JP2002537822A - スプライシング反応を検出するための試験系およびその使用 - Google Patents
スプライシング反応を検出するための試験系およびその使用Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】
本発明は：（ａ）少なくとも１つのスプライシング可能な核酸を含む１つまたはそれ以上の同一のまたは異なった固定化された核酸；（ｂ）スプライシング反応を検出するための少なくとも１つのゲル無し検出系、適切な場合には；（ｃ）スプライシング成分を含む少なくとも１つの組成物、および好ましくは；（ｄ）好適な検出プローブ、および適切な場合には；（ｅ）さらなる補助物、を含む試験系に関する。
Description
【０００１】 本発明は、 （ａ）少なくとも１つのスプライシング可能な核酸を有する１つまたはそれ以上
の同一のまたは異なった固定化された核酸 （ｂ）スプライシング反応を検出するための少なくとも１つのゲル無し検出系、
適切な場合には （ｃ）スプライシング成分を含む少なくとも１つの組成物、および好ましくは （ｄ）好適な検出プローブ、および、適切な場合には （ｅ）さらなる補助物、 を含む試験系に関する。
の同一のまたは異なった固定化された核酸 （ｂ）スプライシング反応を検出するための少なくとも１つのゲル無し検出系、
適切な場合には （ｃ）スプライシング成分を含む少なくとも１つの組成物、および好ましくは （ｄ）好適な検出プローブ、および、適切な場合には （ｅ）さらなる補助物、 を含む試験系に関する。
【０００２】 真核生物において、タンパク質をコードする遺伝子の多くはそのゲノムの形状
が１つまたはそれ以上のタンパク質をコードしていない配列（イントロン）によ
り分断されている。ゲノムＤＮＡをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へ転写す
る場合、これらの非コード領域（イントロン）は一次転写産物へ取り込まれる。
正しいｍＲＮＡを生成させるため、このｍＲＮＡ前駆体はプロセシングを受けな
ければならない。
が１つまたはそれ以上のタンパク質をコードしていない配列（イントロン）によ
り分断されている。ゲノムＤＮＡをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へ転写す
る場合、これらの非コード領域（イントロン）は一次転写産物へ取り込まれる。
正しいｍＲＮＡを生成させるため、このｍＲＮＡ前駆体はプロセシングを受けな
ければならない。
【０００３】 ｍＲＮＡ前駆体はイントロンを除去し、コード領域（エキソン）を融合させる
ことによりプロセシングされる。その後にのみ、細胞質中での翻訳のために分断
された様式で読むことができるヌクレオチド鎖を提供することが可能である。し
たがって、真核生物におけるｍＲＮＡ形成は、非コード遺伝子領域（イントロン
）が一次遺伝子転写産物から除去される「スプライシング過程」を必要とする。
ことによりプロセシングされる。その後にのみ、細胞質中での翻訳のために分断
された様式で読むことができるヌクレオチド鎖を提供することが可能である。し
たがって、真核生物におけるｍＲＮＡ形成は、非コード遺伝子領域（イントロン
）が一次遺伝子転写産物から除去される「スプライシング過程」を必要とする。
【０００４】 スプライシングはｍＲＮＡが核から移送される前に核内で起こる。それは通常
２段階機構で実施され、各々の場合にトランスエステル化工程が含まれる（Moor
e, J. M. et al.、（１９９３年）、Splicing of precursors to messenger RNA
s by the Spliceosome. In The RNA World、Gesteland R. F.、Gesteland, J. F
. 編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、３０３〜３５８頁）。第１の工
程は遊離５’エキソンおよび３’エキソンにまだ結合しているイントロンの「投
げ縄状構造」を生成させる。投げ縄状構造は、イントロンの５’末端とイントロ
ンの３’末端の約２０〜４０ヌクレオチド上流に位置するアデノシンのリボース
の２’−ヒドロキシル基とのエステル化により生成される分岐ＲＮＡを含む。第
２の触媒工程はエキソンの結合およびイントロンの遊離をもたらす。これらの反
応の間にヌクレオチドは取り込まれないが、エネルギー源、例えばＡＴＰがこの
触媒反応に必要とされる（Guthrie, C.（１９９１年）Science、２５３巻、１５
７頁）。
２段階機構で実施され、各々の場合にトランスエステル化工程が含まれる（Moor
e, J. M. et al.、（１９９３年）、Splicing of precursors to messenger RNA
s by the Spliceosome. In The RNA World、Gesteland R. F.、Gesteland, J. F
. 編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、３０３〜３５８頁）。第１の工
程は遊離５’エキソンおよび３’エキソンにまだ結合しているイントロンの「投
げ縄状構造」を生成させる。投げ縄状構造は、イントロンの５’末端とイントロ
ンの３’末端の約２０〜４０ヌクレオチド上流に位置するアデノシンのリボース
の２’−ヒドロキシル基とのエステル化により生成される分岐ＲＮＡを含む。第
２の触媒工程はエキソンの結合およびイントロンの遊離をもたらす。これらの反
応の間にヌクレオチドは取り込まれないが、エネルギー源、例えばＡＴＰがこの
触媒反応に必要とされる（Guthrie, C.（１９９１年）Science、２５３巻、１５
７頁）。
【０００５】 ｍＲＮＡスプライシングの過程には複数の因子か関与する。今のところ２種類
のスプライシング因子が識別されている。第１の種類は４つの進化的に高度に保
存されたタンパク質−ＲＮＡ粒子（低分子リボ核タンパク質＝ｓｎＲＮＰ）；Ｕ
１、Ｕ２、Ｕ４／Ｕ６およびＵ５を含み、これらは１つ（Ｕ１、Ｕ２、Ｕ５）の
または２つ（Ｕ４／Ｕ６）のｓｎＲＮＡ成分を含む（Moore, J. M. et al.、（
１９９３年）前記文献；Guthrie、（１９９１年）前記文献；Green, M. R.（１
９９１年）、Annu. Rev. Cell Biol.、７巻、５５９頁）。第２の種類は現在に
至るまでよく特徴付けられていないタンパク質を含み、それらはｓｎＲＮＰに強
固に結合していないため非ｓｎＲＮＰスプライシング因子と称される（Lamm, G.
M. & Lamond, A. J.（１９９３年）Biochim. Biophys. Acta、１１７３巻、２
４７頁；Beggs, J. D.（１９９５年）、Yeast splicing factors and genetic s
trategies for their analysis.：Lamond, A. I. 編、Pre-mRNA Processing. La
ndes, R. G. Company、Texas、ｐｐ．７９〜９５；Kramer A.（１９９５年）、T
he biochemistry of pre-mRNA splicing：Lamond, A. I. 編、Pre-mRNA Process
ing. Landes, R. G. Company、Texas、ｐｐ．３５〜６４）。
のスプライシング因子が識別されている。第１の種類は４つの進化的に高度に保
存されたタンパク質−ＲＮＡ粒子（低分子リボ核タンパク質＝ｓｎＲＮＰ）；Ｕ
１、Ｕ２、Ｕ４／Ｕ６およびＵ５を含み、これらは１つ（Ｕ１、Ｕ２、Ｕ５）の
または２つ（Ｕ４／Ｕ６）のｓｎＲＮＡ成分を含む（Moore, J. M. et al.、（
１９９３年）前記文献；Guthrie、（１９９１年）前記文献；Green, M. R.（１
９９１年）、Annu. Rev. Cell Biol.、７巻、５５９頁）。第２の種類は現在に
至るまでよく特徴付けられていないタンパク質を含み、それらはｓｎＲＮＰに強
固に結合していないため非ｓｎＲＮＰスプライシング因子と称される（Lamm, G.
M. & Lamond, A. J.（１９９３年）Biochim. Biophys. Acta、１１７３巻、２
４７頁；Beggs, J. D.（１９９５年）、Yeast splicing factors and genetic s
trategies for their analysis.：Lamond, A. I. 編、Pre-mRNA Processing. La
ndes, R. G. Company、Texas、ｐｐ．７９〜９５；Kramer A.（１９９５年）、T
he biochemistry of pre-mRNA splicing：Lamond, A. I. 編、Pre-mRNA Process
ing. Landes, R. G. Company、Texas、ｐｐ．３５〜６４）。
【０００６】 ｓｎＲＮＰの組成はヒーラー細胞で最もよく研究されている（Will, C. L. et
al.、（１９９５年）Nuclear pre-mRNA splicing：Eckstein, F. and Lilley,
D. M. J. 編、Nucleic Acids and Molecular Biology．Springer Verlag、 Berl
in、ｐｐ．３４２〜３７２）。比較的低い塩濃度で、ヒーラー細胞からの核抽出
物はインビトロでｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを促進することが可能であり
、この濃度では、ｓｎＲＮＰは１２Ｓ Ｕ１ ｓｎＲＮＰ、１７Ｓ Ｕ２ ｓｎＲＮ
Ｐおよび２５Ｓ［Ｕ４／Ｕ６．Ｕ５］トリ−ｓｎＲＮＰ複合体中に存在する。よ
り高い塩濃度（約３５０〜４５０ｍＭ）では、トリ−ｓｎＲＮＰ複合体は２０Ｓ
Ｕ５粒子および１２Ｓ Ｕ４／Ｕ５粒子に解離する。Ｕ４／Ｕ６ ｓｎＲＮＰに
おいて、Ｕ４およびＵ６ ＲＮＡは二つの分子間らせんを経た塩基対として存在
する（Bringmann, P. et al.（１９８４年）EMBO J.、３巻、１３５７頁；Hashi
moto, C. & Steitz, J. A.（１９８４年）Nucleic Acids Res.、１２巻、３２８
３頁；Rinke, J. et al.、（１９８５年）J. Mol. Biol.、１８５巻、７２１頁
；Brow. D. A. & Guthrie, C.（１９８８年）Nature、３３４巻、２１３頁）。
al.、（１９９５年）Nuclear pre-mRNA splicing：Eckstein, F. and Lilley,
D. M. J. 編、Nucleic Acids and Molecular Biology．Springer Verlag、 Berl
in、ｐｐ．３４２〜３７２）。比較的低い塩濃度で、ヒーラー細胞からの核抽出
物はインビトロでｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを促進することが可能であり
、この濃度では、ｓｎＲＮＰは１２Ｓ Ｕ１ ｓｎＲＮＰ、１７Ｓ Ｕ２ ｓｎＲＮ
Ｐおよび２５Ｓ［Ｕ４／Ｕ６．Ｕ５］トリ−ｓｎＲＮＰ複合体中に存在する。よ
り高い塩濃度（約３５０〜４５０ｍＭ）では、トリ−ｓｎＲＮＰ複合体は２０Ｓ
Ｕ５粒子および１２Ｓ Ｕ４／Ｕ５粒子に解離する。Ｕ４／Ｕ６ ｓｎＲＮＰに
おいて、Ｕ４およびＵ６ ＲＮＡは二つの分子間らせんを経た塩基対として存在
する（Bringmann, P. et al.（１９８４年）EMBO J.、３巻、１３５７頁；Hashi
moto, C. & Steitz, J. A.（１９８４年）Nucleic Acids Res.、１２巻、３２８
３頁；Rinke, J. et al.、（１９８５年）J. Mol. Biol.、１８５巻、７２１頁
；Brow. D. A. & Guthrie, C.（１９８８年）Nature、３３４巻、２１３頁）。
【０００７】 ｓｎＲＮＰは２つのタンパク質群を含む。すべてのｓｎＲＮＰは一般的タンパ
ク質群（Ｂ／Ｂ’、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅ、ＦおよびＧ）を含む。加えて、各々
のｓｎＲＮＰはそのｓｎＲＮＰにのみ存在する特異的タンパク質を含む。したが
って、従来の研究状況によれば、Ｕ１ ｓｎＲＮＰは３つの更なるタンパク質（
７０Ｋ、ＡおよびＣ）を、Ｕ２ ｓｎＲＮＰは１１のさらなるタンパク質を含む
。従来の知識によれば、２０Ｓ Ｕ５ ｓｎＲＮＰは、１５、４０、５２、１００
、１０２、１１０、１１６、２００および２２０ｋＤａの分子量を有するさらに
９つのタンパク質を含み、一方、１２Ｓ Ｕ４／Ｕ６ ｓｎＲＮＰは約６０および
９０ｋＤａの分子量を有するさらに２つのタンパク質を含む。２５Ｓ トリ−ｓ
ｎＲＮＰ［Ｕ４／Ｕ６．Ｕ５］は、約１５．５、２０、２７、６１および６３ｋ
Ｄａの分子量を有するさらに５つのタンパク質を含む（Behrens, S. E. & Luhrm
ann, R.（１９９１年）Genes Dev.、５巻、１４３９頁；Utans, U. et al.、（
１９９２年）Genes Dev.、６巻、６３１頁；Lauber, J. et al.、（１９９６年
）EMBO J.、１５巻、４００１頁；Will, C. L. et al.（１９９５年）、前記文
献；Will, C. L. & Luhrmann, R.（１９９７年）Curr. Opin. Cell Biol.、９巻
、３２０〜３２８頁）。
ク質群（Ｂ／Ｂ’、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅ、ＦおよびＧ）を含む。加えて、各々
のｓｎＲＮＰはそのｓｎＲＮＰにのみ存在する特異的タンパク質を含む。したが
って、従来の研究状況によれば、Ｕ１ ｓｎＲＮＰは３つの更なるタンパク質（
７０Ｋ、ＡおよびＣ）を、Ｕ２ ｓｎＲＮＰは１１のさらなるタンパク質を含む
。従来の知識によれば、２０Ｓ Ｕ５ ｓｎＲＮＰは、１５、４０、５２、１００
、１０２、１１０、１１６、２００および２２０ｋＤａの分子量を有するさらに
９つのタンパク質を含み、一方、１２Ｓ Ｕ４／Ｕ６ ｓｎＲＮＰは約６０および
９０ｋＤａの分子量を有するさらに２つのタンパク質を含む。２５Ｓ トリ−ｓ
ｎＲＮＰ［Ｕ４／Ｕ６．Ｕ５］は、約１５．５、２０、２７、６１および６３ｋ
Ｄａの分子量を有するさらに５つのタンパク質を含む（Behrens, S. E. & Luhrm
ann, R.（１９９１年）Genes Dev.、５巻、１４３９頁；Utans, U. et al.、（
１９９２年）Genes Dev.、６巻、６３１頁；Lauber, J. et al.、（１９９６年
）EMBO J.、１５巻、４００１頁；Will, C. L. et al.（１９９５年）、前記文
献；Will, C. L. & Luhrmann, R.（１９９７年）Curr. Opin. Cell Biol.、９巻
、３２０〜３２８頁）。
【０００８】 サッカロマイセス セレビジアエ中のスプライシング成分の組成はまだ詳細に
は研究されていない。しかしながら、生化学的および遺伝子工学的研究は、ｓｎ
ＲＮＡおよびｓｎＲＮＰタンパク質の両配列が進化的に高度に保存されているこ
とを示している（Fabrizio, P. et al.、（１９９４年）Science、２６４巻、２
６１頁；Lauber, J. et al.、（１９９６年）、前記文献；Neubauer, G. et al.
、（１９９７年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９４巻、３８５頁；Kramer, A.
（１９９５年）、前記文献；Beggs, J. D.（１９９５年）、前記文献；Gottscha
lk, A. et al.（１９９８年）ＲＮＡ、４巻、３７４〜３９３頁）。
は研究されていない。しかしながら、生化学的および遺伝子工学的研究は、ｓｎ
ＲＮＡおよびｓｎＲＮＰタンパク質の両配列が進化的に高度に保存されているこ
とを示している（Fabrizio, P. et al.、（１９９４年）Science、２６４巻、２
６１頁；Lauber, J. et al.、（１９９６年）、前記文献；Neubauer, G. et al.
、（１９９７年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９４巻、３８５頁；Kramer, A.
（１９９５年）、前記文献；Beggs, J. D.（１９９５年）、前記文献；Gottscha
lk, A. et al.（１９９８年）ＲＮＡ、４巻、３７４〜３９３頁）。
【０００９】 機能性スプライシング複合体（スプライソソーム）を形成させるために、個々
の成分（ｍＲＮＡ前駆体、ｓｎＲＮＰおよび非ｓｎＲＮＰタンパク質）が段階的
に結合させる。これはｍＲＮＡ前駆体とタンパク質含有成分との相互作用による
のみではなく、タンパク質含有成分自身の間の多数の相互作用により達成される
（Moore, J. M.（１９９３年）前記文献；Madhani, H. D. & Guthrie, C.（１９
９４年）Annu. Rev. Genetics、２８巻、１頁；Nilsen, T. W.（１９９４年）Ce
ll、６５巻、１１５頁）。ｍＲＮＡ前駆体配列は異なるスプライシング成分のた
めの特異的認識配列を有する。第１に、Ｕ１ ｓｎＲＮＰは前記認識配列を介し
てｍＲＮＡ前駆体イントロンの５’スプライシング領域に結合する。同時に、ま
だ特定されていない数の種々の他の因子（例えば、ＳＦ２／ＡＳＦ、Ｕ２ＡＦ、
ＳＣ３５、ＳＦ１）がこの複合体により取り込まれ、スプライソソーム前駆体の
連続形成においてｓｎＲＮＡと協同して働く。Ｕ２ ｓｎＲＮＰ粒子はイントロ
ン領域中の「分岐部位」と相互作用する（Kramer, A. & Utans, U.（１９９１年
）EMBO J.、１０巻、１５０３頁；Fu, X. D. & Maniatis, T.（１９９２年）Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻、１７２５頁；Kramer, A.（１９９２年）Mol
. Cell Biol.、１２巻、４５４５頁；Zamore, P. D. et al.（１９９２年）Natu
re、３５５巻、６０９頁；Eperon, J. C. et al.（１９９３年）EMBO J.、１２
巻、３６０７頁；Zuo, P.（１９９４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９１巻
、３３６３頁；Hodges, P. E. & Beggs, J. D.（１９９４年）Curr. Biol.４巻
、２６４頁；Reed, R.（１９９６年）Curr. Op. Gen. Dev.、６巻、２１５頁）
。スプライソソーム形成の最終工程において、成熟スプライソソームを形成する
ために［Ｕ４／Ｕ６．Ｕ５］トリ−ｓｎＲＮＰおよび詳細には特徴付けられてい
ない多くのタンパク質がスプライソソーム前駆体と相互作用する（Moore, J. M.
et al.、（１９９３年）前記文献）。
の成分（ｍＲＮＡ前駆体、ｓｎＲＮＰおよび非ｓｎＲＮＰタンパク質）が段階的
に結合させる。これはｍＲＮＡ前駆体とタンパク質含有成分との相互作用による
のみではなく、タンパク質含有成分自身の間の多数の相互作用により達成される
（Moore, J. M.（１９９３年）前記文献；Madhani, H. D. & Guthrie, C.（１９
９４年）Annu. Rev. Genetics、２８巻、１頁；Nilsen, T. W.（１９９４年）Ce
ll、６５巻、１１５頁）。ｍＲＮＡ前駆体配列は異なるスプライシング成分のた
めの特異的認識配列を有する。第１に、Ｕ１ ｓｎＲＮＰは前記認識配列を介し
てｍＲＮＡ前駆体イントロンの５’スプライシング領域に結合する。同時に、ま
だ特定されていない数の種々の他の因子（例えば、ＳＦ２／ＡＳＦ、Ｕ２ＡＦ、
ＳＣ３５、ＳＦ１）がこの複合体により取り込まれ、スプライソソーム前駆体の
連続形成においてｓｎＲＮＡと協同して働く。Ｕ２ ｓｎＲＮＰ粒子はイントロ
ン領域中の「分岐部位」と相互作用する（Kramer, A. & Utans, U.（１９９１年
）EMBO J.、１０巻、１５０３頁；Fu, X. D. & Maniatis, T.（１９９２年）Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻、１７２５頁；Kramer, A.（１９９２年）Mol
. Cell Biol.、１２巻、４５４５頁；Zamore, P. D. et al.（１９９２年）Natu
re、３５５巻、６０９頁；Eperon, J. C. et al.（１９９３年）EMBO J.、１２
巻、３６０７頁；Zuo, P.（１９９４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９１巻
、３３６３頁；Hodges, P. E. & Beggs, J. D.（１９９４年）Curr. Biol.４巻
、２６４頁；Reed, R.（１９９６年）Curr. Op. Gen. Dev.、６巻、２１５頁）
。スプライソソーム形成の最終工程において、成熟スプライソソームを形成する
ために［Ｕ４／Ｕ６．Ｕ５］トリ−ｓｎＲＮＰおよび詳細には特徴付けられてい
ない多くのタンパク質がスプライソソーム前駆体と相互作用する（Moore, J. M.
et al.、（１９９３年）前記文献）。
【００１０】 スプライシング過程のため、ｍＲＮＡ前駆体、ｓｎＲＮＡおよびｓｎＲＮＰ間
の種々の相互作用が除かれ、新しい相互作用が形成される。したがって、スプラ
イシング反応の第１の触媒工程の前または間に、Ｕ４およびＵ６の相互作用して
いる構造において２つのらせんがお互いに分離され、新しい相互作用がＵ２ Ｒ
ＮＡおよびＵ６ ＲＮＡ間に塩基対を形成する（Datta, B. & Weiner, A. M.（１
９９１年）Nature、３５２巻、８２１頁；Wu, J. A. & Manley, J. L.（１９９
１年）Nature、３５２巻、８１８頁；Madhani, H. D. & Guthrie, C.（１９９２
年）Cell、７１巻、８０３頁；Sun, J. S. & Manley, J. L.（１９９５年）Gene
s Dev.、９巻、８４３頁）。同時に、５’スプライシング部位へのＵ１の結合が
除かれ、ｍＲＮＡ前駆体がＵ６ ｓｎＲＮＡの認識配列ＡＣＡＧＡＧに結合する
（Fabrizio, P. & Abelson, J.（１９９０年）、Science、２５０巻、４０４頁
；Sawa, H. & Abelson, J.（１９９２年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻
、１１２６９頁；Kandels-Lewis, S. & Seraphin, B.（１９９３年）Science、
２６２巻、２０３５頁；Lesser, C. F. & Guthrie C.（１９９３年）Science、
２６２巻、１９８２頁；Sontheimer, E. J. & Steitz, J. A.（１９９３年）Sci
ence、２６２巻、１９８９頁）。Ｕ５ ｓｎＲＮＰはその保存されているループ
１を介して５’および３’スプライシング部位の近くに位置するエキソン配列と
相互作用する。この過程は連続的であるようにみえる。一方、全スプライシング
過程は段階１から段階２へと進行する（M. McKeown（１９９２年）Annu. Rev. C
ell Dev. Biol.、８巻：１３３〜１５５頁；Newman, A. & Norman, C.（１９９
１年）Cell、６５巻、１１５頁；Wyatt, J. R. et al.（１９９２年）Genes Dev
.、６巻、２５４２頁；Cortes, J. J. et al.（１９９３年）EMBO J.、１２巻、
５１８１頁；Sontheimer, E. J. & Steits（１９９３年）前記文献）。スプライ
シング反応終了後、成熟ｍＲＮＡが遊離され、スプライソソームは解離する（Mo
ore, J. M. et al（１９９３年）前記文献）。
の種々の相互作用が除かれ、新しい相互作用が形成される。したがって、スプラ
イシング反応の第１の触媒工程の前または間に、Ｕ４およびＵ６の相互作用して
いる構造において２つのらせんがお互いに分離され、新しい相互作用がＵ２ Ｒ
ＮＡおよびＵ６ ＲＮＡ間に塩基対を形成する（Datta, B. & Weiner, A. M.（１
９９１年）Nature、３５２巻、８２１頁；Wu, J. A. & Manley, J. L.（１９９
１年）Nature、３５２巻、８１８頁；Madhani, H. D. & Guthrie, C.（１９９２
年）Cell、７１巻、８０３頁；Sun, J. S. & Manley, J. L.（１９９５年）Gene
s Dev.、９巻、８４３頁）。同時に、５’スプライシング部位へのＵ１の結合が
除かれ、ｍＲＮＡ前駆体がＵ６ ｓｎＲＮＡの認識配列ＡＣＡＧＡＧに結合する
（Fabrizio, P. & Abelson, J.（１９９０年）、Science、２５０巻、４０４頁
；Sawa, H. & Abelson, J.（１９９２年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻
、１１２６９頁；Kandels-Lewis, S. & Seraphin, B.（１９９３年）Science、
２６２巻、２０３５頁；Lesser, C. F. & Guthrie C.（１９９３年）Science、
２６２巻、１９８２頁；Sontheimer, E. J. & Steitz, J. A.（１９９３年）Sci
ence、２６２巻、１９８９頁）。Ｕ５ ｓｎＲＮＰはその保存されているループ
１を介して５’および３’スプライシング部位の近くに位置するエキソン配列と
相互作用する。この過程は連続的であるようにみえる。一方、全スプライシング
過程は段階１から段階２へと進行する（M. McKeown（１９９２年）Annu. Rev. C
ell Dev. Biol.、８巻：１３３〜１５５頁；Newman, A. & Norman, C.（１９９
１年）Cell、６５巻、１１５頁；Wyatt, J. R. et al.（１９９２年）Genes Dev
.、６巻、２５４２頁；Cortes, J. J. et al.（１９９３年）EMBO J.、１２巻、
５１８１頁；Sontheimer, E. J. & Steits（１９９３年）前記文献）。スプライ
シング反応終了後、成熟ｍＲＮＡが遊離され、スプライソソームは解離する（Mo
ore, J. M. et al（１９９３年）前記文献）。
【００１１】 選択的スプライシングは１つのおよび同一の一次転写産物から、種々のタンパ
ク質をコードする種々の成熟ｍＲＮＡを形成することを可能にする。多くの場合
、この選択的スプライシングは制御されている。従って、例えば、非機能性タン
パク質から機能性タンパク質へのスイッチングの目的でこの機構を利用すること
が可能である（例えば、ショウジョウバエにおけるトランスポゼース）。さらに
選択的スプライシングが組織特異的に実施されることも知られている。従って、
例えば、ｓｒｃ原癌遺伝子によりコードされているチロシンキナーゼは、選択的
スプライシングにより神経細胞において特異的形態で合成される。
ク質をコードする種々の成熟ｍＲＮＡを形成することを可能にする。多くの場合
、この選択的スプライシングは制御されている。従って、例えば、非機能性タン
パク質から機能性タンパク質へのスイッチングの目的でこの機構を利用すること
が可能である（例えば、ショウジョウバエにおけるトランスポゼース）。さらに
選択的スプライシングが組織特異的に実施されることも知られている。従って、
例えば、ｓｒｃ原癌遺伝子によりコードされているチロシンキナーゼは、選択的
スプライシングにより神経細胞において特異的形態で合成される。
【００１２】 間違って制御されたまたは実行された選択的スプライシングは種々の状態をも
たらすであろう。グレーブス病を患う患者においては、間違ったスプライシング
がきわめて重要な酵素（サイロペルオキシダーゼ）を不活性な形で産生すること
が示されている（Zanelli, E.（１９９０年）Biochem. Biophys. Res. Comm.、
１７０巻、７２５頁）。棘筋萎縮症の研究は、ＳＭＮ（運動ニューロンの生存）
遺伝子の欠陥遺伝子産物がｓｎＲＮＰの形成をかなり破壊することを示している
。運動ニューロンのスプライシング装置の阻害は神経細胞の麻痺および筋肉組織
の退化をもたらす（Fischer, U. et al.（１９９７年）、Cell、９０巻：１０２
３〜９頁；Liu, Q. et al.（１９９７年）、Cell、９０巻：１０１３〜２１頁；
Lefebvre, S. et al.（１９９７年）Nat. Genet.１６巻、２６５頁）。とりわけ
、膜結合分子ＣＤ４４の特定の選択的スプライシング変異体は、癌細胞転移の決
定的部分で働いているようにみえる。ＣＤ４４遺伝子は多数のエキソンを含み、
そのうちの１０のエキソンは互いに隣に位置しているが、ｍＲＮＡ生成の間に異
なった取り合わせでｍＲＮＡ前駆体からスプライシングされる。ラット癌腫細胞
において、転移変異体がエキソン４から７、または６から７を有することが検出
された。タンパク質のエキソン６にコードされた部分に対する抗体の助けによっ
て、転移を有効に抑制することが可能であった（Sherman, L. et al.（１９９６
年）Curr. Top. Microbiol. Immunol.２１３巻：２４９〜２６９頁）。
たらすであろう。グレーブス病を患う患者においては、間違ったスプライシング
がきわめて重要な酵素（サイロペルオキシダーゼ）を不活性な形で産生すること
が示されている（Zanelli, E.（１９９０年）Biochem. Biophys. Res. Comm.、
１７０巻、７２５頁）。棘筋萎縮症の研究は、ＳＭＮ（運動ニューロンの生存）
遺伝子の欠陥遺伝子産物がｓｎＲＮＰの形成をかなり破壊することを示している
。運動ニューロンのスプライシング装置の阻害は神経細胞の麻痺および筋肉組織
の退化をもたらす（Fischer, U. et al.（１９９７年）、Cell、９０巻：１０２
３〜９頁；Liu, Q. et al.（１９９７年）、Cell、９０巻：１０１３〜２１頁；
Lefebvre, S. et al.（１９９７年）Nat. Genet.１６巻、２６５頁）。とりわけ
、膜結合分子ＣＤ４４の特定の選択的スプライシング変異体は、癌細胞転移の決
定的部分で働いているようにみえる。ＣＤ４４遺伝子は多数のエキソンを含み、
そのうちの１０のエキソンは互いに隣に位置しているが、ｍＲＮＡ生成の間に異
なった取り合わせでｍＲＮＡ前駆体からスプライシングされる。ラット癌腫細胞
において、転移変異体がエキソン４から７、または６から７を有することが検出
された。タンパク質のエキソン６にコードされた部分に対する抗体の助けによっ
て、転移を有効に抑制することが可能であった（Sherman, L. et al.（１９９６
年）Curr. Top. Microbiol. Immunol.２１３巻：２４９〜２６９頁）。
【００１３】 間違ったスプライシングは影響を受けた生体の強度に発達した表現型をもたら
すであろう。したがって、β−グロビンイントロン中の点突然変異はβ＋サラセ
ミアをもたらすであろうことが知られている。この点突然変異は間違ったスプラ
イシング位置を生み出し、それは変更された読み取り枠およびペプチド鎖の予備
的終結をもたらす（Weatherall, D. J. & Clegg, J. B.（１９８２年）Cell、２
９巻、７頁；Fukumaki, Y. et al.（１９８２年）Cell、２８巻、５８５頁）。
例えば、シロイヌナズナ変異体において、フィトクロムＢ遺伝子の５’スプライ
シング部位での点突然変異は遺伝子の間違った発現をもたらす。この修飾は、そ
の配列が停止コドンを含むイントロンを除去することを不可能にする。この遺伝
子は、植物形態形成に関与するため植物の発育が停止する（Bradley, J. M. et
al.（１９９５年）Plant Mol. Biol.、２７巻、１１３３頁）。
すであろう。したがって、β−グロビンイントロン中の点突然変異はβ＋サラセ
ミアをもたらすであろうことが知られている。この点突然変異は間違ったスプラ
イシング位置を生み出し、それは変更された読み取り枠およびペプチド鎖の予備
的終結をもたらす（Weatherall, D. J. & Clegg, J. B.（１９８２年）Cell、２
９巻、７頁；Fukumaki, Y. et al.（１９８２年）Cell、２８巻、５８５頁）。
例えば、シロイヌナズナ変異体において、フィトクロムＢ遺伝子の５’スプライ
シング部位での点突然変異は遺伝子の間違った発現をもたらす。この修飾は、そ
の配列が停止コドンを含むイントロンを除去することを不可能にする。この遺伝
子は、植物形態形成に関与するため植物の発育が停止する（Bradley, J. M. et
al.（１９９５年）Plant Mol. Biol.、２７巻、１１３３頁）。
【００１４】 現在に至るまで、細胞におけるスプライシング過程の影響を記載した研究はわ
ずかしか知られていない。したがって、スプライシング装置の成分に対する抗血
清またはモノクローナル抗体の助けによって成熟ｍＲＮＡの生成を妨げることは
可能である（Padgett, R. A. et al.（１９８３年）Cell、３５巻、１０頁；Gat
toni, R. et al.（１９９６年）Nucleic Acid Res.、２４巻、２５３５頁）。
ずかしか知られていない。したがって、スプライシング装置の成分に対する抗血
清またはモノクローナル抗体の助けによって成熟ｍＲＮＡの生成を妨げることは
可能である（Padgett, R. A. et al.（１９８３年）Cell、３５巻、１０頁；Gat
toni, R. et al.（１９９６年）Nucleic Acid Res.、２４巻、２５３５頁）。
【００１５】 インフルエンザウイルスゲノムによりコードされているＮＳ１タンパク質はＵ
６ ｓｎＲＮＡに結合することによりスプライシングを同様に妨害することがで
きる。このタンパク質はヒトＵ６ ｓｎＲＮＡのヌクレオチド２７〜４６および
８３〜１０１に結合し、スプライシング過程の間にＵ６が結合相手であるＵ２お
よびＵ４と相互作用できることを妨げる（Fortes, P. et al.（１９９４年）EMB
O J.、１３巻、７０４頁；Qiu, Y. & Krug, R. M.（１９９５年）J. Virol.、６
８巻、２４２５頁）。さらに、ＮＳ１タンパク質は形成されたｍＲＮＡのポリＡ
尾部に結合することにより核からの移送も妨げると思われる（Fortes, P. et al
.（１９９４年）、前記文献；Qiu, Y. & Krug, R. M.（１９９４年）、前記文献
）。同様の作用がヘルペス単純ウイルスＩ型ゲノムの遺伝子産物について記載さ
れている。インビトロ実験において、タンパク質ＩＣＰ２７はモデルＲＮＡ（β
−グロビンｍＲＮＡ前駆体）のスプライシングを効果的に防止することができた
（Hardy, W. R. & Sandri-Goldin, R. M.（１９９４年）J. Virol.、６８巻、７
７９０頁）。加えて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのラージサブユニットのＣ末端ド
メインから生成させたペプチドは、スプライシング過程を同様に妨害することが
できるように思われる（Yurvey, A. et al.（１９９６年）Proc. Natl. Acad. S
ci. USA、９３巻、６９７５頁；WO97/20031）。スプライシングされるべきｍＲ
ＮＡ内への人工ヌクレオチド類似体（５−フルオロ、５−クロロまたは５−ブロ
モウリジン）の取り込みは、インビトロにおいて同様にスプライシング過程の阻
害をもららすようにみえる（Sierakowska, H. et al.（１９８９年）J. Biol. C
hem.、２６４巻、１９１８５頁；Wu, X. P. & Dolnick, B.（１９９３年）Mol.
Pharmacol.、４４巻、２２頁）。
６ ｓｎＲＮＡに結合することによりスプライシングを同様に妨害することがで
きる。このタンパク質はヒトＵ６ ｓｎＲＮＡのヌクレオチド２７〜４６および
８３〜１０１に結合し、スプライシング過程の間にＵ６が結合相手であるＵ２お
よびＵ４と相互作用できることを妨げる（Fortes, P. et al.（１９９４年）EMB
O J.、１３巻、７０４頁；Qiu, Y. & Krug, R. M.（１９９５年）J. Virol.、６
８巻、２４２５頁）。さらに、ＮＳ１タンパク質は形成されたｍＲＮＡのポリＡ
尾部に結合することにより核からの移送も妨げると思われる（Fortes, P. et al
.（１９９４年）、前記文献；Qiu, Y. & Krug, R. M.（１９９４年）、前記文献
）。同様の作用がヘルペス単純ウイルスＩ型ゲノムの遺伝子産物について記載さ
れている。インビトロ実験において、タンパク質ＩＣＰ２７はモデルＲＮＡ（β
−グロビンｍＲＮＡ前駆体）のスプライシングを効果的に防止することができた
（Hardy, W. R. & Sandri-Goldin, R. M.（１９９４年）J. Virol.、６８巻、７
７９０頁）。加えて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのラージサブユニットのＣ末端ド
メインから生成させたペプチドは、スプライシング過程を同様に妨害することが
できるように思われる（Yurvey, A. et al.（１９９６年）Proc. Natl. Acad. S
ci. USA、９３巻、６９７５頁；WO97/20031）。スプライシングされるべきｍＲ
ＮＡ内への人工ヌクレオチド類似体（５−フルオロ、５−クロロまたは５−ブロ
モウリジン）の取り込みは、インビトロにおいて同様にスプライシング過程の阻
害をもららすようにみえる（Sierakowska, H. et al.（１９８９年）J. Biol. C
hem.、２６４巻、１９１８５頁；Wu, X. P. & Dolnick, B.（１９９３年）Mol.
Pharmacol.、４４巻、２２頁）。
【００１６】 多くの更なる研究はスプライシングに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
の作用に関している。したがって、ラットのｃ−ｅｒｂ原癌遺伝子ｍＲＮＡの２
つの異なるスプライシング産物（ｃ−ｅｒｂＡ−アルファ１および２）の比は他
のｍＲＮＡ、ｒｅｖ−ＥｒｂＡ−アルファにより制御されていると思われる。ｒ
ｅｖ−ＥｒｂＡ−アルファは天然に存在するアンチセンスＲＮＡであり、これは
ｃ−ｅｒｂＡ−アルファ２ ｍＲＮＡと対を形成するがｃ−ｅｒｂＡ−アルファ
１ ｍＲＮＡとは対を形成しない。３’スプライシング部位と相補的であるｒｅ
ｖ−ＥｒｂＡ−アルファｍＲＮＡ構築物が過剰にあると、ｃ−ｅｒｂＡ−アルフ
ァｍＲＮＡ前駆体のｃ−ｅｒｂＡ−アルファ２ ｍＲＮＡへのスプライシングを
有効に阻害することが可能である（Munroe, S. H. & Lazar, M. A.（１９９１年
）J. Biol. Chem. ２６６巻（３３）、２２０８３頁）。さらに、スプライシン
グされるべきｍＲＮＡのイントロン配列に結合するアンチセンスＲＮＡの生成は
同様にスプライシングを阻害することが示されている（Volloch, V. et al.（１
９９１年）Biochem. Biophys. Res. Comm.、１７９巻、１６００頁）。Hodgesお
よびCrookeは、弱く認識されるスプライシング部位に対して、スプライシングを
うまく停止させるためにはオリゴヌクレオチドの結合で十分であることを示すこ
とができた。しかしながら、好適に認識されるスプライシング部位が構築物に取
り込まれる場合には、さらにＲＮａｓｅ Ｈの活性化を引き起こすことができる
オリゴヌクレオチドが必要とされる（Hodges, D. & Crooke S. T.（１９９５年
）Mol. Pharmacol.、４８巻、９０５頁）。スプライシングに必要とされるｍＲ
ＮＡ前駆体のより詳細な分析は、分岐点のアデノシンから上流の１９ヌクレオチ
ド並びに３’および５’スプライシング部位周辺の２５ヌクレオチドがアンチセ
ンスＲＮＡを生成に適した配列であることを示している（Dominski, Z. & Kole,
R.（１９９４年）Mol. Cell Biol.、１４巻、７４４５頁）。アンチセンス分子
による研究は特にウイルスの阻害について実施された。高等生物に影響を及ぼす
ウイルスの多くはそのゲノム内にイントロン含有遺伝子を有する。したがって、
ヘルペス単純ウイルスの極初期ｍＲＮＡ前駆体４／５遺伝子の３’スプライシン
グ部位に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドがベロ細胞におけるウイルス複
製を阻害できたことを示すことが可能であった（Iwatani, W. et al.（１９９６
年）Drug Delivery Syst.、１１巻、４２７頁）。
の作用に関している。したがって、ラットのｃ−ｅｒｂ原癌遺伝子ｍＲＮＡの２
つの異なるスプライシング産物（ｃ−ｅｒｂＡ−アルファ１および２）の比は他
のｍＲＮＡ、ｒｅｖ−ＥｒｂＡ−アルファにより制御されていると思われる。ｒ
ｅｖ−ＥｒｂＡ−アルファは天然に存在するアンチセンスＲＮＡであり、これは
ｃ−ｅｒｂＡ−アルファ２ ｍＲＮＡと対を形成するがｃ−ｅｒｂＡ−アルファ
１ ｍＲＮＡとは対を形成しない。３’スプライシング部位と相補的であるｒｅ
ｖ−ＥｒｂＡ−アルファｍＲＮＡ構築物が過剰にあると、ｃ−ｅｒｂＡ−アルフ
ァｍＲＮＡ前駆体のｃ−ｅｒｂＡ−アルファ２ ｍＲＮＡへのスプライシングを
有効に阻害することが可能である（Munroe, S. H. & Lazar, M. A.（１９９１年
）J. Biol. Chem. ２６６巻（３３）、２２０８３頁）。さらに、スプライシン
グされるべきｍＲＮＡのイントロン配列に結合するアンチセンスＲＮＡの生成は
同様にスプライシングを阻害することが示されている（Volloch, V. et al.（１
９９１年）Biochem. Biophys. Res. Comm.、１７９巻、１６００頁）。Hodgesお
よびCrookeは、弱く認識されるスプライシング部位に対して、スプライシングを
うまく停止させるためにはオリゴヌクレオチドの結合で十分であることを示すこ
とができた。しかしながら、好適に認識されるスプライシング部位が構築物に取
り込まれる場合には、さらにＲＮａｓｅ Ｈの活性化を引き起こすことができる
オリゴヌクレオチドが必要とされる（Hodges, D. & Crooke S. T.（１９９５年
）Mol. Pharmacol.、４８巻、９０５頁）。スプライシングに必要とされるｍＲ
ＮＡ前駆体のより詳細な分析は、分岐点のアデノシンから上流の１９ヌクレオチ
ド並びに３’および５’スプライシング部位周辺の２５ヌクレオチドがアンチセ
ンスＲＮＡを生成に適した配列であることを示している（Dominski, Z. & Kole,
R.（１９９４年）Mol. Cell Biol.、１４巻、７４４５頁）。アンチセンス分子
による研究は特にウイルスの阻害について実施された。高等生物に影響を及ぼす
ウイルスの多くはそのゲノム内にイントロン含有遺伝子を有する。したがって、
ヘルペス単純ウイルスの極初期ｍＲＮＡ前駆体４／５遺伝子の３’スプライシン
グ部位に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドがベロ細胞におけるウイルス複
製を阻害できたことを示すことが可能であった（Iwatani, W. et al.（１９９６
年）Drug Delivery Syst.、１１巻、４２７頁）。
【００１７】 スプライシング機構は一般には最初にインビトロ転写でｍＲＮＡを調製するこ
とにより研究される。この目的のために、ウイルス、例えばアデノウイルスまた
は細胞性構造遺伝子からの遺伝子構築物が使用される。この種のｍＲＮＡは、ス
プライソソームによるｍＲＮＡの認識およびスプライシング過程に必要であるす
べての重要な構造要素を含む。一般的には、ウレア変性ポリアクリルアミドゲル
での分画後の特徴的なバンドパターンにより、スプライシング反応が起こったか
どうか、またはこの反応工程で破壊が起こったかどうかの評価を可能にするため
にｍＲＮＡは放射性標識される。しかしながら、この種の試験系は非常に時間が
かかり且つ労力を要するため、スプライシングを調節できる物質を系統的に発見
することには適していない。
とにより研究される。この目的のために、ウイルス、例えばアデノウイルスまた
は細胞性構造遺伝子からの遺伝子構築物が使用される。この種のｍＲＮＡは、ス
プライソソームによるｍＲＮＡの認識およびスプライシング過程に必要であるす
べての重要な構造要素を含む。一般的には、ウレア変性ポリアクリルアミドゲル
での分画後の特徴的なバンドパターンにより、スプライシング反応が起こったか
どうか、またはこの反応工程で破壊が起こったかどうかの評価を可能にするため
にｍＲＮＡは放射性標識される。しかしながら、この種の試験系は非常に時間が
かかり且つ労力を要するため、スプライシングを調節できる物質を系統的に発見
することには適していない。
【００１８】 したがって、本発明の１つの目的は、核酸のスプライシングに対する作用につ
いて、化学物質または天然物質のライブラリーから多数の化合物を簡便且つ効果
的な様式で研究することを可能にする試験系を発見することである（高処理量ス
クリーニング）。
いて、化学物質または天然物質のライブラリーから多数の化合物を簡便且つ効果
的な様式で研究することを可能にする試験系を発見することである（高処理量ス
クリーニング）。
【００１９】 驚くべきことに、スプライシング反応を検出するためのゲル無し検出系を含む
試験系が、従来の試験系の上記欠点を克服するのに適しており、したがって高処
理量スクリーニング、例えばロボット系に適していることが見出された。
試験系が、従来の試験系の上記欠点を克服するのに適しており、したがって高処
理量スクリーニング、例えばロボット系に適していることが見出された。
【００２０】 したがって、本発明は、 （ａ）少なくとも１つのスプライシング可能な核酸を有する１つまたはそれ以上
の同一のまたは異なった固定化された核酸 （ｂ）スプライシング反応を検出するための少なくとも１つのゲル無し検出系、
適切な場合には （ｃ）スプライシング成分を含む少なくとも１つの組成物、および好ましくは （ｄ）好適な検出プローブ、および、適切な場合には （ｅ）さらなる補助物、 含む試験系に関する。
の同一のまたは異なった固定化された核酸 （ｂ）スプライシング反応を検出するための少なくとも１つのゲル無し検出系、
適切な場合には （ｃ）スプライシング成分を含む少なくとも１つの組成物、および好ましくは （ｄ）好適な検出プローブ、および、適切な場合には （ｅ）さらなる補助物、 含む試験系に関する。
【００２１】 スプライシング過程を研究するためのゲル無し検出系を提供するため、試験さ
れるべき核酸を固相に固定化する必要がある。核酸は例えば、スプライシングさ
れるべき核酸内に特別の構造要素、例えばアプタマーを導入して上記構造要素の
結合相手を用いることにより、またはハイブリダイゼーションにより共有結合で
固定することができる。
れるべき核酸を固相に固定化する必要がある。核酸は例えば、スプライシングさ
れるべき核酸内に特別の構造要素、例えばアプタマーを導入して上記構造要素の
結合相手を用いることにより、またはハイブリダイゼーションにより共有結合で
固定することができる。
【００２２】 更に都合のよいことには、スプライシングが起こったか起こっていないかを検
出することを容易にするのに適したプローブをゲル無し試験系のために生成させ
る必要がある。上記プローブは例えば、試験されるべき核酸とのハイブリダイゼ
ーションに使用されるオリゴヌクレオチドまたは試験されるべき核酸内に導入さ
れた構造要素に結合する結合相手でもよい。
出することを容易にするのに適したプローブをゲル無し試験系のために生成させ
る必要がある。上記プローブは例えば、試験されるべき核酸とのハイブリダイゼ
ーションに使用されるオリゴヌクレオチドまたは試験されるべき核酸内に導入さ
れた構造要素に結合する結合相手でもよい。
【００２３】 従って、ゲル無し検出系は好ましくは少なくとも１つのプローブを含む。この
プローブは、特に、スプライシング可能な核酸に相補的な核酸、スプライシング
可能な核酸を結合させる低分子量化合物、および／またはスプライシング可能な
核酸を結合させるペプチドまたはタンパク質である。
プローブは、特に、スプライシング可能な核酸に相補的な核酸、スプライシング
可能な核酸を結合させる低分子量化合物、および／またはスプライシング可能な
核酸を結合させるペプチドまたはタンパク質である。
【００２４】 好ましい態様において、スプライシング可能な核酸は少なくとも１つのイント
ロンにより分離されている少なくとも２つのエキソンを含む。 例えば、相補的核酸は、少なくとも１つのイントロン、少なくとも１つのエキ
ソン、および／または少なくとも１つのエキソン／イントロン移行部位、および
／または２つのエキソンの融合後に生成したエキソン／エキソン境界域に相補的
である。ここで相補的核酸はスプライシング反応を検出するためのプローブとし
て役に立つ。
ロンにより分離されている少なくとも２つのエキソンを含む。 例えば、相補的核酸は、少なくとも１つのイントロン、少なくとも１つのエキ
ソン、および／または少なくとも１つのエキソン／イントロン移行部位、および
／または２つのエキソンの融合後に生成したエキソン／エキソン境界域に相補的
である。ここで相補的核酸はスプライシング反応を検出するためのプローブとし
て役に立つ。
【００２５】 したがって、例えば、ゲル無し検出系によりスプライシング反応の間に遊離さ
れたイントロンを検出することが可能であり、このことからスプライシング反応
の両工程が完了しているという結論が導かれる。あるいは、適した検出系、例え
ばエキソン／イントロン移行部位に相補的な核酸に基づいて、スプライシング過
程の間にイントロンからエキソンが除去されたかどうかを決定することが可能で
ある；このことは第１のスプライシング反応がイントロンの５’末端で起こった
かどうか、および／または第２のスプライシング反応がイントロンの３’末端で
起こったかどうかについての情報を提供する。他の検出形態を以下に詳細に例示
する。
れたイントロンを検出することが可能であり、このことからスプライシング反応
の両工程が完了しているという結論が導かれる。あるいは、適した検出系、例え
ばエキソン／イントロン移行部位に相補的な核酸に基づいて、スプライシング過
程の間にイントロンからエキソンが除去されたかどうかを決定することが可能で
ある；このことは第１のスプライシング反応がイントロンの５’末端で起こった
かどうか、および／または第２のスプライシング反応がイントロンの３’末端で
起こったかどうかについての情報を提供する。他の検出形態を以下に詳細に例示
する。
【００２６】 特に好ましい態様において、プローブは低分子量化合物、例えばテオフィリン
、キサンチンまたはトブラマイシンのようなアミノグリコシドである。例えば、
スプライシング可能な核酸またはスプライシング可能な核酸に相補的なゲル無し
検出系の核酸が「アプタマー構造」、即ちこの種の結合相手のための結合配列（
例えば、Jenison, R. D. et al（１９９４年）Science ２６３巻、１４２５〜１
４２９頁；Hamasaki, K. et al.（１９９８年）Biochem. ３７巻、６５６〜６６
３頁またはKiga, D. et al.（１９９８年）Nucleic Acids Res.、２６巻（７）
、１７５５〜１７６０頁を参照されたい）を含む場合は、スプライシング過程は
結合相手を介して特に容易に検出することができる。
、キサンチンまたはトブラマイシンのようなアミノグリコシドである。例えば、
スプライシング可能な核酸またはスプライシング可能な核酸に相補的なゲル無し
検出系の核酸が「アプタマー構造」、即ちこの種の結合相手のための結合配列（
例えば、Jenison, R. D. et al（１９９４年）Science ２６３巻、１４２５〜１
４２９頁；Hamasaki, K. et al.（１９９８年）Biochem. ３７巻、６５６〜６６
３頁またはKiga, D. et al.（１９９８年）Nucleic Acids Res.、２６巻（７）
、１７５５〜１７６０頁を参照されたい）を含む場合は、スプライシング過程は
結合相手を介して特に容易に検出することができる。
【００２７】 他の特に好ましい態様において、結合相手は核酸結合タンパク質、特に鉄応答
性配列結合タンパク質（ＩＢＰ）であり、これは核酸結合タンパク質の認識配列
、特に鉄応答性配列（ＩＲＥ）を認識する。起こったであろうスプライシング過
程はここでは核酸結合タンパク質を介して検出される。
性配列結合タンパク質（ＩＢＰ）であり、これは核酸結合タンパク質の認識配列
、特に鉄応答性配列（ＩＲＥ）を認識する。起こったであろうスプライシング過
程はここでは核酸結合タンパク質を介して検出される。
【００２８】 結合相手と核酸内の構造要素との間（低分子量化合物およびアプタマー、ＩＢ
ＰおよびＩＲＥ、オリゴヌクレオチドおよび核酸内の配列）の上記相互作用は試
験されるべきおよびスプライシング可能な核酸を固相に固定化するのに同様に適
している。この目的のためには、結合相手を好適な様式で固相に固定する必要が
ある。これに関連し、例えば、結合相手を固相に共有結合で結合させることが可
能である。さらに、ビオチンの核酸へのカップリングおよび固相に結合した（ス
トレプト）アビジンの使用は核酸の固定に適している。上記固定は例えば、抗体
／抗原相互作用を用いても達成することができる。
ＰおよびＩＲＥ、オリゴヌクレオチドおよび核酸内の配列）の上記相互作用は試
験されるべきおよびスプライシング可能な核酸を固相に固定化するのに同様に適
している。この目的のためには、結合相手を好適な様式で固相に固定する必要が
ある。これに関連し、例えば、結合相手を固相に共有結合で結合させることが可
能である。さらに、ビオチンの核酸へのカップリングおよび固相に結合した（ス
トレプト）アビジンの使用は核酸の固定に適している。上記固定は例えば、抗体
／抗原相互作用を用いても達成することができる。
【００２９】 一般的には、プローブは標識、例えば放射性標識、蛍光色素による標識、ビオ
チンによる標識、ジゴキシゲニンによる標識および／または抗体による標識を含
む。標識は好ましくはリガンド、例えば相補的核酸、低分子量化合物または核酸
結合タンパク質に結合している。特に蛍光色素の助けにより、例えば、少なくと
も１つの試験されるべき物質の存在下で、例えば、スプライシング過程の間に核
酸中のプローブの結合相手を除去することにより、スプライシング反応が妨害さ
れずに進行することが可能であるかどうかを、簡便且つ自動化された系では迅速
な様式で決定することが可能である。
チンによる標識、ジゴキシゲニンによる標識および／または抗体による標識を含
む。標識は好ましくはリガンド、例えば相補的核酸、低分子量化合物または核酸
結合タンパク質に結合している。特に蛍光色素の助けにより、例えば、少なくと
も１つの試験されるべき物質の存在下で、例えば、スプライシング過程の間に核
酸中のプローブの結合相手を除去することにより、スプライシング反応が妨害さ
れずに進行することが可能であるかどうかを、簡便且つ自動化された系では迅速
な様式で決定することが可能である。
【００３０】 他の好ましい態様において、スプライシング可能な核酸およびプローブ結合核
酸は互いに連結している。このことは、例えば、プローブ結合核酸の遊離により
、スプライシング反応を直接的に検出することを可能にする利点を有する。この
態様において、プローブ結合核酸は好ましくは、低分子量化合物、例えば「アプ
タマー」、および／または核酸結合タンパク質と結合できる核酸である。一般的
に、核酸の特定の構造要素がこの種のプローブの結合に応答性があるため、下記
の好ましい構築物において、プローブ結合核酸は構造要素「ＳＥ」と略記してお
り、ここで「３’領域」とは核酸の３’末端の核酸部分である。 １．５’エキソン内に導入された構造要素（ＳＥ）を有する構築物： −−−Ｔ７プロモーター−−−ＳＥ−−−エキソン１−−−イントロン−−−
エキソン２−−−３’領域−−− −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−ＳＥ−−−エキソン１−−−
イントロン−−−エキソン２−−−３’領域−−− ２．イントロン内に導入された構造要素を有する構築物： −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−イントロン−−−ＳＥ−−−
イントロン−−−エキソン２−−−３’領域−−− ３．３’エキソン内に導入された構造要素を有する構築物： −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−イントロン−−−エキソン２
−−−ＳＥ−−−エキソン２−−−３’領域−−− −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−イントロン−−−エキソン２
−−−ＳＥ−−−３’領域−−− −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−イントロン−−−エキソン２
−−−３’領域−−−ＳＥ−−−３’領域−−− −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−イントロン−−−エキソン２
−−−３’領域−−−ＳＥ−−− ４．１〜３に掲げた構築物の組み合わせを有する構築物 ５．種々の構造要素を有する構築物： −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−ＳＥ１−−−イントロン−−
−エキソン２−−−ＳＥ２−−−３’領域 −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−ＳＥ１−−−エキソン１−−
−イントロン−−−ＳＥ２−−−イントロン−−−エキソン２−−−ＳＥ３−−
−３’領域−−− １の構築物は特にスプライシング過程の間にイントロン配列からエキソン１を
除去できたかどうかを検出するのに役に立つ。２の構築物は除去されたイントロ
ン配列を直接的に検出するのに役に立つ。３の構築物はイントロン配列からのエ
キソン２をうまく除去することができたかどうかを検出するのに役に立つ。４の
構築物の組み合わせはスプライシング過程の間の個々の中間体および最終産物を
検出するのに役に立つ。エキソン１は一般的にイントロンの５’に位置すエキソ
ンであり、エキソン２は一般的にはイントロンの３’に位置するエキソンである
。
酸は互いに連結している。このことは、例えば、プローブ結合核酸の遊離により
、スプライシング反応を直接的に検出することを可能にする利点を有する。この
態様において、プローブ結合核酸は好ましくは、低分子量化合物、例えば「アプ
タマー」、および／または核酸結合タンパク質と結合できる核酸である。一般的
に、核酸の特定の構造要素がこの種のプローブの結合に応答性があるため、下記
の好ましい構築物において、プローブ結合核酸は構造要素「ＳＥ」と略記してお
り、ここで「３’領域」とは核酸の３’末端の核酸部分である。 １．５’エキソン内に導入された構造要素（ＳＥ）を有する構築物： −−−Ｔ７プロモーター−−−ＳＥ−−−エキソン１−−−イントロン−−−
エキソン２−−−３’領域−−− −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−ＳＥ−−−エキソン１−−−
イントロン−−−エキソン２−−−３’領域−−− ２．イントロン内に導入された構造要素を有する構築物： −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−イントロン−−−ＳＥ−−−
イントロン−−−エキソン２−−−３’領域−−− ３．３’エキソン内に導入された構造要素を有する構築物： −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−イントロン−−−エキソン２
−−−ＳＥ−−−エキソン２−−−３’領域−−− −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−イントロン−−−エキソン２
−−−ＳＥ−−−３’領域−−− −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−イントロン−−−エキソン２
−−−３’領域−−−ＳＥ−−−３’領域−−− −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−イントロン−−−エキソン２
−−−３’領域−−−ＳＥ−−− ４．１〜３に掲げた構築物の組み合わせを有する構築物 ５．種々の構造要素を有する構築物： −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−ＳＥ１−−−イントロン−−
−エキソン２−−−ＳＥ２−−−３’領域 −−−Ｔ７プロモーター−−−エキソン１−−−ＳＥ１−−−エキソン１−−
−イントロン−−−ＳＥ２−−−イントロン−−−エキソン２−−−ＳＥ３−−
−３’領域−−− １の構築物は特にスプライシング過程の間にイントロン配列からエキソン１を
除去できたかどうかを検出するのに役に立つ。２の構築物は除去されたイントロ
ン配列を直接的に検出するのに役に立つ。３の構築物はイントロン配列からのエ
キソン２をうまく除去することができたかどうかを検出するのに役に立つ。４の
構築物の組み合わせはスプライシング過程の間の個々の中間体および最終産物を
検出するのに役に立つ。エキソン１は一般的にイントロンの５’に位置すエキソ
ンであり、エキソン２は一般的にはイントロンの３’に位置するエキソンである
。
【００３１】 ５の構築物は種々の更なる認識配列を含み、それは一方では種々の検出系に関
係し、一方ではそれらの結合相手を介した固相への核酸の結合を容易にすること
ができる。したがって、例えば、固定化のために３’領域内にプローブ結合核酸
を導入すること、同時にスプライシング過程を検出するためにエキソン１内に他
のプローブ結合核酸を導入することが可能である（５の最初の構築物を参照され
たい）。さらに、例えば、３つの異なる核酸を導入することが可能である。これ
は、第１に全核酸を固定化し、第２に除去されたイントロンを検出し、且つ残っ
ている核酸へのエキソン１の結合を検出することに役立つ（５の第２の構築物を
参照されたい）。例として５に掲げた個々のプローブ結合核酸の位置は、１〜４
に記載の構築物によって変化してもよい。加えて、個々のプローブ結合核酸の正
確な位置は変化可能である。
係し、一方ではそれらの結合相手を介した固相への核酸の結合を容易にすること
ができる。したがって、例えば、固定化のために３’領域内にプローブ結合核酸
を導入すること、同時にスプライシング過程を検出するためにエキソン１内に他
のプローブ結合核酸を導入することが可能である（５の最初の構築物を参照され
たい）。さらに、例えば、３つの異なる核酸を導入することが可能である。これ
は、第１に全核酸を固定化し、第２に除去されたイントロンを検出し、且つ残っ
ている核酸へのエキソン１の結合を検出することに役立つ（５の第２の構築物を
参照されたい）。例として５に掲げた個々のプローブ結合核酸の位置は、１〜４
に記載の構築物によって変化してもよい。加えて、個々のプローブ結合核酸の正
確な位置は変化可能である。
【００３２】 従って、他の態様において、核酸、好ましくはスプライシング可能な核酸、特
に前記の態様のいずれかの核酸は直接的に共有結合で、または構造要素および構
造要素の結合相手を介して間接的に、またはハイブリダイゼーション法により固
相に結合される。
に前記の態様のいずれかの核酸は直接的に共有結合で、または構造要素および構
造要素の結合相手を介して間接的に、またはハイブリダイゼーション法により固
相に結合される。
【００３３】 直接的な共有結合は例えば、核酸のリボース骨格の３’末端シス−ジオール基
を介して起こっていてもよい。例えば、３’末端リボースの隣位２’３’ヒドロ
キシル基の過ヨウ素酸酸化後に固相のヒドラジン基にＲＮＡを結合させることが
可能である。間接的な結合には、例えば、ビオチンリンカーまたはジカルボン酸
リンカーのようなリンカーが適している。しかしながら、上記したように、核酸
は、結合相手を介して、例えば、テオフィリン、キサンチンまたはトブラマイシ
ンのようなアミノグリコシドを介して、および／または例えば、ＩＢＰのような
核酸結合タンパク質を介しても結合する。
を介して起こっていてもよい。例えば、３’末端リボースの隣位２’３’ヒドロ
キシル基の過ヨウ素酸酸化後に固相のヒドラジン基にＲＮＡを結合させることが
可能である。間接的な結合には、例えば、ビオチンリンカーまたはジカルボン酸
リンカーのようなリンカーが適している。しかしながら、上記したように、核酸
は、結合相手を介して、例えば、テオフィリン、キサンチンまたはトブラマイシ
ンのようなアミノグリコシドを介して、および／または例えば、ＩＢＰのような
核酸結合タンパク質を介しても結合する。
【００３４】 核酸を支持体結合リガンドに固定化するのに適しているものは、例えば、テオ
フィリンが支持体に結合した結合相手の場合にはテオフィリンアプタマーＴｈ（
Ｋｄ＝０．９μＭ）（例えば、Jenison, R. G. et al.（１９９４年）前記文献
を参照されたい）であり、またはトブラマイシンが支持体に結合した結合相手の
場合にはトブラマイシンアプタマーの最小体Ｔｏ（Ｋｄ＝０．２μＭ）（Hamasa
ki, K. et al.（１９９８年）前記文献）である。これらの２つのアプタマーの
配列は好ましくは下記の配列である： Ｔｈ：AAGUGAUACC AGCAUCGUCU UGAUGCCCUU GGCAGCACUU（４０ｍｅｒ） Ｔｏ：GGCUUAGUAU AGCGAGGUUU AGCUACACUC GUGCUGAGCC（４０ｍｅｒ） ここで固相は例えば、セラミック、金属、特に貴金属、ガラス、プラスチック
またはポリサッカリド、例えばアガロースポリマーである。
フィリンが支持体に結合した結合相手の場合にはテオフィリンアプタマーＴｈ（
Ｋｄ＝０．９μＭ）（例えば、Jenison, R. G. et al.（１９９４年）前記文献
を参照されたい）であり、またはトブラマイシンが支持体に結合した結合相手の
場合にはトブラマイシンアプタマーの最小体Ｔｏ（Ｋｄ＝０．２μＭ）（Hamasa
ki, K. et al.（１９９８年）前記文献）である。これらの２つのアプタマーの
配列は好ましくは下記の配列である： Ｔｈ：AAGUGAUACC AGCAUCGUCU UGAUGCCCUU GGCAGCACUU（４０ｍｅｒ） Ｔｏ：GGCUUAGUAU AGCGAGGUUU AGCUACACUC GUGCUGAGCC（４０ｍｅｒ） ここで固相は例えば、セラミック、金属、特に貴金属、ガラス、プラスチック
またはポリサッカリド、例えばアガロースポリマーである。
【００３５】 しかしながら、プローブ結合核酸、例えばアプタマーは結合標識プローブにも
適しており、その結果として例えば、アプタマー含有核酸を検出し、さらに定量
することが可能である。例えば、トブラマイシンを市販品として入手可能なＮＨ
２−反応性蛍光色素と反応させることが可能である（Wang, Y. et al.（１９９
６年）Biochemistry ３５巻、１２３３８〜１２３４６頁）。テオフィリンの場
合、アプタマーと結合できる３−メチルキサンチンの１−アミノアルキルまたは
１−チオアルキル誘導体の製造が選択される（Jenison, R. D. et al.（１９９
４年）、前記文献）。
適しており、その結果として例えば、アプタマー含有核酸を検出し、さらに定量
することが可能である。例えば、トブラマイシンを市販品として入手可能なＮＨ
２−反応性蛍光色素と反応させることが可能である（Wang, Y. et al.（１９９
６年）Biochemistry ３５巻、１２３３８〜１２３４６頁）。テオフィリンの場
合、アプタマーと結合できる３−メチルキサンチンの１−アミノアルキルまたは
１−チオアルキル誘導体の製造が選択される（Jenison, R. D. et al.（１９９
４年）、前記文献）。
【００３６】 本発明によれば、スプライシング可能な核酸とはスプライシングされることが
できる任意の核酸であり、好ましくはＲＮＡであり、例えば、「ｍＲＮＡ前駆体
」形態またはＲＮＡ部分を含むＤＮＡ形態のＲＮＡである。ＲＮＡが、すでに前
により詳細に説明したようなさらなるプローブ結合配列を含むべきである場合、
上記プローブ結合配列が、特定のスプライシング部位から少なくとも約２５ヌク
レオチド両方のエキソン側に、分岐点から少なくとも約１７ヌクレオチドイント
ロン側に、および／または５’スプライシング部位から少なくとも約７ヌクレオ
チドに位置していれば好都合である。このことは一般的にさらなるプローブ結合
配列がスプライシング反応を妨害できないことを保証している。
できる任意の核酸であり、好ましくはＲＮＡであり、例えば、「ｍＲＮＡ前駆体
」形態またはＲＮＡ部分を含むＤＮＡ形態のＲＮＡである。ＲＮＡが、すでに前
により詳細に説明したようなさらなるプローブ結合配列を含むべきである場合、
上記プローブ結合配列が、特定のスプライシング部位から少なくとも約２５ヌク
レオチド両方のエキソン側に、分岐点から少なくとも約１７ヌクレオチドイント
ロン側に、および／または５’スプライシング部位から少なくとも約７ヌクレオ
チドに位置していれば好都合である。このことは一般的にさらなるプローブ結合
配列がスプライシング反応を妨害できないことを保証している。
【００３７】 ヒト系においてスプライシングに好適なスプライシング可能な核酸の例は、Ｍ
ＩＮＸモデルｍＲＮＡ前駆体（ＭＩＮＸ＝微小野生型基質；Zillmann, M.、Zapp
, M. L.、Berget, S. M.（１９９８年）、Mol. Cell. Biol.、８巻：８１４〜２
１頁）である。ＭｌＮＸをコードするＤＮＡに、上記したような検出または固定
化に適したさらなるプローブ結合核酸を、好ましく保持された制限酵素切断部位
とともに、好ましく導入することが可能である。このことは、所望ならば、蛍光
信号を増大させまたは固相へのより強固な結合を可能にするために、検出または
固定化のための他の同一のまたは異なったプローブ結合核酸をさらなるクローニ
ング工程で取り込ませることを可能にする。
ＩＮＸモデルｍＲＮＡ前駆体（ＭＩＮＸ＝微小野生型基質；Zillmann, M.、Zapp
, M. L.、Berget, S. M.（１９９８年）、Mol. Cell. Biol.、８巻：８１４〜２
１頁）である。ＭｌＮＸをコードするＤＮＡに、上記したような検出または固定
化に適したさらなるプローブ結合核酸を、好ましく保持された制限酵素切断部位
とともに、好ましく導入することが可能である。このことは、所望ならば、蛍光
信号を増大させまたは固相へのより強固な結合を可能にするために、検出または
固定化のための他の同一のまたは異なったプローブ結合核酸をさらなるクローニ
ング工程で取り込ませることを可能にする。
【００３８】 ｍＲＮＡ前駆体は例えば、ｍＲＮＡ前駆体エキソン２の３’末端にＴｈまたは
Ｔｏアプタマーを挿入し、対応する結合相手を固相に共有結合で結合させること
により固定化される。対応するコード核酸配列を図１Ａおよび図１Ｂに示す。
Ｔｏアプタマーを挿入し、対応する結合相手を固相に共有結合で結合させること
により固定化される。対応するコード核酸配列を図１Ａおよび図１Ｂに示す。
【００３９】 これに関連して、例えば、適したアプタマー配列を、ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ドとして、コードＭｉｎｘ ＤＮＡのＢａｍＨＩ切断部位に、即ち、対応するＭ
ｉｎｘ ｍＲＮＡ前駆体の２１９位と２２０位との間に挿入する。
ドとして、コードＭｉｎｘ ＤＮＡのＢａｍＨＩ切断部位に、即ち、対応するＭ
ｉｎｘ ｍＲＮＡ前駆体の２１９位と２２０位との間に挿入する。
【００４０】 すでに上記したように、プローブ結合核酸をｍＲＮＡ前駆体イントロン構造内
に挿入することも可能であり、上記核酸はスプライシングにより遊離され、従っ
て例えば固定化したｍＲＮＡ中には存在しない。したがって、この種の構築物は
第１工程、即ちｍＲＮＡの開放および投げ縄状構造形成または第２工程、即ち投
げ縄状構造の除去におけるスプライシングの阻害を検出するのに適している。ス
プライシング過程の阻害の場合、プローブ結合核酸はｍＲＮＡ前駆体から除去さ
れないため、例えば、ｍＲＮＡ前駆体の固定化後に検出できるであろう。好適な
核酸構築物の例を図２Ａおよび図２Ｂにそのコード配列の形で示す。
に挿入することも可能であり、上記核酸はスプライシングにより遊離され、従っ
て例えば固定化したｍＲＮＡ中には存在しない。したがって、この種の構築物は
第１工程、即ちｍＲＮＡの開放および投げ縄状構造形成または第２工程、即ち投
げ縄状構造の除去におけるスプライシングの阻害を検出するのに適している。ス
プライシング過程の阻害の場合、プローブ結合核酸はｍＲＮＡ前駆体から除去さ
れないため、例えば、ｍＲＮＡ前駆体の固定化後に検出できるであろう。好適な
核酸構築物の例を図２Ａおよび図２Ｂにそのコード配列の形で示す。
【００４１】 この目的のために、例えば、適したアプタマー配列が、ＤＮＡオリゴヌクレオ
チドとして、コードＭｉｎｘ ＤＮＡのＰｓｔＩ切断部以内に、即ち対応するｍ
ＲＮＡ前駆体の８８位と８９位との間に挿入される。
チドとして、コードＭｉｎｘ ＤＮＡのＰｓｔＩ切断部以内に、即ち対応するｍ
ＲＮＡ前駆体の８８位と８９位との間に挿入される。
【００４２】 すでにより詳細に説明したように、第１のスプライシング工程においてスプラ
イソソームはイントロンの５’スプライシング部位でエキソン１とイントロンと
の間の結合を開裂させる。第２のスプライシング工程においてのみエキソン１お
よびエキソン２が共有結合で連結される。その結果として、エキソン１はスプラ
イシング反応の第１の工程の間はｍＲＮＡにもはや結合しておらず、従ってスプ
ライシング反応から除去可能である。例えば、イントロン中にアプタマー構造を
有する構築物に関しては、例えば、第１のスプライシング工程において阻害が起
こったかどうかについて述べることが可能である。例えば、異なるプローブを認
識する２つの異なるアプタマーがｍＲＮＡ前駆体のエキソン１の５’末端におよ
びイントロン内に取り込まれる場合には、試験系において第１のスプライシング
工程および第２のスプライシング工程の両方を追跡することが可能である。好適
な核酸構築物の例を図３Ａおよび図３Ｂにそのコード配列の形で示す。
イソソームはイントロンの５’スプライシング部位でエキソン１とイントロンと
の間の結合を開裂させる。第２のスプライシング工程においてのみエキソン１お
よびエキソン２が共有結合で連結される。その結果として、エキソン１はスプラ
イシング反応の第１の工程の間はｍＲＮＡにもはや結合しておらず、従ってスプ
ライシング反応から除去可能である。例えば、イントロン中にアプタマー構造を
有する構築物に関しては、例えば、第１のスプライシング工程において阻害が起
こったかどうかについて述べることが可能である。例えば、異なるプローブを認
識する２つの異なるアプタマーがｍＲＮＡ前駆体のエキソン１の５’末端におよ
びイントロン内に取り込まれる場合には、試験系において第１のスプライシング
工程および第２のスプライシング工程の両方を追跡することが可能である。好適
な核酸構築物の例を図３Ａおよび図３Ｂにそのコード配列の形で示す。
【００４３】 この目的のために、例えば、適したアプタマー配列が、ＤＮＡオリゴヌクレオ
チドとして、コードＭｉｎｘ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断部以内に、即ち対応する
ｍＲＮＡ前駆体の９位と１０位との間に挿入される。
チドとして、コードＭｉｎｘ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断部以内に、即ち対応する
ｍＲＮＡ前駆体の９位と１０位との間に挿入される。
【００４４】 酵母系での研究のため、例えば、酵母Ｕ３に対するｍＲＮＡ前駆体（Mougin,
A. et al.（１９９６年）、ＲＮＡ、２巻：１０７９〜９３頁）から出発し、例
えば、前記のテオフィリンまたはトブラマイシンアプタマーのような好適なアプ
タマーを取り込ませることが可能である。好適な核酸構築物の例を図４Ａから図
４Ｃにそのコード配列の形で示す。
A. et al.（１９９６年）、ＲＮＡ、２巻：１０７９〜９３頁）から出発し、例
えば、前記のテオフィリンまたはトブラマイシンアプタマーのような好適なアプ
タマーを取り込ませることが可能である。好適な核酸構築物の例を図４Ａから図
４Ｃにそのコード配列の形で示す。
【００４５】 図４Ａの核酸構築物は、例えば、好適なアプタマーを、ＤＮＡオリゴヌクレオ
チドとして、コードＵ３ ＤＮＡのＳａｃＩＩ切断部以内に、即ちＵ３ ＲＮＡ前
駆体の２２位と２３位との間に挿入することにより調製される。
チドとして、コードＵ３ ＤＮＡのＳａｃＩＩ切断部以内に、即ちＵ３ ＲＮＡ前
駆体の２２位と２３位との間に挿入することにより調製される。
【００４６】 図４Ｂの核酸構築物は、例えば、好適なアプタマーを、ＤＮＡオリゴヌクレオ
チドとして、コードＵ３ ＤＮＡのＢｓｔＮＩ切断部以内に、即ちＵ３ ＲＮＡ前
駆体の１０５位と１０６位との間に挿入することにより調製される。
チドとして、コードＵ３ ＤＮＡのＢｓｔＮＩ切断部以内に、即ちＵ３ ＲＮＡ前
駆体の１０５位と１０６位との間に挿入することにより調製される。
【００４７】 図５Ａの核酸配列はヒト系での研究に適している鉄応答性配列（ＩＲＥ）を有
する核酸配列の例である。ここでＩＲＥは前記アプタマーと同様にエキソン２の
３’末端に挿入されている。
する核酸配列の例である。ここでＩＲＥは前記アプタマーと同様にエキソン２の
３’末端に挿入されている。
【００４８】 酵母系での研究には、例えば、図５Ｂに示したようにＩＲＥをＵ３ ＲＮＡ前
駆体のエキソン２の３’末端に挿入することが可能である。 したがって、本発明はさらに、前に例示したようにスプライシングされるスプ
ライシング可能な核酸、および試験系を調製するためのそれらの使用に関する。
駆体のエキソン２の３’末端に挿入することが可能である。 したがって、本発明はさらに、前に例示したようにスプライシングされるスプ
ライシング可能な核酸、および試験系を調製するためのそれらの使用に関する。
【００４９】 本発明の試験系の助けによる個々のスプライシング反応の研究は、通常、個々
のスプライシング成分、好ましくは低分子リボ核タンパク質粒子（ｓｎＲＮＰ）
成分および非ｓｎＲＮＰ成分を含む組成物を使用することにより実施される。ｓ
ｎＲＮＰ成分は特にＵ１、Ｕ２、Ｕ４，Ｕ５および／またはＵ６タンパク質を含
む。研究のために特に適した細胞抽出物、特に真核生物細胞抽出物を使用するこ
とが選択される。例えば、動物細胞、特に哺乳動物細胞、特別にはヒーラー細胞
からの細胞抽出物、特にヒーラー細胞の核抽出物、または真菌、特に酵母の細胞
抽出物を、当業者には一般的に知られている方法に従って得ることが可能である
（実施例参照）。細胞抽出物は一般的にインビトロでスプライシングを実施する
ことができるすべての重要な因子を含む。
のスプライシング成分、好ましくは低分子リボ核タンパク質粒子（ｓｎＲＮＰ）
成分および非ｓｎＲＮＰ成分を含む組成物を使用することにより実施される。ｓ
ｎＲＮＰ成分は特にＵ１、Ｕ２、Ｕ４，Ｕ５および／またはＵ６タンパク質を含
む。研究のために特に適した細胞抽出物、特に真核生物細胞抽出物を使用するこ
とが選択される。例えば、動物細胞、特に哺乳動物細胞、特別にはヒーラー細胞
からの細胞抽出物、特にヒーラー細胞の核抽出物、または真菌、特に酵母の細胞
抽出物を、当業者には一般的に知られている方法に従って得ることが可能である
（実施例参照）。細胞抽出物は一般的にインビトロでスプライシングを実施する
ことができるすべての重要な因子を含む。
【００５０】 例えば、緩衝溶液、安定化剤および／またはエネルギー等価物、特にＡＴＰの
ようなさらなる補助物を使用することが研究を実施するために必須である。 したがって、本発明は試験系を調製する方法にも関しており、この試験系には
少なくとも１つの固定化されたスプライシング可能な核酸、および少なくとも１
つのゲル無し検出系、さらに適切な場合には、スプライシング成分を含む少なく
とも１つの組成物、および適切な場合には、さらなる補助物が混合されている。
個々の成分の好ましい態様はすでに前に詳細に説明されている。
ようなさらなる補助物を使用することが研究を実施するために必須である。 したがって、本発明は試験系を調製する方法にも関しており、この試験系には
少なくとも１つの固定化されたスプライシング可能な核酸、および少なくとも１
つのゲル無し検出系、さらに適切な場合には、スプライシング成分を含む少なく
とも１つの組成物、および適切な場合には、さらなる補助物が混合されている。
個々の成分の好ましい態様はすでに前に詳細に説明されている。
【００５１】 本発明はさらに、活性物質を発見するための方法であって： （ａ）１つまたはそれ以上の同一のまたは異なった固定化された核酸を、少なく
とも１つのスプライシング可能な核酸配列とともに、少なくとも１つの試験され
るべき物質、およびスプライシング成分を含む少なくとも１つの組成物、および
適切な場合には、さらなる補助物の存在下で、好適な条件下でインキュベートし
、および （ｂ）ゲル無し検出系によって形成されたスプライシング産物を検出する、 ことを含む方法に関する。
とも１つのスプライシング可能な核酸配列とともに、少なくとも１つの試験され
るべき物質、およびスプライシング成分を含む少なくとも１つの組成物、および
適切な場合には、さらなる補助物の存在下で、好適な条件下でインキュベートし
、および （ｂ）ゲル無し検出系によって形成されたスプライシング産物を検出する、 ことを含む方法に関する。
【００５２】 本発明の方法の好ましい個々の成分はすでに前に詳細に説明されている。 ここで活性物質とは医薬的に活性な化合物、殺真菌薬、除草剤、農薬および／
または殺虫剤であり、好ましくは抗生物質である。試験されるべき物質は一般的
に自然発生物質、自然発生物質で化学的に修飾された物質、および／または合成
物質である。本発明の方法は特に、「組み合わせ物質ライブラリー」を簡便且つ
迅速な様式でスクリーニングすることを可能にする。
または殺虫剤であり、好ましくは抗生物質である。試験されるべき物質は一般的
に自然発生物質、自然発生物質で化学的に修飾された物質、および／または合成
物質である。本発明の方法は特に、「組み合わせ物質ライブラリー」を簡便且つ
迅速な様式でスクリーニングすることを可能にする。
【００５３】 本明細書の導入部においてすでに種々の障害がスプライシング機構の破壊に帰
することを示した。従って本発明は障害の診断にも適している。 従って本発明はさらに障害を診断する方法であって： （ａ）１つまたはそれ以上の同一のまたは異なった固定化された核酸を、少なく
とも１つのスプライシング可能な核酸とともに、スプライシング成分を含む少な
くとも１つの組成物、および適切な場合には、さらなる補助物の存在下で、好適
な条件下でインキュベートし、および （ｂ）ゲル無し検出系によって形成されたスプライシング産物を検出する、 ことを含む方法にも関する。
することを示した。従って本発明は障害の診断にも適している。 従って本発明はさらに障害を診断する方法であって： （ａ）１つまたはそれ以上の同一のまたは異なった固定化された核酸を、少なく
とも１つのスプライシング可能な核酸とともに、スプライシング成分を含む少な
くとも１つの組成物、および適切な場合には、さらなる補助物の存在下で、好適
な条件下でインキュベートし、および （ｂ）ゲル無し検出系によって形成されたスプライシング産物を検出する、 ことを含む方法にも関する。
【００５４】 ここで診断されるべき障害は好ましくは遺伝的障害、がんおよび／またはウイ
ルス疾患、特にグレーブス病、棘筋萎縮症、β’サラセミア、ｃ−ｅｒｂ原癌遺
伝子に関連するがん、Ｃ型肝炎感染および／またはヘルペス単純ウイルス感染で
ある。スプライシング成分を含む組成物は、この場合、例えば、処置されたまた
は未処置の患者組織試料でよい。
ルス疾患、特にグレーブス病、棘筋萎縮症、β’サラセミア、ｃ−ｅｒｂ原癌遺
伝子に関連するがん、Ｃ型肝炎感染および／またはヘルペス単純ウイルス感染で
ある。スプライシング成分を含む組成物は、この場合、例えば、処置されたまた
は未処置の患者組織試料でよい。
【００５５】 以下の図面および実施例は本発明をより詳細に説明することを意図したもので
あり、本発明を制限するものではない。構築物をＤＮＡ配列中に示す。スプライ
シング可能なＲＮＡはインビトロ転写により生成することができ、以下にさらに
説明されている。
あり、本発明を制限するものではない。構築物をＤＮＡ配列中に示す。スプライ
シング可能なＲＮＡはインビトロ転写により生成することができ、以下にさらに
説明されている。
【００５６】 実施例 １．ＲＮＡ構築物 スプライシングされるべきｍＲＮＡはイントロンにより分断された少なくとも
２つのエキソンを含む。これらの配列に加えて、ＲＮＡ結合タンパク質または低
分子量化合物による特異的認識を容易にするのに適した配列が含まれる。上記結
合タンパク質または化合物のマトリックスへのカップリングを介して、ｍＲＮＡ
はマトリックスに選択的に結合する。あるいは、ｍＲＮＡもリボースの３’ＯＨ
基を介してマトリックスに直接的に共有結合でカップリングされる。
２つのエキソンを含む。これらの配列に加えて、ＲＮＡ結合タンパク質または低
分子量化合物による特異的認識を容易にするのに適した配列が含まれる。上記結
合タンパク質または化合物のマトリックスへのカップリングを介して、ｍＲＮＡ
はマトリックスに選択的に結合する。あるいは、ｍＲＮＡもリボースの３’ＯＨ
基を介してマトリックスに直接的に共有結合でカップリングされる。
【００５７】 ２．核抽出物の調製 ２．１ 哺乳動物細胞からの核抽出物 核抽出物をヒーラー細胞の細胞培養物を用いることによって哺乳動物細胞から
調製する。この目的のため、細胞を遠心分離（１,０００×ｇ、１０分）により
培地から沈降させ、リン酸緩衝液で洗浄する。次に細胞沈降物を５倍容量の緩衝
液Ａ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．
５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．９、４℃）にとり、１０分間インキュベートする。細
胞を再び沈降させ、２倍容量の緩衝液Ａにとる。この懸濁液をＤｏｕｎｃｅホモ
ジナイザー（乳棒Ｂ）（乳棒を上下に１０回動かす）で破壊する。核を遠心分離
により沈降させる。最後に、核を再び緩衝液Ａにとり、２５,０００×ｇで２０
分間遠心分離する。沈降物を３ｍｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５％
（ｖ／ｖ）グリセロール、０．４２Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．
２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ
）、０．５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．９）にとり、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを
使用して再び破壊する。生成した懸濁液をマグネチックスターラー上で３０分間
インキュベートし、その後２５,０００×ｇで３０分間遠心分離する。この液を
再び２５,０００×ｇ（３０分）で遠心分離する。透明な上清を５０倍容量の緩
衝液Ｃ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１Ｍ ＫＣ
ｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７
．９）に対して透析する。透析液を遠心分離し（２５,０００×ｇ、２０分）、
得られた上清は核抽出物として液体窒素中で保存することができる（Dignam, J.
D. et al.（１９８３年）Nucleic Acid Res.、１１巻、１４７５頁）。 ２．２ 酵母細胞からの細胞抽出物 酵母細胞からの細胞抽出物を非常に類似した方法で調製する。プロテアーゼ欠
損株の酵母細胞（ＢＪ９２６、ＥＪ１０１または類似の株）を対数増殖期に遠心
分離（１,５００×ｇ、５分、４℃）により沈降させる。細胞を２〜４倍容量の
氷冷水に再懸濁し、再び１,５００×ｇで遠心分離（５分、４℃）する。次に細
胞を１倍容量のザイモリエース緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１Ｍソルビトール、３０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）にとり、室温
で３０分間インキュベートする。細胞を遠心分離（１,５００×ｇ、５分、４℃
）により除去し、２ｍｇ（２００Ｕ）のザイモリエース１００Ｔを添加した３倍
容量のザイモリエース緩衝液にとり、シェーカー（５０ｒｐｍ）上、３０℃で４
０分間インキュベートする。形成されたスフェロプラストを遠心分離（１,５０
０×ｇ、５分、４℃）により除去し、２ｍｌの氷冷ザイモリエース緩衝液で１回
洗浄する。沈降物を２倍容量の溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭ ＤＴＴ、プ
ロテアーゼ阻害剤、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）で洗浄し、最後に１倍容量
の溶解緩衝液にとる。次にスフェロプラストを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー中
で乳棒を上下に１５〜２０回動かすことにより（距離１〜２μｍ）溶解させる。
同一容量の抽出緩衝液（溶解緩衝液＋０．８Ｍ硫酸アンモニウム、２０％（ｖ／
ｖ）グリセロール）を溶解物に加え、混合物をエンドオバーエンド（end-over-e
nd）シェーカー上で１５〜３０分間インキュベートする（４℃）。続いて、１０
０,０００×ｇで９０分間遠心分離する（４℃）。上清を１００倍容量の保存緩
衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グ
リセロール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤、１ｍＭ
ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に対して透析する。透析物を１０,０００×ｇ（４℃）
の遠心分離により除去し、上清を液体窒素中に保存する（Dunn, B. & Wobbe, C.
R.（１９９４年）Preparation of protein extracts from yeast：Ausubel, F.
M. et al. 編、Current Protocols in Molecular Biolody、第２巻、John Wile
y and Sons, Inc.、USA、ｐｐ．１３．１３．１〜１３．１３．９）。
調製する。この目的のため、細胞を遠心分離（１,０００×ｇ、１０分）により
培地から沈降させ、リン酸緩衝液で洗浄する。次に細胞沈降物を５倍容量の緩衝
液Ａ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．
５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．９、４℃）にとり、１０分間インキュベートする。細
胞を再び沈降させ、２倍容量の緩衝液Ａにとる。この懸濁液をＤｏｕｎｃｅホモ
ジナイザー（乳棒Ｂ）（乳棒を上下に１０回動かす）で破壊する。核を遠心分離
により沈降させる。最後に、核を再び緩衝液Ａにとり、２５,０００×ｇで２０
分間遠心分離する。沈降物を３ｍｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５％
（ｖ／ｖ）グリセロール、０．４２Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．
２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ
）、０．５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．９）にとり、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを
使用して再び破壊する。生成した懸濁液をマグネチックスターラー上で３０分間
インキュベートし、その後２５,０００×ｇで３０分間遠心分離する。この液を
再び２５,０００×ｇ（３０分）で遠心分離する。透明な上清を５０倍容量の緩
衝液Ｃ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１Ｍ ＫＣ
ｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７
．９）に対して透析する。透析液を遠心分離し（２５,０００×ｇ、２０分）、
得られた上清は核抽出物として液体窒素中で保存することができる（Dignam, J.
D. et al.（１９８３年）Nucleic Acid Res.、１１巻、１４７５頁）。 ２．２ 酵母細胞からの細胞抽出物 酵母細胞からの細胞抽出物を非常に類似した方法で調製する。プロテアーゼ欠
損株の酵母細胞（ＢＪ９２６、ＥＪ１０１または類似の株）を対数増殖期に遠心
分離（１,５００×ｇ、５分、４℃）により沈降させる。細胞を２〜４倍容量の
氷冷水に再懸濁し、再び１,５００×ｇで遠心分離（５分、４℃）する。次に細
胞を１倍容量のザイモリエース緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１Ｍソルビトール、３０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）にとり、室温
で３０分間インキュベートする。細胞を遠心分離（１,５００×ｇ、５分、４℃
）により除去し、２ｍｇ（２００Ｕ）のザイモリエース１００Ｔを添加した３倍
容量のザイモリエース緩衝液にとり、シェーカー（５０ｒｐｍ）上、３０℃で４
０分間インキュベートする。形成されたスフェロプラストを遠心分離（１,５０
０×ｇ、５分、４℃）により除去し、２ｍｌの氷冷ザイモリエース緩衝液で１回
洗浄する。沈降物を２倍容量の溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭ ＤＴＴ、プ
ロテアーゼ阻害剤、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）で洗浄し、最後に１倍容量
の溶解緩衝液にとる。次にスフェロプラストを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー中
で乳棒を上下に１５〜２０回動かすことにより（距離１〜２μｍ）溶解させる。
同一容量の抽出緩衝液（溶解緩衝液＋０．８Ｍ硫酸アンモニウム、２０％（ｖ／
ｖ）グリセロール）を溶解物に加え、混合物をエンドオバーエンド（end-over-e
nd）シェーカー上で１５〜３０分間インキュベートする（４℃）。続いて、１０
０,０００×ｇで９０分間遠心分離する（４℃）。上清を１００倍容量の保存緩
衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グ
リセロール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤、１ｍＭ
ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に対して透析する。透析物を１０,０００×ｇ（４℃）
の遠心分離により除去し、上清を液体窒素中に保存する（Dunn, B. & Wobbe, C.
R.（１９９４年）Preparation of protein extracts from yeast：Ausubel, F.
M. et al. 編、Current Protocols in Molecular Biolody、第２巻、John Wile
y and Sons, Inc.、USA、ｐｐ．１３．１３．１〜１３．１３．９）。
【００５８】 ３．試験系におけるＩＲＥを有する構築物のインビトロスプライシング ＲＮＡからのイントロンの切り出しは、２つの新しく連結したエクソンの境界
域にヌクレオチド配列をもたらし、この配列はスプライシングされていないｍＲ
ＮＡ前駆体中には存在しない（新配列）。この配列は相補的ヌクレオチド配列を
生成させるために利用され、それは上記新配列に選択的に結合する。蛍光色素、
ビオチン、ジゴキシゲニンまたは類似の分子、または放射性標識の共有結合によ
る結合は、実施されたスプライシングを間接的に検出する。アッセイは適した分
析機（ＥＬＩＳＡリーダー、蛍光分析機など）で分析される。
域にヌクレオチド配列をもたらし、この配列はスプライシングされていないｍＲ
ＮＡ前駆体中には存在しない（新配列）。この配列は相補的ヌクレオチド配列を
生成させるために利用され、それは上記新配列に選択的に結合する。蛍光色素、
ビオチン、ジゴキシゲニンまたは類似の分子、または放射性標識の共有結合によ
る結合は、実施されたスプライシングを間接的に検出する。アッセイは適した分
析機（ＥＬＩＳＡリーダー、蛍光分析機など）で分析される。
【００５９】 説明したすべての実験は、Eperon, I. C. and Krainer, A. R.（１９９４年）
Splicing of mRNA precursors in mammalian cells. In RNA Processing、ｖｏ
ｌ．Ｉ−Ａ Practical Approach（B. D. Hames and S. J. Higgins 編）Oxford
：IRL Press、ｐｐ．５７〜１０１）に説明されているような標準法に従って実
施した。 ３．１ インビトロ転写法 図５Ａに示す構築物を、インビトロ転写により、それをコードするプラスミド
から対応するｍＲＮＡ内に転写した。同様に、ＩＲＥ配列を含まない対応する構
築物を対照として及びその後の比較のための実験に使用した。
Splicing of mRNA precursors in mammalian cells. In RNA Processing、ｖｏ
ｌ．Ｉ−Ａ Practical Approach（B. D. Hames and S. J. Higgins 編）Oxford
：IRL Press、ｐｐ．５７〜１０１）に説明されているような標準法に従って実
施した。 ３．１ インビトロ転写法 図５Ａに示す構築物を、インビトロ転写により、それをコードするプラスミド
から対応するｍＲＮＡ内に転写した。同様に、ＩＲＥ配列を含まない対応する構
築物を対照として及びその後の比較のための実験に使用した。
【００６０】 それに先立ち、構築物をベクターｐＧＥＭ−３Ｚｆ（Pharmacia）にクローン
化し、大腸菌中で増殖させた。プラスミドを精製し、標準技術によって所望の濃
度に調節した。インビトロ転写での使用に先立ち、プラスミドを制限酵素により
直線状とした。
化し、大腸菌中で増殖させた。プラスミドを精製し、標準技術によって所望の濃
度に調節した。インビトロ転写での使用に先立ち、プラスミドを制限酵素により
直線状とした。
【００６１】 反応は以下の条件下で実施した： ５μｌの５×転写緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９、３０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、１０ｍＭスペルミジン、５０ｍＭ ＮａＣｌ） １μｌのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ） １μｌのＲＮＡｓｉｎ ２．５μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ） １μｌのＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰは２．５ｍＭおよびＵＴＰは１．２５
ｍＭ） ２μｌの３２Ｐ−ＵＴＰ（３,０００Ｃｉ／ｍＭ） ２μｌの直線状化ＭＩＮＸプラスミド（１ｍｇ／ｍｌ） ２．５μｌのＧｐｐｐＧ−Ｃａｐ（１ｍＭ） ２μｌのＳＰ６ポリメラーゼ ２５μｌのＨ２Ｏを加える。
ＭｇＣｌ２、１０ｍＭスペルミジン、５０ｍＭ ＮａＣｌ） １μｌのＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ） １μｌのＲＮＡｓｉｎ ２．５μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ） １μｌのＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰは２．５ｍＭおよびＵＴＰは１．２５
ｍＭ） ２μｌの３２Ｐ−ＵＴＰ（３,０００Ｃｉ／ｍＭ） ２μｌの直線状化ＭＩＮＸプラスミド（１ｍｇ／ｍｌ） ２．５μｌのＧｐｐｐＧ−Ｃａｐ（１ｍＭ） ２μｌのＳＰ６ポリメラーゼ ２５μｌのＨ２Ｏを加える。
【００６２】 転写混合物を３７℃で２時間インキュベートし、続いて標準法に従って分取用
ゲルで精製した。標識したＲＮＡを、Ｘ線フィルムを１分間感光させることによ
り検出し、バンドをメスで切断した。ゲル断片を切り出し、ＲＮＡを溶出緩衝液
（５００ｍＭ 酢酸Ｎａ、ｐＨ５、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、２．５％フェノー
ル／クロロホルム）を使用し、４℃で一晩かけてゲルから抽出した。 ３．２ スプライシング反応法 ７μｌのヒーラー細胞核抽出物（＝３５％ ｖ／ｖ）を３．２５ｍＭ ＭｇＣｌ
２、３５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１Ｕ／μｌ
ＲＮＡｓｉｎおよび３０,０００〜５０,０００ｃｐｍのＭＩＮＸ ｍＲＮＡ前駆
体（Zillmann et al.、１９８８年、Molecular and Cellular Biology、８巻：
８１４頁）と２０μｌの反応容量で３０℃にて、０、１０、２０、３０および４
０分間インキュベートした。ＩＲＥを含まないｍＲＮＡ前駆体を比較のために用
いた。次に４００μｌのプロテイナーゼＫ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ
、０．１ｍｇプロテイナーゼＫ）を加えることにより反応を停止させた。試料を
４００μｌのフェノール／クロロホルムで抽出し、水相に２．５倍容量のエタノ
ールおよび１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えて−２０℃
で沈殿させた。ＲＮＡを遠心分離により分離し、７０〜８０％エタノールで洗浄
した。さらに遠心分離を行った後、ＲＮＡを乾燥させた。
ゲルで精製した。標識したＲＮＡを、Ｘ線フィルムを１分間感光させることによ
り検出し、バンドをメスで切断した。ゲル断片を切り出し、ＲＮＡを溶出緩衝液
（５００ｍＭ 酢酸Ｎａ、ｐＨ５、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、２．５％フェノー
ル／クロロホルム）を使用し、４℃で一晩かけてゲルから抽出した。 ３．２ スプライシング反応法 ７μｌのヒーラー細胞核抽出物（＝３５％ ｖ／ｖ）を３．２５ｍＭ ＭｇＣｌ
２、３５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭホスホクレアチン、１Ｕ／μｌ
ＲＮＡｓｉｎおよび３０,０００〜５０,０００ｃｐｍのＭＩＮＸ ｍＲＮＡ前駆
体（Zillmann et al.、１９８８年、Molecular and Cellular Biology、８巻：
８１４頁）と２０μｌの反応容量で３０℃にて、０、１０、２０、３０および４
０分間インキュベートした。ＩＲＥを含まないｍＲＮＡ前駆体を比較のために用
いた。次に４００μｌのプロテイナーゼＫ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ
、０．１ｍｇプロテイナーゼＫ）を加えることにより反応を停止させた。試料を
４００μｌのフェノール／クロロホルムで抽出し、水相に２．５倍容量のエタノ
ールおよび１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えて−２０℃
で沈殿させた。ＲＮＡを遠心分離により分離し、７０〜８０％エタノールで洗浄
した。さらに遠心分離を行った後、ＲＮＡを乾燥させた。
【００６３】 乾燥ＲＮＡを５μｌの試料緩衝液（０．５×ＴＢＥ、８０％（ｖ／ｖ）ホルム
アミド、０．１％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールおよび０．１％（ｗ／ｖ）ブロ
モフェノールブルー）にとり、６５℃で１０分間加熱し、氷上で冷却した後、８
％強度ポリアクリルアミドゲルにより分画した。分画されたＲＮＡをオートラジ
オグラフィーにより検出した（図６参照）。
アミド、０．１％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールおよび０．１％（ｗ／ｖ）ブロ
モフェノールブルー）にとり、６５℃で１０分間加熱し、氷上で冷却した後、８
％強度ポリアクリルアミドゲルにより分画した。分画されたＲＮＡをオートラジ
オグラフィーにより検出した（図６参照）。
【００６４】 図６のレーン１〜５は３’ＯＨ末端にＩＲＥを含まないＭＩＮＸｍＲＮＡ前駆
体のスプライシング反応の時間変化（０、１０、２０、３０、４０分）を示す。
図は約２０分後にｍＲＮＡ前駆体の大部分が成熟ｍＲＮＡに変換したことを示し
ている。レーン６〜１０は３’ＯＨ末端がＩＲＥにより修飾されているｍＲＮＡ
前駆体を用いた同様の実験を示す。ここでもまた、明瞭なスプライシング反応が
２０分のインキュベーション時間後に観察することができる。
体のスプライシング反応の時間変化（０、１０、２０、３０、４０分）を示す。
図は約２０分後にｍＲＮＡ前駆体の大部分が成熟ｍＲＮＡに変換したことを示し
ている。レーン６〜１０は３’ＯＨ末端がＩＲＥにより修飾されているｍＲＮＡ
前駆体を用いた同様の実験を示す。ここでもまた、明瞭なスプライシング反応が
２０分のインキュベーション時間後に観察することができる。
【配列表】
【図１】 図１Ａはコード核酸配列を示し、ここでＴｈアプタマーがＭｉｎｘ
をコードするｍＲＮＡ前駆体のエキソン２の３’末端に挿入されている。図１Ｂ
はコード核酸配列を示し、ここでＴｏアプタマーがＭｉｎｘをコードするｍＲＮ
Ａ前駆体のエキソン２の３’末端に挿入されている。
をコードするｍＲＮＡ前駆体のエキソン２の３’末端に挿入されている。図１Ｂ
はコード核酸配列を示し、ここでＴｏアプタマーがＭｉｎｘをコードするｍＲＮ
Ａ前駆体のエキソン２の３’末端に挿入されている。
【図２】 図２Ａはコード核酸配列を示し、ここでＴｈアプタマーがＭｉｎｘ
をコードするｍＲＮＡ前駆体のイントロン内に挿入されている。図２Ｂはコード
核酸配列を示し、ここでＴｏアプタマーがＭｉｎｘをコードするｍＲＮＡ前駆体
のイントロン内に挿入されている。
をコードするｍＲＮＡ前駆体のイントロン内に挿入されている。図２Ｂはコード
核酸配列を示し、ここでＴｏアプタマーがＭｉｎｘをコードするｍＲＮＡ前駆体
のイントロン内に挿入されている。
【図３】 図３Ａはコード核酸配列を示し、ここでＴｈアプタマーがＭｉｎｘ
をコードするｍＲＮＡ前駆体のエキソン１の５’末端に挿入されている。図３Ｂ
はＲＮＡ配列を示し、ここでＴｈアプタマーがＭｉｎｘをコードするｍＲＮＡ前
駆体のエキソン１の５’末端に挿入されている。
をコードするｍＲＮＡ前駆体のエキソン１の５’末端に挿入されている。図３Ｂ
はＲＮＡ配列を示し、ここでＴｈアプタマーがＭｉｎｘをコードするｍＲＮＡ前
駆体のエキソン１の５’末端に挿入されている。
【図４】 図４ＡはＵ３ ｍＲＮＡ前駆体をコードするコード核酸配列を示す
。エキソン１の５’末端にＴｈまたはＴｏアプタマーのための挿入部位を示す。
図４ＢはＵ３ ｍＲＮＡ前駆体をコードするコード核酸配列を示す。イントロン
中にＴｈまたはＴｏアプタマーのための挿入部位を示す。図４ＣはＵ３ ｍＲＮ
Ａ前駆体をコードするコード核酸配列を示す。エキソン２の３’末端にＴｈまた
はＴｏアプタマーのための挿入部位を示す。
。エキソン１の５’末端にＴｈまたはＴｏアプタマーのための挿入部位を示す。
図４ＢはＵ３ ｍＲＮＡ前駆体をコードするコード核酸配列を示す。イントロン
中にＴｈまたはＴｏアプタマーのための挿入部位を示す。図４ＣはＵ３ ｍＲＮ
Ａ前駆体をコードするコード核酸配列を示す。エキソン２の３’末端にＴｈまた
はＴｏアプタマーのための挿入部位を示す。
【図５】 図５ＡはＭｉｎｘ ｍＲＮＡ前駆体をコードするコード核酸配列を
示す。エキソン２の３’末端にＩＲＥのための配列が挿入されている。図５Ｂは
Ｕ３ ｍＲＮＡ前駆体をコードするコード核酸配列を示す。エキソン２の３’末
端にＩＲＥのための配列が挿入されている。
示す。エキソン２の３’末端にＩＲＥのための配列が挿入されている。図５Ｂは
Ｕ３ ｍＲＮＡ前駆体をコードするコード核酸配列を示す。エキソン２の３’末
端にＩＲＥのための配列が挿入されている。
【図６】 図６はヒーラー核抽出物によるＭＩＮＸおよびＭＩＮＸ−ＩＲＥ
ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの時間変化を示す。インビトロで転写されたＭ
ＩＮＸ（レーン１〜５）およびＭＩＮＸ−ＩＲＥ（レーン６〜１０）ｍＲＮＡ前
駆体をヒーラー核抽出物とともに図示した時間インキュベートした。次に試料を
ポリアクリルアミド／ウレアゲル電気泳動により分画し、３２Ｐ−標識ＲＮＡを
オートラジオグラフィーにより検出した。ＩＲＥ含有ＲＮＡの場合（レーン６〜
１０）、多数のバンドは、不完全なＩＲＥ変性により説明できる。
ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの時間変化を示す。インビトロで転写されたＭ
ＩＮＸ（レーン１〜５）およびＭＩＮＸ−ＩＲＥ（レーン６〜１０）ｍＲＮＡ前
駆体をヒーラー核抽出物とともに図示した時間インキュベートした。次に試料を
ポリアクリルアミド／ウレアゲル電気泳動により分画し、３２Ｐ−標識ＲＮＡを
オートラジオグラフィーにより検出した。ＩＲＥ含有ＲＮＡの場合（レーン６〜
１０）、多数のバンドは、不完全なＩＲＥ変性により説明できる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年５月３１日（２００１．５．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【化２】 ここで、（Ｔｈ／Ｔｏ）は、 AAGTGATACC AGCATCGTCT TGATGCCCTT GGCAGCACTT GAATT（Ｔｈ）または GGCTTAGTAT AGCGAGGTTT AGCTACACTC GTGCTGAGCC GAATT（Ｔｏ）から選択される
配列である、 に由来するスプライシング可能なＲＮＡ。
配列である、 に由来するスプライシング可能なＲＮＡ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シマンディ，クラウス ドイツ連邦共和国デー−40699 エアクラ ト，エーデュアルト−ダエレン−シュトラ ーセ ７ (72)発明者 リュールマン，ラインハルド ドイツ連邦共和国デー−35041 マーブル グ，エーヴィヒス・タール・16ベー (72)発明者 アクセル，ティルマン ドイツ連邦共和国デー−37085 ゲッティ ンゲン，アム・シュタインスグラーベン 15 (72)発明者 フォルンロッハー，ハンス−ペーター ドイツ連邦共和国デー−35041 マーブル グ／ヴェーアダ，ヴァルトヴェーグ 12 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB10 BB14 BB20 BB48 BB50 BB51 DA13 FB02 FB03 FB07 4B024 AA11 CA09 CA10 CA11 CA12 HA12 4B063 QA19 QA20 QQ52 QQ53 QR08 QR35 QR42 QR56 QR66 QS25 QS34 QX02 QX07
Claims (35)
- 【請求項１】 （ａ）少なくとも１つのスプライシング可能な核酸を有する
１つまたはそれ以上の同一のまたは異なった固定化された核酸 （ｂ）スプライシング反応を検出するための少なくとも１つのゲル無し検出系、
適切な場合には （ｃ）スプライシング成分を含む少なくとも１つの組成物、および好ましくは （ｄ）好適な検出プローブ、および、適切な場合には （ｅ）さらなる補助物、 を含む試験系。 - 【請求項２】 該スプライシング可能な核酸が、少なくとも１つのイントロ
ンにより分離されている少なくとも２つのエキソンを含む請求項１に記載の試験
系。 - 【請求項３】 該ゲル無し検出系が少なくとも１つのプローブを含む請求項
１または２に記載の試験系。 - 【請求項４】 該プローブが、該スプライシング可能な核酸に相補的な核酸
、該スプライシング可能な核酸を結合させる低分子量化合物および／または該ス
プライシング可能な核酸を結合させるペプチド若しくはタンパク質である請求項
３に記載の試験系。 - 【請求項５】 該低分子量化合物が、テオフィリン、キサンチンまたはアミ
ノグリコシド、好ましくはトブラマイシンから成る群より選択され、該核酸結合
ペプチドまたはタンパク質が、鉄応答配列結合タンパク質ＩＢＰである請求項４
に記載の試験系。 - 【請求項６】 該相補的な核酸が、少なくとも１つのイントロン、少なくと
も１つのエキソンおよび／または少なくとも１つのエキソン／イントロン移行部
位に相補的である請求項４に記載の試験系。 - 【請求項７】 該ゲル無し検出系の該スプライシング可能な核酸または該相
補的な核酸が、核酸結合低分子量化合物および／または核酸結合ペプチド若しく
はタンパク質に対する認識配列を含む請求項３〜６の任意の項に記載の試験系。 - 【請求項８】 核酸結合低分子量化合物に対する該認識配列がアプタマー配
列である請求項７に記載の試験系。 - 【請求項９】 該ゲル無し検出系が標識を含む請求項１〜８の任意の項に記
載の試験系。 - 【請求項１０】 該標識が、放射性標識、蛍光色素標識、ビオチン標識、ジ
ゴキシゲニン標識および／または抗体標識である請求項９に記載の試験系。 - 【請求項１１】 該スプライシング可能な核酸および該プローブ結合核酸配
列が互いに結合している請求項３〜８の任意の項に記載の試験系。 - 【請求項１２】 少なくとも２つの異なるプローブ結合核酸配列がスプライ
シング可能な核酸に結合する請求項１１に記載の試験系。 - 【請求項１３】 該核酸が、直接的に共有結合で、または構造要素および構
造要素の結合相手を介して間接的に、またはハイブリダイゼーションにより固相
に結合する請求項１〜１２の任意の項に記載の試験系。 - 【請求項１４】 該直接的な共有結合が、該核酸のリボース骨格の隣位２’
,３’−ヒドロキシル基を介してなされる請求項１１に記載の試験系。 - 【請求項１５】 該構造要素がビオチンリンカーまたはジカルボン酸リンカ
ーである請求項１３に記載の試験系。 - 【請求項１６】 該結合相手が、テオフィリン、キサンチンまたはアミノグ
リコシド、好ましくはトブラマイシン、および／または核酸結合タンパク質、特
にＩＢＰである請求項１３に記載の試験系。 - 【請求項１７】 該固相が、セラミック、金属、特に貴金属、ガラスまたは
プラスチックから成る群より選択される請求項１３〜１６の任意の項に記載の試
験系。 - 【請求項１８】 少なくとも１つの核酸がＲＮＡである請求項１〜１７の任
意の項に記載の試験系。 - 【請求項１９】 該ＲＮＡが下記式の配列： 【化１】 ここで、（Ｔｈ／Ｔｏ）は、 AAGTGATACC AGCATCGTCT TGATGCCCTT GGCAGCACTT GAATT（Ｔｈ）または GGCTTAGTAT AGCGAGGTTT AGCTACACTC GTGCTGAGCC GAATT（Ｔｏ）から選択される
配列である、 から選択される核酸に由来する請求項１８に記載の試験系。 - 【請求項２０】 特徴（ｃ）の該組成物が、低分子リボ核タンパク質粒子（
ｓｎＲＮＰ）成分および非ｓｎＲＮＰ成分を含む請求項１〜１９の任意の項に記
載の試験系。 - 【請求項２１】 該ｓｎＲＮＰ成分が、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５および／ま
たはＵ６タンパク質を含む請求項２０に記載の試験系。 - 【請求項２２】 特徴（ｃ）の該組成物が、細胞抽出物、特に真核生物細胞
抽出物または核抽出物である請求項１〜２１の任意の項に記載の試験系。 - 【請求項２３】 該核抽出物が、動物細胞、特に哺乳動物細胞から、または
真菌、特に酵母から得られる請求項２２に記載の試験系。 - 【請求項２４】 特徴（ｄ）の該さらなる補助物が、緩衝液、安定化剤およ
び／またはエネルギー等価物、特にＡＴＰから選択される請求項１〜２３の任意
の項に記載の試験系。 - 【請求項２５】 請求項１〜２４の任意の項に記載の試験系を調製するため
の方法であって、特徴（ａ）に記載の少なくとも１つのスプライシング可能な核
酸、および特徴（ｂ）に記載の少なくとも１つのゲル無し検出系、さらに、適切
な場合には、特徴（ｃ）に記載のスプライシング成分を含む少なくとも１つの組
成物、および、適切な場合には、さらなる補助物を組み合わせること、を含む方
法。 - 【請求項２６】 活性物質を発見するための方法であって、 （ａ）１つまたはそれ以上の同一のまたは異なった固定化された核酸を、少な
くとも１つのスプライシング可能な核酸配列とともに、少なくとも１つの試験さ
れるべき物質およびスプライシング成分を含む少なくとも１つの組成物、および
適切な場合には、さらなる補助物の存在下で、好適な条件下でインキュベートし
、および （ｂ）ゲル無し検出系によって形成されたスプライシング産物を検出する、 ことを含む方法。 - 【請求項２７】 該活性物質が、医薬的に活性な化合物、殺真菌薬、除草剤
、農薬および／または殺虫剤である請求項２６に記載の方法。 - 【請求項２８】 該医薬的に活性な物質が抗生物質である請求項２７に記載
の方法。 - 【請求項２９】 該試験されるべき物質が、自然発生物質、自然発生物質で
化学的に修飾された物質および／または合成物質から選択される請求項２６〜２
８の任意の項に記載の方法。 - 【請求項３０】 該試験されるべき物質が組み合わせ物質ライブラリーの形
で使用される請求項２９に記載の方法。 - 【請求項３１】 障害を診断するための方法であって、 （ａ）１つまたはそれ以上の同一のまたは異なった固定化された核酸を、少な
くとも１つのスプライシング可能な核酸配列とともに、スプライシング成分を含
む少なくとも１つの組成物、および適切な場合には、さらなる補助物の存在下で
、好適な条件下でインキュベートし、および （ｂ）ゲル無し検出系によって形成されたスプライシング産物を検出する、 ことを含む方法。 - 【請求項３２】 該障害が、遺伝的障害、がんおよび／またはウイルス疾患
である請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３３】 該障害が、グレーブス病、棘筋萎縮症、β’サラセミア、
ｃ−ｅｒｂ原癌遺伝子に関連するがん、Ｃ型肝炎感染および／またはヘルペス単
純ウイルス感染から選択される請求項３１または３２に記載の方法。 - 【請求項３４】 下記式の配列： 【化２】 ここで、（Ｔｈ／Ｔｏ）は、 AAGTGATACC AGCATCGTCT TGATGCCCTT GGCAGCACTT GAATT（Ｔｈ）または GGCTTAGTAT AGCGAGGTTT AGCTACACTC GTGCTGAGCC GAATT（Ｔｏ）から選択される
配列である、 から選択される核酸に由来するＲＮＡから選択されるスプライシング可能な核酸
。 - 【請求項３５】 試験系を調製するための請求項３４に記載のスプライシン
グ可能な核酸の使用。
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