked dimer structure due to IgG partial disulfide bonds have also been found to be more effective at binding and neutralizing other molecules than monomeric polypeptides or fragments thereof alone. See, eg, Footoulakis et al. Bioche
m. 270: 3958-3964 (1995). Nucleic acids encoding the above-described epitopes may also be epitope tags (eg, hemagglutinin ("HA")).
Tag or flag tag) in combination with the gene of interest to aid in the detection and purification of the expressed polypeptide. For example, the system described by Janknecht et al. Allows for easy purification of non-denatured fusion proteins expressed in human cell lines (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl.
Acad. Sci. ScL USA 88: 8972-897). In this system, the gene of interest is subcloned into a vaccinia recombination plasmid such that the open reading frame of the gene is translationally fused to an amino-terminal tag consisting of six histidine residues. This tag acts as a matrix binding domain for the fusion protein. Extracts from cells infected with this recombinant vaccinia virus can be loaded onto a Ni2 + nitriloacetic acid-agarose column and histidine-tagged proteins can be selectively eluted with imidazole-containing buffers.
【０１６８】 本発明のさらなる融合タンパク質が、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリングとい
う技術（まとめて、「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）を介して生成され得
る。ＤＮＡシャッフリングは、本発明のポリペプチドの活性を調節するために使
用され得、このような方法は、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそ
のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成するために使用され得
る。一般的には、米国特許第５，６０５，７９３号；同５，８１１，２３８号；
同５，８３０，７２１号；同５，８３４，２５２号；および同５，８３７，４５
８号、ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．８：７２４〜３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５〜７６（１９９９）；およびＬｏｒｅｎ
ｚｏおよびＢｌａｓｃｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８〜
１３（１９９８）（これらの特許および刊行物は、その全体が本明細書中によっ
て参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号１
に対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドの変化が、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシ
ャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより２つ以上のＤＮＡセ
グメントをアセンブリしてそのポリヌクレオチド配列に変化を生成することを含
む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドまたはそのコードされる
ポリペプチドは、エラープローンＰＣＲ、ランダムなヌクレオチドの挿入または
他の方法によるランダムな変異誘発に、組換え前に供することにより変化され得
る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドの１つ以上のコンポーネント、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラ
グメントなどが、１つ以上の異種分子の１つ以上のコンポーネント、モチーフ、
セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組合され得る。[0168] Additional fusion proteins of the invention can be produced via the techniques of gene shuffling, motif shuffling, exon shuffling, and / or codon shuffling (collectively referred to as "DNA shuffling"). DNA shuffling can be used to modulate the activity of a polypeptide of the invention, and such methods can be used to generate polypeptides with altered activity, and agonists and antagonists of the polypeptide . Generally, U.S. Patent Nos. 5,605,793; 5,811,238;
5,830,721; 5,834,252; and 5,837,45
No. 8, and Patten et al., Curr. Opinion Biotechn
ol. 8: 724-33 (1997); Harayama, Trends Bi.
otechnol. 16 (2): 76-82 (1998); Hansson et al.
J. Mol. Biol. 287: 265-76 (1999); and Loren.
zo and Blasco, Biotechniques 24 (2): 308-
13 (1998) (these patents and publications are incorporated herein by reference in their entirety). In one embodiment, SEQ ID NO: 1
Polynucleotides corresponding to and changes in the polypeptides encoded by these polynucleotides can be achieved by DNA shuffling. DNA shuffling involves assembling two or more DNA segments by homologous recombination or site-specific recombination to produce a change in the polynucleotide sequence. In another embodiment, the polynucleotide of the invention or its encoded polypeptide may be altered by subjecting it to error-prone PCR, random nucleotide insertion or random mutagenesis by other methods before recombination. . In another embodiment, one or more components, motifs, sections, portions, domains, fragments, etc., of a polynucleotide encoding a polypeptide of the invention comprise one or more components, motifs, one or more heterologous molecules.
Can be combined with sections, parts, domains, fragments, etc.
【０１６９】 本発明のポリペプチドは、図１に示されるポリヌクレオチド配列（配列番号１
）、その相補鎖、および／または寄託されたクローンに含まれるヌクレオチド配
列に、（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）ハイブ
リダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、ポリペプチドを含む。The polypeptide of the present invention has the polynucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
), Its complement, and / or a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes (eg, under stringent hybridization conditions) to a nucleotide sequence contained in the deposited clone.
【０１７０】 （ガレクチン１１の機能的活性についてのアッセイ） 本発明のガレクチン１１ポリペプチド、フラグメント、改変体、誘導体および
アナログの機能的活性および／または生物学的活性は、種々の方法によってアッ
セイされ得る。Assay for Functional Activity of Galectin-11 The functional and / or biological activity of the galectin-11 polypeptides, fragments, variants, derivatives and analogs of the present invention can be assayed by various methods. .
【０１７１】 例えば、ガレクチン１１ポリペプチドに結合する能力についてか、または抗ガ
レクチン１１抗体への結合についてガレクチン１１ポリペプチドと競合する能力
についてアッセイする、１つの実施形態では、当該分野で公知の種々の免疫アッ
セイが用いられ得、これらのアッセイとしては、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ
、「サンドイッチ」免疫アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイおよび拡散
沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド状
金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、
凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ）、補体結合ア
ッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセ
イなどのような技術を用いる、競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が挙
げられるがこれらに限定されない。免疫アッセイにおいて結合を検出するための
多くの手段が当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内にある。For example, in one embodiment assaying for the ability to bind to a galectin-11 polypeptide or to compete with a galectin-11 polypeptide for binding to an anti-galectin-11 antibody, in one embodiment, various assays known in the art are used. Immunoassays can be used, including radioimmunoassays, ELISAs
, "Sandwich" immunoassays, immunoradiometric assays and diffusion sedimentation reactions, immunodiffusion assays, in situ immunoassays (e.g., using colloidal gold, enzyme or radioisotope labels), Western blots, sedimentation reactions,
Competitive and non-competitive assay systems using techniques such as agglutination assays (eg, gel agglutination assays, hemagglutination assays), complement binding assays, immunofluorescence assays, protein A assays, and immunoelectrophoresis assays But are not limited to these. Many means for detecting binding in an immunoassay are known in the art and are within the scope of the present invention.
【０１７２】 別の実施形態では、本発明のガレクチン１１ポリペプチド、フラグメント、改
変体、誘導体およびアナログがβ−ガラクトシド糖を結合する能力は、当該分野
で公知のアッセイを用いてかまたはそのアッセイを慣用的に改変して、決定され
得る。例えば、発現されたガレクチン１１ポリペプチドおよびそのフラグメント
、改変体、誘導体、またはアナログのラクトース結合活性は、ニトロセルロース
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に固定化したアシアロフェチュイン（ａｓｉａｌｏｆｅ
ｔｕｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）へのインサイチュ結合活性の免疫検出によってアッセ
イされ得る（Ｍａｄｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１１）：５８
２３−５８２９（１９９５））。例えば、１つのアッセイでは、３μｌの水に溶
解された３０μｇのアシアロフェチュインが、１ｃｍ2のニトロセルロース片に
スポットされる。次いでこのニトロセルロース片は、２４ウェル組織培養プレー
ト（ｐｌａｎｔ）中に配置され、そして緩衝液Ｂ（５８ｍＭ ＮＡ2ＨＰＯ4、１
８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および３％ Ｂ
ＳＡ、ｐＨ７．２）中で一定に攪拌しながら２２℃にて一晩インキュベートされ
る。インキュベーション後、ブロッキング培地が吸引され、そしてこのニトロセ
ルロース片は、緩衝液Ａ（５８ｍＭ ＮＡ2ＨＰＯ4、１８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、７
５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ β−メルカプトエタノールおよ
び０．２％ ＢＳＡ、ｐＨ７．２）中で３回洗浄される。１％ ＢＳＡを含有し
、かつ１５０ｍＭラクトースを有するかまたは有さないかのいずれかである細胞
（好ましくは、ＣＯＳ細胞）抽出物（１０５μｌの一次抽出物、緩衝液Ａ中の１
５μｌの１０％ ＢＳＡ、および緩衝液Ａ中の０．７５Ｍラクトース３０μｌま
たは３０μｌの緩衝液Ａのいずれか）を調製する。固定されたアシアロフェチュ
インが、その抽出物とともに２時間インキュベートし、そして緩衝液Ａ中で５回
洗浄される。次いで、ニトロセルロース片が、ＰＢＳ（５８ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4 、１８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２
）中の２％ホルマリン中にて１時間固定されて、結合したガレクチン１１の損失
が防止される。ＰＢＳ中での大洗浄後、この片は、ＰＢＳ中に１：１００に希釈
されたウサギ抗ガレクチン１１ポリクローナル血清（当該分野で公知の技術を用
いて生成される）とともに２２℃にて２時間インキュベートされる。次いで、こ
の片は、ＰＢＳ中で洗浄され、そしてペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギ
抗体（ＤＡＫＯ）とともにインキュベートされる。２２℃にて２時間のインキュ
ベーション後、この片はＰＢＳ中で洗浄され、そしてその基質が添加される。ニ
トロセルロース片は、発色するまでインキュベートされ、そしてこの反応は、蒸
留水中で洗浄することにより停止される。In another embodiment, the ability of the galectin-11 polypeptides, fragments, variants, derivatives and analogs of the present invention to bind β-galactoside sugars is determined using or using assays known in the art. It can be determined by customary modification. For example, the lactose binding activity of the expressed galectin-11 polypeptide and its fragments, variants, derivatives, or analogs can be measured by asialofetuin (asialofe) immobilized on nitrocellulose (Amersham).
tuin) (Sigma) by immunodetection of in situ binding activity (Madsen et al., J. Biol. Chem. 270 (11): 58).
23-5829 (1995)). For example, in one assay, 30 μg of asialofetuin dissolved in 3 μl of water is spotted on a 1 cm 2 piece of nitrocellulose. The nitrocellulose pieces were then placed in a 24-well tissue culture plant and buffer B (58 mM NA 2 HPO 4 , 1
8 mM KH 2 PO 4 , 75 mM NaCl, 2 mM EDTA, and 3% B
(SA, pH 7.2) with constant stirring at 22 ° C. overnight. After the incubation, the blocking medium was aspirated and the nitrocellulose pieces were buffered A (58 mM NA 2 HPO 4 , 18 mM KH 2 PO 4 , 7 mM).
Wash 3 times in 5 mM NaCl, 2 mM EDTA, 4 mM β-mercaptoethanol and 0.2% BSA, pH 7.2). Cell (preferably COS cell) extract containing 1% BSA and either with or without 150 mM lactose (105 μl primary extract, 1 in buffer A)
Prepare 5 μl of 10% BSA and either 30 μl of 0.75 M lactose in buffer A or 30 μl of buffer A). The immobilized asialofetuin is incubated with the extract for 2 hours and washed 5 times in buffer A. The nitrocellulose pieces were then placed in PBS (58 mM Na 2 HPO 4 , 18 mM KH 2 PO 4 , 75 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7.2.
) Is fixed in 2% formalin for one hour to prevent loss of bound galectin-11. After extensive washing in PBS, the strips were incubated for 2 hours at 22 ° C. with rabbit anti-galectin-11 polyclonal serum (generated using techniques known in the art) diluted 1: 100 in PBS. Is done. The strip is then washed in PBS and incubated with a peroxidase labeled goat anti-rabbit antibody (DAKO). After a 2 hour incubation at 22 ° C., the strip is washed in PBS and the substrate is added. The nitrocellulose pieces are incubated until color develops, and the reaction is stopped by washing in distilled water.
【０１７３】 本発明のガレクチン１１ポリペプチド、フラグメント、改変体、誘導体および
アナログが、トリプシン処理したウサギ赤血球を凝集させる能力は、当該分野で
公知の技術を用いて慣用的にアッセイされ得る。The ability of the galectin-11 polypeptides, fragments, variants, derivatives and analogs of the invention to aggregate trypsinized rabbit erythrocytes can be routinely assayed using techniques known in the art.
【０１７４】 本発明のガレクチン１１ポリペプチド、フラグメント、改変体、誘導体および
アナログが、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する能力は、本明細書中に記載される
技術（例えば、実施例５を参照のこと）かさもなければ当該分野で公知の技術を
、用いてかまたはその技術を慣用的に改変して、決定され得る。例えば、Ｐｅｒ
ｉｌｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３７８：７３６−７３９（１９９５）；Ｃｈｉｎｎ
ａｉｙａｎら、Ｃｅｌｌ ８１：５０５−５１２（１９９５）；Ｂｏｌｄｉｎら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７７９５−７７９８（１９９５）；Ｋｉｓ
ｃｈｋｅｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：５５７９−５５８５（１９９５）；Ｃｈｉ
ｎｎａｉｙａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４９６１−４９６５（１
９９６）（これらの各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用され
る）を参照のこと。The ability of the galectin-11 polypeptides, fragments, variants, derivatives and analogs of the present invention to induce T cell apoptosis is determined by the techniques described herein (see, eg, Example 5). ) May be determined otherwise using techniques known in the art or routinely modifying the techniques. For example, Per
illo et al., Nature 378: 736-739 (1995); Chinn.
aiyan et al., Cell 81: 505-512 (1995); Boldin et al. Biol. Chem. 270: 7795-7798 (1995); Kis.
chkel et al., EMBO J .; 14: 5579-5585 (1995); Chi.
Nnaiyan et al. Biol. Chem. 271: 4961-4965 (1
996), the contents of each of which is incorporated herein by reference in its entirety.
【０１７５】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれらのフ
ラグメント、改変体、誘導体およびアナログ；ならびにそれらに対する抗体、ア
ゴニストおよびアンタゴニストは、所望の治療活性または予防活性についてイン
ビボで試験され得る。例えば、このような化合物は、ヒトにおいて試験する前に
適切な動物モデル系において試験され得る。このような動物モデルとしては、ラ
ット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどが挙げられるが、これらに限
定されない。このような試験を用いて、ヒト患者に送達するための投薬量もまた
慣用的に決定され得る。ヒトに投与する前のインビボでの試験のために、当該分
野で公知の任意の動物モデル系が用いられ得る（例えば、Ｌｅｖｉら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｉｍｕｎ．１３：５００−５０７（１９８３）；およびＯｆｆｎｅｒら、Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ２８：１７７−１８４（１９９０）を参照のこと
）。例えば、ヒトＭＳの処置の研究のために有用な動物モデルは、実験的アレル
ギー脳脊髄炎（ＥＡＥ）である。ＥＡＥは、ＭＳの同じ臨床的症状および病理学
的症状の多くを共有する、実験的に誘導される疾患である（Ｍａｒｔｉｎら、Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１５３−１８７（１９９２）；Ｈａｆｌ
ｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １０：１０４−１０７（１９８９
））。げっ歯類におけるいくつかの研究は、ＭＳと同様に、ＣＤ４+ Ｔ細胞が
、ＥＡＥの病態生理に関与することを示している（Ｔｒａｕｇｏｔｔら、Ｃｅｌ
ｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９１：２４０−２５４（１９８５）；Ｂｅ
ｎ−Ｎｕｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１９５−１９９（１９８１）
；Ｐｅｔｔｉｎｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：１４２０−１４２３（１
９８１））。ＥＡＥは、マウスの特定の系統において、アジュバント中のミエリ
ンでの免疫によって誘導され得る。この免疫は、ミエリン塩基性タンパク質（Ｍ
ＢＰ）およびプロテオリピド（ＰＬＰ）に特異的なＣＤ４+ Ｔ細胞を活性化す
る（Ｂｅｒｎａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４：１５３７−１５４０（１
９７５）；Ｃｈｏｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：２１８３−２１８６（１
９８３）；Ｋｕｒｃｈｒｏｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３７７６−３７
８２（１９９２））。この活性化されたＴ細胞は、中枢神経系に進入し、そして
それらの局所的作用は、この疾患の解剖学的病理および臨床的徴候（例えば、麻
痺をもたらす、上行後肢不全麻痺）の両方を引き起こす。上記で議論したように
、ガレクチン１は、ラットにおける実験的自己免疫脳脊髄炎の臨床的徴候および
組織学的徴候を抑制することが実証されている（Ｏｆｆｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１７７−１８４（１９９０））。Galectin-11 polynucleotides and polypeptides, and fragments, variants, derivatives and analogs thereof; and antibodies, agonists and antagonists thereto, can be tested in vivo for the desired therapeutic or prophylactic activity. For example, such compounds can be tested in a suitable animal model system before testing in humans. Such animal models include, but are not limited to, rats, mice, chickens, cows, monkeys, rabbits, and the like. Using such tests, dosages for delivery to human patients can also be routinely determined. For in vivo testing prior to administration to humans, any animal model system known in the art can be used (see, eg, Levi et al., Eur.
J. Imun. 13: 500-507 (1983); and Offner et al., J.
. Neuroimmunol 28: 177-184 (1990)). For example, a useful animal model for studying treatment of human MS is experimental allergic encephalomyelitis (EAE). EAE is an experimentally induced disease that shares many of the same clinical and pathological symptoms of MS (Martin et al., A.
nn. Rev .. Immunol. 10: 153-187 (1992); Hafl.
er et al., Immunology Today 10: 104-107 (1989).
)). Several studies in rodents have shown that, like MS, CD4 + T cells are involved in the pathophysiology of EAE (Tragott et al., Cel.
lul Immunology 91: 240-254 (1985); Be.
n-Nun, Eur. J. Immunol. 11: 195-199 (1981)
Pettinel et al., J .; Immunol. 127: 1420-1423 (1
981)). EAE can be induced in certain strains of mice by immunization with myelin in adjuvant. This immunization is based on the myelin basic protein (M
Activates CD4 + T cells specific for BP) and proteolipid (PLP) (Bernard et al., J. Immunol. 114: 1537-1540 (1
975); Chou et al. Immunol. 130: 2183-2186 (1
983); Kurcrowo et al. Immunol. 148: 3776-37
82 (1992)). The activated T cells enter the central nervous system and their local effects are associated with both anatomical pathology and clinical signs of the disease (eg, ascending hind limb paresis resulting in paralysis). cause. As discussed above, galectin 1 has been demonstrated to suppress the clinical and histological signs of experimental autoimmune encephalomyelitis in rats (Offner et al., J. Neuro.
oimmunol. 28: 177-184 (1990)).
【０１７６】 免疫応答のサプレッサーとしての本発明のポリペプチド、改変体、誘導体およ
びアナログの役割を研究すること、およびこのようにするために有効な投薬量を
決定することの両方のために利用され得る別のモデル系は、ウサギにおける実験
的自己免疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）である。ＥＡＭＧは、精製されたアセチル
コリンレセプタータンパク質（ＡＣｈＲ）での免疫によって誘導される自己免疫
疾患であり、そしてヒトの疾患である重症筋無力症についての良好なモデルであ
るとみなされる。上記でさらに議論したように、ガレクチン１は、ウサギにおけ
る実験的自己免疫重症筋無力症に対して予防的および治療的な作用を有すること
が実証された（Ｌｅｖｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５００−５０
７（１９８３））。It is utilized both to study the role of the polypeptides, variants, derivatives and analogs of the present invention as suppressors of the immune response, and to determine effective dosages to do so. Another model system to obtain is experimental autoimmune myasthenia gravis (EAMG) in rabbits. EAMG is an autoimmune disease induced by immunization with purified acetylcholine receptor protein (AChR) and is considered a good model for the human disease myasthenia gravis. As further discussed above, galectin 1 has been demonstrated to have prophylactic and therapeutic effects on experimental autoimmune myasthenia gravis in rabbits (Levi et al., Eur. J. Immunol. 13). : 500-50
7 (1983)).
【０１７７】 本発明の化合物の所望の治療的または予防的な活性（例えば、免疫応答のサプ
レッサーとして）を決定するために用いられ得る当該分野で公知の他のモデルア
ッセイとしては、混合リンパ球反応アッセイにおけるＴ細胞増殖（同種異系移植
片拒絶について当該分野で受け入れられているモデル）および当該分野で公知の
マウス同種移植片モデルが挙げられるが、これらに限定されない。Other model assays known in the art that can be used to determine the desired therapeutic or prophylactic activity of a compound of the invention (eg, as a suppressor of an immune response) include mixed lymphocyte reactions. These include, but are not limited to, T cell proliferation in the assay (an art-recognized model for allograft rejection) and mouse allograft models known in the art.
【０１７８】 本発明のどのガレクチン１１ポリペプチド、フラグメント、改変体、誘導体お
よびアナログが、ガレクチン１１の機能的活性を示すかそしてこれらの化合物が
この活性を示す最適濃度を、慣用的に決定するために、本明細書中に記載される
かさもなければ当該分野で公知のアッセイが適用され得る。これらのアッセイは
、ガレクチン１１の機能的活性を増強する分子（アゴニスト）または抑制する分
子（アンタゴニスト）を同定するためにさらに利用され得る。To routinely determine which galectin-11 polypeptides, fragments, variants, derivatives and analogs of the invention exhibit the functional activity of galectin-11 and the optimal concentration at which these compounds exhibit this activity In addition, assays described herein or otherwise known in the art can be applied. These assays can be further utilized to identify molecules that enhance (agonists) or inhibit (antagonists) the functional activity of galectin-11.
【０１７９】 （エピトープ） 本発明は、以下を含むかあるいはこれらからなる、ポリペプチドを包含する：
配列番号２、２５、もしくは２７のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピト
ープ；ＡＴＣＣ受託番号２０９０５３に含まれるポリヌクレオチド配列によりコ
ードされるポリペプチド配列のエピトープ；あるいは配列番号１、２４、もしく
は２６の配列の相補体またはＡＴＣＣ受託番号２０９０５３に含まれる配列の相
補体に、上記に規定されるようなストリンジェントなハイブリダイズ条件もしく
はより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列のエピトープ。本
発明はさらに、以下を包含する：本発明のポリペプチド配列（例えば、配列番号
１、２４、または２６に開示される配列）のエピトープをコードするポリヌクレ
オチド配列；本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖の
ポリヌクレオチド配列；ならびにこの相補鎖に上記で規定されたストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件またはより低いストリンジェンシーのハイブリ
ダイゼーション条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド配列。Epitopes The invention encompasses polypeptides comprising or consisting of:
An epitope of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 25, or 27; an epitope of a polypeptide sequence encoded by the polynucleotide sequence contained in ATCC Accession No. 209053; A polynucleotide encoded by a polynucleotide that hybridizes to the complement or the complement of the sequence contained in ATCC Accession No. 209053 under stringent hybridization conditions or lower stringency hybridization conditions as defined above. Epitope of the peptide sequence. The invention further includes: a polynucleotide sequence encoding an epitope of a polypeptide sequence of the invention (eg, a sequence disclosed in SEQ ID NO: 1, 24, or 26); A polynucleotide sequence of the complement of the nucleotide sequence; and a polynucleotide sequence that hybridizes to the complementary strand under stringent hybridization conditions or lower stringency hybridization conditions as defined above.
【０１８０】 用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物、好ましくは哺
乳動物、そして最も好ましくはヒトにおいて、抗原性活性または免疫原性活性を
有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピ
トープを含むポリペプチド、ならびにこのポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを含む。「免疫原性エピトープ」は、本明細書で使用される場合、動物に
おいて抗体応答を誘発するタンパク質の一部分として定義され、当該分野で公知
の任意の方法（例えば、以下に記載された抗体生成のための方法）によって決定
される。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。用語「抗原性
エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、当該分野で周知の任意の方法
（例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような
、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一部として定義される
。免疫特異的な結合は、非特異的な結合を除外するが、必ずしも他の抗原との交
差反応性を除外する必要はない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性を必要
とはしない。The term “epitope” as used herein refers to a portion of a polypeptide that has antigenic or immunogenic activity in an animal, preferably a mammal, and most preferably a human. . In a preferred embodiment, the invention includes a polypeptide comprising an epitope, as well as a polynucleotide encoding the polypeptide. An "immunogenic epitope," as used herein, is defined as a portion of a protein that elicits an antibody response in an animal, and may be formed by any method known in the art (e.g., for the production of antibodies described below). Method). (See, eg, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
ScL USA 81: 3998-4002 (1983)). The term “antigenic epitope”, as used herein, refers to the antibody as determined by any method known in the art (eg, the immunoassays described herein). It is defined as a part of a protein that can immunospecifically bind to an antigen. Immunospecific binding excludes non-specific binding, but need not necessarily exclude cross-reactivity with other antigens. Antigenic epitopes do not necessarily require immunogenicity.
【０１８１】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の手段により生成され
得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）（米国特許第４，６３１，２１
１号にさらに記載される）を参照のこと）。[0181] Fragments that function as epitopes can be generated by any conventional means. (See, for example, Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82: 5131-5135 (1985) (U.S. Pat.
No. 1).
【０１８２】 従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、例え
ば、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む
）を惹起するために有用である。好ましい抗原性エピトープとしては、本明細書
中に開示される抗原性エピトープ、ならびにこれらの抗原性エピトープの２つ、
３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の任意の組み合わせが挙げられる。抗原性エ
ピトープは、免疫アッセイにおいて標的分子として使用され得る（例えば、Ｗｉ
ｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆ
ｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０〜６６６（１９８３）を参照のこと）。Accordingly, the antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are useful, for example, for raising antibodies (including monoclonal antibodies) that specifically bind to the polypeptides of the present invention. Preferred antigenic epitopes include the antigenic epitopes disclosed herein, as well as two of these antigenic epitopes,
Any combination of three, four, five or more. Antigenic epitopes can be used as target molecules in immunoassays (eg, Wi
lson et al., Cell 37: 767-778 (1984); Sutcliffe.
e, et al., Science 219: 660-666 (1983)).
【０１８３】 同様に、免疫原性のエピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に
従って抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（前出）；Ｗｉｌｓ
ｏｎら（前出）；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６
６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピト
ープは、本明細書で開示された免疫原性エピトープ、ならびにこれらの免疫原性
エピトープの２つ、３つ、４つ、５つ以上の任意の組み合わせを含む。１つ以上
の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、ア
ルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対する抗体応答を
惹起するために提示され得るか、または、そのポリペプチドが十分に長い場合で
は（少なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドはキャリアなしで提示され
得る。しかし、８〜１０個程度のわずかなアミノ酸を含む免疫原性エピトープが
、変性されたポリペプチドの直鎖エピトープに（少なくとも）結合し得る抗体を
惹起するのに十分であることが示されている（例えば、ウエスタンブロッティン
グにおいて）。[0183] Similarly, immunogenic epitopes can be used to elicit antibodies, for example, according to methods well known in the art. (See, eg, Sutcliffe et al., Supra); Wils.
on et al., supra; Chow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 910-914; and Bittle et al. Gen. Virol. 6
6: 2347-2354 (1985)). Preferred immunogenic epitopes include the immunogenic epitopes disclosed herein, as well as any combination of two, three, four, five or more of these immunogenic epitopes. A polypeptide comprising one or more immunogenic epitopes can be presented to elicit an antibody response against an animal system (eg, rabbit or mouse) with a carrier protein (eg, albumin), or the polypeptide can be If long enough (at least about 25 amino acids), the polypeptide can be presented without a carrier. However, immunogenic epitopes containing as few as 8 to 10 amino acids have been shown to be sufficient to raise antibodies capable of (at least) binding to the linear epitopes of the denatured polypeptide. (Eg, in Western blotting).
【０１８４】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは、
図１または６に示されるアミノ酸配列（配列番号２、２５、または２７）の少な
くとも７個、９個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個
、５０個、７５個、１００個、１１０個または１２０個連続するアミノ酸残基の
配列を含む。本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４
個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは、少な
くとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくと
も１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくと
も２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくと
も５０個、そして最も好ましくは、約１５〜約３０個のアミノ酸の配列を含む。
免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む好ましいポリペプチドは、長
さが少なくとも１０アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、２０アミノ酸残基、２５
アミノ酸残基、３０アミノ酸残基、３５アミノ酸残基、４０アミノ酸残基、４５
アミノ酸残基、５０アミノ酸残基、５５アミノ酸残基、６０アミノ酸残基、６５
アミノ酸残基、７０アミノ酸残基、７５アミノ酸残基、８０アミノ酸残基、８５
アミノ酸残基、９０アミノ酸残基、９５アミノ酸残基、または１００アミノ酸残
基である。非限定的なさらなる好ましい抗原性エピトープとしては、本明細書中
に開示される抗原性エピトープ、ならびにその部分が挙げられる。The antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are preferably
At least 7, 9, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 amino acid sequences (SEQ ID NO: 2, 25, or 27) shown in FIG. 1 or 6 , 75, 100, 110 or 120 consecutive amino acid residues. In the present invention, the antigenic epitope is preferably at least 4
, At least 5, at least 6, at least 7, more preferably at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, It comprises a sequence of at least 20, at least 25, at least 30, at least 40, at least 50, and most preferably from about 15 to about 30 amino acids.
Preferred polypeptides comprising an immunogenic or antigenic epitope are at least 10 amino acid residues, 15 amino acid residues, 20 amino acid residues, 25 amino acids in length.
Amino acid residue, 30 amino acid residue, 35 amino acid residue, 40 amino acid residue, 45
Amino acid residue, 50 amino acid residue, 55 amino acid residue, 60 amino acid residue, 65
Amino acid residue, 70 amino acid residue, 75 amino acid residue, 80 amino acid residue, 85
Amino acid residues, 90 amino acid residues, 95 amino acid residues, or 100 amino acid residues. Non-limiting additional preferred antigenic epitopes include the antigenic epitopes disclosed herein, as well as portions thereof.
【０１８５】 ガレクチン１１特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチド
またはペプチドの非限定的な例としては、図１（配列番号２）におけるアミノ酸
残基およそ６５〜７０を含むポリペプチドならびにアミノ酸残基およそ１１８〜
１２４を含むポリペプチドが挙げられる。上記に示されるように、本発明者らは
、上記のポリペプチドフラグメントがガレクチン１１タンパク質の抗原性領域で
あることを決定した。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to generate galectin 11-specific antibodies include polypeptides comprising about amino acid residues 65-70 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). And about 118-
124-containing polypeptides. As indicated above, the present inventors have determined that the above polypeptide fragment is an antigenic region of the galectin 11 protein.
【０１８６】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
より生成され得る。一般的には、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１〜５１３５（１９８５）を参
照のこと。この同時多重ペプチド合成（ＳＭＰＳ）プロセスは、さらに、Ｈｏｕ
ｇｈｔｅｎらに対する米国特許第４，６３１，２１１（１９８６）に記載されて
いる。[0186] The epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention can be produced by any conventional means. See generally, Houghten, R.A. A. Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985). This simultaneous multiple peptide synthesis (SMPS) process also provides for Hou
No. 4,631,211 (1986) to Ghten et al.
【０１８７】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得、この周知の方法としては、インビボ免疫、インビ
トロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されな
い。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およびＢｉ
ｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２３４７−２３５４（１９８５
）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドで免疫し得
る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリン
ペットヘモシアニン（ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）または破傷風トキソイ
ド）にそのペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システ
イン残基を含むペプチドが、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得、その
一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を
用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は
、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エ
マルジョン（約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質と、フロイント
アジュバントまたは免疫応答を刺激すると知られる任意の他のアジュバントとを
、含む）の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。数回のブース
ター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間
の間隔で、必要とされ得、この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプ
チドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清
中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知
の方法に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出によ
る）により上昇され得る。The epitope-bearing polypeptides of the present invention can be used to elicit antibodies according to methods well known in the art, including in vivo immunization, in vitro immunization, and phage display methods. , But not limited to them. See, for example, Sutcliffe et al., Supra; Wilson et al., Supra; and Bi.
ttle et al. Gen. Virol. , 66: 2347-2354 (1985).
)checking. When using in vivo immunization, animals can be immunized with the free peptide; however, anti-peptide antibody titers can be obtained by attaching the peptide to a macromolecular carrier (eg, keyhole limpet hemocyanin (KLH) or tetanus toxoid). It can be boosted by coupling. For example, a peptide containing a cysteine residue can be attached to a carrier using a linker such as maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), while other peptides have more common binding agents (eg, , Glutaraldehyde). Animals such as rabbits, rats, and mice can be used with either free peptide or carrier-bound peptide, for example, by adding an emulsion (about 100 μg of peptide or carrier protein with Freund's adjuvant or any known to stimulate an immune response). With other adjuvants) and / or intradermally. Several booster injections may be required, for example, at intervals of about two weeks, to provide useful titers of the anti-peptide antibody, such as free peptide adsorbed on a solid surface. Can be detected by an ELISA assay using The titer of the anti-peptide antibody in the serum from the immunized animal is determined by the choice of the anti-peptide antibody (eg, by adsorption to the peptide on a solid support and elution of the selected antibody according to methods well known in the art). Can be elevated.
【０１８８】 （抗体） 本発明のさらなるポリペプチドは、（特異的抗体−抗原結合をアッセイするた
めに当該分野で周知の免疫アッセイにより決定されるように）本発明のポリペプ
チド、ポリペプチドフラグメント、または配列番号２の改変体、および／または
エピトープに免疫特異的に結合する、抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ
）に関する。本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体
、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ
フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成
されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体
に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグ
メントが挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗体」は、本明細書中に
て使用される場合、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的
に活性な部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子
）をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例
えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例
えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）
またはサブクラスであり得る。(Antibodies) Additional polypeptides of the invention include polypeptides, polypeptide fragments, and polypeptides of the invention (as determined by immunoassays well known in the art for assaying specific antibody-antigen binding). Alternatively, antibodies and T cell antigen receptors (TCRs) that immunospecifically bind to a variant of SEQ ID NO: 2 and / or an epitope
). Antibodies of the present invention include polyclonal, monoclonal, multispecific, human, humanized or chimeric, single chain, Fab
Fragments, F (ab ') fragments, fragments produced by Fab expression libraries, anti-idiotype (anti-Id) antibodies (including, for example, anti-Id antibodies to the antibodies of the invention), and epitope binding of any of the above Fragments, including but not limited to fragments. The term "antibody," as used herein, refers to an immunoglobulin molecule, and an immunologically active portion of an immunoglobulin molecule (ie, a molecule that includes an antigen-binding site that immunospecifically binds to an antigen). ). The immunoglobulin molecules of the invention can be of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), class (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2).
Or a subclass.
【０１８９】 より好ましくは、これらの抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントで
あり、そして以下を含むがこれらに限定されない：Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（
ａｂ’）2、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合したＦ
ｖ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含むフ
ラグメント。抗原結合抗体フラグメント（単鎖抗体を含む）は、可変領域単独か
または以下のうちの全部または部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ
１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン。ヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの可変領域の任意の組み合わせも
また含む、抗原結合フラグメントもまた、本発明に含まれる。本発明の抗体は、
鳥類および哺乳動物類を含む、任意の動物起源に由来し得る。好ましくは、この
抗体は、ヒト、ネズミ（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ
、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。本明細書中で使用
される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体
を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーから単離されたかまたは１つ以
上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックの動物から単離され、そし
て上記および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９
，５９８号に記載されるような、内因性免疫グロブリンを発現しない、抗体を含
む。More preferably, these antibodies are human antigen-binding antibody fragments of the invention and include, but are not limited to, Fab, Fab 'and F (
ab ′) 2 , Fd, single-chain Fv (scFv), single-chain antibody, disulfide-bonded F
v (sdFv), and fragments containing either the VL or VH domains. Antigen binding antibody fragments (including single chain antibodies) may comprise the variable region alone or in combination with all or a portion of the following: hinge region, CH
One domain, CH2 domain, and CH3 domain. Antigen binding fragments that also include any combination of variable regions with the hinge, CH1, CH2, and CH3 domains are also included in the invention. The antibody of the present invention
It can be from any animal source, including birds and mammals. Preferably, the antibody is human, murine (eg, mouse and rat), donkey, sheep, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse, or chicken. As used herein, a "human" antibody includes an antibody having the amino acid sequence of a human immunoglobulin and is isolated from a human immunoglobulin library or transgenic for one or more human immunoglobulins. And from, for example, Kucherlapati et al., US Patent No. 5,939.
No. 598, which do not express endogenous immunoglobulins.
【０１９０】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる特異性
の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピト
ープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種のエ
ピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）の両方に特異的
であり得る。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９２／０８
８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４
，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，
５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍ
ｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。The antibodies of the present invention can be monospecific, bispecific, trispecific or more multispecific. Multispecific antibodies can be antibodies of different specificity for a polypeptide of the invention. Multispecific antibodies can be specific for different epitopes of a polypeptide of the invention, or can be specific for both a polypeptide of the invention and a heterologous epitope (eg, a heterologous polypeptide or a solid support material). Can be specific. For example, PCT publications WO 93/17715; WO 92/08
802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al.
J. Immunol. 147: 60-69 (1991); U.S. Patent No. 4,474.
No. 4,893, No. 4,714,681, No. 4,925,648, No. 5,
Nos. 573,920 and 5,601,819; Kostelny et al. Im
unol. 148: 1547-1553 (1992).
【０１９１】 本発明の抗体は、これらが認識するかまたは特異的に結合する本発明のポリペ
プチドのエピトープまたは部分に関して、記載または特定化され得る。このエピ
トープまたはポリペプチド部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、
連続するアミノ酸残基でのサイズによって、本明細書中に記載されるように、ま
たは表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の好ましいエピト
ープとしては、配列番号２のアミノ酸６５〜７０およびアミノ酸１１８〜１２４
、ならびにこれらのエピトープをコードするポリヌクレオチドが、挙げられる。
従って、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合し、そして本発明のポ
リペプチドの排除を可能にする、抗体を含む。The antibodies of the present invention can be described or specified in terms of the epitopes or portions of the polypeptides of the present invention that they recognize or specifically bind. The epitope or polypeptide portion may be, for example, by N-terminal and C-terminal positions.
It may be specified by size at consecutive amino acid residues, as described herein or as listed in the tables and figures. Preferred epitopes of the present invention include amino acids 65-70 and amino acids 118-124 of SEQ ID NO: 2.
And polynucleotides encoding these epitopes.
Accordingly, the present invention includes antibodies that specifically bind to a polypeptide of the present invention and allow for elimination of the polypeptide of the present invention.
【０１９２】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの他の任意のアナログ、オルソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドに結合する抗体もまた、
本発明に含まれる。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８
５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５
５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に
記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドに結合しない抗
体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、
本明細書中に開示された、任意の単一の特異的な抗原性または免疫原性ポリペプ
チド、あるいは２、３、４、５以上のそれら特異的抗原性および／または免疫原
生ポリペプチドの組み合わせに、関する。ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下（本明細書中で記載されるような）で本発明のポリヌクレオチドに
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに結合す
る抗体が、さらに本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチ
ドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化され得る。好ましい結
合親和性としては、５×１０-2Ｍ未満、１０-2Ｍ未満、５×１０-3Ｍ未満、１０ -3 Ｍ未満、５×１０-4Ｍ未満、１０-4Ｍ未満、５×１０-5Ｍ未満、１０-5Ｍ未満
、５×１０-6Ｍ未満、１０-6Ｍ未満、５×１０-7Ｍ未満、１０-7Ｍ未満、５×１
０-8Ｍ未満、１０-8Ｍ未満、５×１０-9Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ
未満、１０-10Ｍ未満、５×１０-11Ｍ未満、１０-11Ｍ未満、５×１０-12Ｍ未満
、１０-12Ｍ未満、５×１０-13Ｍ未満、１０-13Ｍ未満、５×１０-14Ｍ未満、１
０-14Ｍ未満、５×１０-15Ｍ未満または１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄ
を有する結合親和性が、挙げられる。The antibodies of the present invention may also be described or specified for their cross-reactivity. Book
Binds any other analog, ortholog or homolog of the polypeptide of the invention
No antibodies are included. At least 95% less than the polypeptide of the invention.
At least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 75%, less
At least 70%, at least 65%, at least 60%, at least 55% and
At least 50% identity (methods known in the art and as described herein)
Antibodies that bind to a polypeptide having
Included in the present invention. Less than 95%, less than 90%, 8 relative to the polypeptide of the invention
Less than 5%, less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, 5
Less than 5% and less than 50% identity (methods known in the art and as used herein)
Antibodies that do not bind to a polypeptide having (when calculated using the described method)
The body is also included in the present invention. In certain embodiments, the cross-reactivity is
Any single specific antigenic or immunogenic polypeptide disclosed herein
Or their specific antigenicity and / or immunogens of 2, 3, 4, 5 or more
It relates to combinations of raw polypeptides. Stringent hybridization
Under conditions (as described herein) to a polynucleotide of the invention.
Binds to the polypeptide encoded by the hybridizing polynucleotide
Antibodies are further included in the present invention. The antibody of the present invention may also be a polypeptide of the present invention.
Can be described or specified for their binding affinity to Favorable knot
5 × 10-2Less than M, 10-2Less than M, 5 × 10-3Less than M, 10 -3 Less than M, 5 × 10-FourLess than M, 10-FourLess than M, 5 × 10-FiveLess than M, 10-FiveLess than M
, 5 × 10-6Less than M, 10-6Less than M, 5 × 10-7Less than M, 10-7Less than M, 5 × 1
0-8Less than M, 10-8Less than M, 5 × 10-9Less than M, 10-9Less than M, 5 × 10-TenM
Less than 10-TenLess than M, 5 × 10-11Less than M, 10-11Less than M, 5 × 10-12Less than M
, 10-12Less than M, 5 × 10-13Less than M, 10-13Less than M, 5 × 10-14Less than M, 1
0-14Less than M, 5 × 10-15Less than M or 10-15A dissociation constant less than M or Kd
And a binding affinity having
【０１９３】 本発明はまた、競合的な結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（
例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、
本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好
ましい実施形態において、抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少な
くとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少な
くとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープに対する結合を競合的に阻
害する。The invention also relates to any method known in the art for determining competitive binding (
For example, as determined by the immunoassay described herein)
An antibody that competitively inhibits the binding of the antibody to the epitope of the present invention is provided. In preferred embodiments, the antibody competitively inhibits binding to the epitope by at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 75%, at least 70%, at least 60%, or at least 50%. .
【０１９４】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、レセプター／リガンドと本発明のポリペプ
チドとの相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好ま
しくは、本発明の抗体は、本明細書中に開示される抗原性のエピトープまたはそ
の部分に結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体
の両方を特徴とする。本発明はまた、リガンド結合を妨げないがレセプターの活
性化を妨げるレセプター特異的抗体を特徴とする。レセプターの活性化（すなわ
ち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載される技術、またはさもなくば当該分
野で公知の技術によって決定され得る。例えば、レセプターの活性化は、免疫沈
降、続いてウエスタンブロット分析（例えば、上記されたような）によって、レ
セプターのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）あるいはそ
の基質を検出することによって決定され得る。特定の実施形態において、抗体の
非存在下の活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少
なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、ま
たは少なくとも５０％リガンド活性またはレセプター活性を阻害する抗体を提供
する。The antibodies of the present invention can act as agonists or antagonists of the polypeptide of the present invention. For example, the invention includes antibodies that disrupt, either partially or completely, the interaction of the receptor / ligand with a polypeptide of the invention. Preferably, the antibodies of the present invention bind to an antigenic epitope disclosed herein or a portion thereof. The invention features both receptor-specific antibodies and ligand-specific antibodies. The invention also features receptor-specific antibodies that do not prevent ligand binding but prevent activation of the receptor. Receptor activation (ie, signal transduction) can be determined by techniques described herein, or otherwise known in the art. For example, receptor activation is determined by immunoprecipitation followed by Western blot analysis (eg, as described above) to detect receptor phosphorylation (eg, tyrosine or serine / threonine) or its substrate. obtain. In certain embodiments, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 75%, at least 70%, at least 60%, or at least 50% ligand activity or receptor in the absence of the antibody. Antibodies that inhibit activity are provided.
【０１９５】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプター−リガンド複合体を認識し、そして、好まし
くは、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識
しない抗体を特徴とする。同様に、本発明には、リガンドに結合し、そしてリガ
ンドのレセプターへの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それ
によってレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターに結合することは
妨げない抗体が含まれる。さらに本発明に含まれるのは、レセプターを活性化す
る抗体である。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわ
ち、リガンド媒介のレセプター活性化の生物学的活性のすべてまたはサブセット
（ｓｕｂｓｅｔ）のいずれかを増強または活性化し得る（例えば、レセプターの
二量体化を誘導することによる）。この抗体は、本明細書中に開示される本発明
のペプチドの特定の生物学的活性を含む生物学的活性に対するアゴニスト、アン
タゴニストまたはインバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）アゴニストとして特定化され得
る。上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例
えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄ
ｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅ
ｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）
；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（
１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２
１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０
−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２
）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら
、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９
９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９
９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７
（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０
（１９９６）（上記の文献はすべて、その全体が本明細書において参考として援
用される）を参照のこと。The present invention also recognizes receptor-specific antibodies that interfere with both ligand binding and receptor activation, and recognizes receptor-ligand complexes, and preferably recognizes unbound receptors or unbound ligands. Characterized by antibodies that do not specifically recognize. Similarly, the present invention includes neutralizing antibodies that bind to a ligand and prevent binding of the ligand to the receptor, as well as binding to the ligand, thereby preventing receptor activation, but preventing the ligand from binding to the receptor. Not including antibodies. Also included in the invention are antibodies that activate the receptor. These antibodies can act as receptor agonists, ie, enhance or activate any or all of the biological activities of ligand-mediated receptor activation (eg, receptor dimerization). By inducing). The antibody can be specified as an agonist, antagonist or inverse agonist for a biological activity, including a specific biological activity of the peptides of the invention disclosed herein. The above antibody agonists can be made using methods known in the art. See, for example, PCT Publication WO 96/40281; U.S. Pat. No. 5,811,097; D
eng et al., Blood 92 (6): 1981-1988 (1998); Che.
n et al., Cancer Res. 58 (16): 3668-3678 (1998)
Harrop et al., J .; Immunol. 161 (4): 1786-1794 (
1998); Zhu et al., Cancer Res: 58 (15): 3209-32.
14 (1998); Yoon et al. Immunol. 160 (7): 3170
-3179 (1998); Prat et al. Cell. Sci. 111 (Pt2
): 237-247 (1998); Pitard et al. Immunol. Me
methods 205 (2): 177-190 (1997); Liauard et al., Cytokine 9 (4): 233-241 (1997); Carlson
J. et al. Biol. Chem. 272 (17): 11295-11301 (19
97); Taryman et al., Neuron 14 (4): 755-762 (19
95); Muller et al., Structure 6 (9): 1153-1167.
(1998); Bartunek et al., Cytokine 8 (1): 14-20.
(1996), all of which are incorporated herein by reference in their entirety.
【０１９６】 本発明の抗体は、例えば、インビトロおよびインビボの両方における診断方法
および治療方法を含めて、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化する
のために使用され得るが、これに限定されない。例えば、この抗体は、生物学的
サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定す
るためのイムノアッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９
８８）（その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。The antibodies of the present invention can be used for, but not limited to, purifying, detecting and targeting polypeptides of the present invention, including, for example, both in vitro and in vivo diagnostic and therapeutic methods. Not done. For example, the antibodies have use in immunoassays for qualitatively and quantitatively measuring levels of a polypeptide of the invention in biological samples. See, for example, Harlow et al., An.
tibodies: A Laboratory Manual, (Cold S
spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, 19
88), which is hereby incorporated by reference in its entirety.
【０１９７】 以下により詳細が議論されるように、本発明の抗体は、単独で、または他の組
成物との組み合わせのいずれかで用いられ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端も
しくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプ
チドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）さ
れ得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子
およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または
毒素）に組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０
８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１
４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。As discussed in more detail below, the antibodies of the invention can be used either alone or in combination with other compositions. The antibody may further be recombinantly fused at the N-terminus or C-terminus to a heterologous polypeptide, or chemically conjugated (including covalent and non-covalent) to the polypeptide or other composition. . For example, the antibodies of the invention can be recombinantly fused or conjugated to molecules and effector molecules useful as labels in detection assays, such as heterologous polypeptides, drugs, radionuclides or toxins. For example, PCT publication WO92 / 0
8495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. Patent No. 5,31.
4,995; and EP 396,387.
【０１９８】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。The antibodies of the present invention may be modified (ie, covalently attached).
Attachment) includes derivatives (by covalent attachment of any type of molecule to the antibody) that do not prevent the antibody from producing an anti-idiotypic response. For example, without limitation, antibody derivatives include, for example, glycosylation, acetylation, pegylation, phosphorylation, and the like.
n), amidation, known protecting / blocking group
Antibodies that have been modified by derivatization, proteolytic cleavage, ligation to cellular ligands or other proteins, and the like. Numerous optional chemical modifications can be performed by known techniques, including but not limited to specific chemical cleavage, acetylation, formylation, metabolic synthesis of tunicamycin, and the like. Further, the derivative may contain one or more non-classical amino acids.
【０１９９】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバン
トが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そして
フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（
ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、
キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カ
ルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ
のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。こ
のようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。The antibodies of the present invention can be produced by any suitable method known in the art.
Polyclonal antibodies to an antigen of interest can be produced by various procedures well known in the art. For example, a polypeptide of the invention can be administered to a variety of host animals, including, but not limited to, rabbits, mice, rats, and the like, to induce the production of serum containing polyclonal antibodies specific for the antigen. . Various adjuvants can be used to increase the immunological response, depending on the host species, and mineral gels such as Freund (complete and incomplete), aluminum hydroxide (
mineral gel), surfactants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions,
Keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol, and BCG (bacilli Calmette-Guerin) and corynebacterium parvum
Including but not limited to potentially useful human adjuvants. Such adjuvants are also well-known in the art.
【０２００】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてその生成
される方法に由来する抗体ではない。[0200] Monoclonal antibodies can be prepared using a wide variety of techniques known in the art, including the use of hybridoma, recombinant, and phage display technologies, or a combination thereof. For example, monoclonal antibodies can be produced using the following hybridoma techniques known in the art and include, for example, Harr
low et al., Antibodies: A Laboratory Manual,
(Cold Spring Harbor Laboratory Press
Hammerling et al., Monoclonal An.
tibodies and T-Cell Hybridomas 563-6
81 (Elsevier, NY 1981), the above references being incorporated by reference in their entirety. As used herein, the term "monoclonal antibody" is not limited to antibodies produced through hybridoma technology. The term "monoclonal antibody" refers to an antibody derived from a single clone, including any eukaryotic, prokaryotic, or phage clone, and not the method derived from the method by which it was generated.
【０２０１】 ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例に詳細に議論される（例え
ば、実施例１６）。非限定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチ
ドまたはそのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応
用が検出される（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）
と、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の
技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株
ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択お
よびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチド
に結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッ
セイする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ
）が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫させることによって、
産生され得る。Methods for producing and screening for specific antibodies using hybridoma technology are routine and well known in the art, and are discussed in detail in the Examples (eg, Example 16). In a non-limiting example, a mouse can be immunized with a polypeptide of the invention or a cell expressing such a peptide. Once immune application is detected (eg, antigen-specific antibodies are detected in mouse serum)
The mouse spleen is collected and the spleen cells are isolated. The splenocytes are then fused by well known techniques to any suitable myeloma cells (eg, cells from cell line SP20 available from the ATCC). Hybridomas are selected and cloned by limiting dilution. Next, the hybridoma clones are assayed for cells secreting antibodies capable of binding the polypeptide of the invention by methods known in the art. Ascites fluid containing generally high levels of antibodies
) By immunizing mice with a positive hybridoma clone,
Can be produced.
【０２０２】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。Thus, the present invention provides a method of producing an antibody produced by a method comprising culturing a monoclonal antibody and a hybridoma cell secreting the antibody of the present invention, preferably The hybridoma is obtained by fusing myeloma cells with splenocytes isolated from a mouse immunized with the antigen of the present invention, and then hybridoma clones secreting antibodies capable of binding to the polypeptide of the present invention.
It is produced by screening hybridomas resulting from the fusion.
【０２０３】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。[0203] Antibody fragments that recognize a particular epitope can be generated by known techniques. For example, Fab and F (ab ') 2 fragments of the present invention comprise (Fa
It can be produced by proteolytic cleavage of immunoglobulin molecules using an enzyme such as papain (to produce the b-fragment) or pepsin (to produce the F (ab ') 2 fragment). The F (ab ') 2 fragment contains the variable region, the light chain constant region and the CH1 domain of the heavy chain.
【０２０４】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパー三量
体またはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から
発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合
する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され
得る（例えば、標識した抗体あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉さ
れた抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的に
は、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質
のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化され
たＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ド
メインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本
発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例として
は、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔ
ｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８
（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂ
ｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１
−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ
公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４
７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８
２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第
５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号
；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０
４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１
６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５
，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細
書中でその全体が参考として援用される）。For example, the antibodies of the present invention can also be produced using various phage display methods known in the art. In phage display methods, functional antibody domains are displayed on the surface of phage particles that carry the polynucleotide sequences that encode them. In certain embodiments, such phage can be utilized to display antigen binding domains expressed from a reper trimer or combinatorial antibody library (eg, human or mouse). Phage expressing an antigen binding domain that binds to the antigen of interest can be selected or identified using the antigen (eg, using a labeled antibody or antigen bound or captured to a solid surface or beads). The phage used in these methods is typically a phage having the antibody domain of a Fab, Fv or disulfide stabilized Fv recombinantly fused to either the phage gene III protein or the phage gene VIII protein. Filamentous phage containing fd and M13 binding domains expressed from. Examples of phage display methods that can be used to make the antibodies of the invention include the methods disclosed below: Brinkman et al. Immun
ol. Methods 182: 41-50 (1995); Ames et al. I
mmunol. Methods 184: 177-186 (1995); Ket.
treborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958
(1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); B
urton et al., Advances in Immunology 57: 191.
-280 (1994); PCT Application No. PCT / GB91 / 01134; PCT
Published WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/0104
7; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/1598
WO 95/20401; and U.S. Patent Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; and 5,427. No. 5,750,753; No. 5,821,0
No. 47; 5,571,698; 5,427,908; 5,51
No. 6,637; No. 5,780,225; No. 5,658,727; No. 5
Nos. 5,733,743 and 5,969,108, each of which is hereby incorporated by reference in its entirety.
【０２０５】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。As described in the above references, after phage selection, the regions encoding the phage-derived antibodies may be used to generate whole antibodies, including human antibodies, or any other desired antigen-binding fragment. Can be isolated and used, and can be expressed in any desired host, including, for example, mammalian cells, insect cells, plant cells, yeast and bacteria, as described in detail below. For example, techniques for recombinantly producing Fab, Fab ', and F (ab') 2 fragments can also be used using methods known in the art, and such methods are disclosed below. : PC
T-Publication WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechnique.
es 12 (6): 864-869 (1992); and Sawai et al., AJR.
I 34: 26-34 (1995); and Better et al., Science.
240: 1041-1043 (1998) (these references are incorporated by reference in their entirety).
【０２０６】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号
を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）
。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒ
ト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合
する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内
のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合を
変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残
基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によっ
て同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣ
ＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置に
おける異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば、
Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体が
参考として本明細書中に援用される）。）抗体は、以下を含む当該分野で公知の
種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９
，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３
９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリ
ング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎ
ｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（
１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９
１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉ
ｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。Examples of techniques that can be used to produce single-chain Fvs and antibodies include US Pat. Nos. 4,946,778 and 5,258,498; Huston.
Et al., Methods in Enzymology 203: 46-88 (19
91); Shu et al., PNAS 90: 7995-7999 (1993); and Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988). For some uses, including in vivo use of antibodies in humans and in vitro detection assays, the use of chimeric, humanized or human antibodies may be preferred. A chimeric antibody is a molecule in which different portions of the antibody are derived from different animal species (eg, an antibody having a variable region derived from a mouse monoclonal antibody and a human immunoglobulin constant region). Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. For example, Morris
on, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTec.
hniques 4: 214 (1986); Gillies et al., (1989) J.
. Immunol. Methods 125: 191-202; U.S. Pat.
Nos. 807,715; 4,816,567; and 4,816,397, which are incorporated herein by reference in their entirety.
. A humanized antibody is an antibody molecule from a non-human species antibody that binds to a desired antigen having one or more complementarity determining regions (CDRs) from a non-human species and framework regions from a human immunoglobulin molecule. . Often, framework residues within the human framework regions are replaced with corresponding residues from a CDR donor antibody to alter (preferably improve) antigen binding. These framework substitutions are identified by methods well known in the art, and include, for example, the use of Cs to identify framework residues important for antigen binding.
By modeling the interaction of DR and framework residues, and by sequence comparison to identify abnormal framework residues at specific positions. (For example,
Queen et al., U.S. Patent No. 5,585,089; Riechmann et al., Na.
332: 323 (1988), which are incorporated herein by reference in their entirety. ) Antibodies can be humanized using various techniques known in the art, including: CDR-grafting (EP 239).
PCT Publication WO 91/09967; US Patent No. 5,225,53.
9, No. 5,530,101 and 5,585,089), veneering or resurfacin.
g) (European Patents 592,106; 519,596; Padlan, M.
molecular Immunology 28 (4/5): 489-498 (
1991); Studnicka et al., Protein Engineerin.
g 7 (6): 805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 9
1: 969-973 (1994)), and chain shuffling (chai).
n shuffling) (U.S. Patent No. 5,565,332).
【０２０７】 完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、Ｗ
Ｏ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、お
よびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書
中に援用される）もまた参照のこと。[0207] Fully human antibodies are particularly desirable for therapeutic treatment of human patients. Human antibodies can be produced by various methods known in the art, including the phage display method described above using an antibody library derived from human immunoglobulin sequences. U.S. Pat. Nos. 4,444,887 and 4,716,111; and PCT Publication W
O 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, W
See also O 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, and WO 91/10741; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.
【０２０８】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を増殖させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次に、キメラマウスを、ヒト抗体
を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニック
マウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分）
を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハ
イブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る。
トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細
胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異を
受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体、
ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産生
するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉ
ｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。
ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびにそ
のような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、
ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９
６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，４
１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第
５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号
；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７
７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が本
明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒ
ｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のよ
うな企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗
体を提供することに従事し得る。[0208] Human antibodies can also be produced using transgenic mice, which are unable to express functional endogenous immunoglobulin, but are capable of expressing human immunoglobulin genes. For example, a complex of a human heavy chain immunoglobulin gene and a human light chain immunoglobulin gene can be introduced randomly or by homologous recombination into mouse embryonic stem cells. Alternatively, the human variable region, constant region, and diversity region (diversity)
region) can be introduced into mouse embryonic stem cells in addition to the human heavy and light chain genes. The mouse heavy and light immunoglobulin genes can be rendered non-functional separately or simultaneously with the introduction of a human immunoglobulin locus by homologous recombination. In particular, homozygous deletion of the JH region prevents endogenous antibody production. The modified embryonic stem cells are expanded and microinjected into blastocysts to produce chimeric mice. The chimeric mice are then bred to produce homozygous offspring that express human antibodies. The transgenic mouse is treated with a selected antigen (eg, all or a portion of a polypeptide of the invention).
For immunization in the usual manner. Monoclonal antibodies directed against the antigen can be obtained from the immunized transgenic mice using conventional hybridoma technology.
The human immunoglobulin transgenes retained in the transgenic mice rearrange during B cell differentiation, and subsequently undergo class switching and somatic mutation. Thus, by using such techniques, therapeutically useful IgG antibodies,
It is possible to produce IgA, IgM and IgE antibodies. For an overview of this technology for producing human antibodies, see Lonberg and Huszar, I.
nt. Rev .. Immunol. 13: 65-93 (1995).
For a detailed discussion of this technology for producing human and human monoclonal antibodies, as well as protocols for producing such antibodies, see, e.g.,
PCT Publication WO98 / 24893; WO92 / 01047; WO96 / 3409
6; WO 96/33735; EP 0 598 877; US Pat.
13,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,7
No. 71; and 5,939,598, which are incorporated herein by reference in their entirety. Further, Abgenix, Inc. (Fr
Companies such as EEmont, CA) and Genpharm, San Jose, CA can engage in providing human antibodies to selected antigens using techniques similar to those described above.
【０２０９】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。Human antibodies that fully recognize the selected epitope were identified as “guided (gui
ded) selection ". In this approach,
Selected non-human monoclonal antibodies (eg, mouse antibodies) are used to guide the selection of human antibodies that fully recognize the same epitope. (Jespers
Et al., Bio / technology 12: 899-903 (1988)).
【０２１０】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドの多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競
合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化ドメインおよび／または結合ド
メインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結
果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。
そのような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグ
メントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用
され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチド
に結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用
され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。In addition, antibodies to the polypeptides of the invention may in turn be utilized to generate anti-idiotype antibodies that "mimic" the polypeptides of the invention using techniques well known to those of skill in the art. (Eg, Greenspan and Bona, FASEB
J. 7 (5): 437-444; (1989) and Nissinoff, J.
. Immunol. 147 (8): 2429-2438 (1991). E.g., bind and multimerize polypeptides
) and / or antibodies that competitively inhibit the binding of the polypeptide of the invention to its ligand are used to produce anti-idiotypes that "mimic" the multimerization and / or binding domains of the polypeptide. And thus binds and neutralizes the polypeptide and / or its ligand.
Neutralization of such anti-idiotypes or Fab fragments of such anti-idiotypes can be used in therapeutic regimens to neutralize polypeptide ligand. For example, such anti-idiotype antibodies can be used to bind a polypeptide of the invention and / or to bind its ligand / receptor, thereby blocking its biological activity.
【０２１１】 本発明のポリペプチドおよびそれらのフラグメント、改変体、誘導体またはア
ナログ、あるいはそれらを発現する細胞はまた、本発明のガレクチン１１ポリペ
プチドに免疫特異的な抗体を産生するための免疫原として使用され得る。用語「
免疫特異的」は、抗体が、先行技術の他に関連したポリペプチドについてのそれ
らの親和性より、本発明のポリペプチドについて実質的に大きな親和性を有する
ことを意味する。The polypeptides of the invention and fragments, variants, derivatives or analogs thereof, or cells expressing them, also serve as immunogens for producing antibodies immunospecific for the galectin-11 polypeptides of the invention. Can be used. the term"
"Immunospecific" means that the antibodies have a substantially greater affinity for the polypeptides of the present invention than their affinity for other related polypeptides of the prior art.
【０２１２】 本明細書中で使用される用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」
（ｍＡｂ）は、抗原と結合し得るインタクトな分子およびそれらのフラグメント
（例えば、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）2フラグメント）を含むことを意味する
。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）2フラグメントは、循環からより迅速
に、インタクトな抗体のＦｃフラグメントに欠き、そしてインタクトな抗体のよ
り小さな非特異的組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２
４：３１６−３２５（１９８３））。As used herein, the term “antibody” (Ab) or “monoclonal antibody”
(MAb) is meant to include intact molecules and fragments thereof (eg, Fab and F (ab ′) 2 fragments) that can bind antigen. Fab, Fab ′, and F (ab ′) 2 fragments lack the Fc fragment of intact antibody more rapidly from the circulation and may have smaller non-specific tissue binding of the intact antibody (Wahl et al. J. Nucl.Med.2
4: 316-325 (1983)).
【０２１３】 本発明に従う抗体は、本発明のガレクチン１１免疫原を使用する種々の標準方
法のいずれかによって調製され得る。例えば、完全長ガレクチン１１ポリペプチ
ドに対して発生した抗体は、ポリペプチドまたはエピトープを保有するフラグメ
ント、改変体、誘導体、アナログ、または細胞を、哺乳動物（好ましくは、非ヒ
ト）に、慣用プロトコルを使用して、投与することによって得られ得る。モノク
ローナル抗体の調製のために、連続した細胞株培養物によって産生された抗体を
提供する任意の技術が使用され得る。例として、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ技術
、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔ
ｏｄａｙ ４：７２（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌ
ｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ
ＴＨＥＲＡＰＹ、７７−９６頁、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．，１９８５
）が挙げられる。さらに、単鎖抗体の産生のための技術（米国特許第４，９４６
，７７８号）はまた、本発明のポリペプチドに対して単鎖抗体を産生するように
適合され得る。さらに、トランスジェニックマウスまたは他の生物（他の哺乳動
物を含む）は、ヒト化抗体を発現するために使用され得る。[0213] Antibodies according to the present invention can be prepared by any of a variety of standard methods using the galectin-11 immunogens of the present invention. For example, antibodies raised against the full-length galectin-11 polypeptide can be used to convert fragments, variants, derivatives, analogs, or cells bearing the polypeptide or epitope into mammals (preferably, non-human) using conventional protocols. And can be obtained by administration. For preparation of monoclonal antibodies, any technique which provides antibodies produced by continuous cell line cultures can be used. As an example, the hybridoma technology (Kohl
er et al., Nature 256: 495-497 (1975)), trioma technology, human B cell hybridoma technology (Kozbor et al., Immunology T).
day 4:72 (1983)) and EBV-hybridoma technology (Col.
e, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER
THERAPY, pp. 77-96; Lis, Inc. , 1985
). In addition, techniques for the production of single chain antibodies (US Pat. No. 4,946,946)
, 778) can also be adapted to produce single-chain antibodies to the polypeptides of the invention. In addition, transgenic mice or other organisms, including other mammals, can be used to express humanized antibodies.
【０２１４】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチド配列の局在化および活性に関する当該
分野で公知の方法（例えば、これらのポリペプチドを画像化するための方法、適
切な生理学的サンプル中のそれらのレベルを測定するための方法など）に使用さ
れ得る。抗体はまた、ガレクチン１１のアゴニストおよびアンタゴニストとして
、イムノアッセイおよび治療の用途を有する。さらに、本発明の抗体は、ポリペ
プチドを発現するクローンを単離または同定するか、あるいはアフィニティーク
ロマトグラフィーによってポリペプチドを精製するために使用され得る。Antibodies of the present invention can be obtained by methods known in the art for localizing and activity of a polypeptide sequence of the present invention (eg, methods for imaging these polypeptides, in suitable physiological samples). Methods for measuring their level, etc.). Antibodies also have immunoassay and therapeutic uses as agonists and antagonists of galectin-11. Further, the antibodies of the invention can be used to isolate or identify clones expressing the polypeptide, or to purify the polypeptide by affinity chromatography.
【０２１５】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。(Polynucleotide encoding antibody) The present invention further provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the antibody of the present invention and a fragment thereof. The present invention also provides antibodies (preferably as specifically defined above) under stringent or lower stringency hybridization conditions (preferably, which specifically bind to a polypeptide of the present invention, preferably , An antibody that binds to a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2).
【０２１６】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が公知である場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学
的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ
ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよう
な）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする配
列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴ
ヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリゴ
ヌクレオチドの増幅。[0216] A polynucleotide can be obtained by any method known in the art, and the nucleotide sequence of the polynucleotide is determined. For example, if the nucleotide sequence of the antibody is known, the polynucleotide encoding the antibody can be constructed from chemically synthesized oligonucleotides (eg, Kutmeier).
Et al., BioTechniques 17: 242 (1994)), which briefly comprises the following steps: synthesis of overlapping oligonucleotides containing portions of the sequence encoding this antibody; Annealing and ligation of these oligonucleotides, followed by amplification of the ligated oligonucleotides by PCR.
【０２１７】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。Alternatively, a polynucleotide encoding an antibody can be produced from nucleic acid from a suitable source. If no clone is available containing the nucleic acid encoding the particular antibody, but the sequence of the antibody molecule is known, the nucleic acid encoding the immunoglobulin can be chemically synthesized or obtained from a suitable source ( For example, an antibody cDNA library, or a cDNA library generated from any tissue or cell that expresses the antibody (eg, a hybridoma cell selected for expression of an antibody of the invention), or a nucleic acid isolated therefrom (Preferably poly A + RNA)), for example, to identify a cDNA clone from a cDNA library encoding the antibody, using PCR amplification using synthetic primers capable of hybridizing to the 3 'and 5' ends of the sequence. Or use oligonucleotide probes specific for a particular gene sequence. It may be obtained by cloning. P
The amplified nucleic acid generated by the CR can then be cloned into a replicable cloning vector using any method known in the art.
【０２１８】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。Once the nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence of the antibody have been determined,
The nucleotide sequence of an antibody can be determined by methods known in the art for manipulating nucleotide sequences (eg, recombinant DNA technology, site-directed mutagenesis, PCR, etc. (eg,
Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, AL.
laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
And Ausubel et al., Eds. 1998, Current Protocols.
in Molecular Biology, John Wiley & Sons
, NY. These are both incorporated herein by reference in their entirety. )) Can be used to generate antibodies with different amino acid sequences to make, for example, amino acid substitutions, deletions, and / or insertions.
【０２１９】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。In certain embodiments, the amino acid sequences of the variable domains of the heavy and / or light chains are identified by methods well known in the art for identification of complementarity determining region (CDR) sequences (eg, sequences Other heavy chains, to determine the region of hypervariability,
And by comparing the variable region of the light chain with the known amino acid sequence). Using conventional recombinant DNA techniques, one or more CDRs can be inserted into a framework region as described above (eg, into a human framework region to humanize a non-human antibody). . The framework region can be naturally occurring or a consensus framework region, and can preferably be a human framework region (eg, for the listed human framework regions, see Chothia et al., J. Mol. Biol.278: 457-479 (1
998)). Preferably, the polynucleotide generated by the combination of the framework regions and the CDRs encodes an antibody that specifically binds a polypeptide of the invention. Preferably, as discussed above, one or more amino acid substitutions can be made within the framework regions, and preferably, the amino acid substitutions improve the binding of the antibody to its antigen. Further, such methods can produce antibody molecules that lack one or more intrachain disulfide bonds,
It can be used to make amino acid substitutions or deletions of cysteine residues in one or more of the variable regions involved in intrachain disulfide bonds. Other changes to polynucleotides are encompassed by the present invention and in the art.
【０２２０】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。Furthermore, by splicing genes from mouse antibody molecules of appropriate antigen specificity with genes from human antibody molecules of appropriate biological activity,
Techniques developed to produce "chimeric antibodies" (Morrison et al., Proc
. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855 (1984); Neub.
Erger et al., Nature 312: 604-608 (1984); Take.
Da et al., Nature 314: 452-454 (1985)). As noted above, a chimeric antibody is a molecule in which different portions are derived from different animal species, such molecules having variable regions derived from the constant regions of mouse mAbs and human immunoglobulins (eg, humanized antibodies). .
【０２２１】 あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。Alternatively, the techniques described for the production of single chain antibodies (US Pat. No. 4,946,946)
No. 778; Bird, Science 242: 423-42 (1988); H
Uston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 587
9-5883 (1988); and Ward et al., Nature 334: 544.
-54 (1989)) may be adapted for the production of single chain antibodies. Single chain antibodies are formed by linking the heavy and light chain fragments of the Fv region via an amino acid bridge, resulting in a single chain polypeptide. E. FIG. Techniques for the assembly of functional Fv fragments in E. coli can also be used (Sk
erra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)).
【０２２２】 （抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。Methods for Producing Antibodies The antibodies of the present invention can be produced by any method known in the art for synthesizing antibodies, particularly by chemical synthesis, or preferably, by recombinant expression techniques. obtain.
【０２２３】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。The antibodies of the present invention, or fragments, derivatives or analogs thereof (eg,
Recombinant expression of a heavy or light chain of an antibody of the invention or a single chain antibody of the invention) requires the construction of an expression vector containing a polynucleotide encoding the antibody. Once a polynucleotide encoding the antibody molecule or antibody heavy or light chain, or portions thereof, (preferably containing the heavy or light chain variable domains) of the invention is obtained, the production of the antibody molecule is Can be produced by recombinant DNA technology using techniques well known in the art. Accordingly, methods for preparing a protein by expression of a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding an antibody are described herein. Methods well known to those skilled in the art can be used for the construction of expression vectors containing antibody-encoding sequences and appropriate transcriptional and translational control signals. These methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination. Accordingly, the present invention provides a replicable vector comprising a nucleotide sequence encoding an antibody molecule of the present invention, or a heavy or light chain thereof, or a variable domain of a heavy or light chain, operably linked to a promoter. I will provide a.
Such vectors contain the constant region of the antibody molecule (eg, PCT Publication WO86 /
05807; PCT Publication WO 89/01036; and US Pat. No. 5,122.
, 464), and the variable domains of the antibody can be cloned into such a vector for expression of the entire heavy or light chain.
【０２２４】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞
中に同時発現され得る。The expression vector is transferred to a host cell by conventional techniques, and the transfected cells are then cultured by conventional techniques to produce an antibody of the present invention. Accordingly, the invention includes host cells comprising a polynucleotide encoding an antibody of the invention, or a heavy or light chain thereof, or a single chain antibody of the invention, operably linked to a heterologous promoter. In a preferred embodiment for expression of a double-chain antibody, the vector encoding both the heavy and light chains is co-expressed in a host cell for expression of the entire immunoglobulin molecule, as detailed below. Can be done.
【０２２５】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、抗体をコードする配列を含む組換えバ
クテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター
を用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転
換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体を
コードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス
）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー
モザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植
物細胞系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例
えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞の
ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）また
は哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プ
ロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築
物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ
３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組換え抗
体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用
される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモー
ターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの
卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系であ
る（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔ
ｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。[0225] A variety of host expression vector systems can be utilized to express the antibody molecules of the present invention. Such host expression systems represent vehicles in which the coding sequence of interest can be produced and subsequently purified, but also can be used in situ when transformed or transfected with sequences encoding the appropriate nucleotides. 1 represents a cell capable of expressing the antibody molecule of the invention. These include bacteria (eg, E. coli, B. subtilis) transformed with a recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA expression vector containing the sequence encoding the antibody.
Such as microorganisms; yeast transformed with a recombinant yeast expression vector containing a sequence encoding an antibody (eg, Saccharomyces, Pichia); and a recombinant virus expression vector containing a sequence encoding an antibody (eg, baculovirus). Infected insect cell lines; plant cell lines infected with a recombinant viral expression vector (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or a recombinant plasmid expression vector containing a sequence encoding an antibody (eg, a Ti plasmid ); Or a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, the metallothionein promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg, the adenovirus late promoter; A virus 7.5K promoter) mammalian cell systems harboring recombinant expression constructs containing (e.g., COS, CHO, BHK, 293,3T
3 cells). Preferably, Escheri
Bacterial cells such as chia coli, and more preferably, eukaryotic cells, particularly for the expression of whole recombinant antibody molecules, are used for expression of recombinant antibody molecules. For example, mammalian cells, such as Chinese hamster ovary cells (CHO), combined with vectors, such as the major intermediate early gene promoter element from human cytomegalovirus, are effective expression systems for antibodies. (Foecking et al., Gene 45: 101 (1986); Cocket
et al., Bio / Technology 8: 2 (1990)).
【０２２６】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、抗体をコードする配列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクター
にインフレームで個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ
．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１
７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａ
ｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３
−５５０９（１９８９））などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥ
Ｘベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タ
ンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に
、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリ
ックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グ
ルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクター
は、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、そ
の結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得
る。In bacterial systems, a number of expression vectors may be advantageously selected depending upon the use intended for the expression of the antibody molecule. For example, if large quantities of such a protein are to be produced, a vector that directs high-level expression of a fusion protein product that is easily purified may be desirable for the production of a pharmaceutical composition of the antibody molecule. In such a vector, the sequence encoding the antibody can be individually linked in frame with the vector along with the region encoding lacZ, resulting in the production of a fusion protein.
. coli expression vector pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2: 1).
791 (1983)); pIN vector (Inouye & Inouye, Nuc)
leic Acids Res. 13: 3101-3109 (1985); Va
n Heake & Schuster, J.A. Biol. Chem. 24: 5503
-5509 (1989)), but are not limited thereto. pGE
The X vector can also be used as a fusion protein with glutathione S-transferase (GST) to express foreign polypeptides. Generally, such fusion proteins are soluble and can be readily purified from lysed cells by adsorption and binding to matrix glutathione-agarose beads, followed by elution in the presence of free glutathione. The pGEX vector is designed to include a thrombin or factor Xa protease cleavage site so that the cloned target gene product can be released from the GST moiety.
【０２２７】 昆虫系において、オートグラファカリフォルニカ核多核体病ウイルス（Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒ
ｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、外来性遺伝子を発現させるためのベ
クターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉ
ｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。この抗体をコードする配列は、ウイルスの非必須
領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃ
ＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され
得る。In an insect system, Autographa californica nuclear polynucleosis virus (Aut)
ograph californica nuclear polyhedr
Osis virus (AcNPV) is used as a vector for expressing a foreign gene. The virus is Spodoptera frugi
Proliferate in perda cells. Sequences encoding this antibody can be individually cloned into non-essential regions of the virus, such as the polyhedrin gene, and Ac
It can be placed under the control of an NPV promoter (eg, a polyhedrin promoter).
【０２２８】 哺乳動物の宿主細胞において、多くのウイルスに基づいた発現系が利用され得
る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、抗体をコードする目
的の配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーター
および３部からなるリーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子
は、インビトロまたはインビボの組換えによって、アデノウイルスゲノム中に挿
入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）へ
の挿入は、感染した宿主において生存し、かつ抗体分子を発現し得る組換えウイ
ルスを生じる。（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特
定の開始シグナルもまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のた
めに必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配
列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入物全体の翻訳を保証するように、所
望のコード配列のリーディングフレームと同調（ｉｎ ｐｈａｓｅ）でなければ
ならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合
成の両方の種々の起源であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレ
メント、転写ターミネーターなどを含めることによって増大され得る（Ｂｉｔｔ
ｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１
９８７）を参照のこと）。In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems may be utilized. If an adenovirus is used as the expression vector, the sequence of interest encoding the antibody may be ligated to an adenovirus transcription / translation control complex (eg, the late promoter and tripartite leader sequence). This chimeric gene can then be inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion into a non-essential region of the viral genome (eg, region E1 or E3) results in a recombinant virus that survives in the infected host and can express the antibody molecule. (Eg, Logan & Shenk, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. ScL USA 81: 355-359 (1984)). Certain initiation signals may also be required for efficient translation of the inserted antibody-encoding sequence. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. In addition, this initiation codon must be in phase with the reading frame of the desired coding sequence to ensure translation of the entire insert. These exogenous translational control signals and initiation codons can be of various origins, both natural and synthetic. The efficiency of expression can be increased by including appropriate transcription enhancer elements, transcription terminators, etc. (Bitt
ner et al., Methods in Enzymol. 153: 51-544 (1
987)).
【０２２９】 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定
の様式に改変およびプロセスする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物
のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断
）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク
質産物および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変について特徴的かつ特
有の機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現した外来性タンパク質の
正確な改変およびプロセシングを保証するように選択され得る。この目的のため
に、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン
酸化のための細胞の機構を有する真核生物の宿主細胞が使用され得る。このよう
な哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、Ｍ
ＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および、特に、乳癌細胞株（例えば、ＢＴ
４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄなど）、ならびに正
常な乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなど）が挙げ
られるが、これらに限定されない。In addition, a host cell strain may be chosen which modulates the expression of the inserted sequences, or modifies and processes the gene product in the specific fashion desired. Such modifications (eg, glycosylation) and processing (eg, cleavage) of protein products may be important for the function of the protein. Different host cells have characteristic and unique mechanisms for the post-translational processing and modification of protein and gene products. Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the correct modification and processing of the foreign protein expressed. To this end, eukaryotic host cells that have the cellular machinery for proper processing of the primary transcript, glycosylation of the gene product, and phosphorylation can be used. Such mammalian host cells include CHO, VERY, BHK, Hela, COS, M
DCK, 293, 3T3, WI38, and especially breast cancer cell lines (eg, BT
483, Hs578T, HTB2, BT20 and T47D) and normal mammary gland cell lines (such as CRL7030 and Hs578Bst).
【０２３０】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生のためには、安定発現が好ましい。例
えば、安定に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を
含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（
例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニ
ル化部位、など）、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質
転換され得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化
培地で増殖させられ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミド
における選択可能マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞が、プラス
ミドをその染色体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、
これを今度はクローニングし得、細胞株に拡大され得ることを可能にする。この
方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。こ
のような操作された細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化
合物のスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression is preferred. For example, cell lines that stably express the antibody molecule can be engineered. Rather than using an expression vector that contains the viral origin of replication, the host cell may have appropriate expression control elements (such as
For example, promoters, enhancers, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.), and DNA controlled by selectable markers. Following the introduction of the foreign DNA, the engineered cells can be allowed to grow for 1-2 days in an enriched media, and are then switched to a selective media. The selectable marker on the recombinant plasmid confers resistance to selection, and the cell stably integrates the plasmid into its chromosome and proliferates to form cell foci,
This in turn allows it to be cloned and expanded into cell lines. This method can be advantageously used to engineer cell lines that express the antibody molecule. Such engineered cell lines may be particularly useful in screening and evaluating compounds that interact directly or indirectly with the antibody molecule.
【０２３１】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚ
ｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０
２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗ
ｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず、こ
れらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ
使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠として使
用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇ
ｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；
Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５
２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を与える（
Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８
に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−
５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９
１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉ
ｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄ
ｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９
３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５）；な
らびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅ
ｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の分野で
周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用され得、
そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（
編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇ
ｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１
９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐ
ｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）（これらはその全体が
本明細書中に参考として援用される）。A number of selection systems can be used, including herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., Cell 11: 223 (1977)), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Szybalska & Sz).
ybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:20
2 (1992)), and adenine phosphoribosyltransferase (Low)
y et al., Cell 22: 817 (1980)), which can be used in tk-, hgprt- or aprt- cells, respectively. Also, antimetabolite resistance can be used as a basis for selection of the following genes: dhfr, which confers resistance to methotrexate (Wig
ler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77: 357 (1980);
O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:15
27 (1981)); gpt, which confers resistance to mycophenolic acid (
Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78: 2072 (1981)); neo, which is an aminoglycoside G-418.
(Clinical Pharmacy 12: 488-
505; Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (199
1); Tolstoshev, Ann. Rev .. Pharmacol. Toxi
col. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science.
e 260: 926-932 (1993); and Morgan and And.
erson, Ann. Rev .. Biochem. 62: 191-217 (199
3); May 1993, TIB TECH 11 (5): 155-215); and hygro, which confers resistance to hygromycin (Sante)
rre et al., Gene 30: 147 (1984)). Methods well known in the art of recombinant DNA technology can be routinely applied to select a desired recombinant clone,
And such methods are described below: for example, Ausubel et al. (
Ed.), Current Protocols in Molecular Bi
, John Wiley & Sons, NY (1993); Krieg.
ler, Gene Transfer and Expression, AL
laboratory Manual, Stockton Press, NY (1
990); and chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (Eds.), Cur.
rent Protocols in Human Genetics, Joh
n Wiley & Sons, NY (1994); Colverre-Graph.
in et al. Mol. Biol. 150: 1 (1981), which are hereby incorporated by reference in their entirety.
【０２３２】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、第３巻（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと）。
抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主細胞の
培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子のコピ
ーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産生もま
た増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９
８３））。The expression level of an antibody molecule can be increased by vector amplification (for review, see
Bebbington and Hentschel, The use of ve
ctors based on gene amplification fo
r the expression of cloned genes in
mammarian cells in DNA cloning, vol. 3 (A
Cademic Press, New York, 1987).
If the marker in the vector system expressing the antibody is amplifiable, an increase in the level of inhibitor present in the culture of the host cell will increase the number of copies of the marker gene. Since the amplification region is linked to the antibody gene, production of the antibody also increases (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3: 257 (19
83)).
【０２３３】 宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）とともに、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖およ
び軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを
含み得る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方
のポリペプチドをコードし、そして発現することができる。このような状況にお
いて、過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべき
である（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏ
ｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（
１９８０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮ
Ａを含み得る。Host cells can be co-transfected with two expression vectors of the invention, a first vector encoding a polypeptide derived from the heavy chain and a second vector encoding a polypeptide derived from the light chain. . The two vectors may contain the same selectable marker that allows for equal expression of the heavy and light chain polypeptides. Alternatively, a single vector can be used, which can encode and express both heavy and light chain polypeptides. In such situations, the light chain should be placed before the heavy chain in order to avoid excessive toxic free heavy chains (Prodfoot, Nature 322: 52 (1986); Ko).
hler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197 (
1980)). The coding sequence for the heavy and light chains can be cDNA or genomic DN
A.
【０２３４】 一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対する親和性による）
、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタン
パク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。さらに、
本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかまたはそう
でなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され得、精製
を容易にする。Once an antibody molecule of the present invention is produced by an animal, chemically synthesized, or recombinantly expressed, any of the methods known in the art for the purification of immunoglobulin molecules are available. Methods, for example, chromatography (eg, ion exchange,
Affinity (especially due to affinity for specific antigens after protein A)
And size column chromatography), centrifugation, solubility differences, or any other standard technique for protein purification. further,
The antibodies of the invention or fragments thereof can be fused to a heterologous polypeptide sequence as described herein or otherwise known in the art, to facilitate purification.
【０２３５】 本発明は、本発明のポリペプチド（もしくはその部分、好ましくはこのポリペ
プチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
もしくは１００個のアミノ酸）に、組換えにより融合されるかまたは化学的に結
合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成す
る抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はなく、リンカー配列を介して
起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましくは
このポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８
０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例え
ば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを特
定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによって
、特定の細胞型に対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗体が使
用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた、インビ
トロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法において使用
され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／２１２
３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．
３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉ
ｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこと。これ
らは、その全体が参考として援用される。The present invention relates to a polypeptide of the invention (or a part thereof, preferably at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,
Or 100 amino acids), which are recombinantly fused or chemically linked (including both covalent and non-covalent bonds) to produce a fusion protein. This fusion need not be direct, but can occur via a linker sequence. The antibody may comprise a polypeptide of the invention (or a portion thereof, preferably at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 8 of the polypeptide).
(0, 90, or 100 amino acids). For example, by fusing or binding a polypeptide of the invention to an antibody specific for a particular cell surface receptor, either in vitro or in vivo, to target the polypeptide of the invention to a particular cell type Antibodies can be used to Antibodies fused or conjugated to the polypeptides of the present invention can also be used in in vitro immunoassays and purification methods using methods known in the art. See, for example, Harbor et al., Supra, and PCT Publication WO 93/212.
32; EP 439,095; Naramura et al., Immunol. Lett.
39: 91-99 (1994); U.S. Patent No. 5,474,981; Gilli.
es et al., PNAS 89: 1428-1432 (1992); Fell et al.
Immunol. 146: 2446-2452 (1991). These are incorporated by reference in their entirety.
【０２３６】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチ
ドに融合されたこの抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の
任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融
合または結合され、多量体を形成し得る。例えば、本発明のポリぺプチドに融合
されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成
し得る。より高度の多量体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に
融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合
または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特
許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４
６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２
，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９
６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考とし
て援用される）を参照のこと。The present invention further includes compositions comprising a polypeptide of the present invention fused or conjugated to a domain other than the variable region of the antibody. For example, a polypeptide of the invention can be fused or conjugated to the Fc region of an antibody, or a portion thereof. The portion of this antibody fused to the polypeptide of the invention comprises the constant region, hinge region, CH1 domain, C
It may include the H2 domain, and the CH3 domain, or any combination of all or part of the domain. These polypeptides can also be fused or conjugated to portions of the above antibodies to form multimers. For example, an Fc portion fused to a polypeptide of the invention can form a dimer through disulfide bonds between the Fc portions. Higher multimeric forms can be made by fusing the polypeptide to portions of IgA and IgM. Methods for fusing or binding the polypeptides of the present invention to an antibody moiety are known in the art. For example, U.S. Patent Nos. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,04.
No. 6, No. 5,349,053; No. 5,447, 851; No. 5,112
, No. 946; EP 307, 434; EP 367, 166; PCT Publication WO9
6/04388; WO91 / 06570; Ashkenazi et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10538 (1991)
); Zheng et al. Immunol. 154: 5590-5600 (199
5); and Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89
: 11337-11341 (1992), which is incorporated by reference in its entirety.
【０２３７】 上記で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または
配列番号２の変異体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ
半減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッ
セイにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合体化され得る。
さらに、配列番号２、２５、または２７に対応するポリぺプチドを、上記の抗体
部分に融合または結合体化させて、精製を容易にし得る。１つの報告された例は
、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロ
ブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質
を記載している（ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧ
に起因する）を有する抗体に融合または結合体化される本発明のポリぺプチドも
また、単量体分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分
子に結合しそして中和するのにさらに効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋ
ｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多
くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、
従って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２
，２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製され
た後に、Ｆｃ部分を欠失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫
化のための抗原として使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得
る。例えば、薬物の発見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩ
Ｌ−５のアンタゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセ
イの目的のためにＦｃ部分と融合されてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａ
ｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５
）を参照のこと）。As discussed above, the polypeptide corresponding to the polypeptide, polypeptide fragment, or variant of SEQ ID NO: 2 may be used to increase the in vivo half-life of the polypeptide, or The antibodies can be fused or conjugated to the antibody portions described above for use in immunological assays using methods known in the art.
In addition, a polypeptide corresponding to SEQ ID NO: 2, 25, or 27 may be fused or conjugated to the antibody portion described above to facilitate purification. One reported example describes a chimeric protein consisting of the first two domains of a human CD4 polypeptide and various domains of the constant regions of the heavy or light chains of a mammalian immunoglobulin (EP 394). , 827; Traunecker et al., Nature.
e 331: 84-86 (1988)). Disulfide-linked dimer structure (IgG
The polypeptides of the present invention, which are fused or conjugated to an antibody having (due to) are also more efficient at binding and neutralizing other molecules than monomeric secreted proteins or protein fragments alone. (Funtoulak)
is et al. Biochem. 270: 3958-3964 (1995)). Often, the Fc portion of the fusion protein is beneficial in therapy and diagnostics,
Thus, for example, it may result in improved pharmacokinetic properties (EP A 232
, 262). Alternatively, it may be desirable to delete the Fc portion after the fusion protein has been expressed, detected, and purified. For example, if the fusion protein is used as an antigen for immunization, the Fc portion can interfere with therapy and diagnosis. For example, in drug discovery, human proteins such as hIL-5
Fc portions have been fused for the purpose of high-throughput screening assays to identify antagonists of L-5 (Bennett et al., J. Mole.
color Recognition 8: 52-58 (1995); Joha
nson et al. Biol. Chem. 270: 9449-9471 (1995)
)checking).
【０２３８】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を
提供する。精製のために有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集
素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに
限定されない。Further, the antibodies or fragments thereof of the present invention can be fused to a marker sequence, such as a peptide that facilitates purification. In a preferred embodiment, the marker amino acid sequence is a hexa-histidine peptide, such as a pQE vector (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chats).
tags provided in worth, CA, 91311), and many of these marker amino acid sequences are commercially available. For example, Gentz et al., Proc.
. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), hexa-histidine provides for convenient purification of the fusion protein. Other peptide tags useful for purification include the “HA” tag corresponding to an epitope from the influenza hemagglutinin protein (Wilson et al., Ce.
11 37: 767 (1984)), and the "flag" tag.
【０２３９】 本発明は、診断剤または治療剤に結合体化される、抗体またはそのフラグメン
トをさらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジ
メン（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生また
は進行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能
な物質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては
、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、
種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金
属イオン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメン
ト）に対して直接的にか、または当該分野で公知の技術を使用する媒介物（例え
ば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して間接的にかのいずれかで、連結ま
たは結合体化され得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体
に結合体化され得る金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を
参照のこと。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが
挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチ
ンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベ
リフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン
、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコ
エリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発
光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げら
れ；ならびに、適切な放射性物質の例としては、放射性同位体（例えば、ヨウ素
（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（ 3 Ｈ）、インジウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネ
チウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ
）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フ
ッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ，177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166
Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）が挙げら
れる。The present invention relates to an antibody or fragment thereof, conjugated to a diagnostic or therapeutic agent.
Further included. Antibodies can be used, for example, in clinical testing procedures (eg,
As part of the development of tumors (to determine the efficacy of
Can be used diagnostically to monitor progress. Detection can detect antibodies
Can be facilitated by linking with other materials. Examples of detectable substances include
, Various enzymes, prosthetic groups, fluorescent substances, luminescent substances, bioluminescent substances, radioactive substances,
Positron emitting metal and non-radioactive paramagnetic gold using various positron emission tomography
Genus ions. The detectable substance is an antibody (or its fragment).
Media), either directly to the agent or using techniques known in the art.
Linking, either indirectly, via a linker known in the art, for example).
Or conjugated. For example, antibodies for use as diagnostics according to the present invention
No. 4,741,900 for metal ions that can be conjugated to
See also. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidase, alkaline
Phosphatase, β-galactosidase, or acetylcholinesterase
Examples of suitable prosthetic group complexes include streptavidin / bioti
And avidin / biotin; examples of suitable fluorescent materials include
Riferon, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine
, Dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phyco
Erythrin; examples of luminescent materials include luminol;
Examples of light substances include luciferase, luciferin and aequorin.
And examples of suitable radioactive materials include radioisotopes (eg, iodine
(131I,125I,one two ThreeI,121I), carbon (14C), sulfur (35S), tritium ( Three H), indium (115mIn,113mIn,112In,111In) and Techne
Titanium (99Tc,99mTc), thallium (201Ti), gallium (68Ga,67Ga
),palladium(103Pd), molybdenum (99Mo), xenon (133Xe)
(18F),153Sm,177Lu,159Gd,149Pm,140La,175Yb,166
Ho,90Y,47Sc,186Re,188Re,142Pr,105Rh,97Ru)
It is.
【０２４０】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合体化され得る。細
胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては
、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジン
Ｄ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔ
ｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌ
ｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン
ジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサン
トロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、
グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロー
ル、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げら
れる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプ
リン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５
−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例え
ば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラ
ン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファ
ミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニト
ール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジア
ミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダ
ウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例
えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラ
マイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、
ならびに抗有糸***剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含む
が、それらに限定されない。Further, the antibody or fragment thereof may be a therapeutic moiety (eg, a cytotoxin (eg, a cytostatic or cytocidal agent)), a therapeutic agent, or a radiometal ion (eg, an α-emitter (eg, 213Bi)). Etc.). Cytotoxic or cytotoxic agents include any agents that are harmful to cells. Examples include paclitaxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetin, mitomycin, etoposide, teniposide (t
enoposide), vincristine, vinblastine, colchicine (col)
chicin), doxorubicin, daunorubicin, dihydroxy anthracin dione, mitoxantrone, mitramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone,
Glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, and puromycin, and analogs or homologs thereof. Therapeutic agents include antimetabolites (e.g., methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, 5-fluorouracil decarbazine (5
-Fluorouracil decarbazine, alkylating agents (e.g., mechlorethamine, thioepa chlorambucil, melphalan, carmustine (BSNU) and lomustine (CCNU), cyclophosphamide (cyclothospamide), busulfan, myptominositol, dibromotositol, dibromotositol, dibromostomitol And cis-dichlorodiamineplatinum (II) (DDP) cisplatin), anthracyclines (eg, daunorubicin (formerly daunomycin) and doxorubicin), antibiotics (eg, dactinomycin (formerly actinomycin), bleomycin, mitramycin, And anthramycin (AMC)),
And anti-mitotic agents (eg, vincristine and vinblastine).
【０２４１】 本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス性薬剤
（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８
９９号を参照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参
照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２
３１０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジ
オスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリン
ホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「
ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳ
Ｆ」）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。The conjugates of the present invention can be used to modify a given biological response, and the therapeutic or drug moiety is not to be construed as limited to classical chemotherapeutic agents. For example, the drug moiety can be a protein or polypeptide having the desired biological activity. Such proteins include, for example, toxins (eg, abrin, ricin A, Pseudomonas exotoxin, or diphtheria toxin); proteins (eg,
Tumor necrosis factor, a-interferon, β-interferon, nerve growth factor,
Platelet-derived growth factor, tissue plasminogen activator, apoptotic agent (eg, TNF-α, TNF-β, AIM I (International Publication WO 97/338)
No. 99), AIM II (see WO 97/34911), Fas ligand (Takahashi et al., Int. Immunol).
. 6: 1567-1574 (1994)), VEGI (International Publication No. WO 99/2).
No. 3105)), thrombotic or anti-angiogenic agents (eg, angiostatin or endostatin); or biological response modifiers (eg, lymphokines, interleukin-1 (“IL-1”)) , Interleukin-2 ("
IL-2 "), interleukin-6 (" IL-6 "), granulocyte macrophage colony stimulating factor (" GM-CSF "), granulocyte colony stimulating factor (" G-CS
F "), or other growth factors).
【０２４２】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。Antibodies can also be attached to a solid support, which is particularly useful for immunoassays or purification of the target antigen. Such solid supports include, but are not limited to, glass, cellulose, polyacrylamide, nylon, polystyrene, polyvinyl chloride or polypropylene.
【０２４３】 このような治療部分を抗体に結合体化する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎ
ｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎ
ｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌ
ｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄ
ｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａ
ｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１
９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ
Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３
０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐ
ｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと
。Techniques for conjugating such therapeutic moieties to antibodies are well known and include, for example, Arn
on et al., Monoclonal Antibodies For Immun.
targeting Of Drugs In Cancer Therap
y "Monoclonal Antibodies And Cancer T
Herapy, Reisfeld et al. (eds.), pages 243-56 (Alan RL).
iss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies.
For Drug Delivery "Controlled Drug D
elivery (2nd edition), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Ma
rcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibo
dy Carriers Of Cytotoxic Agents In C
ancer Therapy: A Review ”Monoclonal An
tibodies'84: Biological And Clinical
Applications, Pinchera et al. (Eds.), Pages 475-506 (1
985); “Analysis, Results, And Future Pr.
Ospective Of The Therapeutic Use Of
Radiolabeled Antibody In Cancer Ther
apy "Monoclonal Antibodies For Cancer
Detection And Therapy, Baldwin et al. (Eds.), 3
03-16 (Academic Press 1985), and Thorp.
e, et al., "The Preparation And Cytotoxic Pr.
operations Of Antibody-Toxin Conjugate
s ", Immunol. Rev .. 62: 119-58 (1982).
【０２４４】 あるいは、抗体は第二の抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（
これは、その全体が本明細書に参考として援用される）においてＳｅｇａｌによ
り記載されるような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成
し得る。Alternatively, the antibody is conjugated to a second antibody and is described in US Pat. No. 4,676,980 (
This can form an antibody heteroconjugate as described by Segal in its entirety, which is incorporated herein by reference.
【０２４５】 単独、あるいは細胞傷害性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投
与される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬と
して使用され得る。Antibodies with or without a therapeutic moiety that binds to the antibody, administered alone or in combination with cytotoxic factors and / or cytokines, can be used as therapeutics.
【０２４６】 （免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対するモノクロナール抗体は、マーカーを発現する細
胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞
集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用され得、そ
してその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固
体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パニング」、な
らびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およ
びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこ
と）が挙げられる。Immunophenotyping The antibodies of the present invention can be utilized for immunophenotyping cell lines and biological samples. The translation products of the genes of the invention are useful as cell-specific markers or, more specifically, as cell markers that are differentially expressed at various stages of differentiation and / or maturation of a particular cell type. obtain. Monoclonal antibodies directed against specific epitopes, or combinations of epitopes, allow for the screening of cell populations expressing the marker. A variety of techniques can be employed with monoclonal antibodies to screen for cell populations that express the marker, including magnetic separation using magnetic beads coated with the antibody, solid matrices (ie, "Panning" using antibodies attached to plates), and flow cytometry (see, e.g., U.S. Patent No. 5,985,660; and Morrison et al., Cell, 96: 737-49 (1999)). Can be
【０２４７】 これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を受け得る、造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングを可
能にする。[0247] These techniques are useful for hematological malignancies (ie, minimal residual disease (MRD) in patients with acute leukemia).
And screening of specific populations of cells as can be found with "non-self" cells in transplantation to prevent graft versus host disease (GVHD). Alternatively, these techniques allow for the screening of hematopoietic stem and progenitor cells that can undergo proliferation and / or differentiation as can be found in human umbilical cord blood.
【０２４８】 （抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ
イ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテイン
Ａ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そ
して当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫ア
ッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図
されない）。Assays for Antibody Binding Antibodies of the invention can be assayed for immunospecific binding by any method known in the art. Immunoassays that can be used include Western blots, radioimmunoassays,
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), "sandwich" immunoassay, immunoprecipitation assay, sedimentation reaction, gel diffusion sedimentation reaction, immunodiffusion assay, agglutination assay, complement binding assay, immunoradiometric assay, fluorescent immunoassay, protein A Examples include, but are not limited to, competitive and non-competitive assay systems that use techniques such as immunoassays. Such assays are conventional and well known in the art (eg, Ausubel et al., Eds., 1994, Current Protocol, which is incorporated by reference herein in its entirety).
ls in Molecular Biology, Volume 1, John Wil
eye & Sons, Inc. , New York). Exemplary immunoassays are briefly described below (although these are not intended to be limiting).
【０２４９】 免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよ
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／ま
たはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以
上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およ
びＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体
が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により、
評価され得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そしてバック
グラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファロース
ビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、認識し得る。
免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。The immunoprecipitation protocol generally involves a RIPA buffer (1% NP-40 or Triton X-100, 1% NP-40 or Triton X-100, supplemented with a protein phosphatase inhibitor and / or a protease inhibitor (eg, EDTA, PMSF, aprotinin, sodium vanadate)). % Sodium deoxycholate, 0.1%
SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M sodium phosphate (pH 7.2)
) Lysing a population of cells in a lysis buffer such as 1% Trasylol, adding the antibody of interest to the cell lysate, and incubating at 4 ° C. for a certain period of time (eg, 1-4 hours). Adding protein A sepharose beads and / or protein G sepharose beads to the cell lysate, incubating at 4 ° C. for about 1 hour or more, washing the beads in lysis buffer, and SDS / sample buffer Resuspending the beads in the solution. The ability of the antibody of interest to immunoprecipitate a particular antigen, for example, by Western blot analysis,
Can be evaluated. One of skill in the art will be aware of parameters that can be modified to increase the binding of the antibody to the antigen and reduce the background (eg, pre-clearing cell lysate using Sepharose beads). obtain.
For further discussion on immunoprecipitation protocols, see, for example, Ausubel
Ed., 1994, Current Protocols in Molecul.
ar Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc. ,
See New York, 10.16.1.
【０２５０】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉
乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希
釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例
えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放
射性分子（例えば、32Ｐまたは125Ｉ）に結合体化された二次抗体（一次抗体を
認識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程、洗浄緩
衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を包含
する。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウ
ンドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認識し得る。
ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕ
ｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，
Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。Western blot analysis generally involves the steps of preparing a protein sample, a polyacrylamide gel (eg, 8% -20% SDS-depending on the molecular weight of the antigen).
Electrophoresis of the protein sample in PAGE), transferring the protein sample from the polyacrylamide gel to a membrane such as nitrocellulose, PVDF or nylon, a blocking solution (eg, PBS with 3% BSA or skim milk powder) Blocking the membrane in a washing buffer (eg, PB
Washing the membrane in S-Tween 20), blocking the membrane with a primary antibody (antibody of interest) diluted in blocking buffer, washing the membrane in washing buffer A secondary antibody (recognizing the primary antibody, eg, recognizing the primary antibody, conjugated to an enzyme substrate (eg, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase) or a radioactive molecule (eg, 32 P or 125 I) diluted in blocking buffer , Anti-human antibody), washing the membrane in a wash buffer, and detecting the presence of the antigen. One of skill in the art will be aware of parameters that can be modified to increase the signal detected and reduce background noise.
For further discussion on Western blot protocols, see, for example, Au
Ed. subel et al., 1994, Current Protocols in Mo.
Lectural Biology, Volume 1, John Wiley & Sons,
Inc. , New York, 10.8.1.
【０２５１】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
体化された目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートす
る工程、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて
、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検
出可能な化合物に結合体化された第二の抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェ
ルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体が
ウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合体化された
第二の抗体が、コーティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加
され得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラ
メータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関し
て、認識し得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。ELISA comprises preparing an antigen, coating the wells of a 96-well microtiter plate with the antigen, conjugate to a detectable compound such as an enzyme substrate (eg, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase). Adding the antibody of interest to the wells and incubating for a certain period of time, and detecting the presence of the antigen. In an ELISA, the antibody of interest need not be conjugated to the detectable compound; instead, a second antibody conjugated to the detectable compound (recognizing the antibody of interest) is added to the well. It can be added. Further, instead of coating the well with the antigen, the antibody can be coated on the well. In this case, a second antibody conjugated to a detectable compound can be added following addition of the antigen of interest to the coated wells. One skilled in the art will be aware of parameters that can be modified to increase the signal detected, and other variations of ELISAs known in the art. For further discussion on ELISA, see, for example, Aus
Edited by Ubel et al., 1994, Current Protocols in Mol.
ecology Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, I
nc. , New York, 11.2.1.
【０２５２】 抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、漸増量の
非標識抗原の存在下での、目的の抗体との標識された抗原（例えば、3Ｈまたは1 25 Ｉ）のインキュベーション、および標識抗原に結合された抗体の検出を含む。
特定の抗原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、スキャッチ
ャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はまた
、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の非
標識の第二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）に結合し
た目的の抗体とともにインキュベートされる。他の適切な放射性物質としては、
放射性同位体（例えば、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）
、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉ
ｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｉ
）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍ
ｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ，177Ｌｕ、159Ｇｄ、14 9 Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐ
ｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）が挙げられるが、これらに限定されない。The binding affinity of the antibody to the antigen and the off-rate of the antibody-antigen interaction (of
f-rate) can be determined by competitive binding assays. Competitive binding assays
One example is a radioimmunoassay, which is an increasing amount of radioimmunoassay.
In the presence of an unlabeled antigen, a labeled antigen with the antibody of interest (eg,ThreeH or1 twenty five I) Incubation and detection of antibody bound to labeled antigen.
The affinity of the antibody of interest for a particular antigen, and the binding off-rate,
Can be determined from data by Chard plot analysis. Competition with the second antibody is also
Can be determined using a radioimmunoassay. In this case, the antigen is used in increasing amounts of non-
In the presence of a labeled second antibody, a labeled compound (eg,ThreeH or125I)
And incubated with the desired antibody. Other suitable radioactive materials include:
Radioisotopes (eg, iodine (131I,125I,one two ThreeI,121I), carbon (14C)
,sulfur(35S), tritium (ThreeH), indium (115mIn,113mIn,112I
n,111In) and technetium (99Tc,99mTc), thallium (201Ti
),gallium(68Ga,67Ga), palladium (103Pd), molybdenum (99M
o), xenon (133Xe), fluorine (18F),153Sm,177Lu,159Gd,14 9 Pm,140La,175Yb,166Ho,90Y,47Sc,186Re,188Re,142P
r,105Rh,97Ru), but is not limited thereto.
【０２５３】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を
、１つ以上の開示された疾患、障害または状態を処置するために、動物、好まし
くは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。本発明
の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載するような、それらの
フラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコードす
る核酸（本明細書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび
誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活
性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載する疾患、障害、または
状態の任意の１つ以上を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予防
するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活
性と関連した疾患、障害または状態の処置、検出および／または予防としては、
これらの疾患、障害または状態と関連した症状を緩和することが挙げられるが、
これらに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知のように、または本明
細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物において提供され得る。Therapeutic Uses The present invention further relates to antibody-based therapies, wherein the antibodies are used to treat one or more of the disclosed diseases, disorders or conditions in animals, Preferably to a mammal, and most preferably to a human patient. Therapeutic compounds of the invention include antibodies of the invention (including fragments, analogs and derivatives thereof, as described herein) and nucleic acids encoding the antibodies of the invention (described herein). Including, but not limited to, fragments, analogs and derivatives thereof, and anti-idiotype antibodies). An antibody of the invention may comprise a disease, disorder or condition associated with aberrant expression and / or activity of a polypeptide of the invention (including any one or more of the diseases, disorders or conditions described herein). (Including but not limited to) treatment, inhibition or prevention. For treating, detecting and / or preventing a disease, disorder or condition associated with abnormal expression and / or activity of a polypeptide of the invention,
Relieve symptoms associated with these diseases, disorders or conditions,
It is not limited to these. The antibodies of the present invention may be provided in pharmaceutically acceptable compositions as known in the art or as described herein.
【０２５４】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の１つの要約は、身体内で局所的に
または全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクタ
ー細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これら
のアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供さ
れる教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタ
リングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわ
かる。One summary of how the antibodies of the present invention can be used therapeutically is to treat locally or systemically in the body, or (eg, by complement (CDC) or by effector cells (ADCC)). Due to the direct cytotoxicity of the antibody (as mediated)
And binding the polynucleotide or polypeptide of the invention. Some of these approaches are described in more detail below. Given the teachings provided herein, one of skill in the art would recognize, without undue experimentation, how to use the antibodies of the present invention for diagnostic, monitoring, or therapeutic purposes. Understand.
【０２５５】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。Antibodies of the present invention can be used, for example, to increase the number or activity of effector cells that interact with the antibody, other monoclonal or chimeric antibodies, or lymphokines or hematopoietic growth factors (eg, IL-2, IL-3 and IL
-7, etc.).
【０２５６】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。The antibodies of the invention can be administered alone or in combination with other types of treatment, such as radiation therapy, chemotherapy, hormonal therapy, immunotherapy and anti-tumor agents.
Generally, administration of a species-derived or species-reactive product that is the same species as the patient (in the case of antibodies) is preferred. Thus, in a preferred embodiment, a human antibody,
Fragment derivatives, analogs, or nucleic acids are administered to a human patient for treatment or prevention.
【０２５７】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本
発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または
強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、そのフラグメント、ま
たはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、また
は領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフ
ラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性としては、５
×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4Ｍ、５
×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５
×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、
５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０- 13 Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍより小さい
解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。The polynucleotides or polypeptides (including fragments thereof) of the present invention
This book is for both immunoassays related to
High affinity for the polypeptide or polynucleotide of the invention and / or
Strong, in vivo inhibitory and / or neutralizing antibodies, fragments thereof, or even
Alternatively, it is preferable to use that region. Such antibodies, fragments,
The region is preferably a polynucleotide or polypeptide of the invention (of which
(Including fragmentation). The preferred binding affinity is 5
× 10-2M, 10-2M, 5 × 10-3M, 10-3M, 5 × 10-FourM, 10-FourM, 5
× 10-FiveM, 10-FiveM, 5 × 10-6M, 10-6M, 5 × 10-7M, 10-7M, 5
× 10-8M, 10-8M, 5 × 10-9M, 10-9M, 5 × 10-TenM, 10-TenM,
5 × 10-11M, 10-11M, 5 × 10-12M, 10-12M, 5 × 10-13M, 10- 13 M, 5 × 10-14M, 10-14M, 5 × 10-15M, and 10-15Less than M
Dissociation constant or binding affinity with Kd.
【０２５８】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。Gene Therapy In certain embodiments, a nucleic acid comprising a sequence encoding an antibody or a functional derivative thereof treats a disease or disorder associated with aberrant expression and / or activity of a polypeptide of the invention. Administered for gene therapy purposes to inhibit or prevent. Gene therapy refers to therapy performed by the administration of an expressed or expressible nucleic acid to a subject. In this embodiment of the invention, the nucleic acids produce their encoded protein, which mediates a therapeutic effect.
【０２５９】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。[0259] Any of the methods for gene therapy available in the art can be used according to the present invention. An exemplary method is described below.
【０２６０】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；お
よびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。For a general review of methods for gene therapy, see Goldspiel et al., Cli.
natural Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstos.
hev, Ann. Rev .. Pharmacol. Toxicol. 32: 573
-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-.
932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann.
Rev .. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIB.
TECH 11 (5): 155-215 (1993). Methods generally known in the recombinant DNA art that can be used are Ausubel
Et al. (Ed.), Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Express.
ion, A Laboratory Manual, Stockton Pre
ss, NY (1990).
【０２６１】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核酸の染
色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；
Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの
核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラ
グメントを含む。In a preferred aspect, the compound contains a nucleic acid sequence encoding an antibody, wherein the nucleic acid sequence expresses the antibody, or a fragment or chimeric protein thereof, or a heavy or light chain thereof, in a suitable host. Part of. In particular, such nucleic acid sequences have a promoter operably linked to the antibody coding region, wherein the promoter is inducible or constitutive, and optionally tissue-specific. In another particular embodiment, a nucleic acid molecule is used in which the sequence encoding the antibody and any other desired sequences are flanked by regions that promote homologous recombination at the desired site in the genome, thus rendering the antibody Provides intrachromosomal expression of the encoding nucleic acid (Koller and Smithies, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989);
Zijlstra et al., Nature 342: 435-438 (1989)).
In certain embodiments, the expressed antibody molecule is a single-chain antibody; or the nucleic acid sequence comprises a sequence encoding both the heavy and light chains of the antibody or a fragment thereof.
【０２６２】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。Delivery of nucleic acid to a patient can be direct (where the patient is directly exposed to the nucleic acid or nucleic acid-bearing vector) or indirect (where the cells are first transduced with the nucleic acid in vitro). Converted and then implanted into the patient). These two approaches are known, respectively, as in vivo gene therapy or as ex vivo gene therapy.
【０２６３】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し
、そしてそれを細胞内になるように投与することにより（例えば、欠損性または
弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０
，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは、裸のＤＮＡの直接
注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌ
ｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセ
プターまたはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、あるいは、リ
ポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化により、あるいは
、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与することにより
、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合させて投与する
ことにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４
２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異的に発現する細
胞の型を標的にするために用いられ得る）など）のいずれかにより達成され得る
。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、リガン
ドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス性
ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする。さらに別の実施
形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすることにより、細胞特異
的な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る（例えば、ＰＣＴ公
開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；同第ＷＯ９２／２
０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２０２２１号を参照
のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得、そして相同組換えにより
、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉ
ｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２
−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５
−４３８（１９８９））。In certain embodiments, a nucleic acid sequence is administered directly in vivo, where the nucleic acid sequence is expressed to produce an encoded product. This can be accomplished by a number of methods known in the art, such as by constructing them as part of a suitable nucleic acid expression vector and administering it intracellularly (eg, defective or attenuated retroviruses). Viral or other viral vectors (US Pat. No. 4,980,980)
, 286), or by direct injection of naked DNA, or by microparticle bombardment (eg, a gene gun; Biol).
istic, Dupont), or by coating with lipids or cell surface receptors or transfectants, or by encapsulation in liposomes, microparticles, or microcapsules, or by allowing them to enter the nucleus. By administration in conjunction with a known peptide, and administration in conjunction with a ligand that undergoes receptor-mediated endocytosis (eg, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262: 44).
29-4432 (1987)), which can be used to target cell types that specifically express the receptor. In another embodiment, a nucleic acid-ligand complex may be formed, wherein the ligand comprises a fusogenic viral peptide that disrupts endosomes, such that the nucleic acid avoids lysosomal degradation. In yet another embodiment, nucleic acids can be targeted in vivo for cell-specific uptake and expression by targeting specific receptors (eg, PCT Publication Nos. WO92 / 06180; WO92 / No. 22635; WO92 / 2
No. 0316; WO 93/14188, WO 93/20221). Alternatively, the nucleic acid can be introduced inside the cell and integrated by homologous recombination into host cell DNA for expression (Koller and Smi).
thes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932.
-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435.
-438 (1989)).
【０２６４】 具体的な実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイル
スベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍ
ｉｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３
）を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正
確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成
要素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ
以上のベクター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の送達を容易に
する。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉ
ｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療
法に対してより耐性にするために、ｍｄｒＩ遺伝子を造血性幹細胞に送達するた
めの、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療
におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である
：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９
９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓ
ａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３
：１１０−１１４（１９９３）。In a specific embodiment, a viral vector comprising a nucleic acid sequence encoding an antibody of the invention is used. For example, a retroviral vector can be used (M
iller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)
)checking). These retroviral vectors contain the necessary components for correct packaging of the viral genome and correct integration into host cell DNA. Nucleic acid sequences encoding antibodies used in gene therapy are cloned into one or more vectors, which facilitates delivery of the gene into a patient. Further details on retroviral vectors can be found in Boesen et al., Bi.
Others, see 6: 291-302 (1994), which describes the use of retroviral vectors to deliver the mdrI gene to hematopoietic stem cells to make them more resistant to chemotherapy. Can be issued. Other references describing the use of retroviral vectors in gene therapy are: Clowes et al. Clin. Invest. 93: 644-651 (19
94); Kiem et al., Blood 83: 1467-1473 (1994);
almons and Gunzberg, Human Gene Therapy
4: 129-141 (1993); and Grossman and Wils.
on, Curr. Opin. in Genetics and Level. 3
: 110-114 (1993).
【０２６５】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮
細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非***細胞を感染することができ
るという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の概
説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０
（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイルスベ
クターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）
；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａ
ｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（
１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好まし
い実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。[0265] Adenoviruses are other viral vectors that can be used in gene therapy. Adenoviruses are particularly attractive vehicles for delivering genes to the respiratory epithelium. Adenoviruses naturally infect respiratory epithelia where they cause a mild disease. Other targets for adenovirus-based delivery systems are the liver, central nervous system, endothelial cells, and muscle. Adenovirus has the advantage that it can infect non-dividing cells. Kozarsky and Wilson, Current
Opinion in Genetics and Development
3: 499-503 (1993) provides an overview of adenovirus-based gene therapy. Bout et al., Human Gene Therapy 5: 3-10.
(1994) showed the use of adenovirus vectors to transfer genes to the airway epithelium of rhesus monkeys. Other examples of the use of adenovirus in gene therapy include
Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991).
Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (1992); Ma.
Strangeli et al. Clin. Invest. 91: 225-234 (
1993); PCT Publication No. WO 94/12649; and Wang et al., Gen.
e Therapy 2: 775-783 (1995). In a preferred embodiment, an adenovirus vector is used.
【０２６６】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。Adeno-associated virus (AAV) has also been proposed for use in gene therapy (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:
289-300 (1993); U.S. Patent No. 5,436,146).
【０２６７】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養物中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移
入の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入
された遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選択下に置かれる
。次いで、それらの細胞は患者に送達される。Another approach to gene therapy involves transferring the gene to cells in tissue culture by such methods as electroporation, lipofection, calcium phosphate mediated transfection, or viral infection. Usually, the method of transfer involves the transfer of a selectable marker to the cells. The cells are then placed under selection to isolate cells that take up and express the transferred gene. The cells are then delivered to the patient.
【０２６８】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、
そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないなら
ば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を
提供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好ま
しくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。In this embodiment, the nucleic acid is introduced into the cells prior to in vivo administration of the resulting recombinant cells. Such introduction can be performed by any method known in the art, including, but not limited to: transfection, electroporation, microinjection, viruses including nucleic acid sequences. Vector or bacteriophage vector infection, cell fusion, chromosome-mediated gene transfer, microcell-mediated gene transfer, spheroplast fusion, and the like. Numerous techniques are known in the art for introducing foreign genes into cells (eg, Loeffler and Behr, Met).
h. Enzymol. 217: 599-618 (1993); Cohen et al., M.
eth. Enzymol. 217: 618-644 (1993); Cline,
Pharmac. Ther. 29: 69-92m (1985)),
And if the necessary developmental and physiological functions of the recipient cells are not disrupted, they can be used in accordance with the present invention. The technique should provide for a stable transfer of the nucleic acid into the cell, so that the nucleic acid is expressible by the cell, and preferably is hereditary and expressible by the progeny of the cell.
【０２６９】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。[0269] The resulting recombinant cells can be delivered to a patient by various methods known in the art. Recombinant blood cells (eg, hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells) are preferably administered intravenously. The amount of cells contemplated for use depends on the desired effect, patient condition, etc., and can be determined by one skilled in the art.
【０２７０】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。Cells into which nucleic acids can be introduced for purposes of gene therapy include any desired available cell type, including but not limited to: epithelial cells, endothelial cells,
Keratinocytes, fibroblasts, muscle cells, hepatocytes; blood cells such as T lymphocytes, B lymphocytes, monocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, megakaryocytes, granulocytes; various stem or progenitor cells; In particular, hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitor cells (eg, cells obtained from bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood, fetal liver, etc.).
【０２７１】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。In a preferred embodiment, the cells used for gene therapy are autologous to the patient.
【０２７２】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる
。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞およ
び／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅ
ｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ
，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔ
ｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７
７１（１９８６）を参照のこと）。In embodiments where recombinant cells are used in gene therapy, the nucleic acid sequence encoding the antibody is introduced into the cell such that the nucleic acid sequence is expressible by the cell or its progeny, and then the recombinant cell is Administered in vivo for therapeutic effect. In a specific embodiment, stem cells or progenitor cells are used. Any stem and / or progenitor cells that can be isolated in vitro and maintained in vitro can potentially be used according to this embodiment of the invention (
For example, PCT Publication No. WO 94/08598: Temple and Ande
rson, Cell 71: 973-985 (1992); Rheinwald
, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980); and Pit
Telkow and Scott, Mayo Clinic Proc. 61: 7
71 (1986)).
【０２７３】 具体的な実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コー
ド領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の
発現は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能で
ある。治療活性または予防活性の証明。In a specific embodiment, the nucleic acid to be introduced for the purpose of gene therapy contains an inducible promoter operably linked to the coding region so that expression of the nucleic acid is properly transcriptionally induced. It can be controlled by controlling the presence or absence of the factor. Proof of therapeutic or prophylactic activity.
【０２７４】 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試
験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性
を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプル
に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対す
る化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセ
イおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決
定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定する
ために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイ
が挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そ
して化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サン
プルに対するそのような化合物の効果が観察される。The compounds or pharmaceutical compositions of the invention are preferably tested in vitro prior to use in humans, and then in vivo for the desired therapeutic or prophylactic activity. For example, in vitro assays to demonstrate the therapeutic or prophylactic utility of a compound or pharmaceutical composition include the effect of the compound on a cell line or patient tissue sample. The effect of a compound or composition on a cell line and / or tissue sample can be determined utilizing techniques known to those of skill in the art, including, but not limited to, rosette formation assays and cell lysis assays. In vitro assays that can be used to determine whether administration of a particular compound is indicated, according to the present invention, include in vitro cell culture assays, in which a patient tissue sample grows in culture, The compound is then exposed or otherwise administered, and the effect of such compound on the tissue sample is observed.
【０２７５】 （診断および予後） 特定の疾患（例えば、以下を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患：エリ
テマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、インスリン依存性糖尿病
、多発性硬化症（ＭＳ）、巨細胞性動脈炎、結節性多発性動脈炎、重症筋無力症
、強皮症、および対宿主性移植片病；移植拒絶；以下を含むがこれらに限定され
ない哺乳動物癌：黒色腫、腎臓星状細胞腫、ホジキン病、乳癌、卵巣癌、前立腺
癌、骨癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、および脾臓癌；炎症性疾患；喘息；ならびに
アレルギー性疾患）を有する哺乳動物における特定の組織は、対応する「標準的
な」哺乳動物（すなわち、その疾患を有さない同じ種の哺乳動物）と比較した場
合に、有意に変化（例えば、増大または減少）したレベルのガレクチン１１ポリ
ペプチドおよびガレクチン１１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現すると
考えられる。さらに、この障害を有さない同じ種の哺乳動物に由来する血清と比
較した場合に変化したレベルのガレクチン１１ポリペプチドが、その障害を有す
る哺乳動物由来の特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）において
検出され得ると考えられる。従って、本発明は、診断の間に有用な診断方法を提
供する。これは、哺乳動物の細胞または体液中のガレクチン１１ポリペプチドを
コードする遺伝子の発現レベルをアッセイすること、およびその遺伝子発現レベ
ルと標準的なガレクチン１１の遺伝子発現レベルとを比較することを含み、それ
によって、標準を上回る遺伝子発現レベルにおける増大または減少が、その疾患
の指標となる。Diagnosis and Prognosis Certain diseases such as, but not limited to, autoimmune diseases: lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis (MS) Giant cell arteritis, polyarteritis nodosa, myasthenia gravis, scleroderma, and graft-versus-host disease; transplant rejection; mammalian cancer, including but not limited to: melanoma, kidney Certain tissues in mammals with astrocytoma, Hodgkin's disease, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, bone cancer, liver cancer, lung cancer, pancreatic cancer, and spleen cancer; inflammatory disease; asthma; and allergic disease) Has significantly altered (eg, increased or decreased) levels of galectin when compared to a corresponding “standard” mammal (ie, a mammal of the same species without the disease). It believed to express the mRNA encoding the emissions 11 polypeptide and galectin 11 polypeptides. In addition, altered levels of galectin-11 polypeptide as compared to serum from a mammal of the same species without the disorder may result in altered levels of a specific bodily fluid from a mammal with the disorder (eg, serum, plasma, Urine, and cerebrospinal fluid). Thus, the present invention provides a useful diagnostic method during diagnosis. This includes assaying the expression level of a gene encoding a galectin-11 polypeptide in a mammalian cell or body fluid, and comparing the gene expression level to a standard galectin-11 gene expression level, Thereby, an increase or decrease in gene expression levels above the norm is indicative of the disease.
【０２７６】 診断が、通常の方法に従ってすでに行われていた場合、本発明は、予後指標物
として有用であり、それによって変化したガレクチン１１の遺伝子発現を示す患
者は、正常レベルでこの遺伝子を発現する患者と比較してより悪い臨床結果を経
験する。If the diagnosis had already been made according to the usual methods, the present invention is useful as a prognostic indicator, whereby patients with altered galectin-11 gene expression will express this gene at normal levels. Experience worse clinical results compared to patients who do.
【０２７７】 「ガレクチン１１ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルをアッセイす
ること」により、第一の生物学的サンプルにおけるガレクチン１１ポリペプチド
またはガレクチン１１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡレベルを、直接的（例
えば、絶対ポリペプチドレベルまたは絶対ｍＲＮＡレベルを測定するかまた見積
もることにより）または相対的（例えば、第二の生物学的サンプルにおけるガレ
クチン１１ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルと比較することにより）の
いずれかで、定性的または定量的に測定および評価することが意図される。By “assaying the level of expression of a gene encoding a galectin 11 polypeptide”, the level of galectin 11 polypeptide or mRNA encoding a galectin 11 polypeptide in a first biological sample can be directly (eg, Either by measuring or estimating absolute polypeptide or mRNA levels) or relative (eg, by comparing to galectin-11 polypeptide or mRNA levels in a second biological sample). It is intended to be measured and evaluated qualitatively or quantitatively.
【０２７８】 診断のための核酸は、被験体の生物学的サンプル（例えば、血液、尿、唾液、
組織生検、または剖検材料）から、当該分野で公知の技術を使用して得られ得る
。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用され得るか、またはＰＣＲもしくは他
の増幅技術を使用することによって分析の前に酵素的に増幅され得る。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡはまた、同様の様式で使用され得る。欠失および挿入は、正常な遺
伝子型と比較して変化した増幅産物のサイズによって検出され得る。点変異は、
増幅したＤＮＡを標識したガレクチン１１ヌクレオチド配列にハイブリダイズさ
せることによって同定され得る。完全にマッチした配列は、ＲＮａｓｅ消化によ
って、または融解温度の差異によって、ミスマッチ二重鎖から区別され得る。Ｄ
ＮＡ配列の差異また、ゲル（変性剤ありまたはなし）におけるＤＮＡフラグメン
トの電気泳動移動度における変化によって、または直接ＤＮＡ配列決定（例えば
、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０；１２４２（１９８５）を参照のこと
）によって検出され得る。特定の位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護ア
ッセイ（例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護）または化学切断方法によって明ら
かにされ得る（Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８５：４３９７−４４０１（１９８５）を参照のこと）。別の実施形態にお
いて、ガレクチン１１ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むオリ
ゴヌクレオチドプローブのアレイは、例えば、遺伝子変異の効率的なスクリーニ
ングを行うために構築され得る。アレイ技術方法は周知であり、そして一般的適
用可能性を有し、そして遺伝子発現、遺伝子連鎖、および遺伝子変異性を含む分
子遺伝学における種々の質問に取り組むために使用され得る（例えば、Ｃｈｅｅ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０−６１３（１９９６）を参照のこと） 診断用アッセイは、記載される方法によるガレクチン１１遺伝子における変異
の検出を通じて特定の疾患に対する感受性を診断または決定するためのプロセス
を、提供する。[0278] Nucleic acids for diagnosis may be obtained from a biological sample of a subject (eg, blood, urine, saliva,
Tissue biopsy, or autopsy material) using techniques known in the art. Genomic DNA can be used directly for detection, or can be amplified enzymatically prior to analysis by using PCR or other amplification techniques. RNA or cDNA can also be used in a similar manner. Deletions and insertions can be detected by an altered size of the amplified product as compared to the normal genotype. Point mutations are
It can be identified by hybridizing the amplified DNA to a labeled galectin 11 nucleotide sequence. Perfectly matched sequences can be distinguished from mismatched duplexes by RNase digestion or by differences in melting temperatures. D
NA sequence differences also by changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments in gels (with or without denaturing agents) or by direct DNA sequencing (see, eg, Myers et al., Science 230; 1242 (1985)). Can be detected. Sequence changes at specific positions may also be revealed by nuclease protection assays (eg, RNase and S1 protection) or chemical cleavage methods (Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US).
A 85: 4397-4401 (1985)). In another embodiment, an array of oligonucleotide probes comprising a galectin-11 polynucleotide sequence or a fragment thereof can be constructed, for example, to perform efficient screening for genetic mutations. Array technology methods are well known and have general applicability and can be used to address a variety of questions in molecular genetics, including gene expression, gene linkage, and gene variability (eg, Chee
Et al., Science 274: 610-613 (1996). Diagnostic assays provide a process for diagnosing or determining susceptibility to a particular disease through detection of mutations in the galectin-11 gene by the described method. I do.
【０２７９】 さらに、特定の疾患は、被験体から得られたサンプルから、ガレクチン１１ポ
リペプチドまたはｍＲＮＡの異常に減少したかまたは増加したレベルを決定する
工程を包含する方法によって診断され得る。減少したかまたは増加した発現は、
当該分野で周知の方法のいずれかを使用してＲＮＡレベルで測定され得る。これ
らの方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ノーザンブロッ
ト分析（Ｈａｒａｄａら、Ｃｅｌｌ ６３：３０３−３１２ （１９９０）、Ｓ
１ヌクレアーゼマッピング（Ｆｉｊｉｔａら、Ｃｅｌｌ ４９：３５７−３６７
（１９８７））、ＲＮＡｓｅ保護、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメ
ラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｍａｋｉｎｏら、Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅ ２：２９５−３０１ （１９９０））、リガーゼ連鎖反応と組
み合わせた逆転写ＲＴ−ＬＣＲ）、および他のハイブリダイゼーション方法。[0279] In addition, certain diseases can be diagnosed by methods comprising determining abnormally reduced or increased levels of galectin 11 polypeptide or mRNA from a sample obtained from a subject. Decreased or increased expression is
It can be measured at the RNA level using any of the methods well known in the art. These methods include, but are not limited to: Northern blot analysis (Harada et al., Cell 63: 303-312 (1990);
1 nuclease mapping (Fijita et al., Cell 49: 357- 367)
(1987)), RNAse protection, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription (RT-PCR) in combination with polymerase chain reaction (Makino et al., Te.
chnique 2: 295-301 (1990)), reverse transcription RT-LCR combined with ligase chain reaction), and other hybridization methods.
【０２８０】 生物学的サンプル中のガレクチン１１ポリペプチドレベルをアッセイする工程
は、当該分野で公知の技術のいずれかによってなされ得る。これらの技術として
は、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ラジオイムノアッセイ、競合結
合アッセイ、ウエスタンブロット分析、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）、ならびに他の抗体ベース技術。例えば、組織中のガレクチン１１ポリ
ペプチド発現は、古典的な免疫組織学的方法によって研究され得る（Ｊａｌｋａ
ｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １０１：９７６−９８５ （１９８５）
； Ｊａｌｋａｎｅｎ， Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １０５：３０８
７−３０９６ （１９８７））。Assaying galectin-11 polypeptide levels in a biological sample can be done by any of the techniques known in the art. These techniques include, but are not limited to: radioimmunoassays, competitive binding assays, western blot analysis, and enzyme-linked immunosorbent assays (EL
ISA), as well as other antibody-based technologies. For example, galectin-11 polypeptide expression in tissues can be studied by classical immunohistological methods (Jalka
Nen et al. Cell. Biol. 101: 976-185 (1985)
Jalkanen, M .; J. et al. Cell. Biol. 105: 308
7-3096 (1987)).
【０２８１】 適切な標識が当該分野で公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオ
キシダーゼ）、および放射性同位体（例えば、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、1 21 Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115m
Ｉｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ
）、タリウム（201Ｔｌ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ
）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、 177 Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186
Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）；発光標識（例えば、ルミノール
）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビ
オチンを含む。Suitable labels are known in the art, and enzyme labels (eg, glucose
Oxidase), and radioisotopes (eg, iodine (131I,125I,one two ThreeI,1 twenty one I), carbon (14C), sulfur (35S), tritium (ThreeH), indium (115m
In,113mIn,112In,111In) and technetium (99Tc,99mTc
),thallium(201Tl), gallium (68Ga,67Ga), palladium (103Pd
),molybdenum(99Mo), xenon (133Xe), fluorine (18F),153Sm, 177 Lu,159Gd,149Pm,140La,175Yb,166Ho,90Y,47Sc,186
Re,188Re,142Pr,105Rh,97Ru); a luminescent label (eg, luminol)
); And fluorescent labels (eg, fluorescein and rhodamine) and
Contains otine.
【０２８２】 従って、別の局面において、本発明は、疾患または疾患に対する感受性につい
ての診断用キットに関し、このキットは、以下を含む： （ａ）ガレクチン１１ポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号１、２４また
は２６のヌクレオチド配列またはそのフラグメント； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列； （ｃ）本発明のガレクチン１１ポリペプチド、好ましくは配列番号２、２５ま
たは２７のポリペプチドまたはそのフラグメント；あるいは （ｄ）本発明のガレクチン１１ポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番
号２、２５または２７のポリペプチドに対する抗体。Thus, in another aspect, the invention relates to a diagnostic kit for a disease or susceptibility to a disease, comprising: (a) a galectin 11 polynucleotide, preferably SEQ ID NO: 1, 24 Or (b) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a); (c) a galectin 11 polypeptide of the present invention, preferably a polypeptide of SEQ ID NO: 2, 25 or 27 or a fragment thereof. Or (d) an antibody against the galectin-11 polypeptide of the present invention, preferably an antibody against the polypeptide of SEQ ID NO: 2, 25 or 27.
【０２８３】 任意のこのようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は、
実質的な成分を含み得ることが理解される。In any such kit, (a), (b), (c) or (d) is
It is understood that it can include substantial components.
【０２８４】 従って、本発明はまた、障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法
は、個体由来の細胞または体液中の本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測
定する工程、および測定された遺伝子発現レベルをポリヌクレオチド発現レベル
の標準レベルと比較する工程を包含し、これによって、標準と比較して、遺伝子
発現レベルの増加または減少が、障害の指標になる。Thus, the present invention also provides a diagnostic method useful during the diagnosis of a disorder, comprising the step of measuring the expression level of a polynucleotide of the present invention in cells or body fluids from an individual; Comparing the measured gene expression level to a standard level of polynucleotide expression level, whereby an increase or decrease in gene expression level relative to the standard is indicative of the disorder.
【０２８５】 なお別の実施形態では、本発明は、サンプルを、試験被験体に由来する増殖性
および／または癌性のポリヌクレオチドの存在について分析するためのキットを
含む。一般的実施形態において、このキットは、本発明のポリヌクレオチドと特
異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレ
オチドプローブ、および適切な容器を備える。この特定の実施形態では、このキ
ットは、本発明のポリヌクレオチドの内部領域を規定する２つのポリヌクレオチ
ドプローブを含み、ここで各プローブは、この領域に対して内部に３１’マー末
端を含む１つの鎖を有する。さらなる実施形態では、このプローブは、ポリメラ
ーゼ連鎖反応増幅のためのプライマーとして有用であり得る。In yet another embodiment, the invention includes a kit for analyzing a sample for the presence of a proliferative and / or cancerous polynucleotide from a test subject. In a general embodiment, the kit comprises at least one polynucleotide probe comprising a nucleotide sequence that specifically hybridizes to a polynucleotide of the invention, and a suitable container. In this particular embodiment, the kit comprises two polynucleotide probes defining an internal region of a polynucleotide of the invention, wherein each probe contains a 31 'mer end internal to this region. With two chains. In a further embodiment, the probe may be useful as a primer for polymerase chain reaction amplification.
【０２８６】 障害の診断が既に従来方法に従って行われている場合、本発明は、予後インジ
ケーターとして有用であり、それによって増強または抑制された本発明のポリヌ
クレオチド発現を示す患者が、標準レベルにより近いレベルでこの遺伝子を発現
する患者と比較して悪い臨床結果を経験する。If the diagnosis of the disorder has already been made according to conventional methods, the present invention is useful as a prognostic indicator, whereby patients exhibiting enhanced or suppressed polynucleotide expression of the present invention are closer to standard levels Experience poor clinical results as compared to patients expressing this gene at the level.
【０２８７】 「本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する（こと）」によって、本
発明のポリペプチドのレベルまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
のレベルを、第１の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対的なタンパ
ク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相
対的（例えば、第２の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡ
レベルに対して比較することによって）のいずれかで定性的または定量的に測定
または評価することが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のポ
リペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準のポ
リペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、障害を
有さない個体から得られる第２の生物学的サンプルから得られるかまたは障害を
有さない個体の集団由来のレベルを平均することによって決定される。当該分野
で認識されるように、一旦標準的なポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが
公知になれば、これは、比較のための標準として反復して用いられ得る。[0287] By "measuring (expressing) the expression level of the polynucleotide of the present invention", the level of the polypeptide of the present invention or mRNA encoding the polypeptide of the present invention is determined.
Can be determined directly (eg, by determining or assessing absolute protein or mRNA levels) or relative (eg, polypeptides in a second biological sample) in a first biological sample. Level or mRNA
Qualitatively or quantitatively, either by comparison to a level). Preferably, the polypeptide or mRNA level in the first biological sample is measured or evaluated and compared to a standard polypeptide or mRNA level, wherein the standard is obtained from an individual without a disorder. Determined by averaging levels obtained from a second biological sample obtained or from a population of individuals without the disorder. As will be recognized in the art, once a standard polypeptide or mRNA level is known, it can be used repeatedly as a standard for comparison.
【０２８８】 「生物学的サンプル」によって、本発明のポリペプチドまたはｍＲＮＡを含む
、個体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られる任意の生物学
的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、本発明のポリ
ペプチドを含む体液（例えば、***、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液
）、および本発明のポリペプチドを発現することが見出された組織供給源を含む
。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知である
。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。By “biological sample” is intended any biological sample obtained from an individual, a body fluid, a cell line, a tissue culture or other source, comprising a polypeptide or mRNA of the present invention. As shown, biological samples may express body fluids (eg, semen, lymph, serum, plasma, urine, synovial fluid and cerebrospinal fluid) containing polypeptides of the invention, and polypeptides of the invention. Includes tissue sources found. Methods for obtaining tissue biopsies and body fluids from mammals are well known in the art. If the biological sample contains mRNA, a tissue biopsy is the preferred source.
【０２８９】 上記で提供された方法は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドおよび／ま
たはポリペプチドが固体支持体に結合される、診断方法および／またはキットに
適用され得る。１つの例示的な方法では、この支持体は、米国特許第５，８３７
，８３２号、同第５，８７４，２１９号および同第５，８５６，１７４号に記載
されるように、「遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であり得る。さらに
、本発明のポリヌクレオチドが結合されたこのような遺伝子チップを用いて、本
発明の単離されたポリヌクレオチド配列と、試験被験体から単離されたポリヌク
レオチドとの間の多型性を同定し得る。このような多型性の知見（すなわち、そ
れらの位置ならびにそれらの存在）は、多くの障害（癌性疾患および状態を含む
）についての疾患の遺伝子座を同定する際に有益である。このような方法は、米
国特許第５，８５８，６５９号および同第５，８５６，１０４号に記載される。
上記に参照した米国特許は、その全体が本明細書中に参考として援用される。The methods provided above can preferably be applied to diagnostic methods and / or kits where the polynucleotides and / or polypeptides of the invention are bound to a solid support. In one exemplary method, the support is provided in US Pat. No. 5,837.
, 832, 5,874,219 and 5,856,174, which can be "gene chips" or "biological chips." Further, using such a gene chip to which the polynucleotide of the present invention is bound, polymorphism between the isolated polynucleotide sequence of the present invention and a polynucleotide isolated from a test subject can be determined. Can be identified. The knowledge of such polymorphisms (ie, their location and their presence) is useful in identifying disease loci for many disorders, including cancerous diseases and conditions. Such methods are described in U.S. Patent Nos. 5,858,659 and 5,856,104.
The U.S. patents referred to above are incorporated herein by reference in their entirety.
【０２９０】 （ガレクチン１１のアゴニストまたはアンタゴニストについてのスクリーニン
グアッセイ） ガレクチン１１の発現における異常性は、多くの生物学的機能（多くの病理を
含む）を担う。従って、ガレクチン１１の活性を増強する、あるいはガレクチン
１１の活性を抑制する化合物および薬物を見出すことが所望される。本発明はま
た、化合物をスクリーニングしてガレクチン１１の活性を増強または抑制するも
のを同定する方法を提供する。アゴニストは、ガレクチン１１の天然の生物学的
機能を増加させるか、またはガレクチン１１に類似の様式で機能する化合物であ
り、一方、アンタゴニストは、このような機能を減少または排除する。Screening Assays for Galectin 11 Agonists or Antagonists Abnormalities in the expression of galectin 11 are responsible for many biological functions, including many pathologies. Therefore, it is desirable to find compounds and drugs that enhance the activity of galectin 11 or suppress the activity of galectin 11. The present invention also provides a method of screening compounds to identify those that enhance or suppress the activity of galectin-11. Agonists are compounds that increase the natural biological function of galectin 11 or that function in a manner similar to galectin 11, while antagonists reduce or eliminate such function.
【０２９１】 従って、本発明の実施形態は、本発明のガレクチン１１ポリペプチドと相互作
用する（例えば、結合する）化合物、ガレクチン１１とその同属リガンドとの相
互作用を妨害または増強する化合物を同定するように設計されたアッセイ、なら
びにガレクチン１１遺伝子を調節する（すなわち、ガレクチン１１の遺伝子発現
のレベルを調節する）か、またはガレクチン１１の機能的もしくは生物学的活性
のレベルを調節する化合物に関する。アッセイはまた、ガレクチン１１遺伝子調
節配列（例えば、プロモーター配列）を結合する化合物、およびガレクチン１１
の遺伝子発現を調節し得る化合物を同定するために使用され得る。例えば、Ｐｌ
ａｔｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２８５５８−２８５６２（１９９４
）（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される）を参照の
こと。Accordingly, embodiments of the present invention identify compounds that interact with (eg, bind to) a galectin-11 polypeptide of the invention, and compounds that interfere with or enhance the interaction of galectin-11 with its cognate ligand. As well as compounds that modulate the galectin 11 gene (ie, modulate the level of galectin 11 gene expression) or modulate the level of galectin 11 functional or biological activity. The assay also includes compounds that bind a galectin-11 gene regulatory sequence (eg, a promoter sequence), and a galectin-11 gene.
Can be used to identify compounds that can modulate the gene expression of a. For example, Pl
att, J.A. Biol. Chem. 269: 28558-28562 (1994)
), Which is incorporated by reference herein in its entirety.
【０２９２】 従って、本発明のポリペプチドは、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブ
ラリー、および天然物の混合物中での、低分子基質とリガンドの結合を評価する
ために使用され得る。これらの基質およびリガンドは、天然の基質およびリガン
ドであり得るか、または構造的もしくは機能的模倣物であり得る。Ｃｏｌｉｇａ
ｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １
（２）：第５章（１９９１）を参照のこと。スクリーニングされ得るさらなる化
合物の例には、ペプチド（例えば、ランダムペプチドライブラリー（例えば、Ｌ
ａｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６（１９９１）を参照のこと）、およ
びコンビナトリアルケミストリーに由来する、Ｄ型アミノ酸およびＬ型アミノ酸
からなる分子ライブラリー；ホスホペプチド（ランダム指向性ホスホペプチドラ
イブラリーまたは部分的縮重指向性ペプチドライブラリーのメンバー（例えば、
Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８（１９９３）を参照のこ
と）を含むがそれらに限定されない）；抗体（モノクローナル抗体、ヒト化抗体
、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、または単鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（
ａｂ’）２、およびＦＡＢ発現ライブラリーフラグメント、ならびにそのエピト
ープ結合フラグメントを含むがそれらに限定されない）；ならびに小さな有機分
子または無機分子において見出されるペプチドが含まれるがこれらに限定されな
い可溶性ペプチド）が含まれるがこれらに限定されない。Thus, the polypeptides of the present invention can be used to evaluate the binding of a small substrate to a ligand, for example, in a mixture of cells, cell-free preparations, chemical libraries, and natural products. These substrates and ligands can be natural substrates and ligands or can be structural or functional mimetics. Coliga
n et al., Current Protocols in Immunology 1
(2): See Chapter 5 (1991). Examples of additional compounds that can be screened include peptides (eg, random peptide libraries (eg, L
Am et al., Nature 354: 84-86 (1991)), and molecular libraries consisting of D- and L-amino acids from combinatorial chemistry; phosphopeptides (random-directed phosphopeptide libraries or parts). Members of a highly degenerate directional peptide library (eg,
(Including, but not limited to, Songyang et al., Cell 72: 767-778 (1993)); antibodies (monoclonal, humanized, anti-idiotype, chimeric, or single-chain antibodies, and Fabs). , F (
ab ') 2, and FAB expression library fragments, including, but not limited to, epitope-binding fragments thereof; and soluble peptides, including but not limited to peptides found in small organic or inorganic molecules). But not limited to these.
【０２９３】 多くの実験方法が、本発明のガレクチン１１ポリペプチドを結合させ、それに
よってガレクチン１１発現または活性を調節する化合物を、選択および検出する
ために使用され得る。それらの方法には、タンパク質アフィニティークロマトグ
ラフィー、アフィニティーブロッティング、免疫沈降、架橋、およびライブラリ
ーに基づく方法（例えば、タンパク質プロービング、ファージディスプレイ、ツ
ーハイブリッド系（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４
５−２４６（１９８９））、ならびにツーハイブリッド系の改変されたバージョ
ン（Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ ７５：７９１−８０３（１９９３）；Ｚｅｒｖ
ｏｓら、Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２（１９９３）））が含まれるがこれら
に限定されない。一般的には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。A number of experimental methods can be used to select and detect compounds that bind a galectin-11 polypeptide of the invention and thereby modulate galectin-11 expression or activity. These methods include protein affinity chromatography, affinity blotting, immunoprecipitation, cross-linking, and library-based methods (eg, protein probing, phage display, two-hybrid systems (Fields and Song, Nature 340: 24).
5-246 (1989)), as well as a modified version of the two-hybrid system (Gyuris et al., Cell 75: 791-803 (1993); Zerv).
os et al., Cell 72: 223-232 (1993))). See generally, Phizicky et al., Microbiol. Re
v. 59: 94-123 (1995).
【０２９４】 本発明のガレクチン１１ポリペプチドに結合する化合物を同定するアッセイの
背景にある原理は、２つの成分を相互作用および結合させ、従って、複合体を形
成することを可能にする条件下で、ガレクチン１１ポリペプチドおよび試験化合
物の反応混合物を調製する工程を含む。この複合体は、当該分野で公知の技術を
用いて、反応混合物中で検出され得、そして精製され得る。従って、アッセイは
、ガレクチン１１に対する候補化合物の結合を簡単に試験し得る。The principle behind the assay to identify compounds that bind to the galectin 11 polypeptide of the invention is that under conditions that allow the two components to interact and bind, thus forming a complex. , Preparing a reaction mixture of the galectin 11 polypeptide and the test compound. The complex can be detected in the reaction mixture and purified using techniques known in the art. Thus, the assay can simply test the binding of the candidate compound to galectin-11.
【０２９５】 さらに、そのアッセイは、候補化合物をガレクチン１１ポリペプチドを含む溶
液とともに合わせて混合物を形成する工程、およびこの混合物中に含まれるガレ
クチン１１の、ガレクチン１１同種リガンド（例えば、Ｔ細胞の表面で発現され
るβガラクトシド糖および／または分子を含む化合物）を結合して、トリプシン
処理したウサギ赤血球を凝集させるか、またはＴ細胞のアポトーシスを誘導する
能力を決定する工程、およびこの能力を、候補化合物を含まない以外は同じまた
は類似の条件下で、同じまたは類似の溶液中で、ガレクチン１１ポリペプチドに
ついて観察された能力と比較する工程、を簡単に包含し得る。この候補分子の、
同種リガンドへのガレクチン１１の結合を妨害する能力は、候補分子の非存在下
でのその能力と比較した、標識されたガレクチン１１の同種リガンドへの結合の
減少において反映される。ガレクチン１１の、その同種リガンドへの結合から生
じる細胞応答（例えば、アポトーシス）を誘発するガレクチン１１の能力を妨害
する分子は、アンタゴニストである。ガレクチン１１によって誘導される細胞応
答を増強する分子は、ガレクチン１１と混合された場合に、またはそれらがガレ
クチンの非存在下で類似の細胞応答を誘導し得る場合に、アゴニストである。In addition, the assay comprises combining the candidate compound with a solution containing the galectin-11 polypeptide to form a mixture, and the galectin-11 cognate ligand of galectin-11 contained in the mixture (eg, the surface of T cells A compound comprising a β-galactoside sugar and / or a molecule expressed in a) to determine the ability to aggregate trypsinized rabbit erythrocytes or induce T cell apoptosis; Comparing the ability observed for the galectin-11 polypeptide under the same or similar conditions but without the compound, in the same or similar solution, can be simply included. Of this candidate molecule,
The ability to interfere with the binding of galectin-11 to the cognate ligand is reflected in a decrease in the binding of labeled galectin-11 to the cognate ligand compared to its ability in the absence of the candidate molecule. Molecules that interfere with the ability of galectin-11 to elicit a cellular response (eg, apoptosis) resulting from the binding of galectin-11 to its cognate ligand are antagonists. Molecules that enhance the cellular response induced by galectin-11 are agonists when mixed with galectin-11 or when they can induce a similar cellular response in the absence of galectin.
【０２９６】 本発明のガレクチン１１ポリヌクレオチド、ガレクチン１１ポリペプチド、お
よびガレクチン１１抗体はまた、細胞内のガレクチン１１のｍＲＮＡおよびタン
パク質の産生に対する添加された化合物の効果を検出するアッセイを構成するた
めに使用され得る。例えば、ＥＬＩＳＡが、ガレクチン１１タンパク質の分泌さ
れたレベルまたは細胞に付随するガレクチン１１タンパク質のレベルを測定する
ために、当該分野で公知である標準的な方法によって、モノクローナル抗体およ
びポリクローナル抗体を使用して構築され得、そしてこれは、適切に操作された
細胞または組織から、ガレクチン１１の産生を阻害し得るかまたは増強し得る因
子（それぞれ、アンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる）を発見するため
に使用され得る。スクリーニングアッセイを行うための標準的な方法は、当該分
野で十分に理解されている。The galectin-11 polynucleotides, galectin-11 polypeptides, and galectin-11 antibodies of the present invention can also be used to construct assays that detect the effect of added compounds on the production of galectin-11 mRNA and protein in cells. Can be used. For example, ELISA uses monoclonal and polyclonal antibodies by standard methods known in the art to measure the secreted level of galectin-11 protein or the level of galectin-11 protein associated with cells. It can be constructed and used to discover factors (also called antagonists or agonists, respectively) that can inhibit or enhance the production of galectin 11 from appropriately engineered cells or tissues. Standard methods for performing screening assays are well understood in the art.
【０２９７】 強力なガレクチン１１アンタゴニストの例には、抗体、または、いくつかの場
合においては、ガレクチン１１もしくはその同種リガンド（例えば、ガレクチン
１１のフラグメントもしくはガレクチン１１のリガンド）に密接に関連するオリ
ゴヌクレオチドもしくはタンパク質、または同種リガンドに結合するが、応答を
誘発せず、その結果ガレクチン１１の活性が妨害される、低分子が含まれる。Examples of potent galectin-11 antagonists include antibodies or, in some cases, oligonucleotides closely related to galectin-11 or a cognate ligand thereof (eg, a fragment of galectin-11 or a ligand of galectin-11). Or small molecules that bind to a protein, or cognate ligand, but do not elicit a response, thereby disrupting the activity of galectin-11.
【０２９８】 従って、別の局面において、本発明は、ガレクチン１１ポリペプチドについて
のアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レセプター、基質、酵素など；また
はガレクチン１１の産生を減少もしくは増強する化合物を同定するためのスクリ
ーニングキットに関し、このキットは、以下： （ａ）例えば、配列番号２、２５または２７のポリペプチドのような、本発明
のガレクチン１１ポリペプチド； （ｂ）例えば、Ｔ細胞のような、ガレクチン１１リガンドを発現する細胞； （ｃ）好ましくはＴ細胞の膜である、ガレクチン１１リガンドを発現する細胞
膜； （ｄ）βガラクトシド糖を含有する化合物；または （ｅ）好ましくは配列番号２、２５または２７のポリペプチドである、本発明
のガレクチン１１ポリペプチドに対する抗体、 を包含する。Thus, in another aspect, the invention relates to screening for identifying agonists, antagonists, ligands, receptors, substrates, enzymes, etc. for galectin-11 polypeptides; or compounds that decrease or enhance galectin-11 production. With respect to the kit, the kit comprises: (a) a galectin-11 polypeptide of the invention, eg, a polypeptide of SEQ ID NO: 2, 25 or 27; (b) a galectin-11 ligand, eg, a T cell (C) a cell membrane expressing galectin 11 ligand, which is preferably a T cell membrane; (d) a compound containing β-galactoside sugar; or (e) preferably a compound of SEQ ID NO: 2, 25 or 27 Against the galectin-11 polypeptide of the present invention, which is a polypeptide Encompasses body, the.
【０２９９】 任意のそのようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または
（ｅ）は、実質的な成分を含み得ることが理解される。It is understood that in any such kit, (a), (b), (c), (d), or (e) may include substantial components.
【０３００】 本明細書中に開示されるようなアッセイを介して同定された化合物は、例えば
、ガレクチン１１遺伝子産物の生物学的機能を作り出す際に、そして細胞増殖（
ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ）、細胞増殖（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
）および分化、ならびにアポトーシスを調節するために有用であり得る。例えば
、本発明のガレクチン１１に対する抗体およびガレクチン１１ポリペプチド、フ
ラグメント、誘導体、改変体、またはアナログは、ガレクチン１１活性を抑制す
るために利用され、上昇したガレクチン１１から生じる異常を処置し得る。薬学
的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書中に記載されるようなキャリア）を
有するこれらの同定された化合物の組み合わせ、ならびに増殖調節障害、および
免疫調節障害（自己免疫疾患、癌、および炎症性疾患を含むがこれらに限定され
ない）を処置または予防するためのそれらの投与もまた、本発明によって包含さ
れる。Compounds identified via assays as disclosed herein can be used, for example, in creating the biological function of the galectin 11 gene product and in cell growth (
cell growth, cell proliferation
) And differentiation, and may be useful for regulating apoptosis. For example, antibodies to galectin-11 and galectin-11 polypeptides, fragments, derivatives, variants, or analogs of the invention can be used to suppress galectin-11 activity and treat abnormalities resulting from elevated galectin-11. Combinations of these identified compounds having a pharmaceutically acceptable carrier (eg, a carrier as described herein), and disorders of proliferation and immune regulation (autoimmune diseases, cancer, and Their administration for treating or preventing (including but not limited to, inflammatory diseases) is also encompassed by the present invention.
【０３０１】 （予防的方法および治療的方法） 以下の議論は具体的にヒト患者に関するが、これらの教示はまた、ガレクチン
１１を発現する任意の動物に適用可能であることが理解されるべきである。Prophylactic and Therapeutic Methods Although the following discussion specifically relates to human patients, it should be understood that these teachings are also applicable to any animal that expresses galectin-11. is there.
【０３０２】 上記で述べたように、ガレクチン１１は、他のガレクチンと有意な相同性を共
有する。さらに、本明細書中に開示されるように、ガレクチン１１は、ガレクチ
ン１と同様に、Ｔ細胞株のアポトーシスを誘導する。さらに、上記に議論される
ように、ガレクチン１は、細胞増殖およびいくつかの免疫機能（例えば、実験的
重症筋無力症動物モデル系および実験的自己免疫脳脊髄炎動物モデル系における
自己免疫疾患に対する治療活性）において役割を果たすことが実証されている。
従って、ガレクチン１１は、ガレクチン１と同様に、増殖調節活性（例えば、細
胞分化および／または細胞増殖）、免疫調節活性、細胞−細胞相互作用、および
細胞−基質相互作用、ならびにアポトーシスにおいて活性であるようである。As noted above, galectin 11 shares significant homology with other galectins. Further, as disclosed herein, galectin 11 induces apoptosis of T cell lines, similar to galectin 1. In addition, as discussed above, galectin 1 is responsible for cell proliferation and some immune functions (eg, against autoimmune diseases in experimental animal models of myasthenia gravis and experimental animal models of autoimmune encephalomyelitis). Therapeutic activity).
Thus, galectin 11, like galectin 1, is active in growth regulatory activity (eg, cell differentiation and / or cell proliferation), immunomodulatory activity, cell-cell and cell-substrate interactions, and apoptosis. It seems.
【０３０３】 アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死は、免疫系の末梢Ｔリンパ球
の欠損に関与する生理的な機構であり、そしてその調節不全は、多数の異なる病
原性プロセスを導き得る。細胞の生存の増加、またはアポトーシスの阻害に関連
する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌、およびホ
ルモン依存性腫瘍（結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠
芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ
腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺
癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが、これらに限定されない；自己免疫障害
（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、
ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋
炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマ
チ）、およびウイルス性感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、
およびアデノウイルス）、炎症；対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、および慢
性移植片拒絶が含まれる。好ましい実施形態において、本発明のガレクチン１１
のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニストは、癌（特に
上に列挙した癌）の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害
するために使用される。Apoptosis, or programmed cell death, is a physiological mechanism involved in the deficiency of peripheral T lymphocytes of the immune system, and its dysregulation can lead to a number of different pathogenic processes. Diseases associated with increased cell survival or inhibition of apoptosis include cancer (eg, follicular lymphoma, cancer with a p53 mutation, and hormone-dependent tumors (colon, heart, pancreatic, melanoma, retina) Blastoma, glioblastoma, lung cancer, intestinal cancer, testicular cancer, gastric cancer, neuroblastoma, myxoma, fibroid, lymphoma, endothelioma, osteoblastoma, bone giant cell tumor, osteosarcoma, cartilage Autoimmune disorders (eg, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, Hashimoto's thyroiditis, bile cirrhosis,
Behcet's disease, Crohn's disease, polymyositis, systemic lupus erythematosus and immune-associated glomerulonephritis and rheumatoid arthritis), and viral infections (eg, herpes virus, poxvirus,
And adenovirus), inflammation; graft-versus-host disease, acute graft rejection, and chronic graft rejection. In a preferred embodiment, the galectin 11 of the present invention
The polynucleotides, polypeptides and / or antagonists of the invention are used to inhibit the growth, progression, and / or metastasis of cancer (especially those listed above).
【０３０４】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストによって処置あるいは検出され得る細胞生存の増大に関
連するさらなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならび
に以下のような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（
急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前
骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白
血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））
、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多
発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固
形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、
骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍ
ａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑
筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌
、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄
様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎
生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮
癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、
松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉ
ｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限
定されない）。Additional diseases or conditions associated with increased cell survival that can be treated or detected by a galectin-11 polynucleotide or polypeptide, or agonist or antagonist, include the progression and / or metastasis of a malignant disease and associated Disorders, including but not limited to: leukemia (
Acute leukemia (including, for example, acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia (including myeloblastic, promyelocytic, myelomonocytic, monocytic, and erythroleukemia)) and chronic leukemia (eg, chronic myeloid leukemia) (Granulocytic) leukemia and chronic lymphocytic leukemia))
Polycythemia vera, lymphomas (eg, Hodgkin's disease and non-Hodgkin's disease), multiple myeloma, Waldenstrom's macroglobulinemia, heavy chain disease, and solid tumors (sarcomas and carcinomas (eg, fibrosarcoma, mucus) Sarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma,
Osteogenic sarcoma, chordoma, hemangiosarcoma, endothelial sarcoma (endotheliosarcoma)
a), lymphatic sarcoma, lymphatic endothelioma, periosteoma, mesothelioma, Ewing tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon carcinoma, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, basal Cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous carcinoma, papillary carcinoma, papillary carcinoma, cystic carcinoma, medullary carcinoma, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryo Stage cancer, Wilms tumor, cervical cancer, testicular tumor, lung cancer, small cell lung cancer, bladder cancer, epithelial cancer, glioma, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma ,
Pinealoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, meningioma (menangi)
oma), melanomas, neuroblastomas, and retinoblastomas).
【０３０５】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチ
ン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置あるいは検出され得る
アポトーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変
性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色
素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害
（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、
ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋
炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマ
チ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚
血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓
傷害（例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅ
ｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコール
によって引き起こされるようなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲
不振。Diseases associated with increased apoptosis that can be treated or detected by a galectin 11 polynucleotide or polypeptide, and an agonist or antagonist of galectin 11 include: AIDS; neurodegenerative disorders (eg, Alzheimer's disease) Autoimmune disorders (eg, multiple sclerosis, Sjogren's syndrome, Hashimoto's thyroiditis, biliary cirrhosis) ,
Behcet's disease, Crohn's disease, polymyositis, systemic lupus erythematosus and immune-associated glomerulonephritis and rheumatoid arthritis), myelodysplastic syndrome (eg, aplastic anemia), graft versus host disease , Ischemic injury (such as caused by myocardial infarction, stroke and reperfusion injury), liver injury (eg, hepatitis-related liver injury, ischemia / reperfusion injury, cholestasis)
toxicosis (such as caused by alcohol), septic shock, cachexia and anorexia.
【０３０６】 ガレクチン１１活性を中和するか、または増強する任意の方法は、増殖調節活
性（例えば、細胞増殖）、免疫調節活性、細胞−細胞相互作用および細胞−基質
相互作用、ならびにアポトーシスを調節するために使用され得る。Any method that neutralizes or enhances galectin-11 activity modulates growth-regulating activity (eg, cell proliferation), immunomodulatory activity, cell-cell and cell-substrate interactions, and apoptosis Can be used to
【０３０７】 ガレクチン１１のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（本明細書中に記載さ
れるように、ガレクチン１１フラグメント、改変体、誘導体、およびアナログ、
ならびにガレクチン１１のアゴニストおよびアンタゴニストを含む）は、免疫細
胞の増殖、分化、または移動（走化性）を活性化するか、または阻害することに
よって、免疫系の欠損または障害を処置する際に有用であり得る。免疫細胞は、
多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球細胞、好中球、およびマクロファ
ージ）およびリンパ系細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を産生する造血と呼
ばれるプロセスを通して発達する。これらの免疫欠損または障害の病因は、遺伝
的であり得るか、身体的であり得るか、例えば、癌もしくは何らかの自己免疫障
害であり得るか、後天的であり得るか（例えば、化学療法もしくは毒素によって
）、または感染性であり得る。さらに、ガレクチン１１のポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーまたはディテクター
として使用され得る。Galectin-11 polypeptides or polynucleotides (as described herein, such as galectin-11 fragments, variants, derivatives, and analogs,
And agonists and antagonists of galectin 11) are useful in treating immune system deficiencies or disorders by activating or inhibiting the proliferation, differentiation, or migration (chemotaxis) of immune cells. Can be Immune cells
It develops through a process called hematopoiesis that produces myeloid cells (platelets, red blood cells, neutrophils, and macrophages) and lymphoid cells (B and T lymphocytes) from pluripotent stem cells. The etiology of these immune deficiencies or disorders may be genetic, physical, eg, cancer or any autoimmune disorder, or acquired (eg, chemotherapy or toxin). ) Or infectious. In addition, galectin-11 polynucleotides or polypeptides can be used as markers or detectors for certain immune system diseases or disorders.
【０３０８】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（本明細書中に記載さ
れた通りのガレクチン１１のフラグメント、改変体、誘導体およびアナログ、な
らびにガレクチン１１のアゴニストおよびアンタゴニストを含む）は、造血細胞
の欠損または障害を処置または検出する際に有用であり得る。下記でさらに議論
されるように、ガレクチン１１のポリペプチドまたはポリヌクレオチドあるいは
ガレクチン１１のアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、特定の（または多
くの）型の造血細胞の減少と関連した障害を処置する取組みにおいて造血細胞（
多能性幹細胞を含む）の分化および増殖を増加させ得る。免疫学的欠損症候群の
例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：血液タンパク質障害（
例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性
運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ
−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、リンパ球減少、食細胞殺菌機能不全、重
症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血
小板減少症、または血色素尿。Galectin-11 polynucleotides or polypeptides (including fragments, variants, derivatives and analogs of galectin-11 as described herein, as well as agonists and antagonists of galectin-11) are defective in hematopoietic cells. Or it may be useful in treating or detecting a disorder. As discussed further below, in an approach to treat disorders associated with the reduction of certain (or many) types of hematopoietic cells using galectin-11 polypeptides or polynucleotides or agonists and antagonists of galectin-11. Hematopoietic cells (
(Including pluripotent stem cells). Examples of immunological deficiency syndromes include, but are not limited to: blood protein disorders (
For example, agammaglobulinemia, hypogammaglobulinemia), ataxia telangiectasia, unclassifiable immunodeficiency, DiGeorge syndrome, HIV infection, HTLV
-BLV infection, leukocyte adhesion deficiency syndrome, lymphopenia, phagocytic bactericidal dysfunction, severe combined immunodeficiency (SCID), Viscott-Aldrich disorder, anemia, thrombocytopenia, or hemoglobinuria.
【０３０９】 さらに、ガレクチン１１のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（本明細書中
に記載された通りのガレクチン１１のフラグメント、改変体、誘導体およびアナ
ログ、ならびにガレクチン１１のアゴニストおよびアンタゴニストを含む）はま
た、止血活性（出血を停止すること）または血栓崩壊活性（血餅の形成）を調節
するために使用され得る。例えば、止血または血栓崩壊活性を増加させることに
よって、ガレクチン１１のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、血液凝固障
害（例えば、無フィブリノーゲン血症、因子欠乏）、血液血小板障害（例えば、
血小板減少症）、または外傷、手術もしくは他の原因から生じる創傷を処置する
ために使用され得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る、
ガレクチン１１のポリヌクレオチドまたはポリペプチドあるいはガレクチン１１
のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、凝固を阻害し得るかまたは凝固を
溶解し得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）、発作、または瘢痕の処置に重
要である。In addition, galectin 11 polypeptides or polynucleotides (including fragments, variants, derivatives and analogs of galectin 11 as described herein, as well as agonists and antagonists of galectin 11) are also hemostatic. It can be used to modulate activity (to stop bleeding) or thrombolytic activity (clot formation). For example, by increasing haemostatic or thrombolytic activity, galectin-11 polynucleotides or polypeptides can cause blood coagulation disorders (eg, afibrinogenemia, factor deficiency), blood platelet disorders (eg,
Thrombocytopenia), or wounds resulting from trauma, surgery or other causes. Alternatively, it can reduce hemostatic or thrombolytic activity,
Galectin 11 polynucleotide or polypeptide or galectin 11
Can be used to inhibit or dissolve coagulation. These molecules are important in treating a heart attack (infarction), stroke, or scar.
【０３１０】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（本明細書中に記載さ
れた通りのガレクチン１１のフラグメント、改変体、誘導体およびアナログ、な
らびにガレクチン１１のアゴニストまたはアンタゴニストを含む）はまた、自己
免疫障害を処置または検出するのに有用であり得る。本明細書中に開示されるよ
うに、ガレクチン１１は、Ｔ細胞株のアポトーシスを誘導する（実施例５、図５
Ａおよび図５Ｂを参照のこと）。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって、自
己を外来物質として不適切に認識されることからもたらされる。この不適切な認
識は、宿主組織の破壊を導く免疫応答を生じる。それゆえ、免疫応答、特にＴ細
胞の増殖、分化、または走化性を阻害し得るガレクチン１１のポリペプチドまた
はポリヌクレオチドの投与は、自己免疫障害を予防するのに有効な治療であり得
る。Galectin-11 polynucleotides or polypeptides (including fragments, variants, derivatives and analogs of galectin-11 as described herein, as well as agonists or antagonists of galectin-11) may also be present in autoimmune disorders. May be useful for treating or detecting. As disclosed herein, galectin 11 induces apoptosis of T cell lines (Example 5, FIG.
A and FIG. 5B). Many autoimmune disorders result from inappropriate recognition of self as a foreign substance by immune cells. This improper recognition results in an immune response that leads to destruction of the host tissue. Therefore, administration of a galectin-11 polypeptide or polynucleotide that can inhibit an immune response, particularly T cell proliferation, differentiation, or chemotaxis, can be an effective treatment to prevent autoimmune disorders.
【０３１１】 処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、以下が挙げられるが、そ
れらに限定されない：アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、慢性関節
リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候
群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼結膜炎、水疱性類
天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、スティッフマン症候群
、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎症、ギヤン−
バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼病。Examples of autoimmune disorders that can be treated or detected include, but are not limited to: Addison's disease, hemolytic anemia, antiphospholipid syndrome, rheumatoid arthritis, dermatitis, allergic cerebrospinal cord Inflammation, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, Graves' disease, multiple sclerosis, myasthenia gravis, neuritis, ocular conjunctivitis, bullous pemphigoid, pemphigus, polyendocrine disease, purpura, Reiter's disease, stiff Man syndrome, autoimmune thyroiditis, systemic lupus erythematosus, autoimmune pulmonary inflammation, Guian-
Barre syndrome, insulin-dependent diabetes, and autoimmune inflammatory eye disease.
【０３１２】 同様に、例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸の問題のよう
なアレルギー性反応および状態もまた、ガレクチン１１のポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドあるいはガレクチン１１のアゴニストまたはアンタゴニストによ
り処置され得る。さらに、これらの分子を用いて、アナフィラキシー、抗原性分
子に対する過敏症、または血液型不適合性を処置し得る。Similarly, allergic reactions and conditions such as, for example, asthma (particularly allergic asthma) or other respiratory problems are also treated with galectin-11 polypeptides or polynucleotides or galectin-11 agonists or antagonists. obtain. In addition, these molecules can be used to treat anaphylaxis, hypersensitivity to antigenic molecules, or blood group incompatibility.
【０３１３】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（本明細書中に記載さ
れた通りのガレクチン１１のフラグメント、改変体、誘導体およびアナログ、な
らびにガレクチン１１のアゴニストまたはアンタゴニストを含む）はまた、器官
拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置および／または予防するために
用いられ得る。器官拒絶は、宿主免疫細胞が免疫応答を介して移植された組織を
破壊することにより引き起こされる。同様に、免疫応答はまた、ＧＶＨＤに関与
しているが、この場合、外来の移植された免疫細胞は宿主組織を破壊する。免疫
応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害するガレクチン１１のポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチドあるいはガレクチン１１のアゴニストまたはア
ンタゴニストの投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤを予防するのに有効な治療であ
り得る。Galectin 11 polynucleotides or polypeptides (including fragments, variants, derivatives and analogs of galectin 11 as described herein, as well as agonists or antagonists of galectin 11) may also inhibit organ rejection or It can be used to treat and / or prevent graft versus host disease (GVHD). Organ rejection is caused by host immune cells destroying the transplanted tissue via an immune response. Similarly, the immune response is also involved in GVHD, where exogenous transplanted immune cells destroy host tissues. Administration of a galectin-11 polypeptide or polynucleotide or a galectin-11 agonist or antagonist that inhibits the immune response, particularly T cell proliferation, differentiation, or chemotaxis, is an effective treatment to prevent organ rejection or GVHD. possible.
【０３１４】 同様に、ガレクチン１１のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（本明細書中
に記載された通りのガレクチン１１のフラグメント、改変体、誘導体およびアナ
ログ、ならびにガレクチン１１のアゴニストまたはアンタゴニストを含む）はま
た、炎症を調節するために用いられ得る。例えば、ガレクチン１１のポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドあるいはガレクチン１１のアゴニストまたはアンタゴ
ニストは、炎症性応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの
分子は、感染（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症応答症候
群（ＳＩＲＳ））、虚血性再灌流障害、内毒素死亡、関節炎、補体媒介性超急性
拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性腸疾患、クロ
ーン病に関連した炎症、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）
の過剰産生からもたらされる炎症を含む炎症状態（慢性および急性の両方の状態
）を処置するために使用され得る。Similarly, galectin-11 polypeptides or polynucleotides (including fragments, variants, derivatives and analogs of galectin-11 as described herein, and agonists or antagonists of galectin-11) also include Can be used to control inflammation. For example, a galectin-11 polypeptide or polynucleotide or a galectin-11 agonist or antagonist can inhibit proliferation and differentiation of cells involved in the inflammatory response. These molecules may be infected (eg, septic shock, sepsis, or systemic inflammatory response syndrome (SIRS)), ischemic reperfusion injury, endotoxin death, arthritis, complement-mediated hyperacute rejection, nephritis, cytokines or Chemokine-induced lung injury, inflammatory bowel disease, inflammation associated with Crohn's disease, or cytokines (eg, TNF or IL-1)
Can be used to treat inflammatory conditions, including inflammation resulting from overproduction of both chronic and acute conditions.
【０３１５】 ガレクチン１１のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（本明細書中に記載さ
れた通りのガレクチン１１のフラグメント、改変体、誘導体およびアナログ、な
らびにガレクチン１１のアゴニストおよびアンタゴニストを含む）は、新生物を
含む過剰増殖性障害を処置または検出するために使用され得る。ガレクチン１１
のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはガレクチン１１のアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、直接的相互作用または間接的相互作用を介して障害
の増殖を阻害し得る。あるいは、ガレクチン１１のポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチド、またはガレクチン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストは、過
剰増殖性障害を阻害し得る他の細胞を増殖させ得る。Galectin-11 polypeptides or polynucleotides (including fragments, variants, derivatives and analogs of galectin-11 as described herein, and agonists and antagonists of galectin-11) include neoplasms It can be used to treat or detect a hyperproliferative disorder. Galectin 11
Or agonists or antagonists of galectin 11 can inhibit the growth of a disorder through direct or indirect interactions. Alternatively, a galectin-11 polypeptide or polynucleotide, or an agonist or antagonist of galectin-11 can proliferate other cells that can inhibit a hyperproliferative disorder.
【０３１６】 例えば、免疫応答を上昇させることによって、特に過剰増殖性障害の抗原性の
質を上げることによって、またはＴ細胞の増殖、分化、もしくは動員によって、
過剰増殖性障害は処置され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を増強させる
かまたは新たな免疫応答を開始させるかのいずれかによって上昇し得る。あるい
は、免疫応答の減少はまた、化学療法剤のような過剰増殖性障害を処置する方法
であり得る。For example, by increasing the immune response, especially by increasing the antigenicity of the hyperproliferative disorder, or by expanding, differentiating, or recruiting T cells.
Hyperproliferative disorders can be treated. This immune response can be increased by either enhancing an existing immune response or initiating a new immune response. Alternatively, reducing the immune response can also be a method of treating a hyperproliferative disorder, such as a chemotherapeutic agent.
【０３１７】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置または検出
され得る過剰増殖性障害の例としては、以下に存在する新生物が挙げられるがこ
れらに限定されない：結腸、腹部、骨、***、消化器系、肝臓、膵臓、前立腺、
腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、
頭部および頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾
臓、胸部、ならびに泌尿生殖器。Examples of hyperproliferative disorders that can be treated or detected by a galectin-11 polynucleotide or polypeptide include, but are not limited to, neoplasms that exist: colon, abdomen, bone, breast, digestion Organs, liver, pancreas, prostate,
Peritoneum, endocrine glands (adrenal gland, parathyroid gland, pituitary, testis, ovary, thymus, thyroid), eyes,
Head and neck, nerves (central and peripheral), lymphatic system, pelvis, skin, soft tissue, spleen, breast, and genitourinary tract.
【０３１８】 同様に、他の過剰増殖性障害もまた、ガレクチン１１のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、またはガレクチン１１のアゴニストもしくはアンタゴニスト
により処置または検出され得る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下
が挙げられるがこれらに限定されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖
性障害、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァ
ルデンストレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および任意
の他の過剰増殖性疾患、加えて上記に列挙した器官系に見出される新生物。Similarly, other hyperproliferative disorders can also be treated or detected by a galectin-11 polynucleotide or polypeptide, or an agonist or antagonist of galectin-11. Examples of such hyperproliferative disorders include, but are not limited to: hypergammaglobulinemia, lymphoproliferative disorders, paraproteinemia, purpura, sarcoidosis, Sezary syndrome, Waldenstrom Macroglobulinemia, Gaucher disease, histiocytosis, and any other hyperproliferative diseases, as well as neoplasms found in the organ systems listed above.
【０３１９】 本発明のポリヌクレオチドを利用する１つの好ましい実施形態は、本発明およ
び／または融合タンパク質もしくはそのフラグメントを用いる遺伝子治療によっ
て、異常な細胞***を阻害することである。One preferred embodiment utilizing a polynucleotide of the present invention is to inhibit abnormal cell division by the present invention and / or gene therapy using a fusion protein or fragment thereof.
【０３２０】 従って、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを異常に増殖している細胞に挿
入することによって、細胞増殖性障害を処置するための方法を提供し、ここでこ
のポリヌクレオチドはこの発現を示す。Thus, the present invention provides a method for treating a cell proliferative disorder by inserting a polynucleotide of the present invention into an abnormally growing cell, wherein the polynucleotide comprises Is shown.
【０３２１】 本発明の別の実施形態は、個体における細胞増殖性障害を処置する方法を提供
し、この方法は、本発明の１以上の活性遺伝子コピーを異常に増殖している１つ
の細胞または複数の細胞に投与することを包含する。好ましい実施形態において
は、本発明のポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配
列の発現において有効な組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明
の別の好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドをコードするＤ
ＮＡ構築物は、レトロウイルスベクター、またはより好ましくは、アデノウイル
スベクターを用いて、処理されるべき細胞に挿入される（Ｇ Ｊ．Ｎａｂｅｌら
、ＰＮＡＳ １９９９ ９６：３２４−３２６（これは、本明細書中に参考とし
て援用される）を参照のこと）。最も好ましい実施形態においては、ウイルスベ
クターは不完全であり、非増殖性細胞ではなく増殖性細胞のみを形質転換する。
さらに、好ましい実施形態においては、単独、または他のポリヌクレオチドと組
み合わされたかもしくは融合されたかのいずれかで増殖性細胞に挿入される本発
明のポリヌクレオチドは、次いで外部刺激（すなわち、磁気、特異的小分子、化
学的、または薬物投与など）を介して調節され得、これはこのポリヌクレオチド
の上流のプロモーターに作用し、コードされたタンパク質産物の発現を誘導する
。このように、本発明の有益な治療効果は、この外部刺激に基づいて明確に調節
され得る（すなわち、本発明の発現を増加、減少、または阻害する）。Another embodiment of the present invention provides a method of treating a cell proliferative disorder in an individual, the method comprising: Administering to multiple cells. In a preferred embodiment, the polynucleotide of the present invention is a DNA construct comprising a recombinant expression vector effective in expressing a DNA sequence encoding the polynucleotide. In another preferred embodiment of the invention, the D encoding the polynucleotide of the invention
The NA construct is inserted into the cells to be treated using a retroviral vector, or more preferably, an adenoviral vector (GJ. Nabel et al., PNAS 1999 96: 324-326, which is described herein. Which is incorporated herein by reference). In a most preferred embodiment, the viral vector is defective and transforms only proliferating cells, not non-proliferating cells.
Further, in a preferred embodiment, the polynucleotides of the present invention inserted into proliferative cells, either alone or in combination or fusion with other polynucleotides, are then exposed to an external stimulus (ie, magnetic, specific (Eg, small molecule, chemical, or drug administration), which acts on the promoter upstream of the polynucleotide to induce expression of the encoded protein product. Thus, the beneficial therapeutic effects of the invention can be unambiguously modulated (ie, increase, decrease, or inhibit the expression of the invention) based on this external stimulus.
【０３２２】 本発明のポリヌクレオチドは、発癌遺伝子または抗原の発現の抑制において有
用であり得る。「発癌遺伝子の発現の抑制」によって、遺伝子の転写の抑制、遺
伝子転写物の分解（プレメッセージ（ｐｒｅ−ｍｅｓｓａｇｅ）ＲＮＡ）、スプ
ライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後改変の予
防、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常な機能の阻害が意図される。The polynucleotides of the present invention may be useful in suppressing oncogene or antigen expression. “Inhibition of oncogene expression” can be used to suppress gene transcription, degrade gene transcripts (pre-message RNA), inhibit splicing, disrupt messenger RNA, prevent post-translational modification of proteins, Or disruption of the normal function of the protein.
【０３２３】 異常に増殖している細胞への局所的投与のために、本発明のポリヌクレオチド
は当業者に公知の任意の方法によって投与され得、この方法としては、トランス
フェクション、エレクトロポレーション、細胞の微量注入、またはビヒクル（例
えば、リポソーム、リポフェクチン）中で、または裸のポリヌクレオチドとして
、または本明細書を通して記載される任意の他の方法が挙げられるが、これらに
限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子送達系（例えば、レ
トロウイルスベクター（Ｇｉｌｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：８４５（
１９８２）；Ｈｏｃｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌ
ｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：３０１
４）、ワクシニアウイルス系（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１９８５））または当業者に公知の他の有効なＤＮＡ
送達系（Ｙａｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１２（１９８５））があるが
、これらに限定されない）によって送達され得る。これらの参考文献は、例示の
みであり、本明細書中に参考として援用される。異常に増殖している細胞を特異
的に送達またはトランスフェクトし、そして非***細胞を使わないために、当業
者に公知のレトロウイルス、またはアデノウイルス（当該分野および本明細書中
のいずれかに記載のような）送達系を使用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製
は、組み込みのためにレトロウイルスＤＮＡを必要とし、レトロウイルスはその
ライフサイクルに必要なレトロウイルス遺伝子を欠くために自己複製できないか
らである。このようなレトロウイルス送達系を本発明のポリヌクレオチドのため
に用いることによって、この遺伝子および構築物は異常に増殖している細胞を標
的とし、そして非***正常細胞を使用しない。For topical administration to abnormally growing cells, the polynucleotides of the invention can be administered by any method known to those of skill in the art, including transfection, electroporation, These include, but are not limited to, microinjection of cells, or in vehicles (eg, liposomes, lipofectin), or as naked polynucleotides, or any of the other methods described throughout this specification. The polynucleotide of the present invention can be prepared by a known gene delivery system (for example, retroviral vector (Gilboa, J. Virology 44: 845 (
1982); Hocke, Nature 320: 275 (1986); Wil.
Son et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85: 301
4), vaccinia virus system (Chakrabarty et al., Mol. Cell
Biol. 5: 3403 (1985)) or other effective DNA known to those of skill in the art.
Delivery systems (including, but not limited to, Yates et al., Nature 313: 812 (1985)). These references are exemplary only and are incorporated herein by reference. To specifically deliver or transfect abnormally growing cells and to avoid using non-dividing cells, retroviruses known to those skilled in the art, or adenoviruses (anywhere in the art and herein) Preferably, a delivery system (as described) is used. Host DNA replication requires retroviral DNA for integration, and retroviruses cannot replicate themselves due to the lack of retroviral genes required for their life cycle. By using such a retroviral delivery system for the polynucleotides of the present invention, the genes and constructs target abnormally growing cells and do not use non-dividing normal cells.
【０３２４】 本発明のポリヌクレオチドは、注射針を疾患部位に直接導くために使用される
画像化デバイスの使用によって、内部器管、体腔などにおける細胞増殖性障害／
疾患部位へ直接送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、外科的処置の
ときに疾患部位へ投与され得る。[0324] The polynucleotides of the present invention may be used to control cell proliferative disorders in internal organs, body cavities, etc.
It can be delivered directly to the disease site. The polynucleotides of the present invention can also be administered to a disease site during a surgical procedure.
【０３２５】 「細胞増殖性疾患」によって、器管、腔、または身体の部分の任意の１つまた
は任意の組み合わせに影響を与える、任意のヒトまたは動物の疾患もしくは障害
が意味され、これは良性であるか悪性であるかに関わらず、細胞、細胞の群、ま
たは組織の単一または複数の局所的異常増殖によって特徴付けられる。By “cell proliferative disease” is meant any human or animal disease or disorder that affects any one or any combination of organs, cavities, or body parts, which is benign , Whether malignant or malignant, is characterized by one or more local abnormal growths of a cell, group of cells, or tissue.
【０３２６】 本発明のポリヌクレオチドが処置される細胞の増殖に対して生物学的に阻害す
る効果を有する限り、本発明のポリヌクレオチドの任意の量が投与され得る。さ
らに、本発明のポリヌクレオチドの１つより多くを、同じ部位へ同時に投与する
ことが可能である。「生物学的に阻害する」によって、細胞の部分的または全体
的な増殖阻害および細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）または成長（ｇ
ｒｏｗｔｈ）の速度における減少が意味される。生物学的阻害用量は、組織培養
物における標的悪性細胞増殖もしくは異常増殖細胞増殖、動物および細胞培養物
における腫瘍増殖に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価することによ
って、または当業者に公知の任意の他の方法によって決定され得る。Any amount of a polynucleotide of the present invention can be administered, so long as the polynucleotide of the present invention has a biologically inhibitory effect on the growth of the treated cells. Further, more than one of the polynucleotides of the present invention can be administered simultaneously to the same site. By "biologically inhibit", partial or total growth inhibition of a cell and proliferation or growth (g
reduction) rate is implied. The biological inhibitory dose can be determined by assessing the effect of a polynucleotide of the invention on target malignant or abnormally growing cell growth in tissue culture, tumor growth in animals and cell culture, or any known to those of skill in the art. Can be determined by other methods.
【０３２７】 本発明はさらに、抗体に基づく治療に関し、この治療は、１以上の記載された
障害を処置するために、抗ポリペプチド抗体および抗ポリヌクレオチド抗体を哺
乳動物（好ましくは、ヒト）患者に投与する工程を包含する。抗ポリペプチド抗
体および抗ポリヌクレオチド抗体のポリクロナール抗体およびモノクロナール抗
体を生成するための方法は、本明細書中のいずれかに詳細に記載される。このよ
うな抗体は、当該分野において公知であるかまたは本明細書中に記載されるよう
な薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。The present invention further relates to antibody-based therapies, wherein the therapy comprises treating an anti-polypeptide antibody and an anti-polynucleotide antibody in a mammalian (preferably human) patient to treat one or more of the described disorders. Administering to the subject. Methods for producing polyclonal and monoclonal antibodies of anti-polypeptide and anti-polynucleotide antibodies are described in detail elsewhere herein. Such antibodies can be provided in a pharmaceutically acceptable composition as known in the art or as described herein.
【０３２８】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の要旨は、本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、身体中で局所的もしくは全体的に、または抗体の直接
的な細胞傷害性によって（例えば、相補細胞（ＣＤＣ）またはエフェクター細胞
（ＡＤＣＣ）によって媒介されるように）結合させる工程を包含する。これらの
アプローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供され
る教示によって、当業者は過度の実験なしで、本発明の抗体を診断目的、モニタ
リング目的または治療目的のために使用する方法を理解する。A summary of the methods by which the antibodies of the present invention can be used therapeutically is that polynucleotides or polypeptides of the present invention can be administered locally or totally in the body or by the direct cytotoxicity of the antibody ( For example, binding (as mediated by complementing cells (CDC) or effector cells (ADCC)). Some of these approaches are described in more detail below. With the teachings provided herein, one of skill in the art will understand, without undue experimentation, how to use the antibodies of the present invention for diagnostic, monitoring, or therapeutic purposes.
【０３２９】 特に、本発明の抗体、フラグメントおよび誘導体は、本明細書中に記載される
ような細胞増殖性障害および／または細胞分化障害を有しているかまたは発症し
ている被験体を処置するために有用である。このような処置は、抗体もしくはフ
ラグメント、誘導体またはそれらの結合体の単一または複数の用量を投与する工
程を包含する。In particular, the antibodies, fragments and derivatives of the present invention treat a subject having or developing a cell proliferative disorder and / or a cell differentiation disorder as described herein. Useful for. Such treatment includes administering one or more doses of the antibody or fragment, derivative or conjugate thereof.
【０３３０】 本発明の抗体は、例えば、他のモノクロナール抗体もしくはキメラ抗体と組み
合わせて、またはリンホカインもしくは造血成長因子と組み合わせて有利に使用
され得、これは抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させ
るために役立つ。The antibodies of the present invention can be advantageously used, for example, in combination with other monoclonal or chimeric antibodies, or in combination with lymphokines or hematopoietic growth factors, depending on the number of effector cells that interact with the antibody or Helps to increase activity.
【０３３１】 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して高親和性および／また
は強力なインビボ阻害および／または中和抗体、それらのフラグメントもしくは
領域を、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメント
を含む）に関するイムノアッセイおよびそれらに関連する障害の治療の両方のた
めに使用することが好ましい。このような抗体、フラグメントまたは領域は、好
ましくは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む
）に対する親和性を有する。好ましい結合親和性としては、５×１０-6Ｍ、１０ -6 Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０ -9 Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ
、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１
０-15Ｍおよび１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを伴う結合親和性が挙げら
れる。[0331] High affinity and / or affinity for a polypeptide or polynucleotide of the invention
Are potent in vivo inhibitory and / or neutralizing antibodies, fragments thereof or
The region may be a polynucleotide or polypeptide (fragment thereof) of the invention.
For both immunoassays and the treatment of disorders related to them.
It is preferred to use Such antibodies, fragments or regions are preferably
Preferably, the polynucleotide or polypeptide (including fragments thereof)
). Preferred binding affinity is 5 × 10-6M, 10 -6 M, 5 × 10-7M, 10-7M, 5 × 10-8M, 10-8M, 5 × 10-9M, 10 -9 M, 5 × 10-TenM, 10-TenM, 5 × 10-11M, 10-11M, 5 × 10-12M
, 10-12M, 5 × 10-13M, 10-13M, 5 × 10-14M, 10-14M, 5 × 1
0-15M and 10-15Dissociation constants below M, ie binding affinity with Kd, are mentioned.
It is.
【０３３２】 さらに、本明細書中のいずれかに記載されるように、本発明のポリペプチドは
、単独で、融合タンパク質として、または他のポリペプチドと組み合わせて、直
接的または間接的のいずれかで、増殖性細胞または組織の新脈管形成の阻害にお
いて有用である。最も好ましい実施形態においては、この抗新脈管形成効果は、
例えば造血性細胞、腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ）の阻害
を通して、間接的に達成され得る（Ｊｏｓｅｐｈ ＩＢら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，９０（２１）：１６４８−５３（１９９８）（これは本明
細書中に参考として援用される）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドを指向する抗体はまた、直接的または間接的に新脈管形成の阻
害を生じ得る（Ｗｉｔｔｅ Ｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅ
ｖ．１７（２）：１５５−６１（１９９８）（これは本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと）。In addition, as described elsewhere herein, the polypeptides of the present invention can be either directly or indirectly, alone, as fusion proteins, or in combination with other polypeptides. And is useful in inhibiting angiogenesis of proliferating cells or tissues. In a most preferred embodiment, the anti-angiogenic effect is
It can be achieved indirectly, eg, through inhibition of hematopoietic cells, tumor-specific cells (eg, tumor-associated macrophages) (Joseph IB et al., J Natl Ca
ncer Inst, 90 (21): 1648-53 (1998), which is incorporated herein by reference. Antibodies directed to the polypeptides or polynucleotides of the invention can also directly or indirectly inhibit angiogenesis (Witte L et al., Cancer Metastasis Re.
v. 17 (2): 155-61 (1998), which is incorporated herein by reference).
【０３３３】 本発明のポリペプチド（融合タンパク質を含む）またはそのフラグメントは、
アポトーシスの誘導を通した増殖性細胞または組織の阻害において有用であり得
る。このポリペプチドは、デスドメインレセプター（例えば、腫瘍壊死因子（Ｔ
ＮＦ）レセプター１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）、ＴＮＦレセプター関連
アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導
リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター１およびレセプター２）の活性化において、
直接的または間接的のいずれかで、増殖性細胞および組織のアポトーシスを誘導
するために作用し得る（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ Ｋら、Ｅｕｒ Ｊ
Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）（これは本明細書中
に参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明の別の好ましい実施
形態においては、このポリペプチドは、他の機構を通して（例えば、アポトーシ
スを活性化する他のタンパク質の活性化において）、あるいは単独または小分子
薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン（ａｐｏｐｔｏｎｉｎ）、ガ
レクチン、チオレドキシン、抗炎症タンパク質）との組み合わせのいずれかで、
このタンパク質の発現の刺激を通して、アポトーシスを誘導し得る（例えば、Ｍ
ｕｔａｔ Ｒｅｓ ４００（１−２）：４４７−５５（１９９８）、Ｍｅｄ Ｈ
ｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９８）、Ｃｈｅｍ Ｂｉ
ｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ ２４；１１１−１１２：２３−３４（１９９
８）、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２（１９９８）、Ｉｎｔ
Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５（１９９８）（これらは
すべて本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。The polypeptides of the present invention (including fusion proteins) or fragments thereof,
It may be useful in inhibiting proliferating cells or tissues through the induction of apoptosis. The polypeptide is a death domain receptor (eg, tumor necrosis factor (T
(NF) receptor 1, CD95 (Fas / APO-1), TNF receptor-related apoptosis-mediated protein (TRAMP) and TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptors 1 and 2)
Either directly or indirectly, it can act to induce apoptosis of proliferating cells and tissues (Schulze-Osthoff K et al., Eur J.
Biochem 254 (3): 439-59 (1998), which is hereby incorporated by reference. Further, in another preferred embodiment of the invention, the polypeptide can be administered through other mechanisms (eg, in the activation of other proteins that activate apoptosis), or alone or in small molecule drugs or adjuvants (eg, Either in combination with apoptonin, alectin, thioredoxin, anti-inflammatory protein)
Apoptosis can be induced through stimulation of expression of this protein (eg, M
ut Res 400 (1-2): 447-55 (1998), Med H
ypotheses. 50 (5): 423-33 (1998), Chem Bi.
ol Interact. Apr 24; 111-112: 23-34 (199
8), J Mol Med. 76 (6): 402-12 (1998), Int.
J Tissue React; 20 (1): 3-15 (1998), which are all incorporated herein by reference).
【０３３４】 本発明のポリペプチド（それとの融合タンパク質もしくはそのフラグメントを
含む）は、増殖性細胞または組織の転移の阻害において有用である。阻害は、ポ
リペプチド、または本明細書中のいずれかに記載されるようなこのポリペプチド
を指向する抗体の投与の直接的な結果として、あるいは間接的に（例えば、転移
を阻害することが知られているタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現
の活性化）生じ得る（例えば、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ １９９８；２３１：１２５−４１（これは本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと）。本発明のこのような治療的効果は、単独、または小
分子薬物もしくはアジュバントとの組み合わせのいずれかで達成され得る。The polypeptides of the present invention (including fusion proteins or fragments thereof) are useful in inhibiting the metastasis of proliferating cells or tissues. Inhibition can be a direct result of the administration of the polypeptide, or an antibody directed to this polypeptide as described herein, or indirectly (eg, to inhibit metastasis). (Eg, activation of expression of a protein (eg, α4 integrin)) (eg, Curr Top Microbiol Imm)
unol 1998; 231: 125-41, which is incorporated herein by reference). Such therapeutic effects of the present invention can be achieved either alone or in combination with small molecule drugs or adjuvants.
【０３３５】 別の実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含有する組成物
（例えば、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグに会合する
ポリペプチドまたはポリペプチド抗体を含有する組成物）を、本発明のポリペプ
チドを発現する標的細胞に送達する方法を提供する。本発明のポリペプチドまた
はポリペプチド抗体は、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性相
互作用を介して、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグに会
合し得る。In another embodiment, the present invention provides a composition comprising a polypeptide of the invention (eg, comprising a polypeptide or polypeptide antibody that associates with a heterologous polypeptide, heterologous nucleic acid, toxin, or prodrug). ) To a target cell that expresses a polypeptide of the invention. A polypeptide or polypeptide antibody of the invention can be associated with a heterologous polypeptide, heterologous nucleic acid, toxin, or prodrug via hydrophobic, hydrophilic, ionic, and / or covalent interactions.
【０３３６】 本発明のポリペプチド、それらとの融合タンパク質またはそれらのフラグメン
トは、直接的（例えば、本発明のポリペプチドが増殖性抗原および免疫原に応答
するために、免疫応答を「ワクチン接種した」場合に起こるように）、または間
接的（例えば、この抗原および免疫原に対する免疫応答を増強することが知られ
ているタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現の活性化におけるように）のい
ずれかで、増殖細胞または組織の免疫原性および／または抗原性の増強において
有用である。The polypeptides of the invention, fusion proteins therewith, or fragments thereof can be directly (eg, vaccinated with an immune response, such that the polypeptides of the invention respond to proliferative antigens and immunogens). "As occurs when" or indirectly (eg, as in activating the expression of a protein (eg, a chemokine) known to enhance the immune response to this antigen and immunogen). Useful in enhancing the immunogenicity and / or antigenicity of proliferating cells or tissues.
【０３３７】 ガレクチン１１のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（本明細書中に記載さ
れた通りのガレクチン１１のフラグメント、改変体、誘導体およびアナログ、な
らびにガレクチン１１のアゴニストおよびアンタゴニストを含む）は、感染因子
を処置または検出するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させること
によって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させること
によって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を増強させ
るか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇し得る。ある
いは、ガレクチン１１のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、免疫応答
を必ずしも誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。Galectin 11 polypeptides or polynucleotides (including fragments, variants, derivatives and analogs of galectin 11 as described herein, and agonists and antagonists of galectin 11) treat infectious agents Or it can be used to detect. For example, an infectious disease can be treated by increasing the immune response, particularly by increasing the proliferation and differentiation of B and / or T cells. The immune response can be increased either by enhancing an existing immune response or by initiating a new immune response. Alternatively, the galectin-11 polypeptide or polynucleotide may also directly inhibit the infectious agent without necessarily eliciting an immune response.
【０３３８】 ウイルスは、ガレクチン１１のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処
置または検出され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。
ウイルスの例としては、以下のＤＮＡウイルスの科およびＲＮＡウイルスの科が
挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレ
ナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カリ
チウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイル
ス科、デング熱ウイルス、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイル
ス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純疱疹
、帯状疱疹）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パ
ラミクソウイルス科、モルビリウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウ
イルス科（例えば、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型およびパラインフ
ルエンザ）、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、パポバウ
イルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例え
ば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レト
ロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガ
ウイルス科（例えば、ルビウイルス）。これらの科内に入るウイルスは、以下を
含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎、
細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、ＲＳウイルス、脳炎、眼性感染
症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ
型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎、フニン、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜
炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出
血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白
血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血
症。本発明のガレクチン１１のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、または
アゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいずれ
かが処置または検出され得る。特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレ
オチド、ポリペプチドまたはアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下を処置
するために使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎（例え
ば、Ｂ型肝炎）。さらなる特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチ
ド、ポリペプチドまたはアゴニストもしくはアンタゴニストは、１以上の他の市
販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために使用される。さらに特定の
実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、ＡＩＤＳを処置するために使用される。A virus is an example of an infectious agent that can cause a disease or condition that can be treated or detected by a galectin-11 polynucleotide or polypeptide.
Examples of viruses include, but are not limited to, the following families of DNA viruses and RNA viruses: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Virnaviridae, Bunyaviridae, Karichi. Viridae, sarcoviridae, coronaviridae, dengue virus, EBV, HIV, flaviviridae, hepadnaviridae (hepatitis), herpesviridae (eg, cytomegalovirus, herpes simplex, shingles), Mononegavirus (for example, Paramyxoviridae, Morbillivirus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (for example, influenza A, influenza B and parainfluenza), papiro Maviridae (papilloma virus), Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (eg, pox or vaccinia), Reoviridae (eg, rotavirus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-). II, lentivirus), and Togaviridae (eg, rubivirus). Viruses that fall within these families can cause a variety of diseases or conditions, including but not limited to: arthritis,
Bronchiolitis, respiratory syncytial virus, encephalitis, ocular infections (eg, conjunctivitis, keratitis), chronic fatigue syndrome, hepatitis (types A, B, C, E
Type, chronic activity, delta), Japanese encephalitis, Junin, Rift Valley fever, yellow fever, meningitis, opportunistic infections (eg, AIDS), pneumonia, Burkitt's lymphoma, chickenpox, hemorrhagic fever, measles, epidemic ear Lower inflammation, parainfluenza, rabies, cold, polio, leukemia, rubella, sexually transmitted diseases, skin diseases (eg, capoge, warts), and viremia. Any of these conditions or diseases can be treated or detected using a galectin-11 polypeptide or polynucleotide, or agonist or antagonist, of the present invention. In certain embodiments, the polynucleotides, polypeptides or agonists or antagonists of the invention are used to treat: meningitis, dengue, EBV, and / or hepatitis (eg, hepatitis B) . In a further particular embodiment, the polynucleotides, polypeptides or agonists or antagonists of the invention are used to treat patients who are unresponsive to one or more other commercially available hepatitis vaccines. In a more specific embodiment, a polynucleotide, polypeptide or agonist or antagonist of the invention is used to treat AIDS.
【０３３９】 同様に、疾患もしくは症状を引き起こし得、そして本発明のガレクチン１１ポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアン
タゴニストにより処置または検出され得る細菌または真菌因子としては、以下の
グラム陰性細菌科およびグラム陽性細菌科ならびに真菌科が挙げられるが、それ
らに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒ
ｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、
Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）
、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂ
ａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏ
ｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏ
ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ
Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、お
よびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒ
ｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌ
ｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ
、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａ
ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）
、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃ
ｅａ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ
型）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓ
ｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌ
ｌａ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａ
ｌ、ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＧｒｏｕｐ Ｂ Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細菌科または真菌科は、以下の疾患もし
くは症状を引き起こし得、これらの疾患もしくは症状としては、以下が挙げられ
るが、それらに限定されない：菌血症、心内膜炎、眼の感染（結膜炎、結核、ブ
ドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連感染症）、爪周囲炎
、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿
症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、チフ
ス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば、Ａ型髄膜炎およびＢ型髄膜炎）、クラミジア
症、梅毒、ジフテリア、ライ病、パラ結核、結核、狼蒼、ボツリヌス中毒、壊疽
、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、
皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、***症、創傷感
染症。本発明のガレクチン１１のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、また
はアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、任意のこれらの症状または疾
患を処置または検出し得る。特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、アゴニストもしくはアンタゴニストは、以下を処置するた
めに使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および／またはＢ型髄
膜炎。Similarly, bacterial or fungal factors that can cause a disease or condition and that can be treated or detected by a galectin-11 polynucleotide or polypeptide, and / or agonist or antagonist of the present invention include the following Gram-negative bacteria: And Gram-positive bacteria and fungi, but are not limited to: Actinomycetales (eg, Coryneb)
acterium, Mycobacterium, Norcardia), Cr
yptococcus neoformans, Aspergillosis,
Bacillaceae (eg, Anthrax, Clostridium)
, Bacteroidaceae, Blastomycosis, Bordet
ella, Borrelia (for example, Borrelia burgdorfef)
ri), Brucellosis, Candidiasis, Campylob
acter, Coccidioidomycosis, Cryptococco
sis, Dermatocycoses, E.C. coli (for example, Entero)
toxogenic E. coli and Enterohemorrhgic
E. FIG. coli), Enterobacteriaceae (Klebsiel)
la, Salmonella (eg, Salmonella typhi, and Salmonella paratyphi), Serratia, Yer
sinia), Erysipelothrix, Helicobacter, L
egionellosis, Leptospirosis, Listeria,
Mycoplasmatales, Mycobacterium leprae
, Vibrio cholerae, Neisseriaceae (for example, A
cinebacter, Gonorrhea, Menigococcal)
, Meisseria meningitidis, Pasteurellac
ea Infections (e.g., Actinobacillus, Hea
mophilus (eg, Heamophilus influenza B)
Type), Pasteurella), Pseudomonas, Ricketts
iaceae, Chlamydiaceae, Syphilis, Shigel
la spp. , Staphylococcal, Meningiococca
1, Pneumococcal and Streptococcal (eg,
Streptococcus pneumoniae and Group BS
treptococcus). These bacteria or fungi can cause the following diseases or conditions, including but not limited to: bacteremia, endocarditis, ocular infections ( Conjunctivitis, tuberculosis, uveitis), gingivitis, opportunistic infections (eg, AIDS-related infections), periungualitis, prosthesis-related infections, reiter's disease, respiratory tract infections (eg, pertussis or pyometra), sepsis, lime Disease, cat scratching disease, dysentery, paratyphoid fever, food poisoning, typhoid, pneumonia, gonorrhea, meningitis (eg, meningitis A and B meningitis), chlamydiasis, syphilis, diphtheria, Leprosy, paratuberculosis , Tuberculosis, lupus, botulism, gangrene, tetanus, impetigo, rheumatic fever, scarlet fever, sexually transmitted diseases, skin diseases (eg, cellulitis,
Dermatocycoses), toxicemia, urinary tract infections, wound infections. Galectin-11 polypeptides or polynucleotides, or agonists or antagonists, of the invention can be used to treat or detect any of these conditions or diseases. In certain embodiments, the polynucleotides, polypeptides, agonists or antagonists of the invention are used to treat: tetanus, diphtheria, botulism, and / or meningitis B.
【０３４０】 さらに、ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、アゴニス
トもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患もしくは症状を引
き起こす寄生生物因子としては、以下の科が挙げられるが、それらに限定されな
い：Ａｍｅｂｉａｓｉｓ、Ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ、Ｃ
ｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ、Ｄｏｕ
ｒｉｎｅ、Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ、Ｇｉａｒｄｉａｓｉｓ、Ｈｅｌｍｉｎ
ｔｈｉａｓｉｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａｓｉｓ、Ｔ
ｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ、およびＴｒｉｃ
ｈｏｍｏｎａｓおよびＳｐｏｒｏｚｏａｎｓ（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄ
ｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）。これら
の寄生生物は、種々の疾患もしくは症状を引き起こし得、これらの疾患もしくは
症状としては以下が挙げられるが、それらに限定されない：疥癬、***、眼の
感染症、腸の感染症（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患
、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症（ｐｒｅｇｎ
ａｎｃｙ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、およびトキソプラズマ症。ガレクチン
１１のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアン
タゴニストを使用して、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置または検出し得
る。特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまた
はアゴニストもしくはアンタゴニストは、マラリアを処置するために使用される
。In addition, parasitic agents that cause a disease or condition that can be treated or detected by a galectin-11 polynucleotide or polypeptide, agonist or antagonist include, but are not limited to, the following families: Amebiasis, Babesissis , Coccidiosis, C
ryptosporidiosis, Dientamoebiasis, Dou
line, Ectoparasitic, Giardiassis, Helmin
thiasis, Leishmaniasis, Theileriasis, T
oxoplasmosis, Trypanosomiasis, and Tric
homonas and Sporozoans (eg, Plasmodium)
virax, Plasmodium falciparium, Plasmod
ium malariae and Plasmodium ovale). These parasites can cause various diseases or conditions, including but not limited to: scabies, tsutsugamushi disease, eye infections, intestinal infections (eg, Dysentery, giardiasis, liver disease, lung disease, opportunistic infections (eg, AIDS-related), malaria, pregnancy complications (pregn)
ancy complication) and toxoplasmosis. Galectin-11 polypeptides or polynucleotides, or agonists or antagonists, can be used to treat or detect any of these conditions or diseases. In certain embodiments, the polynucleotides, polypeptides, or agonists or antagonists of the invention are used to treat malaria.
【０３４１】 好ましくは、本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／または
アゴニストもしくはアンタゴニストを用いる処置は、有効量のポリペプチドを患
者に投与することによるか、または患者から細胞を取り出してその細胞に本発明
のポリペプチドを供給し、そして操作した細胞を患者に戻すこと（エキソビボ治
療）によるかのいずれかであり得る。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドをワクチンにおいて抗原として使用して、感染性疾患に対する免疫
応答を惹起し得る。Preferably, treatment with a polypeptide or polynucleotide and / or agonist or antagonist of the present invention is by administering an effective amount of the polypeptide to the patient, or by removing cells from the patient and allowing the cells to carry out the treatment. Either by supplying the polypeptide of the invention and returning the engineered cells to the patient (ex vivo treatment). In addition, the polypeptides or polynucleotides of the present invention can be used as an antigen in a vaccine to elicit an immune response against an infectious disease.
【０３４２】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（本明細書中に記載
のガレクチン１１フラグメント、改変体、誘導体、およびアナログ、ならびにガ
レクチン１１のアゴニストおよびアンタゴニストを含む）を使用して、組織の再
生を導く細胞を分化し、増殖し、そして誘引し得る。（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６
：５９−８７（１９９７）を参照のこと。）組織の再生を用いて、先天性欠損、
外傷（創傷、熱傷、切開または潰瘍）、加齢性疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性
関節症（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、外科手術（美
容形成外科手術を含む）、線維症、再灌流障害、または全身性サイトカイン損傷
（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｄａｍａｇｅ）によって損傷された組
織を修復、交換、または保護し得る。Tissue regeneration using galectin-11 polynucleotides or polypeptides (including galectin-11 fragments, variants, derivatives, and analogs described herein, as well as agonists and antagonists of galectin-11). The leading cells can differentiate, proliferate, and attract. (Science 276
: 59-87 (1997). B) Using tissue regeneration, birth defects,
Trauma (wounds, burns, incisions or ulcers), age-related diseases (eg, osteoporosis, osteoarthritis, periodontal disease, liver failure), surgery (including cosmetic plastic surgery), fibrosis, It can repair, replace, or protect tissue that has been damaged by reperfusion injury, or systemic cytokine damage.
【０３４３】 本発明を用いて再生され得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば
、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋組織（平滑筋、骨格筋または心筋）
、脈管組織（脈管内皮を含む）、神経組織、造血組織、および骨格（例えば、骨
、軟骨、腱、および靱帯）組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または低減し
た瘢痕を生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。Tissues that can be regenerated using the present invention include: organs (eg, pancreas, liver, intestine, kidney, skin, endothelium), muscle tissue (smooth, skeletal or cardiac)
Vascular tissue (including vascular endothelium), nervous tissue, hematopoietic tissue, and skeletal (eg, bone, cartilage, tendon, and ligament) tissue. Preferably, the regeneration results in no or reduced scarring. Regeneration may also include angiogenesis.
【０３４４】 さらに、ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（本明細書
中に記載のガレクチン１１フラグメント、改変体、誘導体、およびアナログ、な
らびにガレクチン１１のアゴニストおよびアンタゴニストを含む）は、治癒の困
難な組織の再生を増大し得る。例えば、増大した腱／靱帯再生は、損傷後の回復
時間が早められる。本発明のガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、損傷を回避するための取
り組みにおいてもまた予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾患としては
、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損もしくは靱帯欠損が挙げられる。治癒
されない創傷の組織再生のさらなる例としては、圧迫性潰瘍、弁閉鎖不全と関連
する潰瘍、手術の創傷、および外傷の創傷が挙げられる。In addition, galectin-11 polynucleotides or polypeptides (including galectin-11 fragments, variants, derivatives, and analogs, and galectin-11 agonists and antagonists described herein) may be present in tissues that are difficult to heal. Regeneration can be increased. For example, increased tendon / ligament regeneration hastens recovery time after injury. Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of the invention, can also be used prophylactically in approaches to avoid injury. Particular diseases that can be treated include tendinitis, carpal tunnel syndrome, and other tendon or ligament defects. Further examples of tissue regeneration of unhealed wounds include pressure ulcers, ulcers associated with valve regurgitation, surgical wounds, and trauma wounds.
【０３４５】 同様に、神経組織および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるため
に、本発明のガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または
アゴニストもしくはアンタゴニストを使用することにより再生され得る。この方
法を用いて処置され得る疾患としては、中枢神経系および末梢神経系の疾患、ニ
ューロパシー、または機械的障害および外傷性障害（例えば、脊髄損傷、頭部外
傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。詳細には、末梢神
経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法または他の医学療法か
ら生じる）、限局性ニューロパシー、および中枢神経系疾患（例えば、アルツハ
イマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、お
よびシャイ−ドレーガー症候群）は全て、ガレクチン１１のポリヌクレオチドも
しくはポリペプチド、またはガレクチン１１のアゴニストもしくはアンタゴニス
トを用いて処置され得る。Similarly, neural and brain tissue can also be regenerated by using a galectin-11 polynucleotide or polypeptide of the invention, or an agonist or antagonist, to proliferate and differentiate neural cells. Diseases that can be treated using this method include diseases of the central and peripheral nervous system, neuropathy, or mechanical and traumatic disorders such as spinal cord injury, head trauma, cerebrovascular disease, and stroke. )). In particular, diseases associated with peripheral nerve injury, peripheral neuropathy (eg, resulting from chemotherapy or other medical therapy), localized neuropathy, and central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's choreography) Disease, amyotrophic lateral sclerosis, and Shy-Drager syndrome) can all be treated with galectin-11 polynucleotides or polypeptides, or galectin-11 agonists or antagonists.
【０３４６】 本発明のガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細
胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、マスト細胞、好酸球、上皮細
胞および／または内皮細胞）を身体における特定の部位（例えば、炎症、感染ま
たは過剰増殖の部位）に誘引または移動させる。次いで、移動した細胞は、特定
の外傷または異常を撃退および／または治癒し得る。Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists of the invention may have chemotactic activity. Chemotactic molecules cause cells (eg, monocytes, fibroblasts, neutrophils, T cells, mast cells, eosinophils, epithelial cells and / or endothelial cells) to become specific sites in the body (eg, inflammation, (Site of infection or hyperproliferation). The migrated cells can then repel and / or heal certain traumas or abnormalities.
【０３４７】 本発明のガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増加させ得る。
次いで、これらの走化性分子は、身体における特定の部位を標的にする細胞の数
を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免疫系
障害を処置するために使用され得る。例えば、走化性分子は、免疫細胞を損傷部
位に誘引することによって、創傷および組織に対する他の外傷を処置するために
使用され得る。本発明の走化性分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷
を処置するために使用され得る。A galectin-11 polynucleotide or polypeptide, or agonist or antagonist, of the present invention may increase chemotactic activity of a particular cell.
These chemotactic molecules are then used to treat inflammation, infection, hyperproliferative disorders, or any immune system disorder by increasing the number of cells that target specific sites in the body. obtain. For example, chemotactic molecules can be used to treat wounds and other trauma to tissues by attracting immune cells to the site of injury. The chemotactic molecule of the present invention can also attract fibroblasts, which can be used to treat wounds.
【０３４８】 本発明のガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、走化性活性を阻害し得ることもまた予想さ
れる。これらの分子はまた、障害を処置するために使用され得る。従って、本発
明のガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、走化性のインヒビターとして使用され得る。It is also anticipated that the galectin-11 polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists, of the present invention will be able to inhibit chemotactic activity. These molecules can also be used to treat disorders. Accordingly, the galectin-11 polynucleotides or polypeptides, or agonists or antagonists, of the present invention can be used as chemotactic inhibitors.
【０３４９】 本発明のガレクチン１１の組成物（例えば、ガレクチン１１のポリペプチド、
ポリヌクレオチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニスト）を用い
て処置され得る神経系障害としては、神経系損傷、および軸索の切断、ニューロ
ンの減少もしくは変性、または脱髄のいずれかを生じる疾患または障害が挙げら
れるが、これらに限定されない。患者（ヒト患者および非ヒト哺乳動物患者を含
む）において本発明に従って処置され得る神経系病変としては、中枢神経系（脊
髄、脳を含む）または末梢神経系のいずれかの以下の病変が挙げられるが、これ
らに限定されない：（１）神経系の一部における酸素不足がニューロンの損傷ま
たは死を引き起こす虚血性病変（脳梗塞もしくは脳虚血、または脊髄の梗塞もし
くは虚血を含む）；（２）外傷性病変（物理的損傷によって引き起こされる病変
または手術に関連する病変を含む）（例えば、神経系の一部を切断する病変また
は圧迫損傷）；（３）神経系の一部が悪性組織（これは、悪性腫瘍を有する神経
系または非神経系組織由来の悪性腫瘍のいずれかである）によって破壊または損
傷される悪性病変；（４）神経系の一部が感染の結果として破壊または損傷され
る感染性病変（例えば、膿瘍によるか、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘ
ルペスウイルスもしくは単純ヘルペスウイルスによる感染に関連するか、または
ライム病、結核、梅毒に関連する）；（５）神経系の一部が変性プロセスの結果
として破壊または損傷される変性病変（この変性プロセスとしては、パーキンソ
ン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、または筋萎縮性側索硬化症
（ＡＬＳ）に関連する変性が挙げられるがこれらに限定されない）；（６）神経
系の一部が代謝の栄養障害または疾患によって破壊または損傷される、栄養疾患
または障害に関連する病変（この代謝の栄養障害または疾患としては、ビタミン
Ｂ１２欠乏、葉酸欠乏、ヴェルニッケ疾患、タバコ−アルコール弱視、マルキア
ファーヴァ−ビニャーミ病（脳梁の一次変性）およびアルコール性小脳変性が挙
げられるが、これらに限定されない）；（７）全身性疾患に関連する神経学的病
変（この全身性疾患としては、糖尿病（糖尿病性神経障害、ベル麻痺）、全身性
エリテマトーデス、癌または類肉腫が挙げられるが、これらに限定されない）；
（８）アルコール、鉛、または特定の神経毒を含む毒性物質によって引き起こさ
れる病変；ならびに（９）神経系の一部が脱髄疾患によって破壊または損傷され
る脱髄病変（この脱髄疾患としては、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連
神経障害、横神経障害または種々の病因、進行性多病巣性白質脳症、および橋中
央ミエリン溶解が挙げられるが、これらに限定されない）。A composition of Galectin 11 of the present invention (eg, a Galectin 11 polypeptide,
Nervous system disorders that can be treated with polynucleotides and / or agonists or antagonists) include nervous system damage and diseases or disorders that result in either axonal transection, neuronal loss or degeneration, or demyelination. But not limited to them. Nervous system lesions that can be treated in accordance with the present invention in patients (including human and non-human mammal patients) include the following lesions of either the central nervous system (including the spinal cord, brain) or the peripheral nervous system But not limited to: (1) ischemic lesions (including cerebral infarction or cerebral ischemia, or spinal cord infarction or ischemia) where oxygen deprivation in parts of the nervous system causes damage or death of neurons; ) Traumatic lesions (including lesions caused by physical injury or surgery-related lesions) (eg, lesions that cut parts of the nervous system or compression injuries); (3) parts of the nervous system are malignant tissues ( This is either a nervous system with malignancy or a malignancy derived from non-nervous tissue) malignant lesions that are destroyed or damaged by; Infectious lesions that are destroyed or damaged (eg, by an abscess or associated with infection by human immunodeficiency virus, herpes zoster or herpes simplex virus, or associated with Lyme disease, tuberculosis, syphilis); 5) degenerative lesions in which parts of the nervous system are destroyed or damaged as a result of the degenerative process (including degenerative processes such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, or amyotrophic lateral sclerosis (ALS)) (6) a pathology associated with a nutritional disease or disorder in which a portion of the nervous system is destroyed or damaged by a metabolic nutritional disorder or disease, such as a metabolic nutritional disorder or disorder. Disorders include vitamin B12 deficiency, folate deficiency, Wernicke disease, tobacco-alcohol amblyopia, (7) Neurological lesions associated with systemic disease, including, but not limited to, Kiafava-Vinami disease (primary degeneration of the corpus callosum) and alcoholic cerebellar degeneration. Diabetic neuropathy, Bell's palsy), systemic lupus erythematosus, cancer or sarcoma) but not limited to;
(8) lesions caused by toxic substances, including alcohol, lead, or certain neurotoxins; and (9) demyelinating lesions in which parts of the nervous system are destroyed or damaged by demyelinating diseases. , Multiple sclerosis, human immunodeficiency virus-related neuropathy, transverse neuropathy or various etiologies, progressive multifocal leukoencephalopathy, and central pontine myelinolysis).
【０３５０】 好ましい実施形態においては、本発明のガレクチン１１のポリペプチド、ポリ
ヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、脳低酸素症の有害
な影響から神経細胞を保護するために使用される。この実施形態に従って、本発
明のガレクチン１１組成物は、脳低酸素症に関連する神経細胞損傷を処置または
予防するために使用される。この実施形態の１つの局面においては、本発明のガ
レクチン１１のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはア
ンタゴニストは、脳虚血に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために使
用される。この実施形態の別の局面においては、本発明のガレクチン１１のポリ
ペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、脳
梗塞に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために使用される。この実施
形態の別の局面においては、本発明のガレクチン１１のポリペプチド、ポリヌク
レオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、発作に関連する神経細
胞損傷を処置または予防するために使用される。この実施形態のさらなる局面に
おいては、本発明のガレクチン１１のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または
アゴニストもしくはアンタゴニストは、心臓発作に関連する神経細胞損傷を処置
または予防するために使用される。In a preferred embodiment, galectin-11 polypeptides, polynucleotides, or agonists or antagonists of the invention are used to protect neurons from the deleterious effects of cerebral hypoxia. According to this embodiment, the galectin 11 composition of the invention is used to treat or prevent neuronal damage associated with cerebral hypoxia. In one aspect of this embodiment, a galectin-11 polypeptide, polynucleotide, or agonist or antagonist of the invention is used to treat or prevent neuronal damage associated with cerebral ischemia. In another aspect of this embodiment, a galectin-11 polypeptide, polynucleotide, or agonist or antagonist of the invention is used to treat or prevent neuronal damage associated with cerebral infarction. In another aspect of this embodiment, a galectin-11 polypeptide, polynucleotide, or agonist or antagonist of the invention is used to treat or prevent stroke-related neuronal damage. In a further aspect of this embodiment, a galectin-11 polypeptide, polynucleotide, or agonist or antagonist of the invention is used to treat or prevent nerve cell damage associated with a heart attack.
【０３５１】 神経系障害を処置または予防するために有用な本発明の組成物は、ニューロン
の生存または分化の促進における生物学的活性について試験することによって選
択され得る。（限定の目的ではないが）例えば、以下の効果のいずれかを誘発す
る本発明のガレクチン１１組成物は、本発明に従って有用であり得る：（１）培
養物中のニューロンの増加した生存時間；（２）培養物中またはインビボにおけ
るニューロンの増加した出芽；（３）培養物中またはインビボにおけるニューロ
ン関連分子（例えば、運動ニューロンに関しては、コリンアセチルトランスフェ
ラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ）の増加した生成；あるいは（４）イ
ンビボにおけるニューロン機能不全減少した症状。このような効果は、当該分野
において公知の任意の方法によって測定され得る。好ましい、非限定的な実施形
態においては、ニューロンの増加した生存は、本明細書中に記載されるか、そう
でなければ当該分野において公知の方法（例えば、Ａｒａｋａｗａら（Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ．１０：３５０７−３５１５（１９９０））に記載される方法）を
用いて慣習的に測定され得；ニューロンの増加した出芽は、当該分野において公
知の方法（例えば、Ｐｅｓｔｒｏｎｋら（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５−
８２（１９８０））またはＢｒｏｗｎら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．
４：１７−４２（１９８１））に記載される方法）によって検出され得；ニュー
ロン関連分子の増加した生成は、当該分野で公知であり、測定されるべき分子に
依存した技術を用いて、バイオアッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、ノーザンブ
ロットアッセイなどによって測定され得；そして運動ニューロン機能不全は、運
動ニューロン障害の物理的症状（例えば、弱さ、運動ニューロン伝導速度または
機能的障害）を評価することによって測定され得る。Compositions of the invention useful for treating or preventing a nervous system disorder can be selected by testing for biological activity in promoting neuronal survival or differentiation. For example (but not by way of limitation), a galectin-11 composition of the invention that elicits any of the following effects may be useful according to the invention: (1) increased survival time of neurons in culture; (2) increased sprouting of neurons in culture or in vivo; (3) increased production of neuron-associated molecules (eg, for motor neurons, choline acetyltransferase or acetylcholinesterase) in culture or in vivo; or (4) 2.) Symptoms of reduced neuronal dysfunction in vivo. Such an effect can be measured by any method known in the art. In a preferred, non-limiting embodiment, the increased survival of neurons is determined by methods described herein or otherwise known in the art (eg, Arakawa et al. (J. Ne.)
urosci. 10: 3507-3515 (1990)); increased sprouting of neurons can be measured by methods known in the art (eg, Pestronk et al. (Exp. Neurol. 70: 65-
82 (1980)) or Brown et al. (Ann. Rev. Neurosci.
4: 17-42 (1981)); increased production of neuron-associated molecules is known in the art and can be performed using techniques that depend on the molecule to be measured. Motor neuron dysfunction may be measured by assays, enzyme assays, antibody binding, Northern blot assays, etc .; and assessing the physical symptoms of motor neuron damage (eg, weakness, motor neuron conduction velocity or functional impairment) Can be measured by
【０３５２】 特定の実施形態において、本願発明に従って処置され得る運動ニューロン障害
としては、以下のような障害が挙げられるが、それらに限定されない：梗塞形成
、感染、毒素への曝露、外傷、外科的損傷、変性疾患または運動ニューロンなら
びに神経系の他の構成要素に影響し得る悪性疾患のような障害、ならびに筋萎縮
性側索硬化症および、これらに限定されないが、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性
球麻痺、原発性側索硬化症、乳児性および若年性筋萎縮、小児の進行性球麻痺（
ファチオ・ロンデ症候群）、ポリオおよびポリオ後症候群、ならびに遺伝性運動
感覚性ニューロパシー（シャルコー‐マリー‐ツース病）を含む、ニューロンに
選択的に影響する障害。In certain embodiments, motor neuron disorders that can be treated according to the present invention include, but are not limited to, the following: infarction, infection, exposure to toxins, trauma, surgical Disorders such as injury, degenerative diseases or malignancies that can affect motor neurons and other components of the nervous system, and amyotrophic lateral sclerosis and, but not limited to, progressive spinal muscular atrophy; Progressive bulbar palsy, primary lateral sclerosis, infantile and juvenile muscular atrophy, progressive bulbar palsy in children (
Disorders that selectively affect neurons, including Fachio-Ronde syndrome), polio and post-polio syndrome, and hereditary kinesthetic neuropathy (Charcot-Marie-Tooth disease).
【０３５３】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト、および／またはアン
タゴニストを用いて処置または検出され得る神経性疾患のさらなる例としては、
以下が挙げられる：脳疾患（例えば、代謝脳疾患（母体性フェニルケトン尿症の
ようなフェニルケトン尿症、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損、ピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ複合体欠損、ヴェルニッケ脳障害、脳水腫を含む）、小脳新生物の
ような脳新生物（テント下新生物、脈絡叢新生物のような脳室新生物、視床下部
新生物、テント上新生物、キャナヴァン病を含む）、小脳性運動失調のような小
脳疾患（脊髄小脳変性（例えば、毛細血管拡張性運動失調）、小脳性共同運動障
害、フリートライヒ運動失調、マチャド−ジョセフ病、オリーブ橋小脳萎縮を含
む）、テント下新生物のような小脳新生物、広汎性脳硬化症（例えば、軸周囲性
脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性汎脳炎）、脳
血管障害（例えば、頸動脈疾患（頸動脈血栓症、頸動脈狭窄症およびモヤモヤ病
を含む）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、脳酸素欠乏症、大脳動
脈硬化症、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、脳塞栓症および血栓症（例えば
、頸動脈血栓症、洞血栓症およびヴァレンベルク症候群）、脳出血（例えば、硬
膜上血腫、硬膜下血腫およびクモ膜下出血）、脳梗塞、脳虚血（例えば、一過性
脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群および椎骨基部不全）、血管性痴呆（例えば、多
発脳梗塞性痴呆）、室周白斑、血管性頭痛（例えば、群発性頭痛、片頭痛）、痴
呆（例えば、ＡＩＤＳ痴呆複合症、初老期痴呆（例えば、アルツハイマー病およ
びクロイツフェルト−ヤーコプ病）、老年痴呆（例えば、アルツハイマー病およ
び進行性核上性麻痺）、血管性痴呆（例えば、多発脳梗塞性痴呆））、脳炎（軸
周囲性脳炎、ウイルス性脳炎（例えば、流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳
炎、ダニ媒介脳炎および西ナイル熱）を含む）、急性播種性脳脊髄炎、髄膜脳炎
（例えば、ブドウ膜脳炎症候群、脳炎後のパーキンソン病および亜急性硬化性汎
脳炎）、脳軟化症（例えば、室周白斑）、てんかん（例えば、全身てんかん（点
灯麻痺を含む）、アプサンスてんかん、ミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ症
候群、強直性間代性てんかんを含む）、部分てんかん（例えば、複雑部分てんか
ん、前頭葉てんかんおよび側頭葉てんかん）、外傷後てんかん、てんかん重積持
続状態（例えば、持続性部分てんかん）を含む）、ハレルフォルデン−シュパッ
ツ症候群、水頭症（例えば、ダンディ−ウォーカー症候群および正常圧水頭症）
、視床下部疾患（例えば、視床下部新生物）、大脳マラリア、ナルコレプシー（
脱力発作を含む）、延髄ポリオ、大脳偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床
疾患、トキソプラスマ症、頭蓋内結核腫およびツェルヴェーガー症候群、中枢神
経系感染（例えば、ＡＩＤＳ痴呆複合症、ブレーン膿瘍、硬膜下蓄膿、脳脊髄炎
（例えば、ウマ脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎）、
ビスナ、大脳マラリア、髄膜炎（例えば、クモ膜炎、無菌性髄膜炎（例えば、ウ
イルス性髄膜炎（リンパ球性脈絡髄膜炎を含む）、細菌性髄膜炎（ヘモフィルス
髄膜炎、リステリア髄膜炎を含む）、髄膜炎菌性髄膜炎（例えば、ウォーターハ
ウス−フリーデリックセン症候群、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核）、真菌類髄
膜炎（例えば、クリプトコックス髄膜炎）、硬膜下滲出、髄膜脳炎（例えば、ブ
ドウ膜髄膜脳炎症候群）、脊髄炎（例えば、横断脊髄炎）、神経梅毒（例えば、
脊髄ろう）、ポリオ（延髄ポリオおよびポリオ後症候群を含む）、プリオン疾患
（例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ症候群、ウシ海綿状脳症、ゲルストマン
−シュトロイスラー症候群、クールー、スクラピー）、大脳トキソプラスマ症、
中枢神経系新生物（例えば、脳新生物（小脳新生物（例えば、テント下新生物）
、脳室新生物（例えば、脈絡叢新生物）、視床下部新生物およびテント上新生物
を含む）、髄膜新生物、脊髄新生物（硬膜外新生物を含む）、脱髄疾患（例えば
、キャナヴァン病）、広汎性脳硬化症（副腎脳白質ジストロフィー、軸周囲性脳
炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症のような広汎性脳硬化症を含む）、
アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多
発性硬化症、橋中央ミエリン溶解、横断脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊
柱前弯症、慢性疲労症候群、ビスナ、高圧神経症候群、髄膜症、脊髄疾患（例え
ば、先天性筋無緊張症、筋萎縮性側索硬化症）、棘筋萎縮症（例えば、ヴェルド
ニッヒ−ホフマン病）、脊髄圧迫、脊髄新生物（例えば、硬膜外新生物）、脊髄
空洞症、脊髄ろう、スティッフマン症候群、精神遅滞（例えば、Ａｎｇｅｌｍａ
ｎ症候群、ネコ鳴き症候群、ド・ランゲ症候群、ダウン症候群）、ガングリオシ
ドーシス（例えば、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）、ザントホフ病、テイ−サ
ックス病）、ハートナップ病、ホモシスチン尿症、ローレンス−ムーン−ビード
ル症候群、レッシュ−ナイハン症候群、カエデシロップ病、ムコリピドーシス（
例えば、フコース蓄積症）、セロイド脂褐素沈着症、眼脳腎症候群、フェニルケ
トン尿症（例えば、母体フェニルケトン尿症）、プラーダー−ヴィリ症候群、レ
ット症候群、ルービンスタイン−テービ症候群、結節硬化症、ＷＡＧＲ症候群、
神経系異常（例えば、全前脳症、神経管欠損（例えば、無脳症（水無脳症（ｈｙ
ｄｒａｎｇｅｎｃｅｐｈａｌｙ）を含む）））、アルノルト−キアーリ奇形、脳
ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、脊椎癒合不全（例えば、嚢胞性二分脊椎および
潜在性二分脊椎）、遺伝性感覚ニューロン障害および運動ニューロン障害（シャ
ルコー−マリー病を含む）、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺、
ヴェルドニッヒ−ホフマン病、遺伝性運動ニューロン障害および感覚ニューロン
障害（例えば、先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害）、神経症的発現（
例えば、認知不能症（ゲルストマン症候群を含む）、健忘症（例えば、逆向性健
忘症）、失行症、神経因性膀胱障害、脱力発作、伝達障害（例えば、聴覚障害（
難聴、部分的聴力欠損、大声（ｌｏｕｄｎｅｓｓ）レクルートメントおよび耳鳴
を含む）、言語障害（例えば、失語症（失書症、名称失語症、ブロカ失語症およ
びヴェルニッケ失語症を含む）、失読症（例えば、後天性失読症）、言語発達障
害、発語障害（例えば、失語症（名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ
失語症を含む））、構音障害、伝達障害（例えば、発語障害（構語障害、反響言
語、無言症およびどもりを含む）、発声障害（例えば、失声症および嗄声））、
除脳硬直状態、せん妄、束形成、幻覚、髄膜症、運動障害（例えば、Ａｎｇｅｌ
ｍａｎ症候群、運動失調、アテトーシス、舞踏病、失調症、運動低下症、筋緊張
低下、ミオクロヌス、チック、斜頸および振せん）、筋緊張亢進（例えば、筋硬
直（例えば、スティッフマン症候群）、筋痙性、麻痺（例えば、顔面神経麻痺（
耳帯状疱疹を含む）、胃不全麻痺、片麻痺、眼筋麻痺（例えば、複視、デュエー
ン症候群、ホルナー症候群、慢性進行性外眼筋麻痺症（例えば、キーンズ症候群
））、延髄麻痺、熱帯性痙性不全対麻痺、対麻痺（例えば、ブラウン−セカール
症候群、四肢麻痺）、呼吸性麻痺および声帯麻痺、不全麻痺）、幻影肢、味覚障
害（例えば、無味覚症および味覚不全）、視覚障害（例えば、弱視、失明、色覚
障害、複視、半盲、暗点および正常以下の視覚）、睡眠障害（例えば、睡眠過剰
（クライネ−レヴィン症候群を含む）、不眠症、および夢遊症）、痙縮（例えば
、開口障害）、意識消失（例えば、昏睡、持続性植物状態および失神）および眩
暈、神経筋障害（例えば、先天性筋無緊張症、筋萎縮性側索硬化症、ランバート
−イートン筋無力症症候群、運動ニューロン疾患、筋萎縮（例えば、棘筋萎縮、
シャルコー−マリー病およびヴェルドニッヒ−ホフマン病）、ポリオ後症候群、
筋ジストロフィー、重症筋無力症、萎縮性ミオトニー、先天性ミオトニー、ネマ
リンミオパシー、家族性周期性四肢麻痺、多発性パラミオクロヌス（ｐａｒａｍ
ｙｌｏｃｌｏｎｕｓ）、熱帯性痙性不全対麻痺およびスティッフマン症候群）、
末梢神経系障害（例えば、先端疼痛症）、アミロイドニューロパシー、自律神経
系疾患（例えば、アーディー症候群、Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ症候群、家族性自
律神経障害、ホルナー症候群、反射***感神経性ジストロフィーおよびシャイ−
ドレーガー症候群）、脳神経疾患（例えば、聴神経疾患（例えば、聴神経腫（２
型神経線維腫症を含む））、顔面神経疾患（例えば、顔面神経痛、メルカーソン
−ローゼンタール症候群、眼球運動障害（弱視、眼振、動眼神経麻痺を含む）、
眼筋麻痺（例えば、デュエーン症候群、ホルナー症候群、慢性進行性外眼筋麻痺
症（キーンズ症候群を含む））、斜視（例えば、内斜視および外斜視）、視神経
麻痺、視神経疾患（例えば、眼萎縮症（遺伝性眼萎縮症を含む）、視神経円板結
晶腔、視神経炎（例えば、視神経脊髄炎、乳頭水腫））、三叉神経痛、声帯麻痺
、脱髄疾患（例えば、視神経脊髄炎および脊柱前弯症）、糖尿病性ニューロパシ
ー（例えば、糖尿病足）、神経圧挫症候群（例えば、手根管症候群、足根管症候
群）、胸郭出口症候群（例えば、頸肋症候群）、尺骨神経圧挫症候群、神経痛（
例えば、カウザルギー、頸腕神経痛、顔面神経痛および三叉神経痛）、神経炎（
例えば、実験的アレルギー性神経炎、眼神経炎、多発性神経炎、多発神経根神経
炎および神経根炎（例えば、多発性神経根炎））、遺伝性運動ニューロン障害お
よび感覚ニューロン障害（例えば、シャルコー−マリー病）、遺伝性眼萎縮症、
レフサム病、遺伝性痙性対麻痺およびヴェルドニッヒ−ホフマン病、遺伝性感覚
ニューロン障害および自律神経ニューロン障害（先天性痛覚脱失症および家族性
自律神経障害を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐骨神経痛、味覚性発汗症およびテ
タニー）。Further examples of neurological disorders that can be treated or detected using the polynucleotides, polypeptides, agonists, and / or antagonists of the invention include:
Brain disorders (eg, metabolic brain disorders (including phenylketonuria such as maternal phenylketonuria, pyruvate carboxylase deficiency, pyruvate dehydrogenase complex deficiency, Wernicke encephalopathy, cerebral edema)) Brain neoplasms such as cerebellar neoplasms (including subventricular neoplasms, ventricular neoplasms such as choroid plexus neoplasms, hypothalamus neoplasms, supratentorial neoplasms, Canavan's disease), such as cerebellar ataxia Cerebellar disorders (including spinocerebellar degeneration (eg, ataxia telangiectasia), cerebellar coordination disorder, Friedreich's ataxia, Machado-Joseph disease, Olive bridge cerebellar atrophy), cerebellar neoplasms such as subtentive neoplasms Organisms, diffuse cerebral sclerosis (eg, periaxial encephalitis, bulbous cell leukodystrophy, metachromatic leukodystrophy and subacute sclerosing panencephalitis), cerebrovascular disorders (eg, Arterial disease (including carotid thrombosis, carotid stenosis and moyamoya disease), cerebral amyloid angiopathy, cerebral aneurysm, cerebral anoxia, cerebral atherosclerosis, cerebral arteriovenous malformations, cerebral artery disease, cerebral embolism And thrombosis (eg, carotid thrombosis, sinus thrombosis and Wallenberg syndrome), cerebral hemorrhage (eg, epidural hematoma, subdural hematoma and subarachnoid hemorrhage), cerebral infarction, cerebral ischemia (eg, Transient cerebral ischemia, subclavian artery stealing syndrome and vertebral base failure), vascular dementia (eg, multiple cerebral infarction dementia), vitiligo periplasm, vascular headache (eg, cluster headache, migraine), Dementia (eg, AIDS dementia complex, presenile dementia (eg, Alzheimer's disease and Creutzfeldt-Jakob disease), senile dementia (eg, Alzheimer's disease and progressive supranuclear palsy), vascular dementia (eg, Encephalitis (including periaxial encephalitis, viral encephalitis (eg, pandemic encephalitis, Japanese encephalitis, St. Louis encephalitis, tick-borne encephalitis and West Nile fever)), acute disseminated cerebrospinal cord Inflammation, meningoencephalitis (eg, uveoencephalitis syndrome, post-encephalitis Parkinson's disease and subacute sclerosing panencephalitis), cerebral malacia (eg, periatrial vitiligo), epilepsy (eg, generalized epilepsy (including lighting paralysis)) Apsans epilepsy, myoclonic epilepsy (including MERRF syndrome, tonic-clonic epilepsy), partial epilepsy (eg, complex partial epilepsy, frontal and temporal lobe epilepsy), post-traumatic epilepsy, status epilepticus (eg, (Including persistent partial epilepsy)), Harel-Folden-Spatz syndrome, hydrocephalus (eg, Dandy-Walker syndrome and And normal pressure hydrocephalus)
, Hypothalamic disorders (eg, hypothalamic neoplasms), cerebral malaria, narcolepsy (
Cataplexy, including cataplexy), medullary polio, cerebral pseudotumor, Rett syndrome, Reye syndrome, thalamus disease, toxoplasmosis, intracranial tuberculoma and Zellweger syndrome, central nervous system infections (eg, AIDS dementia complex, brain abscess, Subdural pyogenesis, encephalomyelitis (eg, equine encephalomyelitis, Venezuelan equine encephalomyelitis, necrotizing hemorrhagic encephalomyelitis),
Visna, cerebral malaria, meningitis (eg, arachnoid, aseptic meningitis (eg, viral meningitis (including lymphocytic choriomeningitis)), bacterial meningitis (hemophilus meningitis) , Including Listeria meningitis), meningococcal meningitis (e.g., Waterhouse-Friedericken syndrome, pneumococcal meningitis, and meningitis tuberculosis), fungal meningitis (e.g., cryptococcal medulla) Meningitis), subdural effusion, meningoencephalitis (eg, uveo-meningoencephalitis syndrome), myelitis (eg, transverse myelitis), neurosyphilis (eg,
Spinal fistula), polio (including medullary polio and post-polio syndrome), prion diseases (eg, Creutzfeldt-Jakob syndrome, bovine spongiform encephalopathy, Gerstmann-Stroisler syndrome, kuru, scrapie), cerebral toxoplasmosis,
Central nervous system neoplasms (eg, brain neoplasms (cerebellar neoplasms (eg, subtentive neoplasms))
, Ventricular neoplasms (eg, choroid plexus neoplasms), hypothalamic and supratentorial neoplasms, meningeal neoplasms, spinal neoplasms (including epidural neoplasms), demyelinating diseases (eg, , Canavan's disease), diffuse cerebral sclerosis (including diffuse cerebral sclerosis such as adrenoleukodystrophy, periaxial encephalitis, squamous cell leukodystrophy, metachromatic leukodystrophy),
Allergic encephalomyelitis, necrotizing hemorrhagic encephalomyelitis, progressive multifocal leukoencephalopathy, multiple sclerosis, central pontine myelinolysis, transverse myelitis, neuromyelitis optica, scrapie, lordosis, chronic fatigue syndrome , Visna, hypertension syndrome, meningopathy, spinal cord disease (eg, congenital myotonia, amyotrophic lateral sclerosis), spinal muscular atrophy (eg, Werdnig-Hoffman disease), spinal cord compression, spinal cord Neoplasms (eg, epidural neoplasms), syringomyelia, spinal fistula, stiff man syndrome, mental retardation (eg, Angelma)
n syndrome, cat barking syndrome, de Lange syndrome, Down syndrome), gangliosidosis (eg, gangliosidosis G (M1), Zandhov's disease, Tay-Sachs disease), heart nap disease, homocystinuria, Lawrence-moon -Beadle syndrome, Resh-Nyhan syndrome, maple syrup disease, mucolipidosis (
For example, fucose storage disease), erythropoietic celloidosis, ophthalmorenal syndrome, phenylketonuria (eg, maternal phenylketonuria), Prader-Willi syndrome, Rett syndrome, Rubinstein-Tevi syndrome, tuberous sclerosis , WAGR syndrome,
Nervous system abnormalities (eg, forebrain, neural tube defects (eg, encephalopathy (water encephalopathy (hy
))), Arnold-Chiari malformations, cerebral hernia, meningocele, meningocele, malunion (eg, cystic spina bifida and occult spina bifida), hereditary sensory neuropathy and motor neurons Disorders (including Charcot-Marie disease), hereditary ocular atrophy, Refsum's disease, hereditary spastic paraplegia,
Werdnig-Hoffman disease, hereditary motor and sensory neuron disorders (eg, congenital anesthesia and familial autonomic disorders), neurotic manifestations (
For example, dementia (including Gerstmann syndrome), amnesia (eg, retrograde amnesia), apraxia, neuropathic bladder disorder, cataplexy, impaired transmission (eg, hearing impairment (
Deafness, partial hearing loss, including loudness recruitment and tinnitus, speech disorders (eg, aphasia (including alexia, name aphasia, Broca aphasia and Wernicke aphasia), dyslexia (eg, acquired Dyslexia), language development disorders, speech disorders (eg, aphasia (including name aphasia, Broca aphasia and Wernicke aphasia)), dysarthria, communication disorders (eg, speech disorders (dyslexia, reverberant language, silence and Stuttering), dysphonia (eg, ataxia and hoarseness),
Decerebrate stiffness, delirium, fasciculation, hallucinations, meningopathy, movement disorders (eg, Angel
man syndrome, ataxia, athetosis, chorea, ataxia, hypokinesia, hypotonia, myoclonus, tics, torticollis and tremor), hypertonia (eg, stiffness (eg, stiff man syndrome), muscle Spasticity, paralysis (for example, facial paralysis (
Gastric palsy, hemiplegia, ophthalmoplegia (eg, diplopia, Duane's syndrome, Horner's syndrome, chronic progressive external ophthalmoplegia (eg, Keen's syndrome)), bulbar palsy, tropical Spastic paraparesis, paraplegia (eg, Brown-Secar syndrome, quadriplegia), respiratory and vocal cord paralysis, paresis), phantom limb, taste disorders (eg, anesthesia and dysphagia), visual impairment (eg, , Amblyopia, blindness, color blindness, diplopia, semi-blindness, scotoma and subnormal vision), sleep disorders (eg, hypersomnia (including Kleine-Levin syndrome), insomnia, and sleepwalking), spasticity (eg, , Trismus), loss of consciousness (eg, coma, persistent vegetative state and syncope) and dizziness, neuromuscular disorders (eg, congenital myotonia, amyotrophic lateral sclerosis, Lambert-Eaton myasthenia) Syndrome, motor neuron disease, muscular atrophy (e.g., spinal muscular atrophy,
Charcot-Marie disease and Werdnig-Hoffman disease), post-polio syndrome,
Muscular dystrophy, myasthenia gravis, atrophic myotonia, congenital myotony, nemarin myopathy, familial periodic limb paralysis, polyparamyoclonus (param)
yloclonus), tropical spastic paraparesis and stiff man syndrome),
Peripheral nervous system disorders (eg apical pain), amyloid neuropathy, autonomic nervous system disorders (eg Ardy syndrome, Barre-Lieou syndrome, familial autonomic dysfunction, Horner syndrome, reflex sympathetic dystrophy and Shy-
Dräger syndrome), cranial nerve diseases (for example, acoustic nerve disease (for example, acoustic neuroma (2
Neurofibromatosis), facial nerve disorders (eg, facial neuralgia, Mercarson-Rosenthal syndrome, oculomotor disorders (including amblyopia, nystagmus, oculomotor paralysis),
Ophthalmoplegia (eg, Duane's Syndrome, Horner's Syndrome, Chronic Progressive External Ophthalmoplegia (including Keynes' Syndrome)), Strabismus (eg, Internal and External Strabismus), Optic Nerve, Optic Neuropathy (eg, Eye Atrophy) (Including hereditary ocular atrophy), optic disc crystal space, optic neuritis (eg, optic neuromyelitis, papillary edema), trigeminal neuralgia, vocal cord paralysis, demyelinating disease (eg, optic neuromyelitis and lordosis) , Diabetic neuropathy (eg, diabetic foot), nerve crush syndrome (eg, carpal tunnel syndrome, tarsal tunnel syndrome), thoracic outlet syndrome (eg, cervical rib syndrome), ulnar nerve crush syndrome, neuralgia (
For example, causalgia, cervical and neuralgia, facial and trigeminal neuralgia), neuritis (
For example, experimental allergic neuritis, optic neuritis, polyneuritis, polyradiculoneuritis and radiculitis (eg, polyradiculitis), hereditary motor and sensory neuronal disorders (eg, Charcot-Marie disease), hereditary eye atrophy,
Refsum's disease, hereditary spastic paraplegia and Werdnig-Hoffman disease, hereditary sensory and autonomic neuronal disorders (including congenital analgesia and familial autonomic disorders), POEMS syndrome, sciatica, taste Sweating and tetany).
【０３５４】 本発明のなおさらなる局面に従って、ガレクチン１１のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、ならびにガレクチン１１のアゴニストもしくはアンタゴニス
トを、治療目的のため、例えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基
底ケラチノサイトを刺激するため、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺
激するために、利用するためのプロセスが提供される。ガレクチン１１のポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチン１１のアゴニストもしく
はアンタゴニストは、以下を含む創傷治癒を刺激することにおいて臨床的に有用
であり得る：外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮および表皮の損傷を含む
）、眼組織の創傷、歯の組織の創傷、口腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、
肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露または化学物質による熱
傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、***、栄養失調、ビタミン欠乏
、ならびにステロイド、放射能療法および抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用
いる全身性処置に関連する合併症）。ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、ならびにガレクチン１１のアゴニストもしくはアンタゴニスト
は、皮膚の欠失後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。In accordance with yet a further aspect of the present invention, galectin-11 polynucleotides or polypeptides, and agonists or antagonists of galectin-11, are used to modulate epithelial cell proliferation and basal keratinocytes for therapeutic purposes, eg, for wound healing purposes. Processes for utilization are provided to stimulate and to stimulate hair follicle production and skin wound healing. Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, and agonists or antagonists of galectin-11, may be clinically useful in stimulating wound healing, including: surgical wounds, resected wounds, deep wounds (dermis and epidermis) Ocular wounds, tooth tissue wounds, oral wounds, diabetic ulcers, skin ulcers,
Elbow ulcers, arterial ulcers, venous stasis ulcers, heat or chemical burns, and other abnormal wound healing conditions (eg, uremia, malnutrition, vitamin deficiency, and steroids, radiotherapy) And complications associated with systemic treatment with antineoplastic drugs and antimetabolites). Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can be used to promote skin recovery after skin loss.
【０３５５】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチ
ン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）
への皮膚移植片の付着を増大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激す
るために使用され得る。以下は、ガレクチン１１のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド、ガレクチン１１のアゴニストまたはアンタゴニストが創傷床への付着
を増大するために使用され得る、移植片の型である：自家移植片、人工皮膚、同
種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐ
ｄｅｒｍｉｃ ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレア−
ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移
植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（
ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、層板状の移植片、網状移
植片、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大網移植片（ｏｍｅｎｐａｌ
ｇｒａｆｔ）、パッチの移植片、茎状移植片、全層移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔ
ｉｎｇ ｇｒａｆｔ）、分層植皮片、分層皮膚移植片。ガレクチン１１のポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチン１１のアゴニストもしく
はアンタゴニストは、皮膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改
善するために使用され得る。Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can be used in wound beds.
Can be used to increase the attachment of skin grafts to the skin and to stimulate re-epithelialization from the wound bed. The following are types of grafts in which a galectin 11 polynucleotide or polypeptide, a galectin 11 agonist or antagonist can be used to increase adhesion to the wound bed: autograft, artificial skin, allograft (Allograft), autograft, autoepidermal graft (autoep)
dermic graft, avascular graft, Blair-
Brown grafts, bone grafts, embryonic tissue grafts, dermal grafts, delayed grafts, skin grafts, epidermal grafts, fascia grafts, full thickness skin grafts, xenografts
ogous graft, xenograft, allograft (
homologous graft, proliferative graft, lamellar graft, reticular graft, mucosal graft, Olie-Tielsch graft, omental graft (omenpal)
graft, patch graft, stalk graft, full thickness graft (penetrat)
ing graft, split skin grafts, split skin grafts. Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can be used to promote skin strength and improve the appearance of aged skin.
【０３５６】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチ
ン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳
房、膵臓、胃、小腸（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における
上皮細胞増殖における変化を生じると考えられる。ガレクチン１１のポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチン１１のアゴニストもしくはア
ンタゴニストは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝
実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ム
チン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管
内に含まれるそれらの前駆体）の増殖を促進し得る。ガレクチン１１のポリヌク
レオチドもしくはポリペプチド、アゴニストもしくはアンタゴニストは、内皮細
胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, may also alter hepatocyte proliferation and epithelial cell proliferation in lung, breast, pancreas, stomach, small intesting, and large intestine. Likely to occur. Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can be used in epithelial cells (eg, sebocytes, hair follicles, hepatic parenchymal cells, alveolar epithelial cells type II pneumocyte, mucin production). Goblet cells, and other epithelial cells, and their precursors contained in the skin, lung, liver, and gastrointestinal tract). Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, agonists or antagonists can promote proliferation of endothelial cells, keratinocytes, and basal keratinocytes.
【０３５７】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチ
ン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、照射、化学療法処置または
ウイルス感染から生じる腸の毒性の副作用を低減するために使用され得る。ガレ
クチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチン１１
のアゴニストもしくはアンタゴニストは、小腸粘膜上で細胞保護的な効果を有し
得る。ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレ
クチン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、化学療法およびウイル
ス感染から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口粘膜）の治癒を刺激し得る
。Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can also be used to reduce intestinal toxic side effects resulting from irradiation, chemotherapeutic treatment or viral infection. Galectin 11 polynucleotide or polypeptide, and galectin 11
May have a cytoprotective effect on the small intestinal mucosa. Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can also stimulate the healing of mucositis (oral mucosa) resulting from chemotherapy and viral infection.
【０３５８】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチ
ン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分
的な厚さの皮膚欠損における皮膚の十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および
皮脂腺の再増殖）、乾癬のような他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得
る。ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレク
チン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストは、表皮水疱症、これらの損傷の
再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼痛性の水疱を生じる内在的
な真皮への表皮の接着における欠損を処置するために使用され得る。ガレクチン
１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチン１１のアゴ
ニストもしくはアンタゴニストはまた、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、そ
して粘膜の内層の瘢痕形成ならびにより迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の
内層の再生による治癒を助けるために使用され得る。炎症性腸疾患（例えば、ク
ーロン病および潰瘍性大腸結腸炎）は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の
崩壊を生じる疾患である。従って、ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド、ならびにガレクチン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストは
、粘膜表面の再表面化（ｒｅｓｕｌｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な治癒
を助けるため、および炎症性腸疾患の進行を予防するために、使用され得る。ガ
レクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ガレクチン１１のアゴ
ニストもしくはアンタゴニストを用いる処置は、胃腸管全体の粘膜の産生に対し
て有意な効果を有することが予測され、そして腸粘膜を、摂取されたかまたは外
科手術後の有害な物質から保護するために使用され得る。ガレクチン１１のポリ
ヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチン１１のアゴニストもし
くはアンタゴニストは、ガレクチン１１の発現下に関連する疾患を処置するため
に使用され得る。Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can be used to adequately regenerate the skin (ie, hair follicles, sweat glands, And regrowth of sebaceous glands), and can be used further in the treatment of other skin defects such as psoriasis. Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can be used to induce epidermolysis bullosa, a frequent open and painful blister by promoting re-epithelialization of these lesions, into the intrinsic dermis. Can be used to treat defects in epidermal adhesion. Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, and agonists or antagonists of galectin-11, also treat gastric and duodenal ulcers, and by scarring of the lining of the mucosa and more rapidly regenerating the lining of the glandular and duodenal mucosa. Can be used to help heal. Inflammatory bowel diseases (eg, Coulomb's disease and ulcerative colitis) are diseases that result in disruption of the mucosal surface of the small or large intestine, respectively. Thus, galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, promote resurfacing of mucosal surfaces to aid more rapid healing and prevent the development of inflammatory bowel disease Can be used to Treatment with a galectin-11 polynucleotide or polypeptide, an agonist or antagonist of galectin-11 is expected to have a significant effect on the production of mucosa throughout the gastrointestinal tract, and the intestinal mucosa may be ingested or surgically treated. Can be used to protect against harmful substances after surgery. Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can be used to treat diseases associated with galectin-11 expression.
【０３５９】 さらに、ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに
ガレクチン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストは、種々の病的状態に起因
する肺への損傷を予防および治癒するために使用され得る。ガレクチン１１のポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはガレクチン１１のアゴニ
ストもしくはアンタゴニストは、急性または慢性の肺損傷を予防または処置する
ために、増殖および分化を刺激し得、そして肺胞および気管支（ｂｒｏｃｈｉｏ
ｌａｒ）上皮の修復を促進し得る。例えば、気管支上皮および肺胞（ａｖｅｏｌ
ｉ）の壊死を生じる、気腫（これは、肺胞の進行性の損失を生じる）および吸入
損傷（すなわち、煙の吸入および熱傷から生じる）は、ガレクチン１１のポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチド、ガレクチン１１のアゴニストまたはアンタゴ
ニストを使用して効果的に処置され得る。また、ガレクチン１１のポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチン１１のアゴニストもしくはアン
タゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ型の増殖および分化を刺激するために使用され
得、これは、未熟な乳児における硝子膜疾患（例えば、乳児呼吸窮迫症候群およ
び気管支肺異形成症）のような疾患を処置または予防することを助け得る。In addition, galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can be used to prevent and cure lung damage due to various pathological conditions. Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, and / or agonists or antagonists of galectin-11, can stimulate proliferation and differentiation to prevent or treat acute or chronic lung injury, and induce alveolar and bronchial
lar) may promote epithelial repair. For example, bronchial epithelium and alveoli (aveol)
Emphysema (which results in progressive loss of alveoli) and inhalation damage (ie, resulting from smoke inhalation and burns), resulting in necrosis of i), are caused by galectin 11 polynucleotides or polypeptides, galectin 11 Can be effectively treated using agonists or antagonists. Also, galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can be used to stimulate the proliferation and differentiation of alveolar epithelial cell type II, which can be used to stimulate the vitreous membrane disease in immature infants. For example, it can help treat or prevent diseases such as infant respiratory distress syndrome and bronchopulmonary dysplasia.
【０３６０】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチ
ン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を
刺激し得、そして従って、肝臓疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇
症肝不全、肝炎ウイルスおよび毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩
化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および他の当該分野で
公知の肝臓毒素）により生じる肝臓損傷）を緩和または処置するために使用され
得る。Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can stimulate the proliferation and differentiation of hepatic parenchymal cells and, therefore, hepatic diseases and conditions, such as fulminant hepatic failure caused by cirrhosis , Hepatitis virus and toxic agents (ie, liver damage caused by acetaminophen, carbon tetrachloride, and other art-known hepatotoxins)).
【０３６１】 さらに、ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに
ガレクチン１１のアゴニストもしくはアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処
置または予防するために使用され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と
診断された患者において、いくつかの島細胞機能が残っている場合、ガレクチン
１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにガレクチン１１のアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、その疾患の持続性の発現を緩和、遅延または
予防するように、その島機能を維持するために使用され得る。また、ガレクチン
１１のポリヌクレオチドもしくポリペプチド、ならびにガレクチン１１のアゴニ
ストまたはアンタゴニストは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移
植における補助として使用され得る。Additionally, galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can be used to treat or prevent the development of diabetes mellitus. In patients newly diagnosed with Type I and Type II diabetes, if some islet cell functions remain, galectin-11 polynucleotides or polypeptides, and agonists or antagonists of galectin-11, may cause the persistence of the disease. It can be used to maintain its islet function, such as to reduce, delay or prevent sexual development. Also, galectin-11 polynucleotides or polypeptides, as well as galectin-11 agonists or antagonists, can be used as an aid in islet cell transplantation to improve or promote islet cell function.
【０３６２】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはガレクチン
１１のアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、四肢虚血のような末梢動
脈疾患を含む、心臓血管障害を処置し得る。Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, or galectin-11 agonists or antagonists, can be used to treat cardiovascular disorders, including peripheral arterial disease such as limb ischemia.
【０３６３】 心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉ
ｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉ
ｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候
群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三
房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）
、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉ
ｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候
群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖
症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃ
ｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓ
ｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファ
ロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｓｅｐ
ｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。Cardiovascular disorders include arterio-arterial fistulas.
stula), arteriovenous fistula, cerebral arteriovenous congenital anomaly, congenital heart defect (congeni)
tal heart defects), cardiovascular abnormalities such as pulmonary valve atresia, and scimitar syndrome. Congenital heart defects include aortic constriction, triatrial heart, coronary vessel anomalies.
, Cross heart, right thoracic heart, patent ductus arteri
osus), Ebstein malformation, Eisenmenger complex, left ventricular dysgenesis syndrome, left thoracic heart, tetralogy of Fallot, transposition of great arteries, right ventricle of both great vessels, tricuspid regurgitation, remnant ductus arteriosus , And heart septal defect
ts) (eg, aortopulmonary septum defect)
eptal defect, endocardial bed deficiency, Ryutanbache syndrome, trilogy of Fallot, ventricular heart septum (ventricular heart sep)
tal defects))).
【０３６４】 心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉ
ｇｈ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ ｃａｒｄｉａｃ
ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、
心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大
、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆ
ａｒｃｔｉｏｎ ｈｅａｒｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、
心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、
気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充
血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ
ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管
結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心
臓病が挙げられる。Cardiovascular disorders also include arrhythmias, carcinoid heart disease, high cardiac output (hi
gh cardiac output, low cardiac output (low cardiac)
output), cardiac tamponade, endocarditis (including bacterial), cardiac aneurysm,
Cardiac arrest, congestive heart failure, congestive cardiomyopathy, paroxysmal dyspnea, cardiac edema, cardiac hypertrophy, congestive cardiomyopathy, left ventricular hypertrophy, right ventricular hypertrophy, post-infarction cardiac rupture (post-inf)
arct heart rupture, ventricular septal rupture, heart valve disease,
Myocardial disease, myocardial ischemia, endocardial effusion, epicarditis (including infarct and tuberculosis),
Air pericardiopathy, post-pericardiotomy syndrome, right heart disease, rheumatic heart disease, ventricular dysfunction, hyperemia, cardiovascular pregnancy complication (cardiovascular pregnancy)
complications, scimitar syndrome, cardiovascular syphilis, and heart diseases such as cardiovascular tuberculosis.
【０３６５】 不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダ
ムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ
ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群
、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａ
ｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不
全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられる。頻拍としては、発作性頻拍、
上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉ
ｃｕｌａｒ ｎｏｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心
房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ ｎｏ
ｄａｌ ｒｅｅｎｔｒｙ ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・
ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。The arrhythmia includes sinus arrhythmia, atrial fibrillation, atrial flutter, bradycardia, extrasystole, Adams-Stokes syndrome, leg block, sinoatrial block, long QT syndrome (long
QT syndrome, accessory contractions, Lone-Gangong-Levine syndrome, Mahaim-type pre-excita syndrome
sion syndrome), Wolf-Parkinson-White syndrome, sinus dysfunction syndrome, tachycardia, and ventricular fibrillation. Tachycardia includes paroxysmal tachycardia,
Supraventricular tachycardia, ventricular specific rhythm promotion, atrioventricular nodal reentrant tachycardia (atrioventri
Circular nodal reentry tachycardia), ectopic atrial tachycardia, ectopic junctional tachycardia, sinoatrial nodal reentry tachycardia (sinoatrial no)
dal reentry tachycardia), sinus tachycardia, torsade
De pointes, and ventricular tachycardia.
【０３６６】 心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａ
ｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁
機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症
、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。[0366] Heart valve diseases include aortic valve dysfunction, aortic stenosis, heart murmur (hea).
murmurs), aortic valve prolapse, mitral valve prolapse, tricuspid valve prolapse, mitral dysfunction, mitral stenosis, pulmonary valve regurgitation, pulmonary valve dysfunction, pulmonary valve stenosis, tricuspid Examples include atresia, tricuspid dysfunction, and tricuspid stenosis.
【０３６７】 心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁
下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症
、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、お
よび心筋炎が挙げられる。Cardiomyopathy includes alcoholic cardiomyopathy, congestive cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, hypovalvular aortic stenosis, hypovalvular pulmonary stenosis, restricted cardiomyopathy, Chagas cardiomyopathy, intracardiac Membrane fibroelastosis, endocardial myocardial fibrosis, Keynes syndrome, myocardial reperfusion injury, and myocarditis.
【０３６８】 心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈
血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｔｕｎｎｉｎ
ｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。Myocardial ischemia includes angina, coronary aneurysm, coronary atherosclerosis, coronary artery thrombosis, coronary vasospasm, myocardial infarction, and myocardial stunnin
g) coronary artery disease.
【０３６９】 心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫
症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ Ｄｉｓｅａｓｅ
）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、
血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、
動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性
動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先
端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管障害、静脈炎
、肺静脈閉塞疾患、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞
疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静
脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ ｔｅｌａ
ｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静
脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙げられる
。Cardiovascular diseases also include aneurysms, angiogenesis, hemangiomatosis, bacterial hemangioma symptoms, Hippel-Lindau disease (Hippel-Lindau disease).
), Klipel-Tornonnay-Weber Syndrome, Sturge-Weber Syndrome,
Vasomotor edema, aortic disease, Takayasu arteritis, aortitis, Lurish syndrome,
Arterial occlusive disease, arteritis, arteritis, arteritis nodosa, cerebrovascular disorder, diabetic vascular disorder, diabetic retinopathy, embolism, thrombosis, acrolysis, hemorrhoid, liver Venous obstruction disorder, hypertension, hypotension, ischemia, peripheral vascular disorder, phlebitis, pulmonary vein obstruction disease, hypertension, hypotension, ischemia, peripheral vascular disease, phlebitis, pulmonary vein obstruction disease, Raynaud's disease, CREST syndrome, Retinal vein occlusion, scimitar syndrome, superior vena cava syndrome, telangiectasia, telangiectasia ataxia (atasia tela)
ngectasia), hereditary hemorrhagic telangiectasia, varicocele, varicose veins, varicose ulcers, vasculitis, and vascular diseases such as venous insufficiency.
【０３７０】 動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤
、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が
挙げられる。[0370] Aneurysms include dissecting aneurysms, pseudoaneurysms, infected aneurysms, ruptured aneurysms, aortic aneurysms, cerebral aneurysms, coronary aneurysms, cardiac aneurysms, and iliac aneurysms Is mentioned.
【０３７１】 動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。[0371] Arterial occlusive diseases include arteriosclerosis, intermittent claudication, carotid stenosis, fibromuscular dysplasia, mesenteric vascular occlusion, Moyamoya disease, renal artery occlusion, retinal artery occlusion, and obstructive thrombus Vasculitis.
【０３７２】 脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈
瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の
塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出
血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ ｈｅ
ｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症
候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃ
ｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏ
ｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられる。Cerebrovascular disorders include carotid artery disease, cerebral amyloid angiopathy, cerebral aneurysm, cerebral anoxia, cerebral arteriosclerosis, cerebral arteriovenous malformations, cerebral artery disease, cerebral embolism and thrombosis, Carotid thrombosis, sinus thrombosis, Wallenberg syndrome, cerebral hemorrhage, epidural hematoma, subdural hematoma, subarachnoid hemorrhage (subaraxhnoid he
morrhage), cerebral infarction, cerebral ischemia (including transient), subclavian artery steal syndrome, periventricular leukomalac
ia), vascular headache, cluster headache, migraine, and vertebral base (vertebro)
basilar) dysfunction.
【０３７３】 塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血
栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、
洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。[0393] Embolisms include air embolism, amniotic fluid embolism, cholesterol embolism, toe cyanosis syndrome, fat embolism, pulmonary embolism, and thromboembolism. Thrombosis includes coronary thrombosis, hepatic vein thrombosis, retinal vein occlusion, carotid thrombosis,
Sinus thrombosis, Wallenberg syndrome, and thrombophlebitis.
【０３７４】 虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅ
ｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｏｍｐａｒ
ｔｍｅｎｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血
が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅ
ｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血
栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌ
ｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェ
ーゲナー肉芽腫症が挙げられる。As ischemia, cerebral ischemia, ischemic colitis, partition syndrome (compartme
nt syndrome, anterior compartment syndrome
ment syndrome, myocardial ischemia, reperfusion injury, and peripheral limb ischemia. As vasculitis, aoritis, arteritis, Behce (Behce)
t) Syndrome, Churg-Strauss syndrome, mucocutaneous lymph node syndrome, obstructive thrombotic vasculitis, irritable vasculitis, Schönlein-Henoch purpura (Schoenl)
ein-Henoch purpura), allergic cutaneous vasculitis and Wegener's granulomatosis.
【０３７５】 ガレクチン１１のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはガレクチン
１１のアゴニストもしくはアンタゴニストは、危険な四肢虚血および冠状動脈疾
患の処置に対して特に有効である。Galectin-11 polynucleotides or polypeptides, or galectin-11 agonists or antagonists, are particularly effective for the treatment of dangerous limb ischemia and coronary artery disease.
【０３７６】 ガレクチン１１のポリペプチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用し
て投与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内
注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子
加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経
口または坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エ
アロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分
野で公知である。ガレクチン１１のポリペプチドは、下記でより詳細に記載され
る、治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）の一部として投与され得る。ガレクチン
１１のポリヌクレオチドを送達する方法は本明細書中でより詳細に記載される。The galectin-11 polypeptide can be administered using any method known in the art, including direct needle injection at the site of delivery, intravenous injection, topical administration, catheter injection. , Biolistic injection, particle accelerators, gel foam sponge depots, other commercially available depot materials, osmotic pumps, solid pharmaceutical formulations for oral or suppository, intraoperative decanting or topical application, aerosol delivery. But not limited to these. Such methods are known in the art. Galectin-11 polypeptides can be administered as part of a Therapeutic, described in more detail below. Methods for delivering Galectin-11 polynucleotides are described in more detail herein.
【０３７７】 新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡
は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５
６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下におい
て生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プ
ロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的
に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）
の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は
病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する
。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼
の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏ
ｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎ
ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；
Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１
（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ
．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌ
ｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説
を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状
態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する
有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。The naturally occurring equilibrium between an endogenous stimulator and an inhibitor of angiogenesis is that in which inhibitory effects predominate. Rastinejad et al., Cell 5
6: 345-355 (1989). In the rare cases where neovascularization occurs under normal physiological conditions (eg, wound healing, organ regeneration, embryonic development, and the female reproductive process), angiogenesis is tightly regulated and spatially and temporally Is determined. Pathological conditions of angiogenesis (eg, characterizing solid tumor growth)
Under these conditions, control of these adjustments is not possible. Unregulated angiogenesis becomes pathological and maintains the progression of many neoplastic and non-neoplastic diseases. Many serious diseases are governed by abnormal neovascularization, including solid tumor growth and metastasis, arthritis, some types of ocular disorders and psoriasis. For example, Mo
ses et al., Biotech. 9: 630-634 (1991); Folkman.
Et al. Engl. J. Med. 333: 1775-1763 (1995);
Auerbach et al. Microvasc. Res. 29: 401-411
(1985); Folkman, Advances in Cancer Re.
Academic P, edited by search, Klein and Weinhouse
Resz, New York, pp. 175-203 (1985); Patz, Am
. J. Opthalmol. 94: 715-743 (1982); and Fol.
See the review by Kman et al., Science 221: 719-725 (1983). In many pathological conditions, the process of angiogenesis contributes to the disease state. For example, significant data has been accumulated that suggests that solid tumor growth is dependent on angiogenesis. Folkman and Klagsbrunn, S
science 235: 442-447 (1987).
【０３７８】 本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに
本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生血管形成に関連する
疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪性状態およ
び転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫瘍、および癌、ならびに
当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎ
ら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈ
ｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限
定されない。従って、本発明は、新脈管形成関連疾患および／または障害を処置
する方法を提供し、この方法は、治療有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを、その処置の必要な個
体に投与する工程を包含する。例えば、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、癌または腫瘍を治療的に処置
するために、種々のさらなる方法で利用され得る。本発明のポリヌクレオチド、
ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストで処置され得る癌とし
ては、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌
、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、
腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌を含む固形腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色腫；膠
芽腫；カポージ肉腫；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性（ａｄｖ
ａｎｃｅｄ）悪性疾患；および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げら
れるが、これらに限定されない。例えば、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、***
腫瘍およびカポージ肉腫のような癌を処置するために、局所送達され得る。The present invention provides for the treatment of a disease or disorder associated with neovascularization by administration of a polynucleotide and / or polypeptide of the invention, and an agonist or antagonist of the invention. Malignant and metastatic conditions that can be treated with the polynucleotides and polypeptides of the present invention, or agonists or antagonists, include the malignancies, solid tumors, and cancers described herein, as well as others known in the art. (For a review of such disorders, see Fishman
Et al., Medicine, 2nd ed. B. Lippincott Co. , Ph
iladelphia (1985)). Accordingly, the present invention provides a method of treating an angiogenesis-related disease and / or disorder, the method comprising: administering a therapeutically effective amount of a polynucleotide, polypeptide, antagonist and / or agonist of the present invention to a subject. Administering to an individual in need of treatment. For example, the polynucleotides, polypeptides, antagonists and / or agonists of the present invention can be utilized in various additional ways to therapeutically treat cancer or tumors. The polynucleotide of the present invention,
Cancers that can be treated with polypeptides, antagonists and / or agonists include prostate cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, laryngeal cancer, esophageal cancer, testicular cancer, liver cancer, parotid gland cancer, bile duct cancer , Colon cancer, rectal cancer, cervical cancer, uterine cancer, endometrial cancer,
Solid tumors including kidney, bladder, and thyroid cancers; primary tumors and metastases; melanomas; glioblastomas; kaposi's sarcoma; leiomyosarcoma; non-small cell lung cancer; colorectal cancer; advanced (adv
anced) malignancies; and tumors arising from the blood (eg, leukemia). For example, the polynucleotides, polypeptides, antagonists and / or agonists of the present invention can be delivered locally to treat cancers such as skin cancer, head and neck tumors, breast tumors and Kaposi's sarcoma.
【０３７９】 なお他の局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴ
ニストおよび／またはアゴニストは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形
態を処置するために利用され得る。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、
アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、腫瘍に直接的に、または注射もし
くはカテーテルを介して腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業
者が理解するように、適切な投与様式は、処置されるべき癌によって変化する。
他の送達様式は本明細書中において議論される。In yet other aspects, the polynucleotides, polypeptides, antagonists and / or agonists of the invention can be utilized to treat the surface morphology of bladder cancer, for example, by intravesical administration. Polynucleotides, polypeptides of the invention,
Antagonists and / or agonists can be delivered directly to the tumor or near the tumor site via injection or catheter. Of course, as the skilled artisan will appreciate, the appropriate mode of administration will vary depending on the cancer being treated.
Other modes of delivery are discussed herein.
【０３８０】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはア
ゴニストは、癌に加えて、他の障害（新脈管形成を含む）を処置する際に有用で
あり得る。これらの障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿
性肉芽腫）；動脈硬化プラーク；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、
未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ル
ベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（
Ｐｔｅｒｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創
傷治癒；子宮内膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨
折；強皮症；トラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏ
ｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新
脈管形成；オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラ
ーク新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成
異常；創傷顆粒化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。The polynucleotides, polypeptides, antagonists and / or agonists of the present invention may be useful in treating other disorders, including angiogenesis, in addition to cancer. These disorders include, but are not limited to: benign tumors (eg, hemangiomas, acoustic neuromas, neurofibromas, trachoma, and purulent granulomas); atherosclerotic plaques; ocular angiogenesis Diseases (eg, diabetic retinopathy,
Immature retinopathy, macular degeneration, corneal transplant rejection, neovascular glaucoma, retro lens fibroplasia, rubeosis, retinoblastoma, uveitis, and pterygium of the eye (
Rheumatoid arthritis; psoriasis; delayed wound healing; endometriosis; angiogenesis; granulation; hyperplastic scars (keloids); pseudoarticular fractures; Vascular adhesion; myocardial angiogenesis; coronary collaterals (coro);
arteriovenous malformations; ischemic limb angiogenesis; Osler-Webber syndrome; plaque neovascularization; telangiectasia; hemophilic joints; angiofibromas Fibromuscular dysplasia; wound granulation; Crohn's disease; and atherosclerosis.
【０３８１】 例えば、本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを過形成性瘢痕またはケロイド
に投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法
が提供される。For example, in one aspect of the present invention, treating hyperplastic scars and keloids comprises administering a polynucleotide, polypeptide, antagonist and / or agonist of the present invention to the hyperplastic scars or keloids. A method is provided for doing so.
【０３８２】 本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これら
の病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕および
ケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防処置
において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷
害の約１４日後）を有した後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前
に開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、
角膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖お
よび黄斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。In one embodiment of the invention, polynucleotides, polypeptides, antagonists and / or agonists are injected directly into hyperplastic scars or keloids to prevent the progression of these lesions. This treatment is particularly valuable in the prophylactic treatment of conditions known to result in the development of hyperplastic scars and keloids (eg, burns), and preferably during the time when the proliferative phase progresses (for the first injury). (After about 14 days) but before the onset of hyperplastic scars or keloids. As mentioned above, the present invention also relates to neovascular diseases of the eye (eg,
(Including corneal neovascularization, neovascular glaucoma, proliferative diabetic retinopathy, post-lens fibroplasia and macular degeneration).
【０３８３】 さらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（アゴニストおよび／
またはアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼
の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障
、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟網膜症
、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、
および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａ
ｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧ
ａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７８
）による総説を参照のこと。Further, the polynucleotides and polypeptides of the present invention (agonists and / or
Or ocular disorders associated with neovascularization that can be treated with an angiogenesis (including, but not limited to, antagonists) include, but are not limited to: neovascular glaucoma, diabetic retinopathy, retinoblastoma, retro lens fibrosis Hyperplasia, uveitis, immature retinopathy, macular degeneration, corneal transplant neovascularization, and other inflammatory diseases of the eye, tumors of the eye,
And diseases associated with choroidal or iris neovascularization. For example, Waltma
n et al., Am. J. Ophthal. 85: 704-710 (1978) and G
Artner et al., Surv. Ophthal. 22: 291-32 (1978)
)).
【０３８４】 従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（上記のような）
を患者に対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する
、角膜新生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成
疾患を処置するための方法が、提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を
欠く組織である。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲
脈管叢から角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた
混濁されるようになり、患者の視力の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる
（ｏｐａｃｉｔａｔｅ）場合に、視力喪失が完全になり得る。広範な種々の障害
は、例えば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラ
コーマ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫
学的プロセス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）
、アルカリやけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態
、ならびにコンタクトレンズを装着することの合併症として。Thus, in one aspect of the invention, a therapeutically effective amount of a compound (as described above)
For treating ocular neovascularization diseases such as corneal neovascularization (including corneal transplant neovascularization), which comprises administering to a patient the cornea such that the formation of blood vessels is inhibited. Is provided. Briefly, the cornea is tissue that usually lacks blood vessels. However, in certain pathological conditions, capillaries can extend from the marginal pericorneal plexus to the cornea. When the cornea becomes vascularized, the cornea also becomes cloudy, resulting in impaired vision for the patient. If the cornea is completely opaque, vision loss can be complete. A wide variety of disorders can result, for example, in corneal neovascularization, including: corneal infections (eg, trachoma, herpes simplex keratitis, leishmaniasis and onchocerciasis), immunological processes (eg, graft rejection) And Stevens-Johnson syndrome)
As a complication of alkaline burns, trauma, inflammation (of any cause), toxic and nutrient deficiencies, and wearing contact lenses.
【０３８５】 特に好ましい実施形態において、本発明は、生理食塩水（眼の調製において一
般に使用される保存剤および抗菌剤のいずれかと組合せて）中で局所投与のため
に調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、その純
粋な形態で調製され得、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記のよう
に調製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい実施
形態において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーととも
に調製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形成組
成物は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治療は
また、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有するこ
とが公知である角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合におい
て、処置（おそらくステロイドと組み合わせられる）は、その後の合併症を予防
するのを補助するために直ちに開始され得る。In a particularly preferred embodiment, the invention can be prepared for topical administration in saline (in combination with any of the preservatives and antibacterials commonly used in ophthalmic preparations) and eye drops It can be administered in the form. Solutions or suspensions may be prepared in their pure form and administered several times a day. Alternatively, the anti-angiogenic composition prepared as described above can also be administered directly to the cornea. In a preferred embodiment, the anti-angiogenic composition is prepared with a mucoadhesive polymer that binds to the cornea. In a further embodiment, an anti-angiogenic factor or an anti-angiogenic composition may be utilized as an adjunct to conventional steroid therapy. Topical treatment may also be useful prophylactically in corneal lesions that are known to have a high potential to induce an angiogenic response (eg, chemical burns). In these cases, treatment (possibly combined with steroids) can be started immediately to help prevent subsequent complications.
【０３８６】 他の実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡の案内の下
で眼科医によって注射され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態で変化
し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（すな
わち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合において
、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉｌ
ｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に防
ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、角
膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲角膜に
注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の毛細血
管浸潤を予防するために利用され得る。徐放形態において、注射は、１年に２〜
３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注射溶液に添加され、その注射自
体から生じる炎症を低減し得る。In another embodiment, the above compounds may be injected by an ophthalmologist directly under the guidance of a microscope into the corneal stroma. While the preferred injection site may vary in the form of individual lesions, the goal of administration is to place the composition on the advancing surface of the vasculature (ie, distributed between the blood vessels and the normal cornea). ). In most cases, this would be peril (peril) to "protect" the cornea from advancing blood vessels.
imbic) including corneal injections. This method can also be used immediately after corneal injury to prevent corneal neovascularization prophylactically. In this situation, the substance can be injected into the perilimbic cornea dispersed between the corneal lesion and the edge of its unwanted potential blood supply. Such methods can also be used to prevent capillary infiltration of the implanted cornea in a similar manner. In a sustained release form, injections may be 2 to 3
Only three times may be required. Steroids may also be added to the injection solution to reduce inflammation resulting from the injection itself.
【０３８７】 本発明の別の局面において、患者に、血管の形成を阻害するように、本発明の
治療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／または
アゴニストを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方
法が提供される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形
態を処置するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は
、前方角（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ ａｎｇｌｅ）の領域に注入によ
って移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連
続的に放出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の局面において
、患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼に投与する工程を包
含する、増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。In another aspect of the present invention, the method includes administering to a patient a therapeutically effective amount of a polynucleotide, polypeptide, antagonist and / or agonist of the present invention so as to inhibit blood vessel formation. A method for treating neovascular glaucoma is provided. In one embodiment, the compound may be administered topically to the eye to treat early forms of neovascular glaucoma. In other embodiments, the compound can be implanted by injection into the area of the anterior chamber angle. In other embodiments, the compound may also be located at any location so that the compound is continuously released into the aqueous humor. In another aspect of the invention, a proliferative diabetic comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of a polynucleotide, polypeptide, antagonist and / or agonist such that blood vessel formation is inhibited. Methods are provided for treating retinopathy.
【０３８８】 本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜にお
けるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注射によって処置さ
れ得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に
開始されるべきである。In a particularly preferred embodiment of the invention, proliferative diabetic retinopathy is directed to the aqueous humor or the vitreous to increase the local concentration of polynucleotides, polypeptides, antagonists and / or agonists in the retina. It can be treated by injection. Preferably, this treatment should be started before the acquisition of a serious disease requiring photocoagulation.
【０３８９】 本発明の別の局面において、血管の形成が阻害されるように、患者に、本発明
の治療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／また
はアゴニストを眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するた
めの方法が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼
内移植を介して局所投与され得る。In another aspect of the present invention, the method comprises administering to a patient a therapeutically effective amount of a polynucleotide, polypeptide, antagonist and / or agonist of the present invention to the eye such that blood vessel formation is inhibited. Provided are methods for treating post lens fibroplasia. The compound may be administered locally via intravitreal injection and / or via intraocular implantation.
【０３９０】 さらに、本発明のこのポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／
またはアゴニストで処置され得る障害としては、以下が挙げられるが、それらに
限定されない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅
延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー
−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラ
コーマ、および血管接着。Further, the polynucleotides, polypeptides, agonists and / or
Or disorders that may be treated with an agonist include, but are not limited to: hemangiomas, arthritis, psoriasis, angiofibromas, atherogenic plaques, delayed wound healing, granulation, hemophilic joints, Hyperplastic scars, pseudoarticular fractures, Osler-Weber syndrome, purulent granulomas, scleroderma, trachoma, and vascular adhesions.
【０３９１】 さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが
、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）腫瘍
（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴
神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、
乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角
膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞
腫、およびブドウ膜炎）、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒化、過
形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ、血管接着、心筋の
新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳
側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−ウェーバー症候群、
プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線維筋性
形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬化症、産児制限薬剤（
月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防することによる）、病
原性の結果（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕ
ｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、バルトネ
ラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する疾患。Additionally, disorders and / or conditions that can be treated with the polynucleotides, polypeptides, agonists and / or agonists include, but are not limited to: solid tumors, blood born Tumors (eg, leukemia), tumor metastases, Kaposi's sarcoma, benign tumors (eg, hemangiomas, acoustic neuromas, neurofibromas, trachoma, and purulent granulomas), rheumatoid arthritis,
Psoriasis, ocular angiogenesis disorders (eg, diabetic retinopathy, immature retinopathy, macular degeneration, corneal transplant rejection, neovascular glaucoma, retrolental fibroplasia, rubeosis, retinoblastoma, and uveitis), Delayed wound healing, endometriosis, angiogenesis, granulation, hyperplastic scar (keloid), pseudoarticular fracture, scleroderma, trachoma, vascular adhesion, myocardial neovascularization, coronary collaterals ( coronary collaterals), collateral collaterals, arteriovenous malformations, ischemic limb angiogenesis, Ausler-Weber syndrome,
Plaque neovascularization, telangiectasia, hemophilic joints, angiofibroma, fibromuscular dysplasia, wound granulation, Crohn's disease, atherosclerosis, birth control drugs (
By controlling menstruation, by preventing angiogenesis required for embryo implantation, pathogenic consequences (eg, cat scratch disease (Rochele minalia qu
diseases with angiogenesis such as (intosa), ulcers (Helicobacter pylori), bartonellosis and bacterial hemangioma symptoms).
【０３９２】 出産制限方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物
の量は、***および受精が起こる前またはその後に投与され、従って産児制限の
有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ）」方法を提供す
る。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴ
ニストはまた、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症
の処置における腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与さ
れ得る。In one aspect of the birth control method, an amount of the compound sufficient to block embryo implantation is administered before or after sexual intercourse and fertilization occurs, and thus is an effective method of birth control, presumably "post-hoc (Morning after) method. The polynucleotides, polypeptides, agonists and / or agonists of the present invention may also be used in controlling menstruation or administered either as a peritoneal lavage in the treatment of endometriosis or for peritoneal transplantation. Can be done.
【０３９３】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ
得る。The polynucleotides, polypeptides, agonists and / or agonists of the invention can be incorporated into surgical sutures to prevent stitch granulomas.
【０３９４】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストは、広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの
局面において、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、
悪性組織から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への
疾患の広がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレ
ーするために利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプ
レーの形態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新
脈管形成を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他
の局面において、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが
、外科メッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発
明の１つの実施形態において、抗脈管形成組成物を有した外科メッシュレーデン
（ｌａｄｅｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管
形成因子を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利
用され得る。The polynucleotides, polypeptides, agonists and / or agonists of the invention can be utilized in a wide variety of surgical procedures. For example, in one aspect of the invention, the composition (eg, in the form of a spray or film) comprises:
It may be used to coat or spray the area prior to tumor removal to separate normal surrounding tissue from malignant tissue and / or to prevent spread of disease to surrounding tissue. In another aspect of the invention, the composition (eg, in the form of a spray) is delivered via an endoscopic procedure to coat a tumor or to inhibit angiogenesis at a desired location. obtain. In yet another aspect of the present invention, a surgical mesh coated with the anti-angiogenic composition of the present invention can be utilized in any procedure where a surgical mesh can be utilized. For example, in one embodiment of the present invention, a surgical mesh laden with an anti-angiogenic composition provides support for the structure and releases a certain amount of anti-angiogenic factors. It can be used during abdominal cancer resection surgery (eg, after colectomy).
【０３９５】 本発明のさらなる局面において、癌の局所的再発およびその部位での新しい血
管の形成が阻害されるように、切除後に本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、アゴニストおよび／またはアゴニストを腫瘍の切除縁に投与する工程を包含
する、腫瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の１つの実施形
態において、抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗
布、ブラッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の方法で抗脈管形成化合物で
腫瘍の切除縁をコートすることによって適用される）。あるいは、抗脈管形成化
合物は、投与前に公知の外科ペーストに組み込まれ得る。本発明の特に好ましい
実施形態において、抗脈管形成化合物は、悪性疾患についての肝切除後および神
経外科手術後に適用される。In a further aspect of the invention, the polynucleotides, polypeptides, agonists and / or agonists of the invention are recruited to a tumor after resection so that local recurrence of the cancer and formation of new blood vessels at the site are inhibited. A method is provided for treating a tumor resection site comprising administering to the resection margin. In one embodiment of the invention, the anti-angiogenic compound is administered directly to the site of tumor excision (eg, smearing, brushing, or otherwise excising the tumor margin with an anti-angiogenic compound). Applied by coating). Alternatively, the anti-angiogenic compound may be incorporated into a known surgical paste prior to administration. In a particularly preferred embodiment of the invention, the anti-angiogenic compound is applied after hepatectomy for malignancy and after neurosurgery.
【０３９６】 本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ア
ゴニストおよび／またはアゴニストは、広範な種々の腫瘍（例えば、***腫瘍、
結腸腫瘍、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発
明の１つの実施形態において、抗脈管形成化合物は、切除後に、神経学的腫瘍の
部位に、その部位での新しい血管の形成が阻害されるように投与され得る。In one aspect of the invention, the polynucleotides, polypeptides, agonists and / or agonists of the invention can be used in a wide variety of tumors, such as breast tumors,
(Including colon, brain and liver tumors). For example, in one embodiment of the present invention, an anti-angiogenic compound may be administered to a site of a neurological tumor after resection so that the formation of new blood vessels at that site is inhibited.
【０３９７】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の
代表的な例としては以下が挙げられる：抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその
誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビ
ター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、プラスミノーゲン活性化
インヒビター−１、プラスミノーゲン活性化インヒビター−２および種々の形態
のより軽い「ｄ群」遷移金属。The polynucleotides, polypeptides, agonists and / or agonists of the invention can also be administered with other anti-angiogenic factors. Representative examples of other anti-angiogenic factors include the following: anti-invasive factors, retinoic acid and its derivatives, paclitaxel, suramin, tissue inhibitors of metalloproteinase-1, tissue inhibitors of metalloproteinase-2, Plasminogen activation inhibitor-1, plasminogen activation inhibitor-2 and various forms of lighter "group d" transition metals.
【０３９８】 より軽い「ｄ群」遷移金属としては、例えばバナジウム種、モリブデン種、タ
ングステン種、チタン種、ニオブ種およびタンタル種が挙げられる。そのような
遷移金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体とし
ては、オキソ遷移金属錯体が挙げられる。The lighter “Group d” transition metals include, for example, vanadium, molybdenum, tungsten, titanium, niobium and tantalum species. Such transition metal species can form a transition metal complex. Suitable complexes of the above transition metal species include oxo transition metal complexes.
【０３９９】 バナジウム錯体の代表的な例としては、バナデート錯体およびバナジル錯体の
ようなオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナデート錯体としては、例
えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナ
ジン酸ナトリウムのようなメタバナデート錯体およびオルトバナデート錯体が挙
げられる。適切なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネート
および硫酸バナジル（硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のよう
な硫酸バナジル水和物を含む）が挙げられる。[0399] Representative examples of vanadium complexes include oxovanadium complexes such as vanadate complexes and vanadyl complexes. Suitable vanadate complexes include metavanadate and orthovanadate complexes such as, for example, ammonium metavanadate, sodium metavanadate and sodium orthovanadate. Suitable vanadyl complexes include, for example, vanadyl acetylacetonate and vanadyl sulfate (including vanadyl sulfate hydrates such as vanadyl sulfate monohydrate and vanadyl sulfate trihydrate).
【０４００】 タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯
体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステート錯体
およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングステート錯体とし
ては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン
酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステン
オキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）
オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデート、
モリブデンオキシドおよびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデート
錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナト
リウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙
げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、
モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデ
ニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他
の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール
、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。[0400] Representative examples of tungsten complexes and molybdenum complexes also include oxo complexes. Suitable oxotungsten complexes include tungstate complexes and tungsten oxide complexes. Suitable tungstate complexes include ammonium tungstate, calcium tungstate, sodium tungstate dihydrate and tungstic acid. Suitable tungsten oxides include tungsten (IV) oxide and tungsten (VI)
Oxides. Suitable oxomolybdenum complexes include molybdate,
Molybdenum oxide and molybdenyl complexes. Suitable molybdate complexes include ammonium molybdate and its hydrates, sodium molybdate and its hydrates, and potassium molybdate and its hydrates. Suitable molybdenum oxides include molybdenum (VI) oxide,
Molybdenum (VI) oxide and molybdic acid. Suitable molybdenyl complexes include, for example, molybdenyl acetylacetonate. Other suitable tungsten and molybdenum complexes include, for example, hydroxo derivatives from glycerol, tartaric acid and sugars.
【０４０１】 広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る
。代表的な例としては、以下が挙げられる：血小板因子４；硫酸プロタミン；硫
酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ ｃｒａｂ）の殻から調製され
る）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）
；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ス
テロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によっ
て、増強され得る）；スタウロスポリン；基質代謝の調節因子（例えば、プロリ
ンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チ
アプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）
；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトト
レキサート；ミトザントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリ
ン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７
：１７３２１〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキスト
リンテトラデカサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（
Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリ
ンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲ
ナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（
Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａ
ｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」；Ｔａｋ
ｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２〜３１６、１９９
２）；サリドマイド；Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カ
ルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ
）；およびメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。A wide variety of other anti-angiogenic factors may also be utilized in the context of the present invention. Representative examples include: platelet factor 4; protamine sulfate; sulfated chitin derivative (prepared from queen crab shell) (Murata et al., Cancer Res. 51: 22-26; 1991)
Sulfated polysaccharide peptidoglycan complex (SP-PG) (the function of this compound may be enhanced by the presence of steroids (eg, estrogens) and tamoxifen citrate); staurosporine; regulators of substrate metabolism (eg, Including proline analogs, cis hydroxyproline, d, L-3,4-dehydroproline, thiaproline, α, α-dipyridyl, aminopropionitrile fumarate)
4-propyl-5- (4-pyridinyl) -2 (3H) -oxazolone; methotrexate; mitozantrone; heparin; interferon; 2 macroglobulin-serum; ChIMP-3 (Pavloff et al., J. Bio. Chem. 267).
: 17321-17326, 1992); chymostatin (Tomkinson et al., Biochem J. 286: 475-480, 1992); cyclodextrin tetradecasulfate; eponemycin; camptothecin; fumagillin (
Ingber et al., Nature 348: 555-557, 1990); sodium gold thiomalate ("GST"; Matsubara and Ziff, JC).
lin. Invest. 79: 1440-1446, 1987); anti-collagenase-serum; α2-antiplasmin (Holmes et al., J. Biol. Chem.).
. 262 (4): 1659-1664, 1987);
nal Cancer Institute); lobenzarit disodium (
N- (2) -carboxyphenyl-4-chloroanthronic acid (chloroa
nthronic acid) disodium, ie "CCA"; Tak
euchi et al., Agents Actions 36: 312-316,199.
2); Thalidomide; Angostatic steroid; AGM-1470; carboxyaminoimidazole (carboxynaminomidazole)
); And metalloproteinase inhibitors (eg, BB94).
【０４０２】 従って、１つの局面において、本発明は、ガレクチン１１により調節されるア
ポトーシス、細胞増殖、細胞分化、または他の細胞増殖活性を増強するための方
法に関し、この方法は、増大したレベルのガレクチン１１機能的または生物学的
活性が必要な個体に、ガレクチン１１媒介性細胞応答を増大し得る、治療的に有
効な量のガレクチン１１ポリペプチド、フラグメント、改変体、誘導体もしくは
アナログ、またはアゴニストを投与する工程を包含する。特定の実施形態におい
て、ガレクチン１１媒介性シグナル伝達は、減少したアポトーシスを示す疾患を
処置するために増大される。Thus, in one aspect, the present invention relates to a method for enhancing apoptosis, cell proliferation, cell differentiation, or other cell proliferative activity regulated by galectin 11, wherein the method comprises an increased level of In an individual in need of a galectin-11 functional or biological activity, a therapeutically effective amount of a galectin-11 polypeptide, fragment, variant, derivative or analog or agonist capable of increasing a galectin-11 mediated cellular response is provided. Administering. In certain embodiments, galectin-11 mediated signaling is increased to treat diseases that exhibit reduced apoptosis.
【０４０３】 ガレクチン１１により調節される活性が与えられると、標準レベルもしくは「
正常」レベルと比較して、個体の実質的に変化した（増大または低減した）ガレ
クチン１１の発現レベルが、上記のような病理学的状態を生じることは容易に明
らかである。本発明のガレクチン１１ポリペプチドが、その標的細胞のいずれか
に対する活性の調節を発揮することもまた、当業者に明らかである。従って、個
体における、標準レベルもしくは正常レベルのガレクチン１１活性の減少により
引き起こされる状態が、ガレクチン１１タンパク質またはそのアゴニストの投与
により処置され得ることは明らかである。Given the activity regulated by galectin 11, standard levels or “
It is readily apparent that substantially altered (increased or decreased) galectin 11 expression levels in an individual as compared to "normal" levels will result in a pathological condition as described above. It is also apparent to one skilled in the art that the galectin-11 polypeptides of the present invention exert their modulation of activity on any of the target cells. Thus, it is clear that conditions in an individual caused by a decrease in normal or normal levels of galectin-11 activity can be treated by administration of a galectin-11 protein or agonist thereof.
【０４０４】 ガレクチン１１活性の上昇したレベルもしくは減少したレベルと関連する疾患
を処置することに加えて、本発明は、ガレクチン１１ポリペプチドまたはポリヌ
クレオチド（本明細書中に記載のフラグメント、改変体、誘導体、およびアナロ
グ、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストを含む）を投与して、ガレクチン
１１と関連する生物学的活性を上昇させる工程を包含する。In addition to treating diseases associated with elevated or decreased levels of galectin-11 activity, the present invention also provides galectin-11 polypeptides or polynucleotides (fragments, variants, (Including derivatives and analogs, as well as agonists and antagonists) to increase the biological activity associated with galectin-11.
【０４０５】 例えば、ガレクチン濃度および／または活性を上昇させる任意の方法を使用し
て、造血を刺激し得る。これらの方法を使用して、本明細書中に記載のガレクチ
ン１１のポリペプチド配列およびヌクレオチド配列を使用して、造血を刺激し得
る。特定の実施形態において、ガレクチン１１のポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドは、血液の酸素運搬能力の補助を指向する、エリスロポエチン治療におい
て使用される。本発明の範囲内のガレクチン１１処置としては、以下が挙げられ
るが、それらに限定されない：一般に輸血を必要とする患者（例えば、外傷被害
者、外科手術患者、透析患者、および種々の血液組成物関連障害（例えば、血友
病、嚢胞性線維症、妊娠、月経障害、早熟の初期貧血、脊髄損傷、宇宙飛行、加
齢、種々の新生物疾患状態など））。血液の酸素運搬能力の補助に必要であり、
本発明の範囲内である患者の状態の例としては、以下が挙げられるが、それらに
限定されない：低赤血球生成または赤血球生成欠損により特徴づけられる血液障
害の処置、慢性腎不全と関連する貧血、網状赤血球応答の刺激、鉄動態効果の発
生（例えば、血漿イオン代謝回転効果および骨髄輸送時間効果）、赤血球質量の
変化、ヘモグロビンＣ合成の刺激、および脊椎動物におけるヘマトクリットのレ
ベルの増加。本発明はまた、個体の酸素運搬能力を増強するための処置（例えば
、個体を低酸素状態に遭遇させる）を提供する。For example, hematopoiesis can be stimulated using any method that increases galectin concentration and / or activity. Using these methods, hematopoiesis can be stimulated using the galectin-11 polypeptide and nucleotide sequences described herein. In certain embodiments, the galectin-11 polypeptides and polynucleotides are used in erythropoietin therapy, which is directed at assisting the blood's ability to carry oxygen. Galectin-11 treatments within the scope of the present invention include, but are not limited to, patients who generally require a blood transfusion (eg, trauma victims, surgical patients, dialysis patients, and various blood compositions). Related disorders (eg, hemophilia, cystic fibrosis, pregnancy, menstrual disorders, precocious early anemia, spinal cord injury, space flight, aging, various neoplastic disease states, etc.). Necessary for supporting the oxygen carrying capacity of blood,
Examples of patient conditions that are within the scope of the present invention include, but are not limited to: treatment of blood disorders characterized by hypoerythropoiesis or deficiency of erythropoiesis, anemia associated with chronic renal failure, Stimulation of the reticulocyte response, generation of iron kinetic effects (eg, plasma ion turnover and bone marrow transit time effects), changes in red blood cell mass, stimulation of hemoglobin C synthesis, and increased levels of hematocrit in vertebrates. The invention also provides a treatment for enhancing the oxygen carrying capacity of the individual (eg, causing the individual to experience hypoxia).
【０４０６】 本発明はまた、本明細書中に記載のガレクチン１１のポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドと、他の推奨されるか、または従来の造血治療との組み合わせを包
含する。従って、例えば、ガレクチン１１は、赤血球生成刺激効果を単独に示す
化合物（例えば、エリスロポエチン、テストステロン、前駆細胞刺激因子、イン
スリン様増殖因子、プロスタグランジン、セロトニン、サイクリックＡＭＰ、プ
ロラクチン、およびトリヨードサイロニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｚｏｎｉｎｅ
））と組み合わされ得る。また、再生不良性貧血を処置するために一般に使用さ
れる化合物（例えば、メテノレン（ｍｅｔｈｅｎｏｌｅｎｅ）、スタノゾロール
、およびナンドロレン）；鉄欠乏性貧血を処置するために一般に使用される化合
物（例えば、鉄調製物）；悪性貧血を処置するために一般に使用される化合物（
例えば、ビタミンＢ１２および／または葉酸）；ならびに溶血性貧血を処置する
ために一般に使用される化合物（例えば、副腎皮質ステロイド（例えば、コルチ
コイド））との組み合わせを包含する。例えば、Ｒｅｓｅｇｏｔｔｉら、１９８
１、Ｐａｎｍｉｎｅｒｖａ Ｍｅｄｉｃａ、２３：２４３−２４８；Ｋｕｒｔｚ
、１９８２、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１４ａ：１０５−１０８；ＭｃＧｏｎ
ｉｇｌｅら、１９８４、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，２５：４３７−４４４；なら
びにＰａｖｌｏｖｉｃ−Ｋａｎｔｅｒａ、１９８０、Ｅｘｐｔ．Ｈｅｍａｔｏｌ
．８（増補８）２８３−２９１を参照のこと。The present invention also encompasses combinations of galectin-11 polypeptides and polynucleotides described herein with other recommended or conventional hematopoietic treatments. Thus, for example, galectin 11 is a compound that alone exhibits an erythropoiesis stimulating effect (eg, erythropoietin, testosterone, progenitor cell stimulating factor, insulin-like growth factor, prostaglandin, serotonin, cyclic AMP, prolactin, and triiodothyro). Nin (triiodothyzonine)
)). Also, compounds commonly used to treat aplastic anemia (eg, methenolene, stanozolol, and nandrolen); compounds commonly used to treat iron deficiency anemia (eg, iron preparations) ); Compounds commonly used to treat pernicious anemia (
For example, vitamin B12 and / or folic acid); and compounds commonly used to treat hemolytic anemia (eg, corticosteroids (eg, corticoids)). For example, Resegotti et al., 198
1, Panminerva Medica, 23: 243-248; Kurtz
McGon, 1982, FEBS Letters, 14a: 105-108;
igle et al., 1984, Kidney Int. , 25: 437-444; and Pavlovic-Kantera, 1980, Expt. Hematol
. 8 (Supplement 8) 283-291.
【０４０７】 エリスロポエチンの効果を増強するかまたはそれと相乗的に作用する化合物は
また、本明細書中のアジュバントとして有用であり、そしてこれらの化合物は、
以下を含むがそれらに限定されない：アドレナリン作用性アゴニスト、甲状腺ホ
ルモン、アンドロゲン、肝性赤血球生成因子、エリスロトロピン（ｅｒｙｔｈｒ
ｏｔｒｏｐｉｎ）、およびエリスロゲニン（ｅｒｙｔｈｒｏｇｅｎｉｎ）（例え
ば、Ｄｕｎｎ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐ
ｏｉｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔ
ｅｒ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８３）；Ｗｅｉｌａｎｄら、１９８２、Ｂｌｕｔ、
４４：１７３−１７５；Ｋａｌｍａｎｉ、１９８２、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、
２２：３８３−３９１；Ｓｈａｈｉｄｉ、１９７３、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅ
ｄ．、２８９：７２−８０；Ｕｒａｂｅら、１９７９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、
１４９：１３１４−１３２５；Ｂｉｌｌａｔら、１９８２、Ｅｘｐｔ．Ｈｅｍａ
ｔｏｌ．、１０：１３３−１４０；Ｎａｕｇｈｔｏｎら、１９８３、Ａｃｔａ
Ｈａｅｍａｔ、６９：１７１−１７９；Ｃｏｇｎｏｔｅら、要約 ３６４、Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ７ｔｈ Ｉｎｔｌ．Ｃｏｎｇ．ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ（Ｑｕｅｂｅｃ Ｃｉｔｙ、Ｑｕｅｂｅｃ、１９８４年７月１〜７日）
；およびＲｏｔｈｍａｎら、１９８２、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．、２０：１
０５−１０８を参照のこと）。Compounds that enhance or act synergistically with the effects of erythropoietin are also useful as adjuvants herein, and these compounds
Including but not limited to: adrenergic agonists, thyroid hormones, androgens, hepatic erythropoiesis factor, erythrotropin (erythrr)
otropin), and erythrogenin (eg, Dunn, “Current Concepts in Erythrop”).
oiesis ", John Wiley and Sons (Chichest
er, England, 1983); Weiland et al., 1982, Blut,
44: 173-175; Kalmani, 1982, Kidney Int. ,
22: 383-391; Shahidi, 1973, New Eng. J. Me
d. Urabe et al., 1979, J. Am. Exp. Med. ,
149: 1314-1325; Billat et al., 1982, Expt. Hema
tol. 10: 133-140; Naughton et al., 1983, Acta.
Haemat, 69: 171-179; Cognote et al., Summary 364, Pr.
receiveds 7th Intl. Cong. of Endocrino
logy (Quebec City, Quebec, July 1-7, 1984)
And Rothman et al., 1982, J .; Surg. Oncol. , 20: 1
05-108).
【０４０８】 造血を刺激する方法は、患者にガレクチン１１を含有する薬学的組成物の造血
有効量（すなわち、血球の形成をもたらす量）を投与する工程を包含する。ガレ
クチン１１は、非経口、舌下、局所的、肺内、および鼻腔内を含むがそれらに限
定されない任意の適切な技術により患者に投与され、そしてこれらの技術は、本
明細書中でさらに議論される。薬学的組成物は、必要に応じて、以下からなる群
のメンバーを１つ以上含む：エリスロポエチン、テストステロン、前駆細胞刺激
因子、インスリン様増殖因子、プロスタグランジン、セロトニン、サイクリック
ＡＭＰ、プロラクチン、トリヨードサイロニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｚｏｎｉ
ｎｅ）、メテノロン（ｍｅｔｈｅｎｏｌｅｎｅ）、スタノゾロール、およびナン
ドロロン、鉄調製物、ビタミンＢ１２、葉酸および／または副腎皮質ステロイド
。ガレクチン１１および同時処置（ｃｏｔｒｅａｔｍｅｎｔ）薬物は、別々の、
または同じ投与経路により、そして同時にまたは異なる時間に、例えば、投薬、
患者の臨床状態などに依存して、適切に送達される。A method of stimulating hematopoiesis comprises administering to a patient a hematopoietic effective amount (ie, an amount that results in blood cell formation) of a pharmaceutical composition containing galectin-11. Galectin 11 is administered to a patient by any suitable technique including, but not limited to, parenteral, sublingual, topical, pulmonary, and intranasal, and these techniques are discussed further herein. Is done. The pharmaceutical composition optionally comprises one or more members of the group consisting of: erythropoietin, testosterone, progenitor cell stimulating factor, insulin-like growth factor, prostaglandin, serotonin, cyclic AMP, prolactin, bird. Iodothyronine (triiodothyzoni)
ne), methenolone, stanozolol, and nandrolone, iron preparations, vitamin B12, folic acid and / or corticosteroids. Galectin 11 and the cotreatment drug are separate,
Or by the same route of administration and simultaneously or at different times, e.g.
It is delivered appropriately depending on the clinical condition of the patient.
【０４０９】 ガレクチン１１の過少発現およびその活性に関する異常な状態の処置について
、またはガレクチン１１の上昇もしくは減少したレベルが所望される処置につい
て、いくつかのアプローチが利用可能である。１つのアプローチは、身体におい
てガレクチン１１の増加したレベルが必要とされる個体に、本発明の単離された
ガレクチン１１ポリペプチド、フラグメント、改変体、誘導体もしくはアナログ
、またはガレクチン１１を活性化する化合物（すなわち、上記のようなアゴニス
ト）の治療有効量を、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせ
て投与する工程を包含する。あるいは、遺伝子治療は、被験体における関連細胞
によるガレクチン１１の内因性の産生をもたらすために使用され得る。例えば、
本発明のポリヌクレオチドは、当該分野において公知の技術を用いて複製欠失レ
トロウイルスベクターにおける発現について操作され得る。次いで、レトロウイ
ルス発現構築物が単離され得、そして本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ
を含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング
細胞中に導入され得、その結果、ここでパッケージング細胞は目的の遺伝子を含
有する感染性ウイルス粒子を産生する。これらのプロデューサー細胞は、インビ
ボで細胞を操作し、そしてインビボでのポリペプチドの発現のために被験体に投
与され得る。遺伝子治療の概説については、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ
ｏｔｈｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ、第２０章（およびそこで引用される参考
文献）、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｔ Ｓｔｒａｃ
ｈａｎおよびＡ Ｐ Ｒｅａｄ、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ（１９９６）を参照のこと。Several approaches are available for treating abnormal conditions related to underexpression of galectin-11 and its activity, or for treatments where elevated or decreased levels of galectin-11 are desired. One approach is to provide an isolated galectin-11 polypeptide, fragment, variant, derivative or analog of the invention, or a compound that activates galectin-11, to an individual in need of increased levels of galectin-11 in the body. Administering a therapeutically effective amount of (ie, an agonist as described above), optionally in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. Alternatively, gene therapy can be used to effect the endogenous production of galectin 11 by relevant cells in a subject. For example,
A polynucleotide of the invention can be engineered for expression in a replication-defective retroviral vector using techniques known in the art. The retroviral expression construct can then be isolated and RNA encoding a polypeptide of the invention
Can be introduced into a packaging cell transduced with a retroviral plasmid vector containing, so that the packaging cell now produces infectious viral particles containing the gene of interest. These producer cells manipulate the cells in vivo and can be administered to a subject for expression of the polypeptide in vivo. For an overview of gene therapy, see Gene Therapy and
other Molecular Genetic-based Thera
peupic Approaches, Chapter 20 (and references cited therein), Human Molecular Genetics, T Strac.
han and AP Read, BIOS Scientific Public
See shers Ltd (1996).
【０４１０】 さらに、処置は、例えば、遺伝子置換治療の形態において投与され得る。詳細
には、通常の機能を示すガレクチン１１遺伝子産物の産生を指向する本発明のガ
レクチン１１のヌクレオチド配列の一つ以上のコピーが、細胞中にＤＮＡを導入
する他の粒子（例えば、リポソーム、および遺伝子活性化マトリクス）に加えて
、以下を含むがそれらに限定されないベクターを用いて、患者または動物被験体
中の適切な細胞中に挿入され得る：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レト
ロウイルスおよびヘルペスウイルスのベクター。ガレクチン１１遺伝子は好中球
において発現されるので、このような遺伝子置換技術は、患者内のこれらの細胞
にガレクチン１１遺伝子配列を送達し得るべきであるか、あるいはガレクチン１
１遺伝子の配列が発現されるべき細胞の部位へのこのようなガレクチン１１ポリ
ヌクレオチド配列の直接投与を含むべきである。あるいは、標的された相同組換
えを利用して、欠損内因性ガレクチン１１遺伝子および／またはその調節配列（
例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列）を補正し得るか、あるいは
適切な組織または細胞型において他の休止状態のガレクチン１１活性を「刺激（
ｔｕｒｎ ｏｎ）」し得る。In addition, treatment may be administered, for example, in the form of gene replacement therapy. In particular, one or more copies of the nucleotide sequence of Galectin-11 of the present invention, which directs the production of a Galectin-11 gene product that exhibits normal function, can be used to transfer other particles (eg, liposomes, and liposomes) that introduce DNA into cells. In addition to gene activation matrices), they can be inserted into appropriate cells in a patient or animal subject using vectors, including but not limited to: adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus and herpes virus Vector. Since the galectin-11 gene is expressed in neutrophils, such a gene replacement technique should be able to deliver the galectin-11 gene sequence to these cells in the patient, or
It should involve direct administration of such a galectin-11 polynucleotide sequence to the site of the cell where the sequence of one gene is to be expressed. Alternatively, using targeted homologous recombination, the defective endogenous galectin 11 gene and / or its regulatory sequence (
(Eg, promoter and enhancer sequences), or "stimulate (" stimulate "other dormant galectin-11 activity in appropriate tissues or cell types.
turn on) ".
【０４１１】 ガレクチン１１の発現および／またはガレクチン１１の活性の全体的なレベル
を増加するために利用され得るさらなる方法は、細胞増殖調節における異常な症
状の改善に十分な位置および数での患者への適切なガレクチン１１発現細胞、好
ましくは自己の細胞の導入が含まれる。そのような細胞は、組換え体または非組
換え体のいずれかであり得る。患者においてガレクチン１１遺伝子の発現の全体
的なレベルを増加するために投与され得る細胞の中には、ガレクチン１１遺伝子
を発現する正常な細胞がある。細胞ベースの遺伝子治療技術は、当業者に周知で
ある。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，３９９，３４９号；および
ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎの米国特許第５，４６０，９５９号を参照
のこと。Further methods that can be utilized to increase the overall level of galectin 11 expression and / or activity of galectin 11 are to patients at locations and numbers sufficient to ameliorate abnormal symptoms in cell growth regulation. The introduction of a suitable galectin 11 expressing cell, preferably an autologous cell. Such cells can be either recombinant or non-recombinant. Among the cells that can be administered to increase the overall level of expression of the galectin 11 gene in a patient are normal cells that express the galectin 11 gene. Cell-based gene therapy techniques are well known to those skilled in the art. See, for example, Anderson et al., U.S. Patent No. 5,399,349; and Mulligan and Wilson U.S. Patent No. 5,460,959.
【０４１２】 ガレクチン１１の活性が過剰である場合、いくつかのアプローチが、上記のポ
リペプチド配列およびポリヌクレオチド配列に由来する分子を用いてガレクチン
１１の活性を減少または阻害するために利用される。従って、本発明のさらなる
局面は、身体のガレクチン１１活性の減少したレベルを必要とする個体を処置す
る方法に関し、これは、そのような個体に、ガレクチン１１のアンタゴニストと
して作用する本発明のガレクチン１１ポリペプチド、フラグメント、改変体、誘
導体またはアナログの治療有効量を、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリ
アとの組み合わせにおいて含む組成物を投与する工程を包含する。好ましくは、
増加したアポトーシスまたはガレクチン１１により調節される他の細胞の増殖活
性が示される疾患を処置するために、ガレクチン１１活性が減少される。ガレク
チン１１のアンタゴニストとして機能する本発明のポリペプチド、誘導体、改変
体およびアナログは、通常、以下に記載されるアッセイおよび当該分野で公知の
他の技術を用いて同定され得る。本発明の使用のために好ましいアンタゴニスト
は、ガレクチン１１特異的抗体である。In cases where the activity of galectin-11 is in excess, several approaches are utilized to reduce or inhibit the activity of galectin-11 using molecules derived from the polypeptide and polynucleotide sequences described above. Accordingly, a further aspect of the invention relates to a method of treating an individual in need of a reduced level of galectin-11 activity in the body, comprising the step of treating such an individual with a galectin-11 of the invention acting as an antagonist of galectin-11. Administering a composition comprising a therapeutically effective amount of the polypeptide, fragment, variant, derivative or analog, optionally in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. Preferably,
Galectin-11 activity is reduced to treat diseases that exhibit increased apoptosis or other cellular proliferative activity regulated by galectin-11. Polypeptides, derivatives, variants and analogs of the invention that function as antagonists of galectin-11 can generally be identified using the assays described below and other techniques known in the art. A preferred antagonist for use in the present invention is a galectin 11-specific antibody.
【０４１３】 従って、本発明の１つの実施形態は、例えば、ガレクチン１１活性を抑制する
（すなわち、低くする）に有効な量の薬学的に受容可能なキャリアを伴う、本発
明の抗体またはフラグメント、改変体、誘導体もしくはアナログのようなインヒ
ビター化合物（アンタゴニスト）を被験体に投与する工程を包含する。Thus, one embodiment of the present invention provides an antibody or fragment of the present invention, for example, with an effective amount of a pharmaceutically acceptable carrier to inhibit (ie, reduce) galectin-11 activity. Administering an inhibitor compound (antagonist) such as a variant, derivative or analog to the subject.
【０４１４】 別のアプローチにおいて、ガレクチン１１活性は、ガレクチン１１遺伝子の発
現レベルの減少により、減少または阻害され得る。特異的な実施形態において、
本発明に従うアンタゴニストは、、配列番号１に含まれる配列に対応する核酸、
またはその相補鎖、および／または寄託クローン２０９０５３に含まれるヌクレ
オチド配列に対応する核酸、またはその相補鎖である。１つの実施形態において
、これは、生物によって内部生成されたか、または別々に投与されるかのいずれ
かで、アンチセンス配列の使用を通して達成される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ
，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（１９９１）５６：５６０、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）を参照のこと）。アンチセンス技術を使用して、アン
チセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して、あるいは三重らせん体形成を通して遺
伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎ
ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ
（１９８８）において議論される。三重らせん体形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃ
ｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖ
ａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）において議論される。
これらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基
づく。In another approach, galectin-11 activity can be reduced or inhibited by decreasing the level of expression of the galectin-11 gene. In specific embodiments,
An antagonist according to the present invention is a nucleic acid corresponding to the sequence contained in SEQ ID NO: 1,
Or its complementary strand, and / or a nucleic acid corresponding to the nucleotide sequence contained in the deposited clone 209053, or its complementary strand. In one embodiment, this is achieved through the use of antisense sequences, either internally generated by the organism or administered separately (eg, O'Connor).
, J. et al. Neurochem. (1991) 56: 560, Oligodeoxy.
nucleotides as Antisense Inhibitors
of Gene Expression, CRC Press, Boca Ra
ton, FL (1988)). Antisense technology can be used to control gene expression through antisense DNA or RNA, or through triple helix formation. Antisense technology is described, for example, in Okano, J. et al. Neu
rochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleo.
tides as Antisense Inhibitors of Gen
e Expression, CRC Press, Boca Raton, FL
(1988). Triple helix formation is described, for example, by Lee et al., N.
ucleic Acids Research 6: 3073 (1979); C
ooney et al., Science 241: 456 (1988); and Derv.
et al., Science 251: 1360 (1991).
These methods are based on the binding of the polynucleotide to complementary DNA or RNA.
【０４１５】 例えば、非リンパ性白血病細胞株ＨＬ−６０および他の細胞株の増殖を阻害す
るためのｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂアンチセンスＲＮＡ構築物の使用は、以前
に記載された（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら（１９８
９））。これらの実験は、細胞をオリゴリボヌクレオチドとインキュベーション
することによってインビトロで行われた。インビボ用途のための類似の手順は、
ＷＯ９１／１５５８０に記載される。簡単には、所定のアンチセンスＲＮＡにつ
いてのオリゴヌクレオチドの対は、以下のように生成される：オープンリーディ
ングフレームの最初の１５塩基に相補的な配列を、５末端のＥｃｏＲＩ部位およ
び３末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接させる。次に、オリゴヌクレオチドの対は
、９０℃で１分間加熱され、次いで２×ライゲーション緩衝液（２０ｍＭ ＴＲ
ＩＳ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）および０．２ｍＭ ＡＴＰ）中でアニーリングされ、次いで、レ
トロウイルスベクターＰＭＶ７のＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結される
（ＷＯ９１／１５５８０）。For example, the use of c-myc and c-myb antisense RNA constructs to inhibit the growth of the non-lymphocytic leukemia cell line HL-60 and other cell lines has been described previously (Wickstrom et al. 1988); Anfossi et al. (198)
9)). These experiments were performed in vitro by incubating cells with oligoribonucleotides. A similar procedure for in vivo applications is
WO 91/15580. Briefly, a pair of oligonucleotides for a given antisense RNA is generated as follows: a sequence complementary to the first 15 bases of the open reading frame is provided with a 5 terminal EcoRI site and a 3 terminal HindIII. Adjacent to the site. Next, the oligonucleotide pair is heated at 90 ° C. for 1 minute and then 2 × ligation buffer (20 mM TR
Annealed in IS HCl pH 7.5, 10 mM MgCl 2 , 10 mM dithiothreitol (DTT) and 0.2 mM ATP) and then ligated into the EcoR1 / HindIII site of the retroviral vector PMV7 (WO91 / 15580).
【０４１６】 例えば、本発明のガレクチン１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
の５’コード部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリ
ゴヌクレオチドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関連する遺
伝子の領域に相補的であるように設計され、それによりガレクチン１１ポリペプ
チドの転写および産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、
インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のポリペプチドへ
の翻訳をブロックする。For example, the 5 ′ coding portion of a polynucleotide encoding a galectin 11 polypeptide of the present invention can be used to design an antisense RNA oligonucleotide of about 10-40 base pairs in length. DNA oligonucleotides are designed to be complementary to regions of the gene involved in transcription, thereby inhibiting the transcription and production of the galectin-11 polypeptide. Antisense RNA oligonucleotides are
It hybridizes to mRNA in vivo and blocks translation of the mRNA molecule into a polypeptide.
【０４１７】 １つの実施形態において、本発明のガレクチン１１アンチセンス核酸は、外因
性配列からの転写により細胞内に産生される。例えば、ベクターまたはその一部
が転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベク
ターは、ガレクチン１１アンチセンス核酸をコードする配列を含む。このような
ベクターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エ
ピソームのままであり得るか、または染色体に組みこまれ得る。このようなベク
ターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクタ
ーは、脊椎動物細胞において複製および発現に使用される、プラスミド、ウイル
ス、または当該分野で公知の他のベクターであり得る。ガレクチン１１をコード
する配列またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞にお
いて作用する当該分野で公知の任意のプロモーターによってであり得る。このよ
うなプロモーターは、誘導性または構成性であり得る。このようなプロモーター
には、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター
領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９：３０４−
３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復（Ｙａｍａｍｏｔ
ｏら、Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロ
モーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節
配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２（１９８２））
などに含まれるプロモーター。In one embodiment, a galectin-11 antisense nucleic acid of the invention is produced intracellularly by transcription from an exogenous sequence. For example, a vector or a portion thereof is transcribed to produce an antisense nucleic acid (RNA) of the invention. Such a vector contains a sequence encoding a galectin-11 antisense nucleic acid. Such a vector can remain episomal or integrate chromosomally, as long as it can be transcribed to produce the desired antisense RNA. Such vectors can be constructed by recombinant DNA technology methods standard in the art. The vector can be a plasmid, virus, or other vector known in the art, used for replication and expression in vertebrate cells. Expression of the sequence encoding galectin 11 or a fragment thereof may be by any promoter known in the art to work in vertebrate, preferably human cells. Such a promoter can be inducible or constitutive. Such promoters include, but are not limited to, the SV40 early promoter region (Bernoist and Chambon, Nature 29: 304-
310 (1981)), the 3 'long terminal repeat of Rous sarcoma virus (Yamamot).
o et al., Cell 22: 787-797 (1980)), the herpes thymidine promoter (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US.
A. 78: 1441-1445 (1981)), the regulatory sequence of the metallothionein gene (Brinster et al., Nature 296: 39-42 (1982)).
Promoters included in etc.
【０４１８】 本発明のアンチセンス核酸は、ガレクチン１１遺伝子のＲＮＡ転写物の少なく
とも一部に相補的な配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましいが必要で
はない。本明細書中で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列と
は、ＲＮＡとハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成し得るに十分な相補性を
有する配列を意味し；従って、ガレクチン１１アンチセンス核酸が二重鎖である
状況において、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または３重鎖の形成が
アッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセン
ス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が大きくな
るにつれて、ガレクチン１１ＲＮＡとの塩基ミスマッチが多くなり、これは安定
な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を含み得そしてなお形成し得る。当業
者は、ハイブリダイズされた複合体の融解点を決定するために標準的な手段の使
用により、相当な程度のミスマッチを確認し得る。[0418] The antisense nucleic acids of the present invention include a sequence complementary to at least a portion of the RNA transcript of the galectin 11 gene. However, absolute complementarity is preferred but not required. As used herein, a sequence "complementary to at least a portion of an RNA" refers to a sequence that has sufficient complementarity to hybridize to the RNA and form a stable duplex. Thus, in situations where the galectin-11 antisense nucleic acid is double-stranded, a single strand of double-stranded DNA can be tested, or triplex formation can be assayed. The ability to hybridize depends on both the degree of complementarity and the length of the antisense nucleic acid. In general, the larger the hybridizing nucleic acid, the more base mismatches with galectin 11 RNA, which may include and still form a stable duplex (or in some cases a triplex). One skilled in the art can ascertain a significant degree of mismatch by use of standard means to determine the melting point of the hybridized complex.
【０４１９】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３
３５を参照のこと。従って、図１に示されるガレクチン１１の５’−または３’
−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性の
ガレクチン１１ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得
る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コ
ドンの相補鎖を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオ
リゴヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明
に従って使用され得る。ガレクチン１１のｍＲＮＡの５’領域、３’領域または
コード領域にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アンチ
センス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましく
は６〜約５０ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面に
おいて、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも
１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオ
チドである。Oligonucleotides that are complementary to the 5 ′ end of the message (eg, 5 ′ untranslated sequences up to and including the AUG start codon) should work most efficiently at inhibiting translation. is there. However, sequences complementary to the 3 'untranslated sequence of mRNA have been shown to be effective in inhibiting translation of mRNA as well. Generally, Wagner, R.A. , 1994, Nature 372: 333-3.
See 35. Therefore, 5′- or 3 ′ of galectin 11 shown in FIG.
Oligonucleotides complementary to any of the -untranslated non-coding regions can be used in antisense approaches to inhibit translation of endogenous galectin 11 mRNA. Oligonucleotides complementary to the 5 'untranslated region of the mRNA should include the complement of the AUG start codon. Antisense oligonucleotides complementary to the mRNA coding region are less efficient inhibitors of translation, but can be used in accordance with the present invention. Whether designed to hybridize to the 5 ', 3' or coding region of the galectin 11 mRNA, the antisense nucleic acid should be at least 6 nucleotides in length, and preferably Oligonucleotides ranging from ~ 50 nucleotides in length. In certain aspects, the oligonucleotide is at least 10 nucleotides, at least 17 nucleotides, at least 25 nucleotides or at least 50 nucleotides.
【０４２０】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物
、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であ
り得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改
変されて、例えば、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得る。
このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボに
おいて宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を
促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒ
ｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５
２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参
照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４
（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘引切
断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ
ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、
６：９５８−９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏ
ｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を含み
得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド
、ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘引切
断剤など）に結合体化され得る。A polynucleotide of the invention can be DNA or RNA, or a chimeric mixture, or a derivative or modified version thereof, single-stranded or double-stranded. The oligonucleotide can be modified at the base moiety, sugar moiety, or phosphate backbone to improve, for example, molecular stability, hybridization, and the like.
The oligonucleotides may be linked to other additional groups such as peptides (eg, to target host cell receptors in vivo) or factors that facilitate transport across cell membranes (eg, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl.
. Acad. Sci. U. S. A. 86: 6553-6556; Lemaitr
e et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-65
2; see PCT Publication No. WO 88/09810 (published December 15, 1988)), or the blood-brain barrier (eg, PCT Publication No. WO 89/10134).
(Published April 25, 1988)), a hybridization-triggered cleavage.
agent) (eg, Kroll et al., 1988, BioTechniques,
6: 958-976), or intercalating agents (eg, Zo
n, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549). For this purpose, the oligonucleotide can be conjugated to another molecule, such as a peptide, a hybridization-triggered crosslinker, a transport agent, a hybridization-triggered cleavage agent, and the like.
【０４２１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。An antisense oligonucleotide can include at least one modified base moiety, wherein the base moiety is selected from the group including, but not limited to: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5 -Chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2
-Thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, β-D-galactosylcuosin, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine,
2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D- Mannosylcuosin, 5'-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2
-Methylthio-N6-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid (v
), Wybutoxosine, pseudouracil, cuocin, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxy Acetic acid (v), 5-methyl-2-thiouracil,
3- (3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, (acp3)
w, and 2,6-diaminopurine.
【０４２２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。An antisense oligonucleotide can also include at least one modified sugar moiety selected from the group including, but not limited to: arabinose, 2-fluoroarabinose, xylulose, and hexose.
【０４２３】 なお別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含む
がそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン酸骨
格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエ
ート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロジア
ミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムア
セタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。In yet another embodiment, the antisense oligonucleotide comprises at least one modified phosphate backbone selected from the group including, but not limited to: phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphorothioate Amidothioate, phosphoramidate, phosphorodiamidate, methylphosphonate, alkyl phosphotriester, and formacetal or analogs thereof.
【０４２４】 なお別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノマ
ーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲ
ＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のｂ−ユニットとは反対に、
その鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは、２’−
０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮ
Ａアナログである（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３
２７−３３０）。[0424] In yet another embodiment, the antisense oligonucleotide is an a-anomeric oligonucleotide. The a-anomeric oligonucleotide has a complementary R
Forms a specific double-stranded hybrid with NA, as opposed to the normal b-unit,
The chains are parallel to each other (Gautier et al., 1987, Nucl. Acid
s Res. 15: 6625-6641). This oligonucleotide is 2'-
0-methylribonucleotide (Inoue et al., 1987, Nucl. A
cids Res. 15: 6131-148), or chimeric RNA-DN
A analog (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 3).
27-330).
【０４２５】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法により（例えば、
自動ＤＮＡ合成機（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）合成され得る。例
えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（１９８
８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）により合成され得、メチ
ルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御化ポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅ
ｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、１９８８、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１）な
どの使用により調製され得る。A polynucleotide of the present invention can be prepared by standard methods known in the art (eg,
An automatic DNA synthesizer (such a device is available from Biosearch, Applied B
(commercially available from iosystems, etc.). For example, phosphorothioate oligonucleotides can be prepared using the method of Stein et al.
8, Nucl. Acids Res. 16: 3209), wherein the methylphosphonate oligonucleotide is a controlled pore glass.
d pore glass) polymer support (Sarin et al., 1988, Pro
c. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85: 7448-7451).
【０４２６】 ガレクチン１１コード領域配列に対してアンチセンスヌクレオチド相補鎖が使
用され得るが、それらの転写された非翻訳領域に対する相補鎖が最も好ましい。Although antisense nucleotide complements to the galectin 11 coding region sequence may be used, complements to their transcribed, untranslated regions are most preferred.
【０４２７】 本発明に従う潜在的ガレクチン１１アンタゴニストはまた、触媒性ＲＮＡ、す
なわちリボザイムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４（１９
９０年１０月４日公開）；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２
−１２２５（１９９０）を参照のこと）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断
するリボザイムは、ガレクチン１１ｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、
ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは
、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域によって指示される位置で、
ｍＲＮＡを切断する。唯一の必要条件は、その標的ｍＲＮＡが以下の２塩基の配
列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築
および生成は当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａ
ｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１（１９８８）により十分に記載さ
れる。多くの潜在的なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が、ガレクチン１１
のヌクレオチド配列（図１；配列番号１）内に存在する。好ましくは、リボザイ
ムは、その切断認識部位がガレクチン１１ｍＲＮＡの５’末端の近くに位置され
るように操作され；すなわち、効率を増加して、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物
の細胞内蓄積を最小化する。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、アンチセ
ンスコードＤＮＡの導入について上記されたのと同じ様式で、細胞内に導入され
得る。Potential galectin-11 antagonists according to the present invention also include catalytic RNAs, ie, ribozymes (see, eg, PCT International Publication WO 90/11364 (19
Published October 4, 1990); Sarver et al., Science 247: 1222.
-1225 (1990)). Ribozymes that cleave mRNA at a site-specific recognition sequence can be used to destroy galectin 11 mRNA,
The use of hammerhead ribozymes is preferred. The hammerhead ribozyme is located at the position dictated by the adjacent region forming a complementary base pair with the target mRNA,
Cleaves the mRNA. The only requirement is that the target mRNA has the following two base sequence: 5'-UG-3 '. The construction and production of hammerhead ribozymes is well known in the art and haseloff and Gerla.
ch, Nature 334: 585-591 (1988). Many potential hammerhead ribozyme cleavage sites are associated with galectin 11
(FIG. 1; SEQ ID NO: 1). Preferably, the ribozyme is engineered such that its cleavage recognition site is located near the 5 'end of galectin 11 mRNA; that is, to increase efficiency and minimize intracellular accumulation of non-functional mRNA transcripts I do. A ribozyme-encoding DNA construct can be introduced into a cell in the same manner as described above for introducing antisense-encoding DNA.
【０４２８】 アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改良された）から構成され得
、そしてインビボにおいてガレクチン１１を発現する細胞に送達されるべきであ
る。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンス
の導入のための上記と同じ様式で細胞中に導入され得る。送達の好ましい方法は
、強力な構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロ
モーターのような）の制御下で、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使
用する工程を包含し、その結果トランスフェクトした細胞が内因性ガレクチン１
１メッセージを破壊しそして翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成する
。リボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるので、より低い細胞内濃
度が効率のために必要とされる。In the case of the antisense approach, the ribozymes of the invention can be composed of modified oligonucleotides (eg, improved in stability, targeting, etc.) and delivered to cells expressing galectin 11 in vivo. It should be. A ribozyme-encoding DNA construct can be introduced into a cell in the same manner as described above for the introduction of antisense encoding DNA. A preferred method of delivery involves using a DNA construct that "encodes" a ribozyme under the control of a strong constitutive promoter (such as, for example, a pol III or pol II promoter), and thus transfected. Cells are endogenous galectin 1
It produces enough ribozyme to destroy one message and inhibit translation. Because ribozymes are catalytic, unlike antisense molecules, lower intracellular concentrations are required for efficiency.
【０４２９】 内因性のガレクチン１１遺伝子発現はまた、標的化相同組換え（例えば、Ｓｍ
ｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：３３０−２３４（１９８５）；Ｔｈｏ
ｍａｓら、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら
、Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９）（これらの各々は、その全体が参
考として本明細書中に援用される）を参照のこと）を使用して、ガレクチン１１
遺伝子またはそのプロモーターを不活性化すなわち「ノックアウト」することに
よって減少され得る。このようなアプローチは、組換えＤＮＡ構築物が、適切な
ウイルスベクターを使用して、インビボで必要とされる部位に直接投与されるか
、または標的化される場合、ヒトにおける使用に適用され得る。[0429] Endogenous galectin-11 gene expression can also be measured by targeted homologous recombination (eg, Sm
ties, et al., Nature 317: 330-234 (1985); Tho.
mas et al., Cell 51: 503-512 (1987); Thompson et al., Cell 5: 313-321 (1989), each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Using Galectin 11
It can be reduced by inactivating or "knocking out" the gene or its promoter. Such an approach can be adapted for use in humans where the recombinant DNA construct is directly administered or targeted in vivo at the required site using an appropriate viral vector.
【０４３０】 あるいは、内因性ガレクチン１１遺伝子発現は、ガレクチン１１遺伝子の調節
領域（すなわち、ガレクチン１１プロモーターおよび／またはエンハンサー）に
相補的であり、体内の標的細胞中のガレクチン１１遺伝子の転写を妨げる三重ら
せん構造を形成する標的化デオキシリボヌクレオチド配列によって減少され得る
。一般的に、Ｈｅｌｅｎｅら、Ａｎｎ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２
７−３６（１９９２）；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｓ．，６（６）：５６９−５８４（１９９１）；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．
Ｊ．，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−８１５（１９９２）を参照
のこと。Alternatively, endogenous galectin-11 gene expression is complementary to a galectin-11 gene regulatory region (ie, a galectin-11 promoter and / or enhancer), preventing triple transcription of the galectin-11 gene in target cells in the body. It can be reduced by targeted deoxyribonucleotide sequences that form a helical structure. See generally, Helene et al., Ann, N .; Y. Acad. Sci. 660: 2
7-36 (1992); Helene, C .; , Anticancer Drug
Des. , 6 (6): 569-584 (1991); and Maher, L. et al.
J. , Bioassays 14 (12): 807-815 (1992).
【０４３１】 本発明のさらに別の実施形態において、ガレクチン１１の活性は、「ドミナン
トネガティブ」を使用して減少され得る。この目的のために、欠損ガレクチン１
１をコードする構築物（例えば、β−ガラクトシドを結合するガレクチン１１の
領域の全てまたは一部を欠失する変異体のような）は、適切な標的細胞上のガレ
クチン１１の活性を消失するために遺伝子治療アプローチにおいて使用され得る
。例えば、β−ガラクトシドを結合するガレクチン１１の領域の全てまたは一部
が改変または欠失しているガレクチン１１の宿主細胞発現を指向するヌクレオチ
ド配列は、好中球細胞、あるいはガレクチン１１を発現する他の細胞または組織
内に導入され得る（例えば、本明細書中に記載のようなインビボまたはエキソビ
ボでの遺伝子治療方法のいずれかによって）。あるいは、標的化相同組換えが、
そのような欠失または変異を、好中球またはガレクチン１１を発現する他の細胞
中の対象の内因性のガレクチン１１遺伝子に導入するために利用され得る。In yet another embodiment of the present invention, the activity of galectin-11 can be reduced using a “dominant negative”. For this purpose, the defective galectin 1
1 (such as, for example, a mutant that deletes all or part of the region of galectin 11 that binds β-galactoside) to eliminate the activity of galectin 11 on appropriate target cells. It can be used in gene therapy approaches. For example, a nucleotide sequence that directs host cell expression of galectin 11 in which all or part of the region of galectin 11 that binds β-galactoside is modified or deleted is a neutrophil cell, or a nucleotide sequence that expresses galectin 11 (Eg, by any of the methods for gene therapy in vivo or ex vivo, as described herein). Alternatively, targeted homologous recombination
Such deletions or mutations can be utilized to introduce the subject's endogenous galectin-11 gene in neutrophils or other cells that express galectin-11.
【０４３２】 アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組織に対
する本発明のポリペプチドの細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍のアゴニストを刺激し、
それにより異常な細胞増殖および増殖を（例えば、腫瘍形成または増殖において
）遅延または防止する。Utilizing antagonist / agonist compounds, the growth and proliferation of polypeptides of the invention against neoplastic cells and tissues (proli
feration) effect. That is, it stimulates a tumor agonist,
Thereby delaying or preventing abnormal cell growth and proliferation (eg, in tumorigenesis or proliferation).
【０４３３】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患を阻害し得、そ
して水晶体嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｃａｔａｒａｃｔ）手術
後の上皮レンズ細胞の増殖を防止する。本発明のポリペプチドのマイトジェン活
性の防止はまた、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要求され得る。[0433] Antagonists / agonists may also be employed to inhibit hypervascular disease and prevent proliferation of epithelial lens cells following extracapsular cataract surgery. Prevention of the mitogenic activity of the polypeptides of the invention may also be required in cases such as restenosis following balloon angioplasty.
【０４３４】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖
防止し得る。An antagonist / agonist may also be utilized to prevent scar tissue growth during wound healing.
【０４３５】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
処置し得る。[0435] Antagonists / agonists may also be used to treat the diseases described herein.
【０４３６】 従って、本発明は、障害または疾患（本発明のポリヌクレオチドの過剰発現に
関連する、本願の全体に渡って列挙される障害または疾患が含まれるが、これら
に限定されない）を、（ａ）本発明のポリヌクレオチドに指向されたアンチセン
ス分子、および／または（ｂ）本発明のポリヌクレオチドに指向されたリボザイ
ムを、患者に投与することによって処置する方法を提供する。Accordingly, the present invention relates to disorders or diseases, including, but not limited to, those disorders or diseases listed throughout this application that are associated with overexpression of a polynucleotide of the present invention, including (but not limited to): Methods are provided for treating a patient by administering a) an antisense molecule directed to a polynucleotide of the invention, and / or (b) a ribozyme directed to a polynucleotide of the invention.
【０４３７】 （処方および投与） 個体中の標準または正常なレベルのガレクチン１１活性の減少によって生じる
症状は、本発明のガレクチン１１ポリペプチド、あるいはフラグメント、改変体
、誘導体、またはアナログあるいはそれらのアゴニストの投与によって処置され
得ることが理解される。従って、本発明はさらに、ガレクチン１１活性の増加レ
ベルを必要とする個体を処置する方法を提供し、この方法は、そのような個体に
、そのような個体におけるガレクチン１１活性レベルを増加させるのに有効な、
本発明の単離されたガレクチン１１ポリペプチドあるいはフラグメント、改変体
、誘導体、またはアナログ（例えば、ガレクチン１１の全長形態のような）の有
効量を含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。Formulations and Administration Symptoms caused by a decrease in standard or normal levels of galectin-11 activity in an individual are indicated by galectin-11 polypeptides, or fragments, variants, derivatives, or analogs of the invention, or agonists thereof. It is understood that treatment can be by administration. Accordingly, the invention further provides a method of treating an individual in need of an increased level of galectin-11 activity, the method comprising providing such an individual with an increased level of galectin-11 activity in such an individual. An effective,
Administering a pharmaceutical composition comprising an effective amount of an isolated galectin-11 polypeptide or fragment, variant, derivative, or analog of the invention (eg, such as the full-length form of galectin-11).
【０４３８】 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。被験体は好ましく
は、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれら
に限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ま
しくはヒトである。The present invention provides methods of treatment, inhibition and prevention by administering to a subject an effective amount of a compound or pharmaceutical composition of the invention, preferably an antibody of the invention. In a preferred aspect, the compound is substantially purified (eg, substantially free of substances that limit its effect or produce undesired side effects). The subject is preferably an animal, including but not limited to animals such as cows, pigs, horses, chickens, cats, dogs, and the like, and is preferably a mammal, and most preferably a human.
【０４３９】 必要とされる投薬量範囲は、ペプチドの選択、投与経路、処方物の性質、被験
体の状態の性質、および主治医の判断に依存する。一般的提案として、１用量あ
たりに非経口的に投与されるガレクチン１１ポリペプチドの全薬学的有効量は、
患者の体重の約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上記の
ように、これは、治療上任意に決定される。より好ましくは、この用量は、少な
くとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であり、そしてヒトについて最も好ましくは、こ
の用量は、被験体の０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であるか、または約０．０
１ｍｇ／ｋｇ／日と１ｍｇ／ｋｇ／日との間の範囲である。連続的に与えられる
場合、ガレクチン１１ポリペプチドは、代表的には、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約
５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で投与され、これは、１日当たり１〜４回の注
射によるか、または例えば、ミニポンプを使用する連続的な皮下注入によるかの
いずれかである。静脈内バック溶液もまた、使用され得る。しかし、必要とされ
る投薬量の広範な変更は、利用可能な化合物の多様性および種々の投与経路の異
なる効率の観点から予測される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よ
りも、より高い投薬量を必要とすることが予測される。これらの投薬量レベルに
おける変更は、最適化のための標準的な経験的慣習を用いて調整され得、当業者
に十分理解される。The required dosage range depends on the choice of peptide, the route of administration, the nature of the formulation, the nature of the condition of the subject, and the judgment of the attending physician. As a general proposition, the total pharmaceutically effective amount of galectin-11 polypeptide administered parenterally per dose is:
It ranges from about 1 μg / kg / day to 10 mg / kg / day of the patient's body weight, but as noted above, this is determined therapeutically. More preferably, the dose is at least 0.01 mg / kg / day, and most preferably for humans, the dose is in the range of 0.1-100 mg / kg of the subject, or about 0.1 mg / kg. 0
The range is between 1 mg / kg / day and 1 mg / kg / day. When given continuously, galectin-11 polypeptides are typically administered at a dosage rate of about 1 μg / kg / hr to about 50 μg / kg / hr, which is obtained by 1-4 injections per day. Or by continuous subcutaneous infusion using, for example, a minipump. An intravenous bag solution may also be used. However, wide variations in the required dosage are to be expected in view of the variety of compounds available and the differing efficiencies of various routes of administration. For example, oral administration is expected to require higher dosages than administration by intravenous injection. Changes in these dosage levels can be adjusted using standard empirical practices for optimization and are well understood by those skilled in the art.
【０４４０】 本発明のガレクチン１１ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（フラグメント
、改変体、誘導体またはアナログを含む）、ならびにガレクチン１１のアゴニス
トおよびアンタゴニストを含む薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと
組み合わせて慣習的に処方され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非
毒性の固体、半固体または液体の、賦形剤、希釈剤、カプセル化材料または処方
補助剤の任意の型を意味する。特定の実施形態において、「薬学的に受容可能」
とは、連邦政府または州政府の監督機関によって承認されるか、あるいは米国薬
局方または動物、およびより特にヒトにおける使用について他の一般的に認識さ
れる薬局方に列挙されることを意味する。本実施形態に従う適切な薬学的キャリ
アの限定されない例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に提供され、そしてこれ
らには、滅菌液体（例えば、水、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、グリセロール
、エタノール、および油（石油、動物、植物または合成起源の油（例えば、ピー
ナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）を含む））が含まれる。処方物は、投
与様式に適切であり、そして十分に当該分野の範囲内である。例えば、水は、薬
学的組成物が静脈内投与される場合に好ましいキャリアである。生理食塩水なら
びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、液体キャリアとして、特に
注射溶液に使用され得る。本発明はさらに、本発明の上記組成物の１以上の成分
を満たされた１以上の容器を含む、薬学的パックおよびキットに関する。Pharmaceutical compositions comprising the galectin-11 polypeptides and polynucleotides (including fragments, variants, derivatives or analogs) of the present invention, and agonists and antagonists of galectin-11, are combined with a pharmaceutically acceptable carrier. Can be customarily prescribed. By "pharmaceutically acceptable carrier" is meant any non-toxic solid, semi-solid or liquid excipient, diluent, encapsulating material or formulation aid. In certain embodiments, "pharmaceutically acceptable"
By means means approved by a federal or state government authority or listed in the United States Pharmacopeia or animals, and more particularly in other commonly recognized pharmacopeias for use in humans. Non-limiting examples of suitable pharmaceutical carriers according to this embodiment are described in E.I. W. "Remington's by Martin
Pharmaceutical Sciences, and include sterile liquids such as water, saline, buffered saline, glycerol, ethanol, and oils (oils of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanuts). Oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, etc.). The formulation is appropriate for the mode of administration, and is well within the skill of the art. For example, water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. The invention further relates to pharmaceutical packs and kits comprising one or more containers filled with one or more components of the composition of the invention.
【０４４１】 本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独で投与され得るか、または他
の化合物（例えば、治療化合物）と組み合わせて投与され得る。本発明の薬学的
組成物は、経口、直腸、非経口、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣
内、腹腔内、局所（例えば、粉末剤、軟膏剤、ドロップ剤または経皮パッチによ
る）、口腔内、または経口スプレーまたは鼻内スプレーとして投与され得る。薬
学的組成物の全身性投与に好ましい形態としては、代表的に静脈内注射による、
非経口注射が挙げられる。他の注射経路（例えば、皮下、筋肉内、胸骨下、関節
内または腹腔内）が使用され得る。全身性投与のための代替的手段としては、浸
透剤（例えば、胆汁酸塩またはフシジン酸、あるいは他の界面活性剤）を使用す
る、経粘膜および経皮投与が挙げられる。さらに、腸内またはカプセル処方物で
適切に処方される場合、経口投与もまた可能であり得る。これらの化合物の投与
はまた、軟膏剤、パスタ剤、ゲル剤などの形態で、局所的であり得、そして／ま
たは局在化され得る。The polypeptides and other compounds of the present invention can be administered alone or in combination with other compounds (eg, therapeutic compounds). Pharmaceutical compositions of the invention may be orally, rectally, parenterally, intracistemally, intravaginally, intraperitoneally, topically (eg, by powder, ointment, drop or transdermal patch), buccally, Or they can be administered as an oral or nasal spray. Preferred forms for systemic administration of the pharmaceutical compositions are typically by intravenous injection,
Parenteral injections are included. Other injection routes may be used, for example, subcutaneous, intramuscular, substernal, intraarticular or intraperitoneal. Alternative means for systemic administration include transmucosal and transdermal administration using penetrants such as bile salts or fusidic acid, or other surfactants. In addition, if properly formulated in enteral or capsule formulations, oral administration may also be possible. The administration of these compounds may also be topical and / or localized, in the form of ointments, pastes, gels and the like.
【０４４２】 処置に使用されるポリペプチドはまた、上記のような「遺伝子治療」としばし
ば呼ばれる処置様式で、被験体中で内因的に生成され得る。従って、例えば、被
験体由来の細胞は、エキソビボでポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（
例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）で操作され得、そしてこれは、例えば、レトロウ
イルスプラスミドベクターの使用による。次いで、この細胞は、その被験体内に
導入される。The polypeptides used for treatment can also be produced endogenously in a subject, in a treatment modality often referred to as “gene therapy” as described above. Thus, for example, a cell from a subject can be a polynucleotide encoding a polypeptide ex vivo (
(Eg, DNA or RNA), and this is by way of example, using a retroviral plasmid vector. The cells are then introduced into the subject.
【０４４３】 この組成物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用される、投与の処方
物および方法は、上記に記載され；さらなる適切な投与の処方物および経路は、
本明細書以下に記載される処方物および経路から選択され得る。The formulations and methods of administration used when the composition comprises nucleic acids or immunoglobulins are described above; further suitable formulations and routes of administration are
It may be selected from the formulations and routes described herein below.
【０４４４】 様々な送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用
いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発
現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部とし
ての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合
物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注
射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など
）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒
に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬
学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を
包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り
付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入す
ることが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化
剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。Various delivery systems are known and can be used to administer the compounds of the invention (eg, liposomes, microparticles, microcapsules, encapsulation in recombinant cells capable of expressing the compounds). , Receptor-mediated endocytosis (
See, for example, Wu and Wu, J. et al. Biol. Chem. 262: 4429-443
2 (1987)), construction of nucleic acids as part of retroviruses or other vectors). Methods of introduction include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The compound or composition may be administered by any convenient route, such as by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucosal linings such as oral, rectal and intestinal mucosa, and other It can be administered together with a biologically active agent. Administration can be systemic or local. In addition, the pharmaceutical compounds or compositions of the present invention can be administered by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injections; intraventricular injection can be, for example, an intraventricularly attached reservoir such as an Ommaya reservoir. It may be desirable to introduce it into the central nervous system (which can be facilitated by a catheter). Pulmonary administration may also be used, for example, with the use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent.
【０４４５】 具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必
要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限の目的ではなく、
例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わ
せて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラン
ト（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような
膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成さ
れ得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質
が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。In a specific embodiment, it may be desirable to administer the pharmaceutical compounds or compositions of the invention locally to the area in need of treatment;
For example, by local injection during surgery, topical application (eg, in combination with post-surgical wound dressing), by injection, by catheter, by suppository, or by implants (such as sialastic membranes). Including porous membranes or fibers, which are porous, non-porous, or glue-like materials). Preferably, when administering a protein of the invention, including an antibody, care must be taken to use materials to which the protein does not absorb.
【０４４６】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中で
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。In another embodiment, the compound or composition may be delivered in a vesicle, especially a liposome (Langer, Science 249: 1527-1533 (
1990); Treat et al., Liposomes in the Therap.
y of Infectious Disease and Cancer, L
opez-Berstein and Fidler (eds.), Liss, New
York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berstein,
See pages 317-327 of the same book; see broadly the same book).
【０４４７】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅ
ｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８
：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：
５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３
５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（
１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出
システムは、治療標的、即ち、脳の近位に配置され、これにより、全身用量の一
部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２
巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。In yet another embodiment, the compound or composition can be delivered in a controlled release system. In one embodiment, a pump may be used (Lang
er, (supra); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. E
ng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88.
: 507 (1980); Saudek et al. Engl. J. Med. 321:
574 (1989)). In another embodiment, a polymeric material may be used (Medical Applications of Control).
led Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pre
s. , Boca Raton, Florida (1974); Control.
ed Drug Bioavailability, Drug Product
Design and Performance, Smolen and Bal
1 (eds), Wiley, New York (1984); Ranger and P.
eppas, J .; Macromol. Sci. Rev .. Macromol. Ch
em. 23:61 (1983); Levy et al., Science 2
28: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25: 3
51 (1989); Howard et al. Neurosurg. 71: 105 (
1989)). In yet another embodiment, the controlled release system is positioned proximal to the therapeutic target, ie, the brain, thereby requiring only a portion of the systemic dose (eg, Goodson, Medical Applic.
nations of Controlled Release, (supra), 2nd
Vol. 115-138 (1984)).
【０４４８】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。Other controlled release systems are discussed in a review by Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).
【０４４９】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。In a specific embodiment, where the compound of the invention is a protein-encoding nucleic acid, the nucleic acid is such that it is part of a suitable nucleic acid expression vector and is intracellular. By administration (eg, by use of a retroviral vector (see US Pat. No. 4,980,286)), or by direct injection, or by microparticle bombardment (eg, a gene gun; Biolis).
tic, Dupont) or by coating with lipids or cell surface receptors or transfectants, or in conjunction with a homeobox-like peptide known to enter the nucleus (eg,
Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:18
64-1868 (1991)), and the like, to enhance the expression of the encoded protein. Alternatively, the nucleic acid can be introduced intracellularly and integrated into host cell DNA by homologous recombination for expression.
【０４５０】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において
、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにお
ける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または
米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。
用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦
形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石
油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬
学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水
溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可
能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ
、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン
酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン
、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるな
らば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組
成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物
などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのよ
うなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級の
マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン
ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得
る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される
。このような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように、好
ましくは精製された形態で、治療有効量の化合物を適切な量のキャリアと共に含
む。処方物は、投与形態に適するべきである。[0450] The present invention also provides pharmaceutical compositions. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the compound, and a pharmaceutically acceptable carrier. In a specific embodiment, the term "pharmaceutically acceptable" has been approved by the Federal regulatory authority or the U.S. Government for use in animals, and more particularly in humans, or Means listed in the recognized pharmacopeias.
The term "carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic is administered. Such pharmaceutical carriers include sterile liquids such as water and oils, including oils of petroleum, animal, plant, or synthetic origin (eg, peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like). Can be Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skim milk powder, glycerol, propylene , Glycol, water, ethanol and the like. The composition may also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents, if desired. These compositions may take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations and the like. The composition can be formulated as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides. Oral formulations can include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate, and the like. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in W. "Reming by Martin
ton's Pharmaceutical Sciences ". Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the compound, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier so as to provide the form for proper administration to the patient. The formulation should suit the mode of administration.
【０４５１】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。典型的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。In a preferred embodiment, the composition is formulated according to conventional procedures, as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to humans. Typically, compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. Where necessary, the composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection. Generally, the components are either separated or mixed together in a single dosage form, for example, in an ampoule or sachet (s) representing a fixed amount of active agent.
Supplied as a lyophilized powder or water-free concentrate in a sealed container such as an acetette. If the composition is to be administered by infusion, the composition can be dispensed into infusion bottles containing sterile pharmaceutical grade water or saline. When the composition is administered by injection, the components can be mixed prior to administration.
An ampoule of sterile water for injection or saline can be provided.
【０４５２】 本発明の化合物は、中性すなわち塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。The compounds of the present invention may be formulated as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include those formed with anions such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids and the like, and sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxide, Isopropylamine, triethylamine,
Salts formed with cations such as those derived from 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, and the like.
【０４５３】 この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する
疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は
、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイを使用し
て、必要に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを補助し得る。処
方において使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障
害の重篤さに依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定され
るべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から導いた用量
反応曲線から外插され得る。The amount of a compound of the invention that is effective in this treatment (suppression and prevention of a disease or disorder associated with abnormal expression and / or activity of a polypeptide of the invention) is determined by standard clinical techniques. Can be done. In addition, in vitro assays may optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. The precise dose to be used in the formulation will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease or disorder, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient's circumstances. Effective doses can be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems.
【０４５４】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、典型的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドに対する免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半
減期を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばし
ば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例え
ば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組
織浸透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。For antibodies, the dosage administered to a patient is typically 0.1 mg / kg to 100 mg / kg of the patient's body weight. Preferably, the dosage administered to a patient is between 0.1 mg / kg and 20 mg / kg of the patient's body weight, more preferably between 1 mg / kg and 10 mg / kg of the patient's body weight. Generally, human antibodies have a longer half-life in the human body than antibodies from other species, due to the immune response to the foreign polypeptide. Thus, low dosages and infrequent administration of human antibodies are often possible. In addition, the dosage and frequency of administration of the antibodies of the invention can be reduced by enhancing antibody uptake and tissue penetration (eg, into the brain) by modification (eg, such as lipidation). .
【０４５５】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. Notification in the form prescribed by governmental agencies regulating the manufacture, use or sale of pharmaceutical or biological products may optionally accompany such containers. This notice,
Reflects the agency's approval of manufacture, use or sale for human administration.
【０４５６】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。Diagnostics and Imaging Labeled antibodies that specifically bind to a polypeptide of interest, and derivatives and analogs thereof, are used for diagnostic purposes to detect abnormal expression of a polypeptide of the invention and Diseases and / or disorders associated with / or activity may be detected, diagnosed or monitored. The present invention provides for the detection of abnormal expression of a polypeptide of interest, comprising the steps of (a) using one or more antibodies specific for the polypeptide of interest in a cell or body fluid of an individual. Assaying for the expression of the polypeptide of
And (b) comparing the gene expression level to a standard gene expression level, thereby increasing or decreasing the assayed polypeptide gene expression level compared to the standard expression level. Show abnormal expression.
【０４５７】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。The present invention provides a diagnostic assay for diagnosing a disorder, the assay comprising:
a) assaying the expression of the polypeptide of interest in cells or body fluids of an individual using one or more antibodies specific for the polypeptide of interest; and (b) Comparing the level of gene expression, whereby an increase or decrease in the assayed polypeptide gene expression level compared to its standard expression level is indicative of a particular disorder. For cancer, the presence of relatively high amounts of transcripts in biopsy tissue from an individual may indicate a predisposition for the development of the disease, or provide a means for detecting the disease before the actual clinical symptoms appear. Can provide. A more conclusive diagnosis of this type may allow health professionals to use preventive measures, or allow early aggressive treatment, thereby preventing the development or further progression of cancer.
【０４５８】 生物学的サンプル中のガレクチン１１ポリペプチドレベルをアッセイすること
は、抗体をベースとする技術を使用して生じ得る。例えば、組織におけるガレク
チン１１ポリペプチドの発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得
る（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７
６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋｎｅｎ，Ｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
０５：３０８７−３０９６（１９８７））。ガレクチン１１ポリペプチド遺伝子
発現を検出するのに有用な他の抗体をベースとする方法は、酵素結合イムノソル
ベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような
イムノアッセイを含む。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、そ
して例えば、グルコースオキシダーゼのような酵素標識、放射性同位体（例えば
、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｃ）、トリ
チウム（3Ｈ）、インジウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およ
びテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ
、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘ
ｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙ
ｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）
；発光標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオロセイン
およびローダミン）、およびビオチンが挙げられる。Assaying galectin-11 polypeptide levels in a biological sample can occur using antibody-based techniques. For example, the expression of a galectin-11 polypeptide in a tissue can be studied using classical immunohistological methods (eg, Jalkanen, M et al., J. Cell. Biol. 101: 97).
6-985 (1985); Jalknen, M et al. Cell. Biol. 1
05: 3087-3096 (1987)). Other antibody-based methods useful for detecting galectin-11 polypeptide gene expression include immunoassays such as the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA). Suitable antibody assay labels are known in the art and include, for example, enzyme labels such as glucose oxidase, radioisotopes (eg, iodine ( 131 I, 125 I, 123 I, 121 I), carbon ( 14 C). ), sulfur (35 C), tritium (3 H), indium (115m In, 113m In, 112 In, 111 In), and technetium (99 Tc, 99m Tc), thallium (201 Ti), gallium (68 Ga
, 67 Ga), palladium (103 Pd), molybdenum (99 Mo), xenon (133 X
e), fluorine (18 F), 153 Sm, 177 Lu, 159 Gd, 149 Pm, 140 La, 175 Y
b, 166 Ho, 90 Y, 47 Sc, 186 Re, 188 Re, 142 Pr, 105 Rh, 97 Ru)
Luminescent labels (eg, luminol); and fluorescent labels (eg, fluorescein and rhodamine), and biotin.
【０４５９】 当該分野において公知の技術は、本発明（抗体を含む）のポリペプチドを標識
するために適用され得る。このような技術として、二官能性結合剤の使用（例え
ば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６
９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第
５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号
；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５
６０号；および同第５，８０８，００３号（それぞれの内容は、本明細書中にお
いて、その全体が参考として援用される）を参照のこと）が挙げられるが、これ
らに限定されない。[0459] Techniques known in the art can be applied to label polypeptides of the present invention (including antibodies). Such techniques include the use of bifunctional binders (eg, US Pat. Nos. 5,756,065; 5,714,631; 5,619).
96,239; 5,652,361; 5,505,931; 5,489,425; 5,435,990; 5,428,139; Nos. 5,342,604; 5,274,119; 4,994,5
No. 60; and 5,808,003 (the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety), but are not limited thereto.
【０４６０】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現される被験体
内の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および
結合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投
与後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；およ
びｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバ
ックグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペ
プチドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バッ
クグラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出
された標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る
。One aspect of the invention is the detection and diagnosis of a disease or disorder associated with aberrant expression of a polypeptide of interest in an animal, preferably a mammal, and most preferably a human. In one embodiment, the diagnosis comprises: a) administering to the subject (eg, parenterally, subcutaneously, or intraperitoneally) an effective amount of a labeled molecule that specifically binds the polypeptide of interest. B) to allow for preferential enrichment of the labeled molecule at the site in the subject where the polypeptide is expressed (and because unbound labeled molecule is removed to background levels); C) determining a background level; and d) detecting a labeled molecule in the subject such that the background level is exceeded. Detection of the labeled molecule indicates that the subject has a particular disease or disorder associated with abnormal expression of the polypeptide of interest. Background levels can be determined by a variety of methods, including comparing the amount of labeled molecule detected with standard values previously determined for a particular system.
【０４６１】 放射性同位体（例えば、131Ｉ、121Ｉ、99mＴｃ、（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、12 1 Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｃ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115mＩ
ｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）
、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）
、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、17 7 Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒ
ｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）、放射線不透過性物質、または核磁
気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像化部分で標識された
、ガレクチン１１ポリペプチド特異的抗体または抗体フラグメントは、免疫系の
障害について調べられるために哺乳動物に（例えば、非経口的、皮下、または腹
腔内に）導入される。被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断
画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解さ
れる。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の
量は、通常、99mＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識さ
れた抗体または抗体フラグメントは、ガレクチン１１タンパク質を含む細胞の位
置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら
、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂ
ｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」
（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔ
ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌおよ
びＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（
１９８２））に記載される。A radioisotope (eg,131I,121I,99mTc, (131I,125I,one two ThreeI,12 1 I), carbon (14C), sulfur (35C), tritium (ThreeH), indium (115mI
n,113mIn,112In,111In) and technetium (99Tc,99mTc)
,thallium(201Ti), gallium (68Ga,67Ga), palladium (103Pd)
,molybdenum(99Mo), xenon (133Xe), fluorine (18F),153Sm,17 7 Lu,159Gd,149Pm,140La,175Yb,166Ho,90Y,47Sc,186R
e,188Re,142Pr,105Rh,97Ru), radiopaque material, or nuclear magnet
Labeled with an appropriate detectable imaging moiety, such as a material detectable by gas resonance
Galectin 11 polypeptide-specific antibodies or antibody fragments
Mammals to be examined for damage (eg, parenterally, subcutaneously, or
(Intracavity). The size of the subject and the imaging system used
It is understood in the art to determine the amount of imaging portion required to produce an image.
It is. In the case of a radioisotope moiety, the
The amount is usually99mTc is in the range of about 5-20 millicuries. Then labeled
The resulting antibody or antibody fragment is located in a cell containing the galectin-11 protein.
Is stored preferentially in the device. In vivo tumor imaging is described by S.D. W. Burchiel et al.
, "Immunopharmacokinetics of Radiolab
eled Antibodies and Their Fragments "
(Tumor Imaging: The Radiochemical Det
section of the Action of Cancer, S.E. W. Burchiel and
And B. A. Rhodes, Masson Publishing Inc. (
1982)).
【０４６２】 さらに、ガレクチン１１リガンドを検出するために、存在が検出され得る任意
のガレクチン１１ポリペプチドが投与され得る。例えば、標識抗体について上記
で議論されるように、放射線不透過物質または他の適切な化合物で標識されたガ
レクチン１１ポリペプチドは投与され、そしてインビボで視覚化され得る。さら
にこのようなガレクチン１１ポリペプチドは、インビトロ診断手順に使用され得
る。In addition, to detect a galectin-11 ligand, any galectin-11 polypeptide whose presence can be detected can be administered. For example, a galectin-11 polypeptide labeled with a radiopaque material or other suitable compound, as discussed above for labeled antibodies, can be administered and visualized in vivo. Further, such galectin-11 polypeptides can be used in in vitro diagnostic procedures.
【０４６３】 用いられる標識の型および投与の様式を含むいくつかの可変要素に依存して、
標識された分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして結合されていない標識
された分子がバックグラウンドレベルまで一掃されることを可能にする、投与後
の時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別
の実施形態においては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間
である。Depending on several variables, including the type of label used and the mode of administration,
The time interval after administration is 6-48 hours, allowing the labeled molecules to concentrate preferentially at the site of the subject and allowing unbound labeled molecules to be cleared to background levels. Or 6 to 24 hours or 6 to 12 hours. In another embodiment, the time interval after administration is 5-20 days or 5-10 days.
【０４６４】 １つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、その疾患また
は障害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最
初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。In one embodiment, monitoring a disease or disorder comprises repeating the method for diagnosing the disease or disorder (eg, 1 month after first diagnosis, 6 months after initial diagnosis, first diagnosis One year later).
【０４６５】 標識された分子の存在は、インビボ走査について当該分野において公知の方法
を用いて、患者において検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に
依存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本
発明の診断方法において用いられ得る方法およびデバイスとしては、コンピュー
ター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影法（ＰＥＴ）の
ような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が挙げられるがこ
れらい限定されない。[0465] The presence of the labeled molecule can be detected in the patient using methods known in the art for in vivo scanning. These methods depend on the type of label used. One of skill in the art can determine the appropriate method for detecting a particular label. Methods and devices that can be used in the diagnostic methods of the present invention include computerized tomography (CT), whole body scans such as proton emission tomography (PET), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound diagnostics But not limited thereto.
【０４６６】 特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射
線応答性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合
物で標識され、そして蛍光応答性の走査機器を用いて患者において検出される。
別の実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射
出断層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）において検出される。さらに別の実
施形態においては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴映像（Ｍ
ＲＩ）を用いて患者において検出される。In certain embodiments, the molecule is labeled with a radioisotope and detected from the patient using a radioresponsive surgical instrument (Thurston et al., US Pat. No. 5,441,050). . In another embodiment, the molecule is labeled with a fluorescent compound and detected in a patient using a fluorescence-responsive scanning device.
In another embodiment, the molecule is labeled with a positron emitting metal and is detected in the patient using proton emission tomography. In yet another embodiment, the molecule is labeled with a paramagnetic label and is labeled with a magnetic resonance image (M
(RI) in the patient.
【０４６７】 本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形
態においては、キットは、１以上の容器中に、本発明の抗体（好ましくは精製さ
れた抗体）を備える。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキッ
トに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に分離
されたポリペプチドを備える。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプ
チドと反応しないコントロール抗体を、さらに備える。別の特定の実施形態にお
いては、本発明のキットは、目的のポリペプチドとの抗体の結合（例えば、この
抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または
発光化合物）と結合体化され得るか、あるいは第一の抗体を認識する第二の抗体
が、検出可能な基質と結合体化され得る）を検出するための手段を備える。[0467] The present invention provides kits that can be used in the above methods. In one embodiment, the kit comprises an antibody (preferably a purified antibody) of the invention in one or more containers. In certain embodiments, a kit of the invention comprises a substantially isolated polypeptide comprising an epitope that is specifically immunoreactive with the antibodies contained in the kit. Preferably, the kit of the present invention further comprises a control antibody that does not react with the polypeptide of interest. In another specific embodiment, the kits of the invention provide for binding of an antibody to a polypeptide of interest (eg, the antibody is a detectable substrate (eg, a fluorescent, enzymatic, radioactive or luminescent compound). Or a second antibody that recognizes the first antibody or can be conjugated to a detectable substrate).
【０４６８】 本発明の別の特定の実施形態においては、このキットは、増殖性および／また
は癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清
をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目
的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキット
は、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピ
トープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。さらに、この
ようなキットは、この抗体の抗原への結合（例えば、この抗体は、フローサイト
メトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光化
合物と結合体化され得る）を検出するための手段を備える。特定の実施形態にお
いては、このキットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に
合成されたポリペプチド抗原を備え得る。このキットのポリペプチド抗原はまた
、固体支持体に付着され得る。In another specific embodiment of the invention, the kit is used for screening diagnostic sera containing antibodies specific for proliferative and / or cancerous polynucleotides and polypeptides. It is a kit. Such a kit can include a control antibody that does not react with the polypeptide of interest. Such a kit may comprise a substantially isolated polypeptide antigen comprising an epitope specifically immunoreactive with at least one anti-polypeptide antigen antibody. In addition, such kits can be used to detect binding of the antibody to an antigen (eg, the antibody can be conjugated to a fluorescent compound such as fluorescein or rhodamine, which can be detected by flow cytometry). Means. In certain embodiments, the kit may comprise a recombinantly produced polypeptide antigen or a chemically synthesized polypeptide antigen. The polypeptide antigens of the kit can also be attached to a solid support.
【０４６９】 より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチ
ド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識抗ヒト抗体を備える。この実施形態においては、抗体のポリペプチド抗
原との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。In a more particular embodiment, the detection means of the above kit comprises a solid support to which the polypeptide antigen is attached. Such kits also include a non-attached reporter-labeled anti-human antibody. In this embodiment, binding of the antibody to the polypeptide antigen can be detected by binding of the reporter-labeled antibody.
【０４７０】 さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む
血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは
、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である、実質
的に単離された抗体、およびこのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗
体との結合を検出する手段を備える。１つの実施形態においては、この抗体は、
固体支持体に付着される。特定の実施形態においては、この抗体は、モノクロナ
ール抗体であり得る。このキットの検出手段は、第二の標識されたモノクロナー
ル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識された競合
抗原を含み得る。In a further embodiment, the present invention includes a diagnostic kit for use in screening serum containing an antigen of a polypeptide of the present invention. The diagnostic kit comprises a substantially isolated antibody that is specifically immunoreactive with a polypeptide or polynucleotide antigen, and means for detecting binding of the polynucleotide or polypeptide antigen to the antibody. . In one embodiment, the antibody is:
Attached to a solid support. In certain embodiments, the antibodies can be monoclonal antibodies. The detection means of the kit may include a second labeled monoclonal antibody. Alternatively or additionally, the detection means may include a labeled competitor antigen.
【０４７１】 １つの診断の構成において、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結
合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ、
そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合する
抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試薬
をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗体
を除去するため、再び洗浄され、そしてこの試薬と結合したレポーターの量が決
定される。典型的には、レポーターは、適切な蛍光測定基質、発光基質または比
色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をインキ
ュベートすることにより検出される酵素である。In one diagnostic configuration, a test serum is reacted with a solid phase reagent having a surface-bound antigen obtained by a method of the invention. Binding a specific antigen-antibody to this reagent,
After removing unbound serum components by washing, the reagent is reacted with a reporter-labeled anti-human antibody to bind the reporter to the reagent, depending on the amount of the anti-antigen antibody bound to the solid support. The reagent is washed again to remove unbound labeled antibody, and the amount of reporter bound to the reagent is determined. Typically, a reporter is an enzyme that is detected by incubating this solid phase in the presence of a suitable fluorometric, luminescent or colorimetric substrate (Sigma, St. Louis, MO).
【０４７２】 上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着さ
せるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に
、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な
基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）と
のタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的
には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンで
コートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。[0472] The solid surface reagent in the assays described above converts protein material to solid support material (
For example, prepared by known techniques for attachment to polymeric beads, dipsticks, 96-well plates or filtration materials). These methods of attachment generally include non-specific adsorption of proteins to a support or chemically active groups (eg, activated carboxyl, hydroxyl, or aldehyde groups) on a solid support. Covalent attachment of the protein (typically via a free amine group). Alternatively, streptavidin-coated plates can be used with biotinylated antigen.
【０４７３】 従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト
抗体を備える。Accordingly, the present invention provides an assay system or kit for performing this diagnostic method. The kit generally comprises a support having a surface-bound recombinant antigen, and a reporter-labeled anti-human antibody for detecting the surface-bound anti-antigen antibody.
【０４７４】 （染色体アッセイ） 本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有益である。この配列は、ヒト第１１
染色体上の特定の位置に特異的に標的され、そして、その位置とハイブリダイズ
し得る。本発明に従うＤＮＡの染色体へのマッピングは、これらの配列を疾患に
関連する遺伝子と相関付ける際の重要な第一段階である。Chromosome assays The nucleic acid molecules of the invention are also useful for chromosome identification. This sequence is human
It can be specifically targeted to a particular location on the chromosome and hybridize to that location. Mapping DNA to chromosome according to the present invention is an important first step in correlating these sequences with genes associated with disease.
【０４７５】 ガレクチン１１遺伝子は、正確な染色***置にマッピングされているため、そ
の配列の染色体上の物理的位置は、遺伝子マップデータと相関付けられ得る。こ
のようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ Ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通してオンライン
で利用可能）に見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされている遺
伝子と疾患との間の関係は、連鎖解析（物理的に近接する遺伝子の同時遺伝（ｃ
ｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ））を通して同定される。Since the galectin-11 gene has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of the sequence on the chromosome can be correlated with genetic map data. Such data is described, for example, in V.A. McKusick, Mendelian In
heritance In Man (Johns Hopkins Unive)
rsity, available online through the Welch Medical Library). The relationship between the disease and the gene mapped to the same chromosomal region is then analyzed by linkage analysis (simultaneous inheritance of physically close genes (c
oinheritance)).
【０４７６】 次に、罹患した個体と罹患していない個体との間の、ｃＤＮＡまたはゲノム配
列における差異を決定することが必要である。変異が、罹患した個体のいくらか
または全てにおいて観察されるが、正常個体で全く観察されない場合、従って、
その変異は、その疾患の原因であるようである。Next, it is necessary to determine the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals. If the mutation is observed in some or all of the affected individuals but not in normal individuals, then:
The mutation appears to be responsible for the disease.
【０４７７】 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することに
よってより容易に理解され、以下の実施例は、例示の目的で提供され、かつ限定
することを意図されない。Having described the invention in general, the invention will be more readily understood by reference to the following examples, which are provided for purposes of illustration and are not limiting. Not intended.
【０４７８】 （実施例） （実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるガレクチン１１の発現および精製） 寄託されたｃＤＮＡクローンにおけるガレクチン１１タンパク質をコードする
ＤＮＡ配列を、ガレクチン１１タンパク質のアミノ末端配列およびベクター配列
３’からその遺伝子に対して特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用
いて増幅する。クローニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレ
オチドを、それぞれ５’側の配列および３’側の配列に付加する。EXAMPLES Example 1 Expression and Purification of Galectin 11 in E. coli The DNA sequence encoding the galectin 11 protein in the deposited cDNA clone was replaced with the amino terminal sequence of the galectin 11 protein and the vector sequence 3 'Amplify using PCR oligonucleotide primers specific for that gene. Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning are added to the 5 'and 3' sequences, respectively.
【０４７９】 ５’ガレクチン１１のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’ｃｇｃＣＣ ＡＴＧＧ ＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＧ３’（配列番号２３）（
これは、下線を付したＮｃｏＩ制限部位および図１に記載されるガレクチン１１
ヌクレオチド配列（配列番号１）のヌクレオチド４９〜６９を含む）を有する。The 5 ′ galectin 11 oligonucleotide primer has the sequence 5 ′ cgc CC ATGG ATGAGCCCCAGGGCTGGAGGTG3 ′ (SEQ ID NO: 23) (
This is due to the underlined NcoI restriction site and galectin 11 described in FIG.
Nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1).
【０４８０】 ３’ガレクチン１１のプライマーは、配列５’ｃｇｃＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧ
ＡＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＡＧ３’（配列番号６）（これは、下線を付したＨｉ
ｎｄＩＩＩ制限部位に続いて図１に記載されるガレクチン１１ヌクレオチド配列
（配列番号１）の４３１位〜４５１位に相補的なヌクレオチドを含む）を有する
。The primer for 3 ′ galectin 11 has the sequence 5 ′ cgc AAGCTT TCAGG
AGTGGACACAGTAG3 '(SEQ ID NO: 6) (this is underlined Hi
Following the ndIII restriction site has the galectin 11 nucleotide sequence set forth in FIG. 1 (comprising nucleotides complementary to positions 431-451 of the SEQ ID NO: 1).
【０４８１】 この制限部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ６０における制限酵素部位に対して
適合している。このｐＱＥ６０は、これらの実施例において細菌発現のために使
用される。（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈ
ａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質
耐性（「Ａｍｐｒ」）をコードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰ
ＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグ
および制限酵素部位を含む。This restriction site is compatible with the restriction enzyme site in the bacterial expression vector pQE60. This pQE60 is used for bacterial expression in these examples. (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Ch.
atsworth, CA, 91311). pQE60 encodes ampicillin antibiotic resistance ("Ampr") and has a bacterial origin of replication ("ori"), IP
Includes a TG-inducible promoter, a ribosome binding site ("RBS"), a 6-His tag and a restriction enzyme site.
【０４８２】 増幅されたガレクチン１１ＤＮＡおよびｐＱＥ６０ベクターを、ＮｃｏＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで消化されたＤＮＡを一緒に連結する。ガレク
チン１１ポリペプチドＤＮＡの制限消化されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入によ
って、ガレクチン１１ポリペプチドコード領域が、そのベクターのＩＰＴＧ誘導
性プロモーターの下流にかつそこに作動可能に連結されるように配置され、そし
てガレクチン１１の転写について適切に配置された開始ＡＵＧとインフレームに
配置される。The amplified Galectin-11 DNA and pQE60 vector are digested with NcoI and HindIII, and the digested DNAs are ligated together. Insertion of the galectin-11 polypeptide DNA into the restriction digested pQE60 vector places the galectin-11 polypeptide coding region downstream of and operably linked to the vector's IPTG-inducible promoter; and It is located in frame with the appropriately positioned starting AUG for transcription of galectin-11.
【０４８３】 連結混合物を、標準的な手順を用いてコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞へと形
質転換する。そのような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている。Ｅ．
ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（これは、多重コピーのプラスミドｐＲＥＰ４を含
み（このプラスミドは、ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性
（「Ｋａｎｒ」）を付与する））を用いて、本明細書に記載される実施例を行う
。この株は、ガレクチン１１タンパク質を発現するのに適切である多くのものの
うちのほんの一つであり、Ｑｉａｇｅｎから市販されている。The ligation mixture was transformed into competent E. coli using standard procedures. E. coli cells. Such a procedure is described in Sambrook et al., Molecular C.
loning: A Laboratory Manual, 2nd edition; Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.M. Y. (1989). E. FIG.
E. coli strain M15 / rep4, which contains multiple copies of the plasmid pREP4, which expresses the lac repressor and confers kanamycin resistance ("Kanr"), and is described herein. The following example is performed. This strain is just one of many that is suitable for expressing the galectin-11 protein and is commercially available from Qiagen.
【０４８４】 形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下で、ＬＢプレート上
で増殖する能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し
、そしてクローニングされたＤＮＡの同一性を制限分析によって確認する。Transformants are identified by their ability to grow on LB plates in the presence of ampicillin and kanamycin. Plasmid DNA is isolated from resistant colonies and the identity of the cloned DNA is confirmed by restriction analysis.
【０４８５】 所望の構築物を含むクローンを一晩（Ｏ／Ｎ）、アンピシリン（１００μｇ／
ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中の液
体培養物中で増殖させる。The clones containing the desired construct were cloned overnight (O / N) with ampicillin (100 μg /
ml) and kanamycin (25 μg / ml) in liquid culture in LB medium supplemented.
【０４８６】 Ｏ／Ｎ培養物を約１：１００〜１：２５０の希釈で使用して、大培養物を播種
する。この細胞を、０．４と０．６との間の６００ｎｍでの光学密度（「ＯＤ６
００」）にまで増殖させる。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（「ＩＰＴＧ」）を最終濃度１ｍＭで添加して、ｌａｃＩリプレッサーを
不活化することによって、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を
誘導する。次いで、細胞を、さらに３〜４時間インキュベートする。次いで、標
準的な方法によって、細胞を遠心分離によって採集し、そして破壊する。封入体
を、慣用的な収集技術をもちいて破壊した細胞から精製し、そしてタンパク質を
封入体から８Ｍ尿素へと可溶化する。可溶化したポリペプチドを含むこの８Ｍ尿
素溶液を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中でＰＤ−１０カラムを
通し、それによって、尿素を除去し、その緩衝液を交換し、そしてそのタンパク
質を再びフォールディングさせる。このポリペプチドを、さらなる工程のクロマ
トグラフィーによって精製してエンドトキシンを除去する。次いで、これを濾過
滅菌する。濾過滅菌したタンパク質調製物を９５μｇ／ｍｌの濃度で２×ＰＢＳ
中に保存した。The large culture is inoculated using the O / N culture at a dilution of about 1: 100 to 1: 250. The cells were grown at an optical density at 600 nm between 0.4 and 0.6 ("OD6
00 "). Then, isopropyl-BD-thiogalactopyranoside ("IPTG") is added at a final concentration of 1 mM to induce transcription from the lac repressor sensitive promoter by inactivating the lacI repressor. The cells are then incubated for an additional 3-4 hours. The cells are then collected by centrifugation and disrupted by standard methods. Inclusion bodies are purified from disrupted cells using conventional harvesting techniques, and proteins are solubilized from the inclusion bodies into 8M urea. This 8M urea solution containing the solubilized polypeptide is passed through a PD-10 column in 2x phosphate buffered saline ("PBS"), thereby removing the urea and replacing the buffer. And the protein is folded again. The polypeptide is purified by an additional step of chromatography to remove endotoxin. It is then sterilized by filtration. Filter sterilized protein preparation at a concentration of 95 μg / ml in 2 × PBS
Saved while.
【０４８７】 （実施例２：バキュロウイルス発現系におけるガレクチン１１タンパク質のク
ローニングおよび発現） 寄託されたクローンにおける全長ガレクチン１１タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡ配列を、この遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて増幅する。Example 2: Cloning and Expression of Galectin-11 Protein in Baculovirus Expression System cD encoding full-length galectin-11 protein in the deposited clone
The NA sequence is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of this gene.
【０４８８】 ５’ガレクチン１１オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’ｃｇｃＣＣＣ ＧＧＧ ＧＣＣＴＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧ３’（配列番号７）（
これは、下線を付したＳｍａＩ制限部位および図１に示すガレクチン１１ヌクレ
オチド配列（配列番号１）のヌクレオチド４９〜６６を含む）を有する。The 5 ′ galectin 11 oligonucleotide primer has the sequence 5 ′ cgc CCC GGG GCCTATGAGCCCCAGCGCTGGAGG 3 ′ (SEQ ID NO: 7) (
It has an underlined SmaI restriction site and nucleotides 49-66 of the galectin 11 nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
【０４８９】 ３’ガレクチン１１プライマーは、配列５’ｃｇｃＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＧＡ
ＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＡＧ３’（配列番号８）（これは、下線を付したＡｓｐ
７１８制限部位に続いて図１に示すガレクチン１１ヌクレオチド配列（配列番号
１）のヌクレオチド４３２位〜４５０位に相補的なヌクレオチドを含む）を有す
る。The 3 ′ galectin 11 primer has the sequence 5 ′ cgc GGTACTCAGGA
GTGGACACAGTAG3 '(SEQ ID NO: 8) (this is the underlined Asp
Following the 718 restriction site has the galectin 11 nucleotide sequence shown in Figure 1 (comprising nucleotides complementary to nucleotides 432-450 of the SEQ ID NO: 1).
【０４９０】 真核生物細胞における翻訳の開始について効率的なシグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ
．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７）に記載される
）を、この構築物のベクター部分に適切に配置する。An efficient signal for the initiation of translation in eukaryotic cells (Kozak, M.
. , J. et al. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987)) is appropriately placed in the vector portion of this construct.
【０４９１】 増幅したフラグメントを、１％アガロースゲルから、市販のキット（「Ｇｅｎ
ｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ．）を用い
て単離する。次いで、このフラグメントを、ＸｂａＩで消化し、そして再び１％
アガロースゲルで精製する。このフラグメントを、本明細書においてＦ２と命名
する。The amplified fragment was prepared from a 1% agarose gel using a commercially available kit (“Gen
eclean ", BIO101 Inc. , La Jolla, Ca. ). The fragment was then digested with XbaI and again 1%
Purify on agarose gel. This fragment is designated herein as F2.
【０４９２】 ベクターｐＡ２−ＧＰを用いて、バキュロウイルス発現系において、ガレクチ
ン１１タンパク質を、Ｓｕｍｍｅｒｓら（「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅ
ｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ
ｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５ （１９８７））に記載される標準的な方法を用いて
発現させる。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ｃａ核多核体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続
いて便利な制限部位を含む。ＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６７のシグナルペプチド（これ
は、Ｎ末端メチオニンを含む）を、ＢａｍＨＩ部位のすぐ上流に配置する。シミ
アンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデ
ニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、ポリヘドリン
プロモーターと同方向でＥ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が挿入
され、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリ
ン配列は両方の側で、クローン化したポリヌクレオチドを発現する生存可能なウ
イルスを生成するために、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えの
ためのウイルス配列と隣接する。Using the vector pA2-GP, the galectin-11 protein was transferred from Summers et al. (“A Manual of Meth” in a baculovirus expression system.
ods for Baculovirus Vectors and Inse
ct Cell Culture Procedures ", Texas Ag
ricultural Experimental Station Bullet
etin No. 1555 (1987)). This expression vector is Autographa californi.
It contains the strong polyhedrin promoter of the ca nuclear polykaryotic virus (AcMNPV), followed by convenient restriction sites. The AcMNPV gp67 signal peptide, which includes the N-terminal methionine, is located just upstream of the BamHI site. The simian virus 40 ("SV40") polyadenylation site is used for efficient polyadenylation. For easy selection of recombinant viruses, E. coli is oriented in the same direction as the polyhedrin promoter. The β-galactosidase gene from E. coli is inserted, followed by the polyadenylation signal of the polyhedrin gene. The polyhedrin sequence is flanked on both sides by viral sequences for cell-mediated homologous recombination with wild-type viral DNA to generate a viable virus expressing the cloned polynucleotide.
【０４９３】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、輸送などのために適切に配置されたシグナル（例えば、必要とされる場合、
インフレームなＡＵＧおよびシグナルペプチド）を提供する限りにおいて、ｐＡ
２−ＧＰの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９に記載される。[0493] Many other baculovirus vectors (eg, pAc373, pVL941
, And pAcIM1), as will be readily appreciated by those skilled in the art, are signals in which the construct is properly positioned for transcription, translation, transport, etc. (eg, where required,
PA as long as it provides in-frame AUG and signal peptide).
Can be used instead of 2-GP. Such vectors are, for example, Lucko
et al., Virology 170: 31-39.
【０４９４】 このプラスミドを、当該分野で公知の慣用の手順を用いて、制限酵素ＳｍａＩ
およびＡｓｐ７１８で消化し、次いで、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン
酸化する。次いでこのＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲ
ルから単離する。このベクターＤＮＡを本明細書においてＶ２と命名する。The plasmid was transformed with the restriction enzyme SmaI using conventional procedures known in the art.
And Asp718, followed by dephosphorylation using calf intestinal phosphatase. This DNA was then converted to a commercially available kit ("Geneclean" BIO
101 Inc. , La Jolla, Ca) using a 1% agarose gel. This vector DNA is designated herein as V2.
【０４９５】 フラグメントＦ２および脱リン酸化したプラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を、連結混合液で
形質転換し、そして培養プレート上に拡げる。ヒトガレクチン１１遺伝子を有す
るプラスミドを含む細菌を、個々のコロニー由来のＤＮＡをＸｂａＩを用いて消
化すること、次いで消化産物をゲル電気泳動によって分析することにより同定す
る。クローニングしたフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認する。
このプラスミドを本明細書においてｐＢａｃｇａｌｅｃｔｉｎ１１と命名する。The fragment F2 and the dephosphorylated plasmid V2 are ligated together using T4 DNA ligase. E. FIG. E. coli HB101 cells are transformed with the ligation mixture and spread on culture plates. Bacteria containing the plasmid with the human galectin 11 gene are identified by digesting DNA from individual colonies with XbaI, and then analyzing the digested product by gel electrophoresis. The sequence of the cloned fragment is confirmed by DNA sequencing.
This plasmid is designated herein as pBacgalectin11.
【０４９６】 ５μｇのプラスミドｐＢａｃｇａｌｅｃｔｉｎ１１を、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７ （
１９８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市
販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）と
ともに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄウイルスＤＮ
Ａおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃｇａｌｅｃｔｉｎ１１を、５０μｌの無血
清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中
で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を
加え、混合し、そして室温で１５分間インキュベートする。次いで、トランスフ
ェクション混合液を、無血清グレース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレ
ートに播種したＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加え
る。このプレートを前後に揺らして新たに添加した溶液を混合する。次いで、こ
のプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクシ
ョン溶液をそのプレートから除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍ
ｌのグレース昆虫培地を添加する。このプレートをインキュベーターに戻し、そ
して培養を２７℃で４日間継続する。5 μg of the plasmid pBacgalectin11 was transferred to Felgner et al.
rc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 (
1987) using the lipofection method described in US Pat.
irrus DNA, "Pharmingen, San Diego, CA. ) And co-transfected. 1 μg of BaculoGold virus DN
A and 5 μg of plasmid pBacgalectin11 were added to 50 μl of serum-free Grace's medium (Life Technologies Inc., Gaithh).
(M. ersburg, MD) in a sterile well of a microtiter plate. Thereafter, 10 μl Lipofectin and 90 μl Grace's medium are added, mixed and incubated at room temperature for 15 minutes. The transfection mixture is then added dropwise to Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711) seeded on a 35 mm tissue culture plate with 1 ml of serum-free Grace's medium. The plate is rocked back and forth to mix the newly added solution. The plate is then incubated at 27 ° C. for 5 hours. After 5 hours, the transfection solution was removed from the plate and 1 m supplemented with 10% fetal calf serum.
Add 1 Grace insect medium. The plate is returned to the incubator and the culture is continued at 27 ° C. for 4 days.
【０４９７】 ４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出によって記載さ
れたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロース
ゲルを、ｇａｌを発現するクローン（青色に着色したプラークを生ずる）の容易
な同定および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークアッセイ
」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって配布される、昆虫細胞培養およびバキュロウイル
ス学のための使用者ガイドの中の９−１０頁に見出され得る）。After 4 days, supernatants are collected and plaque assays are performed as described by Summers and Smith, supra. "Blue Gal" (Life Tec
hnologies Inc. Agarose gel containing Gaitersburg, Inc., is used to allow easy identification and isolation of clones expressing gal (resulting in blue-colored plaques). (A detailed description of this type of “plaque assay” is also available from Life Technologies Inc., Ga.
(see pages 9-10 in the User's Guide for Insect Cell Culture and Baculovirology, distributed by itersburg).
【０４９８】 連続希釈の４日後、そのウイルスをその細胞に加える。適切なインキュベーシ
ョンの後、青色に着色したプラークをＥｐｐｅｎｄｏｒｆピペットの尖端で拾う
。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含むＥｐ
ｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で再懸濁させる。この寒天を短い遠心分離により除き
、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を使用して、３５ｍｍディッシュに
播種したＳｆ９細胞に感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採
集し、次いで４℃に保存する。適切に挿入されたｈＥＳＳＢ Ｉ、ＩＩおよびＩ
ＩＩを含有するクローンを、制限マッピングおよび配列決定を含むＤＮＡ分析に
よって同定する。これを、本明細書において、Ｖ−ｇａｌｅｃｔｉｎ １１と命
名する。After 4 days of serial dilution, the virus is added to the cells. After appropriate incubation, the blue colored plaque is picked up with the tip of an Eppendorf pipette. The agar containing the recombinant virus was then mixed with 200 μl Grace's medium in Ep.
Resuspend in a pendorf tube. The agar is removed by brief centrifugation and the supernatant containing the recombinant baculovirus is used to infect Sf9 cells seeded on a 35 mm dish. Four days later, the supernatants of these culture dishes are collected and then stored at 4 ° C. HESSB I, II and I properly inserted
Clones containing II are identified by DNA analysis, including restriction mapping and sequencing. This is named V-galectin 11 in this specification.
【０４９９】 Ｓｆ９細胞を、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したＧｒａｃｅ培地中で増殖する
。この細胞に、組換えバキュロウイルスＶ−ガレクチン１１を、約２（約１〜約
３）の感染多重度（「ＭＯＩ」）で感染させる。６時間後、培地を除去し、メチ
オニンおよびシステインを含有しないＳＦ９００ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇより入手可能）で置換
する。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ−シス
テイン（Ａｍｅｒｓｈａｍより入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間培
養し、次に遠心分離によって回収し、溶解し、そして標識したタンパク質を、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって可視化する。Sf9 cells are grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. The cells are infected with recombinant baculovirus V-galectin 11 at a multiplicity of infection ("MOI") of about 2 (about 1 to about 3). After 6 hours, the medium was removed and SF900II medium without methionine and cysteine (LifeTech).
noologies Inc. , Available from Gaithersburg). After 42 hours, 5 μCi of 35 S-methionine and 5 μCi of 35 S-cysteine (available from Amersham) are added. The cells are cultured for an additional 16 hours, then harvested by centrifugation, lysed, and labeled protein
Visualize by DS-PAGE and autoradiography.
【０５００】 （実施例３：クローニングおよび哺乳動物細胞内での発現） 哺乳動物細胞内でのガレクチン１１ポリペプチド遺伝子配列を一過的に発現す
るために使用されるほとんどのベクターは、ＳＶ４０の複製起点を有するべきで
ある。このことは、ウイルスＤＮＡ合成の開始に必要とされるＴ抗原を発現する
細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）中での、高コピー数までのベクターの複製を可能に
する。任意の他の哺乳動物細胞もまた、この目的のために使用され得る。Example 3 Cloning and Expression in Mammalian Cells Most vectors used to transiently express galectin-11 polypeptide gene sequences in mammalian cells are SV40 replication. Should have a starting point. This allows for replication of the vector up to high copy numbers in cells (eg, COS cells) that express the T antigen required for initiation of viral DNA synthesis. Any other mammalian cells can also be used for this purpose.
【０５０１】 代表的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモー
ターエレメント、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポ
リアデニル化に必要なシグナルを含有する。さらなるエレメントとしては、エン
ハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、ならびにＲＮＡスプライシングのドナーおよびアク
セプターによって隣接される介在配列が、挙げられる。高効率転写は、ＳＶ４０
由来の初期プロモーターおよび後期プロモーター、レトロウイルス（例えば、Ｒ
ＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、ならびにサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成され得る。しかし、細
胞性シグナル（例えば、ヒトアクチンプロモーター）もまた、使用され得る。本
発明の実施のために適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭ
ＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ
（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）ならび
にｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）が挙げられる。使用され得る哺乳動
物宿主細胞としては、ヒトのＨｅＬａ、２８３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、
マウスのＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、
アフリカミドリザル細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞ならびにチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞が挙げられる。A typical mammalian expression vector contains a promoter element that mediates the initiation of transcription of mRNA, a protein coding sequence, and signals necessary for termination of transcription and polyadenylation of the transcript. Additional elements include enhancers, Kozak sequences, and intervening sequences flanked by donor and acceptors of RNA splicing. High efficiency transfer is SV40
Early and late promoters from retroviruses (eg, R
Long terminal repeats (LTRs) from SV, HTLVI, HIVI) as well as the early promoter of cytomegalovirus (CMV). However, cellular signals such as the human actin promoter can also be used. Expression vectors suitable for practicing the present invention include, for example, pSVL and pM
SG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat
(ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) and pBC12MI (ATCC 67109). Mammalian host cells that can be used include human HeLa, 283, H9 and Jurkat cells,
Mouse NIH3T3 and C127 cells, Cos1, Cos7 and CV1,
African green monkey cells, quail QC1-3 cells, mouse L cells, and Chinese hamster ovary cells.
【０５０２】 あるいは、遺伝子は、染色体中に組み込んだ遺伝子を含有する安定な細胞株に
おいて発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンのよ
うな選択マーカーを用いる同時トランスフェクションは、トランスフェクトした
細胞の同定および単離を可能とする。Alternatively, the gene can be expressed in a stable cell line that contains the gene integrated into a chromosome. Co-transfection with a selectable marker such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin allows identification and isolation of transfected cells.
【０５０３】 トランスフェクトされた遺伝子はまた増幅され、コードされるタンパク質を大
量に発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）は、数百または数千も
の目的の遺伝子のコピーを保持する細胞株の開発のための有用なマーカーである
。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）（Ｍｕｒｐｈ
ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７〜２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉ
ｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９〜１７５（１９９
２））である。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖
し、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体中
に組み込まれた増幅された遺伝子を含有する。チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞は、タンパク質の産生において、しばしば使用される。The transfected gene can also be amplified and express large amounts of the encoded protein. DHFR (dihydrofolate reductase) is a useful marker for the development of cell lines that carry hundreds or thousands of copies of the gene of interest. Another useful selectable marker is the enzyme glutamine synthase (GS) (Murph
y et al., Biochem J. et al. 227: 277-279 (1991); Bebbi.
ngton et al., Bio / Technology 10: 169-175 (199).
2)). Using these markers, mammalian cells are grown in selective media and cells with the highest resistance are selected. These cell lines contain the amplified gene integrated into the chromosome. Chinese hamster ovary (C
HO) cells are often used in the production of proteins.
【０５０４】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４４７０（Ｍａｒｃｈ、１９８５））、およびＣ
ＭＶエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１〜５３０（１９
８５））のフラグメントを含有する。多重クローニング部位（例えば、ＢａｍＨ
Ｉ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８の制限酵素切断部位）は、目的の遺伝子のクロ
ーニングを促進する。このベクターは、さらに、ラットプレプロインシュリン遺
伝子の３つのイントロン、ポリアデニル化シグナルおよび終結シグナルを含有す
る。The expression vectors pC1 and pC4 are compatible with the Rous sarcoma virus strong promoter (LTR) (Cullen et al., Molecular and Cellula).
r Biology, 438-4470 (March, 1985)), and C
MV enhancer (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (19
85)). Multiple cloning sites (eg, BamH
I, XbaI and Asp718 restriction enzyme cleavage sites) facilitate cloning of the gene of interest. This vector also contains three introns of the rat preproinsulin gene, a polyadenylation signal and a termination signal.
【０５０５】 （実施例３（ａ）：クローニングおよびＣＯＳ細胞中での発現） 発現プラスミドであるｐｇａｌｅｃｔｉｎ１１を、ガレクチン１１をコードす
るｃＤＮＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．より入手可能）中にクローニングすることによって、作製する。(Example 3 (a): Cloning and Expression in COS Cells) The expression plasmid pgalectin11 was replaced with the cDNA encoding galectin 11 by the expression vector pcDNAI / Amp (Invitrogen, I
nc. (Available from Co., Ltd.).
【０５０６】 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは、以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよ
び他の原核生物細胞中での増殖のために効果的な、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点；（
２）プラスミドを含有する原核生物細胞の選択のための、アンピシリン耐性遺伝
子；（３）真核生物細胞中での増殖のためのＳＶ４０の複製起点；（４）ポリリ
ンカーの制限部位によって、ｃＤＮＡを、都合よくＣＭＶプロモーターの発現制
御下に配置し得、そしてＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルと作
動可能に連結し得るように配置される、ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、Ｓ
Ｖ４０イントロン、およびポリアデニル化シグナル。The expression vector pcDNAI / amp contains the following: E. coli, effective for growth in E. coli and other prokaryotic cells. E. coli origin of replication; (
2) the ampicillin resistance gene for selection of prokaryotic cells containing the plasmid; (3) the SV40 origin of replication for growth in eukaryotic cells; (4) the polylinker restriction site A CMV promoter, a polylinker, a S linker, which can be conveniently placed under expression control of the CMV promoter and operably linked to the SV40 intron and polyadenylation signal.
V40 intron, and polyadenylation signal.
【０５０７】 ガレクチン１１タンパク質およびその３’末端のインフレームで融合したＨＡ
タグをコードするＤＮＡフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域中にクロ
ーン化し、その結果、組換えタンパク質発現を、ＣＭＶプロモーターによって指
向する。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら（Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））
によって記載されるインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに
対応する。標的タンパク質に対するＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを認識す
る抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。Galectin 11 Protein and HA In-Frame Fused at its 3 ′ End
The DNA fragment encoding the tag is cloned into the polylinker region of the vector so that recombinant protein expression is driven by the CMV promoter. The HA tag is described in Wilson et al. (Cell 37: 767 (1984)).
Corresponds to the epitope derived from the influenza hemagglutinin protein. Fusion of the HA tag to the target protein allows for easy detection of the recombinant protein using an antibody that recognizes the HA epitope.
【０５０８】 プラスミド構築の戦略は、以下のとおりである。寄託されたクローンのガレク
チン１１ ｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのガレクチン１１の発現のための発現
ベクターの構築に関して、上記に十分に記載されるようにな都合よい制限部位を
含有するプライマーを使用して増幅する。発現されたガレクチン１１の検出、精
製および特徴付けを容易にするために、プライマーの１つは、上記に記載される
ような赤血球凝集素タグ（「ＨＡタグ」）を含有する。The strategy for plasmid construction is as follows. The galectin-11 cDNA of the deposited clone was cloned into E. coli. For construction of the expression vector for expression of galectin-11 in E. coli, amplification is performed using primers containing convenient restriction sites as fully described above. One of the primers contains a hemagglutinin tag ("HA tag") as described above to facilitate detection, purification and characterization of the expressed galectin-11.
【０５０９】 本実施例において使用される適切なプライマーとしては、以下が挙げられる。
５’ガレクチン１１プライマーは、配列５’ｃｇｃＣＣＣＧＧＧｇｃｃａｔｃＡ
ＴＧＧＣＣＴＡＴＣＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧ３’（配列番号９
）を有し、下線のＳｍａＩ制限酵素部位、その後に続く図１（配列番号１）のヌ
クレオチド配列４９〜６６を含む。Suitable primers for use in this example include the following.
The 5 'galectin 11 primer has the sequence 5' cgc CCCGGG gccatcA
TGGCCTATCATGAGCCCGAGCTGGGAG 3 ′ (SEQ ID NO: 9
) And comprises the underlined SmaI restriction enzyme site followed by the nucleotide sequence 49-66 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
【０５１０】 ３’ガレクチン１１プライマーは、配列５’ｃｇｃＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＧＡ
ＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＡＧ３’（配列番号８）を有し、Ａｓｐ７１８制限酵素
部位、その後に続く図１（配列番号１）に記載されるガレクチン１１のヌクレオ
チド配列のヌクレオチド４３２〜４５０に相補的なヌクレオチドを含む。The 3 ′ galectin 11 primer has the sequence 5 ′ cgc GGTACTCAGGA
It has a GTGGACACAGTAG 3 '(SEQ ID NO: 8) and comprises nucleotides complementary to the Asp718 restriction enzyme site, followed by nucleotides 432-450 of the nucleotide sequence of galectin 11 described in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
【０５１１】 ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＨ
ｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、そして連結する。この連結混合物
を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ、１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、
Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７より入手可能）中に形質転換し、そして形
質転換した培養物をアンピシリン培地プレート上にプレーティングし、次に、イ
ンキュベートして、アンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤＮＡ
を耐性コロニーから単離し、そしてガレクチン１１をコードするフラグメントの
存在について制限分析およびゲルでのサイズ分画によって試験する。The PCR amplified DNA fragment and the vector pcDNAI / Amp were
Digest with indIII and XhoI and ligate. The ligation mixture is coli SURE strain (Stratagene Cloning Sy
stems, 11099 North Torrey Pines Road,
(Available from La Jolla, CA 92037), and the transformed culture is plated on ampicillin medium plates and then incubated to grow ampicillin-resistant colonies. Plasmid DNA
Are isolated from resistant colonies and tested for the presence of the fragment encoding galectin 11 by restriction analysis and size fractionation on a gel.
【０５１２】 組換えガレクチン１１の発現のために、上記のようにＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡ
Ｎを使用して（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩ
ＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランスフェクト
する。細胞をベクターによるガレクチン１１の発現のための条件下において、イ
ンキュベートする。For expression of recombinant galectin 11, DEAE-DEXTRA as described above
N (see, eg, Sambrook et al., MOLECULAR CLONI).
NG: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring L
laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
ew York (1989)), transfect COS cells with an expression vector. The cells are incubated under conditions for expression of galectin-11 by the vector.
【０５１３】 ガレクチン１１ ＨＡ融合タンパク質の発現を、放射能標識および免疫沈降（
例えば、Ｈａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
ＭＡＮＵＡＬ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９８８）に記載される方法を使用する）によって検出する。この目的の
ために、トランスフェクションの２日後、細胞を３５Ｓ−システインを含有する
培地中で８時間インキュベーションすることによって、標識する。この細胞と培
地を収集し、そして細胞を洗浄し、そして界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液（上記
に引用されるＷｉｌｓｏｎらに記載されるように、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％
ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０
ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ ７．５）を用いて溶解する。タンパク質を細胞溶解物、
および培養培地から、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を使用して沈殿する。次に
、沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジオグラフィーに
よって分析する。予想されたサイズの発現産物が細胞溶解物中に見出される。こ
の予想されたサイズの発現産物は、ネガティブコントロール中では見られない。The expression of the galectin-11 HA fusion protein was determined by radiolabeling and immunoprecipitation (
See, for example, Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY.
MANUAL, 2nd edition; Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Cold Spring Harbor, New Yo
rk (using the method described in 1988)). For this purpose, two days after transfection, the cells are labeled by incubating them for 8 hours in a medium containing 35S-cysteine. The cells and media are collected, and the cells are washed and detergent-containing RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% as described in Wilson et al., Cited above).
NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50
Dissolve using mM TRIS, pH 7.5). A protein lysate,
And from the culture medium using an HA-specific monoclonal antibody. Next, the precipitated protein is analyzed by SDS-PAGE gel and autoradiography. An expression product of the expected size is found in the cell lysate. An expression product of this expected size is not seen in the negative control.
【０５１４】 （実施例３（ｂ）：クローニングおよびＣＨＯ細胞中での発現） ベクターｐＣ１をガレクチン１１タンパク質の発現のために使用する。プラス
ミドｐＣ１は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ［ＡＴＣＣ受託番号３７１４６］
の誘導体である。両方のプラスミドが、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマ
ウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされた、ジ
ヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学
治療剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中での細胞の増殖によって選択され得る。メトトレキ
サート（ＭＴＸ）耐性の細胞中のＤＨＦＲ遺伝子の増幅が、十分に証明されてい
る（例えば、Ａｌｔ、Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ、Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ、
Ｊ．Ｒ．、およびＳｃｈｉｍｋｅ、Ｒ．Ｔ．、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５３：１３５７〜１３７０、Ｈａｍｌｉｎ、Ｊ．Ｌ．およびＭａ、Ｃ．、
１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１０
７〜１４３、Ｐａｇｅ、Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ、Ｍ．Ａ．１９９１、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第９巻：６４〜６８を参照のこと）。漸増濃度の
ＭＴＸ中の細胞増殖は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素であるＤ
ＨＦＲの過剰発現による薬物の耐性をもたらす。第２の遺伝子が、ＤＨＦＲ遺伝
子と連結している場合、その遺伝子は、通常、同時に増幅され、そして過剰発現
される。１，０００コピーを超える遺伝子のコピーを保有する細胞株の開発は、
当該分野における技術水準である。引き続いて、メトトレキサートが取り除かれ
た時、細胞株は、染色体中に組み込まれた増幅された遺伝子を含有する。Example 3 (b): Cloning and Expression in CHO Cells The vector pC1 is used for the expression of the galectin-11 protein. Plasmid pC1 is plasmid pSV2-dhfr [ATCC accession number 37146].
Is a derivative of Both plasmids contain the mouse DHFR gene under the control of the SV40 early promoter. Chinese hamster ovary cells or other cells lacking dihydrofolate activity, transfected with these plasmids, are selected from selective media (α minus MEM, Life T) supplemented with the chemotherapeutic agent methotrexate.
(e.g., technologies). Amplification of the DHFR gene in methotrexate (MTX) resistant cells is well documented (eg, Alt, FW, Kellems, RM, Bertino,
J. R. And Schimke, R .; T. 1978; Biol. Che
m. 253: 1357-1370, Hamlin, J. M .; L. And Ma, C.I. ,
1990, Biochem. et Biophys. Acta. 1097: 10
7-143, Page, M.P. J. And Sydenham, M .; A. 1991,
Biotechnology 9: 64-68). Cell growth in increasing concentrations of MTX resulted in the target enzyme D
Overexpression of HFR results in drug resistance. When a second gene is linked to the DHFR gene, that gene is usually co-amplified and over-expressed. The development of cell lines that carry more than 1,000 copies of a gene
State of the art in the field. Subsequently, when the methotrexate is removed, the cell line contains the amplified gene integrated into the chromosome.
【０５１５】 プラスミドｐＣ１は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルスの長
末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｒｃｈ、１９８５：４３
８〜４４７０））、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子
のエンハンサーより単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４
１：５２１〜５３０、１９８５）を含有する。プロモーターの下流は、単一の制
限酵素切断部位が続き、遺伝子の組み込みを可能とする：ＢａｍＨＩ、ＰｖｕＩ
Ｉ、およびＮｒｕＩ。これらのクローニング部位の後に、プラスミドは、全部の
３つのリーディングフレーム中に翻訳終止コドン、その後に、ラットプレプロイ
ンシュリン遺伝子の３つのイントロンおよびポリアデニル化部位を含有する。他
の高効率プロモーターもまた、発現のために使用され得る（例えば、ヒトアクチ
ンプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたは後期プロモーター、あるいは
他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）。
ｍＲＮＡのポリアデニル化のための他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンま
たはグロビン遺伝子由来）もまた使用され得る。[0515] Plasmid pC1 is a strong promoter of the Rous sarcoma virus long terminal repeat (LTR) (Cullen et al., Molecula) for expression of the gene of interest.
r and Cellular Biology (March, 1985: 43).
8-4470)), and a fragment isolated from an enhancer of the immediate early gene of human cytomegalovirus (CMV) (Boshart et al., Cell 4).
1: 521-530, 1985). Downstream of the promoter is followed by a single restriction enzyme cleavage site to allow for gene integration: BamHI, PvuI.
I, and NruI. After these cloning sites, the plasmid contains a translation stop codon in all three reading frames, followed by three introns of the rat preproinsulin gene and a polyadenylation site. Other high efficiency promoters may also be used for expression (eg, the human actin promoter, the SV40 early or late promoter, or long terminal repeats from other retroviruses (eg, HIV and HTLVI)).
Other signals for polyadenylation of mRNA, such as from the human growth hormone or globin gene, can also be used.
【０５１６】 染色体中に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞株もまた、ｇｐｔ
、Ｇ４１８またはハイグロマイシンのような選択マーカーを用いる同時トランス
フェクションの際に、選択され得る。最初は、１つより多い選択マーカー（例え
ば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが有利である。Stable cell lines carrying the gene of interest integrated into the chromosome are also gpt
, G418 or hygromycin during co-transfection with a selectable marker. Initially, it is advantageous to use more than one selectable marker (eg, G418 and methotrexate).
【０５１７】 プラスミドｐＣ１を制限酵素ＢａｍＨＩを用いて消化し、次に、当該分野にお
いて公知の手順によって、ウシ小腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。
次に、ベクターを１％アガロースゲルより単離する。The plasmid pC1 is digested with the restriction enzyme BamHI and then dephosphorylated using bovine intestinal phosphatase by procedures known in the art.
Next, the vector is isolated from a 1% agarose gel.
【０５１８】 ガレクチン１１をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号２０９０５３）を
、遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー
を使用して増幅する。The DNA sequence encoding galectin 11 (ATCC Accession No. 209053) is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of the gene.
【０５１９】 ５’ガレクチン１１プライマーは、配列５’ｃｇｃＣＣＣＧＧＧｇｃｃａｔｃ
ＡＴＧＧＣＣＴＡＴＣＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧ３’（配列番号
９）を有し、下線のＳｍａＩ制限酵素部位、その後に続く図１（配列番号１）の
ヌクレオチド配列４９〜６６を含む。下記のように、発現ベクター中に挿入する
と、ヒトガレクチン１１をコードする増幅されたフラグメントの５’末端は、効
率的なシグナルペプチドを提供する。真核生物細胞中の翻訳開始のための効率的
なシグナルは、Ｋｏｚａｃ、Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７〜９５
０（１９８７）に記載されるように、構築物のベクター部分に適切に位置する。The 5 ′ galectin 11 primer has the sequence 5 ′ cgc CCCGGG gccatc
It has ATGGCCTATCATGAGCCCAGGCTGGGAG 3 ′ (SEQ ID NO: 9) and includes an underlined SmaI restriction enzyme site followed by the nucleotide sequence 49-66 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). As described below, when inserted into an expression vector, the 5 'end of the amplified fragment encoding human galectin 11 provides an efficient signal peptide. Efficient signals for translation initiation in eukaryotic cells are described in Kozac, M .; J. Mol. Biol. 196: 947-95
0 (1987) is appropriately located in the vector portion of the construct.
【０５２０】 ３’ガレクチン１１プライマーは、配列５’ｃｇｃＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＧＡ
ＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＡＧ３’（配列番号８）を有し、Ａｓｐ７１８制限酵素
部位、その後に続く図１（配列番号１）に記載されるガレクチン１１のヌクレオ
チド配列のヌクレオチド４３２〜４５０に相補的なヌクレオチドを含む。The 3 ′ galectin 11 primer has the sequence 5 ′ cgc GGTACTCAGGA
It has a GTGGACACAGTAG 3 '(SEQ ID NO: 8) and comprises nucleotides complementary to the Asp718 restriction enzyme site, followed by nucleotides 432-450 of the nucleotide sequence of galectin 11 described in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
【０５２１】 増幅したフラグメントを、上記のように、１％アガロースゲルから単離し、次
に、エンドヌクレアーゼＳｍａＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次に、１％アガ
ロースゲルで再び精製する。The amplified fragment is isolated from a 1% agarose gel as described above, then digested with the endonucleases SmaI and Asp718, and then purified again on a 1% agarose gel.
【０５２２】 次に、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクターをＴ４ ＤＮＡ
リガーゼで連結する。次に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そし
て制限酵素ＳｍａＩを用いて、正確な配向において挿入されたプラスミドｐＣ１
を含有する細菌を同定する。挿入された遺伝子の配列を、ＤＮＡ配列決定によっ
て確認する。Next, the isolated fragment and the dephosphorylated vector were converted to T4 DNA
Connect with ligase. Next, E. coli HB101 cells and the plasmid pC1 inserted in the correct orientation using the restriction enzyme SmaI.
Bacteria containing are identified. The sequence of the inserted gene is confirmed by DNA sequencing.
【０５２３】 （ＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクション） 活性なＤＨＦＲ酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランス
フェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドＣ１を、リポフェクチ
ング方法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ
ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは優性
選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質への耐性を与える酵素をコードす
るＴｎ５由来の遺伝子ｎｅｏ）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充
したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、ハイブリ
ドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種し、
そして１０〜１４日培養する。この期間の後、単一のクローンをトリプシン処理
し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、
２００ｎＭ、４００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿に播種する。次いで、最
高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサ
ート（５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ）を含む新たな６ウェルプレートに
移す。同じ手順を、クローンが１００μＭの濃度で増殖するまで繰り返す。Transfection of CHO-DHFR cells Chinese hamster ovary cells lacking active DHFR enzyme are used for transfection. 5 μg of the expression plasmid C1 was ligated with 0.5 μg of plasmid pSV using the lipofecting method (Felgner et al., Supra).
Co-transfect with neo. Plasmid pSV2-neo contains a dominant selectable marker (neo, a Tn5-derived gene encoding an enzyme that confers resistance to a group of antibiotics, including G418). Cells are seeded in α-min MEM supplemented with 1 mg / ml G418. Two days later, the cells were trypsinized and plated on hybridoma cloning plates (Greiner, Germany),
Then, the cells are cultured for 10 to 14 days. After this period, a single clone was trypsinized and then different concentrations of methotrexate (25 nM, 50 nM, 100 nM,
(200 nM, 400 nM) into a 6-well petri dish. The clones growing at the highest concentration of methotrexate are then transferred to a new 6-well plate containing higher concentrations of methotrexate (500 nM, 1 μM, 2 μM, 5 μM). The same procedure is repeated until the clone grows at a concentration of 100 μM.
【０５２４】 所望の遺伝子産物の発現を、ウエスタンブロット分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分析する。[0524] Expression of the desired gene product was determined by Western blot analysis and SDS-PAGE.
Analyze by
【０５２５】 （実施例４：タンパク質発現の組織分布） ノーザンブロット分析を行って、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋら（上記に引用さ
れる）によって記載される方法を用いて、ヒト組織におけるガレクチン１１遺伝
子発現を調べる。ガレクチン１１タンパク質をコードする全ヌクレオチド配列（
配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉプライム ＤＮＡ標識システ
ム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の説明書に従って
用いて３２Ｐで標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１０
０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を製造
者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って用いて精製する。次いで、精製し
た標識プローブを用いて、種々のヒト組織をガレクチン１１ ｍＲＮＡについて
調べる。Example 4: Tissue Distribution of Protein Expression Northern blot analysis is performed to determine galectin-11 gene expression in human tissues, particularly using the method described by Sambrook et al. (Cited above). The entire nucleotide sequence encoding the galectin 11 protein (
The cDNA probe containing SEQ ID NO: 1) is labeled with 32 P using a redi prime DNA labeling system (Amersham Life Science) according to the manufacturer's instructions. After labeling, the probe was replaced with CHROMA SPIN-10.
Purify using a 0 column (Clontech Laboratories, Inc.) according to the manufacturer's protocol number PT1200-1. Various human tissues are then examined for galectin 11 mRNA using the purified labeled probe.
【０５２６】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む複数組織のノーザ
ン（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓ
Ｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロトコル
番号ＰＴ１１９０−１に従って用いて標識プローブを用いて調べる。ハイブリダ
イゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウントし、そして−７０℃にて一晩フ
ィルムに曝し、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。Multiple (MTN) blots of multiple tissues, including various human tissues (H) or human immune system tissues (IM), were obtained from Clontech and Express.
The Hyb hybridization solution (Clontech) is probed with a labeled probe according to the manufacturer's protocol number PT1190-1. After hybridization and washing, the blot is mounted and exposed to film overnight at -70 ° C, and the film is developed according to standard procedures.
【０５２７】 本発明が、特に前述の説明および実施例に詳細に記載される以外に実施され得
ることは明白である。It is apparent that the present invention can be practiced other than as specifically described in the foregoing description and examples.
【０５２８】 （実施例５：トランスフェクト細胞におけるガレクチン１１誘導アポトーシス
） 本実施例は、ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞への構成性のガレクチン１１発現構築
物のトランスフェクションが、トランスフェクト細胞のアポトーシスを誘導する
ことを示すデータを示す。Example 5 Galectin-11-Induced Apoptosis in Transfected Cells This example demonstrates that transfection of a constitutive galectin-11 expression construct into human Jurkat T cells induces apoptosis of transfected cells. The data shown is shown.
【０５２９】 Ｔ細胞は、外来性巨大分子（抗原と呼ばれる）に対する細胞性免疫応答を媒介
するリンパ球のタイプ、すなわち「白血球」、である。Ｔ細胞は、正常な哺乳動
物免疫応答に必要であるが、いくつかの場合、それらの活性化を阻害することが
望ましい：例えば、いくつかの自己免疫疾患において、被験体のＴ細胞は、外来
作製の巨大分子よりむしろ、「自己抗原」、すなわち、被験体により生成される
巨大分子、に応答し、そしてこの被験体の細胞および組織を損傷する。自己免疫
Ｔ細胞応答は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）
、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、および多発性硬化症（ＭＳ）を有す
る被験体において見出され、そしてそれぞれの病態生理学に寄与する。Ｔ細胞は
また、移植片拒絶および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を引き起こす。移植片拒
絶は、レシピエント（宿主）のＴ細胞によって「外来」と認識される、移植組織
（移植片）に対する免疫応答により引き起こされる。対宿主性移植片病は、宿主
作製の巨大分子を「外来」として認識する、移植されたＴ細胞により引き起こさ
れる。T cells are a type of lymphocyte that mediates a cellular immune response to foreign macromolecules (called antigens), or “leukocytes”. T cells are required for a normal mammalian immune response, but in some cases it is desirable to inhibit their activation: For example, in some autoimmune diseases, a subject's T cells Rather than producing macromolecules, they respond to "self-antigens", ie, macromolecules produced by a subject, and damage cells and tissues of the subject. Autoimmune T cell responses include systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA)
, Found in subjects with insulin-dependent diabetes, myasthenia gravis, and multiple sclerosis (MS), and contribute to their respective pathophysiology. T cells also cause graft rejection and graft versus host disease (GVHD). Graft rejection is caused by an immune response to the transplanted tissue (graft) that is recognized as "foreign" by the recipient (host) T cells. Graft versus host disease is caused by transplanted T cells that recognize host-produced macromolecules as "foreign."
【０５３０】 （方法） 寄託されたｃＤＮＡクローンのガレクチン１１タンパク質をコードするＤＮＡ
配列を、ガレクチン１１タンパク質のアミノ末端配列に特異的なＰＣＲオリゴヌ
クレオチドプライマーおよび遺伝子の３’側のベクター配列に特異的なＰＣＲオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。５’ガレクチン１１オリゴヌク
レオチドプライマーは、配列５’ＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧ
ＧＣ３’（配列番号１０）を有した。これは、図１に示すガレクチン１１ヌクレ
オチド配列（配列番号１）のヌクレオチド４９〜６１を含む。３’ガレクチン１
１プライマーは、配列５’ＧＧＡＡＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡＣ３’
（配列番号１１）を有した。これは、図１に示すガレクチン１１ヌクレオチド配
列（配列番号１）の４３９〜４５０位に相補的なヌクレオチド配列が続く下線の
ＸｂａＩ制限部位を含む。(Method) DNA encoding galectin 11 protein of deposited cDNA clone
The sequence was amplified using a PCR oligonucleotide primer specific for the amino terminal sequence of the galectin 11 protein and a PCR oligonucleotide primer specific for the vector sequence 3 'to the gene. The 5 'galectin 11 oligonucleotide primer has the sequence 5' CCGCCGCACCATGAGCCCCCAG
GC3 '(SEQ ID NO: 10). It contains nucleotides 49-61 of the galectin 11 nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). 3 'galectin 1
One primer had the sequence 5′GGAA TCTAGA TCAGGAGTGGAC3 ′
(SEQ ID NO: 11). It contains an underlined XbaI restriction site followed by a nucleotide sequence complementary to positions 439-450 of the galectin 11 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) shown in FIG.
【０５３１】 増幅されたガレクチン１１フラグメントを、上記のように１％アガロースゲル
から単離し、エンドヌクレアーゼＸｂａＩで消化し、１％アガロースゲル上で再
度精製し、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて制限されたｐＥＦ１のマルチプ
ルクローニング部位に連結した。The amplified galectin-11 fragment was isolated from a 1% agarose gel, digested with endonuclease XbaI, purified again on a 1% agarose gel, and restricted using T4 DNA ligase as described above. It was ligated to the multiple cloning site of pEF1.
【０５３２】 ｐＥＦ１ベクターを、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上のＣＭＶプ
ロモーターをｐＥＦ−ＢＯＳ由来のヒト延長因子１ａ構成性プロモーターと置換
することにより生成した。ＥＦ１ａプロモーターは、種々の細胞型において非常
に活性であることが示されている（データは示さず）。このベクターはまた、ウ
シ成長ホルモンポリＡシグナルおよびアンピシリン耐性遺伝子、リボソーム結合
部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位を含む。このベクタ
ーを、当該分野で公知の技術を用いて、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、およびホスフ
ァターゼで消化した。The pEF1 vector was generated by replacing the CMV promoter on pIRESneo (Clontech) with a human elongation factor 1a constitutive promoter from pEF-BOS. The EF1a promoter has been shown to be very active in various cell types (data not shown). This vector also contains a bovine growth hormone poly A signal and ampicillin resistance gene, a ribosome binding site ("RBS"), a 6-His tag, and a restriction enzyme site. This vector was digested with EcoRI, BamHI, and phosphatase using techniques known in the art.
【０５３３】 単離されたガレクチン１１フラグメントの制限されたｐＥＦ１ベクターへの挿
入は、ガレクチン１１ポリペプチドコード領域を、ベクターの延長因子１構成性
プロモーターの下流に、かつ作動可能に連結して、そしてガレクチン１１の翻訳
のために適切に位置した開始ＡＵＧとインフレームに配置した。次いで、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ細胞を連結反応物で形質転換し、そして所望の構築物（ｐＥＦＬｅｇ１１
）を含む細胞を、当該分野で公知の技術を用いて同定した。次いで、ｐＥＦＬｅ
ｇ１１発現構築物を含む細胞を、高収量を好む公知の条件下で培養し、そしてこ
の発現構築物を、当該分野で公知の技術を用いて細菌細胞培養物から単離した。Insertion of the isolated galectin-11 fragment into the restricted pEF1 vector comprises linking the galectin-11 polypeptide coding region downstream and operably downstream of the elongation factor 1 constitutive promoter of the vector, and Placed in frame with the starting AUG, which was properly positioned for translation of galectin-11. Then, E. c
Oli cells were transformed with the ligation reaction and the desired construct (pEFLeg11
) Were identified using techniques known in the art. Then, pEFLe
Cells containing the g11 expression construct were cultured under known conditions that favored high yields, and the expression construct was isolated from bacterial cell cultures using techniques known in the art.
【０５３４】 アポトーシスの検出のために、当該分野で公知の技術を用いて、ヒトＪｕｒｋ
ａｔ Ｔ細胞を、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするマーカープラ
スミドと共にｐＥＦＬｅｇ１１発現構築物で同時トランスフェクトした。次いで
、トランスフェクトされた細胞をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、ミトコンドリアの膜貫通電位を決定し、そ
して二色フローサイトメトリーによって分析した。トランスフェクトされた集団
を、ＧＦＰの発現に起因する緑色蛍光の放射によって同定した。アポトーシス細
胞は、崩壊されたミトコンドリア膜貫通電位を示し、従って、より低い赤色蛍光
放射を有する。これは、色素ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄを消光する能力が
減少したためである。For detection of apoptosis, human Jurk was detected using techniques known in the art.
at T cells were co-transfected with the pEFLeg11 expression construct along with a marker plasmid encoding green fluorescent protein (GFP). The transfected cells were then transferred to MitoTracker Red (Molec
ultraprobes), the transmembrane potential of mitochondria was determined and analyzed by two-color flow cytometry. Transfected populations were identified by emission of green fluorescence due to GFP expression. Apoptotic cells display a disrupted mitochondrial transmembrane potential and therefore have lower red fluorescence emission. This is due to the reduced ability to quench the dye MitoTracker Red.
【０５３５】 （結果） 「ガレクチン１１」についての構成性発現プラスミドでトランスフェクトされ
たＪｕｒｋａｔ細胞は、トランスフェクションの２４時間後に有意なアポトーシ
スを生じた。約３０％の「ガレクチン１１」トランスフェクト細胞が、挿入片（
ｐＥＦ１）のないコントロールベクターでトランスフェクトした細胞中の１０％
未満に匹敵した、ミトコンドリア膜貫通電位の減少を示した（図５Ａ）。(Results) Jurkat cells transfected with the constitutive expression plasmid for “Galectin 11” developed significant apoptosis 24 hours after transfection. About 30% of the “galectin 11” transfected cells had the insert (
10% in cells transfected with control vector without pEF1)
A decrease in mitochondrial transmembrane potential was shown, which was less than (Figure 5A).
【０５３６】 本発明者らはまた、コントロールベクターｐＥＦ１または「ガレクチン１１」
発現ベクターｐＥＦ１−Ｌｅｇ１１のいずれかでの同時トランスフェクション後
の４日間培養の間、ＧＦＰ陽性細胞の数を追跡した。ｐＥＦ１でのトランスフェ
クション後に、ｐＥＦ１−Ｌｅｇ１１でのトランスフェクションよりも約４倍多
い生存ＧＦＰ陽性細胞が存在した（図５Ｂ）。We also have control vector pEF1 or “galectin 11”
The number of GFP positive cells was followed during 4 days of culture after co-transfection with either of the expression vectors pEF1-Leg11. After transfection with pEF1, there were about 4 times more viable GFP positive cells than transfection with pEF1-Leg11 (FIG. 5B).
【０５３７】 （実施例６：Ｎ末端および／またはＣ末端欠失変異体の構築） 以下の一般的な方法を使用して、Ｎ末端またはＣ末端欠失ガレクチン１１欠失
変異体をクローン化し得る。一般に、約１５〜２５ヌクレオチドの２つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーは、配列番号１のポリヌクレオチドの所望の５’および
３’位置に由来する。プライマーの５’および３’の位置を、所望のガレクチン
１１ポリヌクレオチドフラグメントに基づいて決定する。開始コドンおよび終止
コドンを、必要ならば、ポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるガ
レクチン１１ポリぺプチドフラグメントを発現するように、５’および３’プラ
イマーにそれぞれ加える。好ましいガレクチン１１ポリヌクレオチドフラグメン
トは、本明細書中の「ガレクチン１１ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリ
ぺプチドフラグメント」の節において上記に開示される、Ｎ末端およびＣ末端の
欠失変異体をコードするフラグメントである。Example 6: Construction of N-terminal and / or C-terminal deletion mutants The following general method can be used to clone an N-terminal or C-terminal deletion galectin 11 deletion mutant . Generally, two oligonucleotide primers of about 15-25 nucleotides are derived from the desired 5 'and 3' positions of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1. The 5 'and 3' positions of the primers are determined based on the desired galectin-11 polynucleotide fragment. Initiation codons and stop codon are added, if necessary, to the 5 'and 3' primers, respectively, to express the galectin-11 polypeptide fragment encoded by the polynucleotide fragment. Preferred galectin-11 polynucleotide fragments are those encoding the N-terminal and C-terminal deletion variants disclosed above in the "Galectin-11 Polynucleotide Fragments and Polypeptide Fragments" section herein. .
【０５３８】 所望のベクター中でガレクチン１１ポリヌクレオチドフラグメントのクローニ
ングを容易にするための制限部位を含む、さらなるヌクレオチドもまた、５’お
よび３’プライマー配列に加え得る。ガレクチン１１ポリヌクレオチドフラグメ
ントを、適切なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーならびに本明細書中で議論
される条件もしくは当該分野に公知の条件を使用して、ゲノムＤＮＡからまたは
寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅する。本発明のガレクチン１１ポリヌクレ
オチドフラグメントによってコードされるガレクチン１１ポリペプチドフラグメ
ントは、同様の一般的な様式で、完全長のポリぺプチドとして発現され得、そし
て精製され得るが、特定のフラグメントと完全長のポリぺプチドとの間の化学的
特徴および物理的特徴の相違に起因して、慣用的な改変が必要とされ得る。Additional nucleotides, including restriction sites to facilitate cloning of the Galectin-11 polynucleotide fragment in the desired vector, can also be added to the 5 ′ and 3 ′ primer sequences. Galectin-11 polynucleotide fragments are amplified from genomic DNA or from a deposited cDNA clone using appropriate PCR oligonucleotide primers and conditions discussed herein or known in the art. Galectin-11 polypeptide fragments encoded by the galectin-11 polynucleotide fragments of the invention can be expressed as full-length polypeptides and purified in a similar general manner, but with specific fragments and full-length Conventional modifications may be required due to differences in chemical and physical characteristics between the polypeptides.
【０５３９】 本発明を限定しない例示的な手段としては、ガレクチン１１ポリペプチドフラ
グメント（Ｌ−５〜Ｌ−１２８）をコードするポリヌクレオチドを、以下のよう
に増幅し、そしてクローン化する：Ｌ−５で始まるポリぺプチドフラグメントの
Ｎ末端部分をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、インフレームで制限酵
素部位に続いて開始コドンを含む５’プライマーを生成する。Ｌ−１２８で終了
するガレクチン１１ポリぺプチドフラグメントのＣ末端部分をコードするポリヌ
クレオチド配列を用いて、インフレームで制限酵素部位に続いて終止コドンを含
む相補的な３’プライマーを生成する。By way of example, and not by way of limitation, a polynucleotide encoding a galectin-11 polypeptide fragment (L-5 to L-128) is amplified and cloned as follows: The polynucleotide sequence encoding the N-terminal portion of the polypeptide fragment beginning with 5 is used to generate a 5 'primer that includes a restriction enzyme site in frame, followed by a start codon. The polynucleotide sequence encoding the C-terminal portion of the galectin-11 polypeptide fragment terminating in L-128 is used to generate a complementary 3 'primer containing a restriction enzyme site in-frame followed by a stop codon.
【０５４０】 増幅されたポリヌクレオチドフラグメントおよび発現ベクターは、プライマー
中の部位を認識する制限酵素によって消化される。次いで、消化されたポリヌク
レオチドは、一緒に連結される。ガレクチン１１ポリヌクレオチドフラグメント
は、制限された発現ベクターに、好ましくはガレクチンポリペプチドフラグメン
トコード領域がプロモーターから下流に配置されるような様式で挿入される。こ
の連結混合物は、標準的な手順そして本明細書中の実施例に記載されるようにコ
ンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換される。プラスミドＤＮＡが耐性コロニ
ーから単離され、クローン化されたＤＮＡの同定は、制限分析、ＰＣＲおよびＤ
ＮＡ配列決定によって確認される。The amplified polynucleotide fragment and expression vector are digested with a restriction enzyme that recognizes a site in the primer. The digested polynucleotides are then ligated together. The galectin-11 polynucleotide fragment is inserted into the restricted expression vector, preferably such that the galectin polypeptide fragment coding region is located downstream from the promoter. This ligation mixture was subjected to standard procedures and to competent E. coli as described in the Examples herein. E. coli cells. Plasmid DNA was isolated from resistant colonies and identification of cloned DNA was performed by restriction analysis, PCR and D
Confirmed by NA sequencing.
【０５４１】 （実施例７：ガレクチン１１のタンパク質融合物） ガレクチン１１ポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。
これらの融合タンパク質は、種々の適用に使用され得る。例えば、ガレクチン１
１ポリぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、お
よびマルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照
のこと；ＥＰ Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら
、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：８４−８６（１９８８））。同様に、ＩｇＧ−１、Ｉ
ｇＧ−３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。ガ
レクチン１１ポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の
細胞内局在に標的化し得る。一方、共有結合ヘテロ二量体またはホモ二量体は、
融合タンパク質の活性を増大または減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つ
より多い機能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非
融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増
大させ得る。上記の融合タンパク質の全ての型は、ＩｇＧ分子へのポリぺプチド
の融合を概説する以下のプロトコル、または実施例３に記載されるプロトコルを
改変することによって作製され得る。Example 7: Protein fusion of galectin 11 Galectin 11 polypeptide is preferably fused to another protein.
These fusion proteins can be used for various applications. For example, galectin 1
Fusion of one polypeptide to His tag, HA tag, Protein A, IgG domain and maltose binding protein facilitates purification (see Example 5; see also EP A 394,827). Traunecker et al., Nature, 331: 84-86 (1988)). Similarly, IgG-1, I
Fusion to gG-3 and albumin increases half-life in vivo. Nuclear localization signals fused to galectin-11 polypeptides can target proteins to specific subcellular locations. On the other hand, covalent heterodimers or homodimers are
The activity of the fusion protein may be increased or decreased. Fusion proteins can also create chimeric molecules with more than one function. Finally, the fusion protein may increase the solubility and / or stability of the fusion protein as compared to a non-fusion protein. All types of the above fusion proteins can be made by modifying the following protocol outlining the fusion of the polypeptide to an IgG molecule, or the protocol described in Example 3.
【０５４２】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’末端および
３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマ
ーはまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニン
グを容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。[0521] Briefly, the human Fc portion of an IgG molecule can be PCR amplified using primers spanning the 5 'and 3' ends of the sequences described below. These primers should also have convenient restriction sites to facilitate cloning into expression vectors, preferably mammalian expression vectors.
【０５４３】 例えば、ｐＣ４（寄託番号２０９６４６）が使用される場合、ヒトＦｃ部分は
、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊され
るべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが、Ｂ
ａｍＨＩを用いて再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載さ
れるＰＣＲプロトコルによって単離されたガレクチン１１ポリヌクレオチドが、
このＢａｍＨＩ部位に連結される。ポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクロ
ーニングされ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意する
こと。For example, if pC4 (Accession No. 209646) is used, the human Fc portion can be ligated into a BamHI cloning site. Note that the 3 'BamHI site should be destroyed. Next, the vector containing the human Fc portion is
The galectin-11 polynucleotide was re-restricted with amHI, the vector was linearized, and isolated by the PCR protocol described in Example 1.
It is linked to this BamHI site. Note that the polynucleotide is cloned without a stop codon, otherwise no fusion protein will be produced.
【０５４４】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むよ
うに改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。When a naturally occurring signal sequence is used to produce a secreted protein, pC4 does not require a second signal peptide. Alternatively, if a naturally occurring signal sequence is not used, the vector can be modified to include a heterologous signal sequence (see, eg, WO 96/34891).
【０５４５】 ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域：[0545] Human IgG Fc region:
【０５４６】[0546]
【化２】 。Embedded image .
【０５４７】 （実施例８：抗体の産生） （ａ．ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、ガ
レクチン１１を発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導す
るために動物に投与される。好ましい方法において、ガレクチン１１タンパク質
の調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないよう
にされる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために
、このような調製物は、動物に導入される。Example 8 Production of Antibodies (a. Hybridoma Technology) The antibodies of the present invention can be prepared by various methods. (Current Pr
otocols, see Chapter 2). As one example of such a method, cells expressing galectin 11 are administered to an animal to induce the production of serum containing polyclonal antibodies. In a preferred method, a preparation of the galectin-11 protein is prepared and purified to be substantially free of natural contaminants. Such a preparation is then introduced into an animal to produce a higher specific activity polyclonal antiserum.
【０５４８】 ガレクチン１１タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリ
ドーマ技術を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４
９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１
（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１
９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．
Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくはマウス）は
、ガレクチン１１ポリペプチドで、またはより好ましくは分泌ガレクチン１１ポ
リペプチド発現細胞で免疫される。このようなポリペプチド発現細胞は、任意の
適切な組織培養培地において、好ましくは１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働
化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍ
ｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥ
ａｒｌｅ改変イーグル培地において培養される。[0555] Monoclonal antibodies specific for the galectin-11 protein are prepared using hybridoma technology (Kohler et al., Nature 256: 4).
95 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511
(1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1
976); Hammerling et al .: Monoclonal Antibodi.
es and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N .;
Y. 563-681 (1981)). Generally, an animal (preferably a mouse) is immunized with a galectin-11 polypeptide, or more preferably, with cells expressing a secreted galectin-11 polypeptide. Such polypeptide-expressing cells are preferably supplemented with 10% fetal calf serum (inactivated at about 56 ° C.) in any suitable tissue culture medium, and contain about 10 g / l of non-essential amino acids, about 1 2,000U / m
E supplemented with 1 penicillin and about 100 μg / ml streptomycin
Cultured in arrle modified Eagle's medium.
【０５４９】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合され
る。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴ
ＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合
後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次い
でＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（
１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次い
で、このような選択を通して得られるハイブリドーマ細胞は、ガレクチン１１ポ
リぺプチドを結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされ
る。The splenocytes of such mice are extracted and fused with a suitable myeloma cell line. Any suitable myeloma cell line can be used according to the present invention;
It is preferred to use the parental myeloma cell line (SP2O) available from CC. After fusion, the resulting hybridoma cells are selectively maintained in HAT medium, and then are described in Wands et al. (Gastroenterology 80: 225-232 (
1981)) by cloning by limiting dilution. The hybridoma cells obtained through such selection are then assayed to identify clones secreting antibodies capable of binding galectin-11 polypeptide.
【０５５０】 あるいは、ガレクチン１１ポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イデ
ィオタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方
法は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得るこ
とが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗
体を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動
物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリ
ドーマ細胞は、抗体のガレクチン１１タンパク質特異的抗体に結合する能力がガ
レクチン１１によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するため
にスクリーニングされる。このような抗体は、ガレクチン１１タンパク質特異的
抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるガレ
クチン１１タンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用される。Alternatively, additional antibodies capable of binding galectin-11 polypeptide may be generated in a two-step procedure using anti-idiotypic antibodies. Such methods take advantage of the fact that antibodies are themselves antigens, and thus it is possible to obtain antibodies that bind to a second antibody. According to this method, an animal, preferably a mouse, is immunized using a protein-specific antibody. The spleen cells of such animals are then used to produce hybridoma cells. The hybridoma cells are then screened to identify clones that produce an antibody that can block the ability of the antibody to bind to a galectin-11 protein-specific antibody. Such antibodies include anti-idiotypic antibodies to galectin-11 protein-specific antibodies and are used to immunize animals to induce the formation of additional galectin-11 protein-specific antibodies.
【０５５１】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。この
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト
化抗体を産生するための方法は当該分野で公知であり、そして本明細書中で議論
される（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０
２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６
）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
ら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６
７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと
）。For in vivo use of the antibody in humans, the antibody is “humanized”. Such antibodies can be produced by using a genetic construct derived from a hybridoma cell producing the monoclonal antibody described above. Methods for producing chimeric and humanized antibodies are known in the art and are discussed herein (for a review, see Morrison, Science 229: 120).
2 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986).
Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Taniguchi.
Morrison et al., EP 173494; Neub.
Erger et al., WO 8615333; Robinson et al., WO 87026.
71; Boulianne et al., Nature 312: 643 (1984); N.
Euberger et al., Nature 314: 268 (1985)).
【０５５２】 （ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリーからのガレクチン１１ポリペプチドに対して
指向される抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝され得たかま
たは曝され得なかったガレクチン１１に対する反応性を含む抗体フラグメントの
ライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（その全体
が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。(B) Isolation of Antibody Fragments Directed to Galectin-11 Polypeptide from a Library of scFvs The naturally occurring V gene isolated from human PBLs was exposed to or exposed to a donor. A library of antibody fragments containing reactivity to galectin 11 that could not be constructed (see, eg, US Pat. No. 5,885,793, which is incorporated herein by reference in its entirety). .
【０５５３】 ライブラリーのレスキュー。Library rescue.
【０５５４】 ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡから
ｓｃＦｖｓのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージを
レスキューするため、ファージミドを保有する約１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用い
て、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０
．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×Ｔ
Ｙ−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０８ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ
遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そし
て培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら
３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．
ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌ
アンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そ
して一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載のよう
に調製する。A library of scFvs is constructed from human PBL RNA as described in PCT Publication WO 92/01047. To rescue phage displaying antibody fragments, approximately 10 9 E. coli harboring phagemids were rescued. E. coli is used to inoculate 50 ml of 2 × TY (containing 1% glucose and 100 μg / ml ampicillin) (2 × TY-AMP-GLU) and shake with O.
. 8 of O. D. Propagate to growth. Using 5 ml of this culture, 50 ml of 2 × T
Y-AMP-GLU was inoculated and 2 × 108 TU Δgene 3 helper (M13Δ
Gene III, see PCT Publication No. WO 92/01047) is added and the culture is incubated at 37 ° C. for 45 minutes without shaking, and then for 45 minutes at 37 ° C. with shaking. The culture is incubated at 4000 r. p.
m. And pellet the pellet in 2 liters of 2 × TY (100 μg / ml).
(Containing ampicillin and 50 μg / ml kanamycin) and grow overnight. The phage is prepared as described in PCT Publication WO 92/01047.
【０５５５】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を
供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖させ
ることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪なし
で３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらにインキ
ュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ．ｐ．ｍ
．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカ
ナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３００ｍｌ
中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させる。ファージ粒子を、
２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地から精製お
よび濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィルター（Ｍ
ｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０13形質導入
単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。The M13Δ gene III is prepared as follows: M13Δ gene III helper phage does not encode the gene III protein. Thus, phage displaying antibody fragments (phagemids) have a greater binding avidity for the antigen. During phage morphogenesis, infectious M13Δgene III particles are generated by growing helper phage in cells carrying a pUC19 derivative that supplies the wild-type gene III protein. The culture is incubated for 1 hour at 37 ° C. without shaking, then further incubated at 37 ° C. with shaking. The cells are centrifuged (IEC-Centra 8, 400 rpm).
. For 10 minutes) and 300 ml of 2 × TY broth (2 × TY-AMP-KAN) containing 100 μg / ml ampicillin and 25 μg / ml kanamycin
And grown overnight at 37 ° C. with shaking. Phage particles
Purify and concentrate from culture medium by two PEG precipitations (Sambrook et al., 1990), resuspend in 2 ml PBS, and filter with 0.45 μm filter (M
Inert NML; Sartorius) to give a final concentration of about 10 13 transducing units / ml (ampicillin resistant clone).
【０５５６】 ライブラリーのパニング。[0556] Library panning.
【０５５７】 Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％ Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし
、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをチューブに適用し
、そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室温で３０分間インキュベー
トし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．１％ Ｔ
ｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭ
トリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることに
よりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに
３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌ
の対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを
１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート
上にプレートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝
子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製す
る。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３
回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で２
０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。[0557] Immunotubes (Nunc) was used to prepare 100 μg of the polypeptide of the present invention.
Coat overnight in PBS with 4 ml of either 10 / ml or 10 μg / ml. Tubes are blocked with 2% Marvel-PBS at 37 ° C. for 2 hours, then washed three times in PBS. Approximately 10 13 TU of phage is applied to the tube and incubated for 30 minutes at room temperature while tumbling up and down on a turntable, and then allowed to stand for an additional 1.5 hours. Place the tube in PBS 0.1% T
Wash 10 times with ween-20 and 10 times with PBS. 1 ml of 100 mM
The phage was eluted by adding triethylamine and spinning up and down on a wheel for 15 minutes, after which 0.5 ml of 1.0 M Tris-H was added to the solution.
Neutralize immediately with Cl, pH 7.4. The eluted phages were then incubated with the bacteria for 30 minutes at 37 ° C., so that
Mid-logarithmic growth of E. coli. E. coli TG1. Then, E. E. coli is plated on a TYE plate containing 1% glucose and 100 μg / ml ampicillin. The resulting bacterial library is then rescued with the Δ gene 3 helper phage as described above to prepare phage for the next round of selection. This process was then repeated for all four rounds of affinity purification,
On the fourth and fourth rounds, the tube was washed with PBS, 0.1% Tween-20 for 2 times.
Increase to 0 times and 20 times with PBS.
【０５５８】 結合剤の特徴付け。Characterization of the binder.
【０５５９】 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタ
イタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンを
ＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を
参照のこと）、次いで配列決定することによりさらに特徴付ける。これらのＥＬ
ＩＳＡ陽性クローンはまた、当該分野において公知の技術（例えば、エピトープ
マッピング、結合親和性、レセプターシグナル形質導入、抗体／抗原結合をブロ
ックするかまたは競合的に阻害する能力、および競合的アゴニスト活性または競
合的アンタゴニスト活性など）によりさらに特徴付けられ得る。Using phage eluted from the third and fourth rounds of selection, E. coli coli
HB 2151 is infected and soluble scFv is generated from a single colony for the assay (Marks et al., 1991). 50 mM bicarbonate, pH 9.
ELISAs are performed using microtiter plates coated with any of the polypeptides of the invention in 10 pg / ml. Positive clones in the ELISA are further characterized by PCR fingerprinting (see, eg, PCT Publication WO 92/01047), and then sequencing. These EL
ISA-positive clones can also be prepared using techniques known in the art, such as epitope mapping, binding affinity, receptor signal transduction, the ability to block or competitively inhibit antibody / antigen binding, and competitive agonist activity or competition. Antagonist activity, etc.).
【０５６０】 （実施例９：高スループットスクリーニングアッセイのためのガレクチン１１
タンパク質の産生） 以下のプロトコルは、試験されるべきガレクチン１１ポリぺプチドを含有する
上清を産生する。次いで、この上清は、実施例１４〜２１に記載されるスクリー
ニングアッセイにおいて使用され得る。Example 9 Galectin 11 for High Throughput Screening Assay
Protein Production The following protocol produces a supernatant containing the galectin-11 polypeptide to be tested. This supernatant can then be used in the screening assays described in Examples 14-21.
【０５６１】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）保存溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウムもマ
グネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１：２
０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、各ウ
ェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベートす
る。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２チャンネ
ルピペッターは、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用され得る）。ポリ
−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩
水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残すべき
であり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティングし得る
。First, poly-D-lysine (644 587 Boehringer-Man
nheim) stock solution (1 mg / ml in PBS) in PBS (17-516F Biowhittaker without calcium or magnesium) at 1: 2.
Dilute to 0 to make working solution 50 μg / ml. 200 μl of this solution is added to each well (24 well plate) and incubated for 20 minutes at room temperature. Ensure that the solution is distributed over each well (Note: a 12-channel pipettor can be used with tips on every other channel). The poly-D-lysine solution is aspirated off and rinsed with 1 ml PBS (phosphate buffered saline). PBS should be left in the well until just before plating the cells, and the plate can be pre-coated with polylysine up to two weeks before.
【０５６２】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０5細胞／ウ
ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。293T cells (no cells beyond P + 20) were treated at 2 × 10 5 cells / well with 0.5 ml of DMEM (Dulbecco modified Eagle's medium) (4.
5 G / L glucose and L-glutamine (12-604F Biowhite)
taker)) / 10% heat-inactivated FBS (14-503F Biowhi)
ttaker) / 1 × Penstrep (17-602E Biowhitta)
ker). Grow cells overnight.
【０５６３】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（
３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８〜１０に記載す
る方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現ベ
クターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。マ
ルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔｉ
ｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下げ
たりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、マ
ルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉを各ウェ
ルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つの
プレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべきで
ある。The following day, in a sterile solution container (basin), 300 μl Lipofectamine (1
8324-012 Gibco / BRL) and 5 ml Optimem I (
Mix 31985070 Gibco / BRL) / 96 well plates together. Using a small volume multi-channel pipettor, place about 2 μg of the expression vector containing the polynucleotide insert produced by the method described in Examples 8-10 into a suitably labeled 96-well round bottom plate. Aliquot. Using a multichannel pipettor, 50 μl of Lipofectamine / Opti
Add the mem I mixture to each well. Mix by pipetting up and down gently. Incubate at room temperature for 15-45 minutes. After about 20 minutes, add 150 μl Optimem I to each well using a multi-channel pipettor. As a control, one plate of vector DNA lacking the insert should be transfected with each set of transfections.
【０５６４】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１つお
きにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮＡ
／リポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに、次
いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で６時
間インキュベートする。[0564] Preferably, the transfection is performed in a team
tag-teaming). By forming a tag team,
The time effort is halved and cells do not spend too much time on PBS. First, A removes the medium from the four 24-well plates of cells, and then B rinses each well with 0.5-1 ml of PBS. Mr. A then aspirated off the PBS rinse, and Mr. B. used a 12-channel pipettor with a tip every other channel and 200 μl of DNA.
The / Lipofectamine / Optimem I complex is added to each row on a 24-well plate, first to odd wells, then to even wells. Incubate at 37 ° C. for 6 hours.
【０５６５】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、または２ｍＭグルタミンおよび１×ペンスト
レップを含むＨＧＳ ＣＨＯ−５培地（１１６．６ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２（無水
物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ；０．０５０ｍｇ／Ｌの
Ｆｅ（ＮＯ３）３−９Ｈ２Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ；３
１１．８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇＣｌ２；４８．８４ｍ
ｇ／ＬのＭｇＳＯ４；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；２４００．０ｍｇ／
ＬのＮａＨＣＯ３；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ；７１．０２
ｍｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ；０
．００２ｍｇ／Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステロール；０．
０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍｇ／Ｌのリノ
ール酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのミリスチン酸
；０．０１０ｍｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミトオレイン酸
（ｐａｌｍｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミチン酸；１０
０ｍｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌのステアリン酸
；２．２０ｍｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グルコース；１
３０．８５ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アルギニ
ン−ＨＣｌ；７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ２Ｏ；６．６５ｍｇ／
ｍｌのＬ−アスパラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン２ＨＣｌ−Ｈ
２Ｏ；３１．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−グルタミン酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８．７５ｍｇ／
ｍｌのグリシン；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ２Ｏ；１
０６．９７ｍｇ／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍｌのＬ−ロイ
シン；１６３．７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣＬ；３２．３４ｍｇ／ｍｌのＬ
−メチオニン；６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４０．０ｍｇ／
ｍｌのＬ−プロリン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１．０５ｍｇ／
ｍｌのＬ−スレオニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファン；９１．７
９ｍｇ／ｍｌのＬ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２Ｈ２Ｏ；９９
．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビオチン；３．２４ｍ
ｇ／ＬのＤ−Ｃａパントテン酸；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化コリン；４．６５ｍ
ｇ／Ｌの葉酸；１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３．０２ｍｇ／Ｌのナ
イアシンアミド；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣＬ；０．０３１ｍｇ／
ＬのピリドキシンＨＣＬ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビン；３．１７ｍｇ／
ＬのチアミンＨＣＬ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；０．６８０ｍｇ／Ｌのビ
タミンＢ１２；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／ＬのＮａヒポキサ
ンチン；０．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌのプトレシンナトリ
ウム−２ＨＣＬ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；０．００６７ｍｇ
／Ｌの亜セレン酸ナトリウム；２０μＭのエタノールアミン；０．１２２ｍｇ／
Ｌのクエン酸第二鉄；４１．７０ｍｇ／Ｌのリノール酸と複合体化したメチル−
Ｂ−シクロデキストリン；３３．３３ｍｇ／Ｌのオレイン酸と複合体化したメチ
ル−Ｂ−シクロデキストリン；１０ｍｇ／Ｌの酢酸レチナールと複合体化したメ
チル−Ｂ−シクロデキストリン（容量オスモル濃度を３２７ｍＯｓｍまで調整）
のいずれかの適切な培地を調製する。（１０％ＢＳＡ保存溶液のために、１Ｌ
ＤＭＥＭ中にＢＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ）１００ｇを溶解した）。
培地を濾過し、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレン
コニカル中に収集する。While incubating the cells, either 1% BSA in DMEM with 1 × penstrep or HGS CHO-5 medium containing 2 mM glutamine and 1 × penstrep (116.6 mg / L CaCl 2 (anhydrous Product); 0.00130 mg / L CuSO4-5H2O; 0.050 mg / L Fe (NO3) 3-9H2O; 0.417 mg / L FeSO4-7H2O;
11.80 mg / L KCl; 28.64 mg / L MgCl2; 48.84 m
g / L MgSO4; 6995.50 mg / L NaCl; 2400.0 mg /
L NaHCO3; 62.50 mg / L NaH2PO4-H2O; 71.02
mg / L Na2HPO4; 0.4320 mg / L ZnSO4-7H2O; 0
. 002 mg / L arachidonic acid; 1.022 mg / L cholesterol;
070 mg / L DL-α-tocopherol acetate; 0.0520 mg / L linoleic acid; 0.010 mg / L linolenic acid; 0.010 mg / L myristic acid; 0.010 mg / L oleic acid; 0.010 mg / L palmito oleic acid; 0.010 mg / L palmitic acid; 10
0 mg / L Pluronic F-68; 0.010 mg / L stearic acid; 2.20 mg / L Tween 80; 4551 mg / L D-glucose; 1
30.85 mg / ml L-alanine; 147.50 mg / ml L-arginine-HCl; 7.50 mg / ml L-asparagine-H2O; 6.65 mg /
ml L-aspartic acid; 29.56 mg / ml L-cystin 2HCl-H
20; 31.29 mg / ml L-cystin-2HCl; 7.35 mg / ml L-glutamic acid; 365.0 mg / ml L-glutamine; 18.75 mg / ml
ml of glycine; 52.48 mg / ml L-histidine-HCl-H2O; 1
06.97 mg / ml L-isoleucine; 111.45 mg / ml L-leucine; 163.75 mg / ml L-lysine HCL; 32.34 mg / ml L
-Methionine; 68.48 mg / ml L-phenylalanine; 40.0 mg /
ml L-proline; 26.25 mg / ml L-serine; 101.05 mg / ml
ml L-threonine; 19.22 mg / ml L-tryptophan; 91.7
9 mg / ml L-Tyrosine-2Na-2H2O; 99
. 65 mg / ml L-valine; 0.0035 mg / L biotin; 3.24 m
g / L D-Ca pantothenic acid; 11.78 mg / L choline chloride; 4.65 m
g / L folic acid; 15.60 mg / L i-inositol; 3.02 mg / L niacinamide; 3.00 mg / L pyridoxal HCL; 0.031 mg / L
L pyridoxine HCL; 0.319 mg / L riboflavin; 3.17 mg / L
L thiamine HCL; 0.365 mg / L thymidine; 0.680 mg / L vitamin B12; 25 mM HEPES buffer; 2.39 mg / L Na hypoxanthine; 0.105 mg / L lipoic acid; 0.081 mg / L of putrescine sodium-2HCL; 55.0 mg / L of sodium pyruvate; 0.0067 mg
/ L sodium selenite; 20 μM ethanolamine; 0.122 mg /
L ferric citrate; methyl complexed with 41.70 mg / L linoleic acid
B-cyclodextrin; methyl-B-cyclodextrin complexed with 33.33 mg / L oleic acid; methyl-B-cyclodextrin complexed with 10 mg / L retinal acetate (adjusted osmolality to 327 mOsm) )
Prepare an appropriate culture medium. (1 L for 10% BSA stock solution
100 g of BSA (81-068-3 Bayer) was dissolved in DMEM).
The medium is filtered and 50 μl are collected in a 15 ml polystyrene conical for the endotoxin assay.
【０５６６】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５時間または７２時間、３７℃でインキュベートする：
１％ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。The transfection reaction is terminated at the end of the incubation period, preferably in a tag team. Mr. A aspirates off the transfection medium, while Mr. B adds 1.5 ml of the appropriate medium to each well. Incubate at 37 ° C. for 45 or 72 hours depending on the medium used:
45% for 1% BSA or 72 hours for CHO-5.
【０５６７】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１１〜１
７に記載するアッセイにおいて使用し得る。On day 4, 600 μl using a 300 μl multichannel pipettor
Was aliquoted into one 1 ml deep well plate and the remaining supernatant was
Aliquot into the deep wells. Then, the supernatant from each well was prepared in Examples 11-1.
7 can be used.
【０５６８】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、ガレクチン１１ポリぺプチドから直接に（例えば、分泌タンパク
質として）か、または他のタンパク質の発現を誘導するガレクチン１１によって
（このタンパク質は、次いで上清中に分泌される）のいずれかに由来することが
特に理解される。従って、本発明はさらに、特定のアッセイにおける活性によっ
て特徴づけられる上清中のタンパク質を同定する方法を提供する。If activity is obtained in any of the assays described below using the supernatant, the activity may be directly from galectin-11 polypeptide (eg, as a secreted protein) or from other proteins. It is particularly understood that it is derived either from galectin-11 which induces expression (this protein is then secreted into the supernatant). Accordingly, the invention further provides a method of identifying a protein in a supernatant that is characterized by activity in a particular assay.
【０５６９】 （実施例１０：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路と呼ばれる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路において活性化されたタンパク質は、
多くの遺伝子のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメントま
たはインターフェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。これ
らのエレメントに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化させ
る。Example 10 Construction of GAS Reporter Constructs One signaling pathway involved in cell differentiation and proliferation is Jak-STA.
Called the T path. The proteins activated in the Jak-STAT pathway are:
Binds to the gamma activation site "GAS" element or interferon sensitive response element ("ISRE"), located in the promoters of many genes. Binding of the protein to these elements alters the expression of the relevant gene.
【０５７０】 ＧＡＳエレメントおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデュ
ーサーおよびアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれるクラスの転写因
子によって認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓ
ｔａｔ１およびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広
範であるように）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定さ
れており、そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘ
ルパークラスＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は***成長因子と呼
ばれたが、骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。そ
れは、多くのサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。The GAS and ISRE elements are recognized by signal transducers and activators of transcription, a class of transcription factors called “STATs”. There are six members of the STAT family. S
tat1 and Stat3, like Stat2 (like a broad response to IFNα), are present in many cell types. Stat4 is more restricted and absent in many cell types, but is found in T helper class I cells after treatment with IL-12. Stat5 was originally called breast growth factor, but has been found at higher concentrations in other cells, including bone marrow cells. It can be activated in tissue culture cells by many cytokines.
【０５７１】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋ」）ファミリ
ーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質か
ら核へ移動する。Ｊａｋは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリーの代
表であり、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。これ
らのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞において触
媒的に不活性である。STATs are activated and translocate from the cytoplasm to the nucleus upon tyrosine phosphorylation by a set of kinases known as the Janus Kinase (“Jak”) family. Jak is representative of a unique family of soluble tyrosine kinases and includes Tyk2, Jak1, Jak2, and Jak3. These kinases show significant sequence similarity and are generally catalytically inactive in resting cells.
【０５７２】 Ｊａｋは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活性
化される。（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋを活
性化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：（ａ
）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９
、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、
ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンに対するレセプター
を含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−１０
を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの保存さ
れたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷＳモチ
ーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号５）をコードする膜
近接領域）を共有する。Jak is activated by a wide range of receptors as summarized by the table below. (Schidler and Darnell, Ann. Rev. Bio.
chem. 64: 621-51 (1995). The family of cytokine receptors that can activate Jak can be divided into two groups: (a
) Class 1 is IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9
, IL-11, IL-12, IL-15, Epo, PRL, GH, G-CSF,
Including receptors for GM-CSF, LIF, CNTF, and thrombopoietin; and (b) class 2 includes IFN-a, IFN-g, and IL-10
including. Class 1 receptors include a conserved cysteine motif (a set of four conserved cysteines and one tryptophan), and a WSXWS motif (a membrane-proximal region encoding Trp-Ser-XXX-Trp-Ser (SEQ ID NO: 5)). To share.
【０５７３】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋは活性化され、これは
次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメントに
結合する。この全プロセスは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含される
。Thus, upon binding of the ligand to the receptor, Jak is activated, which in turn activates STAT, which then migrates and binds to the GAS element. This entire process is involved in the Jak-STAT signaling pathway.
【０５７４】 それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示す
ために使用され得る。例えば、増殖因子およびサイトカインは、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路を活性化することが知られている。（以下の表を参照のこと）。従って、
レポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋ−Ｓ
ＴＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。Thus, Jak reflected by the binding of GAS or ISRE elements
-Activation of the STAT pathway can be used to indicate proteins involved in cell growth and differentiation. For example, growth factors and cytokines are available from Jak-STA.
It is known to activate the T pathway. (See table below). Therefore,
By using a GAS element linked to a reporter molecule, Jak-S
Activators of the TAT pathway can be identified.
【０５７５】[0575]
【表３】 実施例１１〜１２に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモータ
ーエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテジ
ーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を生成する。５’プライマーは、
ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインでの
誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に実証されたＧＡＳ結合部位の４つの
直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５７−４
６８（１９９４））、他のＧＡＳエレメントまたはＩＳＲＥエレメントを代わり
に使用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対して
相補的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライマ
ーの配列は以下である：[Table 3] To construct a synthetic GAS containing the promoter elements used in the biological assays described in Examples 11-12, a GAS-SV40 promoter sequence is generated using a PCR-based strategy. The 5 'primer is
Includes four tandem copies of the GAS binding site found in the IRF1 promoter and previously demonstrated to bind to STAT upon induction with a range of cytokines (Rothman et al., Immunity 1: 457. -4
68 (1994)), other GAS or ISRE elements may be used instead. The 5 'primer also contains an 18 bp sequence complementary to the SV40 early promoter sequence and is adjacent to the XhoI site. The sequence of the 5 'primer is as follows:
【０５７６】[0576]
【化３】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位に隣接する：Embedded image The downstream primer is complementary to the SV40 promoter and
adjacent to the dIII site:
【０５７７】[0577]
【化４】 。Embedded image .
【０５７８】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：The PCR amplification is performed using the SV40 promoter template present in the B-gal: promoter plasmid obtained from Clontech. The resulting PCR fragment is digested with XhoI / HindIII and subcloned into BLSK2- (Stratagene). Sequencing using forward and reverse primers confirms that the insert contains the following sequence:
【０５７９】[0579]
【化５】 このＧＡＳプロモーターエレメントがＳＶ４０プロモーターに結合されると、
次に、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター分
子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、明
らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター分
子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知のレ
ポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑
色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパク質が
挙げられる。Embedded image When this GAS promoter element is linked to the SV40 promoter,
Next, the GAS: SEAP2 reporter construct is manipulated. Here, the reporter molecule is secreted alkaline phosphatase, or “SEAP”. However, obviously, in either this or other examples, any reporter molecule can replace SEAP. Known reporter molecules that can be used in place of SEAP include chloramphenicol acetyltransferase (C
AT), luciferase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, green fluorescent protein (GFP), or any protein detectable by an antibody.
【０５８０】 上記の配列により確認された合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントを
、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ
を用いて、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントでＳＶ４０プロモ
ーターを有効に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。The synthetic GAS-SV40 promoter element identified by the above sequence was combined with HindIII and XhoI to create a GAS-SEAP vector.
Is used to effectively replace the SV40 promoter with the amplified GAS: SV40 promoter element and subcloned into the pSEAP-promoter vector obtained from Clontech. However, this vector does not contain the neomycin resistance gene and is therefore not preferred for mammalian expression systems.
【０５８１】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター（例えば、ｐＧＦＰ
−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞に
トランスフェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例１１〜１２に記載され
るようにＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。Thus, to create a stable mammalian cell line that expresses a GAS-SEAP reporter, the GAS-SEAP cassette was removed from the GAS-SEAP vector using SalI and NotI and GAS-SEAP / Neo To make the vector, these restriction sites in the multiple cloning site are used to create a backbone vector containing the neomycin resistance gene (eg, pGFP).
-1 (Clontech)). Once the vector has been transfected into mammalian cells, the vector can then be used as a reporter molecule for GAS binding as described in Examples 11-12.
【０５８２】 他の構築物を、上記の説明を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例１４および１３に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターを、これらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得
る。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモー
ターを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、Ｇ
ＡＳ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得
る。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細
胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞
）、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る
。Other constructs can be made using the above description and replacing GAS with a different promoter sequence. For example, the construction of a reporter molecule comprising NFK-B and EGR promoter sequences is described in Examples 14 and 13. However, many other promoters can be replaced using the protocols described in these examples. For example, SRE, IL-2, NFAT, or osteocalcin promoters alone or in combination (eg, GAS / NF-KB / EGR, G
AS / NF-KB, Il-2 / NFAT, or NF-KB / GAS). Similarly, other cell lines (eg, HELA (epithelial cells), HUVECs (endothelial cells), Reh (B cells), Saos-2 (osteoblasts), HUVACs (aortic cells), or cardiomyocytes) are Can be used to test the activity of the construct.
【０５８３】 （実施例１１：Ｔ細胞の活性についての高スループットスクリーニングアッセ
イ） 以下のプロトコルを使用して、因子を同定すること、および本発明のポリペプ
チドを含有する上清がＴ細胞を増殖および／または分化するか否かを決定するこ
とによって、Ｔ細胞活性を評価する。Ｔ細胞の活性を実施例１０で作製したＧＡ
Ｓ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加さ
せる因子は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。こ
のアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩ
Ｂ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１５５２
）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた使
用し得る。Example 11: High Throughput Screening Assay for T Cell Activity The following protocol is used to identify factors and that supernatants containing polypeptides of the invention proliferate and promote T cells. T cell activity is assessed by determining whether or not to differentiate. The activity of T cells was determined by GA prepared in Example 10.
Evaluate using the S / SEAP / Neo construct. Thus, factors that increase SEAP activity exhibit the ability to activate the Jak-STATS signaling pathway. The T cells used in this assay were Jurkat T cells (ATCC Deposit No. TI
B-152), but in Molt-3 cells (ATCC accession number CRL-1552).
) And Molt-4 cells (ATCC Deposit No. CRL-1582) cells may also be used.
【０５８４】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクトする（以下に記載のトランスフェクション
手順）。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して
耐性であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、
漸増する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選
択したクローンの用量応答を示す。[0584] Jurkat T cells are lymphoblastic CD4 + Th1 helper cells. Approximately 2 million Jurkat cells were converted to DMR to create a stable cell line.
GAS-SEAP using IE-C (Life Technologies)
/ Neo vector (transfection procedure described below). Transfected cells are seeded at a density of approximately 20,000 cells / well, and transfectants that are resistant to 1 mg / ml genticin are selected. Grow resistant colonies, then
Test their response to increasing concentrations of interferon gamma. 3 shows the dose response of selected clones.
【０５８５】 詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、これをスケールアップするか、または複数で実施するかの
いずれかを行う。Ｊｕｒｋａｔ細胞を１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰ
ＭＩ＋１０％血清中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−Ｍ
ＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡと
を組み合わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥ
Ｍを添加し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。In particular, the following protocol obtains enough cells for 75 wells containing 200 μl of cells. Thus, to produce enough cells for multiple 96-well plates, either this is scaled up or performed in multiples. Jurkat cells were transformed with RP containing 1% Pen-Strep
Maintain in MI + 10% serum. 2.5 ml OPTI-M in a T25 flask
Combine 10 μg of plasmid DNA with EM (Life Technologies). 2.5 ml OPTI-ME containing 50 μl DMRIE-C
Add M and incubate at room temperature for 15-45 minutes.
【０５８６】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０7個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０7細胞／ｍ
ｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中
の１×１０7個の細胞の１ｍｌをＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間
インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の
血清を添加する。Ｐ Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌジェネティシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを中で維持する
。これらの細胞は、実施例９に記載のプロトコールにより産生されるような、ガ
レクチン１１ポリペプチドまたはガレクチン１１誘導ポリペプチドを含む上清を
用いて処理される。During the incubation period, the cell concentration was counted, the required number of cells (10 7 per transfection) was spun down, and the final concentration was 10 7 cells / m
Resuspend in OPTI-MEM to l. Then 1 ml of 1 × 10 7 cells in OPTI-MEM is added to the T25 flask and incubated at 37 ° C. for 6 hours. After incubation, 10 ml of RPMI + 15% serum is added. P Jurkat: GAS-SEAP stable reporter strain with RPMI + 10% serum,
Maintain 1 mg / ml Geneticin and 1% Pen-Strep in. These cells are treated with a supernatant containing a galectin-11 polypeptide or a galectin-11-derived polypeptide, as produced by the protocol described in Example 9.
【０５８７】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の細胞の密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべき
である。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。
１枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレ
ートについて１億個の細胞）を必要とする。Cells should be washed on the day of treatment with the supernatant and 500,00 / ml
It should be resuspended in fresh RPMI + 10% serum to a density of 0 cells. The exact number of cells required will depend on the number of supernatants screened.
Approximately 10 million cells are required for one 96-well plate (100 million cells for 10 plates).
【０５８８】 １２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに細胞を分与する
ために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００μｌの細胞を、１２チャ
ンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル当たり１
００，０００個の細胞を添加する）。Transfer cells to a triangular reservoir boat to dispense cells into a 96-well dish using a 12-channel pipette. Transfer 200 μl of cells to each well using a 12-channel pipette (thus, 1 per well)
Add 00,000 cells).
【０５８９】 全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして使用する。After seeding all plates, 50 μl of supernatant is transferred directly from a 96-well plate containing supernatant to each well using a 12-channel pipette. further,
The dose of exogenous interferon gamma (0.1, 1.0, 10 ng) was added to well H
9, Add to wells H10 and H11 and use as additional positive controls for the assay.
【０５９０】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ターに４８時間置く（注記：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）
。次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを１２チャンネルのピペットを用い
て、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンのカ
バーを用いて）覆うべきであり、そして実施例１５に従ってＳＥＡＰアッセイを
実施するまで、−２０℃で保存するべきである。残存する処理した細胞を含むプ
レートを４℃に置き、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを
繰り返すための物質の供給源として供する。A 96-well dish containing Jurkat cells treated with the supernatant is placed in an incubator for 48 hours (note: this time can be varied between 48 and 72 hours)
. 35 μl of sample from each well is then transferred to an opaque 96-well plate using a 12-channel pipette. The opaque plate should be covered (using a cellophane cover) and stored at −20 ° C. until the SEAP assay is performed according to Example 15. The plate containing the remaining treated cells is placed at 4 ° C. and, if desired, serves as a source of material to repeat the assay on a particular well.
【０５９１】 陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。[0591] As a positive control, 100 units / ml of interferon gamma can be used, which is known to activate Jurkat T cells. Typically, more than 30-fold induction is observed in the positive control wells.
【０５９２】 上述のプロトコルは、一過性および安定性の両方のトランスフェクト細胞の作
製に用いられ得、このことは当業者に明らかである。The above protocol can be used to generate both transient and stable transfected cells, which will be apparent to those skilled in the art.
【０５９３】 （実施例１２：骨髄性の活性を同定する高スループットスクリーニングアッセ
イ） 以下のプロトコルを使用して、ガレクチン１１が骨髄性細胞を増殖および／ま
たは分化させるか否かを決定することによりガレクチン１１の骨髄性の活性を評
価する。骨髄性細胞の活性を実施例１０において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／
Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊ
ａｋ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに
使用した骨髄性細胞は、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株
）であるが、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も使用し得る。Example 12: High Throughput Screening Assay to Identify Myeloid Activity Galectin by determining whether galectin 11 proliferates and / or differentiates myeloid cells using the following protocol Evaluate 11 myeloid activities. The activity of myeloid cells was measured using GAS / SEAP / produced in Example 10.
Evaluate using Neo construct. Therefore, factors that increase SEAP activity are J
Figure 4 shows the ability to activate the ak-STATS signaling pathway. The myeloid cells used in this assay are U937 (pre-monocytic cell line), but TF-1, HL60, or KG1 may also be used.
【０５９４】 Ｕ９３７細胞を、実施例１０において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ7個
のＵ９３７細胞を回収し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１
００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン
を補充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培
地中で増殖させる。To transiently transfect U937 cells with the GAS / SEAP / Neo construct produced in Example 10, the DEAE-Dextran method (
Kharbanda et al., 1994, Cell Growth & Differ.
entry, 5: 259-265). First, 2 × 10e 7 U937 cells are collected and washed with PBS. U937 cells are usually
Grow in RPMI 1640 medium containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) supplemented with 00 units / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin.
【０５９５】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、および６７５μＭ ＣａＣｌ2
を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞を懸
濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。Next, 0.5 mg / ml DEAE-Dextran, 8 μg of GAS-SE
AP2 plasmid DNA, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 375 μM
Na 2 HPO 4 · 7H 2 O , 1mM MgCl 2, and 675μM CaCl 2
The cells are suspended in 1 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) buffer containing Incubate at 37 ° C. for 45 minutes.
【０５９６】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。The cells were washed with RPMI 1640 medium containing 10% FBS and then washed with 10% FBS.
Resuspend in ml of complete medium and incubate at 37 ° C for 36 hours.
【０５９７】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。GAS-SEAP / U937 stable cells are obtained by growing cells in 400 μg / ml G418. G418-free medium is used to grow routinely, but every 1-2 months the cells are grown at 400 μg / ml G418 for two passages.
Should be regrown in.
【０５９８】 これらの細胞を１×１０8個の細胞（これは１０枚の９６ウェルプレートアッ
セイのために十分である）を回収することにより試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０5細胞／ｍｌの最終密度で細胞
を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞（すな
わち、１×１０5細胞／ウェル）をプレートする。The cells are tested by collecting 1 × 10 8 cells, which is enough for ten 96-well plate assays, and washing with PBS. Suspend cells at a final density of 5 × 10 5 cells / ml in 200 ml of growth medium as described above. Plate 200 μl of cells per well (ie, 1 × 10 5 cells / well) in a 96-well plate.
【０５９９】 実施例９に記載されるプロトコルにより調製された上清の５０μｌを添加する
。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１０
０単位／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性化さ
せることが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロール
ウェルにおいて観察される。実施例１５に記載のプロトコルに従って上清をＳＥ
ＡＰアッセイする。Add 50 μl of the supernatant prepared by the protocol described in Example 9. Incubate at 37 ° C for 48-72 hours. As a positive control, 10
0 units / ml of interferon gamma may be used, which is known to activate U937 cells. Typically, more than 30-fold induction is observed in positive control wells. Supernatant was purified by SE according to the protocol described in Example 15.
Perform AP assay.
【０６００】 （実施例１３：ニューロン活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ
） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に結合したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、ガレクチン１１による細胞の活性化を評価し得る。Example 13: High Throughput Screening Assays to Identify Neuronal Activity As cells undergo differentiation and proliferation, a group of genes is activated via many different signaling pathways. One of these genes, EGR1 (early growth response gene 1), is induced in various tissues and cell types upon activation. EG
The R1 promoter is responsible for such induction. EGR bound to a reporter molecule
One promoter can be used to assess cell activation by galectin-11.
【０６０１】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ）細胞）は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テトラデカ
ノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ（上皮
増殖因子））での活性化により、増殖および／または分化することが公知である
。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポータ
ーに結合したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランス
フェクトすることにより、ガレクチン１１によるＰＣ１２細胞の活性化を評価し
得る。In particular, the following protocol is used to assess neuronal activity in the PC12 cell line. PC12 cells (rat pheochromosome (phenochrom)
proliferating and / or differentiating by activation with a number of mitogens, such as TPA (tetradecanoylphorbol acetate), NGF (nerve growth factor), and EGF (epidermal growth factor). Is known. Activates EGR1 gene expression during this treatment. Thus, by stably transfecting PC12 cells with a construct containing the EGR promoter linked to a SEAP reporter, activation of PC12 cells by galectin-11 can be assessed.
【０６０２】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６：８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用い
て、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る： ５’ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧ−
３’（配列番号１７） ５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣ−３
’（配列番号１８）。The EGR / SEAP reporter construct can be assembled according to the following protocol.
EGR-1 promoter sequence (-633 to +1) (Sakamoto K et al., O.
ncogene 6: 867-871 (1991)) can be PCR-amplified from human genomic DNA using the following primers:
3 ′ (SEQ ID NO: 17) 5 ′ GCGAAGCTTCCGCGACTCCCCGGATCCGCCCTC-3
'(SEQ ID NO: 18).
【０６０３】 次いで、実施例１０において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを直鎖状化し、ＧＡ
Ｓ／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらと同じ酵素を
用いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターと
を連結する。The EGR1 amplification product can then be inserted into this vector using the GAS: SEAP / Neo vector created in Example 10. Restriction enzyme XhoI / H
The GAS: SEAP / Neo vector is linearized using indIII and GA
Remove the S / SV40 stuffer. The EGR1 amplification product is subjected to restriction treatment using these same enzymes. Ligate the vector and the EGR1 promoter.
【０６０４】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．カタログ番号０８
−１１５）の３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を１つの１０ｃ
ｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートのウェルあたり５０ｍｌ添
加し、そして２時間風乾させる。To prepare a 96-well plate for cell culture, the coating solution (
Collagen Type I (Upstate Biotech Inc. Cat. No. 08
-115) in 1% dilution with 30% ethanol (sterile filtration)
Add 2 ml per m plate or 50 ml per well in a 96 well plate and air dry for 2 hours.
【０６０５】 ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充
した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１２４
４９−７８Ｐ）、５％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４
０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから４つ
への分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り出し
、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。PC12 cells were plated on pre-coated 10 cm tissue culture dishes supplemented with 10% horse serum (JRH BIOSCIENCES, Cat. No. 124) supplemented with penicillin (100 units / ml) and streptomycin (100 μg / ml).
49-78P) RPMI-164 with 5% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)
Grow routinely in Medium 0 (Bio Whitaker). A 1 to 4 split is performed every 3 to 4 days. Remove cells from plate by scraping and resuspend by pipetting up and down more than 15 times.
【０６０６】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１１に記載のＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅプロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェクトする。ＥＧＲ−Ｓ
ＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させ
ることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的な増殖のために使用するが
、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖
させるべきである。The EGR / SEAP / Neo construct was purified using the Lipofecta described in Example 11.
Transfect PC12 using the mine protocol. EGR-S
EAP / PC12 stable cells are obtained by growing the cells in 300 μg / ml G418. G418-free medium is used for conventional growth, but every 1-2 months, cells should be regrown in 300 μg / ml G418 for 2 passages.
【０６０７】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリーニン
グする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。次い
で、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ ＦＢＳ
を含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓（ｓｔａｒｖｅ）させる。To assay for neuronal activity, 10 cm plates with cells at approximately 70-80% confluence are screened by removing old media. The cells are washed once with PBS (phosphate buffered saline). The cells were then transferred to low serum medium (1% horse serum and 0.5% FBS with antibiotics).
In RPMI-1640).
【０６０８】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中で懸濁する。細胞数をカウントし、そして
より低血清の培地を添加し、５×１０5細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達させる
。The next morning, remove the medium and wash the cells with PBS. The cells are scraped off the plate and the cells are suspended in 2 ml of low serum medium. Count the cell number and add lower serum medium to reach a final cell density of 5 × 10 5 cells / ml.
【０６０９】 ２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０5細胞／ウェルに等しい）。実施例９により産生された５０μｌの上清を、３
７℃で４８〜７２時間添加する。陽性コントロールとして、ＥＧＲを介してＰＣ
１２細胞を活性化することが公知の成長因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経成
長因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導が
陽性コントロールウェルにおいて見られる。実施例１５に従って、上清をＳＥＡ
Ｐアッセイする。Add 200 μl of the cell suspension to each well of a 96-well plate (1 × 1
0 equal to 5 cells / well). 50 μl of the supernatant produced according to Example 9
Add at 7 ° C for 48-72 hours. As a positive control, PC via EGR
A growth factor known to activate 12 cells can be used (eg, 50 ng / μl nerve growth factor (NGF)). Typically, more than 50-fold SEAP induction is seen in positive control wells. The supernatant was purified by SEA according to Example 15.
Perform P assay.
【０６１０】 （実施例１４：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） ＮＦ−ＫＢ（核因子ＫＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−ＫＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−ＫＢは、アポトーシスから細胞を保護するようである）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。Example 14: High Throughput Screening Assay for T Cell Activity NF-KB (nuclear factor KB) has a wide variety of agents, including the inflammatory cytokines IL-1 and TNF, CD30 and CD40. , Lymphotoxin-α and Lymphotoxin-β), are transcription factors that are activated by exposure to LPS or thrombin, and by expression of certain viral gene products. As transcription factors, NF-KB is the expression of genes involved in immune cell activation, regulates apoptosis (NF-KB appears to protect cells from apoptosis),
Regulates B and T cell development, antiviral and antimicrobial responses, and multiple stress responses.
【０６１１】 刺激されない条件において、ＮＦ−ＫＢは、Ｉ−ＫＢ（インヒビターＫＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−ＫＢはリン酸化され、そ
して分解され、ＮＦ−ＫＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ）を引き起こし、これ
により標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−ＫＢにより活性化される標的遺伝
子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１およびクラス１
ＭＨＣが挙げられる。In unstimulated conditions, NF-KB is retained in the cytoplasm with I-KB (inhibitor KB). However, upon stimulation, I-KB is phosphorylated and degraded, causing a shuttle of NF-KB to the nucleus, thereby activating transcription of the target gene. Target genes activated by NF-KB include IL-2, IL-6, GM-CSF, ICAM-1 and class 1
MHC.
【０６１２】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
ＫＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例９において
産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−ＫＢのアクチベー
ターまたはインヒビターは、疾患の処置に有用である。例えば、ＮＦ−ＫＢのイ
ンヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−ＫＢの活性化に関連する疾患（例えば
、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る。[0610] Due to its central role and the ability to respond to a range of stimuli, NF-
A reporter construct utilizing the KB promoter element is used to screen the supernatant produced in Example 9. Activators or inhibitors of NF-KB are useful for treating disease. For example, an inhibitor of NF-KB may be used to treat a disease associated with acute or chronic NF-KB activation (eg, rheumatoid arthritis).
【０６１３】 ＮＦ−ＫＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−ＫＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号１９）の４つの直列のコピー、ＳＶ４０
初期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そし
てＸｈｏＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡ
ＴＴＡＧ：３’（配列番号２０）。To construct a vector containing the NF-KB promoter element, the PCR
Is used. The upstream primer has an NF-KB binding site (
GGGGACTTTCCC) (SEQ ID NO: 19), four tandem copies, SV40
Contains an 18 bp sequence complementary to the 5 'end of the early promoter sequence and is adjacent to the XhoI site: 5': GCGGCCTCGAGGGGACTTTTCCCGGGGACTTTCC
GGGGACTTCCGGGACTTTCCATCCTGGCCATCTCAA
TTAG: 3 '(SEQ ID NO: 20).
【０６１４】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号２１）。The downstream primer is complementary to the 3 ′ end of the SV40 promoter,
And adjacent to the HindIII site: 5 ': GCGGCAAGCTTTTTCAAAGCCTAGGC: 3' (SEQ ID NO: 21).
【０６１５】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して実施する。
得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして
ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ
３プライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むことを確認す
る：The PCR amplification is performed using the SV40 promoter template present in the pB-gal: promoter plasmid obtained from Clontech.
The resulting PCR fragment is digested with XhoI and HindIII and subcloned into BLSK2- (Stratagene). T7 and T
Sequencing with the three primers confirms that the insert contains the following sequence:
【０６１６】[0616]
【化６】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０フラグメントで置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、そしてそれゆえ哺乳動物の発現系には好
ましくない。Embedded image The SV40 minimal promoter element present in the pSEAP2-promoter plasmid (Clontech) is then replaced with this NF-KB / SV40 fragment using XhoI and HindIII. However, this vector does not contain the neomycin resistance gene and is therefore not preferred for mammalian expression systems.
【０６１７】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−ＫＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
詳細には、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限処理した後に、ＮＦ−
ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入
し、ＧＦＰ遺伝子を置換した。To generate a stable mammalian cell line, the NF-KB / SV40 / SEAP cassette was transformed using the restriction enzymes SalI and NotI as described above for NF-KB / SEA.
Remove from P vector and insert into vector containing neomycin resistance.
Specifically, after restriction treatment of pGFP-1 with SalI and NotI, NF-
The KB / SV40 / SEAP cassette was inserted into pGFP-1 (Clontech) to replace the GFP gene.
【０６１８】 一旦、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例１１に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、
そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をア
ッセイするための方法がまた、実施例１１に記載される。陽性コントロールとし
て、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、および
Ｈ１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。Once the NF-KB / SV40 / SEAP / Neo vector has been prepared, stable Jurkat T cells are prepared according to the protocol described in Example 11.
And maintain. Similarly, a method for assaying supernatants containing these stable Jurkat T cells is also described in Example 11. As a positive control, exogenous TNFα (0.1, 1, 10 ng) is added to wells H9, H10, and H11, typically 5-10 fold activation is observed.
【０６１９】 （実施例１５：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） 実施例１２および１３に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、
ＳＥＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−
ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒ
ｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝
液、アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。Example 15 Assay for SEAP Activity As a reporter molecule for the assays described in Examples 12 and 13,
SEAP activity was measured according to the following general procedure for Tropix Phospho-
Assay using the light Kit (catalog number BP-400). Tr
The opix Phospho-light Kit supplies the dilution buffer, assay buffer, and reaction buffer used below.
【０６２０】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。Fill the dispenser with 2.5 × dilution buffer and dispense 15 μl of 2.5 × dilution buffer to Optiplate containing 35 μl of supernatant. Seal the plate with a plastic sealer and incubate at 65 ° C. for 30 minutes. Separate the Optiplate to avoid uneven heating.
【０６２１】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液を満たす。５０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液を満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、１回に
５つのプレートを処理し、１０分後に２つ目のセットを開始するべきである。Cool the sample to room temperature for 15 minutes. Empty the dispenser and fill with assay buffer. Add 50 μl of assay buffer and incubate at room temperature for 5 minutes. Empty the dispenser and fill with reaction buffer (see table below). Add 50 μl reaction buffer and incubate for 20 minutes at room temperature. Since the intensity of the chemiluminescent signal is time-dependent and it takes about 10 minutes to read 5 plates on a luminometer, process 5 plates at a time and start a second set after 10 minutes Should be.
【０６２２】 ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取
る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加
は、レポーター活性を示す。Read the relative light unit in the luminometer. Set H12 as blank and print the result. An increase in chemiluminescence indicates a reporter activity.
【０６２３】[0623]
【表４】 （実施例１６：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定する高スルー
プットスクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させるこ
とは公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を
行うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセ
イを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、ま
たは蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよ
うに容易に改変され得る。[Table 4] Example 16: High Throughput Screening Assay to Identify Changes in Small Molecule Concentration and Membrane Permeability Binding of a ligand to a receptor alters intracellular levels of small molecules such as calcium, potassium, and sodium and pH. , As well as changing the membrane potential are known. These changes can be measured in assays that identify supernatants that bind to receptors on particular cells. The following protocol describes an assay for calcium, but this protocol is easily modified to detect changes in potassium, sodium, pH, membrane potential, or any other small molecule detectable by a fluorescent probe Can be done.
【０６２４】 以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子を結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子を、本明細書で
用いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ
，Ｉｎｃ．；カタログ番号Ｆ−１４２０２）の代わりに使用し得る。The following assays measure changes in fluorescent molecules (Molecular Probes) that bind small molecules using a fluorimetric imaging plate reader (“FLIPR”). Clearly, any fluorescent molecule that detects a small molecule is a calcium fluorescent molecule, fluo-4 (Molecular Probes), used herein.
, Inc. Catalog number F-14202).
【０６２５】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ2
インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で二回洗浄し、最後の洗浄後、緩衝液１００μｌを残す。For adherent cells, cells are seeded at 10,000-20,000 cells / well in Co-star black 96-well plates with clear bottoms. Plate CO 2
Incubate for 20 hours in the incubator. The adherent cells were washed in a Biotek washer with 200 μl HBSS (Hank's Balanced Salt).
Solution), leaving 100 μl of buffer after the last wash.
【０６２６】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで作製する。細胞にｆｌｕｏ−４を負荷するため、
１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレー
トをＣＯ2インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレー
トをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳにより４回洗浄し、緩衝液１００μｌを残
す。The stock solution of 1 mg / ml fluo-4 was added to 10% pluronic acid (puro
nic acid) Made with DMSO. To load cells with fluo-4,
12 μg / ml fluo-4 (50 μl) is added to each well. The plate is incubated for 60 minutes at 37 ° C. in a CO 2 incubator. The plate is washed four times with HBSS in a Biotek washer, leaving 100 μl of buffer.
【０６２７】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌのコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０6細胞／ｍｌに再懸
濁する。細胞懸濁液１ｍｌに対して、１ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４の１０％プル
ロン酸ＤＭＳＯ溶液４μｌを加える。次に、チューブを３７℃の水浴中に３０〜
６０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０6細胞／ｍｌに再懸濁し
、そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分配する。プレートを１０
００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、プレートをＤｅｎｌｅｙ ＣｅｌｌＷ
ａｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μｌ
にする。For non-adherent cells, the cells are spun down from the culture medium. 50 cells
Resuspend to 2-5 x 10 6 cells / ml with HBSS in a ml conical tube. To 1 ml of the cell suspension, 4 μl of a 10% pluronic acid DMSO solution of 1 mg / ml fluo-4 is added. Next, place the tube in a 37 ° C water bath for 30-
Leave for 60 minutes. The cells are washed twice with HBSS, resuspended at 1 × 10 6 cells / ml, and distributed to the microplate at 100 μl / well. Plate 10
Centrifuge at 00 rpm for 5 minutes. Next, place the plate on Denley CellW
After washing once with 200 μl in ash, the final volume was 100 μl by aspiration step
To
【０６２８】 非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−４のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。For non-cell based assays, each well contains a fluorescent molecule, such as fluo-4. The supernatant is added to the wells and a change in fluorescence is detected.
【０６２９】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷであり；（２）
曝露時間は、０．４秒間であり；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２であり；
（４）励起は４８８ｎｍであり；（５）発光は５３０ｎｍであり；そして（６）
サンプル添加は５０μｌである。５３０ｎｍにおける発光の増加は、細胞内Ｃａ ++ 濃度の増加を生じる、ガレクチン１１またはガレクチン１１によって誘導され
る分子のいずれかの分子によって引き起こされる細胞外シグナリング事象を示す
。To measure the fluorescence of intracellular calcium, FLIPR was adjusted to the following parameters:
Set: (1) System gain is 300-800 mW; (2)
Exposure time is 0.4 seconds; (3) Camera F / Stop is F / 2;
(4) excitation is 488 nm; (5) emission is 530 nm; and (6)
Sample addition is 50 μl. The increase in emission at 530 nm is due to intracellular Ca ++ Galectin-11 or galectin-11 induced by increasing concentration
Exhibit extracellular signaling events caused by any of the molecules
.
【０６３０】 （実施例１７：チロシンキナーゼ活性を同定する高スループットスクリーニン
グアッセイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲の有糸***促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）お
よび代謝性成長因子のレセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知であ
る大きなＲＰＴＫファミリーがある。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌され
る低分子量タンパク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質
も含む。Example 17: High Throughput Screening Assay to Identify Tyrosine Kinase Activity Protein tyrosine kinases (PTKs) represent a diverse group of transmembrane and cytoplasmic kinases. Within the receptor protein tyrosine kinase (RPTK) family there is a range of receptors for mitogenic and metabolic growth factors, including PDGF, FGF, EGF, NGF, HGF and the insulin receptor subfamily. In addition, there is a large RPTK family for which the corresponding ligand is unknown. RPTK ligands include mainly secreted low molecular weight proteins, but also include membrane-bound and extracellular matrix proteins.
【０６３１】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化を含み
、これはレセプターサブユニットのトランスリン酸化および細胞質チロシンキナ
ーゼの活性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（
例えば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシン
キナーゼ、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質
ゾルプロテインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイトカ
インスーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ
−ＣＳＦおよびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒介
する。Activation of RPTK by ligand involves ligand-mediated receptor dimerization, which results in transphosphorylation of the receptor subunit and activation of cytoplasmic tyrosine kinase. Cytoplasmic tyrosine kinases include the src family (
For example, receptor-related tyrosine kinases of src, yes, lck, lyn, fyn), and non-receptor-bound and cytosolic protein tyrosine kinases such as the Jak family. These members are members of the cytokine superfamily (eg, interleukins, interferons, GM
-CSF and leptin).
【０６３２】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、ガレクチン
１１またはガレクチン１１によって誘導される分子がチロシンキナーゼシグナル
伝達経路を活性化し得るか否かの同定は興味深い。従って、以下のプロトコルを
設計して、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るこのような分子を
同定する。Because of the wide range of known factors that can stimulate tyrosine kinase activity, it is of interest to identify whether galectin-11 or a molecule induced by galectin-11 can activate the tyrosine kinase signaling pathway. Accordingly, the following protocol is designed to identify such molecules that can activate the tyrosine kinase signaling pathway.
【０６３３】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで３０分間、二回リンスして滅菌し、水でリ
ンスした後、一晩乾燥させる。幾つかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養グレ
ードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジン（
５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あるいは仔
ウシ血清で２時間コートし、ＰＢＳでリンスした後、４℃で保存する。増殖培地
に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）が記載するように、ａｌａ
ｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間接定量することにより、これ
らのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を使用し、
Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅを覆う。Ｆａｌ
ｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、いくつかの増殖
実験において使用し得る。Target cells (eg, primary keratinocytes) were purchased from Nalge Nunc (Naperville, Ill.) At a density of about 25,000 cells / well.
Inoculate well Loprodyne Silent Screen Plate. The plate is sterilized by rinsing twice with 100% ethanol for 30 minutes, rinsing with water and drying overnight. Some plates were prepared with 100 ml of cell culture grade type I collagen (50 mg / ml), gelatin (2%) or polylysine (
50 mg / ml) (all of which are available from Sigma Chemicals (St. L.)
oois, MO) or Becton Dickinso
n (Bedford, MA), coated with 10% Matrigel or calf serum for 2 hours, rinsed with PBS, and stored at 4 ° C. Seed 5,000 cells / well in growth medium and use the manufacturer's Alamar Biosie
nces, Inc. As described by (Sacramento, CA), ala
Cell proliferation on these plates is assayed by indirect quantification of cell numbers after 48 hours using marBlue. Becton Dickinson
(Falcon plate cover # 3071 from Bedford, MA)
Cover Loprodyne Silent Screen Plate. Fal
Con Microtest III cell culture plates can also be used in some growth experiments.
【０６３４】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地中で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１２で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０
．１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２ｍＭ Ｎａ4Ｐ2Ｏ7およびＢｏｅｈｅｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手し
たプロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに添加
し、そしてプレートを回転振盪器上、４℃で５分間振盪する。次に、プレートを
真空トランスファーマニホールド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｎｉ
ｆｏｌｄ）に設置し、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底
の０．４５ｍｍ膜で濾過する。抽出物をバキュームマニホールドの底の９６ウェ
ル捕獲／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に置く。遠心分離により明
澄化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェルの含有
物を取り出し、４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。To prepare the extract, A431 cells are seeded (20,000 / 200 ml / well) on nylon membranes of Loprodyne plates and cultured overnight in complete medium. Cells are incubated in serum-free basal medium for 24 hours and allowed to rest. EGF (60 ng / ml) or 50 μl of the supernatant generated in Example 12
After treatment for 0 minutes, the medium was removed and 100 ml of extraction buffer (20 mM HEP)
ES pH 7.5, 0.15 M NaCl, 1% Triton X-100, 0
. 1% SDS, 2 mM Na 3 VO 4 , 2 mM Na 4 P 2 O 7 and Boher
A mixture of protease inhibitors (# 1836170) obtained from Ninger Mannheim (Indianapolis, Ind.) is added to each well and the plate is shaken on a rotary shaker at 4 ° C. for 5 minutes. Next, the plate was evacuated to a vacuum transfer manifold.
fold) and filter the extract through a 0.45 mm membrane at the bottom of each well using house vacuum. The extracts are collected in a 96-well capture / assay plate at the bottom of the vacuum manifold and immediately placed on ice. To obtain an extract clarified by centrifugation, the contents of each well are taken out after solubilization with a surfactant for 5 minutes, and centrifuged at 4 ° C., 16,000 × g for 15 minutes.
【０６３５】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては方法の一つ
を記載する。The filtered extract is tested for the level of tyrosine kinase activity. Although a number of methods for detecting tyrosine kinase activity are known, one of the methods is described herein.
【０６３６】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用し得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞***キナーゼｃｄ
ｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ
酸１〜１７に相当）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの基
質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。Generally, the tyrosine kinase activity of the supernatant is assessed by determining its ability to phosphorylate tyrosine residues on a particular substrate (biotinylated peptide). Biotinylated peptides that can be used for this purpose include PSK1 (cytokinase kinase cd)
c2-p34, corresponding to amino acids 6-20) and PSK2 (corresponding to amino acids 1-17 of gastrin). Both peptides are substrates for a series of tyrosine kinases and are available from Boehringer Mannheim.
【０６３７】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加した後、順に、ＡＴＰ／Ｍｇ2+（
５ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）１０μｌ、５×アッセイ緩衝液（４０
ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ）１０μｌ、バナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、最後に水５μｌを
加える。成分を穏やかに混合し、反応混合物を３０℃で２分間プレインキュベー
トする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加えて反応を開始させる。The tyrosine kinase reaction is set up by adding the following components in order. First, after adding 10 μl of 5 μM biotinylated peptide, the ATP / Mg 2+ (
10 μl of 5 mM ATP / 50 mM MgCl 2 , 5 × assay buffer (40
mM imidazole hydrochloride, pH 7.3, 40 mM β-glycerophosphate, 1 mM
EGTA, 100 mM MgCl 2 , 5 mM MnCl 2 , 0.5 mg / ml
Add 10 μl of BSA, 5 μl of sodium vanadate (1 mM) and finally 5 μl of water. The components are mixed gently and the reaction mixture is pre-incubated for 2 minutes at 30 ° C. The reaction is started by adding 10 μl of control enzyme or filtered supernatant.
【０６３８】 次に、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ １０μｌを添加することによりチロシンキナー
ゼアッセイ反応を停止し、反応物を氷上に置く。Next, the tyrosine kinase assay reaction is stopped by adding 10 μl of 120 mM EDTA, and the reaction is placed on ice.
【０６３９】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を測定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。
ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合体化した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏ
ｓｉｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウ
ェルに添加した後、３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように
洗浄する。Tyrosine kinase activity is measured by transferring a 50 μl aliquot of the reaction mixture to a microtiter plate (MTP) module and incubating at 37 ° C. for 20 minutes. Thereby, streptavidin (streptava)
din) Associate coated 96-well plate with biotinylated peptide.
Wash MTP module four times with 300 μl / well PBS. Next, anti-phosphotyrosine conjugated to horseradish peroxidase.
sine) 75 μl of antibody (anti-P-Tyr-POD (0.5 u / ml)) is added to each well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Wash wells as described above.
【０６４０】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度を
測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルをＥＬＩＳＡリーダーを使用
して定量し、これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。Next, a peroxidase substrate solution (Boehringer Mannheim)
) Add 100 μl and incubate at room temperature for at least 5 minutes (up to 30 minutes). The absorbance of the sample at 405 nm is measured using an ELISA reader. The level of bound peroxidase activity was quantified using an ELISA reader, which reflects the level of tyrosine kinase activity.
【０６４１】 （実施例１８：リン酸化活性を同定する高スループットスクリーニングアッセ
イ） 実施例１６に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性アッセイの可能性のある
代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内シ
グナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る。
例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２
キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８
ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉特
異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の分
子、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレオニン
分子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子でＥｒｋ−１またはＥ
ｒｋ−２を置き換えることにより検出し得る。Example 18: High Throughput Screening Assay to Identify Phosphorylation Activity The major cells as potential alternatives and / or complements of the protein tyrosine kinase activity assay described in Example 16 Assays that detect activation (phosphorylation) of internal signaling intermediates may also be used.
For example, as described below, one particular assay is Erk-1 and Erk-2.
Tyrosine phosphorylation of the kinase can be detected. However, Raf, JNK, p38
Phosphorylation of MAP, Map Kinase Kinase (MEK), MEK Kinase, Src, Muscle Specific Kinase (MuSK), IRAK, Tec and other molecules such as Janus, and any other phosphoserine, phosphotyrosine or phosphothreonine molecule , Erk-1 or Erk with these molecules in the following assays
It can be detected by replacing rk-2.
【０６４２】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次に、プレートをＰＢＳでリンスし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより
ＲＴで１時間ブロックする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２に対する二つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時間）す
る。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクローナル
抗体を交換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３〜５回
リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で貯蔵する。Specifically, the wells of the 96-well ELISA plate were filled with protein G (1 μg /
Make assay plate by coating with 0.1 ml for 2 hours at room temperature (RT). The plates are then rinsed with PBS and blocked with 3% BSA / PBS for 1 hour at RT. Next, protein G plates were loaded with Erk-1 and Erk-1.
Two commercially available monoclonal antibodies against rk-2 (100 ng / well) (S
Treat (1 hour at RT) with ant Cruz Biotechnology. (This step can be easily modified by replacing the monoclonal antibody that detects any of the above molecules to detect other molecules). After rinsing 3-5 times with PBS, plates are stored at 4 ° C. until use.
【０６４３】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、増殖培地中で一晩培養する。次に、細胞を基本培地（Ｄ
ＭＥＭ）中で４８時間飢餓させた後、ＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または実施例９
で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次に、細胞を可溶化し、抽出物を
濾過して直接アッセイプレート中に入れる。A431 cells are seeded at 20,000 / well in 96-well Loprodyne filter plates and cultured overnight in growth medium. Next, the cells were placed in a basal medium (D
After starvation in MEM) for 48 hours, EGF (6 ng / well) or Example 9
5. Treat with 50 μl of the supernatant obtained in the above for 5-20 minutes. The cells are then solubilized and the extract is filtered directly into the assay plate.
【０６４４】 抽出物を用いてＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、プレートを、Ｅｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクローナ
ル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を標
準的な手順によりビオチン化する。次に、結合ポリクローナル抗体をユーロピウ
ムストレプトアビジンおよびユーロピウム蛍光増強剤とＷａｌｌａｃ ＤＥＬＦ
ＩＡ装置内で連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）ことによって定量
する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、ガレクチン１１または
ガレクチン１１により誘導される分子によるリン酸化を示す。After incubating with the extract for 1 hour at RT, the wells are rinsed again. As a positive control, a commercially available MAP kinase preparation (10 ng / well)
Is used instead of the A431 extract. The plates were then plated with Erk-1 and Erk-1.
Treatment with a commercially available polyclonal (rabbit) antibody (1 μg / ml) that specifically recognizes the phosphorylated epitope of rk-2 kinase (1 hour at RT). The antibody is biotinylated by standard procedures. Next, the conjugated polyclonal antibody was combined with europium streptavidin and europium fluorescence enhancer and Wallac DELF.
Quantification is by continuous incubation (time-resolved fluorescence) in an IA device. An increase in the fluorescent signal above the background indicates galectin-11 or phosphorylation by the molecule induced by galectin-11.
【０６４５】 （実施例１９：ガレクチン１１遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されたＲＮＡを単離する。次に、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次に、このｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを
用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の
緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；およ
び７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。Example 19 Method for Determining Alterations in the Galectin 11 Gene RNA isolated from whole families or individual patients presenting the phenotype of interest (eg, disease) is isolated. Next, cDNA is generated from these RNA samples using protocols known in the art (see Sambrook).
Next, this cDNA is used as a template for PCR using primers surrounding the target region in SEQ ID NO: 1. Suggested PCR conditions are Sid
ransky, D .; Et al., Science 252: 706 (1991), consisting of 35 cycles of 95 ° C. for 30 seconds; 52-58 ° C. for 60-120 seconds; and 70 ° C. for 60-120 seconds.
【０６４６】 次に、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５’末端にＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。ガレクチン１１
の選択したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノムＰＣＲ産
物を分析してその結果を確認する。次に、ガレクチン１１において疑わしい変異
を有するＰＣＲ産物のクローン化および配列決定を行い、直接配列決定の結果を
確認する。[0646] Next, the PCR product was purified using SequiTherm Polymerase (Epi
and sequencing using primers labeled at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase. Galectin 11
The intron-exon boundaries of the selected exons are also determined and the genomic PCR products are analyzed to confirm the results. Next, a PCR product having a suspected mutation in galectin 11 is cloned and sequenced to confirm the results of direct sequencing.
【０６４７】 ガレクチン１１のＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．Ａ．およびＧｒａｈａｍ
，Ｍ．Ｗ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６
（１９９１）に記載のようにＴテールベクターにクローン化し、Ｔ７ポリメラー
ゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定する。
罹患個体を、非罹患個体には存在しないガレクチン１１における変異により同定
する。The galectin-11 PCR product was prepared according to the method of Holton, T .; A. And Graham
, M .; W. , Nucleic Acids Research, 19: 1156.
(1991) and cloned into a T-tail vector and sequenced with T7 polymerase (United States Biochemical).
Affected individuals are identified by mutations in galectin 11 that are not present in unaffected individuals.
【０６４８】 ゲノム再配置もまた、ガレクチン１１に対応する遺伝子における改変を決定す
る方法として観察する。実施例１に従って増幅した全長ガレクチン１１ｃＤＮＡ
を、ジゴキシゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏ
ｎ，Ｃｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：７３−９９（１９
９１）に記載のようにＦＩＳＨを行う。ガレクチン１１の遺伝子座への特異的ハ
イブリダイゼーションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識
プローブとのハイブリダイゼーションを行う。[0648] Genomic rearrangements are also observed as a way to determine alterations in the gene corresponding to galectin-11. Full length galectin-11 cDNA amplified according to Example 1
With digoxigenin deoxy-uridine 5'-triphosphate (Boehringer
Nick translation using Mannheim) and Johnso
n, Cg. Et al., Methods Cell Biol. 35: 73-99 (19
FISH is performed as described in 91). For specific hybridization of galectin 11 to the locus, a large excess of human cot-1 DNA is used to hybridize with the labeled probe.
【０６４９】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメ
ラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィ
ルターとを組み合わせて用いて得る（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．
Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））。ＩＳｅｅ Ｇｒａ
ｐｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して、イメージ収集、分析およ
び染色体部分長測定を行う。ガレクチン１１の（プローブによってハイブリダイ
ズされた）ゲノム領域の染色体変化を、挿入、欠失および転座として同定する。
これらのガレクチン１１の変化を関連疾患の診断マーカーとして使用する。Chromosomes are counterstained with 4,6-diamino-2-phenylidol and propidium iodide to generate a combination of C and R bands. Aligned images for accurate mapping were obtained using a triple band filter set (Chroma T).
technology, Brattleboro, VT) and a cooled charge-coupled device camera (Photometrics, Tucson, AZ) and a variable excitation wavelength filter (Johnson, Cv. et al., Genet.
Anal. Tech. Appl. , 8:75 (1991)). Isee Gra
physical Program System (Invision Cor.
image collection, analysis and chromosome segment length measurements are performed using the method of the present invention (portation, Durham, NC). Chromosomal changes in the genomic region of galectin 11 (hybridized by the probe) are identified as insertions, deletions and translocations.
These changes in galectin 11 are used as diagnostic markers for related diseases.
【０６５０】 （実施例２０：生物学的サンプル中のガレクチン１１の異常レベルを検出する
方法） ガレクチン１１ポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてガレ
クチン１１レベルの上昇または低下が検出されるなら、このポリペプチドは、特
定表現型のマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以
下のアッセイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解さ
れる。Example 20 Method of Detecting an Abnormal Level of Galectin-11 in a Biological Sample A galectin-11 polypeptide can be detected in a biological sample, and an increase or decrease in galectin-11 levels is detected. If so, this polypeptide is a marker for a particular phenotype. It is understood that there are a number of detection methods and, therefore, those skilled in the art can modify the following assays to suit their particular needs.
【０６５１】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のガレクチン１１を検出する。マイクロタイタープレートのウ
ェルを、ガレクチン１１に対する特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌ
で用いてコーティングする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル
のいずれかであって、実施例８に記載の方法により産生される。ウェルに対する
ガレクチン１１の非特異的結合が減少するように、このウェルをブロックする。For example, an antibody sandwich ELISA is used to detect galectin 11 in a sample, preferably a biological sample. The wells of the microtiter plate were loaded with a specific antibody against galectin 11 at a final concentration of 0.2-10 μg / ml.
Coating using This antibody is either monoclonal or polyclonal and is produced by the method described in Example 8. The wells are blocked so that non-specific binding of galectin 11 to the wells is reduced.
【０６５２】 次に、コーティングしたウェルを、ガレクチン１１含有サンプルを用いてＲＴ
で２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用
して結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回
洗浄し、非結合ガレクチン１１を除去する。Next, the coated wells were subjected to RT using a galectin 11-containing sample.
And incubate for more than 2 hours. Preferably, serial dilutions of the sample should be used to confirm the results. Next, the plate is washed three times with deionized or distilled water to remove unbound galectin 11.
【０６５３】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。Then, 50 μl of the specific antibody-alkaline phosphatase conjugate was added to 25 to 400 n.
g and incubate at room temperature for 2 hours. The plate is again washed three times with deionized or distilled water to remove unbound conjugate.
【０６５４】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。コ
ントロールサンプルの系列希釈を使用して標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数
スケール）にガレクチン１１濃度を、そしてＹ軸（直線スケール）に蛍光または
吸光度をプロットする。標準曲線を用いてサンプル中のガレクチン１１濃度を補
間する。Add 75 μl of 4-methylumbelliferyl phosphate (MUP) or p-nitrophenyl phosphate (NPP) substrate solution to each well and incubate for 1 hour at room temperature. The reaction is measured with a microtiter plate reader. A standard curve is generated using serial dilutions of control samples, and the galectin 11 concentration is plotted on the X-axis (log scale) and the fluorescence or absorbance on the Y-axis (linear scale). The standard curve is used to interpolate the galectin-11 concentration in the sample.
【０６５５】 （実施例２１：処方） 本発明はまた、被験体に有効量の治療剤を投与することにより疾患または障害
（例えば、本明細書中に開示される疾患または障害の任意の１つ以上のような）
を処置および／または予防する方法を提供する。治療剤により、薬学的に受容可
能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合わせた、本発明のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチド（フラグメントおよび改変体を含む）、そのアゴニス
トまたはアンタゴニスト、および／またはそれらに対する抗体が意味される。Example 21 Formulations The present invention also provides a method for administering a disease or disorder (eg, any one of the diseases or disorders disclosed herein) to a subject by administering to the subject an effective amount of a therapeutic agent. Like above)
Are provided. A polynucleotide or polypeptide of the present invention (including fragments and variants), agonists or antagonists thereof, and / or antibodies thereto, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier form (eg, a sterile carrier), depending on the therapeutic agent. Is meant.
【０６５６】 治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部
位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施
基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方お
よび投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような
考慮を行って決定される。Therapeutic agents can be determined by taking into account the clinical condition of the individual patient (particularly the side effects of treatment with the therapeutic agent alone), site of delivery, method of administration, dosing regimen, and other factors known to those of skill in the art. prescription and dosing in a manner that complies with good medical practice. Therefore, the “effective amount” intended in the present specification is determined in view of such considerations.
【０６５７】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効
量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、
上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホルモン
について、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒ
トに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続
投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ
／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポ
ンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得
る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、
所望の効果に応じて変化するようである。As a general suggestion, the total pharmaceutically effective amount of a therapeutic agent administered parenterally per dose is in the range of about 1 μg / kg / day to 10 mg / kg / day of the patient's body weight,
As noted above, this is left to therapeutic discretion. More preferably, for this hormone, the dose is at least 0.01 mg / kg / day, most preferably between about 0.01 mg / kg / day and about 1 mg / kg / day for a human. When administered continuously, typically the therapeutic agent is administered from about 1 μg / kg / hour to about 50 μg / kg.
Administered either by injection 1 to 4 times daily or by continuous subcutaneous infusion (eg using a minipump) at a dosing rate of / hour. Intravenous bag solutions may also be used. The duration of treatment needed to observe the change and the post-treatment interval at which the response occurs
It seems to vary depending on the desired effect.
【０６５８】 治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌ
ｙ）、膣内、腹腔内、局所的（散剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチに
よるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的
に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈
剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で用いる場合、用語「
非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射お
よび注入を含む投与の様式をいう。Therapeutic agents can be administered orally, rectally, parenterally, intracistemally.
y), may be administered intravaginally, intraperitoneally, topically (such as by a powder, ointment, gel, drop, or transdermal patch), buccally or orally or as a nasal spray. “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to a non-toxic solid, semi-solid or liquid filler, diluent, encapsulating material or any type of formulation auxiliary. As used herein, the term "
"Parenteral" refers to modes of administration, including intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intraarticular injection and infusion.
【０６５９】 本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療
剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内、膣内、腹腔内、局所的（散
剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口ま
たは鼻腔スプレーとして投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒
性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補
助剤をいう。本明細書で用いる場合、用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、
腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。Therapeutic agents of the invention are also suitably administered by sustained release systems. Suitable examples of sustained release therapeutic agents include oral, rectal, parenteral, intracisternal, vaginal, intraperitoneal, topical (such as by powder, ointment, gel, drop, or transdermal patch), It is administered orally or orally or as a nasal spray. “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to a non-toxic solid, semi-solid or liquid filler, diluent, encapsulating material or any type of formulation auxiliary. As used herein, the term "parenteral" refers to intravenous, intramuscular,
Refers to modes of administration including intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intraarticular injection and infusion.
【０６６０】 本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療
剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまた
はマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性
物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、お
よび貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。Therapeutic agents of the invention are also suitably administered by sustained release systems. Suitable examples of sustained release therapeutic agents include suitable polymeric substances (eg, semipermeable polymer matrices in the form of shaped articles (eg, films or microcapsules)), suitable hydrophobic substances (eg, in acceptable quality oils). Or an ion exchange resin, and poorly soluble derivatives (eg, poorly soluble salts).
【０６６１】 徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５
５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９
８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９
８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ
−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。As the sustained release matrix, polylactide (US Pat. No. 3,773,919)
No. EP 58,481), a copolymer of L-glutamic acid and γ-ethyl-L-glutamate (Sidman et al., Biopolymers 22: 547-5).
56 (1983)), poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (Lang
er et al. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (19
81), and Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (19
82)), ethylene vinyl acetate (Langer et al., Ibid.) Or poly-D
-(-)-3-hydroxybutyric acid (EP133,988).
【０６６２】 徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の組成物を包含する（一
般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０
）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃｅｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ
−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治
療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：
ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９
８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３
，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国
特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１
０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）単層型で
あり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択
された割合が、最適な治療剤のために調整される。Sustained release therapeutic agents also include compositions of the present invention encapsulated in liposomes (see generally, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).
); Treat et al., Liposomes in the Therapy of
Infectious Disease and Censor, Lopez
-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New Yo
rk, 317-327 and 353-365 (1989)). Liposomes containing a therapeutic agent can be prepared by methods known per se:
DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Pr.
oc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4034 (19
80); EP52,322; EP36,676; EP88,046; EP143.
, 949; EP 142,641; Japanese Patent Application No. 83-118008; U.S. Patent Nos. 4,485,045 and 4,544,545;
02,324. Typically, liposomes are small (about 200-800 °) monolayers, where the lipid content is greater than about 30 mol% cholesterol and the selected proportion is adjusted for optimal therapeutic agents. You.
【０６６３】 なおさらなる実施形態において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達される
（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ
８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。In a still further embodiment, a Therapeutic Agent of the invention is delivered by a pump (Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biome).
d. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery.
88: 507 (1980); Saudek et al. Engl. J. Med. 3
21: 574 (1989)).
【０６６４】 他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５
３３（１９９０））による総説において議論される。Other controlled release systems are described in Langer (Science 249: 1527-1515).
33 (1990)).
【０６６５】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、治療剤は、それを所
望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および
濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するもの
と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合すること
により処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および治療剤
に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。For parenteral administration, in one embodiment, generally, the therapeutic agent will be administered to a recipient in a desired degree of purity, in a pharmaceutically acceptable carrier, ie, the dosage and concentration employed. It is formulated by mixing it with non-toxic and compatible with other ingredients of the formulation in a unit dosage injectable form (solution, suspension or emulsion). For example, the formulation is preferably free of oxidizing agents and other compounds known to be harmful to therapeutic agents.
【０６６６】 一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方
と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物
を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より
好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビ
ヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液
が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもま
た、リポソームと同様に本明細書において有用である。Generally, the formulations are prepared by uniformly and intimately contacting the therapeutic agent with a liquid carrier or a finely divided solid carrier or both. Next, if necessary, the product is shaped into the desired formulation. Preferably, the carrier is a parenteral carrier, more preferably a solution that is isotonic with the blood of the recipient. Examples of such carrier vehicles include water, saline, Ringer's solution and dextrose solution. Non-aqueous vehicles such as fixed oils and ethyl oleate are also useful herein, as are liposomes.
【０６６７】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のよう
な抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ
ンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロ
ースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖
類、二糖類、および他の糖質；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまた
はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／
またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活
性剤が挙げられる。The carrier suitably contains minor amounts of additives such as substances that enhance isotonicity and chemical stability. Such substances are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include such substances as phosphate, citrate, succinate, acetic acid and other organic acids or salts thereof. Antioxidants such as ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides (eg, polyarginine or tripeptide); proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; polyvinylpyrrolidone Amino acids such as glycine, glutamic acid, aspartic acid or arginine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including cellulose or derivatives thereof, glucose, mannose or dextrin; chelates such as EDTA Agent: sugar alcohol such as mannitol or sorbitol ; Counterions such as sodium; and /
Or a non-ionic surfactant such as polysorbate, poloxamer or PEG.
【０６６８】 治療剤は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１
〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方さ
れる。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポ
リペプチド塩が形成されることが理解される。Therapeutic agents will typically comprise from about 0.1 mg / ml to 100 mg / ml, preferably 1 mg / ml to 100 mg / ml.
Formulated in such vehicles at a concentration of 〜１０10 mg / ml and a pH of about 3-8. It is understood that the use of the particular excipients, carriers or stabilizers described above results in the formation of polypeptide salts.
【０６６９】 治療的投与に用いられる任意の治療剤は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例
えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成さ
れる。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注
射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置され
る。Any therapeutic agent used for therapeutic administration can be sterile. Sterility is readily achieved by filtration through sterile filtration membranes (eg, a 0.2 micron membrane). Generally, the therapeutic agent will be placed in a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.
【０６７０】 治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたは
バイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。
凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ
）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾
燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。Therapeutic agents are typically stored in unit or multi-dose containers, for example, sealed ampules or vials, as an aqueous solution or a lyophilized formulation for reconstitution.
As an example of a lyophilized formulation, sterile filtered 1% (w / v) into 10 ml vials
) Fill 5 ml of aqueous therapeutic solution and freeze-dry the resulting mixture. The lyophilized therapeutic agent is reconstituted with bacteriostatic water for injection to prepare an infusion solution.
【０６７１】 本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を
備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造
、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に
付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政
府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使
用し得る。The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the therapeutic of the present invention. A notice in the form of a government agency that regulates the manufacture, use or sale of pharmaceuticals or biological products may accompany such containers, and may be issued by the government regarding manufacture, use or sale for human administration. Represents institutional approval. In addition, therapeutic agents may be used in combination with other therapeutic compounds.
【０６７２】 本発明の治療剤は、単独で、またはアジュバントと組み合わせて投与され得る
。本発明の治療剤とともに投与され得るアジュバントとしては、以下が挙げられ
るが、それらに限定されない：ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシコール酸
（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２
１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、ならびにＭＰＬ。特定の実施形
態において、本発明の治療剤は、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の特
定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＱＳ２１と組み合わせて投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得るさらなるアジュバントとしては、以下が
挙げられるが、これらに限定されない：モノホスホリル脂質免疫調節剤、Ａｄｊ
ｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム
塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術。本発明の治療剤
とともに投与され得るワクチンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘
、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ、百日咳（ｗ
ｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイル
ス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、灰白髄炎（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂
犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対する防御に指向する
ワクチン。組み合わせは、付随的にか（例えば、混合物として、別々であるが同
時にもしくは並行して）；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは
、組み合わされた薬剤が治療混合物としてともに投与されるプレゼンテーション
（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々である
が同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手
順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物
または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。Therapeutic agents of the invention can be administered alone or in combination with an adjuvant. Adjuvants that can be administered with the therapeutics of the invention include, but are not limited to, alum, alum and deoxycholic acid (ImmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.), QS2.
1 (Genentech, Inc.), BCG, and MPL. In certain embodiments, a Therapeutic of the invention is administered in combination with alum. In another specific embodiment, a Therapeutic Agent of the Invention is administered in combination with QS21. Additional adjuvants that can be administered with the therapeutics of the invention include, but are not limited to: monophosphoryl lipid immunomodulators, Adj
uVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, aluminum salt, MF-59, and Virosomal adjuvant technology. Vaccines that can be administered with the therapeutics of the invention include, but are not limited to: MMR (measles, mumps, rubella), polio, varicella, tetanus / diphtheria, A Hepatitis, hepatitis B, influenza B, pertussis (w
A vaccine directed at protection against hoping cough, pneumonia, influenza, Lyme disease, rotavirus, cholera, yellow fever, Japanese encephalitis, poliomyelitis, rabies, typhoid fever, and pertussis. The combination may be administered either concomitantly (eg, as a mixture, separately but simultaneously or in parallel); or sequentially. This includes a presentation in which the combined agents are administered together as a therapeutic mixture, and the combined agents are administered separately but simultaneously (eg, through separate intravenous lines to the same individual). Procedures are also included. "Combination" administration further includes separately administering one of the compounds or agents given first, followed by the second.
【０６７３】 本発明の治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）は、単独で、または他の治療的薬
剤と組み合わせて投与され得る。本発明の治療剤とともに投与され得る治療的薬
剤としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＮＦファミリーの
他のメンバー、化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗
炎症剤、従来の免疫療法剤、サイトカインならびに／または増殖因子。組み合わ
せは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；ま
たは逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治
療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々
であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与さ
れる手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与
えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。Therapeutic agents (Therapeutic) of the present invention may be administered alone or in combination with other therapeutic agents. Therapeutic agents that can be administered with the therapeutic agents of the present invention include, but are not limited to: other members of the TNF family, chemotherapeutic agents, antibiotics, steroidal and non-steroidal anti-inflammatory agents Conventional immunotherapeutic agents, cytokines and / or growth factors. The combination may be administered, for example, either simultaneously, as a mixture, separately but simultaneously or concurrently; or sequentially. This includes presentations where the combined agents are administered together as a therapeutic mixture, and also procedures where the combined agents are administered separately but simultaneously (eg, through separate intravenous lines to the same individual). Also includes. "Combination" administration further includes separately administering one of the compounds or agents given first, followed by the second.
【０６７４】 １つの実施形態において、本発明の治療剤は、ＴＮＦファミリーのメンバーと
組み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るＴＮＦ分子、Ｔ
ＮＦ関連分子、またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、ＴＮ
Ｆ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−βの状態で
見出された）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４
−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４
３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン（
ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際
公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン（ｎｅｕｔ
ｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および
神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、可溶性形態のＣＤ３０
、可溶性形態のＣＤ２７、可溶性形態のＣＤ４０および可溶性形態の４−ＩＢＢ
、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９
７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国
際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９
４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国
際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２
０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、
ならびに可溶性形態のＣＤ１５４、可溶性形態のＣＤ７０、および可溶性形態の
ＣＤ１５３。In one embodiment, a Therapeutic Agent of the Invention is administered in combination with a member of the TNF family. A TNF molecule, T, which can be administered with a therapeutic of the invention.
NF-related or TNF-like molecules include, but are not limited to: soluble forms of TNF-α, lymphotoxin-α, (LT-α, TN
F-β), LT-β (found in the complex heterotrimer LT-α2-β), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L,
-1BBL, DcR3, OX40L, TNF-γ (International publication number WO96 / 14
328), AIM-I (International Publication Number WO97 / 33899), Endokine (
endokine) -α (International Publication No. WO98 / 07880), TR6 (International Publication No. WO98 / 30694), OPG, and Neutrokine (neut)
rokine) -α (International Publication No. WO 98/18921), OX40, and nerve growth factor (NGF), and soluble form of Fas, soluble form of CD30
, Soluble form of CD27, soluble form of CD40 and soluble form of 4-IBB
, TR2 (International Publication Number WO96 / 34095), DR3 (International Publication Number WO9
7/33904), DR4 (International Publication Number WO98 / 32856), TR5 (International Publication Number WO98 / 30693), TR6 (International Publication Number WO98 / 3069).
4), TR7 (International Publication No. WO98 / 41629), TRANK, TR9 (International Publication No. WO98 / 56892), TR10 (International Publication No. WO98 / 542)
02), 312C2 (WO 98/06842) and TR12,
And soluble forms of CD154, soluble forms of CD70, and soluble forms of CD153.
【０６７５】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤および／またはプロ
テアーゼインヒビターと組み合わせて投与される。本発明の治療剤と組み合わせ
て投与され得るヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥ
ＺTM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲ
ＩＴTM（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブジン／３ＴＣ）、およ
びＣＯＭＢＩＶＩＲTM（ジドブジン／ラミブジン）。本発明の治療剤と組み合わ
せて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤としては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩ
ＰＴＯＲTM（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡTM（エファビレンツ）。本
発明の治療剤と組み合わせて投与され得るプロテアーゼインヒビターとしては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮTM（インディナ
ビル）、ＮＯＲＶＩＲTM（リトナビル）、ＩＮＶＩＲＡＳＥTM（サキナビル））
、およびＶＩＲＡＣＥＰＴTM（ネルフィナビル）。特定の実施形態において、抗
レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵
素阻害剤、および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳを処置するた
め、および／またはＨＩＶ感染を予防もしくは処置するために、本発明の治療剤
との任意の組み合わせで使用され得る。In certain embodiments, a Therapeutic Agent of the invention is administered in combination with an antiretroviral agent, a nucleoside reverse transcriptase inhibitor, a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor and / or a protease inhibitor. Nucleoside reverse transcriptase inhibitors that can be administered in combination with the therapeutic agents of the invention include the following,
Not limited to: RETROVIR ™ (Zidovudine / AZT), VIDE
Z ™ (didanocine / ddI), HIVID ™ (zarcitabine / ddC), ZER
IT ™ (stavudine / d4T), EPIVIR ™ (lamivudine / 3TC), and COMBIVIR ™ (zidovudine / lamivudine). Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors that may be administered in combination with the therapeutic agents of the present invention include, but are not limited to: VIRAMUNE ™ (nevirapine), RESCRI
PTOR ™ (delavirdine) and SUSTIVA ™ (efavirenz). Protease inhibitors that can be administered in combination with the therapeutic agents of the present invention include:
Examples include, but are not limited to: CRIXIVAN ™ (indinavir), NORVIR ™ (ritonavir), INVIRASE ™ (saquinavir)
And VIRACEPT ™ (Nelfinavir). In certain embodiments, the antiretroviral agent, nucleoside reverse transcriptase inhibitor, non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor, and / or protease inhibitor is for treating AIDS and / or preventing or treating HIV infection. In addition, it can be used in any combination with the therapeutic agent of the present invention.
【０６７６】 他の実施形態において、本発明の治療剤は、抗日和見感染症薬剤と組み合わせ
て投与され得る。本発明の治療剤と組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬
剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰ
ＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡ
ＭＩＤＩＮＥTM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭ
ＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTM、ＲＩＦＡＢ
ＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、
ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲTM、Ｆ
ＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯ
ＬＥTM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTM、ＰＹＲＩＭＥＴＨ
ＡＭＩＮＥTM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTM、ＮＥＵＰＯＧＥＮTM（フィルグラスチ
ム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥTM（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａ
ｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ）。特定の実施形態において、本発明の治療剤は
、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置ま
たは予防するために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺ
ＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、および／またはＡＴ
ＯＶＡＱＵＯＮＥTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態に
おいて、本発明の治療剤は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ複
合感染を予防的に処置または予防するために、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡ
ＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯ
ＬTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明
の治療剤は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感
染を予防的に処置または予防するために、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴ
ＨＲＯＭＹＣＩＮTM、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTMとの任意の組
み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和
見サイトメガロウイルス感染を予防的に処置または予防するために、ＧＡＮＣＩ
ＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲTM との任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治
療剤は、日和見真菌感染を予防的に処置または予防するために、ＦＬＵＣＯＮＡ
ＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺ
ＯＬＥTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本
発明の治療剤は、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型感染を
予防的に処置または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTMおよび／またはＦＡ
ＭＣＩＣＯＬＶＩＲTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態
において、本発明の治療剤は、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ感染
を予防的に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTMおよび／
またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の
実施形態において、本発明の治療剤は、日和見細菌感染を予防的に処置または予
防するために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮTMとの
任意の組み合わせで使用される。In another embodiment, a Therapeutic Agent of the Invention may be administered in combination with an anti-opportunistic infection agent. Anti-opportunistic infection agents that can be administered in combination with the therapeutic agents of the present invention include, but are not limited to: TRIMETHOP
RIM-SULFAMETHOXAZOLE ™ , DAPSON ™ , PENTA
MIDINE ™ , ATOVAQONE ™ , ISONIAZID ™ , RIFAM
PIN TM , PYRAZINAMIDE TM , ETHAMBUTOL TM , RIFAB
UTIN ™ , CLARITROMYCIN ™ , AZITTHROMYCIN ™ ,
GANICLOVIR ™ , FOSCARNET ™ , CIDOFOVIR ™ , F
LUCONAZOLE ™ , ITRACONAZOLE ™ , KETOCONAZO
LE ™ , ACYCLOVIR ™ , FAMCICOLVIR ™ , PYRIMETH
AMINE ™ , LEUCOVORIN ™ , NEUPOGEN ™ (filgrastim / G-CSF), and LEUKINE ™ (sargramostine (sargra)
most) / GM-CSF). In certain embodiments, a therapeutic agent of the invention is used to prevent or prevent an opportunistic Pneumocystis carinii pneumonia infection in TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZ.
OLE ™ , DAPSONE ™ , PENTAMIDINE ™ , and / or AT
Used in any combination with OVAQUAONE ™ . In another specific embodiment, the therapeutic agent of the present invention is administered with ISONIAZID ™ , RIFA to prevent or prevent opportunistic Mycobacterium avium complex infection.
MPIN ™ , PYRAZINAMIDE ™ , and / or ETHAMBUTO
As used in any combination with L TM. In another specific embodiment, the therapeutic agent of the invention is used to prophylactically treat or prevent opportunistic Mycobacterium tuberculosis infection, RIFABUTIN ™ , CLARIT.
As used in any combination with HROMYCIN TM, and / or Azithromycin TM. In another specific embodiment, a Therapeutic of the Invention comprises a GANCI to treat or prevent an opportunistic cytomegalovirus infection prophylactically.
Used in any combination with CLIVIR ™ , FOSCARNET ™ , and / or CIDOFOVIR ™ . In another specific embodiment, the therapeutic agent of the invention is used to prophylactically treat or prevent opportunistic fungal infections.
ZOLE ™ , ITRACONAZOLE ™ , and / or KETOCONAZ
Used in any combination with OLE ™ . In another specific embodiment, the therapeutic agent of the invention comprises ACYCLOVIR ™ and / or FA for the prophylactic treatment or prevention of opportunistic herpes simplex virus type I and / or II infections.
Used in any combination with MCICOLVIR ™ . In another specific embodiment, the therapeutic agent of the present invention comprises PYRIMETHAMINE ™ and / or PYRIMETHAMINE ™ for prophylactically treating or preventing an opportunistic Toxoplasma gondii infection.
Or used in any combination with LEUCOVORIN ™ . In another specific embodiment, the therapeutics of the invention are used in any combination with LEUCOVORIN ™ and / or NEUPOGEN ™ to preventively treat or prevent opportunistic bacterial infections.
【０６７７】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗ウイルス薬剤との組み合わ
せで投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗ウイルス薬剤としては
、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎ
ｔｉｄｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。In a further embodiment, a Therapeutic of the Invention is administered in combination with an antiviral agent. Antiviral agents that can be administered with the therapeutics of the invention include acyclovir, ribavirin, amantadine, and remantidine (remantidine).
tidine), but is not limited thereto.
【０６７８】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗生物質とともに投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得る抗生物質としては、アモキシシリン、β
−ラクタマーゼ、アミノ配糖体、β−ラクタム（グリコペプチド）、β−ラクタ
マーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロ
フロキサシン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン類、
マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル、ペニシリン、キノロン類、リファン
ピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリ
ム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンが挙げら
れるが、これらに限定されない。In a further embodiment, a Therapeutic of the Invention is administered with an antibiotic. Antibiotics that can be administered with the therapeutics of the invention include amoxicillin, β
Lactamase, aminoglycoside, β-lactam (glycopeptide), β-lactamase, clindamycin, chloramphenicol, cephalosporin, ciprofloxacin, ciprofloxacin, erythromycin, fluoroquinolones,
Examples include, but are not limited to, macrolide antibiotics, metronidazole, penicillins, quinolones, rifampin, streptomycin, sulfonamide, tetracycline, trimethoprim, trimethoprim-sulfamethoxazole, and vancomycin.
【０６７９】 本発明の治療剤とともに投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては、ス
テロイド類、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドメ
チルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオ
キシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答Ｔ
細胞の機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが、こ
れらに限定されない。Conventional non-specific immunosuppressants that can be administered with the therapeutic agents of the present invention include steroids, cyclosporin, cyclosporin analogs, cyclophosphamide methylprednisone, prednisone, azathioprine, FK-506, 15-deoxyspell Guarin (15-deoxyspergualin), and response T
Examples include, but are not limited to, other immunosuppressants that act by inhibiting the function of cells.
【０６８０】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、免疫抑制剤と組み合わせて投与
される。本発明の治療剤と共に投与され得る免疫抑制剤調製物としては、ＯＲＴ
ＨＯＣＬＯＮＥTM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／ＮＥＯＲＡＬTM／Ｓ
ＡＮＧＤＹＡTM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦTM（タクロリムス）、ＣＥ
ＬＬＣＥＰＴTM（ミコフェノール酸塩）、アザチオプリン、グルコルチコステロ
イド類（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥTM （シロリムス）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態におい
て、免疫抑制剤は、器官または骨髄の移植の拒絶を予防するために使用され得る
。In certain embodiments, a Therapeutic Agent of the Invention is administered in combination with an immunosuppressant. Immunosuppressant preparations that can be administered with the therapeutics of the invention include ORT
HOCLONE TM (OKT3), SANDIMMUNE TM / NEORAL TM / S
ANGDYA ™ (cyclosporine), PROGRAF ™ (tacrolimus), CE
Examples include, but are not limited to, LLCEPT ™ (mycophenolate), azathioprine, glucocorticosteroids, and RAPAMUNE ™ (sirolimus). In certain embodiments, immunosuppressive agents can be used to prevent rejection of organ or bone marrow transplants.
【０６８１】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独でかまたは１以上の静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の治療剤と組み合わ
せて投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶ
ＥＥＧＡＭTM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／ＤTM およびＧＡＭＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施
形態において、本発明の治療剤は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。In a further embodiment, a Therapeutic Agent of the Invention is administered alone or in combination with one or more intravenous immunoglobulin preparations. Intravenous immunoglobulin preparations that can be administered in combination with the therapeutic agents of the present invention include GAMMER ™ , IV
Examples include, but are not limited to, EEGAM ™ , SANDOGLOBULIN ™ , GAMMAGARD S / D ™ and GAMIMUNE ™ . In certain embodiments, a Therapeutic of the invention is administered in combination with an intravenous immunoglobulin preparation in transplantation therapy (eg, bone marrow transplantation).
【０６８２】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。In a further embodiment, a Therapeutic of the Invention is administered alone or in combination with an anti-inflammatory agent. Anti-inflammatory agents that can be administered with the therapeutic agents of the present invention include glucocorticoid and non-steroidal anti-inflammatory agents, aminoaryl carboxylic acid derivatives, aryl acetic acid derivatives, aryl butyric acid derivatives, aryl carboxylic acids, aryl propionic acid derivatives, pyrazoles, Pyrazolones, salicylic acid derivatives, thiazinecarboxamides, e-acetamidocaproic acid, S-adenosylmethionine, 3-amino-4-hydroxybutyric acid, amixetrine
e), bendazac, benzidamine, bucolome, difenpyramide, ditazole, emorfazone, guaiazulene, nabumetone, nimesulide, orgothein, oxaseprol, paranyline, perisoxal,
Pifoxime, procazone, proxazole, and tenidap,
It is not limited to these.
【０６８３】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の治療剤とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。[0684] In another embodiment, a composition of the present invention is administered in combination with a chemotherapeutic agent. Chemotherapeutic agents that can be administered with the therapeutic agents of the invention include antibiotic derivatives (eg, doxorubicin, bleomycin, daunorubicin, and dactinomycin); anti-estrogens (eg, tamoxifen); antimetabolites (eg, fluorouracil, 5 -FU, methotrexate, floxuridine, interferon α-2b, glutamic acid, plicamycin
, Mercaptopurine, and 6-thioguanine); cytotoxic agents (eg, carmustine, BCNU, lomustine, CCNU, cytosine arabinoside, cyclophosphamide, estramustine, hydroxyurea, procarbazine, mitomycin, busulfan, cis-platin) And vincristine sulfate); hormones (eg, medroxyprogesterone, estramustine sodium phosphate, ethinyl estradiol, estradiol, megestrol acetate, methyltestosterone, diethylstilbestrol diphosphate, chlorotrianisene, and test lactone); Nitrogen mustard derivatives (eg, mephalen, chlorambucil, mechlorethamine (ni Roger emissions mustard) and thiotepa); steroids and combinations (e.g., betamethasone sodium); and others (
Examples include, but are not limited to, dicarbazine, asparaginase, mitotene, vincristine sulfate, vinblastine sulfate, and etoposide.
【０６８４】 特定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミ
ド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて投
与されるか、ＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせで投与される。別の実施形態に
おいて、本発明の治療剤は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さ
らなる実施形態において、本発明の治療剤は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰ
と共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせと共
に投与される。In certain embodiments, a Therapeutic Agent of the Invention is administered in combination with CHOP (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone) or in any combination of the components of CHOP. In another embodiment, a Therapeutic Agent of the Invention is administered in combination with Rituximab. In a further embodiment, the therapeutic of the invention comprises Rituxmab and CHOP
Or with any combination of components of Rituxmab and CHOP.
【０６８５】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ
２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３
、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられ
るが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明の治療剤は、任意
のインターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４
、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１
１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１
７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２１を含むが、これらに
限定されない）と共に投与され得る。[0686] In a further embodiment, a Therapeutic Agent of the Invention is administered in combination with a cytokine. Cytokines that can be administered with the therapeutic agents of the present invention include IL
2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13
, IL15, anti-CD40, CD40L, IFN-γ and TNF-α. In another embodiment, the therapeutic agent of the present invention may comprise any interleukin (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4
, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-1
1, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-1
7, including, but not limited to, IL-18, IL-19, IL-20 and IL-21).
【０６８６】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、脈管形成タンパク質と組み合
わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る脈管形成タンパク質と
しては、欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム由来増
殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小
板由来増殖因子Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３１７に開示さ
れるような血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０
６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇ
ｏｒｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるよ
うな胎盤増殖因子２（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に
開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４
７７に開示されるような血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号Ｗ
Ｏ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子２（ＶＥＧＦ−２）
；血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号
に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際
公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥ
ＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮
増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許番号ＤＥ１９６３９６０１に
開示されるような血管内皮増殖因子Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これら
に限定されない。上記の参考文献は、本明細書で参考として援用される。[0686] In a further embodiment, a Therapeutic of the Invention is administered in combination with an angiogenic protein. Angiogenic proteins that can be administered with the therapeutic agents of the invention include glioma-derived growth factor (GDGF) as disclosed in European Patent No. EP-399816; platelet-derived as disclosed in European Patent No. EP-682110. Growth Factor A (PDGF-A); Platelet-Derived Growth Factor B (PDGF-B) as disclosed in European Patent No. EP-282317; International Publication No. WO 92/0
Placental Growth Factor (PIGF) as disclosed in US Pat.
Orthh Factors, 4: 259-268 (1993); placental growth factor 2 (PIGF-2); vascular endothelial growth factor (VEGF) as disclosed in International Publication No. WO 90/13649; European Patent No.EP-5064
Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) as disclosed in International Publication No. W;
Vascular endothelial growth factor 2 (VEGF-2) as disclosed in O96 / 39515
Vascular endothelial growth factor B (VEGF-3); vascular endothelial growth factor B-186 (VEGF-B186) as disclosed in International Publication No. WO 96/26736; as disclosed in International Publication No. WO 98/02543. Vascular endothelial growth factor D (VE
GF-D); vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) as disclosed in International Publication No. WO 98/07732; and vascular endothelial growth factor E (VEGF-E) as disclosed in German Patent No. DE19639601. ), But is not limited thereto. The above references are incorporated herein by reference.
【０６８７】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、造血増殖因子と組み合わせて
投与される。本発明の治療剤と共に投与され得る造血増殖因子としては、ＬＥＵ
ＫＩＮＥTM（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭTM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮTM（ＦＩＬ
ＧＲＡＳＴＩＭTM）が挙げられるが、これらに限定されない。In a further embodiment, a Therapeutic of the Invention is administered in combination with a hematopoietic growth factor. Hematopoietic growth factors that can be administered with the therapeutic agents of the present invention include LEU
KINE ™ (SARGRAMOSTIM ™ ) and NEUPOGEN ™ (FIL
GRASTIM ™ ), but is not limited thereto.
【０６８８】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、線維芽細胞増殖因子と組み合
わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。In a further embodiment, a Therapeutic of the Invention is administered in combination with a fibroblast growth factor. Examples of fibroblast growth factors that can be administered with the therapeutic agent of the present invention include FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, and FG.
F-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11,
Examples include, but are not limited to, FGF-12, FGF-13, FGF-14, and FGF-15.
【０６８９】 さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。In a further embodiment, a Therapeutic Agent of the Invention is administered in combination with another treatment or prophylactic regime (eg, radiation therapy).
【０６９０】 （実施例２２：ガレクチン１１のレベル低下を処置する方法） 本発明は、体内における本発明のポリペプチドのレベルを増大させる必要のあ
る個体を処置するための方法に関し、この方法は、治療有効量の本発明のアゴニ
スト（本発明のポリペプチドを含む）を含む組成物をそのような個体に投与する
工程を包含する。さらに、個体における本発明のガレクチン１１の標準の発現レ
ベルまたは正常発現レベルの低下により引き起こされる状態は、本発明のガレク
チン１１を投与することにより処置し得ることが理解される。従って、本発明は
また、このガレクチン１１ポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法
を提供する。この方法は、このような個体に、このような個体でこのガレクチン
１１の活性レベルを増加させる量のガレクチン１１を含む治療剤を投与する工程
を包含する。Example 22 Method of Treating a Decreased Level of Galectin 11 The present invention relates to a method for treating an individual in need of increasing the level of a polypeptide of the present invention in the body, the method comprising: Administering to such an individual a composition comprising a therapeutically effective amount of an agonist of the present invention (including a polypeptide of the present invention). It is further understood that conditions caused by reduced levels of normal or normal expression of galectin 11 of the present invention in an individual can be treated by administering galectin 11 of the present invention. Accordingly, the present invention also provides a method of treating an individual in need of increasing levels of this galectin-11 polypeptide. The method includes administering to such an individual an amount of a galectin-11-containing therapeutic agent that increases the galectin-11 activity level in such individual.
【０６９１】 例えば、ガレクチン１１ポリペプチドのレベルが低下した患者は、そのポリペ
プチドを、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。投与およ
び処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、実施例１３に提供されている。For example, a patient with reduced levels of galectin-11 polypeptide will take the polypeptide at a daily dose of 0.1-100 μg / kg for six consecutive days. The exact details of the dosing regimen based on administration and formulation are provided in Example 13.
【０６９２】 （実施例２３：ガレクチン１１のレベル上昇を処置する方法） 本発明はまた、体内における本発明のポリペプチドのレベルを減少させる必要
のある個体を処置するための方法に関し、この方法は、治療有効量の本発明のア
ンタゴニスト（本発明のポリペプチドおよび抗体を含む）を含む組成物をそのよ
うな個体に投与する工程を包含する。Example 23 Method of Treating Elevated Galectin 11 Levels The present invention also relates to a method for treating an individual in need of reducing the level of a polypeptide of the invention in the body, the method comprising: Administering to such an individual a composition comprising a therapeutically effective amount of an antagonist of the invention (including a polypeptide and an antibody of the invention).
【０６９３】 １つの例において、アンチセンス技術を使用して本発明のガレクチン１１の産
生を阻害する。この技術は、ガンのような様々な病因に起因するガレクチン１１
のレベルを低下させる方法の１つの例である。In one example, antisense technology is used to inhibit the production of galectin 11 of the present invention. This technique uses galectin 11 from various etiologies such as cancer.
Is an example of a method for lowering the level of.
【０６９４】 例えば、ガレクチン１１のレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アン
チセンスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍ
ｇ／ｋｇ／日で２１日間、静脈内投与する。この処置に対して十分に寛容化され
た場合は、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。このアンチセンスポリ
ヌクレオチドの処方は、実施例２０に提供されている。For example, patients diagnosed with abnormally elevated levels of galectin-11 can receive antisense polynucleotides at 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 and 3.0 m.
It is administered intravenously at g / kg / day for 21 days. If the treatment is well tolerated, the treatment is repeated after a 7 day washout period. The formulation of this antisense polynucleotide is provided in Example 20.
【０６９５】 （実施例２４：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、ガレクチン１１ポリペプチドを発現し得る線維芽
細胞を患者に移植する。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得ら
れる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。組織の小塊を
組織培養フラスコの湿潤表面に置き、約１０片を各フラスコに置く。このフラス
コを倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フ
ラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして新鮮な
培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する
ＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間インキュ
ベートする。Example 24 Treatment Methods Using Gene Therapy-Ex Vivo One method of gene therapy transplants fibroblasts capable of expressing a galectin-11 polypeptide into a patient. Generally, fibroblasts are obtained from a subject by skin biopsy. The resulting tissue is placed in a tissue culture medium and divided into small pieces. A small chunk of tissue is placed on the wet surface of a tissue culture flask and approximately 10 pieces are placed in each flask. The flask is inverted, closed tightly, and left overnight at room temperature. After 24 hours at room temperature, the flask is inverted, the tissue mass remains fixed at the bottom of the flask, and fresh medium (eg, Ham's F12 medium containing 10% FBS, penicillin and streptomycin) is added. The flask is then incubated at 37 ° C. for about one week.
【０６９６】 この時点で、新鮮な培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週
間培養した後に、単層の線維芽細胞が出現する。この単層をトリプシン処理し、
さらに大きなフラスコにスケールアップする。At this point, fresh medium is added and then changed every few days. After another two weeks of culture, a monolayer of fibroblasts appears. This monolayer is trypsinized,
Scale up to a larger flask.
【０６９７】 モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃ
ｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。
線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズを使用して精製
する。PMV-7 (Kirsc) flanked by Moloney murine sarcoma virus long terminal repeats
hmeier, P .; T. Et al., DNA, 7: 219-25 (1988)).
After digestion with RI and HindIII, it is treated with calf intestinal phosphatase.
The linear vector is fractionated on an agarose gel and purified using glass beads.
【０６９８】 本発明のガレクチン１１をコードするｃＤＮＡを、必要な場合、ＰＣＲプライ
マーを用いそして適切な制限部位および開始／終止コドンを有する、実施例１に
記載のそれぞれ５’ 末端配列および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマー
を使用して増幅し得る。好ましくは、この５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含
み、そしてこの３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、モロニー
マウス肉腫ウイルスの線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合
物を、この２つのフラグメントを連結するのに適した条件下で維持する。次に、
連結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する。次に、それを、カナマイ
シンを含む寒天上にプレーティングし、ベクターが正確に挿入されたガレクチン
１１を有することを確認する。The cDNA encoding galectin 11 of the present invention was ligated to the 5 ′ and 3 ′ end sequences as described in Example 1, respectively, using PCR primers and having appropriate restriction sites and start / stop codons. It can be amplified using PCR primers corresponding to the sequence. Preferably, the 5 'primer contains an EcoRI site and the 3' primer contains a HindIII site. Equal amounts of Moloney murine sarcoma virus linear skeleton and amplified EcoRI and HindIII
The fragments are added together in the presence of T4 DNA ligase. The resulting mixture is maintained under conditions suitable for joining the two fragments. next,
The ligation mixture is used to transform bacteria HB101. It is then plated on agar containing kanamycin to confirm that the vector has correctly inserted galectin-11.
【０６９９】 アンホトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１
０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッ
コ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな密度まで増殖
させる。次に、そのガレクチン１１を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そして
パッケージング細胞をこのベクターで形質導入する。このとき、このパッケージ
ング細胞は、そのガレクチン１１遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（
ここで、このパッケージング細胞をプロデューサー細胞という）。[0699] Amphotropic pA317 or GP + am12 packaging cells were
Grow to confluent density in tissue culture in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing 0% calf serum (CS), penicillin and streptomycin. Next, the MSV vector containing the galectin 11 is added to the medium and the packaging cells are transduced with the vector. At this time, the packaging cells produce infectious virus particles containing the galectin 11 gene (
Here, this packaging cell is called a producer cell).
【０７００】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮な培地を添加し、次いでこの培地を
１０ｃｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性
ウイルス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、は
がれたプロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感
染させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そし
てプロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そ
して新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線
維芽細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまた
はｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用すること
が必要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、その線維芽細胞を分
析し、ガレクチン１１が産生されているか否かを決定する。[0700] Fresh media is added to the transduced producer cells, and the media is then harvested from 10 cm plates of confluent producer cells. The used medium containing the infectious virus particles is filtered through a Millipore filter to remove the detached producer cells before using this medium to infect fibroblasts. Remove the medium from the subconfluent plate of fibroblasts and immediately replace with the medium from the producer cells. Remove this medium and replace with fresh medium. If the titer of the virus is high, virtually all fibroblasts will be infected and no selection is necessary. If the titer is very low, it is necessary to use a retroviral vector with a selectable marker such as neo or his. Once the fibroblasts have been efficiently infected, the fibroblasts are analyzed to determine if galectin 11 is being produced.
【０７０１】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する
。The engineered fibroblasts are then implanted into a host, either alone or after being grown to confluence on cytodex 3 microcarrier beads.
【０７０２】 （実施例２５：内因性ガレクチン１１遺伝子を使用する遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、本発明の内因性ガレクチン１１配列を
、例えば、米国特許番号５，６４１，６７０（１９９７年６月２４日発行）；国
際公開番号ＷＯ ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公開番
号ＷＯ ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１９
８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（
１９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能に
結合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞
中では発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子
の活性化を包含する。Example 25 Gene Therapy Using Endogenous Galectin-11 Gene Another method of gene therapy according to the present invention uses the endogenous galectin-11 sequence of the present invention, for example, in US Pat. No. 5,641,670. (Issued June 24, 1997); International Publication No. WO 96/29411 (published September 26, 1996); International Publication No. WO 94/12650 (published August 4, 1994); Koller et al., Pr.
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8932-8935 (19
89); and Zijlstra et al., Nature, 342: 435-438 (
1989) operably linked to a promoter via homologous recombination. The method involves the activation of a gene that is present in the target cell, but is not expressed or expressed at a lower level than desired in the cell.
【０７０３】 プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。こ
の標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ガレクチン１１配列の５’非コ
ード配列に相同である。この標的化配列は、このガレクチン１１配列の５’末端
に十分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配
列に作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを使
用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端および
３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’
末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第
２の標的化配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限部位
を含む。A polynucleotide construct comprising a promoter and a targeting sequence is generated. This target sequence is homologous to the 5 'non-coding sequence of the endogenous galectin 11 sequence, adjacent to the promoter. The targeting sequence is sufficiently close to the 5 'end of the galectin-11 sequence so that the promoter is operably linked to the endogenous sequence during homologous recombination. The promoter and targeting sequence can be amplified using PCR. Preferably, the amplified promoter contains different restriction sites on the 5 'and 3' ends. Preferably, 3 ′ of the first targeting sequence
The ends contain the same restriction sites as the 5 'end of the amplified promoter, and the 5' ends of the second targeting sequence contain the same restriction sites as the 3 'end of the amplified promoter.
【０７０４】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混
合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築
物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール
沈殿により精製する。The amplified promoter and the amplified targeting sequence are digested with appropriate restriction enzymes and subsequently treated with bovine intestinal phosphatase. The digested promoter and the digested targeting sequence are added together in the presence of T4 DNA ligase. The resulting mixture is maintained under conditions appropriate for ligation of these two fragments. The construct is size fractionated on an agarose gel and then purified by phenol extraction and ethanol precipitation.
【０７０５】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方
法は、当該分野で公知である。In this example, the polynucleotide construct is administered as a naked polynucleotide via electroporation. However, the polynucleotide construct can also be administered with a transfection facilitating agent (eg, liposomes, viral sequences, viral particles, precipitants, etc.). Such methods of delivery are known in the art.
【０７０６】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが生じて、このプロモータ
ーがこの内因性ガレクチン１１配列に作動可能に連結される。これは、この細胞
中におけるこのガレクチン１１の発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当
該分野で公知の他の任意の方法により、検出され得る。[0706] Once the cells are transfected, homologous recombination occurs and the promoter is operably linked to the endogenous galectin-11 sequence. This results in expression of the galectin-11 in the cell. Expression can be detected by immunological staining or any other method known in the art.
【０７０７】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％ウシ胎仔血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この
細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミ
ン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細
胞懸濁物は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸
濁直後に実施すべきである。[0707] Fibroblasts are obtained from a subject by skin biopsy. The obtained tissue was used for DMEM +
Place in 10% fetal calf serum. Fibroblasts in the logarithmic or early stationary phase are trypsinized and rinsed with nutrient media from the surface of the plastic. An aliquot of the cell suspension is removed for counting and the remaining cells are subjected to centrifugation. The supernatant is aspirated and the pellet is washed with 5 ml of electroporation buffer (20 mM HEPES pH 7.3, 137 mM NaCl, 5 mM K
(Cl, 0.7 mM Na 2 HPO 4 , 6 mM dextrose). The cells are recentrifuged, the supernatant is aspirated, and the cells are resuspended in electroporation buffer containing 1 mg / ml acetylated bovine serum albumin. This final cell suspension contains about 3 × 10 6 cells / ml. Electroporation should be performed immediately after resuspension.
【０７０８】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、本発明のポリヌ
クレオチドに対応する遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために
、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ
）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部
位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つのガレ
クチン１１非コード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方の非コード配列（フラ
グメント１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａＩ部位
を備えて増幅する；他方のガレクチン１１非コード配列（フラグメント２）を、
５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えて増幅す
る。このＣＭＶプロモーターおよびガレクチン１１フラグメント（１および２）
を、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；ガレクチン
１１フラグメント１−ＸｂａＩ；ガレクチン１１フラグメント２−ＢａｍＨＩ）
で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し
、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。[0708] Plasmid DNA is prepared according to standard techniques. For example, to construct a plasmid for targeting to a locus corresponding to a polynucleotide of the present invention, plasmid pUC18 (MBI Fermentas, Amherst, NY
) Is digested with HindIII. The CMV promoter is amplified by PCR with an XbaI site at the 5 'end and a BamHI site at the 3' end. Two galectin-11 non-coding sequences are amplified via PCR: one non-coding sequence (fragment 1) is amplified with a HindIII site at the 5 'end and an XbaI site at the 3'end; The coding sequence (fragment 2)
Amplification is provided with a BamHI site at the 5 'end and a HindIII site at the 3' end. This CMV promoter and galectin 11 fragment (1 and 2)
With the appropriate enzymes (CMV promoter-XbaI and BamHI; galectin 11 fragment 1-XbaI; galectin 11 fragment 2-BamHI)
And ligate together. The resulting ligation product is digested with HindIII and ligated with the HindIII digested pUC18 plasmid.
【０７０９】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合が劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２
０ｍＳｅｃが観察されるはずである。The plasmid DNA was placed in a sterile cuvette with a 0.4 cm electrode gap (B
io-Rad). The final DNA concentration is generally at least 120μ
g / ml. Then 0.5 ml of the cell suspension (containing about 1.5 × 10 6 cells) is added to the cuvette and the cell suspension and DNA solution are mixed gently. Electroporation is performed using a Gene-Pulser device (Bio-Rad). The capacitance and voltage are set to 960 μF and 250-300 V, respectively. Increasing the voltage decreases cell viability, but dramatically increases the percentage of viable cells that stably integrate the introduced DNA into their genome. Given these parameters, a pulse time of about 14 to 2
0 mSec should be observed.
【０７１０】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。容量および電圧を、それぞれ、９６０μ
Ｆおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生存が減少す
るが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割合が劇的に
増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２０ｍＳｅｃ
が観察されるはずである。The plasmid DNA was placed in a sterile cuvette with a 0.4 cm electrode gap (B
io-Rad). The final DNA concentration is generally at least 120μ
g / ml. Then 0.5 ml of the cell suspension (containing about 1.5 × 10 6 cells) is added to the cuvette and the cell suspension and DNA solution are mixed gently. Electroporation is performed using a Gene-Pulser device (Bio-Rad). The capacitance and the voltage are respectively 960 μm
F and 250-300V. Increasing the voltage decreases cell viability, but dramatically increases the percentage of viable cells that stably integrate the introduced DNA into their genome. Given these parameters, a pulse time of about 14-20 mSec
Should be observed.
【０７１１】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。The electroporated cells are maintained at room temperature for about 5 minutes, then the contents of the cuvette are gently removed using a sterile transfer pipette. The cells were placed in a pre-warmed nutrient medium (D with 15% bovine serum) in a 10 cm dish.
(MEM) add directly to 10 ml and incubate at 37 ° C. The next day, the medium was aspirated and replaced with 10 ml of fresh medium and an additional 16-24
Incubate for hours.
【０７１２】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいず
れかで、注入する。ここで、この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次
いで、この線維芽細胞を、上記のような患者に導入し得る。The engineered fibroblasts are then injected into the host, either alone or after being grown to confluence on cytodex 3 microcarrier beads. Here, the fibroblasts produce a protein product. The fibroblasts can then be introduced into a patient as described above.
【０７１３】 （実施例２６：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、ガレクチン１１ポリペ
プチドの発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）ガレクチン１１配列の導入に関す
る。ガレクチン１１ポリヌクレオチドは、プロモーター、または標的組織による
ガレクチン１１ポリペプチドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作
動可能に連結され得る。このような遺伝子治療および送達の技術および方法は、
当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９
；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号
；Ｔａｂａｔａら、（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：
４７０−４７９；Ｃｈａｏ Ｊら、（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．
３５（６）：５１７−５２２；ＷｏｌｆＪ．Ａ．、（１９９７）Ｎｅｕｒｏｍｕ
ｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８、Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ．
ら、（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３（５）：４０５−４１１；Ｔｓｕｒ
ｕｍｉ Ｙら、（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２８１
−３２９０（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。Example 26: Methods of Treatment Using Gene Therapy-In Vivo Another aspect of the invention is the use of in vivo gene therapy methods to treat disorders, diseases, and conditions. This gene therapy method involves the use of naked nucleic acids (DNA, RN) in animals to increase or decrease galectin-11 polypeptide expression.
A, and antisense DNA or RNA). The galectin-11 polynucleotide can be operably linked to a promoter or any other genetic element required for expression of the galectin-11 polypeptide by the target tissue. Techniques and methods for such gene therapy and delivery include:
Known in the art, for example, WO 90/11092, WO 98/11779.
U.S. Patent Nos. 5,693,622; 5,705,151; 5,580,859; Tabata et al., (1997) Cardiovasc. Res. 35 (3):
470-479; Chao J et al., (1997) Pharmacol. Res.
35 (6): 517-522; WolfJ. A. , (1997) Neuromu
scul. Disord. 7 (5): 314-318, Schwartz B.R.
Et al. (1996) Gene Ther. 3 (5): 405-411; Tsur
Umi Y et al. (1996) Circulation 94 (12): 3281.
See -3290 (hereby incorporated by reference).
【０７１４】 ガレクチン１１ポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送
達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間
隙空間への注入）によって送達され得る。ガレクチン１１ポリヌクレオチド構築
物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。[0714] Galectin-11 polynucleotide constructs can be produced by any method that delivers an injectable substance to the cells of an animal, such as injection into the interstitial space of tissue (heart, muscle, skin, lung, liver, intestine, etc.). Can be delivered. Galectin-11 polynucleotide constructs can be delivered in a pharmaceutically acceptable liquid or aqueous carrier.
【０７１５】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、ガレクチン１１ポリヌクレオチドはまた、当
業者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎ
ｅｒ Ｐ．Ｌ．ら、（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１
２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら、（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ ８５（１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。The term “naked” polynucleotide, DNA or RNA, refers to any delivery vehicle (viral sequence, viral particle, liposome formulation, lipofectin, or lipoprotein) that acts to assist, facilitate, or facilitate entry into cells. (Including a precipitant and the like). However, galectin-11 polynucleotides can also be prepared in liposome formulations (eg, Felgn), which can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
er P.R. L. Et al. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772: 1
26-139 and Abdallah B.A. Et al. (1995) Biol. Cel
185 (1): 1-7).
【０７１６】 この遺伝子治療方法において使用されるガレクチン１１ポリヌクレオチドベク
ター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列
も含まない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡ
の発現を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核
酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレ
オチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導
入されて、６ヶ月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ること
が示された。The galectin-11 polynucleotide vector construct used in the gene therapy method is preferably a construct that is not integrated into the host genome and does not contain sequences that allow it to replicate. Any strong promoter known to those of skill in the art
Can be used to drive the expression of Unlike other gene therapy techniques, one major advantage of introducing a naked nucleic acid sequence into a target cell is the transient nature of polynucleotide synthesis in that cell. Studies have shown that non-replicating DNA sequences can be introduced into cells to provide production of the desired polypeptide for a period of up to six months.
【０７１７】 このガレクチン１１ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、
脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓
、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を
包含する）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、ムコ
多糖基質（器官組織の細網線維、血管または腔（ｃｈａｍｂｅｒ）の壁における
弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維間にある）、あるいは結合組織鞘性筋肉
細胞内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿お
よびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙
空間への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細
胞を含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは
、分化した持続性の非***細胞に送達され、そしてその細胞において発現される
が、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば
、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋
肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能力において
、特に適格である。This galectin-11 polynucleotide construct can be used in tissues (muscle, skin,
Brain, lung, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach, intestine, testis, ovary, uterus, rectum, nervous system, eyes, glands, and connective tissue To the interstitial space of the patient). The interstitial space of this tissue may be intercellular fluid, mucopolysaccharide matrix (reticulum fibers of organ tissue, elastic fibers in the walls of blood vessels or chambers, collagen fibers of fibrous tissue), or connective tissue sheath Includes the same matrix in muscle cells or in bone hiatus. This is also the space occupied by the circulating plasma and the lymph of the lymph channels. Delivery of muscle tissue to the interstitial space is preferred for reasons discussed below. They can be conveniently delivered by injection into the tissue containing these cells. They are preferably delivered to and expressed in differentiated, persistent, non-dividing cells, but are delivered and expressed in non-differentiated cells or in fully differentiated cells (eg, blood stem cells). Or dermal fibroblasts). In vivo, muscle cells are particularly competent in their ability to take up and express polynucleotides.
【０７１８】 裸のガレクチン１１ポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有
効投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。
好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであ
り、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。
もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変
化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得
、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組
織の間隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路もま
た用いられ得、これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉、または鼻の
粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のガレ
クチン１１ポリヌクレオチド構築物が、血管形成術の間に、この手順において用
いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。For naked Galectin-11 polynucleotide injection, effective dosages of DNA or RNA range from about 0.05 g / kg to about 50 mg / kg body weight.
Preferably, the dosage will be from about 0.005 mg / kg to about 20 mg / kg, and more preferably, from about 0.05 mg / kg to about 5 mg / kg.
Of course, as the skilled artisan will appreciate, this dosage will vary according to the tissue site of the injection. Appropriate and effective dosages of nucleic acid sequences can be readily determined by one skilled in the art, and will depend on the condition being treated and the route of administration. The preferred route of administration is by parenteral injection into the interstitial space of the tissue. However, other parenteral routes may also be used, including, for example, inhalation of an aerosol formulation, particularly for delivery to lung or bronchial tissue, the throat, or the mucous membrane of the nose. In addition, naked galectin-11 polynucleotide constructs can be delivered to arteries during angioplasty by the catheter used in this procedure.
【０７１９】 インビボでの筋肉における注入ガレクチン１１ポリヌクレオチドの用量応答効
果を、以下のようにして決定する。ガレクチン１１ポリペプチドをコードするｍ
ＲＮＡの生成のための適切なガレクチン１１鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮ
Ａ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれかであ
り得る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかの
いずれかである。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する
。The dose response effect of injected Galectin-11 polynucleotide in muscle in vivo is determined as follows. M encoding galectin 11 polypeptide
Suitable galectin-11 template DNA for RNA production was prepared using standard recombinant DN
Prepared according to A methodology. The template DNA, which can be either circular or linear, is either used as naked DNA or complexed with liposomes. The quadriceps of the mouse are then injected with various amounts of template DNA.
【０７２０】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。ガレクチン１１鋳型ＤＮＡを、０
．１ｍｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわ
たって、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの
深さで注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上に配置し、そし
てその皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。[0720] Female and male Balb / C mice, 5-6 weeks of age, were given 0.3 ml of 2.5%
Anesthetize by injecting Avertin intraperitoneally. A 1.5 cm incision is made in the anterior thigh and the quadriceps are visualized directly. Galectin 11 template DNA was
. Inject in a 1 ml carrier with a 1 cc syringe through a 27 gauge needle for 1 minute into the knee at about 0.5 cm from the distal insertion site of the muscle at a depth of about 0.2 cm. The suture is placed over the injection site for future positioning and the skin is closed with a stainless steel clip.
【０７２１】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、ガ
レクチン１１タンパク質発現について組織化学的に染色する。ガレクチン１１タ
ンパク質発現についてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間
で採取すること以外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中のガレクチン１
１ＤＮＡの持続性を、注入したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性
ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得
る。マウスにおける上記実験の結果を、ガレクチン１１の裸のＤＮＡを用いて、
ヒトおよび他の動物において適切な投薬量および他の処置パラメーターを外挿す
るために使用し得る。After an appropriate incubation time (eg, 7 days), a muscle extract is prepared by cutting out all four animals. Every 15 μm section of each quadriceps is histochemically stained for galectin-11 protein expression. A time course for galectin-11 protein expression can be performed in a similar manner, except that four animals from different mice are harvested at different times. Galectin 1 in muscle after injection
Persistence of 1 DNA can be determined by Southern blot analysis after preparing total cellular DNA and HIRT supernatant from injected and control mice. Using the results of the above experiments in mice, using naked galectin-11 DNA,
It can be used to extrapolate appropriate dosages and other treatment parameters in humans and other animals.
【０７２２】 （実施例２７：ガレクチン１１トランスジェニック動物） ガレクチン１１ポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現さ
れ得る。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（
ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、
ヒヒ、サルおよびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物
は、トランスジェニック動物を作製するために用いられ得る。特定の実施形態に
おいて、本明細書に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、
遺伝子治療プロトコルの一部として、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現
のために用いられる。Example 27 Galectin-11 Transgenic Animals Galectin-11 polypeptides can also be expressed in transgenic animals. Mouse, rat, rabbit, hamster, guinea pig, pig, mini pig (
micro-pig), goats, sheep, cattle and non-human primates (eg,
Any species of animal, including, but not limited to, baboons, monkeys and chimpanzees, can be used to make transgenic animals. In certain embodiments, the techniques described herein or otherwise known in the art include:
Used as part of a gene therapy protocol for expression of a polypeptide of the invention in humans.
【０７２３】 当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列
（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤胞または胚へのレトロ
ウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
ら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクト
ロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３
−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入
（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参
照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物の
導入および胚盤胞へのこの幹細胞の再移入；ならびに***媒介遺伝子移入（Ｌａ
ｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含
むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にそ
の全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎ
ｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９
８９）を参照のこと。Any technique known in the art for introducing a transgene (ie, a polynucleotide of the present invention) into an animal can be used to introduce the transgenic animal into a founder line (fou).
ndr line). Such techniques are described in Pronuclear Microinjection (Paterson et al., Appl. Microbiol. Biotec).
hnol. 40: 691-698 (1994); Carver et al., Biotec.
hnology (NY) 11: 1263-1270 (1993); Wright
Biotechnology (NY) 9: 830-834 (1991); and Hoppe et al., U.S. Patent No. 4,873,191 (1989); germline (Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82: 6148-6152 (1985)), retrovirus-mediated gene transfer into blastocysts or embryos; gene targeting in embryonic stem cells (Thompson
Et al., Cell 56: 313-321 (1989)); Electroporation of cells or embryos (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3: 1803).
-1814 (1983)); introduction of a polynucleotide of the present invention using a gene gun (see, for example, Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993)); nucleic acid into embryonic pluripotent stem cells Introduction of the construct and retransfer of this stem cell into the blastocyst; and sperm-mediated gene transfer (La
vitrano et al., Cell 57: 717-723 (1989)); and the like. For a review of such techniques, Gordon, "Transgenic An," incorporated herein by reference in its entirety.
imals ", Intl. Rev .. Cytol. 115: 171-229 (19
89).
【０７２４】 当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。[0724] Any technique known in the art can be used to generate transgenic clones containing the polynucleotides of the invention (eg, cultured, quiescently induced embryonic, fetal or adult cells). Nuclear transfer into the nucleus of enucleated oocytes from cells (Campell et al., Nature 380: 64-66 (1996); Will)
Mut et al., Nature 385: 810-813 (1997)).
【０７２５】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手
短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ない
くつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介
して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機
能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に
選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型において
のみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされ
る調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかで
ある。この段落に列挙された文献の各々の内容は、本明細書中で、その全体が参
考として援用される。The present invention provides transgenic animals that have the transgene in all of their cells, as well as animals that have the transgene in some (but not all) cells (ie, mosaic animals or chimeras). I do. The transgene can be a single transgene or a concatamer (eg, head-to-head tandem or head-to-head).
Tail tandem). This transgene can also be obtained, for example, from the teachings of Lasko et al. (Lasko et al., Proc. Natl. Ac.
ad. Sci. USA 89: 6322-2236 (1992)) and can be selectively introduced into specific cell types and activated. The regulatory sequences required for such cell type-specific activation will depend on the particular cell type of interest, and they will be apparent to those skilled in the art. If it is desired that the polynucleotide transgene be integrated into the chromosomal site of the endogenous gene, gene targeting is preferred. Briefly, when such a technique is used, a vector containing several nucleotide sequences homologous to the endogenous gene is transformed into a nucleotide sequence of the endogenous gene through homologous recombination with a chromosomal sequence. And designed to disrupt the function of the nucleotide sequence. The transgene can also be selectively introduced into a particular cell type, thus, for example, by Gu et al. (Gu et al., Science 26
5: 103-106 (1994)), and endogenous genes are inactivated only in the introduced cell type. The regulatory sequences required for such cell type-specific inactivation will depend on the particular cell type of interest, and they will be apparent to those skilled in the art. The contents of each of the documents listed in this paragraph are incorporated herein by reference in their entirety.
【０７２６】 本明細書を通して開示されるガレクチン１１ポリヌクレオチドのいずれも、ト
ランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、ガレクチン１１
タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、以下のようなプライマーを使用して
、ベクターに挿入され得る：以下に示される下線を引かれたＳｍａＩ制限部位を
含む５’プライマー：[0725] Any of the galectin-11 polynucleotides disclosed throughout this specification can be used to generate transgenic animals. For example, galectin 11
The DNA encoding the protein can be inserted into the vector using, for example, primers such as the following: 5 ′ primer containing the underlined SmaI restriction site shown below:
【０７２７】[0727]
【化７】 および、下線を引かれたＡｓｐ７１８制限部位、続いて図１（配列番号１）に示
されるガレクチン１１ヌクレオチド配列の位置４３２〜４５０に相補的なヌクレ
オチドを含む以下のような３’プライマー配列。Embedded image And a 3 'primer sequence comprising the underlined Asp718 restriction site followed by nucleotides complementary to positions 432-450 of the galectin 11 nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
【０７２８】[0728]
【化８】 。これら２つの例に加えて、ガレクチン１１の他のフラグメントもまた、ベクタ
ーに挿入されて、遍在的発現を有するトランスジェニックを作製し得る。Embedded image . In addition to these two examples, other fragments of galectin 11 can also be inserted into the vector to create a transgenic with ubiquitous expression.
【０７２９】 あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、組織特異的プロモーターを介する組
織特異的な発現を制御するベクターに挿入され得る。例えば、トランスフェリン
プロモーターを有する構築物は、トランスジェニック動物の肝臓においてガレク
チン１１ポリペプチドを発現する。従って、全長ガレクチン１１タンパク質をコ
ードするＤＮＡはまた、以下のプロモーターを使用して、組織特異的発現のため
のベクターに挿入され得る：以下に示される下線を引かれたＳｍａＩ制限部位を
含む５’プライマー：Alternatively, the polynucleotide of the present invention can be inserted into a vector that controls tissue-specific expression via a tissue-specific promoter. For example, a construct having a transferrin promoter expresses a galectin-11 polypeptide in the liver of the transgenic animal. Thus, DNA encoding the full-length galectin-11 protein can also be inserted into a vector for tissue-specific expression using the following promoter: 5 'containing the underlined SmaI restriction site shown below. Primer:
【０７３０】[0730]
【化９】 および以下に示される下線を引かれたＡｓｐ１７８制限部位を含む３’プライマ
ー：Embedded image And a 3 'primer containing an underlined Asp178 restriction site as shown below:
【０７３１】[0731]
【化１０】 トランスジェニック動物において、遍在的様式または組織特異的様式で、本発
明のポリペプチドを発現することに加えて、種々の他の手段によってポリペプチ
ドの発現（例えば、発生的にまたは化学的に調節された発現）を調節する構築物
を作製することはまた、当業者にとって日常的である。Embedded image In a transgenic animal, in addition to expressing the polypeptide of the present invention in a ubiquitous or tissue-specific manner, expression of the polypeptide (eg, developmentally or chemically regulated) by various other means. It is also routine for one of ordinary skill in the art to create constructs that regulate the expression of a gene.
【０７３２】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。[0732] Once a transgenic animal has been produced, expression of the recombinant gene can be assayed using standard techniques. Initial screening can be accomplished by Southern blot analysis or PCR techniques, and analysis of animal tissue can confirm that transgene integration has occurred. Transgene mRNA expression levels in tissues of transgenic animals can also be determined by Northern blot analysis, in situ hybridization analysis and reverse transcriptase P analysis of tissue samples obtained from the animals.
It can be assessed using techniques including, but not limited to, CR (rt-PCR). Samples of the transgenic gene-expressing tissue can also be assessed immunocytochemically or immunohistochemically using antibodies specific for the transgene product.
【０７３３】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するため
の１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相
加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジ
ェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部
位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の
交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合
系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導
入遺伝子を配置するための交配。Once founders are generated, they can be crossed, inbred, outbred or crossed to produce colonies of a particular animal. Examples of such mating strategies include, but are not limited to: outcrossing of founders with more than one integration site to establish another lineage; additive expression of each transgene By effect, inbreeding of separate strains to produce complex transgenics expressing higher levels of the transgene; certain routines for both enhancing expression and eliminating the need to screen animals by DNA analysis. Crosses of heterozygous transgenic animals that produce animals homozygous for the integration site; crosses of separate homozygous lines to generate compound heterozygous or homozygous lines; and the desired experimental model Crosses to place the transgene on a suitable different background.
【０７３４】 本発明のトランスジェニック動物は、ガレクチン１１ポリペプチドの生物学的
機能の詳述、異常なガレクチン１１発現に関連する状態および／または障害の研
究、ならびにこのような状態および／または障害の改善に有効な化合物について
のスクリーニングに有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を有
する。The transgenic animals of the present invention can be used to elaborate the biological functions of galectin-11 polypeptides, study conditions and / or disorders associated with aberrant galectin-11 expression, and treat such conditions and / or disorders. It has uses, including but not limited to animal model systems useful for screening for compounds that are effective for improvement.
【０７３５】 （実施例２８：ガレクチン１１ノックアウト動物） 内因性ガレクチン１１遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用して
ガレクチン１１遺伝子および／またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノ
ックアウトする」ことによって減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅ
ｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら
、Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、
本明細書中でその全体が参考として援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオ
チド配列（この遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮ
Ａに隣接される、本発明の変異体、非機能的なポリヌクレオチド（または完全に
関連のないＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカ
ーを用いてまたは用いずに使用し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する
細胞をトランスフェクトし得る。別の実施形態において、当該分野で公知の技術
を、目的の遺伝子を含むが、発現しない細胞中でノックアウトを生じるために使
用する。標的化された相同性組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的
化された遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対
する改変が不活性な標的化された遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使
用され得る研究および農業分野に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａ
ｐｅｃｃｈｉ １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと
）。しかし、このアプローチは、当業者に明白な、適切なウイルスベクターを使
用して、組換えＤＮＡ構築物がインビボで要求された部位に直接投与されるか、
または標的化される場合、ヒトにおける使用に慣用的に適合され得る。Example 28 Galectin-11 Knockout Animals Endogenous galectin-11 gene expression also inactivates or “knocks out” the galectin-11 gene and / or its promoter using targeted homologous recombination. (Eg, Smithies et al., Na
cure 317: 230-234 (1985); Thomas and Cape.
cchi, Cell 51: 503-512 (1987); Thompson et al., Cell 5: 313-321 (1989);
Which is hereby incorporated by reference in its entirety). For example, a DN homologous to an endogenous polynucleotide sequence (either the coding or regulatory region of this gene).
A variant, non-functional polynucleotide (or completely unrelated DNA sequence) of the present invention flanked by A is used in vivo with or without a selectable and / or negative selectable marker. Cells expressing the polypeptide of the invention can be transfected. In another embodiment, techniques known in the art are used to cause knockout in cells that contain, but do not express, the gene of interest. Insertion of this DNA construct via targeted homologous recombination results in inactivation of the targeted gene. Such an approach is particularly suitable for the research and agricultural fields that can be used to generate progeny of animals with targeted genes in which modifications to embryonic stem cells are inactive (eg, Thomas and Ca).
pecchi 1987 and Thompson 1989, supra). However, this approach requires that the recombinant DNA construct be administered directly to the required site in vivo, using an appropriate viral vector, as will be apparent to those skilled in the art,
Or, if targeted, may be routinely adapted for use in humans.
【０７３６】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチ
ドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは
プロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、ガレクチン１１ポリペプチドの
発現および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好
ましくは分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患
者中へ全身的に導入し得る。In a further embodiment of the present invention, cells that are genetically engineered to express a polypeptide of the present invention or that are genetically engineered to not express a polypeptide of the present invention (eg, a knockout) are Administered to the patient in vivo. Such cells can be obtained from patients (ie, animals including humans) or MHC compatible donors, and include fibroblasts, bone marrow cells, blood cells (eg, lymphocytes), adipocytes, muscle cells, endothelial cells, and the like. But not limited to them. The cells can be transformed, for example, by transduction (using viral vectors and preferably vectors that incorporate the transgene into the cell genome) or transfection procedures (plasmids, cosmids, YACs, naked DNA, electroporation, liposomes, etc.). (Including, but not limited to, use) to introduce a coding sequence for a polypeptide of the invention into a cell, or to bind to the coding sequence and / or a polypeptide of the invention. To destroy the array,
Genetically engineered in vitro using recombinant DNA technology. The coding sequence of a polypeptide of the present invention may be placed under the control of a strong constitutive or inducible promoter or promoter / enhancer to achieve expression and, preferably, secretion of the galectin-11 polypeptide. Engineered cells that express and preferably secrete a polypeptide of the present invention can be introduced systemically into a patient, for example, in the circulation or intraperitoneally.
【０７３７】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。Alternatively, the cells can be incorporated into a matrix and transplanted into the body (
For example, genetically engineered fibroblasts can be transplanted as part of a skin graft); genetically engineered endothelial cells can be transplanted as part of a lymphoid or vascular graft (eg, Anderson et al., US Pat. No. 5,399,349 and Mu
See lligan and Wilson, U.S. Patent No. 5,460,959. Each of these is hereby incorporated by reference in its entirety).
【０７３８】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。If the cells to be administered are non-autologous or non-MHC compatible cells, they may be administered using well-known techniques that would prevent the generation of a host immune response against the transduced cells. For example, the cells can be introduced in a capsular form, which does not allow the introduced cells to be recognized by the host immune system, while allowing the components to exchange with the immediate extracellular environment.
【０７３９】 本発明のノックアウト動物は、ガレクチン１１ポリペプチドの生物学的機能の
詳述、異常なガレクチン１１発現に関連する状態および／または障害の研究、な
らびにこのような状態および／または障害を寛解させる場合に有効な化合物のス
クリーニングにおいて有用な動物モデル系を含むが、それらに限定されない用途
を有する。The knockout animals of the present invention detail the biological function of the galectin-11 polypeptide, study conditions and / or disorders associated with abnormal galectin-11 expression, and ameliorate such conditions and / or disorders And has uses including, but not limited to, animal model systems useful in screening for effective compounds.
【０７４０】 （実施例２９：Ｂ細胞増殖および分化のアッセイ検出刺激または阻害） 機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系列の細胞とそれらの微小環境との間に、
可溶性のシグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナル
は、陽性の刺激（Ｂ系列の細胞がプログラムされた発生を持続するようにさせる
）、または陰性の刺激（細胞が電流発生経路を阻止するように指示する）を伝え
得る。現在までに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む、多数の刺激シグナル
および阻害シグナルがＢ細胞応答性に影響することが見出されている。興味深い
ことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、種々の同時
刺激タンパク質と組み合わせて、Ｂ細胞集団中の活性化、増殖、分化、ホーミン
グ、耐性、および細胞死を誘導し得る。Example 29: Assay Detection Stimulation or Inhibition of B Cell Proliferation and Differentiation The generation of a functional humoral immune response depends on the interaction between B lineage cells and their microenvironment.
It requires both soluble and cognate signaling. The signal may carry a positive stimulus (allowing the cells of the B lineage to sustain programmed development) or a negative stimulus (instructing the cell to block the current generation pathway). To date, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL
Numerous stimulatory and inhibitory signals have been found to affect B cell responsiveness, including -10, IL-13, IL-14 and IL-15. Interestingly, these signals are weak effectors themselves, but can be combined with various costimulatory proteins to induce activation, proliferation, differentiation, homing, resistance, and cell death in B cell populations.
【０７４１】 Ｂ細胞同時刺激タンパク質の最も研究されたクラスの１つがＴＮＦスーパーフ
ァミリーである。このファミリー内で、ＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、
そのそれぞれのリガンドである、ＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３と共に
種々の免疫応答を調節することが見出されている。これらのＢ細胞集団およびそ
れらの前駆細胞の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセ
イは、種々のタンパク質がこれらのＢ細胞集団に対する、増殖および分化の点で
有し得る効果を決定する際に価値のあるツールである。以下に列挙するのは、Ｂ
細胞集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするよ
うに設計された２つのアッセイである。One of the most studied classes of B cell costimulatory proteins is the TNF superfamily. Within this family, CD40, CD27 and CD30
Together with their respective ligands, CD154, CD70 and CD153, they have been found to modulate various immune responses. Assays that allow detection and / or observation of the proliferation and differentiation of these B cell populations and their progenitor cells determine the effects that various proteins can have on these B cell populations in terms of proliferation and differentiation It is a valuable tool in doing. Listed below are B
Two assays designed to allow the detection of differentiation, proliferation, or inhibition of cell populations and their precursors.
【０７４２】 （インビトロアッセイ）−精製されたガレクチン１１タンパク質、またはそれ
らの短縮化形態を、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体において活性化、増殖、分
化もしくは阻害および／または細胞死を誘導する能力について評価する。精製し
たヒト扁桃腺Ｂ細胞へのガレクチン１１タンパク質の活性（定性的に０．１〜１
０，０００ｎｇ／ｍＬの用量範囲にわたって測定した）を、標準的なＢリンパ球
同時刺激アッセイにおいて評価する。このアッセイでは、精製した扁桃腺Ｂ細胞
を、プライミング因子として、ホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）、または固定した抗ヒトＩｇＭ抗体の
いずれかの存在下で培養する。ＩＬ−２およびＩＬ−１５のような第２のシグナ
ルは、トリチウム化チミジン取り込みにより測定した場合、ＳＡＣおよびＩｇＭ
架橋と協同してＢ細胞増殖を誘発する。新規な協同因子を、このアッセイを用い
て容易に同定し得る。このアッセイは、ＣＤ３陽性細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ
）枯渇によりヒト扁桃腺Ｂ細胞を単離する工程を包含する。得られる細胞集団は
、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現により評価する場合、９５％のＢ細胞より大き
い。In Vitro Assay-Purified Galectin-11 proteins, or truncated forms thereof, for the ability to induce activation, proliferation, differentiation or inhibition and / or cell death in B cell populations and their precursors evaluate. Galectin-11 protein activity on purified human tonsillar B cells (qualitatively 0.1-1
(Measured over a dose range of 000 ng / mL) is evaluated in a standard B lymphocyte costimulation assay. In this assay, purified tonsillar B cells were used as priming factors in formalin-fixed Staphylococcus.
Culture in the presence of either Aureus Cowan I (SAC) or immobilized anti-human IgM antibody. Secondary signals, such as IL-2 and IL-15, were measured by SAC and IgM as measured by tritiated thymidine incorporation.
Induces B cell proliferation in cooperation with crosslinking. New synergists can be easily identified using this assay. This assay uses magnetic beads (MACS
And b) isolating human tonsillar B cells by depletion. The resulting cell population is greater than 95% B cells as assessed by CD45R (B220) expression.
【０７４３】 種々の希釈のそれぞれのサンプルを９６ウェルプレートの個々のウェルに配置
し、ここへ、培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０-5希釈のＳＡＣを
含有するＲＰＭＩ １６４０）中で懸濁した、総量１５０μｌ中の、１０5Ｂ細
胞を添加する。増殖または阻害を、因子の添加後７２時間から開始して、３Ｈ−
チミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）で２０ｈパルス（１μＣｉ／ウェル）により定量
する。陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地
である。Each sample of the various dilutions is placed in an individual well of a 96-well plate, and the culture medium (10% FBS, 5 × 10 −5 M 2ME, 100 U / ml)
Add 10 5 B cells in a total volume of 150 μl suspended in RPMI 1640 containing penicillin, 10 μg / ml streptomycin, and 10 −5 dilution of SAC. Growth or inhibition was initiated 72 hours after addition of the factor, starting with 3H-
Quantification with thymidine (6.7 Ci / mM) with a 20 h pulse (1 μCi / well). Positive and negative controls are IL2 and medium, respectively.
【０７４４】 （インビボアッセイ）−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみ、または２ｍｇ／
ｋｇのガレクチン１１タンパク質、またはそれらの短縮形態を、１日２回注射（
腹腔内）する。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時点でそれらを屠
殺し、そして分析のために種々の組織および血清を収集した。正常な脾臓および
ガレクチン１１タンパク質で処理した脾臓由来のＨ＆Ｅ切片の比較により、脾臓
細胞でのガレクチン１１タンパク質の活性の結果、例えば、動脈周囲リンパ性鞘
の拡散および／または赤色脾髄領域の有核の細胞充実性の有意な増加（これは、
Ｂ細胞集団の分化および増殖の活性化を示し得る）が確認される。Ｂ細胞マーカ
ーである、抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を用いる免疫組織化学的研究を用いて、脾
臓細胞への任意の生理的な変化（例えば、脾臓組織崩壊）が、樹立されたＴ細胞
領域に浸潤する漠然と規定されたＢ細胞区画内のＢ細胞提示の増加に起因するか
否かを決定する。(In Vivo Assay)-BALB / c mice received only buffer or 2 mg /
kg galectin-11 protein, or a truncated form thereof, is injected twice daily (
Intraperitoneally). Mice were given this treatment for 4 consecutive days, at which point they were sacrificed and various tissues and sera were collected for analysis. Comparison of H & E sections from normal spleen and spleen treated with galectin-11 protein resulted in activity of galectin-11 protein in spleen cells, eg, diffusion of peri-arterial lymphatic sheath and / or nucleation of red pulp region Significant increase in cellularity of
(Which may indicate activation of differentiation and proliferation of the B cell population). Using immunohistochemical studies with the B cell marker, anti-CD45R (B220), any physiological changes to spleen cells (eg, spleen tissue disruption) infiltrate established T cell areas. Determine if it is due to increased B cell presentation within the vaguely defined B cell compartment.
【０７４５】 ガレクチン１１タンパク質で処置したマウス由来の脾臓のフローサイトメトリ
ー分析を用いて、ガレクチン１１タンパク質が、ＴｈＢ＋であるＣＤ４５Ｒ（Ｂ
２２０）ｄｕｌｌ Ｂ細胞の比を、コントロールマウスで観察される比よりも特
異的に増加するか否かを示す。Using flow cytometric analysis of spleens from mice treated with galectin-11 protein, the galectin-11 protein was identified as ThB +, CD45R (B
220) Indicates whether the ratio of dull B cells is specifically increased above that observed in control mice.
【０７４６】 さらに、増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示の推定される結果は、血清Ｉ
ｇ力価の相対的な増加である。従って、血清ＩｇＭおよびＩｇＡレベルを緩衝液
処置マウスとガレクチン１１タンパク質処置マウスとの間で比較する。Further, the putative consequences of the in vivo presentation of increased mature B cells is that serum I
g is a relative increase in titer. Therefore, serum IgM and IgA levels are compared between buffer-treated and galectin-11 protein-treated mice.
【０７４７】 本実施例において記載する試験は、ガレクチン１１タンパク質の活性を試験し
た。しかし、当業者は、ガレクチン１１ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝
子治療）、ガレクチン１１のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性
を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。The tests described in this example tested the activity of galectin-11 protein. However, one of skill in the art can readily modify the exemplified studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), the activity of a galectin-11 agonist, and / or antagonist.
【０７４８】 （実施例３０：Ｔ細胞増殖アッセイ） ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣで実行し、そして3Ｈ−チミジンの取
り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェルプレ
ートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１００
μｌ／ウェル、またはアイソタイプ適合のコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１）（
０．０５Ｍ 炭酸水素緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で１晩、コ
ートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ／Ｈ勾配
遠心分離により単離し、そしてガレクチン１１タンパク質の種々の濃度での存在
下で、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍＡｂでコートしたプ
レートの４通りのウェル（５×１０4／ウェル）に添加する（総量２００μｌ）
。関連するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロールである。３７℃での
培養の４８時間後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転させ、そして１００
μｌの上清を除去し、そして、増殖への効果が観察される場合、ＩＬ−２（また
は他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵した。ウェルに０．５μＣ
ｉの3Ｈチミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、そして３７℃で１８〜
２４時間培養する。ウェルを収集し、そして3Ｈチミジンの取り込みを増殖の指
標として用いた。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロールである。ＩＬ−２（１
００Ｕ／ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールとして用いる。Ｔ細胞の増
殖を誘導しないコントロール抗体をガレクチン１１タンパク質の効果についての
陰性コントロールとして用いる。Example 30 T Cell Proliferation Assay A CD3-induced proliferation assay is performed on PBMC and measured by 3 H-thymidine incorporation. This assay is performed as follows. 96-well plates were loaded with 100 mAb against CD3 (HIT3a, Pharmingen).
μl / well, or isotype matched control mAb (B33.1) (
(1 μg / ml in 0.05 M bicarbonate buffer, pH 9.5) at 4 ° C. overnight, then wash three times with PBS. PBMCs were isolated from human peripheral blood by F / H gradient centrifugation and plates coated with mAbs in RPMI containing 10% FCS and P / S in the presence of various concentrations of galectin-11 protein. Add to 4 wells (5 × 10 4 / well) (200 μl total)
. The relevant protein buffer and medium alone are controls. After 48 hours of culture at 37 ° C., the plate was spun at 1000 rpm for 2 minutes and
μl of supernatant was removed and stored at −20 ° C. for measurement of IL-2 (or other cytokines) if an effect on growth was observed. 0.5 μC per well
supplemented medium 100μl containing 3 H-thymidine i, and 18 at 37 ° C.
Incubate for 24 hours. Wells were collected and 3 H thymidine incorporation was used as an indicator of proliferation. Anti-CD3 alone is a positive control for proliferation. IL-2 (1
00U / ml) is also used as a control to enhance proliferation. A control antibody that does not induce T cell proliferation is used as a negative control for the effect of galectin-11 protein.
【０７４９】 本実施例において記載される研究は、ガレクチン１１タンパク質の活性を試験
した。しかし、当業者は、ガレクチン１１ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺
伝子治療）、ガレクチン１１のアゴニスト、および／またはアンタゴニストじょ
活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。The study described in this example tested the activity of the galectin-11 protein. However, one of skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of galectin-11 polynucleotides (eg, gene therapy), agonist and / or antagonist activity of galectin-11.
【０７５０】 （実施例３１：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、なら
びに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化へのガレクチン１１の効果） 樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着
性ＰＢＭＣまたは清浄化単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩ
Ｌ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は
、非成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭ
ＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処理
は、表面表現形に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激分子および
接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を生じ
る。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関連す
る。Example 31 Effect of Galectin-11 on MHC Class II, Costimulatory and Adhesion Molecule Expression, and Cell Differentiation of Monocytes and Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Dendritic cells were found in peripheral blood Produced by the growth of proliferating progenitors: adherent PBMC or purified monocyte fractions are made up of GM-CSF (50 ng / ml) and I
Incubate with L-4 (20 ng / ml) for 7 to 10 days. These dendritic cells have the characteristic phenotype of immature cells (CD1, CD80, CD86, CD40 and M
HC class II antigen expression). Treatment with activators such as TNF-α causes rapid changes in surface phenotype (MHC class I and II, increased expression of costimulatory and adhesion molecules, down-regulation of FCγRII, up-regulation of CD83). Occurs. These changes are associated with increased antigen presenting ability and functional maturation of dendritic cells.
【０７５１】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、ガレクチン１１また
はＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜３日処理し、１％ＢＳＡお
よび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０
希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクローナル抗
体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識した細
胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメ
トリーにより分析する。The FACS analysis of the surface antigen is performed as follows. Cells are treated with increasing concentrations of Galectin-11 or LPS (positive control) for 1-3 days, washed with PBS containing 1% BSA and 0.02 mM sodium azide, then 1:20
Incubate with diluted appropriate FITC- or PE-labeled monoclonal antibody for 30 minutes at 4 ° C. After a further wash, the labeled cells are analyzed by flow cytometry on a FACScan (Becton Dickinson).
【０７５２】 （サイトカインの生成への効果）樹状細胞により生成されるサイトカイン、特
にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１２
は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害性Ｔ
細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のようにＩＬ
−１２放出を測定する。樹状細胞（１０6／ｍｌ）を、ガレクチン１１の漸増す
る濃度で２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロール
として細胞培養に添加する。次いで、細胞培養からの上清を収集し、そして市販
のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉ
ｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量について分析する。キットに提供される標
準的プロトコールを用いる。(Effects on Cytokine Production) Cytokines produced by dendritic cells, particularly IL-12, are important in initiating T cell dependent immune responses. IL-12
Strongly influences the development of Th1 helper T cell immune responses and cytotoxic T
Induces cellular and NK cell functions. Using an ELISA, the IL
Measure -12 release. Dendritic cells (10 6 / ml) are treated with increasing concentrations of galectin 11 for 24 hours. LPS (100 ng / ml) is added to the cell culture as a positive control. The supernatant from the cell culture is then collected and a commercially available ELISA kit (eg, R & D Systems (Minneapolis)
s, MN)) to analyze for IL-12 content. Use the standard protocol provided in the kit.
【０７５３】 ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現への効果。細胞表面抗
原の３つの主なファミリー：接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦｃレ
セプター、が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の同時刺
激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１）の発現の調節は、単球の抗原提示能
力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセプターの発
現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の改善と相関
し得る。Effect on MHC class II, costimulatory and adhesion molecule expression. Three main families of cell surface antigens: adhesion molecules, molecules involved in antigen presentation, and Fc receptors can be identified on monocytes. Modulation of the expression of MHC class II antigens and other costimulatory molecules (eg, B7 and ICAM-1) can alter the ability of monocytes to present antigen and induce T cell activation. Increased expression of the Fc receptor may correlate with improved monocyte cytotoxic activity, cytokine release and phagocytosis.
【０７５４】 ＦＡＣＳ分析は、以下のような表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、ガレクチン１１またはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜５日
処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗
浄し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ
標識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらな
る洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
）でのフローサイトメトリーにより分析する。[0753] FACS analysis is used to test for surface antigens as follows. Monocytes are treated with increasing concentrations of Galectin-11 or LPS (positive control) for 1-5 days, washed with PBS containing 1% BSA and 0.02 mM sodium azide, and then diluted 1:20 with the appropriate FITC-labeled monoclonal antibody or PE
Incubate with labeled monoclonal antibody for 30 minutes at 4 ° C. After further washing, the labeled cells were washed with FACScan (Becton Dickinson).
Analyze by flow cytometry in).
【０７５５】 （単球活性化および／または生存の増加）単球を活性化する（あるいは、不活
化する）および／または単球の生存を増加する（あるいは、単球生存を低下させ
る）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、そして本発明の分子が
単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定するため
に慣用的に適用され得る。ガレクチン１１、ガレクチン１１のアゴニストまたは
アンタゴニストは、以下に記載の３つのアッセイを用いてスクリーニングされ得
る。これらのアッセイのそれぞれについて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈ
ｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分離により、単一のドナー
ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏ
ｒｅ，ＭＤ）から精製する。単球を向流遠心性エルトリエーション（ｃｏｕｎｔ
ｅｒｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によりＰＢ
ＭＣから単離する。(Monocyte Activation and / or Increased Survival) For molecules that activate (or inactivate) monocytes and / or increase monocyte survival (or decrease monocyte survival) Assays are known in the art and can be routinely applied to determine whether a molecule of the invention functions as a monocyte inhibitor or activator. Galectin 11, an agonist or antagonist of galectin 11, can be screened using the three assays described below. For each of these assays, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were
Centrifugation through istopaque gradients (Sigma) resulted in single donor leukopacks (American Red Cross, Baltimo).
re, MD). Monocytes are counter-currently centrifuged elutriated (count
erflow centrifugal elimination)
Isolate from MC.
【０７５６】 （単球生存アッセイ）ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で培
養した場合、次第に生存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス（ア
ポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、劇的
に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨード（
ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１００ｎ
ｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種々の
濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コント
ロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを含有
するＰＢＳ中で２×１０6／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析の
前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイムに
おけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。Monocyte Survival Assay Human peripheral blood monocytes gradually lose viability when cultured in the absence of serum or other stimuli. Their death results from an internally regulated process (apoptosis). Addition of activators, such as TNFα, to the culture dramatically improves cell survival and prevents DNA fragmentation. Propidium iodine (
Apoptosis is measured using PI) staining as follows. Monocytes, 100n
Culture for 48 hours in serum-free medium (positive control) in polypropylene tubes in the presence of g / ml TNF-α (negative control) and in the presence of various concentrations of compound to be tested. Cells are suspended at a concentration of 2 × 10 6 / ml in PBS containing PI at a final concentration of 5 μg / ml, and then incubated for 5 minutes at room temperature before FACScan analysis. PI incorporation has been shown to correlate with DNA fragmentation in this test paradigm.
【０７５７】 （サイトカイン放出への影響）単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後
のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団へのそれらの調節活性であ
る。サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡは、以下のように実施する。
ヒト単球を、５×１０5細胞／ｍｌの密度で、ガレクチン１１の漸増する濃度と
ともに、および同じ条件下でガレクチン１１の非存在下で、インキュベートする
。ＩＬ−１２の生成については、この細胞を、ガレクチン１１の存在下でＩＦＮ
（１００Ｕ／ｍｌ）で１晩プライムする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を
添加する。馴化培地を２４時間後に収集し、そして使用するまで凍結保存する。
次いで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を市販のＥ
ＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，
ＭＮ）を用い、そしてキットに提供される標準的プロトコールを適用して実施す
る。Effect on Cytokine Release An important function of monocytes / macrophages is their regulatory activity on other cell populations of the immune system through the release of cytokines after stimulation. An ELISA for measuring cytokine release is performed as follows.
Human monocytes are incubated at a density of 5 × 10 5 cells / ml with increasing concentrations of galectin 11 and in the absence of galectin 11 under the same conditions. For the production of IL-12, the cells were transfected with IFN in the presence of galectin-11.
(100 U / ml) overnight. Then LPS (10 ng / ml) is added. Conditioned media is collected after 24 hours and stored frozen until use.
The measurement of TNF-α, IL-10, MCP-1 and IL-8 was then performed using commercially available E
LISA kits (eg, R & D Systems Minneapolis,
MN) and apply standard protocols provided in the kit.
【０７５８】 （酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ））精製した単球を９６
ウェルプレートに２〜１×１０5細胞／ウェルでプレートする。ガレクチン１１
の漸増濃度をウェルの総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％
ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）に添加する。３日間のインキュベーション
後、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。マクロファージ
の単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭデキストロー
ス、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、刺激物
質（２００ｎＭ ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３７℃で２時間イ
ンキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加して反
応を停止する。吸収を６１０ｎｍで読む。マクロファージにより生成されるＨ2
Ｏ2の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ2Ｏ2溶液の標準曲線をそれぞれの
実験について実施する。(Oxidative burst) Purified monocytes were collected from 96
Plate well plates at 2-1 × 10 5 cells / well. Galectin 11
Of increasing concentrations of culture medium (RPMI 1640 + 10%
FCS, glutamine and antibiotics). After 3 days of incubation, the plate is centrifuged and the medium is removed from the wells. In a monolayer of macrophages, 0.2 ml of a phenol red solution (140 mM N
aCl, 10 mM potassium phosphate buffer pH 7.0, 5.5 mM dextrose, 0.56 mM phenol red and 19 U / ml HRPO) are added along with the stimulant (200 nM PMA). The plate is incubated at 37 ° C. for 2 hours and the reaction is stopped by adding 20 μl of 1N NaOH per well. Read the absorbance at 610 nm. H 2 produced by macrophages
To calculate the amount of O 2, performed for each experiment a standard curve of H 2 O 2 solution of known molarity.
【０７５９】 本実施例において記載される研究は、ガレクチン１１タンパク質の活性を試験
した。しかし、当業者は、ガレクチン１１ポリヌクレオチドの活性（例えば、遺
伝子治療）、ガレクチン１１のアゴニストの活性、および／またはガレクチン１
１のアンタゴニストの活性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る
。The study described in this example tested the activity of the galectin-11 protein. However, one skilled in the art will appreciate that the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), the activity of an agonist of galectin-11, and / or the activity of galectin-1
To test the activity of one antagonist, the illustrated studies can be readily modified.
【０７６０】 （実施例３２：ガレクチン１１の生物学的効果） （星状細胞および神経アッセイ） 上記のように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現され、そして精製さ
れた組換えガレクチン１１を、皮質ニューロン細胞の生存、神経突起成長または
表現形分化を促進する活性について、およびグリア線維性酸性タンパク質免疫陽
性細胞、星状細胞の増殖の誘導について試験し得る。バイオアッセイのための皮
質細胞の選択は、皮質構造中のＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の広く行き渡ってい
る発現、ならびにＦＧＦ−２処理から生じる皮質ニューロン生存の以前に報告さ
れた増強に基づく。チミジン取り込みアッセイを用いて、例えば、これらの細胞
へのガレクチン１１の活性を解明し得る。Example 32 Biological Effects of Galectin 11 Astrocytes and Neuronal Assays As described above, recombinant galectin 11 expressed and purified in Escherichia coli was used to survive cortical neuronal cell survival. , For promoting neurite outgrowth or phenotypic differentiation, and for inducing proliferation of glial fibrillary acidic protein immunopositive cells, astrocytes. Selection of cortical cells for bioassays is based on the widespread expression of FGF-1 and FGF-2 in cortical structures and previously reported enhancement of cortical neuron survival resulting from FGF-2 treatment. A thymidine incorporation assay can be used, for example, to elucidate the activity of galectin 11 on these cells.
【０７６１】 さらに、インビトロにおける皮質ニューロンまたは海馬ニューロンへのＦＧＦ
−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的効果を記載する以前のレポートは、ニューロン
生存および神経突起成長の両方における増大を実証している（Ｗａｌｉｃｋｅ，
Ｐら、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅ
ｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａ
ｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｅｕｒｉｔｅ ｅｘｔｅｎ
ｓｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３０１２〜
３０１６（１９８６）、この文献におけるアッセイはその全体が参考として援用
される）。しかし、ＰＣ−１２細胞で実行される実験からの報告は、これらの２
つの応答が必ずしも同義でないこと、そしてどのＦＧＦを試験しいるかだけでな
く、どのレセプターが標的細胞で発現されているかにも依存し得ることを示唆す
る。神経突起成長を誘導するガレクチン１１の能力を、一次の皮質ニューロン培
養パラダイムを用いて、例えば、チミジン取り込みアッセイを用いてＦＧＦ−２
で得られた応答と比較し得る。In addition, FGF to cortical or hippocampal neurons in vitro
Previous reports describing the biological effects of -2 (basic FGF) have demonstrated an increase in both neuronal survival and neurite outgrowth (Wallike,
P et al., "Fibroblast growth factor promote."
s survival of dissociated hippocampa
l neurons and enhances neuroite extend
Sion "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3012
3016 (1986), the assays in this document are incorporated by reference in their entirety). However, reports from experiments performed on PC-12 cells indicate that these 2
This suggests that the two responses are not necessarily synonymous and may depend not only on which FGF is being tested, but also on which receptor is expressed in the target cell. The ability of galectin-11 to induce neurite outgrowth was determined using a primary cortical neuron culture paradigm, for example, FGF-2 using a thymidine incorporation assay.
Can be compared with the response obtained in
【０７６２】 （線維芽細胞および内皮細胞アッセイ） ヒト肺線維芽細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入
手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの増殖培地で維持する。真皮性微小血管内
皮細胞をＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）か
ら得る。増殖アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮
細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中で１日間、５，０００細胞／ウェルで
培養し得る。次いでこの細胞を０．１％ＢＳＡ基礎培地中で１日間インキュベー
トする。新鮮な０．１％ＢＳＡ培地で培地を置換した後、細胞を試験タンパク質
と共に３日間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌｍａｒ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度になる
ように各ウェルに添加する。この細胞を４時間インキュベートする。細胞生存度
をＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読取りにより測定する。ＰＧＥ2アッセ
イについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，００
０細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換した後、細胞
をＩＬ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２またはガレクチ
ン１１と２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＩＡキット（Ｃ
ａｙｍａｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によりＰＧＥ2についてアッセイする
。ＩＬ−６アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で
１日間、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を
変換した後、細胞を、ＦＧＦ−２またはガレクチン１１と、ＩＬ−１αとともに
、またはそれをともなわずに、２４時間インキュベートする。上清を収集し、そ
してＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によりＩ
Ｌ−６についてアッセイする。[0764] Fibroblast and Endothelial Cell Assays Human lung fibroblasts are obtained from Clonetics (San Diego, Calif.) And are maintained in growth media from Clonetics. Dermal microvascular endothelial cells are obtained from Cell Applications (San Diego, CA). For proliferation assays, human lung fibroblasts and dermal microvascular endothelial cells can be cultured at 5,000 cells / well in growth media in 96-well plates for 1 day. The cells are then incubated for one day in 0.1% BSA basal medium. After replacing the medium with fresh 0.1% BSA medium, the cells are incubated with the test protein for 3 days. Alamar Blue (Almar Bi
oscenses, Sacramento, CA) is added to each well to a final concentration of 10%. The cells are incubated for 4 hours. Cell viability is measured by reading on a CytoFluor fluorescence reader. For PGE 2 assays, the human lung fibroblasts, one day in 96-well plates 5,00
Culture at 0 cells / well. After changing the medium to 0.1% BSA basal medium, the cells are incubated with FGF-2 or galectin 11 with or without IL-1α for 24 hours. The supernatant is collected and the EIA kit (C
assay for PGE 2 by Ayman, Ann Arbor, MI). For the IL-6 assay, human lung fibroblasts are cultured at 5,000 cells / well in a 96-well plate for 1 day. After changing the medium to 0.1% BSA basal medium, the cells are incubated with FGF-2 or Galectin 11 with or without IL-1α for 24 hours. Supernatants were collected and purified by ELISA kit (Endogen, Cambridge, MA).
Assay for L-6.
【０７６３】 ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２またはガレクチン１１とともに基礎培地中で３
日間培養し、その後、線維芽細胞の増殖への効果を評価するためＡｌａｍａｒ
Ｂｌｕｅを添加する。ＦＧＦ−２は、ガレクチン１１での刺激に匹敵して用いら
れ得る１０〜２５００ｎｇ／ｍｌの刺激を示す。[0764] Human lung fibroblasts were cultured in basal medium with FGF-2 or Galectin 11 for 3 hours.
Days, then Alamar to assess its effect on fibroblast proliferation
Add Blue. FGF-2 exhibits a stimulus of 10 to 2500 ng / ml that can be used comparable to stimulation with galectin-11.
【０７６４】 （パーキンソンモデル） パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投
射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴
付けされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３
，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身投与を含む。ＣＮＳにおいて、
ＭＰＴＰは、星状細胞に取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１
−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ+）に異化され、そして放出される。
引き続き、ＭＰＰ+は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによ
りドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積される。次いで、ＭＰＰ+は、電
気化学勾配によりミトコンドリア中で濃縮され、そしてニコチドアミンアデニン
ジホスフェート：ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）を選択的に阻害し、これ
により電子伝達を妨害し、そして最終的に活性酸素を生成する。[0764] Parkinson's Model The loss of motor function in Parkinson's disease is due to striatal dopamine deficiency resulting from degeneration of dopaminergic projection neurons in the substantia nigra. An animal model of Parkinson's disease that has been extensively characterized is 1-methyl-4phenyl 1,2,3
, 6-tetrahydropyridine (MPTP). In the CNS,
MPTP is taken up by astrocytes and is mediated by monoamine oxidase B
-Catalyzed to -methyl-4-phenylpyridine (MPP + ) and released.
Subsequently, MPP + is actively accumulated in dopaminergic neurons by the high-affinity reuptake transporter of dopamine. MPP + is then enriched in mitochondria by an electrochemical gradient and selectively inhibits nicotidoamine adenine diphosphate: ubiquinone oxidoreductase (complex I), thereby preventing electron transfer and Generates active oxygen.
【０７６５】 ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）が黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活
性を有することが組織培養パラダイムにおいて実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉ
ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９）。近年、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは
、線条体のゲルフォームインプラントでのＦＧＦ−２投与がＭＰＴＰ曝露と関連
する毒性から黒質のドーパミン作動性ニューロンのほぼ完全な防御を生じること
を実証している（ＯｔｔｏおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎ
ｃｅ，１９９０）。It has been demonstrated in a tissue culture paradigm that FGF-2 (basic FGF) has trophic activity on substantia nigra dopaminergic neurons (Ferrari)
Dev. Biol. 1989). In recent years, Dr. Unsicker's group has demonstrated that administration of FGF-2 in a striatum gel foam implant results in near complete protection of substantia nigra dopaminergic neurons from the toxicity associated with MPTP exposure ( Otto and Unsicker, J. Neuroscien.
ce, 1990).
【０７６６】 ＦＧＦ−２を用いたデータに基づいて、ガレクチン１１は、インビトロにおけ
るドーパミン作動性ニューロン生存を増強する際において、ガレクチン１１がＦ
ＧＦ−２の作用と類似の作用を有するか否かを決定するために評価され得、そし
て、ガレクチン１１はまた、線条体におけるドーパミン作動性ニューロンの、Ｍ
ＰＴＰ処理と関連する損傷からの防御についてインビボで試験され得る。ガレク
チン１１の潜在的効果を、まずドーパミン性ニューロン細胞培養パラダイムにお
いてインビトロで試験する。妊娠１４日のＷｉｓｔｅｒラット胚由来の中脳底板
を解剖することにより、培養物を調製する。組織をトリプシンで分離し、そして
ポリオルチニン−ラミニンでコートしたカバーガラスに２００，０００細胞／ｃ
ｍ2の密度で播いた。この細胞をダルベッコ改変イーグル培地およびホルモン補
充物（ＮＩ）を含有するＦ１２培地中で維持する。インビトロで８日後培養物を
パラホルムアミドで固定し、そしてチロシンヒドロキシラーゼ（ドーパミン作動
性ニューロンについての特異的マーカー）での免疫組織化学染色のために処理す
る。分離した細胞培養物を胚性ラットから調製する。培養培地を３日ごとに変化
させ、そしてこの因子をまたその時点ごとに添加する。[0766] Based on data using FGF-2, galectin 11 has shown that galectin 11 has a role in enhancing dopaminergic neuron survival in vitro.
Galectin-11 can also be evaluated to determine if it has an effect similar to that of GF-2, and galectin 11 also inhibits the activity of dopaminergic neurons in the striatum, M
It can be tested in vivo for protection from damage associated with PTP treatment. The potential effect of galectin 11 is first tested in vitro in a dopaminergic neuron cell culture paradigm. Cultures are prepared by dissecting mesencephalic plates from Wister rat embryos on day 14 of gestation. Tissues were dissociated with trypsin and placed on coverslips coated with polyortinin-laminin at 200,000 cells / c.
Seeded at a density of m 2 . The cells are maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium and F12 medium containing hormone supplement (NI). After 8 days in vitro, the cultures are fixed with paraformamide and processed for immunohistochemical staining with tyrosine hydroxylase, a specific marker for dopaminergic neurons. Separate cell cultures are prepared from embryonic rats. The culture medium is changed every three days, and the factor is also added every time.
【０７６７】 ドーパミン作動性ニューロンを妊娠１４日（この発生時間は、ドーパミン作動
性前駆細胞が増殖する段階を過ぎる）で動物から単離するので、チロシンヒドロ
キシラーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、インビトロで生存しているドーパ
ミン作動性ニューロンの数の増加を示す。従って、もしガレクチン１１がドーパ
ミン作動性の生存を延長するように作用するならば、ガレクチン１１がパーキン
ソン病に関与し得ることを示唆する。Since dopaminergic neurons are isolated from animals at day 14 of gestation (the time of development is past the stage at which dopaminergic progenitor cells proliferate), the increase in the number of tyrosine hydroxylase immunopositive neurons was determined in vitro. 2 shows an increase in the number of surviving dopaminergic neurons. Thus, if galectin 11 acts to prolong dopaminergic survival, it suggests that galectin 11 may be involved in Parkinson's disease.
【０７６８】 本実施例において記載される研究は、ガレクチン１１タンパク質の活性を試験
した。しかし、当業者は、ガレクチン１１のポリヌクレオチドの活性（例えば、
遺伝子治療）、ガレクチン１１のアゴニスト、および／またはアンタゴニストを
試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。The study described in this example tested the activity of the galectin-11 protein. However, those skilled in the art will recognize that the activity of the galectin 11 polynucleotide (eg,
Gene therapy), agonists and / or antagonists of galectin 11 can be readily modified from the illustrated studies.
【０７６９】 （実施例３３：血管内皮細胞の増殖に対するガレクチン１１ポリペプチドの
効果） １日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、２〜５×１０4細胞／３５
ｍｍディッシュ密度で、４％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１６ユニット／ｍｌヘパ
リン、および５０ユニット／ｍｌ内皮細胞増殖補充物（ＥＣＧＳ，Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ，Ｉｎｃ）を含むＭ１９９培地中に播種する。２日目に、その培
地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含むＭ１９９に置換し、配列
番号２のガレクチン１１タンパク質および陽性コントロール（例えば、ＶＥＧＦ
および塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度で添加する。４日目および６日
目に、その培地を置換する。８日目に、細胞数を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔ
ｅｒを用いて決定する。Example 33: Effect of Galectin-11 Polypeptide on Proliferation of Vascular Endothelial Cells On the first day, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were transformed with 2-5 × 10 4 cells / 35
At a mm dish density, 4% fetal bovine serum (FBS), 16 units / ml heparin, and 50 units / ml endothelial cell growth supplement (ECGS, Biotec)
hniques, Inc.). On day 2, the medium was replaced with M199 containing 10% FBS, 8 units / ml heparin, the galectin 11 protein of SEQ ID NO: 2 and a positive control (eg, VEGF
And basic FGF (bFGF)) at various concentrations. On days 4 and 6, the medium is replaced. On day 8, cell counts were determined using Coulter Count.
er.
【０７７０】 ＨＵＶＥＣ細胞の数の増加は、ガレクチン１１が、血管内皮細胞を増殖し得る
ことを示す。[0770] An increase in the number of HUVEC cells indicates that galectin 11 can proliferate vascular endothelial cells.
【０７７１】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性
、ガレクチン１１ポリペプチドのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを試
験し得る。The study described in this example tests activity on the galectin-11 protein. However, one of ordinary skill in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a polynucleotide (eg, gene therapy) encoding a galectin-11 polypeptide, an agonist and / or antagonist of a galectin-11 polypeptide.
【０７７２】 （実施例３４：血管内皮細胞の増殖に対するガレクチン１１の刺激効果） 増殖因子の有糸***活性の評価について、比色ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチ
ルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（
４−スルホフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを、電子共役試薬ＰＭＳ
（フェナジンメトスルフェート）を用いて行った（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６Ａ
Ｑ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を、９６ウェルプレート中に、０．１ｍＬの血清補
充培地中で（５，０００細胞／ウェル）で播種し、そして一晩付着させる。０．
５％ＦＢＳにおける１２時間の血清飢餓の後、ヘパリン（８Ｕ／ｍｌ）を伴うか
または伴わない条件（０．５％ ＦＢＳ中のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ165またはガレ
クチン１１）を、ウェルに４８時間添加する。２０ｍｇのＭＴＳ／ＰＭＳ混合物
（１：０．０５）を、１ウェルあたりに添加し、そしてＥＬＩＳＡプレートリー
ダーにおいて４９０ｎｍで吸光度を測定する前に、３７℃で１時間インキュベー
トさせる。コントロールウェル（同じ培地、細胞なし）からのバックグラウンド
吸光度を減じ、そして７つのウェルを、並行して各条件について行う。Ｌｅａｋ
ら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ：５１２−５１８
（１９９４）を参照のこと。(Example 34: Stimulating effect of galectin 11 on proliferation of vascular endothelial cells) For evaluation of mitotic activity of growth factors, colorimetric MTS (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (
4-sulfophenyl) 2H-tetrazolium) assay was performed using the electron conjugate reagent PMS
(Phenazine methosulfate) (CellTiter 96A)
Q, Promega). Cells are seeded in 96-well plates in 0.1 mL of serum-supplemented medium (5,000 cells / well) and allowed to attach overnight. 0.
After 12 hours serum starvation in 5% FBS, conditions (bFGF, VEGF 165 or galectin 11 in 0.5% FBS) with or without heparin (8 U / ml) are added to the wells for 48 hours. 20 mg of the MTS / PMS mixture (1: 0.05) is added per well and allowed to incubate at 37 ° C. for 1 hour before measuring absorbance at 490 nm in an ELISA plate reader. Background absorbance from control wells (same medium, no cells) is reduced, and 7 wells are run for each condition in parallel. Leak
Et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 30A: 512-518
(1994).
【０７７３】 本実施例において記載される試験は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験した。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The tests described in this example tested activity on the galectin-11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０７７４】 （実施例３５：ＰＤＧＦ誘導された血管平滑筋細胞増殖刺激効果の阻害） ＨＡｏＳＭＣ増殖は、例えば、ＢｒｄＵｒｄ取り込みによって測定され得る。
簡潔には、４チャンバスライド上で増殖されたサブコンフルエントな、静止細胞
を、ＣＲＰまたはＦＩＴＣで標識したＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。
次いで、この細胞を、１０％ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌ ＢｒｄＵｒｄでパル
ス刺激する。２４時間後、免疫細胞化学を、ＢｒｄＵｒｄ染色キット（Ｚｙｍｅ
ｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いることによって行う。簡潔には、この細
胞を、変性溶液に曝露後にビオチン化マウス抗ＢｒｄＵｒｄ抗体とともに、４℃
で２時間インキュベートし、次いで、ストレプトアビジンペルオキシダーゼおよ
びジアミノベンジジンとともにインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染
色の後、この細胞を、顕微鏡検査のためにマウントし、そしてＢｒｄＵｒｄ陽性
細胞を計数する。ＢｒｄＵｒｄ指数を、細胞数の合計に対するＢｒｄＵｒｄ陽性
細胞の割合として算出する。さらに、ＢｒｄＵｒｄ染色（核）およびＦＩＴＣ取
り込み（細胞質）の同時検出を、個々の細胞について、明野照明および暗野ＵＶ
蛍光照明の同時使用によって行う。Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．６：２７１（３６）２１９８５−２１９９２（１９９６）を参照のこと。Example 35 Inhibition of PDGF-Induced Stimulation of Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation HAoSMC proliferation can be measured, for example, by BrdUrd uptake.
Briefly, subconfluent, quiescent cells grown on 4-chamber slides are transfected with CRP or FITC labeled AT2-3LP.
The cells are then pulsed with 10% bovine serum and 6 mg / ml BrdUrd. Twenty-four hours later, immunocytochemistry was performed using a BrdUrd staining kit (Zyme
d Laboratories). Briefly, the cells were incubated with a biotinylated mouse anti-BrdUrd antibody at 4 ° C. after exposure to a denaturing solution.
For 2 hours and then with streptavidin peroxidase and diaminobenzidine. After counterstaining with hematoxylin, the cells are mounted for microscopic examination and BrdUrd positive cells are counted. The BrdUrd index is calculated as the ratio of BrdUrd positive cells to the total number of cells. In addition, simultaneous detection of BrdUrd staining (nuclei) and FITC uptake (cytoplasm) was performed for individual cells by light field illumination and dark field UV.
This is done by using fluorescent light simultaneously. Hayashida et al. Biol. Ch
em. 6: 271 (36) 21985-21992 (1996).
【０７７５】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The study described in this example tests activity on the galectin-11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０７７６】 （実施例３６：内皮移動の刺激） 本実施例を用いて、ガレクチン１１が、リンパ球内皮細胞移動を刺激し得る可
能性を探索する。Example 36 Stimulation of Endothelial Migration Using this example, we explore the potential of galectin 11 to stimulate lymphocyte endothelial cell migration.
【０７７７】 内皮細胞移動アッセイを、４８ウェル微小化学遊走性チャンバ（Ｎｅｕｒｏｐ
ｒｏｂｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ、ＭＤ；Ｆａｌｋ，Ｗ．ら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９８０；３３−２３９−２４７
）を使用して実施する。８μｍの孔サイズを有するポリビニルピロリドンを含ま
ないポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、０．１％ゼラチンを用いて、少なくとも６時間室温でコ
ーティングし、そして滅菌空気下で乾燥する。試験物質を、０．２５％のウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＭ１９９中で適切な濃度に希釈し、そして２
５μｌの最終希釈物を、改変したＢｏｙｄｅｎ装置のより低いチャンバに配置す
る。サブコンフルエントの初期継代（２−６）ＨＵＶＥＣまたはＢＭＥＣの培養
物を洗浄し、細胞剥離を達成するに必要な最小限の時間トリプシン処理する。よ
り低いチャンバとより高いチャンバとの間のフィルターを配置した後、１％ Ｆ
ＢＳを含む５０μｌのＭ１９９に懸濁した２．５×１０5細胞を、より高いチャ
ンバ中に播種する。次いで、この装置を、５時間、３７℃で細胞移動をさせる５
％ ＣＯ2を含む加湿チャンバ中でインキュベートする。インキュベーション時
間後、このフィルターを取り除き、そして非移動性の細胞を有するフィルターの
上側を、ラバーポリスマンを用いて掻き取る。このフィルターを、メタノールを
用いて固定し、そしてギムザ溶液（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ、Ｂａｘｔｅｒ、Ｍｃ
Ｇｒａｗ Ｐａｒｋ ＩＬ）を用いて染色する。移動を、各々のウェル中の３つ
のランダムな高電力野（４０×）の細胞を計数することによって定量し、そして
全ての群を、四連で行う。The endothelial cell migration assay was performed using a 48-well microchemotactic chamber (Neurop
robe Inc. Fabin, W., Cabin John, MD; J. et al. I
Munological Methods 1980; 33-239-247
). Polyvinylpyrrolidone-free polycarbonate filter with a pore size of 8 μm (Nucleopore Corp. Cumb)
(Ridge, MA) is coated with 0.1% gelatin for at least 6 hours at room temperature and dried under sterile air. The test substance is diluted to the appropriate concentration in M199 supplemented with 0.25% bovine serum albumin (BSA) and
Place 5 μl of the final dilution in the lower chamber of the modified Boyden instrument. The sub-confluent early passage (2-6) HUVEC or BMEC culture is washed and trypsinized for the minimum time necessary to achieve cell detachment. After placing the filter between the lower and higher chambers, 1% F
2.5 × 10 5 cells suspended in 50 μl M199 containing BS are seeded in the higher chamber. The device is then allowed to migrate for 5 hours at 37 ° C.
They are incubated in a humidified chamber containing a% CO 2. After the incubation period, the filter is removed and the top of the filter with immobile cells is scraped off with a rubber policeman. The filter was fixed using methanol and Giemsa solution (Diff-Quick, Baxter, Mc
Stain using (Grow Park IL). Migration is quantified by counting 3 random high power field (40 ×) cells in each well, and all groups are performed in quadruplicate.
【０７７８】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The study described in this example tests activity on the galectin-11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０７７９】 （実施例３７：内皮細胞による一酸化窒素産生の刺激） 血管内皮によって放出された一酸化窒素は、血管内皮弛緩のメディエーターで
あると考えられる。従って、ガレクチン１１活性は、ガレクチン１１に対する内
皮細胞による一酸化窒素の産生の決定によってアッセイされ得る。Example 37: Stimulation of Nitric Oxide Production by Endothelial Cells Nitric oxide released by vascular endothelium is thought to be a mediator of vascular endothelial relaxation. Thus, galectin-11 activity can be assayed by determining the production of nitric oxide by endothelial cells on galectin-11.
【０７８０】 一酸化窒素を、２４時間の飢餓、および種々のレベルの陽性コントロール（例
えば、ＶＥＧＦ−１）およびガレクチン１１に対する続いての４時間の曝露の後
のコンフルエントの微小血管内皮細胞の９６ウェルのプレート中で測定する。そ
の培地中の一酸化窒素を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬の使用によって、決定してニトレー
トレダクターゼによる一酸化窒素由来のニトレートの還元の後の亜硝酸塩の合計
を測定する。一酸化窒素放出に対するガレクチン１１の効果をＨＵＶＥＣに対し
て試験する。[0780] Nitric oxide was added to 96 wells of confluent microvascular endothelial cells after 24 hours of starvation and subsequent 4 hours of exposure to various levels of positive control (eg, VEGF-1) and galectin-11. Measure in plate. Nitric oxide in the medium is determined by using the Griess reagent to determine the total nitrite after reduction of nitrate from nitric oxide by nitrate reductase. The effect of galectin-11 on nitric oxide release is tested against HUVEC.
【０７８１】 簡潔には、培養されたＨＵＶＥＣの単層からのＮＯ放出を、ＮＯメーター（Ｉ
ｓｏ−ＮＯ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎ
ｃ．）（１０４９）に接続されたＮＯ特異的なポーラログラフ電極を用いて測定
する。ＮＯ要素の較正を、以下の等式に従って行う。[0781] Briefly, NO release from cultured HUVEC monolayers was measured using a NO meter (I
so-NO, World Precision Instruments In
c. ) Measurement is performed using a NO-specific polarographic electrode connected to (1049). Calibration of the NO element is performed according to the following equation:
【０７８２】 ２ＫＮＯ2＋２ＫＩ＋２Ｈ2ＳＯ4＝２ＮＯ＋Ｉ2＋２Ｈ2Ｏ＋２Ｋ2ＳＯ4 標準的な較正曲線を、等級付けした濃度のＫＮＯ2（０、５、１０、２５、５
０、１００、２５０および５００ｎｍｏｌ／Ｌ）をＫＩおよびＨ2ＳＯ4を含む較
正溶液中に加えることによって得る。Ｉｓｏ−ＮＯ電極のＮＯに対する特異性は
、以前に、真正のＮＯガス（１０５０）からのＮＯの測定によって決定されてい
る。この培養培地を除き、そしてＨＵＶＥＣをＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化
生理食塩水で２回洗浄する。次いで、この細胞を、濾過した５ｍｌのＫｒｅｂｓ
−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液を６ウェルのプレート中にバッチし、そしてこの細胞
プレートを、スライドウォーマー（Ｌａｂ Ｌｉｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
Ｉｎｃ．）上で維持する。温度を３７℃に維持する。ＮＯセンサープローブを
、そのウェル中に垂直に挿入し、その異なる条件の添加の前に、電極の尖端を、
溶液の表面の下２ｍｍに維持する。Ｓ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡ
Ｐ）を陽性コントロールとして用いる。放出されたＮＯの量を、１×１０6内皮
細胞あたりのピコモルで表す。報告されたすべての値は、各群における４〜６の
測定値の平均である（細胞培養ウェル数）。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎ
ｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を
参照のこと。[0782] 2KNO 2 + 2KI + 2H 2 SO 4 = 2NO + I 2 + 2H 2 O + 2K 2 SO 4 Standard calibration curves, grades with concentrations of KNO 2 (0,5,10,25,5
0, 100, 250 and 500 nmol / L) in a calibration solution containing KI and H 2 SO 4 . The specificity of the Iso-NO electrode for NO has been previously determined by measuring NO from authentic NO gas (1050). The culture medium is removed and the HUVEC is washed twice with Dulbecco's phosphate buffered saline. The cells were then filtered with 5 ml of filtered Krebs.
-Henseleit solution is batched into a 6-well plate and the cell plate is placed on a slide warmer (Lab Line Instruments).
Inc. ) Keep on. Maintain temperature at 37 ° C. The NO sensor probe is inserted vertically into the well, and before the addition of the different conditions, the tip of the electrode is
Maintain 2 mm below the surface of the solution. S-Nitrosoacetylpenicillamine (SNA
P) is used as a positive control. The amount of NO released is expressed in picomoles per 1 × 10 6 endothelial cells. All values reported are the average of 4-6 measurements in each group (cell culture wells). Leak et al., Biochem. an
d Biophys. Res. Comm. 217: 96-105 (1995).
【０７８３】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The studies described in this example test for activity on the galectin-11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０７８４】 （実施例３８：血管形成における臍形成に対するガレクチン１１の効果） 血管形成における別の工程は、臍形成である。これは、内皮細胞の分化によっ
て特徴付けられる。このバイオアッセイは、微小血管内皮細胞がインビトロで培
養される場合に、毛細管様の構造（中空構造）を形成する能力を測定する。Example 38: Effect of Galectin 11 on Navel Formation in Angiogenesis Another step in angiogenesis is umbilical formation. It is characterized by endothelial cell differentiation. This bioassay measures the ability of microvascular endothelial cells to form capillary-like structures (hollow structures) when cultured in vitro.
【０７８５】 ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）を、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
，Ｉｎｃ．から増殖性（継代２）細胞として購入し、そしてＣｅｌｌ ＡＰｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓのＣＡＤＭＥＣ増殖培地中で培養し、そして継代５で使用する
。インビトロ血管形成アッセイについて、４８ウェル細胞培養プレートのウェル
をＣｅｌｌ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓのＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ
Ｍｅｄｉｕｍ（２００ｍｌ／ウェル）で３０分間、３７℃でコーティングする
。ＣＡＤＭＥＣを、７，５００細胞／ウェルでコーティングしたウェルに播種し
、そして一晩増殖培地で増殖する。次いで、この増殖培地を、３００ｍｇ Ｃｅ
ｌｌ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓのＣｈｏｒｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉ
ｕｍ（コントロール緩衝液またはガレクチン１１（０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）
を含む）に置き換え、そしてその細胞を、さらに４８時間培養する。毛細管様の
臍の数および長さを、Ｂｏｅｃｋｅｌｅｒ ＶＩＡ−１７０のビデオ画像分析機
の使用を通じて定量する。全てのアッセイを三連で行う。[0785] CADEC (microvascular endothelial cells) was purchased from Cell Applications.
, Inc. Purchased as proliferating (passage 2) cells from Cell APpl
cultures in the I.CATIONs CADME growth medium and used at passage 5. For the in vitro angiogenesis assay, the wells of a 48-well cell culture plate were harvested using the Attachment Factor from Cell Applications.
Coat with Medium (200 ml / well) for 30 minutes at 37 ° C. CADMECs are seeded into coated wells at 7,500 cells / well and grown overnight in growth media. The growth medium was then added to 300 mg Ce
ll Applications' Chord Formation Media
um (control buffer or galectin 11 (0.1-100 ng / ml)
And the cells are cultured for an additional 48 hours. The number and length of capillary-like navels are quantified through the use of a Boeckeler VIA-170 video image analyzer. All assays are performed in triplicate.
【０７８６】 市販（Ｒ＆Ｄ）のＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして用
いる。ｂ−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を、陰性コントロールとして用い
る。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして利用する。[0786] Commercially available (R & D) VEGF (50 ng / ml) is used as a positive control. b-estradiol (1 ng / ml) is used as a negative control. An appropriate buffer (no protein) is also used as a control.
【０７８７】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The studies described in this example test activity on the galectin-11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０７８８】 （実施例３９：ニワトリ漿尿膜に対する血管形成効果） ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）は、血管形成を試験するための充分に確立された系
である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に可視性であり、そして定量可能であ
る。ガレクチン１１がＣＡＭにおける血管形成を刺激する能力が、試験され得る
。Ｗｈｉｔｅ Ｌｅｇｈｏｒｎ ｃｈｉｃｋ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）の
受精卵および日本ウズラ（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｃｏｔｕｒｎｉｘ）を、３７．８
℃および８０℃の湿度で孵化する。１６日齢のニワトリおよび１３日齢のウズラ
の胚の分化したＣＡＭを、以下の方法を用いて研究する。Example 39: Angiogenic Effect on Chick Chorioallantoic Membrane Chick allantois (CAM) is a well-established system for testing angiogenesis. Angiogenesis in the CAM is easily visible and quantifiable. The ability of galectin 11 to stimulate angiogenesis in the CAM can be tested. Fertilized eggs of White Leghorn chicken (Gallus gallus) and Japanese quail (Coturnix coturnix) were cultured at 37.8.
Incubate at 80 ° C and 80 ° C humidity. The differentiated CAMs of 16 day old chicken and 13 day old quail embryos are studied using the following method.
【０７８９】 発生４日目に、ウインドウを、ニワトリ卵の卵の殻の上に作製する。この胚を
、正常な発生についてチェックし、そしてこの卵をセロテープ（登録商標）で封
着する。これらを、さらに、１３日目まで孵化する。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバー
スリップ（Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を、約５ｍｍの直径のディ
クスに切り分ける。滅菌で塩を含まない増殖因子を、蒸留水中に溶解し、そして
約３．３ｍｇ／５ｍｌをディスク上にピペットする。風乾後、反転したディスク
を、ＣＡＭに添加する。３日後、検体を３％グルタルアルデヒドおよび２％ホル
ムアルデヒド中で固定し、そして０．１２Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液中で
リンスする。これら検体の写真を、実体顕微鏡（Ｗｉｌｄ Ｍ８）を用いて撮影
し、そして上記のような半切片化および超薄切片化のために包埋する。コントロ
ールを、キャリアディスクのみを用いて行う。On the fourth day of development, a window is created on the egg shell of a chicken egg. The embryo is checked for normal development and the egg is sealed with Cellotape®. They are further hatched until day 13. Thermanox cover slips (Nunc, Naperville, Ill.) Are cut into discs about 5 mm in diameter. The sterile, salt-free growth factor is dissolved in distilled water and about 3.3 mg / 5 ml is pipetted onto the disc. After air drying, the inverted disc is added to the CAM. Three days later, the specimens are fixed in 3% glutaraldehyde and 2% formaldehyde and rinsed in 0.12 M sodium cacodylate buffer. Pictures of these specimens are taken using a stereomicroscope (Wild M8) and embedded for half sectioning and ultrathin sectioning as described above. Control is performed using only the carrier disk.
【０７９０】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The study described in this example tests activity on the galectin-11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０７９１】 （実施例４０：マウスにおけるマトリゲルイインプラントを用いた血管形成
アッセイ） ガレクチン１１のインビボ血管形成アッセイは、既存の毛細管ネットワークが
マウス細胞外マトリクス材料（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の移植された莢膜中に新たな
血管を形成する能力を測定する。このタンパク質を、液体Ｍａｔｒｉｇｅｌとと
もに、４℃で混合し、次いでこの混合物を、マウスに皮下注射し、そこで、固化
させる。７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌの固体の「プラグ」を取り出し、そして新た
な血管の存在について検査する。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ／Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入する。Example 40: Angiogenesis Assay Using Matrigelii Implants in Mice The in vivo angiogenesis assay for galectin-11 shows that an existing capillary network is encapsulated in a transplanted capsule of mouse extracellular matrix material (Matrigel). Measure the ability to form new blood vessels. The protein is mixed with liquid Matrigel at 4 ° C., and the mixture is then injected subcutaneously into mice, where it solidifies. After 7 days, the Matrigel solid "plug" is removed and examined for the presence of new blood vessels. Matrigel, Becton Dick
inson Labware / Collaborative Biomedic
Purchased from al Products.
【０７９２】 ４℃で解凍される場合、Ｍａｔｒｉｇｅｌ材料は液体である。Ｍａｔｒｉｇｅ
ｌを、ガレクチン１１と１５０ｎｇ／ｍｌで、４℃で混合し、そして冷３ｍｌの
シリンジに入れる。雌性Ｃ５７Ｂ１／６マウス（約８週齢）に、Ｍａｔｒｉｇｅ
ｌと実験タンパク質の混合物を、腹の中腹局面での２部位に注射する（０．５ｍ
ｌ／部位）。７日後、このマウスを頚部脱臼によって屠殺し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ
プラグを取り出し、そして洗浄（すなわち、すべての粘着膜および繊維性組織を
取り除く）。複製の全体プラグを、中性緩衝化１０％ホルムアルデヒド中に固定
し、パラフィン包埋し、そしてこれを用いてＭａｓｓｏｎのＴｒｉｃｈｒｏｍｅ
での染色後の組織検査のための切片を作製した。各プラグの３つの異なる領域か
らの切片を処理する。選択した切片を、ｖＷＦの存在について染色する。このア
ッセイについての陽性コントロールは、ウシ塩基性ＦＧＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）
である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ単独を用いて、血管形成の基底レベルを決定する。[0792] When thawed at 4 ° C, the Matrigel material is a liquid. Matrige
1 is mixed with Galectin 11 at 150 ng / ml at 4 ° C. and placed in a cold 3 ml syringe. Female C57B1 / 6 mice (about 8 weeks of age) were injected with Matrige
and a mixture of the experimental protein are injected at two sites (0.5 m
1 / site). Seven days later, the mice were sacrificed by cervical dislocation and Matrigel
Remove the plug and wash (ie, remove all cohesive film and fibrous tissue). The entire plug of replication was fixed in neutral buffered 10% formaldehyde, embedded in paraffin, and used with Masson's Trichrome.
A section was prepared for histological examination after staining with the kit. Sections from three different regions of each plug are processed. Selected sections are stained for the presence of vWF. The positive control for this assay was bovine basic FGF (150 ng / ml)
It is. Matrigel alone is used to determine the basal level of angiogenesis.
【０７９３】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The study described in this example tests activity on the galectin-11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０７９４】 （実施例４１：ウサギ下肢モデルにおける虚血の救出） 虚血に対するガレクチン１１のインビボ効果を研究するために、ウサギの後肢
虚血モデルを、以前に記載される（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ、Ｓ．ら、Ａｍ Ｊ．Ｐ
ａｔｈｏｌ １４７：１６４９−１６６０（１９９５））ように１つの大腿動脈
の手術除去により作製する。大腿動脈の切除は、血栓の逆行性性増殖および外来
の腸骨動脈の閉塞を生じる。結果として、虚血性肢への血流は、腸骨動脈から生
じる副行血管に依存する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ、Ｓ．ら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏ
ｌ １４７：１６４９−１６６０（１９９５））。１０日の間隔は、ウサギの術
後の回復および内皮性の副行血管の発生を可能にする。１０日の術後（０日目）
にて、基底線の血管造影を行った後、虚血性の肢の腸骨動脈を、５００ｍｇの、
ガレクチン１１の裸の発現プラスミドで、記載される（Ｒｉｅｓｓｅｎ、Ｒ．ら
、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９３）；Ｌｅｃｌｅ
ｒｃ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４（１９９２
））ようなヒドロゲルコーティングしたバルーンカテーテルを用いた動脈遺伝子
移入技術によってトランスフェクトする。ガレクチン１１を処置において使用す
る場合、５００ｍｇのガレクチン１１タンパク質またはコントロールの単回ボー
ラスを、虚血性肢の腸骨動脈へと１分間で、注入カテーテルを通じて送達する。
３０日目に、種々のパラメータを、これらのウサギにおいて測定する：（ａ）Ｂ
Ｐ比率−正常な肢の収縮期圧に対する、虚血性肢の収縮期圧の血圧比率；（ｂ）
血流および流保存−静止ＦＬ：拡張していない状態の間の血流および最大ＦＬ：
完全に拡張した状態の間の血流（また、血管量の間接的な縮尺である）、そして
流保存は最大ＦＬ：静止ＦＬの比に反映される；（ｃ）血管造影値−これは、副
行血管の血管造影によって測定される。値は、ウサギの腿における合計数によっ
て割った交叉する不透明化動脈を伴う重複グリッドにおける丸の割合によって決
定される；（ｄ）毛細管密度−後肢からとった光顕微鏡切片において決定した副
行毛細管の数。Example 41: Rescue of ischemia in a rabbit lower limb model To study the in vivo effects of galectin-11 on ischemia, a rabbit hind limb ischemia model was previously described (Takeshita, S. et al.). , Am JP
atol 147: 1649-1660 (1995)) by surgical removal of one femoral artery. Resection of the femoral artery results in retrograde growth of thrombus and occlusion of the foreign iliac artery. As a result, blood flow to the ischemic limb is dependent on collateral vessels originating from the iliac artery (Takeshita, S. et al., Am J. Patho.
1 147: 1649-1660 (1995)). The 10-day interval allows for post-operative recovery and the development of endothelial collateral vessels in rabbits. 10 days after surgery (day 0)
After performing baseline angiography, the iliac artery of the ischemic limb was
Galectin-11 naked expression plasmid is described (Riessen, R. et al., Hum Gene Ther. 4: 749-758 (1993); Lecle
rc, G .; J. et al. Clin. Invest. 90: 936-944 (1992)
Transfection by the arterial gene transfer technique using a hydrogel-coated balloon catheter as in)). When Galectin-11 is used in the treatment, a single bolus of 500 mg Galectin-11 protein or control is delivered through the infusion catheter to the iliac artery of the ischemic limb in one minute.
On day 30, various parameters are measured in these rabbits: (a) B
P ratio-blood pressure ratio of ischemic limb systolic pressure to normal limb systolic pressure; (b)
Blood flow and flow preservation-rest FL: blood flow and max FL during unexpanded state:
Blood flow during full dilation (also an indirect scale of vascular volume), and flow preservation is reflected in the maximum FL: static FL ratio; (c) angiographic values- It is measured by angiography of collateral vessels. Values are determined by the percentage of circles in the overlapping grid with intersecting opacified arteries divided by the total number in rabbit thighs; (d) Capillary density-collateral capillaries determined in light microscopic sections taken from hind limbs number.
【０７９５】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The studies described in this example test activity on the galectin-11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０７９６】 （実施例４２：血管拡張に対するガレクチン１１の効果） 血管内皮の拡張が血圧降下に重要であることから、高血圧自然発症ラット（Ｓ
ＨＲ）における血圧にガレクチン１１ポリペプチドが影響を与える能力を試験す
る。漸増用量（０、１０、３０、１００、３００および９００ｍｇ／ｋｇ）のガ
レクチン１１を、１３〜１４週齢の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）に投与する
。データを、平均±ＳＥＭで表現する。統計学的分析を、両側ｔ検定で行い、そ
して統計的有意を、緩衝液単独に対する応答に対するｐ＜０．０５として規定す
る。(Example 42: Effect of galectin 11 on vasodilation) Since dilation of vascular endothelium is important for lowering blood pressure, spontaneously hypertensive rats (S
Test the ability of galectin-11 polypeptide to affect blood pressure in HR). Increasing doses (0, 10, 30, 100, 300 and 900 mg / kg) of galectin 11 are administered to 13-14 week old spontaneously hypertensive rats (SHR). Data are expressed as mean ± SEM. Statistical analysis is performed with a two-tailed t-test, and statistical significance is defined as p <0.05 for response to buffer alone.
【０７９７】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The study described in this example tests activity on the galectin-11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０７９８】 （実施例４３：ラット虚血皮膚皮弁モデル） 評価パラメータとしては、皮膚血流、皮膚温度および第ＶＩＩＩ因子免疫組織
化学もしくは内皮アルカリホスファターゼ反応が挙げられる。皮膚虚血の間のガ
レクチン１１発現を、インサイチュハイブリダイゼーションを用いて研究する。Example 43: Rat Ischemic Skin Flap Model Evaluation parameters include skin blood flow, skin temperature, and Factor VIII immunohistochemistry or endothelial alkaline phosphatase reaction. Galectin-11 expression during cutaneous ischemia is studied using in situ hybridization.
【０７９９】 このモデルにおける研究を、以下の３つの部分に分割する： ａ）虚血性皮膚 ｂ）虚血性皮膚創傷 ｃ）正常創傷。The study in this model is divided into three parts: a) ischemic skin b) ischemic skin wound c) normal wound.
【０８００】 実験プロトコルは以下を包含する： ａ）３×４ｃｍの単一の茎完全厚のランダム皮弁（動物の腰にわたる筋皮弁） ｂ）虚血性皮膚（皮弁）における切除創傷（４−６ｍｍ直径） ｃ）以下の種々の投薬量範囲での切除創傷のガレクチン１１を用いた局所処置
（創傷後０日目、１日目、２日目、３日目、４日目）：１ｍｇ〜１００ｍｇ ｄ）創傷後３日目、５日目、７日目、１０日目、１４日目および２１日目での
創傷組織を、組織学的研究、免疫組織化学的研究およびインサイチュ研究のため
の採取。The experimental protocol includes: a) a single stem full thickness random flap of 3 × 4 cm (muscle flap over the waist of the animal) b) resected wound on ischemic skin (flap) (4) C) topical treatment of resected wounds with galectin 11 (day 0, 1, 2, 3 and 4 after wounding) in the following different dosage ranges: 1 mg -100 mg d) Wound tissues at 3, 5, 7, 10, 14, and 21 days after wounding were used for histological, immunohistochemical and in situ studies Sampling.
【０８０１】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The study described in this example tests activity on the galectin-11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０８０２】 （実施例４４：末梢動脈疾患モデル） ガレクチン１１を用いた血管形成治療は、末端動脈疾患の場合における虚血の
周りの血流の回復を得るための新たな治療戦略である。この実験プロトコルは以
下を包含する： ａ）大腿動脈の一方の側を結紮して、後肢の虚血性筋肉を作製し、後肢の他方
の側をコントロールとして作用させる ｂ）２０ｍｇ−５００ｍｇの投薬量範囲のガレクチン１１タンパク質を、１週
間に３回（おそらくそれより多い）を２〜３週間静脈内送達および／または筋肉
内送達する ｃ）この虚血性筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、１週間、２週間および３週間
にて、ガレクチン１１発現および組織学の分析のために収集する。生検を、対側
の後肢の正常筋肉の他方の側においてもまた行う。Example 44 Peripheral Artery Disease Model Angioplasty treatment with galectin 11 is a new therapeutic strategy to obtain a restoration of blood flow around ischemia in the case of terminal arterial disease. This experimental protocol involves: a) ligating one side of the femoral artery to create hindlimb ischemic muscle and acting on the other side of the hindlimb as a control b) dosage range of 20 mg-500 mg C) intravenously and / or intramuscularly three times a week (possibly more) for 2-3 weeks c). At two and three weeks, galectin-11 expression and histology are collected. A biopsy is also performed on the other side of the normal muscle of the contralateral hind limb.
【０８０３】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The study described in this example tests activity on the galectin 11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０８０４】 （実施例４５：虚血性心筋疾患モデル） ガレクチン１１を、副行血管の発生を刺激し得、そして冠状動脈閉塞後の新た
な血管の再構成をし得る強力なマイトジェンとして評価する。ガレクチン１１発
現の変化を、インサイチュで調査する。この実験プラスミドは以下を包含する： ａ）心臓を、ラットにおける左側の開胸を通じて露出させる。直ぐに、左の冠
状動脈を、薄い縫合（６−０）で閉塞させ、そして胸郭を閉塞させる ｂ）２０ｍｇ−５００ｍｇの投薬量範囲のガレクチン１１タンパク質を、静脈
内および／または筋肉内で、１週間に３回（おそらくそれより多い）２から４週
間送達する ｃ）術後３０日にて、心臓を取り出し、そして形態測定のために切片化し、そ
してインサイチュで分析する。Example 45: Ischemic myocardial disease model Galectin 11 is evaluated as a potent mitogen that can stimulate the development of collateral vessels and reconstitute new vessels after coronary artery occlusion. Changes in galectin 11 expression are investigated in situ. The experimental plasmids include: a) The heart is exposed through the left thoracotomy in rats. Immediately occlude the left coronary artery with thin sutures (6-0) and occlude the thorax b) Galectin-11 protein in a dosage range of 20 mg-500 mg, intravenously and / or intramuscularly for 1 week C. 3 times (possibly more) for 2 to 4 weeks c) At 30 days post-operative, hearts are removed and sectioned for morphometry and analyzed in situ.
【０８０５】 本実施例において記載された研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性
を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、ガレクチン
１１ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）の活性、ガレクチン１１のアゴニ
ストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。The study described in this example tests activity on the galectin-11 protein. However, one skilled in the art can readily modify the illustrated studies to test the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), an agonist and / or antagonist of galectin-11.
【０８０６】 （実施例４６：ラット角膜創傷治癒モデル） この動物モデルは、新生血管形成に対するガレクチン１１の効果を示す。この
実験プロトコルは、以下を包含する： ａ）間質層へ角膜の中心からの１〜１．５ｍｍ長の切込みを入れる ｂ）スパーテルを、目の外側の角に面する切込みのリップの下に挿入する ｃ）ポケットを作製する（そのベースは、目の端から１〜１．５ｍｍに存在す
る） ｄ）５０ｎｇから５ｕｇのガレクチン１１を含有するペレットを、ポケット内
に配置する ｅ）ガレクチン１１処置もまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲の投薬量（５日
間毎日処置する）で角膜損傷に局所的に適用し得る。Example 46: Rat Corneal Wound Healing Model This animal model shows the effect of galectin 11 on neovascularization. This experimental protocol involves: a) making a 1-1.5 mm long cut from the center of the cornea into the stromal layer b) placing the spatula under the cut lip facing the outer corner of the eye Insert c) Create pocket (its base is 1-1.5 mm from the end of the eye) d) Place a pellet containing 50 ng to 5 ug of galectin 11 in the pocket e) Galectin 11 treatment May also be applied topically to corneal injury at dosages ranging from 20 mg to 500 mg (treated daily for 5 days).
【０８０７】 この実施例に記載される研究は、ガレクチン１１タンパク質における活性を試
験した。しかし、当業者は、ガレクチン１１ポリヌクレオチドの活性を試験する
ための例示的な研究（例えば、遺伝子治療）、ガレクチン１１のアゴニストおよ
び／またはアンタゴニストの活性を試験するための例示的な研究を容易に改変し
得る。The studies described in this example tested activity on the galectin-11 protein. However, those skilled in the art will readily appreciate exemplary studies for testing the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), and for testing the activity of a galectin-11 agonist and / or antagonist. Can be modified.
【０８０８】 （実施例４７：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド障害性創傷治癒モデル
） （Ａ．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル） ガレクチン１１が治癒プロセスを加速し得ることを実証するために、創傷治癒
の遺伝的糖尿病マウスモデルを使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける全厚創
傷治癒モデルは、十分特徴付けられ、臨床的に関連し、そして再現可能な、障害
性創傷治癒のモデルである。糖尿病性創傷の治癒は、収縮よりもむしろ、肉芽組
織の形成および再上皮形成に依存する（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕ
ｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（１９９２）；Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら
、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。Example 47 Diabetic Mice and Glucocorticoid Impaired Wound Healing Model A. Diabetic db + / db + Mouse Model To demonstrate that galectin 11 can accelerate the healing process, inheritance of wound healing The experimental diabetic mouse model is used. The full thickness wound healing model in db + / db + mice is a well-characterized, clinically relevant, and reproducible model of impaired wound healing. Healing of diabetic wounds depends on granulation tissue formation and re-epithelialization rather than contraction (Gartner, MH et al., J. Su).
rg. Res. 52: 389 (1992); Greenhalgh, D.C. G. FIG. Et al., Am. J. Pathol. 136: 1235 (1990)).
【０８０９】 糖尿病動物は、ＩＩ型糖尿病において観察される多くの特有の特徴を有する。
ホモ接合性（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合性（ｄｂ＋
／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満体である。変異体糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウ
スは、第４染色体上に単一の常染色体劣性変異（ｄｂ＋）を有する（Ｃｏｌｅｍ
ａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８３−２９
３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症および多尿症を示す。変異体糖尿病
マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したかまたは正常
なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介性免疫性を有する（Ｍａｎｄｅ
ｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａｙ−Ｓ
ａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１−７（
１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１１４：４６：
４６−５５（１９８５））。末梢ニューロパシー、心筋合併症、ならびに微小血
管損傷、基底膜肥厚化（ｔｈｉｃｋｎｉｎｇ）および糸球体濾過異常は、これら
の動物において記載されている（Ｎｏｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ
．８３（２）：２２１−２３２（１９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６７（１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌ
ａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：４６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａ
ｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１（補遺）：１−６（１９８２））。これ
らのホモ接合性糖尿病マウスは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対し
て抵抗性である高血糖症を発症する（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
２０：１３７５−１３７７（１９７８））。[0809] Diabetic animals have many unique characteristics observed in type II diabetes.
Homozygous (db + / db +) mice show their normal heterozygous (db +
/ + M) Obese compared to littermates. Mutant diabetic (db + / db +) mice have a single autosomal recessive mutation (db +) on chromosome 4 (Colem).
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 283-29
3 (1982)). Animals exhibit polyphagia, polydipsia and polyuria. Mutant diabetic mice (db + / db +) have elevated blood glucose, increased or normal insulin levels, and suppressed cell-mediated immunity (Mande)
J. l et al. Immunol. 120: 1375 (1978); Debray-S
achs, M.A. Et al., Clin. Exp. Immunol. 51 (1): 1-7 (
1983); Leiter et al., Am. J. of Pathol. 114: 46:
46-55 (1985)). Peripheral neuropathy, myocardial complications, and microvascular injury, basement membrane thickening and glomerular filtration abnormalities have been described in these animals (Norido, F. et al., Exp. Neurol).
. 83 (2): 221-232 (1984); Robertson et al., Diab.
etes 29 (1): 60-67 (1980); Giacomelli et al., L.
ab Invest. 40 (4): 460-473 (1979); Colema.
n, D. L. , Diabetes 31 (Supplement): 1-6 (1982)). These homozygous diabetic mice develop hyperglycemia which is similar to human type II diabetes and is resistant to insulin (Mandel et al., J. Immunol. 1).
20: 1375-1377 (1978)).
【０８１０】 これらの動物において観察される特徴は、このモデルにおける治癒がヒト糖尿
病において観察される治癒と類似し得ることを示唆する（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ
ら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０）
）。The characteristics observed in these animals suggest that healing in this model may be similar to that observed in human diabetes (Greenhalghg)
Et al., Am. J. of Pathol. 136: 1235-1246 (1990).
).
【０８１１】 遺伝的糖尿病の雌Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスおよびそれら
の非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究において使用する
（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を、研究の開始
時に６週齢および８週齢にて購入する。動物は個々に収容し、そして食物および
水を適宜与える。全ての操作を、無菌技術を使用して行う。この実験を、Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔ
ｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏ
ｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って
行う。[0813] Genetically diabetic female C57BL / KsJ (db + / db +) mice and their non-diabetic (db + / + m) heterozygous littermates are used in this study (Jackson Laboratories). These animals are purchased at the start of the study at 6 and 8 weeks of age. Animals are housed individually and provided food and water ad libitum. All operations are performed using aseptic techniques. This experiment, Hum
an Genome Sciences, Inc. Institutional
Animal Care and Use Committee and t
he Guidelines for the Care and Useo
f Follow the rules and guidelines of Laboratory Animals.
【０８１２】 創傷プロトコルを、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．およびＲｉｆ
ｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０）
）に従って行う。簡単に述べると、創傷作製の日に、動物を、脱イオン水に溶解
したＡｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノー
ルおよび２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。この動物の背側
の領域を剃毛し、そしてその皮膚を、７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄
する。この外科領域を、創傷作製の前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ミリの全厚
の創傷を、次いで、Ｋｅｙｅｓ組織パンチを使用して作製する。創傷作製直後に
、取り囲む皮膚が穏やかに伸張し、創傷の拡大を排除する。これらの創傷は、実
験の期間の間、開いたままである。この処置の適用を、局所的に、創傷作製の日
を開始として５日間連続して与える。処置の前に、創傷を、滅菌生理食塩水およ
びガーゼスポンジで穏やかに洗浄する。The wound protocol was adapted from previously reported methods (Tsuboi, R. and Rif.
Kin, D.C. B. , J. et al. Exp. Med. 172: 245-251 (1990).
). Briefly, on the day of wound creation, animals were injected intraperitoneally with Avertin (0.01 mg / mL), 2,2,2-tribromoethanol and 2-methyl-2-butanol dissolved in deionized water. Anesthetize. The dorsal area of the animal is shaved and the skin is washed with a 70% ethanol solution and iodine. The surgical area is dried with sterile gauze before making the wound. An 8 mm full thickness wound is then made using a Keyes tissue punch. Immediately after wound creation, the surrounding skin gently stretches, eliminating the spread of the wound. These wounds remain open for the duration of the experiment. The application of this treatment is given topically for 5 consecutive days starting on the day of wound creation. Prior to treatment, the wound is gently washed with sterile saline and gauze sponge.
【０８１３】 創傷を視覚的に検査し、そして手術の日に固定した距離にて写真撮影し、以後
２日間隔で行う。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の日々の測定によって決
定する。創傷を、較正したＪａｍｅｓｏｎカリパスを使用して水平方向および垂
直方向に測定する。肉芽組織がもはや可視ではなく、そして創傷が連続する上皮
によって覆われる場合に、この創傷を治癒したとみなす。The wounds are visually inspected and photographed at a fixed distance on the day of surgery, and are performed at 2 day intervals thereafter. Wound closure is determined by daily measurements on days 1-5 and day 8. Wounds are measured horizontally and vertically using calibrated Jameson calipers. A wound is considered healed if the granulation tissue is no longer visible and the wound is covered by a continuous epithelium.
【０８１４】 ガレクチン１１を、ビヒクル中に、１日に創傷あたり４ｍｇから５００ｍｇま
でのガレクチン１１の、異なる範囲の用量を使用して、８日間投与する。ビヒク
ルコントロール群には、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。Galectin 11 is administered in a vehicle for 8 days using different ranges of doses of galectin 11 from 4 mg to 500 mg per wound per day. The vehicle control group received 50 mL of vehicle solution.
【０８１５】 動物を、ペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を
用いて８日目に安楽死させる。次いで、この創傷および周囲の皮膚を、組織学お
よび免疫組織化学のために採取する。組織標本を、さらなる処理のための生検ス
ポンジの間の組織カセットにおいて、１０％中性緩衝化ホルマリン中におく。各
１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の３つの群を
評価する：１）ビヒクルプラシーボコントロール、２）未処置の群；および３）
処置した群。Animals are euthanized on day 8 using an intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (300 mg / kg). The wound and surrounding skin are then harvested for histology and immunohistochemistry. Tissue specimens are placed in 10% neutral buffered formalin in a tissue cassette between biopsy sponges for further processing. Three groups of 10 animals each (5 diabetic and 5 non-diabetic controls) are evaluated: 1) vehicle placebo control, 2) untreated group; and 3).
The treated group.
【０８１６】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸における面積を測定し、そしてこの創傷の全
面積を得ることによって分析する。次いで、収縮（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）を
、最初の創傷面積（０日目）と処置後の創傷面積（８日目）との間の差異を確立
することによって評価する。１日目における創傷面積は６４ｍｍ2の皮膚パンチ
の対応する大きさである。以下の式を使用して計算を行う： （８日目の開口面積）−（１日目の開口面積）／（１日目の開口面積）。 標本を、１０％緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてパラフィン包埋ブロックを
、創傷表面に対して垂直に区切り（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎ
ｇマイクロトームを使用して切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ
＆Ｅ）染色を、二等分した創傷の断面で行う。この創傷の組織学的検査を使用し
て、治癒プロセスおよび修復された皮膚の形態学的外観がガレクチン１１を用い
る処置によって変更されるか否かを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症性細
胞、毛細管、線維芽細胞、再上皮形成および上皮成熟の存在の確認を含んだ（Ｇ
ｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｔｈｏｌ．１３６：１２３
５（１９９０））。較正したレンズマイクロメーターを、盲目観察者（ｂｌｉｎ
ｄｅｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒ）によって使用する。The wound closure is analyzed by measuring the area in the vertical and horizontal axes and obtaining the total area of the wound. Contraction is then assessed by establishing the difference between the initial wound area (day 0) and the post-treatment wound area (day 8). The wound area on day 1 is the corresponding size of a 64 mm 2 skin punch. The calculation is made using the following formula: (open area on day 8)-(open area on day 1) / (open area on day 1). Specimens were fixed in 10% buffered formalin, and paraffin-embedded blocks were sectioned perpendicular to the wound surface (5 mm), and
g Cut using a microtome. Conventional hematoxylin-eosin (H
& E) Staining is performed on bisected wound sections. The histological examination of this wound is used to assess whether the healing process and the morphological appearance of the repaired skin are altered by treatment with galectin-11. This assessment included confirmation of the presence of cell accumulation, inflammatory cells, capillaries, fibroblasts, reepithelialization and epithelial maturation (G
Reenhalgh, D .; G. FIG. Et al., Am. J. Pathol. 136: 123
5 (1990)). The calibrated lens micrometer is used for blind observer (blin).
Deed observer).
【０８１７】 組織切片もまた、ポリクローナルウサギ抗ヒトケラチン抗体を用いて、ＡＢＣ
Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用して、免疫組織化学的に染色する。ヒトの皮膚
を、ポジティブ組織コントロールとして使用し、一方、非免疫ＩｇＧを、ネガテ
ィブコントロールとして使用する。ケラチノサイトの増殖を、創傷の再上皮形成
の程度を、較正したレンズマイクロメーターを使用して評価することによって決
定する。[0817] Tissue sections were also prepared using a polyclonal rabbit anti-human keratin antibody, ABC
Immunohistochemical staining is performed using the Elite detection system. Human skin is used as a positive tissue control, while non-immune IgG is used as a negative control. Keratinocyte proliferation is determined by assessing the extent of wound re-epithelialization using a calibrated lens micrometer.
【０８１８】 皮膚標本における増殖する細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、抗ＰＣＮ
Ａ抗体（１：５０）をＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを用いて使用することに
よって実証する。ヒト結腸癌をポジティブ組織コントロールとして提供し、そし
てヒト脳組織を、ネガティブ組織コントロールとして使用する。各標本は、一次
抗体の省略および非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含んだ。これらの
切片の順位付けは、０〜８のスケールにおける増殖の程度に基づき、このスケー
ルのより低い側は、わずかな増殖を反映し、より高い側は、激しい増殖を反映す
る。Proliferating cell nuclear antigen / cyclin (PCNA) in skin specimens was
The A antibody (1:50) is demonstrated by using the ABC Elite detection system. Human colon cancer is provided as a positive tissue control, and human brain tissue is used as a negative tissue control. Each specimen contained sections with omission of the primary antibody and replacement with non-immunized mouse IgG. The ranking of these sections is based on the degree of growth on a scale of 0-8, with the lower side of this scale reflecting slight growth and the higher side reflecting vigorous growth.
【０８１９】 実験データを、片側ｔ検定を使用して分析する。０．０５未満のｐ値を有意で
あるとみなす。The experimental data is analyzed using a one-tailed t-test. A p-value less than 0.05 is considered significant.
【０８２０】 （Ｂ．ステロイド障害性ラットモデル） ステロイドによる創傷治癒の阻害は、様々なインビトロおよびインビボ系にお
いて十分検証されてきた（Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ
ａｎｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ．Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａ
ｓｐｅｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）；Ｗａｈｌ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂ，Ｚ．ら、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコイド
は、新脈管形成を阻害して、血管浸透性（Ｅｂｅｒｔ，Ｒ．Ｈ．ら、Ａｎ．Ｉｎ
ｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７０１−７０５（１９５２）、線維芽細胞増殖、およ
びコラーゲン合成（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．５
：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））を減少させることによって、
および循環する単球の一過性減少を生成することによって（Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．
Ｆ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗ
ａｈｌ，Ｓ．Ｍ．，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ
ｈｅａｌｉｎｇ」、Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃ
ｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０〜３０２頁（１９８９））、
創傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒へのステロイドの全身投与は、ラットに
おいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆ
ａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）；Ｗａｈｌ，
Ｓ．Ｍ．，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌ
ｉｎｇ」、Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ
：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２８０〜３０２頁（１９８９）；Ｐｉｅｒｃ
ｅ，Ｇ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２２
２９−２２３３（１９８９））。B. Steroid Impaired Rat Model Inhibition of wound healing by steroids has been well documented in various in vitro and in vivo systems (Wahl, SM Glucocorticoids).
and Wound hearing. Anti-Inflammatory
Steroid Action: Basic and Clinical A
spectras. 280-302 (1989); Wahl, S .; M. J. et al. Im
munol. 115: 476-481 (1975); Werb, Z .; J. et al. E
xp. Med. 147: 1684-1694 (1978)). Glucocorticoids inhibit angiogenesis and increase vascular permeability (Ebert, RH, et al., An. In.
tern. Med. 37: 701-705 (1952), fibroblast proliferation, and collagen synthesis (Beck, LS et al., Growth Factors. 5).
: 295-304 (1991); Haynes, B .; F. J. et al. Clin. I
nvest. 61: 703-797 (1978)).
And by producing a transient decrease in circulating monocytes (Haynes, B .;
F. J. et al. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978); W
ahl, S .; M. , "Glucocorticoids and wound
healing ", Antiinflammation Steroid Ac
Tion: Basic and Clinical Aspects, Acad
emic Press, New York, 280-302 (1989)),
Delays wound healing. Systemic administration of steroids to impaired wound healing is a well-established phenomenon in rats (Beck, LS et al., Growth F
actors. 5: 295-304 (1991); Haynes, B .; F. Et al.,
J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978); Wahl,
S. M. , "Glucocorticoids and wound sound.
ing ", Antiinflammatory Steroid Action Action
: Basic and Clinical Aspects, Academic
Press, New York, 280-302 (1989); Pierc
e, G. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:22
29-2233 (1989)).
【０８２１】 ガレクチン１１が治癒プロセスを加速し得ることを実証するために、ラット（
このラットにおいて、治癒は、メチルプレドニゾロンの全身投与によって障害さ
れている）における全厚切除皮膚創傷（ｆｕｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｅｘｃ
ｉｓｉｏｎａｌ ｓｋｉｎ ｗｏｕｎｄ）に対するガレクチン１１の複数の局所
適用の効果を評価する。To demonstrate that galectin-11 can accelerate the healing process, rats (
In this rat, healing is impaired by systemic administration of methylprednisolone) in a full-thickness excised wound.
The effect of multiple topical applications of galectin 11 on the initial skin wound is evaluated.
【０８２２】 体重２５０〜３００ｇの若年成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃ
ｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、この実施例におい
て使用する。この動物を８週齢にて購入し、そしてこの研究の開始時には９週齢
である。ラットの治癒応答を、創傷時にメチルプレドニゾロンの全身投与（１７
ｍｇ／ｋｇ／ラット、筋肉内）によって、障害させる。動物を個々に収容し、そ
して食物および水を適宜与える。全ての操作を、無菌技術を使用して行う。この
研究を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅ
ｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎ
ｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイド
ラインに従って行う。[0827] Young adult male Sprague Dawley rats weighing 250-300 g (C
harles River Laboratories) is used in this example. The animals are purchased at the age of 8 weeks and are 9 weeks old at the start of the study. The healing response of rats was determined by systemic administration of methylprednisolone (17
mg / kg / rat, intramuscular). Animals are housed individually and provided food and water ad libitum. All operations are performed using aseptic techniques. This work is described in Human Genome Sciences, Inc. Insit
universal Animal Care and Use Committe
e and the Guidelines for the Care an
d. Perform according to the rules and guidelines of Use of Laboratory Animals.
【０８２３】 創傷プロトコルを、上記のＡ節に従って続けて行う。創傷作製の日に、動物を
、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射
で麻酔する。この動物の背側の領域を剃毛し、そしてその皮膚を、７０％エタノ
ール溶液およびヨウ素溶液で洗浄する。この外科領域を、創傷作製の前に滅菌ガ
ーゼで乾燥させる。８ミリの全厚の創傷を、Ｋｅｙｅｓ組織パンチを使用して作
製する。これらの創傷は、実験の期間の間、開いたままである。この試験材料の
適用を、局所的に、創傷の日を開始として７日間連続して、１日１回与え、続い
てメチルプレドニゾロンを投与する。処置の前に、創傷を、滅菌生理食塩水およ
びガーゼスポンジで穏やかに洗浄する。The wound protocol is subsequently performed according to section A above. On the day of wounding, animals are anesthetized with an intramuscular injection of ketamine (50 mg / kg) and xylazine (5 mg / kg). The dorsal area of the animal is shaved and the skin is washed with a 70% ethanol solution and an iodine solution. The surgical area is dried with sterile gauze before making the wound. An 8 mm full thickness wound is created using a Keyes tissue punch. These wounds remain open for the duration of the experiment. Application of the test material is given topically, once daily for 7 consecutive days starting on the day of the wound, followed by administration of methylprednisolone. Prior to treatment, the wound is gently washed with sterile saline and gauze sponge.
【０８２４】 創傷を視覚的に検査し、そして創傷の日および手術の日の最後に固定した距離
にて写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の日々の測定によって
決定する。創傷を、較正したＪａｍｅｓｏｎカリパスを使用して水平方向および
垂直方向に測定する。肉芽組織がもはや可視ではなく、そして創傷が連続する上
皮によって覆われる場合に、この創傷を治癒したとみなす。The wounds are visually inspected and photographed at a fixed distance at the end of the day of the wound and day of surgery. Wound closure is determined by daily measurements on days 1-5 and day 8. Wounds are measured horizontally and vertically using calibrated Jameson calipers. A wound is considered healed if the granulation tissue is no longer visible and the wound is covered by a continuous epithelium.
【０８２５】 ガレクチン１１を、ビヒクル中に、１日に創傷あたり４ｍｇから５００ｍｇま
でのガレクチン１１の、異なる範囲の用量を使用して、８日間投与する。ビヒク
ルコントロール群には、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。Galectin-11 is administered in a vehicle for 8 days using different ranges of doses of galectin-11 from 4 mg to 500 mg per wound per day. The vehicle control group received 50 mL of vehicle solution.
【０８２６】 動物を、ペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を
用いて８日目に安楽死させる。次いで、この創傷および周囲の皮膚を、組織学の
ために採取する。組織標本を、さらなる処理のための生検スポンジの間の組織カ
セットにおいて、１０％中性緩衝化ホルマリン中におく。Animals are euthanized on day 8 using an intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (300 mg / kg). The wound and surrounding skin are then harvested for histology. Tissue specimens are placed in 10% neutral buffered formalin in a tissue cassette between biopsy sponges for further processing.
【０８２７】 各１０匹の動物（５匹はメチルプレドニゾロンあり、および５匹は糖質コルチ
コイドなし）の４つの群を評価する： １）未処理の群 ２）ビヒクルプラシーボコントロール ３）ガレクチン１１処置群。[0827] Four groups of 10 animals each (5 with methylprednisolone and 5 without glucocorticoid) are evaluated: 1) untreated group 2) vehicle placebo control 3) galectin 11 treated group .
【０８２８】 創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸における面積を測定し、そしてこの創傷の全
面積を得ることによって分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷面積（０日目）
と処置後の創傷面積（８日目）との間の差異を確立することによって評価する。
１日目における創傷面積は６４ｍｍ2の皮膚パンチの対応する大きさである。以
下の式を使用して計算を行う： （８日目の開口面積）−（１日目の開口面積）／（１日目の開口面積）。[0827] Wound closure is analyzed by measuring the area in the vertical and horizontal axes and obtaining the total area of the wound. The closure was then replaced with the initial wound area (day 0).
And assessing the difference between the wound area after treatment (day 8).
The wound area on day 1 is the corresponding size of a 64 mm 2 skin punch. The calculation is made using the following formula: (open area on day 8)-(open area on day 1) / (open area on day 1).
【０８２９】 標本を、１０％緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてパラフィン包埋ブロック
を、創傷表面に対して垂直に区切り（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓマイクロ
トームを使用して切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色
を、二等分した創傷の断面で行う。この創傷の組織学的検査は、治癒プロセスお
よび修復された皮膚の形態学的外観がガレクチン１１を用いる処置によって改善
されるか否かの評価を可能にする。較正したレンズマイクロメーターを、盲目観
察者によって使用されて、創傷ギャップの距離を決定する。The specimens are fixed in 10% buffered formalin and the paraffin-embedded blocks are sectioned perpendicular to the wound surface (5 mm) and cut using an Olympus microtome. Conventional hematoxylin-eosin (H & E) staining is performed on bisected wound sections. Histological examination of this wound allows assessment of whether the healing process and the morphological appearance of the repaired skin are improved by treatment with Galectin-11. A calibrated lens micrometer is used by a blind observer to determine the distance of the wound gap.
【０８３０】 実験データを、片側ｔ検定を使用して分析する。０．０５未満のｐ値を有意で
あるとみなす。The experimental data is analyzed using a one-tailed t-test. A p-value less than 0.05 is considered significant.
【０８３１】 この実施例に記載される研究は、ガレクチン１１における活性を試験した。し
かし、当業者は、ガレクチン１１ポリヌクレオチドの活性を試験するための例示
的な研究（例えば、遺伝子治療）、ガレクチン１１のアゴニストおよび／または
アンタゴニストの活性を試験するための例示的な研究を容易に改変し得る。The study described in this example tested activity on galectin-11. However, those skilled in the art will readily appreciate exemplary studies for testing the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), and for testing the activity of a galectin-11 agonist and / or antagonist. Can be modified.
【０８３２】 （実施例４８：リンパ水腫動物モデル） この実験的アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ循環系のリンパ管
形成（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）および再樹立において、ガレクチ
ン１１の治療効果を試験するための、適切かつ一致したリンパ水腫モデルを作製
することである。有効性を、罹患した肢の腫脹体積、リンパ血管系の量の定量、
全血血漿タンパク質、および組織病理学によって測定する。急性リンパ水腫を、
７〜１０日間観察する。おそらく、より重要なことには、水腫の慢性的な進行は
、３〜４種間まで続く。Example 48: Lymphedema animal model The purpose of this experimental approach was to test the therapeutic effect of galectin-11 on lymphangiogenesis and re-establishment of the lymphatic circulation in the rat hind limb. The goal is to create an appropriate and consistent lymphedema model. Efficacy can be measured by measuring the swelling volume of the affected limb, the amount of lymphatic vasculature,
Measured by whole blood plasma protein, and histopathology. Acute lymphedema,
Observe for 7-10 days. Perhaps more importantly, the chronic progression of edema lasts between three to four species.
【０８３３】 手術の開始前に血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために引き出す。約３
５０ｇの体重の雄ラットに、ペントバルビタールを投薬する。続いて、その右肢
を、膝から臀部まで剃毛する。剃毛した領域を、７０％ＥｔＯＨに浸漬したガー
ゼで拭く。血清全タンパク質試験のために血液を引き出す。周径および体積測定
を、足に染料を注入する前に、２つの測定レベルを作製した後に、行う（背側の
足の中央部分にて、かかとの０．５ｃｍ上）。右足および左足の両方の皮内の背
側に、１％ Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅ ０．０５ｍｌを注射する。次いで、周径
および体積測定を、足への染料の注射の後に行う。[0832] Prior to the start of surgery, a blood sample is drawn for protein concentration analysis. About 3
Male rats weighing 50 g are dosed with pentobarbital. Subsequently, the right limb is shaved from the knee to the buttocks. The shaved area is wiped with gauze soaked in 70% EtOH. Withdraw blood for serum total protein test. Circumferential and volume measurements are taken (0.5 cm above the heel in the middle part of the dorsal foot) after making two measurement levels before injecting the dye into the foot. Inject 0.05 ml of 1% Evan's Blue on the dorsum of the skin intradermally on both the right and left feet. Circumference and volume measurements are then taken after injection of the dye into the paw.
【０８３４】 目印として膝関節を使用して、脚の中央部の鼡径の切開を外周的に行って、大
腿管を配置させる。鉗子および止血物質を使用して、皮膚弁を切り出して分離さ
せる。大腿管を配置した後、管を沿ってかつ下部に流れるリンパ管を配置する。
次いで、この領域の主なリンパ管を、電気的に凝固させるか、または縫合結紮す
る。Using the knee joint as a landmark, an incision is made circumferentially in the middle of the leg to place the femoral canal. The flap is cut out and separated using forceps and a hemostat. After the femoral canal has been placed, the lymph vessels flowing along and down the vessel are placed.
The major lymph vessels in this area are then either electrocoagulated or sutured and ligated.
【０８３５】 顕微鏡を使用して、脚の後ろの筋肉（半腱状態（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉ
ｓ）および内転筋付近）を、ざっと切り出す。次いで、膝窩リンパ節を配置する
。次いで、膝窩節の２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管ならびに遠位
血液供給を、縫合によって連結する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付随す
る脂肪組織を、結合組織を切断することによって除去する。Using a microscope, the muscles behind the legs (semitendinosi
s) and near the adductor muscle). The popliteal lymph nodes are then placed. The two proximal and two distal lymph vessels of the popliteal node and the distal blood supply are then connected by suture. The popliteal lymph nodes and any accompanying fat tissue are then removed by cutting connective tissue.
【０８３６】 この手順から生じる軽度の出血を制御するために、手当てを施す。リンパ管を
閉塞した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ）を使用
することによって密封する。別々の皮膚エッジを、その下の筋肉組織に、脚の周
囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚もまた、必要なときに
その下の筋肉に縫合することによって係留し得る。Care is taken to control for minor bleeding resulting from this procedure. After occlusion of the lymphatic vessels, the flap is sealed by using liquid skin (Vetbond) (AJ Buck). The separate skin edges are sealed to the underlying muscle tissue, leaving a gap of about 0.5 cm around the leg. The skin may also be anchored when necessary by suturing to the underlying muscle.
【０８３７】 感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きな
し）。回収した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピー
クは、代表的には５〜７日まで生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察す
る。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径お
よび体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タン
パク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かも
また調査する。コントロールおよび水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する。
分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ ｍａｎｎｅｒ）で行う。Animals are housed individually using mesh (no bedding) to avoid infection. The collected animals are checked daily through the optimal edema peak. This peak typically occurs for up to 5-7 days. The plateau edema peak is then observed. To assess the intensity of lymphedema, the circumference and volume of two designated locations on each limb are measured before manipulation and daily for 7 days. The effect of plasma proteins on lymphedema is determined and it is also investigated whether protein analysis is a useful test perimeter. The weights of both the control and edema paw are evaluated at two points.
The analysis is performed in a blind manner.
【０８３８】 周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用し
て、肢の周径を測定する。測定を、足首の骨および背面の足にて、２人の異なる
人物によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、
コントロールおよび水腫肢の両方から得る。[0838] Circumference measurement: Measure the limb circumference using a cloth tape measure under short-term gas anesthesia to prevent limb movement. Measurements are taken by two different persons at the ankle bone and the dorsal foot, and then these two readings are averaged. Read,
Obtained from both control and edema paw.
【０８３９】 体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前
に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定お
よびすばやい回収）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカーを
用いて脚に等しくしるしをつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々顕著なレ
ベルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔ
ｏｒ）によって測定する。データを１人の人物によって記録し、一方他者は、脚
をしるしを付けた領域まで漬ける。[0839] Volume measurement: On the day of surgery, animals are anesthetized with pentobarbital and tested prior to surgery. For daily volume measurements, animals are placed under short-term halothane anesthesia (rapid fixation and quick recovery), both legs are shaved and equally marked on the legs using a water-resistant marker. The legs are first dipped in water, then dipped into the device to each significant level, and then the Buxco edema software (Chen / Vict).
or). The data is recorded by one person, while the other dips into the marked area.
【０８４０】 血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして
血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。[0839] Blood-Plasma Protein Measurement: Blood is removed, centrifuged, and serum separated prior to surgery, and then conclusions are made for total protein and Ca2 + comparison.
【０８４１】 肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。
この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用
脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量
を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行
う。[0841] Limb Weight Comparison: After blood is drawn, the animals are prepared for tissue collection.
The limb is cut with quiltine, then both the experimental and control legs are ligated and cut and weighed. A second weighing is performed by removing the tibio-cacaneal joint and weighing the foot.
【０８４２】 組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属
型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、標識したサ
ンプルバッグに切断するまで−８０ＥＣにて配置する。切断の際に、筋肉を、蛍
光顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。Histological Preparation: Transverse muscle located behind the knee (popliteal) area is excised and placed in a metal mold, filled with freezeGel, immersed in cold methylbutane, and cut at -80EC until cut into labeled sample bags. To place. At the time of the cut, the muscle is observed for lymphatic vessels under a fluorescent microscope.
【０８４３】 この実施例に記載される研究は、ガレクチン１１における活性を試験した。し
かし、当業者は、ガレクチン１１ポリヌクレオチドの活性を試験するための例示
的な研究（例えば、遺伝子治療）、ガレクチン１１のアゴニストおよび／または
アンタゴニストの活性を試験するための例示的な研究を容易に改変し得る。The study described in this example tested activity on galectin-11. However, those skilled in the art will readily appreciate exemplary studies for testing the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), and for testing the activity of a galectin-11 agonist and / or antagonist. Can be modified.
【０８４４】 （実施例４９：ＴＮＦα誘導性接着分子発現のガレクチン１１による抑制） 炎症および新脈管形成の領域に対するリンパ球の漸増は、リンパ球上の細胞表
面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特定のレセプター−リガンド相互作用
に関する。この接着プロセスは、通常の設定および病理学的設定の両方において
、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１
）、内皮細胞（ＥＣ）におけるおよび内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチン
）発現を含む、他段階カスケードに続く。これらの分子および他の分子の血管内
皮における発現は、白血球が局所血管系に接着し得、そして炎症応答の発生の間
に局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所濃
度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。Example 49: Inhibition of TNFα-Induced Adhesion Molecule Expression by Galectin-11 Recruitment of lymphocytes to areas of inflammation and angiogenesis was due to cell surface adhesion molecules (CAM) on lymphocytes and vascular endothelium. Between the specific receptor-ligand interaction. This adhesion process involves intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in both normal and pathological settings.
), Followed a multi-step cascade involving endothelial cell (EC) and endothelial leukocyte adhesion molecule-1 (E-selectin) expression. The expression of these and other molecules on the vascular endothelium determines the efficiency with which leukocytes can adhere to the local vasculature and extravasate to local tissues during the development of an inflammatory response. Local concentrations of cytokines and growth factors are involved in regulating the expression of these CAMs.
【０８４５】 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（強力なプロ炎症性サイトカイン）は、内皮細
胞における３つ全てのＣＭＡの刺激因子であり、そして広範な種々の炎症応答に
関与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。[0845] Tumor necrosis factor-α (TNF-α), a potent pro-inflammatory cytokine, is a stimulator of all three CMA in endothelial cells and can be involved in a wide variety of inflammatory responses, often Brings physical consequences.
【０８４６】 ＴＮＦ−α誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介するガレクチン１１の潜在能力を試
験し得る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相吸着剤としてＥＣを使用す
る）を使用して、多数のＢＭＰファミリーのタンパク質を用いて同時刺激した場
合に、ＴＮＦ−α処理タンパク質ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量を測定する。[0846] The potential of galectin-11 to mediate suppression of TNF-α-induced CAM expression can be tested. The amount of CAM expression in the TNF-α treated protein EC when co-stimulated with multiple BMP family proteins using a modified ELISA assay, which uses EC as a solid phase sorbent, was determined. Measure.
【０８４７】 この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、プール
した索採取物から得、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマ
イシンを補充した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）中で、５％ＣＯ2を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて維
持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中１×１０4細胞／ウェルの濃度で、９６ウ
ェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間またはコンフルエントになるまで播
種する。続いて、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌス
トレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄し、そ
して所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、２４時間３７℃にて
処理した。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現について評
価する。To perform this experiment, human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) cultures were obtained from pooled cord harvest and grown in growth medium (EGM-2; supplemented with 10% FCS and 1% penicillin / streptomycin). Clonetics, San Die
(go, CA) in a humidified incubator at 37 ° C. with 5% CO 2 . HUVECs are seeded at a concentration of 1 × 10 4 cells / well in EGM medium in 96-well plates at 37 ° C. for 18-24 hours or until confluent. Subsequently, the monolayer is washed three times with a serum-free solution of RPMI-1640 supplemented with 100 U / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin, and at 37 ° C. for 24 hours with the given cytokines and / or growth factors. Processed. After incubation, the cells are then evaluated for CAM expression.
【０８４８】 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレートにおいて
コンフルエントになるまで増殖させる。増殖培地を、細胞から取り除き、そして
９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験のためのサンプルお
よびポジティブまたはネガティブコントロールを、このプレートに三連で添加す
る（１０μｌ容量）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびイン
テグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュ
ベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、そして１００μｌの０．１％
パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェル
に添加する。プレートを、４℃にて３０分間保持する。次いで、固定液をウェル
から除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡを用いて
１回洗浄し、そして排水する。このウェルを乾燥させないこと。１０μｌの希釈
した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェルに添加する。抗ＩＣＡＭ
−１−Ｂｉｏｔｉｎ、抗ＶＡＣＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎおよび抗Ｅ−セレクチン−
Ｂｉｏｔｉｎを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌストック抗体の１：
１０希釈）で使用する。細胞を、加湿した環境において、３７℃にて３０分間イ
ンキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡを用い
て３回洗浄する。[0848] Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are grown to confluence in standard 96-well plates. Growth medium is removed from the cells and replaced with 90 μl of 199 medium (10% FBS). Samples for testing and positive or negative controls are added to the plate in triplicate (10 μl volume). Plates are incubated at 37 ° C. for either 5 hours (selectin and integrin expression) or 24 hours (integrin expression only). The plate is aspirated, the medium is removed and 100 μl of 0.1%
Paraformaldehyde-PBS (with Ca ++ and Mg ++) is added to each well. The plate is kept at 4 ° C. for 30 minutes. The fixative is then removed from the wells and the wells are washed once with PBS (+ Ca, Mg) + 0.5% BSA and drained. Do not allow this well to dry. Add 10 μl of diluted primary antibody to test and control wells. Anti-ICAM
-1-Biotin, anti-VACM-1-Biotin and anti-E-selectin-
Biotin at a concentration of 10 μg / ml (1: 0.1 mg / ml stock antibody 1:
10 dilution). The cells are incubated for 30 minutes at 37 ° C. in a humidified environment. The wells are washed three times with PBS (+ Ca, Mg) + 0.5% BSA.
【０８４９】 次いで、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、そして３７℃
にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５
％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐ
ＮＰＰ）を、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン
緩衝液中のｐＮＰＰ基質１００μｌを、各試験ウェルに添加する。三連の標準ウ
ェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏ
ｓｐｈｏｔａｓｅの操作希釈（ｗｏｒｋｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（１：５，
０００（１０0）＞１０-0.5＞１０-1＞１０-1.5）から調製する。５μｌの各希
釈物を、三連のウェルに添加し、そして各ウェル中の得られたＡＰ含量は、５．
５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００
μｌのｐＮＰＰ試薬を、標準ウェルの各々に添加しなければならない。このプレ
ートを、３７℃にて４時間インキューベートしなければならない。３Ｍ ＮａＯ
Ｈの５０μｌの容量を全てのウェルに添加する。この結果を、プレートリーダー
において４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプションを、グリシ
ン緩衝液のみで満たしたブランクウェルにおいて使用する。このテンプレートを
、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する（５．５０
ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ）。結果を、各サンプル中の
結合したＡＰ結合体の量として示す。[0849] Then, 20 μl of the diluted ExtraAvidin-Alkaline Ph
Osphotase (1: 5,000 dilution) is added to each well and
And incubate for 30 minutes. Wells were added with PBS (+ Ca, Mg) +0.5
Wash three times with% BSA. One tablet of p-nitrophenol phosphate (p
NPP) is dissolved in 5 ml of glycine buffer (pH 10.4). 100 μl of pNPP substrate in glycine buffer is added to each test well. Triplicate standard wells were prepared with ExtraAvidin-Alkaline Pho in glycine buffer.
Working dilution of sphotase (1: 5,
000 (10 0 )> 10 −0.5 > 10 −1 > 10 −1.5 ). 5 μl of each dilution is added to triplicate wells, and the resulting AP content in each well is 5.
50 ng, 1.74 ng, 0.55 ng and 0.18 ng. Then 100
μl of pNPP reagent must be added to each of the standard wells. The plate must be incubated at 37 ° C. for 4 hours. 3M NaO
Add a volume of 50 μl of H to all wells. The result is quantified at 405 nm in a plate reader. The background subtraction option is used in blank wells filled with glycine buffer only. This template is set to indicate the concentration of AP conjugate in each standard well (5.50).
ng; 1.74 ng; 0.55 ng; 0.18 ng). The results are shown as the amount of bound AP conjugate in each sample.
【０８５０】 この実施例に記載される研究は、ガレクチン１１における活性を試験した。し
かし、当業者は、ガレクチン１１ポリヌクレオチドの活性を試験するための例示
的な研究（例えば、遺伝子治療）、ガレクチン１１のアゴニストおよび／または
アンタゴニストの活性を試験するための例示的な研究を容易に改変し得る。The studies described in this example tested activity on galectin-11. However, those skilled in the art will readily appreciate exemplary studies for testing the activity of a galectin-11 polynucleotide (eg, gene therapy), and for testing the activity of a galectin-11 agonist and / or antagonist. Can be modified.
【０８５１】 （実施例５０：ガレクチン１１は細胞サイクルを調節し、ガン細胞増殖を阻
害する） （糖質結合） ガレクチン１１のＣ末端ドメインのアミノ酸配列は、ガレクチンのコンセンサ
ス配列から有意に散在し、そして他のガレクチンに見出される糖質と接触する領
域中の保存性残基のほとんどは、ガレクチン中に存在しない。従って、ガレクチ
ン１１が糖質に結合する能力を試験した。ガレクチン１１αまたはβｃＤＮＡで
トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞由来の溶解産物を、ラクトシル−セファロ
ース４Ｂと混合し、そして結合タンパク質をＳＤＳサンプル緩衝液で溶離した。
未結合の画分と溶離した物質の両方を、ガレクチン１１の内部ペプチドに特異的
な抗体を使用する免疫ブロット法により分析した。ガレクチン１１は、ラクトシ
ル−セファロース４Ｂに結合せず、一方同じ実験において、ラクトース結合は、
予想どおり、ガレクチン−３について得られた。Example 50: Galectin 11 regulates cell cycle and inhibits cancer cell proliferation Carbohydrate binding The amino acid sequence of the C-terminal domain of galectin 11 is significantly scattered from the galectin consensus sequence, And most of the conserved residues in the carbohydrate contacting regions found in other galectins are absent in galectins. Therefore, the ability of galectin 11 to bind to carbohydrates was tested. Lysates from HeLa cells transfected with galectin 11α or β cDNA were mixed with lactosyl-Sepharose 4B and bound proteins were eluted with SDS sample buffer.
Both unbound fractions and eluted material were analyzed by immunoblot using an antibody specific for the internal peptide of galectin-11. Galectin 11 does not bind to lactosyl-Sepharose 4B, while in the same experiment lactose binding was
As expected, it was obtained for galectin-3.
【０８５２】 （ガレクチン１１ｍＲＮＡの組織分布） ノーザンブロット分析は、ガレクチン１１ｍＲＮＡは、ほとんど全ての組織に
おいて検出されるガレクチン−３ｍＲＮＡとは対照的に、試験された多くの組織
においてほとんど検出不可能であることを示した。この結果は、ガレクチン１１
ｃＤＮＡプローブの質に起因するものではない。なぜなら同じプローブを使用
して、ガレクチン１１ｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞由来のｍＲＮＡのノ
ーザンブロットにおいて、強いシグナルが観測されたからである。しかし、より
高感度の手順である、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ガレクチン１１ｍＲＮＡは、心
臓、脾臓、胸腺および末梢血液白血球において検出可能であった。これはまた、
肺、骨格筋、腎臓、脾臓、前立腺、精巣、卵巣および結腸中に低レベルで存在し
たが、脳および肝臓においてほとんど検出不可能であった。ガレクチン１１ｍＲ
ＮＡは、試験された多くの細胞株において検出されなかったが、その発現は、末
梢血液単球および多核細胞、ならびに骨髄性細胞株、Ｕ９３７、ＨＬ−６０およ
びＫＵ−８１２、Ｂ細胞株Ｗｉｌ−２、および乳癌細胞株ＨＢＬ−１００におい
て、ＲＴ−ＰＣＲにより確認された。しかし、抗ペプチド抗体を用いる免疫ブロ
ット分析は、ガレクチン１１被形質導入体由来の溶解産物中のタンパク質を検出
したが、その手順はそれらの細胞株中のガレクチン１１タンパク質しなかった。Tissue Distribution of Galectin 11 mRNA Northern blot analysis shows that galectin 11 mRNA is almost undetectable in many tissues tested, as opposed to galectin-3 mRNA, which is detected in almost all tissues. showed that. This result indicates that galectin 11
It is not due to the quality of the cDNA probe. This is because strong signals were observed in Northern blots of mRNA from cells transfected with galectin-11 cDNA using the same probe. However, using a more sensitive procedure, RT-PCR, galectin 11 mRNA was detectable in heart, spleen, thymus and peripheral blood leukocytes. This is also
It was present at low levels in lung, skeletal muscle, kidney, spleen, prostate, testis, ovary and colon, but was barely detectable in brain and liver. Galectin 11mR
Although NA was not detected in many of the cell lines tested, its expression was detected in peripheral blood monocytes and multinucleated cells, as well as in myeloid cell lines, U937, HL-60 and KU-812, B cell line Wil-. 2, and in breast cancer cell line HBL-100 by RT-PCR. However, although immunoblot analysis using anti-peptide antibodies detected proteins in lysates from galectin-11 transductants, the procedure did not include galectin-11 proteins in those cell lines.
【０８５３】 （ストレスシグナルによるガレクチン１１発現の誘導） ガレクチン１１クローンは、Ｇ１で停止されたＪｕｒｋａｔ細胞ライブラリー
から単離されたため、これらの条件、および細胞静止を誘導する条件下で、メッ
セージの発現を評価することに関心がもたれる。ＨｅＬａ−Ｓ３およびＪｕｒｋ
ａｔ細胞を、Ｇ１−Ｓボーダーで細胞を同期化するためのチミジン、またはＧ１
における細胞の同期化のためのテオフィリンおよびジブチリル−ｃＡＭＰで処理
した。両方の処理は、ガレクチン１１発現を誘導した。ガレクチン１１ｍＲＮＡ
中のＡＵリッチな要素およびその制限された発現パターンは、ガレクチン１１遺
伝子産物が誘導可能であることを示唆する。実際に、ＨＬ−６０細胞がＰＭＡお
よびイオノマイシンで処理される場合、ガレクチン１１ｍＲＮＡは、０．５時間
以内に迅速に誘導されたが、メッセージは処理後２時間で迅速に減少し、そして
４時間後にはもはや検出不可能であった。Induction of Galectin-11 Expression by Stress Signaling Since the galectin-11 clone was isolated from a G1 arrested Jurkat cell library, expression of the message under these conditions and under conditions that induced cell stasis was I am interested in evaluating. HeLa-S3 and Jurk
at cells, thymidine to synchronize cells at the G1-S border, or G1
Treated with theophylline and dibutyryl-cAMP for cell synchronization. Both treatments induced galectin-11 expression. Galectin 11 mRNA
The AU-rich element in and its restricted expression pattern suggest that the galectin-11 gene product is inducible. Indeed, when HL-60 cells were treated with PMA and ionomycin, galectin 11 mRNA was rapidly induced within 0.5 hours, but the message decreased rapidly 2 hours after treatment, and 4 hours later. Was no longer detectable.
【０８５４】 （ガレクチン１１の異所性発現による細胞サイクルの停止） ガレクチン１１がＧ１期で停止されたＪｕｒｋａｔ細胞株由来のｃＤＮＡから
単離されたという事実は、このタンパク質が細胞サイクルの調節において機能し
得ることを示唆する。この可能性を試験するために、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬ
ａを、ガレクチン１１（αおよびβの両方）に対して完全なｃＤＮＡを含むベク
ター、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡを用いて同時トランスフェ
クトした。Cell cycle arrest by ectopic expression of galectin-11 The fact that galectin-11 was isolated from cDNA from the G1 phase arrested Jurkat cell line indicates that this protein functions in cell cycle regulation. Suggest that you can. To test this possibility, the human cervical cancer cell line HeL
a was co-transfected with a vector containing the complete cDNA for galectin 11 (both α and β), and green fluorescent protein (GFP) cDNA.
【０８５５】 コントロールベクター−トランスフェクトしたＨｅＬＡ細胞を比較すると、Ｈ
Ａ標識ガレクチン１１を発現する有意に上昇した割合の細胞が細胞サイクルのＧ
１期において見出され、そして代償的に、ＳおよびＧ２／Ｍ期においてより低い
割合の細胞が見出された（データは示さず）。同様の結果は、乳癌細胞株、ＭＣ
Ｆ−７を用いた場合に得られた（データは示さず）。ガレクチン１１のαおよび
β形態の効果は、比較可能であった。When comparing control vector-transfected HeLA cells,
Significantly increased percentage of cells expressing A-labeled galectin 11 were G cells in the cell cycle.
A lower percentage of cells were found in phase 1 and at the expense of S and G2 / M phases (data not shown). Similar results were obtained with the breast cancer cell line, MC
Obtained using F-7 (data not shown). The effects of the α and β forms of galectin 11 were comparable.
【０８５６】 ガレクチンファミリーの別のメンバーである、ガレクチン−９（これはまた、
２つのＣＲＤを含む）を、比較のために研究した。血球凝集素（ＨＡ）標識ガレ
クチン−９およびガレクチン１１αを、トランスフェクトされた細胞中のそれら
の発現レベルが、抗ＨＡ抗体を使用する免疫ブロットにより比較され得るように
使用した。同一のレシピエントの細胞株および同一の手順を使用したにもかかわ
らず、それぞれの被形質導入体において、ガレクチン−９のレベルはガレクチン
１１のレベルよりはるかに高かった。同様に、ガレクチン−９発現は、細胞サイ
クルに対していずれの目立った効果も有さなかったが、ガレクチン１１は、用量
依存様式でＧ１停止を誘導した。[0857] Another member of the galectin family, galectin-9, which also comprises
(Including two CRDs) were studied for comparison. Hemagglutinin (HA) labeled galectin-9 and galectin 11α were used such that their expression levels in transfected cells could be compared by immunoblot using anti-HA antibodies. In spite of using the same recipient cell line and the same procedure, in each transductant the level of galectin-9 was much higher than the level of galectin-11. Similarly, galectin-9 expression did not have any noticeable effect on the cell cycle, but galectin 11 induced G1 arrest in a dose-dependent manner.
【０８５７】 上記の所見を確認するために、様々な細胞型において非常に高いトランスフェ
クション効率を有することが知られている、アデノウイルスに基づくトランスフ
ェクション系を用いた。従って、ガレクチン１１を含む複製欠損アデノウイルス
を使用して、Ａｒｐｅ−１９細胞を感染させた。最初の実験は、フローサイトメ
トリーにより測定されるように、ＧＦＰの発現に基づいて、１００％近くの細胞
が感染したことを確認した。有意に高い割合のガレクチン１１でトランスフェク
トされた細胞は、Ｇ１期にあり、コントロール被形質導入体と比較された。Ｇ１
にある細胞の蓄積は、促進されたＭからＧ１への移行よりむしろＧ１停止の結果
であることを示すために、実験が行われ、ここで、ノコダゾール（紡錘体を破壊
し、従ってｈｅ細胞が有糸***を終了するのを防ぐことが知られている薬物）が
、トランスフェクション後に細胞に添加される。処置の４８時間後、コントロー
ルウイルスでトランスフェクトされたほとんどの細胞は、終了したＧ１を有し、
有糸***においてブロックされ、一方、ガレクチン１１のαまたはβアイソフォ
ームのいずれかを発現するウイルスに感染した細胞の有意な部分は、Ｇ１のまま
であった。To confirm the above findings, an adenovirus-based transfection system was used, which is known to have very high transfection efficiency in various cell types. Therefore, replication-deficient adenovirus containing galectin 11 was used to infect Ape-19 cells. Initial experiments confirmed that nearly 100% of the cells were infected based on the expression of GFP as measured by flow cytometry. Cells transfected with a significantly higher percentage of galectin 11 were in G1 phase and were compared to control transductants. G1
Experiments were performed to show that the accumulation of cells in the nodazole was a consequence of G1 arrest rather than an accelerated transition from M to G1, where nocodazole (which destroys the spindle and thus he cells A drug known to prevent termination of mitosis) is added to the cells after transfection. Forty-eight hours after treatment, most cells transfected with the control virus have terminated G1;
A significant portion of cells infected with virus that were blocked in mitosis while expressing either the α or β isoform of galectin 11 remained G1.
【０８５８】 （ガレクチン１１の異所性発現によるガン細胞増殖の阻害） ガレクチン１１の細胞サイクル停止活性は、ガレクチン１１でトランスフェク
トした細胞が増殖しないことを示す。コロニー形成アッセイを行って、ガレクチ
ン１１の異所性発現から生じる細胞増殖の抑制を公式に証明した。ＨｅＬａ細胞
を、プロマイシン耐性遺伝子の構築物と共に、ガレクチン１１ｄＤＮＡで同時ト
ランスフェクトした。コントロール形質導入体は多数のコロニーを形成したが、
ガレクチン１１形質導入体は、プロマイシン含有培地における選択の２週間後に
わずかなコロニーを形成したにすぎなかった。細胞増殖の抑制に対するガレクチ
ン１１発現の効果は、比色アッセイを使用することによって、より定量的に測定
された。コントロール形質導入体と比較して有意に少数の細胞が、ガレクチン１
１形質導入体から得られた。(Inhibition of Cancer Cell Growth by Ectopic Expression of Galectin 11) The cell cycle arrest activity of galectin 11 indicates that cells transfected with galectin 11 do not grow. Colony formation assays were performed to officially demonstrate suppression of cell proliferation resulting from ectopic expression of galectin-11. HeLa cells were co-transfected with galectin 11d DNA along with the construct of the puromycin resistance gene. Control transductants formed many colonies,
Galectin-11 transductants formed only a few colonies two weeks after selection in puromycin-containing media. The effect of galectin-11 expression on inhibition of cell proliferation was measured more quantitatively by using a colorimetric assay. Significantly fewer cells were compared to galectin 1 compared to control transductants.
Obtained from one transductant.
【０８５９】 本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態により発明の範囲を制限さ
れず、本発明の個々の局面の１つの例示であることが意図される。実際に、本明
細書中に示され記載される改変物に加えて、本発明の様々な改変物が、上記の説
明および添付の図面から当業者に明らかになる。このような改変物は、添付の特
許請求の範囲内であることが意図される。The present invention is not limited by the specific embodiments described herein, but is intended to be an illustration of one of the individual aspects of the invention. Indeed, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and accompanying figures. Such modifications are intended to fall within the scope of the appended claims.
【０８６０】 本明細書中で引用される全ての刊行物（特許、特許出願、学術論文、研究説明
書、書物または他の資料を含む）の全開示は、本明細書中で参考として援用され
る。The entire disclosure of all publications (including patents, patent applications, scholarly articles, research manuals, books or other materials) cited herein is hereby incorporated by reference. You.
【０８６１】 さらに、紙およびコンピューター読みとり可能形態で提出される配列表は、そ
の全体が本明細書中で参考として援用される。In addition, sequence listings provided in paper and computer readable form are incorporated by reference herein in their entirety.
【０８６２】[0862]
【表５】 （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。[Table 5] (Canada) Applicant will continue to operate with the Commissioner of Patents until the Canadian patent is issued based on the application, or the application is refused or abandoned and cannot be reinstated or withdrawn. Requesting that only an independent expert nominated by the Authorized Company provide a sample of the deposited biological material referred to in the application, the applicant shall comply with the rules for publication of the international application. Before completion of the preparations, the International Bureau must be informed in writing.
【０８６３】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。(Norway) The applicant hereby assumes that until the application has been published (by the Norwegian Patent Office) or has been decided without the publication by the Norwegian Patent Office, Request that it be done only for the house. A request to this effect shall be filed by the applicant with the Norwegian Patent Office before the time when the application is made publicly available under sections 22 and 33 (3) of the Norwegian Patent Act. If such a request is made by the applicant, any request for the provision of a sample by a third party shall indicate the expert employed. The expert is a list of certified experts prepared by the Norwegian Patent Office (list of
Recognized experts), or
In each case, it can be any person approved by the applicant.
【０８６４】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。(Australia) The applicant hereby gives the sample of the microorganism,
Alternatively, prior to lapsing, rejection or withdrawal of the application, the subject is a skilled adder who has no interest in the invention.
ssee) (Australia Patent Law 3.25 (3)).
【０８６５】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。(Finland) The applicant hereby filed that the application was filed (Patent and
Until published (by the Board of Patents and Regulations) or without publication and subject to a decision by the National Patent and Legislative Commission, the sample will be provided only to experts in the art. ,Claim.
【０８６６】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にさ
れる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が
完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。 ＡＴＣＣ受託番号２０９０５９ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。[0866] Applicants hereby request that samples of microorganisms be made available only to professionals. Such a request must be made by the applicant to the International Bureau before the regulatory preparations for international publication of the application have been completed. ATCC Accession No. 209059 (Denmark) The applicant hereby assumes that until the application has been published (by the Danish Patent Office) or has been decided by the Danish Patent Office without being published, Request that this be done only to experts. A request to this effect shall be made by the applicant to the Danish Patent Office prior to the time the application is made publicly available under sections 22 and 33 (3) of the Danish Patent Act. If such a request is made by the applicant, any request for the provision of a sample by a third party shall indicate the expert employed. The expert is a list of certified experts prepared by the Danish Patent Office (list of
Recognized experts), or
In each case, it can be any person approved by the applicant.
【０８６７】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。(Sweden) The applicant hereby assumes that until the application has been published (by the Swedish Patent Office) or has been decided without the publication by the Swedish Patent Office, the donation of samples is Request that it be done only for the house. A request to this effect shall be made by the applicant to the International Bureau prior to the expiration of 16 months from the priority date (preferably PCT Application's Gui).
Format PCT / RO / 13 described in annex Z of Volume I of de
4). If such a request is made by the applicant, any request for the provision of a sample by a third party shall indicate the expert employed. The expert is a list of accredited experts created by the Swedish Patent Office (list
to any of the recognized experts), or
Alternatively, it may be any person approved by the applicant in each case.
【０８６８】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。(Netherlands) The applicant hereby states that, under the provisions of Patent Act 31F (1), the microorganisms may be specialized until the date of issuance of the Dutch patent, or until the date the application is rejected, withdrawn or lapped. Request that this be done only in the form of sample delivery to the house. The request to this effect shall be filed by the applicant prior to the date on which the application is made publicly available under section 22C or 25 of the Dutch Patent Law, whichever comes first. Shall be submitted to the Bureau.
【配列表】 [Sequence list]
【図１】 図１は、ガレクチン１１のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ
酸配列（配列番号２）を示す。このタンパク質は、約１４．８ｋＤａの推定分子
量を有する。配列番号１のヌクレオチド配列の相補鎖は配列番号１２に示される
。FIG. 1 shows the nucleotide sequence of galectin 11 (SEQ ID NO: 1) and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2). This protein has an estimated molecular weight of about 14.8 kDa. The complementary strand of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 12.
【図２】 図２は、ガレクチン１１タンパク質（ＨＪＡＣＥ５４）、ラットガレクチン５
（配列番号３）、およびヒトガレクチン８（配列番号４）のアミノ酸配列間の類
似性領域を示す。これらのガレクチン間で共有される同一のアミノ酸が影を付け
られ、保存的アミノ酸変化は枠で囲まれている。影を付け、そして／または枠で
囲まれたアミノ酸の領域を試験することにより、当業者は、２つのポリペプチド
の間の保存されたドメインを容易に同定し得る。これらの保存されたドメインは
、本発明の好ましい実施形態である。FIG. 2 shows galectin 11 protein (HJACE54), rat galectin 5
(SEQ ID NO: 3) and the region of similarity between the amino acid sequences of human galectin 8 (SEQ ID NO: 4). Identical amino acids shared between these galectins are shaded and conservative amino acid changes are boxed. By examining the shadowed and / or boxed regions of amino acids, one of skill in the art can readily identify conserved domains between the two polypeptides. These conserved domains are preferred embodiments of the present invention.
【図３】 図３は、示されたコンピュータープログラムのデフォルトパラメーターを使用
して推定されたガレクチン１１（配列番号２）の構造的および機能的特徴を示す
。α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒
性領域；可撓性領域；抗原性指数および表面確率が示される。抗原性指数−Ｊａ
ｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆグラフにおいて、ポジティブなピークは、ガレクチン１１
タンパク質の高度の抗原性領域（すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが
得られ得る領域）の位置を示す。このグラフにより規定されるドメイン（例えば
、図１（配列番号２）におけるアミノ酸残基６５〜７０および１１８〜１２４を
含む）は、本発明により意図される。これは、ガレクチン１１ポリペプチドの示
された高度に抗原性の領域に対応する。 図３に示されるデータはまた、表１における表形態で表される。この列は、標
題「残基」、「位置」、およびローマ数字Ｉ〜ＸＩＩＩで標識される。列の標題
は、図１および３に、ならびに表１に示されるアミノ酸配列の以下の特徴をいう
：「残基」：配列番号２および図１のアミノ酸残基；「位置」；配列番号２およ
び図１内の対応する残基の位置；Ｉ：α領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；
ＩＩ：α領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；ＩＩＩ：β領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒ
ｏｂｓｏｎ；ＩＶ：β領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；Ｖ：ターン領域−Ｇａｒ
ｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩ：ターン領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；ＶＩＩ
：コイル領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩＩＩ：親水性プロット−Ｋ
ｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ；ＩＸ：α，両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；
Ｘ：β，両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；ＸＩ：可撓性領域−Ｋａｒｐｌｕ
ｓ−Ｓｃｈｕｌｚ；ＸＩＩ：抗原性指数−Ｊａｍｓｏｎ−Ｗｏｌｆ；およびＸＩ
ＩＩ：表面確率プロット−Ｅｍｉｎｉ。FIG. 3 shows the structural and functional characteristics of Galectin 11 (SEQ ID NO: 2) estimated using the default parameters of the indicated computer program. α region, β region, turn region and coil region; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic region; flexible region; antigenic index and surface probability. Antigenicity index-Ja
In the meson-Wolf graph, the positive peak is galectin 11
The location of the highly antigenic region of the protein (ie, the region where the epitope-bearing peptide of the present invention can be obtained) is indicated. The domains defined by this graph (eg, including amino acid residues 65-70 and 118-124 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2)) are contemplated by the present invention. This corresponds to the indicated highly antigenic region of the galectin 11 polypeptide. The data shown in FIG. 3 is also represented in tabular form in Table 1. This column is labeled with the titles "residue", "position", and Roman numerals I-XIII. The column titles refer to the following features of the amino acid sequence shown in FIGS. 1 and 3 and in Table 1: "residues": amino acid residues of SEQ ID NO: 2 and FIG. 1; "positions"; Position of the corresponding residue in FIG. 1; I: α-region-Garnier-Robson;
II: α region-Chou-Fasman; III: β region-Garnier-R
obson; IV: β region-Chou-Fasman; V: turn region-Gar
nier-Robson; VI: turn region-Chou-Fasman; VII
: Coil region-Garnier-Robson; VIII: hydrophilicity plot-K
ix: α, amphipathic region-Eisenberg;
X: β, amphipathic region-Eisenberg; XI: flexible region-Karplu
s-Schulz; XII: Antigenicity Index-Jamson-Wolf; and XI
II: Surface probability plot-Emini.
【図４】 図４は、ヒトガレクチン１１遺伝子の構造である。ヒトガレクチン１１遺伝子
は、第１１染色体上に位置する。この図は、ガレクチン１１遺伝子を含む第１１
染色体の領域の構造を示し、そしてこの染色体のこの領域の転写される部分（影
付き）および転写されない部分（白抜き）に対応するヌクレオチドの数を開示す
る。ヒトガレクチン１１遺伝子は、５つのエキソンを含む。翻訳開始部位は、第
２のエキソン上に位置する。ローマ数字で表されたエキソン中で同定されたヌク
レオチドの番号付けは、図１（配列番号１）に示されるものと対応する。FIG. 4 shows the structure of the human galectin 11 gene. The human galectin 11 gene is located on chromosome 11. This figure shows the eleventh gene containing the galectin 11 gene.
1 shows the structure of a region of a chromosome and discloses the number of nucleotides corresponding to the transcribed (shaded) and non-transcribed (open) portions of this region of the chromosome. The human galectin 11 gene contains five exons. The translation start site is located on the second exon. The numbering of the nucleotides identified in the exons represented by Roman numerals corresponds to that shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
【図５Ａ】 図５Ａは、ガレクチン１１発現構築物（ｐＥＦ−Ｌｅｇ１１）でのＪｕｒｋａ
ｔ細胞のトランスフェクションが、トランスフェクトされた細胞のアポトーシス
を誘導することを示す棒グラフである。影付きの棒は、ガレクチン１１発現構築
物でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシス％を示し、一方白
抜き棒は、ｐＥＦコントロールベクターでトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ
細胞のアポトーシス％を示す。アポトーシスは、ミト（ｍｉｔｏ）Ｔｒａｃｋｅ
ｒＲｅｄを使用する二色細胞計算法により測定された。FIG. 5A shows Jurka with galectin-11 expression construct (pEF-Leg11).
4 is a bar graph showing that transfection of t cells induces apoptosis of transfected cells. Shaded bars indicate% apoptosis of Jurkat cells transfected with galectin-11 expression construct, while open bars indicate Jurkat cells transfected with pEF control vector.
The percentage of cell apoptosis is shown. Apoptosis is mitoTracke
It was measured by a two-color cell count method using rRed.
【図５Ｂ】 図５Ｂは、首尾良くトランスフェクトされたＧＥＰ陽性細胞の、トランスフェ
クション４日後の生存を示す棒グラフである。トランスフェクトされた細胞の生
存は、コントロールベクター（ｐＥＦ１）またはガレクチン１１発現ベクター（
ｐＥＦ−Ｌｅｇ１１）のいずれかでの同時トランスフェクション後に試験された
。ｐＥＦ−Ｌｅｇ１１でのトランスフェクション後よりもｐＥＦ１でのトランス
フェクション後に、約４倍より多くの生存するＧＥＰ陽性細胞が存在した。FIG. 5B is a bar graph showing the survival of successfully transfected GEP positive cells 4 days after transfection. The survival of the transfected cells was determined by control vector (pEF1) or galectin-11 expression vector (
tested after co-transfection with either of pEF-Leg11). There were about 4 times more viable GEP positive cells after transfection with pEF1 than after transfection with pEF-Leg11.
【図６】 図６は、それぞれ、完全なガレクチン１１α ｃＤＮＡおよびタンパク質のヌ
クレオチド配列（配列番号２４）および推定アミノ酸配列（配列番号２５）を示
す。FIG. 6 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 24) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 25) of the complete galectin 11α cDNA and protein, respectively.
【図７】 図７は、ガレクチン１１遺伝子を含む８つのエキソンの相対的位置を示す模式
図である。改変体の間で互いに異なるＮ末端を生じるガレクチン１１αとガレク
チン１１βとの間の選択的スプライシングにより作製された差異もまた示す（ガ
レクチン１１αは、エキソン２の５’末端で７ヌクレオチド長い）。FIG. 7 is a schematic diagram showing the relative positions of eight exons containing the galectin 11 gene. The differences created by alternative splicing between galectin 11α and galectin 11β, which give rise to different N-termini among the variants, are also shown (galectin 11α is 7 nucleotides longer at the 5 ′ end of exon 2).
【図８】 図８は、ガレクチン１１αとガレクチン１１βのポリペプチド配列間の差を示
す。ガレクチン１１βの完全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ
、配列番号２６および２７として配列表に示される。FIG. 8 shows the differences between the polypeptide sequences of galectin 11α and galectin 11β. The complete nucleotide sequence and amino acid sequence of galectin 11β are shown in the sequence listing as SEQ ID NOs: 26 and 27, respectively.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ 37/08 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/06 33/50 Ｚ 5/10 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 33/68 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ラ ホヤ インスティチュート フォー アラジー アンド イムノロジー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92121 サンディエゴ サイエンス セン ター ドライブ 10355 (72)発明者 ニ， ジアン アメリカ合衆国 メリーランド 20853， ロックビル， マナーフィールド 5502 (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 (72)発明者 ジェンツ， ライナー エル． アメリカ合衆国 メリーランド 20850， ロックビル， マウント プロスペクト ドライブ 13608 (72)発明者 リュ， フ−トン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92130， サン ディエゴ， メンシャ プレイス 4351 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 DA78 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 CA09 CA20 DA02 DA03 DA06 EA02 EA04 GA11 GA13 GA18 GA19 GA25 HA13 HA14 4B064 AG01 AG28 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CC01 CC24 CE12 DA01 DA13 4B065 AA26X AA58X AA72X AA90X AA93X AA93Y AB10 AC01 AC14 BA01 BA05 BA16 BA30 BD14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA21 BA22 BA23 CA17 CA18 CA23 CA59 MA66 NA14 ZA592 ZB072 ZB112 ZB132 ZB262 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 DA80 EA20 EA50 FA71 FA74 GA26 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 37/00 C07K 14/47 4H045 37/08 16/18 C07K 14/47 C12N 1/15 16/18 1 / 19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 G01N 33/15 Z 5/06 33/50 Z 5/10 33/53 D C12P 21/02 33/68 G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA 33/50 A61K 37/02 33/53 C12N 5/00 A 33/68 E (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB , GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG ), AP (GH, GM, KE, LS, MW) SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN , IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (71) Hoya Institute for Allergy and Immunology United States of America Cali Orunia State 92121 San Diego Science Center Drive 10355 (72) invention have two, Jian United States Maryland 20853, Rockville, manners field 5502 (72) inventor Rosen, Craig rays. United States Maryland 20882, Layton'sville, Rolling Hill Road 22400 (72) Inventor Genz, Rainer L. United States Maryland 20850, Rockville, Mount Prospect Drive 13608 (72) Inventor Ryu, Futon California 92130, USA, San Diego, Mensha Place 4351 F-term (reference) 2G045 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 DA78 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 CA09 CA20 DA02 DA03 DA06 EA02 EA04 GA11 GA13 GA18 GA19 GA25 HA13 HA14 4B064 AG01 AG28 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CC01 CC24 CE12 DA01 DA13 4B065 AA26X AA58X AA72X AA90X AA93BA14 BA10 AC14 BA10 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA21 BA22 BA23 CA17 CA18 CA23 CA59 MA66 NA14 ZA592 ZB072 ZB112 ZB132 ZB262 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 DA80 EA20 EA50 FA71 FA74 GA26
Claims (20)
離されたポリヌクレオチド： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１３３をコードするヌクレオチド配列に少な
くとも９５％同一であるヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜１３３をコードするヌクレオチド配列に少な
くとも９５％同一であるヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２５のアミノ酸１〜２７５をコードするヌクレオチド配列に少
なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列； （ｄ）配列番号２５のアミノ酸２〜２７５をコードするヌクレオチド配列に少
なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列； （ｅ）配列番号２７のアミノ酸１〜２９６をコードするヌクレオチド配列に少
なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列； （ｆ）配列番号２７のアミノ酸２〜２９６をコードするヌクレオチド配列に少
なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列；および （ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の相補体。1. An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of: (a) a nucleotide sequence that is at least 95% identical to the nucleotide sequence encoding amino acids 1-133 of SEQ ID NO: 2 (B) a nucleotide sequence that is at least 95% identical to the nucleotide sequence encoding amino acids 2-133 of SEQ ID NO: 2; (c) is at least 95% identical to the nucleotide sequence encoding amino acids 1-275 of SEQ ID NO: 25 (D) a nucleotide sequence that is at least 95% identical to the nucleotide sequence encoding amino acids 2-275 of SEQ ID NO: 25; (e) a nucleotide sequence that is at least 95% identical to the nucleotide sequence encoding amino acids 1-296 of SEQ ID NO: 27 (F) SEQ ID NO: A nucleotide sequence that is at least 95% identical to the nucleotide sequence encoding 27 amino acids 2-296; and (g) the complement of (a), (b), (c), (d), (e) or (f). body.
列である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。2. The isolated polynucleotide according to claim 1, wherein the nucleotide sequence is (a) or a sequence complementary thereto.
列である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。3. The isolated polynucleotide according to claim 1, wherein the nucleotide sequence is (c) or a sequence complementary thereto.
列である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。4. The isolated polynucleotide according to claim 1, wherein the nucleotide sequence is (e) or a sequence complementary thereto.
挿入する工程を包含する、組換えベクターを作製する方法。5. A method for producing a recombinant vector, comprising a step of inserting the isolated polynucleotide according to claim 1 into a vector.
。6. A recombinant vector comprising the polynucleotide according to claim 1.
た宿主細胞。7. A genetically engineered host cell comprising the polynucleotide of claim 1.
、該ポリペプチドを産生するために適切な条件下で、請求項７に記載の遺伝子操
作された宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程、を包
含する、方法。8. A method for producing a galectin-11 polypeptide, which comprises culturing the genetically engineered host cell of claim 7 under conditions suitable for producing the polypeptide. And recovering the polypeptide.
れたガレクチン１１ポリペプチド： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１３３に少なくとも９５％同一であるアミノ
酸配列； （ｂ）配列番号２５のアミノ酸１〜２７５に少なくとも９５％同一であるアミ
ノ酸配列； （ｃ）配列番号２７のアミノ酸１〜２９６に少なくとも９５％同一であるアミ
ノ酸配列； （ｄ）配列番号２５のアミノ酸１〜１２１； （ｅ）配列番号２７のアミノ酸１〜１４２；および （ｅ）配列番号２５のアミノ酸１５１〜２７５。9. An isolated galectin 11 polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: (a) an amino acid sequence that is at least 95% identical to amino acids 1-133 of SEQ ID NO: 2; A) an amino acid sequence at least 95% identical to amino acids 1-275 of SEQ ID NO: 25; (c) an amino acid sequence at least 95% identical to amino acids 1-296 of SEQ ID NO: 27; 121; (e) amino acids 1-142 of SEQ ID NO: 27; and (e) amino acids 151-275 of SEQ ID NO: 25.
されたポリペプチド。10. The isolated polypeptide according to claim 9, wherein said amino acid sequence is (a).
されたポリペプチド。11. The isolated polypeptide of claim 9, wherein said amino acid sequence is (b).
キャリアを含む、薬学的組成物。12. A pharmaceutical composition comprising the polypeptide of claim 9 and a pharmaceutically acceptable carrier.
された抗体。13. An isolated antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 9.
離された抗体。14. An isolated antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 10.
であって： ａ）請求項１３に記載の抗体と該サンプルとを接触させる工程、および ｂ）該ポリペプチドに結合された該抗体の存在を検出する工程、 を包含する、方法。15. A method for detecting a galectin-11 polypeptide in a sample, comprising: a) contacting the antibody of claim 13 with the sample; and b) the antibody bound to the polypeptide. Detecting the presence of the method.
であって： ａ）請求項１４に記載の抗体と該サンプルとを接触させる工程、および ｂ）該ポリペプチドに結合された該抗体の存在を検出する工程、 を包含する、方法。16. A method for detecting a galectin-11 polypeptide in a sample, comprising: a) contacting the antibody of claim 14 with the sample; and b) the antibody bound to the polypeptide. Detecting the presence of the method.
乳動物に、治療有効量の請求項９に記載のポリペプチドを投与する工程を包含す
る、方法。17. A method of treating a cell proliferative disorder in a mammal, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of the polypeptide of claim 9.
アレルギー性疾患からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。18. The method of claim 17, wherein said disorder is selected from the group consisting of cancer, autoimmune disease, inflammatory disease, asthma and allergic disease.
あって、該哺乳動物に、請求項９に記載のガレクチン１１ポリペプチドを、細胞
の増殖または分化を抑制するに十分な量で投与する工程を包含する、方法。19. A method for regulating the growth or differentiation of a cell in a mammal, comprising administering to the mammal the galectin-11 polypeptide of claim 9 in an amount sufficient to inhibit the growth or differentiation of the cell. Administering to the subject.
あって、該哺乳動物に、請求項１に記載のガレクチン１１ポリペプチドを、細胞
の増殖または分化を抑制するに十分な量で投与する工程を包含する、方法。20. A method for regulating the growth or differentiation of a cell in a mammal, wherein the galectin-11 polypeptide according to claim 1 is added to the mammal in an amount sufficient to suppress the growth or differentiation of the cell. Administering to the subject.
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