JP2002538826A - カエノラブジチス・エレガンス由来の多飽和脂肪酸（ｐｕｆａ）エロンガーゼ - Google Patents

カエノラブジチス・エレガンス由来の多飽和脂肪酸（ｐｕｆａ）エロンガーゼ

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JP2002538826A JP2000605748A JP2000605748A JP2002538826A JP 2002538826 A JP2002538826 A JP 2002538826A JP 2000605748 A JP2000605748 A JP 2000605748A JP 2000605748 A JP2000605748 A JP 2000605748A JP 2002538826 A JP2002538826 A JP 2002538826A
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エー． ネイピア，ジョナサン
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Abstract

(57)【要約】 機能性の長鎖多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）エロンガーゼを含む単離されたポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）エロンガーゼに関する。さらに明確に
は、本発明はＰＵＦＡエロンガーゼをコードしているシー．エレガンス（C.eleg
ans）由来のＤＮＡ配列に関する。
【０００２】 不飽和脂肪酸は正常な細胞機能に必要な必須の成分であり、膜の流動性からシ
グナル分子としての作用におよぶ数多くの役割に深くかかわっている（Gill, Ｉ
Ｖalivety, R.（1997）.Trends Biotechnol. 15, 401 - 409；Broun, P. ら、（
1999）Ann. Rev. Nutr. 19, 197 - 216）。特に、多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）
として知られる脂肪酸の種類は、薬剤および栄養剤化合物として多大な興味を引
いてきた（Broun上記；Horrobin, D.F.（1990）Reviews in Contemp Pharmacoth
erpy 1, 1 - 45）。
【０００３】 ＰＵＦＡ、すなわち１８炭素またはそれより長く、かつ二つまたはそれより多
い二重結合を含む脂肪酸の合成は、種々の生物において特異的な脂肪酸エロンガ
ーゼにより触媒されると考えられている。このエロンガーゼは１８炭素ＰＵＦＡ
への２個の炭素の付加を成し、結果として２０炭素脂肪酸を生じる。この反応の
実例は、γ−リノレン酸（ＧＬＡ；１８：３Δ6,9,12）のジホモ−γ−リノレン
酸（ＤＨＧＬＡ；２０：３Δ8,11,14）への伸長であり、ここでは３価不飽和１
８炭素脂肪酸が２個の炭素の付加によって伸長されて、３価不飽和２０炭素脂肪
酸を生じる。鎖長が１８炭素を超える長鎖ＰＵＦＡの製造には大いに興味が持た
れており、たとえばアラキドン酸およびエイコサペンタエン酸（eicosapentaeno
ic acid）については、この酵素の同定は学術上ならびに商業上の双方の興味が
持たれている。
【０００４】 現在、ＰＵＦＡエロンガーゼをコードする遺伝子が同定されたという実例はな
いが、脂質合成の他の面に深くかかわっていると考えられる酵素をコードしてい
る多数の遺伝子が同定されている。たとえば、シロイヌナズナの遺伝子（ＦＡＥ
１）は、非常に長鎖である１価不飽和脂肪酸（エルカ酸；２０：１Δ11など）の
合成に必要とされることが示されている（James, D.W.ら、（1995）Plant Cell
7, 309 - 319）。しかしながら、この酵素は２価および３価の不飽和１８炭素脂
肪酸、たとえばリノール酸、１８：２Δ9,12またはα−リノール酸、１８：３Δ 9, 12,15 を、各々基質として認識せず、したがって長鎖のＰＵＦＡの合成には深
くかかわっていないことは明らかである（MillerおよびKunst（1997）Plant Jou
rnal 12, 121 - 131）。このことはそれ自体驚くべきことではないが、それは植
物界では、ニセツリガネゴケ（Physcomicotrella patens）（Girkeら、（1998
）, Plant J. 15：39 - 48）といったセン類などのごく少数の下等な植物種のみ
が長鎖のＰＵＦＡの合成が可能であり、したがってシロイヌナズナがこのような
酵素を含むことは期待されないからである（Napierら、（1997）, Biochem J. 3
28：717 - 720；Napierら、（1999）Trends in Plant Sci 4, 2 - 5）。
【０００５】 ＰＵＦＡ製造の一般経路を表している概要図を図１に示す。哺乳類の伸長シス
テム（とりわけ肝臓のミクロソームから）における生化学的な特徴は、哺乳類の
エロンガーゼが縮合酵素、β−ケトレダクターゼ、デヒドラーゼ、およびエノイ
ルレダクターゼで構成される４つのサブユニットから成ることであるということ
が示されている（Cinti, D.L.,ら（1992）Prog. Lipid Res. 31, 1 - 15に総説
）。シロイヌナズナのＦＡＥ１遺伝子産物は、５６ｋＤａのポリペプチドをコー
ドしたものであり、それはカルコンシンターゼおよびスチルベンシンターゼとい
った縮合酵素に対しごくわずかな相同性を示す（James, D.W. 上記）。ＦＡＥ１
は正常には種子組織においてのみ発現されるが、非種子組織における（または異
種のものとしては酵母における）異所的な発現は、ＦＡＥ１がエルカ酸の合成を
導くことができることを示した（Millar, A.A., Kunst, L.（1997）Plant J. 12
, 121 - 131）。
【０００６】 三つの脂肪酸エロンガーゼの活性は、パン酵母（S. cerevisiae）から特徴づ
けられてきた。重ねて、この微生物はＰＵＦＡを合成せず、それゆえにＰＵＦＡ
エロンガーゼをコードしている遺伝子を含んでいない。１つの遺伝子ＥＬＯ１は
、１４炭素鎖（すなわち中鎖）飽和脂肪酸の伸長に欠損のある突然変異体を単離
するためのスクリーニングを基に同定された（TokeおよびMartin（1996）J. Bio
l Chem 271, 18413 - 18422）。ｅｌｏ１突然変異体の相補性は生存力を回復さ
せ、その結果ＥＬＯ１遺伝子産物が１４：０脂肪酸の１６：０脂肪酸への特異的
な伸長を成すポリペプチドをコードするものであることが示された。
【０００７】 また二つの関連した遺伝子がパン酵母のゲノムに検出されており、それらの機
能は破壊により決定された。これらの二つの遺伝子は、後にＥＬＯ２およびＥＬ
Ｏ３と名付けられたが、スフィンゴ脂質分子に見られる非常に長鎖の飽和脂肪酸
の伸長に深く関与していることが示された（Ohら、（1997）, J. Biol Chem 27
2, 17376 - 17384）。特に、ＥＬＯ２は２４炭素までの脂肪酸の伸長に必要であ
り、ＥＬＯ３は２４炭素脂肪酸の２６炭素への伸長に必要であった。しかしなが
ら、いずれの遺伝子も生存力には必須ではなかった。これら三つの脂肪酸エロン
ガーゼの検査により、ポリペプチド配列の中心へ向かう保存的「ヒスチジンボッ
クス（histidine box）」モチーフ（Shanklinら、（1994）Biochemistry, 33, 1
2787 - 12794）（Ｈｉｓ−Ｘ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ、Ｘはアミノ酸である）の存
在を明らかにした。重要なことに、酵母のエロンガーゼ（ＥＬＯ１、２、３）と
植物の非常に長鎖の１価不飽和脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ１）との間に相同性
は検出できなかった（Ohら、上記）。
【０００８】 ＰＵＦＡエロンガーゼをコードしている遺伝子を同定するためには、ＰＵＦＡ
の合成が充分に実証されている系を研究することが必要である。この良い実例が
モデル動物系シー．エレガンス（C. elegans）であり、小型の非寄生蠕虫である
（Tanakaら、（1996）, Lipids 31, 1173 - 1178）。シー．エレガンスはほとん
どの他の動物と同様に、また高等植物とは対照的に、エイコサノイドとして知ら
れる前駆体としてのアラキドン酸（ＡＡ；２０；４Δ5,8,11,14）などのＰＵＦ
Ａを合成し、そしてそれはプロスタグランジンおよびロイコトリエンといった化
合物の前駆体として利用される。（Horrobin,（1990）, Reviews in Contemp Ph
armacotherpy；1 : 1 - 45）。シー．エレガンスにおけるＡＡおよび他の長鎖多
不飽和脂肪酸の存在は、充分実証されている（Tanakaら、（1996）, Lipids 31,
1173 - 1178）。線虫類のゲノムの完全な配列は、現在公に入手することができ
る（The C. elegans consortium, 1998, Science 282, 2012 - 2018 : データベ
ースhttp://www.sanger.ac.uk/Projects/C_elegans/blast_server.shtml）。
【０００９】 本発明の目的は、単離されたＰＵＦＡエロンガーゼを提供することである。
【００１０】 本発明者らは、上述のシー．エレガンズのゲノム配列を適当なサーチストリン
グ（search strings）と共に用いることにより、ＰＵＦＡエロンガーゼをコード
している８つの関連した推定されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を
同定した。脂肪酸エロンガーゼ活性をもつポリペプチドをコードしていると思わ
れる多数の（ＯＲＦ）を同定するため、いくつかの異なる検索基準が用いられた
。これらのＯＲＦは次に、酵母における異種性の発現により機能的に特徴づけら
れ、ＰＵＦＡエロンガーゼの同定が可能となるようにした。
【００１１】 したがって、本発明の第１の態様は、機能性の長鎖多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ
）エロンガーゼを含む単離されたポリペプチド、すなわち１８炭素ＰＵＦＡの鎖
長を２０炭素長に延長する機能を有するポリペプチドを提供する。このポリペプ
チドは動物におけるＰＵＦＡのレベルを上昇させるべく用いることが可能であり
、それによりＰＵＦＡの便利な供給源を提供する。
【００１２】 当該ポリペプチドは真核生物に由来してよい。
【００１３】 当該ポリペプチドは配列番号１５に示されたアミノ酸の少なくとも一部か、ま
たはその変異体を含んでよい。
【００１４】 本願の目的のためには、ある配列に関係した「変異体」という用語は、一つま
たはそれより多いアミノ酸残基の挿入または欠失か、あるいは一つまたはそれよ
り多いアミノ酸残基の、同様な性質を有しているアミノ酸残基による置換、たと
えばある極性アミノ酸残基の、別の極性アミノ酸残基を用いた置換、あるいはあ
る非極性アミノ酸残基の、別の非極性アミノ酸残基を用いた置換、を通して当該
配列から由来するタンパク質またはポリペプチドを意味する。いずれの場合にも
、変異体は本文に定義されたようなエロンガーゼ機能を有していなければならな
い。
【００１５】 本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様によるポリペプチドに対して少な
くとも６０％の相同性を有しているポリペプチドを提供する。当該ポリペプチド
は、本発明の第一の態様によるポリペプチドに対し、少なくとも８０％か、また
は９０％もの、あるいはそれよりも高い相同性を有してもよい。
【００１６】 本発明のいずれかの態様によるポリペプチドは、小胞体（ＥＲ）の保持を担う
配列モチーフを含んでよい。このことは、当該ポリペプチドが細胞のＥＲに特異
的に局在化または標的化されることを可能にする。
【００１７】 当該ポリペプチドはまたパルミトレイン酸（ＰＡ；１６：１Δ9）の、バクセ
ン酸（vacceric acid)（ＶＡ；１８：１Δ11）への伸長を可能にしてもよい。し
たがって、当該ポリペプチドはまたΔ9−１価不飽和１６炭素脂肪酸を伸長する
こともできる。
【００１８】 好ましくは、当該ポリペプチドは動物由来であり、さらに好ましくは当該動物
は蠕虫などの無脊椎動物である。当該動物が蠕虫である場合には、それは好まし
くはシー．エレガンスである。別法として、当該動物は脊椎動物であり、好まし
くはヒト、ラット、または、マウスなどの哺乳類である。
【００１９】 本発明の第３の態様は、単離されたＤＮＡ配列、好ましくは本発明の第１また
は第２の態様のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を提供する。当該ＤＮＡ
配列はトランスジェニック生物を操作するべく用いられてよい。
【００２０】 好ましくは、当該ＤＮＡ配列は配列番号７に示された配列か、または、たとえ
ば塩基の置換、欠失、および／または付加による当該配列の変異体を含む。
【００２１】 本発明の第４の態様は、本発明の第１または第２の態様によるポリペプチドを
発現するべく操作されたトランスジェニック動物などの、操作された生物を提供
する。操作された生物は、増進されたレベル(level)で当該ポリペプチドを発現
するべく操作されてよく、それにより、使用されねばならない生物の数が減じら
れるため、ポリペプチドの供給を減じられたコストにて提供する。
【００２２】 好ましくは、当該操作された生物はラット、マウス、またはサルなどの哺乳類
である。
【００２３】 本発明の第５の態様は、本発明の第１または第２の態様によるポリペプチドの
製造のための合成経路を含む操作された生物を提供する。このことは、当該経路
によるＰＵＦＡの製造について、生物によるさらに充分な制御を可能にするとい
う利点をもつ。
【００２４】 当該経路はΔ5−脂肪酸デサチュラーゼ、および／またはΔ6−脂肪酸デサチュ
ラーゼを含んでよい。
【００２５】 本発明の第４または第５の態様による操作された生物は、酵母などより下等な
真核生物でよい。一方、トランスジェニック生物は魚でもよい。
【００２６】 本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様によるポリペプチドを発現するべ
く操作されたトランスジェニック植物を提供する。
【００２７】 本発明の第７の態様は、本発明の第３の態様によるＤＮＡ配列を含むトランス
ジェニック植物を提供する。
【００２８】 本発明の第８の態様は、本発明の第１または第２の態様によるポリペプチドに
より触媒されるエロンガーゼ反応を実行することを含むＰＵＦＡの製造法を提供
する。
【００２９】 当該ＰＵＦＡは、ジホモ−γ−リノール酸（２０：３Δ8,11,14）、アラキド
ン酸（２０：４Δ5,8,11,14）、エイコサペンタン酸（２０：５Δ5,8,11,14,17
）、ドコサトリエン酸（２２：３Δ3,16,19）、ドコサテトラエン酸（２２：４
Δ7,10,13,16）、ドコサペンタエン酸（２２：５Δ7,10,13,16,19）、またはド
コサヘキサエン酸（２２：６Δ4,7,10,13,16,19）でよい。
【００３０】 ＰＵＦＡは少なくとも４つの二重結合をもつ２４炭素脂肪酸でもよい。
【００３１】 本発明の第９の態様は、本発明の第８の態様による方法によって製造されるＰ
ＵＦＡを提供する。
【００３２】 ＰＵＦＡは食料品、補助食品、または薬剤組成物に使用されてよい。
【００３３】 本発明の第１０の態様は、本発明の第５の態様によるＰＵＦＡを含む食料品を
提供する。当該食料品は動物に与えることが可能である。
【００３４】 本発明の第１１の態様は、本発明の第５の態様によるＰＵＦＡを含む補助食品
を提供する。当該補助食品は、動物にそのＰＵＦＡレベルを増大するべく供給さ
れることが可能である。
【００３５】 本発明の第１２の態様は、本発明の第１または第２の態様によるポリペプチド
かまたは本発明の第９の態様によるＰＵＦＡを含む薬剤組成物を提供する。
【００３６】 好ましくは、当該薬剤組成物は薬剤学上許容される希釈剤、担体、賦形剤、ま
たは増量剤を含む。このことは当該組成物が、問題となっている薬剤学的適用に
最も適した形状で供給されることを可能にする。たとえば、局所適用は好ましく
はクリームまたはローションであろうが、もし当該組成物が摂取されるものであ
れば、異なる形状がより適しているであろう。
【００３７】 本発明の第１３の態様は、本発明の第３の態様によるＤＮＡ配列か、本発明の
第１０の態様による食料品か、本発明の第１１の態様による補助食品か、本発明
の第１２の態様による薬剤組成物か、または本発明の第９の態様によるＰＵＦＡ
を動物または植物に供給することを含む、哺乳類などの動物かまたは植物の治療
法を提供する。
【００３８】 好ましくは、当該動物はヒトである。 本発明は、配列番号１〜１６および図２〜１１を、単なる例として参照しなが
らここでさらに説明されるであろう： 配列番号１〜８は、ＰＵＦＡエロンガーゼ、ＡからHを各々コードしている推
定されるＯＲＦを示しており； 配列番号９〜１６は、各々配列番号１〜８の推定されるＯＲＦの、推測される
アミノ酸配列を示しており； 図２〜９は、各ＰＵＦＡエロンガーゼＡ〜Ｈの各々についての疎水性プロット
を示している。 図１０は、シー．エレガンスのＯＲＦ Ｆ５６Ｈ１１．４（Ｚ６８７４９）を
、関連する配列と比較したアミノ酸配列の整列を示す。 図１１は、形質転換された酵母からの脂肪酸メチルエステルのクロマトグラム
を示す。
【００３９】 （全体的な戦略についての序） 最初シー．エレガンスのデータベースは、酵母のＥＬＯ遺伝子（ＥＬＯ２およ
びＥＬＯ３）に対して低いレベルの相同性を示した配列について、ＴＢＬＡＳＴ
Ｎプログラムを用いて検索された。同様の検索は、３つのＥＬＯポリペプチド配
列の間に保存されていたＥＬＯ遺伝子の短い（２０〜５０アミノ酸）ストレッチ
(stretches)を用いて行なわれた。この方法により同定されたシー．エレガンス
の配列は、次にそれら自身が検索プローブとして、初めに酵母の配列を用いた検
索において同定されなかった関連するシー．エレガンスの遺伝子を同定するべく
用いられた。このことは、酵母のＥＬＯ遺伝子と蠕虫の遺伝子との間の相同性の
レベルが常に低いことから必要であった（後出のＢＬＡＳＴスコア参照）。蠕虫
の配列についてさらに高感度の検索を可能にするため、ＢＬＡＳＴプログラムを
用いた検索の主要な欠点を巧みに回避するべく新規なアプローチが適用された、
すなわち検索ストリング（すなわち入力検索モチーフ）は作動するためのアルゴ
リズムについて１５文字より長くなければならないということである。したがっ
て、短いモチーフ（ヒスチジンボックスのような）を検索することを望んでいた
なら、ＢＬＡＳＴプログラムではこれを行なうことができなかったであろう。シ
ー．エレガンスゲノムに存在するすべての予測されるＯＲＦの完全なリストは、
Ｗｏｒｍｐｅｐと呼ばれるデータベースとして存在しており、それはＳａｎｇｅ
ｒ ＷＷＷ サイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒ
ｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｅｌｅｇａｎｓ／ｗｅｂａｃｅ＿ｆｒｏｎｔ＿ｅｎｄ．ｓｈ
ｔｍｌ）から無料で入手できる。Ｗｏｒｍｐｅｐの最新バージョンは、ペンティ
アム（登録商標）（Ｐｅｎｔｉｕｍ）ＰＣのハードディスクへダウンロードされ 、マイクロソフト・ワード（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄ）６文書として再フ ォーマットされ、結果として３，５００頁の文書を得た。これは次いで、検索モ チーフに「ワイルドカード」文字を導入することも可能なワード６の「Ｓｅａｒ ｃｈ ＆ Ｒｅｐｌａｃｅ（検索および置き換え）」機能を用いて検索された。 したがって、たとえば、このモチーフを含むＷｏｒｍｐｅｐの３，５００頁の文 書の中に存在する予測された蠕虫のＯＲＦを同定する短いテキストストリングＨ ＰＧＧについて検索することもできれば、またその代わりにＨＰＧＸ（Ｘはワイ ルドカード文字）を用いて検索することもできる。明らかに、３，５００頁の文 書についてのこのような（手作業の）検索は、非常に時間がかかり、かつ過酷で あり、また同定されたＯＲＦの各々およびすべてについての視覚による検査も必 要とする。たとえば、ＨＸＸＨＨのようなモチーフを用いた検索は、３００を超 える異なるＯＲＦを同定する。しかしながら、いくつかの短いサーチストリング （以下に概説されるような）を用いることにより、またこれらを推定上のエロン ガーゼ酵素を同定するための他の方法と結び付けることにより、いくつかのＯＲ Ｆの候補が同定されている。
【００４０】 （ＦＡＥ１ポリペプチド配列を用いたデータベース検索） ネガティブコントロールとして、ＦＡＥ１遺伝子配列がＰＵＦＡエロンガーゼ
をコードするシー．エレガンスの配列の同定において有用な検索配列を提供する
ことはないことを証明するため、 関連する遺伝子または発現された配列転写物
（ＥＳＴ）を同定するべく、シロイヌナズナのＦＡＥ１ポリペプチド配列を用い
てＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎ
ｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｓｅａｒｃｈ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）が検索された。
ＧｅｎＢａｎｋはＮＩＨの遺伝子配列データベースであり、公に入手できるすべ
てのＤＮＡ配列の注釈付のコレクションである（Nucleic Acid Research（1998
）26, 1 - 7）。１９９８年１２月現在で、３，０４４，０００配列中の約２，
１６２，０００，０００塩基が記録されている。検索はＢＬＡＳＴ２（Ｂａｓｉ
ｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）アルゴリズム
（Altschulら、（1990）J. Mol Biol 215, 403, 410 ）を用いて行なわれた。
いくつかの植物のＯＲＦおよびＥＳＴが関連していると報告されたが、この検索
では動物の配列は何ら同定されず、ＦＡＥ１がＰＵＦＡエロンガーゼの検索テン
プレートとして適切な候補ではなさそうであるという観察が確証された。
【００４１】 （酵母のＥＬＯ配列を用いたデータベース検索） 酵母の３つの脂肪酸エロンガーゼ配列（ＥＬＯ １、２、３）をプローブとし
て用いて、シー．エレガンスのゲノム配列データベースを形成しているシー．エ
レガンス由来のコスミド配列のＤＮＡにおけるいくつかの推定されるＯＲＦが同
定された。さらに、Ｗｏｒｍｐｅｐデータベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｓａｎ
ｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ．／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｅｓ／ｗｏｒｍｐｅｐ）のダウン
ロードされたコピーについての、ＭＳワード６の手作業による検索ストリングを
用いた広範囲にわたる、かつ時間のかかる検索は、推定されるヒスチジンボック
スを含んだいくつかのシー．エレガンスＯＲＦを同定した。Ｗｏｒｍｐｅｐはシ
ー．エレガンスゲノム配列（シーケンス）プロジェクトから予測されるタンパク
質を含んでおり、それは英国ケンブリッジのサンガーセンター（Sanger Center
）と、合衆国セントルイスのゲノムシーケンシングセンター（Genom Sequencing
Center）とにより共同で行なわれている。現在のＷｏｍｐｅｐデータベース、
Ｗｏｒｍｐｅｐ１６は、１６，３３２のタンパク質配列（７，１２０，１１５残
基）を含む。使用されたサーチストリングは、［ＨＸＸＨＨ］、［ＨＸＸＸＨＨ
］、［ＱＸＸＨＨ］、および［ＹＨＨ］を含む。二つの異なる検索からのデータ
の比較は、候補のエロンガーゼとして少数（＜１０）の推定されるＯＲＦを示し
た。ヒスチジンボックスモチーフは、配列番号９〜１６に肉太活字で示されてい
る。
【００４２】 （疎水性プロット分析） 脂肪酸エロンガーゼ反応は内膜系の細胞質ゾル表面において行なわれるため（
TokeおよびMartin（1996）、上記；Ohら、（1997）、上記）、推定されるシー．
エレガンスのＯＲＦは、kyteおよびDoolittleの疎水性プロットにより（J. Mol
Biol.（1982）, 157, 105 - 132）、膜にかかっている潜在性のドメインについ
て調査された。これは膜にかかっている潜在性のドメインをもついくつかのＯＲ
Ｆを明らかにし、またいくつかの同定されたＯＲＦの二次構造にある程度の類似
性を示した。
【００４３】 （ＥＲ保持シグナル配列についてのスクリーニング） 本発明者らは、脂肪酸エロンガーゼが小胞体（ＥＲ）の膜タンパク質であると
予想されることから、それらが「ＥＲ−保持」を担うペプチドシグナルをもつこ
とが期待されると仮定した。ＥＲの膜タンパク質の場合には、このシグナルはし
ばしばＣ−末端モチーフ［Ｋ−Ｋ−Ｘ2.3−Ｓｔｏｐ］か、またはそれらの類似
した変異体の形状をとる（Jacksonら、（1990）, EMBO J. 9, 3153 ？ 3162）。
シー．エレガンスの推定上のエロンガーゼのさらなる配列分析は、４つのＯＲＦ
（Ｆ４１Ｈ１０．７、Ｆ４１Ｈ１０．８、Ｆ５６Ｈ１１．４、Ｙ５３Ｆ４Ｂ．ｃ
）がこの検索パターンに正確に合致したＣ−末端モチーフをもつこと、およびさ
らなる２つのＯＲＦ（Ｆ１１Ｅ６．５、Ｃ４０Ｈ１．４）が関連した配列をもつ
ことを明らかにした。これらの配列モチーフは、配列番号９〜１３、１５、およ
び１６において下線が付されている。
【００４４】 （染色体地図作成） 本発明者らは先に、ＰＵＦＡ合成に深くかかわっているシー．エレガンス遺伝
子がタンデムに存在してよいことを観察しているため（たとえば、各々ＡＡおよ
びＧＬＡ合成に必要なΔ５およびΔ６デサチュラーゼは、第ＩＶ染色体上で＜１
ｋＢ離れている（Michaelsonら、（1998）, FEBS Letts 439, 215 - 218））、
推定されるシー．エレガンスのエロンガーゼのＯＲＦの位置が、サンガーセンタ
ーのＷｅｂＡｃｅ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓ
ａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｅｌｅｇａｎｓ／ｗｅｂａｃ
ｅ＿ｆｒｏｎｔ＿ｅｎｄ．ｓｈｔｍｌ）を用いて決定された。これは、２対の推
定されるのエロンガーゼが、シー．エレガンスの第ＩＶ染色体上で互いに密に近
接していたことを示している。
【００４５】 Ｆ４１Ｈ１０．７およびＦ４１Ｈ１０．８は、第ＩＶ染色体上で約１０Ｋｂ離
れて同定され、またＦ５６Ｈ１１．３およびＦ５６Ｈ１１．４は第ＩＶ染色体上
で約２Ｋｂ離れて同定された。
【００４６】 （推定されるシー．エレガンス脂肪酸エロンガーゼ） シー．エレガンスゲノムにおける推定されるＯＲＦの位置は以下に、すなわち
染色体番号、およびセンチモルガンでの地図上の位置が、ＧｅｎＢａｎｋデータ
ベース受託番号と共に示されている。
【００４７】 用いられた名称は、サンガーセンターのシー．エレガンスデータベースで使用
されているものと同一であり、すなわちＯＲＦＣ４０Ｈ１．４はコスミドＣ４０
Ｈ１上の配列４をコードしていると予測される。
【００４８】
【表１】
【００４９】 （シー．エレガンスの推定されるエロンガーゼＯＲＦの酵母遺伝子との比較
：） 酵母の３つのＥＬＯポリペプチドの各々は、すべての推定される蠕虫のエロン
ガーゼの翻訳されたＯＲＦ配列と比較され、次いで類似性の順（ＢＬＡＳＴスコ
アにより測定された）（Altschulら、（1990）、上記）に並べられた。
【００５０】 この結果は以下に、最も似ているものから最も似ていないものへ並べられたＯ
ＲＦ配列を用いて示されており、ＢＬＡＳＴスコアは括弧内に示されている。
【００５１】 酵母ＥＬＯ１ （１４〜１６炭素脂肪酸エロンガーゼ） Ｇ（２６２）＞Ｅ（２４１）＞Ｄ（２２５）＞Ｃ（２１９）＞Ａ（２１６）＞Ｆ
（２１５）＞Ｈ（１９７）＞Ｂ（１７２） 酵母ＥＬＯ２ （２４炭素スフィンゴ脂質エロンガーゼ） Ｅ（２３１）＞Ｃ（２２６）＞Ｇ（１８９）＞Ａ（１８１）＞Ｆ（１６６）＞Ｄ
（１５０）＞Ｈ（１４１）＞Ｂ（１４０） 酵母ＥＬＯ３ （２４〜２６スフィンゴ脂質エロンガーゼ） Ｄ（１７１）＞Ｇ（１６３）＞Ｆ（１５４）＞Ａ（１５２）＞Ｅ（１５０）＞Ｃ
（１３１）＞Ｂ（１３２）＞Ｈ（１２８）
【００５２】 ＢＬＡＳＴスコアの数値から、当該配列には関連性があることは明らかである
が、相同性のレベルは低い。比較として、二つの関連した蠕虫タンパク質、Δ５
およびΔ６デサチュラーゼの間の相同性についてのＢＬＡＳＴスコアは５００以
上である。
【００５３】 （スフィンゴ脂質の可能性のある起源についての分析） 本発明者らは先に、脂肪酸Δ６デサチュラーゼと植物のスフィンゴ脂質デサチ
ュラーゼとの間の類似性に注目しており、しかも当該二つの別個の酵素は一つの
祖先遺伝子から生じた可能性があった。さらに、スフィンゴ脂質デサチュラーゼ
は脂肪酸デサチュラーゼより先に発生したと考えられ、実際に原始の祖先であっ
たかもしれない。したがって、アラキドン酸生合成経路における次の段階もまた
スフィンゴ脂質の代謝経路から進化したということはもっともらしい。それゆえ
シー．エレガンスＯＲＦの推定されるエロンガーゼのいくつかがスフィンゴ脂質
酵素に類似性をもつことは非常に意味深いものと考えられる。こうした理由から
、これらのＯＲＦはＰＵＦＡエロンガーゼの非常に明確な候補であると考えられ
る。以前、シー．エレガンスのΔ５およびΔ６脂肪酸デサチュラーゼは一つの祖
先遺伝子から進化したと考えられた（Michaelsonら、（1998）, FEBS Letts 439
, 215 - 218）。シー．エレガンスの一対の推定されるエロンガーゼＯＲＦ（Ｆ
およびＧ）は、Δ５／Δ６脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子に近接して遺伝学的にマ
ップされ、双方の遺伝子対は第ＩＶ染色体の上端に位置することもまた意味深い
。
【００５４】
【表２】
【００５５】 （酵母発現ベクターにおけるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子のク
ローニング） 推定されるエロンガーゼ配列、Ｆ５６Ｈ１１．４およびＦ４１Ｈ１０．８は、
ＰＣＲによりｐＹＥＳ２ベクター（インヴィトロジェン（Invitrogen））へクロ
ーニングされた。シー．エレガンスの混在したな時期のｃＤＮＡライブラリーが
、ＰＣＲの鋳型として用いられた。Ｆ５６Ｈ１１．４はプライマー：
【００５６】 ５６ｈ１１４．前向き５´−ＧＣＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡＴＣ
ＣＧＣＴＣ−３´および； ５６ｈ１１４．逆向き５´−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＧＴＴＣＴＴＣ
ＴＴＣＴＴ−３´、を用いて増幅された。 Ｆ４１Ｈ１０．８はプライマー： ４１ｈ１０８．前向き５´−ＧＣＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＧＡＧ
ＡＡＧＴＣ−３´および； ４１ｈ１０８．逆向き５´−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴ
ＣＴＴＴＴ−３´、 を用いて増幅された。
【００５７】 増幅された配列は次にＫｐｎｌおよびＢａｍＨＩを用いて制限され（前向きお
よび逆向きのプライマーに各々下線を付した）、キアゲン（Qiagen）ＰＣＲ精製
キットを用いて精製され、さらにＫｐｎｌ／ＢａｍＨＩで切断されたｐＹｅｓ２
ベクターに連結された。
【００５８】 モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）のΔ5−脂肪酸デサチュラ
ーゼをコードしているＯＲＦ （Michaelson, L.V.ら、（1998）J. Biol. Chem.
273, 19055 - 19059）がプライマー：
【００５９】 Ｍａｄ５．前向き５´−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＣＧＧＡＣＣ
ＡＡＧＧＡ−３´および； Ｍａｄ５．逆向き５´−ＧＣＧＧＡＧＣＴＣＣＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＧ
ＡＣＧ−３´
【００６０】 を用いて増幅され、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩを用いて制限され、記述されたよ
うにゲル精製され、さらにＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ切断されたｐＥＳＴ−ＴＲＰベ
クター（ストラタジーン（Stratagene））に連結してｐＥＳＣ／Δ5を生じた。
【００６１】 ルリヂサのΔ６−脂肪酸デサチュラーゼをコードしているＯＲＦ（Sayanova,
O.,ら、（1997）Proc. Natl. Acad. Sci USA 94, 4211 - 4216）は、ｐＧＥＭ
３からＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いて制限され、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ切断
されたｐＥＳＣ−ＴＲＰベクターに連結されてｐＥＳＣ／Δ6を生じた。
【００６２】 また二重構築物も、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩルリヂサΔ6挿入断片を、先に述べた
ｐＥＳＣ／Δ5構築物に連結し、ｐＥＳＣ／（Δ5、Δ6）を生じることにより生
成された。
【００６３】 （酵母における機能性の特徴づけ） エロンガーゼおよびデサチュラーゼ構築物は、酢酸リチウムを主体とする方法
（Elble, R.（1972）Biotechniques 13, 18 - 20）によりパン酵母（Saccharomy
ces cerevisiae）Ｗ３０３−１Ａに導入され、トランス遺伝子の発現はＮａｐｉ
ｅｒら（Napier, J.A. ら、（1998）Biochem J 330, 611 - 614；Michaelson L.
V.、上記；Michaelson, L.V.,（（1998）FEBS Letts 439, 215 - 218））に記述
されたようにガラクトースを２％（ｗ／ｖ）まで添加することによって誘導され
た。ｐＹＥＳ２由来の構築物を含む酵母の形質転換物は、合成最少培地（ＳＤ、
この組成はSherman, F（1991）Methods in Enzymology 194, 3 - 21に定義され
ている）、ウラシルのない合成最少培地上で成育され、ｐＥＳＣ由来の構築物は
トリプトファンを除くＳＤ最少培地上で生育された。同時形質転換された酵母（
ｐＹＥＳ２およびｐＥＳＣ派生物の双方を含む）は、ウラシルおよびトリプトフ
ァンのないＳＤ最少培地上で生育された。誘導に先立ち、培養物は２％ラフィノ
ースの存在下に生育され、１％タージトール（tergitol）−（ＮＰ４０）（シグ
マ）の存在下に０．５ｍＭの適当な脂肪酸基質を補足された。次にすべての培養
物は、表示しない限りさらに４８時間生育された。
【００６４】 （脂肪酸分析） ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＨＧＬＡ；２０：３Δ8,11,14）の、ＧＬＡから
の合成を引受けている伸長反応を同定するべく、後者の脂肪酸が（外来性の）基
質として与えられた。
【００６５】 脂質は、形質転換および対照酵母から、ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ3中でのホモジェ
ナイゼーションにより、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ（DickensonおよびLester（1
999）Biochim Biophys Acta 1426, 347 - 357）の変法を用いて抽出された。結
果として得られたＣＨＣｌ3の相は窒素ガス下に乾燥状態まで蒸発され、さらに
試料はメタノール中の１ＭＨＣｌを用いて、８０℃にて１時間メチル基転移され
た。脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥＳ）はヘキサン中に抽出され、フロリジル
を詰めた小型のカラムを用いて精製された。ＦＡＭＥＳの分析は、２５Ｍ ｘ
０．３２ｍｍのＲＳＬ−５００ＢＰ固着毛管カラムと炎イオン検出器とを装備さ
れたヒューレット・パッカード（Hewlett Packard）５８８０Ａシリーズガスク
ロマトグラフを用いて行なわれた。脂肪酸は、同一のＧＣで分離されたＦＡＭＥ
スタンダード（シグマ）との保持時間の比較により同定された。定量化は全積分
の合計として表された、ピーク高さの面積積分を用いておこなわれた（Bligh, E
.G. およびDyer, W.J.（1959）Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911- 917）。 酵母培養物から抽出された全脂肪酸は、メチルエステル誘導体についてのガス
クロマトグラフィー（ＧＣ）により分析された。脂質は抽出され、メチル基転移
され、さらに脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）はＳａｙａｎｏｖａらによって
示されたたように分析された。
【００６６】 図１１は対照（空の）プラスミドｐＹＥＳ２を用いて（図１１Ａ）、またはｐ
ＹＥＳ２中のＯＲＦ、Ｆ５６Ｈ１１．４（図１１Ｂ）を用いてトランスフォーム
された酵母からの脂肪酸メチルエステルのクロマトグラムを示している。ＧＬＡ
という形状での外来性基質が培養物に適用された。二つの新規なピークが（Ｂ）
において観察され；これらのピーク（２０：３および１８：１＊と注釈を付され
ている）は、各々ＤＨＧＬＡおよびバクセン酸として（既知のスタンダードに対
して）同定された。検出は炎イオン化によった。
【００６７】 この方法で検査された一つのｃＤＮＡ ＯＲＦは、ＧＬＡ基質上において高レ
ベルのエロンガーゼ活性を示し、４４％をＤＨＧＬＡに転換した。この伸長産物
の正体は、既知のスタンダード（使用されたスタンダードは、シグマケミカルズ
社からのＤＨＧＬＡ、ＡＡ、ＥＰＡ、またはＶＡのいずれかのための既知のスタ
ンダードであった）との比較により、クラトス（Kratos）ＭＳ８０ＲＦＡを使用
したＧＣＭＳ分析（Napier, J.A.、上記；Michaelson, L.V.、上記；Michaelson
, L.V.、上記）を用いてＤＨＧＬＡとして確認された。機能性のエロンガーゼク
ローンについて推測されるアミノ酸配列は、それがシー．エレガンス遺伝子Ｆ５
６Ｈ１１．４によりコードされているものと同定し、酵母ＥＬＯ遺伝子との比較
は、わずかな短いアミノ酸モチーフに限定された低い相同性を示した（図１０参
照）。肝臓における褐色脂肪組織の補充に関係づけられてきたマウス遺伝子Ｃｉ
ｇ３０（Tvrdik, P.,（1977）J. Biol. Chem. 272, 31738 - 31746）とのいくつ
かの類似性は、染色体４ｑ２５ ＢＡＣ ２０７ｄ４に位置する遺伝子によって
コードされた潜在的なヒトとの相同物と同様に観察された。最も密に関係してい
るシー．エレガンスＯＲＦ、Ｆ４１Ｈ１０．８（Ｕ６１９５４）およびＦ５６Ｈ
１１．３（Ｚ６８７４９）も、染色体ＩＶ上に存在する関連するヒト遺伝子の一
部として示されている（ＢＡＣクローンＢ２０７ｄ４上に存在；ＡＣ００４０５
０）。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、すべての配列について与えられている。
【００６８】 シー．エレガンスによって合成される脂肪酸は、多くの異なる伸長反応を必要
とする（Tanaka, T.,（1996）Lipids 31, 1173 - 1178）。そこで、Ｆ５６Ｈ１
１．４ＰＵＦＡエロンガーゼの基質特異性が、外から与えられたある脂肪酸を用
いて測定された。このことは、ＧＬＡが主要な基質であり、いくつかの他の脂肪
酸が低い効率で伸長されていることを明らかにした（表Ｉ参照）。これらの基質
のほとんどは多不飽和脂肪酸であるが、意外にもパルミトレオイックアシド（pa
rmitoleoic acid）（ＰＡ；１６：１Δ9）もまたＦ５６Ｈ１１．４により伸長さ
れてバクセン酸（ＶＡ；１８：１Δ11）を生じた。ＶＡの生合成経路はわかって
いないが、このデータはそれがΔ9−１価不飽和１６炭素脂肪酸の伸長によって
合成されてもよいことを示している。
【００６９】 シー．エレガンスＰＵＦＡエロンガーゼＯＲＦ５６Ｈ１１．４は、染色体ＩＶ
（４．３２ｃＭに）の上部に、１，８２４ｂｐ下流に位置する関連配列（Ｆ５６
Ｈ１１．３；５１％類似性）と共にマップされる。もう一つのシー．エレガンス
遺伝子（Ｆ４１Ｈ１０．８）もまた観察され、それは染色体ＩＶ上に存在してお
り、ＰＵＦＡエロンガーゼに対しＦ５６Ｈ１１．３よりもわずかに高いレベル（
５３％）の類似性を示す（図１０参照）。しかしながら、ＯＲＦ Ｆ４１Ｈ１０
．８をコードしているＰＣＲ産物が、酵母においてＦ５６Ｈ１１．４に用いられ
たものと同等の方法で発現された時、前者は広範囲の基質の供給にもかかわらず
、どの脂肪酸の伸長にも寄与できなかった（表ＩＩ参照）。
【００７０】 ＰＵＦＡの生合成経路を異種の系において再構築するため、ＰＵＦＡエロンガ
ーゼＦ５６Ｈ１１．４が、先に本発明者により単離されかつ特徴づけられたΔ5
−またはΔ6−脂肪酸デサチュラーゼ（Napier, J.A.、上記；Michaelson, L.V.
、上記）と共に酵母において発現された。Δ6−脂肪酸デサチュラーゼとＦ５６
Ｈ１１．４との発現は、二つの異なる基質（ＬＡまたはＡＬＡ）の存在下に行な
われたが、一方Δ5−脂肪酸デサチュラーゼと当該エロンガーゼとはＧＬＡのみ
の存在下に発現された。このことは、デサチュラーゼとエロンガーゼとを酵母に
おいて組合せて、有意な量の最終「産物」を生じることができたことを証明した
（表ＩＩＩ参照）。エロンガーゼとΔ6−脂肪酸デサチュラーゼとの場合には、
反応はＬＡ基質からの４．５％のＤＨＧＬＡの産出という高い効率を証明した。
このことは、ＬＡ基質からＧＬＡへの２５％の不飽和化に起因したものであり、
それは次に同じようなレベルの効率（１８％）でＤＨＧＬＡへ伸長された。これ
は外来性に与えられた場合にＧＬＡについて観察された％転換よりも低く（表Ｉ
参照）、伸長のためのインビボにおける基質の製造が律速であってもよいことを
示している。
【００７１】 もしＡＬＡが基質として用いられた場合には、このうちの２７％がまずΔ6−
不飽和化されてオクタデカテトラエン酸（ＯＴＡ；１８：４Δ8,9,12,15）を生
じたが、その８％だけが続いて伸長されてエイコサテトラエン酸（２０：４Δ8, 11,14,17 ）を生じた。したがって、 最終的な２０炭素のテトラエンＰＵＦＡへ
のＡＬＡの転換効率は、わずかに約２．２％であった。 ＤＨＧＬＡはｎ−６脂肪酸であるのに対し、ＯＴＡ由来のエイコステトラエン
酸（eicostetraenoic acid）はｎ−３型であるため、このことはエロンガーゼが
必須脂肪酸の双方の種類を、たとえ効率は異なっても受入れることができること
を証明している。また、Δ6−デサチュラーゼは２０：２または２０：３基質に
対して何ら活性を示さなかったため、酵母の発現系において合成された２０炭素
ＰＵＦＡは１８炭素基質のΔ6−不飽和化によって生じ、その後伸長されたとい
うことも証明された（表ＩＩＩ参照）。
【００７２】 Δ5−デサチュラーゼとエロンガーゼとの組合せはまた、これらの二つの酵素
がタンデムに作動することができることを証明したが、この全体的な転換の効率
は低く（ＧＬＡからは３．３％のＡＡ）、それは先に観察されたΔ5−デサチュ
ラーゼ酵素自体の低い活性（Michaelson, L.V.、上記；Michaelson, L.V.、上記
）によるものであった。したがって、ＧＬＡ基質のほぼ４５％がＤＨＧＬＡに伸
長されたとはいえ、このうちのわずか７．５％だけが次にＡＡに不飽和化された
にすぎない（表ＩＩＩ参照）。
【００７３】 最後に、酵母におけるＡＡまたはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５Δ 5,8,11,14,17 ）の、ジエンまたはトリエン１８炭素基質からの産生が、３つの酵
素（二つのデサチュラーゼおよびＦ５６Ｈ１１．４ＰＵＦＡエロンガーゼ）すべ
ての同時発現によって達成された。表ＩＶに示したように、１８炭素ジエン脂肪
酸ＬＡが酵母に与えられた場合、少量ではあるが有意な量のＡＡが産生された。
【００７４】 （ＧＣ−質量分光学（ＭＳ）による分析法） ピークの同定および確認は、クラトス（Ｋｒａｔｏｓ）ＭＳ８０ＲＦＡを使用
し、 既知のスタンダード（シグマ）を用いたＧＣ−ＭＳにより行なわれた。こ
の２０炭素ＰＵＦＡの同定はＧＣＭＳにより確認され、ＬＡからの転換効率は０
．６５％であることが示された。基質としてＡＬＡが用いられた場合には、（Δ 6 −不飽和化されかつ伸長された）エイコサテトラエンｎ−３脂肪酸の１２．５
％がΔ5−不飽和化され、全体としてはＡＬＡ基質の０．３％がＥＰＡに変換さ
れる結果となった（ＥＰＡの同定はＧＣＭＳにより確認された）。
【００７５】 （植物におけるシー．エレガンスエロンガーゼの発現） シー．エレガンスのエロンガーゼを植物において発現させるためには、以下の
プロトコールが、トランスジェニック植物を作るために使用されることが可能な
プロセスの一例である。シー．エレガンスのＯＲＦ配列は、ウイルス３５Ｓプロ
モーターおよびＮｏｓターミネーターを含む植物の発現ベクターｐＪＤ３３０に
サブクローンされることが可能である。結果として得られるカセットまたはプロ
モーター／コード配列／ターミネーターは、次に植物のバイナリー形質転換ベク
ターｐＢｉｎ １９にサブクローニングされ、生じたプラスミドはアグロバクテ
リウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入される。この
アグロバクテリウムの系統は、花部の真空浸潤法によりシロイヌナズナを形質転
換するべく用いられることが可能であり、種子はカナマイシンを含む選択培地上
にプレートされる。ｐＢｉｎ １９はこの抗生物質に対する耐性を与えるため、
形質転換された植物材料のみが成育するであろう。したがって耐性の系統は同定
され、自家受粉されて同型接合の材料を生じる。葉の材料は、シー．エレガンス
エロンガーゼの発現について分析されることが可能である。
【００７６】 脂肪酸メチルエステルは以前に記述したようにように分析された。
【００７７】
【表３】
【００７８】
【表４】
【００７９】
【表５】
【００８０】
【表６】
【００８１】
【表７】
【００８２】
【表８】
【００８３】
【表９】
【００８４】
【表１０】
【００８５】
【表１１】
【００８６】
【表１２】
【００８７】
【表１３】
【００８８】
【表１４】
【００８９】
【表１５】
【００９０】
【表１６】
【００９１】
【表１７】
【００９２】
【表１８】
【００９３】
【表１９】
【００９４】
【表２０】
【００９５】
【表２１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＰＵＦＡ製造の一般化された経路を表す略線図である。
【図２】 ＰＵＦＡエロンガーゼＡの各々についての疎水性プロットを示している。
【図３】 ＰＵＦＡエロンガーゼＢの各々についての疎水性プロットを示している。
【図４】 ＰＵＦＡエロンガーゼＣの各々についての疎水性プロットを示している。
【図５】 ＰＵＦＡエロンガーゼＤの各々についての疎水性プロットを示している。
【図６】 ＰＵＦＡエロンガーゼＥの各々についての疎水性プロットを示している。
【図７】 ＰＵＦＡエロンガーゼＦの各々についての疎水性プロットを示している。
【図８】 ＰＵＦＡエロンガーゼＧの各々についての疎水性プロットを示している。
【図９】 ＰＵＦＡエロンガーゼＨの各々についての疎水性プロットを示している。
【図１０】 シー．エレガンスのＯＲＦ Ｆ５６Ｈ１１．４（Ｚ６８７４９）を、関連する
配列と比較したアミノ酸配列の整列を示す。
【図１１】 形質転換された酵母からの脂肪酸メチルエステルのクロマトグラムを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 9/00 ４Ｃ２０６ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 7/64 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 7/64 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B018 MD10 MD11 MD12 MD13 ME04 4B024 AA01 AA05 BA07 CA03 DA02 DA03 DA12 HA17 4B050 CC01 CC03 CC08 DD11 KK06 LL01 LL02 LL05 4B064 AD12 BH07 BH20 CA19 CB30 CD07 CE08 CE10 DA01 DA10 4B065 AA72X AA90X AA90Y AA91X AB01 BB08 BD29 CA10 CA27 CA41 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 DC01 MA52 NA14 ZB212 ZC612 4C206 AA01 AA02 DA04 DA05 MA04 MA72 ZB21 ZC61

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 本文で定義される機能性の長鎖多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）
    エロンガーゼを含む単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 真核生物に由来することを特徴とする請求項１記載のポリペ
    プチド。
  3. 【請求項３】 配列番号１５に示されたアミノ酸配列の少なくとも一部か、
    またはその変異体を有することを特徴とする請求項１または２に記載のポリペプ
    チド。
  4. 【請求項４】 請求項３記載のポリペプチドに対し少なくとも６０％の相同
    性を有し、かつＰＵＦＡエロンガーゼ機能を有するポリペプチド。
  5. 【請求項５】 少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする請求項
    ４記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする請求項
    ５記載のポリペプチド。
  7. 【請求項７】 小胞体（ＥＲ）の保持を担う配列モチーフ（motif）を含む
    ことを特徴とする先行する請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 パルミトレイン酸（ＰＡ；１６：１Δ9）を、バクセン酸（
    ＶＡ；１８：１Δ11）へ伸長させることが可能であることを特徴とする先行する
    請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】 動物由来であることを特徴とする先行する請求項のいずれか
    に記載のポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 前記動物が無脊椎動物であることを特徴とする請求項９記
    載のポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 前記無脊椎動物が蠕虫であることを特徴とする請求項１０
    記載のポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記蠕虫がシー．エレガンス（C.elegans）であることを
    特徴とする請求項１１記載のポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 前記動物が脊椎動物であることを特徴とする請求項９記載
    のポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 前記脊椎動物が哺乳類であることを特徴とする請求項１３
    記載のポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 前記哺乳類がヒト、ラット、またはマウスであることを特
    徴とする請求項１４記載のポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 先行する請求項のいずれかに記載のポリペプチドをコード
    するＤＮＡ配列。
  17. 【請求項１７】 配列番号７に示される配列か、または当該配列についての
    塩基の置換、欠失、および／または付加による変異体を含むことを特徴とする請
    求項１６記載のＤＮＡ配列。
  18. 【請求項１８】 請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリペプチドが
    発現するように操作された***作生物。
  19. 【請求項１９】 前記動物が哺乳類であることを特徴とする請求項１８記載
    の操作された生物。
  20. 【請求項２０】 前記哺乳類がラット、マウス、またはサルであることを特
    徴とする請求項１９記載の操作された生物。
  21. 【請求項２１】 請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリペプチドの
    合成経路を含む操作された生物。
  22. 【請求項２２】 前記経路がΔ5−脂肪酸デサチュラーゼを含むことを特徴
    とする請求項２１記載の操作された生物。
  23. 【請求項２３】 前記経路がΔ6−脂肪酸デサチュラーゼを含むことを特徴
    とする請求項２１または２２記載の操作された生物。
  24. 【請求項２４】 前記動物が下等真核生物であることを特徴とする請求項２
    １〜２３のいずれか１項記載の操作された生物。
  25. 【請求項２５】 前記下等な真核生物が酵母であることを特徴とする請求項
    ２４記載の操作された生物。
  26. 【請求項２６】 前記動物が魚類であることを特徴とする請求項１８記載の
    操作された生物。
  27. 【請求項２7】 請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリペプチドを
    発現するべく操作されたトランスジェニック植物。
  28. 【請求項２８】 請求項１６または１７記載のＤＮＡ配列を含むトランスジ
    ェニック植物。
  29. 【請求項２９】 請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリペプチドに
    より触媒されるエロンガーゼ反応を行なうことを含むＰＵＦＡの製造法。
  30. 【請求項３０】 前記ＰＵＦＡがジホモ−γ−リノレン酸（２０：３Δ8,11 ,14 ）、アラキドン酸（２０：４Δ5,8,11,14）、エイコサペンタン酸（２０：５
    Δ5,8,11,14,17）、ドコサトリエン酸（２２：３Δ3,16,19）、ドコサテトラエ
    ン酸（２２：４Δ7,10,13,16）、ドコサペンタエン酸（２２：５Δ7,10,13,16,1 9 ）、またはドコサヘキサエン酸（２２：６Δ4,7,10,13,16,19）であることを特
    徴とする請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記ＰＵＦＡが少なくとも４つの二重結合をもつ２４炭素
    脂肪酸であることを特徴とする請求項２９記載の方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２９から３１のいずれか１項記載の方法により製造
    されたＰＵＦＡ。
  33. 【請求項３３】 請求項３２記載のＰＵＦＡを含む食料品。
  34. 【請求項３４】 請求項３２記載のＰＵＦＡを含む補助食品。
  35. 【請求項３５】 請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリペプチドを
    含む薬剤組成物。
  36. 【請求項３６】 請求項３２記載のＰＵＦＡを含む薬剤組成物。
  37. 【請求項３７】 製薬上許容される希釈剤、担体、賦形剤、または増量剤を
    含むことを特徴とする請求項３５または３６記載の薬剤組成物。
  38. 【請求項３８】 動物または植物のＰＵＦＡレベルを高める方法であって、
    請求項１から１５のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１６または１７記載
    のＤＮＡ配列、請求項３３記載の食料品、請求項３４記載の補助食品、請求項３
    ５から３７のいずれかに記載の薬剤組成物、または請求項３２記載のＰＵＦＡを
    、当該動物または植物に与える方法。
  39. 【請求項３９】 前記動物が哺乳類であることを特徴とする請求項３８記載
    の治療法。
  40. 【請求項４０】 前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項３９記載
    の治療法。
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