JP2002539771A - Immunoglobulin receptor (pIgR) binding domains and methods of use therefor - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、重合性イムノグロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）の標的化および粘膜上皮への抗体の輸送を担うＩｇＡのＣαＡドメインに位置するドメインを同定する。このｐＩｇＲ結合ドメインを使用して、広汎で種々の組成物を粘膜上皮へ標的化し得、これらには、タンパク質、核酸、薬物および診断剤が含まれる。他の詳細な標的化剤は、ｐＩｇＲ結合ドメインとともに使用されて、体内の複合体の最終的な局在化をさらに規定し得る。大多数の疾患状態（例えば、ウイルス感染、真菌感染および細菌感染）および癌の処置は、ｐＩｇＲ結合ドメインの使用を通じて改善され得る。   (57) [Summary] The present invention identifies domains located in the CαA domain of IgA that are responsible for targeting the polymerizable immunoglobulin receptor (pIgR) and transporting antibodies to mucosal epithelium. The pIgR binding domain can be used to target a wide variety of compositions to mucosal epithelium, including proteins, nucleic acids, drugs and diagnostics. Other detailed targeting agents can be used with the pIgR binding domain to further define the ultimate localization of the complex in the body. Treatment of most disease states (eg, viral, fungal and bacterial infections) and cancer can be improved through the use of the pIgR binding domain.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 （１．発明の背景） 本願は、米国仮特許出願番号第６０／１１９、９３２号（１９９９年２月１２
日出願）にたいする優先権を主張する。この出願は、本明細書において、棄権な
しにその全体が参考として援用される。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈからの補助金番号ＡＩ４４２０６−０１Ａ１に従い、米
国政府は、本発明に対して権利を有する。(1. Background of the Invention) The present application is related to US Provisional Patent Application No. 60 / 119,932 (February 12, 1999).
Priority application). This application is incorporated herein by reference in its entirety without abstention. National Institute
In accordance with Grant No. AI44206-01A1 from s of Health, the United States Government has rights in the invention.

【０００２】 （発明の背景） 本発明は、概して診断、予防および治療的な処置の組成物および方法の分野に
関する。より詳細には、本発明は、重合性免疫グロブリンレセプターを認識およ
び結合する、結合ドメインを用いて、粘膜上皮へと薬剤を送達するためのシステ
ムに関する。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates generally to the field of diagnostic, prophylactic and therapeutic treatment compositions and methods. More particularly, the present invention relates to a system for delivering drugs to mucosal epithelium using a binding domain that recognizes and binds a polymerizable immunoglobulin receptor.

【０００３】 （２．関連技術の説明） 外部の病原体に暴露される身体の大部分の領域は粘膜表面である。この粘膜表
面は、４００平方メートルの表面積を構成する。対して、皮膚のカバー領域は１
．８平方ｍである（Ｃｈｉｌｄｅｒｓら、１９８９）。驚くべきことではないが
、感染は、しばしば、粘膜表面を含む。ＩｇＡは、粘膜分泌物において主に見出
されるクラスである。従って、ＩｇＡ抗体は、免疫防禦の最初の線として役立つ
。2. Description of the Related Art Most areas of the body that are exposed to external pathogens are mucosal surfaces. This mucosal surface constitutes a surface area of 400 square meters. In contrast, the skin coverage area is 1
. 8 square meters (Childers et al., 1989). Not surprisingly, infections often involve mucosal surfaces. IgA is a class found primarily in mucosal secretions. Thus, IgA antibodies serve as the first line of immune defense.

【０００４】 粘膜分泌物に放出されるために、ＩｇＡ（これは、血漿細胞によって産生され
る）は、細胞の基底膜側から細胞の先端の膜側へと、粘膜上皮を横切って移行す
ることを必要とする。ＩｇＡのエンドサイトーシスおよびトランスサイトーシス
は、重合性イムノグロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）によｔって媒介される。こ
のｐＩｇＲは、粘膜上皮の基底膜に位置する（Ｍｏｓｔｏｖ、１９９４ ；Ｍｏ
ｓｔｏｖら、１９８２）。次いで、粘膜分泌におけるＩｇＡは、能動的または受
動的な免疫応答を媒介し得る。[0004] IgA, which is produced by plasma cells, migrates across the mucosal epithelium from the basement membrane side of the cell to the membrane side of the cell tip, because it is released into mucosal secretions. Need. Endocytosis and transcytosis of IgA are mediated by the polymerizable immunoglobulin receptor (pIgR). This pIgR is located in the basement membrane of mucosal epithelium (Mostov, 1994; Mo
stov et al., 1982). IgA in mucosal secretion can then mediate active or passive immune responses.

【０００５】 ２つの異なる機構がＩｇＡの抗病原体活性の原因であると記載されている：能
動的免疫は、Ｆｃレセプター結合または補体活性化を通じて、病原体に対する分
子および細胞性の免疫応答を生成することを包含する；受動的な免疫は、免疫系
の刺激を含まず、そのかわり、例えば、ＩｇＡが宿主細胞にウイルスを付着する
ことをブロックする能力または細菌の運動性を阻害する能力を通じて引き起こさ
れる。[0005] Two different mechanisms have been described to be responsible for the antipathogenic activity of IgA: active immunity generates molecular and cellular immune responses to pathogens through Fc receptor binding or complement activation Passive immunity does not involve stimulation of the immune system, but instead is triggered, for example, through the ability to block IgA from attaching the virus to host cells or to inhibit bacterial motility. .

【０００６】 多数の研究が強力な粘膜ＩｇＡ応答と、ロタウイルス（Ｕｎｄｅｒｄｏｗｎお
よびＳｃｈｉｆｆ、１９８６、Ｆｅｎｇら、１９９４）、インフルエンザウイル
ス（ＴａｙｌｏｒおよびＤｉｍｍｏｃｋ、１９８５、Ｌｉｅｗら、１９８４）、
ポリオウイルス（Ｏｇｒａ ａｎｄ Ｋａｒｚｏｎ、１９７０）、ＲＳウイルス
（Ｋａｕｌら、１９８１）、サイトメガロウイルス（Ｔａｍｕｒａら、１９８０
）およびエプスタイン−バーウイルス（Ｙａｏら、１９９１）でのウイルス感染
からの保護との間の関連を実証した。従って、分泌性ＩｇＡは、これらのウイル
スが、体内へのアクセスを得ることを、侵入の部位（すなわち、粘膜病面）での
感染をブロックすることによって予防することにおいて成功している。鼻内Ｉｇ
Ｇ Ｆａｂでの受動性免疫治療は、ＲＳウイルスに対して保護性であった（Ｃｒ
ｏｗｅら、１９９４）。このことは、抗ウイルス抗体を中和することの存在のみ
が、エフェクター機能を何ら伴わず、粘膜表面において、ウイルス感染を予防し
得ることを示す。さらに、ＨＩＶ特異的なＩｇＡ（これは、粘膜分泌物に輸送さ
れる）は、保護的抗体媒介性の免疫を惹起するワクチンとして使用され得る（米
国出願番号第０８／７７９，５９７号。これは、本明細書において参考として援
用される）。[0006] Numerous studies have shown strong mucosal IgA responses to rotaviruses (Underdown and Schiff, 1986, Feng et al., 1994), influenza viruses (Taylor and Dimmock, 1985, Liew et al., 1984),
Poliovirus (Ogra and Karzon, 1970), Respiratory syncytial virus (Kaul et al., 1981), Cytomegalovirus (Tamura et al., 1980).
) And protection from viral infection with the Epstein-Barr virus (Yao et al., 1991). Thus, secretory IgA has been successful in preventing these viruses from gaining access to the body by blocking infection at the site of entry (ie, the mucosal disease surface). Nasal Ig
Passive immunotherapy with G Fab was protective against respiratory syncytial virus (Cr
Owe et al., 1994). This indicates that only the presence of neutralizing anti-viral antibodies can prevent viral infection at mucosal surfaces without any effector function. In addition, HIV-specific IgA, which is transported to mucosal secretions, can be used as a vaccine to elicit protective antibody-mediated immunity (US Ser. No. 08 / 779,597; , Incorporated herein by reference).

【０００７】 この情報にもかかわらず、どのようにＩｇＡが機能し、そして特に、ＩｇＡが
どのように輸送されるかについて多数の問題が残存している。ｐＩｇＲを介した
粘膜上皮へのＩｇＡの標的化および輸送を担う、ＩｇＡ構造を含む構造の性質お
よび同一性を知ることは、非常に利益がある。[0007] Despite this information, a number of problems remain regarding how IgA functions and, in particular, how IgA is transported. Knowing the nature and identity of the structures, including IgA structures, that are responsible for targeting and transporting IgA to the mucosal epithelium via pIgR is of great benefit.

【０００８】 （発明の要旨） 従って、粘膜上皮へと標的化および輸送することを付与する構造を提供するこ
とが本発明の課題である。本発明の課題はまた、この構造のための種々の組成物
および使用を提供することである。これらおよび他の課題を達成するにおいて、
単離されたｐＩｇＲドメインが提供される。「ｐＩｇＲ結合ドメイン」とは、重
合性イムノグロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）に結合し得るアミノ酸のモチーフ
または構造をいう。このドメインは、それが付着する分子に対して、粘膜上皮に
標的化される能力を付与する。特定の実施形態において、本発明は、ｐＩｇＲ結
合ドメインを含む１０残基と約５０残基との間のアミノ酸の単離されたペプチド
に関する。さらなる実施形態は、１０残基長、約１５残基長、約２０残基長、約
２５残基長、約３０残基長、約３５残基長、約４０残基長、約４５残基長、また
は約５０残基長である、ｐＩｇＲドメインを含むペプチドに関する。本発明は、
配列番号１の配列を含むペプチド、ならびに配列番号２〜３３からなる群より選
択される配列を含むペプチドをさらに包含する。さらに、他の実施形態において
、ｐＩｇＲ結合ドメインは、ＩｇＡのＣα３ドメインそのフラグメントを包含す
る。ＩｇＡのＣαドメインを含む、ｐＩｇＲ結合ドメインに隣接するアミノ酸は
、本発明の組成物において含有され得る。隣接領域としては以下：１、２、３、
４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０、または
それより多いアミノ酸が、ｐＩｇＲ結合ドメインの一方の側または両方の側にお
いて包含し得る。１つを超えるｐＩｇＲ結合ドメイン含有するペプチドに関して
１つのｐＩｇＲ結合ドメインを含むペプチドに関連する制限および実施形態もま
た使用され得ることが意図される。そのような多量体ペプチドは、２、３、４、
５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるｐＩｇＲ結合ドメインを含み得
る。[0008] Accordingly, it is an object of the present invention to provide a structure that confers targeting and transport to the mucosal epithelium. It is also an object of the present invention to provide various compositions and uses for this structure. In achieving these and other challenges,
An isolated pIgR domain is provided. “PIgR binding domain” refers to an amino acid motif or structure that can bind to a polymerizable immunoglobulin receptor (pIgR). This domain confers on the molecule to which it is attached the ability to be targeted to the mucosal epithelium. In certain embodiments, the invention relates to an isolated peptide of between 10 and about 50 amino acids comprising the pIgR binding domain. Further embodiments are 10 residues, about 15 residues, about 20 residues, about 25 residues, about 30 residues, about 35 residues, about 40 residues, about 45 residues Long, or about 50 residues in length, comprising a pIgR domain. The present invention
It further includes a peptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 1 and a peptide comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-33. Further, in other embodiments, the pIgR binding domain comprises a Cα3 domain of IgA or a fragment thereof. Amino acids adjacent to the pIgR binding domain, including the Cα domain of IgA, can be included in the compositions of the invention. The adjacent areas are as follows: 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 50, or more amino acids may be included on one or both sides of the pIgR binding domain. It is contemplated that the limitations and embodiments relating to peptides containing one pIgR binding domain with respect to peptides containing more than one pIgR binding domain can also be used. Such multimeric peptides are 2, 3, 4,
It may comprise 5, 6, 7, 8, 9, 10, or more pIgR binding domains.

【０００９】 本発明の他の実施形態は、ｐＩｇＲ結合ドメインを含むペプチドを包含する。
ここで、このペプチドは、以下のような連結部分に付着している：ＳＭＴＰ、Ｓ
ＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、スルホ−ＬＣ−ＳＤＰＤ、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣ
Ｃ、ＭＢ、スルホ−ＭＢ、ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＩＡＢ、ＳＭＰＢ、スルホ−Ｓ
ＭＰＢ、ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳおよびＡＢＨ。一般に、用語「連結部分」とは
、他の化合物と連結するかまたは連結し得る化学的または薬理学的特性を有する
構造をいう。１を超えるｐＩｇＲ結合ドメインを含む多量体ペプチドにおいて、
連結部分は、互いに２つ以上のｐＩｇＲ結合ドメインを接続し得る。[0009] Another embodiment of the invention encompasses a peptide comprising a pIgR binding domain.
Here, the peptide is attached to a connecting moiety such as: SMTP, S
PDP, LC-SPDP, Sulfo-LC-SDPD, SMCC, Sulfo-SMC
C, MB, sulfo-MB, SIAB, sulfo-SIAB, SMPB, sulfo-S
MPB, EDC / sulfo-NHS and ABH. In general, the term "linking moiety" refers to a structure that has chemical or pharmacological properties that link or can link with other compounds. In a multimeric peptide comprising more than one pIgR binding domain,
The linking moiety may connect two or more pIgR binding domains to each other.

【００１０】 このペプチドはまた、選択された薬剤に対して、その連結部分を介して付着さ
れ得る。これは、いくつかの実施形態において治療的または予防的な化合物であ
る。この選択された薬剤は、例えば、以下であり得る：ペプチド、ポリペプチド
、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、検出可能な標識、または薬物。さら
に、本発明は、以下をさらに含む：酵素、抗体領域、タンパク質同士の相互作用
もしくはリガンドレセプター相互作用に関与する領域、サイトカイン、増殖因子
、ホルモン、毒素、腫瘍サプレッサー、転写因子、またはアポトーシスのインデ
ューサーであるポリペプチド。さらなる実施形態において、その選択された薬剤
は、以下をコードするポリヌクレオチドである：ポリペプチド、単鎖抗体、アン
チセンス構築物、またはリボザイム。本発明の他の実施例は以下を開示する：以
下である：検出可能な標識：ローダミンまたはフルオレセイン、あるいは放射標
識。なおさらなる実施形態において、ｐＩｇＲ結合ドメインを含むそのペプチド
は、薬物（例えば、抗生物質）、ＤＮＡ傷害剤、酵素インヒビターまたは代謝産
物に連結される。[0010] The peptide can also be attached to the selected agent via its linking moiety. It is a therapeutic or prophylactic compound in some embodiments. The selected agent can be, for example, a peptide, polypeptide, oligonucleotide, polynucleotide, detectable label, or drug. In addition, the invention further includes: an enzyme, an antibody region, a region involved in protein-protein or ligand-receptor interaction, a cytokine, a growth factor, a hormone, a toxin, a tumor suppressor, a transcription factor, or an apoptosis inhibitor. A polypeptide that is a producer. In a further embodiment, the selected agent is a polynucleotide that encodes: a polypeptide, single chain antibody, antisense construct, or ribozyme. Other embodiments of the invention disclose the following: Detectable label: Rhodamine or fluorescein, or a radiolabel. In still further embodiments, the peptide comprising the pIgR binding domain is linked to a drug (eg, an antibiotic), a DNA damaging agent, an enzyme inhibitor or a metabolite.

【００１１】 本発明はまた、非ｐＩｇＲ標的化剤に連結されたペプチド内にのｐＩｇＲ結合
ドメインを、いくつかの実施形態において記載する。「非ｐＩｇＲ標的化剤」ま
たは「非ｐＩｇＲ部分」とは、ｐＩｇＲではない分子の標的化を可能にする構造
をいう。いくつかの場合において、非ｐＩＧＲ標的剤は、抗体の抗原結合ドメイ
ンである。他方、他の場合において、それはレセプターリガンドまたはリガンド
結合ドメインである。従って、これらの例において、その標的化された分子は、
それぞれ抗原、レセプター、またはリガンドのいずれかである。[0011] The invention also describes, in some embodiments, a pIgR binding domain within a peptide linked to a non-pIgR targeting agent. “Non-pIgR targeting agent” or “non-pIgR moiety” refers to a structure that allows targeting of a molecule that is not pIgR. In some cases, the non-pIGR targeting agent is the antigen binding domain of an antibody. On the other hand, in other cases, it is a receptor ligand or ligand binding domain. Thus, in these examples, the targeted molecule is
Each is either an antigen, receptor, or ligand.

【００１２】 なおさらなる実施形態において、本発明は、非抗体ペプチドまたはポリペプチ
ドに共有結合したｐＩｇＲ結合ドメインを含む融合タンパク質を包含する。[0012] In yet a further embodiment, the invention encompasses a fusion protein comprising a pIgR binding domain covalently linked to a non-antibody peptide or polypeptide.

【００１３】 本発明のいくつかの例は、ＩｇＡのＣα３ドメインを含む、ｐＩｇＲ結合ドメ
インを包含する。抗体ペプチドまたはポリペプチドは、以下からなる群より選択
され得る：酵素、タンパク質同士の相互作用を媒介する領域またはリガンドレセ
プターの相互作用を媒介する領域、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、毒素、
腫瘍サプレッサー、転写因子、およびアポトーシスのインデューサー。Some examples of the invention include a pIgR binding domain, including the Cα3 domain of IgA. The antibody peptide or polypeptide may be selected from the group consisting of: an enzyme, a region that mediates interaction between proteins or a region that mediates interaction of ligand receptors, cytokines, growth factors, hormones, toxins,
Tumor suppressors, transcription factors, and inducers of apoptosis.

【００１４】 本発明は、非抗体ペプチドまたはポリペプチドの配列に共有結合されたｐＩｇ
Ｒ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに包
含する。いくつかの実施形態において、非抗体ポリペプチドまたはポリペプチド
は、以下からなる群より選択される：酵素、タンパク質同士の相互作用を媒介す
る領域またはリガンドレセプターの相互作用を媒介する領域、サイトカイン、増
殖因子、ホルモン、毒素、腫瘍サプレッサー、転写因子、およびアポトーシスの
インデューサー。The present invention provides a pIg covalently linked to a sequence of a non-antibody peptide or polypeptide.
Further encompasses a polynucleotide encoding a fusion protein comprising an R-binding domain. In some embodiments, the non-antibody polypeptide or polypeptide is selected from the group consisting of: an enzyme, a region that mediates protein-protein interaction or ligand receptor interaction, cytokine, proliferation. Factors, hormones, toxins, tumor suppressors, transcription factors, and inducers of apoptosis.

【００１５】 本発明はまた、粘膜上皮に選択された薬剤を標的化するための方法を包含する
。この方法は、少なくとも、その選択された薬剤、およびｐＩｇＲ結合ドメイン
を含む１０残基と約５０残基との間の単離されたペプチドを含む複合体を提供す
る工程；ならびにその複合体を動物へと投与する工程による。ここで、その複合
体は、ｐＩｇＲを発現する細胞へ結合し、その細胞によって取り込まれ、そして
粘膜上皮へと輸送される。実施例はさらに、この方法を記載し、この方法は、以
下の経路によって投与される：経口、吸入、経眼、経鼻、経膣、経直腸、静脈内
、皮下、筋肉内、または動脈内の経路。いくつかの例において、この方法はまた
、第二の非ｐＩｇＲ標的化部分を含む。[0015] The invention also includes a method for targeting a selected agent to mucosal epithelium. The method comprises providing a complex comprising at least the selected agent and an isolated peptide between 10 and about 50 residues comprising the pIgR binding domain; Depending on the step of administration. Here, the complex binds to cells expressing pIgR, is taken up by the cells, and transported to the mucosal epithelium. The examples further describe the method, which is administered by the following routes: oral, inhalation, ophthalmic, nasal, vaginal, rectal, intravenous, subcutaneous, intramuscular, or intraarterial. Route. In some cases, the method also includes a second non-pIgR targeting moiety.

【００１６】 非抗体ペプチドまたはポリペプチドを、粘膜上皮へと標的化するための、本発
明の別の方法は、以下を含む：非抗体ペプチドまたはポリペプチドに共有結合し
たｐＩｇＲ結合ドメインを含む融合タンパク質を提供する工程；ならびにその標
的化複合体を哺乳動物へと投与する工程；ここで、その標的化複合体は、ｐＩｇ
Ｒを発現する細胞に結合し、その細胞によって取り込まれ、そして粘膜上皮へと
輸送される。なおさらなる実施形態において、本発明は、以下の経路を通じて投
与され得る：経口、経眼、経鼻、経膣、経直腸、静脈内、皮下、筋肉内、または
動脈内の経路。さらなる実施形態は、その融合タンパク質がまた非ｐＩｇＲ標的
化剤のような第二の標的化部分を含む方法を開示する。Another method of the invention for targeting a non-antibody peptide or polypeptide to the mucosal epithelium comprises: a fusion protein comprising a pIgR binding domain covalently linked to the non-antibody peptide or polypeptide And administering the targeting complex to a mammal; wherein the targeting complex comprises pIg
It binds to, is taken up by, and transports into the mucosal epithelium of cells that express R. In still further embodiments, the present invention may be administered via the following routes: oral, ocular, nasal, vaginal, rectal, intravenous, subcutaneous, intramuscular, or intraarterial. A further embodiment discloses a method wherein the fusion protein also comprises a second targeting moiety, such as a non-pIgR targeting agent.

【００１７】 本明細書において記載される本発明はまた、細胞に、選択された薬剤を送達す
る方法を包含する。この方法は、以下の工程を包含する：選択された薬剤、およ
びｐＩｇＲ結合ドメインを含む１０残基と約５０残基との間の単離されたペプチ
ドを含む複合体を提供する工程；ならびにｐＩｇＲを発現する細胞に、その標的
化された複合体を接触させる工程。The invention described herein also includes a method of delivering a selected agent to a cell. The method includes the steps of: providing a conjugate comprising the selected agent and an isolated peptide between 10 and about 50 residues comprising the pIgR binding domain; and pIgR Contacting the targeted complex with a cell expressing.

【００１８】 さらなる例は、その複合体を提供する前に、その細胞において作動可能なプロ
モーターの制御下に、ｐＩｇＲをコードする発現構築物を用いてその細胞を形質
転換する工程を包含する。なおさらなる実施形態は、非ｐＩｇＲ標的化薬剤のよ
うな第二の標的化部分もまた含む複合体を開示する。A further example involves transforming the cell with an expression construct encoding pIgR under the control of a promoter operable in the cell before providing the complex. Still further embodiments disclose conjugates that also include a second targeting moiety, such as a non-pIgR targeting agent.

【００１９】 非抗体ペプチドまたはポリペプチドを細胞へと送達する別の方法は、以下を包
含する：非ペプチドまたはポリペプチドに共有結合したｐＩｇＲ結合ドメインを
含む融合タンパク質を提供する工程；ならびにその融合タンパク質に、ｐＩｇＲ
を発現する細胞を接触させる工程。この方法はまた、その融合タンパク質を提供
する前に、その細胞において作動可能なプロモーターの制御下で、ｐＩｇＲをコ
ードする発現構築物を用いてその細胞をまず形質転換する工程を包含する。この
方法の他の実施形態は、非ｐＩｇＲ標的化薬剤のような第二の標的化部分もまた
含む融合タンパク質を包含する。Another method of delivering a non-antibody peptide or polypeptide to a cell includes: providing a fusion protein comprising a pIgR binding domain covalently linked to the non-peptide or polypeptide; and the fusion protein In addition, pIgR
Contacting cells expressing The method also includes, before providing the fusion protein, first transforming the cell with an expression construct encoding pIgR under the control of a promoter operable in the cell. Other embodiments of this method include a fusion protein that also includes a second targeting moiety, such as a non-pIgR targeting agent.

【００２０】 単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、請求の範囲および／または明細書におい
て「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む、包含する）との関連で使用される場合、「１
」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１を
超える」の意味に一致する。The use of the word “a” or “an” when used in the claims and / or in the specification in connection with “comprising” includes “1”
", But is consistent with the meaning of" one or more "," at least one ", and" one or more ".

【００２１】 本発明の他の目的、特徴および利点は，以下の詳細な説明から明白になる。し
かし、以下の詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示
すものではあるが、例示のみの目的で与えられる。なぜなら、本発明の趣旨およ
び範囲内にある種々の変化および改変は、この詳細な説明から、当業者には明ら
かであるからである。[0021] Other objects, features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description. However, the following detailed description and specific examples, which illustrate preferred embodiments of the present invention, are given by way of illustration only. Because various changes and modifications within the spirit and scope of the invention will be apparent to those skilled in the art from this detailed description.

【００２２】 （例示的な実施形態の説明） 本発明は、配列（ＩｇＡ配列）を使用する組成物および方法に関する。この配
列は、粘膜表面への治療化合物の送達についてｐＩｇＲを標的化する。ＩｇＡの
ｐＩｇＲ結合モチーフまたはｐＩｇＲ結合ペプチド配列の同定は、ＩｇＡのモノ
マー全体またはポリマーを用いる複雑性を減少して、粘膜上皮への標的化された
送達系を提供する。治療化合物のこの領域への送達によって、身体が、感染、疾
患または状態の発症を予防、阻害、または減少させる能力が増強されることによ
って予防的および治療的な利益を付与する。本発明は、ｐＩｇＲ結合ドメインを
用いて粘膜上皮へ化合物を一般的に標的化すること、および粘膜上皮内での特定
の作用部位へと化合物をさらに特異的に標的化することの両方を包含する。特異
的な標的化は、タンパク質同士の特異的な相互作用に関与する配列を利用する他
の標的化機構（例えば、抗原−抗体相互作用またはリガンド−レセプター会合）
の使用を通じて達成される。DESCRIPTION OF ILLUSTRATIVE EMBODIMENTS The present invention relates to compositions and methods using sequences (IgA sequences). This sequence targets pIgR for delivery of therapeutic compounds to mucosal surfaces. Identification of the IgA pIgR binding motif or pIgR binding peptide sequence provides a targeted delivery system to the mucosal epithelium with reduced complexity using whole IgA monomers or polymers. Delivery of a therapeutic compound to this area confers prophylactic and therapeutic benefits by enhancing the body's ability to prevent, inhibit or reduce the development of an infection, disease or condition. The present invention encompasses both the general targeting of compounds to mucosal epithelium using the pIgR binding domain and the more specific targeting of compounds to specific sites of action within mucosal epithelium. . Specific targeting is another targeting mechanism that utilizes sequences involved in specific interactions between proteins (eg, antigen-antibody interactions or ligand-receptor associations).
Achieved through the use of

【００２３】 （１．治療的使用） 身体の粘膜表面は、環境との境界として作用する。それらは、外的病原体、お
よび結果として、これらの表面を一般的に含む感染に対して暴露された身体の最
大の領域を構成する（Ｃｈｉｌｄｅｒｓら、１９８９）。主な粘膜抗体は、Ｉｇ
Ａであり、これは、免疫防禦、特に微生物、毒素および他の抗原に対する最初の
線を形成すると考えられる。1. Therapeutic Use The mucosal surface of the body acts as a boundary with the environment. They constitute the largest area of the body exposed to foreign pathogens and, consequently, infections that generally include these surfaces (Childers et al., 1989). The main mucosal antibody is Ig
A, which is thought to form the first line of defense against immune, especially microorganisms, toxins and other antigens.

【００２４】 （Ａ．ＩｇＡ抗体） 本発明は、ＩｇＡ抗体からの配列を含む。この配列は、ＩｇＡのＣαＡドメイ
ン内の配列のように、ＩｇＡのｐＩｇＲへの結合を媒介する。本発明のさらなる
実施形態において、ＩｇＡ抗体からの他の抗体が使用され、例えば、免疫応答を
惹起するために必要とされる配列があり、抗原特異性を媒介する配列を含み得る
。これらのＩｇＡ配列は、予防的または治療的な化合物とともにさらなる実施形
態において利用され得る。これは、ＩｇＡのｐＩｇＲ結合ドメインを介して粘膜
上皮に対して指向される。A. IgA Antibodies The present invention includes sequences from IgA antibodies. This sequence mediates the binding of IgA to pIgR, as does a sequence in the IgA CαA domain. In further embodiments of the invention, other antibodies from IgA antibodies are used, for example, those sequences required to elicit an immune response and may include sequences that mediate antigen specificity. These IgA sequences may be utilized in further embodiments with prophylactic or therapeutic compounds. It is directed to the mucosal epithelium via the IgA binding domain of IgA.

【００２５】 ＩｇＡ抗体は、概して、大量に産生され、そしてＩｇＡは、それらが粘膜分泌
物内に放出される前に粘膜内の血漿細胞によって局所的に製造される。それらは
、呼吸器管、食道管、眼、胃腸管、尿管および生殖管に配置され、ならびに唾液
、血清、涙および初乳において存在する。[0025] IgA antibodies are generally produced in large quantities, and IgA is produced locally by plasma cells within the mucosa before they are released into mucosal secretions. They are located in the respiratory tract, esophagus tract, eyes, gastrointestinal tract, ureters and genital tract, and are present in saliva, serum, tears and colostrum.

【００２６】 ＩｇＡは、ＩｇＧと同様に、３つの定常ドメイン（Ｃα１、Ｃα２、Ｃα３）
を、Ｃα１ドメインとＣα２ドメインとを接触するヒンジ領域とともに含む。し
かし、ＩｇＧとは異なり、ＩｇＡのアイソタイプは、ＣＨ３のＣ末端に配置され
る１８残基の「テイル片」を有する。これは、ＩｇＡポリマーが形成されること
を可能にする（Ｐｕｔｎａｍら、１９７９）。さらに、「Ｊ鎖」と呼ばれる小さ
な糖タンパク質が、２つのテイル片システイン残基とともにジスルフィド結合を
形成するが、そのテイル片は、互いに直接ジスルフィド結合を形成する（Ｇａｒ
ｃｉａ−Ｐａｒｄｏら、１９８１；Ｂａｓｔｉａｎ、ら、１９９２）。Ｊ鎖は、
重合化をより効率よくさせることによって血清ＩｇＡダイマー形成を媒介する（
Ｚｉｋａｎら、１９８６）が、絶対に必要というわけではない（Ｈｅｎｄｒｉｃ
ｋｓｏｎ、ら、１９９５）。IgA, like IgG, has three constant domains (Cα1, Cα2, Cα3)
With a hinge region that contacts the Cα1 and Cα2 domains. However, unlike IgG, the IgA isotype has an 18-residue “tail piece” located at the C-terminus of CH3. This allows an IgA polymer to be formed (Putnam et al., 1979). In addition, a small glycoprotein called the "J chain" forms a disulfide bond with two tail piece cysteine residues, which tail pieces form disulfide bonds directly with each other (Gar
cia-Pardo et al., 1981; Bastian, et al., 1992). The J chain
Mediates serum IgA dimer formation by making polymerization more efficient (
Zikan et al., 1986) are not absolutely necessary (Hendric
kson, et al., 1995).

【００２７】 ＩｇＡは、粘膜上皮の基礎をなす血漿細胞から、サブユニット間Ｊ鎖によって
結合されるダイマーとして主に分泌される。ここで、各々のＩｇＡは、２つの同
一の軽鎖、およびその特異性を与える２つの同一の重鎖から構成される。ＩｇＡ
ダイマーは、粘膜上皮の基底外側表面における重合性イムノグロブリンレセプタ
ー（ｐＩｇＲ）に対して結合する。外側のＩｇＡ結合ドメインを通じて、ｐＩｇ
Ｒ−ＩｇＡ複合体は、ｐＩｇＲドメインＩの高親和性の非共有結合によって形成
され （Ｆｒｕｔｉｇｅｒら、１９８６；Ｂａｋｏｓ ら、１９９１）、そして
この複合体は、続いて、エンドサイトーシスされる。ｐＩｇＲの細胞質ドメイン
は、ソーティングシグナルを含み、このシグナルは、その複合体がベシクルを介
して先端表面へとトランスサイトーシスされることを引き起こす。ここで、タン
パク質分解による開裂によって、ｐＩｇＲの外側部分（「分泌成分」と呼ばれる
）が分離する（Ｌｉｎｄｈら、１９７４；Ｆａｌｌｇｒｅｎｎ−Ｇｅｂａｕｅｒ
ら、１９９３；Ｕｎｄｅｒｄｏｗｎ ら、１９７７）。結果として、ダイマーＩ
ｇＡ分泌性成分複合体（「分泌製ＩｇＡ」またはｓＩｇＡと称する）は、粘膜分
泌物へと放出される（Ｕｎｄｅｒｄｏｗｎら、１９７７）。[0027] IgA is mainly secreted from plasma cells underlying mucosal epithelium as dimers that are bound by J chains between subunits. Here, each IgA is composed of two identical light chains and two identical heavy chains that confer its specificity. IgA
Dimers bind to the polymerizable immunoglobulin receptor (pIgR) on the basolateral surface of the mucosal epithelium. Through the outer IgA binding domain, pIg
The R-IgA complex is formed by the high affinity non-covalent association of pIgR domain I (Frutiger et al., 1986; Bakos et al., 1991), and the complex is subsequently endocytosed. The cytoplasmic domain of pIgR contains a sorting signal, which causes the complex to be transcytosed through the vesicles to the tip surface. Here, proteolytic cleavage separates the outer part of the pIgR (called the “secretory component”) (Lindh et al., 1974; Fallgrenn-Gebauer).
Et al., 1993; Underdown et al., 1977). As a result, dimer I
The gA secretory component complex (referred to as "secreted IgA" or sIgA) is released into mucosal secretions (Underdown et al., 1977).

【００２８】 重合性イムノグロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）は、Ｉ型膜貫通タンパク質で
あって、細胞外領域を構成する５つのイムノグロブリンスーパーファミリー相同
性ドメイン（Ｉ−Ｖ）を伴う （Ｍｏｓｔｏｖら、１９８４）。重合性イムノグ
ロブリンであるＩｇＡおよびＩｇＭは、粘膜上皮細胞の基底外側表面においてｐ
ＩｇＲによって結合し、これらの細胞を通じて輸送され、次いで粘膜へと分泌さ
れる（Ｍｏｓｔｏｖら、１９８２）。The polymerizable immunoglobulin receptor (pIgR) is a type I transmembrane protein with five immunoglobulin superfamily homology domains (IV) that make up the extracellular region (Mostov et al., 1984). . IgA and IgM, which are polymerizable immunoglobulins, are found on the basolateral surface of mucosal epithelial cells.
It is bound by IgR, transported through these cells, and then secreted into the mucous membrane (mostov et al., 1982).

【００２９】 かなりのことがＩｇＡおよびｐＩｇＲの高分子相互作用および活性について知
られているが、分子スケールにおけるその相互作用の必要性については比較的殆
ど知られていない。While much is known about the macromolecular interactions and activities of IgA and pIgR, relatively little is known about the need for that interaction on a molecular scale.

【００３０】 本発明によれば、ｐＩｇＲ結合を媒介するＩｇＡの領域が同定された。ＩｇＡ
のｐＩｇＲに対する主要な結合モチーフは、Ｃα３ドメイン、特にアミノ酸４０
２−４１０に局在化されており、これは、Ｃα３ドメインの予測された暴露され
たループの部分を形成する。ｐＩｇＲ結合ドメインは、アミノ酸４０２〜４１０
の任意の部分自体、または他のｐＩｇＲ結合配列（ＩｇＡ配列）との組合せを含
み得、そして標的化ペプチドとして利用されて粘膜上皮へ化合物を補充し得る。
さらに、ＩｇＡに由来しないｐＩｇＲ結合を媒介する配列もまた、ｐＩｇＲ結合
ドメイン、従って、本発明の部分であると考えられる。従って、ｐＩｇＲ結合ド
メインおよび選択された薬剤を含む複合体が本発明によって意図される。ｐＩｇ
Ｒ結合ドメインおよび治療的／予防的な化合物は、モノマーまたはポリマーのい
ずれかとして（コンカテマーを含む）、粘膜上皮の基底膜に配置されるｐＩｇＲ
へと結合し、そして集合的にエンドサイトーシスされ得る。次いで、この複合体
は、それが先端膜に達するまでトランスサイトーシスされ、そこで、ｐＩｇＲの
分泌性成分が標的化ペプチドおよびその治療的／予防的化合物で切断される。一
旦分泌されると、治療的化合物は、以下に議論されるように種々の機能について
利用され得る。これには、病原体によって生じる疾患または状態の予防；疾患状
態、状態または障害（ガンを含む）の減少または改善；およびワクチン摂取を介
した粘膜免疫。According to the present invention, regions of IgA that mediate pIgR binding have been identified. IgA
The major binding motif for pIgR is the Cα3 domain, particularly amino acid 40
Localized at 2-410, which forms part of the predicted exposed loop of the Cα3 domain. The pIgR binding domain comprises amino acids 402-410
Can include itself or in combination with other pIgR binding sequences (IgA sequences) and can be utilized as a targeting peptide to recruit compounds to the mucosal epithelium.
In addition, sequences that mediate pIgR binding that are not derived from IgA are also considered to be part of the pIgR binding domain and, therefore, the present invention. Thus, complexes comprising the pIgR binding domain and the selected agent are contemplated by the present invention. pIg
The R-binding domain and the therapeutic / prophylactic compound are located in the basement membrane of mucosal epithelium, either as monomers or polymers (including concatemers).
And can be collectively endocytosed. This complex is then transcytosed until it reaches the apical membrane, where the secretory component of pIgR is cleaved with the targeting peptide and its therapeutic / prophylactic compound. Once secreted, the therapeutic compound may be utilized for various functions, as discussed below. This includes the prevention of a disease or condition caused by a pathogen; the reduction or amelioration of a disease state, condition or disorder (including cancer); and mucosal immunity through vaccination.

【００３１】 身体の粘膜表面は、すでに起こった感染に対して応答することではなく、粘膜
表面における免疫学的応答が感染因子が身体に侵入することを防ぐという点にお
いて、疾患の免疫学的予防または阻害の部位として血清よりも重要な利点を提供
する。そのような予防的方法は、本開示によって提供されるように、性感染病お
よびそれらの疾患の誕生の際の母子感染の予防におけるのみならず、生殖管、口
、鼻腔、肺、眼などのような粘膜表面を通して身体に侵入する他の感染の予防に
おいても、ヒトおよび家庭向けまたは非家庭向け動物において、劇的な利点であ
る。さらに、粘膜上皮へのアクセスは、粘膜上皮に近位する多くの疾患、状態、
または障害を処置する方法を提供し、これは、それらが必要とする部位に予防的
または治療的化合物を到達させるための経路を提供することによる。The mucosal surface of the body does not respond to an already occurring infection, but the immunological prevention of the disease in that the immunological response at the mucosal surface prevents infectious agents from entering the body. Or it offers significant advantages over serum as a site of inhibition. Such prophylactic methods, as provided by the present disclosure, include not only in the prevention of sexually transmitted diseases and mother-to-child transmission during the birth of those diseases, but also in the genital tract, mouth, nasal cavity, lungs, eyes, etc. It is also a dramatic advantage in humans and domestic or non-home animals in the prevention of other infections that enter the body through various mucosal surfaces. In addition, access to the mucosal epithelium is dependent on many diseases, conditions,
Or a method of treating a disorder, by providing a route to reach a prophylactic or therapeutic compound at the site where they are needed.

【００３２】 この標的化は、ＩｇＡの標的化配列を使用することによって達成される。この
ＩｇＡは、重合性イムノグロブリンレセプター（ｐＩｇＲ）とのその相互作用を
媒介することに関与する。このｐＩｇＲは、粘膜分泌物におけるその放出のため
に基底粘膜上皮からＩｇＡをシャトルする。本発明は、この標的化機能を担うＩ
ｇＡ内のドメインを本発明者らが同定したことを利用しようとする。従って、Ｉ
ｇＡ標的化配列を利用して、疾患、状態または障害の処置のために粘膜上皮へと
予防的および治療的な化合物をシャトルし得る。さらに、本発明は、ＩｇＡのｐ
ＩｇＲへの結合活性を模倣するペプチド配列を使用して、その結果、それらの配
列が以前に記載された送達シャトル系として使用され得ることを包含する。This targeting is achieved by using IgA targeting sequences. This IgA is involved in mediating its interaction with the polymerizable immunoglobulin receptor (pIgR). This pIgR shuttles IgA from the basal mucosal epithelium due to its release in mucosal secretions. The present invention provides I
We attempt to take advantage of what we have identified domains within gA. Therefore, I
The gA targeting sequence can be used to shuttle prophylactic and therapeutic compounds into the mucosal epithelium for treatment of a disease, condition or disorder. In addition, the present invention provides a pA of IgA.
Including the use of peptide sequences that mimic the binding activity to IgR, so that those sequences can be used as the previously described delivery shuttle systems.

【００３３】 当業者に理解されるように、小さな改変および変更は、ｐＩｇＲを結合するド
メインの構造内に作製され得る。これは、ＩｇＡからの配列よりもｐＩｇＲにつ
いて大きな結合親和性を付与するような変更を含む。As will be appreciated by those skilled in the art, small modifications and alterations can be made in the structure of the domain that binds pIgR. This includes changes that confer greater binding affinity for pIgR than for sequences from IgA.

【００３４】 さらに、特定のアミノ酸は、ｐＩｇＲとの相互作用結合能力の認識し得る欠失
を伴わずに、タンパク質構造において他のアミノ酸へと置換され得る。そのタン
パク質の生物学的機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能力および性質
であることから、特定のアミノ酸配列置換がタンパク質配列（または糖全、その
もととなるＤＮＡコード配列）において作製され得、そしてそれでもなお、類似
の（アゴニスト様）特性を有するタンパク質を得ることができる。従って、本発
明者らによって意図されるのは、種々の変更がその生物学的有用性または活性の
認識し得る欠失を伴わずに治療的またはＩｇＡのｐＩｇＲ結合配列、または予防
的化合物、ポリペプチドまたはペプチド（またはそのもととなるＤＮＡ）におい
てなされ得る。In addition, certain amino acids can be substituted for other amino acids in the protein structure without a recognizable deletion of the ability to interact with pIgR. Specific amino acid sequence substitutions are made in the protein sequence (or the entire sugar, the DNA coding sequence from which it is derived) because the ability to interact with the protein determines the biological functional activity of the protein. And still obtain proteins with similar (agonist-like) properties. Thus, it is contemplated by the inventors that various alterations may be made without recognizable deletions of their biological utility or activity, such as therapeutic or IgA pIgR binding sequences, or prophylactic compounds, This can be done in the peptide or peptide (or the DNA from which it is derived).

【００３５】 本発明において、ｐＩｇＲ結合に必要であることが示されている残基は、概し
て、保存的アミノ酸に置換されるべきか、または全く変化されないべきである（
例えば、ＩｇＡの２つの隣接するβ鎖配列の間のループを構成する領域に位置す
る残基の群）。暴露されるループのアラニン置換をＬ１およびＬ３へ導入すると
、ｐＩｇＲ結合が消失する。なぜなら、それらは、ＩｇＡの主要な結合ドメイン
であるからである。In the present invention, residues indicated to be required for pIgR binding generally should be replaced with conservative amino acids or not changed at all (
For example, a group of residues located in a region that constitutes a loop between two adjacent β-chain sequences of IgA). Introducing an alanine substitution of the exposed loop into L1 and L3 abolishes pIgR binding. Because they are the major binding domains of IgA.

【００３６】 アミノ酸置換は、概して、アミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性に基づく。例
えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさなど。アミノ酸側鎖の置換の大きさ、
形状、および型の分析によって、アルギニン、リジン、およびヒスチジンはすべ
て、正に荷電した残基であり；アラニン、グリシン、およびセリンはすべて、類
似の大きさであり；そしてフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン
はすべて、概して類似の形状を有する。従って、これらの考慮事項に基づいて、
以下のサブセットが、本明細書において、生物学的に機能等価であると定義され
る：アルギニン、リジン、およびヒスチジン；アラニン、グリシン、およびセリ
ン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン。[0036] Amino acid substitutions are generally based on the relative similarity of the amino acid side-chain substituents. For example, its hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc. The size of the amino acid side chain substitution,
By shape and type analysis, arginine, lysine, and histidine are all positively charged residues; alanine, glycine, and serine are all of similar size; and phenylalanine, tryptophan, and tyrosine are all All generally have similar shapes. Therefore, based on these considerations,
The following subsets are defined herein as biologically functionally equivalent: arginine, lysine, and histidine; alanine, glycine, and serine; and phenylalanine, tryptophan, and tyrosine.

【００３７】 より定量的な変化を行うために、アミノ酸の疎水性親水性指数がその疎水性お
よび電荷特徴に基づいて疎水性親水性指数が与えられている。これらは：イソロ
イシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルア
ラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．
９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）
；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；
プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；
グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．
５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。To make more quantitative changes, the hydropathic index of amino acids has been given a hydropathic index based on its hydrophobicity and charge characteristics. These are: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1.
9); alanine (+1.8); glycine (-0.4); threonine (-0.7)
Serine (-0.8); tryptophan (-0.9); tyrosine (-1.3);
Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamic acid (-3.5);
Glutamine (-3.5); Aspartic acid (-3.5); Asparagine (-3.
5); lysine (-3.9); and arginine (-4.5).

【００３８】 タンパク質に対して相互作用生物学的機能を付与するにおける疎水性親水性ア
ミノ酸指数の重要性は、概して、当該分野において理解されている（Ｋｙｔｅ
＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、本明細書において参考として援用される）
。特定のアミノ酸は、類似の親水性疎水性指数またはスコアを有する他のアミノ
酸に取って代わられ得、なおも、類似の生物学的活性を保持し得る。親水性疎水
性指数に基づいて変化を行う際に、その親水性疎水性指数が＋２未満のアミノ酸
の置換が好ましく、１以内であるものが特に好ましく、そして０．５以内である
ものがさらにより特に好ましい。The importance of the hydrophobic hydrophilic amino acid index in conferring interactive biological function on a protein is generally understood in the art (Kyte
& Doolittle, 1982, incorporated herein by reference)
. Certain amino acids may be replaced by other amino acids having a similar hydrophilicity / hydrophobicity index or score and still retain similar biological activity. In making a change based on the hydrophilicity / hydrophobicity index, substitution of amino acids whose hydrophilicity / hydrophobicity index is less than +2 is preferred, those with 1 or less are particularly preferred, and those with 0.5 or less are even more preferred. Particularly preferred.

【００３９】 また、類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて有効に行われ得ることが理解
される。特に、それによって作製されたその生物学的に等価なタンパク質または
ペプチドは、本事例におけるように、免疫学的実施形態において使用するに意図
される。米国特許第４，５５４，１０１号（本明細書において参考として援用さ
れる）は、タンパク質の局所的平均親水性疎水性の最大値（その隣接するアミノ
酸の親水性によって支配される）は、その免疫原性および抗原性（すなわち、本
発明の生物学的特性）と相関すると述べている。It is also understood that substitution of similar amino acids can be effectively performed based on hydrophilicity. In particular, the bioequivalent protein or peptide produced thereby is intended for use in immunological embodiments, as in the present case. U.S. Pat. No. 4,554,101, incorporated herein by reference, states that the maximum value of the local average hydrophilic hydrophobicity of a protein, governed by the hydrophilicity of its adjacent amino acids, is not It is said to correlate with immunogenicity and antigenicity (ie, the biological properties of the invention).

【００４０】 米国特許第４，５５４，１０１号において詳説されるように、以下の親水性値
がアミノ酸残基へと割り当てられる：１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セ
リン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリ
シン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５ ＋ １）；アラニ
ン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニ
ン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（
−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプト
ファン（−３．４）。As detailed in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity values are assigned to amino acid residues: 1); glutamic acid (+ 3.0 ± 1); serine (+0.3 ); Asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (-0.4); proline (-0.5 + 1); alanine (-0.5); histidine (-). Cysteine (-1.0); methionine (-1.3); valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (
-1.8); tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); tryptophan (-3.4).

【００４１】 類似の親水性値に基づいて変化を作製する際において、親水性値が±２以内の
置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、そして±０．５であるものが
さらにより特に好ましい。In making changes based on similar hydrophilicity values, substitutions with a hydrophilicity value within ± 2 are preferred, those with a hydrophilicity value within ± 1 are particularly preferred, and those with ± 0.5 are even more preferred. Particularly preferred.

【００４２】 「ペプチド模倣物のような非ペプチド構造を使用して、ｐＩｇＲ結合ドメイン
構造内の特定の構造および接触点を複製し得ること、それによって、ｐＩｇＲに
結合するそれゆえ標的化するその能力を二倍にすることが意図される。“A non-peptide structure such as a peptidomimetic can be used to replicate specific structures and contact points within the pIgR binding domain structure, thereby binding to the pIgR and therefore its ability to target Is intended to be doubled.

【００４３】 （Ｂ．処置使用） 本発明を使用して、上皮を含む任意の疾患、病気または状態を予防または闘い
得る。これは、粘膜上皮にアクセス可能な任意の疾患、病気または状態を包含す
る。本明細書に記載される効果は、粘膜上皮細胞内で、ならびに、粘膜分泌物ま
たは内腔において、本発明の化合物が粘膜上皮へと横切った後に達成され得る。
本発明は、粘膜上皮の処置を包含する。これは、呼吸器、鼻食道、眼、消化器官
、尿管および生殖管を包含するが、それらに限定されない。 呼吸器管において
、本発明は、以下の処置を包含するがそれらに限定されない：喘息；気管支炎；
気腫；嚢胞性線維症；気管支拡張；細気管支炎；肺気腫；ウイルス性気管気管支
炎；睡眠無呼吸症候群；感染疾患（例えば、細菌性肺炎、マイコプラズマ肺炎、
インフルエンザ、結核、地方真菌性肺炎、および侵襲性アスペルギルス症）；新
生物状態（例えば、肺癌、ガン腫およびリンパ腫）；非感染性疾患、非新生物性
疾患（例えば、レフラー症候群、熱帯性肺好酸球増加、サルコイドーシス、肺線
維症、キャプラン症候群、ヴァーグナー肉芽腫症、気管支性嚢胞；脊柱後側弯症
、神経筋肉症候群、拡散実質肺疾患のような胸壁の障害；ならびに他の慢性拡散
浸潤肺疾患。B. Therapeutic Uses The present invention can be used to prevent or combat any disease, illness or condition involving the epithelium. This includes any disease, illness or condition that has access to the mucosal epithelium. The effects described herein can be achieved in mucosal epithelial cells, as well as in mucosal secretions or lumens, after a compound of the invention has crossed into the mucosal epithelium.
The invention includes the treatment of mucosal epithelium. This includes, but is not limited to, the respiratory tract, nasal esophagus, eyes, digestive tract, ureter and genital tract. In the respiratory tract, the invention includes but is not limited to the following treatments: asthma; bronchitis;
Emphysema; cystic fibrosis; bronchiectasis; bronchiolitis; emphysema; viral tracheobronchitis; sleep apnea syndrome; infectious diseases (eg, bacterial pneumonia, mycoplasma pneumonia,
Influenza, tuberculosis, local fungal pneumonia, and invasive aspergillosis); neoplastic conditions (eg, lung cancer, carcinoma and lymphoma); non-infectious diseases, non-neoplastic diseases (eg, Leffler syndrome, Eosinophilia, sarcoidosis, pulmonary fibrosis, Caplan syndrome, Wagner granulomatosis, bronchial cyst; disorders of the chest wall such as kyphoscoliosis, neuromuscular syndrome, diffuse parenchymal lung disease; and other chronic diffusely infiltrating lung diseases .

【００４４】 本発明はまた、鼻食道および胃腸の障害の処置にも関する。これらの障害とし
ては、いかが挙げられるがそれらに限定されない：嚥下障害；消化性潰瘍；下痢
疾患；炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性腸炎およびクローン病）；急性膵炎、胆石
および胆汁管疾患；急性肝炎；慢性肝炎；肝硬変；とりわけ潰瘍、粘膜侵食性疾
患、悪性疾患、結腸憩室症、結腸炎、および出血によって生じる胃腸出血；吸収
不良および消化不良の疾患；胃腸移動障害；ならびに憩室症、憩室炎、および虫
垂炎。The present invention also relates to the treatment of nasoesophageal and gastrointestinal disorders. These disorders include, but are not limited to: dysphagia; peptic ulcer; diarrheal disease; inflammatory bowel disease (eg, ulcerative colitis and Crohn's disease); acute pancreatitis, gallstone and bile duct disease; acute Hepatitis; Chronic hepatitis; Cirrhosis; Gastrointestinal bleeding caused by ulcers, mucosal erosive disease, malignancy, colon diverticulosis, colitis, and bleeding; Absorptive and dyspepsia diseases; , And appendicitis.

【００４５】 さらなる実施形態において、本発明はまた、以下を含む尿生殖管障害および状
態の処置に関する：水およびナトリウムの非平衡の腎障害；酸塩基およびカリウ
ムの平衡の障害；糸球体疾患；全身性血管炎；尿細管間質性疾患；多発性嚢胞腎
疾患；アルポート症候群；間質性嚢胞性疾患；腎石症；過剰増殖疾患（例えば、
新生物および悪性疾患）；性感染病（例えば、ＡＩＤＳ、肝炎、性器いぼ；ヘル
ペス，淋病、梅毒およびクラミジア。In a further embodiment, the present invention also relates to the treatment of genitourinary tract disorders and conditions, including: renal disorders in water and sodium imbalance; disorders in acid base and potassium balance; glomerular diseases; Cystic vasculitis; tubular interstitial disease; polycystic kidney disease; Alport syndrome; interstitial cystic disease; nephrolithiasis;
Neoplasms and malignancies); sexually transmitted diseases (eg, AIDS, hepatitis, genital warts; herpes, gonorrhea, syphilis and chlamydia).

【００４６】 本発明によって意図されるものはまた、細胞過剰増殖を含む疾患および障害の
処置である。これらには、例えば、以下が挙げられる：悪性疾患、前悪性状態（
過形成、化生、形成異常）、良性腫瘍、過剰増殖障害、および良性増殖機能不全
（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害）。本発明は、さらに、以下に由来
する前癌細胞および腫瘍の処置を包含する：膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸（乳
房）、結腸、食道、胃腸、頭、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮
膚、胃、および子宮。[0046] Also contemplated by the present invention are the treatment of diseases and disorders involving cell hyperproliferation. These include, for example: malignant diseases, pre-malignant conditions (
Hyperplasia, metaplasia, dysplasia), benign tumors, hyperproliferative disorders, and dysproliferative disorders). The invention further encompasses treatment of precancerous cells and tumors derived from: bladder, blood, bone, bone marrow, brain, breast (breast), colon, esophagus, gastrointestinal, head, kidney, liver, lung, Nasopharynx, neck, ovaries, prostate, skin, stomach, and uterus.

【００４７】 （Ｃ．病原体防禦） 本発明の別の実施形態は、粘膜上皮へ治療的／予防的な化合物を送達して、病
原体感染を予防または阻害する標的化剤の使用である。本発明は、治療化合物お
よび方法に加えて、受動免疫および能動免疫の生成を意図する。１つの作動様式
は、特定の病原体に対する感染を予防または阻害するための、その特定の病原体
に対する特異的なｄＩｇＡを含む。C. Pathogen Protection Another embodiment of the present invention is the use of targeting agents that deliver therapeutic / prophylactic compounds to mucosal epithelia to prevent or inhibit pathogen infection. The present invention contemplates the generation of passive and active immunity, in addition to therapeutic compounds and methods. One mode of operation involves specific dIgA against a particular pathogen to prevent or inhibit infection against that particular pathogen.

【００４８】 本発明の組成物は、動物またはヒトのような被験体に投与され、そして続いて
、２４時間までの潜在性の気管の後、粘膜バリアを横切って輸送される。粘膜へ
の能動輸送または受動輸送の後、本発明の抗体は、その部位において感染を阻害
するのに利用可能である。これが受動免疫の方法であることから、抗体の血清半
減期に基づいて、数週間の期間にわたり、保護が続き得、そしてその組成物が必
要性がある場合、再度投与され得ることが理解される。従って、本発明は、身体
への侵入の前に感染を阻害する方法を提供し、これは、特定の病原体への暴露の
前の防禦の第一の線を提供する。被験体に感染することから阻害され得る病原体
は、以下を含むがそれらに限定されない：ウイルス、細菌、および肉眼でみえる
寄生動物（原生動物）。The compositions of the present invention are administered to a subject, such as an animal or a human, and are subsequently transported across the mucosal barrier after a latent trachea of up to 24 hours. After active or passive transport to the mucosa, the antibodies of the invention can be used to inhibit infection at that site. Because this is a method of passive immunization, it is understood that protection can continue over a period of several weeks, based on the serum half-life of the antibody, and can be re-administered if the composition is needed. . Thus, the present invention provides a method of inhibiting infection prior to entry into the body, which provides a first line of defense before exposure to a particular pathogen. Pathogens that can be inhibited from infecting a subject include, but are not limited to, viruses, bacteria, and macroscopic parasites (protozoa).

【００４９】 従って、本発明は、以下の病原体ウイルス（これは例示の目的で言及する）の
ような粘膜表面を介して身体に侵入し得るかまたは出得る）のウイルス疾患の予
防および処置における適用を有する：インフルエンザＡ、ＢおよびＣ、パライン
フルエンザ、パラミクソウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ＲＳウイルス
、麻疹、流行性耳下腺炎、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイル
ス、エプスタイン−バーウイルス、リノウイルス、コクサッキーウイルス、エコ
ーウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎、コロナウ
イルス、ポリオウイルス、単純ヘルペス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロ
ウイルス、パピローマウイルス、ウイルスＢ、水痘‐帯状疱疹、天然痘ウイルス
、風疹、狂犬病、ピコルナウイルス、ロタウイルス、およびカポージ関連ヘルペ
スウイルス。Accordingly, the present invention has application in the prevention and treatment of viral diseases of the following pathogen viruses, which can enter or exit the body via mucosal surfaces, such as those mentioned for illustrative purposes: Having: influenza A, B and C, parainfluenza, paramyxovirus, Newcastle disease virus, RS virus, measles, mumps, adenovirus, adeno-associated virus, parvovirus, Epstein-Barr virus, Reno Virus, coxsackievirus, echovirus, reovirus, rhabdovirus, lymphocytic choriomeningitis, coronavirus, poliovirus, herpes simplex, human immunodeficiency virus, cytomegalovirus, papillomavirus, virus B, varicella-zoster, Smallpox virus, rubella, Rabies, picornavirus, rotavirus, and caposi-associated herpesvirus.

【００５０】 上記のウイルス疾患に加え、本発明はまた、以下を含むがそれらに限定されな
い細菌感染の予防、阻害または処置において有用である：８３以上の異なる血清
型のｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、以下のようなｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ：Ｓ
．ｐｙｏｇｅｎｅ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉ、Ｓ．ｃａｎｉ、
Ｓ．ｂｏｖｉ、Ｓ．ｅｑｕｉｎｕ、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉ、
Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕ、Ｓ．ｍｉｔｉ、Ｓ．ｍｕｔａｎ、他のｖｉｒｉｄａｎ
ｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、他
の関連する種のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；以下のようなｅｎｔｅｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕ
ｓｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ）（特に鼻咽頭）；Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；以下
の種のｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｍａｌｌｅｉ；以下のようなｂｒｕｃｅｌｌａ：Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅ
ｌｉｔｅｎｓｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕ
、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌ
ｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈ
ｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎ、Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｑｕｉ、など
；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ、Ｎｏｃｏｒｄｉａ ａｓｔｅ
ｒｏｉｄｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ種、Ｔｒ
ｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓａ種および関連す
る生物。本発明はまた、以下のようなグラム陰性に対しても有用であり得る：Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ、Ｐｒｏｔｅｕ、Ｓｅｒｒａｔｉａ種、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｙｅｒ
ｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉ、Ｅｎ
ｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ およびＬｅｇｉｏｎｅｌｌ
ａ種など。さらに、本発明は、以下のような原生動物および肉眼的感染を制御す
るにおいて有用であると判明し得る：Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｉｓｏ
ｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏ
ｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ種（例えば）、およびＣ
ｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよび他のＣｈｌａｍｙｄｉａ感染
について（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、またはＣｈｌａｍ
ｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（例えば）。当然、本発明は、有効な抗体が
作製され得る任意の病原体に対して使用され得ることが理解される。本開示に照
らし、当業者は、そのような任意の病原体と免疫反応性である二量対ＩｇＡ抗体
の組成物を生産し得、そして被験体にそのような組成物を投与し得る。In addition to the above viral diseases, the present invention is also useful in the prevention, inhibition or treatment of bacterial infections, including but not limited to: 83 or more different serotypes of pneumococcus, streptococcus such as : S
. pyogene, S.A. agalactiae, S.A. equi, S.E. cani,
S. bovi, S.M. equinu, S.E. anginosu, S .; sangui,
S. salivariu, S.M. miti, S.M. mutan, other viridan
s streptococcus, peptostreptococcus, streptococcus of other related species; enterococcus as follows
cus: Enterococcus faecalus, Enterococcu
sfaecium, Staphylococcus (eg, Staphylo)
coccus epidermidi, Staphylococcus aur
eus) (especially the nasopharynx); Hemophilus influenzae; pseudomonas of the following species: Pseudomonas aeruginos
a, Pseudomonas pseudomallei, Pseudomon
as mallei; Brucella as follows: Brucella me
littensi, Brucella sui, Brucella abortu
, Bordetella pertussi, Neisseria menin
gitidi, Neisseria gonorrhoeae, Moraxel
la catarrhali, Corynebacterium diphth
eriaia, Corynebacterium ulceran, Coryne
bacterium pseudotuberculosis, Coryneba
cterium pseudodiphtheriticum, Coryneb
acterium urealyticum, Corynebacterium
hemolyticum, Corynebacterium equi, etc .; Listeria monocytogene, Nocordia aste
rode, Bacteroides species, Actinomycetes species, Tr
eponema pallidum, Leptospirosa species and related organisms. The present invention may also be useful for Gram negatives such as:
lessiella pneumoniae, Escherichia col
i, Proteu, Serratia species, Acinetobacter, Yer
sinia pesti, Francisella tularensi, En
terobacter species, Bacteriodes and Legionell
a kind. In addition, the present invention may prove useful in controlling protozoa and gross infections such as: Cryptosporidium, Iso
spora belli, Toxoplasma gondii, Tricho
monas vaginali, Cyclospora species (for example), and C
hlamydia trachomatis and other Chlamydia infections (eg, Chlamydia psittaci, or Chlamydia
ydia pneumoniae) (for example). Of course, it is understood that the present invention can be used against any pathogen for which effective antibodies can be made. In light of the present disclosure, one of skill in the art can produce a composition of dimeric versus IgA antibodies that is immunoreactive with any such pathogen, and can administer such a composition to a subject.

【００５１】 いくつかのグループが広汎なヒト病原体に対する保護的抗体としてのＩｇＡア
イソタイプの使用を報告した。これらには以下が挙げられる：以下のようなウイ
ルス：ＨＩＶ（Ｂｕｒｎｅｔｔら、１９９４）、インフルエンザＡ（Ｌｉｅｗら
、１９８４）、Ｓｅｎｄａｉ（Ｍａｎｚａｎｅｃら、１９８７）、およびＲＳウ
イルス（Ｗｅｌｔｚｉｎら、１９９４）；以下のような細菌：Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｍｉｃｈｅｔｔｉ、１９９２）、Ｖｉｂｒｉｏ
ｃｈｏｌｅｒａｅ（Ａｐｔｅｒら、１９９３、Ｗｉｎｎｅｒら、１９９１）、
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｃｏｔｔｅｒら、１９９５）；
細菌毒素、および肉眼的寄生動物（Ｇｒｚｙｃｈら、１９９３）。さらに、伝染
性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）に対して指向される抗原特異性を有する組
換え二量体ＩｇＡは、細胞株にトランスフェクトされたときに、顕著にＴＧＥＶ
産生を減少させた（Ｃａｓｔｉｌｌａら、１９９７）。[0051] Several groups have reported the use of IgA isotypes as protective antibodies against a wide range of human pathogens. These include: viruses such as: HIV (Burnett et al., 1994), influenza A (Liew et al., 1984), Sendai (Manzanec et al., 1987), and respiratory syncytial virus (Weltzin et al., 1994); Bacteria such as: Salmonel
la typhimurium (Michetti, 1992), Vibrio
cholerae (Apper et al., 1993, Winner et al., 1991),
Chlamydia trachomatis (Cotter et al., 1995);
Bacterial toxins, and gross parasites (Grzych et al., 1993). In addition, recombinant dimeric IgA with antigen specificity directed against infectious gastroenteritis coronavirus (TGEV), when transfected into a cell line, has a marked TGEV.
Production was reduced (Castilla et al., 1997).

【００５２】 （Ｄ．治療化合物） 本発明の標的化剤は、選択薬剤または化合物に対して作動可能に連結または付
着され得る。異なるおよび種々の治療化合物が例示される。これらには以下が挙
げられる：酵素、薬物（例えば、抗細菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤）、抗体領
域、蛋白質同士またはリガンド−レセプターの相互作用を媒介する領域、サイト
カイン、増殖因子、ホルモン、毒素、タンパク質をコードするポリヌクレオチド
、アンチセンス配列、放射性治療剤、化学療法剤、リボザイム、腫瘍サプレッサ
ー、転写因子、アポトーシスのインデューサー、または上記の任意のものを含む
リポソーム。精製された化合物の送達を含むことに加えて、本発明は、ポリペプ
チドのような同族化合物をコードする拡散の送達をさらに意図する。D. Therapeutic Compounds The targeting agents of the invention can be operably linked or attached to a selected agent or compound. Different and various therapeutic compounds are exemplified. These include: enzymes, drugs (eg, antibacterial, antifungal, antiviral), antibody domains, domains that mediate protein-protein or ligand-receptor interactions, cytokines, growth factors, hormones. A liposome comprising a toxin, a polynucleotide encoding a protein, an antisense sequence, a radiotherapeutic agent, a chemotherapeutic agent, a ribozyme, a tumor suppressor, a transcription factor, an inducer of apoptosis, or any of the above. In addition to including the delivery of purified compounds, the present invention further contemplates the delivery of diffusion that encodes cognate compounds such as polypeptides.

【００５３】 従って、本発明に従って、精製された化合物およびその化合物（例えば、サイ
トカイン）をコードする核酸配列の両方がが、ｐＩｇＲ結合ドメインとともに送
達され得る。Thus, according to the present invention, both a purified compound and a nucleic acid sequence encoding the compound (eg, a cytokine) can be delivered with a pIgR binding domain.

【００５４】 （１．酵素） 種々の酵素が本発明に従う標的である。ｐＩｇＲ結合ドメインに付着され得る
酵素は、シトシンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン−グ
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトース−１ホスフェートウリ
ジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコース−６
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ＨＳＶチミジンキナーゼおよびヒトチミジン
キナーゼならびに細胞外タンパク質（例えば、コラゲナーゼおよびマトリクスメ
タロプロテアーゼ）、リソソームグルコシダーゼ（ポーンプ病）、筋肉ホスホリ
ラーゼ （マッカードル症候群）、グルコセレボシダーゼ （ゴーシェ病）、α
−Ｌ−イズロニダーゼ（フルラー症候群）、Ｌ−イズロネートスルファターゼ（
ハンター症候群）、スフィンゴミエリナーゼ（ニーマン−ピック病）およびヘキ
ソサミナーゼ（テイサックス病）。(1. Enzymes) Various enzymes are targets according to the present invention. Enzymes that can be attached to the pIgR binding domain include cytosine deaminase, adenosine deaminase, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, galactose-1 phosphate uridyltransferase, phenylalanine hydroxylase, glucose-6
-Phosphate dehydrogenase, HSV thymidine kinase and human thymidine kinase and extracellular proteins (e.g., collagenase and matrix metalloproteases), lysosomal glucosidase (Pump's disease), muscle phosphorylase (McCardre's syndrome), glucocerebosidase (Gaucher disease), α
-L-iduronidase (Fuller syndrome), L-iduronate sulfatase (
Hunter syndrome), sphingomyelinase (Niemann-Pick disease) and hexosaminase (Teysach's disease).

【００５５】 （２．薬物） 本発明に従って、薬物は、ｐＩｇＲ結合ドメインに作動可能に連結されて、そ
の薬物を粘膜上皮へと送達し得る。代謝拮抗剤（例えば、プリンアナログ、ピリ
ミジンアナログ、葉酸アナログ）、酵素インヒビター、代謝産物、または抗生物
質（例えば、マイトマイシン）が本発明において有用であることが意図される。2. Drugs In accordance with the present invention, a drug can be operably linked to the pIgR binding domain to deliver the drug to mucosal epithelium. Antimetabolites (eg, purine analogs, pyrimidine analogs, folate analogs), enzyme inhibitors, metabolites, or antibiotics (eg, mitomycin) are contemplated as being useful in the present invention.

【００５６】 （３．抗体領域） イムノグロブリンファミリーの種々のメンバーからの領域もまた、本発明にお
いて意図される。特異的な抗体からの両方の可変領域が本発明内に網羅される。
これには、相補性決定領域（ＣＤＲ）が、抗体中和領域（Ｆｃ領域のようなエフ
ェクター分子に結合するものを含む）とともに、含まれる。抗体由来の抗原特異
性コード領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡからの可変領域）は、ｐ
ＩｇＲ結合ドメインとともに、上記の抗体中和領域または治療化合物と組み合わ
せて使用され得る。3. Antibody Regions Regions from various members of the immunoglobulin family are also contemplated in the present invention. Both variable regions from a specific antibody are encompassed within the invention.
This includes complementarity determining regions (CDRs) along with antibody neutralizing regions (including those that bind effector molecules such as Fc regions). Antigen-specific coding regions from antibodies (eg, variable regions from IgG, IgM, or IgA)
It can be used in conjunction with an antibody neutralizing region or therapeutic compound as described above, together with an IgR binding domain.

【００５７】 さらに別の実施形態において、１つの遺伝子は、単鎖抗体を含み得る。単鎖抗
体の産生のための方法は、当業者には周知である。当業者は、そのような方法に
ついて、米国特許第５，３５９，０４６号を参照されたい（本明細書において参
考として援用される）。単鎖抗体は、短いペプチドリンカーを用いて重鎖および
軽鎖の可変領域を一緒に融合することによって作製され、それによって、単一の
分子において抗原結合部位を再構成する。[0057] In yet another embodiment, one gene may include a single chain antibody. Methods for the production of single chain antibodies are well known to those skilled in the art. One skilled in the art should refer to US Pat. No. 5,359,046 for such a method (incorporated herein by reference). Single chain antibodies are made by fusing the heavy and light chain variable regions together using a short peptide linker, thereby reconstituting the antigen binding site in a single molecule.

【００５８】 一方の可変ドメインのＣ末端が他方の可変ドメインのＮ末端に対して１５〜２
５アミノ酸ペプチドまたはリンカーを介してテザリングされている単鎖抗体の可
変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）が抗原結合または結合の特異性を有意に破壊する
ことなく開発されている（Ｂｅｄｚｙｋら、１９９０；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、
１９９０）。これらのＦｖは、ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖に存在する定常
領域（Ｆｃ）を欠如する。The C-terminus of one variable domain is 15-2 relative to the N-terminus of the other
Single chain antibody variable fragments (scFvs) tethered via a five amino acid peptide or linker have been developed without significantly disrupting antigen binding or binding specificity (Bedzyk et al., 1990; Chaudhary et al.,
1990). These Fvs lack the constant regions (Fc) present in the heavy and light chains of the native antibody.

【００５９】 広汎な種々の分子に対する抗体が意図され、例えば、オンコジーン（癌遺伝子
）、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、酵素、転写因子またはレセプターがあ
る。意図されるのはまた、以下に対して標的化された分泌された抗体である：血
清、血管形成因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ；βＦＧＦ；αＦＧＦ；など）、凝固因子
、および血管形成に必要な内皮抗原（すなわち、Ｖ３インテグリン）。特に意図
されるおよび／または、トランスフォーミング増殖因子、線維芽細胞増殖因子、
ならびに血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびＰＤＧＦファミリーメンバーの
ような増殖因子である。Antibodies to a wide variety of molecules are contemplated, including, for example, oncogenes (oncogenes), cytokines, growth factors, hormones, enzymes, transcription factors or receptors. Also contemplated are secreted antibodies targeted to: serum, angiogenic factors (VEGF / VPF; βFGF; αFGF; etc.), coagulation factors, and endothelial antigens required for angiogenesis (Ie, V3 integrin). Particularly contemplated and / or transforming growth factor, fibroblast growth factor,
And growth factors such as platelet-derived growth factor (PDGF) and PDGF family members.

【００６０】 本発明は、さらに、抗原特異的配列の使用による特定の病原を標的化するか、
または特定の細胞型（例えば、その細胞を同定するための特定の細胞表面マーカ
ーを表現する細胞型）を標的化する組成物を具体化する。そのような細胞表面マ
ーカーの例としては、ＣＤ４またはＣＤ８のような腫瘍関連抗原または細胞型特
異的マーカーが挙げられる。The invention further relates to targeting a particular pathogen by using an antigen-specific sequence,
Or embody a composition that targets a particular cell type (eg, a cell type that expresses a particular cell surface marker to identify the cell). Examples of such cell surface markers include tumor associated antigens such as CD4 or CD8 or cell type specific markers.

【００６１】 （４．タンパク質同士またはリガンド−レセプターの相互作用を媒介する領域
） タンパク質同士の相互作用（リガンド−レセプターの相互作用を含む）を媒介
するタンパク質の領域の使用もまた、本発明によって意図される。この領域は、
タンパク質同士の相互作用のインヒビターもしくはコンペティターとして、また
は特異的標的化モチーフとして使用され得る。結果として、本発明は、ｐＩｇＲ
結合ドメインを使用して、タンパク質同士の相互作用を媒介するタンパク質領域
を粘膜上皮へ補充することを包含する。一旦、本発明の組成物が粘膜上皮に達す
ると、その組成物のより特異的な標的化が、リガンド−レセプター相互作用を含
むタンパク質同士の相互作用を媒介する領域によって意図される。4. Regions that Mediate Protein-to-Protein or Ligand-Receptor Interactions The use of regions of proteins that mediate protein-to-protein interactions (including ligand-receptor interactions) is also contemplated by the present invention. Is done. This area is
It can be used as an inhibitor or competitor of protein-protein interactions or as a specific targeting motif. As a result, the present invention provides pIgR
Includes the use of binding domains to recruit mucosal epithelia to protein regions that mediate protein-protein interactions. Once the composition of the present invention reaches the mucosal epithelium, more specific targeting of the composition is intended by regions that mediate protein-protein interactions, including ligand-receptor interactions.

【００６２】 タンパク質同士の相互作用としては、以下のタンパク質の間およびその中の相
互作用が挙げられる：レセプターおよびリガンド；レセプターおよびレセプター
；重合性複合体；転写因子；キナーゼおよび下流の標的；酵素および基質など。
例えば、リガンド結合ドメインは、リガンドとその同族レセプターとの間のタン
パク質同士の相互作用を媒介する。結果として、このドメインは、内因性リガン
ド結合を阻害またはそれと競合するように使用し得、またはｐＩｇＲ結合ドメイ
ンに作動可能に付着されたリガンド結合ドメインを認識するレセプターを発現す
る細胞型により特異的に標的化するために使用され得る。Interactions between proteins include those between and within the following proteins: receptors and ligands; receptors and receptors; polymerizable complexes; transcription factors; kinases and downstream targets; Substrate etc.
For example, a ligand binding domain mediates a protein-protein interaction between a ligand and its cognate receptor. As a result, this domain can be used to inhibit or compete with endogenous ligand binding, or more specifically to cell types that express a receptor that recognizes a ligand binding domain operably attached to a pIgR binding domain. Can be used to target.

【００６３】 リガンド結合ドメインの例としては、以下のリガンドが挙げられる：とりわけ
、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ；βＦＧＦ；αＦＧＦ；凝固因子および血管新生に必要な内
皮抗原（すなわち、Ｖ３インテグリン）；増殖因子（例えば、トランスフォーミ
ング増殖因子、線維芽細胞増殖因子、コロニー刺激因子、Ｋｉｔリガンド（ＫＬ
）、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３、および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびＰ
ＤＧＦファミリーメンバー；ＭＨＣ分子のような細胞表面レセプターに結合する
リガンド。Examples of ligand binding domains include the following ligands: VEGF / VPF; βFGF; αFGF; clotting factors and endothelial antigens required for angiogenesis (ie, V3 integrin); growth factors (eg, Transforming growth factor, fibroblast growth factor, colony stimulating factor, Kit ligand (KL
), Flk-2 / flt-3, and platelet-derived growth factor (PDGF) and P
DGF family members; ligands that bind to cell surface receptors such as MHC molecules.

【００６４】 最も広汎に特徴付けられているリガンドは、アシアロオソムコイド（ＡＳＯＲ
）（ＷｕおよびＷｕ、１９８７）ならびにトランスフェリン（Ｗａｇｎｅｒら、
１９９０）である。最近、合成ネオ糖タンパク質（これは、ＡＳＯＲと同じレセ
プターを認識する）は、遺伝子送達ビヒクルとして使用されている（Ｆｅｒｋｏ
ｌら、１９９３；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４）、そして上皮増殖因子（ＥＧＦ
）もまた、扁平癌細胞へ遺伝子を送達するために使用されている（Ｍｙｅｒ、Ｅ
ＰＯ ０２７３０８５）。The most widely characterized ligand is asialoosomucoid (ASOR)
) (Wu and Wu, 1987) and transferrin (Wagner et al.
1990). Recently, synthetic neoglycoproteins, which recognize the same receptors as ASOR, have been used as gene delivery vehicles (Ferko).
Perales et al., 1994) and epidermal growth factor (EGF
) Have also been used to deliver genes to squamous cancer cells (Myer, E
PO 0273085).

【００６５】 他の実施形態において、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、ラクトシル−セラ
ミド、ガラクトース末端アシアルガングリオシドを使用し、リポソームへと取り
込み、そして肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加を観察した。また
、ヒト前立腺特異的抗原（Ｗａｔｔら、１９８６）を、前立腺組織への媒介性送
達のためのレセプターとして使用し得る。In another embodiment, Nicolau et al. (1987) used lactosyl-ceramide, galactose-terminated asialgangliosides, incorporated into liposomes, and observed increased uptake of the insulin gene by hepatocytes. Also, human prostate specific antigen (Watt et al., 1986) can be used as a receptor for mediated delivery to prostate tissue.

【００６６】 （５．サイトカイン） 本発明のｐＩｇＲ結合ドメインに作動可能に連結されることが意図される別の
クラスの化合物は、以下のようなインターロイキンおよびサイトカインを含む：
インターロイキン１ （ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５
、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ１１、ＩＬ−１
２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、β−インターフェロン、α−インタ
ーフェロン、γ−インターフェロン、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、
ＥＮＤスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、Ｆｌｋ２／Ｆｌｔリガンド、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）。5. Cytokines Another class of compounds intended to be operably linked to the pIgR binding domain of the present invention comprises the following interleukins and cytokines:
Interleukin 1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5
, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL11, IL-1
2, IL-13, IL-14, IL-15, β-interferon, α-interferon, γ-interferon, angiostatin, thrombospondin,
END statins, METH-1, METH-2, Flk2 / Flt ligand, G
M-CSF, G-CSF, M-CSF, and tumor necrosis factor (TNF).

【００６７】 （６．増殖因子） 本発明の他の実施形態において、増殖因子またはリガンドが治療剤によって包
含される。例としては以下が挙げられる：ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ
、ＴＩＥに結合するリガンド、腫瘍関連フィブロネクチン、散乱（ｓｃａｔｔｅ
ｒ）因子、肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板因子（ＰＦ４）、ＰＤ
ＧＦ、ＫＩＴリガンド（ＫＬ）、コロニー刺激因子 （ＣＳＦｓ）、ＬＩＦ、お
よびＴＩＭＰ。6. Growth Factor In another embodiment of the invention, a growth factor or ligand is included by the therapeutic. Examples include: VEGF / VPF, FGF, TGFβ
, TIE binding ligand, tumor associated fibronectin, scatter (scatte)
r) factor, hepatocyte growth factor, fibroblast growth factor, platelet factor (PF4), PD
GF, KIT ligand (KL), colony stimulating factors (CSFs), LIF, and TIMP.

【００６８】 （７．ホルモン） さらなる実施形態は、選択剤としてのホルモンの使用を包含する。例えば、以
下のホルモンまたはステロイドが、本発明において実施され得る：プレドニゾン
、プロゲステロン、エストロゲン、アンドロゲン、ゴナドトロピン、ＡＣＴＨ、
ＣＧＨ、または胃腸ホルモン（例えば、セクレチン）。7. Hormones A further embodiment involves the use of hormones as selection agents. For example, the following hormones or steroids can be practiced in the present invention: prednisone, progesterone, estrogen, androgen, gonadotropin, ACTH,
CGH, or gastrointestinal hormones (eg, secretin).

【００６９】 （８．毒素） 本発明の特定の実施形態において、治療剤は、一般に、植物由来毒素、真菌由
来毒素または細菌由来毒素を含む：リシンＡ鎖（Ｂｕｒｂａｇｅ、１９９７）、
リボソーム不活化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシ
ン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素 Ａ （Ｍａｓｕｄａら、１９９７；Ｌ
ｉｄｏｒ、１９９７）、百日咳毒素 Ａサブユニット、Ｅ．ｃｏｌｉ 腸毒素
毒素 Ａ サブユニット、コレラ毒素 Ａサブユニット、およびシュードモナス
毒素Ｃ末端。最近、融合タンパク質調節可能なジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子を含む
プラスミドのトランスフェクションが、癌細胞について細胞傷害性であることが
見出された。従って、調節された毒素遺伝子の遺伝子移入もまた、疾患の処置に
適用され得る（Ｍａｓｕｄａら、１９９７）。8. Toxins In certain embodiments of the invention, the therapeutic agent generally comprises a plant-derived toxin, a fungal-derived toxin or a bacterial-derived toxin: ricin A chain (Burbage, 1997);
Ribosome-inactivating protein, α-sarcin, aspergillin, restrictocin, ribonuclease, diphtheria toxin A (Masuda et al., 1997; L
idor, 1997), pertussis toxin A subunit, E. coli. coli enterotoxin
Toxin A subunit, cholera toxin A subunit, and Pseudomonas toxin C-terminus. Recently, transfection of a plasmid containing the fusion protein regulatable diphtheria toxin A chain gene was found to be cytotoxic for cancer cells. Thus, transfection of regulated toxin genes may also be applied to the treatment of disease (Masuda et al., 1997).

【００７０】 （９．アンチセンス構築物） アンチセンス方法論は、核酸が「相補性」配列と対合する傾向がある事実を利
用する。相補性によって、ポリヌクレオチドが標準的なワトソンクリック相補性
規則に従って塩基対合し得るものであることが意味される。すなわち、より大き
なプリンは、より小さなピリミジンと塩基対合して、シトシンと対合したグアニ
ンの組合せ（Ｇ：Ｃ）を形成し、そしてＤＮＡの場合にはチミンと対合したアデ
ニン（Ａ；Ｔ）またはＲＮＡの場合にはウラシルと対合したアデニン（Ａ：Ｕ）
を形成する。より一般的ではない塩基（例えば、イノシン、５−メチルシトシン
、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンなど）のハイブリダイズ配列内への内包
は、対合には影響しない。9. Antisense Constructs Antisense methodology takes advantage of the fact that nucleic acids tend to pair with “complementary” sequences. By complementation is meant that the polynucleotide is capable of base-pairing according to standard Watson-Crick complementarity rules. That is, larger purines base-pair with smaller pyrimidines to form guanine combinations (G: C) with cytosines, and, in the case of DNA, adenine (A; T) with thymine. ) Or adenine paired with uracil in the case of RNA (A: U)
To form Inclusion of less common bases (eg, inosine, 5-methylcytosine, 6-methyladenine, hypoxanthine, etc.) within the hybridizing sequence does not affect pairing.

【００７１】 ポリヌクレオチドで二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを標的化すると、三重鎖ヘリックス
形成が生じる：ＲＮＡを標的化することで、二重ヘリックス形成が生じる。アン
チセンスポリヌクレオチドは、標的細胞に導入されるときに、特異的にそれらの
標的ポリヌクレオチドに結合し、そして転写、ＲＮＡプロセシング、輸送、翻訳
および／または安定性に影響を与える。アンチセンスＲＮＡ構築物またそのよう
なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを使用して、インビトロまたはインビ
ボのいずれかで宿主（例えば、宿主動物（ヒト被験体を含む）内で）内の転写も
しくは翻訳またはその両方を阻害し得る。Targeting double-stranded (ds) DNA with a polynucleotide results in triple-helix formation: targeting RNA results in double-helix formation. Antisense polynucleotides, when introduced into target cells, specifically bind to their target polynucleotides and affect transcription, RNA processing, transport, translation, and / or stability. The antisense RNA constructs or the DNA encoding such antisense RNAs can be used to transcribe or translate or transduce or translate them in a host (eg, in a host animal, including a human subject) either in vitro or in vivo. It can inhibit both.

【００７２】 アンチセンス構築物は、プロモーターおよび他の制御領域、遺伝子のエキソン
、イントロンまたはエキソンイントロン境界でさえ結合するように設計され得る
。最も有効なアンチセンス構築物は、イントロン／エキソンスプライシング接合
部に対して相補的である領域を含むことが意図される。従って、好ましい実施形
態は、５０〜２００ベースのイントロン−エキソンスプライシング接合部の領域
に対する相補性を伴うアンチセンス構築物を包含することが提唱される。いくつ
かのエキソン配列は、その標的選択性に重大な影響を与えることなくその構築物
内に含まれ得ることが観察された。含まれるエキソン材料量は、使用される特定
のエキソンおよびイントロンの配列に依存して変動する。あまりに多すぎるエキ
ソンＤＮＡが含まれるか否かは、単純に、その構築物をインビトロで試験して正
常細胞機能に影響が出ていないかどうか、または相補性配列を有する関連遺伝子
の発現が変化していないかどうかを判定することによって容易に試験され得る。Antisense constructs can be designed to bind promoters and other regulatory regions, exons, introns or even exon intron boundaries of a gene. The most effective antisense constructs are intended to include regions that are complementary to an intron / exon splicing junction. Accordingly, it is proposed that preferred embodiments include antisense constructs with complementation to regions of the 50-200 base intron-exon splicing junction. It has been observed that some exon sequences can be included in the construct without significantly affecting its target selectivity. The amount of exon material included will vary depending on the particular exon and intron sequences used. Whether too much exon DNA was included simply tested whether the construct was tested in vitro to affect normal cell function or altered the expression of related genes with complementary sequences. It can be easily tested by determining if there is none.

【００７３】 上記のように、「相補性（的）」または［アンチセンス」とは、その全体の長
さにわたってポリヌクレオチド配列が実質的に相補的であり、そして塩基ミスマ
ッチをほとんど有しないことを意味する。例えば、１５塩基長の配列は、１３位
または１４位において相補的なヌクレオチドを有するときに、相補的であると称
され得る。当然、完全に相補的である配列は、その配列全体の長さが全体的に相
補的である配列であり、そして塩基ミスマッチは有しない。より低い程度の相同
性を有する他の配列もまた意図される。例えば、高い相同性の限定された領域を
有するが非相同領域（リボザイム、以下を参照のこと）をも含むアンチセンス構
築物も設計され得る。これらの分子は、５０％未満の相同性を有するが、適切な
条件下で標的配列に結合する。As noted above, “complementary” or “antisense” refers to the fact that a polynucleotide sequence is substantially complementary over its entire length and has few base mismatches. means. For example, a 15 base long sequence can be said to be complementary when it has a complementary nucleotide at position 13 or 14. Of course, sequences that are completely complementary are those sequences whose overall length is entirely complementary and have no base mismatches. Other sequences with a lower degree of homology are also contemplated. For example, antisense constructs having limited regions of high homology but also containing non-homologous regions (ribozymes, see below) can be designed. These molecules have less than 50% homology, but bind to the target sequence under appropriate conditions.

【００７４】 ゲノムＤＮＡの部分をｃＤＮＡまたは合成配列と組み合わせて特定の構築物を
生成することも有利であり得る。例えば、イントロンが最終構築物である場合、
ゲノムクローンを使用する必要がある。ｃＤＮＡまたは合成されたポリヌクレオ
チドが、残りの部分の構築物により簡便な制限部位を提供し、そしてそれゆえそ
の配列の残りについて使用される。、 アンチセンス構築物についての標的である特定のオンコジーンとしては以下が
挙げられる：ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕ
ｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｈｓｔ、ｇｓｐ、ｂｃｌ−２およびａｂｌ。有用であると
意図されるものはまた、抗アポトーシス遺伝子および血管新生プロモーターであ
る。他のアンチセンス構築物は、ウイルス遺伝子または微生物遺伝子に指向され
て、病原性を減少または消滅させ得る。特定の構築物は、以下のような遺伝子を
標的化する：ウイルスのｅｎｖ、ｐｏｌ、ｇａｇ、ｒｅｖ、ｔａｔまたはコート
遺伝子またはキャプシド遺伝子、あるいは微生物内毒素、組換え遺伝子、複製遺
伝子、または転写遺伝子。It may also be advantageous to combine portions of genomic DNA with cDNA or synthetic sequences to produce a particular construct. For example, if the intron is the final construct,
Genomic clones must be used. The cDNA or synthesized polynucleotide provides a more convenient restriction site for the rest of the construct, and is therefore used for the rest of the sequence. Specific oncogenes that are targets for antisense constructs include: ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, ju
n, trk, ret, hst, gsp, bcl-2 and abl. Also intended to be useful are anti-apoptotic genes and angiogenesis promoters. Other antisense constructs can be directed to viral or microbial genes to reduce or eliminate pathogenicity. Certain constructs target genes such as: viral env, pol, gag, rev, tat or coat or capsid genes, or microbial endotoxins, recombinant genes, replication genes, or transcription genes.

【００７５】 （１０．リボザイム） タンパク質が伝統的には、核酸の触媒に使用されてきたが、別のクラスの高
分子もまたこの使命のために有用であるとして出現してきた。リボザイムは、Ｒ
ＮＡタンパク質複合体であって部位特異的な様式で核酸を切断するものである。
リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有する（
ＫｉｍおよびＣｏｏｋ、１９８７；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９８７；Ｆｏｒｓｔｅ
ｒおよびＳｙｍｏｎ、１９８７）．。例えば、大多数のリボザイムは、ホスホエ
ステル転移反応を、高度の特異性をもって加速する。ここで、しばしばオリゴヌ
クレオチド基質におけるいくつかのホスホエステルのうちの１つのみを切断する
（ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅ
ｋおよびＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、特定の塩基対合相互作用を介し
て基質が化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＤ」）に結合する
ことを必要とすることに帰されている。10. Ribozymes Although proteins have traditionally been used to catalyze nucleic acids, another class of macromolecules has also emerged as being useful for this mission. The ribozyme is R
An NA protein complex that cleaves nucleic acids in a site-specific manner.
Ribozymes have a specific catalytic domain with endonuclease activity (
Kim and Cook, 1987; Gerlach et al., 1987; Forste.
r and Symon, 1987). . For example, the majority of ribozymes accelerate the phosphoester transfer reaction with a high degree of specificity. Here, often only one of several phosphoesters in the oligonucleotide substrate is cleaved (Michel and Westofof, 1990; Reinhold-Hure).
k and Shub, 1992). This specificity has been attributed to the need for the substrate to bind to the internal guide sequence ("IGD") of the ribozyme prior to chemical reaction via specific base pairing interactions.

【００７６】 リボザイム触媒は、核酸を含む配列特異的な切断／連結反応の一部として主に
観察される（Ｊｏｙｃｅ、１９８９；Ｃｏｏｋら、１９８１）。例えば、米国特
許第５，３５４，８５５号は、特定のリボザイムが、公知のリボヌクレアーゼの
ものを超えた配列特異性であって、かつ、ＤＮＡ制限酵素のものに近似する配列
特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用し得ることが報告されている。従
って、遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介性の阻害は、治療適用に部分的に
適切であり得る（Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。
最近、リボザイムがそれらが適用されるいくつかの細胞株において遺伝子変化す
ることが報告された。変化した遺伝子は、オンコジーンＨ−ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓ
およびＨＩＶの遺伝子を含んでいた。この研究の殆どは、特定のリボザイムによ
って切断される特定の変異コドンに基づく、標的ｍＲＮＡの改変を含む。この実
施形態についての標的は、ＶＥＧＦおよびアンジオポエチンならびにオンコジー
ン（例えば、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕ
ｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｈｓｔ、ｇｓｐ、ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｇｒｂ２および
ａｂｌ）を含む。他の構築物は、抗アポトーシス遺伝子（例えば、ｂｃｌ−２）
およびウイルス遺伝子もしくは細菌遺伝子に対して指向される微生物遺伝子の過
剰発現を含む。Ribozyme catalysts are mainly observed as part of sequence-specific cleavage / ligation reactions involving nucleic acids (Joyce, 1989; Cook et al., 1981). For example, U.S. Pat. No. 5,354,855 discloses that certain ribozymes are endonucleases having a sequence specificity exceeding that of known ribonucleases and having a sequence specificity approaching that of DNA restriction enzymes. It has been reported that it can act as Thus, sequence-specific ribozyme-mediated inhibition of gene expression may be partially relevant for therapeutic applications (Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990).
Recently, ribozymes have been reported to be genetically altered in some cell lines to which they are applied. The altered genes are oncogene H-ras, c-fos
And HIV genes. Most of this work involves modifying the target mRNA based on a particular mutant codon that is cleaved by a particular ribozyme. Targets for this embodiment include VEGF and angiopoietin and oncogenes (eg, ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, ju
n, trk, ret, hst, gsp, bcl-2, EGFR, grb2 and abl). Other constructs include anti-apoptotic genes (eg, bcl-2)
And overexpression of microbial genes directed against viral or bacterial genes.

【００７７】 （１１．化学療法剤および放射性治療剤） 本発明に従って、化学療法剤および放射性治療化合物は、ｐＩｇＲ標的化モチ
ーフと作動可能に付着され得る。有用であると意図される化学療法剤は、例えば
以下が挙げられる：アドリアマイシン、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル
（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、カムプトテシン、アクチノマイシン−
Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ポドフィロトキシン、ベラ
パミル、および過酸化水素でさえ。11. Chemotherapeutic and Radiotherapeutic Agents In accordance with the present invention, chemotherapeutic and radiotherapeutic compounds can be operably attached to a pIgR targeting motif. Chemotherapeutic agents that are intended to be useful include, for example: adriamycin, bleomycin, 5-fluorouracil (5FU), etoposide (VP-16), camptothecin, actinomycin-
D, mitomycin C, cisplatin (CDDP), podophyllotoxin, verapamil, and even hydrogen peroxide.

【００７８】 （１２．転写因子および調節因子） 有利な組合せで適用される別のクラスの遺伝子は、負および正の両方の転写因
子である。例としては以下が挙げられる：Ｃ／ＥＢＰα、ＩＫＢ、ＮＦＫＢ、Ａ
Ｐ−１、ＹＹ−１、Ｓｐｌ、ＣＲＥＢ、ＶＰ１６、およびＰａｒ−４。12. Transcription Factors and Regulators Another class of genes applied in advantageous combinations is both negative and positive transcription factors. Examples include: C / EBPα, IKB, NFKB, A
P-1, YY-1, Spl, CREB, VP16, and Par-4.

【００７９】 （１３．細胞周期調節因子） 細胞周期調節因子は、他の遺伝子と組み合わされたとき可能な利点を提供する
。そのような細胞周期調節因子としては以下が挙げられる：ｐ２７、ｐｌ６、ｐ
２１、ｐ５７、ｐｌ８、ｐ７３、ｐｌ９、ｐｌ５、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ
２Ｆ−３、ｐｌ０７、ｐｌ３０、およびＥ２Ｆ−４。他の細胞周期調節因子とし
ては、以下が挙げられる：抗血管新生タンパク質（例えば、可溶性Ｆｌｋｌ （
優性ネガティブ可溶性ＶＥＧＦレセプター）、可溶性Ｗｎｔレセプター、可溶性
Ｔｉｅ２／Ｔｅｋレセプター、マトリクスメタロプロテアーゼ２の可溶性ヘモペ
キシンドメイン、および他の血管新生サイトカインの可溶性レセプター（例えば
、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ３／Ｆｌｔ４およびネオト
ロピリン−１および−２のコレセプター）。13. Cell Cycle Regulators Cell cycle regulators offer possible advantages when combined with other genes. Such cell cycle regulators include: p27, pl6, p
21, p57, pl8, p73, pl9, pl5, E2F-1, E2F-2, E
2F-3, pl07, pl30, and E2F-4. Other cell cycle regulators include: anti-angiogenic proteins such as soluble Flkl (
Dominant negative soluble VEGF receptor, soluble Wnt receptor, soluble Tie2 / Tek receptor, soluble hemopexin domain of matrix metalloprotease 2, and soluble receptors of other angiogenic cytokines (eg, VEGFR1, VEGFR2 / KDR, VEGFR3 / Flt4 and Neotropilin-1 and -2 coreceptors).

【００８０】 （１４、ケモカイン） ケモカインもまた、本発明において使用され得る。ケモカインは、概して、化
学誘引剤として作用して、ケモカイン発現の部位に対する免疫エフェクター細胞
を補充する。特定のケモカイン遺伝子を例えば、サイトカイン遺伝子と組み合わ
せて発現させて、処置部位への他の免疫系成分の補充を強化することが有利であ
り得る。そのようなケモカインとしては、以下が挙げられる：ＲＡＮＴＥ、ＭＣ
ＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、およびＩＰ−１０。当業者は、特定のサイ
トカインがまた、化学誘引効果を有することが知られ、そしてまた用語ケモカイ
ンのもとで分類され得ることを認識する。(14, Chemokines) Chemokines can also be used in the present invention. Chemokines generally act as chemoattractants to recruit immune effector cells to the site of chemokine expression. It may be advantageous to express certain chemokine genes, for example, in combination with cytokine genes to enhance the recruitment of other immune system components to the treatment site. Such chemokines include: RANTE, MC
AF, MIP1-α, MIP1-β, and IP-10. One skilled in the art will recognize that certain cytokines are also known to have chemoattractant effects and can also be classified under the term chemokine.

【００８１】 （１５．腫瘍サプレッサー） 多数のタンパク質が腫瘍サプレッサーとして特徴付けられている。これは、制
御された細胞集団を有するタンパク質のクラスと定義される。野生型腫瘍サプレ
ッサー活性の欠失は、新形成または制御されない細胞増殖に関連する。いくつか
のグループによって、野生型コピーの特定の腫瘍サプレッサーを欠如する細胞の
新形成増殖が野生型の型のその主要サプレッサーの添加によって停止し得ること
が示された。これは、例えば、ｐ５３で観察されている（Ｄｉｌｌｅｒら、１９
９０）。本発明は、ｐＩｇＲ結合ドメインを使用して、粘膜上皮を、腫瘍サプレ
ッサー（例えば、ｐ５３）の送達について標的化することを意図する。本発明に
従って使用され得る他の腫瘍サプレッサーとしては以下が挙げられる：ｐ２１、
ｐｌ５、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＩＲＦ−１、ＰＴＥＮ（ＭＭＡＣ１）、Ｒｂ
、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ
、ｚａｃ１、ｐ７３、ＶＨＬ、ＦＣＣおよびＭＣＣ。15. Tumor Suppressors A number of proteins have been characterized as tumor suppressors. This is defined as a class of proteins that have a controlled cell population. Loss of wild-type tumor suppressor activity is associated with neoplasia or uncontrolled cell growth. Several groups have shown that neoplastic growth of cells lacking a particular tumor suppressor of the wild-type copy can be stopped by the addition of its major suppressor of the wild-type copy. This has been observed, for example, in p53 (Diller et al., 19
90). The present invention contemplates using the pIgR binding domain to target mucosal epithelium for delivery of tumor suppressors (eg, p53). Other tumor suppressors that can be used in accordance with the present invention include: p21,
pl5, BRCA1, BRCA2, IRF-1, PTEN (MMAC1), Rb
, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II
, Zac1, p73, VHL, FCC and MCC.

【００８２】 （１６．アポトーシスのインデューサー） アポトーシスのインデューサー（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘ、Ｂａ
ｄ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｈａｒａｋｉｒｉ、Ａｄ Ｅ１Ｂ、およびＩＣＥ−ＣＥＤ
３のプロテアーゼ）は、同様に、本発明に従って有用であり得る。(16. Inducers of Apoptosis) Inducers of apoptosis (eg, Bax, Bak, Bcl-X, Ba)
d, Bim, Bik, Harakiri, Ad E1B, and ICE-CED
3 proteases) may also be useful according to the invention.

【００８３】 （１７．選択された薬剤のキャリアとしてのリポソーム） 本発明の別の実施形態において、選択された薬剤は、リポソーム内に捕捉され
得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水媒体によって特徴付けら
れるベシクル構造である。多層リポソームは、水媒体によって分離された多重脂
質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されるときに自然に
形成する。脂質成分は、自己再構成を行い、その後、密閉構造の形成および水お
よび溶解した溶質の、脂質二重層の間への捕捉が生じる（ＧｈｏｓｈおよびＢａ
ｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。意図されるのはまた、カチオン脂質核酸複合体（
例えば、リポフェクトアミン核酸複合体）である。17. Liposomes as Carriers of Selected Drugs In another embodiment of the present invention, selected drugs can be entrapped in liposomes. Liposomes are vesicle structures characterized by a phospholipid bilayer membrane and an inner aqueous medium. Multilamellar liposomes have multiple lipid layers separated by an aqueous medium. They form spontaneously when phospholipids are suspended in excess aqueous solution. The lipid components undergo self-reconstitution, followed by the formation of a closed structure and entrapment of water and dissolved solutes between the lipid bilayers (Ghosh and Ba).
chhatat, 1991). Also contemplated are cationic lipid nucleic acid complexes (
For example, lipofectamine nucleic acid complex).

【００８４】 「リポソーム」は、密封脂質二重層の生成によって形成される種々の単層脂質
ベシクルおよび多層脂質ベシクルを包含する包括用語である。リン脂質は、本発
明に従ってリポソームを調整するために使用され、そして正味で正の荷電、正味
で負の荷電を有し得るか、または中性である。ジセチルホスフェートは、リポソ
ームの負の荷電を付与するために使用され得る。そして、ステアリルアミンは、
リポソームにおいて正の荷電を付与するために使用され得る。“Liposome” is a generic term encompassing various unilamellar and multilamellar lipid vesicles formed by the formation of a sealed lipid bilayer. Phospholipids are used to prepare liposomes according to the invention and can have a net positive charge, a net negative charge, or are neutral. Dicetyl phosphate can be used to impart a negative charge to the liposome. And stearylamine is
It can be used to impart a positive charge on liposomes.

【００８５】 本発明に従って使用するために適切な脂質は、市販されてい得る。例えば、ジ
ミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．から入手され得、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ
＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）から入手され
；コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ
から得られ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および
他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ、Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎ
ｇｈａｍ、Ａｌａ．）から得られ得る。クロロホルム／メタノールまたはｔ−ブ
タノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存され得る。好ましくは、
クロロホルムが唯一の溶媒として使用される。なぜなら、それは、メタノールよ
りも容易に蒸発するからである。[0085] Suitable lipids for use in accordance with the present invention may be commercially available. For example, dimyristyl phosphatidylcholine ("DMPC") is available from Sigma Chemi.
cal Co. Dicetyl phosphate ("DCP") is obtained from K
& K Laboratories (Plainview, NY); cholesterol (“Chol”) is available from Calbiochem-Behring.
Dimyristyl phosphatidyl glycerol ("DMPG") and other lipids are available from Avanti Polar Lipid, Inc. (Birmin
gham, Ala. ). Stock solutions of lipids in chloroform / methanol or t-butanol can be stored at about -20 <0> C. Preferably,
Chloroform is used as the only solvent. Because it evaporates more easily than methanol.

【００８６】 天然の供給源からのリン脂質（例えば、卵またはダイズのホスファチジルコリ
ン、脳ホスファチジン酸、脳または植物のホスファチジルイノシトール、心臓カ
ルジオリピン、および植物または細菌のホスファチジルエタノールアミン）は、
好ましくは、主要なホスファチド（すなわち、ホスファチド組成の全体の５０％
以上を構成する）としては使用しない。なぜなら、得られるリポソームが不安定
であり、そして漏れやすいからである。Phospholipids from natural sources (eg, egg or soy phosphatidylcholine, brain phosphatidylinositol, brain or plant phosphatidylinositol, cardiac cardiolipin, and plant or bacterial phosphatidylethanolamine)
Preferably, the major phosphatide (ie, 50% of the total phosphatide composition)
The above is not used. Because the liposomes obtained are unstable and leaky.

【００８７】 本発明に従って使用されるリポソームは、種々の方法によって作製され得る。
リポソームの大きさは、合成の方法に依存して変動する。水溶液中に懸濁したリ
ポソームは、概して球状のベシクルの形状であり、脂質二重層分子の１以上の同
心円層を有する。各層は、式ＸＹによって表される平行した列の分子からなる。
ここで、Ｘは、親水性部分であり、そしてＹは疎水性部分である。水性懸濁液に
おいて、同心円層は、その親水性部分が水相と接触したままであるような傾向に
あり、そしてその疎水性領域が自己会合するような傾向にあるように配置される
。例えば、水相は、リポソーム内およびそれなしの両方で存在するときに、その
脂質分子は、ＸＹ−ＹＸの二重層を形成し（これは層（ラメラ（ｌａｍｅｌｌａ
））として知られる）。The liposomes used according to the present invention can be made by various methods.
The size of the liposomes varies depending on the method of synthesis. Liposomes suspended in an aqueous solution are generally in the form of spherical vesicles and have one or more concentric layers of lipid bilayer molecules. Each layer consists of parallel rows of molecules represented by the formula XY.
Where X is a hydrophilic moiety and Y is a hydrophobic moiety. In aqueous suspensions, the concentric layers are arranged such that the hydrophilic portions tend to remain in contact with the aqueous phase and the hydrophobic regions tend to self-associate. For example, when the aqueous phase is present both within and without liposomes, the lipid molecules form an XY-YX bilayer (which is a layer (lamella).
))).

【００８８】 本発明の範囲内のリポソームは、公知の研究室技術に従って調製され得る。１
つの好ましい実施形態において、リポソームは、リポソーム脂質を容器（例えば
、ガラス洋ナシ形フラスコ）中の溶媒に混合することによって調製される。この
容器は、リポソームの予測される懸濁物の容量の１０倍の容量を有すべきである
。回転式エバポレーターを用いて、その溶媒を約４０℃で陰圧で除く。溶媒は通
常、リポソームの所望の容量に依存して約５分〜２時間で除かれる。その組成物
は、減圧下でデシケーター内でさらに乾燥され得る。この乾燥した脂質は、一般
に、約１週間後に捨てられる。なぜなら、時間とともに悪化する傾向があるから
である。[0088] Liposomes within the scope of the present invention can be prepared according to known laboratory techniques. 1
In one preferred embodiment, liposomes are prepared by mixing liposome lipids with a solvent in a container (eg, a glass pear-shaped flask). This container should have a volume that is 10 times the volume of the expected suspension of liposomes. The solvent is removed under a negative pressure at about 40 ° C. using a rotary evaporator. The solvent is usually removed in about 5 minutes to 2 hours, depending on the desired volume of the liposome. The composition may be further dried in a desiccator under reduced pressure. The dried lipid is generally discarded after about one week. This is because it tends to deteriorate over time.

【００８９】 乾燥した脂質は、およそ２５〜５０ｍＭのリン脂質を、滅菌の発熱物質無しの
水中に、その脂質すべてのフィルムが再懸濁されるまで水和され得る。次いで、
この水性リポソームをアリコートに分け得、その各々のをバイアル中に入れ、凍
結乾燥し、そして減圧下で封入する。The dried lipid can hydrate approximately 25-50 mM phospholipid in sterile pyrogen-free water until the film of all of the lipid is resuspended. Then
The aqueous liposomes may be divided into aliquots, each of which is placed in a vial, lyophilized, and encapsulated under reduced pressure.

【００９０】 代替において、リポソームは、他の公知の研究室手順に従って調製され得る；
Ｂａｎｇｈａｍら（１９６５）の方法、この内容は、本明細書において参考とし
て援用される；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉの方法、ＤＲＵＧ ＣＡＲＲＩＥＲＳＩＮ
ＢＩＯＬＯＧＹＡＮＤＭＥＤＩＣＩＮＥ、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編 （１
９７９）ｐｐ．２８７−３４１に記載される、その内容は本明細書において参考
として援用される；ＤｅａｍｅｒおよびＵｓｔｅｒ（１９８３）の方法、その内
容は、本明細書において参考として援用される；ならびにＳｚｏｋａおよびＰａ
ｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）によって記載されるような逆相エバポ
レーション。上記方法は、そのそれぞれが水性材料を捕捉する能力およびそれぞ
れの水性空間対脂質の比率において異なる。[0090] Alternatively, liposomes can be prepared according to other known laboratory procedures;
The method of Bangham et al. (1965), the contents of which are incorporated herein by reference; the method of Gregoriadi, DRUG CARRIERSIN.
BIOLOGYANDMEDICINE, G. Gregoriadis (1
979) pp. 287-341, the contents of which are incorporated herein by reference; the method of Deamer and Uster (1983), the contents of which are incorporated herein by reference; and Szoka and Pa
Reversed phase evaporation as described by pahadjopoulos (1978). The above methods differ in their ability to capture aqueous material and in their respective aqueous space to lipid ratios.

【００９１】 上記の如く調製された乾燥脂質または凍結乾燥リポソームは、核酸の溶液中に
再構成され得、そして適切な溶媒（例えば、ＤＰＢＳ）を用いて適切な濃度に希
釈され得る。次いで、この混合物を、激しくボルテクスミキサにおいて振盪する
。カプセル化されていない核酸を、２９，０００×ｇでの遠心分離により除き、
そしてリポソームペレットを洗浄する。その洗浄したリポソームを適切な総リン
脂質濃度（例えば、約５０〜２００ｍＭ）で再懸濁する。カプセル化された核酸
の量は、標準的な方法に従って決定され得る。リポソーム調製物においてカプセ
ル化された核酸の量の決定後、そのリポソームを希釈して、適切な濃度とし得、
そして使用まで４℃で保存し得る。[0091] Dried lipids or lyophilized liposomes prepared as described above can be reconstituted in a solution of the nucleic acid and diluted with a suitable solvent (eg, DPBS) to a suitable concentration. The mixture is then shaken vigorously in a vortex mixer. Unencapsulated nucleic acids are removed by centrifugation at 29,000 × g,
Then, the liposome pellet is washed. The washed liposomes are resuspended at an appropriate total phospholipid concentration (eg, about 50-200 mM). The amount of the encapsulated nucleic acid can be determined according to standard methods. After determining the amount of nucleic acid encapsulated in the liposome preparation, the liposome can be diluted to an appropriate concentration,
It can be stored at 4 ° C. until use.

【００９２】 別の実施形態において、脂質ジオレオイルホスファチジルコリンを使用する。
ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドを、過剰のｔ−ブタノールの存在下で脂質
と混合した。この混合物をボルテクスし、その後、アセトン／ドライアイス浴に
おいて凍結させた。凍結混合物を凍結乾燥し、そしてＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩
水（１ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０ ｍＭ ＮａＣＩ、ｐＨ ７．５）で一晩水和
し、次いでそのリポソームを浴型超音波処理器で１０〜１５分間超音波処理した
。リポソームオリゴヌクレオチドの大きさは、代表的に、μｍ未満の粒子サイズ
測定自己希釈モデル３７０（Ｎｉｃｏｍｐ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ
）で測定すると２００〜３００ｎｍ直径の範囲内であった。[0092] In another embodiment, the lipid dioleoylphosphatidylcholine is used.
The nuclease resistant oligonucleotide was mixed with the lipid in the presence of excess t-butanol. The mixture was vortexed and then frozen in an acetone / dry ice bath. The frozen mixture is lyophilized and hydrated overnight in Hepes-buffered saline (1 mM Hepes, 10 mM NaCI, pH 7.5), and the liposomes are then lysed in a bath sonicator for 10-15 minutes. Sonicated. The size of liposome oligonucleotides is typically determined by sub-μm particle size measurement self-dilution model 370 (Nicomp, Santa Barbara, CA).
) Was in the range of 200 to 300 nm diameter.

【００９３】 （Ｅ．診断化合物） タンパク質結合体の特定の例は、タンパク質配列（例えば、ｐＩｇＲ結合ドメ
インを含むペプチド）を、検出可能な標識に連結したような結合体である。「検
出可能な標識」とは、その特定の機能特徴または化学的特徴に起因して検出され
得る化合物または要素であり、その使用によって、それらが付着するペプチドま
たはタンパク質を検出することが可能となる。そして、さらに、所望である場合
定量される。E. Diagnostic Compounds A particular example of a protein conjugate is a conjugate wherein a protein sequence (eg, a peptide comprising a pIgR binding domain) is linked to a detectable label. A "detectable label" is a compound or element that can be detected due to its specific functional or chemical characteristics, the use of which makes it possible to detect the peptide or protein to which it is attached . And, if desired, it is quantified.

【００９４】 多くの適切な造影剤が当該分野で公知である。例えば、タンパク質のその造影
剤のの付着のための方法 （例えば、米国特許第５，０２１，２３６号および同
第４，４７２，５０９号を参照のこと、これら両方は、本明細書において参考と
して援用される）。特定の付着方法は、金属キレート錯体の使用を含む。これは
、例えば、抗体に付着したＤＴＰＡのような有機キレート剤を使用する（米国特
許第４，４７２，５０９号）。タンパク質配列もまた、グルタルアルデヒドまた
は過ヨウ素酸塩のような結合剤（カップリング剤）の存在下で酵素と反応され得
る。フルオレセインマーカーとの結合体は、これらの結合剤の存在下またはイソ
チオシアネートとの反応によって調製される。ローダミンマーカーもまた調製さ
れ得る。[0094] Many suitable contrast agents are known in the art. For example, methods for the attachment of proteins to their contrast agents (see, for example, US Pat. Nos. 5,021,236 and 4,472,509, both of which are incorporated herein by reference). Incorporated). Certain attachment methods include the use of metal chelate complexes. This uses, for example, an organic chelating agent such as DTPA attached to the antibody (US Pat. No. 4,472,509). Protein sequences can also be reacted with an enzyme in the presence of a binding agent such as glutaraldehyde or periodate. Conjugates with fluorescein markers are prepared in the presence of these binders or by reaction with isothiocyanates. Rhodamine markers can also be prepared.

【００９５】 常磁性イオンの場合、例示の目的で、以下のようなイオンに言及し得る：クロ
ム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ
）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ
）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）
、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）お
よびエルビウム（ＩＩＩ）。ここで、ガドリニウムが特に好ましい。In the case of paramagnetic ions, mention may be made, by way of example, of the following ions: chromium (III), manganese (II), iron (III), iron (II), cobalt (II)
), Nickel (II), copper (II), neodymium (III), samarium (III)
), Ytterbium (III), gadolinium (III), vanadium (II)
, Terbium (III), dysprosium (III), holmium (III) and erbium (III). Here, gadolinium is particularly preferred.

【００９６】 他の状況（Ｘ線造影）において有用なイオンとしては以下が挙げられるがそれ
らに限定されない：ランタンＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、および特に
ビスマス （ＩＩＩ）。[0096] Ions useful in other situations (X-ray imaging) include, but are not limited to, lanthanum III), gold (III), lead (II), and especially bismuth (III).

【００９７】 治療適用および／または診断適用のための放射性同位体の場合、以下に言及し
得る：²¹¹アスタチン、¹⁴炭素、⁵¹クロム、³⁶塩素、⁵⁷コバルト、⁵⁸コバルト、^{6 7} 銅、¹⁵²Ｅｕ、⁶⁷ガリウム、³水素、¹²³ヨウ素、¹²⁵ヨウ素、¹³¹ヨウ素、¹¹¹イ
ンジウム、⁵⁹鉄、³²リン、¹⁸⁶レニウム、¹⁸⁸レニウム、⁷⁵セレン、³⁵イオウ、^{99 m} テクネチウムおよび⁹⁰イットリウム。¹²⁵ヨウ素がしばしば特定の実施形態にお
いて好ましく、そして^99mテクネチウムおよび¹¹¹インジウムがもまたしばしば、
その低エネルギーおよび超範囲の検出のための適性に起因して好ましい。[0097] For therapeutic applications and / or diagnostic applications radioisotopes for, it may be mentioned the following: ²¹¹ astatine, ¹⁴ carbon, ⁵¹ chromium, ³⁶ chlorine, ⁵⁷ cobalt, ⁵⁸ cobalt, ^{6 7} copper, ¹⁵² Eu, ⁶⁷ gallium, ³ hydrogen, ¹²³ iodine, ¹²⁵ iodine, ¹³¹ iodine, ¹¹¹ indium, ⁵⁹ iron, ³² phosphorus, ¹⁸⁶ rhenium, ¹⁸⁸ rhenium, ⁷⁵ selenium, ³⁵ sulfur, ^{99 m} technetium and ⁹⁰ yttrium. ¹²⁵ iodine is often preferred in certain embodiments, and ^99m technetium and ¹¹¹ indium are also often
Preferred due to its low energy and suitability for detection in the ultra-range.

【００９８】 （Ｆ．免疫治療、伝統的化学療法、放射線療法または他の抗ガン剤との組合せ
治療） 多くの治療において、１を超える機能性治療を提供することが有利である。そ
のような「組合せ治療」は、多剤耐性（ＭＤＲ）癌の処置局面において、および
抗生物質耐性細菌感染において特に重要であり得る。従って、本発明の１つの局
面は、ｐＩｇＲ結合ドメインを利用して、疾患の処置のための粘膜上皮へ治療化
合物を送達しながら、他方で、第二の治療（標的化であれ、非標的化であれ）も
また、提供される。F. Immunotherapy, Traditional Chemotherapy, Radiation Therapy or Combination Therapy with Other Anticancer Agents In many treatments, it is advantageous to provide more than one functional treatment. Such "combination therapy" can be particularly important in the treatment phase of multidrug resistant (MDR) cancer and in antibiotic resistant bacterial infections. Thus, one aspect of the invention utilizes the pIgR binding domain to deliver a therapeutic compound to the mucosal epithelium for the treatment of disease, while on the other hand a second therapeutic (targeted or non-targeted). Is also provided.

【００９９】 非標的化処置は、数分から数週間の範囲の間隔を置いてその標的化薬剤処置の
前または後であり得る。他の薬剤および発現構築物が別々の細胞に適用される実
施形態において、一般に、有意な期間が、各送達の時間の間に経たないことを確
実にし、その結果、その薬剤および発現構築物が、なおも、その細胞に対して有
利に組み合わされた効果を発揮し得る。そのような場合において、互いに約１２
〜２４時間以内に、より好ましくは、約６〜１２時間以内の両方の様相とその細
胞を接触させることが意図される。ここで、約１２時間のみの遅延時間が最も好
ましい。特定の場合において、処置のために有意にその期間を延長することが所
望され得るが、ここで、数日（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、
２、３、４、５、６、７または８）がそれぞれの投与の間の間に経過する。The non-targeted treatment may be before or after the targeted drug treatment at intervals ranging from minutes to weeks. In embodiments where the other agent and expression construct are applied to separate cells, generally ensuring that no significant period of time has elapsed between each delivery time, so that the agent and expression construct are still intact. Can also exert an advantageously combined effect on the cell. In such a case, about 12
It is contemplated that the cell will be contacted with both aspects within 、 24 hours, more preferably within about 6-12 hours. Here, a delay time of only about 12 hours is most preferred. In certain cases, it may be desirable to extend the period significantly for treatment, where several days (2, 3, 4, 5, 6, or 7) to several weeks (1,
2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8) elapse between each administration.

【０１００】 いずれかの薬剤の一回の投与が所望されることもまた意図され得る。種々の組
合せが使用され得る。ここで、その標的化された薬剤は、「Ａ」および非標的化
された薬剤は「Ｂ」とすると、以下のように例示される： Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／
Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ Ａ／Ｂ／
Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ。It may also be contemplated that a single administration of any agent is desired. Various combinations can be used. Here, assuming that the targeted drug is “A” and the non-targeted drug is “B”, A / B / AB / A / BB / B / B / A A / A / B B / A / A A / B / B
B / B / B / AB / B / A / BA / A / B / BA / B / A / BA / B /
B / A B / B / A / A B / A / B / AB / A / A / B B / B / B / A
A / A / A / B B / A / A / A A / B / A / A A / A / B / A A / B /
B / B B / A / B / B B / B / A / B.

【０１０１】 他の組合せも意図される。例えば、本発明の状況において、本発明の粘膜表皮
標的化治療は、非標的化抗ガン剤と使用され得る。これには、化学療法介入また
は放射性治療介入が含まれる。細胞を殺傷、細胞増殖を阻害、転移を阻害、血管
新生を阻害、または他の方法で腫瘍細胞の悪性表現型を反転またはあ減少させる
ために、本発明の方法および組成物を使用して、概して、「標的」細胞を、標的
化薬剤／治療剤および少なくとも１つの他の薬剤と接触させる。これらの組成物
は、これらの目標を達成するに有効な組合せ量で提供される。このプロセスは、
発現構築物および薬剤または因子に同時にその細胞を接触させる工程を包含する
。これは、その細胞に、単一の組成物または両方の薬剤を含む薬理学的処方物を
接触させることによって、または２つの異なる組成物もしくは処方物に同時に接
触させることによって、達成され得る。ここで、１つの組成物は、発現構築物を
含み、そして他方は、その薬剤を含む。あるいは、腫瘍サプレッサー遺伝子、ア
ンチセンスオンコジーンまたはオンコジーン特異的リボザイムを含む遺伝子治療
処置が使用され得る。Other combinations are also contemplated. For example, in the context of the present invention, the mucosal epidermal targeted therapy of the present invention may be used with a non-targeted anti-cancer agent. This includes chemotherapy or radiotherapy intervention. Using the methods and compositions of the present invention to kill cells, inhibit cell proliferation, inhibit metastasis, inhibit angiogenesis, or otherwise reverse or reduce the malignant phenotype of tumor cells, Generally, "target" cells are contacted with a targeting agent / therapeutic agent and at least one other agent. These compositions are provided in effective combinations to achieve these goals. This process is
Contacting the cell with the expression construct and the agent or agent simultaneously. This can be achieved by contacting the cells with a single composition or a pharmacological formulation containing both agents, or by simultaneously contacting two different compositions or formulations. Here, one composition includes the expression construct and the other includes the agent. Alternatively, gene therapy treatments involving tumor suppressor genes, antisense oncogenes or oncogene-specific ribozymes can be used.

【０１０２】 組合せ癌治療において使用するために適切な薬剤または因子は、後願活性を有
する任意の化学化合物または処置方法であり、従って、本明細書のいたるところ
で使用される用語「抗癌」は、抗癌活性を有する薬剤をいう。これらの化合物ま
たは方法は、アルキル化剤、トポイソメラーゼＩインヒビター、トポイソメラー
ゼインヒビターＩＩ、ＲＮＡ／ＤＮＡ抗代謝産物、ＤＮＡ抗代謝産物、抗有糸分
裂薬剤、およびＤＮＡ損傷剤が挙げられ。これらは、細胞に適用されるときにＤ
ＮＡ傷害を誘発する。Agents or factors suitable for use in combination cancer therapy are any chemical compound or method of treatment having posterior activity, and thus the term “anti-cancer” as used herein , A drug having anticancer activity. These compounds or methods include alkylating agents, topoisomerase I inhibitors, topoisomerase inhibitors II, RNA / DNA antimetabolites, DNA antimetabolites, antimitotic agents, and DNA damaging agents. These are D when applied to cells
Induces NA injury.

【０１０３】 アルキル化剤の例としては、とりわけ、クロラムブシル、シスプラチン、シク
ロジソン、フルロドパン、メチルＣＣＮＵ、ピペラジンジオン、テロキシロンが
挙げられる。トポイソメラーゼＩインヒビターは、以下のような化合物を含む：
カムプトテシン誘導体、およびモルフォールイノドキソルビシン。ドキソルビシ
ン、ピラゾールアクリジン、ミトキサントロン、およびルビダゾンは、トポイソ
メラーゼＩＩインヒビターの例示である。ＲＮＡ／ＤＮＡ抗代謝産物としては、
Ｌ−アラノシン、５−フルオロウラシル、アミノプテリン誘導体、メトトレキサ
ート、およびピラゾフリンが挙げられ；他方、ＤＮＡ抗代謝産物グループとして
は、例えば、以下が挙げられる：ａｒａ−Ｃ、グアノゾール、ヒドロキシ尿素、
チオプリン。代表的な抗有糸***薬剤は、コルヒチン、リゾキシン、タキソール
、およびビンブラスチン硫酸を含む。他の薬剤および因子としては、ＤＮＡ損傷
を引き起こす放射線および波（例えば、γ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、
電離放射など）が挙げられる。種々の抗癌剤（「化学療法剤」とも記載される）
は、ＤＮＡ傷害を誘発するように機能し、これらはすべて、本明細書において開
示される組合せ処置方法において有用であることが意図される。有用であること
が意図される化学療法剤としては、例えば、以下が挙げられる：アドリアマイシ
ン、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−１
６）、カムプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチ
ン（ＣＤＤＰ）、ポドフィロトキシン、ベラパミル、およびさらに過酸化水素。
本発明はまた、放射線ベースであれ、実際の化合物であれ、１つ以上のＤＮＡ損
傷剤の組合せ使用を包含する（例えば、Ｘ線とシスプラチンとの使用、またはシ
スプラチンとエトポシドとの使用）。Examples of alkylating agents include chlorambucil, cisplatin, cyclodisone, flurodopan, methyl CCNU, piperazinedione, teloxylone, among others. Topoisomerase I inhibitors include the following compounds:
Camptothecin derivatives, and morpholinodoxorubicin. Doxorubicin, pyrazole acridine, mitoxantrone, and ruvidazone are examples of topoisomerase II inhibitors. RNA / DNA antimetabolites include:
L-alanosine, 5-fluorouracil, aminopterin derivatives, methotrexate, and pyrazofurin; while the DNA antimetabolites group includes, for example: ara-C, guanozole, hydroxyurea,
Thiopurine. Representative anti-mitotic agents include colchicine, rhizoxin, taxol, and vinblastine sulfate. Other agents and factors include radiation and waves that cause DNA damage (eg, gamma irradiation, X-rays, UV irradiation, microwaves,
Ionizing radiation). Various anticancer agents (also described as "chemotherapeutic agents")
Function to induce DNA damage, all of which are intended to be useful in the combination treatment methods disclosed herein. Chemotherapeutic agents intended to be useful include, for example: adriamycin, bleomycin, 5-fluorouracil (5FU), etoposide (VP-1)
6), camptothecin, actinomycin-D, mitomycin C, cisplatin (CDDP), podophyllotoxin, verapamil, and even hydrogen peroxide.
The invention also encompasses the combined use of one or more DNA damaging agents, whether radiation based or actual compounds (eg, the use of X-rays and cisplatin, or the use of cisplatin and etoposide).

【０１０４】 当業者は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ」第１５版、第３３節、特に６２４−６５２頁を参酌されたい。投
薬量においていくらかの変動が、処置されるべき被験体の状態に応じて必然的に
生じる。投与責任者は、いずれにせよ、個々の被験体について適切な用量を決定
する。さらに、ヒト投与について、調製物は、滅菌性、発熱物質、一般的安全性
および純度標準を、ＦＤＡ局によって必要とされる生物学的標準に応じて満たさ
ねばならない。Those skilled in the art will appreciate that “Remington's Pharmaceutical Sc
issues, 15th edition, section 33, especially pages 624-652. Some variation in dosage will necessarily occur depending on the condition of the subject to be treated. The person responsible for administration will, in any event, determine the appropriate dose for the individual subject. In addition, for human administration, preparations must meet sterility, pyrogen, general safety and purity standards as appropriate to biological standards required by the FDA.

【０１０５】 本発明者らは、粘膜上皮を介して達し得る癌、前癌または過剰増殖状態を有す
る患者における粘膜上皮に対して標的化される治療的／予防剤の局所的、領域的
送達が臨床的疾患を中和するための治療的に有効な化合物について非常に効率よ
い方法であることを提唱する。同様に、化学療法または放射線療法は、被験体の
身体の特定の罹患した領域に指向され得る。あるいは、化合物および／または薬
剤の全身送達は、特定の環境、例えば、広汎な転移が起こっている場合において
適切であり得る。We have found that local, regional delivery of therapeutic / prophylactic agents targeted to the mucosal epithelium in patients with cancer, precancerous or hyperproliferative conditions that can be reached via the mucosal epithelium. It proposes a very efficient way for therapeutically effective compounds to neutralize clinical diseases. Similarly, chemotherapy or radiation therapy may be directed to a particular affected area of the subject's body. Alternatively, systemic delivery of the compound and / or agent may be appropriate in certain circumstances, for example, where extensive metastasis has occurred.

【０１０６】 粘膜上皮標的化治療を、化学療法および放射線療法と組み合わせることに加え
て、遺伝子両方との組合せが有利であることもまた意図される。例えば、以下の
組合せを使用する粘膜上皮の標的化もまた本発明の範囲内に含まれる：ｐ５３、
ｐｌ６、ｐ２１、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＢＣＲＡ２、ｐ
ｌ６、ＦＨＩＴ、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、
ＦＣＣもしくはＭＣＣ、または以下のアンチセンス型：オンコジーンｒａｓ、ｍ
ｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇ
ｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｌもしくはａｂｌ。In addition to combining mucosal epithelial targeted therapy with chemotherapy and radiation therapy, it is also contemplated that a combination with both genes may be advantageous. For example, targeting mucosal epithelia using the following combinations is also within the scope of the invention: p53,
p16, p21, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, BCRA2, p
16, FHIT, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL,
FCC or MCC, or the following antisense types: oncogene ras, m
yc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, g
sp, hst, bcl or abl.

【０１０７】 別の例の組合せ治療は、細菌感染の処置においてである。おそらく、組合せは
、（ａ）２つの薬物または（ｂ）薬物および抗体である。種々の抗生物質として
は以下が挙げられる：フルオロキノロン（ペフロキサシン、ノルフロキサシン、
シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、エノキサシン、フレ
ロキサシン、ロメフロキサシン、テモフロキサシン、アミフロキサシン、トスフ
ロキサシン、フルメキン、ルフロキサシン、クリナフロキサシン）、ペニシリン
類（ペニシリンＧもしくはＶ、メチシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロロ
キサシリン、ジクロキサシリイン、アンピシリン、アモキシシリン、カルボベニ
シリン、チカルシリン、アズロシリン、メクソロシリン、ピペラシリン）、スル
ホンアミド類（スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファジアジ
ン、スルフイソオキサゾール、スルフアセトアミド）、セファロスポリン類（セ
ファロチン、セファピリン、セファゾリン、セファレキシン、セフラジン、セフ
ァドキシル、セファマナドール、セフォキシチン、セファクロル、セフルオキシ
ム、セフォニシド、セフォテタン、セフォラニド、セフォタキシム、セフチゾキ
シム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム）、アミノグリコシド
類（ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、アミカシン、カナマイ
シン、ネオマイシン）、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ライコマイシン
、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、バンコマイシン、およびストレプト
マイシン。抗真菌剤（アムホテリシンＢ、フルシトシン（ｆｌｙｃｙｔｏｓｉｎ
ｅ）、ケトコナゾール、フルコナゾール、グリセオフルビン、クロトリマゾール
、エコナゾール、ミコナゾール、シクロピロクスオラミン（ｃｉｃｌｏｐｉｒｏ
ｘ ｏｌａｍｉｎｅ）、ハルプロゲイン、トルナフテート、ナフチフィン、ナタ
マイシンおよびニスタチン）ならびに抗ウイルス剤 （ＡＺＴ、アシクロビル、
ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルイリジン、フォスル
ネット、αインターフェロン、アマチジン、リバビリンおよびリマンチジン）も
また、これらの疾患の治療において有用である。[0107] Another example combination therapy is in the treatment of a bacterial infection. Possibly, the combination is (a) two drugs or (b) a drug and an antibody. Various antibiotics include: fluoroquinolones (pefloxacin, norfloxacin,
Ciprofloxacin, ofloxacin, levofloxacin, enoxacin, fleloxacin, lomefloxacin, temofloxacin, amifloxacin, tosfloxacin, flumequin, rufloxacin, clinafloxacin), penicillins (penicillin G or V, methicillin, oxacillin, nafcilillin, cloxicilin, chloroxillin, chloroxillin, chlorixillin, chloroxillin, chloroxillin, chloroxillin, chloroxillin) Oxacillin, ampicillin, amoxicillin, carbovenicillin, ticarcillin, azlocillin, mexolocillin, piperacillin), sulfonamides (sulfanilamide, sulfamethoxazole, sulfadiazine, sulfisoxazole, sulfacetoamide), cephalosporins ( Cephalotin, cefapirin, cefazolin, cephalexin, cefradine, cephadoxyl, cepha Nadol, cefoxitin, cefaclor, cefluoxime, cefoniside, cefotetan, ceforanid, cefotaxime, ceftizoxime, ceftriaxone, cefoperazone, ceftazidime), aminoglycosides (gentamicin, tobramycin, netilmycin, amicacin, kanamycin, neomycin, tetramycin, tetralomycin Clindamycin, spectinomycin, vancomycin, and streptomycin. Antifungal agents (amphotericin B, flucytosin (flycytosin)
e), ketoconazole, fluconazole, griseofulvin, clotrimazole, econazole, miconazole, ciclopirox olamine (cyclopiro)
x olamine), halprogain, tolnaftate, naftifine, natamycin and nystatin) and antiviral agents (AZT, acyclovir,
Ganciclovir, vidarabine, idoxuridine, trifluridine, fosulnet, alpha interferon, amatidin, ribavirin and rimantidine) are also useful in the treatment of these diseases.

【０１０８】 本明細書上記に列挙した薬剤はまた、個々に使用して、ｐＩｇＲによる粘膜上
皮への標的化を用いて、関連状態を処置し得ることが復唱されるべきである。It should be reiterated that the agents enumerated herein above can also be used individually to treat related conditions using targeting to the mucosal epithelium by pIgR.

【０１０９】 （ＩＩ．調製方法） 本発明の化合物は、標的化薬剤およびある実施形態において、治療剤または診
断剤を包含する。本発明の標的化剤は、化学的結合体化（例えば、架橋）または
、組換えＤＮＡ技術によるかのいずれかによって、治療剤または診断剤に対して
連結されるか、または作動可能に付着されて、その化合物が生成され得る。II. Methods of Preparation The compounds of the present invention include targeting agents and, in certain embodiments, therapeutic or diagnostic agents. The targeting agents of the invention are linked or operably attached to a therapeutic or diagnostic agent, either by chemical conjugation (eg, cross-linking) or by recombinant DNA technology. Thus, the compound can be produced.

【０１１０】 （Ａ．タンパク質精製） ｐＩｇＲ結合ドメインおよび選択剤を含む組成物を調製するために、組成物ま
たはその改変体を精製することが所望され得る。本発明の１つの実施形態に従っ
て、ｐＩｇＲ結合ドメインを含むペプチドの精製は、最終的に、選択剤を有する
このドメインと作動可能に連結させ得る。タンパク質精製技術は、当業者に周知
である。これらの技術としては、あるレベルでは、ポリペプチドおよび非ポリペ
プチド画分に対する細胞環境の粗製画分を含む。ポリペプチドが他のタンパク質
から分離されると、目的のポリペプチドは、クロマトグラフ技術および電気泳動
技術を用いてさらに精製されて、部分精製または完全精製（または均一に精製）
され得る。純粋なペプチドの調製に特に適した分析的方法は、イオン交換クロマ
トグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等
電点フォーカシングである。ペプチドを精製する特に効率よい方法は、ＦＰＬＣ
またはＨＰＬＣでさえある。A. Protein Purification To prepare a composition comprising a pIgR binding domain and a selection agent, it may be desirable to purify the composition or a variant thereof. Purification of the peptide containing the pIgR binding domain, according to one embodiment of the invention, may ultimately be operably linked to this domain with the selection agent. Protein purification techniques are well-known to those of skill in the art. These techniques include, at one level, crude fractions of the cellular environment for polypeptide and non-polypeptide fractions. Once the polypeptide has been separated from other proteins, the polypeptide of interest can be further purified using chromatographic and electrophoretic techniques to achieve partial or complete purification (or homogeneous purification).
Can be done. Analytical methods particularly suitable for the preparation of pure peptides are ion exchange chromatography, exclusion chromatography; polyacrylamide gel electrophoresis; isoelectric focusing. A particularly efficient method of purifying peptides is FPLC
Or even HPLC.

【０１１１】 本発明の特定の局面は、ＩｇＡまたはｐＩｇＲ結合ドメインの精製に関し、そ
して特定の実施形態において、ＩｇＡまたはｐＩｇＲ結合ドメインの実質的な精
製に関する。本明細書において使用される用語「精製されたタンパク質またはペ
プチド」は、他の成分から単離可能な組成物をいうことが意図される。ここで、
そのタンパク質またはペプチドは、その天然に入手可能な状態に対して任意の程
度にまで精製される。従って、精製されたタンパク質またはペプチドはまた、そ
れが天然に存在し得る環境から遊離しているタンパク質またはペプチドをいう。Certain aspects of the invention relate to the purification of an IgA or pIgR binding domain, and in certain embodiments, to the substantial purification of an IgA or pIgR binding domain. The term “purified protein or peptide” as used herein is intended to refer to a composition that can be isolated from other components. here,
The protein or peptide is purified to any degree relative to its naturally available state. Thus, a purified protein or peptide also refers to a protein or peptide that is free from the environment in which it can naturally occur.

【０１１２】 一般に「精製（された）」とは、タンパク質またはペプチドの組成物（例えば
、ｐＩｇＲ結合ドメイン）であって、分画に供されて種種の他の成分がのぞかれ
たものをいい、そしてその組成物は、その発現された生物学的活性を保持する。
用語「実質的に精製された」が使用される場合、この表現は、そのタンパク質ま
たはペプチドがその組成物の主要成分を形成する組成物をいい、それは例えば、
以下を構成する：その組成物において、約５０％、約６０％、約７０％、約８０
％、約９０％、約９５％またはそれを超えるタンパク質。In general, “purified” refers to a protein or peptide composition (eg, a pIgR binding domain) that has been subjected to fractionation to remove any other components. And the composition retains its expressed biological activity.
When the term "substantially purified" is used, the expression refers to a composition in which the protein or peptide forms a major component of the composition, for example,
Comprising: in the composition, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%;
%, About 90%, about 95% or more protein.

【０１１３】 そのタンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための種々の方法は、
本開示に照らし、当業者には公知である。これらには、例えば、以下が包含され
る：活性タンパク質の比活性を決定すること、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画
分内のポリペプチドの量を評価すること。ある画分の純度を評価するための好ま
しい方法は、その画分の比活性を算出すること、それを、最初の抽出物の比活性
を比較すること、および従って純度の程度を算出することを含み、本明細書にお
いて、「〜倍の精製数値」によって評価される。活性の量を表すのに使用される
実際の単位は、当然、その精製に従うように選択した特定のアッセイ技術、およ
び発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存す
る。Various methods for quantifying the degree of purification of the protein or peptide include:
In light of the present disclosure, those skilled in the art are well-known. These include, for example: determining the specific activity of the active protein, assessing the amount of polypeptide in the fraction by SDS / PAGE analysis. A preferred method for assessing the purity of a fraction is to calculate the specific activity of that fraction, compare it to the specific activity of the initial extract, and thus calculate the degree of purity. And is herein evaluated by "-fold purification value". The actual units used to describe the amount of activity will, of course, depend on the particular assay technique chosen to follow its purification, and whether the expressed protein or peptide exhibits detectable activity.

【０１１４】 タンパク質精製において使用するために適切な種々の技術は、当業者に周知で
ある。これらには、例えば以下が挙げられるがそれらに限定されない：硫酸アン
モニウム、ＰＥＧ、抗体などでの沈降または熱変性に続いて、遠心分離；イオン
交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、およびアフィニティークロマ
トグラフィーのようなクロマトグラフィー；等電点フォーカシング；ゲル電気泳
動；ならびにそのようなおよび他の技術の組合せ。当該分野において一般に知ら
れるように、種々の精製工程を行う順番が変更され得、または特定の工程が省略
され得、そしてなお、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製のた
めの適切な方法を生じると考えられる。Various techniques suitable for use in protein purification are well-known to those of skill in the art. These include, but are not limited to: precipitation or thermal denaturation with ammonium sulfate, PEG, antibodies, etc., followed by centrifugation; ion exchange, gel filtration, reverse phase, hydroxylapatite, and affinity chromatography. Chromatography such as; isoelectric focusing; gel electrophoresis; and combinations of such and other techniques. As is generally known in the art, the order in which the various purification steps are performed may be altered, or certain steps may be omitted, and still suitable methods for the preparation of substantially purified proteins or peptides It is thought to produce

【０１１５】 タンパク質またはペプチドは、その最も精製された状態において常に提供され
る一般的な要件はない。実際、あまり実質的に精製されていない生産物が特定の
実施形態において有用性を有することが意図される。部分精製は、組合せにおい
てより少ない精製工程を使用するか、または一般の同じ精製スキームとは異なる
形態を利用することによって達成され得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実
施されるカチオン交換カラムクロマトグラフィーが、低圧クロマトグラフィー系
を利用した同じ技術よりも一般により大きな「倍数」精製を生じることが理解さ
れる。より低い程度の相対精製度を示す方法は、タンパク質産物の総回収におい
て、または発現されたタンパク質の活性を維持するにおいて有利で有り得る。There is no general requirement that a protein or peptide always be provided in its most purified state. Indeed, it is contemplated that less substantially purified products will have utility in certain embodiments. Partial purification can be achieved by using fewer purification steps in combination or by utilizing a different form than the same general purification scheme. For example, it is understood that cation exchange column chromatography performed utilizing an HPLC instrument generally results in a larger "fold" purification than the same technique utilizing a low pressure chromatography system. Methods exhibiting a lower degree of relative purity may be advantageous in total recovery of the protein product or in maintaining the activity of the expressed protein.

【０１１６】 ポリペプチドの移動が、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件においてときに顕著に
変動し得ることは公知である（Ｃａｐａｌｄｉら、１９７７）。従って、異なる
電気泳動状態のもとで、精製されたかまたは部分精製された発現産物の見かけ上
の分子量が変動し得ることは理解される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）は、高度の解像度のピークをもって非常に迅速な分離によって特徴付けられ
る。このことは、非常に細かい粒子および適切な流速を維持するための高圧の使
用によって達成される。分離は、数分で達成されるか、長くても１時間である。
さらに、非常に小さな容量のサンプルのみが必要である。なぜなら、その粒子は
、空隙容量が非常に小さな割合のベッド容量であるように小さくかつ密封して充
填されているからである。また、サンプルの濃度は、非常に高くある必要はない
。なぜなら、そのバンドは、そのサンプルの非常に小さな拡散が存在するように
非常に小さいからである。It is known that polypeptide migration can sometimes vary significantly under different conditions of SDS / PAGE (Capaldi et al., 1977). Thus, it is understood that the apparent molecular weight of a purified or partially purified expression product may vary under different electrophoretic conditions. High Performance Liquid Chromatography (HPL
C) is characterized by a very rapid separation with a high resolution peak. This is achieved by the use of very fine particles and high pressure to maintain a proper flow rate. Separation is achieved in minutes or at most one hour.
In addition, only very small volumes of sample are required. This is because the particles are small and hermetically packed such that the void volume is a very small percentage of the bed volume. Also, the concentration of the sample need not be very high. Because the band is so small that there is very little diffusion of the sample.

【０１１７】 ゲルクロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーは、分子サイズ
に基づく、特定の型の分画クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィー
の理論は、小さな孔を含む不活性の物質の小さな粒子を用いて調製されるカラム
がより小さな分子からより大きな分子を、それらがその大きさに依存してその孔
を通ってまたは周りを通過するにつれて分離することである。従って、分子は、
その形状が比較的定常である限り、サイズが減少するにおいてそのカラムから溶
出される。ゲルクロマトグラフィーは、異なる大きさの分子を分離するためには
卓越している。なぜなら、分離は、ｐＨ、イオン強度、温度などの他の多くの因
子から独立しているからである。実質的に吸収はなく、ほとんどゾーン拡がりも
なく、そしてその溶出容量は、単純に分子量の問題に関連する。Gel chromatography or molecular sieving chromatography is a specific type of fractional chromatography based on molecular size. The theory of gel chromatography is that columns prepared using small particles of an inert substance containing small pores move from smaller molecules to larger molecules, through their pores depending on their size or To separate as you pass around. Thus, the molecule is
As long as its shape is relatively steady, it elutes from the column in decreasing size. Gel chromatography is excellent for separating molecules of different sizes. This is because the separation is independent of many other factors such as pH, ionic strength, temperature and the like. There is virtually no absorption, little zone expansion, and its elution volume is simply related to molecular weight issues.

【０１１８】 アフィニティークロマトグラフィーは、単離される物質とそれが特異的に結合
し得る分子との間の特異的親和性に依存するクロマトグラフィー手順である。こ
れは、レセプターリガンド型の相互作用である。このカラム材料は、結合パート
ナーを不溶性のマトリクスに対して共有結合させることによって合成される。Affinity chromatography is a chromatography procedure that depends on the specific affinity between the substance to be isolated and the molecule to which it can specifically bind. This is a receptor ligand type interaction. This column material is synthesized by covalently binding the binding partner to an insoluble matrix.

【０１１９】 次いで、カラム材料は、その溶液からその物質を特異的に吸収し得る。溶出は
、その条件を、結合が起こらないような条件に変更する（例えば、ｐＨ、イオン
強度および温度を変える）ことによって生じる。炭水化物を含む化合物の精製に
おいて有用であるアフィニティークロマトグラフィーの特定の型は、レクチンア
フィニティークロマトグラフィーである。レクチンは、種々のポリサッカリドお
よび糖タンパク質に結合する物質のクラスである。レクチンは、通常、シアノゲ
ンブロミドによってアガロースに結合される。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合された
コンカナバリンＡは、使用されるべきこのタイプの第一の材料であり、そしてレ
ンズマメレクチン、コムギ麦芽凝集素（これは、Ｎアセチルグルコサミニル残基
の精製において有用である）およびＨｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａレクチンのよう
に、ポリサッカリドおよび糖タンパク質の単離において広汎に使用されている。
レクチン自体は、炭水化物リガンドを有するアフィニティークロマトグラフィー
を用いて精製される。ラクトースは、ひまし油およびピーナツからレクチンを精
製するために使用されている；マルトースは、レンズマメおよナタマメ；Ｎ−ア
セチル−Ｄガラクトサミンを、ダイズからレクチンを精製するために使用する；
Ｎ−アセチルグルコサミニルは、コムギ麦芽からのレクチンを結合する；Ｄ−ガ
ラクトサミンは、クラム（ｃｌａｍ）からのレクチンを得る際に使用され、そし
てＬ−フコースは、ロータスからのレクチンに結合する。The column material can then specifically absorb the substance from the solution. Elution occurs by changing the conditions to such that binding does not occur (eg, changing pH, ionic strength, and temperature). A particular type of affinity chromatography that is useful in purifying compounds containing carbohydrates is lectin affinity chromatography. Lectins are a class of substances that bind to various polysaccharides and glycoproteins. Lectins are usually bound to agarose by cyanogen bromide. Concanavalin A bound to Sepharose is the first material of this type to be used, and lentil lectin, wheat malt agglutinin, which is useful in the purification of N-acetylglucosaminyl residues and Like Helix pomatia lectin, it is widely used in the isolation of polysaccharides and glycoproteins.
The lectin itself is purified using affinity chromatography with a carbohydrate ligand. Lactose has been used to purify lectins from castor oil and peanuts; maltose uses lentils and beans; N-acetyl-D-galactosamine to purify lectins from soybean;
N-acetylglucosaminyl binds lectin from wheat malt; D-galactosamine is used in obtaining lectin from clam, and L-fucose binds lectin from lotus.

【０１２０】 マトリクスは、任意の有意な程度にまで分子をそれ自身が吸収せず、そして広
い範囲の化学的、物理的、および熱学的安定性を有する物質であるべきである。
そのリガンドは、その結合特性に影響を与えないような方法で結合されるべきで
ある。そのリガンドはまた、比較的強固な結合を提供すべきである。そして、そ
のサンプルまたはそのリガンドを破壊することなく溶出することも可能であるべ
きである。アフィニティークロマトグラフィーの最も共通する形態の一つは、免
疫アフィニティークロマトグラフィーである。本発明に従う使用のために適切な
抗体の生成を以下に議論する。The matrix should be a material that does not itself absorb molecules to any significant degree and has a wide range of chemical, physical, and thermal stability.
The ligand should be bound in such a way as not to affect its binding properties. The ligand should also provide relatively tight binding. It should also be possible to elute without destroying the sample or its ligand. One of the most common forms of affinity chromatography is immunoaffinity chromatography. The generation of antibodies suitable for use in accordance with the present invention is discussed below.

【０１２１】 （１．合成ペプチド） 本発明はまた、本発明の種々の実施形態における使用のためのｐＩｇＲ結合ド
メイン（ＩｇＡ Ｃα３ペプチドを含む）を記載する。本発明内に含まれるのは
、ＩｇＡの対応する領域よりさえ大きな、ｐＩｇＲに対する結合親和性を実証す
るペプチドである。本発明のペプチドは、従来技術に従って液体中でまたは固体
支持体において合成され得る。種々の自動合成器が市販されており、そして公知
のプロトコルに従って使用され得る。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ
、（１９８４）；Ｔａｍら、（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、（１９８６
）；ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９７９）を参照の
こと、その各々は、本明細書において参考として援用される。短いペプチド配列
または重複するペプチドのライブラリー（通常約６〜約３５〜５０アミノ酸）（
これは、本明細書に記載される選択される領域に対応する）が容易に合成され得
、そして次いで反応性ペプチドを同定するように設計されるスクリーニングアッ
セイにおいてスクリーニングされる。少なくとも約１０、１１、１２、１３、１
４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２
６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３
８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０、５５、６０、６５、７
０、７５、８０、８５、９０、９５ または約１００までのアミノ酸残基を有す
るペプチドは、本発明によって意図される。1. Synthetic Peptides The present invention also describes pIgR binding domains (including IgA Cα3 peptides) for use in various embodiments of the present invention. Included within the invention are peptides that demonstrate a greater binding affinity for pIgR than even the corresponding region of IgA. The peptides of the invention can be synthesized in liquid or on a solid support according to conventional techniques. Various automatic synthesizers are commercially available and can be used according to known protocols. For example, Stewart and Young
Tam et al., (1983); Merrifield, (1986).
); And Barany and Merrifield (1979), each of which is incorporated herein by reference. Libraries of short peptide sequences or overlapping peptides (typically about 6 to about 35 to 50 amino acids) (
This corresponds to the selected region described herein) can be readily synthesized and then screened in a screening assay designed to identify reactive peptides. At least about 10, 11, 12, 13, 1
4, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 2,
6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 3,
8, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 50, 55, 60, 65, 7
Peptides having 0, 75, 80, 85, 90, 95 or up to about 100 amino acid residues are contemplated by the present invention.

【０１２２】 本発明の組成物は、ｐＩｇＲ結合ドメインを含むペプチドを包含し得る。この
ドメインは、ｐＩｇＲ結合ドメイン能力を増強するため、またはそれを生物学的
に保護させるために改変されている。生物学的に保護されたペプチドは、ヒト被
験体に投与されるとき、および米国特許第５，０２８，５９２号（本明細書にお
いて参考として援用される）に開示されるように、保護されるペプチドがしばし
ば増強された薬理学的活性を示すときに、保護されていないペプチドよりも特定
の利点を有する。A composition of the invention may include a peptide comprising a pIgR binding domain. This domain has been modified to enhance the ability of the pIgR binding domain or to make it biologically protective. Biologically protected peptides are protected when administered to a human subject and as disclosed in US Pat. No. 5,028,592, which is incorporated herein by reference. Peptides have certain advantages over unprotected peptides when they often exhibit enhanced pharmacological activity.

【０１２３】 本発明において使用するための組成物はまた、すべてのＬ−アミノ酸、すべて
のＤ−アミノ酸、またはそれらの混合物を含むペプチドを包含し得る。Ｄ−アミ
ノ酸の使用は、ヒト身体において天然に見出されるプロテアーゼに対するさらな
る抵抗性を付与し得、そしてそれほど免疫原性がなく、そして従ってより長い生
物学的半減期を有すると予測され得る。A composition for use in the present invention may also include a peptide comprising all L-amino acids, all D-amino acids, or a mixture thereof. The use of D-amino acids may confer additional resistance to proteases found naturally in the human body, and may be expected to be less immunogenic and therefore have a longer biological half-life.

【０１２４】 （２．リンカー／カップリング剤） 所望される場合、ｐＩｇＲ結合ドメインのダイマーまたはマルチマー（例えば
、二量体ＩｇＡポリペプチド）および治療化合物または予防化合物は、生物学的
に放出可能な結合（例えば、選択的に切断可能なリンカーまたはアミノ酸配列）
を介して結合され得る。例えば、腫瘍環境において優先的に位置するかまたは活
性である酵素についての切断部位を含むペプチドリンカーが意図される。そのよ
うなペプチドリンカーの例示的形態は、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン
、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、またはメタロプロテイナーゼ（例えば、コラゲナ
ーゼ、ゲラチナーゼ、またはストロメライシン）によって切断されるペプチドリ
ンカーである。2. Linkers / Coupling Agents If desired, a dimer or multimer of a pIgR binding domain (eg, a dimeric IgA polypeptide) and a therapeutic or prophylactic compound can be a biologically releasable linkage. (Eg, a selectively cleavable linker or amino acid sequence)
Can be combined via For example, peptide linkers containing cleavage sites for enzymes that are preferentially located or active in the tumor environment are contemplated. Exemplary forms of such a peptide linker are peptide linkers that are cleaved by urokinase, plasmin, thrombin, factor IXa, factor Xa, or a metalloproteinase (eg, collagenase, gelatinase, or stromelysin).

【０１２５】 ｐＩｇＲ結合ドメインのマルチマーを含むペプチドがヘテロマー配列から構成
され得ることが意図される。ここで、ｐＩｇＲ結合配列は、互いに同一すなわち
ホモマー配列ではなく、ここでは、ｐＩｇＲ結合ドメイン配列は少なくとも１回
反復される。選択的に切断可能なリンカー、合成リンカーまたは他のアミノ酸配
列のようなアミノ酸を使用して、別のｐＩｇＲ結合ドメインからｐＩｇＲ結合ド
メインを分離し得る。あるいは、リンカー配列は少なくとも１つセットのｐＩｇ
Ｒ結合ドメインの間、およびｐＩｇＲ結合ドメインと選択剤または化合物との間
の両方で使用され得る。It is contemplated that peptides containing multimers of the pIgR binding domain may be composed of heteromeric sequences. Here, the pIgR binding sequences are not identical to each other, ie, are not homomeric sequences, wherein the pIgR binding domain sequence is repeated at least once. Amino acids such as selectively cleavable linkers, synthetic linkers or other amino acid sequences can be used to separate the pIgR binding domain from another pIgR binding domain. Alternatively, the linker sequence comprises at least one set of pIg
It can be used both between the R binding domain and between the pIgR binding domain and the selective agent or compound.

【０１２６】 さらに、標的化剤と毒素部分とを結合体化するように首尾よく使用され得るリ
ンカーを含む多数の型のジスルフィド結合が公知であるが、特定のリンカーは、
一般に、異なる薬理学的特徴および能力に基づいて他のリンカーよりも好ましい
。例えば、立体的に「障害を有する」ジスルフィド結合を含むリンカーは、イン
ビボでのより高い安定性に起因して好ましい。従って、作用部位での結合の前に
、その毒素部分の放出が予防される。さらに、本発明に従って、特定の利点が多
数の毒素部分のいずれかの使用を通じて現実化されるが、本発明者らは、リシン
Ａ鎖の使用、および皿により好ましくは脱グリコシル化Ａ鎖が特別の利益を提供
することを見出した。In addition, although many types of disulfide bonds are known, including linkers that can be successfully used to conjugate a targeting agent and a toxin moiety, certain linkers are
In general, they are preferred over other linkers based on different pharmacological characteristics and capabilities. For example, a linker containing a sterically "hindered" disulfide bond is preferred due to its higher stability in vivo. Thus, prior to binding at the site of action, release of the toxin moiety is prevented. Further, while certain advantages are realized in accordance with the present invention through the use of any of a number of toxin moieties, the present inventors have identified the use of ricin A chains, and more particularly, the deglycosylated A chains, Found to provide benefits.

【０１２７】 （ａ．生物学的架橋） 上記成分の任意の、標的化ペプチドへの結合は、一般に、イムノトキシンの調
製のために開発されるのと同じ技術を使用する。一般的なガイドラインとして、
イムノトキシンにおける使用のために適切である任意の生化学的架橋もまた、本
発明において有用であることが考慮され得、そしてさらなるリンカーもまた考慮
され得る。A. Biological Crosslinking The conjugation of any of the above components to the targeting peptide generally uses the same techniques as are developed for the preparation of immunotoxins. As a general guideline,
Any biochemical crosslinks that are suitable for use in immunotoxins may also be considered useful in the present invention, and additional linkers may also be considered.

【０１２８】 架橋試薬を使用して、２つの異なる分子（例えば、安定化剤および凝固剤）の
官能基を一緒に結合する分子架橋を形成する。２つの異なるタンパク質を段階的
に結合させるために、所望されないホモポリマー形成を除去するためにヘテロ二
官能架橋が、使用され得る。A crosslinking reagent is used to form a molecular bridge that links together the functional groups of two different molecules (eg, a stabilizer and a coagulant). To link two different proteins step by step, heterobifunctional crosslinks can be used to remove unwanted homopolymer formation.

【０１２９】[0129]

【表１】 例示のヘテロ二官能性架橋剤は２つの反応性基を含む：１つは、一級アミン基
（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、そして他方はチオール基
（例えば、ピリジル、ジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応する。
一級アミン反応性基を通じて、この架橋剤は、１つのタンパク質（例えば、選択
された抗体またはフラグメント）のリジン残基（単数または複数）と反応し得、
そしてチオール反応性基を通じて既に第１のタンパク質に結合していた架橋剤は
、別のタンパク質（例えば、選択的薬剤）のシステイン残基と反応する。[Table 1] Exemplary heterobifunctional crosslinkers contain two reactive groups: one that reacts with a primary amine group (eg, N-hydroxysuccinimide) and the other a thiol group (eg, pyridyl, disulfide, maleimide, Reacts with halogens).
Through a primary amine reactive group, the crosslinker can react with lysine residue (s) of one protein (eg, selected antibody or fragment),
The crosslinker, which is already bound to the first protein through a thiol-reactive group, reacts with a cysteine residue on another protein (eg, a selective drug).

【０１３０】 従って、標的とされたペプチド組成物は、一般に、架橋目的に利用可能な官能
基を有するか、または有するように誘導体化されることが観察され得る。この要
求は、広範な種類の基がこの様式で用いられ得るという点で制限されているとは
考えられない。例えば、一級アミン基または二級アミン基、ヒドラジドまたはヒ
ドラジン基、カルボキシルアルコール、ホスフェート、またはアルキル化基が、
結合または架橋のために用いられ得る。連結技術の一般的概観のため、Ｇｈｏｓ
ｅ ＆ Ｂｌａｉｒ（１９８７）に言及することを希望し得る。Thus, it can be observed that the targeted peptide compositions generally have or are derivatized to have functional groups available for crosslinking purposes. This requirement is not considered to be limiting in that a wide variety of groups can be used in this manner. For example, a primary or secondary amine group, a hydrazide or hydrazine group, a carboxyl alcohol, a phosphate, or an alkylating group is
Can be used for binding or crosslinking. For a general overview of coupling techniques, see Ghos
e & Blair (1987).

【０１３１】 架橋剤の２つの反応性基の間のスペーサーアームは、種々の長さおよび化学的
組成を有し得る。より長いスペーサーアームは、結合体成分のより良好な可撓性
を可能にし、その一方、ブリッジ（例えばベンゼン基）中のいくつかの特定の成
分は、反応性基に対する特別の安定性、または種々の局面の作用に対する化学的
連結の増大した抵抗性（例えば、還元剤に対するジスルフィド結合の抵抗性）を
与え得る。Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａのようなペプチド
スペーサーの使用もまた企図される。The spacer arm between the two reactive groups of the crosslinker can have various lengths and chemical compositions. Longer spacer arms allow for better flexibility of the conjugate component, while some specific components in the bridge (eg, benzene groups) may have extra stability to reactive groups, or various Can provide increased resistance of the chemical linkage to the effects of aspects of (e.g., resistance of disulfide bonds to reducing agents). The use of a peptide spacer such as L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala is also contemplated.

【０１３２】 血液中で適切な安定性を有する架橋剤が採用されることが好ましい。標的化剤
および治療剤／予防剤を結合するために首尾良く採用され得る、リンカーを含む
ジスルフィド結合の多くのタイプが公知である。立体的に妨害されているジスル
フィド結合を含むリンカーは、インビボでより大きな安定性を与えることが証明
され得て、作用の部位に到達する前に、標的化ペプチドの放出を防ぐ。これらの
リンカーは、それ故結合剤の１つのグループである。Preferably, a cross-linking agent having appropriate stability in blood is employed. Many types of disulfide bonds, including linkers, are known that can be successfully employed to link targeting and therapeutic / prophylactic agents. A linker containing a sterically hindered disulfide bond may prove to confer greater stability in vivo, preventing release of the targeted peptide before reaching the site of action. These linkers are therefore one group of binders.

【０１３３】 イムノトキシンにおける使用のための別の架橋試薬はＳＭＰＴであり、これは
、隣接するベンゼン環およびメチル基によって「立体的に妨害」されるジスルフ
ィド結合を含む二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体的妨害は、組織
および血液中に存在し得るグルタチオンのようなチオレートアニオンによる攻撃
からこの結合を保護する機能を供し、そしてそれによって腫瘍部位への結合した
薬剤の送達の前に、結合体の解離を防ぐことを補助すると考えられる。このＳＭ
ＰＴ薬剤はまた、本発明の二特異性結合リガンドと組み合わせて用いられ得るこ
とが企図される。Another cross-linking reagent for use in immunotoxins is SMPT, which is a bifunctional cross-linker containing a disulfide bond that is “sterically hindered” by adjacent benzene rings and methyl groups. The steric hindrance of the disulfide bond serves to protect this bond from attack by thiolate anions such as glutathione, which may be present in tissues and blood, and thus prior to delivery of the bound drug to the tumor site. It is thought to assist in preventing dissociation of the conjugate. This SM
It is contemplated that PT agents can also be used in combination with the bispecific binding ligands of the invention.

【０１３４】 このＳＭＰＴ架橋試薬は、多くのその他の公知の架橋試薬と同様に、システイ
ンのＳＨまたは一級アミン（例えばリジンのεアミノ基）のような官能性基を架
橋する能力を与える。架橋剤の別の可能なタイプは、スルホスクシンイミジル−
２−（ｐ−アジドサリシルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネートの
ような切断可能なジスルフィド結合を含むヘテロ二官能性感光性フェニルアジド
を含む。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル基は、一級アミノ基と反応し、そし
てフェニルアジドは、（光分解に際し）任意のアミノ酸残基と非選択的に反応す
る。This SMPT crosslinking reagent, like many other known crosslinking reagents, confers the ability to crosslink functional groups such as cysteine SH or primary amines (eg, the ε-amino group of lysine). Another possible type of crosslinker is sulfosuccinimidyl-
Heterobifunctional photosensitive phenyl azides containing cleavable disulfide bonds, such as 2- (p-azidosalicylamido) ethyl-1,3'-dithiopropionate. N-hydroxy-succinimidyl groups react with primary amino groups and phenylazide reacts non-selectively (on photolysis) with any amino acid residue.

【０１３５】 妨害された架橋に加えて、妨害されていないリンカーもまた、本明細書に従っ
て採用され得る。保護されたジスルフィドを含むかまたは生成するとは考えられ
ない、その他の有用な架橋剤は、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰおよび２−イミノチオレン
を含む（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ ＆ Ｔｈｏｒｐｅ、１９８７）。このような
架橋剤の使用は、当該技術分野で良く理解されている。In addition to hindered cross-links, unhindered linkers can also be employed in accordance with the present disclosure. Other useful crosslinkers that do not contain or are not expected to form protected disulfides include SATA, SPDP and 2-iminothiolene (Wawrzynczak & Thorpe, 1987). The use of such crosslinking agents is well understood in the art.

【０１３６】 一旦結合すると、標的化ペプチドは、一般に、非結合標的化剤または凝固剤か
ら、およびその他の夾雑物から結合体を分離するために精製される。多数の精製
技法が、結合体を臨床的に有用にするに十分な程度の純度の結合体を提供するこ
とにおける使用に利用可能である。ゲル濾過、ゲル浸透または高速液体クロマト
グラフィーのようなサイズ分離を基礎にした精製方法が、一般に、最も有用であ
る。Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分離のようなその他のクロマトグラフィー技
法もまた用いられ得る。[0136] Once bound, the targeting peptide is generally purified to separate the conjugate from unbound targeting agents or coagulants, and from other contaminants. Numerous purification techniques are available for use in providing conjugates of sufficient purity to render the conjugate clinically useful. Purification methods based on size separation, such as gel filtration, gel permeation or high performance liquid chromatography are generally most useful. Other chromatography techniques such as Blue-Sepharose separation can also be used.

【０１３７】 化学的結合に加えて、精製されたＩｇＡタンパク質またはペプチドは、タンパ
ク質レベルで改変され得る。本発明の範囲内に含まれるのは、ＩｇＡタンパク質
フラグメント、または翻訳の間または翻訳後、例えば、グリコシル化、アセチル
化、リン酸化、アミデート化、公知の保護／ブロッキング基、およびタンパク質
分解切断による誘導体化により差次的に改変されているその他の誘導体またはア
ナログである。任意の数の化学的改変を、公知の技法により実施し得、これには
、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、Ｎ
ａＢＨ₄による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、ファルネシル化、
酸化、還元；ツニカマイシンの存在下の代謝合成を含むがこれらに制限されない
。In addition to chemical conjugation, a purified IgA protein or peptide can be modified at the protein level. Included within the scope of the invention are IgA protein fragments or derivatives during or after translation, for example, by glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, known protecting / blocking groups, and proteolytic cleavage. Other derivatives or analogs that have been differentially modified by chemical modification. Any number of chemical modifications can be performed by known techniques, including cyanogen bromide, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, N
ABH ₄ by specific chemical cleavage; acetylation, formylation, farnesylation,
Oxidation, reduction; including, but not limited to, metabolic synthesis in the presence of tunicamycin.

【０１３８】 （Ｂ．アッセイ） 本発明の他の局面は、ｐＩｇＲ結合性ドメインおよび選択された薬剤を含む複
合体の生成を含み、この複合体は、粘膜上皮を標的にする目的で用いられる。こ
のような化合物は、ｐＩｇＲ結合のためにインビトロ、および標的化のためにイ
ンビボの両方で試験され得る。機能におけるこのような変化を測定することにお
ける使用のための種々のアッセイは慣用的であり、そして当業者によって容易に
実施される。B. Assays Another aspect of the present invention involves the generation of a complex comprising the pIgR binding domain and a selected agent, which complex is used for targeting mucosal epithelium. Such compounds can be tested both in vitro for pIgR binding and in vivo for targeting. Various assays for use in measuring such changes in function are conventional and are readily performed by those skilled in the art.

【０１３９】 インビトロアッセイは、単離されたｐＩｇＲまたはｐＩｇＲを保持する細胞の
使用を含む。結合をモニターする簡便な方法は、検出可能な標識の使用により、
そしてこの標識の、例えば、支持体（カラム、プレート、ウェル、ディップステ
ィック）に固定され得るレセプターへの結合を評価する。あるいは、例えば、標
的細胞に影響する（殺傷、増殖を促進する）能力である、機能的な読み出しが好
適であり得る。In vitro assays involve the use of isolated pIgRs or cells carrying pIgRs. A convenient way to monitor binding is through the use of a detectable label.
Then, the binding of the label to, for example, a receptor that can be immobilized on a support (column, plate, well, dipstick) is evaluated. Alternatively, a functional readout, for example, the ability to affect target cells (kill, promote proliferation) may be preferred.

【０１４０】 ＭＤＣＫトランスサイトーシス系アッセイのような、インビボアッセイもまた
容易に実施され得る（Ｍｏｓｔｏｖら、１９８６）。ここで再び、一般に、これ
らの系では、試験候補ＩｇＡ構築物を検出可能なマーカーで標識し、そして好ま
しくは究極の治療処置戦略で意図される経路を経由して動物に投与された後マー
カーの存在を追従することが好ましい。このプロセスの一部として、体液のサン
プル、特に粘膜上皮サンプルを採取し得、そしてＩｇＡ構築物に結合したマーカ
ーの存在についてサンプルを分析し得る。[0140] In vivo assays, such as the MDCK transcytosis-based assay, can also be readily performed (mostov et al., 1986). Here again, generally in these systems, the test candidate IgA construct is labeled with a detectable marker, and preferably the presence of the marker after administration to the animal via the intended route in the ultimate therapeutic treatment strategy. Is preferably followed. As part of this process, a sample of the body fluid, in particular a mucosal epithelial sample, can be taken and the sample analyzed for the presence of the marker bound to the IgA construct.

【０１４１】 （Ｃ．組換えＤＮＡ技法） あるいは、組換えＤＮＡ技術が、ポリペプチドまたはペプチドを提供する方法
として採用され得、ここで、本発明のポリペプチドまたはペプチドをコードする
ヌクレオチド配列が発現ベクター中に挿入され、適切な宿主細胞中に形質転換ま
たはトランスフェクトされ、そして発現に適した条件下で培養される。論議はア
ミノ酸変化から生じる機能的に等価なポリペプチドに焦点をあてているが、これ
らの変化が、遺伝コードが縮重していること、しかも２つ以上のコドンが同じア
ミノ酸をコードし得ることを考慮に入れて、コードＤＮＡの改変によりなされ得
ることが認識される。アミノ酸およびそれらのコドンの表が、そのような実施形
態における使用のため、ならびにプローブおよびプライマーなどの設計における
ようなその他の使用のために、本明細書において既に提示されている。C. Recombinant DNA Technology Alternatively, recombinant DNA technology can be employed as a method of providing a polypeptide or peptide, wherein the nucleotide sequence encoding the polypeptide or peptide of the invention is expressed in an expression vector. Inserted, transformed or transfected into a suitable host cell, and cultured under conditions suitable for expression. The discussion focuses on functionally equivalent polypeptides arising from amino acid changes, but these changes are due to the degeneracy of the genetic code and that two or more codons can encode the same amino acid. It will be appreciated that this can be done by altering the coding DNA. A table of amino acids and their codons has already been presented herein for use in such embodiments, and for other uses, such as in the design of probes and primers.

【０１４２】 先に論議した合成ペプチドと同様に、ｐＩｇＲ結合ドメインのマルチマーが、
ペプチド内で、このペプチドがｐＩｇＲ結合ドメインより多くを含むように含ま
れ得る。ペプチドのｐＩｇＲ結合ドメイン互いに同一（すなわちホモマー）であ
るか、または同一でなくても（すなわちヘテロマー）よい。従って、本発明のマ
ルチマーペプチドは、核酸配列によってコードされ得る。アミノ酸から構成され
るリンカーが、互いから、または選択的化合物または薬剤からｐＩｇＲ結合ドメ
インを分離するために採用され得る。このようなリンカーおよび／または選択的
薬剤は、アミノ酸を含む場合、これらをコードする核酸配列を、細胞がコードさ
れたアミノ酸配列を発現し得るように提供することによって細胞または生物に提
供され得る。As with the synthetic peptides discussed above, multimers of the pIgR binding domain
Within a peptide, the peptide may be included to include more than a pIgR binding domain. The pIgR binding domains of the peptides may be identical (ie, homomeric) to each other or may not be identical (ie, heteromeric). Thus, a multimeric peptide of the invention can be encoded by a nucleic acid sequence. Linkers composed of amino acids can be employed to separate the pIgR binding domains from each other or from selective compounds or agents. Such linkers and / or selective agents, if containing amino acids, can be provided to a cell or organism by providing the nucleic acid sequence encoding them so that the cell can express the encoded amino acid sequence.

【０１４３】 （１．ＩｇＡまたは予防的／治療的化合物ポリペプチドおよびそのフラグメン
ト） 本発明の局面は、野生型、多型性のまたは変異体ＩｇＡポリペプチドもしくは
予防的／治療的化合物ポリペプチド、およびそれらのフラグメントをコードする
単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクターの使用、ならびにこれらの野
生型、多型性のまたは変異体ポリペプチドを発現するＤＮＡ技術の適用による組
換え宿主細胞の使用に関する。あるいは、非ＩｇＡペプチドまたはポリペプチド
が、ｐＩｇＲ結合ドメインとして本発明で用いられ得る。変異体ＩｇＡポリペプ
チドは、野生型配列と同一ではないが、なおｐＩｇＲ結合活性を保持する配列で
あり得る。請求項に記載の方法の実施形態は、ＩｇＡのＣα３領域からのアミノ
酸の使用を含み、おそらく、ＩｇＡのアミノ酸４０２−４１０を包含する領域か
らの残基を含む。さらに、本発明は、ｐＩｇＲ結合を仲介し、かつＩｇＡに由来
しない残基をコードするＤＮＡセグメントおよび組換えベクターの使用を包含す
る。本発明は、ｐＩｇＲ結合ドメインを、単独で、または他のＩｇＡ領域もしく
は他の抗体との組合せ、または他の選択的薬剤との組合せで産生する組換えＤＮ
Ａ技法を包含する。多くのこれらの技法は当業者に周知である。1. IgA or Prophylactic / Therapeutic Compound Polypeptides and Fragments thereof Aspects of the invention relate to wild-type, polymorphic or mutant IgA polypeptides or prophylactic / therapeutic compound polypeptides, and The present invention relates to the use of isolated DNA segments encoding these fragments and recombinant vectors, and the use of recombinant host cells by applying DNA technology to express these wild-type, polymorphic or variant polypeptides. Alternatively, a non-IgA peptide or polypeptide can be used in the present invention as a pIgR binding domain. A variant IgA polypeptide may be a sequence that is not identical to the wild-type sequence, but still retains pIgR binding activity. An embodiment of the claimed method involves the use of amino acids from the Cα3 region of IgA, possibly including residues from the region encompassing amino acids 402-410 of IgA. Further, the invention encompasses the use of DNA segments and recombinant vectors that mediate pIgR binding and encode residues that are not derived from IgA. The present invention provides recombinant DNs that produce the pIgR binding domain alone or in combination with other IgA regions or other antibodies, or with other selective agents.
A technique. Many of these techniques are well known to those skilled in the art.

【０１４４】 （ａ．増幅およびＰＣＲ） ｐＩｇＲ結合ドメインまたは他の領域は、核酸増幅方法のような組換えＤＮＡ
技法を用いて産生され得る。ＩｇＡ配列の増幅のためのテンプレートとして用い
られる核酸は、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って、生物
学的サンプル中に含まれる細胞から単離される。この核酸は、ゲノムＤＮＡまた
は分画されたかまたは総細胞ＲＮＡであり得る。ＲＮＡが用いられる場合、ＲＮ
Ａを相補的ＤＮＡに変換することが所望され得る。１つの実施形態では、このＲ
ＮＡは、総細胞ＲＮＡであり、そして増幅のためのテンプレートとして直接用い
られる。A. Amplification and PCR The pIgR binding domain or other region contains recombinant DNA as in nucleic acid amplification methods.
It can be produced using techniques. Nucleic acids used as templates for the amplification of IgA sequences are isolated from cells contained in a biological sample according to standard methods (Sambrook et al., 1989). The nucleic acid can be genomic DNA or fractionated or total cellular RNA. If RNA is used, RN
It may be desirable to convert A to complementary DNA. In one embodiment, this R
NA is total cellular RNA and is used directly as a template for amplification.

【０１４５】 多くのテンプレートに依存したプロセスが、所定のテンプレートサンプル中に
存在するマーカー配列を増幅するために利用可能である。最も良く知られた増幅
方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと呼ばれる）であり、これは、米
国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８
００，１５９号に詳細に記載され、そして各々はその全体が参考として本明細書
に援用される。A number of template-dependent processes are available for amplifying marker sequences present in a given template sample. One of the best known amplification methods is the polymerase chain reaction (referred to as PCR), which is disclosed in U.S. Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,683,202. 8
00,159, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

【０１４６】 逆転写酵素ＰＣＲ増幅手順を、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実施
し得る。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は周知であり、そしてＳａｍｂｒｏ
ｏｋら、１９８９に記載されている。逆転写の代替方法は、熱安定性のＲＮＡ依
存性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。これらの方法は、本明細書に参考として援
用される、１９９０年１２月２１日に出願されたＷＯ９０／０７６４１中に記載
されている。ポリメラーゼ連鎖反応方法は当該分野で周知である。増幅のための
別の方法は、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）であり、その全体が参考として本
明細書に援用されるＥＰＡ第３２０３０８号に開示されている。米国特許第４，
８８３，７５０号は、プローブ対を標的配列に結合するために、ＬＣＲに類似の
方法を記載する。A reverse transcriptase PCR amplification procedure can be performed to quantify the amount of mRNA that has been amplified. Methods for reverse transcribing RNA to cDNA are well known and are described in Sambro.
Ok et al., 1989. An alternative to reverse transcription utilizes a thermostable RNA-dependent DNA polymerase. These methods are described in WO 90/07641, filed December 21, 1990, which is incorporated herein by reference. Polymerase chain reaction methods are well known in the art. Another method for amplification is the ligase chain reaction ("LCR"), which is disclosed in EPA 320308, which is incorporated herein by reference in its entirety. U.S. Patent No. 4,
883,750 describes a method similar to LCR for binding a probe pair to a target sequence.

【０１４７】 制限部位の１つのストランド中にヌクレオチド５’−［α−チオ］−トリホス
フェートを含む標的分子の増幅を達成するために制限エンドヌクレアーゼおよび
リガーゼが用いられる等温増幅方法もまた、本発明において核酸の増幅に有用で
あり得る。ストランド置換増幅（ＳＤＡ）は、核酸の等温増幅を実施する別の方
法であり、複数ラウンドのストランド置換および合成、すなわち、ニック翻訳を
含む。修復連鎖反応（ＲＣＲ）と呼ばれる同様の方法は、増幅の標的とされる領
域の全体に亘っていくつかのプローブをアニーリングする工程を含み、次いで４
つの塩基の２つのみが存在する修復反応が続く。その他の２つの塩基は、容易な
検出のためにビオチン化誘導体として添加され得る。標的特異的配列はまた、サ
イクリックプローブ反応（ＣＰＲ）を用いて検出され得る。ＣＰＲでは、非特異
的ＤＮＡの３’および５’配列を有するプローブ、および特異的ＲＮＡの中央配
列が、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーシ
ョンに際し、反応物は、ＲＮａｓｅＨで処理され、そしてプローブの産物が、消
化後に放出される別個の産物として同定される。当初のテンプレートは、別のサ
イクリングプローブにアニールされ、そして反応が繰り返される。An isothermal amplification method in which restriction endonucleases and ligases are used to achieve amplification of a target molecule comprising the nucleotide 5 ′-[α-thio] -triphosphate in one strand of the restriction site is also provided by the present invention. May be useful for the amplification of nucleic acids. Strand displacement amplification (SDA) is another method of performing isothermal amplification of nucleic acids and involves multiple rounds of strand displacement and synthesis, ie, nick translation. A similar method, called the repair chain reaction (RCR), involves annealing several probes throughout the region targeted for amplification, and then
A repair reaction follows in which only two of the two bases are present. The other two bases can be added as biotinylated derivatives for easy detection. Target-specific sequences can also be detected using a cyclic probe reaction (CPR). In CPR, a probe having 3 ′ and 5 ′ sequences of non-specific DNA, and a central sequence of specific RNA hybridizes to DNA present in the sample. Upon hybridization, the reaction is treated with RNase H and the product of the probe is identified as a separate product released after digestion. The original template is annealed to another cycling probe and the reaction is repeated.

【０１４８】 他の核酸増幅手順は、転写を基礎にした増幅系（ＴＡＳ）を含み、これは、核
酸配列を基礎にした増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲ 本明細書に参考として援
用されるＧｉｎｇｅｒａｓら、ＰＣＴ出願ＷＯ８８／１０３１５を含む。Ｄａｖ
ｅｙら、ＥＰＡ第３２９８２２号（その全体が参考として本明細書に援用される
）は、本発明に従って用いられ得る、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤ
ＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をサイクルにより合成することを包含
する核酸増幅プロセスを開示する。Ｍｉｌｌｅｒら、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０６
７００（その全体が参考として本明細書に援用される）は、標的一本鎖ＤＮＡ（
「ｓｓＤＮＡ」）へのプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション
、引き続くこの配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキーム
を開示する。このスキームはサイクルによらない。すなわち、新たなテンプレー
トは、得られるＲＮＡ転写物から産生されない。他の増幅方法は、「ＲＡＣＥ」
および「片側ＰＣＲ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｍ．Ａ．、Ｉｎ：ＰＣＲ ＰＲＯＴＯ
ＣＯＬＳ：Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴ
ＩＯＮＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９９０ 参考として援
用）を含む。Other nucleic acid amplification procedures include a transcription-based amplification system (TAS), which includes nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) and 3SR Gingeras et al., Incorporated herein by reference. Includes PCT application WO 88/10315. Dav
ey et al., EPA 329822, which is hereby incorporated by reference in its entirety, describes single-stranded RNA ("ssRNA"), ssD, which can be used in accordance with the present invention.
Disclosed is a nucleic acid amplification process that involves cycling NA and double-stranded DNA (dsDNA). Miller et al., PCT application WO 89/06.
700 (incorporated herein by reference in its entirety) contains the target single-stranded DNA (
Disclosed is a nucleic acid sequence amplification scheme based on hybridization of a promoter / primer sequence to "ssDNA"), followed by transcription of many RNA copies of this sequence. This scheme does not depend on the cycle. That is, no new template is produced from the resulting RNA transcript. Another amplification method is "RACE"
And “one-sided PCR” (Frohman, MA, In: PCR PROTO
COLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICAT
IONS, Academic Press, N.M. Y. , 1990).

【０１４９】 （ｂ．組換えＤＮＡクローニング） 本発明はまた、総ゲノムＤＮＡがなく、しかもＩｇＡ、特にＣα３ドメインに
由来するものを含む、ｐＩｇＲに結合するタンパク質またはポリペプチドを発現
し得る哺乳動物およびヒト細胞から単離可能であるＤＮＡセグメントに関する。(B. Recombinant DNA Cloning) The present invention also relates to mammals that are free of total genomic DNA and that can express proteins or polypeptides that bind to pIgR, including those derived from IgA, especially the Cα3 domain. DNA segments that can be isolated from human cells.

【０１５０】 本明細書で用いられる用語「ＤＮＡセグメント」は、特定の種の総ゲノムＤＮ
Ａのない、単離されたＤＮＡ分子をいう。それ故、ＩｇＡポリペプチドをコード
するＤＮＡセグメントは、野生型、多型性、または変異体ＩｇＡポリペプチドコ
ード配列を含み、なお、総哺乳動物またはヒトゲノムＤＮＡから単離されるか、
それのない単離されたＤＮＡセグメントをいう。用語「ＤＮＡセグメント」内に
含まれて、ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さなフラグメ
ント、そしてまた例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む
組換えベクターがある。The term “DNA segment” as used herein refers to the total genome DN of a particular species.
Refers to an isolated DNA molecule without A. Thus, a DNA segment encoding an IgA polypeptide comprises a wild-type, polymorphic, or mutant IgA polypeptide-encoding sequence, and may still be isolated from total mammalian or human genomic DNA,
Refers to an isolated DNA segment without it. Included within the term "DNA segment" are DNA segments and smaller fragments of such segments, and also recombinant vectors, including, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses, and the like.

【０１５１】 同様に、単離または精製された野生型、多型性、または変異体ＩｇＡポリペプ
チド遺伝子またはｐＩｇＲ結合ドメインを含むＤＮＡセグメントは、野生型、多
型性、または変異体ＩｇＡポリペプチド遺伝子またはｐＩｇＲ結合ドメインコー
ド配列、そして特定の局面では、他の天然に存在する遺伝子またはタンパク質コ
ード配列の実質的を含まない単離された調節配列を含むＤＮＡセグメントをいう
。この観点から、用語「遺伝子」は、単純さのために用いられ、機能的タンパク
質、ポリペプチド、またはペプチドコード単位をいう。当業者によって理解され
るように、この機能的用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド
、融合タンパク質、および変異体を発現するか、または発現するために適合され
た、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、およびより小さな操作された遺伝子セグメント
を含む。Similarly, an isolated or purified wild-type, polymorphic, or mutant IgA polypeptide gene or DNA segment containing a pIgR binding domain is a wild-type, polymorphic, or mutant IgA polypeptide gene. Or, a pIgR binding domain coding sequence, and in certain aspects, a DNA segment comprising an isolated regulatory sequence substantially free of other naturally occurring gene or protein coding sequences. In this regard, the term "gene" is used for simplicity and refers to a functional protein, polypeptide, or peptide coding unit. As will be appreciated by those of skill in the art, this functional term refers to genomic sequences, cDNA sequences, which express or are adapted to express proteins, polypeptides, domains, peptides, fusion proteins, and variants. And smaller engineered gene segments.

【０１５２】 「他のコード配列から実質的に単離された」は、目的の遺伝子、この場合、野
生型、多型性、または変異体ＩｇＡポリペプチド遺伝子が、ＤＮＡセグメントの
コード領域の重要な部分を形成し、しかもこのＤＮＡセグメントが、大きな染色
体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはｃＤＮＡコード領域のような、天
然に存在するコードＤＮＡの大きな部分を含まないことを意味する。勿論、これ
は、当初単離されたＤＮＡセグメントをいい、そしてヒトの操作によりこのセグ
メントに後に付加された遺伝子またはコード領域を排除しない。“Substantially isolated from other coding sequences” means that the gene of interest, in this case, a wild-type, polymorphic, or mutant IgA polypeptide gene, is an important region of the coding region of the DNA segment. Part, but means that the DNA segment does not include a large portion of naturally occurring coding DNA, such as a large chromosomal fragment or other functional gene or cDNA coding region. This, of course, refers to the originally isolated DNA segment and does not exclude genes or coding regions that have been subsequently added to this segment by human manipulation.

【０１５３】 詳細な実施形態では、本発明は、そのアミノ酸配列内に、野生型、多型性、ま
たは変異体ＩｇＡポリペプチドに従うか、または本質的に対応する連続アミノ酸
を含む、野生型、多型性、または変異体ＩｇＡポリペプチドまたはペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を取り込む、単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベク
ターに関する。In a specific embodiment, the invention relates to a wild-type, polymorphic, polymorphic, or variant IgA polypeptide that conforms to or essentially comprises contiguous amino acids in its amino acid sequence. The present invention relates to isolated DNA segments and recombinant vectors that incorporate a DNA sequence encoding a type or variant IgA polypeptide or peptide.

【０１５４】 他の実施態様では、本発明は、そのアミノ酸配列内に、ＩｇＡのｐＩｇＲ結合
ドメインに従うか、または本質的に対応する連続アミノ酸を含む、ＩｇＡポリペ
プチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ配列を取り込む、単離されたＤＮＡセ
グメントおよび組換えベクターに関する。In another embodiment, the invention incorporates a DNA sequence that encodes an IgA polypeptide or peptide within its amino acid sequence that conforms to or comprises essentially the corresponding contiguous amino acids of the IgA pIgR binding domain. , Isolated DNA segments and recombinant vectors.

【０１５５】 用語「生物学的に機能的等価」は、当該分野で良く理解され、そしてさらに本
明細書で詳細に規定される。従って、同一であるアミノ酸を、約７０％と約８０
％との間；またはより好ましくは約８１％と約９０％との間；またはさらにより
好ましくは約９１％と約９９％との間で有する配列であるか、またはこのタンパ
ク質の標的化する活性が維持されるなら、ＩｇＡポリペプチド配列のアミノ酸と
機能的に等価である。The term “biologically functional equivalent” is well understood in the art and is further defined herein. Thus, amino acids that are identical are about 70% and about 80%
Or more preferably between about 81% and about 90%; or even more preferably between about 91% and about 99%, or the targeting activity of this protein. Are functionally equivalent to the amino acids of the IgA polypeptide sequence.

【０１５６】 用語「機能的に等価なコドン」が本明細書で用いられ、アルギニンまたはセリ
ンに対する６つのコドンのような、同じアミノ酸をコードするコドンをいい、そ
してまた、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンをいう（以下の表２を
参照のこと）。The term “functionally equivalent codon” is used herein to refer to a codon that encodes the same amino acid, such as six codons for arginine or serine, and is also a biologically equivalent amino acid. (See Table 2 below).

【０１５７】[0157]

【表２】 アミノ酸および核酸配列は、付加的なＮ−またはＣ−末端アミノ酸または５’
または３’配列、そしてタンパク質発現に関する場合、生物学的タンパク質活性
の維持を含む、上記で提示された規準に配列が合致する限り、本明細書に開示さ
れた配列の１つで本質的に提示されるような、付加的な残基を含み得ることもま
た理解される。末端配列の付加は、例えば、コード領域の５’または３’部分の
いずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得るか、または種々の内部配列、
すなわち、遺伝子内にあることが知られるイントロンを含み得る核酸配列に特に
適用される。[Table 2] Amino acid and nucleic acid sequences may include additional N- or C-terminal amino acids or 5 '
Or the 3 'sequence, and, as far as protein expression is concerned, is essentially represented by one of the sequences disclosed herein, as long as the sequence meets the criteria set forth above, including the maintenance of biological protein activity. It will also be appreciated that additional residues may be included as described. The addition of terminal sequences can include, for example, various non-coding sequences flanking either the 5 'or 3' portion of the coding region, or various internal sequences,
That is, it has particular application to nucleic acid sequences that may contain introns known to be in genes.

【０１５８】 本発明で用いられる核酸セグメントは、コード配列自身の長さに拘らず、プロ
モーター、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、マルチクローニン
グ部位、他のコードセグメントなどのような他のＤＮＡ配列と組合せられ得、そ
の結果それらの全体の長さはかなり変動し得る。従って、好ましくは、全長は、
調製および意図された組換えＤＮＡプロトコルにおける使用の容易さにより制限
されて、ほぼ任意の長さの核酸フラグメントが採用され得ることが予期される。[0158] The nucleic acid segments used in the present invention may be any DNA, such as a promoter, polyadenylation signal, additional restriction sites, multiple cloning sites, other coding segments, etc., regardless of the length of the coding sequence itself. Can be combined with sequences, so that their overall length can vary considerably. Thus, preferably, the total length is
It is anticipated that nucleic acid fragments of almost any length may be employed, limited by the ease of preparation and use in the intended recombinant DNA protocol.

【０１５９】 本発明で用いられるＤＮＡセグメントは、生物学的に機能的等価なＩｇＡタン
パク質およびペプチドを包含する。このような配列は、核酸配列内およびこのよ
うにコードされたタンパク質内で天然に存在することが知られるコドン重複性お
よび機能的等価性の結果として生じ得る。あるいは、機能的に等価なタンパク質
またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術の適用を経由して作成され得、そこでは、
タンパク質構造における変化が、交換されるアミノ酸の性質を考慮することに基
づいて操作され得る。ヒトによって設計された変化は、部位特異的変異誘発技法
の適用を通じて導入され得、例えば、タンパク質の抗原性に対する改良を導入す
るか、または分子レベルでＤＮＡ結合活性を調べるために変異体をテストする。The DNA segments used in the present invention include biologically functional equivalent IgA proteins and peptides. Such sequences can result from codon duplication and functional equivalence known to occur naturally in nucleic acid sequences and in proteins so encoded. Alternatively, functionally equivalent proteins or peptides can be made via the application of recombinant DNA technology, where:
Changes in protein structure can be manipulated based on considering the nature of the amino acids exchanged. Changes designed by humans can be introduced through the application of site-directed mutagenesis techniques, for example, to introduce improvements to the antigenicity of the protein or to test the mutants for DNA binding activity at the molecular level .

【０１６０】 本発明に包含されるのは、例えば、長さが、約１０、１１、１２、１３、１４
、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５，２６
、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８
、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０
、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５から、または約１０
０アミノ酸までのペプチドのような比較的小さなペプチド；そしてまた、ＩｇＡ
ポリペプチドの全長配列に相当するタンパク質までのこのタンパク質を含むより
大きなポリペプチドである。Included in the present invention are, for example, lengths of about 10, 11, 12, 13, 14
, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26
, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38
, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50
, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or about 10
Relatively small peptides such as peptides up to 0 amino acids; and also IgA
Larger polypeptides containing this protein up to the protein corresponding to the full length sequence of the polypeptide.

【０１６１】 （２．組換え融合タンパク質） 本発明のｐＩｇＲ標的組成物はまた、分子生物学的技法により調製さた融合タ
ンパク質であり得、それによって、ｐＩｇＲを標的にするモチーフを含むＩｇＡ
からのＣα３ドメインのようなｐＩｇＲ結合ドメインが予防または治療化合物と
融合される。あるいは、ｐＩｇＲ結合ドメインが、ＩｇＧまたはＩｇＧＭのよう
な非ＩｇＡ抗体の状況で発現され得、粘膜上皮に対するその抗体を標的にするこ
とが企図される。さらに、単一分子上に、ｐＩｇＲ結合ドメインのダイマーおよ
びトリマーのような、複数のｐＩｇＲ結合ドメインが含まれ得ることが企図され
る。このような目的を達成するための組換えＤＮＡ技法の使用は、現在では、当
業者にとって標準的な実施事項である。これらの方法は、例えば、インビトロ組
換えＤＮＡ技法、合成技法およびインビボ組換え／遺伝子組換えを含む。ＤＮＡ
およびＲＮＡ合成は、さらに、自動化合成機を用いて実施され得る（例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９に記載される
技法を参照のこと）。2. Recombinant Fusion Proteins The pIgR targeting compositions of the present invention can also be fusion proteins prepared by molecular biology techniques, thereby comprising an IgA comprising a motif targeting pIgR.
A pIgR binding domain, such as the Cα3 domain from, is fused to a prophylactic or therapeutic compound. Alternatively, it is contemplated that the pIgR binding domain can be expressed in the context of a non-IgA antibody, such as IgG or IgGM, targeting that antibody to mucosal epithelium. Further, it is contemplated that multiple pIgR binding domains may be included on a single molecule, such as dimers and trimers of the pIgR binding domain. The use of recombinant DNA technology to achieve such goals is now a standard practice for those skilled in the art. These methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo recombination / genetic recombination. DNA
And RNA synthesis can be further performed using an automated synthesizer (eg, S
ambrook et al., 1989; and the techniques described in Ausubel et al., 1989).

【０１６２】 一般に、このような融合タンパク質の調製は、第１および第２のＤＮＡコード
領域を調製し、そしてこれらの領域をインフレームで機能的に連結または結合し
、所望の融合タンパク質をコードする単一のコード領域を調製する。現在の状況
では、一般に、ｐＩｇＲ結合ドメインＤＮＡ配列を、予防または治療化合物およ
び／または不活性タンパク質キャリア、免疫グロブリン、Ｆｃ領域などをコード
するＤＮＡ配列とインフレームで結合する。本発明は、融合タンパク質のＩｇＡ
部分であるかまたは非ＩｇＡ部分のいずれかが、Ｎ末端領域としてまたはＣ末端
領域として調製される構築物を包含する。In general, the preparation of such a fusion protein involves preparing the first and second DNA coding regions and operably linking or joining these regions in frame to encode the desired fusion protein. Prepare a single coding region. In the current context, the pIgR binding domain DNA sequence is generally linked in frame with a DNA sequence encoding a prophylactic or therapeutic compound and / or an inactive protein carrier, an immunoglobulin, an Fc region, and the like. The present invention relates to the fusion protein IgA.
Either the moiety or the non-IgA moiety includes constructs prepared as the N-terminal region or as the C-terminal region.

【０１６３】 一旦所望のコード領域が産生されると、発現ベクターが作成される。発現ベク
ターは、挿入されたＤＮＡ領域の上流に、ＤＮＡの転写を促進するために作用し
、そしてそれ故コードされた組換えタンパク質の発現を促進する、１つ以上のプ
ロモーターを含む。これが、「組換え発現」の意味であり、そして本明細書の他
の部分で論議されている。Once the desired coding region has been produced, an expression vector is created. The expression vector contains, upstream of the inserted DNA region, one or more promoters that act to promote transcription of the DNA and, thus, promote expression of the encoded recombinant protein. This means "recombinant expression" and is discussed elsewhere herein.

【０１６４】 市販されている多くの公知のベクターに加えて、他の有用なベクターは、ｐＩ
Ｎベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５）；および後の精製および分離または切
断のためのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク
質を生成する使用のためのｐＧＥＸベクターを含む。他の適切な融合タンパク質
は、βガラクトシダーゼ、ユビキチン、ヘキサヒスチジンなどとの融合タンパク
質である。[0164] In addition to the many known vectors that are commercially available, other useful vectors include pI
N vectors (Inouye et al., 1985); and pGEX vectors for use in producing glutathione S-transferase (GST) soluble fusion proteins for subsequent purification and isolation or cleavage. Other suitable fusion proteins are fusion proteins with β-galactosidase, ubiquitin, hexahistidine, and the like.

【０１６５】 （３．クローニング、遺伝子移入、および発現のためのベクター） 特定の実施形態では、発現ベクターを採用して、ｐＩｇＲ結合ドメインポリペ
プチド産物を発現し、次いでそれを精製し得、そして例えば、動物をワクチン接
種し、抗血清またはモノクローナル抗体を生成するために用い、これを用いてさ
らなる研究が実施され得る。他の実施形態では、発現ベクターを用いて粘膜上皮
中で目的のタンパク質を発現する。いずれの場合でも、発現は、ベクター中に提
供される適切なシグナルを必要とし、そしてそれは種々の調節配列、例えば、宿
主細胞中で目的の遺伝子の発現を駆動する、ウイルスおよび哺乳動物供給源の両
者由来のエンハンサー／プロモーターを含む。宿主細胞におけるメッセンジャー
ＲＮＡ安定性および翻訳性を最適化するために設計されたエレメントもまた規定
される。産物を発現する不死安定細胞クローンを確立するための多くの優性薬物
選択マーカーの使用のための条件が提供され、例えば、薬物選択マーカーの発現
を、ポリペプチドの発現とリンクするエレメントがある。3. Vectors for Cloning, Gene Transfer, and Expression In certain embodiments, an expression vector may be employed to express a pIgR binding domain polypeptide product, which may then be purified, and Used to vaccinate animals and generate antisera or monoclonal antibodies, which can be used for further studies. In another embodiment, an expression vector is used to express the protein of interest in mucosal epithelium. In each case, expression requires appropriate signals to be provided in the vector, which are various regulatory sequences, such as viral and mammalian sources that drive expression of the gene of interest in the host cell. Includes enhancers / promoters from both. Elements designed to optimize messenger RNA stability and translatability in the host cell are also defined. Conditions are provided for the use of many dominant drug selection markers to establish immortal stable cell clones that express the product, for example, there are elements that link drug selection marker expression to polypeptide expression.

【０１６６】 発現ベクターおよびプラスミドの構築および使用は、当業者に周知である。従
って、実質的に任意の哺乳動物細胞発現ベクターが、本明細書に開示のヒト化遺
伝子と組み合わせて用いられ得る。好適なベクターおよびプラスミドは、少なく
とも１つのマルチクローニング部位を有して構築される。特定の実施形態では、
発現ベクターは、プロモーターとＩｇＡからの配列との間に作動可能に配置され
るマルチクローニング部位を包含する。このようなベクターは、他の実施形態に
おけるそれらの使用に加えて、このマルチクローニング部位中への第２のタンパ
ク質をコードするＤＮＡセグメントを、それがＩｇＡからのｐＩｇＲ結合ドメイ
ン配列を含む、ｐＩｇＲ結合ドメイン配列と連続かつインフレームであるように
クローニングすることによって、Ｎ末端融合タンパク質を作成するために用いら
れ得る。The construction and use of expression vectors and plasmids is well known to those skilled in the art. Thus, virtually any mammalian cell expression vector can be used in combination with the humanized genes disclosed herein. Suitable vectors and plasmids are constructed having at least one multiple cloning site. In certain embodiments,
Expression vectors include a multiple cloning site operably located between the promoter and the sequence from IgA. Such vectors include, in addition to their use in other embodiments, a DNA segment encoding a second protein into this multiple cloning site, comprising a pIgR binding domain sequence comprising a pIgR binding domain sequence from IgA. By cloning contiguous and in-frame with the domain sequence, it can be used to create N-terminal fusion proteins.

【０１６７】 他の実施形態では、発現ベクターは、発現可能なＩｇＡ核酸配列から下流に作
動可能に配置されるマルチクローニング部位を含み得る。これらのベクターは、
それらの使用に加えて、第２のタンパク質をコードするＤＮＡセグメントを、こ
のマルチクローニング部位に、それがＩｇＡ配列と連続かつインフレームである
ようにクローニングすることによってＣ末端融合タンパク質を作成することに有
用である。In another embodiment, the expression vector may include a multiple cloning site operably located downstream from the expressible IgA nucleic acid sequence. These vectors are
In addition to their use, creating a C-terminal fusion protein by cloning a DNA segment encoding a second protein into this multiple cloning site such that it is contiguous and in-frame with the IgA sequence. Useful.

【０１６８】 第２のタンパク質またはＲＮＡコード核酸セグメントがまた存在するベクター
およびプラスミドもまた、勿論、核酸セグメント自身の性質に拘らず、本発明に
包含される。第２のレポーター遺伝子が、本発明の発現ベクター内に含まれ得る
。この第２のレポーター遺伝子は、第２の転写ユニット内に含まれ得る。適切な
第２のレポーター遺伝子は、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシ
ン，ゼオシン、ミコフェノール酸、ヒスチジノールおよびメトトレキサートのよ
うな薬剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む。Vectors and plasmids in which the second protein or RNA-encoding nucleic acid segment is also present are encompassed by the present invention, regardless of the nature of the nucleic acid segment itself. A second reporter gene can be included in the expression vector of the present invention. This second reporter gene can be contained within a second transcription unit. Suitable second reporter genes include those that confer resistance to drugs such as neomycin, hygromycin, puromycin, zeocin, mycophenolic acid, histidinol and methotrexate.

【０１６９】 発現ベクターはまた、ＩＲＥＳエレメント、ポリアデニル化シグナル、スプラ
イスドナー／スプライスアクセプターシグナルなどの他の核酸配列を含み得る。Expression vectors may also include other nucleic acid sequences, such as IRES elements, polyadenylation signals, splice donor / splice acceptor signals.

【０１７０】 （ａ．ウイルスベクター） 本明細書に記載される方法および組成物は、マルチ遺伝子アデノウイルス構築
物を含み；記載されたこの方法および組成物は、レトロウイルス、ヘルペスウイ
ルス、アデノ随伴ウイルス、ワクチニアウイルスを含むがこれらに制限されない
他のウイルスベクターを用いて、マルチ遺伝子構築物の構築に適用可能であり得
る。以下の議論は、これらのウイルスの各々の特徴に関する詳細を、治療組成物
におけるそれらの適用に関連して提供する。A. Viral Vectors The methods and compositions described herein include multigene adenovirus constructs; the methods and compositions described include retroviruses, herpes viruses, adeno-associated viruses, Other viral vectors, including but not limited to vaccinia virus, may be applicable for the construction of multigene constructs. The following discussion provides details regarding the characteristics of each of these viruses in relation to their application in therapeutic compositions.

【０１７１】 ｉ）アデノウイルス インビボ送達のための好適な方法の１つは、アデノウイルス発現ベクターの使
用を含む。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージング
を支持する、および（ｂ）アンチセンスポリヌクレオチド、タンパク質、その中
にクローン化されたポリヌクレオチド（例えば、リボザイム、またはｍＲＮＡ）
を発現するに十分なアデノウイルス配列を含むような構築物を含むことを意味す
る。この状況では、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。I) Adenovirus One suitable method for in vivo delivery involves the use of an adenovirus expression vector. An “adenovirus expression vector” is used to (a) support the packaging of the construct and (b) antisense polynucleotides, proteins, polynucleotides cloned therein (eg, ribozymes, or mRNA).
Is meant to include constructs that contain sufficient adenovirus sequences to express E. coli. In this situation, expression does not require that the gene product be synthesized.

【０１７２】 発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝的に操作された形態を含む。３６ｋｂ
の直線状の二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成の知識は、
７ｋｂまでの外来配列でのアデノウイルスＤＮＡの大きな断片の置換を可能にす
る（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルスとは
対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組込みを生じない。なぜな
ら、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性なくしてエピソーム様式で複製
し得るからである。本明細書で用いる用語「遺伝毒性」は、永久の遺伝性の宿主
細胞の遺伝的改変をいう。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、そして
通常の誘導体の大規模増幅後、ゲノム再配置は検出されない。アデノウイルスは
、実質的にすべての上皮細胞をそれらの細胞サイクルステージに拘らず感染し得
る。[0172] Expression vectors include genetically engineered forms of adenovirus. 36 kb
Knowledge of the genetic makeup of adenovirus, a linear double-stranded DNA virus of
It allows the replacement of large fragments of adenovirus DNA with foreign sequences up to 7 kb (Grunhaus and Horwitz, 1992). In contrast to retroviruses, adenovirus infection of host cells does not result in chromosomal integration. Because adenoviral DNA can replicate in an episomal fashion without potential genotoxicity. As used herein, the term "genotoxicity" refers to the genetic modification of a permanent hereditary host cell. Also, adenoviruses are structurally stable, and no genomic rearrangements are detected after large-scale amplification of normal derivatives. Adenoviruses can infect virtually all epithelial cells regardless of their cell cycle stage.

【０１７３】 アデノウイルスは、その中間サイズのゲノム、操作の容易さ、高力価、広い標
的細胞範囲および高感染性のため、遺伝子移入ベクターとしての使用に特に適切
である。ウイルスゲノムの両方の端部は、１００−２００塩基対の反転反復（Ｉ
ＴＲ）を含み、これは、ウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なシス
エレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮ
Ａ複製の開始により分けられる異なる転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１Ａおよび
Ｅ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび２〜３の細胞遺伝子の転写の調節を行うタン
パク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮ
Ａ複製のためのタンパク質の合成を生じる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製
、後期遺伝子発現および宿主細胞シャットオフ（Ｒｅｎａｎ、１９９０）に関与
している。多数のウイルスキャプシドタンパク質を含む、後期遺伝子の産物は、
主要後期プロモーター（ＭＬＰ）により発行される単一の一次転写物の有意なプ
ロセッシング後のみに発現される。このＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）
は、感染の後期フェーズの間で特に効果的であり、そしてこのプロモーターから
発行されたすべてのｍＲＮＡは、それらを翻訳のために好適なｍＲＮＡとする５
’−３部リーダー（ＴＰＬ）配列を所有する。Adenoviruses are particularly suitable for use as gene transfer vectors because of their mid-sized genome, ease of manipulation, high titer, wide target cell range, and high infectivity. Both ends of the viral genome are 100-200 base pair inverted repeats (I
TR), which are cis elements required for viral DNA replication and packaging. The early (E) and late (L) regions of the genome contain the viral DN
A contains different transcription units separated by the start of replication. The E1 region (E1A and E1B) encodes a protein that regulates the transcription of the viral genome and a few cellular genes. Expression of the E2 region (E2A and E2B)
A results in the synthesis of the protein for replication. These proteins are involved in DNA replication, late gene expression and host cell shutoff (Renan, 1990). The products of the late genes, including numerous viral capsid proteins,
It is expressed only after significant processing of a single primary transcript issued by the major late promoter (MLP). This MLP (located at 16.8 mu)
Is particularly effective during the late phase of infection, and all mRNAs issued from this promoter make them suitable mRNAs for translation.
'Possessing a three-part leader (TPL) sequence.

【０１７４】 Ｅ３領域は、Ａｄ感染細胞の効果的な溶解、ならびに感染細胞のＴＮＦ媒介細
胞溶解およびＣＴＬ媒介溶解に必要であるらしいタンパク質をコードする。一般
に、Ｅ４領域は、７つのタンパク質をコードすると考えられており、そのいくつ
かはＥ２プロモーターを活性化する。それは、宿主ｍＲＮＡ輸送をブロックし、
およびウイルスＲＮＡの細胞質への輸送を増大することが示されている。さらに
、このＥ４産物は、感染の後期に見られる初期遺伝子発現における減少に一部関
係している。Ｅ４はまた、溶解的増殖の間に、Ｅ１ＡおよびＥ４発現を阻害する
（しかしＥ１Ｂ発現は阻害しない）。いくつかのＥ４タンパク質は、効率的なＤ
ＮＡ複製に必要であるが、この関与の機構は未知である。Ｅ４はまた、ウイルス
後期遺伝子発現における転写後事象；すなわち、溶解的増殖における３部リーダ
ーのアルターナティブスプライシングに関与する。しかし、Ｅ４機能は、ＤＮＡ
複製に絶対的に必要であるわけではなく、それらの欠如は複製を遅らせる。他の
機能は、ウイルスＤＮＡ合成のネガティブ調節、アデノウイルス感染の間に通常
見られる核下（ｓｕｂ−ｎｕｃｌｅａｒ）再構築の誘導、およびウイルス複製に
必要である他の機能、後期ウイルスｍＲＮＡ蓄積、および宿主細胞転写シャット
オフを含む。The E3 region encodes a protein that may be required for effective lysis of Ad infected cells, as well as TNF- and CTL-mediated lysis of infected cells. In general, the E4 region is thought to encode seven proteins, some of which activate the E2 promoter. It blocks host mRNA transport,
And increase the transport of viral RNA to the cytoplasm. In addition, this E4 product has been implicated in part in the reduction in early gene expression seen late in infection. E4 also inhibits E1A and E4 expression (but not E1B expression) during lytic growth. Some E4 proteins have efficient D
Although required for NA replication, the mechanism of this involvement is unknown. E4 is also involved in post-transcriptional events in viral late gene expression; ie, alternative splicing of the tripartite leader in lytic growth. However, E4 function is DNA
Duplication is not absolutely necessary, and their lack delays duplication. Other functions include negative regulation of viral DNA synthesis, induction of sub-nuclear rearrangements commonly found during adenovirus infection, and other functions required for viral replication, late viral mRNA accumulation, and Including host cell transcription shutoff.

【０１７５】 現在の系では、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベ
クターとの間の相同的組換えから生成される。２９３細胞中のこのプロウイルス
ベクターとＡｄ配列との間の可能な組換え、またはｐＪＭ１７プラスミドの場合
挿入されたｐＢＲ３２２配列の自然欠失は、完全長の野生型Ａｄ５アデノウイル
スを生成し得る。従って、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し
、そしてそのゲノム構造を調べることは重要である。In current systems, recombinant adenovirus is generated from homologous recombination between a shuttle vector and a proviral vector. Possible recombination between this proviral vector and the Ad sequence in 293 cells, or the natural deletion of the inserted pBR322 sequence in the case of the pJM17 plasmid, can produce a full-length wild-type Ad5 adenovirus. Therefore, it is important to isolate a single clone of the virus from each plaque and examine its genomic structure.

【０１７６】 複製欠損である、現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ａｄ５
ＤＮＡフラグメントによりヒト胎児腎臓細胞から形質転換され、そしてＥ１タ
ンパク質を構成的に発現する２９３と称される特有のヘルパー細胞株に依存する
（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムからなくて
も済むので（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、現在のアデノウイルス
ベクターは、２９３細胞の補助で、Ｅ１、Ｅ３または両方の領域のいずれかに外
来ＤＮＡを保持する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。本質的に
、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージし得（Ｇｈｏｓｈ
−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）、約２ｋｂのＤＮＡに対する収容能力を提
供する。Ｅ１およびＥ３領域において置換可能である約５．５ｋｂのＤＮＡと組
合せ、現在のアデノウイルスベクターの最大収容能力は、７．５ｋｂ以下である
か、またはベクターの全長の約１５％である。The generation and propagation of the current replication-defective adenovirus vector is Ad5.
It is transformed from human fetal kidney cells by DNA fragments and relies on a unique helper cell line designated 293 that constitutively expresses the E1 protein (Graham et al., 1977). Since the E3 region does not have to be from the adenovirus genome (Jones and Shenk, 1978), current adenovirus vectors carry foreign DNA in either the E1, E3 or both regions with the aid of 293 cells. (Graham and Prevec, 1991). In essence, adenovirus can package about 105% of the wild-type genome (Ghosh
-Chowhury et al., 1987), which provides capacity for about 2 kb of DNA. Combined with about 5.5 kb of DNA that can be replaced in the E1 and E3 regions, the maximum capacity of current adenovirus vectors is less than 7.5 kb or about 15% of the total length of the vector.

【０１７７】 ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞または他のヒト胎
児間葉細胞または上皮細胞のようなヒト細胞に由来し得る。あるいは、ヘルパー
細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳動物種の細胞に由来し得る。こ
のような細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胎児間葉細胞または上皮
細胞を含む。上記のように、好適なヘルパー細胞株は２９３である。[0177] Helper cell lines can be derived from human cells such as human fetal kidney cells, muscle cells, hematopoietic cells or other human fetal mesenchymal or epithelial cells. Alternatively, the helper cells can be derived from cells of other mammalian species that tolerate human adenovirus. Such cells include, for example, Vero cells or other monkey fetal mesenchymal cells or epithelial cells. As mentioned above, the preferred helper cell line is 293.

【０１７８】 最近、Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、２９３細胞を培養し、そしてアデノウ
イルスを増殖するための改良された方法を開示した。１つのフォーマットでは、
自然の細胞凝集物を、個々の細胞を、１００−２００ｍｌの培地を含む、１リッ
トルのシリコン処理スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕ
Ｋ）中に接種することにより増殖させる。４０ｒｐｍで攪拌した後、細胞生存率
をトリパンブルーで推定する。別のフォーマットでは、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイ
クロキャリア（Ｂｉｂｂｙ Ｓｔｅｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ、ＵＫ）を以下のよう
に採用する。５ｍｌの培地中に再懸濁した細胞接種物を、２５０ｍｌのＥｒｌｅ
ｎｍｅｙｅｒフラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加し、そしてときどき攪拌
して１〜４時間静置した。次いで、培地を５０ｍｌの新鮮培地で置き換え、そし
て振盪を開始する。ウイルス産生には、細胞を約８０％集密度まで増殖させ、そ
の時間の後、培地を置換し（最終容量の２５％まで）、そしてアデノウイルスを
０．０５のＭＯＩで添加する。培養を一晩静置し、その後容量を１００％まで増
加し、そしてさらなる７２時間の振盪を開始する。Recently, Racher et al. (1995) disclosed an improved method for culturing 293 cells and propagating adenovirus. In one format,
The natural cell aggregates were used to separate individual cells from 1-liter siliconized spinner flasks containing 100-200 ml of media (Techne, Cambridge, U.S.A.).
Propagate by inoculation in K). After stirring at 40 rpm, cell viability is estimated with trypan blue. Another format employs Fibra-Cel microcarriers (Bibby Sterlin, Stone, UK) as follows. The cell inoculum resuspended in 5 ml of medium was added to 250 ml of Erle
Added to carrier (50 ml) in nmeyer flask and allowed to stir occasionally for 1-4 hours. The medium is then replaced with 50 ml of fresh medium and shaking is started. For virus production, cells are grown to approximately 80% confluence, after which time the medium is replaced (to 25% of final volume) and adenovirus is added at an MOI of 0.05. The culture is left overnight, after which the volume is increased to 100% and shaking is started for a further 72 hours.

【０１７９】 アデノウイルスベクターが複製欠損であるか、または少なくとも条件的に欠損
しているという要求の他に、アデノウイルスベクターの性質は、本発明の成功し
た実施に重要であるとは考えられない。アデノウイルスは、４２の異なる既知の
血清型またはサブグループＡ−Ｆのいずれかでもあり得る。サブグループＣのア
デノウイルスタイプ５は、本発明における使用のための条件的複製欠損アデノウ
イルスベクターを得るための好適な出発材料である。これは、アデノウイルスタ
イプ５は、それについて、大量の生化学的、医学的および遺伝的情報が知られ、
そして歴史的にベクターとしてアデノウイルスを採用して大部分の構築物に用い
られているからである。Apart from the requirement that the adenovirus vector be replication-defective or at least conditionally deficient, the nature of the adenovirus vector is not considered critical to the successful practice of the present invention. . The adenovirus may be of any of the 42 different known serotypes or subgroups AF. Adenovirus type 5 of subgroup C is a preferred starting material for obtaining conditional replication defective adenovirus vectors for use in the present invention. This is because adenovirus type 5 has a large amount of known biochemical, medical and genetic information about it,
Historically, adenovirus has been employed as a vector and has been used in most constructs.

【０１８０】 上記のように、本発明による代表的なベクターは複製欠損であり、そしてアデ
ノウイルスＥ１領域を有さない。それ故、Ｅ１コード配列が除去された位置に目
的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も便利である。し
かし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は、本発明にとって重要では
ない。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら
（１９８６）により記載されるように、Ｅ３置換ベクター中の欠失したＥ３領域
の代わりに挿入され得るか、またはヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ
４欠損を相補するＥ４領域中に挿入され得る。As noted above, representative vectors according to the present invention are replication defective and do not have an adenovirus E1 region. Therefore, it is most convenient to introduce a polynucleotide encoding the gene of interest at a position where the E1 coding sequence has been removed. However, the location of the insertion of the construct within the adenovirus sequence is not critical to the invention. The polynucleotide encoding the gene of interest can also be inserted in place of the deleted E3 region in an E3 replacement vector, as described by Karlsson et al. (1986), or the helper cell line or
The four deletions can be inserted into the E4 region that complements them.

【０１８１】 アデノウイルスは増殖および操作し易く、そしてインビトロおよびインビボで
広い宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高力価、例えば、ｍｌあたり
１０⁹−１０¹¹プラーク形成単位で得られ得、そしてそれらは高度に感染性であ
る。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノム中への組込みを必要としない。
アデノウイルスベクターにより送達される外来遺伝子はエピソーム性であり、そ
してそれ故、宿主細胞への遺伝毒性は低い。野生型アデノウイルスを用いたワク
チン接種の研究では副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏ
ｐら、１９７１）、インビボ遺伝子移入ベクターとしてそれらの安全性および治
療可能性を示す。Adenovirus is easy to grow and manipulate, and exhibits a wide host range in vitro and in vivo. This group of viruses can be obtained with high titers, eg, 10 ⁹ -10 ¹¹ plaque forming units per ml, and they are highly infectious. The life cycle of adenovirus does not require integration into the host cell genome.
Foreign genes delivered by adenovirus vectors are episomal and, therefore, have low genotoxicity to host cells. No side effects have been reported in vaccination studies with wild-type adenovirus (Couch et al., 1963; To
p et al., 1971), showing their safety and therapeutic potential as in vivo gene transfer vectors.

【０１８２】 アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現調査（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１
９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈ
ａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１
９９２）で用いられている。最近、動物研究は、組換えアデノウイルスが、遺伝
子治療に用いられ得ることを示唆した（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕ
ｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒ
ｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織に組換え
アデノウイルスを投与する研究は、気管滴下（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１
；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注入（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、
末梢静脈内注入（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）、鼻内接種（Ｇｉｎ
ｓｂｅｒｇら、１９９１）、肺へのエアロゾル投与（Ｂｅｌｌｏｎ、１９９６）
、腹腔内投与（Ｓｏｎｇら、１９９７）、胸膜内注入（Ｅｌｓｈａｍｉら、１９
９６）、小胞内投与を用いる膀胱への投与（Ｗｅｒｔｈｍａｎら、１９９６）、
腹腔内、胸膜内、筋肉内または皮下を含む皮下注入（Ｏｇａｗａ、１９８９）、
心筋中への心室注入（心臓、Ｆｒｅｎｃｈら、１９９４）、肝臓灌流（肝動脈ま
たは門脈、Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら、１９９７）および脳中への定位固定接種（Ｌ
ｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅら、１９９３）を含む。Adenovirus vectors are used for eukaryotic gene expression studies (Leverro et al., 1).
991; Gomez-Foix et al., 1992) and vaccine development (Grunh
aus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1
992). Recently, animal studies have suggested that recombinant adenovirus can be used for gene therapy (Stratford-Perricau).
det and Perricaudet, 1991; Stratford-Per
ricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Studies administering recombinant adenovirus to different tissues have been described by tracheal instillation (Rosenfeld et al., 1991).
Rosenfeld et al., 1992), intramuscular injection (Ragot et al., 1993),
Peripheral intravenous infusion (Herz and Gerard, 1993), intranasal inoculation (Gin
sberg et al., 1991), aerosol administration to the lungs (Bellon, 1996).
, Intraperitoneal administration (Song et al., 1997), intrapleural injection (Elsami et al., 1992).
96), administration to the bladder using intravesicular administration (Werthman et al., 1996);
Subcutaneous injection, including intraperitoneal, intrapleural, intramuscular or subcutaneous (Ogawa, 1989);
Ventricular infusion into myocardium (heart, French et al., 1994), hepatic perfusion (hepatic artery or portal vein, Shiraiishi et al., 1997) and stereotactic inoculation into brain (L
e Gal La Salel et al., 1993).

【０１８３】 ｉｉ）レトロウイルス レトロウイルスは、逆転写のプロセスにより感染細胞中でそれらのＲＮＡを二
本鎖ＤＮＡに転換する能力により特徴付けられる一本鎖ＲＮＡウイルスのグルー
プである（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、得られるＤＮＡは、プロウイル
スとして細胞染色体中に安定に組み込まれ、そしてウイルスタンパク質の合成を
行う。この組込みは、レシピエント細胞中のウイルスゲノム遺伝子配列およびそ
の子孫の保持を生じる。このレトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子ｇａｇ、ｐ
ｏｌ、およびｅｎｖを含み、これらは、キャプシドタンパク質，ポリメラーゼタ
ンパク質、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする。ｇａｇ遺伝子から上
流に見出される配列は、ゲノムのビリオンへのパッケージングのためのシグナル
を含む。２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’および３’
末端に存在する。これらは、強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含み
、そしてまた宿主細胞ゲノムにおける組込みに必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ，１
９９０）。Ii) Retroviruses Retroviruses are a group of single-stranded RNA viruses characterized by their ability to convert their RNA into double-stranded DNA in infected cells by the process of reverse transcription (Coffin, 1990). . The resulting DNA is then stably integrated into cellular chromosomes as a provirus, and performs the synthesis of viral proteins. This integration results in the retention of the viral genomic gene sequence and its progeny in the recipient cell. This retroviral genome contains three genes gag, p
ol, and env, which encode the capsid protein, the polymerase protein, and the envelope component, respectively. Sequences found upstream from the gag gene contain signals for packaging of the genome into virions. Two long terminal repeat (LTR) sequences are located 5 'and 3' of the viral genome.
Present at the end. These contain strong promoter and enhancer sequences and are also required for integration in the host cell genome (Coffin, 1).
990).

【０１８４】 レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸を
特定のウイルス配列の代りにウイルスゲノム中に挿入し、複製欠損であるウイル
スを生成する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝
子を含むが、ＬＴＲとパッケージング成分のないパッケージング細胞株が構築さ
れている（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージン
グ配列とともにｃＤＮＡを含む組換えプラスミドが（例えば、リン酸カルシウム
沈殿により）この細胞株に導入されるとき、このパッケージング配列は、この組
換えプラスミドのＲＮＡ転写物を、ウイルス粒子中にパッケージングすることを
可能にし、次いでこれは、培養培地中に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕ
ｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）
。次いで組換えレトロウイルスを含む培地を集め、必要に応じて濃縮し、そして
遺伝子移入のために用いられる。レトロウイルスベクターは、広範な種類の細胞
型を感染し得る。しかし、組込みおよび安定発現は、宿主細胞の***を必要とす
る（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。To construct a retroviral vector, a nucleic acid encoding a gene of interest is inserted into the viral genome in place of a specific viral sequence, generating a replication-defective virus. To generate virions, packaging cell lines have been constructed that contain the gag, pol, and env genes, but lack the LTR and packaging components (Mann et al., 1983). When a recombinant plasmid containing the cDNA along with the retroviral LTR and the packaging sequence is introduced into the cell line (eg, by calcium phosphate precipitation), the packaging sequence causes the RNA transcript of the recombinant plasmid to be transferred into the virus particle. To be secreted into the culture medium (Nicolas and Ru).
Benstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983).
. The medium containing the recombinant retrovirus is then collected, concentrated if necessary, and used for gene transfer. Retroviral vectors can infect a wide variety of cell types. However, integration and stable expression require the division of host cells (Paskind et al., 1975).

【０１８５】 レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするための新たなアプローチ
が、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイル
スの化学的改変に基づいて最近開発された。この改変は、シアロ糖タンパク質レ
セプターを経由する肝細胞の特異的感染を可能にし得る。A new approach to allow specific targeting of retroviral vectors has recently been developed based on retroviral chemical modification by the chemical addition of lactose residues to the viral envelope. This modification may allow for specific infection of hepatocytes via the sialoglycoprotein receptor.

【０１８６】 組換えレトロウイルスの標的化のための異なるアプローチが設計され、そこで
は、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対する抗体および特異的細胞レセ
プターに対するビオチン化抗体が用いられた。これらの抗体は、ストレプトアビ
ジンを用いることによりビオチン成分を経由して結合された（Ｒｏｕｘら、１９
８９）。主要組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用
いて、彼らは、インビトロでエコトロピックウイルスでのこれらの表面抗原を担
う種々のヒト細胞の感染を証明した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。A different approach for the targeting of recombinant retroviruses was designed, in which antibodies against retroviral envelope proteins and biotinylated antibodies against specific cell receptors were used. These antibodies were coupled via the biotin component by using streptavidin (Roux et al., 1992).
89). Using antibodies against major histocompatibility complex class I and class II antigens, they demonstrated in vitro the infection of various human cells bearing these surface antigens with ecotropic viruses (Roux et al., 1989).

【０１８７】 本発明のすべての局面において、レトロウイルスベクターの使用に対する特定
の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノム中のラン
ダムな部位に組み込まれる。これは、隣接遺伝子の機能を妨害し得る、宿主遺伝
子の中断によるか、またはウイルス調節配列の挿入による挿入変異誘発に至り得
る（Ｖａｒｍｕｓら、１９８１）。欠陥レトロウイルスベクターの使用にともな
う別の関心は、パッケージング細胞における野生型の複製能力のあるウイルスの
潜在的な出現である。これは、組換え事象から生じ得、そこでは、組換えウイル
スからのインタクト配列が、宿主細胞ゲノム中に組み込まれたｇａｇ、ｐｏｌ、
ｅｎｖ配列から上流に挿入する。しかし、新たなパッケージング細胞株が、今や
利用可能であり、それは、組換えの可能性を多いに低減する（Ｍａｒｋｏｗｉｔ
ｚら、１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、１９９０）。In all aspects of the invention, there are certain restrictions on the use of retroviral vectors. For example, retroviral vectors are usually integrated at random sites in the cell genome. This can lead to insertional mutagenesis, which can disrupt the function of adjacent genes, by interruption of the host gene, or by insertion of viral regulatory sequences (Varmus et al., 1981). Another concern with the use of defective retroviral vectors is the potential emergence of wild-type replication competent viruses in packaging cells. This can result from a recombination event, in which intact sequences from the recombinant virus have integrated gag, pol,
Insert upstream from the env sequence. However, new packaging cell lines are now available, which greatly reduce the potential for recombination (Markowit
z et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).

【０１８８】 ｉｉｉ）ヘルペスウイルス 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は神経親和性であるので、神経系障害を処置
することでかなりの利益をもたらした。さらに、潜伏期間の間に活性であるプロ
モーターの存在とともに、宿主細胞染色体中に組み込むことなく非***性神経細
胞における潜在的な感染を確立するか、またはそうでなければ宿主細胞の代謝を
改変するＨＳＶの能力は、ＨＳＶを魅力的なベクターにする。そしてＨＳＶの神
経親和性適用に多くの注意が集められたことにより、このベクターはまた、その
広い宿主範囲が与えられた場合、他の組織に対して開発され得る。Iii) Herpesvirus Herpes simplex virus (HSV) has provided significant benefits in treating nervous system disorders because it is neurotrophic. In addition, with the presence of a promoter that is active during the incubation period, establishes a potential infection in non-dividing neurons without integrating into the host cell chromosome, or otherwise alters the metabolism of the host cell The ability of HSV makes HSV an attractive vector. And with much attention to the neurotrophic application of HSV, this vector can also be developed against other tissues given its broad host range.

【０１８９】 ＨＳＶを魅力的にする別の因子は、そのゲノムのサイズと組織である。ＨＳＶ
は大きいので、他のより小さなウイルス系におけるより、複数遺伝子または発現
カセットの取り込みは問題とならない。さらに、変化する性能（時間的、強さな
ど）をもつ異なるウイルス制御配列の利用可能性は、他の系におけるよりより大
きな程度まで発現を制御することを可能にする。このウイルスが比較的少ないス
プライスされたメッセージを有し、さらに遺伝子操作を容易にすることもまた利
点である。[0189] Another factor that makes HSV attractive is its genome size and organization. HSV
Is large, so incorporation of multiple genes or expression cassettes is less of an issue than in other smaller virus systems. In addition, the availability of different viral regulatory sequences with varying performance (temporal, strength, etc.) allows controlling the expression to a greater extent than in other systems. It is also an advantage that the virus has relatively few spliced messages and further facilitates genetic manipulation.

【０１９０】 ＨＳＶはまた、比較的操作が容易であり、そして高力価まで増殖し得る。それ
故、十分なＭＯＩを達成するに必要な容量に関して、および繰り返し用量に対す
る低減された必要性の両方で問題はより少ない。遺伝子治療ベクターとしてのＨ
ＳＶの総説については、Ｇｌｏｒｉｏｓｏら（１９９５）を参照のこと。HSV is also relatively easy to manipulate and can grow to high titers. Therefore, there is less of a problem both with respect to the capacity required to achieve sufficient MOI and with a reduced need for repeated doses. H as a gene therapy vector
For a review of SV, see Glorioso et al. (1995).

【０１９１】 サブタイプ１および２と命名されるＨＳＶは、全世界で数百万人のヒト被験体
に感染する、ヒトが遭遇する最も一般的な感染物であるエンベロープウイルスで
ある。大きな複合体二本鎖ＤＮＡゲノムは、数十の異なる遺伝子産物をコードし
、そのうちのいくつかは、スプライスされた転写物に由来する。ビリオンおよび
エンベロープ構成成分に加えて、このウイルスは、プロテアーゼ、リボヌクレオ
チドレダクターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ｓｓＤＮＡ結合性タンパク質、ヘリカ
ーゼ／プライマーゼ、ＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ、ｄＵＴＰアーゼなどを含む多
くの他のタンパク質をコードする。HSV, designated subtypes 1 and 2, is an enveloped virus that infects millions of human subjects worldwide and is the most common infection encountered by humans. Large complex double-stranded DNA genomes encode dozens of different gene products, some of which are derived from spliced transcripts. In addition to virions and envelope components, the virus encodes many other proteins, including proteases, ribonucleotide reductases, DNA polymerases, ssDNA binding proteins, helicases / primases, DNA-dependent ATPases, dUTPases, etc. I do.

【０１９２】 ＨＳＶ遺伝子は、その発現が協調的に調節され、かつカスケード様式で逐次的
に順序立てられるいくつかのグループを形成する（ＨｏｎｅｓｓおよびＲｏｉｚ
ｍａｎ、１９７４）。感染後発現される最初の遺伝子のセットであるα遺伝子の
発現は、ビリオンタンパク質番号１６、またはα−トランス誘導因子により増大
される（Ｐｏｓｔら、１９８１；ＢａｔｔｅｒｓｏｎおよびＲｏｉｚｍａｎ、１
９８３；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９８３）。β遺伝子の発現は、機能的なα遺伝
子産物、最も著しくは、α４遺伝子によりコードされるＩＣＰ４を必要とする（
ＤｅＬｕｃａら、１９８５）。大部分はビリオン構造タンパク質をコードする異
質グループ遺伝子であるγ遺伝子は、最適発現のために、ウイルスＤＮＡ合成の
開始を必要とする（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９８０）。The HSV genes form several groups whose expression is coordinately regulated and sequentially ordered in a cascade fashion (Honess and Roiz).
man, 1974). Expression of the α gene, the first set of genes to be expressed post-infection, is increased by virion protein # 16, or an α-trans inducer (Post et al., 1981; Batterson and Roizman, 1).
983; Campbell et al., 1983). Expression of the β gene requires a functional α gene product, most notably ICP4 encoded by the α4 gene (
DeLuca et al., 1985). The γ gene, a heterogeneous group of genes largely encoding virion structural proteins, requires initiation of viral DNA synthesis for optimal expression (Holland et al., 1980).

【０１９３】 ゲノムの複雑性に一致して、ＨＳＶの生活環は極めて複雑である。ウイルス粒
子の合成、そして最終的には細胞死を起こす生活環に加えて、このウイルスは、
そのゲノムが、特定の未だ規定されていないシグナルが溶解サイクルの再発の引
金となるまで、神経節中に維持される潜伏状態に入る能力を有する。ＨＳＶの非
毒性改変体が開発され、そして遺伝子治療状況における使用のために容易に利用
可能である（米国特許第５，６７２，３４４号）。[0193] Consistent with the complexity of the genome, the life cycle of HSV is extremely complex. In addition to the synthesis of virus particles, and the life cycle that eventually leads to cell death, the virus
The genome has the ability to enter a latent state that is maintained in the ganglia until a specific, yet undefined, signal triggers a relapse of the lytic cycle. Non-toxic variants of HSV have been developed and are readily available for use in gene therapy settings (US Pat. No. 5,672,344).

【０１９４】 ｉｖ）アデノ随伴ウイルス 最近、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、より一般的に用いられているレトロ
ウイルスおよびアデノウイルスベクターの可能な代替物として出現した。レトロ
ウイルスおよびアデノウイルス媒介遺伝子移入に関する研究は、前者の可能な発
癌性性質、および後者に関連する免疫原性問題に対する関心をもたらしたが、Ａ
ＡＶは、任意のこのような病理学適応症と関連付けられていない。Iv) Adeno-Associated Virus Recently, adeno-associated virus (AAV) has emerged as a possible alternative to the more commonly used retrovirus and adenovirus vectors. Studies on retrovirus and adenovirus-mediated gene transfer have raised interest in the potential carcinogenic properties of the former, and the immunogenicity issues associated with the latter.
AV has not been associated with any such pathological indication.

【０１９５】 さらに、ＡＡＶは、これを他のベクターより望ましくするいくつかの特有の特
徴もを所有している。レトロウイルスとは異なり、ＡＡＶは非***細胞を感染し
得る；野生型ＡＡＶは、ヒト細胞の第１９染色体中への部位特異的様式の組込み
により特徴付けられている（ＫｏｔｉｎおよびＢｅｒｎｓ、１９８９；Ｋｏｔｉ
ｎら、１９９０；Ｋｏｔｉｎら、１９９１；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９９１）；
そしてＡＡＶはまた、抗発癌性性質を所有する（Ｏｓｔｒｏｖｅら、１９８１；
ＢｅｒｎｓおよびＧｉｒａｕｄ、１９９６）。組換えＡＡＶゲノムは、野生型Ａ
ＡＶゲノムの全コード配列を除いて、ＡＡＶ ＩＴＲ間で目的のＤＮＡ配列を分
子的にクローニングすることにより構築される。従って、このように生成された
ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶの任意のコード配列を欠き、なお、インビトロ
およびインビボの両方で形質導入に際し、組換え遺伝子の安定な染色体組込みお
よび発現の性質を保持する（Ｂｅｒｎｓ、１９９０；ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅ
ｎｓｋｙ、１９８７；Ｂｅｒｔｒａｎら、１９９６；Ｋｅａｒｎｓら、１９９６
；Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら、１９９７ａ）。最近まで、ＡＡＶは、ほとんどす
べての細胞型、そして種バリアを横切ってさえ感染すると考えられていた。しか
し、今や、ＡＡＶ感染はレセプターに媒介されることが決定された（Ｐｏｎｎａ
ｚｈａｇａｎら、１９９６；Ｍｉｚｕｋａｍｉら、１９９６）。In addition, AAV possesses some unique features that make it more desirable than other vectors. Unlike retroviruses, AAV can infect nondividing cells; wild-type AAV is characterized by a site-specific manner of integration into chromosome 19 of human cells (Kotin and Berns, 1989; Koti).
n et al., 1990; Kotin et al., 1991; Samulski et al., 1991);
And AAV also possesses anti-carcinogenic properties (Ostrobe et al., 1981;
Berns and Giraud, 1996). The recombinant AAV genome contains wild-type A
Except for the entire coding sequence of the AV genome, it is constructed by molecularly cloning the DNA sequence of interest between AAV ITRs. Thus, the AAV vector thus generated lacks any coding sequence for wild-type AAV, yet retains the stable chromosomal integration and expression properties of the recombinant gene upon transduction, both in vitro and in vivo. (Berns, 1990; Berns and Bohe.
Nsky, 1987; Bertran et al., 1996; Kearns et al., 1996.
Ponnazhagan et al., 1997a). Until recently, AAV was thought to infect almost all cell types, and even across species barriers. However, it has now been determined that AAV infection is mediated by the receptor (Ponna
Zhagan et al., 1996; Mizukami et al., 1996).

【０１９６】 ＡＡＶは、約４７００塩基対の直線状の一本鎖ＤＮＡを利用する。逆向きの末
端反復がゲノムに隣接する。このゲノム内には２つの遺伝子が存在し、多くの別
個の遺伝子産物を生じる。第１はｃａｐ遺伝子であり、ＶＰ−１、ＶＰ−２およ
びＶＰ−３と称する３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を産生する。第２
はｒｅｐ遺伝子であり、４つの非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これら
のｒｅｐ遺伝子産物の１つ以上がＡＡＶ転写のトランス活性化を行う。ＡＡＶの
配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３）および米国特許第５，２５２，４
７９号によって提供されている（その全体のテキストを詳細に参考として本明細
書に援用する）。AAV utilizes linear, single-stranded DNA of about 4700 base pairs. The inverted terminal repeat is adjacent to the genome. There are two genes in this genome, giving rise to many distinct gene products. The first is the cap gene, which produces three different virion proteins (VP), termed VP-1, VP-2 and VP-3. Second
Is the rep gene and encodes four nonstructural proteins (NS). One or more of these rep gene products transactivate AAV transcription. The sequence of AAV is described in Srivastava et al. (1983) and US Pat. No. 5,252,4.
No. 79, which text is hereby incorporated by reference in its entirety.

【０１９７】 ＡＡＶ中の３つのプロモーターは、ゲノム中、マップ単位で、それらの位置に
よって命名されている。これらは、左から右に、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０であ
る。転写は６つの転写物を与え、３つのプロモーターの各々で２つが開始し、各
ペアの１つがスプライスされる。マップ単位４２−４６由来のスプライス部位は
、各転写物について同じである。４つの非構造タンパク質は、明らかにより長い
転写物に由来し、そして３つのビリオンタンパク質はすべて最も小さい転写物か
ら生じる。The three promoters in AAV are named by their location in the genome, in map units. These are, from left to right, p5, p19 and p40. Transcription gives six transcripts, two at each of the three promoters, one of each pair being spliced. The splice sites from map units 42-46 are the same for each transcript. The four nonstructural proteins clearly originate from longer transcripts, and all three virion proteins all originate from the smallest transcript.

【０１９８】 ＡＡＶは、ヒトにおける任意の病的状態と関連しない。興味深いことに、効率
的な複製には、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウ
イルス、プソイドラビエスウイルス、そして、勿論アデノウイルスのようなウイ
ルスからの「補助（ｈｅｌｐｉｎｇ）」機能を必要とする。最も特徴付けられた
ヘルパーはアデノウイルスであり、そしてこのウイルスについて多くの「初期」
機能がＡＡＶ複製を支援することが示されている。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の
低レベル発現はＡＡＶ構造発現を抑えて保持すると考えられ、そしてヘルパーウ
イルス感染がこのブロックを取り除くと考えられる。AAV is not associated with any pathological condition in humans. Interestingly, for efficient replication, AAV requires a "helping" function from viruses such as herpes simplex viruses I and II, cytomegalovirus, pseudorabies virus, and, of course, adenovirus. And The most characterized helper is the adenovirus, and many "early" about this virus
The function has been shown to support AAV replication. Low level expression of the AAV rep protein is thought to hold down AAV structural expression, and helper virus infection will remove this block.

【０１９９】 ｖ）ワクチニアウイルス ワクチニアウイルスベクターが広範に用いられている。なぜなら、それらの構
築の容易さ、得られる発現の比較的高レベル、広い宿主範囲およびＤＮＡを保持
する大きな能力のためである。ワクチニアは、顕著な「Ａ−Ｔ」優勢を示す約１
８６ｋｂの、直線状の二本鎖ＤＮＡゲノムを含む。約１０．５ｋｂの逆向き末端
反復がゲノムに隣接する。必須遺伝子の大部分は、中央領域内にマップされるよ
うであり、これは、ポックスウイルス間で最も高度に保存されている。ワクチニ
アウイルス中の推定されるオープンリーディングフレームの数は１５０〜２００
である。両方の鎖がコード配列であるが、リーディグフレームの広範な重複は一
般的でない。V) Vaccinia virus Vaccinia virus vectors are widely used. Because of their ease of construction, relatively high levels of expression obtained, wide host range and great ability to retain DNA. Vaccinia has a significant "AT" dominance of about 1
Contains an 86 kb, linear double-stranded DNA genome. An approximately 10.5 kb inverted terminal repeat is adjacent to the genome. Most of the essential genes appear to be mapped within the central region, which is the most highly conserved among poxviruses. The number of putative open reading frames in vaccinia virus is 150-200
It is. Although both strands are coding sequences, extensive duplication of reading frames is not common.

【０２００】 少なくとも２５ｋｂがこのワクチニアウイルスゲノム中に挿入され得る（Ｓｍ
ｉｔｈおよびＭｏｓｓ、１９８３）。プロトタイプワクチニアベクターは、相同
的組換えによりこのウイルス中に挿入された移入遺伝子（トランスジーン）チミ
ジンキナーゼ遺伝子を含む。ベクターは、ｔｋ−表現型を基礎に選択される。脳
心筋炎ウイルスの非翻訳リーダー配列を含めると、発現のレベルは、従来のベク
ターのそれより高く、移入遺伝子は、２４時間で感染細胞のタンパク質の１０％
以上蓄積する（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら、１９８９）。At least 25 kb can be inserted into the vaccinia virus genome (Sm
is and Moss, 1983). The prototype vaccinia vector contains the transgene thymidine kinase gene inserted into this virus by homologous recombination. Vectors are selected on the basis of the tk-phenotype. Including the untranslated leader sequence of the encephalomyocarditis virus, the level of expression was higher than that of conventional vectors, and the transgene was 10% of the protein in infected cells in 24 hours.
The above is accumulated (Elroy-Stein et al., 1989).

【０２０１】 （ｂ．非ウイルス移入） 培養哺乳動物細胞中への発現構築物の移入のためのいくつかの非ウイルス方法
もまた、本発明によって企図される。これらは、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａ
ｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ
、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ
、１９８５）、エレクトロポーレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；
Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、直接マイクロインジョクション（Ｈａｒｌａｎｄ
およびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５）、ＤＮＡ充填リポソーム（Ｎｉｃｏｌａ
ｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９）、細胞音波処理（Ｆ
ｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）、高速微粒子銃を用いる遺伝子ボンバード（
Ｙａｎｇら、１９９０）、およびレセプター媒介トランスフェクション（Ｗｕお
よびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）を含む。B. Non-Viral Transfer Several non-viral methods for transfer of the expression construct into cultured mammalian cells are also contemplated by the present invention. These are calcium phosphate precipitates (Gra
ham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama
Rippe et al., 1990), DEAE-dextran (Gopal).
, 1985), electroporation (Tur-Kaspa et al., 1986;
Potter et al., 1984), direct microinjection (Harland).
And Weintraub, 1985), DNA-filled liposomes (Nicola
u and Sene, 1982; Fraley et al., 1979), cell sonication (F
echheimer et al., 1987), Gene Bombard using high-speed biolistics (
Yang et al., 1990), and receptor-mediated transfection (Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988).

【０２０２】 治療的努力には、一旦構築物が細胞中に送達されると、遺伝子は異なる部位に
配置され、そして発現され得る。特定の実施態様では、治療遺伝子をコードする
核酸は、細胞のゲノム中に安定に組み込まれ得る。この組込みは、相同的組換え
（遺伝子置換）を経由して同族の位置および配向であり得るか、またはランダム
な非特異的位置（遺伝子増強）で組み込まれ得る。なおさらなる実施態様では、
核酸は、細胞中に、ＤＮＡの別のエピソームセグメントとして安定に維持され得
る。このような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主の細胞環とは独立
にまたはそれに同調して維持および複製を可能にするに十分な配列をコードする
。細胞に発現構築物がどのように送達されるか、および細胞中のどこに核酸が残
るかは、採用される発現構築物のタイプに依存する。[0202] For therapeutic efforts, once the construct is delivered into the cell, the gene can be located at a different site and expressed. In certain embodiments, the nucleic acid encoding the therapeutic gene may be stably integrated into the genome of the cell. This integration can be at the cognate location and orientation via homologous recombination (gene replacement) or at a random, non-specific location (gene augmentation). In a still further embodiment,
Nucleic acids can be stably maintained in cells as separate episomal segments of DNA. Such nucleic acid segments or "episomes" encode sufficient sequence to permit maintenance and replication independently or in concert with the host cell ring. How the expression construct is delivered to the cell and where in the cell the nucleic acid remains depends on the type of expression construct employed.

【０２０３】 本発明の特定の実施形態では、発現構築物はリポソーム内に包括される。リポ
ソームは、ホスホリピド二重膜および内部水性媒体により特徴付けられる小胞構
造である。多重膜リポソームは、水性媒体により分離された複数の脂質層を有す
る。これらは、ホスホリピドが過剰の水性溶液中に懸濁されるとき自然に形成す
る。脂質成分は、閉鎖された構造の形成前に自己再配置を行い、そして脂質二重
膜の間に水および溶解された溶質を包括する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗ
ａｔ、１９９１）。カチオン性リポソームへのＤＮＡの添加は、リポソームから
光学的複屈折液体−結晶濃縮小球へのトポロジー的遷移を引き起こす（Ｒａｄｌ
ｅｒら、１９９７）。これらのＤＮＡ−脂質複合体は遺伝子治療における使用の
ための可能な非ウイルスベクターである。[0203] In certain embodiments of the invention, the expression construct is encapsulated in a liposome. Liposomes are vesicular structures characterized by a phospholipid bilayer and an internal aqueous medium. Multilamellar liposomes have multiple lipid layers separated by an aqueous medium. These form spontaneously when the phospholipids are suspended in excess aqueous solution. The lipid component undergoes a self-rearrangement prior to the formation of a closed structure and includes water and dissolved solutes between the lipid bilayers (Ghosh and Bachhaw).
at, 1991). Addition of DNA to cationic liposomes causes a topological transition from liposomes to optically birefringent liquid-crystal-enriched globules (Radl
er et al., 1997). These DNA-lipid complexes are possible non-viral vectors for use in gene therapy.

【０２０４】 インビトロの外来ＤＮＡのリポソーム媒介核酸送達および発現は非常に首尾良
く行なわれている。βラクタマーゼ遺伝子を用い、Ｗｏｎｇら（１９８０）は、
培養ニワトリ胎児、ＨｅＬａ、および肝癌細胞における外来ＤＮＡのリポソーム
媒介送達および発現の実行可能性を示した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、
静脈内注射の後、ラットにおける成功したリポソーム媒介遺伝子移入を達成した
。「リポフェクチン」技術を含む種々の市販のアプローチもまた含まれる。Liposome-mediated nucleic acid delivery and expression of foreign DNA in vitro has been very successful. Using the β-lactamase gene, Wong et al. (1980)
The feasibility of liposome-mediated delivery and expression of foreign DNA in cultured chicken embryos, HeLa, and hepatoma cells was demonstrated. Nicolau et al. (1987)
After intravenous injection, successful liposome-mediated gene transfer in rats was achieved. Various commercially available approaches are also included, including "lipofectin" technology.

【０２０５】 本発明の特定の実施態様では、リポソームは、血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）
と複合体化され得る。これは、細胞膜との融合を促進し、そしてリポソームカプ
セル化ＤＮＡの細胞への侵入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａら、
１９８９）。他の実施態様では、リポソームは核の非ヒストン染色体タンパク質
（ＨＭＧ−１）（Ｋａｔｏら、１９９１）と複合体化またはそれと組み合わせて
採用され得る。なおさらなる実施形態では、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ
−１の両方と複合体化またはそれと組み合わせて採用され得る。このような発現
構築物がインビトロおよびインビボの核酸の移入および発現で首尾良く採用され
ているという点において、これらは発明に適用可能である。In certain embodiments of the invention, the liposome is a hemagglutinating virus (HVJ)
And can be complexed. This has been shown to promote fusion with cell membranes and to promote entry of liposome-encapsulated DNA into cells (Kaneda et al.,
1989). In other embodiments, liposomes can be complexed or employed with nuclear non-histone chromosomal protein (HMG-1) (Kato et al., 1991). In still further embodiments, the liposomes are HVJ and HMG
-1 can be complexed or employed in combination therewith. They are applicable to the invention in that such expression constructs have been successfully employed in the transfer and expression of nucleic acids in vitro and in vivo.

【０２０６】 治療遺伝子コードする核酸を細胞中に送達するために採用され得る他のベクタ
ー送達系は、レセプター媒介送達ビヒクルである。これらは、ほとんどすべての
真核生物細胞におけるレセプター媒介エンドサイトーシスによる、高分子の選択
的取り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異的分布のために、この送
達は高度に特異的であり得る（ＷｕおよびＷｕ、１９９３）。Another vector delivery system that can be employed to deliver a therapeutic gene-encoding nucleic acid into a cell is a receptor-mediated delivery vehicle. They utilize the selective uptake of macromolecules by receptor-mediated endocytosis in almost all eukaryotic cells. Due to the cell type-specific distribution of various receptors, this delivery can be highly specific (Wu and Wu, 1993).

【０２０７】 本発明の別の実施形態では、発現構築物は、単に、裸の組換えＤＮＡまたはプ
ラスミドであり得る。この構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過
処理する上記の方法のいずれをも用いることにより実施され得る。これは、特に
インビトロの移入に適用可能であるが、同様にインビボにも適用され得る。Ｄｕ
ｂｅｎｓｋｙら（１９８４）は、ＣａＰＯ₄沈殿物の形態にあるポリオーマウイ
ルスＤＮＡを、成体および新生仔マウスの肝臓および脾臓中に首尾良く注射し、
活性なウイルス複製および急性感染を示した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅ
ｓｈｉｆ（１９８６）はまた、ＣａＰＯ₄沈殿プラスミドの直接腹腔内注入がト
ランスフェクトされた遺伝子の発現を生じることを示した。In another embodiment of the invention, the expression construct may simply be a naked recombinant DNA or plasmid. Transfer of this construct can be performed by using any of the methods described above that physically or chemically permeabilize the cell membrane. This is particularly applicable for transfer in vitro, but may also be applied in vivo. Du
(1984) have successfully injected polyomavirus DNA in the form of a CaPO ₄ precipitate into the liver and spleen of adult and neonatal mice,
It showed active virus replication and acute infection. Benvenisty and Ne
shif (1986) also showed that direct intraperitoneal injection of a CaPO ₄ precipitation plasmid resulted in expression of the transfected gene.

【０２０８】 （４．調節エレメント） ＩｇＡ配列を含む組成物を含有するｐＩｇＲ標的化組成物を調製および産生す
るために、本発明に包含される組換えＤＮＡ技法は、調節エレメントを含む組換
えベクターまたは発現構築物を利用し得る。これらの調節エレメントは、プロモ
ーター（組織特異的、非組織特異的、および誘導性）およびエンハンサー、ポリ
アデニル化配列、ならびに内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。4. Regulatory Elements In order to prepare and produce pIgR targeting compositions containing compositions containing IgA sequences, the recombinant DNA techniques encompassed by the present invention use recombinant vectors containing regulatory elements. Alternatively, an expression construct may be utilized. These regulatory elements can include promoters (tissue-specific, non-tissue-specific, and inducible) and enhancers, polyadenylation sequences, and an internal ribosome entry site (IRES).

【０２０９】 （ａ．プロモーター） 本出願において、用語「発現カセット」は、配列をコードする核酸の一部また
は全部が転写され得る、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝
子構築物を含むことを意味する。この転写物は、タンパク質に翻訳され得るが、
必ずしもそうである必要はない。特定の実施形態では、発現は遺伝子の転写およ
びｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施態様では、発現は、目
的の遺伝子をコードする核酸の転写を含むのみである。(A. Promoter) In the present application, the term “expression cassette” includes any type of genetic construct, including a nucleic acid encoding a gene product, in which part or all of the nucleic acid encoding the sequence can be transcribed. Means that. This transcript can be translated into a protein,
It does not have to be. In certain embodiments, expression includes both transcription of the gene and translation of the mRNA into a gene product. In other embodiments, expression only involves the transcription of a nucleic acid encoding the gene of interest.

【０２１０】 遺伝子産物をコードする核酸はプロモーターの転写制御下にある。「プロモー
ター」は、遺伝子の特異的転写を開始するために必要な、細胞の合成器械、また
は導入された合成器械により認識されるＤＮＡ配列をいう。語句「転写制御下」
は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始、および遺伝子の発現を制御す
るために、核酸に関連して正確な位置および配向にあることを意味する。[0210] The nucleic acid encoding the gene product is under the transcriptional control of a promoter. "Promoter" refers to a DNA sequence recognized by the synthetic machinery of a cell, or introduced synthetic machinery, required to initiate specific transcription of a gene. The phrase "under transcriptional control"
Means that the promoter is in the correct position and orientation relative to the nucleic acid to control the initiation of RNA polymerase and the expression of the gene.

【０２１１】 用語プロモーターは、本明細書では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周
りにクラスターとなる一群の転写制御モジュールをいうために用いられ得る。ど
のようにプロモーターを組織化するかについて考慮する多くの部分はいくつかの
ウイルスプロモーターの分析に由来する。これらは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（
ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写単位を含む。より最近の研究により増強されたこ
れらの調査は、プロモーターは、各々が約７−２０ｂｐのＤＮＡからなる別々の
機能的モジュールから構成され、そして転写アクチベータまたはリプレッサータ
ンパク質の１つ以上の認識部位を含むことを示した。[0211] The term promoter may be used herein to refer to a group of transcription control modules that cluster around the start site of RNA polymerase II. Much of the consideration in how to organize a promoter comes from the analysis of several viral promoters. These are HSV thymidine kinase (
tk) and the SV40 initial transcription unit. These studies, which were enhanced by more recent studies, indicate that the promoter is composed of separate functional modules, each consisting of about 7-20 bp of DNA, and that it recognizes one or more recognition sites for transcriptional activator or repressor proteins. It is shown to include.

【０２１２】 各プロモーター中の少なくとも１のモジュールは、ＲＮＡ合成のための開始部
位を位置付けるために機能する。これの最も良く知られた例は、ＴＡＴＡボック
スであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子の
プロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターのような、いくつかのプ
ロモーターはＴＡＴＡボックスを欠いており、開始部位自体の上に横たわる別個
のエレメントが開始の位置を固定することを補助する。[0212] At least one module in each promoter functions to position the start site for RNA synthesis. The best known example of this is the TATA box, but some promoters lack the TATA box, such as the promoter of the mammalian terminal deoxynucleotidyl transferase gene and the promoter of the SV40 late gene. A separate element lying on itself helps to fix the starting position.

【０２１３】 付加的なプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を調節する。代表的には
、これらは、開始部位の上流３０−１１０ｂｐの領域中に位置するが、最近、多
くのプロモーターが開始部位の下流に同様に機能的エレメントを含むことが示さ
れている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟である。従って、プ
ロモーター機能は、エレメントが逆になるか、または互いに対して移動しても保
存される。ｔｋプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が
減退する前に、５０ｂｐまで増加され得る。プロモーターに依存して，個々のエ
レメントは、転写を活性化するために協働的または独立して機能し得るようであ
る。[0213] Additional promoter elements regulate the frequency of transcription initiation. Typically, they are located in the region 30-110 bp upstream of the start site, but recently it has been shown that many promoters contain functional elements downstream of the start site as well. The spacing between promoter elements is often flexible. Thus, promoter function is preserved when elements are reversed or moved relative to each other. For the tk promoter, the spacing between promoter elements can be increased to 50 bp before activity is diminished. Depending on the promoter, it appears that individual elements can function cooperatively or independently to activate transcription.

【０２１４】 目的の核酸配列の発現を制御するために採用される特定のプロモーターは、そ
れが標的細胞中で核酸の発現を行い得る限り重要ではないと考えられる。従って
、ヒト細胞が標的される場合、ヒト細胞中で発現され得るプロモーターに隣接し
、かつその制御下に核酸コード領域を配置するのが好適である。一般に、このよ
うなプロモーターは、ヒトまたはウイルスベクターのいずれかを含み得る。[0214] The particular promoter employed to control the expression of the nucleic acid sequence of interest will not be critical as long as it can drive the expression of the nucleic acid in the target cell. Thus, when human cells are targeted, it is preferred to place the nucleic acid coding region adjacent to and under the control of a promoter that can be expressed in human cells. Generally, such promoters can include either human or viral vectors.

【０２１５】 種々の実施形態で、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモ
ーター、ＳＶ４０初期プロモーター，Ｒｏｕｓザルコーマウイルス長末端反復、
βアクチン、ラットインシュリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−
ホスフェートデヒドロゲナーゼを用いて、目的のコード配列の高レベル発現が得
られ得る。目的のコード配列の発現を達成するために当該分野で周知である他の
ウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージプロモーターの使用も、発現の
レベルが所定の目的に十分であれば同様に企図される。周知の性質を備えたプロ
モーターを採用することにより、トランスフェクションまたは形質転換後の目的
のタンパク質の発現のレベルおよびパターンが最適化され得る。[0215] In various embodiments, the human cytomegalovirus (CMV) immediate early gene promoter, the SV40 early promoter, the Rous simian virus long terminal repeat,
β-actin, rat insulin promoter and glyceraldehyde-3-
High-level expression of the coding sequence of interest can be obtained using phosphate dehydrogenase. The use of other viral or mammalian cell or bacterial phage promoters well known in the art to achieve expression of the coding sequence of interest is likewise contemplated if the level of expression is sufficient for the intended purpose. By employing a promoter with well-known properties, the level and pattern of expression of the protein of interest after transfection or transformation can be optimized.

【０２１６】 特定の生理学的または合成シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択
は、遺伝子産物の誘導可能な発現を許容し得る。例えば、マルチシストロン性ベ
クターが利用されるとき、１つの移入遺伝子または複数の移入遺伝子の発現が、
ベクターが産生される細胞に毒性である場合、１つ以上の移入遺伝子の発現を禁
止するから低減することが所望され得る。生産体である細胞株に毒性であり得る
移入遺伝子の例は、プロアポトーシス遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。
いくつかの誘導性プロモーター系が、移入遺伝子産物が毒性であり得る場合のウ
イルスベクターの産生に利用可能である。[0216] The choice of a promoter that is regulated in response to a particular physiological or synthetic signal may allow for inducible expression of the gene product. For example, when a multicistronic vector is utilized, the expression of one or more transgenes
If the vector is toxic to the cell in which it is produced, it may be desirable to reduce the expression of one or more transgenes as it inhibits expression. Examples of transgenes that can be toxic to the producer cell line are pro-apoptotic genes and cytokine genes.
Several inducible promoter systems are available for the production of viral vectors where the transferred gene product can be toxic.

【０２１７】 エクジソン（ｅｃｄｙｓｏｎｅ）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ、ＣＡ）はこのような系の１つである。この系は、哺乳動物細胞中で目的の遺
伝子の調節された発現を可能にするように設計されている。それは、移入遺伝子
の実質的に基礎レベルの発現はないが、２００倍を越える誘導性を可能にするき
つく調節された発現機構からなる。この系は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのヘテロダ
イマー性エクディソンレセプターを基礎にし、そしてエクディソンまたはムリス
テロンＡのようなアナログがこのレセプターに結合するとき、このレセプターが
プロモーターを活性化し、下流移入遺伝子の発現を高レベルのｍＲＮＡ転写物が
達成されるようにオンする。この系では、このヘテロダイマー性レセプターの両
方のモノマーが１つのベクターから構成的に発現されており、その一方、目的の
遺伝子の発現を駆動するエクディソン−応答性プロモーターが別のプラスミド上
にある。従って、目的の遺伝子移入ベクターへのこのタイプの系の操作は有用で
あり得る。生産体細胞株における、目的の遺伝子およびレセプターモノマーを含
むプラスミドの同時トランスフェクションは、次いで、潜在的に毒性である移入
遺伝子の発現なくして、遺伝子移入ベクターの産生を可能にする。適切な時間に
、移入遺伝子の発現は、エクディソンまたはムリステロンＡで活性化され得る。The ecdysone system (Invitrogen, Carlsba)
d, CA) is one such system. This system is designed to allow for regulated expression of the gene of interest in mammalian cells. It consists of a tightly regulated expression mechanism that allows virtually 200-fold inducibility, although there is virtually no basal level of expression of the transgene. This system is based on the heterodimeric ecdysone receptor of Drosophila, and when an analog such as ecdysone or muristerone A binds to this receptor, the receptor activates the promoter and increases the expression of downstream transgenes at high levels. Turn on so that mRNA transcript is achieved. In this system, both monomers of the heterodimeric receptor are constitutively expressed from one vector, while the ecdysone-responsive promoter driving expression of the gene of interest is on another plasmid. Thus, manipulation of this type of system into a gene transfer vector of interest may be useful. Co-transfection of a plasmid containing the gene of interest and the receptor monomer in a producer cell line then allows the production of a gene transfer vector without the expression of a potentially toxic transgene. At the appropriate time, the expression of the transgene can be activated with ecdysone or muristerone A.

【０２１８】 有用であり得る別の誘導可能な系は、当初は、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒ
ｄ（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５）
により開発された、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ^TMまたはＴｅｔ−Ｏｎ^TM系（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）である。この系もまた、テトラサイクリンまた
はドキシサイクリンのようなテトラサイクリン誘導体に応答して調節される、高
レベルの遺伝子発現を可能にする。Ｔｅｔ−Ｏｎ^TM系では、遺伝子発現はドキシ
サイクリンの存在下でオンになり、その一方、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ^TM系では、遺伝子
発現はドキシサイクリンの非存在下でオンになる。これらの系は、Ｅ．ｃｏｌｉ
のテトラサイクリン耐性オペロン由来の２つの調節エレメントに基づく。テトラ
サイクリンオペレーター配列にテトラサイクリンリプレッサーが結合する。目的
の遺伝子は、プラスミド中、テトラサイクリン応答性エレメントがその中にある
プロモーターの後にクローン化される。第２のプラスミドは、テトラサイクリン
制御トランスアクチベータと呼ばれる調節エレメントを含み、これは、Ｔｅｔ−
Ｏｆｆ^TM系中、単純ヘルペスウイルスからのＶＰ１６ドメインおよび野生型テト
ラサイクリンリプレッサーから構成される。それ故、ドキシサイクリンの非存在
下で転写は構成的にオンである。Ｔｅｔ−Ｏｎ^TM系では、テトラサイクリンリプ
レッサーは野生型ではなく、そしてドキシサイクリンの存在下で転写を活性化す
る。遺伝子治療ベクター産生には、このＴｅｔ−Ｏｆｆ^TM系が好適であり、その
結果、生産体細胞は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下で増殖
し得、そして潜在的に毒性の移入遺伝子の発現を防ぐが、ベクターが患者に導入
されるとき、遺伝子発現は構成的にオンになる。Another inducible system that may be useful is, initially, Gossen and Bujar
d (Gossen and Bujard, 1992; Gossen et al., 1995).
Tet-Off ^™ or Tet-On ^™ system (Clontec)
h, Palo Alto, CA). This system also allows for high levels of gene expression to be regulated in response to tetracycline or a tetracycline derivative such as doxycycline. In the Tet-On ^™ system, gene expression is turned on in the presence of doxycycline, while in the Tet-Off ^™ system, gene expression is turned on in the absence of doxycycline. These systems are described in E.I. coli
Based on two regulatory elements from the tetracycline resistance operon. A tetracycline repressor binds to the tetracycline operator sequence. The gene of interest is cloned in the plasmid after the promoter in which the tetracycline responsive element is located. The second plasmid contains a regulatory element called a tetracycline-regulated transactivator, which contains Tet-
In the Off ^™ system, it is composed of the VP16 domain from herpes simplex virus and the wild-type tetracycline repressor. Therefore, transcription is constitutively on in the absence of doxycycline. In the Tet-On ^™ system, the tetracycline repressor is not wild-type and activates transcription in the presence of doxycycline. The Tet-Off ^™ system is suitable for gene therapy vector production, so that producer cells can grow in the presence of tetracycline or doxycycline and prevent expression of potentially toxic transgenes. When the vector is introduced into a patient, gene expression is turned on constitutively.

【０２１９】 いくつかの状況では、遺伝子治療ベクター中で移入遺伝子の発現を調節するこ
とが所望され得る。例えば、変化する活性強さをもつ異なるウイルスプロモータ
ーを、所望の発現のレベルに依存して利用し得る。哺乳動物細胞では、ＣＭＶ前
初期プロモーターが、強力な転写活性化を提供するためにしばしば用いられる。
より少ない能力のＣＭＶプロモーターの改変型もまた、移入遺伝子の低減された
レベルが所望されるとき用いられる。造血細胞中の移入遺伝子の発現が所望され
るとき、ＭＬＶまたはＭＭＴＶからのＬＴＲのようなレトロウイルスプロモータ
ーがしばしば用いられる。所望の効果に依存して用いられ得る他のウイルスプロ
モーターは、ＳＶ４０、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ ＬＴＲ
、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、またはＭＬＰ領域からのようなアデノウイルスプロモーター
、ＡＡＶ ＬＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＳＶ−ＴＫ、およびトリ
ザルコーマウイルスを含む。[0219] In some situations, it may be desirable to regulate the expression of the transgene in the gene therapy vector. For example, different viral promoters with varying strengths of activity may be utilized depending on the level of expression desired. In mammalian cells, the CMV immediate-early promoter is often used to provide strong transcriptional activation.
Modified versions of the CMV promoter of lower capacity are also used when reduced levels of the transferred gene are desired. When expression of the transgene in hematopoietic cells is desired, a retroviral promoter such as the LTR from MLV or MMTV is often used. Other viral promoters that can be used depending on the desired effect include the SV40, RSV LTR, HIV-1 and HIV-2 LTR
Adenovirus promoters, such as from the E1A, E1A, E2A, or MLP regions, AAV LTR, cauliflower mosaic virus, HSV-TK, and avian zalcoma virus.

【０２２０】 同様に、組織特異的プロモーターを用いて、非標的組織への可能な毒性または
所望されない影響を低減するように、特異的組織または細胞中で転写を行い得る
。本発明では、実施形態は、上皮細胞、特に粘膜上皮細胞中で発現を行うプロモ
ーターをカバーする。内皮特異的プロモーターは、Ｅセレクチン、フォン・ビル
ブラント因子、ＴＩＥ（Ｋｏｒｈｏｎｅｎら、１９９５）およびＫＤＲ／ｆｌｋ
−１のような遺伝子の調節を行う。Similarly, transcription can be performed in a specific tissue or cell using a tissue-specific promoter to reduce possible toxicity or undesired effects on non-target tissues. In the present invention, embodiments cover promoters that drive expression in epithelial cells, particularly mucosal epithelial cells. Endothelial-specific promoters include E-selectin, von Willebrand factor, TIE (Korhonen et al., 1995) and KDR / flk.
Regulation of genes such as -1 is performed.

【０２２１】 特定の適応症では、遺伝子治療ベクターの投与後、所定の時間に転写を活性化
することが所望され得る。これは、ホルモンまたはサイトカインで調節可能であ
るようなプロモーターでなされ得る。例えば、適応症が、特異的ステロイドが産
生されるかまたは巡回する生殖腺組織である遺伝子治療適用では、アンドロゲン
またはエストロゲンで調節されたプロモーターが有利であり得る。ホルモンで調
節可能であるこのようなプロモーターは、ＭＭＴＶ、ＭＴ−１、エクディソンお
よびルビスコ（ＲｕＢｉｓｃｏ）を含む。甲状腺、下垂体および副腎ホルモンに
応答性のような他のホルモン調節されるプロモーターが本発明で有用であること
が予期される。用いられ得るサイトカインおよび炎症性タンパク質応答性プロモ
ーターは、ＫおよびＴキニノゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら、１９８７）、ｃ−ｆｏ
ｓ、ＴＮＦ−α、Ｃ−反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら、１９８８）、ハプト
グロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏら、１９８７）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰ
α、ＩＬ−１、ＩＬ−６（ＰｏｌｉおよびＣｏｒｔｅｓｅ、１９８９）、補体Ｃ
３（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９０）、ＩＬ−８、α−１酸糖タンパク質（Ｐｒｏｗ
ｓｅおよびＢａｕｍａｎｎ、１９８８）、α−１アンチトリプシン、リポタンパ
ク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒら、１９８８）、アンギオテンシノゲン（Ｒｏｎ
ら、１９９１）、フィブリノゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦα
、ＵＶ照射、レチノイン酸、および過酸化水素により誘導可能）、コラゲナーゼ
（ホルボールエステルおよびレチノイン酸により誘導される）、メタロチオネイ
ン（重金属およびグルココルチコイドで誘導可能）、ストロメライシン（ホルボ
ールエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦにより誘導可能）、α−２マ
クログロブリンおよびα−１アンチキモトリプシンを含む。For certain indications, it may be desirable to activate transcription at a predetermined time after administration of the gene therapy vector. This can be done with a promoter that is regulatable with hormones or cytokines. For example, in gene therapy applications where the indication is a gonadal tissue where specific steroids are produced or circulates, androgen or estrogen regulated promoters may be advantageous. Such promoters that are hormonally regulatable include MMTV, MT-1, ecdysone, and Rubisco. Other hormone-regulated promoters, such as those responsive to thyroid, pituitary and adrenal hormones, are expected to be useful in the present invention. Cytokine and inflammatory protein responsive promoters that can be used include K and T kininogens (Kageyama et al., 1987), c-fo.
s, TNF-α, C-reactive protein (Arcone et al., 1988), haptoglobin (Oliviero et al., 1987), serum amyloid A2, C / EBP
α, IL-1, IL-6 (Poli and Cortese, 1989), complement C
3 (Wilson et al., 1990), IL-8, α-1 acid glycoprotein (Prow
se and Baumann, 1988), α-1 antitrypsin, lipoprotein lipase (Zechner et al., 1988), angiotensinogen (Ron
Et al., 1991), fibrinogen, c-jun (phorbol ester, TNFα).
, UV irradiation, inducible by retinoic acid and hydrogen peroxide), collagenase (inducible by phorbol esters and retinoic acid), metallothionein (inducible by heavy metals and glucocorticoids), stromelysin (phorbol ester, interferon) Leukin-1 and EGF), α-2 macroglobulin and α-1 antichymotrypsin.

【０２２２】 細胞周期制御可能プロモーターは、本発明において有用であり得ることが予想
される。例えば、２−シストロン遺伝子治療ベクターにおいて、Ｇ１期において
細胞を捕捉するｐ１６のような第１の遺伝子の発現を駆動するための強力なＣＭ
Ｖプロモーターの使用の後に、細胞周期のＧ１期において活性であるプロモータ
ーの制御下でのｐ５３のような第２の遺伝子の発現が続き得、従って、細胞をア
ポトーシスに押しやる「第２のヒット」を提供する。種々のサイクリンのプロモ
ーターのような他のプロモーターは、ＰＣＮＡ、ガレクチン−３、Ｅ２Ｆ１、ｐ
５３、およびＢＲＣＡ１が使用され得る。It is anticipated that a cell cycle regulatable promoter may be useful in the present invention. For example, in a 2-cistronic gene therapy vector, a powerful CM to drive the expression of a first gene, such as p16, that captures cells in the G1 phase.
The use of the V promoter can be followed by expression of a second gene, such as p53, under the control of a promoter that is active in the G1 phase of the cell cycle, thus creating a "second hit" that pushes the cell to apoptosis. provide. Other promoters, such as various cyclin promoters, include PCNA, galectin-3, E2F1, p2
53, and BRCA1 may be used.

【０２２３】 オステオカルシン、低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）、ＭＡＧＥ−４、ＣＥ
Ａ、αフェトプロテイン、ＧＲＰ７８／ＢｉＰ、およびチロシナーゼのような腫
瘍特異的プロモーターもまた、腫瘍細胞において遺伝子発現を調節するために使
用され得る。本発明に従って使用され得る他のプロモーターには、Ｌａｃ−調節
可能プロモーター、化学療法誘導性（例えば、ＭＤＲ）プロモーター、および熱
（高熱）誘導性プロモーター、放射線誘導性プロモーター（例えば、ＥＧＲ（Ｊ
ｏｋｉら、１９９５））、αインヒビン、ＲＮＡｐｏｌ ＩＩＩ ｔＲＮＡｍｅ
ｔ、および他のアミノ酸プロモーター、Ｕ１ ｓｎＲＮＡ（Ｂａｒｔｌｅｔｔら
、１９９６）、ＭＣ−１，ＰＧＫ、βアクチン、およびαグロビンが含まれる。
有用であり得る多くの他のプロモーターは、ＷａｌｔｈｅｒおよびＳｔｅｉｎ（
１９９６）に列挙される。Osteocalcin, hypoxia responsive element (HRE), MAGE-4, CE
Tumor-specific promoters such as A, alpha-fetoprotein, GRP78 / BiP, and tyrosinase can also be used to regulate gene expression in tumor cells. Other promoters that can be used in accordance with the present invention include Lac-regulatable promoters, chemotherapeutic inducible (eg, MDR) promoters, and heat (hyperthermic) inducible promoters, radiation inducible promoters (eg, EGR (J
oki et al., 1995)), α-inhibin, RNApol III tRNAme
and other amino acid promoters, U1 snRNA (Bartlett et al., 1996), MC-1, PGK, β-actin, and α-globin.
Many other promoters that may be useful are Walther and Stein (
1996).

【０２２４】 本発明に従って、所望の作用に依存して、任意の上記のプロモーター単独また
は別のものとの組み合わせが有用であり得ることが予想される。さらに、プロモ
ーターのこのリストは、徹底的なまたは限定的であるように解釈されるべきでは
なく、当業者は、プロモーターおよび本明細書に開示される方法と組み合わせて
使用され得ることを他のプロモーターを理解する。According to the present invention, it is expected that any of the above promoters alone or in combination with another, depending on the desired effect, may be useful. In addition, this list of promoters should not be construed as exhaustive or limiting, and those of skill in the art will recognize that other promoters may be used in combination with the promoters and methods disclosed herein. To understand the.

【０２２５】 （ｂ．エンハンサー） エンハンサーは、ＤＮＡの同じ分子の離れた位置に局在するプロモーターから
の転写を増加する遺伝子エレメントである。エンハンサーは、プロモーターのよ
うに構成される。すなわち、それらは、多くの個々のエレメントから構成され、
その各々は、１つ以上の転写タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモータ
ーとの間の基本的な区別は、作用にある。エンハンサー領域は、全体として、離
れたところから転写を刺激することができなければならない。これは、プロモー
ター領域またはその成分エレメントについて真実である必要はない。他方、プロ
モーターは、特定の位置でかつ特定の方向でＲＮＡ合成の開始を指向する１つ以
上のエレメントを有さなければならない。一方、エンハンサーは、これらの特異
性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば、重複するおよび連続
するものであり、しばしば、非常に類似するモジュラー構成を有するようである
。(B. Enhancer) An enhancer is a genetic element that increases transcription from a promoter located at a distant position on the same molecule of DNA. Enhancers are structured like promoters. That is, they are composed of many individual elements,
Each binds to one or more transcribed proteins. The basic distinction between enhancers and promoters lies in action. The enhancer region as a whole must be able to stimulate transcription from a distance. This need not be true for the promoter region or its component elements. On the other hand, a promoter must have one or more elements that direct the initiation of RNA synthesis at a particular location and in a particular orientation. Enhancers, on the other hand, lack these specificities. Promoters and enhancers are often overlapping and contiguous, and often have a very similar modular organization.

【０２２６】 本発明のいくつかの実施形態において、発現構築物は、ウイルスまたはウイル
スゲノム由来の操作された構築物を含む。レセプター媒介エンドサイトーシスを
介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてウイルスゲノムを
安定にかつ効率的に発現する特定のウイルスの能力は、それらを外来遺伝子の哺
乳動物細胞への移入のための魅力的な候補としてきた（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９
８８；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａ
ｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｔｅｍｉｎ，１９８６）。遺伝子ベクターと
して使用される第１のウイルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス４０、ウ
シパピローマウイルス、およびポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂ
ａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６）およびアデノウイルス（Ｒｉｄ
ｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）を含
むＤＮＡウイルスであった。これらは、外来ＤＮＡ配列に対する比較的低い能力
を有し、そして制限された宿主範囲を有する。さらに、受容可能な細胞における
それらの発癌性および細胞傷害性効果は、安全性に関する懸念を提示する。それ
らは、８ｋＢの外来遺伝子材料までのみを許容し得るが、しかし、種々の細胞株
および研究室動物中に容易に導入され得る（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓ
ｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６）。In some embodiments of the present invention, the expression construct comprises an engineered construct from a virus or viral genome. The ability of certain viruses to invade cells via receptor-mediated endocytosis, integrate into the host cell genome, and stably and efficiently express the viral genome makes them exogenous genes into mammalian cells. Has been an attractive candidate for migration (Ridgeway, 19
88; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwa.
1 and Sugden, 1986; Temin, 1986). The first virus used as a gene vector was Papova virus (Simian virus 40, bovine papilloma virus, and polyoma) (Ridgeway, 1988; B
aichwal and Sugden, 1986) and adenovirus (Rid
gway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986). These have a relatively low capacity for foreign DNA sequences and have a restricted host range. In addition, their carcinogenic and cytotoxic effects on acceptable cells raise safety concerns. They can tolerate only up to 8 kB of foreign genetic material, but can be easily introduced into a variety of cell lines and laboratory animals (Nicolas and Rubens).
tein, 1988; Temin, 1986).

【０２２７】 （ｃ．ポリアデニル化シグナル） ｃＤＮＡインサートが利用される場合、当業者は、代表的には、遺伝子転写物
の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含ませるこ
とを所望する。そのポリアデニル化シグナルの性質が本発明の首尾良い実施に決
定的であると考えられ、そしてヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０ポ
リアデニル化シグナルのような任意のそのような配列が、利用され得る。発現カ
セットのエレメントとしてもまた意図されるのは、ターミネーターである。これ
らのエレメントは、メッセージレベルを増強し、そしてカセットから他の配列へ
のリードスルーを最小化するように作用し得る。C. Polyadenylation Signals When a cDNA insert is utilized, one of skill in the art typically desires to include a polyadenylation signal to effect proper polyadenylation of the gene transcript. It is believed that the nature of the polyadenylation signal is critical to successful practice of the present invention, and any such sequence such as human or bovine growth hormone and the SV40 polyadenylation signal may be utilized. Also contemplated as elements of the expression cassette are terminators. These elements can act to enhance message levels and minimize read-through from the cassette to other sequences.

【０２２８】 ｄ．ＩＲＥＳ 本発明の特定の実施形態において、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレ
メントの使用により、多遺伝子またはポリシストロンメッセージが作製されるこ
とが意図される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボ
ソームスキャニングモデルをバイパスし、そして内部部位で翻訳を開始すること
ができる（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ピコル
ナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳心筋炎）から
のＩＲＥＳエレメント（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８
８）、ならびに哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳエレメント（Ｍａｃｅｊａｋ
およびＳａｒｎｏｗ、１９９１）が記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異
種オープンリーディングフレームに連結し得る。複数のオープンリーディングフ
レームは、一緒に転写され得、各オープンリーディングフレームは、ＩＲＥＳに
よって分離され、ポリシストロンメッセージを作製し得る。ＩＲＥＳエレメント
のために、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソー
ムに接触可能である。複数の遺伝子は、単一のプロモーター／エンハンサーを使
用して効率的に発現され、単一のメッセージを転写し得る。D. IRES In certain embodiments of the invention, it is contemplated that the use of an internal ribosome entry site (IRES) element will create a polygenic or polycistronic message. IRES elements can bypass the ribosome scanning model of 5 'methylated Cap-dependent translation and initiate translation at internal sites (Pelletier and Sonenberg, 1988). IRES elements (Pelletier and Sonenberg, 198) from two members of the picornavirus family (poliovirus and encephalomyocarditis)
8), as well as IRES elements from mammalian messages (Macejak
And Sarnow, 1991). IRES elements can be linked to heterologous open reading frames. Multiple open reading frames can be transcribed together, and each open reading frame can be separated by an IRES to create a polycistronic message. Because of the IRES element, each open reading frame is accessible to ribosomes for efficient translation. Multiple genes can be efficiently expressed using a single promoter / enhancer to transcribe a single message.

【０２２９】 任意の異種のオープンリーディングフレームは、ＩＲＥＳエレメントに連結さ
れ得る。これには、分泌されたタンパク質、独立の遺伝子によってコードされる
多サブユニットタンパク質、細胞内または膜結合タンパク質、および選択マーカ
ーの遺伝子が含まれる。このようにして、いくつかのタンパク質の発現は、単一
の構築物および単一の選択マーカーを用いて細胞中に同時に操作され得る。[0229] Any heterologous open reading frame can be linked to the IRES element. This includes secreted proteins, multisubunit proteins encoded by independent genes, intracellular or membrane-bound proteins, and genes for selectable markers. In this way, the expression of several proteins can be manipulated simultaneously in cells using a single construct and a single selectable marker.

【０２３０】 ５．インビトロタンパク質産生 本発明のいくつかの実施形態に従う発現構築物またはベクターの導入の後に、
一次哺乳動物細胞培養物は、種々の方法によって調製され得る。細胞がインビト
ロでおよび発現構築物に接触して生存したままでいられるようにするために、細
胞が、正確な比の酸素および二酸化炭素および栄養素との接触を維持するが、微
生物の汚染から保護されていることを確実にすることが必要である。細胞培養技
術は、充分に文献に載っており、そして本明細書に参考として援用される（Ｆｒ
ｅｓｈｎｅｒ，１９９２）。[0230] 5. In vitro protein production After introduction of an expression construct or vector according to some embodiments of the invention,
Primary mammalian cell cultures can be prepared by various methods. The cells maintain contact with the correct ratio of oxygen and carbon dioxide and nutrients, but are protected from microbial contamination, so that the cells can survive in vitro and in contact with the expression construct. It is necessary to ensure that Cell culture techniques are well documented and are incorporated herein by reference (Fr.
esner, 1992).

【０２３１】 上記の１つの実施形態は、タンパク質の産生および／または提示のための細胞
を不死化するために遺伝子移入の使用を包含する。目的のタンパク質の遺伝子は
、上記のように適切な宿主細胞へ移入され、その後適切な条件下で細胞の培養を
し得る。実質的に任意のポリペプチドの遺伝子が、この様式で利用され得る。組
換え産生されたベクター、その中に含められるエレメントの生成は、上記の通り
である。あるいは、産生されるべきタンパク質は、問題の細胞によって通常合成
される内因性のタンパク質であり得る。One embodiment described above involves the use of gene transfer to immortalize cells for protein production and / or presentation. The gene for the protein of interest can be transferred to an appropriate host cell as described above, and then the cells can be cultured under appropriate conditions. Virtually any polypeptide gene can be utilized in this manner. The production of the recombinantly produced vector, the elements contained therein, is as described above. Alternatively, the protein to be produced may be an endogenous protein normally synthesized by the cell in question.

【０２３２】 本発明の別の実施形態は、ＩｇＡタンパク質を発現する発現構築物またはベク
ターでトランスフェクトされた細胞株を使用する。哺乳動物宿主細胞株の例には
、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａ細胞、他のＢ細胞株およびＴ細胞株（例えば、ＣＥＭ
、７２１．２２１、Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉなど）、ならびにチャイニー
ズハムスター卵巣、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ
３、ＲＩＮ、およびＭＤＣＫ細胞の細胞株が含まれる。さらに、挿入された配列
の発現を調整する宿主細胞株または所望の様式で遺伝子産物を改変およびプロセ
スする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例えば
、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能の
ために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングお
よび修飾のための特徴的および特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主
系は、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にする
ために選択され得る。Another embodiment of the invention uses a cell line transfected with an expression construct or vector that expresses an IgA protein. Examples of mammalian host cell lines include Vero and HeLa cells, other B and T cell lines (eg, CEM
721.221, H9, Jurkat, Raji, etc.), and Chinese hamster ovary, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T.
3, RIN, and MDCK cell lines. In addition, a host cell strain that modulates the expression of the inserted sequences, or modifies and processes the gene product in the desired manner, may be selected. Such modifications (eg, glycosylation) and processing (eg, cleavage) of protein products may be important for the function of the protein. Different host cells have characteristic and specific mechanisms for the post-translational processing and modification of proteins. Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the correct modification and processing of the foreign protein expressed.

【０２３３】 それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞における、ＨＳＶ、
チミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるが、これら
に限定されない多数の選択系が使用され得る。また、抗代謝産物耐性は、以下に
ついて選択の基礎として使用され得る：ｄｈｆｒ（ に対する耐性を付与する）
；ｇｐｔ（マイコフェノール酸に対する耐性を付与する）；ｎｅｏ（アミノグリ
コシドＧ４１８に対する耐性を付与する）；およびｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシ
ンに対する耐性を付与する）。HSV, tk-, hgprt-, or aprt- cells, respectively.
Numerous selection systems can be used, including, but not limited to, thymidine kinase, hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase and adenine phosphoribosyltransferase genes. Also, antimetabolite resistance can be used as a basis for selection for: dhfr (conferring resistance to
Gpt (confers resistance to mycophenolic acid); neo (confers resistance to aminoglycoside G418); and hygro (confers resistance to hygromycin).

【０２３４】 動物細胞は、インビトロで２つの態様で増殖され得る：培養物のバルクを通し
ての懸濁液において増殖する非足場依存性細胞、または、それらの増殖のために
固相基質への結合を必要とする足場依存性細胞（すなわち、単層型の細胞増殖）
。Animal cells can be grown in vitro in two ways: non-anchorage-dependent cells growing in suspension through the bulk of the culture, or binding to solid substrates for their growth. Required anchorage-dependent cells (ie, monolayer cell growth)
.

【０２３５】 連続的に樹立された細胞株からの非足場依存性または懸濁液培養物は、細胞お
よび細胞産物の大規模産生の最も広範に使用される手段である。しかし、懸濁液
培養細胞は、腫瘍原性能、および接着細胞よりも低いタンパク質産生のような制
限を有する。Non-anchorage-dependent or suspension cultures from continuously established cell lines are the most widely used means of large-scale production of cells and cell products. However, suspension culture cells have limitations such as tumorigenic performance and lower protein production than adherent cells.

【０２３６】 ＩＩＩ．治療的処方および投与の経路 本発明は、粘膜上皮に選択的薬剤を送達するための標的化系を提供するｐＩｇ
Ｒ−結合ドメインを包含する組成物および方法を開示する。処方物の全身的投与
は、治療方法を提供するが、頻繁には、この送達方法は、治療的利益を付与し得
る位置に到達することができないか、または送達しても減少した効果しか得られ
ない。しかし、本発明は、いくつかの実施形態において全身的処方の簡便さを提
供する一方、特に粘膜上皮への処方物の送達を可能にする標的化方法を提供する
。III. The present invention provides pIg that provides a targeted system for delivering selective agents to mucosal epithelium
Disclosed are compositions and methods that include an R-binding domain. Systemic administration of the formulation provides a method of treatment, but frequently, this method of delivery is unable to reach a location that may provide a therapeutic benefit, or has a reduced effect upon delivery. I can't. However, the present invention, while providing the convenience of systemic formulation in some embodiments, provides a targeting method that allows delivery of the formulation, particularly to the mucosal epithelium.

【０２３７】 臨床的な適用が意図される場合、薬学的組成物として（すなわち、インビボ適
用のために適切な形態で）本発明の組成物を調製することが必要である。一般に
、これは、本質的に発熱物質ならびにヒトまたは動物に対して有害であり得るそ
の他の不純物を含まない組成物を調製することを包含する。Where clinical application is intended, it is necessary to prepare the compositions of the invention as pharmaceutical compositions (ie, in a form suitable for in vivo applications). Generally, this involves preparing a composition that is essentially free of pyrogens and other impurities that can be harmful to humans or animals.

【０２３８】 Ａ．処方物 当業者は、一般に、送達ベクターを安定にし、そして標的細胞の取り込みを可
能にするために適切な塩および緩衝液を利用することを所望する。緩衝液はまた
、組換え細胞が患者に導入される場合に、利用される。本発明の水性組成物は、
細胞に対して有効量のベクターを、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体
に溶解または分散されて、包含する。このような組成物はまた、接種材料と呼ば
れる。句「薬学的に受容可能または薬理学的に受容可能」は、動物またはヒトに
投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他のやっかいな反応を生成
しない分子部分および組成物をいう。本明細書において使用されるように、「薬
学的に受容可能なキャリア」には、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーテ
ィング、抗菌剤、および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などが含まれる。薬
学的に活性な物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周
知である。任意の従来の媒体または薬剤が本発明のベクターまたは細胞と不適合
性えある場合を除き、治療的組成物におけるその使用が意図される。補助的な有
効成分もまた、本組成物に組み込まれ得る。A. Formulations Those of skill in the art generally desire to utilize appropriate salts and buffers to render delivery vectors stable and allow for uptake of target cells. Buffers are also utilized when recombinant cells are introduced into a patient. The aqueous composition of the present invention comprises
An effective amount of the vector for the cell is included, dissolved or dispersed in a pharmaceutically acceptable carrier or aqueous medium. Such a composition is also called an inoculum. The phrase "pharmaceutically or pharmacologically acceptable" refers to molecular moieties and compositions that do not produce an adverse, allergic, or other untoward reaction when administered to an animal or human. . As used herein, "pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents and the like. Is included. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well-known in the art. Unless any conventional media or agent is incompatible with the vectors or cells of the present invention, their use in therapeutic compositions is contemplated. Supplementary active ingredients can also be incorporated into the compositions.

【０２３９】 本発明の活性な組成物は、古典的な薬学的調製物を含む。本発明に従うこれら
の組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能な限り、任意の一般的
な経路を介してである。これには、経口、経鼻、粘膜、頬側、直腸、膣、または
局所が含まれる。あるいは、投与は、同所性注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内
注射、腹腔内注射、または静脈内注射であり得る。このような組成物は、通常、
上記のように、薬学的に受容可能な組成物として投与される。The active compositions of the present invention include classic pharmaceutical preparations. Administration of these compositions according to the present invention is via any common route so long as the target tissue is available via that route. This includes oral, nasal, mucosal, buccal, rectal, vaginal, or topical. Alternatively, administration can be orthotopic, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, or intravenous. Such compositions are usually
As described above, it is administered as a pharmaceutically acceptable composition.

【０２４０】 活性な化合物は、非経口的に、または注射もしくは吸入によることを含む任意
の適切な経路を介して投与され得る。遊離塩基または薬学的に受容可能な塩とし
ての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と
適切に混合された水中にて調製され得る。分散はまた、グリセロール、脂質ポリ
エチレングリコール、およびそれらの混合物中で、および油中で、調製され得る
。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止す
るための保存剤を含有する。The active compounds can be administered parenterally or via any suitable route, including by injection or inhalation. Solutions of the active compounds as free base or pharmaceutically acceptable salts can be prepared in water suitably mixed with a surfactant such as hydroxypropylcellulose. Dispersions can also be prepared in glycerol, lipid polyethylene glycols, and mixtures thereof, and in oils. Under ordinary conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.

【０２４１】 注射可能な使用のための薬学的な形態には、滅菌水性溶液または分散液および
滅菌注射可能な溶液または分散液の即席調製のための滅菌粉末が含まれる。全て
の場合において、その形態は、滅菌でなければならず、そして簡単な注入可能性
を存在する程度まで流体でなければならない。製造および保存の条件下で安定で
なければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の作用の混入に対し
て保存されていなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリ
オール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレ
ングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒また
は懸濁液媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、被覆（例えば、レシチン）
の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界
面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌、
抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チ
メロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤、例えば
、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期の
吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよび
ゼラチンの、組成物における使用によってもたらされ得る。Pharmaceutical forms for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. In all cases, the form must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or suspension medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), suitable mixtures thereof, and vegetable oils. Suitable flow properties include, for example, coating (eg, lecithin)
, By the maintenance of the required particle size in the case of dispersions and by the use of surfactants. Prevention of the action of microorganisms, various antibacterial,
It can be provided by antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by the use in the composition of agents delaying absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.

【０２４２】 滅菌注射可能溶液は、上記に列挙した種々の他の成分を必要に応じて用いて適
切な溶媒中において必要とされる量で活性化合物を組み込み、続いて、濾過滅菌
することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌有効成分を、基本
的な分散媒体および上記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含有する
滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射可能な溶液の調製
のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、有効成分＋予め滅菌濾過され
たその溶液からの任意の更なる所望の成分の粉末を生じる減圧乾燥および凍結乾
燥技術である。Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the active compound in the required amount in the appropriate solvent with the various other ingredients enumerated above as necessary, followed by sterile filtration. Is done. Generally, dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile vehicle which contains the basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of sterile powders for the preparation of a sterile injectable solution, the preferred method of preparation is to use the vacuum drying and lyophilization technique to produce a powder of the active ingredient plus any further desired ingredients from the previously sterile filtered solution. It is.

【０２４３】 本明細書で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」には、任意の、
および全ての溶媒、分散液媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張お
よび吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体お
よび薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効
成分と不適合性である場合を除き、治療的組成物におけるその使用が意図される
。補助的な有効成分もまた、本組成物中に組み込まれ得る。As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” includes any,
And all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents and the like. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well-known in the art. Unless any conventional media or agent is incompatible with the active ingredient, its use in therapeutic compositions is contemplated. Supplementary active ingredients can also be incorporated into the present compositions.

【０２４４】 経口投与のために、本発明のポリペプチドおよび発現構築物は、賦形剤ととも
に組み込まれ得、そして摂取不可能なマウスウォッシュおよび歯磨剤の形態で使
用され得る。マウスウォッシュは、有効成分を必要とされる量、適切な溶媒（例
えば、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ溶液）中に取り込むことによって調
製され得る。あるいは、有効成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、および炭
酸水素カリウムを含有する消毒薬中に組み込まれ得る。有効成分はまた、歯磨剤
（ゲル、ペースト、粉末、およびスラリーを含む）中に分散され得る。有効成分
は、治療的有効量で、水、結合剤、研磨剤、香味剤、発泡剤、および湿潤剤を含
み得るペースト歯磨剤に添加され得る。For oral administration, the polypeptides and expression constructs of the present invention can be incorporated with excipients and used in the form of ingestible mouthwashes and dentifrices. A mouthwash may be prepared by incorporating the active ingredient in the required amount in an appropriate solvent, such as a sodium borate solution (Dobell's solution). Alternatively, the active ingredient may be sodium borate, glycerin, and carbonate The active ingredient can also be dispersed in dentifrices (including gels, pastes, powders, and slurries) containing an active ingredient in a therapeutically effective amount of water, It can be added to paste dentifrices which can include binders, abrasives, flavoring agents, foaming agents, and wetting agents.

【０２４５】 本発明の組成物は、中性または塩の形態で処方され得る。薬学的に受容可能な
塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基で形成される）が含まれ、これ
は、無機酸（例えば、塩化水素、リン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ
酸、酒石酸、マンデル（ｍａｎｄｅｌｉｃ）酸など）で形成される。遊離のカル
ボキシル基で形成される塩はまた、無機塩（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）およ
び有機塩（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロ
カインなど）から誘導され得る。The compositions of the present invention may be formulated in a neutral or salt form. Pharmaceutically acceptable salts include acid addition salts (formed at the free amino groups of the protein), which include inorganic acids (eg, hydrogen chloride, phosphoric acid) or organic acids (eg, acetic acid). Oxalic acid, tartaric acid, mandelic acid, etc.). Salts formed with free carboxyl groups also include inorganic salts (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calcium hydroxide, or ferric hydroxide) and organic salts (eg, isopropylamine, trimethylamine). , Histidine, procaine, etc.).

【０２４６】 処方の際に、溶液は、投薬処方と適合可能な様式で、かつ治療的に有効ならび
にである量で投与される。その処方物は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルな
どの種々の投薬形態で容易に投与される。例えば、水性溶液中での非経口投与の
ために、その溶液は、必要に応じて、適切に緩衝化されるべきであり、そしてそ
の液体希釈剤は、まず、充分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。こ
れらの特定の水性溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与のた
めに適切である。Upon formulation, solutions will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in such amount as is therapeutically effective. The formulations are easily administered in a variety of dosage forms, such as injectable solutions, drug release capsules, and the like. For example, for parenteral administration in an aqueous solution, the solution should be suitably buffered, if necessary, and the liquid diluent first diluted with sufficient saline or glucose. Isotonic. These particular aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration.

【０２４７】 組成物は、従来的に、例えば、非経口的に、注射により、皮下または筋肉内に
のいずれかで投与され得る。他の投与の態様について適切なさらなる処方には、
坐剤が含まれ、いくつかの場合には、経口処方物が含まれる。坐剤については、
伝統的な結合剤およびキャリア（例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリ
グリセリド）が含まれ得る。このような坐剤は、約０．５％〜約１０％の範囲、
好ましくは、約１〜約２％の範囲で有効成分を含有する混合物から形成され得る
。経口処方物には、通常利用される賦形剤、例えば、薬学的グレードのマンニト
ール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウ
ム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。これらの組成物は、溶液、
懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放処方物、または粉末の形態をとり、そして
約１０〜約９５％の有効成分、好ましくは、約２５％〜約７０％の有効成分を含
有する。The compositions can be conventionally administered, eg, parenterally, by injection, either subcutaneously or intramuscularly. Further formulations suitable for other modes of administration include:
Suppositories are included, and in some cases, oral formulations. For suppositories,
Traditional binders and carriers such as polyalkalen glycols or triglycerides may be included. Such suppositories may range from about 0.5% to about 10%;
Preferably, it may be formed from a mixture containing the active ingredient in the range of about 1 to about 2%. Oral formulations include such normally employed excipients as, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate, and the like. These compositions comprise a solution,
It takes the form of a suspension, tablet, pill, capsule, sustained release formulation, or powder and contains from about 10% to about 95%, preferably from about 25% to about 70%, of the active ingredient.

【０２４８】 １．リポソーム リポソームは、水性媒体中に分散されたリン脂質から形成され、そして同時に
多層の同心性の二重層粒子を形成する。リポソームは、細胞膜と多くの類似性を
有し、そして薬物送達剤として本発明と組み合わせた使用が意図される。[0248] 1. Liposomes Liposomes are formed from phospholipids dispersed in an aqueous medium and, at the same time, form multilayered, concentric bilayer particles. Liposomes have many similarities to cell membranes and are contemplated for use in conjunction with the present invention as drug delivery agents.

【０２４９】 リポソームの処方および使用は、一般に、当業者に公知である。例えば、いく
つかの米国特許は、生物学的に活性な材料をカプセル化するリポソームの調製お
よび使用に関する（例えば、米国特許第４，４８５，０５４号；米国特許第４，
，０８９，８０１号；同第４，２３４，８７１号；および同第４，０１６，１０
０号（各々は、本明細書中に参考として援用される））。概して、リポソーム調
製物の静脈内注射は、使用されるが、膣坐薬もまた可能であることが意図される
。The formulation and use of liposomes is generally known to those skilled in the art. For example, some US patents relate to the preparation and use of liposomes that encapsulate biologically active materials (eg, US Pat. No. 4,485,054; US Pat.
No. 4,234,871; and No. 4,016,10.
No. 0, each of which is incorporated herein by reference. In general, intravenous injections of the liposome preparation will be used, but it is contemplated that vaginal suppositories would also be possible.

【０２５０】 ２．経鼻投与 当業者はまた、本発明において、経鼻溶液またはスプレー、エアロゾル、また
は吸入剤を使用する。経鼻溶液は、適薬またはスプレーで鼻通路に投与されるよ
うに設計された通常水性溶液である。経鼻溶液は、それらが鼻の分泌液に多くの
点で類似し、そうして通常の毛様体の作用が維持されるように調製される。従っ
て、水性経鼻溶液は、通常、等張性であり、そしてｐＨ５．５〜６．５を維持す
るようにわずかに緩衝化されている。[0250] 2. Nasal Administration Those skilled in the art also use nasal solutions or sprays, aerosols, or inhalants in the present invention. Nasal solutions are usually aqueous solutions designed to be administered to the nasal passages by drug or spray. Nasal solutions are prepared so that they are similar in many ways to nasal secretions, so that normal ciliary body action is maintained. Thus, aqueous nasal solutions are usually isotonic and slightly buffered to maintain a pH of 5.5 to 6.5.

【０２５１】 さらに、抗菌保存剤（眼科の調製物において使用されるものと同様のもの）、
および適切な薬物安定化剤は、必要であれば、その処方物に含められ得る。種々
の市販の経鼻調製物が公知であり、そして例えば、抗生物質および抗ヒスタミン
剤が含まれ、そして喘息の予防に使用される。In addition, antimicrobial preservatives (similar to those used in ophthalmic preparations),
And suitable drug stabilizers, if necessary, can be included in the formulation. Various commercial nasal preparations are known and include, for example, antibiotics and antihistamines, and are used in the prevention of asthma.

【０２５２】 ３．経口投与 特定の実施形態において、活性化合物は、経口的に投与され得る。これは、有
用であると予想される。なぜなら、経口使用のために設計された錠剤に含有され
る多くの物質が、胃腸管に沿って粘膜上皮によって吸収されるからである。[0252] 3. Oral Administration In certain embodiments, the active compounds may be administered orally. This is expected to be useful. This is because many of the substances contained in tablets designed for oral use are absorbed by the mucosal epithelium along the gastrointestinal tract.

【０２５３】 また、所望であれば、ペプチド、抗体、およびその他の薬剤は、消化酵素によ
るタンパク質分解に対して抵抗性にされ、または部分的に抵抗性にされ得る。こ
のような化合物は、化学的に設計されたかまたは修飾された薬剤；右旋性のペプ
チド；およびペプチダーゼおよびリパーゼ分解を避けるために時間放出カプセル
中のペプチドおよびリポソーム処方物を含むことが意図される。Also, if desired, peptides, antibodies, and other agents can be rendered resistant or partially resistant to proteolysis by digestive enzymes. Such compounds are intended to include chemically designed or modified drugs; dextrorotatory peptides; and peptide and liposome formulations in time release capsules to avoid peptidase and lipase degradation. .

【０２５４】 経口投与のために、活性化合物は、例えば、不活性の希釈剤または吸収しうる
食用に適するキャリアとともに投与され得るか、またはそれらは堅い殻または柔
らかい殻のゼラチンカプセル中に包まれ得るか、または錠剤中に圧縮されるか、
直接食餌の食物とともに組み込まれ得る。経口治療的投与のために、活性化合物
は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして消化可能な錠剤、バッカル錠、トロー
チ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハなどの形態で使用され得
る。For oral administration, the active compounds can be administered with, for example, inert diluents or absorbable edible carriers, or they can be enclosed in hard or soft shell gelatin capsules. Or compressed into tablets,
It can be incorporated with direct dietary food. For oral therapeutic administration, the active compound can be incorporated with excipients and used in the form of digestible tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like.

【０２５５】 経口組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有するべき
である。その組成物および調製物のパーセンテージは、当然に、変化し得、そし
て簡便に、一単位の重量の約２〜約６０％の間であり得る。そのような治療的に
有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投薬量が得られるようなものである
。Oral compositions and preparations should contain at least 0.1% of active compound. The percentage of the compositions and preparations may, of course, be varied and may conveniently be between about 2 to about 60% of the weight of one unit. The amount of active compound in such therapeutically useful compositions is such that a suitable dosage will be obtained.

【０２５６】 錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどはまた、以下を含有し得る：トラガカン
トガム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤；リン酸二
カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸など
のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；スクロース、ラク
トース、またはサッカリンのような甘味料が添加され得、または、ペパーミント
、冬緑油、もしくはサクランボ香料のような香味剤が添加され得る。投薬量単位
形態がカプセルである場合、それは上記のタイプの材料に加えて、液体キャリア
を含有し得る。Tablets, troches, pills, capsules and the like may also contain: binders such as tragacanth gum, acacia, corn starch or gelatin; excipients such as dicalcium phosphate; corn starch, potato starch, Disintegrants such as alginic acid; lubricants such as magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, or saccharin may be added, or flavoring agents such as peppermint, wintergreen oil, or cherry flavor may be added. It can be added. When the dosage unit form is a capsule, it may contain, in addition to materials of the above type, a liquid carrier.

【０２５７】 種々の材料は、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければ、そ
の投薬量単位の物理的な形態を改変し得る。例えば、錠剤、ピル、またはカプセ
ルは、セラック、糖、またはその両方で被覆され得る。エリキシルのシロップは
、活性化合物スクロースを甘味剤として、メチルおよびプロピルパラベンを保存
剤として、着色料および香味料（例えば、サクランボもしくはオレンジ香料）を
含有し得る。当然に、任意の投薬量単位形態を調製するのに使用される全ての材
料は、薬学的に純粋であり、そして利用される量において実質的に非毒性である
べきである。さらに、活性化合物は、徐放調製物および処方物中に組み込まれ得
る。A variety of materials can be present as coatings, or otherwise modify the physical form of the dosage unit. For example, a tablet, pill, or capsule may be coated with shellac, sugar, or both. A syrup of elixir may contain the active compound sucrose as a sweetening agent, methyl and propylparabens as preservatives, a dye and flavoring such as cherry or orange flavor. Of course, all materials used in preparing any dosage unit form should be pharmaceutically pure and substantially non-toxic in the amounts employed. In addition, the active compounds may be incorporated into sustained-release preparations and formulations.

【０２５８】 処方において、その化合物は、投薬量形態と適合性の様式で投与され、そして
このような量において、治療的に有効である。その処方物は、本明細書に記載さ
れる種々の投薬量形態で、簡単に投与される。In formulations, the compounds will be administered in a manner compatible with the dosage form, and in such amount, will be therapeutically effective. The formulation is conveniently administered in the various dosage forms described herein.

【０２５９】 ４．膣坐薬 投与のためのその他の態様のために適切であるさらなる処方物は、膣坐剤およ
び膣坐薬である。直腸膣坐薬または坐剤もまた使用され得る。[0259] 4. Vaginal suppositories Further formulations which are suitable for other embodiments for administration are vaginal suppositories and vaginal suppositories. Rectal vaginal suppositories or suppositories may also be used.

【０２６０】 坐剤は、種々の重量および形状の固体投薬形態であり、通常、直腸、膣、また
は尿道への挿入のために投薬される。挿入後、坐剤は、しばしば、腔流体中で溶
融または溶解する。Suppositories are solid dosage forms of various weights and shapes, usually administered for rectal, vaginal or urethral insertion. After insertion, suppositories often melt or dissolve in the cavity fluid.

【０２６１】 一般に、坐剤のために、伝統的な結合剤およびキャリアは、例えば、ポリアル
キレングリコールまたはトリグリセリドを含み得る。このような坐剤は、０．５
％〜１０％、好ましくは、１％〜２％の範囲で有効成分を含有する混合物から形
成され得る。Generally, for suppositories, traditional binders and carriers may include, for example, polyalkylene glycols or triglycerides. Such suppositories are 0.5
%, Preferably from 1% to 2%.

【０２６２】 膣座剤または坐薬は、通常、球状または卵形であり、そしてそれぞれ約５ｇの
重量である。膣医薬は、坐剤の古典的な概念から逸脱する種々の物理的形態（例
えば、クリーム、ゲル、または液体）で利用可能である。しかし、膣錠剤は、そ
の定義に適合し、そして投与および製造の両方における簡便さを提示する。Vaginal suppositories or suppositories are usually globular or oval, and each weigh about 5 g. Vaginal medications are available in various physical forms (eg, creams, gels, or liquids) that depart from the classical concept of suppositories. However, vaginal tablets meet the definition and offer convenience in both administration and manufacture.

【０２６３】 Ｂ．ワクチン 本発明は、能動または受動免疫の実施形態における使用のためのワクチンを意
図する。ワクチンとしての使用のために適切であると仮定される免疫原性組成物
は、本明細書に開示される様式で調製される免疫原性カルシウム結合ペプチドか
ら、直接、最も容易に調製され得る。好ましくは、抗原性材料は、所望でない小
さな分子量の分子を除去するために、広範に、透析され、および／またはより容
易な処方物のために所望のビヒクル中に凍結乾燥される。B. Vaccines The present invention contemplates vaccines for use in active or passive immunization embodiments. Immunogenic compositions that are postulated to be suitable for use as vaccines can be most readily prepared directly from immunogenic calcium binding peptides prepared in the manner disclosed herein. Preferably, the antigenic material is extensively dialyzed to remove unwanted low molecular weight molecules and / or lyophilized into the desired vehicle for easier formulation.

【０２６４】 ＩｇＲ結合ドメイン配列を有効成分として含有するワクチンの調製物は、一般
に、米国特許第４，６０８，２５１号；同第４，６０１，９０３号；同第４，５
９９，２３１号；および同第４，５９９，２３０号（全て本明細書中で参考とし
て援用される）によって例示されるように、当該分野でよく理解される。代表的
には、このようなワクチンは、注射可能に調製される。流体溶液または懸濁液の
いずれかとして、注入前の流体中の溶液または懸濁液用に適切な固体形態もまた
、調製され得る。その調製物もまた、エマルジョン化さ得る。活性な免疫学的成
分は、しばしば、薬学的に受容可能かつ有効成分と適合可能な賦形剤と混合され
る。適切な賦形剤は、しばしば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロー
ル、エタノールなどおよびその組み合わせである。さらに、所望であれば、ワク
チンは、微少量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または
ワクチンの有効性を増強するアジュバント）を含有し得る。さらに、イスコム（
ｉｓｃｏｍ）、超分子球状構造が、非経口および粘膜ワクチン化のために使用さ
れ得る（Ｍｏｒｅｉｎら、１９９８）。Preparations of vaccines containing an IgR binding domain sequence as an active ingredient are generally described in US Pat. Nos. 4,608,251; 4,601,903;
99,231; and 4,599,230, all of which are incorporated herein by reference. Typically, such vaccines are prepared for injection. Solid forms, suitable as solutions or suspensions in fluids prior to injection, either as fluid solutions or suspensions, can also be prepared. The preparation may also be emulsified. The active immunological component is often mixed with excipients that are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient. Suitable excipients are often water, saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, and combinations thereof. In addition, if desired, the vaccine may contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents, or adjuvants which enhance the effectiveness of the vaccine. In addition, Iscom (
iscom), a supramolecular globular structure can be used for parenteral and mucosal vaccination (Morein et al., 1998).

【０２６５】 ワクチンは、従来的に、注射により、例えば、皮下または筋肉内のいずれかで
、非経口投与され得る。投与のその他の態様に適切であるさらなる処方物は、坐
剤が含まれ、場合によっては、経口処方物が含まれる。坐剤については、伝統的
な結合剤およびキャリアが、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリ
セリドが含まれ得；そのような坐剤は、約０．５％〜約１０％、好ましくは、約
１％〜約２％の範囲で有効成分を含有する混合物から形成され得る。経口処方物
には、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステア
リン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムな
どのような通常利用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液
、錠剤、ピル、カプセル、徐放処方物、粉末の形態をとり、そして約１０〜約９
５％の有効成分、好ましくは、約２５〜約７０％の有効成分を含有する。The vaccine may be conventionally administered parenterally, by injection, for example, either subcutaneously or intramuscularly. Additional formulations that are suitable for other aspects of administration include suppositories, and in some cases, oral formulations. For suppositories, traditional binders and carriers may include, for example, polyalkalene glycols or triglycerides; such suppositories may contain from about 0.5% to about 10%, preferably about 1%. It can be formed from a mixture containing the active ingredient in the range of up to about 2%. Oral formulations include such normally employed excipients as, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate, and the like. These compositions take the form of solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release formulations, powders, and from about 10 to about 9
It contains 5% of active ingredient, preferably about 25 to about 70%.

【０２６６】 本発明のカルシウム結合タンパク質由来のペプチドは、中性または塩の形態と
してワクチン中に処方され得る。薬学的に受容可能な塩には、酸添加塩（ペプチ
ドの遊離のアミノ基で形成される）および無機酸（例えば、塩化水素もしくはリ
ン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル（ｍａｎｄｅ
ｉｃ）酸など）で形成されたものが含まれる。遊離のカルボキシル基で形成され
た塩はまた、無機塩（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アン
モニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）および有機塩（イソプロピ
ルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロ
カインなど）から誘導され得る。The peptides derived from the calcium binding proteins of the present invention can be formulated into vaccines as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include acid addition salts (formed at the free amino groups of the peptide) and inorganic acids (eg, hydrogen chloride or phosphoric acid) or organic acids (eg, acetic, oxalic, tartaric, Mandel
ic) acids). Salts formed with free carboxyl groups also include inorganic salts (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calcium hydroxide, or ferric hydroxide) and organic salts (isopropylamine, trimethylamine, -Ethylaminoethanol, histidine, procaine, etc.).

【０２６７】 ワクチンは、投薬量処方物と適合性の様式で、かつ、治療的に有効かつ免疫原
性である量で投与される。投与される量は、処置されるべき被験体（例えば、抗
体を合成する個体の免疫系の能力、および所望される保護の程度）に依存する。
投与に必要とされる有効成分の正確な量は、主治医の判断に依存する。しかし、
適切な投薬量の範囲は、ワクチンあたり数百マイクログラムの有効成分のオーダ
ーである。初期投与およびブースターショットのための適切なレジメンはまた、
可変であるが、代表的には、初期投与、その後の引き続くその他の投与の接種で
ある。The vaccine will be administered in a manner compatible with the dosage formulation, and in such amount as is therapeutically effective and immunogenic. The amount to be administered depends on the subject to be treated (eg, the ability of the individual's immune system to synthesize antibodies, and the degree of protection desired).
Precise amounts of active ingredient required for administration depend on the judgment of the attending physician. But,
Suitable dosage ranges are on the order of hundreds of micrograms of active ingredient per vaccine. Suitable regimens for initial administration and booster shots are also
Variable but typically an inoculation of the initial dose followed by other doses.

【０２６８】 適用の様式は、広範に変化され得る。ワクチンの投与のための従来の任意の方
法が適用可能である。これらには、固体の生理学的に受容可能な塩での経口適用
、または生理学的に受容可能な分散剤、非経口的に、注射によりなどが含まれる
と考えられる。ワクチンの投薬量は、投与の経路に依存し、そして宿主のサイズ
に従って変化する。The mode of application can vary widely. Any conventional method for administration of a vaccine is applicable. These would include oral application with a solid physiologically acceptable salt, or physiologically acceptable dispersants, parenterally, by injection, and the like. The dosage of the vaccine will depend on the route of administration, and will vary according to the size of the host.

【０２６９】 ワクチンのためのアジュバントの効果を達成する種々の方法は、水酸化アルミ
ニウムまたはリン酸（ミョウバン）のような薬剤の使用が含まれ、一般的に、リ
ン酸緩衝化生理食塩水、約０．２５％の溶液として使用される糖の合成ポリマー
（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））との混合物液中の約０．０５〜約０．１％の
溶液、３０秒から２分間で約７０℃〜約１０１℃の範囲の温度での熱処理による
ワクチン中のタンパク質の凝集物として、それぞれ、使用される。アルブミンに
対するペプシン処理（Ｆａｂ）抗体での再活性化による凝集、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ
のような細菌細胞または内毒素またはグラム陽性細菌のリポポリサッカライド成
分、生理学的に受容可能な油ビヒクルエマルジョン（例えば、マンニド（ｍａｎ
ｎｉｄｅ）モノオレイン酸塩（Ａｒａｃｅｌ Ａ）もしくはブロック置換体とし
て使用されるペルフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ^(R)）の２０％溶液
とのエマルジョン）との混合物もまた、利用され得る。Various methods of achieving the effects of adjuvants for vaccines include the use of agents such as aluminum hydroxide or phosphate (alum), and generally include phosphate buffered saline, about A solution of about 0.05 to about 0.1% in a mixture of a sugar and a synthetic polymer (Carbopol®) used as a 0.25% solution, from about 70 ° C. for 30 seconds to 2 minutes. Each is used as an aggregate of proteins in the vaccine by heat treatment at a temperature in the range of about 101 ° C. Aggregation by reactivation with pepsin-treated (Fab) antibody to albumin, C.I. parvum
Lipopolysaccharide components of bacterial cells or endotoxins such as gram-positive bacteria, physiologically acceptable oil vehicle emulsions (eg, mannides (man
Mixtures with nide) monooleate (Aracel A) or perfluorocarbons used as block substitutes ⁽ emulsions with a 20% solution of Fluosol-DA®) may also be utilized.

【０２７０】 多くの場合、ワクチンの多数の投与（通常６回のワクチン接種を超えない、よ
り通常には、４回のワクチン接種を超えない、そして好ましくは、一回以上の、
通常少なくとも約３回のワクチン接種）を有することが所望される。ワクチン接
種は、通常は、２〜１２週間の間隔で、より通常には、３〜５週間の間隔である
。１〜５年の、通常、３年の間隔での定期的なブースターは、抗体の防御レベル
を維持するために所望される。免疫化の経過は、上清抗原についての抗体のアッ
セイによって追跡され得る。そのアッセイは、従来の標識（例えば、放射性核種
、酵素、蛍光色素、など）での標識によって行われ得る。これらの技術は、周知
であり、そして広範な種々の特許（例えば、これらの型のアッセイの例示として
、米国特許第３，７９１，９３２号；同第４，１７４，３８４号および同第３，
９４９，０６４号）に見出され得る。In many cases, multiple administrations of the vaccine (usually not more than six vaccinations, more usually not more than four vaccinations, and preferably one or more,
It is usually desirable to have at least about 3 vaccinations). Vaccinations are usually at intervals of 2 to 12 weeks, more usually at intervals of 3 to 5 weeks. Regular boosters at intervals of 1-5 years, usually 3 years, are desirable to maintain protective levels of the antibody. The course of immunization can be followed by assaying the antibodies for supernatant antigen. The assay can be performed by labeling with a conventional label (eg, a radionuclide, an enzyme, a fluorescent dye, etc.). These techniques are well known and are disclosed in a wide variety of patents (eg, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 4,174,384 and 3,397 for illustrations of these types of assays).
949,064).

【０２７１】 「単位用量」は、適切なキャリア中に分散された治療用組成物の明確な量とし
て規定される。例えば、本発明の方法に従って、ウイルス用量は、特定の数のウ
イルス粒子またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む。アデノウイルスを含む実
施形態において、特定の単位用量は、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷、１
０⁸、１０⁹、１０¹⁰、１０¹¹、１０¹²、１０¹³、または１０¹⁴ｐｆｕを含む。粒
子用量は、感染欠損粒子の存在に起因して、いくらか高い（１０〜１００倍）こ
とがある。A “unit dose” is defined as a defined amount of a therapeutic composition dispersed in a suitable carrier. For example, according to the method of the invention, the viral dose comprises a certain number of viral particles or plaque forming units (pfu). In embodiments comprising an adenovirus, a particular unit dose is 10 ³ , 10 ⁴ , 10 ⁵ , 10 ⁶ , 10 ⁷ , 1
0 ⁸ , 10 ⁹ , 10 ¹⁰ , 10 ¹¹ , 10 ¹² , 10 ¹³ , or 10 ¹⁴ pfu. Particle doses can be somewhat higher (10-100 fold) due to the presence of infectious deficient particles.

【０２７２】 この関係において、利用され得る滅菌水性媒体は、本明細書の開示に照らして
当業者に理解される。例えば、単位用量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶
解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加するか、または注入の予定
された部位注入した（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７
０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくつかの変動は、処置される
被験体の状体に依存して必ず生じる。いずれにせよ、投与に責任のある人が、個
々の被験体について適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与のために、生
物学的標準のＦＤＡオフィスによって要求される調製物は、滅菌性、発熱性（ｐ
ｙｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）、一般的な安全性、および純度標準に適合するべきで
ある。In this connection, sterile aqueous media that can be employed will be known to those of skill in the art in light of the present disclosure. For example, a unit dose can be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and added to 1000 ml of subcutaneous infusion fluid, or injected at the intended site of infusion (eg, “Remington's Pharmaceutical”).
physical Sciences, "15th edition, pages 1035 to 1038 and 157.
0-1580). Some variation in dosage will necessarily occur depending on the condition of the subject being treated. In any case, the person responsible for administration will determine the appropriate dose for the individual subject. In addition, for human administration, the preparations required by the FDA Office of Biological Standards are sterile, pyrogenic (p
(genericity), general safety, and purity standards.

【０２７３】 好ましい実施形態において、本発明は、ヒトの悪性疾患の処置に関する。投与
の種々の異なる経路が意図される。例えば、古典的なおよび代表的な治療は、明
確な腫瘍塊の直接的、腫瘍内注入を包含する。注入は、単一または複数であり得
；ここで、複数の注入は、腫瘍の接触可能な表面にわたって約１ｃｍの間隔をあ
けて作製される。あるいは、腫瘍の血管系の直接的または局所的または限局的動
脈内注入による標的化が意図される。リンパ系（限局的リンパ節を含む）は、こ
の経路に沿った転移のための可能性を仮定すれば、別の同様の標的を提示する。
さらに、全身的注入が、二次（転移）腫瘍を特異的に標的化する場合、好ましい
。In a preferred embodiment, the present invention relates to the treatment of human malignancies. A variety of different routes of administration are contemplated. For example, classic and typical treatments involve direct, intratumoral injection of a well-defined tumor mass. The injections can be single or multiple; wherein multiple injections are made approximately 1 cm apart over the accessible surface of the tumor. Alternatively, targeting by direct or local or localized intra-arterial infusion of the tumor vasculature is contemplated. The lymphatic system (including localized lymph nodes) presents another similar target, given the potential for metastasis along this pathway.
In addition, systemic injection is preferred if it specifically targets secondary (metastatic) tumors.

【０２７４】 別の実施形態において、ウイルス遺伝子治療は、腫瘍の切除の前または後であ
り得る。前の場合、その遺伝子治療は、実際、以前に可能ではなかった腫瘍の切
除を可能にし得る。あるいは、特に有利な実施形態は、腫瘍の前もっての切除（
以前のウイルス遺伝子治療なしまたはありで）、続いて、切除された腫瘍ベッド
の処置を包含する。この引き続く処置は、微視的な残余の疾患（これらは処置さ
れないまま残った場合、腫瘍の再増殖をもたらし得る）を排除することにおいて
有効である。これは、ごく簡単に、腫瘍ベッドを、ウイルスベクターの単位用量
を含有するウイルス調製物に浸すことによって達成され得る。引き続く処置を達
成するための別の好ましい方法は、切除した腫瘍ベッドのカテーテル法を介して
であり、それにより、長期の手術後の期間にわたって、そのベッドのウイルスで
の連続的な灌流を可能にする。In another embodiment, viral gene therapy can be before or after tumor resection. In the former case, the gene therapy could in fact allow for the resection of tumors not previously possible. Alternatively, a particularly advantageous embodiment is a prior excision of the tumor (
(With or without previous viral gene therapy), followed by treatment of the resected tumor bed. This subsequent treatment is effective in eliminating microscopic residual disease, which, if left untreated, can lead to tumor regrowth. This can be achieved very simply by immersing the tumor bed in a virus preparation containing a unit dose of the viral vector. Another preferred way to achieve subsequent treatment is via catheterization of the resected tumor bed, thereby allowing continuous perfusion of the bed with the virus over a long post-operative period. I do.

【０２７５】 Ｃ．キット ｐＩｇＲ結合ドメインを使用して薬剤を粘膜上皮に送達するために要求される
全ての必須の材料および試薬は、キット中に一緒に組み込まれ得る。これは、一
般に、選択された発現構築物を包含する。発現構築物の複製のための種々の培地
およびこのような複製のための宿主細胞もまた包含され得る。このようなキット
は、各個々の試薬のための区分された容器を包含する。C. Kit All essential materials and reagents required to deliver a drug to mucosal epithelium using the pIgR binding domain can be incorporated together into a kit. This will generally include the selected expression construct. Various media for the replication of the expression constructs and host cells for such replication may also be included. Such a kit includes compartmentalized containers for each individual reagent.

【０２７６】 そのキットの構成要素を１つ以上の液体溶液中に分配する場合、その液体溶液
は、好ましくは、水性溶液であり、滅菌水性溶液は、特に好ましい。インビボ用
途のために、発現構築物は、薬学的に受容可能な注射可能な組成物に処方され得
る。この場合、その容器手段自体は、吸入器（ｉｎｈａｌｅｎｔ）、シリンジ、
ピペット、点眼用容器、またはこのような他の器具であり得、これらから、処方
物は、身体（例えば、肺）の感染した部分に適用され得、動物に注入されるか、
またはそのキットの他の構成要素に適用され、そしてそれらと混合される。When distributing the components of the kit into one or more liquid solutions, the liquid solution is preferably an aqueous solution, with a sterile aqueous solution being particularly preferred. For in vivo applications, the expression construct may be formulated into a pharmaceutically acceptable injectable composition. In this case, the container means itself comprises an inhaler, a syringe,
A pipette, eye dropper, or other such device, from which the formulation may be applied to an infected portion of the body (eg, lungs) and injected into an animal,
Or applied to other components of the kit and mixed with them.

【０２７７】 そのキットの構成要素はまた、乾燥したかまたは凍結乾燥した形態で提供され
うる。試薬または構成要素が乾燥した形態で提供される場合、再構成は、一般的
に、適切な溶媒の添加によるものである。その溶媒はまた、別の容器手段におい
て提供されうる。The components of the kit may also be provided in dried or lyophilized form. When the reagents or components are provided in a dried form, reconstitution generally is by the addition of a suitable solvent. The solvent may also be provided in another container means.

【０２７８】 本発明のキットはまた、代表的には、所望のバイアルがその中に保持される、
例えば、注射または胴型プラスチック容器のような市販のために密接に詰め込ま
れてバイアルを含む容器のための手段を包含する。The kits of the invention also typically have a desired vial retained therein.
Includes means for containers containing closely packed vials for commercial sale, such as, for example, injection or barrel-shaped plastic containers.

【０２７９】 容器の数またはタイプに関わりなく、本発明のキットはまた、究極な複雑な組
成物を動物の体内に注入／投与するか、または配置することを補助するための装
置を包含し得るか、またはパッケージ化され得る。このような装置は、吸入剤、
シリンジ、ピペット、ピンセット、計測スプーン、点眼用容器、または任意のこ
のような医学的に認証されている送達ビヒクルであり得る。[0279] Regardless of the number or type of containers, the kits of the invention may also include a device to assist in injecting / administering or placing the ultimate complex composition into an animal. Or can be packaged. Such devices include inhalants,
It can be a syringe, pipette, tweezers, measuring spoon, eye dropper, or any such medically approved delivery vehicle.

【０２８０】 以下の例は、本発明の好ましい実施形態を実施するために含められる。以下の
実施例に開示される技術は、本発明者らの実施において充分に機能するように本
発明者によって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい態様
を構成すると考えられ得ることは、当業者には理解されるべきである。しかし、
当業者は、本開示に鑑みて、多くの改変が、開示される特定の実施形態において
なされ得、そしてなお同様のまたは類似の結果を本発明者らの精神および範囲か
ら逸脱することなく得るることを理解するべきである。The following examples are included to practice preferred embodiments of the present invention. The techniques disclosed in the following examples represent techniques that have been discovered by the inventor to work satisfactorily in our practice, and may therefore be considered to constitute a preferred embodiment for its implementation. It should be understood by those skilled in the art. But,
Those skilled in the art, in light of the present disclosure, will be able to make many modifications in the specific embodiments disclosed and still obtain similar or similar results without departing from the spirit and scope of the inventors. You should understand that.

【０２８１】 （実施例１：材料および方法） Ａ．バキュロウイルス発現 アルソネート（ａｒｓｏｎａｔｅ）ハプテン特異的キメラＩｇＡ１およびＩｇ
Ａ１／ＩｇＧ１ドメインスワップ変異体は、（Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ
ら、１９９４；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９２）に記載されたように発現された
。二量体ＩｇＡを、Ｊ鎖を有するＩｇＡの同時発現によって生成した。アフィニ
ティー精製を、アルソネートセファロース上で行った。抗体を、２００ｍＭのア
ルサニン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２００ｍＭ ｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）で溶出し、これをＰＢＳに対する徹底的な透析によって除去
した。単量体のおよび二量体のＩｇＡが、４％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
確認された。ヘキサヒスチジンタグ化ヒトｐＩｇＲ細胞外ドメインを、類似の様
式で発現し、そしてＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒ
ｔｈ，ＣＡ）カラム上で精製した（Ｒｉｎｄｉｓｂａｃｈｅｒら、１９９５）。Example 1 Materials and Methods Baculovirus expression arsonate hapten-specific chimeric IgA1 and Ig
The A1 / IgG1 domain swap mutant was identified as (Carayanopoulos
Et al., 1994; O'Reilly et al., 1992). Dimeric IgA was generated by co-expression of IgA with J chain. Affinity purification was performed on Arsonate Sepharose. Antibodies were purified from 200 mM arsenic acid (Sigma, St. Louis, MO), 200 mM ris-H.
Eluted with Cl (pH 8.0), which was removed by exhaustive dialysis against PBS. Monomeric and dimeric IgA were confirmed by 4% non-reducing SDS-PAGE. Hexahistidine-tagged human pIgR extracellular domain is expressed in a similar manner, and Ni-NTA agarose (Qiagen, Chatsworth
th, CA) column (Rindisbacher et al., 1995).

【０２８２】 Ｂ．バキュロウイルス発現のための変異体ＩｇＡ抗体の構築 Ｃα３ループ変異体Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を、ＰＣＲ ＳＯＥをおこなうこ
とによって、以下のセンス（Ｓ）およびアンチセンス（ＡＳ）プライマーの相補
的対を使用して構築した（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅ
ｎｓｉｏｎ，Ｈｏｒｔｏｎら、１９９０）。B. Construction of Mutant IgA Antibodies for Baculovirus Expression The Cα3 loop mutants L1, L2, and L3 were subjected to PCR SOE to use the following complementary pairs of sense (S) and antisense (AS) primers (Splicing by Overlap Exte
nsion, Horton et al., 1990).

【０２８３】[0283]

【化１】 このキメラＩｇＡ重鎖のＶＨ領域の５’リーダーに特異的な外側のプライマー
Ｂ１−２（５’−ＣＣＴＡＴＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＴＣ−
３’）、およびＩｇＡ１遺伝子の３’テール部分にコードされる配列に特異的な
Ｃα３−３’（５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＡＧＣＡＧＧＴＧＣＣＧＴ
ＣＣＡＣ−３’）を、上記のプライマー対Ｌ１−Ｌ３とともに使用して、相補的
なオーバーラップを有する５’および３’フラグメントの対を生成した。これら
のフラグメントを、ゲル精製し、次いで、さらに外側プライマーＢ１−２および
Ｃα３−３’を使用してＰＣＲ反応においてスプライスした。改変されたＩｇＡ
１遺伝子をバキュロウイルス移入ベクター中に、ＸｂａＩおよびＮｃｏＩ消化を
使用してクローニングし、挿入配列を評価した。組換えバキュロウイルスを、Ｂ
ａｃＰＡＫシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用し
て産生した。Embedded image An outer primer B1-2 (5'-CCTATAACCATGGGATGGAGCTTCATC-) which is specific to the 5 'leader of the VH region of this chimeric IgA heavy chain
3 '), and a Cα3-3'(5'-CCCTCTAGATTAGTAGCAGGTGCCGT specific to the sequence encoded by the 3 'tail of the IgA1 gene
CCAC-3 ′) was used with the primer pairs L1-L3 described above to generate pairs of 5 ′ and 3 ′ fragments with complementary overlap. These fragments were gel purified and then spliced in a PCR reaction using further outer primers B1-2 and Ca3-3 '. Modified IgA
One gene was cloned into a baculovirus transfer vector using XbaI and NcoI digestion and the insert sequence was evaluated. Recombinant baculovirus, B
Produced using the acPAK system (Clontech, Palo Alto, CA).

【０２８４】 Ｃ．ＦＡＣＳ分析 ＭＤＣＫ細胞を、実験の１６時間前に無血清ＭＥＭ＋Ｅａｒｌｅ塩（Ｍｅｄｉ
ａＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中に置いた。細胞を、ＰＢＳ中
の１０ｍＭ ＥＤＴＡ中に回収し、そしてＰＢＳ０．１％ＢＳＡにおいて洗浄し
た。ヒトＩｇＡ１抗体および変異体のｐＩｇＲ結合を、適切に１０⁶細胞との１
時間の、ＰＢＳ／ＢＳＡ中の１００μｌの抗体のインキュベーションによって評
価した。細胞を３回ＰＢＳ／ＢＳＡ中で洗浄し、そして結合した抗体を１００μ
ｌの抗ヒトｋａｐｐａＦＩＴＣ結合体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
で検出し、１／１００に希釈した。細胞を、上記のように洗浄し、そして１ｍｌ
のＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁した。ＦＡＣＳ分析をＢａｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ ＦＡＣＳＣＡＮ装置上で行った。データ収集および分析を、ＬＹＳＹＳ
ＩＩ装置（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およ
びＷｉＭＩＤＩ（ｈｔｔｐ／／ｆａｃｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ）またはＣＥ
ＬＬＱＵＥＳＴプログラム（Ｂａｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏ
ｓｅ，ＣＡ）を使用して行った。C. FACS analysis MDCK cells were subjected to serum-free MEM + Earle salt (Medi
aTech, Inc. , Herndon, VA). Cells were harvested in 10 mM EDTA in PBS and washed in PBS 0.1% BSA. PIgR binding of the human IgA1 antibody and the mutant was appropriately determined with 1 ⁶ cells.
The time was assessed by incubation of 100 μl of antibody in PBS / BSA. The cells are washed three times in PBS / BSA and the bound antibody is
l anti-human kappa FITC conjugate (Sigma, St. Louis, MO)
And diluted 1/100. The cells are washed as above and 1 ml
Was resuspended in PBS / BSA. FACS analysis by Bacton Dickin
performed on a son FACSCAN instrument. Data collection and analysis can be performed using LYSYS
II device (Becton Dickinson, San Jose, CA) and WiMIDI (http://facs.scripts.edu) or CE
LLQUEST program (Bacton Dickinson, San Jo
(se, CA).

【０２８５】 Ｄ．ファージディスプレイペプチドライブラリー選択 ランダム４０量体ペプチドライブラリーを、ｐＣＡＶＴＡＢ５ｅベクターに構
築し、そして１．５５×１０¹⁰の実際の総多様性を有する（Ｒａｖｅｒａら、１
９９８）。ランダム４０量体は、２つのペプチドタグ配列に隣接し、リーダーペ
プチドの後に続き、そしてＭ１３ファージ被覆タンパク質ＩＩＩの膜隣接ドメイ
ンに融合される。１〜２×１０⁶ＭＤＣＫ細胞を、３７℃で５ｍｌのＰＢＳ＋１
０ｍＭ ＥＤＴＡ中に回収し、そして１５ｍｌのＰＢＳ中で２回洗浄し、そして
４℃で１．８ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。１００μｌのファージミドライブラ
リーストック（４．５×１０¹²ｃｆｕ）を添加し、そして３７℃または４℃で１
時間インキュベートした。次いで、その細胞を１５ｍｌのＰＢＳで４℃で５回洗
浄した。結合したファージを２ｍｌの０．１％ ＢＳＡを含有する０．１Ｍ Ｈ
Ｃｌ／グリシン（ｐＨ２．２）で１０分間溶出し、そして迅速に４００μｌの２
Ｍ Ｔｒｉｓ塩基で中和した。ファージレスキューおよび増幅を、標準的な手順
（Ｈｅｘｈａｍ、１９９８）に従って、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ，Ｐｒｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）中で行った。D. Phage Display Peptide Library Selection A random 40-mer peptide library was constructed in the pCAVTAB5e vector and has an actual total diversity of 1.55 × 10 ¹⁰ (Ravera et al., 1).
998). The random 40-mer is flanked by two peptide tag sequences, following the leader peptide, and fused to the membrane flanking domain of M13 phage coating protein III. 1-2 × 10 ⁶ MDCK cells at 37 ° C. in 5 ml of PBS + 1
Recovered in 0 mM EDTA and washed twice in 15 ml PBS and resuspended in 1.8 ml PBS at 4 ° C. Add 100 μl of phagemid library stock (4.5 × 10 ¹² cfu) and add 1 at 37 ° C. or 4 ° C.
Incubated for hours. The cells were then washed 5 times at 4 ° C. with 15 ml of PBS. The bound phages were washed with 2 ml of 0.1 M H containing 0.1% BSA.
Elution with Cl / glycine (pH 2.2) for 10 minutes and rapid 400 μl of 2
Neutralized with M Tris base. Phage rescue and amplification were performed according to standard procedures (Hexham, 1998). coli strain TG1 (Pharmac
ia, Prscataway, NJ).

【０２８６】 Ｅ．ＤＮＡ配列決定および分析 ＤＮＡ配列決定を、ＡＢＩ３７７プリズム自動化シークエンサーを使用して二
重鎖プラスミドまたはファージミドＤＮＡ上で行った。推定ペプチド配列および
イムノグロブリン定常領域のアラインメントを、ＭＡＰ（Ｈｕａｎｇ，１９９４
）およびＰＩＭＡ（Ｓｍｉｔｈら、１９９２）を使用して行った。E. DNA sequencing and analysis DNA sequencing was performed on double-stranded plasmid or phagemid DNA using an ABI377 Prism automated sequencer. Alignment of the deduced peptide sequence and immunoglobulin constant region was performed using MAP (Huang, 1994).
) And PIMA (Smith et al., 1992).

【０２８７】 実施例２：ｄＩＧＡのドメインマッピング キメラヒトＩｇＡ１（Ｃａｒｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら、１９９４）、および
ネズミにコードされるアルソネート特異性を有するＩｇＡ１／ＩｇＧ１定常領域
ドメインスワップ変異体のパネル（Ｃａｒｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら、１９９６
）を、両方の単量体および二量体としてバキュロウイルスにおいて発現し、アフ
ィニティー精製し、次いで、ｐＩｇＲ結合部位を規定するために使用した。二量
体ＩｇＡ（ｄＩｇＡ）を、ＩｇＡのＪ鎖との同時発現によって作製したＩｇＡ調
製物として作動可能に規定した。ウサギｐＩｇＲでトランスフェクトされたＭＤ
ＣＫ細胞（Ｍｏｓｔｏｖら、１９８６）を使用して、組換えＩｇＡ１変異体の、
レセプターへの結合を、ＦＡＣＳ分析によって測定した（図１Ａ）。特異的な結
合を、ｄＩｇＡによって観察したが、単量体ＩｇＡ（図１Ｂ）、培地コントロー
ル（図１ｂ）またはＩｇＧでは観察しなかった。Ｃα１ドメインがＣγ１ドメイ
ンで置換された変異体ＶＧＡＡは、野生型ＩｇＡ１に類似の様式でｐＩｇＲに結
合した（図１Ｃ）。二量体分子（重線）はレセプターに結合したが、単量体（軽
線）は結合しなかった。同様に、ＩｇＡのヒンジを含むＣα１およびＣα２の両
方が、ＩｇＧからのアナログドメインと置換されたＶＧＧＡ変異体は、二量体と
して結合したが、単量体としては結合しなかった（図１Ｄ）。従って、ｄＩｇＡ
のＣα１およびＣα２ドメインは、ｐＩｇＲ結合に必要ではなく、Ｃα３ドメイ
ンの存在が必要とされることを示唆する。Example 2: Domain Mapping of dIGA A panel of chimeric human IgA1 (Carrynopoulos et al., 1994) and an IgA1 / IgG1 constant region domain swap mutant with murine encoded arsonate specificity (Carrynopoulos et al., 1996)
) Was expressed in baculovirus as both monomer and dimer, affinity purified, and then used to define the pIgR binding site. Dimeric IgA (dIgA) was operably defined as an IgA preparation made by co-expression of IgA with the J chain. MD transfected with rabbit pIgR
Using CK cells (Mostov et al., 1986), recombinant IgA1 mutants were
Binding to the receptor was measured by FACS analysis (FIG. 1A). Specific binding was observed with dIgA, but not with monomeric IgA (FIG. 1B), medium control (FIG. 1b) or IgG. Mutant VGAA in which the Cα1 domain was replaced by the Cγ1 domain bound to pIgR in a manner similar to wild-type IgA1 (FIG. 1C). The dimer molecule (heavy line) bound to the receptor, but the monomer (light line) did not. Similarly, a VGGA mutant in which both Cα1 and Cα2, including the hinge of IgA, were replaced with an analog domain from IgG, bound as a dimer but not as a monomer (FIG. 1D). . Therefore, dIgA
The Cα1 and Cα2 domains of are not required for pIgR binding, suggesting that the presence of the Cα3 domain is required.

【０２８８】 実施例３：ＩｇＡ最小ペプチド結合単位 ｄＩｇＡは、４つのＣα３ドメインおよび共有結合したＪ鎖を含有し、これら
は、ＩｇＡテイルピースと一緒に、ＩｇＡの多量体化を担う。この問題の複雑性
を減少するために、ファージディスプレイライブラリーとして発現されるランダ
ム４０量体ペプチドのライブラリー（Ｒａｖｅｒａら、１９９８）を，ｐＩｇＲ
発現ＭＤＣＫ細胞に対して選択した。その目的は、ＩｇＡ内の推定のｐＩｇＲ結
合部位を、それらを最小ペプチド結合単位に減少すること（数個のレセプターリ
ガンド相互作用についての保証されたアプローチ）によって、同定することであ
った（Ｃｗｉｒｌａら、１９９０；Ｐａｒｍｌｅｙら、１９８８；Ｄｅｖｌｉｎ
ら、１９９０）。Example 3 IgA Minimal Peptide Binding Unit dIgA contains four Cα3 domains and a covalently linked J chain, which together with the IgA tailpiece are responsible for IgA multimerization. To reduce the complexity of this problem, a library of random 40-mer peptides expressed as a phage display library (Ravera et al., 1998) was constructed using pIgR.
Selected for expressing MDCK cells. The aim was to identify putative pIgR binding sites within IgA by reducing them to a minimum peptide binding unit (guaranteed approach for several receptor ligand interactions) (Cwirla et al.). Parmley et al., 1988; Devlin.
Et al., 1990).

【０２８９】 非レセプター発現細胞におけるネガティブ選択で、懸濁液中の生きたｐＩｇＲ
発現ＭＤＣＫ細胞において、選択を行った。結合したファージを、酸または細胞
溶解によって溶出した。酸溶出および細胞結合ファージの両方の回収により、４
から６回の連続的なラウンドにおいて、およそ６×１０⁴から５×１０⁷に徐徐に
増加した。これは、特的な結合クローンの富化を示す。個々のクローンを、酸で
溶出した画分および膜結合画分からの最終的なパニングからランダムに選択し、
そして配列決定した。ＥＬＩＳＡによって測定された富化したファージ集団の組
換えヒトｐＩｇＲへの結合は、パニングの連続するラウンドによって増加し、そ
して多量体ＩｇＭによって阻害された。With negative selection on non-receptor expressing cells, live pIgR in suspension
Selection was performed on expressing MDCK cells. Bound phage were eluted by acid or cell lysis. Recovery of both acid elution and cell-bound phage resulted in 4
From 6 × 10 ⁴ to 5 × 10 ⁷ in 6 consecutive rounds. This indicates an enrichment of the specific binding clone. Individual clones were randomly selected from the final panning from acid-eluted and membrane-bound fractions,
And sequenced. Binding of the enriched phage population to recombinant human pIgR as measured by ELISA was increased by successive rounds of panning and inhibited by multimeric IgM.

【０２９０】 ファージミドＤＮＡの配列決定は、３２の酸溶出クローンからの２０、および
３２の細胞結合クローンからの１２がオープンリーディングフレームを有するこ
とを示した（図２）。配列のこれらの２つの群の間には、ほとんどクローン性が
なかったが、Ａ２２ペプチドは、３回回復した。これらのペプチドは、ＰＩＭＡ
プログラムを使用して（Ｓｍｉｔｈら、１９９２）、ヒトＩｇＡ１ Ｃα３領域
アミノ酸配列との最大相同性についてアラインされた（図２）。ペプチドの多く
は、特に、Ａ１２（９／３０同一アミノ酸）（図３Ａ）は、ヒトＩｇＡ１ Ｃα
３ドメインとの相同性を示し、アミノ酸配列およびこの領域の構造のさらなる検
査を鼓舞する。Sequencing of the phagemid DNA showed that 20 from 32 acid-eluted clones and 12 from 32 cell-bound clones had an open reading frame (FIG. 2). Although there was little clonality between these two groups of sequences, the A22 peptide recovered three times. These peptides are
Using the program (Smith et al., 1992), they were aligned for maximum homology with the human IgA1 Cα3 region amino acid sequence (FIG. 2). Many of the peptides, particularly A12 (9/30 identical amino acids) (FIG. 3A), are human IgA1 Cα
Shows homology to the three domains, inspiring further examination of the amino acid sequence and structure of this region.

【０２９１】 実施例４：変異分析 ヒトＣα３ドメインは、アミノ酸レベルでヒトＩｇＧ１の対応する領域に対し
て４０％同一であり、そして６２％相同である。さらに、イムノグロブリンスー
パーファミリーのフォールドの全ての配列の証明は、保存されている。従って、
ヒトＩｇＧ１結晶構造（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒら、１９８１）を使用して、Ｉ
ｇＡ１配列内の主要構造モチーフの（β鎖およびループ）最もらしい位置を推定
した。ＩｇＡ１上のＦｃαＲ（ＣＤ８９）結合部位をマップするための以前に使
用されたアプローチである（Ｃａｒｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら、１９９６）。図
３Ａは、ペプチドＡ１２のＩｇＡ１配列とのアラインメントおよびその二次構造
特徴とその対応するＩｇＧ１配列を示す。Ａ１２ペプチドは、ＩｇＧ構造におい
て２つのβ鎖の間に露出された６個のアミノ酸ループを形成する領域に対して相
同である。しかし、ＩｇＡ１において、この領域は、そのループを９つのアミノ
酸に拡大するために３つのアミノ酸挿入を含有する。隣接するβ鎖配列およびル
ープの一部は、ＩｇＡとＩｇＧとの間に保存されており、これは、大きな構造的
特徴もまた保存されることを示唆する。図３Ｂは、４つのヒトＩｇＧサブクラス
とアラインされた５つの哺乳動物ＩｇＡ分子のＣＨ３ドメインでのこの領域のア
ラインメントを示す。ループにおける差異にもかかわらず、全てのＩｇＡ配列は
、さらなる３つのアミノ酸を有する一方、ＩｇＧ配列は、有さない。ＩｇＡと類
似して、ＩｇＭの配列は、２つのアミノ酸挿入をこの部位に含有する。Example 4 Mutation Analysis The human Cα3 domain is 40% identical and 62% homologous at the amino acid level to the corresponding region of human IgG1. In addition, the proof of the entire sequence of the fold of the immunoglobulin superfamily is conserved. Therefore,
Using the human IgG1 crystal structure (Deisenhofer et al., 1981),
The most likely positions (β-strands and loops) of the major structural motifs within the gA1 sequence were deduced. A previously used approach to map the FcαR (CD89) binding site on IgA1 (Carrynopoulos et al., 1996). FIG. 3A shows the alignment of peptide A12 with the IgA1 sequence and its secondary structural features and its corresponding IgG1 sequence. The A12 peptide is homologous to a region that forms a six amino acid loop exposed between two β chains in the IgG structure. However, in IgA1, this region contains a three amino acid insertion to extend the loop to nine amino acids. Flanking β-strand sequences and some of the loops are conserved between IgA and IgG, suggesting that large structural features are also conserved. FIG. 3B shows an alignment of this region in the CH3 domain of five mammalian IgA molecules aligned with four human IgG subclasses. Despite differences in the loop, all IgA sequences have an additional three amino acids, while IgG sequences do not. Similar to IgA, the sequence of IgM contains a two amino acid insertion at this site.

【０２９２】 これらの観察に基づいて、３つの変異体ＩｇＡ１分子を構築し、そしてバキュ
ロウイルス中で発現して、この領域でのアミノ酸変化のｐＩｇＲ結合に対する効
果を試験した（図３Ｃ）。変異は、ループ自体の中（Ｌ１およびＬ３）およびネ
ガティブコントロールとしてループ（Ｌ２）に対するＮ末端のβ鎖の中に作製さ
れ。次いで、記載されるように（Ｒｉｎｄｉｓｂａｃｈｅｒら、１９９５）バキ
ュロウイルス中で発現したヒトｐＩｇＲの精製した組換え細胞外ドメインを使用
して、ＥＬＩＳＡによって生理学的に関連のあるヒトレセプターに対する結合を
、測定した。図４は、精製したヒトｐＩｇＲに対する、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３
変異体の単量体および二量体形態と比較しての、ＩｇＡ１単量体および二量体の
結合を示す。二量体野生型ＩｇＡ１および二量体Ｌ２変異体のみ（ここで、その
変異は、ループに対してＮ末端のβ鎖にある）が結合を示す。ループ自体内の変
異（すなわち、Ｌ１およびＬ３）は、二量体ＩｇＡ１変異体分子のおよびｐＩｇ
Ｒへの結合を廃止する。類似の結合パターンを、ループ変異体および、ＦＡＣＳ
によって測定されたウサギｐＩｇＲ発現細胞を用いて得た。これらの結果は、こ
のＣα３ループが、ｄＩｇＡ上のｐＩｇＲに対する主要な結合モチーフであり、
そしてこの観察に基づいて、およびランダムペプチドの選択およびこれらとＩｇ
Ａ配列との間の比較に基づいて、ＩｇＡのアミノ酸４０２〜４１０（配列番号１
）がｐＩｇＲへの結合部位を構成することを示す。Based on these observations, three mutant IgA1 molecules were constructed and expressed in baculovirus to test the effect of amino acid changes in this region on pIgR binding (FIG. 3C). Mutations were made in the β-chain N-terminal to the loop (L1 and L3) and to the loop (L2) as a negative control. Binding to physiologically relevant human receptors was then measured by ELISA using the purified recombinant extracellular domain of human pIgR expressed in baculovirus as described (Rindisbacher et al., 1995). . FIG. 4 shows L1, L2, and L3 against purified human pIgR.
Figure 4 shows IgA1 monomer and dimer binding as compared to the monomeric and dimeric forms of the variants. Only dimeric wild-type IgA1 and dimeric L2 mutants, where the mutation is in the β-chain N-terminal to the loop, show binding. Mutations within the loop itself (ie, L1 and L3) are dependent on the dimeric IgA1 mutant molecule and pIg
Abolish the bond to R. Similar binding patterns were determined by loop variants and FACS
Obtained using rabbit pIgR expressing cells as determined by These results indicate that this Cα3 loop is the major binding motif for pIgR on dIgA,
And based on this observation, and the selection of random peptides and their
Based on a comparison with the A sequence, amino acids 402-410 of IgA (SEQ ID NO: 1)
) Constitutes a binding site for pIgR.

【０２９３】 ＩｇＡは、機能的な用語において、ＩｇＭに密接に関連し、多量体化し、そし
て分泌される能力を共有する。しかし、全体的なＩｇＡドメイン構成は、ＩｇＧ
のそれに類似する。このレセプターに対するリガンドである全ての多量体イムノ
グロブリンにおけるアミノ酸配列の挿入の存在および非ｐＩｇＲ結合イムノグロ
ブリンからの挿入の非存在（図３ｂ）は、イムノグロブリン分泌におけるその役
割を支持する。挿入サイズおよび実際のＩｇＡおよびＩｇＭ配列の変化は、これ
らの多量体抗体の精密な構造における差異またはｐＩｇＲ結合に対するそれらの
親和性における差異を反映し得る。[0293] IgA, in functional terms, is closely related to IgM and shares the ability to multimerize and be secreted. However, the overall IgA domain organization is
Similar to that of. The presence of amino acid sequence insertions in all multimeric immunoglobulins that are ligands for this receptor and the absence of insertions from non-pIgR binding immunoglobulins (FIG. 3b) support their role in immunoglobulin secretion. Changes in insert size and actual IgA and IgM sequences may reflect differences in the precise structure of these multimeric antibodies or in their affinity for pIgR binding.

【０２９４】 単量体ＩｇＡが分泌されない事実は、レセプターに対するｄＩｇＡ結合に必要
とされる多量体化によって誘導されるコンホメーション変化または結合がこれら
のＣα３部位のそのレセプターとの多価相互作用を必要とすることのいずれかを
示唆する。Ｊ鎖の存在は、至適なＩｇＡ（またはＩｇＭ）多量体化を必要とする
が、Ｉｇ分泌におけるその正確な役割は、依然として解明されないままである。
単量体Ｌ３（およびより低い程度にＬ１変異体）と比較した場合の、二量体Ｌ３
で観察される結合における増加は、Ｊ鎖および／または多量体化が、結合におい
て役割を演じる（図４）ことを示唆する。ｄＩｇＡのＣα３ドメインにおけるア
ミノ酸４０２〜４１０は、主要なｐＩｇＲ結合部位を規定するが、他のｄＩｇＡ
構造は、関与し得る。Ｊ鎖欠損マウスは、野生型マウスに比較して、より低いレ
ベルの多量体ＩｇＡを発現し、ＩｇＡ（ヒトは欠失する）の損失した肝臓輸送を
有するが、粘膜上皮部位での正常レベルを有する（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら、
１９９５；Ｈｅｎｄｒｉｃｈｓｏｎら、１９９６）。従って、Ｊ鎖は、ＩｇＡの
分泌のために必要ではないかもしれないが、粘膜環境における分泌成分に対する
安定な結合のために必要とされる。しかし、代替の分泌機構もまた関与する。The fact that monomeric IgA is not secreted is that the conformational changes or binding induced by the multimerization required for dIgA binding to the receptor may result in the polyvalent interaction of these Cα3 sites with the receptor. Suggest any of what you need. Although the presence of the J chain requires optimal IgA (or IgM) multimerization, its precise role in Ig secretion remains elusive.
Dimer L3 when compared to monomeric L3 (and to a lesser extent L1 variant)
The increase in binding observed in, suggests that J-chain and / or multimerization plays a role in binding (FIG. 4). Amino acids 402-410 in the Ca3 domain of dIgA define a major pIgR binding site while other dIgA
Structure can be involved. J chain deficient mice express lower levels of multimeric IgA and have lost hepatic transport of IgA (human is deleted) compared to wild type mice, but have normal levels at mucosal epithelial sites. (Hendrickson et al.,
1995; Hendrichson et al., 1996). Thus, the J chain may not be necessary for secretion of IgA, but is required for stable binding to secretory components in the mucosal environment. However, alternative secretory mechanisms are also involved.

【０２９５】 実施例５：防御免疫 種々の病原性微生物に対する防御免疫は、抗菌特異性を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃ
Ｆｖ）抗体に結合したｐＩｇＲ結合ドメインを用いて送達される。ＨＩＶ感染の
予防は、ｐＩｇＲ結合ドメインに結合した抗ｇｐ１２０ｓｃＦｖを使用する異性
間ＡＩＤＳ伝達のためのＳＨＩＶ／ヒヒモデルにおいて達成され得る。Example 5 Protective Immunity Protective Immunity Against Various Pathogenic Microorganisms is a Single-Chain Fv (sc
Fv) Delivered with pIgR binding domain conjugated to an antibody. Prevention of HIV infection can be achieved in an SHIV / baboon model for heterosexual AIDS transmission using an anti-gp120 scFv linked to the pIgR binding domain.

【０２９６】 ｐＩｇＲ結合ドメインに結合した単鎖Ｆｖフラグメントは、「重複拡張による
スプライス（ｓｐｌｉｃｅ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ」（Ｓ
ＯＥ）を使用して、一連のポリメラーゼ鎖連鎖反応（ＰＣＲ）において、オリゴ
ヌクレオチドプライマーを利用して、ヒト抗ｇｐ１２０ＩｇＧ抗体から生成され
る。得られるフラグメントは、ＶＨ遺伝子、リンカー配列、ＶＬ遺伝子セグメン
ト、およびｐＩｇＲ結合ドメインからなる。５’プライマーは、制限部位、Ｘｈ
ｏ Ｉを含有し、そして３’プライマーは、ファージディスプレイベクター（ｐ
ＣＯＭＢ３）（Ｂａｒｂａｓ，１９９１）へのクローニングのための第２の部位
、Ｓｐｅ Ｉを含有する。得られる産物は、ｐＣＯＭＢ３ベクター内に含有され
るＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ部位にクローニングされる。結果として、このベクタ
ーは、インフレームおよび単鎖Ｆｖの上流にクローニングされた細菌周辺質シグ
ナルペプチドｐｅｌＢ、および繊維状ファージ被覆タンパク質ＩＩＩのカルボキ
シル末端を含有する。ファージ粒子は、以前に記載されるように（Ｂａｒｂａｓ
，１９９１）ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を使用して生成される。得られるフ
ァージは、パニング技術を使用して、抗原特異性を選択するために使用される。
高親和性抗体を選択するためのＨＩＶ抗原でのパニングのための技術は、簡単で
あり、そして公開されている（Ｈｅｘｈａｍ，１９９６）。簡単には、ｇｐ１２
０抗原は、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上に被覆される。種々の量の特異的およ
び非特異的ファージが、ウェルに添加され、そして抗原に結合する。非結合ファ
ージは、洗浄によって除去され、そして保存される。結合したファージは、低ｐ
Ｈを使用してウェルから溶出され、続いて、新鮮な細菌培養物を再び感染し、そ
してさらに、選択のラウンドを行う。The single-chain Fv fragment bound to the pIgR-binding domain is referred to as a “splice by overlap extension” (S
OE) is generated from a human anti-gp120 IgG antibody utilizing oligonucleotide primers in a series of polymerase chain reactions (PCR). The resulting fragment consists of the VH gene, linker sequence, VL gene segment, and pIgR binding domain. The 5 'primer contains a restriction site, Xh
oI, and the 3 'primer is a phage display vector (p
COMB3) (Barbas, 1991) contains a second site, Spe I, for cloning. The resulting product is cloned into the XhoI and SpeI sites contained in the pCOMB3 vector. As a result, this vector contains the bacterial periplasmic signal peptide pelB cloned in-frame and upstream of the single-chain Fv, and the carboxyl terminus of filamentous phage coat protein III. Phage particles were isolated as previously described (Barbas
, 1991) generated using the helper phage VCSM13. The resulting phage is used to select for antigen specificity using panning techniques.
The technique for panning with HIV antigens to select for high affinity antibodies is straightforward and published (Hexham, 1996). Briefly, gp12
The 0 antigen is coated on the wells of the ELISA plate. Various amounts of specific and non-specific phage are added to the wells and bind to the antigen. Unbound phage are removed by washing and preserved. Bound phages have low p
H is used to elute from the wells, followed by reinfection with fresh bacterial cultures and another round of selection.

【０２９７】 ファージから選択されたＤＮＡは、次いで、ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩでの制限
消化によって改変され、遺伝子ＩＩＩフラグメントの切除を容易にする。ベクタ
ーは、再び連結され（ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩは、適合性の末端を有する）、可
溶性のｓｃＦｖの産生を可能にするベクターを形成する。フラグメントは、最大
のタンパク質産生のためのｌａｃＺプロモーター（ＩＰＴＧで誘導可能）の制御
下にある。このシステムにおいて、ヘキサヒスチジン配列は、ＮｈｅＩ部位と終
結コドンとの間においてそのベクターに挿入され、ヘキサヒスチジンタグを有す
るタンパク質を得る。これにより、Ｎｉ⁺⁺親和性クロマトグラフィーを使用して
、任意のタンパク質の精製が可能になる。その組換えｓｃＦｖ抗体が天然の分子
に適合可能に結合するか否かを決定するために、両者の親和性を、ＢＩＡｃｏｒ
ｅおよびＥＬＩＳＡ決定を使用して比較する。The DNA selected from the phage is then modified by restriction digestion with SpeI and NheI to facilitate excision of the gene III fragment. The vectors are ligated again (SpeI and NheI have compatible ends) to form a vector that allows for the production of soluble scFv. The fragment is under the control of the lacZ promoter (inducible with IPTG) for maximum protein production. In this system, a hexahistidine sequence is inserted into the vector between the NheI site and the stop codon, resulting in a protein with a hexahistidine tag. This allows the purification of any protein using Ni ⁺⁺ affinity chromatography. To determine whether the recombinant scFv antibody binds compatible with the native molecule, the affinity of both was determined by BIAcor.
e and compare using ELISA determination.

【０２９８】 ｓｃＦｖ−ｐＩｇＲ結合ドメインの精製後、異性間ＡＩＤＳ伝達のためのヒヒ
ＳＨＩＶモデルにおいてこの分子のＨＩＶ感染を防止する能力が、評価される。After purification of the scFv-pIgR binding domain, the ability of this molecule to prevent HIV infection in a baboon SHIV model for heterosexual AIDS transmission is evaluated.

【０２９９】 同じアプローチを使用して、他の抗病原性ｓｃＦｖ−ｐＩｇＲ結合ドメインの
組み合わせが、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、および淋病に対する免
疫を媒介するために利用され得る。Using the same approach, other combinations of anti-pathogenic scFv-pIgR binding domains can be utilized to mediate immunity to influenza, respiratory syncytial virus, and gonorrhea.

【０３００】 実施例６：ｐＩｇＲに対する高結合親和性を有する他のペプチドモチーフの同
定 ファージディスプレイ技術を使用して、高親和性でｐＩｇＲに結合するペプチ
ドモチーフを同定した。より詳細には、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ
腎臓）細胞経細胞輸送系の改変は、ランダム４０量体および２０量体のペプチド
ファージライブラリーのスクリーニングのために利用された。３つの別々のラウ
ンドの実験を行った。最初の２つは、４０量体ペプチドライブラリーを包含し、
それに対して、３つ目は、２０量体のペプチドライブラリーを包含した。ｐＩｇ
ＲでトランスフェクトされたＭＤＣＫ細胞株は、インビトロでの経細胞輸送アッ
セイとして使用される（Ｍｏｓｔｏｖら、１９９５）。ＭＤＣＫは、極性を有す
る細胞株であり、緊密な結合により単層を形成し得、これは、半透性の支持体上
において増殖された場合、組織培養ウェルのより低いところ（基底面）〜上部（
頂端）チャンバへｄＩｇＡを輸送する。ｐＩｇＲを発現するＭＤＣＫ細胞および
非トランスフェクトＭＤＣＫ細胞は、１．０μｍの孔サイズのポリカーボネート
膜を用いて、孔サイズがファージが通過するように、組織培養インサート上に播
種された。ファージライブラリーを、ウェルのより低いかまたは側底のチャンバ
に導入し、そして３〜４時間３７℃でインキュベートする。次いで、トランスサ
イトーシスが可能なペプチドを表示するファージを、増幅し、そしてトランスサ
イトーシスによる選択のさらなるラウンドに供する。パニングの連続的なラウン
ド（ファージ力価によって評価されるが、代表的には約６）の後、ランダムファ
ージクローンを選択し、そして配列決定した。Example 6: Identification of other peptide motifs with high binding affinity for pIgR Using phage display technology, peptide motifs that bind with high affinity to pIgR were identified. More specifically, a modification of the MDCK (Madin-Darby canine kidney) cell transcellular transport system was utilized for screening random 40-mer and 20-mer peptide phage libraries. Three separate rounds of the experiment were performed. The first two involve a 40-mer peptide library,
In contrast, the third involved a 20-mer peptide library. pIg
The MDCK cell line transfected with R is used as an in vitro transcellular transport assay (Mostov et al., 1995). MDCK is a polar cell line, which can form a monolayer by tight binding, which, when grown on semi-permeable supports, lowers the tissue culture wells (basal surface) to Top (
(Top) Transport dIgA to chamber. MDCK cells expressing pIgR and non-transfected MDCK cells were seeded on tissue culture inserts using a 1.0 μm pore size polycarbonate membrane to allow phage to pass through the pore size. The phage library is introduced into the lower or basolateral chamber of the well and incubated for 3-4 hours at 37 ° C. The phage displaying the peptide capable of transcytosis are then amplified and subjected to a further round of transcytosis selection. After successive rounds of panning (evaluated by phage titer, typically about 6), random phage clones were selected and sequenced.

【０３０１】 最初のラウンドの実験からの２０クローン（４０量体ライブラリー）および第
２のラウンド（４０量体ライブラリー）の実験および第３のラウンドの実験（２
０量体ライブラリー）からの１８クローンを、無作為に選択し、そして配列決定
した。表３は、３つの実験から選択された８個のファージペプチドおよび得られ
た配列によって示される選択の頻度（括弧内）を示す：The 20 clones (40-mer library) from the first round experiment and the second round (40-mer library) and the third round experiment (2
Eighteen clones from the 0-mer library) were randomly selected and sequenced. Table 3 shows the eight phage peptides selected from the three experiments and the frequency of selection (in parentheses) indicated by the resulting sequence:

【０３０２】[0302]

【表３】 ペプチドアラインメントコンピュータプログラムによって評価したところ、ペ
プチドの間に明らかな配列モチーフは存在しなかった。しかし、これらの選択さ
れたファージペプチドがＩｇＡの配列とアラインメントされた場合、３つのペプ
チド（ＶＤＤ、ＳＡＭ、およびＩＰＳ）は、ｐＩｇＲ結合にとって重要であると
本発明者らによって以前に示されている（Ｈｅｘｈａｍら、１９９９）（図５）
４０２〜４１０領域中にかつそのまわりに有意な同一性を示す。ファージペプチ
ドは、それらの配列中の最初の３つのアミノ酸によって言及される。[Table 3] There was no apparent sequence motif between the peptides as assessed by the peptide alignment computer program. However, when these selected phage peptides were aligned with the sequence of IgA, three peptides (VDD, SAM, and IPS) were previously shown by the inventors to be important for pIgR binding. (Hexham et al., 1999) (FIG. 5).
It shows significant identity in and around the 402-410 region. Phage peptides are referred to by the first three amino acids in their sequence.

【０３０３】 上記の８つのファージペプチドは、ｐＩｇＲトランスフェクトされた細胞を介
して（陽性選択法）、連続的なラウンドのトランスサイトーシスによって選択さ
れた。従って、個々のファージディスプレイされたペプチドの、ＭＤＣＫトラン
スサイトーシス系中のｐＩｇＲによって特異的にトランスサイトーシスされる能
力は、ｐＩｇＲトランスフェクトされた、およびトランスフェクトされていない
ＭＤＣＫ細胞の両方を使用して、ネガティブコントロールとして評価された（図
６）。The eight phage peptides described above were selected by successive rounds of transcytosis via pIgR transfected cells (positive selection method). Therefore, the ability of individual phage displayed peptides to be specifically transcytosed by pIgR in the MDCK transcytosis system uses both pIgR transfected and untransfected MDCK cells. Was evaluated as a negative control (FIG. 6).

【０３０４】 これらの結果は、ファージの表面にディスプレイされたＳＡＭ、ＩＰＳ、ＲＳ
Ｒ、ＭＦＶ、ＶＤＤ、およびＱＲＮペプチドが、ファージがＭＤＣＫ細胞によっ
てｐＩｇＲによって特異的にトランスサイトーシスされることを明確に示す（図
６Ａおよび６Ｂ）。対照的に、ＬＶＬおよびＷＱＡファージペプチドは、代替の
トランスサイトーシス経路によるファージの先端の輸送を指向する（図６Ｃ）。[0304] These results indicate that SAM, IPS, RS displayed on the surface of the phage.
The R, MFV, VDD, and QRN peptides clearly show that phage are specifically transcytosed by MDCK cells by pIgR (FIGS. 6A and 6B). In contrast, LVL and WQA phage peptides direct phage tip transport by alternative transcytosis pathways (FIG. 6C).

【０３０５】 さらなるペプチドは、異なるファージディスプレイライブラリー、すなわち、
拘束されたライブラリーを使用して選択される。元々の提出物に記載されるこれ
らおよび他の実験から生じる分子は、ラットモデルにおいて試験される。さらに
、変異ライブラリーは、トランスサイトーシスによって選択されたそれらのペプ
チドおよび誘導体に由来する。これらのライブラリーは、インビトロＭＤＣＫト
ランスサイトーシス系および以下に記載されるラットのインビボモデルの両方に
おいて究極的に試験されるより多くの候補輸送分子を生成する。An additional peptide is a different phage display library, ie,
Selected using the constrained library. The molecules resulting from these and other experiments described in the original submission are tested in a rat model. In addition, mutation libraries are derived from those peptides and derivatives selected by transcytosis. These libraries generate more candidate transport molecules that will ultimately be tested in both the in vitro MDCK transcytosis system and the in vivo rat model described below.

【０３０６】 実施例７：インビボトランスサイトーシスモデル 次いで、ファージペプチドの、トランスサイトーシスのインビボモデルにおい
て輸送される能力を評価した。ラットにおいて、多量体イムノグロブリンを、肝
臓によって発現されたｐＩｇＲによって血液から胆汁に選択的に輸送する。従っ
て、そのラットの肝臓胆汁トランスサイトーシス系を、インビボでのファージペ
プチドの輸送を評価する手段として選択した。この実験のために、胆汁管にカニ
ューレを挿入する前に、ラットを一晩絶食させた。そのラットに塩酸ケタミン（
４４ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、静脈内に生理食塩水のラインを確立し、次いで
、その胆汁管にカニューレを挿入し、カニューレの出口は、ラットの下約１０ｃ
ｍのことろに静止させた。胆汁の回収を、試験ファージおよびネガティブコント
ロールファージ粒子（０．２ｍｌの滅菌生理食塩水中）の静脈内注射の後に開始
し、そして別々のチューブにおける３０分の時点、継続した。複製血清サンプル
もまた、ファージ粒子の末梢クリアランスを評価するために得られ得る。胆汁お
よび血清の回収が完了した後に、その動物を屠殺した。図７は、使用した手順お
よびＩＰＳ試験ファージを注射した１つのラットからの結果を示す。全ての時点
から回収したファージの百パーセントが、ＩＰＳペプチドをディスプレイした。
非特異的ファージをこの実験からは回収しなかった。肝臓胆汁輸送に加えて、ラ
ットモデルはまた、標的化分子の存在についての種々の他の粘膜部位のサンプリ
ングを可能にする。Example 7 In Vivo Transcytosis Model The ability of phage peptides to be transported in an in vivo model of transcytosis was then evaluated. In rats, multimeric immunoglobulins are selectively transported from blood to bile by pIgR expressed by the liver. Therefore, the rat liver bile transcytosis system was chosen as a means to assess phage peptide transport in vivo. For this experiment, rats were fasted overnight before cannulation of the bile duct. Ketamine hydrochloride (
44 mg / kg body weight), establish an intravenous saline line, then cannulate the bile duct and exit the cannula approximately 10 cm below the rat.
m. Bile collection started after intravenous injection of test phage and negative control phage particles (in 0.2 ml of sterile saline) and continued for 30 minutes in separate tubes. Replicating serum samples can also be obtained to assess peripheral clearance of phage particles. After bile and serum collection was completed, the animals were sacrificed. FIG. 7 shows the procedure used and results from one rat injected with the IPS test phage. One hundred percent of the phage recovered from all time points displayed the IPS peptide.
Non-specific phage was not recovered from this experiment. In addition to liver bile transport, the rat model also allows for sampling of various other mucosal sites for the presence of targeting molecules.

【０３０７】 変異誘発部位は、選択されたファージペプチドの結合およびトランスサイトー
シスならびにｄＩｇＡからの天然の領域をさらに最適化するために利用され得る
。これらの試薬は、まず、インビトロＭＤＣＫトランスサイトーシス系において
トランスサイトーシスについて試験され、次いで、分泌のインビボモデルにおい
て評価される必要がある。Mutagenesis sites can be utilized to further optimize the binding and transcytosis of selected phage peptides and the native region from dIgA. These reagents need to be tested first for transcytosis in the in vitro MDCK transcytosis system and then evaluated in an in vivo model of secretion.

【０３０８】 実施例８：多量体ペプチド 他の実験は、ｐＩｇＲ−ｄＩｇＡ相互作用に必要とされる可能な限り最も小さ
いペプチドを局在化させることを目的としていた。この目的のために、ｐＩｇＲ
結合に関与するＩｇＡからの天然の領域（アミノ酸４０２〜４１０）を、単量体
および二量体の形態（小さなリンカーを有する）の両方において、チオレドキシ
ンまたはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質として合成した。ｐ
ＩｇＲ結合ドメインの各々の側の隣接するアミノ酸（５残基）を含ませた。単量
体および二量体の両方について、ＧＰ（Ｇ）₆ＰＧ非切断可能リンカー部分をｐ
ＩｇＲ結合ドメインと選択された薬剤（ＳＡ）（チオレドキシンかまたはＧＦＰ
のいずれか）との間に配置した。さらなるＧＰ（Ｇ）₆ＰＧリンカーを、ｐＩｇ
Ｒ結合ドメインの間にもまた配置した。Example 8 Multimeric Peptides Another experiment was aimed at localizing the smallest possible peptide required for pIgR-dIgA interaction. For this purpose, pIgR
The native region from IgA involved in binding (amino acids 402-410) was synthesized as a thioredoxin or green fluorescent protein (GFP) fusion protein in both monomeric and dimeric form (with a small linker). . p
Contiguous amino acids (5 residues) on each side of the IgR binding domain were included. For both the monomer and the dimer, the GP (G) ₆ PG non-cleavable linker moiety is p
IgR binding domain and selected agent (SA) (thioredoxin or GFP
). Additional GP (G) ₆ PG linker was added to pIg
It was also located between the R binding domains.

【０３０９】 単量体ペプチド： ＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＧＰ（Ｇ）₆ＰＧ−［ＳＡ］ ４０２−４１０ リンカー 二量体ペプチド： TWASRQEPSQGTTTFAVTSGP(G)₆PGTWASRQEPSQGTTTFAVTSGP(G)₆PG-[SA] 402〜410 リンカー 402〜410 リンカー そのペプチドを、標準的なＰＣＲ（単量体ペプチドについて）およびＰＣＲ
ＳＯＥ反応（二量体ペプチドについて）（Ｈｏｒｔｏｎら、１９９０）によって
、ＧＰ（Ｇ）₆ＰＧリンカーおよび従来の反応部位をＰＣＲ産物の末端に付加し
たヒトＩｇＡ ｃＤＮＡおよびプライマーを使用して、構築した。次いで、単量
体および二量体ペプチド構築物を、チオレドキシンおよびＧＦＰ融合タンパク質
ベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現し、そしてアフィニティーク
ロマトグラフィー法によって精製した。Monomer peptide: TWASR QEPSQGTTT FAVTSGP (G) ₆ PG- [SA] 402-410 linker dimer peptide: TWASR QEPSQGTTT FAVTSGP (G) ₆ PGTWASR QEPSQGTTT FAVTSGP (G) ₆ PG- [SA] 402- 410 linker 402-410 linker The peptide can be used for standard PCR (for monomeric peptides) and PCR.
An SOE reaction (for dimeric peptides) (Horton et al., 1990) was constructed using a GP (G) ₆ PG linker and human IgA cDNA and primers with a conventional reaction site added to the end of the PCR product. The monomeric and dimeric peptide constructs were then cloned into a thioredoxin and GFP fusion protein vector and coli and purified by affinity chromatography.

【０３１０】 チオレドキシン単独（ネガティブコントロール）およびチオレドキシン融合タ
ンパク質の、ＭＤＣＫトランスサイトーシス系においてｐＩｇＲによって特異的
に輸送される能力を、評価した（図８）。データは、ｄＩｇＡのＣＨ３領域から
の天然の領域から由来するペプチドが、実際、融合タンパク質を、ｐＩｇＲトラ
ンスフェクトされたＭＤＣＫ細胞を介して、直接輸送し得ることを示す。チオレ
ドキシン融合タンパク質の調製物において、有意な量の多量体化または凝集が存
在するようである。The ability of thioredoxin alone (negative control) and thioredoxin fusion protein to be specifically transported by pIgR in the MDCK transcytosis system was evaluated (FIG. 8). The data indicate that peptides derived from the native region from the CH3 region of dIgA can, in fact, transport the fusion protein directly through pIgR-transfected MDCK cells. There appears to be a significant amount of multimerization or aggregation in the preparation of the thioredoxin fusion protein.

【０３１１】 クリアランス／輸送分析は、インタクトな二量体ＩｇＡ、ｄＩｇＡのＦｃフラ
グメント、組換えペプチド（選択された薬剤を使用しておよび使用せずに）、合
成ペプチド、および単量体ＩｇＡおよびＩｇＧ（コントロールとして）を、使用
して行う。これらの実験において、種々のタンパク質をラットに静脈内注射し、
血清サンプルからのその分子のクリアランスを測定し、そしてその分子の粘膜輸
送を胆汁サンプルから評価した。さらに、他の粘膜部位を、サンプリングして、
この系における、これらの分子の検出の定量的な限界に関する情報を提供し得る
。The clearance / transport analysis was performed on intact dimeric IgA, Fc fragment of dIgA, recombinant peptides (with and without selected agents), synthetic peptides, and monomeric IgA and IgG. (As a control). In these experiments, various proteins were injected intravenously into rats,
The clearance of the molecule from serum samples was measured, and mucosal transport of the molecule was evaluated from bile samples. In addition, sampling other mucosal sites,
It can provide information on the quantitative limits of detection of these molecules in this system.

【０３１２】 本明細書に開示されそして特許請求される全ての組成物および方法は、本明細
書の開示に照らして、過度の実験を要せずになされ、そして行われ得る。本発明
の組成物および方法が好ましい実施形態に関して記載されてきたが、当業者には
、改変がその組成物および方法ならびに本明細書に記載される方法における工程
または工程の配列に、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、
適用され得ることが理解される。より詳細には、化学的にも生理学的にも関連す
る特定の薬剤が、同じかまたは類似の結果を達成しながら、本明細書に記載され
た薬剤と置換されうることが理解される。全てのこのような類似の置換および改
変は、当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲によって規定される本発
明の精神、範囲、および概念内にあるとみなされる。All the compositions and methods disclosed and claimed herein can be made and executed without undue experimentation in light of the present disclosure. Although the compositions and methods of the invention have been described with reference to preferred embodiments, those skilled in the art will recognize that modifications may be made to the compositions or methods and the steps or sequence of steps in the methods described herein, Without departing from the concept, spirit and scope
It is understood that it can be applied. More specifically, it is understood that certain agents, both chemically and physiologically relevant, can be substituted for the agents described herein while achieving the same or similar results. All such similar substitutes and modifications will be apparent to those skilled in the art and are deemed to be within the spirit, scope and concept of the invention as defined by the appended claims.

【０３１３】 （参考文献） 以下の参考文献は、それらが例示的な手順または他の詳細な補充が本明細書に
おいて示されるものに対して提供する程度で、本明細書において参考として援用
される。 米国特許第３，７９１，９３２号 米国特許第３，９４９，０６４号 米国特許第４，０１６，１００号 米国特許第４，０８９，８０１号 米国特許第４，１７４，３８４号 米国特許第４，２３４，８７１号 米国特許第４，３６７，１１０号 米国特許第４，４５２，９０１号 米国特許第４，４８５，０５４号 米国特許第４，５５４，１０１号 米国特許第４，５９９，２３０号 米国特許第４，５９９，２３１号 米国特許第４，６０１，９０３号 米国特許第４，６０８，２５１号 米国特許第４，６８３，１９５号 米国特許第４，６８３，２０２号 米国特許第４，８００，１５９号 米国特許第４，８８３，７５０号 米国特許第５，０２８，５９２号 米国特許第５，２２１，６０５号 米国特許第５，２３８，８０８号 米国特許第５，２５２，４７９号 米国特許第５，２７９，７２１号 米国特許第５，３１０，６８７号 米国特許第５，３５４，８５５号 米国特許第５，３５９，０４６号 米国特許第５，６７２，３４４号 英国出願 ２ ２０２ ３２８ ＰＣＴ 出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０ ＰＣＴ 出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５ ＰＣＴ 出願 ＷＯ ８８／１０３１５ ＰＣＴ 出願 ＷＯ ８９／０６７００ ＷＯ ９０／０７６４１ ＥＰＡ Ｎｏ．３２０ ３０８ ＥＰＡ Ｎｏ．３２９ ８２２ Ａｐｔｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６１：５２７９−８５，１９９３
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）：３１９５−３２０７、１９８８． Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
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ｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ＤＮＡ ｖ
ｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｇｅｎｅｓ」：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆ
ｅｒ、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｒ、ｅｄ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕ
ｍ Ｐｒｅｓ、ｐｐ．１１７−１４８、１９８６． Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ」：Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ：Ａｎａｌｙ
ｓｉ、 Ｓｙｎｔｈｅｓｉ、Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ
、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ｐｐ．３−２８４、１９８０． ＊Ｂａｒｂａｓら「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｎ
ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｐｈａｇｅ （Ｐｈａｂｓ）：Ｒａｐｉｄ ｓ
ｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆａｂ、」：Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ ２：１１９−２１４、１９９１． Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭｏＬ Ｂｉｏｌ ８０：４６１−４７４． Ｂａｒｔｌｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：
８８５２−８８５７、１９９６． Ｂａｓｔｉａｎら、Ａ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、３７
３：１２５５−１２６３、１９９２． ＢａｔｔｅｒｓｏｎａｎｄＲｏｉｚｍａｎ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、４６：３７１−
３７７、１９８３． Ｂｅｄｚｙｋら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１８６１５、１９９０．
Ｂｅｌｌｏｎら、ｄｅ Ｓｅｓ Ｆｉｌｉａｌｅ、１９０ （１）：１０９−１
４２、１９９６． Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ａｎｄ Ｎｅｓｈｉｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：９５５１−９５５５、１９８６． Ｂｅｒｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、５４：３１６−２９、１９９０． Ｂｅｒｎｓ ａｎｄ Ｂｏｈｅｎｚｋｙ、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、３２
：２４３−３０７、１９８７． Ｂｅｒｎｓ ａｎｄ Ｇｉｒａｕｄ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１８：１−２３、１９９６． Ｂｕｒｂａｇｅら、Ｌｅｕｋ Ｒｅ、２１ （７）：６８１−６９０、１９９７
． Ｂｕｒｎｅｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：４６４２−４６４８、１９
９４． Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０：１−１９、１９８４．
Ｃａｐａｌｄｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、７
６：４２５ １９７７． Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９１：８３４８−８３５２、１９９４． Ｃａｓｔｉｌｌａら、ＪＶｉｒｏｌ、７１ （７）：５２５１−８、１９９７．
ＣｈａｕｄｈａｒｙらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．、８７：９４９
１、１９９０． Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７：２７
４５−２７５２、１９８７． Ｃｈｉｌｄｅｒｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４３：５０３−
５３６、１９８９． Ｃｏｆｆｉｎ、Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄｓら、ｅｄｓ．、Ｒａｖｅ
ｎ Ｐｒｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１４３７−１５００、１９９０． Ｃｏｏｋら、Ｃｅｌｌ、６２：６７１−６８０、１９９０． Ｃｏｔｔｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６３：４７０４−１４、１９９
５． Ｃｏｕｃｈら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．、８８：３９４−４０３、１
９６３． Ｃｒｏｗｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、１３８
６−１３９０、１９９４． Ｃｕｌｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：１５５０−１５５２、１９９２． ＤｅＬｕｃａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、５６：５５８−５７０、１９８５． ＤｉｌｌｅｒらＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．、１０：５７７２−５７８１、１９
９０． Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：７
５２９−７５３３、１９８４． Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’Ｉ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
、１９８９． Ｅｌｓｈａｍｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７ （２）：１４１−１４８、
１９９６． Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
８４：８４６３−８４６７、１９８７． Ｆｅｎｇら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、６８、７７６６−７７７３、１９９４． Ｆｅｒｋｏｌら、ＦＡＳＥＢＪ．、７：１０８１−１０９１、１９９３． Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎ、Ｃｅｌｌ、４９：２１１−２２０、１９
８７． Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：３
３４８−３３５２、１９７９． Ｆｒｅｎｃｈ、ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９０ （５）：２４１４−２４２
４、１９９４． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｒ．Ｉ．「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｘ
ｆｏｒｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｐｒｅｓ、１９９２． Ｆｒｏｈｍａｎ、ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴ
ＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０． Ｇａｒｃｉａ−Ｐａｒｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６、１１７３４−
１１７３８、１９８１． Ｇｅｒｌａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ）、３２８：８０２−８０５
、１９８７． Ｇｈｏｓｅ ＆ Ｂｌａｉｒ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉ
ｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、３：
２６２−３５９、１９８７． Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：１７３３−１７３９
、１９８７． Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｈｈａｗａｔ、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐ
ｏｓｏｍｅｓ ｔｏ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａ
ｓｅ、 Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄｓ．Ｗｕ ｅ
ｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ
．８７−１０４、１９９１． Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、ＰＮＡ、８８ （５）１６５１−１６５５、１９９１． Ｇｌｏｒｉｏｓｏら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：６７５−７
１０、１９９５． Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２５１２９−２
５１３４、１９９２． Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、５：１１８８−１１９０、１９８５
． Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１、１９９２． Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９、１９９５． Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ、Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ、ｅｄ．、Ｈ
ｕｍａｎａ Ｐｒｅｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、７：１０９−１２８、１９９１
． Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：３
６３−３９０、１９９２． Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌ．、５２：４５６−
４６７、１９７３． Ｇｒａｈａｍ ら、Ｊ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９−７２、１９７７．
Ｇｒｕｎｈａｕｓ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ、Ｓｅｍｉｎａｒ ｉｎ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、３：２３７−２５２、１９９２． Ｇｒｚｙｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０、５２７−５３５、１９９３． Ｈａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１
０１：１０９４−１０９９、１９８５． Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２、１９０５−１９１１
、１９９５． Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、ＤＮＡ ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、９：７１３−７２３
、１９９０． Ｈｅｒｚ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ、９０：２８１２−２８１６、１９９３． Ｈｅｘｈａｍ、Ｊ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０：４６１−
４７４、１９９６． Ｈｅｘｈａｍら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８９：７４７−７５１、１９９９． Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１０１：１０−１８、１９８０． Ｈｏｎｅｓｓ ａｎｄ Ｒｏｉｚｍａｎ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、１４：８−１９、
１９７４． Ｈｏｎｅｓｓ ａｎｄ Ｒｏｉｚｍａｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１６：１３０８−
１３２６、１９７５． Ｈｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：５２８−５３５、１９９０
． Ｉｎｏｕｙｅら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：３１０１−３１
０９、１９８５． Ｊｏｋｉ、ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、６：１５０７−１５１３、
１９９５． Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ、Ｃｅｌｌ、１３：１８１−１８８、１９７８
． Ｊｏｙｃｅ、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２１７−２４４、１９８９． Ｋａｇｅｙａｍａ、ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２ （５）：２３４５
−２３５１、１９８７． Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５−３７８、１９８９． Ｋａｒｌｓｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、５：２３７７−２３８５、１９８６． Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：３３６１−３３６４、１９９
１． Ｋａｕｌら、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３：９５７−９６２、１
９８１． Ｋｅａｒｎ、ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：７４８−７５５、１９９６． Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｏｏｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
８４：８７８８−８７９２、１９８７． Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７：７０−７３、１９８７． Ｋｏｔｉｎ ａｎｄ Ｂｅｒｎ、Ｖｉｒｏｌ．、１７０：４６０−４６７、１９
８９． Ｋｏｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：２２
１１−２２１５、１９９０． Ｋｏｔｉｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃ、１０：８３１−８３４、１９９１． ＫｙｔｅａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５
−１３２、１９８２． Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：９８８−９９０
、１９９３． Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ、１０１：１９５−２０２、１９９１． Ｌｉｄｏｒら、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ；１７７ （３）：５
７９−５８５、１９９７． Ｌｉｅｗら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３５０、１９８４． Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ、３５３：９０−９４、
１９９１． Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、３３：１５３−１５９、１９８３． Ｍａｎｚａｎｅｃら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６１：２６２４−２６、１９８７． Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１１２０−１１２４、１９８
８． Ｍａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、９４
（２６）：１４７０１−１４７０６、１９９７． Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２：３４１−７、１９８６． Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｈｏｆ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１６：５
８５−６１０、１９９０． Ｍｉｃｈｅｔｔｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６０：１７８６−９２、１
９９２． Ｍｉｚｕｋａｍｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２１７：１２４−１３０、１９９６． Ｍｏｒｅｉｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：３３−３９、１９９８
． Ｍｏｓｔｏｖら、Ｃｅｌｌ ４６ ：６１３−６２１、１９８６． Ｍｏｓｔｏｖら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：１１８１６−１１８２１
、１９８２． Ｍｏｓｔｏｖ、Ｋ．Ｅ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：６３−８
４、１９９４． Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖ
ｅｃｔｏｒｓ」：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
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【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

以下の図面は、本明細書の一部を構成し、そして本発明の特定の局面をさらに
実証するために包含される。本発明は、本明細書において提示される特定の実施
形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参酌することによ
ってよく理解され得る。The following drawings form part of the present specification and are included to further demonstrate certain aspects of the present invention. The present invention may be better understood with reference to one or more of these drawings, in combination with the detailed description of the specific embodiments presented herein.

【図１】 図１Ａ〜Ｄは、ＭＤＣＫ細胞上に発現されたｐＩｇＲに対するモノマーおよび
ダイマーＩｇＡ／ＩｇＧドメインスワップ変異抗体の結合を示す。図１Ａは、ヒ
ツジ抗ｐＩｇＲ（濃い線）抗血清または正常ヒツジ血清（破線）、続いて抗ヒツ
ジＩｇＧ ＦＩＴＣ結合体を用いたＭＤＣＫ細胞の染色である。図１Ｂは、野生
型ＩｇＡモノマー（薄い線）またはダイマー（濃い線）の、ＭＤＣＫ細胞上のｐ
ＩｇＲへの結合である。図１Ｃは、モノマー（薄い線）またはダイマー（濃い線
）として発現されるＶＧＡＡ変異体の、ＭＤＣＫ細胞上のｐＩｇＲへの結合であ
る。図１Ｄは、モノマー（薄い線）またはダイマー（濃い線）として発現される
ＶＦＡＡ変異体のＭＤＣＫ上のｐＩｇＲへの結合である。結合したＩｇＡまたは
ＩｇＡ／Ｇキメラ抗体を、ウサギ抗ヒトκ鎖ＦＩＴＣ結合体によって検出した。
ネガティブコントロールを破線として示す。1A-D show binding of monomeric and dimeric IgA / IgG domain swap mutant antibodies to pIgR expressed on MDCK cells. FIG. 1A is staining of MDCK cells with sheep anti-pIgR (dark line) antiserum or normal sheep serum (dashed line), followed by anti-sheep IgG FITC conjugate. FIG. 1B shows that wild-type IgA monomer (light line) or dimer (dark line) on pCK on MDCK cells.
Binding to IgR. FIG. 1C is the binding of the VGAA mutant expressed as a monomer (light line) or dimer (dark line) to pIgR on MDCK cells. FIG. 1D is the binding of the VFAA mutant expressed as a monomer (light line) or dimer (dark line) to pIgR on MDCK. Bound IgA or IgA / G chimeric antibodies were detected by rabbit anti-human kappa chain FITC conjugate.
Negative controls are shown as dashed lines.

【図２】 図２は、ヒトＣα３ドメインアミノ酸（配列番号２〜３３）を有するｐＩｇＲ
レセプター発現細胞に対する、ファージディスプレイペプチドライブラリーから
の推定ペプチド配列のアラインメントである。ＡまたはＭと称するペプチドは、
それぞれ、酸溶出画分および細胞会合画分由来である。ＩｇＡ１の番号付けは、
参考文献に従った（Ｐｕｔｎａｍら、１９７９）。FIG. 2 shows a pIgR having human Cα3 domain amino acids (SEQ ID NOs: 2-33).
FIG. 4 is an alignment of deduced peptide sequences from a phage display peptide library to receptor expressing cells. Peptides designated A or M are
They are derived from the acid-eluted fraction and the cell-associated fraction, respectively. The numbering of IgA1 is
References were followed (Putnam et al., 1979).

【図３】 図３Ａ〜Ｃは、いくつかのファージ由来のペプチドに対して相同性の領域にお
けるＩｇＧ１およびＩｇＡ１ ＣＨ３の配列と、ＩｇＧ１構造との比較である。
図３Ａは、ヒトＩｇＡ１およびＩｇＡ２の両方とのＡ１２ペプチドアラインメン
トである。ＩｇＧＳＴＲとは、ＩｇＧ１の構造的特徴を示す。ここで、＜は、下
り方向（すなわち、ヒンジからＣＨ３方向）において走るβ鎖を示し、そして−
は、ループまたは開放構造を示す（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒら、１９８１）。図
３Ｂは、いくつかの哺乳動物ＩｇＡ配列と、４つのヒトＩｇＧサブクラスとの比
較であり、ＩｇＡｈａｉｒｅｔｕにおける４０２〜４１０位のループにおいて存
在するさらなるＩｇＡ特異的アミノ酸を示す。ｈｕ＝ヒト、ｇｒ＝ゴリラ、ｍｕ
ｒ＝マウス、ｒａｂ＝ウサギ。図３Ｃは、Ｃα３およびＣγ３野生型配列および
Ｃγ３構造（ＩｇＧＳＴＲ）とアラインメントしたＩｇＡ１ Ｃα３変異体Ｌ１
、Ｌ２およびＬ３である。＝は、そのその変異体における配列同一性を示し、−
は、相同性を最大限とするためにＩｇＧ配列に挿入されたスペースを示す。そし
て、ＩｇＧＳＴＲは、上記図３ａに従って標識される。ＩｇＡ１およびＩｇＧ１
の番号付けは、それぞれ、Ｐｕｔｎａｍら、１９７９およびＤｅｉｓｅｎｈｏｆ
ｅｒら、１９８１に従う。FIGS. 3A-C are a comparison of the IgG1 and IgA1 CH3 sequences with the IgG1 structure in regions of homology to several phage-derived peptides.
FIG. 3A is an A12 peptide alignment with both human IgA1 and IgA2. IgGSTR refers to the structural features of IgG1. Where <indicates a β-strand running in the down direction (ie, from the hinge to the CH3 direction), and −
Indicates a loop or open structure (Deisenhofer et al., 1981). FIG. 3B is a comparison of some mammalian IgA sequences with four human IgG subclasses, showing additional IgA-specific amino acids present in the loop at positions 402-410 in IgAhairetu. hu = human, gr = gorilla, mu
r = mouse, rab = rabbit. FIG. 3C shows IgA1 Cα3 mutant L1 aligned with Cα3 and Cγ3 wild-type sequence and Cγ3 structure (IgGSTR).
, L2 and L3. = Indicates sequence identity in its variant,-
Indicates the space inserted into the IgG sequence to maximize homology. The IgGSTR is then labeled according to FIG. 3a above. IgA1 and IgG1
Are numbered in Putnam et al., 1979 and Deisenhof, respectively.
er et al., 1981.

【図４】 図４は、ＥＬＩＳＡによる、精製されたヒトｐＩｇＲにたいする、ＩｇＡ変異
体Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の結合である。ヒトｐＩｇＲの細胞外ドメインは、バキ
ュロウイルスにおける発現後に精製し、そして１０μｇ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレ
ートにコーティングした。キメラＩｇＡ１およびＩｇＡ１ Ｃα３変異体Ｌ１、
Ｌ２およびＬ３は、モノマー（ｍ）およびダイマー（ｄ）の両方の形態として、
キメラＩｇＧ１とともに発現され、精製され、そしてｐＩｇＲコーティングされ
たプレート上でインキュベートして、ｐＩｇＲへの結合能力を比較した。結合し
た抗体は、抗ヒトＫ軽鎖アルカリホスファターゼ結合体を用いて検出した。FIG. 4 shows the binding of IgA variants L1, L2 and L3 to purified human pIgR by ELISA. The extracellular domain of human pIgR was purified after expression in baculovirus and coated on ELISA plates at 10 μg / ml. Chimeric IgA1 and IgA1 Cα3 mutant L1,
L2 and L3 are in the form of both monomer (m) and dimer (d)
Expressed with chimeric IgG1, purified and incubated on pIgR coated plates to compare their ability to bind pIgR. Bound antibodies were detected using an anti-human K light chain alkaline phosphatase conjugate.

【図５】 図５は、プログラムＬＡＬＩＧＮを用いた、ヒトＩｇＡでのトランスサイトー
シスによって選択されたファージペプチドのアラインメントである。FIG. 5 is an alignment of phage peptides selected by transcytosis with human IgA using the program LALIGN.

【図６】 図６Ａ〜Ｃは、ＭＤＣＫトランスサイトーシス系において測定されたファージ
ペプチドの基底外側から先端への輸送である。５×１０¹⁰ファージを、極性化し
たＭＤＣＫまたはｐＩｇＲトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞のいずれかでコン
フルエントになった１．０μｍのポアインサートを含むウェルの基底外側培地へ
と添加した。トランスサイトーシスを４時間放置して生じさせた。先端の上清流
体を集め、そしてファージ力価を決定した。Ａ．ＳＡＭ、ＩＰ、およびＲＳＲ
ペプチドを評価した。ｐＩｇＲの非存在下でのＳＡＭペプチドでの非常に低いフ
ァージ力価レベルが認められる（棒グラフは、ｙ軸＝０よりもわずかに高い）。
Ｂ．ＭＦＶ、ＶＤＤ、およびＱＲＮ ペプチドを評価した。Ｃ．ＬＶＬおよびＷ
ＱＡ ペプチドを評価した。FIGS. 6A-C are basolateral to apical transport of phage peptides measured in the MDCK transcytosis system. 5 × 10 ¹⁰ phage were added to the basolateral media of wells containing 1.0 μm pore inserts that were confluent with either polarized MDCK or pIgR transfected MDCK cells. Transcytosis was allowed to occur for 4 hours. Tip supernatant fluid was collected and phage titers were determined. A. SAM, IP, and RSR
The peptides were evaluated. Very low phage titer levels are seen with the SAM peptide in the absence of pIgR (bar graph slightly higher than y-axis = 0).
B. MFV, VDD, and QRN peptides were evaluated. C. LVL and W
The QA peptide was evaluated.

【図７】 図７は、肝臓胆汁へ輸送される血液ファージペプチドの手順および反応側魯鈍
の決定である。FIG. 7 is a procedure of blood phage peptide transported to liver bile and determination of the reaction side.

【図８】 図８は、トランスフェクトされていないＭＤＣＫ細胞およびｐＩｇＲでトラン
スフェクトされたＭＤＣＫ細胞を通じたチオレドキシン融合タンパク質のトラン
スサイトーシスである。FIG. 8: Transcytosis of a thioredoxin fusion protein through untransfected MDCK cells and MDCK cells transfected with pIgR.

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成１４年１月１０日（２００２．１．１０）[Submission date] January 10, 2002 (2002.1.10)

【手続補正１】[Procedure amendment 1]

【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing

【補正対象項目名】全図[Correction target item name] All figures

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図１】 FIG.

【図２】 FIG. 2

【図３】 FIG. 3

【図４】 FIG. 4

【図５】 FIG. 5

【図６】 FIG. 6

【図７】 FIG. 7

【図８】 FIG. 8

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/12 Ａ６１Ｐ 1/16 1/14 1/18 1/16 11/00 1/18 11/06 11/00 13/12 11/06 29/00 13/12 31/00 29/00 31/04 31/00 31/10 31/04 31/14 31/10 31/16 31/14 31/18 31/16 31/20 31/18 31/22 31/20 33/02 31/22 35/00 33/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 35/00 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 14/705 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ディージーアイ バイオテクノロジーズ アメリカ合衆国 ニュージャージー 08818−0424， エディソン， ピー．オ ー． ボックス 424， タルマッジ ロ ード 40 (72)発明者 カプラ， ジェイ． ドナルド アメリカ合衆国 オクラホマ 73104， オクラホマ シティ， エヌイー 13ティ ーエイチ ストリート 825 (72)発明者 ホワイト， ケンドラ アメリカ合衆国 オクラホマ 73104， オクラホマ シティ， エヌイー 13ティ ーエイチ ストリート 825 (72)発明者 ヘックスハム， ジェイ． マーク アメリカ合衆国 ニュージャージー 07901， サミット， モリス アベニュ ー 566 (72)発明者 マンデッキ， ウロデック アメリカ合衆国 ニュージャージー 08818， エディソン， ピー．オー． ボックス 424 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA07 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA03 4C076 BB01 BB13 BB14 BB24 BB25 BB29 BB30 BB34 CC31 EE41 FF68 4C084 AA02 AA19 BA44 CA62 MA02 MA05 MA52 MA56 MA58 MA59 MA60 MA65 NA14 ZA661 ZA662 ZA731 ZA732 ZA811 ZA812 ZB111 ZB112 ZB261 ZB262 ZB311 ZB312 ZB331 ZB332 ZB351 ZB352 ZB371 ZB372 ZC611 ZC612 4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 CA40 DA01 DA30 DA50 DA83 DA89 EA28 EA29 FA50 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 1/12 A61P 1/16 1/14 1/18 1/16 11/00 1/18 11/06 11 / 00 13/12 11/06 29/00 13/12 31/00 29/00 31/04 31/00 31/10 31/04 31/14 31/10 31/16 31/14 31/18 31/16 31/20 31/18 31/22 31/20 33/02 31/22 35/00 33/02 C07K 14/47 35/00 14/705 C07K 14/47 19/00 14/705 C12N 15/00 ZNAA 19 / 00 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE) , OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL) , S Z, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP , KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (71) Applicant DG I Biotechnology United States New Jersey 08818-0424, Edison, P Oh. Box 424, Talmadge Road 40 (72) Inventor Coupler, Jay. Donald United States of America 73104, Oklahoma City, NE 13TH Street 825 (72) Inventor White, Kendra United States of America 73104, Oklahoma City, NE 13TH Street 825 (72) Inventor Hexham, J. Mark United States New Jersey 07901, Summit, Morris Avenue 566 (72) Inventor Mandeck, Ulodeck United States New Jersey 08818, Edison, P.M. Oh. Box 424 F term (reference) 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA07 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA03 4C076 BB01 BB13 BB14 BB24 BB25 BB29 BB30 BB34 CC31 EE41 FF68 4C084 AA02 AA19 BA44 CA62 MA02 MA05 ZA1 MA58 MA66 MA65 ZA812 ZB111 ZB112 ZB261 ZB262 ZB311 ZB312 ZB331 ZB332 ZB351 ZB352 ZB371 ZB372 ZC611 ZC612 4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 CA40 DA01 DA30 DA50 DA83 DA89 EA28 EA29 FA50 FA74

Claims (50)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ｐＩｇＲ結合ドメインを含む、１０残基と約５０残基との間
の、単離された、ペプチド。1. An isolated, between 10 and about 50 residues peptide comprising a pIgR binding domain. 【請求項２】 前記ペプチドが１０残基長である、請求項１に記載のペプチ
ド。2. The peptide of claim 1, wherein said peptide is 10 residues long. 【請求項３】 前記ペプチドが約１５残基長である、請求項１に記載のペプ
チド。3. The peptide of claim 1, wherein said peptide is about 15 residues in length. 【請求項４】 前記ペプチドが約２０残基長である、請求項１に記載のペプ
チド。4. The peptide of claim 1, wherein said peptide is about 20 residues in length. 【請求項５】 前記ペプチドが約２５残基長である、請求項１に記載のペプ
チド。5. The peptide of claim 1, wherein said peptide is about 25 residues in length. 【請求項６】 前記ペプチドが約３０残基長である、請求項１に記載のペプ
チド。6. The peptide of claim 1, wherein said peptide is about 30 residues in length. 【請求項７】 前記ペプチドが約３５残基長である、請求項１に記載のペプ
チド。7. The peptide of claim 1, wherein said peptide is about 35 residues in length. 【請求項８】 前記ペプチドが約４０残基長である、請求項１に記載のペプ
チド。8. The peptide of claim 1, wherein said peptide is about 40 residues in length. 【請求項９】 前記ペプチドが約４５残基長である、請求項１に記載のペプ
チド。9. The peptide of claim 1, wherein said peptide is about 45 residues in length. 【請求項１０】 前記ペプチドが約５０残基長である、請求項１に記載のペ
プチド。10. The peptide of claim 1, wherein said peptide is about 50 residues in length. 【請求項１１】 前記ペプチドが配列番号１の配列を含む、請求項１に記載
のペプチド。11. The peptide of claim 1, wherein said peptide comprises the sequence of SEQ ID NO: 1. 【請求項１２】 前記ペプチドが配列番号２〜３３からなる群より選択され
る配列を含む、請求項１に記載のペプチド。12. The peptide of claim 1, wherein said peptide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-33. 【請求項１３】 前記ペプチドが配列番号３４〜４１からなる群より選択さ
れる配列を含む、請求項１に記載のペプチド。13. The peptide of claim 1, wherein said peptide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 34-41. 【請求項１４】 さらに、前記ペプチドに結合した連結部分を含む、請求項
１に記載のペプチド。14. The peptide of claim 1, further comprising a linking moiety attached to said peptide. 【請求項１５】 前記連結部分がＳＭＴＰ、ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ス
ルホ−ＬＣ−ＳＤＰＤ、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＭＢ、スルホ−ＭＢ、Ｓ
ＩＡＢ、スルホ−ＳＩＡＢ、ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、ＥＤＣ／スルホ−Ｎ
Ｈ、およびＡＢＨからなる群より選択される、請求項１４に記載のペプチド。15. The connecting portion according to claim 1, wherein said connecting portion is SMTP, SPDP, LC-SPDP, sulfo-LC-SDPD, SMCC, sulfo-SMCC, MB, sulfo-MB, S
IAB, Sulfo-SIAB, SMPB, Sulfo-SMPB, EDC / Sulfo-N
15. The peptide of claim 14, wherein the peptide is selected from the group consisting of H, and ABH. 【請求項１６】 前記連結部分が、さらに選択された薬剤に付着している、
請求項１４に記載のペプチド。16. The connecting portion is further attached to a selected drug.
A peptide according to claim 14. 【請求項１７】 前記選択された薬剤がペプチド、ポリペプチド、オリゴヌ
クレオチド、ポリヌクレオチド、検出可能な標識、または薬物である、請求項１
６に記載のペプチド。17. The method of claim 1, wherein the selected agent is a peptide, polypeptide, oligonucleotide, polynucleotide, detectable label, or drug.
7. The peptide according to 6. 【請求項１８】 前記ポリペプチドが、酵素、抗体領域、タンパク質同士の
相互作用を媒介する領域、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、毒素、腫瘍サプ
レッサー、転写因子、またはアポトーシスのインデューサーである、請求項１７
に記載のペプチド。18. The polypeptide of claim 18, wherein the polypeptide is an enzyme, an antibody region, a region that mediates protein-protein interactions, a cytokine, a growth factor, a hormone, a toxin, a tumor suppressor, a transcription factor, or an inducer of apoptosis. 17
The peptide according to any one of the above. 【請求項１９】 前記ポリヌクレオチドがポリペプチド、単鎖抗体、アンチ
センス構築物またはリボザイムをコードする、請求項１７に記載のペプチド。19. The peptide of claim 17, wherein said polynucleotide encodes a polypeptide, single chain antibody, antisense construct or ribozyme. 【請求項２０】 前記検出可能な標識が、ローダミン、フルオレセイン、ま
たはＧＦＰである、請求項１７に記載のペプチド。20. The peptide of claim 17, wherein said detectable label is rhodamine, fluorescein, or GFP. 【請求項２１】 前記検出可能な標識が放射標識である、請求項１７に記載
のペプチド。21. The peptide of claim 17, wherein said detectable label is a radiolabel. 【請求項２２】 前記薬物が抗生物質、ＤＮＡ損傷剤、酵素インヒビター、
または代謝物である、請求項１７に記載のペプチド。22. The method according to claim 22, wherein the drug is an antibiotic, a DNA damaging agent, an enzyme inhibitor,
Or the peptide of claim 17, which is a metabolite. 【請求項２３】 さらに、前記ペプチドに連結された非ｐＩｇＲ標的化剤を
含む、請求項１に記載のペプチド。23. The peptide of claim 1, further comprising a non-pIgR targeting agent linked to said peptide. 【請求項２４】 前記非ｐＩｇＲ標的化剤が抗体の抗原結合ドメインである
、請求項２３に記載のペプチド。24. The peptide of claim 23, wherein said non-pIgR targeting agent is an antigen binding domain of an antibody. 【請求項２５】 前記非ｐＩｇＲ標的化剤がレセプターリガンドまたはリガ
ンド結合ドメインである、請求項２３に記載のペプチド。25. The peptide of claim 23, wherein said non-pIgR targeting agent is a receptor ligand or a ligand binding domain. 【請求項２６】 前記ペプチドが２つのｐＩｇＲ結合ドメインを含む、請求
項１に記載のペプチド。26. The peptide of claim 1, wherein said peptide comprises two pIgR binding domains. 【請求項２７】 前記ペプチドが連結部分をさらに含む、請求項２６に記載
のペプチド。27. The peptide of claim 26, wherein said peptide further comprises a linking moiety. 【請求項２８】 前記連結部分が選択された薬剤にさらに付着している、請
求項２７に記載のペプチド。28. The peptide of claim 27, wherein said linking moiety is further attached to a selected agent. 【請求項２９】 前記選択された薬剤が、ペプチド、ポリペプチド、オリゴ
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、検出可能な標識、または薬物である、請求項
２８に記載のペプチド。29. The peptide of claim 28, wherein said selected agent is a peptide, polypeptide, oligonucleotide, polynucleotide, detectable label, or drug. 【請求項３０】 前記ポリペプチドが酵素、抗体領域、タンパク質同士の相
互作用を媒介する領域、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、毒素、腫瘍サプレ
ッサー、転写因子、またはアポトーシスのインデューサーである、請求項２９に
記載のペプチド。30. The polypeptide of claim 29, wherein the polypeptide is an enzyme, an antibody region, a region that mediates protein-protein interactions, a cytokine, a growth factor, a hormone, a toxin, a tumor suppressor, a transcription factor, or an inducer of apoptosis. The peptide according to any one of the above. 【請求項３１】 前記ポリヌクレオチドが、ポリペプチド、単鎖抗体、アン
チセンス構築物、またはリボザイムである、請求項３０に記載のペプチド。31. The peptide of claim 30, wherein said polynucleotide is a polypeptide, a single chain antibody, an antisense construct, or a ribozyme. 【請求項３２】 非抗体ペプチドまたはポリペプチドに共有結合された、ｐ
ＩｇＲ結合ドメインを含む、融合タンパク質。32. A p-protein covalently linked to a non-antibody peptide or polypeptide.
A fusion protein comprising an IgR binding domain. 【請求項３３】 前記ドメインがＣα３ドメインである、請求項３２に記載
の融合タンパク質。33. The fusion protein of claim 32, wherein said domain is a Cα3 domain. 【請求項３４】 前記非抗体ペプチドまたはポリペプチドが、酵素、タンパ
ク質同士の相互作用を媒介する領域、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、毒素
、腫瘍サプレッサー、転写因子、およびアポトーシスのインデューサーからなる
群より選択される、請求項３２に記載の融合タンパク質。34. The non-antibody peptide or polypeptide is selected from the group consisting of enzymes, regions that mediate protein-protein interactions, cytokines, growth factors, hormones, toxins, tumor suppressors, transcription factors, and inducers of apoptosis. 33. The fusion protein of claim 32, which is selected. 【請求項３５】 非抗体ペプチドまたはポリペプチドの配列に共有結合され
た、ｐＩｇＲ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチ
ド。35. A polynucleotide encoding a fusion protein comprising a pIgR binding domain covalently linked to a non-antibody peptide or polypeptide sequence. 【請求項３６】 前記非抗体ペプチドまたはポリペプチドが、酵素、タンパ
ク質同士の相互作用を媒介する領域、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、毒素
、腫瘍サプレッサー、転写因子およびアポトーシスのインデューサーからなる群
より選択される、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。36. The non-antibody peptide or polypeptide is selected from the group consisting of enzymes, regions that mediate protein-protein interactions, cytokines, growth factors, hormones, toxins, tumor suppressors, transcription factors, and inducers of apoptosis. 36. The polynucleotide of claim 35, wherein said polynucleotide is administered. 【請求項３７】 選択された薬剤を粘膜上皮に対して標的化するための方法
であって、該方法は以下の工程： （ｉ）該選択された薬剤、およびｐＩｇＲ結合ドメインを含む１０残基と約５
０残基との間の単離されたペプチドを含む複合体を提供する工程；ならびに （ｉｉ）標的化された該複合体を哺乳動物に投与する工程、 を包含し、該複合体がｐＩｇＲを発現する細胞に結合し、該細胞に取り込まれ、
そして該粘膜上皮へと輸送される、 方法。37. A method for targeting a selected drug to mucosal epithelium, comprising: (i) the selected drug, and 10 residues comprising a pIgR binding domain. And about 5
Providing a complex comprising the isolated peptide between 0 residues; and (ii) administering the targeted complex to a mammal, the complex comprising pIgR. Binds to and is taken up by the expressing cell,
And transported to the mucosal epithelium. 【請求項３８】 前記投与する工程が、経口、吸入、経眼、経鼻、経膣、経
直腸、静脈内、皮下、筋肉内、または動脈内の経路を介する、請求項３７に記載
の方法。38. The method of claim 37, wherein said administering is via an oral, inhalation, ocular, nasal, vaginal, rectal, intravenous, subcutaneous, intramuscular, or intraarterial route. . 【請求項３９】 前記複合体が、非ｐＩｇＲ標的化剤をさらに含む、請求項
３７に記載の方法。39. The method of claim 37, wherein said complex further comprises a non-pIgR targeting agent. 【請求項４０】 非抗体ペプチドまたはポリペプチドを、粘膜上皮に対して
標的化するための方法であって、該方法は以下の工程： （ｉ）該非抗体ペプチドまたはポリペプチドに共有結合した、ｐＩｇＲ結合ド
メインを含む融合タンパク質を提供する工程；ならびに （ｉｉ）該標的化された複合体を哺乳動物に投与する工程、 を包含し、該標的化された複合体は、ｐＩｇＲを発現する細胞に結合し、該細胞
に取り込まれ、そして該粘膜上皮へと輸送される、 方法。40. A method for targeting a non-antibody peptide or polypeptide to mucosal epithelium comprising the following steps: (i) pIgR covalently linked to said non-antibody peptide or polypeptide. Providing a fusion protein comprising a binding domain; and (ii) administering the targeted complex to a mammal, wherein the targeted complex binds to cells expressing pIgR. And is taken up by the cells and transported to the mucosal epithelium. 【請求項４１】 前記投与が、経口、経眼、経鼻、経膣、頸直腸、静脈内ま
たは動脈内の経路を介する、請求項４０に記載の方法。41. The method of claim 40, wherein said administering is via an oral, ocular, nasal, vaginal, cervical, intravenous or intraarterial route. 【請求項４２】 前記融合タンパク質が、２つのｐＩｇＲ結合ドメインを含
む、請求項４０に記載の方法。42. The method of claim 40, wherein said fusion protein comprises two pIgR binding domains. 【請求項４３】 選択された薬剤を細胞に送達する方法であって、該方法は
以下の工程： （ｉ）該選択された薬剤、およびｐＩｇＲ結合ドメインを含む１０残基と約５
０残基との間の単離されたペプチドを含む複合体を提供する工程；ならびに （ｉｉ）ｐＩｇＲを発現する細胞と、該標的化された複合体を接触させる工程
、 を包含する、方法。43. A method of delivering a selected agent to a cell, comprising the steps of: (i) selecting the agent and 10 residues comprising the pIgR binding domain and about 5 residues;
Providing a complex comprising the isolated peptide between zero residues; and (ii) contacting the targeted complex with a cell expressing pIgR. 【請求項４４】 前記工程（ｉ）の前に、前記細胞において作動可能なプロ
モーターの制御下で、ｐＩｇＲをコードする発現構築物を用いて該細胞を形質転
換する工程を包含する、請求項４３に記載の方法。44. The method according to claim 43, further comprising, before the step (i), transforming the cell with an expression construct encoding pIgR under the control of a promoter operable in the cell. The described method. 【請求項４５】 前記複合体が、非ｐＩｇＲ標的化薬剤をさらに含む、請求
項４３に記載の方法。45. The method of claim 43, wherein said conjugate further comprises a non-pIgR targeting agent. 【請求項４６】 前記複合体が２つのｐＩｇＲ結合ドメインを含む、請求項
４３に記載の方法。46. The method of claim 43, wherein said complex comprises two pIgR binding domains. 【請求項４７】 非抗体ペプチドまたはポリペプチドを細胞へと送達する方
法であって、該方法は以下の工程： （ｉ）該非抗体ペプチドまたはポリペプチドに共有結合された、ｐＩｇＲ結合
ドメインを含む融合タンパク質を提供する工程；ならびに （ｉｉ）該融合タンパク質を、ｐＩｇＲを発現する細胞に接触させる工程、
を包含する、方法。47. A method for delivering a non-antibody peptide or polypeptide to a cell, comprising: (i) a fusion comprising a pIgR binding domain covalently linked to the non-antibody peptide or polypeptide. Providing a protein; and (ii) contacting the fusion protein with a cell expressing pIgR;
A method comprising: 【請求項４８】 前記工程（ｉ）の前に、前記細胞において作動可能なプロ
モーターの制御下で、ｐＩｇＲをコードする発現構築物を用いて該細胞を形質転
換する工程を包含する、請求項４７に記載の方法。48. The method according to claim 47, further comprising, before the step (i), transforming the cell with an expression construct encoding pIgR under the control of a promoter operable in the cell. The described method. 【請求項４９】 前記複合体は、非ｐＩｇＲ標的化剤をさらに含む、請求項
４７に記載の方法。49. The method of claim 47, wherein said conjugate further comprises a non-pIgR targeting agent. 【請求項５０】 前記融合タンパク質が２つのｐＩｇＲ結合ドメインを含む
、請求項４７に記載の方法。50. The method of claim 47, wherein said fusion protein comprises two pIgR binding domains.