JP2002537265A - 抗腫瘍Ｔｈ１細胞の製造方法 - Google Patents
抗腫瘍Ｔｈ１細胞の製造方法Info
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- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
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-
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、医薬的に無害な添加剤および補助剤と共に、高いインターフェロンγの産生ならびに低いあるいは皆無のインターロイキン−４の産生を示す腫瘍に反応するＴｈ１類似細胞を含む薬剤、ならびに高いインターフェロンγの産生ならびに低いあるいは皆無のインターロイキン−４の産生を示す、腫瘍に反応するＴｈ１類似細胞の製造方法に関するものである。
Description
【０００１】 この発明は、抗腫瘍性Ｔｈ１細胞を含む治療薬、インターフェロン−γ（ＩＦ
Ｎ−γ）を産生する抗腫瘍性Ｔｈ１細胞の製造方法、ならびに固形腫瘍およびリ
ンパ腫等の造血系腫瘍の治療への適用法に関する。
Ｎ−γ）を産生する抗腫瘍性Ｔｈ１細胞の製造方法、ならびに固形腫瘍およびリ
ンパ腫等の造血系腫瘍の治療への適用法に関する。
【０００２】 人類を含む哺乳類の免疫システムは、多様な腫瘍に対する防護を提供するとと
もにこれを撃退するための一連の戦略を備えている。従って、特に腫瘍細胞の表
面または内側に圧出された、（糖）たんぱく質である腫瘍抗原に対する免疫応答
を呼び出すことが可能である。この抗原に対する免疫応答は、固形腫瘍および造
血システムの腫瘍の形成を防止することができる。文献によれば、腫瘍に対する
免疫応答の殆どはＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）ならびに細胞障害性ＣＤ８＋
Ｔ細胞（Ｔｃ）の両方に依存している。しかしながら、特に細胞障害性Ｔｃが有
効な腫瘍防止に寄与することが認められている。この点からＴｈの役目は今まで
ごくわずかにしか研究されていない。
もにこれを撃退するための一連の戦略を備えている。従って、特に腫瘍細胞の表
面または内側に圧出された、（糖）たんぱく質である腫瘍抗原に対する免疫応答
を呼び出すことが可能である。この抗原に対する免疫応答は、固形腫瘍および造
血システムの腫瘍の形成を防止することができる。文献によれば、腫瘍に対する
免疫応答の殆どはＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）ならびに細胞障害性ＣＤ８＋
Ｔ細胞（Ｔｃ）の両方に依存している。しかしながら、特に細胞障害性Ｔｃが有
効な腫瘍防止に寄与することが認められている。この点からＴｈの役目は今まで
ごくわずかにしか研究されていない。
【０００３】 多様な腫瘍に対して免疫を強化するための多数の治療薬ならびに方法が開発さ
れている。腫瘍予防として特に有効なものとして、例えば樹状抗原提示細胞（Ａ
ＰＣ）を用いた免疫強化、特にインターロイキン−（ＩＬ）−１２等の抗炎症媒
体の適用、ならびにＣＴＬＡ４分子の調合によるＴ細胞活性化が知られている。
別の手法として、腫瘍を濾過するＴ−リンパ球（ＴＩＬ）、リンフォカイン活性
化されたキラー細胞（ＬＡＫ）、またはＣＤ８＋Ｔリンパ球のいずれかを含有す
る医薬剤を用いたワクチン接種がある。しかしながら、この種の手法は極限定的
な効果しかもたらさないことが知られている。
れている。腫瘍予防として特に有効なものとして、例えば樹状抗原提示細胞（Ａ
ＰＣ）を用いた免疫強化、特にインターロイキン−（ＩＬ）−１２等の抗炎症媒
体の適用、ならびにＣＴＬＡ４分子の調合によるＴ細胞活性化が知られている。
別の手法として、腫瘍を濾過するＴ−リンパ球（ＴＩＬ）、リンフォカイン活性
化されたキラー細胞（ＬＡＫ）、またはＣＤ８＋Ｔリンパ球のいずれかを含有す
る医薬剤を用いたワクチン接種がある。しかしながら、この種の手法は極限定的
な効果しかもたらさないことが知られている。
【０００４】 腫瘍防止のため多数の免疫強化プロトコルが作成されたにもかかわらず、すで
に確立した腫瘍に対して有効な、免疫システムに対して効果をもたらす治療薬は
殆ど得られていない。唯一の実際に効果のある治療プロトコルは、白血病治療に
おける同種異系Ｔリンパ球の養子免疫細胞移入である。過去２０年のデータによ
り、ＩＦＮ−γを産生するＴリンパ球が細胞の腫瘍防止において重要な役割を果
たすことが知られている。現在までは、特にＴｃ上でクラスＩの腫瘍組織適合抗
原（ＭＨＣ Ｉ）を介して提示される抗原を対象にする腫瘍免疫応答が研究され
ていた。ＭＨＣクラスIIに関連するＴｈは調整細胞として見られていた。その存
在は、効果的な腫瘍防止において重要であると見られる。それにもかかわらず、
その免疫応答における正確な役割が知られていないばかりか、僅かな例外を除い
てその標的ペプチドも知られていない（免疫学９５：第２版４５−４７頁）。こ
の問題点のため、現在までは特定の腫瘍に対する免疫治療薬としては使用されて
いなかった。
に確立した腫瘍に対して有効な、免疫システムに対して効果をもたらす治療薬は
殆ど得られていない。唯一の実際に効果のある治療プロトコルは、白血病治療に
おける同種異系Ｔリンパ球の養子免疫細胞移入である。過去２０年のデータによ
り、ＩＦＮ−γを産生するＴリンパ球が細胞の腫瘍防止において重要な役割を果
たすことが知られている。現在までは、特にＴｃ上でクラスＩの腫瘍組織適合抗
原（ＭＨＣ Ｉ）を介して提示される抗原を対象にする腫瘍免疫応答が研究され
ていた。ＭＨＣクラスIIに関連するＴｈは調整細胞として見られていた。その存
在は、効果的な腫瘍防止において重要であると見られる。それにもかかわらず、
その免疫応答における正確な役割が知られていないばかりか、僅かな例外を除い
てその標的ペプチドも知られていない（免疫学９５：第２版４５−４７頁）。こ
の問題点のため、現在までは特定の腫瘍に対する免疫治療薬としては使用されて
いなかった。
【０００５】 （後から公開された）国際特許公開ＷＯ９９／５１７２０号には、Ｔｈ１細胞
が生成される極めて特殊な方法が記載されている。しかしながらこれは、例えば
腫瘍抗原等の抗原を特別に認識する、ＣＤ２陽性細胞またはＴ細胞を有効に生成
することを可能にするものではない。
が生成される極めて特殊な方法が記載されている。しかしながらこれは、例えば
腫瘍抗原等の抗原を特別に認識する、ＣＤ２陽性細胞またはＴ細胞を有効に生成
することを可能にするものではない。
【０００６】 既知の方法（クーゲ氏等による１９９５年発行の免疫学ジャーナル１５４（４
）版１７７７−８５頁）において、培養皿内でＴｈ１リンパ球が腫瘍細胞を溶解
し得ることが記載されている。しかしながら、この文献には生体内治療を示唆す
る記述はなされていない。さらに、この手法は直接的に生体内状況に当てはめる
ことが不可能である。
）版１７７７−８５頁）において、培養皿内でＴｈ１リンパ球が腫瘍細胞を溶解
し得ることが記載されている。しかしながら、この文献には生体内治療を示唆す
る記述はなされていない。さらに、この手法は直接的に生体内状況に当てはめる
ことが不可能である。
【０００７】 従って本発明の目的は、腫瘍疾病の予防ならびに治療のための医薬剤を提供す
ることである。特に、生体内において腫瘍に対して効果的な、特殊な腫瘍反応細
胞を試験管内で生成することに関する。全ての腫瘍治療の目的は、腫瘍を可能な
限り破壊し、その際体内のその他の細胞を保護することである。従来の治療では
このことが極限定的にしか達成できなかった。そのため、特殊な腫瘍治療の開発
が試みられた。今日の水準において腫瘍を対象にしている唯一の治療方法は免疫
治療であり、これはリンパ球がその抗原レセプタの働きにより、このリンパ球が
作用する標的細胞のみを認識するためである。
ることである。特に、生体内において腫瘍に対して効果的な、特殊な腫瘍反応細
胞を試験管内で生成することに関する。全ての腫瘍治療の目的は、腫瘍を可能な
限り破壊し、その際体内のその他の細胞を保護することである。従来の治療では
このことが極限定的にしか達成できなかった。そのため、特殊な腫瘍治療の開発
が試みられた。今日の水準において腫瘍を対象にしている唯一の治療方法は免疫
治療であり、これはリンパ球がその抗原レセプタの働きにより、このリンパ球が
作用する標的細胞のみを認識するためである。
【０００８】 腫瘍細胞を直接的に殺消する能力のため、今日の研究は腫瘍特異的Ｔｃによる
抗腫瘍治療に重点がおかれている。しかしながら、自己免疫病の面から、Ｔｃで
はなくＴｈが自己免疫病を極めて有効に解消することが知られている（１９９４
年、ラッケ氏等による）。特に重大な、しばしば急死にいたる形式の自己免疫病
は、ＩＦＮ−γの養子免疫細胞移入を生じさせる、Ｔｈ１とも呼ばれるＴｈによ
って解決される。この養子免疫細胞移入されるＴｈ１は標的組織は破壊するがそ
の際他の全ての組織を保護するため、腫瘍特異的Ｔｈ１の養子免疫細胞移入は腫
瘍治療に極めて良好に適したものである。
抗腫瘍治療に重点がおかれている。しかしながら、自己免疫病の面から、Ｔｃで
はなくＴｈが自己免疫病を極めて有効に解消することが知られている（１９９４
年、ラッケ氏等による）。特に重大な、しばしば急死にいたる形式の自己免疫病
は、ＩＦＮ−γの養子免疫細胞移入を生じさせる、Ｔｈ１とも呼ばれるＴｈによ
って解決される。この養子免疫細胞移入されるＴｈ１は標的組織は破壊するがそ
の際他の全ての組織を保護するため、腫瘍特異的Ｔｈ１の養子免疫細胞移入は腫
瘍治療に極めて良好に適したものである。
【０００９】 本発明に係る医薬剤は、起こり得る腫瘍の発達を防止し、特に既に確立した腫
瘍に対しても同様に効果があることが必要である。さらに、本発明に係る医薬剤
はそれぞれ対処する腫瘍に適合させ得ることが必要である。この医薬剤は、自然
の腫瘍防止方式を真似たもの、あるいはこれを補助するものである必要があり、
従って副作用が全く無いかあるいは極限定的なものとなる。
瘍に対しても同様に効果があることが必要である。さらに、本発明に係る医薬剤
はそれぞれ対処する腫瘍に適合させ得ることが必要である。この医薬剤は、自然
の腫瘍防止方式を真似たもの、あるいはこれを補助するものである必要があり、
従って副作用が全く無いかあるいは極限定的なものとなる。
【００１０】 前記の課題は、高いＩＦＮ−γ産生Ｐ１（１００≦Ｐ１≦１０００００Ｕ／ｍ
ｌ）と低いＩＬ−４産生Ｐ２（Ｐ２≦１０００Ｕ／ｍｌ）を備える、Ｔｈ１に類
似するサイトカインモデルによって特徴付けられた、腫瘍特異的Ｔｈを含有する
医薬剤によって解決される。この際、Ｐ１：Ｐ２比が１０：１もしくはそれより
大きな数値範囲となることが特に重要である。Ｔリンパ球は医薬用添加剤および
補助剤と共に投与される。さらに、腫瘍特異的Ｔｈ１細胞の製造方法が提供され
る。これは、腫瘍および腫瘍に結合した抗原（アミノ酸／たんぱく質配列）を検
知しこれに対して反応する細胞である。しかしながら、この細胞は、体内に有用
に存在するその他の抗原に対しては殆ど反応しない。本発明は、さらに固形腫瘍
および造血システムの腫瘍の予防および／または治療に対してのこのＴｈ１の適
用法に関するものである。
ｌ）と低いＩＬ−４産生Ｐ２（Ｐ２≦１０００Ｕ／ｍｌ）を備える、Ｔｈ１に類
似するサイトカインモデルによって特徴付けられた、腫瘍特異的Ｔｈを含有する
医薬剤によって解決される。この際、Ｐ１：Ｐ２比が１０：１もしくはそれより
大きな数値範囲となることが特に重要である。Ｔリンパ球は医薬用添加剤および
補助剤と共に投与される。さらに、腫瘍特異的Ｔｈ１細胞の製造方法が提供され
る。これは、腫瘍および腫瘍に結合した抗原（アミノ酸／たんぱく質配列）を検
知しこれに対して反応する細胞である。しかしながら、この細胞は、体内に有用
に存在するその他の抗原に対しては殆ど反応しない。本発明は、さらに固形腫瘍
および造血システムの腫瘍の予防および／または治療に対してのこのＴｈ１の適
用法に関するものである。
【００１１】 自己免疫病の病因研究によって、Ｔｈ特にＴｈ１およびＴｈ１に類似する細胞
が腫瘍防止において重要な役割を果たすことが発見された。攻撃すべき腫瘍の（
糖）タンパク質を限定的に検知するＴｈ１を培養することによって、腫瘍の予防
／攻撃を行うための有効な医薬剤を製造することができる。これらの細胞を含有
する医薬剤は、経口外の組織に対して、たいていは腹腔内、静脈内、または皮下
の組織に投与される。投与されたＴｈ１は、直接的に細胞壊死を誘導するかまた
は特定のサイトカインを産生することによって、腫瘍に対する免疫応答を活性化
あるいは強化する。これらは、腫瘍に対して直接的に細胞障害性であるものとす
るか、あるいはＴｃまたは大食細胞等の腫瘍に対して毒性的な効果細胞を補充お
よび活性化するものとし得る。これによって免疫作用による腫瘍の緩解または退
行が決定的なものとなる。
が腫瘍防止において重要な役割を果たすことが発見された。攻撃すべき腫瘍の（
糖）タンパク質を限定的に検知するＴｈ１を培養することによって、腫瘍の予防
／攻撃を行うための有効な医薬剤を製造することができる。これらの細胞を含有
する医薬剤は、経口外の組織に対して、たいていは腹腔内、静脈内、または皮下
の組織に投与される。投与されたＴｈ１は、直接的に細胞壊死を誘導するかまた
は特定のサイトカインを産生することによって、腫瘍に対する免疫応答を活性化
あるいは強化する。これらは、腫瘍に対して直接的に細胞障害性であるものとす
るか、あるいはＴｃまたは大食細胞等の腫瘍に対して毒性的な効果細胞を補充お
よび活性化するものとし得る。これによって免疫作用による腫瘍の緩解または退
行が決定的なものとなる。
【００１２】 本発明によれば、任意の腫瘍類型に対応するＴｈ１−細胞を生成することがで
きる。Ｔｈ１の産生はリンパ腫に対しても有効であることが好適であるが、固形
腫瘍も重要な標的である。従って、本発明に係る医薬剤により所定のタイプの腫
瘍が攻撃される。投与する薬種および薬量は、治療する腫瘍の種類および程度、
患者の病状、ならびに治療期間に従って医者が決定する。本発明に係る医薬剤は
、体重に対して１×１０６−１００−１０００×１０６細胞／ｋｇの配量で一回
のみまたは繰り返し投与される。この医薬剤は人間あるいは動物に投与すること
ができる。
きる。Ｔｈ１の産生はリンパ腫に対しても有効であることが好適であるが、固形
腫瘍も重要な標的である。従って、本発明に係る医薬剤により所定のタイプの腫
瘍が攻撃される。投与する薬種および薬量は、治療する腫瘍の種類および程度、
患者の病状、ならびに治療期間に従って医者が決定する。本発明に係る医薬剤は
、体重に対して１×１０６−１００−１０００×１０６細胞／ｋｇの配量で一回
のみまたは繰り返し投与される。この医薬剤は人間あるいは動物に投与すること
ができる。
【００１３】 本発明に係るＴｈ１細胞は、造血系腫瘍を防止することができ；これはさらに
既に存在するリンパ腫の治療にも適するとともに、この種のＴｈ１細胞を使用し
てさらに固形腫瘍を少なくとも抑制することができる。
既に存在するリンパ腫の治療にも適するとともに、この種のＴｈ１細胞を使用し
てさらに固形腫瘍を少なくとも抑制することができる。
【００１４】 本発明に係る方法によれば、さらに腫瘍に応じた固有のＴｈ１細胞を既に進行
した腫瘍を疾病している動物から生成することができる。この際、多数の異なっ
た免疫細胞の中から培養すべき少数の、特に腫瘍を検知する特定のＴリンパ球系
類を正確に取り出すことができる。腫瘍特異的Ｔｈ１細胞を養子免疫細胞移入す
ることによって、極めて迅速に有効な抗腫瘍免疫応答を形成することができ、こ
れは治療においても極めて即効性であるとともに安全、すなわち副作用が非常に
少ないものである。
した腫瘍を疾病している動物から生成することができる。この際、多数の異なっ
た免疫細胞の中から培養すべき少数の、特に腫瘍を検知する特定のＴリンパ球系
類を正確に取り出すことができる。腫瘍特異的Ｔｈ１細胞を養子免疫細胞移入す
ることによって、極めて迅速に有効な抗腫瘍免疫応答を形成することができ、こ
れは治療においても極めて即効性であるとともに安全、すなわち副作用が非常に
少ないものである。
【００１５】 腫瘍に対して反応するクラスIIのＭＨＣが結合されたＣＤ４＋Ｔｈの役割を探
求するため、腫瘍特異的Ｔｈ１を生成する培養システムを開発することが必要で
あった。クラスIIのＭＨＣと結合された腫瘍ペプチドは、今までは殆ど知られて
いなかった。そのため、固有の腫瘍ペプチドを知ることなく腫瘍特異的Ｔｈ１を
形成することを可能にするシステムが開発された。放射線照射またはマイトマイ
シンＣ等の化学療法によって増殖を抑制された腫瘍細胞を自家移植／同系ＡＰＣ
およびＴｈとともに試験管内で培養する。実用性の理由から今まで実験はＭＨＣ
IIによって自己の腫瘍抗原が提示されるＢ細胞リンパ腫についてのみ実施されて
いた。Ａ２０細胞リンパ腫を既に有しているマウス、またはこのリンパ腫に対し
て免疫を有するマウスからＣＤ４＋Ｔｈが得られた。このＴｈは、以下に記す方
法によって試験管内で培養され、多量のＩＦＮ−γを産生するが極少量または殆
どＩＬ−４を産生しないＴｈからなる腫瘍特異的Ｔｈ１が生成されるようにした
。市販のＥＬＩＳＡ試験によって測定した結果、有効なＩＦＮ−γ範囲は１０２ ないし１０５Ｕ／ｍｌ；ＣＴ４Ｓ細胞で測定した結果ＩＬ−４は１０００Ｕ／ｍ
ｌ未満となった。ここでも、ＩＦＮ−γ対ＩＬ−４の比率が１０：１以下である
ことが重要である。この腫瘍特異的Ｔｈ１は腫瘍治療に使用された。
求するため、腫瘍特異的Ｔｈ１を生成する培養システムを開発することが必要で
あった。クラスIIのＭＨＣと結合された腫瘍ペプチドは、今までは殆ど知られて
いなかった。そのため、固有の腫瘍ペプチドを知ることなく腫瘍特異的Ｔｈ１を
形成することを可能にするシステムが開発された。放射線照射またはマイトマイ
シンＣ等の化学療法によって増殖を抑制された腫瘍細胞を自家移植／同系ＡＰＣ
およびＴｈとともに試験管内で培養する。実用性の理由から今まで実験はＭＨＣ
IIによって自己の腫瘍抗原が提示されるＢ細胞リンパ腫についてのみ実施されて
いた。Ａ２０細胞リンパ腫を既に有しているマウス、またはこのリンパ腫に対し
て免疫を有するマウスからＣＤ４＋Ｔｈが得られた。このＴｈは、以下に記す方
法によって試験管内で培養され、多量のＩＦＮ−γを産生するが極少量または殆
どＩＬ−４を産生しないＴｈからなる腫瘍特異的Ｔｈ１が生成されるようにした
。市販のＥＬＩＳＡ試験によって測定した結果、有効なＩＦＮ−γ範囲は１０２ ないし１０５Ｕ／ｍｌ；ＣＴ４Ｓ細胞で測定した結果ＩＬ−４は１０００Ｕ／ｍ
ｌ未満となった。ここでも、ＩＦＮ−γ対ＩＬ−４の比率が１０：１以下である
ことが重要である。この腫瘍特異的Ｔｈ１は腫瘍治療に使用された。
【００１６】 腫瘍特異的Ｔｈ１の物質生成 マウスのＡ２０細胞（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ−２０８）を１０％のＦＣＳおよび５
０ｍＭのβメルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０内において５％の
ＣＯ２濃度を有し３７℃で湿度が飽和状態の空気中で培養した。試験管内におけ
るＴｈを伴った培養の前に腫瘍細胞を６５グレイで放射線照射した。
０ｍＭのβメルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０内において５％の
ＣＯ２濃度を有し３７℃で湿度が飽和状態の空気中で培養した。試験管内におけ
るＴｈを伴った培養の前に腫瘍細胞を６５グレイで放射線照射した。
【００１７】 Ｔｈ（９５％を超える純度）をバイオテックスＴ細胞酸（フランクフルト市の
テブ社製）を付加してネガティブセレクションによって取り出した。ポジティブ
またはネガティブセレクションによってＴｈを取り出すその他の方式も同様に使
用することができる。これらのＴｈは、１０％のＦＣＳ、ペニシリン、ならびに
５０μＭのβメルカプトエタノールおよびＭＥＭアミノ酸が添加されたＤｕｌｂ
ｅｃｃｏｓ ＭＥＭ（培養媒体）内において、７．５％のＣＯ２濃度を有し３７
℃で湿度が飽和状態の空気中で試験管内培養した。Ｔｈ配列を生成するためにそ
の他の媒体を使用することもでき、そのうちのいくつかは血清の使用を必要とし
ない。
テブ社製）を付加してネガティブセレクションによって取り出した。ポジティブ
またはネガティブセレクションによってＴｈを取り出すその他の方式も同様に使
用することができる。これらのＴｈは、１０％のＦＣＳ、ペニシリン、ならびに
５０μＭのβメルカプトエタノールおよびＭＥＭアミノ酸が添加されたＤｕｌｂ
ｅｃｃｏｓ ＭＥＭ（培養媒体）内において、７．５％のＣＯ２濃度を有し３７
℃で湿度が飽和状態の空気中で試験管内培養した。Ｔｈ配列を生成するためにそ
の他の媒体を使用することもでき、そのうちのいくつかは血清の使用を必要とし
ない。
【００１８】 Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を抗ＣＤ４−および抗ＣＤ８抗体および補体（
マールブルグ市のベーリング工業社製）で処理することによってＡＰＣを集積し
た。試験管内におけるＴｈを付加する前に３０グレイで放射線照射した。
マールブルグ市のベーリング工業社製）で処理することによってＡＰＣを集積し
た。試験管内におけるＴｈを付加する前に３０グレイで放射線照射した。
【００１９】 ホスホチオエイト（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔ）変換されたＣｐＧジヌクレ
オチドを含有するオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８）がＭＷＧ社（
ミュンヘン市）によって使用された（結果：５′−ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ Ｔ
ＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ−３′）。クローン１１Ｂ１１から生じる抗ＩＬ−
４抗体である、人間のｒＩＬ−２は市販のものが使用された。この種の抗体は人
間のＩＬ−４に対しても開発されており；さらにＴｈ１は可溶性ＩＬ−４レセプ
タ分子の使用によって生成することができる（ブライト氏等による１９９６年の
欧州免疫学ジャーナル第２６号１８６０−１８６５頁）。
オチドを含有するオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８）がＭＷＧ社（
ミュンヘン市）によって使用された（結果：５′−ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ Ｔ
ＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ−３′）。クローン１１Ｂ１１から生じる抗ＩＬ−
４抗体である、人間のｒＩＬ−２は市販のものが使用された。この種の抗体は人
間のＩＬ−４に対しても開発されており；さらにＴｈ１は可溶性ＩＬ−４レセプ
タ分子の使用によって生成することができる（ブライト氏等による１９９６年の
欧州免疫学ジャーナル第２６号１８６０−１８６５頁）。
【００２０】 腫瘍特異的Ｔｈ１の製造例 第１日目 第１回目の刺激 ０．２×１０６Ｔｈ＋放射線照射された腫瘍細胞（０．２×１０６Ａ２０）＋
０．３×１０６ＡＰＣ＋抗ＩＬ−４抗原（例えば１０μｇ／ｍｌの１１Ｂ１１）
＋／−免疫刺激性のオリゴヌクレオチド（例えば０．２μＭのＣｐＧ−ＯＤＮ１
６６８）＋ＩＬ−２を９６孔式の丸底培養プレート内で２００μｌの容量で培養
する。
０．３×１０６ＡＰＣ＋抗ＩＬ−４抗原（例えば１０μｇ／ｍｌの１１Ｂ１１）
＋／−免疫刺激性のオリゴヌクレオチド（例えば０．２μＭのＣｐＧ−ＯＤＮ１
６６８）＋ＩＬ−２を９６孔式の丸底培養プレート内で２００μｌの容量で培養
する。
【００２１】 第２日目 抗ＩＬ−４抗体、オリゴヌクレオチド、およびＩＬ−２の媒体を交換する。
【００２２】 第４日目 ２４孔式の培養プレート内で細胞懸濁を実施し、ＩＬ−２を含有する媒体で培
養する。
養する。
【００２３】 第５−１０日目 ２日毎（第７および９日目）に媒体交換およびＩＬ−２を含有する媒体による
培養を実施する。細胞密度に従って培養物を別の培養皿に分配する。
培養を実施する。細胞密度に従って培養物を別の培養皿に分配する。
【００２４】 第１１日目 第２回目の細胞刺激 ０．１×１０６Ｔｈ＋０．２×１０６の放射線照射されたＡ２０＋０．３×１
０６のＡＰＣ＋抗ＩＬ−４抗原＋／−免疫刺激性のオリゴヌクレオチドを９６孔
式の丸底培養プレート内で２００μｌの容量で培養する。
０６のＡＰＣ＋抗ＩＬ−４抗原＋／−免疫刺激性のオリゴヌクレオチドを９６孔
式の丸底培養プレート内で２００μｌの容量で培養する。
【００２５】 第１２日目 抗ＩＬ−４抗体、オリゴヌクレオチド、およびＩＬ−２の媒体を交換する。
【００２６】 第１４日目 ２４孔式の培養プレート内で細胞懸濁を実施し、ＩＬ−２を含有する媒体で培
養する。
養する。
【００２７】 第１５−２０日目 ２日毎（第１７および１９日目）に媒体交換およびＩＬ−２を含有する媒体に
よる培養を実施する。細胞密度に従って培養物を別の培養皿に分配する。
よる培養を実施する。細胞密度に従って培養物を別の培養皿に分配する。
【００２８】 第２１日目 第３回目の刺激 必要に応じてＴｈを１０−１４日毎に、すなわち第２１日目に第３回目そして
さらに多数回にわたって、第２回目の刺激（第１１−２０日目）のプロトコルに
従って再刺激しさらに増進させることができる。あるいは、養子免疫細胞移入に
よる治療に使用することもできる。
さらに多数回にわたって、第２回目の刺激（第１１−２０日目）のプロトコルに
従って再刺激しさらに増進させることができる。あるいは、養子免疫細胞移入に
よる治療に使用することもできる。
【００２９】 これらの直線性表面抗原を制御しながら圧出することができ、これは活性Ｔｈ
を特徴付けるものである。このように生成されたＴｈ配列は： （１） 腫瘍、ここではＡ２０−リンパ腫に対して特異的であり、 （２） Ｔｈ１型（Ｔｈ１類似細胞）のＴ細胞配列である。
を特徴付けるものである。このように生成されたＴｈ配列は： （１） 腫瘍、ここではＡ２０−リンパ腫に対して特異的であり、 （２） Ｔｈ１型（Ｔｈ１類似細胞）のＴ細胞配列である。
【００３０】 これを試験管内において、クラスIIのＭＨＣ分子を介してＡ２０腫瘍の腫瘍ペ
プチドを提示する同系の脾臓細胞で刺激すると、多量のＩＦＮ−γおよび少量（
あるいは皆無）のＩＬ−４を生成する（図１の産生データ参照）。しかしながら
、Ｔｈを腫瘍抗原またはＭＣＰ１１−Ｂ細胞リンパ腫等の他の腫瘍の抗原を提示
しない同系の脾臓細胞とともに培養すると、サイトカインを全く産生しないか、
あるいは極僅かしか産生しない。この細胞はＡ２０リンパ腫を標的として使用す
ることができる医薬剤を形成する。
プチドを提示する同系の脾臓細胞で刺激すると、多量のＩＦＮ−γおよび少量（
あるいは皆無）のＩＬ−４を生成する（図１の産生データ参照）。しかしながら
、Ｔｈを腫瘍抗原またはＭＣＰ１１−Ｂ細胞リンパ腫等の他の腫瘍の抗原を提示
しない同系の脾臓細胞とともに培養すると、サイトカインを全く産生しないか、
あるいは極僅かしか産生しない。この細胞はＡ２０リンパ腫を標的として使用す
ることができる医薬剤を形成する。
【００３１】 最初に、Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入の効果がＢａｌｂ
／ｃマウスのＡ２０腫瘍に対する免疫応答について検査された。このためＢａｌ
ｂ／ｃマウスに０．５×１０６個のＡ２０細胞および０．５×１０６個のＡ２０
に対して特異的なＴｈ１が腹腔内に同時に注入された。５，７および１０日後に
脾臓細胞がマウスから分離され、試験管内において腫瘍、ここでは同系ＡＰＣに
よって提示された０．２×１０６個のＡ２０腫瘍によって刺激された。腫瘍細胞
が付加されたマウスのＴリンパ球は、腫瘍を付加した後５日以内に隔絶された際
にのみＩＦＮ−γを産生した。これとは逆に、Ａ２０腫瘍およびＡ２０特異的Ｔ
ｈ１の両方が注入されたマウスのリンパ球は、同系ＡＰＣならびに腫瘍特異的抗
原によって刺激された腫瘍移入から１０日以上経過してもまだＩＦＮ−γを産生
した（図２）。Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によってＡ２
０腫瘍に対する免疫応答の延長が達成された。
／ｃマウスのＡ２０腫瘍に対する免疫応答について検査された。このためＢａｌ
ｂ／ｃマウスに０．５×１０６個のＡ２０細胞および０．５×１０６個のＡ２０
に対して特異的なＴｈ１が腹腔内に同時に注入された。５，７および１０日後に
脾臓細胞がマウスから分離され、試験管内において腫瘍、ここでは同系ＡＰＣに
よって提示された０．２×１０６個のＡ２０腫瘍によって刺激された。腫瘍細胞
が付加されたマウスのＴリンパ球は、腫瘍を付加した後５日以内に隔絶された際
にのみＩＦＮ−γを産生した。これとは逆に、Ａ２０腫瘍およびＡ２０特異的Ｔ
ｈ１の両方が注入されたマウスのリンパ球は、同系ＡＰＣならびに腫瘍特異的抗
原によって刺激された腫瘍移入から１０日以上経過してもまだＩＦＮ−γを産生
した（図２）。Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によってＡ２
０腫瘍に対する免疫応答の延長が達成された。
【００３２】 腫瘍反応性Ｔｈ１による腫瘍予防 腫瘍予防実験において、Ｂａｌｂ／ｃマウスに直ぐ前後して０．５×１０６個
のＡ２０腫瘍細胞ならびに０．５×１０６個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１腹
腔内に注入された。Ｔｈ１配列の養子免疫細胞移入によってマウスの生存状況が
大幅に延長された（図３）。実験に応じて７０％および１００％のマウスが完全
に治癒された。これは、この腫瘍が極めて悪性であり通常は有効な腫瘍予防を提
供する従来の多くの免疫治療が無効であった点からみて、極めて驚くべきことで
ある。２番目の重要な結果は、このＴｈ１配列の養子免疫細胞移入が腫瘍の進行
を防止するにもかかわらず自己免疫症をもたらすことはなく：実験動物は自然な
死に至るまで生存した。１年後においても実験動物について臨床ならびに検死の
両方において腫瘍および自己免疫症状のいずれの兆候も見られなかった。実験動
物に対して免疫抑制を施しても後の時点で腫瘍が発生することはない。
のＡ２０腫瘍細胞ならびに０．５×１０６個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１腹
腔内に注入された。Ｔｈ１配列の養子免疫細胞移入によってマウスの生存状況が
大幅に延長された（図３）。実験に応じて７０％および１００％のマウスが完全
に治癒された。これは、この腫瘍が極めて悪性であり通常は有効な腫瘍予防を提
供する従来の多くの免疫治療が無効であった点からみて、極めて驚くべきことで
ある。２番目の重要な結果は、このＴｈ１配列の養子免疫細胞移入が腫瘍の進行
を防止するにもかかわらず自己免疫症をもたらすことはなく：実験動物は自然な
死に至るまで生存した。１年後においても実験動物について臨床ならびに検死の
両方において腫瘍および自己免疫症状のいずれの兆候も見られなかった。実験動
物に対して免疫抑制を施しても後の時点で腫瘍が発生することはない。
【００３３】 腫瘍反応性Ｔｈ１による腫瘍治療 この実証を行うため、Ｔｈ１を既に存在する腫瘍を治療するために使用した。
０．５×１０６個のＡ２０腫瘍細胞が静脈内に注入された。移入後７日目におい
て、既に多量の腫瘍がリンパ球組織内に検出され、この時点で実験動物に０．５
×１０６個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１配列、すなわち体重１ｋｇ当り２５
×１０６個のＴｈ１細胞を再び静脈内接種した。５つの実験からのデータは、（
１）略全ての動物において腫瘍の増大が大幅に遅くなり、（２）７０％の実験動
物がＴｈ１の移入によって治癒したと認められた（図４）。この治療は、今まで
の免疫治療において記載されていなかった時点においてもまだ効果があり、また
今までに記載されていた免疫治療プロトコルに比べて脾臓の腫瘍症状が１００倍
に拡大した時点においても効果があった。
０．５×１０６個のＡ２０腫瘍細胞が静脈内に注入された。移入後７日目におい
て、既に多量の腫瘍がリンパ球組織内に検出され、この時点で実験動物に０．５
×１０６個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１配列、すなわち体重１ｋｇ当り２５
×１０６個のＴｈ１細胞を再び静脈内接種した。５つの実験からのデータは、（
１）略全ての動物において腫瘍の増大が大幅に遅くなり、（２）７０％の実験動
物がＴｈ１の移入によって治癒したと認められた（図４）。この治療は、今まで
の免疫治療において記載されていなかった時点においてもまだ効果があり、また
今までに記載されていた免疫治療プロトコルに比べて脾臓の腫瘍症状が１００倍
に拡大した時点においても効果があった。
【００３４】 従って、図２，３および４のデータから、養子免疫細胞移入されたＴｈ１が腫
瘍に対して極めて効果的な免疫応答をもたらすことが示されている。本発明によ
って初めて以下のことが立証された。 （１） Ｔｈ１は予防だけでなく腫瘍治療においても効果的かつ安全に使用可能
である。 （２） この治療は免疫抗体生産能力のある動物にも適用可能である。 （３） ここに記述された方法は、Ｔｈ１を特に固形腫瘍等の他の細胞にも投与
することができることを前提とし、これは抗原の提示が主に自己／同系ＡＰＣ（
この場合脾臓細胞の使用）によって実施されるからである。従ってこの方法によ
れば、クラスIIのＭＨＣを圧出しない固形腫瘍に対する免疫応答に有効なＴｈ１
を生成することも可能となる。
瘍に対して極めて効果的な免疫応答をもたらすことが示されている。本発明によ
って初めて以下のことが立証された。 （１） Ｔｈ１は予防だけでなく腫瘍治療においても効果的かつ安全に使用可能
である。 （２） この治療は免疫抗体生産能力のある動物にも適用可能である。 （３） ここに記述された方法は、Ｔｈ１を特に固形腫瘍等の他の細胞にも投与
することができることを前提とし、これは抗原の提示が主に自己／同系ＡＰＣ（
この場合脾臓細胞の使用）によって実施されるからである。従ってこの方法によ
れば、クラスIIのＭＨＣを圧出しない固形腫瘍に対する免疫応答に有効なＴｈ１
を生成することも可能となる。
【００３５】 添付図面は、本発明をさらに詳細に説明するものである。
【００３６】 図１には、試験管内で刺激された後のＡ２０に対して特異的なＴｈ１細胞配列
によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生が示されている。ＣＤ４＋Ｔ細胞配列の
ＩＦＮ−γの産生は、ＣｐＧ ＯＤＮおよび抗ＩＬ−４抗体をリンパ腫に対して
用いて２週間の間試験管内で発生させた。この際ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ）はＢａ
ｌｂ／ｃマウスから隔出され、これはＡ２０腫瘍によって免疫化されてあったも
のである。得られたＴｈは、同系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ａ２０腫瘍細胞、
抗ＩＬ−４抗体、ＩＬ−２およびＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８の存在下において試験
管内で刺激され、１０日以上にわたって増殖された。培養されたＴｈ１は１１日
目にＡＰＣのみあるいはこれに加えてＡ２０細胞の存在下において２４時間再刺
激された。培養生成物からＩＬ−４とＩＦＮ−γの含有率が測定された。
によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生が示されている。ＣＤ４＋Ｔ細胞配列の
ＩＦＮ−γの産生は、ＣｐＧ ＯＤＮおよび抗ＩＬ−４抗体をリンパ腫に対して
用いて２週間の間試験管内で発生させた。この際ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ）はＢａ
ｌｂ／ｃマウスから隔出され、これはＡ２０腫瘍によって免疫化されてあったも
のである。得られたＴｈは、同系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ａ２０腫瘍細胞、
抗ＩＬ−４抗体、ＩＬ−２およびＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８の存在下において試験
管内で刺激され、１０日以上にわたって増殖された。培養されたＴｈ１は１１日
目にＡＰＣのみあるいはこれに加えてＡ２０細胞の存在下において２４時間再刺
激された。培養生成物からＩＬ−４とＩＦＮ−γの含有率が測定された。
【００３７】 図２には、Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によるＡ２０に
対して特異的な免疫応答の延長が示されている。Ａ２０に対して特異的なＴｈ１
の養子免疫細胞移入によって、Ａ２０Ｂ細胞リンパ腫に対する腫瘍特異的な免疫
応答が大幅に延長された。この際、５０万個のＡ２０腫瘍細胞の静脈内注入また
はこれに加えて５０万個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１の静脈内注入によって
、Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫化が行われた。第５，７，１０日目に、マウスの脾
臓が標本化され、１００万個の細胞が放射線照射されたＡ２０の不在下および存
在下において３７℃の温度で４８時間培養された。培養生成物からＩＦＮ−γが
測定された。
対して特異的な免疫応答の延長が示されている。Ａ２０に対して特異的なＴｈ１
の養子免疫細胞移入によって、Ａ２０Ｂ細胞リンパ腫に対する腫瘍特異的な免疫
応答が大幅に延長された。この際、５０万個のＡ２０腫瘍細胞の静脈内注入また
はこれに加えて５０万個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１の静脈内注入によって
、Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫化が行われた。第５，７，１０日目に、マウスの脾
臓が標本化され、１００万個の細胞が放射線照射されたＡ２０の不在下および存
在下において３７℃の温度で４８時間培養された。培養生成物からＩＦＮ−γが
測定された。
【００３８】 図３には、Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によるＡ２０Ｂ
細胞リンパ腫の予防が示されている。Ａ２０リンパ腫（腫瘍）の養子免疫細胞移
入の後Ｂａｌｂ／ｃマウスは短時間で死亡し、Ａ２０リンパ腫と同時にＡ２０に
対して特異的なＴｈ１を養子免疫細胞移入した後Ｂａｌｂ／ｃマウスは長期間生
存した。５０万個のＡ２０腫瘍細胞の静脈内注入またはこれに加えて５０万個の
Ａ２０に対して特異的なＴｈ１がＢａｌｂ／ｃマウスに投与され、治療の経過は
視覚的に観察された。
細胞リンパ腫の予防が示されている。Ａ２０リンパ腫（腫瘍）の養子免疫細胞移
入の後Ｂａｌｂ／ｃマウスは短時間で死亡し、Ａ２０リンパ腫と同時にＡ２０に
対して特異的なＴｈ１を養子免疫細胞移入した後Ｂａｌｂ／ｃマウスは長期間生
存した。５０万個のＡ２０腫瘍細胞の静脈内注入またはこれに加えて５０万個の
Ａ２０に対して特異的なＴｈ１がＢａｌｂ／ｃマウスに投与され、治療の経過は
視覚的に観察された。
【００３９】 図４には、Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入による既に形成
されているＡ２０Ｂ細胞リンパ腫の治療が示されている。Ａ２０リンパ腫（腫瘍
）の養子免疫細胞移入の後Ｂａｌｂ／ｃマウスは短時間で死亡し、Ａ２０リンパ
腫の移入の７日後にＡ２０に対して特異的なＴｈ１を養子免疫細胞移入した場合
Ｂａｌｂ／ｃマウスの８０％以上までが長期的に治癒した。この時点において、
腫瘍症状は従来最も効果があったサイトカインを移入した腫瘍細胞による治療と
比べて１００倍大きなものである。この際Ｂａｌｂ／ｃマウスに５００μｌのＰ
ＢＳにおける５０万個のＡ２０腫瘍細胞が静脈内投与された。Ａ２０の注入（１
００ＣＦＵ／脾臓）の７日後に、マウスに対し５００μｌのＰＢＳが単独または
５００μｌのＰＢＳ内における５０万個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１を伴っ
て静脈内投与され、治療経過は視覚的に観察された。
されているＡ２０Ｂ細胞リンパ腫の治療が示されている。Ａ２０リンパ腫（腫瘍
）の養子免疫細胞移入の後Ｂａｌｂ／ｃマウスは短時間で死亡し、Ａ２０リンパ
腫の移入の７日後にＡ２０に対して特異的なＴｈ１を養子免疫細胞移入した場合
Ｂａｌｂ／ｃマウスの８０％以上までが長期的に治癒した。この時点において、
腫瘍症状は従来最も効果があったサイトカインを移入した腫瘍細胞による治療と
比べて１００倍大きなものである。この際Ｂａｌｂ／ｃマウスに５００μｌのＰ
ＢＳにおける５０万個のＡ２０腫瘍細胞が静脈内投与された。Ａ２０の注入（１
００ＣＦＵ／脾臓）の７日後に、マウスに対し５００μｌのＰＢＳが単独または
５００μｌのＰＢＳ内における５０万個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１を伴っ
て静脈内投与され、治療経過は視覚的に観察された。
【図１】 試験管内で刺激された後のＡ２０に対して特異的なＴｈ１細胞配列によるＩＦ
Ｎ−γおよびＩＬ−４の産生を示す説明図である。
Ｎ−γおよびＩＬ−４の産生を示す説明図である。
【図２】 Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によるＡ２０に対して特異
的な免疫応答の延長を示す説明図である。
的な免疫応答の延長を示す説明図である。
【図３】 Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によるＡ２０Ｂ細胞リンパ
腫の予防を示す説明図である。
腫の予防を示す説明図である。
【図４】 Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入による既に形成されている
Ａ２０Ｂ細胞リンパ腫の治療を示す説明図である。
Ａ２０Ｂ細胞リンパ腫の治療を示す説明図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年３月１４日（２００１．３．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項６】 薬剤が養子免疫細胞移入に適する形態を有することを特徴と
する請求項１記載の方法。
する請求項１記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年８月２１日（２００１．８．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 抗腫瘍Ｔｈ１細胞の製造方法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 この発明は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を産生する抗腫瘍性Ｔｈ１
細胞の製造方法に関する。
細胞の製造方法に関する。
【０００２】 人類を含む哺乳類の免疫システムは、多様な腫瘍に対する防護を提供するとと
もにこれを撃退するための一連の戦略を備えている。従って、特に腫瘍細胞の表
面または内側に圧出された、（糖）たんぱく質である腫瘍抗原に対する免疫応答
を呼び出すことが可能である。この抗原に対する免疫応答は、固形腫瘍および造
血システムの腫瘍の形成を防止することができる。文献によれば、腫瘍に対する
免疫応答の殆どはＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）ならびに細胞障害性ＣＤ８＋
Ｔ細胞（Ｔｃ）の両方に依存している。しかしながら、特に細胞障害性Ｔｃが有
効な腫瘍防止に寄与することが認められている。この点からＴｈの役目は今まで
ごくわずかにしか研究されていない。
もにこれを撃退するための一連の戦略を備えている。従って、特に腫瘍細胞の表
面または内側に圧出された、（糖）たんぱく質である腫瘍抗原に対する免疫応答
を呼び出すことが可能である。この抗原に対する免疫応答は、固形腫瘍および造
血システムの腫瘍の形成を防止することができる。文献によれば、腫瘍に対する
免疫応答の殆どはＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）ならびに細胞障害性ＣＤ８＋
Ｔ細胞（Ｔｃ）の両方に依存している。しかしながら、特に細胞障害性Ｔｃが有
効な腫瘍防止に寄与することが認められている。この点からＴｈの役目は今まで
ごくわずかにしか研究されていない。
【０００３】 多様な腫瘍に対して免疫を強化するための多数の治療薬ならびに方法が開発さ
れている。腫瘍予防として特に有効なものとして、例えば樹状抗原提示細胞（Ａ
ＰＣ）を用いた免疫強化、特にインターロイキン−（ＩＬ）−１２等の抗炎症媒
体の適用、ならびにＣＴＬＡ４分子の調合によるＴ細胞活性化が知られている。
別の手法として、腫瘍を濾過するＴ−リンパ球（ＴＩＬ）、リンフォカイン活性
化されたキラー細胞（ＬＡＫ）、またはＣＤ８＋Ｔリンパ球のいずれかを含有す
る医薬剤を用いたワクチン接種がある。しかしながら、この種の手法は極限定的
な効果しかもたらさないことが知られている。
れている。腫瘍予防として特に有効なものとして、例えば樹状抗原提示細胞（Ａ
ＰＣ）を用いた免疫強化、特にインターロイキン−（ＩＬ）−１２等の抗炎症媒
体の適用、ならびにＣＴＬＡ４分子の調合によるＴ細胞活性化が知られている。
別の手法として、腫瘍を濾過するＴ−リンパ球（ＴＩＬ）、リンフォカイン活性
化されたキラー細胞（ＬＡＫ）、またはＣＤ８＋Ｔリンパ球のいずれかを含有す
る医薬剤を用いたワクチン接種がある。しかしながら、この種の手法は極限定的
な効果しかもたらさないことが知られている。
【０００４】 腫瘍防止のため多数の免疫強化プロトコルが作成されたにもかかわらず、すで
に確立した腫瘍に対して有効な、免疫システムに対して効果をもたらす治療薬は
殆ど得られていない。唯一の実際に効果のある治療プロトコルは、白血病治療に
おける同種異系Ｔリンパ球の養子免疫細胞移入である。過去２０年のデータによ
り、ＩＦＮ−γを産生するＴリンパ球が細胞の腫瘍防止において重要な役割を果
たすことが知られている。現在までは、特にＴｃ上でクラスＩの腫瘍組織適合抗
原（ＭＨＣ Ｉ）を介して提示される抗原を対象にする腫瘍免疫応答が研究され
ていた。ＭＨＣクラスIIに関連するＴｈは調整細胞として見られていた。その存
在は、効果的な腫瘍防止において重要であると見られる。それにもかかわらず、
その免疫応答における正確な役割が知られていないばかりか、僅かな例外を除い
てその標的ペプチドも知られていない（免疫学９５：第２版４５−４７頁）。こ
の問題点のため、現在までは特定の腫瘍に対する免疫治療薬としては使用されて
いなかった。
に確立した腫瘍に対して有効な、免疫システムに対して効果をもたらす治療薬は
殆ど得られていない。唯一の実際に効果のある治療プロトコルは、白血病治療に
おける同種異系Ｔリンパ球の養子免疫細胞移入である。過去２０年のデータによ
り、ＩＦＮ−γを産生するＴリンパ球が細胞の腫瘍防止において重要な役割を果
たすことが知られている。現在までは、特にＴｃ上でクラスＩの腫瘍組織適合抗
原（ＭＨＣ Ｉ）を介して提示される抗原を対象にする腫瘍免疫応答が研究され
ていた。ＭＨＣクラスIIに関連するＴｈは調整細胞として見られていた。その存
在は、効果的な腫瘍防止において重要であると見られる。それにもかかわらず、
その免疫応答における正確な役割が知られていないばかりか、僅かな例外を除い
てその標的ペプチドも知られていない（免疫学９５：第２版４５−４７頁）。こ
の問題点のため、現在までは特定の腫瘍に対する免疫治療薬としては使用されて
いなかった。
【０００５】 （後から公開された）国際特許公開ＷＯ９９／５１７２０号には、Ｔｈ１細胞
が生成される極めて特殊な方法が記載されている。しかしながらこれは、例えば
腫瘍抗原等の抗原を特別に認識する、ＣＤ２陽性細胞またはＴ細胞を有効に生成
することを可能にするものではない。
が生成される極めて特殊な方法が記載されている。しかしながらこれは、例えば
腫瘍抗原等の抗原を特別に認識する、ＣＤ２陽性細胞またはＴ細胞を有効に生成
することを可能にするものではない。
【０００６】 既知の方法（クーゲ氏等による１９９５年発行の免疫学ジャーナル１５４（４
）版１７７７−８５頁）において、培養皿内でＴｈ１リンパ球が腫瘍細胞を溶解
し得ることが記載されている。しかしながら、この文献には生体内治療を示唆す
る記述はなされていない。さらに、この手法は直接的に生体内状況に当てはめる
ことが不可能である。
）版１７７７−８５頁）において、培養皿内でＴｈ１リンパ球が腫瘍細胞を溶解
し得ることが記載されている。しかしながら、この文献には生体内治療を示唆す
る記述はなされていない。さらに、この手法は直接的に生体内状況に当てはめる
ことが不可能である。
【０００７】 従って本発明の目的は、腫瘍疾病の予防ならびに治療のための医薬剤の製造方
法を提供することである。特に、生体内において腫瘍に対して効果的な、特殊な
腫瘍反応細胞を試験管内で生成することに関する。全ての腫瘍治療の目的は、腫
瘍を可能な限り破壊し、その際体内のその他の細胞を保護することである。従来
の治療ではこのことが極限定的にしか達成できなかった。そのため、特殊な腫瘍
治療の開発が試みられた。今日の水準において腫瘍を対象にしている唯一の治療
方法は免疫治療であり、これはリンパ球がその抗原レセプタの働きにより、この
リンパ球が作用する標的細胞のみを認識するためである。
法を提供することである。特に、生体内において腫瘍に対して効果的な、特殊な
腫瘍反応細胞を試験管内で生成することに関する。全ての腫瘍治療の目的は、腫
瘍を可能な限り破壊し、その際体内のその他の細胞を保護することである。従来
の治療ではこのことが極限定的にしか達成できなかった。そのため、特殊な腫瘍
治療の開発が試みられた。今日の水準において腫瘍を対象にしている唯一の治療
方法は免疫治療であり、これはリンパ球がその抗原レセプタの働きにより、この
リンパ球が作用する標的細胞のみを認識するためである。
【０００８】 腫瘍細胞を直接的に殺消する能力のため、今日の研究は腫瘍特異的Ｔｃによる
抗腫瘍治療に重点がおかれている。しかしながら、自己免疫病の面から、Ｔｃで
はなくＴｈが自己免疫病を極めて有効に解消することが知られている（１９９４
年、ラッケ氏等による）。特に重大な、しばしば急死にいたる形式の自己免疫病
は、ＩＦＮ−γの養子免疫細胞移入を生じさせる、Ｔｈ１とも呼ばれるＴｈによ
って解決される。この養子免疫細胞移入されるＴｈ１は標的組織は破壊するがそ
の際他の全ての組織を保護するため、腫瘍特異的Ｔｈ１の養子免疫細胞移入は腫
瘍治療に極めて良好に適したものである。
抗腫瘍治療に重点がおかれている。しかしながら、自己免疫病の面から、Ｔｃで
はなくＴｈが自己免疫病を極めて有効に解消することが知られている（１９９４
年、ラッケ氏等による）。特に重大な、しばしば急死にいたる形式の自己免疫病
は、ＩＦＮ−γの養子免疫細胞移入を生じさせる、Ｔｈ１とも呼ばれるＴｈによ
って解決される。この養子免疫細胞移入されるＴｈ１は標的組織は破壊するがそ
の際他の全ての組織を保護するため、腫瘍特異的Ｔｈ１の養子免疫細胞移入は腫
瘍治療に極めて良好に適したものである。
【０００９】 本発明に従って製造された医薬剤は、起こり得る腫瘍の発達を防止し、特に既
に確立した腫瘍に対しても同様に効果があることが必要である。さらに、本発明
に従って製造された医薬剤はそれぞれ対処する腫瘍に適合させ得ることが必要で
ある。この医薬剤は、自然の腫瘍防止方式を真似たもの、あるいはこれを補助す
るものである必要があり、従って副作用が全く無いかあるいは極限定的なものと
なる。
に確立した腫瘍に対しても同様に効果があることが必要である。さらに、本発明
に従って製造された医薬剤はそれぞれ対処する腫瘍に適合させ得ることが必要で
ある。この医薬剤は、自然の腫瘍防止方式を真似たもの、あるいはこれを補助す
るものである必要があり、従って副作用が全く無いかあるいは極限定的なものと
なる。
【００１０】 前記の課題は、高いＩＦＮ−γ産生Ｐ１（１００≦Ｐ１≦１０００００Ｕ／ｍ
ｌ）と低いＩＬ−４産生Ｐ２（Ｐ２≦１０００Ｕ／ｍｌ）を備える、Ｔｈ１に類
似するサイトカインモデルによって特徴付けられた、腫瘍特異的Ｔｈを含有する
医薬剤の製造方法によって解決される。この際、Ｐ１：Ｐ２比が１０：１もしく
はそれより大きな数値範囲となることが特に重要である。Ｔリンパ球は医薬用添
加剤および補助剤と共に投与される。腫瘍特異的Ｔｈ１細胞の製造方法が提供さ
れる。これは、腫瘍および腫瘍に結合した抗原（アミノ酸／たんぱく質配列）を
検知しこれに対して反応する細胞である。しかしながら、この細胞は、体内に有
用に存在するその他の抗原に対しては殆ど反応しない。本発明は、さらに固形腫
瘍および造血システムの腫瘍の予防および／または治療に対してのこのＴｈ１の
適用法に関するものである。
ｌ）と低いＩＬ−４産生Ｐ２（Ｐ２≦１０００Ｕ／ｍｌ）を備える、Ｔｈ１に類
似するサイトカインモデルによって特徴付けられた、腫瘍特異的Ｔｈを含有する
医薬剤の製造方法によって解決される。この際、Ｐ１：Ｐ２比が１０：１もしく
はそれより大きな数値範囲となることが特に重要である。Ｔリンパ球は医薬用添
加剤および補助剤と共に投与される。腫瘍特異的Ｔｈ１細胞の製造方法が提供さ
れる。これは、腫瘍および腫瘍に結合した抗原（アミノ酸／たんぱく質配列）を
検知しこれに対して反応する細胞である。しかしながら、この細胞は、体内に有
用に存在するその他の抗原に対しては殆ど反応しない。本発明は、さらに固形腫
瘍および造血システムの腫瘍の予防および／または治療に対してのこのＴｈ１の
適用法に関するものである。
【００１１】 自己免疫病の病因研究によって、Ｔｈ特にＴｈ１およびＴｈ１に類似する細胞
が腫瘍防止において重要な役割を果たすことが発見された。攻撃すべき腫瘍の（
糖）タンパク質を限定的に検知するＴｈ１を培養することによって、腫瘍の予防
／攻撃を行うための有効な医薬剤を製造することができる。これらの細胞を含有
する医薬剤は、経口外の組織に対して、たいていは腹腔内、静脈内、または皮下
の組織に投与される。投与されたＴｈ１は、直接的に細胞壊死を誘導するかまた
は特定のサイトカインを産生することによって、腫瘍に対する免疫応答を活性化
あるいは強化する。これらは、腫瘍に対して直接的に細胞障害性であるものとす
るか、あるいはＴｃまたは大食細胞等の腫瘍に対して毒性的な効果細胞を補充お
よび活性化するものとし得る。これによって免疫作用による腫瘍の緩解または退
行が決定的なものとなる。
が腫瘍防止において重要な役割を果たすことが発見された。攻撃すべき腫瘍の（
糖）タンパク質を限定的に検知するＴｈ１を培養することによって、腫瘍の予防
／攻撃を行うための有効な医薬剤を製造することができる。これらの細胞を含有
する医薬剤は、経口外の組織に対して、たいていは腹腔内、静脈内、または皮下
の組織に投与される。投与されたＴｈ１は、直接的に細胞壊死を誘導するかまた
は特定のサイトカインを産生することによって、腫瘍に対する免疫応答を活性化
あるいは強化する。これらは、腫瘍に対して直接的に細胞障害性であるものとす
るか、あるいはＴｃまたは大食細胞等の腫瘍に対して毒性的な効果細胞を補充お
よび活性化するものとし得る。これによって免疫作用による腫瘍の緩解または退
行が決定的なものとなる。
【００１２】 本発明によれば、任意の腫瘍類型に対応するＴｈ１−細胞を生成することがで
きる。Ｔｈ１の産生はリンパ腫に対しても有効であることが好適であるが、固形
腫瘍も重要な標的である。従って、本発明に従って製造された医薬剤により所定
のタイプの腫瘍が攻撃される。投与する薬種および薬量は、治療する腫瘍の種類
および程度、患者の病状、ならびに治療期間に従って医者が決定する。本発明に
従って製造された医薬剤は、体重に対して１×１０６−１００−１０００×１０ ６ 細胞／ｋｇの配量で一回のみまたは繰り返し投与される。この医薬剤は人間あ
るいは動物に投与することができる。
きる。Ｔｈ１の産生はリンパ腫に対しても有効であることが好適であるが、固形
腫瘍も重要な標的である。従って、本発明に従って製造された医薬剤により所定
のタイプの腫瘍が攻撃される。投与する薬種および薬量は、治療する腫瘍の種類
および程度、患者の病状、ならびに治療期間に従って医者が決定する。本発明に
従って製造された医薬剤は、体重に対して１×１０６−１００−１０００×１０ ６ 細胞／ｋｇの配量で一回のみまたは繰り返し投与される。この医薬剤は人間あ
るいは動物に投与することができる。
【００１３】 本発明に従って製造されたＴｈ１細胞は、造血系腫瘍を防止することができ；
これはさらに既に存在するリンパ腫の治療にも適するとともに、この種のＴｈ１
細胞を使用してさらに固形腫瘍を少なくとも抑制することができる。
これはさらに既に存在するリンパ腫の治療にも適するとともに、この種のＴｈ１
細胞を使用してさらに固形腫瘍を少なくとも抑制することができる。
【００１４】 本発明に係る方法によれば、さらに腫瘍に応じた固有のＴｈ１細胞を既に進行
した腫瘍を疾病している動物から生成することができる。この際、多数の異なっ
た免疫細胞の中から培養すべき少数の、特に腫瘍を検知する特定のＴリンパ球系
類を正確に取り出すことができる。腫瘍特異的Ｔｈ１細胞を養子免疫細胞移入す
ることによって、極めて迅速に有効な抗腫瘍免疫応答を形成することができ、こ
れは治療においても極めて即効性であるとともに安全、すなわち副作用が非常に
少ないものである。
した腫瘍を疾病している動物から生成することができる。この際、多数の異なっ
た免疫細胞の中から培養すべき少数の、特に腫瘍を検知する特定のＴリンパ球系
類を正確に取り出すことができる。腫瘍特異的Ｔｈ１細胞を養子免疫細胞移入す
ることによって、極めて迅速に有効な抗腫瘍免疫応答を形成することができ、こ
れは治療においても極めて即効性であるとともに安全、すなわち副作用が非常に
少ないものである。
【００１５】 腫瘍に対して反応するクラスIIのＭＨＣが結合されたＣＤ４＋Ｔｈの役割を探
求するため、腫瘍特異的Ｔｈ１を生成する培養システムを開発することが必要で
あった。クラスIIのＭＨＣと結合された腫瘍ペプチドは、今までは殆ど知られて
いなかった。そのため、固有の腫瘍ペプチドを知ることなく腫瘍特異的Ｔｈ１を
形成することを可能にするシステムが開発された。放射線照射またはマイトマイ
シンＣ等の化学療法によって増殖を抑制された腫瘍細胞を自家移植／同系ＡＰＣ
およびＴｈとともに試験管内で培養する。実用性の理由から今まで実験はＭＨＣ
IIによって自己の腫瘍抗原が提示されるＢ細胞リンパ腫についてのみ実施されて
いた。Ａ２０細胞リンパ腫を既に有しているマウス、またはこのリンパ腫に対し
て免疫を有するマウスからＣＤ４＋Ｔｈが得られた。このＴｈは、以下に記す方
法によって試験管内で培養され、多量のＩＦＮ−γを産生するが極少量または殆
どＩＬ−４を産生しないＴｈからなる腫瘍特異的Ｔｈ１が生成されるようにした
。市販のＥＬＩＳＡ試験によって測定した結果、有効なＩＦＮ−γ範囲は１０２ ないし１０５Ｕ／ｍｌ；ＣＴ４Ｓ細胞で測定した結果ＩＬ−４は１０００Ｕ／ｍ
ｌ未満となった。ここでも、ＩＦＮ−γ対ＩＬ−４の比率が１０：１以下である
ことが重要である。この腫瘍特異的Ｔｈ１は腫瘍治療に使用された。
求するため、腫瘍特異的Ｔｈ１を生成する培養システムを開発することが必要で
あった。クラスIIのＭＨＣと結合された腫瘍ペプチドは、今までは殆ど知られて
いなかった。そのため、固有の腫瘍ペプチドを知ることなく腫瘍特異的Ｔｈ１を
形成することを可能にするシステムが開発された。放射線照射またはマイトマイ
シンＣ等の化学療法によって増殖を抑制された腫瘍細胞を自家移植／同系ＡＰＣ
およびＴｈとともに試験管内で培養する。実用性の理由から今まで実験はＭＨＣ
IIによって自己の腫瘍抗原が提示されるＢ細胞リンパ腫についてのみ実施されて
いた。Ａ２０細胞リンパ腫を既に有しているマウス、またはこのリンパ腫に対し
て免疫を有するマウスからＣＤ４＋Ｔｈが得られた。このＴｈは、以下に記す方
法によって試験管内で培養され、多量のＩＦＮ−γを産生するが極少量または殆
どＩＬ−４を産生しないＴｈからなる腫瘍特異的Ｔｈ１が生成されるようにした
。市販のＥＬＩＳＡ試験によって測定した結果、有効なＩＦＮ−γ範囲は１０２ ないし１０５Ｕ／ｍｌ；ＣＴ４Ｓ細胞で測定した結果ＩＬ−４は１０００Ｕ／ｍ
ｌ未満となった。ここでも、ＩＦＮ−γ対ＩＬ−４の比率が１０：１以下である
ことが重要である。この腫瘍特異的Ｔｈ１は腫瘍治療に使用された。
【００１６】 腫瘍特異的Ｔｈ１の物質生成 マウスのＡ２０細胞（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ−２０８）を１０％のＦＣＳおよび５
０ｍＭのβメルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０内において５％の
ＣＯ２濃度を有し３７℃で湿度が飽和状態の空気中で培養した。試験管内におけ
るＴｈを伴った培養の前に腫瘍細胞を６５グレイで放射線照射した。
０ｍＭのβメルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０内において５％の
ＣＯ２濃度を有し３７℃で湿度が飽和状態の空気中で培養した。試験管内におけ
るＴｈを伴った培養の前に腫瘍細胞を６５グレイで放射線照射した。
【００１７】 Ｔｈ（９５％を超える純度）をバイオテックスＴ細胞酸（フランクフルト市の
テブ社製）を付加してネガティブセレクションによって取り出した。ポジティブ
またはネガティブセレクションによってＴｈを取り出すその他の方式も同様に使
用することができる。これらのＴｈは、１０％のＦＣＳ、ペニシリン、ならびに
５０μＭのβメルカプトエタノールおよびＭＥＭアミノ酸が添加されたＤｕｌｂ
ｅｃｃｏｓ ＭＥＭ（培養媒体）内において、７．５％のＣＯ２濃度を有し３７
℃で湿度が飽和状態の空気中で試験管内培養した。Ｔｈ配列を生成するためにそ
の他の媒体を使用することもでき、そのうちのいくつかは血清の使用を必要とし
ない。
テブ社製）を付加してネガティブセレクションによって取り出した。ポジティブ
またはネガティブセレクションによってＴｈを取り出すその他の方式も同様に使
用することができる。これらのＴｈは、１０％のＦＣＳ、ペニシリン、ならびに
５０μＭのβメルカプトエタノールおよびＭＥＭアミノ酸が添加されたＤｕｌｂ
ｅｃｃｏｓ ＭＥＭ（培養媒体）内において、７．５％のＣＯ２濃度を有し３７
℃で湿度が飽和状態の空気中で試験管内培養した。Ｔｈ配列を生成するためにそ
の他の媒体を使用することもでき、そのうちのいくつかは血清の使用を必要とし
ない。
【００１８】 Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を抗ＣＤ４−および抗ＣＤ８抗体および補体（
マールブルグ市のベーリング工業社製）で処理することによってＡＰＣを集積し
た。試験管内におけるＴｈを付加する前に３０グレイで放射線照射した。
マールブルグ市のベーリング工業社製）で処理することによってＡＰＣを集積し
た。試験管内におけるＴｈを付加する前に３０グレイで放射線照射した。
【００１９】 ホスホチオエイト（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔ）変換されたＣｐＧジヌクレ
オチドを含有するオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８）がＭＷＧ社（
ミュンヘン市）によって使用された（結果：５′−ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ Ｔ
ＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ−３′）。クローン１１Ｂ１１から生じる抗ＩＬ−
４抗体である、人間のｒＩＬ−２は市販のものが使用された。この種の抗体は人
間のＩＬ−４に対しても開発されており；さらにＴｈ１は可溶性ＩＬ−４レセプ
タ分子の使用によって生成することができる（ブライト氏等による１９９６年の
欧州免疫学ジャーナル第２６号１８６０−１８６５頁）。
オチドを含有するオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８）がＭＷＧ社（
ミュンヘン市）によって使用された（結果：５′−ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ Ｔ
ＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ−３′）。クローン１１Ｂ１１から生じる抗ＩＬ−
４抗体である、人間のｒＩＬ−２は市販のものが使用された。この種の抗体は人
間のＩＬ−４に対しても開発されており；さらにＴｈ１は可溶性ＩＬ−４レセプ
タ分子の使用によって生成することができる（ブライト氏等による１９９６年の
欧州免疫学ジャーナル第２６号１８６０−１８６５頁）。
【００２０】 腫瘍特異的Ｔｈ１の製造例 第１日目 第１回目の刺激 ０．２×１０６Ｔｈ＋放射線照射された腫瘍細胞（０．２×１０６Ａ２０）＋
０．３×１０６ＡＰＣ＋抗ＩＬ−４抗原（例えば１０μｇ／ｍｌの１１Ｂ１１）
＋／−免疫刺激性のオリゴヌクレオチド（例えば０．２μＭのＣｐＧ−ＯＤＮ１
６６８）＋ＩＬ−２を９６孔式の丸底培養プレート内で２００μｌの容量で培養
する。
０．３×１０６ＡＰＣ＋抗ＩＬ−４抗原（例えば１０μｇ／ｍｌの１１Ｂ１１）
＋／−免疫刺激性のオリゴヌクレオチド（例えば０．２μＭのＣｐＧ−ＯＤＮ１
６６８）＋ＩＬ−２を９６孔式の丸底培養プレート内で２００μｌの容量で培養
する。
【００２１】 第２日目 抗ＩＬ−４抗体、オリゴヌクレオチド、およびＩＬ−２の媒体を交換する。
【００２２】 第４日目 ２４孔式の培養プレート内で細胞懸濁を実施し、ＩＬ−２を含有する媒体で培
養する。
養する。
【００２３】 第５−１０日目 ２日毎（第７および９日目）に媒体交換およびＩＬ−２を含有する媒体による
培養を実施する。細胞密度に従って培養物を別の培養皿に分配する。
培養を実施する。細胞密度に従って培養物を別の培養皿に分配する。
【００２４】 第１１日目 第２回目の細胞刺激 ０．１×１０６Ｔｈ＋０．２×１０６の放射線照射されたＡ２０＋０．３×１
０６のＡＰＣ＋抗ＩＬ−４抗原＋／−免疫刺激性のオリゴヌクレオチドを９６孔
式の丸底培養プレート内で２００μｌの容量で培養する。
０６のＡＰＣ＋抗ＩＬ−４抗原＋／−免疫刺激性のオリゴヌクレオチドを９６孔
式の丸底培養プレート内で２００μｌの容量で培養する。
【００２５】 第１２日目 抗ＩＬ−４抗体、オリゴヌクレオチド、およびＩＬ−２の媒体を交換する。
【００２６】 第１４日目 ２４孔式の培養プレート内で細胞懸濁を実施し、ＩＬ−２を含有する媒体で培
養する。
養する。
【００２７】 第１５−２０日目 ２日毎（第１７および１９日目）に媒体交換およびＩＬ−２を含有する媒体に
よる培養を実施する。細胞密度に従って培養物を別の培養皿に分配する。
よる培養を実施する。細胞密度に従って培養物を別の培養皿に分配する。
【００２８】 第２１日目 第３回目の刺激 必要に応じてＴｈを１０−１４日毎に、すなわち第２１日目に第３回目そして
さらに多数回にわたって、第２回目の刺激（第１１−２０日目）のプロトコルに
従って再刺激しさらに増進させることができる。あるいは、養子免疫細胞移入に
よる治療に使用することもできる。
さらに多数回にわたって、第２回目の刺激（第１１−２０日目）のプロトコルに
従って再刺激しさらに増進させることができる。あるいは、養子免疫細胞移入に
よる治療に使用することもできる。
【００２９】 これらの直線性表面抗原を制御しながら圧出することができ、これは活性Ｔｈ
を特徴付けるものである。このように生成されたＴｈ配列は： （１） 腫瘍、ここではＡ２０−リンパ腫に対して特異的であり、 （２） Ｔｈ１型（Ｔｈ１類似細胞）のＴ細胞配列である。
を特徴付けるものである。このように生成されたＴｈ配列は： （１） 腫瘍、ここではＡ２０−リンパ腫に対して特異的であり、 （２） Ｔｈ１型（Ｔｈ１類似細胞）のＴ細胞配列である。
【００３０】 これを試験管内において、クラスIIのＭＨＣ分子を介してＡ２０腫瘍の腫瘍ペ
プチドを提示する同系の脾臓細胞で刺激すると、多量のＩＦＮ−γおよび少量（
あるいは皆無）のＩＬ−４を生成する（図１の産生データ参照）。しかしながら
、Ｔｈを腫瘍抗原またはＭＣＰ１１−Ｂ細胞リンパ腫等の他の腫瘍の抗原を提示
しない同系の脾臓細胞とともに培養すると、サイトカインを全く産生しないか、
あるいは極僅かしか産生しない。この細胞はＡ２０リンパ腫を標的として使用す
ることができる医薬剤を形成する。
プチドを提示する同系の脾臓細胞で刺激すると、多量のＩＦＮ−γおよび少量（
あるいは皆無）のＩＬ−４を生成する（図１の産生データ参照）。しかしながら
、Ｔｈを腫瘍抗原またはＭＣＰ１１−Ｂ細胞リンパ腫等の他の腫瘍の抗原を提示
しない同系の脾臓細胞とともに培養すると、サイトカインを全く産生しないか、
あるいは極僅かしか産生しない。この細胞はＡ２０リンパ腫を標的として使用す
ることができる医薬剤を形成する。
【００３１】 最初に、Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入の効果がＢａｌｂ
／ｃマウスのＡ２０腫瘍に対する免疫応答について検査された。このためＢａｌ
ｂ／ｃマウスに０．５×１０６個のＡ２０細胞および０．５×１０６個のＡ２０
に対して特異的なＴｈ１が腹腔内に同時に注入された。５，７および１０日後に
脾臓細胞がマウスから分離され、試験管内において腫瘍、ここでは同系ＡＰＣに
よって提示された０．２×１０６個のＡ２０腫瘍によって刺激された。腫瘍細胞
が付加されたマウスのＴリンパ球は、腫瘍を付加した後５日以内に隔絶された際
にのみＩＦＮ−γを産生した。これとは逆に、Ａ２０腫瘍およびＡ２０特異的Ｔ
ｈ１の両方が注入されたマウスのリンパ球は、同系ＡＰＣならびに腫瘍特異的抗
原によって刺激された腫瘍移入から１０日以上経過してもまだＩＦＮ−γを産生
した（図２）。Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によってＡ２
０腫瘍に対する免疫応答の延長が達成された。
／ｃマウスのＡ２０腫瘍に対する免疫応答について検査された。このためＢａｌ
ｂ／ｃマウスに０．５×１０６個のＡ２０細胞および０．５×１０６個のＡ２０
に対して特異的なＴｈ１が腹腔内に同時に注入された。５，７および１０日後に
脾臓細胞がマウスから分離され、試験管内において腫瘍、ここでは同系ＡＰＣに
よって提示された０．２×１０６個のＡ２０腫瘍によって刺激された。腫瘍細胞
が付加されたマウスのＴリンパ球は、腫瘍を付加した後５日以内に隔絶された際
にのみＩＦＮ−γを産生した。これとは逆に、Ａ２０腫瘍およびＡ２０特異的Ｔ
ｈ１の両方が注入されたマウスのリンパ球は、同系ＡＰＣならびに腫瘍特異的抗
原によって刺激された腫瘍移入から１０日以上経過してもまだＩＦＮ−γを産生
した（図２）。Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によってＡ２
０腫瘍に対する免疫応答の延長が達成された。
【００３２】 腫瘍反応性Ｔｈ１による腫瘍予防 腫瘍予防実験において、Ｂａｌｂ／ｃマウスに直ぐ前後して０．５×１０６個
のＡ２０腫瘍細胞ならびに０．５×１０６個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１腹
腔内に注入された。Ｔｈ１配列の養子免疫細胞移入によってマウスの生存状況が
大幅に延長された（図３）。実験に応じて７０％および１００％のマウスが完全
に治癒された。これは、この腫瘍が極めて悪性であり通常は有効な腫瘍予防を提
供する従来の多くの免疫治療が無効であった点からみて、極めて驚くべきことで
ある。２番目の重要な結果は、このＴｈ１配列の養子免疫細胞移入が腫瘍の進行
を防止するにもかかわらず自己免疫症をもたらすことはなく：実験動物は自然な
死に至るまで生存した。１年後においても実験動物について臨床ならびに検死の
両方において腫瘍および自己免疫症状のいずれの兆候も見られなかった。実験動
物に対して免疫抑制を施しても後の時点で腫瘍が発生することはない。
のＡ２０腫瘍細胞ならびに０．５×１０６個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１腹
腔内に注入された。Ｔｈ１配列の養子免疫細胞移入によってマウスの生存状況が
大幅に延長された（図３）。実験に応じて７０％および１００％のマウスが完全
に治癒された。これは、この腫瘍が極めて悪性であり通常は有効な腫瘍予防を提
供する従来の多くの免疫治療が無効であった点からみて、極めて驚くべきことで
ある。２番目の重要な結果は、このＴｈ１配列の養子免疫細胞移入が腫瘍の進行
を防止するにもかかわらず自己免疫症をもたらすことはなく：実験動物は自然な
死に至るまで生存した。１年後においても実験動物について臨床ならびに検死の
両方において腫瘍および自己免疫症状のいずれの兆候も見られなかった。実験動
物に対して免疫抑制を施しても後の時点で腫瘍が発生することはない。
【００３３】 腫瘍反応性Ｔｈ１による腫瘍治療 この実証を行うため、Ｔｈ１を既に存在する腫瘍を治療するために使用した。
０．５×１０６個のＡ２０腫瘍細胞が静脈内に注入された。移入後７日目におい
て、既に多量の腫瘍がリンパ球組織内に検出され、この時点で実験動物に０．５
×１０６個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１配列、すなわち体重１ｋｇ当り２５
×１０６個のＴｈ１細胞を再び静脈内接種した。５つの実験からのデータは、（
１）略全ての動物において腫瘍の増大が大幅に遅くなり、（２）７０％の実験動
物がＴｈ１の移入によって治癒したと認められた（図４）。この治療は、今まで
の免疫治療において記載されていなかった時点においてもまだ効果があり、また
今までに記載されていた免疫治療プロトコルに比べて脾臓の腫瘍症状が１００倍
に拡大した時点においても効果があった。
０．５×１０６個のＡ２０腫瘍細胞が静脈内に注入された。移入後７日目におい
て、既に多量の腫瘍がリンパ球組織内に検出され、この時点で実験動物に０．５
×１０６個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１配列、すなわち体重１ｋｇ当り２５
×１０６個のＴｈ１細胞を再び静脈内接種した。５つの実験からのデータは、（
１）略全ての動物において腫瘍の増大が大幅に遅くなり、（２）７０％の実験動
物がＴｈ１の移入によって治癒したと認められた（図４）。この治療は、今まで
の免疫治療において記載されていなかった時点においてもまだ効果があり、また
今までに記載されていた免疫治療プロトコルに比べて脾臓の腫瘍症状が１００倍
に拡大した時点においても効果があった。
【００３４】 従って、図２，３および４のデータから、養子免疫細胞移入されたＴｈ１が腫
瘍に対して極めて効果的な免疫応答をもたらすことが示されている。本発明によ
って初めて以下のことが立証された。 （１） Ｔｈ１は予防だけでなく腫瘍治療においても効果的かつ安全に使用可能
である。 （２） この治療は免疫抗体生産能力のある動物にも適用可能である。 （３） ここに記述された方法は、Ｔｈ１を特に固形腫瘍等の他の細胞にも投与
することができることを前提とし、これは抗原の提示が主に自己／同系ＡＰＣ（
この場合脾臓細胞の使用）によって実施されるからである。従ってこの方法によ
れば、クラスIIのＭＨＣを圧出しない固形腫瘍に対する免疫応答に有効なＴｈ１
を生成することも可能となる。
瘍に対して極めて効果的な免疫応答をもたらすことが示されている。本発明によ
って初めて以下のことが立証された。 （１） Ｔｈ１は予防だけでなく腫瘍治療においても効果的かつ安全に使用可能
である。 （２） この治療は免疫抗体生産能力のある動物にも適用可能である。 （３） ここに記述された方法は、Ｔｈ１を特に固形腫瘍等の他の細胞にも投与
することができることを前提とし、これは抗原の提示が主に自己／同系ＡＰＣ（
この場合脾臓細胞の使用）によって実施されるからである。従ってこの方法によ
れば、クラスIIのＭＨＣを圧出しない固形腫瘍に対する免疫応答に有効なＴｈ１
を生成することも可能となる。
【００３５】 添付図面は、本発明をさらに詳細に説明するものである。
【００３６】 図１には、試験管内で刺激された後のＡ２０に対して特異的なＴｈ１細胞配列
によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生が示されている。ＣＤ４＋Ｔ細胞配列の
ＩＦＮ−γの産生は、ＣｐＧ ＯＤＮおよび抗ＩＬ−４抗体をリンパ腫に対して
用いて２週間の間試験管内で発生させた。この際ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ）はＢａ
ｌｂ／ｃマウスから隔出され、これはＡ２０腫瘍によって免疫化されてあったも
のである。得られたＴｈは、同系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ａ２０腫瘍細胞、
抗ＩＬ−４抗体、ＩＬ−２およびＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８の存在下において試験
管内で刺激され、１０日以上にわたって増殖された。培養されたＴｈ１は１１日
目にＡＰＣのみあるいはこれに加えてＡ２０細胞の存在下において２４時間再刺
激された。培養生成物からＩＬ−４とＩＦＮ−γの含有率が測定された。
によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生が示されている。ＣＤ４＋Ｔ細胞配列の
ＩＦＮ−γの産生は、ＣｐＧ ＯＤＮおよび抗ＩＬ−４抗体をリンパ腫に対して
用いて２週間の間試験管内で発生させた。この際ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ）はＢａ
ｌｂ／ｃマウスから隔出され、これはＡ２０腫瘍によって免疫化されてあったも
のである。得られたＴｈは、同系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ａ２０腫瘍細胞、
抗ＩＬ−４抗体、ＩＬ−２およびＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８の存在下において試験
管内で刺激され、１０日以上にわたって増殖された。培養されたＴｈ１は１１日
目にＡＰＣのみあるいはこれに加えてＡ２０細胞の存在下において２４時間再刺
激された。培養生成物からＩＬ−４とＩＦＮ−γの含有率が測定された。
【００３７】 図２には、Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によるＡ２０に
対して特異的な免疫応答の延長が示されている。Ａ２０に対して特異的なＴｈ１
の養子免疫細胞移入によって、Ａ２０Ｂ細胞リンパ腫に対する腫瘍特異的な免疫
応答が大幅に延長された。この際、５０万個のＡ２０腫瘍細胞の静脈内注入また
はこれに加えて５０万個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１の静脈内注入によって
、Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫化が行われた。第５，７，１０日目に、マウスの脾
臓が標本化され、１００万個の細胞が放射線照射されたＡ２０の不在下および存
在下において３７℃の温度で４８時間培養された。培養生成物からＩＦＮ−γが
測定された。
対して特異的な免疫応答の延長が示されている。Ａ２０に対して特異的なＴｈ１
の養子免疫細胞移入によって、Ａ２０Ｂ細胞リンパ腫に対する腫瘍特異的な免疫
応答が大幅に延長された。この際、５０万個のＡ２０腫瘍細胞の静脈内注入また
はこれに加えて５０万個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１の静脈内注入によって
、Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫化が行われた。第５，７，１０日目に、マウスの脾
臓が標本化され、１００万個の細胞が放射線照射されたＡ２０の不在下および存
在下において３７℃の温度で４８時間培養された。培養生成物からＩＦＮ−γが
測定された。
【００３８】 図３には、Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によるＡ２０Ｂ
細胞リンパ腫の予防が示されている。Ａ２０リンパ腫（腫瘍）の養子免疫細胞移
入の後Ｂａｌｂ／ｃマウスは短時間で死亡し、Ａ２０リンパ腫と同時にＡ２０に
対して特異的なＴｈ１を養子免疫細胞移入した後Ｂａｌｂ／ｃマウスは長期間生
存した。５０万個のＡ２０腫瘍細胞の静脈内注入またはこれに加えて５０万個の
Ａ２０に対して特異的なＴｈ１がＢａｌｂ／ｃマウスに投与され、治療の経過は
視覚的に観察された。
細胞リンパ腫の予防が示されている。Ａ２０リンパ腫（腫瘍）の養子免疫細胞移
入の後Ｂａｌｂ／ｃマウスは短時間で死亡し、Ａ２０リンパ腫と同時にＡ２０に
対して特異的なＴｈ１を養子免疫細胞移入した後Ｂａｌｂ／ｃマウスは長期間生
存した。５０万個のＡ２０腫瘍細胞の静脈内注入またはこれに加えて５０万個の
Ａ２０に対して特異的なＴｈ１がＢａｌｂ／ｃマウスに投与され、治療の経過は
視覚的に観察された。
【００３９】 図４には、Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入による既に形成
されているＡ２０Ｂ細胞リンパ腫の治療が示されている。Ａ２０リンパ腫（腫瘍
）の養子免疫細胞移入の後Ｂａｌｂ／ｃマウスは短時間で死亡し、Ａ２０リンパ
腫の移入の７日後にＡ２０に対して特異的なＴｈ１を養子免疫細胞移入した場合
Ｂａｌｂ／ｃマウスの８０％以上までが長期的に治癒した。この時点において、
腫瘍症状は従来最も効果があったサイトカインを移入した腫瘍細胞による治療と
比べて１００倍大きなものである。この際Ｂａｌｂ／ｃマウスに５００μｌのＰ
ＢＳにおける５０万個のＡ２０腫瘍細胞が静脈内投与された。Ａ２０の注入（１
００ＣＦＵ／脾臓）の７日後に、マウスに対し５００μｌのＰＢＳが単独または
５００μｌのＰＢＳ内における５０万個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１を伴っ
て静脈内投与され、治療経過は視覚的に観察された。
されているＡ２０Ｂ細胞リンパ腫の治療が示されている。Ａ２０リンパ腫（腫瘍
）の養子免疫細胞移入の後Ｂａｌｂ／ｃマウスは短時間で死亡し、Ａ２０リンパ
腫の移入の７日後にＡ２０に対して特異的なＴｈ１を養子免疫細胞移入した場合
Ｂａｌｂ／ｃマウスの８０％以上までが長期的に治癒した。この時点において、
腫瘍症状は従来最も効果があったサイトカインを移入した腫瘍細胞による治療と
比べて１００倍大きなものである。この際Ｂａｌｂ／ｃマウスに５００μｌのＰ
ＢＳにおける５０万個のＡ２０腫瘍細胞が静脈内投与された。Ａ２０の注入（１
００ＣＦＵ／脾臓）の７日後に、マウスに対し５００μｌのＰＢＳが単独または
５００μｌのＰＢＳ内における５０万個のＡ２０に対して特異的なＴｈ１を伴っ
て静脈内投与され、治療経過は視覚的に観察された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 試験管内で刺激された後のＡ２０に対して特異的なＴｈ１細胞配列によるＩＦ
Ｎ−γおよびＩＬ−４の産生を示す説明図である。
Ｎ−γおよびＩＬ−４の産生を示す説明図である。
【図２】 Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によるＡ２０に対して特異
的な免疫応答の延長を示す説明図である。
的な免疫応答の延長を示す説明図である。
【図３】 Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入によるＡ２０Ｂ細胞リンパ
腫の予防を示す説明図である。
腫の予防を示す説明図である。
【図４】 Ａ２０に対して特異的なＴｈ１の養子免疫細胞移入による既に形成されている
Ａ２０Ｂ細胞リンパ腫の治療を示す説明図である。
Ａ２０Ｂ細胞リンパ腫の治療を示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 ゲーエスエフ フォルシュングスツェント ルム フュール ウムヴェルト ウント ゲズンドハイト ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ドイツ連邦共和国、デー−85764 ノイヘ ルベルク、インゴルシュテーター ラント シュトラーセ １ (72)発明者 リョッケン，マルティン ドイツ連邦共和国、デー−80337 ミュン ヘン、フラウエンロープシュトラーセ ９ −11、デルマトロギッシェ クリニク デ ル ルートヴィク−マキシミリアン−ウニ ベルジテート (72)発明者 エーゲター，オリファー ドイツ連邦共和国、デー−80337 ミュン ヘン、フラウエンロープシュトラーセ ９ −11、デルマトロギッシェ クリニク デ ル ルートヴィク−マキシミリアン−ウニ ベルジテート (72)発明者 モチカット，ラルフ ドイツ連邦共和国、デー−85764 ノイヘ ルベルク、インゴルシュテーター ラント シュトラーセ １、ゲーエスエフ フォル シュングスツェントルム フュール ウム ヴェルト ウント ゲズンドハイト ゲゼ ルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｆターム(参考） 4B065 AA94X AC14 AC20 BA18 BA24 BD34 BD35 BD39 BD50 CA44 4C084 AA02 BA44 CA53 DA16 DA24 ZB26 4C087 AA01 AA02 BB43 BB64 DA27 DA32 MA66 ZB26
Claims (9)
- 【請求項１】 Ｔｈ１に類似するサイトカインモデルを有する腫瘍特異的Ｔ
ｈ細胞を含み、医薬的に無害な添加剤および補助剤と共に、高いインターフェロ
ンγの産生を示すとともに少量あるいは皆無のインターロイキン−４を産生する
薬剤。 - 【請求項２】 インターフェロンγの産生が少なくとも１００Ｕ／ｍｌであ
ることを特徴とする請求項１記載の薬剤。 - 【請求項３】 インターロイキン−４の産生が最大でも１０００Ｕ／ｍｌで
あることを特徴とする請求項１記載の薬剤。 - 【請求項４】 インターフェロンγ産生対インターロイキン−４産生の比率
が少なくとも１０：１であることを特徴とする請求項１記載の薬剤。 - 【請求項５】 腫瘍抗原に対して高い特異性を有することを特徴とする請求
項１記載の薬剤。 - 【請求項６】 養子免疫細胞移入に適する形態を有することを特徴とする請
求項１記載の薬剤。 - 【請求項７】 固形腫瘍または造血系腫瘍の予防および／または治療を行う
ための請求項１記載の薬剤。 - 【請求項８】 請求項１に従って高いインターフェロンγの産生を示すとと
もに少量あるいは皆無のインターロイキン−４を産生する、腫瘍に反応するＴｈ
１類似細胞の製造方法。 - 【請求項９】 請求項１に従って高いインターフェロンγの産生を示すとと
もに少量あるいは皆無のインターロイキン−４を産生し、固形腫瘍または造血系
腫瘍の予防および／または治療に使用される、腫瘍に反応するＴｈ１類似細胞の
適用法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19906744A DE19906744A1 (de) | 1999-02-18 | 1999-02-18 | Verfahren zur Herstellung antitumoraler Th1-Zellen |
| DE19906744.9 | 1999-02-18 | ||
| PCT/EP2000/001339 WO2000048614A2 (de) | 1999-02-18 | 2000-02-17 | Verfahren zur herstellung antitumoraler th1-zellen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002537265A true JP2002537265A (ja) | 2002-11-05 |
Family
ID=7897874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000599404A Pending JP2002537265A (ja) | 1999-02-18 | 2000-02-17 | 抗腫瘍Ｔｈ１細胞の製造方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020068053A1 (ja) |
| EP (1) | EP1152767B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002537265A (ja) |
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| CA (1) | CA2371797A1 (ja) |
| DE (2) | DE19906744A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000048614A2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69842060D1 (de) * | 1997-05-08 | 2011-01-27 | Oncothyreon Inc | Verfahren zur Gewinnung aktivierter T-Zellen und mit Antigen-inkubierten Antigen-präsentierender Zellen |
| WO1999051720A2 (en) * | 1998-04-03 | 1999-10-14 | Cytran Ltd. | Methods for production of therapeutic cytokines |
-
1999
- 1999-02-18 DE DE19906744A patent/DE19906744A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-02-17 CA CA002371797A patent/CA2371797A1/en not_active Abandoned
- 2000-02-17 JP JP2000599404A patent/JP2002537265A/ja active Pending
- 2000-02-17 AT AT00912481T patent/ATE269095T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-02-17 WO PCT/EP2000/001339 patent/WO2000048614A2/de active IP Right Grant
- 2000-02-17 EP EP00912481A patent/EP1152767B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-17 DE DE50006815T patent/DE50006815D1/de not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-08-16 US US09/932,575 patent/US20020068053A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000048614A3 (de) | 2000-12-28 |
| WO2000048614A2 (de) | 2000-08-24 |
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| CA2371797A1 (en) | 2000-08-24 |
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| DE50006815D1 (de) | 2004-07-22 |
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