JP2002541815A - Recombinant and mutant adenoviruses derived from bovine adenovirus type 1 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウイルスベクターを提供する。１つの実施形態において、本発明は、初期遺伝子領域４（Ｅ４）中にＤＮＡの欠失および／または挿入を有する、変異ウシアデノウイルスおよび組換えウシアデノウイルスを提供する。別の実施形態において、本発明は、初期遺伝子領域３（Ｅ３）中にＤＮＡの欠失および／または挿入を有する、変異ウシアデノウイルス１ウイルスおよび組換えウシアデノウイルス１ウイルスを提供する。本発明はまた、ワクチン接種、遺伝子治療または適切な場合には他の適用のためのウイルスベクターの使用を意図する。   (57) [Summary] The present invention provides a viral vector. In one embodiment, the invention provides a mutant bovine adenovirus and a recombinant bovine adenovirus having a deletion and / or insertion of DNA in the early gene region 4 (E4). In another embodiment, the invention provides a mutant bovine adenovirus 1 virus and a recombinant bovine adenovirus 1 virus having a deletion and / or insertion of a DNA in the early gene region 3 (E3). The invention also contemplates the use of viral vectors for vaccination, gene therapy or other applications where appropriate.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、動物のワクチン接種のためのウイルスベクターに関する。特に、本
発明は、外来ＤＮＡの導入のための挿入部位を有するウイルスベクターに関する
。[0001] The present invention relates to viral vectors for vaccination of animals. In particular, the present invention relates to a viral vector having an insertion site for introducing foreign DNA.

【０００２】 （発明の背景） アデノウイルスは、ヒトならびに家畜および実験動物において、腸内感染また
は呼吸感染を引き起こす。BACKGROUND OF THE INVENTION [0002] Adenoviruses cause intestinal or respiratory infections in humans and livestock and laboratory animals.

【０００３】 アデノウイルスへの遺伝子の挿入が達成された。ヒトアデノウイルス（ＨｕＡ
ｄ）ゲノムにおいて、２つの重要な領域：Ｅ１およびＥ３（外来遺伝子が挿入さ
れ、組換えアデノウイルスを作製し得る）が存在する。[0003] Insertion of genes into adenovirus has been achieved. Human adenovirus (HuA)
d) There are two important regions in the genome: E1 and E3 (where foreign genes can be inserted to create a recombinant adenovirus).

【０００４】 遺伝子操作の適用は、ワクチンを獲得するためのアデノウイルス発現系を調製
するためのいくつかの試みに帰着した。このような研究の例としては、酵母宿主
における発現のためのアデノウイルス主要後期プロモーターについての米国特許
第４，５１０，２４５号の開示；Ｂ型肝炎表面抗原をコードする遺伝子を有する
有効な（ｌｉｖｅ）組換えアデノウイルス７型についての米国特許第４，９２０
，２０９号；ヒト細胞における非欠損ヒトアデノウイルス５組換え発現系につい
ての欧州特許第３８９，２８６号；および細胞における有効な非病原体免疫原性
生存可能なイヌアデノウイルスについての、公開された国際出願ＷＯ ９１／１
１５２５が挙げられる。[0004] The application of genetic engineering has resulted in several attempts to prepare adenovirus expression systems to obtain vaccines. Examples of such studies include the disclosure of US Pat. No. 4,510,245 for an adenovirus major late promoter for expression in a yeast host; an active gene having a gene encoding hepatitis B surface antigen. ) US Patent No. 4,920 for recombinant adenovirus type 7
, 209; EP 389,286 for non-defective human adenovirus 5 recombinant expression system in human cells; and published international publications for effective non-pathogenic immunogenic viable canine adenovirus in cells. Application WO 91/1
1525.

【０００５】 しかし、宿主細胞の侵入により適切であるため、固有の（ｉｎｄｉｇｅｎｏｕ
ｓ）アデノウイルスベクターが、ヒト起源のアデノウイルスと比較して、異なる
動物種における有効な組換えウイルスワクチンとしての使用により適切である。
例えば、ウシアデノウイルスベースの発現ベクターが、ウシアデノウイルス３（
ＢＡＶ−３）について報告された（米国特許第５，８２０，８６８号を参照のこ
と）。[0005] However, because it is more suitable for host cell invasion, it is unique (indigenou)
s) Adenovirus vectors are more suitable for use as effective recombinant virus vaccines in different animal species as compared to adenoviruses of human origin.
For example, a bovine adenovirus-based expression vector is a bovine adenovirus 3 (
BAV-3) (see US Pat. No. 5,820,868).

【０００６】 ウシアデノウイルス（ＢＡＶ）は、２つの亜型（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）に分割さ
れた少なくとも９つの血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）を含む。これらの亜型は、酵
素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、血清学的研究（免疫蛍光アッセイ、ウイル
ス中和試験、免疫電子顕微鏡を伴い、そして宿主特異性による）および臨床的症
候群に基づいて特徴付けられる。１亜型のウイルスとしては、ＢＡＶ１、ＢＡＶ
２、ＢＡＶ３およびＢＡＶ９が挙げられ、そして２亜型のウイルス（ＢＡＶ４、
ＢＡＶ５、ＢＡＶ６、ＢＡＶ７およびＢＡＶ８を含む）と比較して、確立された
ウシ細胞においては、比較的良好に増殖する。[0006] Bovine adenovirus (BAV) contains at least nine serotypes that have been divided into two subgroups. These subtypes are characterized based on enzyme-linked immunoassay (ELISA), serologic studies (with immunofluorescence assays, virus neutralization tests, immunoelectron microscopy, and by host specificity) and clinical syndromes . BAV1, BAV include viruses of subtype 1
2, BAV3 and BAV9, and two subtypes of the virus (BAV4,
(Including BAV5, BAV6, BAV7 and BAV8) proliferate relatively well in established bovine cells.

【０００７】 ＢＡＶ−３は、１９６５年に最初に単離され、そしてＢＡＶ遺伝子型の最良の
特徴であり、そして約３５キロベースのゲノムを含む。ＢＡＶ−３ゲノムにおけ
るエキソン（ｈｅｘｏｎ）およびプロテイナーゼ遺伝子の位置が同定され、そし
て配列決定された。[0007] BAV-3 was first isolated in 1965 and is the best feature of the BAV genotype and contains a genome of about 35 kilobases. Exon and proteinase gene locations in the BAV-3 genome were identified and sequenced.

【０００８】 ウシアデノウイルス１（ＢＡＶ−１）ゲノムの遺伝子がまた同定され、そして
配列決定された。しかし、他の遺伝子（例えば、ＢＡＶゲノムにおける特定の初
期遺伝子領域）の位置および配列は、報告されていない。[0008] Genes of the bovine adenovirus 1 (BAV-1) genome have also been identified and sequenced. However, the location and sequence of other genes (eg, specific early gene regions in the BAV genome) have not been reported.

【０００９】 適切なウイルスおよび遺伝子挿入部位の引き続きの同定は、新規のワクチンの
開発に役立つ。しかし、外来遺伝子発現のためのベクターを作製するための挿入
部位として使用するための、（ｉ）適切なウイルスおよび（ｉｉ）ゲノムの特定
の部分の選択は、顕著な挑戦を提供する。特に、挿入部位は、ウイルスの生存可
能な複製、ならびに組織培養およびインビボでのその操作に必須ではないはずで
ある。さらに、ウイルスの複製継続を確保しながら、挿入部位は、新規の遺伝物
質を受容し得るはずである。[0009] The subsequent identification of the appropriate virus and gene insertion site will aid in the development of new vaccines. However, the selection of (i) an appropriate virus and (ii) a particular portion of the genome for use as an insertion site for creating a vector for foreign gene expression offers significant challenges. In particular, the insertion site should not be essential for viable replication of the virus and its operation in tissue culture and in vivo. In addition, the insertion site should be able to accept new genetic material, while ensuring that the virus continues to replicate.

【００１０】 新規のウイルスベクターの作製のための、新規のウイルスおよび遺伝子挿入部
位の同定が必要とされる。[0010] There is a need to identify new viruses and gene insertion sites for the production of new viral vectors.

【００１１】 （発明の要旨） 一つの実施形態において、本発明は組換えウイルスを提供する。特定の使用に
限定されないが、これらの組換えウイルスは、ワクチンを生成するために使用さ
れ得る。SUMMARY OF THE INVENTION In one embodiment, the present invention provides a recombinant virus. Without being limited to a particular use, these recombinant viruses can be used to generate vaccines.

【００１２】 特定のウイルスに限定されないが、一つの実施形態において、本発明は、ウシ
アデノウイルスのＥ４遺伝子領域に挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組換えウイ
ルスを提供する。好ましい実施形態において、この挿入は、非必須部位に対する
。別の実施形態において、本発明は、ウシアデノウイルス１のＥ３遺伝子領域に
挿入された外来ＤＮＡ配列を含む組換えウイルスを提供する。好ましい実施形態
において、この挿入は、非必須部位に対する。[0012] Although not limited to a particular virus, in one embodiment, the invention provides a recombinant virus comprising a foreign DNA sequence inserted into the E4 gene region of a bovine adenovirus. In a preferred embodiment, the insertion is to a non-essential site. In another embodiment, the present invention provides a recombinant virus comprising a foreign DNA sequence inserted into the E3 gene region of bovine adenovirus 1. In a preferred embodiment, the insertion is to a non-essential site.

【００１３】 その複製能力に限定されないが、好ましい実施形態において、組換えウイルス
は、複製コンピテントを有する。同様に、挿入されるべき外来ＤＮＡに限定され
ないが、好ましい実施形態において、外来ＤＮＡは、ポリペプチドをコードし、
そして以下からなる群より選択される、ウイルスまたは細菌由来である：ウシロ
タウイルス、ウシコロナウイルス、ウシヘルペスウイルス１型、ウシＲＳウイル
ス、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａ ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３）（ＢＰＩ−３）、ウシ下痢症ウイルス
（ｂｏｖｉｎｅ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ）、ウシ鼻気管炎ウイルス（ｂ
ｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ウシパラインフ
ルエンザ３型ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｔｙｐｅ
３ ｖｉｒｕｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａ
ｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａおよび／またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ｓｏｍｎｕｓ。別の好ましい実施形態において、外来ＤＮＡは、サイトカイ
ンをコードする。さらに好ましい実施形態において、ポリペプチドは、１０を超
えるアミノ酸を含み、そして抗原性である。最後に、特に好ましい実施形態にお
いて、外来ＤＮＡ配列は、外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモーターの制御
下にある。[0013] Although not limited to its replication capacity, in a preferred embodiment, the recombinant virus has replication competence. Similarly, but not limited to the foreign DNA to be inserted, in a preferred embodiment, the foreign DNA encodes a polypeptide,
And bovine rotavirus, bovine coronavirus, bovine herpes virus type 1, bovine respiratory syncytial virus, bovine parainfluenza virus type 3 (bovine para infl) selected from the group consisting of:
uenza virus type 3) (BPI-3), bovine diarrhea virus, bovine rhinotracheitis virus (b
ovine rhinotracheitis virus, bovine parainfluenza type 3 virus (bovine parainfluenza type)
3 virus), Pasteurella haemolytica, Pa
steurella multitocida and / or Haemophilu
s somnus. In another preferred embodiment, the foreign DNA encodes a cytokine. In a further preferred embodiment, the polypeptide comprises more than 10 amino acids and is antigenic. Finally, in a particularly preferred embodiment, the foreign DNA sequence is under the control of a promoter located upstream of the foreign DNA sequence.

【００１４】 本発明はまた、変異体ウイルスを意図する。特定の変異体ウイルスに限定され
ないが、一つの実施形態において、変異体ウイルスは、ウシアデノウイルスのＥ
４遺伝子領域の少なくとも一部分の欠失を含む。好ましい実施形態において、こ
の欠失は、非必須部位である。別の実施形態において、ウイルスは、ウシアデノ
ウイルス１のＥ３遺伝子領域の少なくとも一部分の欠失を含む。好ましい実施形
態において、変異体ウイルスは、複製能を有する。さらに好ましい実施形態にお
いて、ウシアデノウイルスの関連する遺伝子領域の少なくとも一つのオープンリ
ーディングフレームが、完全に欠失している。[0014] The present invention also contemplates mutant viruses. While not limited to a particular mutant virus, in one embodiment, the mutant virus is a bovine adenovirus E
Includes deletion of at least a portion of the four gene regions. In a preferred embodiment, the deletion is a non-essential site. In another embodiment, the virus comprises a deletion of at least a portion of the E3 gene region of bovine adenovirus 1. In a preferred embodiment, the mutant virus is capable of replication. In a further preferred embodiment, at least one open reading frame of the relevant gene region of the bovine adenovirus is completely deleted.

【００１５】 さらに別の実施形態において、本発明は、少なくとも一つの抗原をコードする
少なくとも一つの外来遺伝子または遺伝子フラグメントをウイルスゲノムへ挿入
する工程を包含する、組換えウイルスを調製するための方法を提供する。ここで
、この遺伝子または遺伝子フラグメントは、ウシアデノウイルスの初期遺伝子領
域４に挿入されるか、またはウシアデノウイルス１の初期遺伝子領域３に挿入さ
れた。好ましい実施形態において、この方法は、ウイルスゲノムの少なくとも一
部分の細菌プラスミドへの挿入、上記細菌を上記プラスミドで形質転換する工程
、および上記細菌を、約２５℃でインキュベートする工程を包含する。[0015] In yet another embodiment, the present invention provides a method for preparing a recombinant virus comprising the step of inserting at least one foreign gene or gene fragment encoding at least one antigen into the viral genome. provide. Here, the gene or gene fragment was inserted into the early gene region 4 of bovine adenovirus or into the early gene region 3 of bovine adenovirus 1. In a preferred embodiment, the method comprises inserting at least a portion of the viral genome into a bacterial plasmid, transforming the bacterium with the plasmid, and incubating the bacterium at about 25 ° C.

【００１６】 別の実施形態において、本発明は、ワクチンを提供する。特定のワクチンに限
定されないが、一つの実施形態において、ワクチンは、上記の組換えウイルスを
含む。In another embodiment, the invention provides a vaccine. Although not limited to a particular vaccine, in one embodiment, the vaccine comprises a recombinant virus as described above.

【００１７】 本発明はまた、動物への上記のワクチンの導入を含むがこれに限定されない、
ワクチン接種の方法を意図する。The invention also includes, but is not limited to, the introduction of the above-described vaccines into animals.
Intended methods of vaccination.

【００１８】 （定義） 用語「動物」は、動物界における生物をいう。従って、この用語は、ヒト、な
らびに他の生物を含む。好ましくは、この用語は、脊椎動物をいう。より好まし
くは、この用語は、ウシ属動物をいう。Definitions The term “animal” refers to an organism in the animal kingdom. Thus, the term includes humans as well as other organisms. Preferably, the term refers to a vertebrate. More preferably, the term refers to bovine animals.

【００１９】 「ベクター」は、プラスミド、ファージ、コスミドまたはウイルスのようなレ
プリコンであり、別のＤＮＡ配列は、付着したＤＮＡ配列の発現を引き起こすた
めに、付着され得る。A “vector” is a replicon, such as a plasmid, phage, cosmid or virus, to which another DNA sequence may be attached to cause expression of the attached DNA sequence.

【００２０】 本発明の目的として、「宿主細胞」は、ベクターおよびその挿入物を増殖させ
るために使用される細胞である。細胞の感染は、当業者に周知の方法（例えば、
以下の（ＢＡＶ−１ ＤＮＡのトランスフェクション）に示されるような）によ
って、達成され得る。[0020] For the purposes of the present invention, a "host cell" is a cell used to propagate a vector and its insert. Infection of cells can be performed by methods known to those skilled in the art (eg,
(As shown in (Transfection of BAV-1 DNA) below).

【００２１】 ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、インビ
ボでポリペプチドに転写され、そして翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列
の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および３’（カルボキシ）末端の
翻訳停止コドンによって決定される。コード配列としては、原核生物配列、真核
生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲ
ノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列までもが挙げられ得るが、
これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、コード
配列の３’に位置し得る。[0021] A DNA "coding sequence" is a DNA sequence that is transcribed and translated into a polypeptide in vivo when placed under the control of appropriate regulatory sequences. The boundaries of the coding sequence are determined by a start codon at the 5 '(amino) terminus and a translation stop codon at the 3' (carboxy) terminus. Coding sequences can include prokaryotic sequences, cDNA from eukaryotic mRNA, genomic DNA from eukaryotic (eg, mammalian) DNA, viral DNA, and even synthetic DNA sequences,
It is not limited to these. The polyadenylation signal and transcription termination sequence may be located 3 'of the coding sequence.

【００２２】 「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼまたは補助タンパク質を結合し
得、そして下流（３’方向）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域で
ある。本発明を規定する目的のために、プロモーター配列は、コード配列の翻訳
開始コドン（ＡＴＧ）によって５’末端に近接し、そして上流（５’方向）へ伸
長し、バックグラウンドを超えた検出可能なレベルで転写を容易にするために必
要な、最小限の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内で、転写開始
部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コン
センサス配列）が見出された。真核生物プロモーターは、しばしば（しかし、常
ではない）、多くの真核生物のプロモーター領域で見出された保存配列である、
「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＡＴ」ボックスを含む。A “promoter sequence” is a DNA regulatory region capable of binding RNA polymerase or ancillary protein and initiating transcription of a downstream (3 ′ direction) coding sequence. For purposes of defining the present invention, a promoter sequence is proximate to the 5 'end by the translation initiation codon (ATG) of the coding sequence and extends upstream (5' direction) to be detectable above background. Contains the minimal bases or elements needed to facilitate transcription at the level. Within the promoter sequence, a transcription initiation site was found, as well as a protein binding domain (consensus sequence) responsible for binding RNA polymerase. Eukaryotic promoters are often (but not always) conserved sequences found in many eukaryotic promoter regions.
Contains a "TATA" box and a "CAAT" box.

【００２３】 コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼが、直接的または間接的にプロモーター配
列と相互作用し、そしてｍＲＮＡへのコード配列の転写を生じ、次いで、コード
配列によってコードされるポリペプチドへ翻訳される場合に、細胞におけるプロ
モーターまたは制御配列に「作動可能に連結」されるか、または細胞におけるプ
ロモーターまたは制御配列の制御下にある。A coding sequence is one in which RNA polymerase interacts, directly or indirectly, with a promoter sequence and results in transcription of the coding sequence into mRNA, which is then translated into the polypeptide encoded by the coding sequence. Is "operably linked" to a promoter or control sequence in a cell, or is under the control of a promoter or control sequence in a cell.

【００２４】 「二本鎖ＤＮＡ分子」は、その正常な二本鎖ヘリックスにおけるデオキシリボ
ヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形態を
いう。この用語は、分子の一次構造および二次構造のみをいい、そして任意の特
定の三次形態に限定されない。従って、この用語は、例えば、直鎖状ＤＮＡ分子
（例えば、ウイルス、プラスミドおよび染色体由来のＤＮＡの制限フラグメント
）、ならびにＤＮＡの環状形態およびコンカテマー化形態において見出された二
本鎖ＤＮＡを含む。“Double-stranded DNA molecule” refers to a polymeric form of a deoxyribonucleotide (adenine, guanine, thymine or cytosine) in its normal double-stranded helix. This term refers only to the primary and secondary structure of the molecule, and is not limited to any particular tertiary form. Thus, the term includes, for example, linear DNA molecules (eg, restriction fragments of DNA from viruses, plasmids and chromosomes), as well as double-stranded DNA found in circular and concatemerized forms of DNA.

【００２５】 「外来ＤＮＡ配列」は、組換え技術を使用して、別のＤＮＡ分子に付着したま
たは付着するＤＮＡのセグメントである。ここで、この特定のＤＮＡセグメント
は、他のＤＮＡ分子と関連して、どこにも見出されない。このような外来ＤＮＡ
の供給源は、配置された生物とは別の生物由来であり得るか、または別の生物由
来ではないかもしれない。外来ＤＮＡはまた、ネイティブ遺伝子とは異なるコド
ンを有する合成配列であり得る。組換え技術の例としては、スプライスＤＮＡに
対する制限酵素およびリガーゼの使用が挙げられるがこれに限定されない。An “exogenous DNA sequence” is a segment of DNA that is attached or attached to another DNA molecule using recombinant techniques. Here, this particular DNA segment is not found anywhere in relation to other DNA molecules. Such foreign DNA
May be from a different organism than the organism in which it is located, or may not be from another organism. Foreign DNA can also be a synthetic sequence with different codons than the native gene. Examples of recombinant techniques include, but are not limited to, the use of restriction enzymes and ligases on splice DNA.

【００２６】 「挿入部位」は、外来ＤＮＡが挿入され得るＤＮＡ分子における制限部位をい
う。“Insertion site” refers to a restriction site in a DNA molecule into which foreign DNA can be inserted.

【００２７】 本発明の目的のために、「相同性ベクター」は、アデノウイルスのゲノム上の
特定の部位へ、外来ＤＮＡ配列を挿入するように構築されたプラスミドである。For the purposes of the present invention, a “homology vector” is a plasmid constructed to insert a foreign DNA sequence into a specific site on the genome of an adenovirus.

【００２８】 用語「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、発現される場合
に、完全かつ特定のポリペプチド鎖タンパク質を生成し得る特定の遺伝子のため
の遺伝コード領域として定義される。The term “open reading frame” or “ORF” is defined as the genetic coding region for a particular gene that, when expressed, can produce a complete and specific polypeptide chain protein.

【００２９】 細胞は、このような外因性ＤＮＡが、細胞膜の内部に導入される場合、外因性
ＤＮＡで「形質転換」される。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体
ＤＮＡに組み込まれ得る（共有結合し得る）か、または組み込まれない（共有結
合されない）かもしれない。例えば、原核生物および酵母において、外因性ＤＮ
Ａは、エピソームのエレメント（例えば、プラスミド）上に維持され得る。安定
に形質転換された細胞は、外因性ＤＮＡが、染色体に組み込まれるようになり、
その結果、染色体複製を介して、娘細胞によって受け継がれる細胞である。哺乳
動物細胞について、この安定性は、細胞が、外因性ＤＮＡを含む娘細胞の集団か
らなる細胞株またはクローンを確立する能力によって示される。A cell is “transformed” by exogenous DNA when such exogenous DNA has been introduced inside the cell membrane. Exogenous DNA may or may not be integrated (covalently linked) into the chromosomal DNA making up the genome of the cell. For example, in prokaryotes and yeast, exogenous DN
A can be maintained on an episomal element such as a plasmid. A stably transformed cell is one in which exogenous DNA becomes integrated into the chromosome,
The result is a cell that is inherited by daughter cells via chromosomal replication. For mammalian cells, this stability is indicated by the ability of the cell to establish a cell line or clone consisting of a population of daughter cells containing exogenous DNA.

【００３０】 「複製コンピテントウイルス」は、野生型の生物において見出されるように、
この遺伝物質が、ウイルス複製に不可欠なＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列のすべて
を含むウイルスである。従って、複製コンピテントウイルスは、第二のウイルス
または細胞株を必要とせず、複製するために、ウイルスを欠損するか、またはウ
イルスから欠失されるものを供給する。「アデノウイルスゲノムにおける非必須
部位」は、アデノウイルスゲノムにおける領域を意味し、このポリペプチド産物
または調節配列は、ウイルス感染または複製に不可欠ではない。A “replication-competent virus” is, as found in wild-type organisms,
This genetic material is a virus that contains all of the DNA or RNA sequences essential for viral replication. Thus, a replication competent virus does not require a second virus or cell line and provides one that is either defective or deleted from the virus to replicate. "Non-essential site in the adenovirus genome" means a region in the adenovirus genome, the polypeptide product or regulatory sequence of which is not essential for viral infection or replication.

【００３１】 ２つのポリペプチド配列は、少なくとも約８０％（好ましくは、少なくとも約
９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％）のアミノ酸が、分子の規
定された長さを超えて一致する場合、「実質的に相同」である。[0031] Two polypeptide sequences are those in which at least about 80% (preferably, at least about 90%, and most preferably, at least about 95%) of the amino acids match over a defined length of the molecule. , "Substantially homologous."

【００３２】 ２つのＤＮＡ配列は、これらの配列が、同一か、またはヌクレオチドの４０％
、より好ましくは、ヌクレオチドの約２０％、そして最も好ましくは、ヌクレオ
チドの約１０％を超えて異ならない場合、「実質的に相同」である。Two DNA sequences are identical if they are identical or 40% of nucleotides
More preferably, they are "substantially homologous" if they do not differ by more than about 20% of the nucleotides, and most preferably, about 10% of the nucleotides.

【００３３】 そのゲノムに挿入された外来ＤＮＡ配列を有するウイルスは、「組換えウイル
ス」であるが、意図的な欠失（例えば、遺伝子操作）によって取り除かれたその
ゲノムの一部を有するウイルスは、「変異体ウイルス」である。A virus having a foreign DNA sequence inserted into its genome is a “recombinant virus”, but a virus having a portion of its genome that has been removed by an intentional deletion (eg, genetic engineering) is , "Mutant viruses".

【００３４】 用語「ポリペプチド」は、最も広い意味、すなわち、ペプチド結合を介して連
結したアミノ酸の任意のポリマー（ジペプチドまたはそれ以上のペプチド）にお
いて使用される。従って、用語「ポリペプチド」は、タンパク質、オリゴペプチ
ド、タンパク質フラグメント、アナログ、ムテイン、融合タンパク質などを含む
。The term “polypeptide” is used in its broadest sense, ie, any polymer of amino acids linked via peptide bonds (dipeptide or higher peptide). Thus, the term "polypeptide" includes proteins, oligopeptides, protein fragments, analogs, muteins, fusion proteins and the like.

【００３５】 「抗原性」は、１つ以上のエピトープを含む分子が、動物またはヒトの免疫系
を刺激して、体液性抗原特異的応答および／または細胞性抗原特異的応答を生じ
る能力をいう。「抗原」は、抗原性ポリペプチドである。“Antigenic” refers to the ability of a molecule containing one or more epitopes to stimulate an animal or human immune system to produce a humoral and / or cellular antigen-specific response. . An “antigen” is an antigenic polypeptide.

【００３６】 組成物またはワクチンに対する「免疫学的応答」は、目的の組成物またはワク
チンに対する、細胞性免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答の宿主におけ
る発達である。通常、このような応答は、目的の組成物またはワクチンに含まれ
る抗原を特異的に指向する、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細
胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞を産生する被験体からなる。An “immunological response” to a composition or vaccine is the development in a host of a cellular and / or antibody-mediated immune response to a composition or vaccine of interest. Usually, such a response is produced by a subject producing antibodies, B cells, helper T cells, suppressor T cells and / or cytotoxic T cells that are specifically directed against an antigen contained in the composition or vaccine of interest. Consists of

【００３７】 用語「免疫原性ポリペプチド」および「免疫原性アミノ酸配列」は、それぞれ
、ウイルスの感染力を中和し、そして／あるいは抗体補完（ａｎｔｉｂｏｄｙ−
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）細胞傷害または抗体依存性細胞傷害を媒介する抗体を誘
発して、免疫化宿主の防御を提供する、ポリペプチドまたはアミノ酸配列をいう
。本明細書中で使用されるように、「免疫原性ポリペプチド」は、所望のタンパ
ク質またはその免疫原性フラグメントの全長（または、ほぼ全長）配列を含む。The terms “immunogenic polypeptide” and “immunogenic amino acid sequence”, respectively, neutralize the infectivity of the virus and / or may be used in antibody complementation.
component refers to a polypeptide or amino acid sequence that elicits antibodies that mediate cytotoxicity or antibody-dependent cellular cytotoxicity and provides protection for the immunized host. As used herein, an "immunogenic polypeptide" comprises a full-length (or nearly full-length) sequence of a desired protein or immunogenic fragment thereof.

【００３８】 「免疫原性フラグメント」により、１つ以上のエピトープを含み、従って、イ
ルスの感染力を中和し、そして／あるいは抗体補完細胞傷害または抗体依存性細
胞傷害を媒介する抗体を誘発して、免疫化宿主の防御を提供するポリペプチドの
フラグメントが意味される。このようなフラグメントは、通常、少なくとも約５
アミノ酸長、そして好ましくは、少なくとも約１０〜１５アミノ酸長である。フ
ラグメントの長さの決定的な上限は存在せず、このフラグメントは、タンパク質
配列のほぼ全長、または２つ以上の抗原のフラグメントを含む融合タンパク質で
さえも含み得る。An “immunogenic fragment” comprises one or more epitopes, and thus neutralizes the infectivity of irs and / or elicits antibodies that mediate antibody-complementing or antibody-dependent cytotoxicity. Thus, fragments of a polypeptide that provide protection for the immunized host are meant. Such fragments are usually at least about 5
It is amino acids long, and preferably at least about 10-15 amino acids long. There is no definitive upper limit on the length of the fragment, which may include almost the entire length of the protein sequence, or even a fusion protein comprising two or more fragments of the antigen.

【００３９】 「感染性」により、細胞へウイルスゲノムを送達する能力を有することが意味
される。By “infectious” is meant having the ability to deliver a viral genome to a cell.

【００４０】 「実質的に純粋な」タンパク質は、他のタンパク質を含まず、好ましくは、少
なくとも１０％相同、より好ましくは、６０％相同、そして最も好ましくは、９
５％相同である。A “substantially pure” protein is free of other proteins, preferably at least 10% homologous, more preferably 60% homologous, and most preferably 9% homologous.
5% homologous.

【００４１】 （発明の詳細な説明） この開示に渡って、種々の刊行物、特許および特許出願が参照される。これら
の刊行物、特許および特許出願の開示は、本明細書中で参考として援用される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Throughout this disclosure, various publications, patents and patent applications are referenced. The disclosures of these publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference.

【００４２】 本発明の方法および組成物は、種々の原核生物供給源および真核生物供給源由
来のＤＮＡ配列を、遺伝子挿入、遺伝子欠失、一塩基変化または多重塩基変化に
よって改変する工程、ならびにアデノウイルスゲノムへのこれらの改変された配
列の引き続く挿入を包含する。一つの例としては、細菌プラスミドへアデノウイ
ルスＤＮＡの一部を挿入する工程、ウイルスＤＮＡが、特定の配列の欠失を含む
ような状態でウイルスＤＮＡを再構築する工程、および／あるいはさらに、欠失
の代わりか、または欠失によって取り除かれた部位のいずれかに、外来ＤＮＡ配
列を付加する工程が挙げられる。The methods and compositions of the present invention include the steps of modifying DNA sequences from various prokaryotic and eukaryotic sources by gene insertion, gene deletion, single or multiple base changes, and Includes subsequent insertion of these modified sequences into the adenovirus genome. One example is the step of inserting a portion of the adenoviral DNA into a bacterial plasmid, the step of reconstructing the viral DNA such that the viral DNA contains deletion of a particular sequence, and / or Adding a foreign DNA sequence either in place of the loss or at the site removed by the deletion.

【００４３】 一般的に、外来遺伝子構築物は、全体のアデノウイルスゲノムの一部分のみを
表すアデノウイルスヌクレオチド配列にクローニングされ、この配列は、１つ以
上の適切な欠失を有し得る。このキメラＤＮＡ配列は、通常、成功したクローニ
ングにより、配列の多くのコピーを産生し得るプラスミドに存在する。次いで、
クローニングされた外来遺伝子構築物が、例えば、ＤＮＡ媒介性同時トランスフ
ェクション技術後のインビボ組換えによって、完全なウイルスゲノムに含まれ得
る。コード配列の多重コピーまたは１を超えるコード配列は、ウイルスゲノムに
挿入され得、その結果、組換えウイルスは、１を超える外来タンパク質または同
じタンパク質の多重コピーを発現し得る。外来遺伝子は、付加、欠失または置換
されて、発現および／または発現タンパク質の免疫学的効果を増強し得る。Generally, a foreign gene construct is cloned into an adenovirus nucleotide sequence that represents only a portion of the entire adenovirus genome, which sequence may have one or more appropriate deletions. This chimeric DNA sequence is usually present on a plasmid that can produce many copies of the sequence upon successful cloning. Then
The cloned foreign gene construct can be included in the entire viral genome, for example, by in vivo recombination following a DNA-mediated co-transfection technique. Multiple copies of the coding sequence or more than one coding sequence can be inserted into the viral genome, so that the recombinant virus can express more than one foreign protein or multiple copies of the same protein. Foreign genes can be added, deleted or substituted to enhance expression and / or the immunological effect of the expressed protein.

【００４４】 遺伝子の成功した発現を生じるために、遺伝子は、エンハンサーエレメントお
よびポリアデニル化配列を含む適切なプロモーターとともに、発現ベクターに挿
入され得る。哺乳動物細胞において、外来遺伝子の成功した発現を提供する多く
の真核生物プロモーターおよびポリアデニル化配列、ならびにどのように発現カ
セットを構築するかは、例えば、米国特許第５，１５１，２６７号のように、当
該分野で公知である。プロモーターは、公知の基準に従って、体液性免疫応答、
細胞媒介性免疫応答および粘膜性免疫応答を順番に十分に導く免疫原性タンパク
質の最適な発現を与えるように選択される。[0044] To produce successful expression of the gene, the gene can be inserted into an expression vector, along with a suitable promoter containing enhancer elements and polyadenylation sequences. Many eukaryotic promoters and polyadenylation sequences that provide for successful expression of foreign genes in mammalian cells, and how to construct expression cassettes, are described, for example, in US Pat. No. 5,151,267. Are well known in the art. The promoter, according to known criteria, has a humoral immune response,
It is chosen to give optimal expression of the immunogenic protein which in turn satisfactorily directs the cell-mediated and mucosal immune responses.

【００４５】 外来ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドは、組換えウイルス感染細
胞において、インビボでの発現によって産生される。ポリペプチドは、免疫原性
であり得る。１を超える外来遺伝子が、ウイルスゲノムに挿入されて、１を超え
る有効なタンパク質の成功した産生を獲得し得る。The polypeptide encoded by the foreign DNA sequence is produced by expression in vivo in cells infected with the recombinant virus. The polypeptide can be immunogenic. More than one foreign gene can be inserted into the viral genome to obtain successful production of more than one effective protein.

【００４６】 従って、変異体アデノウイルスの使用、またはアデノウイルスゲノムへの外来
ＤＮＡ配列の付加の一つの有用性は、動物をワクチン接種することである。例え
ば、変異体ウイルスは、動物に導入されて、変異体ウイルスに対する免疫応答を
誘発し得る。Thus, one utility of using mutant adenoviruses or adding foreign DNA sequences to the adenovirus genome is to vaccinate animals. For example, a mutant virus can be introduced into an animal to elicit an immune response against the mutant virus.

【００４７】 あるいは、ポリペプチドをコードするゲノムへ挿入された外来ＤＮＡ配列を有
する組換えアデノウイルスはまた、外来ＤＮＡ配列、外来ＤＮＡ配列および／ま
たはアデノウイルス自身によってコードされるポリペプチドに対する、動物にお
ける免疫応答の誘発に役立ち得る。このようなウイルスはまた、宿主動物へ外来
ＤＮＡおよびその産物を導入するために使用され、宿主動物における欠損ゲノム
状態を緩和し得るか、または宿主動物のゲノム状態を増強し得る。Alternatively, a recombinant adenovirus having a foreign DNA sequence inserted into the genome encoding the polypeptide can also be used in an animal against foreign DNA sequences, foreign DNA sequences and / or polypeptides encoded by the adenovirus itself. It can help elicit an immune response. Such viruses can also be used to introduce foreign DNA and its products into a host animal, which can alleviate the defective genomic state in the host animal or enhance the genomic state of the host animal.

【００４８】 本発明は、特定のウイルスベクターの使用に限定されないが、好ましい実施形
態において、本発明は、ウシアデノウイルス発現ベクター系を利用する。特に好
ましい実施形態において、本発明は、Ｅ４遺伝子領域の一部またはすべてが欠失
され、そして／あるいは外来ＤＮＡが導入されるウシアデノウイルスを含む。あ
るいは、この系は、Ｅ３および／もしくはＥ４遺伝子領域の一部またはＥ３およ
び／もしくはＥ４遺伝子領域のすべてが欠失され、そして／あるいは外来ＤＮＡ
が導入されるウシアデノウイルス１（ＢＡＶ−１）を含む。Although the invention is not limited to the use of a particular viral vector, in a preferred embodiment, the invention utilizes a bovine adenovirus expression vector system. In a particularly preferred embodiment, the invention includes a bovine adenovirus in which some or all of the E4 gene region has been deleted and / or foreign DNA has been introduced. Alternatively, the system may comprise deleting part of the E3 and / or E4 gene region or all of the E3 and / or E4 gene region and / or exogenous DNA
Contains bovine adenovirus 1 (BAV-1) to be introduced.

【００４９】 本発明は、本発明に従って、ウシアデノウイルスヌクレオチド配列に挿入され
る、外来遺伝子またはコード配列（ウイルス、原核生物および真核生物）によっ
て制限されない。代表的には、目的の外来ＤＮＡ配列は、ウシまたは乳業に対す
る経済的衝撃を有する疾患を、ウシにおいて引き起こす病原体由来である。この
遺伝子は、既存のワクチンが存在する生物に由来し得、そしてベクター技術の新
たな利点のために、アデノウイルス由来ワクチンが優れている。また、目的の遺
伝子は、現在ワクチンが存在しないが、疾患の制御が必要とされる病原体由来で
あり得る。代表的には、目的の遺伝子は、病原体の免疫原性ポリペプチドをコー
ドし、そして表面タンパク質、分泌タンパク質および構造タンパク質を表し得る
。The present invention is not limited by foreign genes or coding sequences (viruses, prokaryotes and eukaryotes) inserted into the bovine adenovirus nucleotide sequence according to the present invention. Typically, the foreign DNA sequence of interest is from a pathogen that causes a disease in cattle that has an economic impact on cattle or dairy. This gene can be derived from the organism in which the existing vaccine resides, and adenovirus-derived vaccines are superior because of the new advantages of vector technology. Also, the gene of interest may be from a pathogen for which no vaccine currently exists, but disease control is required. Typically, the gene of interest encodes an immunogenic polypeptide of the pathogen and may represent surface, secreted and structural proteins.

【００５０】 本発明は、外来ＤＮＡ配列が、ウシアデノウイルスゲノムへの遺伝子挿入のた
めに獲得される特定の生物に限定されない。好ましい実施形態において、外来Ｄ
ＮＡは、ウシロタウイルス、ウシコロナウイルス、ウシヘルペスウイルス１型、
ウシＲＳウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ｂｏｖｉｎｅ ｐａ
ｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｔｙｐｅ ３ ｖｉｒｕｓ）（ＢＰＩ−３）、ウシ下
痢症ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ）、ウシ鼻気管炎
ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ウ
シパラインフルエンザ３型ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚ
ａ ｔｙｐｅ ３ ｖｉｒｕｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔ
ｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａおよび／またはＨａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ由来である。別の好ましい実施形態において、外
来ＤＮＡはサイトカインをコードする。The present invention is not limited to a particular organism in which foreign DNA sequences are obtained for gene insertion into the bovine adenovirus genome. In a preferred embodiment, the foreign D
NA is bovine rotavirus, bovine coronavirus, bovine herpesvirus type 1,
Bovine respiratory syncytial virus, bovine parainfluenza virus type 3 (bovine pa
rainfluenza type 3 virus (BPI-3), bovine diarrhea virus, bovine rhinotracheitis virus, bovine parainfluenza type 3 virus (bovineflu).
a type 3 virus), Pasteurella haemolyt
ica, Pasteurella multitocida and / or Haem
opilis somnus. In another preferred embodiment, the foreign DNA encodes a cytokine.

【００５１】 本発明はまた、このような生物由来の特定のＤＮＡ配列の使用に限定されない
。アデノウイルスゲノムに挿入されるべき外来ＤＮＡ配列の選択は、しばしば、
コードするタンパク質に基づく。好ましくは、外来ＤＮＡ配列は、免疫原性ポリ
ペプチドをコードする。The present invention is also not limited to the use of particular DNA sequences from such organisms. The choice of foreign DNA sequence to be inserted into the adenovirus genome is often
Based on the encoding protein. Preferably, the foreign DNA sequence encodes an immunogenic polypeptide.

【００５２】 本発明のウイルス系によって発現されるべき好ましい免疫原性ポリペプチドは
、抗原をコードする全長（ほぼ全長）配列を含む。あるいは、免疫原性である（
すなわち、１つ以上のエピトープをコードする）、より短い配列が使用され得る
。より短い配列が、中和エピトープをコードし得、この中和エピトープは、イン
ビトロアッセイにおいてウイルス感染力を中和する抗体を誘発し得るエピトープ
として定義される。好ましくは、ペプチドは、宿主において、保護性の免疫応答
（すなわち、感染から免疫化宿主を防御する抗体媒介性免疫応答および／または
細胞媒介性免疫応答）を惹起し得る保護性のエピトープをコードするべきである
。場合によっては、特定の抗原についての遺伝子は、多数のイントロンを含み得
るか、またはＲＮＡウイルス由来であり得る。これらの場合、相補的ＤＮＡコピ
ー（ｃＤＮＡ）が使用され得る。[0052] Preferred immunogenic polypeptides to be expressed by the viral system of the present invention comprise a full-length (almost full-length) sequence encoding the antigen. Alternatively, it is immunogenic (
Ie, encoding one or more epitopes), shorter sequences can be used. Shorter sequences can encode a neutralizing epitope, which is defined as an epitope that can elicit antibodies that neutralize viral infectivity in an in vitro assay. Preferably, the peptide encodes a protective epitope capable of eliciting a protective immune response in the host (ie, an antibody- and / or cell-mediated immune response that protects the immunized host from infection). Should. In some cases, the gene for a particular antigen may contain multiple introns or may be from an RNA virus. In these cases, a complementary DNA copy (cDNA) can be used.

【００５３】 野生型生物において見出されたように、完全な配列ではなく、遺伝子のヌクレ
オチド配列のフラグメントを使用することがまた可能である。入手可能であれば
、合成遺伝子またはそのフラグメントがまた使用され得る。しかし、本発明は、
広範な種々の遺伝子および／またはフラグメントを用いて使用され得、そして本
明細書中に述べられるものに限定されない。It is also possible to use fragments of the nucleotide sequence of the gene, rather than the complete sequence, as found in wild-type organisms. Where available, synthetic genes or fragments thereof may also be used. However, the present invention
A wide variety of genes and / or fragments can be used, and are not limited to those described herein.

【００５４】 従って、本発明において使用される外来ＤＮＡ配列によってコードされる抗原
は、ネイティブの免疫原性ポリペプチドまたはフラグメント、あるいは組換え免
疫原性ポリペプチドまたはフラグメントのいずれかであり得る。これらは、部分
配列、全長配列または融合（例えば、組換え宿主についての適切なリーダー配列
を有し、そして／または別の病原体についてのさらなる抗原配列を有する）でさ
えあり得る。Thus, the antigen encoded by the foreign DNA sequence used in the present invention can be either a native immunogenic polypeptide or fragment, or a recombinant immunogenic polypeptide or fragment. These may be subsequences, full length sequences or even fusions (eg, having an appropriate leader sequence for a recombinant host and / or having additional antigenic sequences for another pathogen).

【００５５】 本発明はまた、得られた組換えウイルスおよび変異体ウイルスの複製する能力
によって限定されない。好ましい実施形態において、本発明の変異ウイルスおよ
び組換えウイルスは、複製コンピテントを有する。この様式において、補完（ｃ
ｏｍｐｌｉｍｅｎｔｉｎｇ）細胞株は、ウイルスの適切な供給を産生する必要が
ない。The present invention is also not limited by the ability of the resulting recombinant and mutant viruses to replicate. In a preferred embodiment, the mutant and recombinant viruses of the invention have replication competence. In this style, the complement (c
implementation cell lines do not need to produce an adequate supply of virus.

【００５６】 上記のように、本発明は、動物のワクチン接種のために、本発明の組換えウイ
ルスおよび変異体ウイルスの投与を意図する。本発明は、動物への投与の性質に
限定されない。例えば、本発明において使用される抗原は、特に、短いオリゴペ
プチドからなる場合、ワクチンキャリアに結合体化され得る。ワクチンキャリア
は、当該分野で周知である：例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）およびスカシガイ科ヘモシアニン（ＫＬＨ）。好ましいキ
ャリアタンパク質であるロタウイルスＶＰ６は、ＥＰＯ公開番号０２５９１４９
に開示される。As noted above, the present invention contemplates administration of the recombinant and mutant viruses of the present invention for vaccination of animals. The present invention is not limited to the nature of administration to animals. For example, the antigens used in the present invention can be conjugated to a vaccine carrier, especially if they consist of short oligopeptides. Vaccine carriers are well known in the art: for example, bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA) and keyhole limpet hemocyanin (KLH). A preferred carrier protein, rotavirus VP6, is EPO Publication No. 0259149.
Is disclosed.

【００５７】 外来遺伝子またはフラグメントを保有する本発明のワクチンはまた、適切な経
口キャリア（例えば、腸溶性被覆投薬形態）において経口投与され得る。経口処
方としては、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグ
ネシウム、サッカリンナトリウムセルロース、炭酸マグネシウムなどの薬剤等級
のような通常利用される賦形剤が挙げられる。経口ワクチン組成物は、約１０％
〜約９５％、好ましくは、約２５％〜約７０％の活性成分を含む、溶液（例えば
、水）、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方物、または散剤の形態で摂
取され得る。経口ワクチンは、全身性免疫と組み合わせて粘膜免疫を高めること
が好ましいようであり、これは、胃腸管を感染する病原体に対する防御において
重要な役割を果たす。A vaccine of the invention carrying a foreign gene or fragment can also be administered orally in a suitable oral carrier, such as an enteric coated dosage form. Oral formulations include such normally employed excipients as, for example, pharmaceutical grades such as mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin cellulose, and magnesium carbonate. Oral vaccine composition is about 10%
In the form of solutions (eg, water), suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release formulations, or powders containing from about 25% to about 95%, preferably about 25% to about 70%, of the active ingredient. Can be ingested. It appears that oral vaccines preferably enhance mucosal immunity in combination with systemic immunity, which plays an important role in protection against pathogens that infect the gastrointestinal tract.

【００５８】 さらに、ワクチンは、坐剤に処方され得る。坐剤について、ワクチン組成物と
しては、伝統的な結合剤およびキャリア（例えば、ポリアルカリン（ｐｏｌｙａ
ｌｋａｌｉｎｅ）グリコールまたはトリグリセリド）が挙げられる。このような
坐剤は、約０．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは、約１％〜約２％の範囲
で活性成分を含む混合物から形成され得る。In addition, the vaccine may be formulated in a suppository. For suppositories, vaccine compositions include traditional binders and carriers such as polyalkaline (polyalkaline).
lkaline) glycol or triglyceride). Such suppositories may be formed from mixtures containing the active ingredient in the range of about 0.5% to about 10% (w / w), preferably about 1% to about 2%.

【００５９】 本発明のワクチン組成物の動物への投与のためのプロトコルは、本開示を考慮
して、当該分野の範囲内である。当業者は、抗原性フラグメントに対する抗体媒
介性免疫応答および／またはＴ細胞媒介性免疫応答を誘発するに有効な用量で、
ワクチン組成物の濃度を選択する。[0059] Protocols for administering the vaccine compositions of the invention to animals are within the skill of the art in light of the present disclosure. The skilled artisan will appreciate that a dose effective to elicit an antibody- and / or T-cell mediated immune response to an antigenic fragment can be
Select the concentration of the vaccine composition.

【００６０】 投与のタイミングがまた、重要であり得る。例えば、一次接種は、好ましくは
、必要であれば、引き続くブースター接種の後であり得る。これはまた、任意で
あるが、最初の免疫化の後、数週間から数ヶ月の動物への第二のブースター免疫
を投与することが好ましいようである。疾患に対する防御の持続された高レベル
を保証するために、規則的な間隔（例えば、数年ごとに一度）で、動物にブース
ター免疫を再投与することが有用であり得る。あるいは、最初の用量は、後の接
種後に経口投与され得るか、またその逆も同様である。好ましいワクチン接種プ
ロトコルは、慣用的なワクチン接種プロトコル実験を通して確立され得る。The timing of administration can also be important. For example, a primary inoculation may preferably be after a subsequent booster inoculation, if necessary. It also appears that, optionally, it is preferable to administer a second booster immunization to the animals weeks to months after the initial immunization. At regular intervals (eg, once every few years), it may be useful to re-administer animals with booster immunity to ensure sustained high levels of protection against the disease. Alternatively, the first dose can be administered orally after a subsequent inoculation, and vice versa. A preferred vaccination protocol can be established through routine vaccination protocol experiments.

【００６１】 インビボ組換えウイルスワクチンの投与のあらゆる経路についての投薬は、種
々の因子（患者の寸法、防御が必要とされる感染の性質、キャリアおよび他の因
子の型を含む）に依存し、これは、当業者によって容易に決定され得る。限定し
ない例示の目的のために、１０³プラーク形成単位（ｐｆｕ）と１０⁸ｐｆｕとの
間の投薬が使用され得る。The dosage for any route of administration of the in vivo recombinant viral vaccine depends on various factors, including the size of the patient, the nature of the infection for which protection is required, the type of carrier and other factors, This can be easily determined by one skilled in the art. For non-limiting illustrative purposes, dosing between 10 ³ plaque forming units (pfu) and 10 ⁸ pfu may be used.

【００６２】 本発明はまた、遺伝子欠損の制御を必要として、動物へ遺伝子治療を提供する
ための方法を含む。一つの実施形態において、この方法は、遺伝子の非欠損形態
をコードする外来ヌクレオチド配列を含む、生きている組換えウシアデノウイル
スを、上記の動物へ投与する工程を包含する。外来ヌクレオチド配列は、哺乳動
物ゲノムへ組み込まれるか、または独立に維持されて、標的器官または組織にお
いて必要な遺伝子の発現を提供するかのいずれかである。これらの種類の技術が
、最近当業者によって使用されて、欠損遺伝子またはその一部分を置換した。例
えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，３９９，３４６号は、遺伝子治療に
ついての技術を記載する。さらに、従来の遺伝子治療における使用のために組み
込まれ得る外来遺伝子ヌクレオチド配列またはその一部分としては、システィッ
ク線維形成膜貫通コンダクタンス調節遺伝子（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ
ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ
ｇｅｎｅ）、ヒトミニジストロフィン（ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）遺伝
子、α１抗トリプシン遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。The present invention also includes a method for providing gene therapy to an animal in need of controlling gene deficiency. In one embodiment, the method comprises administering to the animal a live recombinant bovine adenovirus comprising a foreign nucleotide sequence encoding a non-defective form of the gene. The foreign nucleotide sequence is either integrated into the mammalian genome or maintained independently to provide for expression of the required gene in the target organ or tissue. These types of techniques have recently been used by those skilled in the art to replace defective genes or portions thereof. For example, US Pat. No. 5,399,346 to Anderson et al. Describes a technique for gene therapy. In addition, foreign gene nucleotide sequences or portions thereof that can be incorporated for use in conventional gene therapy include the cystic fibrosis transmembrane conductance regulatory gene (cystic fibrosis).
transmembrane conductance regulator
gene, the human minidystrophin gene, the α1 antitrypsin gene, and the like, but are not limited thereto.

【００６３】 組換えアデノウイルスを構築し、選択しそして精製するための方法は、以下の
材料、方法および実施例において以下に記載される。以下は、特定の好ましい実
施形態および本発明の局面を説明するために役立ち、そして本発明の範囲を制限
するように解釈されるべきではない。[0063] Methods for constructing, selecting and purifying recombinant adenovirus are described below in the following Materials, Methods and Examples. The following serves to illustrate certain preferred embodiments and aspects of the invention and should not be construed as limiting the scope of the invention.

【００６４】 （ウシアデノウイルス（ＢＡＶ−１）ストックの調製） ウシアデノウイルスストックを、２ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍｌペ
ニシリン、１００ユニット／ｍｌストレプトマイシン（これらの成分は、Ｓｉｇ
ｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）または同等の供給業者から獲得し、そして今後
完全ＤＭＥ培地という）および１％ウシ胎仔血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅ
ａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で、０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で、組織培
養細胞であるＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ）を感染すること
によって調製した。細胞病理学上の効果が完了した後、培地および細胞を収集し
た。１または２サイクルの凍結（−７０℃）および融解（３７℃）の後、感染細
胞を、１ｍｌのストックとして等分し、そして−７０℃で凍結保存した。(Preparation of Bovine Adenovirus (BAV-1) Stock) Bovine adenovirus stock was prepared using 2 mM glutamine, 100 units / ml penicillin, 100 units / ml streptomycin (these components were Sig
ma (St. Louis, MO) or equivalent supplier and hereinafter referred to as complete DME medium) and Dulbecco modified E containing 1% fetal calf serum.
Prepared by infecting tissue culture cells, Madin-Darby bovine kidney cells (MDBK), in agle medium (DMEM) at a multiplicity of infection of 0.01 PFU / cell. After completion of the cytopathological effects, the media and cells were collected. After one or two cycles of freezing (-70 ° C) and thawing (37 ° C), infected cells were aliquoted as 1 ml stocks and stored frozen at -70 ° C.

【００６５】 （ウシアデノウイルス（ＢＡＶ−１）ＤＮＡの調製） ウシアデノウイルスのすべての操作を、菌株１０（ＡＴＣＣ ＶＲ−３１３）
を使用して行った。感染細胞の細胞質由来のＢＡＶ−１ウイルスＤＮＡの調製の
ために、ＭＤＢＫ細胞を、細胞の過増殖の前に、広範な細胞病理学上の効果を引
き起こすに十分な感染多重度（ＭＯＩ）で感染した。すべてのインキュベーショ
ンは、空気中に５％ ＣＯ₂を含む加湿インキュベーター中で、３７℃で行った
。Preparation of Bovine Adenovirus (BAV-1) DNA All manipulations of bovine adenovirus were performed using strain 10 (ATCC VR-313).
Performed using For the preparation of BAV-1 viral DNA from the cytoplasm of infected cells, MDBK cells are infected at a multiplicity of infection (MOI) sufficient to cause a wide range of cytopathological effects prior to cell overgrowth. did. All incubations were performed at 37 ° C. in a humidified incubator containing 5% CO ₂ in air.

【００６６】 最良のＤＮＡ収率は、最大限に感染されたが、不完全な細胞溶解を示す（代表
的には、５〜７日）単分子層を収集することによって得た。感染細胞を、細胞ス
クレーパー（Ｃｏｓｔａｒブランド）を使用して、培地中へ細胞をこすることに
よって収集した。細胞懸濁液を、ＧＳ−３ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＣＴ）中で、５℃で１０分間、３０００ｒｐ
ｍで遠心分離した。得られたペレットを、冷ＰＢＳ（２０ｍｌ／Ｒｏｌｌｅｒ
Ｂｏｔｔｌｅ）で再懸濁し、そして氷点下で（ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｌｄ）、３０
００ｒｐｍで１０分間、さらなる遠心分離に供した。The best DNA yields were obtained by collecting monolayers that were maximally infected but showed incomplete cell lysis (typically 5-7 days). Infected cells were harvested by scraping the cells into media using a cell scraper (Costar brand). The cell suspension was washed with a GS-3 rotor (Sorvall Inst.
instruments, Newtown, CT) at 3000 rpm for 10 minutes at 5 ° C.
m. The obtained pellet was mixed with cold PBS (20 ml / Roller).
(Bottle) and in the cold, 30
Further centrifugation was performed at 00 rpm for 10 minutes.

【００６７】 ＰＢＳをデカントした後、細胞ペレットを５ｍｌ／ローラーボトルのＴＥ緩衝
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５および１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、
そして１５分間氷上で膨張させる。ＮＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０．ＴＭ
．；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を０．５％の最終濃度までサンプル
に添加し、そしてさらに１５分間氷上に維持する。このサンプルを、低温室で３
０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して、核をペレット化し、そして細胞の破片を
取り除いた。After decanting the PBS, the cell pellet was resuspended in 5 ml / roller bottle of TE buffer (10 mM Tris pH 7.5 and 1 mM EDTA)
Then inflate on ice for 15 minutes. NP40 (Nonidet P-40.TM)
. Sigma, St .; (Louis, MO) is added to the sample to a final concentration of 0.5% and kept on ice for an additional 15 minutes. Place this sample in a cold room
Centrifugation at 000 rpm for 10 minutes pelleted nuclei and removed cell debris.

【００６８】 上清の流体を、３０ｍｌのＣｏｒｅｘ遠心管に慎重に移した。ＳＤＳ（ドデシ
ル硫酸ナトリウム；ストック２０％）を、最終濃度１％までサンプルに添加した
。１０ｍｇ／ｍｌで、２００μｌのプロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）をサンプルの１ローラー
ボトル当たり添加し、混合し、そして４５℃で１〜２時間インキュベートした。The supernatant fluid was carefully transferred to a 30 ml Corex centrifuge tube. SDS (sodium dodecyl sulfate; stock 20%) was added to the sample to a final concentration of 1%. At 10 mg / ml, 200 μl of proteinase K (Boehringer
Mannheim, Indianapolis, Ind.) Was added per roller bottle of sample, mixed and incubated at 45 ° C. for 1-2 hours.

【００６９】 この期間の後、等量の、水で飽和したフェノールをサンプルに添加し、そして
ボルテックスで混合した。サンプルを、臨床用の遠心分離機において、５分間３
０００ｒｐｍでスピンし、相を分離した。ＮａＡｃを、最終濃度０．３Ｍまで水
相に添加し（ストック溶液 ３Ｍ、ｐＨ ５．２）、そして核酸を、２．５容の
冷無水エタノールの添加後、−７０℃で３０分間沈殿させた。サンプル中のＤＮ
Ａを、４℃でＨＢ−４ローターにおいて、８０００ｒｐｍまで２０分間スピンす
ることによってペレット化した。After this period, an equal volume of water-saturated phenol was added to the sample and mixed by vortexing. Samples were placed in a clinical centrifuge for 3 minutes for 5 minutes.
Spin at 000 rpm and separate phases. NaAc was added to the aqueous phase to a final concentration of 0.3M (stock solution 3M, pH 5.2) and the nucleic acids were precipitated at -70 ° C for 30 minutes after the addition of 2.5 volumes of cold absolute ethanol. . DN in sample
A was pelleted by spinning in an HB-4 rotor at 4 ° C to 8000 rpm for 20 minutes.

【００７０】 上清を慎重に取り除き、そしてＤＮＡペレットを、２５ｍｌの８０％エタノー
ルで、１回洗浄した。ＤＮＡペレットを、手短に減圧（２〜３分）によって乾燥
させ、そしてＴＥ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）の感染細胞の２ｍｌ／ローラーボトルに再懸濁させた。１０μｌのＲＮａｓ
ｅＡを１０ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で添加し、そし
て３７℃で１時間インキュベートした。０．５ｍｌの５Ｎ ＮａＣｌおよび０．
７５ｍｌの３０％ ＰＥＧを添加し、そして４℃で一晩沈殿させた。The supernatant was carefully removed and the DNA pellet was washed once with 25 ml of 80% ethanol. The DNA pellet was briefly dried by vacuum (2-3 minutes) and TE buffer (20 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDT)
Resuspended in 2 ml / roller bottle of infected cells of A). 10 μl of RNas
eA was added at 10 mg / ml (Sigma, St. Louis, MO) and incubated for 1 hour at 37 ° C. 0.5 ml of 5N NaCl and 0.
75 ml of 30% PEG was added and precipitated overnight at 4 ° C.

【００７１】 サンプル中のＤＮＡを、４℃でＨＢ−４ローターにおいて、８０００ｒｐｍま
で２０分間スピンすることによってペレット化した。ペレットを２ｍｌのＴＥＳ
緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．２％
ＳＤＳ）中で再懸濁し、そして等量の、水で飽和したフェノールで抽出した。サ
ンプルを、臨床用の遠心分離機において、５分間３０００ｒｐｍでスピンし、相
を分離した。ＮａＡｃを、最終濃度０．３Ｍまで水相に添加し（ストック溶液
３Ｍ、ｐＨ ５．２）、そして核酸を、２．５容の冷無水エタノールの添加後、
−７０℃で３０分間沈殿させた。The DNA in the sample was pelleted by spinning at 8000 rpm for 20 minutes in a HB-4 rotor at 4 ° C. Pellet 2ml TES
Buffer (20 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA and 0.2%
Resuspended in SDS) and extracted with an equal volume of water-saturated phenol. The samples were spun at 3000 rpm for 5 minutes in a clinical centrifuge and the phases were separated. NaAc was added to the aqueous phase to a final concentration of 0.3 M (stock solution).
3M, pH 5.2) and the nucleic acid after addition of 2.5 volumes of cold absolute ethanol
Precipitated at -70 ° C for 30 minutes.

【００７２】 サンプル中のＤＮＡを、５℃でＨＢ−４ローターにおいて、８０００ｒｐｍま
で２０分間スピンすることによってペレット化した。上清を慎重に取り除き、そ
してＤＮＡペレットを、２５ｍｌの８０％エタノールで、１回洗浄した。ＤＮＡ
ペレットを、手短に減圧（２〜３分）によって乾燥させ、そしてＴＥ緩衝液（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の感染細胞の２ｍｌ／ロ
ーラーボトルに再懸濁させた。すべてのウイルスＤＮＡを、約４℃で保存した。The DNA in the sample was pelleted by spinning at 8000 rpm for 20 minutes in a HB-4 rotor at 5 ° C. The supernatant was carefully removed and the DNA pellet was washed once with 25 ml of 80% ethanol. DNA
The pellet was briefly dried by vacuum (2-3 minutes) and TE buffer (1
Resuspended in 2 ml / roller bottle of infected cells (0 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA). All viral DNA was stored at about 4 ° C.

【００７３】 （分子生物学技術） 細菌およびＤＮＡの操作のための技術（制限エンドヌクレアーゼでの消化、ゲ
ル電気泳動、ゲルからのＤＮＡの抽出、連結、キナーゼでのリン酸化、ホスファ
ターゼでの処理、細菌培養物の増殖、ＤＮＡでの細菌の形質転換および他の分子
生物学的方法のような手順を含む）は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２））
およびＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））によって記載される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を使用して、種々のＤＮＡの操作に簡便な制限部位を導入した。使用される
手順は、Ｉｎｎｉｓら（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：
Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，
８４−９１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，ＣＡ（１９９０））によって記載される。Techniques for the manipulation of bacteria and DNA (digestion with restriction endonucleases, gel electrophoresis, extraction of DNA from gels, ligation, phosphorylation with kinases, treatment with phosphatases, (Including procedures such as growth of bacterial cultures, transformation of bacteria with DNA and other molecular biological methods) are described in Maniatis et al.
is et al., Molecular Cloning: A Laboratory M
anual, Cold Spring Harbor, N.W. Y. (1982))
And Sambrook et al. (J. Sambrook et al., Molecular C
loning: A Laboratory Manual 2nd edition, Cold S
spring Harbor Press, Cold Spring Harbor
r, N. Y. (1989)). Polymerase chain reaction (PC
Using R), convenient restriction sites were introduced for manipulation of various DNAs. The procedure used is described in Innis et al. (MA Innis et al., PCR Protocols:
A Guide To Methods And Applications,
84-91, Academic Press, Inc. , San Diego
, CA (1990)).

【００７４】 一般に、増幅されたフラグメントは、２０００塩基対未満の大きさであり、そ
して増幅されたフラグメントの臨界領域を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
記載のない限り、これらの技術を、重要ではない変化を伴って使用した。In general, the amplified fragment was less than 2000 base pairs in size, and the critical region of the amplified fragment was confirmed by DNA sequencing.
Unless otherwise noted, these techniques were used with minor changes.

【００７５】 （ＤＮＡ配列決定） ＤＮＡ配列決定を、製造業者の使用説明書に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７
３Ａ（ＸＬアップグレードで）で行った。サブクローンを作製し、配列決定を容
易にした。内部プライマーをＡＢＩ ３９２ ＤＮＡ合成機で合成するか、また
は市販のものから入手した（Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｉｎｃ．，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）。より大きいＤＮＡ配列を構
築し、連続して重複するプライマーを利用した。大きいゲノムサブクローンの接
合点を横切る配列を、鋳型として全長のゲノムクローンを使用して、直接決定し
た。配列のアセンブリ、操作および比較をＤＮＡｓｔａｒプログラムで行った。
ＧｅｎＢａｎｋとの比較を、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムを使用して行った
（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ
，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ
，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ ＭｉｌｌｅｒおよびＤａｖｉｄ Ｊ．Ｌ
ｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬ
ＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ
ｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。DNA Sequencing DNA sequencing was performed according to the manufacturer's instructions for Applied Bio.
systems Automated Sequencer Model 37
3A (with XL upgrade). Subclones were generated to facilitate sequencing. Internal primers were synthesized on an ABI 392 DNA synthesizer or obtained from commercial sources (Genosys Biotechnologies).
, Inc. , The Woodlands, TX). Larger DNA sequences were constructed and utilized successively overlapping primers. The sequence across the junction of the large genomic subclone was determined directly using the full-length genomic clone as a template. Sequence assembly, manipulation and comparison were performed with the DNAstar program.
Comparisons with GenBank were performed using the NCBI BLAST program (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden).
, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang
, Zheng Zhang, Webb Miller and David J. H .; L
ipman (1997), “Gapped BLAST and PSI-BL
AST: a new generation of protein data
base search programs ", Nucleic Acids
Res. 25: 3389-3402).

【００７６】 （Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＢＡＶ−１ゲノムの構築） 組換えＢＡＶ−１ゲノムを、Ｃ．Ｃｈａｒｔｉｅｒら（１９９６）Ｊ．ｏｆ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：８０５−４８１０の方法に従って、相同組換えによっ
て構築する。(Construction of Recombinant BAV-1 Genome in E. coli) Chartier et al. (1996) J. Am. of
Constructed by homologous recombination according to the method of Virology 70: 805-4810.

【００７７】 ＢＡＶ−１ゲノムの左端および右端の各々に約１０００塩基対を含む容易に操
作された小さなプラスミドを構築した。このベクターとＢＡＶ−１ゲノムＤＮＡ
との間の相同組換えは、完全なＢＡＶ−１ゲノムを含むプラスミド（アデノウイ
ルス骨格ベクター）を生じる。このＢＡＶ−１ゲノムプラスミドが使用されて、
プラスミドの直線化、および所望のＢＡＶ−１挿入部位由来のＤＮＡに隣接する
外来ＤＮＡを含むように操作された相同ＤＮＡでの組換えによる組換えゲノムを
生成し得る。アデノウイルス骨格ベクターを直線化するために、まれな切断酵素
を、隣接するＢＡＶ−１配列に類似する領域内に配置しなければならないことに
注意しなければならない。A small, easily manipulated plasmid containing about 1000 base pairs at each of the left and right ends of the BAV-1 genome was constructed. This vector and BAV-1 genomic DNA
Homologous recombination between results in a plasmid (adenovirus backbone vector) containing the complete BAV-1 genome. This BAV-1 genomic plasmid was used to
A recombinant genome can be generated by linearizing the plasmid and recombining with homologous DNA that has been engineered to include foreign DNA flanking the DNA from the desired BAV-1 insertion site. It must be noted that in order to linearize the adenovirus backbone vector, the rare cleavage enzyme must be placed in a region similar to the adjacent BAV-1 sequence.

【００７８】 本発明者らは、このような酵素の制限部位をマッピングした。ＰｖｕＩは、２
つの位置（一方は、ＢａｍＨ１ Ｄフラグメントにあり、そして一方は、Ｂａｍ
Ｈ１ Ｃフラグメントにある）でＢＡＶ−１ゲノムを切断する（図１を参照のこ
と）。アデノウイルス骨格ベクターは、プラスミドの抗生物質耐性遺伝子の内部
に第三のＰｖｕＩ部位を含む。ＢａｍＨ１ Ｃフラグメントの内部のＰｖｕＩ部
位は、Ｅ３およびＥ４領域の両方の内部の遺伝子挿入部位に適切である。従って
、アデノウイルス骨格ベクターの部分ＰｖｕＩ消化は、ＢａｍＨ１ Ｃフラグメ
ントのＰｖｕＩ部位で直線化された分子の亜集団を生じる。これらの分子は、相
同ＤＮＡと再結合して、生存可能なプラスミドを生成し得る。他の２つの部位で
直線化された分子は、再結合して、生存可能なプラスミドを生成することができ
ない。We have mapped the restriction sites of such an enzyme. PvuI is 2
Two positions (one on the BamH1 D fragment and one on the BamH1 D fragment).
Cleave the BAV-1 genome (located in the H1 C fragment) (see FIG. 1). Adenovirus backbone vectors contain a third PvuI site within the plasmid's antibiotic resistance gene. The PvuI site inside the BamH1 C fragment is suitable for gene insertion sites inside both the E3 and E4 regions. Thus, partial PvuI digestion of the adenovirus backbone vector results in a subpopulation of molecules linearized at the PvuI site of the BamH1 C fragment. These molecules can recombine with the homologous DNA to produce a viable plasmid. Molecules linearized at the other two sites cannot recombine to produce a viable plasmid.

【００７９】 細菌細胞Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＪ５１８３ ｒｅｃＢＣ ｓｂｃＢＣ（Ｄ．Ｈａｎ
ａｈａｎ（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０）の高い
コンピテンス（ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）は、有効な組換えを達成するために所望
である。代表的には、適切なＢＡＶ挿入配列（相同ＤＮＡ）に隣接する外来ＤＮ
Ａを含む１０ナノグラムの制限フラグメントを、総量１０μｌ中の１ナノグラム
の直線化アデノウイルス骨格ベクターと混合する。５０マイクロリットルのコン
ピテントＢＪ５１８３細胞を添加した。氷上で１５分、３７℃で５分、そして氷
上で１５分後、２００μｌのＬＢを添加し、そして細胞を、３７℃で１時間後、
ＬＢおよび８０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む寒天上にプレーティングした
。Bacterial cells E. coli BJ5183 recBC sbcBC (D. Han
ahan (1983) J. Am. Mol. Biol. 166: 557-580) is desired to achieve efficient recombination. Typically, a foreign DN adjacent to the appropriate BAV insertion sequence (homologous DNA)
10 nanograms of the restriction fragment containing A is mixed with 1 nanogram of the linearized adenovirus backbone vector in a total volume of 10 μl. 50 microliters of competent BJ5183 cells were added. After 15 minutes on ice, 5 minutes at 37 ° C., and 15 minutes on ice, 200 μl of LB was added and the cells were removed after 1 hour at 37 ° C.
Plated on agar containing LB and 80 μg / ml carbenicillin.

【００８０】 少量培養（カルベニシリン耐性コロニーをスクリーニングするため）および引
き続く大量培養（大量のプラスミドＤＮＡを単離するため）を増殖させるために
、低温（２５〜２７℃）は必須である。Ｃａｒｂ^Rコロニーを初めに、２日間２
５〜２７℃にて４〜５ｍｌの培養物中で増殖した。少量ＤＮＡを煮沸方法（Ｊ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ
．Ｙ．（１９８９））を用いて調製し、そしてＤＮＡ制限分析により分析した。
ベクターＤＮＡ鎖状体からＤＮＡを精製するために、正しいクローン由来のＤＮ
ＡをＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞へ再形質転換した
。ＤＮＡ制限分析による細菌コロニーの分析を繰り返した。正しいコロニーから
グリセロールストックを調製し、そして−７０℃にて貯蔵した。大量のプラスミ
ドＤＮＡを、２５０ｍｌの培養物から、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ
（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）またはスケールアップした煮沸方法を使用して調製
し、そしてこれをグリセロールストックと共に播種し、そして１日間３７℃にて
増殖した。Low temperatures (25-27 ° C.) are essential for growing small cultures (to screen for carbenicillin resistant colonies) and subsequent large cultures (to isolate large amounts of plasmid DNA). Starting with Carb ^R colony, 2 days for 2 days
Grow in 4-5 ml culture at 5-27 ° C. A small amount of DNA is boiled (J.
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora.
tory Manual Second Edition, Cold Spri
ng Harbor Press, Cold Spring Harbor, N
. Y. (1989)) and analyzed by DNA restriction analysis.
To purify the DNA from the vector DNA strand, DN from the correct clone was used.
A was retransformed into DH10B (Life Technologies) cells. The analysis of bacterial colonies by DNA restriction analysis was repeated. Glycerol stocks were prepared from the correct colonies and stored at -70 ° C. Large amounts of plasmid DNA were removed from 250 ml cultures using the Qiagen Plasmid Kit.
(Qiagen Inc.) or a scaled-up boiling method, which was inoculated with a glycerol stock and grown at 37 ° C. for 1 day.

【００８１】 （ＢＡＶ−１ ＤＮＡのトランスフェクション） 約１．５×１０⁵細胞／ｍｌ（ＭＤＢＫ）をトランスフェクションの２４時間
前に６ｃｍプレートにプレーティングし、この時間により、これらの細胞を、５
０〜７０％のコンフルエンシー集密度に達しさせた。トランスフェクションのた
めに、製造業者（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法を使
用した。トランスフェクション混合物を、製造業者の指示に従って、２００μｌ
の血清を含まない培地へ数（４〜１５）μｇのＢＡＶ−１ウイルスＤＮＡまたは
直鎖状ゲノムプラスミドＤＮＡ、および５０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ Ｒｅ
ａｇｅｎｔを添加することにより調製した。(Transfection of BAV-1 DNA) Approximately 1.5 × 10 ⁵ cells / ml (MDBK) were plated on a 6 cm plate 24 hours before transfection, and by this time, these cells were reduced to ⁵ × 10 ⁵ cells / ml.
A confluency confluency of 0-70% was reached. For transfection, the manufacturer (Lipofectin, Life Technologies)
, Rockville, MD), using the Lipofectin method. Transfection mixture was added to 200 μl according to the manufacturer's instructions.
(4-15) μg of BAV-1 viral DNA or linear genomic plasmid DNA and 50 μl of Lipofectin Re
It was prepared by adding an agent.

【００８２】 １５〜３０分間室温でのインキュベーション後、このトランスフェクション混
合物を細胞に添加した。３７℃で４〜６時間後、トランスフェクション混合物を
含む培地を取り出し、そして５ｍｌの成長培地を添加した。細胞変性効果が７〜
１０日以内に現れた。トランスフェクトされたウイルスストックを、培養物中の
細胞をかき取ることにより収集し、そして−７０℃にて貯蔵した。After incubation for 15-30 minutes at room temperature, the transfection mixture was added to the cells. After 4-6 hours at 37 ° C., the medium containing the transfection mixture was removed and 5 ml of growth medium was added. Cytopathic effect 7 ~
Appeared within 10 days. Transfected virus stocks were collected by scraping cells in culture and stored at -70 ° C.

【００８３】 （組換え構築物のプラーク精製） ６ｃｍまたは１０ｃｍのプレート中の単層のＭＤＢＫ細胞をトランスフェクシ
ョンストックで感染させ、栄養性のアガロース培地で覆い、そして３７℃にて５
〜１０日間インキュベートした。一旦プラークが生じると、単一かつ十分に単離
されたプラークをＭＤＢＫ細胞上へ取り上げた。８０〜９０％の細胞変性効果が
達成された５〜１０日後、感染した細胞（Ｐ１ストック）を収集し、そして−７
０℃にて貯蔵した。この手順を、Ｐ１ストックを用いて１回以上繰り返した。Plaque Purification of Recombinant Constructs Monolayer MDBK cells in 6 cm or 10 cm plates were infected with the transfection stock, covered with nutrient agarose medium, and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
Incubated for ~ 10 days. Once plaques formed, single and well isolated plaques were picked up on MDBK cells. Five to ten days after an 80-90% cytopathic effect was achieved, the infected cells (P1 stock) were collected and -7
Stored at 0 ° C. This procedure was repeated one or more times with the P1 stock.

【００８４】 （ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）糖タンパク質５３（ｇ５３）遺伝
子のクローニング） ウシウイルス性下痢（ウイルス）ｇ５３遺伝子を、本質的には、ヒトインフル
エンザのＨＡ遺伝子についてＫａｔｚらによって記載される（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４：１８０８−１８１１（１９９０））ようなＰＣ
Ｒクローニング手順によってクローニングした。ＭＤＢＫ細胞中で増殖したＢＤ
ＶウイルスのＳｉｎｇｅｒ株から調製されたウイルスＲＮＡを、初めに、標的遺
伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してｃＤＮＡへ転換した。
次いで、このｃＤＮＡを標的領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニン
グ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔ
ｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８４−９１，Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０））のための
鋳型として使用した。このＰＣＲプライマーを、ＢＡＶ−１中での発現のための
適切なシグナルを含むベクター中への増幅されたコード領域のクローン化を可能
にする制限部位を取り込むように設計した。このコード領域のためには、１対の
オリゴヌクレオチドが必要であって、ＢＶＤＶ Ｓｉｎｇｅｒ株由来のｇ５３遺
伝子コード領域（アミノ酸１〜３９４）（Ｍ．Ｓ．Ｃｏｌｌｅｔｔら、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５，２００−２０８（１９８８））を、ｃ
ＤＮＡプライミングのために以下のプライマー：５’−ＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣ
ＡＴＣＣＡＴＡＣＴＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＴＣＴＧＴＴＣ−３’（配
列番号１）を使用してクローン化し、そしてＰＣＲのために５’−ＣＡＴＡＧＡ
ＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡ−３’（配列番号２）と
組み合わせた。Cloning of Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) Glycoprotein 53 (g53) Gene The bovine viral diarrhea (virus) g53 gene is essentially described by Katz et al. For the HA gene of human influenza. (Journal
of Virology 64: 1808-1811 (1990))
Cloned by the R cloning procedure. BD grown in MDBK cells
Viral RNA prepared from the Singer strain of the V virus was first converted to cDNA using oligonucleotide primers specific for the target gene.
This cDNA was then used for polymerase chain reaction (PCR) cloning of the target region (MA Innis et al., PCR Protocols: A Guidet).
o Methods and Applications, 84-91, Aca
demic Press, Inc. Used as a template for San Diego (1990). The PCR primers were designed to incorporate restriction sites that allowed cloning of the amplified coding region into a vector containing the appropriate signals for expression in BAV-1. This coding region requires a pair of oligonucleotides, the g53 gene coding region (amino acids 1-394) from the BVDV Singer strain (MS Collett et al., Jour).
nal of Virology 65, 200-208 (1988))
The following primers for DNA priming: 5'-CTTGGATCCTC
ATCCATACTGAGTCCCTGAGGCCTTCTGTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and cloned using PCR for 5′-CATAGA
Combined with TCTTGTGGTGCTGTTCCGACTTCGCA-3 '(SEQ ID NO: 2).

【００８５】 （ウェスタンブロットの手順） 溶解産物およびタンパク質標準物質のサンプルを、Ｌａｅｍｎｌｉ（Ｎａｔｕ
ｒｅ ２２７，６８０−６８５（１９７０））の手順に従ってポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動した。ゲル電気泳動後、タンパク質をＳａｍｂｒｏｏｋら、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ａａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９
８９）に従って転写し、そして処理した。一次抗体は、Ｔｒｉｓ−塩化ナトリウ
ムおよびアジ化ナトリウム（ＴＳＡ：水１リットルあたり、６．６１ｇ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、０．９７ｇ Ｔｒｉｓ−塩基、９．０ｇ ＮａＣｌおよび２．０ｇ
アジ化ナトリウム）中の５％脱脂粉乳で１：１００に希釈したマウスモノクロー
ナル抗体（Ｄｕｂｏｖｉ，Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｉｔｈａｃ
ａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ製のＭａｂ ６．１２．２）であった。二次抗体は、ＴＳ
Ａで１：１０００に希釈したヤギ抗マウスアルカリンホスファターゼ結合体であ
った。Western Blot Procedures Samples of lysates and protein standards were collected from Laemnli (Natu
re227, 680-685 (1970)) and electrophoresed on a polyacrylamide gel. After gel electrophoresis, the proteins were transferred to Sambrook et al.
Molecular Cloning A Laboratory Manua
l Second Edition, Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, New York (19
89) and processed. Primary antibodies were Tris-sodium chloride and sodium azide (TSA: 6.61 g Tri / liter of water).
s-HCl, 0.97 g Tris-base, 9.0 g NaCl and 2.0 g
Mouse monoclonal antibody (Dubovi, Cornell University, Ithac) diluted 1: 100 with 5% nonfat dry milk in sodium azide).
a, Mab 6.12.2 from New York). The secondary antibody is TS
Goat anti-mouse alkaline phosphatase conjugate diluted 1: 1000 in A.

【００８６】 （プラスミド９９０−１１） プラスミド９９０−１１は、ＢＡＶ−１ゲノムの左の末端および右の末端を含
む。これらの配列を、各々ＥｃｏＲ１ＡおよびＢａｍＨ１Ｆフラグメントについ
て決定された配列に基づくプライマーを使用して、標準のＰＣＲ方法（Ｍ．Ａ．
Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８４−９１頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））によりクロー
ニングした。プライマー（１）５’−３’ＧＧＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＴＣＡ
ＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＧＧＡＡＣＡＣ（配列番号５）および（２）５’−３
’ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＧＣＡＡＴＴＣＡＣＧＣＣＧＧ
ＧＴＡＴ（配列番号６）を、ＢＡＬ−１の左の末端のＰＣＲに使用した。この領
域内の３つの反復エレメントが同じ５’末端配列（すなわち、プライマー１）を
共有するので、１７６０ｂｐ、１３４０ｂｐおよび９２０ｂｐのＢＡＶ−１ Ｄ
ＮＡフラグメントを、ＰＣＲにより増幅した。９２０ｂｐのＤＮＡフラグメント
を、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，
ＣＡ）へクローン化した。プライマー（１）および（３）５’−ＧＧＣＡＡＴＧ
ＡＧＡＴＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣＧＣＧ−３’（配
列番号７）を、ＢＡＬ−１の右の末端のＰＣＲに使用し、７４０ｂｐおよび１１
６０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅し、そして１１６０ｂｐのフラグメントＤＮＡをｐ
ＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）
へクローン化した。次いでプラスミド９９０−１１を、ＢＡＬ−１末端フラグメ
ントをクローン化することによりプラスミドＰｏｌｙＩＩのポリリンカーへ構築
した（Ｒ．Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｌ．ＶｉｌｏｔｔｅおよびＡ．Ｊ．Ｃｌａｒｋ，Ｇ
ｅｎｅ，５７：１９３−２０１，１９９７）。末端フラグメントを、それらの内
部接合部で唯一のＢｇｌＩＩを含む単一のＰａｃＩフラグメントとしてクローン
化した。ＢａｍＨ１部位およびＥｃｏＲ１部位のみを、ポリリンカーから保持し
た。Plasmid 990-11 Plasmid 990-11 contains the left and right ends of the BAV-1 genome. These sequences were constructed using standard PCR methods (MA.) Using primers based on the sequences determined for the EcoR1A and BamH1F fragments, respectively.
Innis et al., PCR Protocols: A Guide To Meth.
ods And Applications, pp. 84-91, Academic.
Press, Inc. (San Diego, CA (1990)). Primer (1) 5'-3'GGCCTTAATTAACATCA
TCAATAATATACCGGAACAC (SEQ ID NO: 5) and (2) 5'-3
'GGAAGATTCTTGAGCATGCAGAGCAATTCACGCCGG
GTAT (SEQ ID NO: 6) was used for PCR on the left end of BAL-1. Since the three repetitive elements in this region share the same 5 ′ terminal sequence (ie, primer 1), 1760 bp, 1340 bp and 920 bp BAV-1 D
The NA fragment was amplified by PCR. The 920 bp DNA fragment was converted to a PCR-Blunt vector (Invitrogen, Carlsbad,
CA). Primers (1) and (3) 5'-GGCAATG
AGATCTTTTGGGATGACAAGCTGAGCTACGCCG-3 ′ (SEQ ID NO: 7) was used for PCR on the right end of BAL-1 and 740 bp and 11
Amplify the 60 bp PCR product and convert the 1160 bp fragment DNA into p
CR-Blunt vector (Invitrogen, Carlsbad, CA)
Cloned into Plasmid 990-11 was then constructed into the polylinker of plasmid PolyII by cloning the BAL-1 terminal fragment (R. Lathe, JL Vilotte and AJ Clark, G.
ene, 57: 193-201, 1997). The terminal fragments were cloned as a single Pad fragment containing only BglII at their internal junction. Only the BamH1 and EcoR1 sites were retained from the polylinker.

【００８７】 （プラスミド９９０−５０）（アデノウイルス骨格ベクター） プラスミド９９０−５０を、上記（Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＢＡＶ−１ゲ
ノムの構築）の方法に従って構築した。簡潔には、ＢｇｌＩＩで直鎖状化したプ
ラスミド９９０−１１およびＢＡＶ−１ゲノムＤＮＡの同時形質転換は、ＢＡＶ
−１ゲノム全体を含む安定な環状プラスミドを再生した。このプラスミドにおい
て、ＰａｃＩ部位は、挿入したＢＡＶ−１ゲノム配列に隣接する。ＰａｃＩがＢ
ＡＶ−１ゲノムＤＮＡに存在しない場合、この酵素を用いる消化は、プラスミド
９９０−５０からの全長ＢＡＶ−１ゲノムの正確な切除を可能にする。(Plasmid 990-50) (Adenovirus Backbone Vector) Plasmid 990-50 was constructed according to the method described above (Construction of recombinant BAV-1 genome in E. coli). Briefly, co-transformation of plasmid 990-11 and BAV-1 genomic DNA linearized with BglII
A stable circular plasmid containing the entire -1 genome was regenerated. In this plasmid, the PacI site is adjacent to the inserted BAV-1 genomic sequence. PacI is B
If not present in the AV-1 genomic DNA, digestion with this enzyme allows for accurate excision of the full length BAV-1 genome from plasmid 990-50.

【００８８】 （プラスミド９９６−８０Ｄ） プラスミド９９６−８０Ｄは、ＥｃｏＲ１「Ｇ」および「Ｈ」フラグメントが
欠失され、そして合成ＳｍａＩ部位で置換されているＢＡＶ−１ゲノムの右の末
端の約５９４５塩基対を含むＤＮＡを含む。このプラスミドを、ＢＡＶ−１ Ｅ
４領域の部分を欠失する目的で構築した。このプラスミドはまた、外来ＤＮＡを
組み換えＢＡＶ−１ゲノムに挿入するために用いられ得る。このプラスミドは、
外来ＤＮＡが挿入され得る唯一のＳｍａＩ制限酵素部位を含む。このプラスミド
を、示される合成ＤＮＡ配列と以下の供給源由来の制限フラグメントを結合する
ことにより、標準の組換えＤＮＡ技術（上記の分子生物学的技術を参照のこと）
を使用して構築し得る。このプラスミドベクターは、約２７７４塩基対（ｐＳＰ
６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＨ
ｉｎｄＩＩＩからＰｖｕＩＩ制限フラグメント）に由来する。合成リンカー配列
５’−ＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＴＣＧＡＣＡ
ＡＧＣＴＴＣＣＣ−３’（配列番号８）は、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＰｖｕＩＩ部位に連結される。
フラグメント１は、ＢＡＶ−１ ＢａｍＨ１「Ｃ」フラグメントの約１６９３塩
基対（ＰｓｔＩ〜ＥｃｏＲ１のサブフラグメント）（配列番号３由来の２８２４
１〜２９９３３位）である。この合成リンカー配列５’−ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴ
ＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡ−３’（配列番号９）は、リンカー配列の
両末端でＥｃｏＲ１部位を保持するフラグメント１に連結される。フラグメント
２は、ＢＡＶ−１ ＢａｍＨ１「Ｃ」フラグメントの約４８塩基対（ＥｃｏＲ１
〜ＢａｍＨ１制限サブフラグメント）（配列番号３由来の３１７３２〜３１７７
９位）である。フラグメント３は、約２４０６塩基対のＢＡＶ−１ ＢａｍＨ１
「Ｆ」フラグメント（配列番号３由来の３１７８０〜３４１８５位）である。こ
の合成リンカー配列５’−ＧＡＣＴＣＴＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＴＴＴＡＡＡ
ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＣＴ−３’（配列番号１０）は、フラグメ
ント３とＰｓｐ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏ
ｎ，ＷＩ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に連結される。ＢＡＶ−１配列は、隣接
する合成リンカー配列に位置するＮｏｔＩ制限部位を介してこのプラスミドから
切り出され得ることに注意のこと。Plasmid 996-80D Plasmid 996-80D contains approximately 5945 bases at the right end of the BAV-1 genome in which the EcoR1 “G” and “H” fragments have been deleted and replaced with a synthetic SmaI site. Includes DNA containing pairs. This plasmid is called BAV-1 E
It was constructed to delete four regions. This plasmid can also be used to insert foreign DNA into the recombinant BAV-1 genome. This plasmid is
It contains a unique SmaI restriction enzyme site into which foreign DNA can be inserted. This plasmid is combined with the indicated synthetic DNA sequences and restriction fragments from the following sources by standard recombinant DNA techniques (see molecular biology techniques above).
Can be constructed using This plasmid vector contains about 2774 base pairs (pSP
H of 64 (Promega Corporation, Madison, WI)
indIII to PvuII restriction fragment). Synthetic linker sequence 5'-CTGTAGATCTGCGGCCGCGTTTAAACGTCGACA
AGCTTCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 8) was synthesized using pSP64 (Promega Co.
rporation, Madison, WI).
Fragment 1 is approximately 1693 base pairs (a subfragment of PstI to EcoR1) of the BAV-1 BamH1 "C" fragment (2824 from SEQ ID NO: 3).
1-29933). This synthetic linker sequence 5'-AATTCGAGCT
CGCCCGGGCGAGCTCGA-3 ′ (SEQ ID NO: 9) is ligated to Fragment 1 carrying an EcoR1 site at both ends of the linker sequence. Fragment 2 is about 48 base pairs (EcoR1) of the BAV-1 BamH1 "C" fragment.
~ BamH1 restriction subfragment) (31732-3177 from SEQ ID NO: 3)
9th). Fragment 3 contains approximately 2406 base pairs of BAV-1 BamH1
"F" fragment (positions 31780-34185 from SEQ ID NO: 3). This synthetic linker sequence 5'-GACTCTAGGGGCGGGGAGTTTAAA
CGCGGCCGCAGATCTAGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 10) is composed of fragment 3 and Psp64 (Promega Corporation, Madiso).
n, WI). Note that the BAV-1 sequence can be excised from this plasmid via a NotI restriction site located on the adjacent synthetic linker sequence.

【００８９】 （プラスミド１００４−７３．１６．１４） プラスミド１００４−７３．１６．１４は、ＥｃｏＲＩ「Ｇ」および「Ｈ」フ
ラグメントが欠失されそして合成ＳｍａＩ部位（５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴ
ＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣ−３’）（配列番号１１）によっ
て置換される組換えＢＡＶ−１ゲノムを含む。このプラスミドを使用して、Ｅ４
領域において欠失および遺伝子挿入を有する組換えウシアデノウイルスベクター
を作製し得る。このプラスミドは、上記の方法（Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＢ
ＡＶ−１ゲノムの構築）に従って構築され得る。この相同ＤＮＡは、プラスミド
９９６−８０ＤのＮｏｔＩ挿入物に由来し、そしてアデノウイルス骨格ベクター
プラスミド９９５−５０は、ＰｖｕＩでの部分消化により直鎖状化される。Plasmid 1004-73.16.14 Plasmid 1004-73.16.14 has the EcoRI "G" and "H" fragments deleted and a synthetic SmaI site (5'-GAATTCGAGCT).
CGCCCGGGCGAGCTCGAATTC-3 ') (SEQ ID NO: 11), including the recombinant BAV-1 genome. Using this plasmid, E4
Recombinant bovine adenovirus vectors having deletions and gene insertions in the regions can be made. This plasmid was prepared as described above (recombinant B in E. coli).
Construction of the AV-1 genome). This homologous DNA is derived from the NotI insert of plasmid 996-80D, and the adenovirus backbone vector plasmid 999-50 is linearized by partial digestion with PvuI.

【００９０】 （プラスミド１００４−０７．１６） プラスミド９９６−８０Ｄの唯一のＳｍａＩ部位へヒトサイトメガロウイルス
最初期プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の制御
下になるように操作したＢＶＤＶｇ５３遺伝子を挿入することにより、プラスミ
ド１００４−０７．１６を構築した。このＢＶＤＶｇ５３遺伝子を、上記の方法
（ウシウイルス性下痢ウイルスｇ５３遺伝子のクローニング）に従って単離した
。Plasmid 1004-07.16 Inserting the BVDVg53 gene engineered to be under the control of the human cytomegalovirus immediate early promoter (Invitrogen, Carlsbad, CA) into the unique SmaI site of plasmid 996-80D. Was used to construct plasmid 1004-07.16. This BVDVg53 gene was isolated according to the method described above (cloning of bovine viral diarrhea virus g53 gene).

【００９１】 （プラスミド１００４−４０） プラスミド１００４−４０は、ＥｃｏＲＩ ＧおよびＨフラグメントが欠失さ
れている組換えＢＡＶ−１ゲノムを含む。ＨＣＭＶ最初期プロモーターの制御下
のウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）糖タンパク質５３（ｇ５３）（アミ
ノ酸１〜３９４）に関する遺伝子を、欠失領域に挿入した。このプラスミドは、
上記の方法（Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＢＡＶ−１ゲノムの構築）に従って構
築され得る。この相同ＤＮＡは、プラスミド１００４−１７．１６のＮｏｔＩ挿
入物に由来し、そしてアデノウイルス骨格ベクタープラスミド９９０−５０は、
ＰｖｕＩでの部分消化により直鎖状化される。Plasmid 1004-40 Plasmid 1004-40 contains a recombinant BAV-1 genome in which the EcoRI G and H fragments have been deleted. The gene for bovine viral diarrhea virus (BVDV) glycoprotein 53 (g53) (amino acids 1-394) under the control of the HCMV immediate early promoter was inserted into the deleted region. This plasmid is
It can be constructed according to the method described above (construction of a recombinant BAV-1 genome in E. coli). This homologous DNA was derived from the NotI insert of plasmid 1004-17.16 and the adenovirus backbone vector plasmid 990-50 was
It is linearized by partial digestion with PvuI.

【００９２】 （プラスミド１０１８−１４．２） プラスミド１０１８−１４．２は、ＳａｌＩおよびＢａｍＨ１部位に隣接する
この配列の特定の領域（配列番号３由来の２５６６４〜２６８４０位）を欠失し
た、ＢＡＶ−１のＥ３領域に隣接するＤＮＡを含む。このプラスミドを、ＢＡＶ
−１ Ｅ３領域の対応する部分を欠失する目的で構築した。このプラスミドはま
た、組換えＢＡＶ−１ゲノムへ外来ＤＮＡを挿入するために使用され得る。この
プラスミドは、外来ＤＮＡが挿入され得る唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を
含む。このプラスミドを、示される合成ＤＮＡ配列と以下の供給源由来の制限フ
ラグメントを結合することにより、標準の組換えＤＮＡ技術（上記の分子生物学
的技術を参照のこと）を使用して構築し得る。このプラスミドベクターは、約２
７７４塩基対（ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＷＩ）のＨｉｎｄＩＩＩからＰｖｕＩＩ制限フラグメント）に由来す
る。合成リンカー配列５’−ＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡ
ＡＡＣＧ−３’（配列番号１２）は、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＰｖｕＩＩ部位に連結される。フラグ
メント１は、ＢＡＶ−１ ＢａｍＨ１「Ｂ」フラグメントの約２６６５塩基対（
ＳａｌＩ〜ＳａｌＩのサブフラグメント）（配列番号３由来の２２９９９〜２５
６６３位）である。フラグメント１は、その接合部におけるＳａｌＩを保持する
上流の合成配列に連結される。フラグメント１は、唯一のＡｖａＩ部位（配列番
号３由来の２５３１７から２５３２２位）を有する。フラグメント１は、この唯
一のＡｖａＩ部位がプラスミドベクターよりもフラグメント２により近く（４０
６塩基対）なるように配置される。この合成リンカー配列５’−ＴＣＧＡＣＡＡ
ＧＣＴＴＣＣＣ−３’（配列番号１３）は、接合部においてＳａｌＩ部位を再び
保持するフラグメント１の第二の末端に連結される。フラグメント２は、ＢＡＶ
−１ ＢａｍＨ１ Ｃフラグメントの約４２２３塩基対のＢａｍＨ１〜Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ制限サブフラグメント（配列番号３由来の２６８５１〜３１０７３位）で
ある。両方のフラグメントの末端がＴ４ポリメラーゼで処理されることにより平
滑末端化されたことに注意のこと。合成リンカー配列５’−ＣＣＣＧＧＧＡＧＴ
ＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＣＴ−３’（配列番号１４）は
、フラグメント２とｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に連結される。ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位が残っていないことに注意のこと。ＢＡＶ−１配列は、隣接する合成リン
カー配列に位置するＮｏｔＩ制限部位を介してこのプラスミドから切り出され得
る。Plasmid 1018-14.2 Plasmid 1018-14.2 lacks a specific region of this sequence flanking the SalI and BamH1 sites (positions 25664-26840 from SEQ ID NO: 3), BAV- 1 including the DNA adjacent to the E3 region. This plasmid is called BAV
-1 Constructed for the purpose of deleting the corresponding part of the E3 region. This plasmid can also be used to insert foreign DNA into the recombinant BAV-1 genome. This plasmid contains a unique HindIII restriction site into which foreign DNA can be inserted. This plasmid can be constructed using standard recombinant DNA techniques (see molecular biology techniques above) by combining the indicated synthetic DNA sequences with restriction fragments from the following sources. . This plasmid vector contains about 2
774 base pairs (pSP64 (Promega Corporation, Mad)
Ison, WI) from the HindIII to PvuII restriction fragment). Synthetic linker sequence 5'-CTGTAGATCTGCGGCCGCGTTTTA
AACG-3 ′ (SEQ ID NO: 12) was synthesized using pSP64 (Promega Corpo).
ration, Madison, WI). Fragment 1 is about 2665 base pairs of the BAV-1 BamH1 "B" fragment (
SalI-SalI subfragment) (22999-25 from SEQ ID NO: 3)
663). Fragment 1 is ligated to an upstream synthetic sequence that carries SalI at its junction. Fragment 1 has a unique AvaI site (positions 25317 to 25322 from SEQ ID NO: 3). Fragment 1 shows that this unique AvaI site is closer to fragment 2 than plasmid vector (40
(6 base pairs). This synthetic linker sequence 5'-TCGACAA
GCTTCCC-3 '(SEQ ID NO: 13) is ligated to the second end of fragment 1 which again retains a SalI site at the junction. Fragment 2 is BAV
-1 BamH1 C fragment about 4223 base pairs of BamH1 to Hind
III restriction subfragment (positions 26851-10773 from SEQ ID NO: 3). Note that the ends of both fragments were made blunt by treatment with T4 polymerase. Synthetic linker sequence 5'-CCCGGGAGGT
TTAAACGCGGCCGCAGATCTAGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 14) was prepared by combining fragment 2 with pSP64 (Promega Corporation, M
adison, WI). HindII
Note that no I site remains. The BAV-1 sequence can be excised from this plasmid via a NotI restriction site located on the adjacent synthetic linker sequence.

【００９３】 （プラスミド１０１８−７５） プラスミド１０１８−７５は、ＢａｍＨ１「Ｂ」フラグメントの特定の領域（
配列番号３由来の２５６６４〜２６８４０位）が欠失された組換えＢＡＶ−１ゲ
ノムを含む。このプラスミドは、Ｅ３部位における欠失および遺伝子挿入を有す
る組換えウシアデノウイルスベクターを作製するために使用され得る。このプラ
スミドは、上記の方法（Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＢＡＶ−１ゲノムの構築）
に従って構築され得る。この相同ＤＮＡは、プラスミド１０１８−１４．２のＮ
ｏｔＩ挿入物に由来し、そしてアデノウイルス骨格ベクタープラスミド９９０−
５０は、ＰｖｕＩでの部分消化により直鎖状化される。Plasmid 1018-75 Plasmid 1018-75 contains specific regions of the BamH1 "B" fragment (
(Positions 25664 to 26840 from SEQ ID NO: 3) are deleted. This plasmid can be used to create a recombinant bovine adenovirus vector with a deletion and gene insertion at the E3 site. This plasmid was prepared according to the method described above (construction of recombinant BAV-1 genome in E. coli).
Can be constructed according to This homologous DNA is derived from the plasmid N
from the otI insert and the adenovirus backbone vector plasmid 990-
50 is linearized by partial digestion with PvuI.

【００９４】 （プラスミド１０１８−２３Ｃ１５） プラスミド１０１８−１４．２の唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位へヒトサイトメガ
ロウイルス最初期プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ
Ａ）の制御下になるように操作したＢＶＤＶｇ５３遺伝子を挿入することにより
、プラスミド１０１８−２３Ｃ１５を構築した。このＢＶＤＶｇ５３遺伝子を、
上記の方法（ウシウイルス性下痢ウイルスｇ５３遺伝子のクローニング）に従っ
て単離した。Plasmid 1018-23C15 The human Cytomegalovirus immediate early promoter (Invitrogen, Carlsbad, C
Plasmid 1018-23C15 was constructed by inserting the BVDVg53 gene manipulated under the control of A). This BVDVg53 gene is
It was isolated according to the method described above (cloning of bovine viral diarrhea virus g53 gene).

【００９５】 （プラスミド１０１８−４２） プラスミド１０１８−４２は、ＢａｍＨ１「Ｂ」フラグメントの特定の領域（
配列番号３由来の２５６６４〜２６８４０位）が欠失された組換えＢＡＶ−１ゲ
ノムを含む。ＨＣＭＶ最初期プロモーターの制御下のウシウイルス性下痢ウイル
ス（ＢＶＤＶ）糖タンパク質５３（ｇ５３）（アミノ酸１〜３９４）に関する遺
伝子を、欠失領域に挿入した。このプラスミドは、上記の方法（Ｅ．ｃｏｌｉに
おける組換えＢＡＶ−１ゲノムの構築）に従って構築され得る。この相同ＤＮＡ
は、プラスミド１０１８−２３Ｃ５のＮｏｔＩ挿入物に由来し、そしてアデノウ
イルス骨格ベクタープラスミド９９０−５０は、ＰｖｕＩでの部分消化により直
鎖状化される。Plasmid 1018-42 Plasmid 1018-42 contains a specific region of the BamH1 “B” fragment (
(Positions 25664 to 26840 from SEQ ID NO: 3) are deleted. The gene for bovine viral diarrhea virus (BVDV) glycoprotein 53 (g53) (amino acids 1-394) under the control of the HCMV immediate early promoter was inserted into the deleted region. This plasmid can be constructed according to the method described above (construction of a recombinant BAV-1 genome in E. coli). This homologous DNA
Is derived from the NotI insert of plasmid 1018-23C5, and the adenovirus backbone vector plasmid 990-50 is linearized by partial digestion with PvuI.

【００９６】 （プラスミド１０１８−４５） プラスミド１０１８−４５は、ＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１部位に隣接するこ
の配列の特定の領域（配列番号３由来の２５７６５〜２６８５０位）が欠失され
た、ＢＡＶ−１のＥ３領域に隣接するＤＮＡを含む。このプラスミドを、ＢＡＶ
−１ Ｅ３領域の対応する部分を欠失する目的で構築した。このプラスミドはま
た、組換えＢＡＶ−１ゲノムへ外来ＤＮＡを挿入するために使用され得る。この
プラスミドは、外来ＤＮＡが挿入され得る唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を
含む。このプラスミドを、示される合成ＤＮＡ配列と以下の供給源由来の制限フ
ラグメントを結合することにより、標準の組換えＤＮＡ技術（上記の分子生物学
的技術を参照のこと）を使用して構築し得る。このプラスミドベクターは、約２
７７４塩基対（ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＷＩ）のＨｉｎｄＩＩＩからＰｖｕＩＩ制限フラグメント）に由来す
る。合成リンカー配列５’−ＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡ
ＡＡＣＧ−３’（配列番号１２）は、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＰｖｕＩＩ部位に連結される。フラグ
メント１は、ＢＡＶ−１ ＢａｍＨ１「Ｂ」フラグメントの約１５８２塩基対（
ＳａｌＩ〜ＥｃｏＲ１のサブフラグメント）（配列番号３由来の２４１８３〜２
５７４６位）である。フラグメント１は、上流の合成配列に連結される。このフ
ラグメントは、Ｔ４ポリメラーゼ処理で平滑末端化されたので、ＳａｃＩ部位も
ＥｃｏＲ１部位も両方とも保持されない。フラグメント１は、唯一のＡｖａＩ部
位（配列番号３由来の２５３１７から２５３２２位）を有する。フラグメント１
は、この唯一のＡｖａＩ部位がプラスミドベクターよりもフラグメント２により
近く（４０６塩基対）なるように配置される。この合成リンカー配列５’−ＣＡ
ＡＧＣＴＴＣＣＣ−３’（配列番号１７）は、接合部においてＳａｌＩ部位を再
び保持するフラグメント１の第二の末端に連結される。フラグメント２は、ＢＡ
Ｖ−１ ＢａｍＨ１ Ｃフラグメントの約４２２３塩基対のＢａｍＨ１〜Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ制限サブフラグメント（配列番号３由来の２６８５１〜３１０７３位）
である。両方のフラグメントの末端がＴ４ポリメラーゼで処理されることにより
平滑末端化されたことに注意のこと。合成リンカー配列５’−ＣＣＣＧＧＧＡＧ
ＴＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＣＴ−３’（配列番号１４）
は、フラグメント２とｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に連結される。ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位が残っていないことに注意のこと。ＢＡＶ−１配列は、隣接する合成リ
ンカー配列に位置するＮｏｔＩ制限部位を介してこのプラスミドから切り出され
得る。Plasmid 1018-45 Plasmid 1018-45 is a fragment of E3 of BAV-1 in which a particular region of this sequence adjacent to the EcoR1 and BamH1 sites (positions 25765-26850 from SEQ ID NO: 3) has been deleted. Includes DNA adjacent to the region. This plasmid is called BAV
-1 Constructed for the purpose of deleting the corresponding part of the E3 region. This plasmid can also be used to insert foreign DNA into the recombinant BAV-1 genome. This plasmid contains a unique HindIII restriction site into which foreign DNA can be inserted. This plasmid can be constructed using standard recombinant DNA techniques (see molecular biology techniques above) by combining the indicated synthetic DNA sequences with restriction fragments from the following sources. . This plasmid vector contains about 2
774 base pairs (pSP64 (Promega Corporation, Mad)
Ison, WI) from the HindIII to PvuII restriction fragment). Synthetic linker sequence 5'-CTGTAGATCTGCGGCCGCGTTTTA
AACG-3 ′ (SEQ ID NO: 12) was synthesized using pSP64 (Promega Corpo).
ration, Madison, WI). Fragment 1 contains about 1582 base pairs of the BAV-1 BamH1 "B" fragment (
SalI to EcoR1 subfragment) (24183-2 from SEQ ID NO: 3)
5746). Fragment 1 is ligated to an upstream synthetic sequence. Since this fragment was blunt-ended by T4 polymerase treatment, neither the SacI site nor the EcoR1 site are retained. Fragment 1 has a unique AvaI site (positions 25317 to 25322 from SEQ ID NO: 3). Fragment 1
Is positioned such that this unique AvaI site is closer to fragment 2 (406 base pairs) than the plasmid vector. This synthetic linker sequence 5'-CA
AGCTTCCC-3 '(SEQ ID NO: 17) is ligated to the second end of fragment 1 which again retains a SalI site at the junction. Fragment 2 contains BA
Approximately 4223 base pairs of BamH1 to Hin of the V-1 BamH1 C fragment
dIII restriction subfragment (positions 26851-13073 from SEQ ID NO: 3)
It is. Note that the ends of both fragments were made blunt by treatment with T4 polymerase. Synthetic linker sequence 5'-CCCGGGAG
TTTAAACGGCGCCGCAGATCTAGCT-3 '(SEQ ID NO: 14)
Is fragment 2 and pSP64 (Promega Corporation,
(Madison, WI). HindI
Note that no II sites remain. The BAV-1 sequence can be excised from this plasmid via a NotI restriction site located on the adjacent synthetic linker sequence.

【００９７】 （プラスミド１０２８−０３） プラスミド１０２８−０３を、ＢａｍＨ１「Ｂ」フラグメントの特定の領域（
配列番号３由来の２５７６５〜２６８５０位）が欠失された組換えＢＡＶ−１ゲ
ノムを含む。このプラスミドは、Ｅ３部位における欠失および遺伝子挿入を有す
る組換えウシアデノウイルスベクターを作製するために使用し得る。このプラス
ミドは、上記の方法（Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＢＡＶ−１ゲノムの構築）に
従って構築され得る。この相同ＤＮＡは、プラスミド１０１８−４５のＮｏｔＩ
挿入物に由来し、そしてアデノウイルス骨格ベクタープラスミド９９０−５０は
、ＰｖｕＩでの部分消化により直鎖状化される。Plasmid 1028-03 Plasmid 1028-03 was constructed using specific regions of the BamH1 "B" fragment (
(Positions 25765-26850 from SEQ ID NO: 3). This plasmid can be used to generate a recombinant bovine adenovirus vector with a deletion and gene insertion at the E3 site. This plasmid can be constructed according to the method described above (construction of a recombinant BAV-1 genome in E. coli). This homologous DNA is the NotI of plasmid 1018-45.
The adenovirus backbone vector plasmid 990-50, derived from the insert, is linearized by partial digestion with PvuI.

【００９８】 （プラスミド１０２８−７７） プラスミド１０１８−４５の唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位へヒトサイトメガロウ
イルス最初期プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）
の制御下になるように操作したＢＶＤＶｇ５３遺伝子を挿入することにより、プ
ラスミド１０２８−７７を構築した。このＢＶＤＶｇ５３遺伝子を、上記の方法
（ウシウイルス性下痢ウイルスｇ５３遺伝子のクローニング）に従って単離した
。Plasmid 1028-77 A human Cytomegalovirus immediate early promoter (Invitrogen, Carlsbad, CA) into the unique HindIII site of plasmid 1018-45.
Plasmid 1028-77 was constructed by inserting the BVDVg53 gene manipulated under the control of This BVDVg53 gene was isolated according to the method described above (cloning of bovine viral diarrhea virus g53 gene).

【００９９】 （プラスミド１０３８−１６） プラスミド１０３８−１６は、ＢａｍＨ１「Ｂ」フラグメントの特定の領域（
配列番号３由来の２５７６５〜２６８５０位）が欠失された組換えＢＡＶ−１ゲ
ノムを含む。ＨＣＭＶ最初期プロモーターの制御下のウシウイルス性下痢ウイル
ス（ＢＶＤＶ）糖タンパク質５３（ｇ５３）（アミノ酸１〜３９４）に関する遺
伝子を、欠失領域に挿入した。このプラスミドは、上記の方法（Ｅ．ｃｏｌｉに
おける組換えＢＡＶ−１ゲノムの構築）に従って構築され得る。この相同ＤＮＡ
は、プラスミド１０２８−７７のＮｏｔＩ挿入物に由来し、そしてアデノウイル
ス骨格ベクタープラスミド９９０−５０は、ＰｖｕＩでの部分消化により直鎖状
化される。Plasmid 1038-16 Plasmid 1038-16 contains a specific region of the BamH1 "B" fragment (
(Positions 25765-26850 from SEQ ID NO: 3). The gene for bovine viral diarrhea virus (BVDV) glycoprotein 53 (g53) (amino acids 1-394) under the control of the HCMV immediate early promoter was inserted into the deleted region. This plasmid can be constructed according to the method described above (construction of a recombinant BAV-1 genome in E. coli). This homologous DNA
Is derived from the NotI insert of plasmid 1028-77, and the adenovirus backbone vector plasmid 990-50 is linearized by partial digestion with PvuI.

【０１００】 （プラスミド１０５４−９３） プラスミド１０５４−９３は、ＢＡＶ−１のＥ４領域由来のＤＮＡを含む。配
列番号３からの３３６１４位〜３３７２５位に対応する配列が、欠失されかつ合
成ＰｓｔＩ部位で置換されている。このプラスミドは、ＢＡＶ−１ Ｅ４領域の
一部を欠失させる目的で構築された。このプラスミドはまた、外来ＤＮＡを組換
えＢＡＶ−１ゲノムに挿入するために使用され得る。このプラスミドは、外来Ｄ
ＮＡを挿入し得る唯一のＰｓｔＩ制限酵素部位を含む。このプラスミドは、標準
的組換えＤＮＡ技術（上記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓを参照のこと）を使用して、以下の供給源由来の制限フラグメ
ントを示される合成ＤＮＡ配列と結合することによって、構築され得る。ＢＡＶ
−１ ＤＮＡ由来のフラグメントが、各フラグメントについて与えられる位置に
より示される方向で連結されていることに留意すること。プラスミドベクターは
、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ
Ｉ）の、約２７７４塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ〜ＰｖｕＩＩ制限フラグメント由来
である。合成リンカー配列５’−ＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴ
ＴＡＡＡＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣ−３’[配列番号８]が、ｐＳＰ６４
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＰｖｕ
ＩＩ部位に連結されている。フラグメント１は、配列番号３からの２８２４１位
〜３１７７９位のＢＡＶ−１ ＢａｍＨＩ「Ｃ」フラグメントの、約３５３８塩
基対であるＰｓｔＩ〜ＢａｍＨＩサブフラグメントである。フラグメント１が、
合成リンカー配列[配列番号８]の３’末端に連結されている。フラグメント２は
、ＢＡＶ−１ゲノムに由来する配列（配列番号３からの３１７８０位〜３３６１
３位）を含む、約１８３２塩基対のＰＣＲフラグメントである。フラグメント２
が、連結部のＢａｍＨＩを保持するようにフラグメント１に連結されている。合
成リンカー配列５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’[配列番号４]がフラグメント２に連結
されている。フラグメント３は、ＢＡＶ−１ゲノム由来の配列（配列番号３から
の３３７２５位〜３４１８５位）を含む、約４６０塩基対のＰＣＲフラグメント
である。フラグメント３が、合成リンカー配列５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’の３’
末端に連結されている。合成リンカー配列５’−ＧＡＣＴＣＴＡＧＧＧＧＣＧＧ
ＧＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＣＴ−３’[配列番
号１０]が、フラグメント３と、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に連結されてい
る。このＢＡＶ−１配列は、隣接する合成リンカー配列中に位置するＮｏｔＩ制
限部位を介して、このプラスミドから切り出され得ることに留意すること。(Plasmid 1054-93) Plasmid 1054-93 contains DNA derived from the E4 region of BAV-1. The sequence corresponding to positions 33614 to 33725 from SEQ ID NO: 3 has been deleted and replaced with a synthetic PstI site. This plasmid was constructed for the purpose of deleting a part of the BAV-1 E4 region. This plasmid can also be used to insert foreign DNA into the recombinant BAV-1 genome. This plasmid contains the foreign D
Contains a unique PstI restriction enzyme site into which NA can be inserted. This plasmid was prepared using standard recombinant DNA techniques (Molecular Biological Tetra, described above).
chniques), by combining restriction fragments from the following sources with the indicated synthetic DNA sequences. BAV
-1 Note that fragments from DNA are ligated in the direction indicated by the position given for each fragment. The plasmid vector is pSP64 (Promega Corporation, Madison, W.).
I) is derived from an approximately 2774 base pair HindIII to PvuII restriction fragment. Synthetic linker sequence 5'-CTGTAGATCTGCGGCCGCGTTT
TAAACGTCGACAAGCTTCCC-3 ′ [SEQ ID NO: 8] is pSP64
(Promega Corporation, Madison, WI) Pvu
It is linked to the II site. Fragment 1 is a PstI-BamHI subfragment that is approximately 3538 base pairs of the BAV-1 BamHI “C” fragment from positions 28241 to 31779 from SEQ ID NO: 3. Fragment 1 is
It is linked to the 3 'end of the synthetic linker sequence [SEQ ID NO: 8]. Fragment 2 has a sequence derived from the BAV-1 genome (positions 31780 to 3361 from SEQ ID NO: 3).
3)), a PCR fragment of about 1832 base pairs. Fragment 2
Is ligated to fragment 1 so as to retain the BamHI at the junction. The synthetic linker sequence 5′-CTGCAG-3 ′ [SEQ ID NO: 4] is ligated to fragment 2. Fragment 3 is an approximately 460 base pair PCR fragment containing sequences from the BAV-1 genome (positions 33725-34185 from SEQ ID NO: 3). Fragment 3 is 3 ′ of the synthetic linker sequence 5′-CTGCAG-3 ′
It is connected to the end. Synthetic linker sequence 5'-GACTCTAGGGGCCG
GGAGTTTAAACGCGGCCGCAGATCTAGCT-3 ′ [SEQ ID NO: 10] is obtained by combining fragment 3 with pSP64 (Promega Corpora).
, Madison, WI). Note that the BAV-1 sequence can be excised from this plasmid via a NotI restriction site located in the adjacent synthetic linker sequence.

【０１０１】 （プラスミド１０５５−３８） プラスミド１０５５−３８は、ＢＡＶ−１のＥ４領域由来のＤＮＡを含む。ｎ
ＯＲＦ１３（表１を参照のこと）をコードする配列が、欠失されかつ合成Ｐｓｔ
Ｉ部位で置換されている。このプラスミドは、ＢＡＶ−１ Ｅ４領域の一部を欠
失させる目的で構築された。このプラスミドはまた、外来ＤＮＡを組換えＢＡＶ
−１ゲノムに挿入するために使用され得る。このプラスミドは、外来ＤＮＡを挿
入し得る唯一のＰｓｔＩ制限酵素部位を含む。このプラスミドは、標準的組換え
ＤＮＡ技術（上記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓを参照のこと）を使用して、以下の供給源由来のＤＮＡフラグメントを
示される合成ＤＮＡ配列と結合することによって、構築され得る。ＢＡＶ−１
ＤＮＡ由来のフラグメントが、各フラグメントについて与えられる位置により示
される方向で連結されていることに留意すること。プラスミドベクターは、ｐＳ
Ｐ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の
、約２７７４塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ〜ＰｖｕＩＩ制限フラグメント由来である
。合成リンカー配列５’−ＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡＡ
ＡＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣ−３’[配列番号８]が、ｐＳＰ６４（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＰｖｕＩＩ部
位に連結されている。フラグメント１は、ＢＡＶ−１ゲノム由来の配列（配列番
号３からの２８２４０位〜２９５２２位）を含む、約１２８２塩基対のＰＣＲフ
ラグメントである。フラグメント１が、上記の合成リンカー配列[配列番号８]の
３’末端に連結されている。合成リンカー配列５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’[配列
番号４]がフラグメント１に連結されている。フラグメント２は、ＢＡＶ−１ゲ
ノムに由来する配列（配列番号３からの３０４０７位〜３１７７９位）を含む、
約１３７２塩基対のＰＣＲフラグメントである。フラグメント２が、合成リンカ
ー配列５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’[配列番号４]の３’末端に連結されている。フ
ラグメント３は、約２４０６塩基対のＢＡＶ−１のＢａｍＨＩ「Ｆ」フラグメン
ト（配列番号３からの３１７７９位〜３４１８５位）である。フラグメント３が
、フラグメント２の３’末端に連結されている。合成リンカー配列５’−ＧＡＣ
ＴＣＴＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴ
ＡＧＣＴ−３’[配列番号１０]が、フラグメント３と、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位
との間に連結されている。このＢＡＶ−１配列は、隣接する合成リンカー配列中
に位置するＮｏｔＩ制限部位を介して、このプラスミドから切り出され得ること
に留意すること。(Plasmid 1055-38) Plasmid 1055-38 contains DNA derived from the E4 region of BAV-1. n
The sequence encoding ORF13 (see Table 1) has been deleted and the synthetic Pst
It is substituted at the I site. This plasmid was constructed for the purpose of deleting a part of the BAV-1 E4 region. This plasmid can also be used to convert foreign DNA into recombinant BAV.
-1 can be used to insert into the genome. This plasmid contains a unique PstI restriction enzyme site into which foreign DNA can be inserted. This plasmid is prepared using standard recombinant DNA techniques (Molecular Biological Technology, supra).
ques) using the DNA fragments from the following sources by combining them with the indicated synthetic DNA sequences. BAV-1
Note that the fragments from the DNA are linked in the direction indicated by the position given for each fragment. The plasmid vector is pS
It is derived from an approximately 2774 base pair HindIII to PvuII restriction fragment of P64 (Promega Corporation, Madison, Wis.). Synthetic linker sequence 5'-CTGTAGATCTGCGGCCGCGTTTAA
ACGTCGACAAGCTTCCC-3 ′ [SEQ ID NO: 8] was replaced with pSP64 (Pr
omega Corporation, Madison, WI). Fragment 1 is a PCR fragment of about 1282 base pairs containing a sequence from the BAV-1 genome (positions 28240 to 29522 from SEQ ID NO: 3). Fragment 1 is ligated to the 3 'end of the synthetic linker sequence [SEQ ID NO: 8] described above. The synthetic linker sequence 5′-CTGCAG-3 ′ [SEQ ID NO: 4] is ligated to fragment 1. Fragment 2 comprises a sequence derived from the BAV-1 genome (positions 30407 to 31779 from SEQ ID NO: 3)
It is a PCR fragment of about 1372 base pairs. Fragment 2 is ligated to the 3 ′ end of the synthetic linker sequence 5′-CTGCAG-3 ′ [SEQ ID NO: 4]. Fragment 3 is a BamHI "F" fragment of BAV-1 of about 2406 base pairs (positions 31779-34185 from SEQ ID NO: 3). Fragment 3 is ligated to the 3 'end of fragment 2. Synthetic linker sequence 5'-GAC
TCTAGGGGCGGGGAGTTTAAACGCGGCCGCAGACTCT
AGCT-3 ′ [SEQ ID NO: 10] is obtained by combining fragment 3 with pSP64 (Prome
ga Corporation, Madison, WI). Note that the BAV-1 sequence can be excised from this plasmid via a NotI restriction site located in the adjacent synthetic linker sequence.

【０１０２】 （プラスミド１０５５−５２） プラスミド１０５５−５２は、Ｅ４領域の一部（配列番号３からの２９５２２
〜３０４０７位）が欠失されかつ合成ＰｓｔＩ部位（５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’
）[配列番号４]で置換されている、組換えＢＡＶ−１ゲノムを含む。このプラス
ミドは、Ｅ４領域での遺伝子挿入および／または欠失を有する、組換えウシアデ
ノウイルスベクターを作製するために使用され得る。このプラスミドは、上記の
方法（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１
Ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ）に従って構築され得る。相同性ＤＮＡ
は、プラスミド１０５５−３８のＮｏｔＩインサートに由来し、そしてアデノウ
イルス骨格ベクタープラスミド９９０−５０が、ＰｖｕＩでの部分消化により線
状化されている。(Plasmid 1055-52) Plasmid 1055-52 is a fragment of the E4 region (29522 from SEQ ID NO: 3).
-30407) was deleted and a synthetic PstI site (5′-CTGCAG-3 ′) was deleted.
) Includes the recombinant BAV-1 genome, replaced with [SEQ ID NO: 4]. This plasmid can be used to create a recombinant bovine adenovirus vector with a gene insertion and / or deletion in the E4 region. This plasmid was prepared according to the method described above (Construction of Recombinant BAV-1).
Genomes in E. coli). Homologous DNA
Is derived from the NotI insert of plasmid 1055-38, and the adenovirus backbone vector plasmid 990-50 has been linearized by partial digestion with PvuI.

【０１０３】 （プラスミド１０５５−４７） プラスミド１０５５−４７は、プラスミド１０５５−３８の唯一のＰｓｔ１部
位にＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子を挿入することによって、構築された。ＢＶＤＶコ
ード領域が、それがゲノムの右端に位置するＥ４領域プロモーターにより転写さ
れるように、逆相補方向に挿入されている。ＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子は、上記の
方法（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ
ｖｉｒｕｓ ｇ５３ ｇｅｎｅ）に従って単離された。Plasmid 1055-47 Plasmid 1055-47 was constructed by inserting the BVDV g53 gene into the unique Pst1 site of plasmid 1055-38. The BVDV coding region has been inserted in the reverse complement orientation such that it is transcribed by the E4 region promoter located at the right end of the genome. The BVDV g53 gene can be obtained by the method described above (Cloning of Bovine Viral Diarrhea).
virus g53 gene).

【０１０４】 （プラスミド１０５５−５６） プラスミド１０５５−５６は、[配列番号３]の２９５２２位〜３０４０７位の
ＢＡＶ−１の配列が欠失されている、組換えＢＡＶ−１ゲノムを含む。ＢＶＤＶ
ｇ５３（アミノ酸１〜３９４）についての遺伝子が、この欠失領域に挿入され
た。このプラスミドは、上記の方法（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ Ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ）に従っ
て構築され得る。相同性ＤＮＡは、プラスミド１０５５−４７のＮｏｔＩインサ
ートに由来し、そしてアデノウイルス骨格ベクタープラスミド９９０−５０が、
ＰｖｕＩでの部分消化により線状化されている。(Plasmid 1055-56) Plasmid 1055-56 contains a recombinant BAV-1 genome in which the sequence of BAV-1 at positions 29522 to 30407 of [SEQ ID NO: 3] has been deleted. BVDV
The gene for g53 (amino acids 1-394) was inserted into this deleted region. This plasmid is prepared according to the method described above (Construction of Rec.).
ombinant BAV-1 Genomes in E. coli). The homologous DNA was derived from the NotI insert of plasmid 1055-47, and the adenovirus backbone vector plasmid 990-50 was
It has been linearized by partial digestion with PvuI.

【０１０５】 （プラスミド１０５５−９３） プラスミド１０５５−９３は、ＢＡＶ−１のＥ４領域由来のＤＮＡを含む。ｎ
ＯＲＦ１３（表１を参照のこと）をコードする配列が、欠失されかつ合成Ｐｓｔ
Ｉ部位で置換されている。このプラスミドは、ＢＡＶ−１ Ｅ４領域の一部を欠
失させる目的で構築された。このプラスミドはまた、外来ＤＮＡを組換えＢＡＶ
−１ゲノムに挿入するために使用され得る。このプラスミドは、外来ＤＮＡを挿
入し得る唯一のＰｓｔＩ制限酵素部位を含む。このプラスミドは、標準的組換え
ＤＮＡ技術（上記のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓを参照のこと）を使用して、以下の供給源由来のＤＮＡフラグメントを
示される合成ＤＮＡ配列と結合することによって、構築され得る。ＢＡＶ−１
ＤＮＡ由来のフラグメントが各フラグメントについて与えられる位置により示さ
れる方向で連結されていることに留意すること。プラスミドベクターは、ｐＳＰ
６４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の約
２７７４塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ〜ＰｖｕＩＩ制限フラグメント由来である。合
成リンカー配列５’−ＣＴＧＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣ
ＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣ−３’[配列番号８]が、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＰｖｕＩＩ部位に
連結されている。フラグメント１は、ＢＡＶ−１ゲノム由来の配列（配列番号３
からの２８２４０位〜２９５２２位）を含む、約１２８２塩基対のＰＣＲフラグ
メントである。フラグメント１が、上記の合成リンカー配列［配列番号８]の３
’末端に連結されている。合成リンカー配列５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’[配列番
号４]がフラグメント１に連結されている。フラグメント２は、ＢＡＶ−１ゲノ
ムに由来する配列（配列番号３からの３０４０３位〜３１７７９位）を含む、約
１３７２塩基対のＰＣＲフラグメントである。フラグメント２が、合成リンカー
配列５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’[配列番号４]の３’末端に連結されている。フラ
グメント３は、約２４０６塩基対のＢＡＶ−１のＢａｍＨＩ「Ｆ」フラグメント
（配列番号３からの３１７７９位〜３４１８５位）である。フラグメント３が、
フラグメント２の３’末端に連結されている。合成リンカー配列５’−ＧＡＣＴ
ＣＴＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＡ
ＧＣＴ−３’[配列番号１０]が、フラグメント３と、ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位と
の間に連結されている。このＢＡＶ−１配列は、隣接する合成リンカー配列中に
位置するＮｏｔＩ制限部位を介して、このプラスミドから切り出され得ることに
留意すること。(Plasmid 1055-93) Plasmid 1055-93 contains DNA derived from the E4 region of BAV-1. n
The sequence encoding ORF13 (see Table 1) has been deleted and the synthetic Pst
It is substituted at the I site. This plasmid was constructed for the purpose of deleting a part of the BAV-1 E4 region. This plasmid can also be used to convert foreign DNA into recombinant BAV.
-1 can be used to insert into the genome. This plasmid contains a unique PstI restriction enzyme site into which foreign DNA can be inserted. This plasmid is prepared using standard recombinant DNA techniques (Molecular Biological Technology, supra).
ques) using the DNA fragments from the following sources by combining them with the indicated synthetic DNA sequences. BAV-1
Note that the fragments from DNA are ligated in the direction indicated by the position given for each fragment. The plasmid vector is pSP
64 (Promega Corporation, Madison, WI) from an approximately 2774 base pair HindIII to PvuII restriction fragment. Synthetic linker sequence 5'-CTGTAGATCTGCGGCCGCGTTTAAAC
GTCGACAAGCTTCCC-3 ′ [SEQ ID NO: 8] was replaced with pSP64 (Prom
ega Corporation, Madison, WI). Fragment 1 has a sequence from the BAV-1 genome (SEQ ID NO: 3).
From position 28240 to position 29522) from about 1282 base pairs. Fragment 1 is 3 in the above synthetic linker sequence [SEQ ID NO: 8].
'It is linked to the end. The synthetic linker sequence 5′-CTGCAG-3 ′ [SEQ ID NO: 4] is ligated to fragment 1. Fragment 2 is an approximately 1372 base pair PCR fragment containing sequences from the BAV-1 genome (positions 30403 to 31779 from SEQ ID NO: 3). Fragment 2 is ligated to the 3 ′ end of the synthetic linker sequence 5′-CTGCAG-3 ′ [SEQ ID NO: 4]. Fragment 3 is a BamHI "F" fragment of BAV-1 of about 2406 base pairs (positions 31779-34185 from SEQ ID NO: 3). Fragment 3 is
It is ligated to the 3 'end of fragment 2. Synthetic linker sequence 5'-GACT
CTAGGGGGGGGGAGTTTAAACGCGGCCGCAGATCTA
GCT-3 ′ [SEQ ID NO: 10] is obtained by combining fragment 3 with pSP64 (Promega).
a Corporation, Madison, WI). Note that the BAV-1 sequence can be excised from this plasmid via a NotI restriction site located in the adjacent synthetic linker sequence.

【０１０６】 （プラスミド１０６４−２６） プラスミド１０６４−２６は、Ｅ４領域の一部（配列番号３からの３３６１３
位〜３３７２５位）が欠失されかつ合成ＰｓｔＩ部位（５’−ＣＴＧＣＡＧ−３
’）[配列番号４]で置換されている、組換えＢＡＶ−１ゲノムを含む。このプラ
スミドは、上記の方法（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ＢＡＶ−１ Ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ）に従って構築され得
る。相同性ＤＮＡは、プラスミド１０５４−９３のＮｏｔＩインサートに由来し
、そしてアデノウイルス骨格ベクタープラスミド９９０−５０が、ＰｖｕＩでの
部分消化により線状化されている。Plasmid 1064-26 is a fragment of the E4 region (33613 from SEQ ID NO: 3).
Positions-33725) were deleted and a synthetic PstI site (5'-CTGCAG-3
') Includes recombinant BAV-1 genome replaced with [SEQ ID NO: 4]. This plasmid was prepared according to the method described above (Construction of Recombina).
nt BAV-1 Genomes in E. coli). Homologous DNA is derived from the NotI insert of plasmid 1054-93, and the adenovirus backbone vector plasmid 990-50 has been linearized by partial digestion with PvuI.

【０１０７】 （プラスミド１０６６−２９） プラスミド１０６６−２９は、プラスミド１０５５−９３の唯一のＰｓｔＩ部
位にＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子を挿入することにより構築された。このＢＶＤＶコ
ード領域は、それがゲノムの右端に位置するＥ４領域プロモーターにより転写さ
れるように、逆相補方向で挿入された。ＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子は、上記の方法
（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉ
ｒｕｓ ｇ５３ ｇｅｎｅ）に従って単離された。Plasmid 1066-29 Plasmid 1066-29 was constructed by inserting the BVDV g53 gene into the unique PstI site of plasmid 1055-93. This BVDV coding region was inserted in the reverse complement orientation so that it was transcribed by the E4 region promoter located at the right end of the genome. The BVDV g53 gene can be obtained by the method described above (Cloning of Bovine Viral Diarrhea vii).
rus g53 gene).

【０１０８】 （プラスミド１０６６−４４） プラスミド１０６６−４４は、Ｅ４領域の一部（配列番号３からの２９５２３
位〜３０４０３位）が欠失されかつ合成ＰｓｔＩ部位（５’−ＣＴＧＣＡＧ−３
’）[配列番号４]で置換されている、組換えＢＡＶ−１ゲノムを含む。このプラ
スミドは、Ｅ４領域で遺伝子挿入および／または欠失を有する、組換えウシアデ
ノウイルスベクターを作製するために使用され得る。このプラスミドは、上記の
方法（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１
Ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ）に従って構築され得る。相同性ＤＮＡ
は、プラスミド１０５５−９３のＮｏｔＩインサートに由来し、そしてアデノウ
イルス骨格ベクタープラスミド９９０−５０が、ＰｖｕＩでの部分消化により線
状化されている。Plasmid 1066-44 is a fragment of the E4 region (29523 from SEQ ID NO: 3).
Positions 30403) were deleted and a synthetic PstI site (5′-CTGCAG-3) was deleted.
') Includes recombinant BAV-1 genome replaced with [SEQ ID NO: 4]. This plasmid can be used to create a recombinant bovine adenovirus vector that has a gene insertion and / or deletion in the E4 region. This plasmid was prepared according to the method described above (Construction of Recombinant BAV-1).
Genomes in E. coli). Homologous DNA
Is derived from the NotI insert of plasmid 1055-93, and the adenovirus backbone vector plasmid 990-50 has been linearized by partial digestion with PvuI.

【０１０９】 （プラスミド１０６６−５１） プラスミド１０６６−５１は、[配列番号３]の３０４０３位〜２９５２３位の
ＢＡＶ−１の配列が欠失されている、組換えＢＡＶ−１ゲノムを含む。ＢＶＤＶ
ｇ５３（アミノ酸１〜３９４）についての遺伝子が、この欠失領域に挿入され
た。このプラスミドは、上記の方法（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ Ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ）に従っ
て構築され得る。相同性ＤＮＡは、プラスミド１０６６−２９のＮｏｔＩインサ
ートに由来し、そしてアデノウイルス骨格ベクタープラスミド９９０−５０が、
ＰｖｕＩでの部分消化により線状化されている。(Plasmid 1066-51) Plasmid 1066-51 contains a recombinant BAV-1 genome in which the sequence of BAV-1 at positions 30403 to 29523 of [SEQ ID NO: 3] has been deleted. BVDV
The gene for g53 (amino acids 1-394) was inserted into this deleted region. This plasmid is prepared according to the method described above (Construction of Rec.).
ombinant BAV-1 Genomes in E. coli). The homologous DNA was derived from the NotI insert of plasmid 1066-29 and the adenovirus backbone vector plasmid 990-50 was
It has been linearized by partial digestion with PvuI.

【０１１０】 （実施例） （実施例１：ＢＡＶ−１の配列） 慣例により、本発明者らは、ＥｃｏＲ１ Ａフラグメントを含む領域を、ＢＡ
Ｖ−１ゲノムの左端と呼ぶ。以前に公開された制限地図（Ｍａｒｉａ Ｂｅｎｋ
ｏおよびＢ．Ｈａｒｒａｃｈ、１９９０ Ａｃｔａ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ
Ｈｕｎｇａｒｉｃａ ３８：２８１〜２８４）を補足するために、ＢＡＶ−１ゲ
ノム中の他の制限酵素部位を規定した（ＰｕｖＩ、ＳｍａＩ）。完全ゲノムを、
いくつかの大きな制限フラグメントとしてクローン化した。これらは、ＢａｍＨ
Ｉ「Ｂ」、「Ｃ」、「Ｄ」、「Ｆ」、ＥｃｏＲ１「Ａ」、「Ｅ」、およびＰｖｕ
Ｉ「Ｂ」を含んだ。このゲノムはまた、上記（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ Ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ
）のように、その全体としてクローン化した。これらのクローンおよび１２６個
の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを、上記の方法（ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ）に従って使用して、ＢＡＶ−１ゲノム全体についての重複配列を決定
した。EXAMPLES Example 1: Sequence of BAV-1 By convention, we used the region containing the EcoR1 A fragment
Called the left end of the V-1 genome. Previously published restriction maps (Maria Benk
o and B. Harrach, 1990 Acta Veterinaria
Hungarica 38: 281-284), other restriction sites in the BAV-1 genome were defined (PuvI, SmaI). Complete genome,
It was cloned as several large restriction fragments. These are BamH
I “B”, “C”, “D”, “F”, EcoR1 “A”, “E”, and Pvu
I "B" was included. This genome is also described above (Construction of
Recombinant BAV-1 Genomes in E. coli
) And cloned as a whole. These clones and 126 different oligonucleotide primers were used as described above (DNA Sequence).
sing) was used to determine overlapping sequences for the entire BAV-1 genome.

【０１１１】 この配列（３４，１８５塩基対）は、１１０アミノ酸以上の、メチオニンで開
始するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（もっと小さい入れ子ＯＲＦを
除く）４３個を含む。４３個すべてのＯＲＦを、上記の方法（ＤＮＡ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ）にて記載されたように、現行バージョンのＧｅｎｂａｎｋタンパ
ク質サブセットと比較した。ＢＬＡＳＴ分析に基づいて、２８個のＯＲＦ（ＯＲ
Ｆ１〜２８）が、他の１つ以上のウイルス遺伝子に対して有意な相同性を示した
。１５個のＯＲＦは、現行バージョンのＧｅｎｂａｎｋ中のウイルス遺伝子に対
して、何の有意な相同性も示さなかった（ｎＯＲＦ１〜１５）。表１は、これら
ＯＲＦが、いくつかの異なる種由来のアデノウイルス遺伝子に対して、広範に変
化する相同性を有することを示す。This sequence (34,185 base pairs) contains 43 open reading frames (ORFs) starting at methionine (excluding the smaller nested ORFs) of 110 amino acids or more. All 43 ORFs were prepared as described above (DNA Sequ
The current version of the Genbank protein subset was compared as described in (1). Based on the BLAST analysis, 28 ORFs (OR
F1-28) showed significant homology to one or more other viral genes. The 15 ORFs did not show any significant homology to the viral genes in the current version of Genbank (nORFs 1-15). Table 1 shows that these ORFs have widely varying homology to adenovirus genes from several different species.

【０１１２】 表１ ＢＡＶ−１左端のオープンリーディングフレーム（Ｏｒｆ）Table 1 Open reading frame (Orf) at the left end of BAV-1

【０１１３】[0113]

【表１】 ^*ＲＣ、逆相補体^** 配列番号３での位置^*** ＡｖＡｄ、トリアデノウイルス；ＨｕＡＤ、ヒトアデノウイルス；ＣＡＶ、
イヌアデノウイルス；ＳＡＶ、ブタアデノウイルス；ＯｖＡｄ、ヒツジアデノウ
イルス。[Table 1] ^* RC, reverse complement ^** Position in SEQ ID NO: 3 ^*** AvAd, avian adenovirus; HuAD, human adenovirus; CAV,
Canine adenovirus; SAV, porcine adenovirus; OvAd, sheep adenovirus.

【０１１４】 ＢＡＶ−１のＥ３遺伝子領域およびＥ４遺伝子領域は、ヒトアデノウイルスの
対応領域由来の遺伝子に対する相同性によって規定し得る。Ｅｖａｎｓら（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ２４４：１７３〜１８５）は、ＢＡＶ−１ Ｅ３遺伝子領域が、
２５３６２〜２５３６５位のＴＡＴＡボックス配列および２７２９１〜２７２９
６位のポリアデニル化シグナルと境を接すると規定する。表１からの遺伝子相同
性の分析は、ＢＡＶ−１のＥ４領域が、２９０５９〜２９０６５位のポリアデニ
ル化シグナルおよび３４１７１〜３４１７４位のＴＡＴＡボックス配列と境を接
することを示す。The E3 and E4 gene regions of BAV-1 can be defined by homology to genes from the corresponding regions of human adenovirus. Evans et al. (Vi
role 244: 173-185) indicates that the BAV-1 E3 gene region is
TATA box sequence at positions 25362-25365 and 27291-2729
It is specified that it borders on the polyadenylation signal at position 6. Analysis of gene homology from Table 1 shows that the E4 region of BAV-1 borders the polyadenylation signal at positions 29059-29065 and the TATA box sequence at positions 34171-34174.

【０１１５】 ＢＡＶ−１は、その左端および右端に、完全配列構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉ
ｏｎ）を示す。そのゲノムは、５７８塩基対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を示す
。４１９塩基対の配列が、このゲノムの左端で２回反復している。この反復の１
つの逆方向コピーが、このゲノムの右端に存在する。このゲノムの左端の２つの
４１９塩基対反復の後には、このゲノムの右端の４１９塩基対配列の上流に逆方
向コピーとして出現する、４２４ｂｐの配列が続く。BAV-1 has a complete sequence construct (organizati) at its left and right ends.
on). The genome displays a 578 base pair inverted terminal repeat (ITR). A 419 base pair sequence is repeated twice at the left end of the genome. One of this iteration
Two inverted copies are at the far right of this genome. The two leftmost 419 base pair repeats of the genome are followed by a 424 bp sequence that appears as a reverse copy upstream of the rightmost 419 base pair sequence of the genome.

【０１１６】 ＢＡＶ−１ゲノムの配列は、組換えＢＡＶ−１ウイルスベクターの構築に有用
である。例えば、この情報は、ヒトアデノウイルス系に対する類似によって、遺
伝子挿入部位として使用し得る非必須領域を推測するために使用し得る。この情
報はまた、遺伝子間領域を推測するためにも使用し得、この領域はまた、遺伝子
挿入部位としても使用し得る。The sequence of the BAV-1 genome is useful for the construction of a recombinant BAV-1 viral vector. For example, this information can be used to infer non-essential regions that can be used as gene insertion sites by analogy to the human adenovirus system. This information can also be used to infer an intergenic region, which can also be used as a site for gene insertion.

【０１１７】 （実施例２：組換えＢＡＶ−１ウイルスベクターを構築する方法） 本発明者らは、組換えウシアデノウイルスベクターの作製についての新規な手
順を開発した。この手順は、細菌プラスミドとして構築される組換えウイルスゲ
ノムを利用する（方法−Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ＢＡＶ−１ Ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉを参照のこと）。これ
らの細菌プラスミドに由来するＤＮＡが、適切な細胞にトランスフェクトされる
場合に（方法−Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＶ−１ ＤＮＡを参照の
こと）、組換えアデノウイルスベクターが、作製される。Example 2 Method for Constructing a Recombinant BAV-1 Viral Vector We have developed a novel procedure for the production of a recombinant bovine adenovirus vector. This procedure utilizes a recombinant viral genome that is constructed as a bacterial plasmid (method-Construction of Recombina).
nt BAV-1 Genomes in E. E. coli). When DNA from these bacterial plasmids is transfected into appropriate cells (see Methods-Transfection of BAV-1 DNA), a recombinant adenovirus vector is created.

【０１１８】 この手順を、プラスミド９９０−５０の感染性によって例示する。このプラス
ミドに由来するＤＮＡを、ＭＤＢＫ細胞に上記のようにトランスフェクトした。
独立したトランスフェクションストックから回収した子孫ウイルスを、ＭＤＢＫ
細胞において増殖させ、そして増殖の特徴、ウイルス産生の収率、およびＤＮＡ
制限パターンについて分析した。全ての場合において、プラスミド９９０−５０
誘導アデノウイルス（Ｓ−ＢＡＶ−００２）は、野生型ＢＡＶ−１から識別不能
であった。The procedure is illustrated by the infectivity of plasmid 990-50. DNA from this plasmid was transfected into MDBK cells as described above.
Progeny virus recovered from independent transfection stocks was
Propagation in cells and growth characteristics, yield of virus production, and DNA
The restriction pattern was analyzed. In all cases, plasmid 990-50
Induced adenovirus (S-BAV-002) was indistinguishable from wild-type BAV-1.

【０１１９】 この手順を使用して、有用な外来ＤＮＡ配列を発現するウシアデノウイルスベ
クターを作製し得る。この手順をまた使用して、ウシアデノウイルスベクターか
らゲノム配列を欠失し得る。ウシ下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）糖タンパク質Ｅ２
（ｇ５３）発現カセット、ならびにＢＡＶ−１のＥ４およびＥ３領域をそれぞれ
保有するウシアデノウイルスベクターの産生は、以下に記載される（実施例４〜
６を参照のこと）。Using this procedure, a bovine adenovirus vector expressing a useful foreign DNA sequence can be generated. This procedure can also be used to delete genomic sequences from a bovine adenovirus vector. Bovine diarrhea virus (BVDV) glycoprotein E2
(G53) Expression cassettes and the production of bovine adenovirus vectors carrying the E4 and E3 regions, respectively, of BAV-1 are described below (Examples 4-
6).

【０１２０】 （実施例３：組換えアデノウイルスベクターＳ−ＢＡＶ−００３の調製） Ｓ−ＢＡＶ−００３は、このゲノムのＥ４領域に欠失を有するＢＡＶ−１ウイ
ルスである。この欠失は、ＥｃｏＲＩ ＨおよびＧフラグメントにわたる。この
欠失は、ＯＲＦ ２５〜２７およびｎＯＲＦ １３の全てまたは主要な部分を除
去する。ＳｍａＩ部位を含むポリリンカー配列（ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＣ
ＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣ）［配列番号１５］を、この欠失体に挿
入した。ＳｍａＩは、ＢＡＶ−１ゲノムＤＮＡに存在しないので（図１を参照の
こと）、このポリリンカー配列の導入は、ウイルスを直接操作するために利用さ
れ得る有用な独特のＳｍａＩ部位を作製する。Example 3 Preparation of Recombinant Adenovirus Vector S-BAV-003 S-BAV-003 is a BAV-1 virus having a deletion in the E4 region of this genome. This deletion spans the EcoRI H and G fragments. This deletion removes all or a major portion of ORFs 25-27 and nORF 13. A polylinker sequence containing a SmaI site (GAATTCGAGCTCGC
CCGGGGGAGCTCGAATTC) [SEQ ID NO: 15] was inserted into this deletion. Since SmaI is not present in BAV-1 genomic DNA (see FIG. 1), the introduction of this polylinker sequence creates a useful unique SmaI site that can be utilized to engineer the virus directly.

【０１２１】 Ｓ−ＢＡＶ−００３を、上記の方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
ｓ）に従って、プラスミド１００４−７３．１６．１４から誘導したＤＮＡをト
ランスフェクトすることによって作製した。得られたウイルスを、上記の方法（
Ｐｌａｑｕｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃ
ｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）に従って精製した。独立したトランスフェクションストッ
クから誘導された子孫ウイルスを、ＭＤＢＫ細胞において増幅させ、そしてＢａ
ｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＳｍａＩのＤＮＡ制限パターンについて分析した。
おの分析は、ＥｃｏＲＩ ＧおよびＨフラグメントが欠失されており、そしてＳ
ｍａＩ部位がこのゲノム中に導入されていることを示す。Ｓ−ＢＡＶ−００３も
また増殖すると、野生型ＢＡＶ−１と同様の力価になることが示された。S-BAV-003 was prepared according to the method described above (Method of construct).
Ting Recombinant BAV-1 viral vectors
s) by transfecting DNA derived from plasmid 1004-73.16.14. The obtained virus was subjected to the above method (
Plaque Purification of Recombinant C
onstructs). Progeny virus derived from independent transfection stock was amplified in MDBK cells and
The DNA restriction patterns of mHI, EcoRI, and SmaI were analyzed.
Each analysis showed that the EcoRI G and H fragments were deleted and that S
Indicates that a maI site has been introduced into this genome. S-BAV-003 was also shown to grow to a similar titer as wild-type BAV-1 when expanded.

【０１２２】 （実施例４：組換えアデノウイルスベクターＳ−ＢＡＶ−００４の調製） Ｓ−ＢＡＶ−００４は、このゲノムのＥ４領域に欠失を有するＢＡＶ−１ウイ
ルスである。この欠失は、ＥｃｏＲ１ ＨおよびＧフラグメントにわたる。この
欠失は、ＯＲＦ ２５〜２７およびｎＯＲＦ １３の全てのまたは主要な部分を
除去する。ＨＣＭＶ最初期プロモーターの制御下にあるウシウイルス性下痢症ウ
イルス（ＢＶＤＶ）糖タンパク質５３（ｇ５３）（アミノ酸１〜３９４）につい
ての遺伝子を、この欠失した領域に挿入した。Example 4 Preparation of Recombinant Adenovirus Vector S-BAV-004 S-BAV-004 is a BAV-1 virus having a deletion in the E4 region of this genome. This deletion spans the EcoR1 H and G fragments. This deletion removes all or a major portion of ORFs 25-27 and nORF 13. The gene for bovine viral diarrhea virus (BVDV) glycoprotein 53 (g53) (amino acids 1-394) under the control of the HCMV immediate early promoter was inserted into this deleted region.

【０１２３】 Ｓ−ＢＡＶ−００４を、上記の方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
ｓ）に従って、プラスミド１００４−４０から誘導したＤＮＡをトランスフェク
トすることによって作製した。得られたウイルスを、上記の方法（Ｐｌａｑｕｅ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｓ）に従って精製した。S-BAV-004 was prepared according to the method described above (Method of construct).
Ting Recombinant BAV-1 viral vectors
s) by transfecting DNA derived from plasmid 1004-40. The obtained virus was subjected to the method described above (Plaque).
Purification of Recombinant Construct
cts).

【０１２４】 （実施例５：組換えアデノウイルスベクターＳ−ＢＡＶ−００５の調製） Ｓ−ＢＡＶ−００５は、このゲノムのＥ３領域に欠失を有するＢＡＶ−１ウイ
ルスである。ＢａｍＨＩフラグメント「Ｂ」のより小さなＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ
サブフラグメント（配列番号３の２５６６４位〜２６８５０位）を、欠失させた
。この欠失は、ＯＲＦ ２１および２２の主要な部分を除去している。Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ部位を含むポリリンカー配列（５’−ＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣ−３
’）［配列番号１６］を、この欠失に挿入した。Example 5 Preparation of Recombinant Adenovirus Vector S-BAV-005 S-BAV-005 is a BAV-1 virus having a deletion in the E3 region of this genome. Smaller SalI to BamHI of BamHI fragment “B”
The subfragment (positions 25664-26850 of SEQ ID NO: 3) was deleted. This deletion removes a major part of ORFs 21 and 22. Hind
Polylinker sequence containing a III site (5'-TCGACAAGCTTCCC-3
') [SEQ ID NO: 16] was inserted into this deletion.

【０１２５】 Ｓ−ＢＡＶ−００５を、上記の方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｏｎｃｔｒｕｃ
ｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
）に従って、プラスミド１０１８−７５から誘導されたＤＮＡをトランスフェク
トすることによって作製した。得られたウイルスを、上記の方法（Ｐｌａｑｕｅ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｔｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｓ）に従って、精製した。The S-BAV-005 was prepared according to the method described above (Method of Contractruc).
Ting Recombinant BAV-1 viral vectors
) Was made by transfecting DNA derived from plasmid 1018-75. The obtained virus was subjected to the method described above (Plaque).
Purificate of Recombinant Construct
cts).

【０１２６】 （実施例６：組換えアデノウイルスベクターＳ−ＢＡＶ−００６の調製） Ｓ−ＢＡＶ−００６は、このゲノムのＥ３領域に欠失を有するＢＡＶ−１ウイ
ルスである。ＢａｍＨＩフラグメントＢのより小さなＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩサブ
フラグメント（配列番号３の２５６６４位〜２６８５０位）を、欠失させた。こ
の欠失は、ＯＲＦ ２１および２２の主要な部分を除去している。ＨＣＭＶ最初
期プロモーターの制御下にあるＢＶＤＶ ｇ５３（アミノ酸１〜３９４）のにつ
いての遺伝子を、この欠失した領域に挿入した。Example 6 Preparation of Recombinant Adenovirus Vector S-BAV-006 S-BAV-006 is a BAV-1 virus having a deletion in the E3 region of this genome. The smaller SalI to BamHI subfragment of BamHI fragment B (positions 25664 to 26850 of SEQ ID NO: 3) was deleted. This deletion removes a major part of ORFs 21 and 22. The gene for BVDV g53 (amino acids 1-394) under the control of the HCMV immediate early promoter was inserted into this deleted region.

【０１２７】 Ｓ−ＢＡＶ−００６を、上記の方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｏｎｃｔｒｕｃ
ｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
）に従って、プラスミド１０１８−４２から誘導されたＤＮＡをトランスフェク
トすることによって作製した。得られたウイルスを、上記の方法（Ｐｌａｑｕｅ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｔｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｓ）に従って、精製した。The S-BAV-006 was prepared according to the method described above (Method of Contractruc).
Ting Recombinant BAV-1 viral vectors
) Was prepared by transfecting DNA derived from plasmid 1018-42. The obtained virus was subjected to the method described above (Plaque).
Purificate of Recombinant Construct
cts).

【０１２８】 （実施例７：組換えアデノウイルスベクターＳ−ＢＡＶ−００７の調製） Ｓ−ＢＡＶ−００５は、このゲノムのＥ３領域に欠失を有するＢＡＶ−１ウイ
ルスである。ＢａｍＨＩフラグメント「Ｂ」のより小さなＥｃｏＲＩ〜ＢａｍＨ
Ｉサブフラグメント（配列番号３の２５７６５位〜２６８５０位）を、欠失させ
た。この欠失は、ＯＲＦ ２１および２２の主要な部分を除去している。Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ部位を含むポリリンカー配列（５’−ＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣ−
３’）［配列番号１６］を、この欠失に挿入した。Example 7 Preparation of Recombinant Adenovirus Vector S-BAV-007 S-BAV-005 is a BAV-1 virus having a deletion in the E3 region of this genome. Smaller EcoRI to BamH of BamHI fragment "B"
The I subfragment (positions 25765-26850 of SEQ ID NO: 3) was deleted. This deletion removes a major part of ORFs 21 and 22. Hin
Polylinker sequence containing dIII site (5'-TCGACAAGCTTCCC-
3 ′) [SEQ ID NO: 16] was inserted into this deletion.

【０１２９】 Ｓ−ＢＡＶ−００７を、上記の方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｏｎｃｔｒｕｃ
ｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
）に従って、プラスミド１０１８−４５から誘導されたＤＮＡをトランスフェク
トすることによって作製した。得られたウイルスを、上記の方法（Ｐｌａｑｕｅ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｔｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｓ）に従って、精製した。独立したトランスフェクションストックから誘導
された子孫ウイルスを、ＭＤＢＫ細胞において増幅させ、そしてＢａｍＨＩ、Ｅ
ｃｏＲＩ、およびＸｂａＩのＤＮＡ制限パターンについて分析した。Ｓ−ＢＡＶ
−００７もまた増殖すると、野生型ＢＡＶ−１と同様の力価になることが示され
た。The S-BAV-007 was prepared according to the method described above (Method of Contractruc).
Ting Recombinant BAV-1 viral vectors
) Was prepared by transfecting DNA derived from plasmid 1018-45. The obtained virus was subjected to the method described above (Plaque).
Purificate of Recombinant Construct
cts). Progeny virus derived from independent transfection stocks was amplified in MDBK cells and BamHI, E
coRI and XbaI were analyzed for DNA restriction patterns. S-BAV
-007 was also shown to grow to a similar titer as wild-type BAV-1 when grown.

【０１３０】 （実施例８：組換えアデノウイルスベクターＳ−ＢＡＶ−０１４の調製） Ｓ−ＢＡＶ−０１４は、このゲノムのＥ３領域に欠失を有するＢＡＶ−１ウイ
ルスである。ＢａｍＨＩフラグメントＢのより小さなＥｃｏＲＩ〜ＢａｍＨＩサ
ブフラグメント（配列番号３の２５７６５位〜２６８５０位）を、欠失させた。
この欠失は、ＯＲＦ２１および２２の主要部分を除去している。ＨＣＭＶ最初期
プロモーターの制御下にあるＢＶＤＶ ｇ５３（アミノ酸１〜３９４）について
の遺伝子を、この欠失した領域に挿入した。Example 8 Preparation of Recombinant Adenovirus Vector S-BAV-014 S-BAV-014 is a BAV-1 virus having a deletion in the E3 region of this genome. The smaller EcoRI to BamHI subfragment of BamHI fragment B (positions 25765 to 26850 of SEQ ID NO: 3) was deleted.
This deletion removes a major portion of ORFs 21 and 22. The gene for BVDV g53 (amino acids 1-394) under the control of the HCMV immediate early promoter was inserted into this deleted region.

【０１３１】 Ｓ−ＢＡＶ−０１４を、上記の方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｏｎｃｔｒｕｃ
ｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
）に従って、プラスミド１０３８−１６から誘導されたＤＮＡをトランスフェク
トすることによって作製した。得られたウイルスを、上記の方法（Ｐｌａｑｕｅ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｔｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｓ）に従って精製した。ＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子の発現を、ウエスタンブロ
ッティング手順によってアッセイした。Ｓ−ＢＡＶ−０１４は、ＢＶＤＶ ｇ５
３抗体に対する特異的な反応性を有する、正確なサイズのタンパク質の発現を示
した。The S-BAV-014 was prepared according to the method described above (Method of Contractruc).
Ting Recombinant BAV-1 viral vectors
) Was prepared by transfecting DNA derived from plasmid 1038-16. The obtained virus was subjected to the method described above (Plaque).
Purificate of Recombinant Construct
cts). The expression of the BVDV g53 gene was assayed by a Western blotting procedure. S-BAV-014 is BVDV g5
The expression of proteins of the correct size with specific reactivity to the three antibodies was demonstrated.

【０１３２】 （実施例９：組換えアデノウイルスベクターＳ−ＢＡＶ−０２２の調製） Ｓ−ＢＡＶ−０２２は、このゲノムのＥ４領域に欠失を有するＢＡＶ−１ウイ
ルスである。この欠失は、配列番号３の２９５２３位〜３０４０７位にわたる。
ＰｓｔＩ部位を含むリンカー配列５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’を、この欠失に挿入
した。Example 9 Preparation of Recombinant Adenovirus Vector S-BAV-022 S-BAV-022 is a BAV-1 virus with a deletion in the E4 region of this genome. This deletion extends from positions 29523 to 30407 of SEQ ID NO: 3.
A linker sequence 5'-CTGCAG-3 'containing a PstI site was inserted into this deletion.

【０１３３】 Ｓ−ＢＡＶ−０２２を、上記の方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｏｎｃｔｒｕｃ
ｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
）に従って、プラスミド１０５５−５２から誘導されたＤＮＡをトランスフェク
トすることによって作製した。得られたウイルスを、上記の方法（Ｐｌａｑｕｅ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｔｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｓ）に従って精製した。独立したトランスフェクションストックから誘導さ
れた子孫ウイルスを、ＭＤＢＫ細胞において増幅させ、そしてＢａｍＨＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ、およびＸｂａＩのＤＮＡ制限パターンについて分析した。Ｓ−ＢＡＶ−
０２２もまた増殖すると、野生型ＢＡＶ−１と同様の力価になることが示された
。The S-BAV-022 was prepared according to the method described above (Method of Contractruc).
Ting Recombinant BAV-1 viral vectors
) Was prepared by transfecting DNA derived from plasmid 1055-52. The obtained virus was subjected to the method described above (Plaque).
Purificate of Recombinant Construct
cts). Progeny virus derived from independent transfection stocks was amplified in MDBK cells and BamHI, Ec
The DNA was analyzed for oRI and XbaI DNA restriction patterns. S-BAV-
022 was also shown to grow to a similar titer as wild-type BAV-1 when grown.

【０１３４】 （実施例１０：組換えアデノウイルスベクターＳ−ＢＡＶ−０２３の調製） Ｓ−ＢＡＶ−０２３は、このゲノムのＥ４領域に欠失を有するＢＡＶ−１ウイ
ルスである。この欠失は、配列番号３の２９５２３位〜３０４０７位にわたる。
ＢＶＤＶ ｇ５３（アミノ酸１〜３９４）についての遺伝子を、この欠失した領
域に挿入した。ＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子は、Ｅ４プロモーターの制御下にあった
。Example 10 Preparation of Recombinant Adenovirus Vector S-BAV-023 S-BAV-023 is a BAV-1 virus having a deletion in the E4 region of this genome. This deletion extends from positions 29523 to 30407 of SEQ ID NO: 3.
The gene for BVDV g53 (amino acids 1-394) was inserted into this deleted region. The BVDV g53 gene was under the control of the E4 promoter.

【０１３５】 Ｓ−ＢＡＶ−０２３を、上記の方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｏｎｃｔｒｕｃ
ｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
）に従って、プラスミド１０５５−５６から誘導されたＤＮＡをトランスフェク
トすることによって作製した。得られたウイルスを、上記の方法（Ｐｌａｑｕｅ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｔｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｓ）に従って精製した。ＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子の発現を、ウエスタンブロ
ッティング手順によってアッセイした。Ｓ−ＢＡＶ−００６は、ＢＶＤＶ ｇ５
３抗体に対する特異的な反応性を有する、正確なサイズのタンパク質の発現を示
した。Ｓ−ＢＡＶ−０２３におけるＢＤＶ ｇ５３外来抗原の発現は、ベクター
系における外来遺伝子の転写に対するＢＡＶ−１ Ｅ４領域の有用性を確立する
。The S-BAV-023 was prepared according to the method described above (Method of Contractruc).
Ting Recombinant BAV-1 viral vectors
) Was prepared by transfecting DNA derived from plasmid 1055-56. The obtained virus was subjected to the method described above (Plaque).
Purificate of Recombinant Construct
cts). The expression of the BVDV g53 gene was assayed by a Western blotting procedure. S-BAV-006 is BVDV g5
The expression of proteins of the correct size with specific reactivity to the three antibodies was demonstrated. Expression of the BDV g53 foreign antigen on S-BAV-023 establishes the utility of the BAV-1 E4 region for transcription of foreign genes in vector systems.

【０１３６】 （実施例１１：組換えアデノウイルスベクターＳ−ＢＡＶ−０２５の調製） Ｓ−ＢＡＶ−０２５は、このゲノムのＥ４領域に欠失を有するＢＡＶ−１ウイ
ルスである。この欠失は、配列番号３の３３６１４位〜３３７２５位にわたる。
ＰｓｔＩ部位を含むリンカー配列５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’を、この欠失に挿入
した。Example 11 Preparation of Recombinant Adenovirus Vector S-BAV-025 S-BAV-025 is a BAV-1 virus having a deletion in the E4 region of this genome. This deletion extends from positions 33614 to 33725 of SEQ ID NO: 3.
A linker sequence 5'-CTGCAG-3 'containing a PstI site was inserted into this deletion.

【０１３７】 Ｓ−ＢＡＶ−０２５を、上記の方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｃｔｒｕｃ
ｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
）に従って、プラスミド１０６４−２６から誘導されたＤＮＡをトランスフェク
トすることによって作製した。得られたウイルスを、上記の方法（Ｐｌａｑｕｅ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｔｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｓ）に従って精製した。独立したトランスフェクションストックから誘導さ
れた子孫ウイルスを、ＭＤＢＫ細胞において増幅させ、そしてＢａｍＨＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ、およびＰｓｔＩのＤＮＡ制限パターンについて分析した。Ｓ−ＢＡＶ−
０２５もまた増殖すると、野生型ＢＡＶ−１と同様の力価になることが示された
。The S-BAV-025 was prepared according to the method described above (Method of contractruc).
Ting Recombinant BAV-1 viral vectors
) Was prepared by transfecting DNA derived from plasmid 1064-26. The obtained virus was subjected to the method described above (Plaque).
Purificate of Recombinant Construct
cts). Progeny virus derived from independent transfection stocks was amplified in MDBK cells and BamHI, Ec
The DNA restriction patterns of oRI and PstI were analyzed. S-BAV-
025 was also shown to grow to a similar titer as wild-type BAV-1 when grown.

【０１３８】 （実施例１２：組換えアデノウイルスベクターＳ−ＢＡＶ−０２６の調製） Ｓ−ＢＡＶ−０２６ベクターは、このゲノムのＥ４領域に欠失を有するＢＡＶ
−１ベクターである。この欠失は、配列番号３の２９５２３位〜３０４０３位に
わたる。ＰｓｔＩ部位を含むリンカー配列５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’を、この欠
失に挿入した。Example 12 Preparation of Recombinant Adenovirus Vector S-BAV-026 The S-BAV-026 vector has a BAV with a deletion in the E4 region of this genome.
-1 vector. This deletion spans positions 29523-30403 of SEQ ID NO: 3. A linker sequence 5'-CTGCAG-3 'containing a PstI site was inserted into this deletion.

【０１３９】 Ｓ−ＢＡＶ−０２６を、上記の方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｃｔｒｕｃ
ｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
ｓ）に従って、プラスミド１０６６−４４から誘導されたＤＮＡをトランスフェ
クトすることによって作製した。得られたウイルスを、上記の方法（Ｐｌａｑｕ
ｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｔｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｏｎｓｔｒ
ｕｃｔｓ）に従って精製した。独立したトランスフェクションストックから誘導
された子孫ウイルスを、ＭＤＢＫ細胞において増幅させ、そしてＢａｍＨＩ、Ｅ
ｃｏＲＩ、およびＸｂａＩのＤＮＡ制限パターンについて分析した。Ｓ−ＢＡＶ
−０２６もまた増殖すると、野生型ＢＡＶ−１と同様の力価になることが示され
た。[0139] S-BAV-026 was prepared according to the method described above (Method of connection).
Ting Recombinant BAV-1 viral vectors
s) by transfecting DNA derived from plasmid 1066-44. The obtained virus was subjected to the above method (Plaqu).
e Purificaiton of Recombinant Constr
cts). Progeny virus derived from independent transfection stocks was amplified in MDBK cells and BamHI, E
coRI and XbaI were analyzed for DNA restriction patterns. S-BAV
-026 was also shown to grow to a similar titer as wild-type BAV-1 when grown.

【０１４０】 （実施例１３：組換えアデノウイルスベクターＳ−ＢＡＶ−０２７の調製） Ｓ−ＢＡＶ−０２７ベクターは、このゲノムのＥ４領域に欠失を有するＢＡＶ
−１ベクターである。この欠失は、配列番号３の２９５２３位〜３０４０３位に
わたる。ＢＶＤＶ ｇ５３（アミノ酸１〜３９４）についての遺伝子を、この欠
失した領域に挿入した。このＢＶＤＶ ｇ５３遺伝子は、Ｅ４プロモーターの制
御下にあった。Example 13 Preparation of Recombinant Adenovirus Vector S-BAV-027 The S-BAV-027 vector has a BAV with a deletion in the E4 region of this genome.
-1 vector. This deletion spans positions 29523-30403 of SEQ ID NO: 3. The gene for BVDV g53 (amino acids 1-394) was inserted into this deleted region. This BVDV g53 gene was under the control of the E4 promoter.

【０１４１】 Ｓ−ＢＡＶ−０２７を、上記の方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｃｔｒｕｃ
ｔｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＡＶ−１ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ
）に従って、プラスミド１０６６−５１から誘導されたＤＮＡをトランスフェク
トすることによって作製した。得られたウイルスを、上記の方法（Ｐｌａｑｕｅ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｔｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｓ）に従って精製した。The S-BAV-027 was prepared according to the method described above (Method of contractruc).
Ting Recombinant BAV-1 viral vectors
) Was prepared by transfecting DNA derived from plasmid 1066-51. The obtained virus was subjected to the method described above (Plaque).
Purificate of Recombinant Construct
cts).

【０１４２】 （実施例１４：船積熱ワクチン） 船積熱またはウシ呼吸疾患（ＢＲＤ）複合体を、ウシの感染性疾患およびさら
なるストレス関連因子の組合せの結果として表す（Ｃ．Ａ．Ｈｊｅｒｐｅ，Ｔｈ
ｅ Ｂｏｖｉｎｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ
．：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：Ｆｏｏｄ
Ａｎｉｍａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．（Ｊ．Ｌ．Ｈｏｗａｒｄ編）Ｐｈｉｌａｄｅ
ｌｐｈｉａ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，１９８６，６７０〜６８０頁
）。ストレスの病態生理学的効果によって増強される呼吸性ウイルス疾患は、多
数の機構により上気道に通常は存在しているＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ生物に対す
るウシの感受性を変更する。ＢＲＤを開始するウイルス感染の制御、および末期
の細菌肺炎の制御は、疾患の症候群の予防に必須である（Ｆ．Ｆｅｎｎｅｒら、
「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ａｃ
ｕｔｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ，
１９８７，１８３〜２０２頁）。Example 14: Fever Shipping Vaccine Shipping fever or bovine respiratory disease (BRD) complex is expressed as a result of a combination of infectious disease in cattle and additional stress-related factors (CA Hjerpe, Th.
e Bovine Respiratory Disease Complex
. : Current Veterinary Therapy 2: Food
Animal Practice. (JL Howard) Philade
lphia, W.M. B. Saunders Co. 1986, 670-680). Respiratory viral diseases, augmented by the pathophysiological effects of stress, alter the sensitivity of cattle to Pasteurella organisms normally present in the upper respiratory tract by a number of mechanisms. Control of viral infection, which initiates BRD, and control of terminal bacterial pneumonia is essential for prevention of the disease syndrome (F. Fenner et al.,
"Mechanisms of Disease Production: Ac
ute Infections ", Veterinary Virology.
Academic Press, Inc. , Orlando, Florida,
1987, 183-202).

【０１４３】 ＢＲＤに寄与する主要な感染性疾患は、以下である：感染性ウシ鼻気管炎ウイ
ルス、パラインフルエンザ３型、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ウシＲＳウイ
ルス、およびＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ（Ｆ．Ｆｅｎｎ
ｅｒら、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ：Ａｃｕｕｔｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏ
ｒｉｄａ，１９８７，１８３〜２０２頁）。このアプローチの拡大は、単一の免
疫で、疾患病原体のアレイを制御するような様式でワクチンを組み合わせること
である。この目標のために、種々のＢＡＶ−１ベクター化抗原（ＩＢＲ、ＢＲＳ
Ｖ、ＰＩ−３、ＢＶＤＶおよびＰ．Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）を、単回のワクチ
ン用量において、混合する。また、ＢＲＤワクチン処方物の一部として含まれ得
る、従来通りに誘導されたワクチン（殺滅されたウイルス、不活性化細菌および
改変された生ウイルス）は、このようなワクチン成分がより効果的であることを
証明するはずである。The major infectious diseases that contribute to BRD are: infectious bovine rhinotracheitis virus, parainfluenza type 3, bovine viral diarrhea virus, bovine respiratory syncytial virus, and Pasteurella haemolytica (F. Fennen).
er, et al., "Mechanisms of Disease Production."
n: Acute Infections ", Veterinary Viro
logic. Academic, Press, Inc. , Orlando, Flo
Rida, 1987, pages 183-202). An extension of this approach is to combine vaccines in such a way that a single immunity controls an array of disease pathogens. To this end, various BAV-1 vectored antigens (IBR, BRS
V, PI-3, BVDV and P.V. Haemolytica) are mixed in a single vaccine dose. Also, conventionally derived vaccines (killed virus, inactivated bacteria, and modified live virus), which can be included as part of a BRD vaccine formulation, make such vaccine components more effective. It must prove that

【０１４４】 本発明の多くの改変およびバリエーションが、当業者に明らかであるように、
その精神および範囲から逸脱することなく、なされ得る。本明細書中に記載され
る特定の実施形態は、例示によってのみ提供され、そして本発明は、添付の特許
請求の範囲が権利を付与される等価物の全範囲とともに、このような特許請求の
範囲の用語によってのみ制限されるべきである。Many modifications and variations of the present invention, as will be apparent to those skilled in the art,
It can be done without departing from its spirit and scope. The specific embodiments described herein are provided by way of illustration only, and the present invention is to be construed with the full scope of equivalents to which such claims are entitled. It should be limited only by the terms of the scope.

【配列表】[Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は、キロベースペアでの種々の領域の相対的大きさを示す、ＢＡＶ−１ゲ
ノムＤＮＡの図である。フラグメントは、減少する大きさ順に文字を入れる。FIG. 1 is a diagram of BAV-1 genomic DNA showing the relative sizes of various regions in kilobase pairs. Fragments enter characters in decreasing size.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｔ Ｚ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA32 CA03 CA04 DA02 EA02 EA04 FA13 GA11 HA01 HA17 4B065 AA01Y AA90X AA95X AA95Y AB01 BA02 CA24 CA43 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, HR, HU, ID, IL , IN, IS, JP, KG, KR, KZ, LC, LK, LR, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, US, UZ, VN, YU, ZA F term (reference) 4B024 AA10 BA32 CA03 CA04 DA02 EA02 EA04 FA13 GA11 HA01 HA17 4B065 AA01Y AA90X AA95X AA95Y AB01 BA02 CA24 CA43

Claims (22)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ウシアデノウイルスのＥ４遺伝子領域中に挿入された外来Ｄ
ＮＡ配列を含む、組換えウイルス。1. An exogenous D inserted into the E4 gene region of bovine adenovirus.
A recombinant virus comprising an NA sequence. 【請求項２】 請求項１に記載の組換えウイルスであって、前記外来ＤＮＡ
が、ウシロタウイルス、ウシコロナウイルス、ウシヘルペスウイルス１型、ウシ
ＲＳウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩ−３）、ウシ下痢
症ウイルス、ウシ鼻気管炎ウイルス、ウシパラインフルエンザ３型ウイルス、Ｐ
ａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍ
ｕｌｔｏｃｉｄａおよび／またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓからな
る群より選択される、ウイルスまたは細菌由来のポリペプチドをコードする、組
換えウイルス。2. The recombinant virus according to claim 1, wherein said foreign DNA is
Are bovine rotavirus, bovine coronavirus, bovine herpes virus type 1, bovine respiratory syncytial virus, bovine parainfluenza virus type 3 (BPI-3), bovine diarrhea virus, bovine rhinotracheitis virus, bovine parainfluenza type 3 virus, P
asterurella haemolytica, Pasteurella m
A recombinant virus encoding a polypeptide derived from a virus or bacterium, selected from the group consisting of ultracida and / or Haemophilus somnus. 【請求項３】 前記ポリペプチドが１０個よりも多いアミノ酸を含む、請求
項２に記載の組換えウイルス。3. The recombinant virus of claim 2, wherein said polypeptide comprises more than 10 amino acids. 【請求項４】 前記ポリペプチドが抗原性である、請求項２に記載の組換え
ウイルス。4. The recombinant virus according to claim 2, wherein said polypeptide is antigenic. 【請求項５】 前記ウシアデノウイルスが１亜型ウシアデノウイルスである
、請求項１に記載の組換えウイルス。5. The recombinant virus according to claim 1, wherein said bovine adenovirus is a bovine adenovirus 1 subtype. 【請求項６】 前記ウシアデノウイルスが２亜型ウシアデノウイルスである
、請求項１に記載の組換えウイルス。6. The recombinant virus of claim 1, wherein said bovine adenovirus is a subtype 2 bovine adenovirus. 【請求項７】 前記外来ＤＮＡ配列が、該外来ＤＮＡ配列の上流に配置され
たプロモーターの制御下にある、請求項５に記載の組換えウイルス。7. The recombinant virus of claim 5, wherein said foreign DNA sequence is under the control of a promoter located upstream of said foreign DNA sequence. 【請求項８】 ウシアデノウイルスのＥ４遺伝子領域の少なくとも一部の欠
失を含む、変異ウイルス。8. A mutant virus comprising a deletion of at least a part of the E4 gene region of bovine adenovirus. 【請求項９】 前記Ｅ４遺伝子領域中に挿入された外来ＤＮＡ配列もまた有
する、請求項８に記載の変異ウイルス。9. The mutant virus according to claim 8, which also has a foreign DNA sequence inserted into the E4 gene region. 【請求項１０】 前記ウシアデノウイルスの前記Ｅ４遺伝子領域の少なくと
も１つのオープンリーディングフレームが、完全に欠失している、請求項８に記
載の変異ウイルス。10. The mutant virus according to claim 8, wherein at least one open reading frame of said E4 gene region of said bovine adenovirus is completely deleted. 【請求項１１】 ウシアデノウイルス１のＥ３遺伝子領域中に挿入された外
来ＤＮＡ配列を含む、組換えウイルス。11. A recombinant virus comprising a foreign DNA sequence inserted into the E3 gene region of bovine adenovirus 1. 【請求項１２】 請求項１１に記載の組換えウイルスであって、前記外来Ｄ
ＮＡが、ウシロタウイルス、ウシコロナウイルス、ウシヘルペスウイルス１型、
ウシＲＳウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩ−３）、ウシ
下痢症ウイルス、ウシ鼻気管炎ウイルス、ウシパラインフルエンザ３型ウイルス
、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ
ｍｕｌｔｏｃｉｄａおよび／またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓか
らなる群より選択される、ウイルスまたは細菌由来のポリペプチドをコードする
、組換えウイルス。12. The recombinant virus according to claim 11, wherein said foreign D
NA is bovine rotavirus, bovine coronavirus, bovine herpesvirus type 1,
Bovine respiratory syncytial virus, bovine parainfluenza virus type 3 (BPI-3), bovine diarrhea virus, bovine rhinotracheitis virus, bovine parainfluenza type 3 virus, Pasteurella haemolytica, Pasteurella
A recombinant virus encoding a polypeptide derived from a virus or bacterium, selected from the group consisting of multicida and / or Haemophilus somnus. 【請求項１３】 前記ポリペプチドが１０個よりも多いアミノ酸を含む、請
求項１２に記載の組換えウイルス。13. The recombinant virus of claim 12, wherein said polypeptide comprises more than 10 amino acids. 【請求項１４】 前記ポリペプチドが抗原性である、請求項１２に記載の組
換えウイルス。14. The recombinant virus according to claim 12, wherein said polypeptide is antigenic. 【請求項１５】 前記外来ＤＮＡ配列が、該外来ＤＮＡ配列の上流に配置さ
れたプロモーターの制御下にある、請求項１２に記載の組換えウイルス。15. The recombinant virus of claim 12, wherein said foreign DNA sequence is under the control of a promoter located upstream of said foreign DNA sequence. 【請求項１６】 ウシアデノウイルス１のＥ３遺伝子領域の少なくとも一部
の欠失を含む、変異ウイルス。16. A mutant virus comprising a deletion of at least a part of a bovine adenovirus 1 E3 gene region. 【請求項１７】 前記Ｅ３遺伝子領域中に挿入された外来ＤＮＡ配列もまた
有する、請求項１６に記載の変異ウイルス。17. The mutant virus according to claim 16, further comprising a foreign DNA sequence inserted into the E3 gene region. 【請求項１８】 前記ウシアデノウイルス１の前記Ｅ３遺伝子領域の少なく
とも１つのオープンリーディングフレームが、完全に欠失している、請求項１６
に記載の組換えウイルス。18. The bovine adenovirus 1 wherein at least one open reading frame of the E3 gene region is completely deleted.
3. The recombinant virus according to item 1. 【請求項１９】 請求項１に記載の組換えウイルスを含む、ワクチン。19. A vaccine comprising the recombinant virus according to claim 1. 【請求項２０】 動物における免疫学的応答を誘導する方法であって、請求
項１９に記載のワクチンを該動物に導入する工程を包含する、方法。20. A method of inducing an immunological response in an animal, comprising introducing the vaccine of claim 19 into the animal. 【請求項２１】 請求項１１に記載の組換えウイルスを含む、ワクチン。21. A vaccine comprising the recombinant virus according to claim 11. 【請求項２２】 動物における免疫学的応答を誘導する方法であって、請求
項２１に記載のワクチンを該動物に導入する工程を包含する、方法。22. A method for inducing an immunological response in an animal, comprising introducing the vaccine of claim 21 into the animal.