JP2002536968A - Antibodies specific for KDR and uses thereof - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＳＩ（ＫＤＲ）結合し、ＫＤＲの活性化を中和する免疫グロブリン分子を提供する。免疫グロブリン分子は、一価一本鎖抗体、多価一本鎖抗体、ジアボディ、トリアボディ、抗体、ヒト化抗体およびキメラ化抗体を含む。本発明はさらに、これらの免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を提供する。本発明は、前記の免疫グロブリン分子の製造方法も提供する。本発明はさらに、このような免疫グロブリンを用いたＫＤＲの活性化の中和方法、哺乳類における新血管形成の抑制方法および哺乳類における腫瘍増殖の抑制方法を提供する。   (57) [Summary] The present invention provides immunoglobulin molecules that bind SI (KDR) with an affinity comparable to human VEGF and neutralize KDR activation. Immunoglobulin molecules include monovalent single chain antibodies, multivalent single chain antibodies, diabodies, triabodies, antibodies, humanized antibodies and chimeric antibodies. The present invention further provides nucleic acid molecules encoding these immunoglobulin molecules. The present invention also provides a method for producing the above-mentioned immunoglobulin molecule. The present invention further provides a method for neutralizing KDR activation using such immunoglobulins, a method for suppressing neovascularization in mammals, and a method for suppressing tumor growth in mammals.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 発明の背景 新血管形成は、新規血管の発生過程である。この過程は、先在血管からの毛管
内皮細胞の増殖、移動および組織浸潤を伴う。新血管形成は、胚発生、卵胞成長
および創傷治癒を含めた正常な生理学的過程において、ならびに腫瘍増殖および
転移を包含する病理学的症状（Folkman, J. and Klagsbrun, M. Science 235:44
2-447（1987））において重要である。BACKGROUND OF THE INVENTION Neovascularization is the process of developing new blood vessels. This process involves the proliferation, migration and tissue infiltration of capillary endothelial cells from pre-existing blood vessels. Neovascularization occurs during normal physiological processes, including embryonic development, follicular growth and wound healing, and pathological conditions involving tumor growth and metastasis (Folkman, J. and Klagsbrun, M. Science 235: 44
2-447 (1987)).

【０００２】 血管内皮は、通常は成人では休止しており、その活性化は新血管形成中にしっ
かり調節される。in vivoでの新血管形成の考え得る調節因子として、いくつか
の因子が結びつけられてきた。これらの例としては、トランスフォーミング増殖
因子（ＴＧＦｂ）、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦ
ＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）
（Klagsbrun,M. and D'Amore, P.（1991）Annual Rev. Physiol. 53:217-239）
が挙げられる。内皮細胞特異的マイトジェンであるＶＥＧＦは、内皮細胞の増殖
を特異的に促進することにより新血管形成誘導物質として作用するという点で、
これらの因子の中では他と異なる。The vascular endothelium is normally dormant in adults, and its activation is tightly regulated during neovascularization. Several factors have been implicated as possible regulators of neovascularization in vivo. Examples of these include transforming growth factor (TGFb), acidic and basic fibroblast growth factors (aFGF and bFGF).
GF), platelet-derived growth factor (PDGF) and angiogenesis-inducing factor (VEGF)
(Klagsbrun, M. and D'Amore, P. (1991) Annual Rev. Physiol. 53: 217-239)
Is mentioned. VEGF, an endothelial cell-specific mitogen, acts as a neovascularization inducer by specifically promoting endothelial cell proliferation,
Among these factors are different.

【０００３】 ＶＥＧＦは、ＰＤＧＦと構造的類似性を有する２つの23 kDサブユニットから
成るホモ二量体糖タンパク質である。ｍＲＮＡの代替的スプライシングに起因す
るＶＥＧＦの４つの異なる単量体アイソフォームが存在する。アイソフォームは
、２つの膜結合形態（ＶＥＧＦ₂₀₆およびＶＥＧＦ₁₈₉）および２つの可溶性形態
（ＶＥＧＦ₁₆₅およびＶＥＧＦ₁₂₁）を含む。胎盤以外のすべてのヒト組織では、
ＶＥＧＦ₁₆₅が最も豊富なアイソフォームである。[0003] VEGF is a homodimeric glycoprotein consisting of two 23 kD subunits with structural similarity to PDGF. There are four different monomeric isoforms of VEGF due to alternative splicing of mRNA. Isoforms include two membrane bound forms (VEGF ₂₀₆ and VEGF ₁₈₉ ) and two soluble forms (VEGF ₁₆₅ and VEGF ₁₂₁ ). In all human tissues except the placenta,
VEGF ₁₆₅ is the most abundant isoform.

【０００４】 ＶＥＧＦは、胚性組織（Breier et al., Development（Camb.）114:521（1992
））、マクロファージ、創傷治癒中の増殖表皮角化細胞（Brown et al., J. Exp
. Med., 176:1375（1992））中で発現され、炎症に関連した組織浮腫に関与し得
る（Ferrara et al., Endocr. Rev. 13:18（1992））。in-situハイブリダイゼ
ーション試験は、多形性神経膠細胞腫、血管芽細胞腫、中枢神経系新生物および
ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫を含めた多数のヒト腫瘍株中の高ＶＥＧＦ発現を実証し
た（Plate, K. et al.（1992）Nature 359:845-848; Plate, K et al（1993）Ca
ncer Res. 53:5822-5827; Berkman, R. et al.（1993）J. Clin. Invest. 91:15
3-159;Nakamura, S. et al.（1992）AIDS Weekly, 13（1））。高レベルのＶＥ
ＧＦは、低酸素症誘発性新血管形成においても観察された（Shweiki, D. et al.
（1992）Nature 359:843-845）。[0004] VEGF is expressed in embryonic tissue (Breier et al., Development (Camb.) 114: 521 (1992).
)), Macrophages, proliferating epidermal keratinocytes during wound healing (Brown et al., J. Exp.
Med., 176: 1375 (1992)) and may be involved in tissue edema associated with inflammation (Ferrara et al., Endocr. Rev. 13:18 (1992)). In-situ hybridization studies have demonstrated high VEGF expression in a number of human tumor lines including glioma, hemangioblastoma, CNS neoplasms and AIDS-related Kaposi's sarcoma (Plate, K. et al. (1992) Nature 359: 845-848; Plate, K et al (1993) Ca
ncer Res. 53: 5822-5827; Berkman, R. et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:15.
3-159; Nakamura, S. et al. (1992) AIDS Weekly, 13 (1)). High level VE
GF was also observed in hypoxia-induced neovascularization (Shweiki, D. et al.
(1992) Nature 359: 843-845).

【０００５】 ＶＥＧＦの生物学的応答は、胚形成（Millauer,B. et al.（1993）Cell 72:83
5-846）および腫瘍形成中の両方で内皮細胞において選択的に発現される高親和
性ＶＥＧＦ受容体により仲介される。ＶＥＧＦ受容体は、典型的には、それらの
アミノ末端細胞外受容体配位子結合ドメイン中にいくつかの、典型的には５また
は７つの免疫グロブリン様ループを有することにより特性化されるクラスＩＩＩ
受容体型チロシンキナーゼである（Kaipainent et al., J. Exp. Med. 178:2077
-2088（1993））。その他の２つの領域としては、膜貫通領域、およびキナーゼ
挿入ドメインと呼ばれる、種々の長さの親水性インターキナーゼ配列の挿入によ
り遮断されるカルボキシ末端細胞内触媒ドメインが挙げられる（Terman et al.,
Oncogene 6:1677-1683（1991））。ＶＥＧＦ受容体としては、Shibuya M. et a
l., Oncogene 5, 519-524（1990）により配列決定されたＦＬＴ−１；PCT/US92/
01300号（1992年2月20日出願）に、およびTerman et al., Oncogene 6:1677-168
3（1991）に記載されたＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン含有受容体）；ならびにM
atthews W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9026-9030（1991）により
配列決定されたＦＬＫ−１が挙げられる。ＫＤＲは、マウスＦＬＫ−１受容体の
ヒト相同体である。ＫＤＲおよびＦＬＫ−１受容体は、ＶＥＧＦＲ２としても知
られている。[0005] The biological response of VEGF was determined by embryogenesis (Millauer, B. et al. (1993) Cell 72:83.
5-846) and during tumorigenesis are mediated by high affinity VEGF receptors that are selectively expressed on endothelial cells. VEGF receptors are typically a class characterized by having several, typically five or seven, immunoglobulin-like loops in their amino-terminal extracellular receptor ligand binding domains. III
It is a receptor tyrosine kinase (Kaipainent et al., J. Exp. Med. 178: 2077
-2088 (1993)). The other two regions include the transmembrane region and the carboxy-terminal intracellular catalytic domain, which is blocked by the insertion of various lengths of the hydrophilic interkinase sequence, termed the kinase insertion domain (Terman et al.,
Oncogene 6: 1677-1683 (1991)). VEGF receptors include Shibuya M. et a
FLT-1 sequenced by l., Oncogene 5, 519-524 (1990); PCT / US92 /
01300 (filed February 20, 1992) and Terman et al., Oncogene 6: 1677-168.
3 (1991); KDR (kinase insertion domain containing receptor); and M
Natl. Acad. Sci. USA 88: 9026-9030 (1991), and FLK-1 sequenced by atthews W. et al., Proc. Natl. KDR is a human homolog of the mouse FLK-1 receptor. The KDR and FLK-1 receptors are also known as VEGFR2.

【０００６】 前記のような相同アミノ酸配列を有する等価受容体は、すべての哺乳類、他と
ヒト、マウスに生じる。抗体と一つのＶＥＧＦ受容体との結合は、必ずしも別の
ＶＥＧＦ受容体との結合を意味せず、ある哺乳類におけるＶＥＧＦ受容体との結
合は、別の哺乳類における等価受容体との結合を必ずしも意味しない。[0006] Equivalent receptors having a homologous amino acid sequence as described above occur in all mammals, others and humans and mice. Binding of an antibody to one VEGF receptor does not necessarily mean binding to another VEGF receptor, and binding to a VEGF receptor in one mammal does not necessarily mean binding to an equivalent receptor in another mammal. do not do.

【０００７】 ＫＤＲ経路は、ヒト腫瘍新血管形成において重要な役割を演じることが示唆さ
れている。ＶＥＧＦ受容体は、主として内皮細胞および造血細胞で発現される。
ＶＥＧＦが腫瘍細胞により合成され、分泌された後、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ２
受容体と結合して、新規血管の増殖を刺激する。腫瘍は、専用血液供給を有さな
い限り、一定サイズを超えて増殖できない、ということが判明している。[0007] The KDR pathway has been suggested to play an important role in human tumor neovascularization. VEGF receptors are mainly expressed on endothelial cells and hematopoietic cells.
After VEGF is synthesized and secreted by the tumor cells, VEGF becomes VEGFR2
Binds receptors and stimulates the growth of new blood vessels. It has been found that tumors cannot grow beyond a certain size without a dedicated blood supply.

【０００８】 ハイブリドーマ技術によるネズミＶＥＧＦ受容体、ＦＬＫ−１に対するモノク
ローナル抗体の産生は、ＰＣＴ出願US95/01678号に記載されている。これらのモ
ノクローナル抗体は、ＶＥＧＦおよびその受容体間の相互作用を妨害することに
より受容体活性化を抑制することが示された。これらの抗体は、トランスフェク
ト化３Ｔ３細胞で発現されるＦＬＫ−１受容体のＶＥＧＦ刺激を特異的に抑制す
る、ということが実証された。in vivoでは、腫瘍関連新血管形成を抑制するこ
とにより、ヌードマウスにおけるヒトグリア芽腫異種移植の増殖を抗体が強力に
抑制することが示された。[0008] The production of monoclonal antibodies to the murine VEGF receptor, FLK-1, by hybridoma technology has been described in PCT application US95 / 01678. These monoclonal antibodies have been shown to suppress receptor activation by interfering with the interaction between VEGF and its receptor. It has been demonstrated that these antibodies specifically inhibit VEGF stimulation of FLK-1 receptor expressed in transfected 3T3 cells. In vivo, the antibody was shown to potently suppress the growth of human glioblastoma xenografts in nude mice by suppressing tumor-associated neovascularization.

【０００９】 すべてではないが、ネズミ受容体ＦＬＫ−１と結合する抗体は、しかしながら
、ヒト療法のために商業的に実行可能な製品であるのに十分な親和性を有するそ
のヒト相同体ＫＤＲとも反応する。したがって、従来技術で既知のものより高い
親和性を有する抗ＫＤＲ抗体が必要とされる。[0009] Antibodies that bind to the murine receptor FLK-1, but not all, are also compatible with their human homolog, KDR, which has sufficient affinity to be a commercially viable product for human therapy. react. Thus, there is a need for anti-KDR antibodies with higher affinities than those known in the prior art.

【００１０】 本発明の目的は、ＶＥＧＦと従来技術のものより高い親和性を有するそのヒト
受容体ＫＤＲ間の相互作用を中和する非常に有効な抗体を提供することである。[0010] It is an object of the present invention to provide highly effective antibodies that neutralize the interaction between VEGF and its human receptor KDR with higher affinity than in the prior art.

【００１１】 発明の要約 これらのそしてその他の目的は、当業者には明らかであり、ヒトＶＥＧＦに匹
敵する親和性を有するＫＤＲと結合し、ＫＤＲの活性化を中和する免疫グロブリ
ン分子を提供することにより満たされた。SUMMARY OF THE INVENTION These and other objects will be apparent to those of skill in the art and provide immunoglobulin molecules that bind to KDR with an affinity comparable to human VEGF and neutralize KDR activation. Was satisfied by

【００１２】 免疫グロブリン分子は、一価一本鎖抗体、多価一本鎖抗体、ジアボディ（diab
odies）、トリアボディ（triabodies）、抗体、ヒト化抗体およびキメラ化抗体
を含む。[0012] Immunoglobulin molecules include monovalent single chain antibodies, polyvalent single chain antibodies, diabodies (diabs).
odies), triabodies, antibodies, humanized antibodies and chimeric antibodies.

【００１３】 本発明はさらに、これらの免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を提供す
る。The present invention further provides nucleic acid molecules encoding these immunoglobulin molecules.

【００１４】 本発明は、前記の免疫グロブリン分子の製造方法も提供する。本発明はさらに
、このような免疫グロブリン分子を用いたＫＤＲの活性化の中和方法、哺乳類に
おける新血管形成の抑制方法および哺乳類における腫瘍増殖の抑制方法を提供す
る。[0014] The present invention also provides a method for producing the above-mentioned immunoglobulin molecule. The present invention further provides a method for neutralizing KDR activation using such an immunoglobulin molecule, a method for suppressing neovascularization in mammals, and a method for suppressing tumor growth in mammals.

【００１５】 略語 ＶＥＧＦ、血管形成誘導因子；ｂＦＧＦ、塩基性繊維芽細胞増殖因子；ＫＤＲ
、キナーゼ挿入ドメイン含有受容体（ＶＥＧＦ受容体２としても知られている）
；ＦＬＫ−１、胎児肝臓キナーゼ１；ｓｃＦｖ、一本鎖Ｆｖ；ＨＵＶＥＣ、ヒト
臍帯静脈内皮細胞；ＰＢＳ、0.01 Mリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ7.2）；ＰＢ
ＳＴ、0.1％トゥイーン20を含有するＰＢＳ；ＡＰ、アルカリ性ホスファターゼ
；ＥＧＦ、上皮増殖因子；Ｖ_HおよびＶ_L、それぞれ免疫グロブリン重鎖および軽
鎖可変ドメイン。 （発明の詳細な説明） 本発明は、ＶＥＧＦのものに匹敵する親和性を有するＫＤＲの細胞外ドメイン
に特異的に結合する免疫グロブリン分子を提供する。このような結合の結果、免
疫グロブリン分子は、従来記載された免疫グロブリン分子より有効に受容体の活
性化を中和し得る。ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、受容体の細胞外ドメイ
ン上の配位子結合ドメインとして本明細書中で定義される。Abbreviations VEGF, angiogenic factor; bFGF, basic fibroblast growth factor; KDR
, A kinase insertion domain containing receptor (also known as VEGF receptor 2)
FLK-1, fetal liver kinase 1; scFv, single chain Fv; HUVEC, human umbilical vein endothelial cells; PBS, 0.01 M phosphate buffered saline (pH 7.2);
ST, PBS containing 0.1% Tween 20; AP, alkaline phosphatase; EGF, epidermal growth factor; _VH and _VL , immunoglobulin heavy and light chain variable domains, respectively. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides immunoglobulin molecules that specifically bind to the extracellular domain of KDR with an affinity comparable to that of VEGF. As a result of such binding, immunoglobulin molecules can neutralize receptor activation more effectively than previously described immunoglobulin molecules. The extracellular domain of the VEGF receptor is defined herein as a ligand binding domain on the extracellular domain of the receptor.

【００１６】 免疫グロブリン分子は、特異的抗原または物質を認識し、それと結合するタン
パク質である。免疫グロブリン分子は、天然抗体、一価一本鎖抗体、多価一本鎖
抗体、ジアボディ、トリアボディ、キメラ化抗体、ヒト化抗体および抗原と特異
的に結合するその他の分子を含む。[0016] Immunoglobulin molecules are proteins that recognize and bind to a specific antigen or substance. Immunoglobulin molecules include natural antibodies, monovalent single chain antibodies, multivalent single chain antibodies, diabodies, triabodies, chimeric antibodies, humanized antibodies and other molecules that specifically bind to an antigen.

【００１７】 本発明の免疫グロブリン分子は、天然配位子のものに匹敵する親和性を有する
ＫＤＲと結合する。免疫グロブリン分子との抗原の会合に関する平衡定数（Ｋ）
により表される親和性は、結合部位の数に関係なく、抗原決定基および免疫グロ
ブリン分子間の結合強度を測定する。エピトープとしても知られている抗原決定
基は、所定の免疫グロブリン分子が結合する抗原上の部位である。Ｋの典型的値
は、１０⁵〜１０¹¹リットル／モルである。１０⁴リットル／モル未満の任意のＫ
は、非特異的である結合を示すと考えられる。Ｋの逆数は、Ｋ_dと示される（Ｋ_d は、解離定数とも呼ばれる）。Ｋ_dの値が低いほど、抗原決定基および抗体結合
部位間の結合強度は強い。The immunoglobulin molecules of the present invention bind to KDR with an affinity comparable to that of the natural ligand. Equilibrium constant (K) for association of antigen with immunoglobulin molecule
The affinity represented by measures the binding strength between the antigenic determinant and the immunoglobulin molecule, regardless of the number of binding sites. An antigenic determinant, also known as an epitope, is the site on an antigen to which a given immunoglobulin molecule binds. Typical values for K are between 10 ^{5 and} 10 ¹¹ l / mol. Any K less than 10 ⁴ liters / mole
Is thought to indicate binding that is non-specific. Reciprocal of K is designated as K _d (K _d is also referred to as the dissociation constant). The lower the value of _Kd, the stronger the binding strength between the antigenic determinant and the antibody binding site.

【００１８】 ＫＤＲの天然配位子は、ヒトＶＥＧＦである。ＶＥＧＦは、0.93 nMの親和性
（Ｋ_d）を有するＫＤＲと結合する。ＫＤＲとのＶＥＧＦの結合を妨げるために
、抗ＫＤＲ抗体は、ＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する必要が
ある。言い換えれば、抗ＫＤＲ抗体は、ＫＤＲと結合することに関してＶＥＧＦ
と首尾よく競合する必要がある。多くて5 nMのＫ_dを有する抗体は、天然配位子
に匹敵する親和性で結合すると考えられる。本発明の抗体は、好ましくは多くて
約4 nMの親和性で、好ましくは多くて約3 nMの親和性で、最も好ましくは多くて
約2 nMの親和性で、最適には約1 nMの親和性でＫＤＲと結合する。[0018] The natural ligand for KDR is human VEGF. VEGF binds to KDR with an affinity (K _d ) of 0.93 nM. To prevent binding of VEGF to KDR, anti-KDR antibodies need to bind to KDR with an affinity comparable to VEGF. In other words, the anti-KDR antibody is VEGF-associated with binding to KDR
Need to compete successfully with Antibodies with a _{Kd of} at most 5 nM are thought to bind with an affinity comparable to the natural ligand. The antibodies of the present invention preferably have an affinity of at most about 4 nM, preferably at most about 3 nM, most preferably at most about 2 nM, and optimally at about 1 nM. Binds with affinity to KDR.

【００１９】 本発明の抗体は、ＫＤＲを中和する（実施例参照）。本明細書中では、受容体
の中和とは、受容体の固有のキナーゼ活性を減少および／または不活性化してシ
グナルを変換することを意味する。ＫＤＲ中和に関する信頼性が高い検定は、受
容体リン酸化の抑制である。The antibodies of the present invention neutralize KDR (see Examples). As used herein, receptor neutralization means reducing and / or inactivating the intrinsic kinase activity of a receptor to transduce a signal. A reliable assay for KDR neutralization is suppression of receptor phosphorylation.

【００２０】 本発明は、ＫＤＲ中和のいかなる特定のメカニズムによっても限定されない。
本出願の出願時点で、抗体によるＫＤＲ中和のメカニズムは十分理解されてはお
らず、ある抗体が従うメカニズムは、別の抗体が従うものと必ずしも同一ではな
い。いくつかの考え得るメカニズムは、ＫＤＲの細胞外結合ドメインとのＶＥＧ
Ｆ配位子の結合を防止し、受容体の二量体化またはオリゴマー化を防止すること
を含む。しかしながら、その他のメカニズムを除外することはできない。The present invention is not limited by any particular mechanism of KDR neutralization.
At the time of filing the present application, the mechanism of KDR neutralization by antibodies is not fully understood, and the mechanism followed by one antibody is not necessarily the same as that followed by another. Some possible mechanisms are VEG with the extracellular binding domain of KDR.
Preventing binding of the F ligand and preventing dimerization or oligomerization of the receptor. However, other mechanisms cannot be ruled out.

【００２１】 好ましい免疫グロブリン分子は、一価一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）と呼ばれる抗体
断片である。一価一本鎖抗体としては、２つの断片を会合させて機能性抗原結合
部位を形成するペプチドリンカーにより抗体可変軽鎖断片（Ｖ_L）に連結される
抗体可変重鎖断片（Ｖ_H）が挙げられる（例えば、米国特許第4,946,778号（Ladn
er等（Genex））、WO88/09344号（Creative Biomolecules, Inc/Huston等）参照
）。WO92/01047号（Cambridge Antibody Technology et al./McCafferty et al.
）は、バクテリオファージのような可溶性遺伝子組換え体遺伝子表示パッケージ
の表面でのｓｃＦｖ断片の表示を記載する。リンカー（Ｌ）を伴う一本鎖抗体は
、Ｖ_L−Ｌ−Ｖ_HまたはＶ_H−Ｌ−Ｖ_Lで表される。A preferred immunoglobulin molecule is an antibody fragment called a monovalent single chain antibody (scFv). As a monovalent single chain antibody, an antibody variable heavy chain fragment (V _H ) linked to an antibody variable light chain fragment (V _L ) by a peptide linker that associates two fragments to form a functional antigen-binding site is used. (Eg, US Pat. No. 4,946,778 (Ladn)
er et al. (Genex)) and WO88 / 09344 (Creative Biomolecules, Inc / Huston et al.)). WO92 / 01047 (Cambridge Antibody Technology et al./McCafferty et al.
) Describes the display of scFv fragments on the surface of a soluble transgenic gene display package such as a bacteriophage. Single-chain antibody with a linker (L) is represented by V _L -L-V _H or V _H -L-V _L.

【００２２】 価数は、免疫グロブリン分子が特定のエピトープに関して有する抗原結合部位
の数を指す。例えば、一価抗体は、特定のエピトープのための１つの結合部位を
有する。アビディティーは、免疫グロブリン分子とその抗原との間の結合の強度
の測定値である。アビディティーは、免疫グロブリン分子上のエピトープとその
抗原結合部位との間の親和性および免疫グロブリン分子の価数の両方に関する。Valency refers to the number of antigen binding sites that an immunoglobulin molecule has for a particular epitope. For example, a monovalent antibody has one binding site for a particular epitope. Avidity is a measure of the strength of the binding between an immunoglobulin molecule and its antigen. Avidity relates to both the affinity between an epitope on an immunoglobulin molecule and its antigen binding site and the valency of the immunoglobulin molecule.

【００２３】 一本鎖抗体は、それらが由来する全抗体の定常ドメインのいくつかまたはすべ
てを欠く。したがって、それらは全抗体の使用に伴う問題のいくつかを克服し得
る。例えば、一本鎖抗体は、生物学的分子と重鎖定常部との間の望ましくない相
互作用、または望ましくない生物学的活性を有さない傾向がある。さらに、一本
鎖抗体は全抗体よりかなり小さく、したがって全抗体より大きい毛管透過性を有
して、一本鎖抗体を局在化させ、より効率的に抗原結合部位に結合させる。さら
に、一本鎖抗体は、原核生物細胞中で相対的に大規模に産生され、したがってそ
れらの産生を促進し得る。さらに、相対的に小サイズの一本鎖抗体は、全抗体よ
りレシピエントにおける望ましくない免疫応答を惹起しないようにさせる。Single chain antibodies lack some or all of the constant domains of the whole antibody from which they are derived. Thus, they may overcome some of the problems associated with using whole antibodies. For example, single-chain antibodies tend not to have unwanted interactions between biological molecules and heavy-chain constants, or unwanted biological activities. Moreover, single-chain antibodies are much smaller than whole antibodies, and thus have greater capillary permeability than whole antibodies, to localize single-chain antibodies and bind more efficiently to antigen-binding sites. In addition, single-chain antibodies are produced on a relatively large scale in prokaryotic cells, and may thus facilitate their production. In addition, relatively small sized single chain antibodies are less likely to elicit an unwanted immune response in the recipient than whole antibodies.

【００２４】 一本鎖抗体を産生するために用いられるペプチドリンカーは、Ｖ_LおよびＶ_Hド
メインの適正な三次元折り畳みが、一旦それらが全長抗ＫＤＲ抗体の標的分子結
合特異性を保持するために連結されれば、起こり得るということを保証するよう
に選択される柔軟性ペプチドであり得る。一般に、Ｖ_LまたはＶ_H配列のカルボキ
シル末端は、このようなペプチドリンカーにより相補的Ｖ_HまたはＶ_L配列のアミ
ノ酸末端に共有結合させることができる。リンカーは、一般に10〜50アミノ酸残
基である。好ましくは、リンカーは10〜30アミノ酸残基である。さらに好ましく
は、リンカーは12〜30アミノ酸残基である。最も好ましくは、15〜25アミノ酸残
基のリンカーである。このようなリンカーペプチドの例としては、（Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）₃が挙げられる。[0024] The peptide linker used to produce single chain antibodies is such that proper three-dimensional folding of the V _L and V _H domains is necessary so that once they retain the target molecule binding specificity of the full length anti-KDR antibody. If linked, it may be a flexible peptide that is selected to ensure that it can happen. Generally, the carboxyl terminus of the _VL or _VH sequence can be covalently linked to the amino acid terminus of the complementary _VH or _VL sequence by such a peptide linker. The linker is generally between 10 and 50 amino acid residues. Preferably, the linker is between 10 and 30 amino acid residues. More preferably, the linker is between 12 and 30 amino acid residues. Most preferably, it is a linker of 15 to 25 amino acid residues. Examples of such linker peptides include (Gly-G
ly-Gly-Gly-Ser) ₃ .

【００２５】 最初のペプチドリンカーにより共有結合される１つのＶ_Hおよび１つのＶ_Lドメ
インを各々有する一本鎖抗体は、少なくとも１以上のペプチドリンカーにより共
有結合されて、多価一本鎖抗体を形成し得る。多価一本鎖抗体は、全抗体の特異
性およびアビディティーを有するが、しかし全長抗体の定常部を欠く抗体断片の
構築を可能にする。Single chain antibodies, each having one V _H and one V _L domain covalently linked by a first peptide linker, are covalently linked by at least one or more peptide linkers to form a multivalent single chain antibody. Can be formed. Multivalent single-chain antibodies have the specificity and avidity of whole antibodies, but allow the construction of antibody fragments that lack the constant region of a full-length antibody.

【００２６】 多価免疫グロブリン分子は、単一特異性または多重特異性である。特異性とい
う用語は、特定の免疫グロブリン分子が結合し得る異なる型の抗原決定基の数を
指す。免疫グロブリン分子が１つの型の抗原決定基のみと結合する場合には、免
疫グロブリン分子は単一特異性である。免疫グロブリン分子が異なる型の抗原決
定基と結合する場合には、免疫グロブリン分子は多重特異性である。[0026] Multivalent immunoglobulin molecules can be monospecific or multispecific. The term specificity refers to the number of different types of antigenic determinants to which a particular immunoglobulin molecule can bind. An immunoglobulin molecule is monospecific if it binds only one type of antigenic determinant. An immunoglobulin molecule is multispecific if it binds to different types of antigenic determinants.

【００２７】 例えば、二重特異性多価一本鎖抗体は、２つの異なる型のエピトープの認識を
可能にする。エピトープはともに、ＫＤＲ上に存在し得る。あるいは、一方のエ
ピトープはＫＤＲ上に存在し、他方のエピトープは別の抗原上に存在し得る。For example, bispecific multivalent single-chain antibodies allow the recognition of two different types of epitopes. Both epitopes can be on KDR. Alternatively, one epitope may be on KDR and the other epitope on another antigen.

【００２８】 多価一本鎖抗体の各鎖は、可変軽鎖断片および可変重鎖断片を含み、ペプチド
リンカーにより少なくとも１つの他の鎖に連結される。ペプチドリンカーは、少
なくとも15のアミノ酸残基から成る。最大数のアミノ酸残基は、約100である。
好ましい実施態様では、Ｖ_LおよびＶ_Hドメインの数は等価である。好ましくは、
Ｖ_HおよびＶ_Lドメインを接合して鎖を形成するペプチドリンカー（Ｌ₁）および
２以上の鎖を接合して多価ｓｃＦｖを形成するペプチドリンカー（Ｌ₂）は、実
質的に同一のアミノ酸配列を有する。[0028] Each chain of the multivalent single chain antibody comprises a variable light chain fragment and a variable heavy chain fragment and is linked to at least one other chain by a peptide linker. Peptide linkers consist of at least 15 amino acid residues. The maximum number of amino acid residues is about 100.
In a preferred embodiment, the numbers of _VL and _VH domains are equivalent. Preferably,
V _H and V _L peptide linker (L ₁₎ that domain are joined to form a chain and two or more chain peptide linker to form a multivalent scFv joined to (L ₂₎ are substantially the same amino acid sequence Having.

【００２９】 例えば、二価一本鎖抗体は、以下のように表し得る： V_L-L₁-V_H-L₂-V_L-L₁-V_HまたはV_L-L₁-V_H-L₂-V_H-L₁-V_LまたはV_H-L₁-V_L-L₂-V_H-L₁-V_L またはV_H-L₁-V_L-L₂-V_L-L₁-V_H。For example, a bivalent single chain antibody may be represented as: V _L -L ₁ -V _H -L ₂ -V _L -L ₁ -V _H or V _L -L ₁ -V _H- L ₂ -V _H -L ₁ -V _L or V _H -L ₁ -V _L -L ₂ -V _H -L ₁ -V _L or V _H -L ₁ -V _L -L ₂ -V _L -L ₁ -V _H.

【００３０】 三価以上である多価一本鎖抗体は、付加的ペプチドリンカーにより二価一本鎖
抗体に接合される１以上の抗体断片を有する。三価一本鎖抗体の一例を以下に示
す： V_L-L₁-V_H-L₂-V_L-L₁-V_H-L₂-V_L-L₁-V_H。A multivalent single chain antibody that is trivalent or more has one or more antibody fragments conjugated to a bivalent single chain antibody by an additional peptide linker. An example of a trivalent single chain antibody is shown below: V _L -L ₁ -V _H -L ₂ -V _L -L ₁ -V _H -L ₂ -V _L -L ₁ -V _H.

【００３１】 ２つの一本鎖抗体は組み合されて、二価二量体としても知られているジアボデ
ィを形成する。ジアボディは、２つの鎖を有する。ジアボディの各鎖は、Ｖ_Lド
メインに連結されたＶ_Hドメインを含む。ドメインは、同一鎖上のドメイン間の
対合を防止するのに十分短く、したがって異なる鎖上の相補的ドメイン間の対合
をおこなって２つの抗原結合部位を再形成するリンカーで連結される。ペプチド
リンカーは、少なくとも５つのアミノ酸残基および10以下のアミノ酸残基、例え
ば（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）、（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）₂を含む。ジアボディ構
造は、剛性且つコンパクトである。抗原結合部位は、分子の反対の端部にある。
ジアボディは、単一特異性または二重特異性であり得る。[0031] The two single-chain antibodies combine to form a diabody, also known as a divalent dimer. Diabodies have two chains. Each chain of the diabody includes a V _H domain connected to a V _L domain. The domains are short enough to prevent pairing between the domains on the same chain, and are thus joined by a linker that causes pairing between complementary domains on different chains to reform the two antigen-binding sites. The peptide linker comprises at least 5 amino acid residues and up to 10 amino acid residues, for example (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) ₂ . The diabody structure is rigid and compact. The antigen binding site is at the opposite end of the molecule.
Diabodies can be monospecific or bispecific.

【００３２】 ３つの一本鎖抗体は組み合されて、三価三量体としても知られているトリアボ
ディを形成し得る。トリアボディは、Ｖ_LまたはＶ_Hドメインのカルボキシル末端
に直接融合された、即ちいかなるリンカー配列も伴わないＶ_LまたはＶ_Hドメイン
のアミノ酸末端を有して構築される。トリアボディは、環状の頭−尾様式で整列
されたポリペプチドによる３つのＦｖ頭を有する。トリアボディの考え得る配座
は、互いに120°の角度で一平面に配置される３つの結合部位を有する平面状で
ある。トリアボディは、単一特異性、二重特異性または三重特異性である。[0032] The three single-chain antibodies can be combined to form a triabody, also known as a trivalent trimer. Triabodies are constructed with the amino acid terminus of the _VL or _VH domain fused directly to the carboxyl terminus of the _VL or _VH domain, ie, without any linker sequence. Triabodies have three Fv heads with polypeptides arranged in a cyclic head-to-tail fashion. A possible conformation of the triabody is planar with three binding sites arranged in a plane at an angle of 120 ° to each other. Triabodies are monospecific, bispecific or trispecific.

【００３３】 好ましくは本発明の抗体は全抗体の６つの相補的決定領域すべてを含有するが
、しかし全部より少ないこのような領域、例えば３、４または５つのＣＤＲを含
有する抗体も機能性である。Preferably, the antibodies of the present invention contain all six complementary determining regions of a whole antibody, but antibodies containing less than all such regions, eg, three, four or five CDRs, are also functional. is there.

【００３４】 ネズミ抗体の免疫原性を最小限にするために、本発明は、ＫＤＲの細胞外ドメ
インと特異的に結合し、受容体の活性化を中和するキメラ化およびヒト化抗体も
提供する。キメラ抗体は、マウス抗体からの可変部およびヒト抗体からの定常部
を含む。キメラ抗体はその結合特異性を保持するが、しかし天然ヒト抗体により
密接に類似する。マウスアミノ酸を含有するヒト化抗体の唯一の部分は、ＫＤＲ
を認識するのに必要であるもの、即ちＣＤＲである。To minimize the immunogenicity of the murine antibody, the present invention also provides chimeric and humanized antibodies that specifically bind to the extracellular domain of KDR and neutralize receptor activation I do. A chimeric antibody contains a variable region from a mouse antibody and a constant region from a human antibody. A chimeric antibody retains its binding specificity, but more closely resembles a natural human antibody. The only part of the humanized antibody containing mouse amino acids is KDR
What is needed to recognize is the CDR.

【００３５】 キメラ化抗体をコードするＤＮＡは、実質的にまたは専らヒト定常部をコード
するＤＮＡおよび実質的にまたは専らヒト以外の哺乳類の可変部の配列から得ら
れる可変部をコードするＤＮＡを組換えることにより調製し得る。The DNA encoding the chimeric antibody is composed of DNA encoding substantially or exclusively human constant regions and DNA encoding variable regions substantially or exclusively obtained from the sequence of the variable region of a non-human mammal. It can be prepared by changing.

【００３６】 ヒト化抗体をコードするＤＮＡは、実質的にまたは専ら対応するヒト抗体から
得られるＣＤＲ以外の定常部および可変部をコードするＤＮＡ、ならびに実質的
にまたは専らヒト以外の哺乳類から得られるＣＤＲをコードするＤＮＡを組換え
ることにより調製し得る。The DNA encoding the humanized antibody is obtained substantially or exclusively from the corresponding human antibody, DNA encoding the constant and variable regions other than the CDRs, and substantially or exclusively from a non-human mammal. It can be prepared by recombination of the DNA encoding the CDR.

【００３７】 ヒト以外の適切な哺乳類としては、モノクローナル抗体を作り得る任意の哺乳
類が挙げられる。このような哺乳類の例としては、ウサギ、ラット、マウス、ウ
マ、ヤギまたは霊長類が挙げられる。マウスが好ましい。[0037] Suitable non-human mammals include any mammal that can make monoclonal antibodies. Examples of such mammals include rabbits, rats, mice, horses, goats or primates. Mice are preferred.

【００３８】 抗体の断片をコードするＤＮＡ分子の適切な供給源としては、全長抗体を発現
する任意の細胞、例えばハイブリドーマおよび脾臓細胞が挙げられる。別の供給
源は、当業界で既知のファージ表示ライブラリーから産生される一本鎖抗体であ
る。Suitable sources of DNA molecules encoding fragments of the antibody include any cell that expresses a full-length antibody, such as hybridomas and spleen cells. Another source is single-chain antibodies produced from phage display libraries known in the art.

【００３９】 本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥのような任意
の免疫グロブリンクラスおよびそれらのサブクラスの成員であるか、またはそれ
らを組み合せ得る。The antibodies of the invention may be members of any of the immunoglobulin classes and subclasses thereof, such as IgG, IgM, IgA, IgD or IgE, or may be a combination thereof.

【００４０】 免疫グロブリン分子を作製するために用いられるＫＤＲは、通常は、内皮細胞
のような細胞と結合される。ＫＤＲは、非内皮細胞、例えば腫瘍細胞とも結合し
得る。あるいは、ＫＤＲは細胞を有さず、好ましくは可溶性形態であり得る。[0040] KDR used to make immunoglobulin molecules is usually associated with cells such as endothelial cells. KDR may also bind non-endothelial cells, eg, tumor cells. Alternatively, KDR may be cell-free, preferably in a soluble form.

【００４１】 下記の実施例において、ＫＤＲと結合するＶＥＧＦを遮断する高親和性抗ＫＤ
Ｒ ｓｃＦｖ抗体は、可溶性形態のヒトＶＥＧＦ受容体で免疫感作したマウスか
ら構築されたファージ表示ライブラリーから単離された。２回の選択後に回収さ
れるクローンの90％より多くが、ＫＤＲに特異的である。これらのｓｃＦｖのＫ
ＤＲに対する結合親和性はｎＭ範囲であり、これはハイブリドーマ技術を用いて
産生されるいくつかの二価抗ＫＤＲモノクローナル抗体のものと同様に高い。In the examples below, high affinity anti-KD blocking VEGF binding to KDR
The R scFv antibody was isolated from a phage display library constructed from mice immunized with the soluble form of the human VEGF receptor. More than 90% of the clones recovered after two rounds of selection are specific for KDR. The K of these scFvs
The binding affinity for DR is in the nM range, which is as high as that of some bivalent anti-KDR monoclonal antibodies produced using hybridoma technology.

【００４２】 ヒトファージライブラリーは、このような高親和性抗ＫＤＲ ｓｃＦｖを生成
するためにも用い得る。[0042] Human phage libraries can also be used to generate such high affinity anti-KDR scFvs.

【００４３】 ｓｃＦｖ抗体ｐ１Ｃ１１（図４）は、ファージ表示ライブラリーから単離され
た一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体から産生された（下記実施例参照）。ｐ１Ｃ１１は、
ＶＥＧＦ−ＫＤＲ相互作用を遮断し、ＶＥＧＦ刺激受容体リン酸化およびＨＵＶ
ＥＣの有糸***誘発を抑制することが示された。このｓｃＦｖは、ＨＵＶＥＣ上
で可溶性ＫＤＲおよび細胞表面発現ＫＤＲの両方と結合する。ｐ１Ｃ１１は、本
発明の好ましいｓｃＦｖの１つである。それは高親和性（Ｋｄ＝2.1 nM）でＫＤ
Ｒと結合する。The scFv antibody p1C11 (FIG. 4) was produced from a single-chain (scFv) antibody isolated from a phage display library (see Examples below). p1C11 is
Block VEGF-KDR interaction, inhibit VEGF-stimulated receptor phosphorylation and HUV
It has been shown to suppress mitogenesis of EC. This scFv binds both soluble and cell surface expressed KDR on HUVEC. p1C11 is one of the preferred scFvs of the present invention. It has high affinity (Kd = 2.1 nM) and KD
Bonds with R;

【００４４】 本発明の抗体の各ドメインは完全免疫グロブリン重または軽鎖可変ドメインで
あり得るし、あるいはそれは天然ドメインの機能的等価物または突然変異体また
は誘導体、または例えばWO93/11236号（Medical Research Council et al/Griff
iths et al.）に記載されたような技術を用いてin vitroで構築される合成ドメ
インであり得る。例えば、少なくとも１つのアミノ酸を失っている抗体可変ドメ
インに対応するドメインを一緒に連結することができる。重要な特性化特徴は、
相補的ドメインと会合して抗原結合部位を形成する各ドメインの能力である。し
たがって、「可変重／軽鎖断片」という用語は、本発明の作業方法に及ぼす物質
作用を有さない変異体を除外するよう解釈されるべきでない。Each domain of the antibody of the invention may be a complete immunoglobulin heavy or light chain variable domain, or it may be a functional equivalent or mutant or derivative of a natural domain, or eg WO 93/11236 (Medical Research Council et al / Griff
iths et al.) can be synthetic domains constructed in vitro using techniques such as those described in For example, domains corresponding to antibody variable domains that have lost at least one amino acid can be linked together. Important characterization features are:
The ability of each domain to associate with a complementary domain to form an antigen binding site. Thus, the term "variable heavy / light chain fragments" should not be interpreted as excluding variants which have no material effect on the working methods of the present invention.

【００４５】 本発明の機能的等価物としては、全長ＫＤＲ抗体の可変または超可変部のアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。「
実質的に同一の」アミノ酸配列とは、本明細書中では、Pearson and Lipman, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448（1988）にしたがってＦＡＳＴＡ検索
方法により確定した場合に、もう一つのアミノ酸配列と少なくとも70％、好まし
くは少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくとも約90％の相同性を有する配
列と定義される。[0045] Functional equivalents of the present invention include polypeptides having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of the variable or hypervariable region of a full-length KDR antibody. "
"Substantially identical" amino acid sequences are used herein to refer to Pearson and Lipman, Pr.
Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 (1988) and at least 70%, preferably at least about 80%, more preferably at least about 80%, of another amino acid sequence as determined by the FASTA search method. Defined as sequences with 90% homology.

【００４６】 本発明の抗体は、付加的アミノ酸残基と融合することができる。このような残
基は、おそらくは単離を促すためのペプチドタグであり得るし、あるいはそれら
は合成時の宿主細胞からのポリペプチドの分泌のためのシグナル配列であり得る
。適切には、サイトゾルからのポリペプチドの動きを指図するためにポリペプチ
ドのＮ末端に接合されるアミノ酸である分泌リーダーペプチドが用いられる。The antibodies of the present invention can be fused to additional amino acid residues. Such residues may be peptide tags, possibly to facilitate isolation, or they may be signal sequences for secretion of the polypeptide from the host cell during synthesis. Suitably, a secretory leader peptide, an amino acid joined to the N-terminus of the polypeptide to direct the movement of the polypeptide from the cytosol, is used.

【００４７】 本発明は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子、およびこ
のような核酸の種々のレパートリーも提供する。The present invention also provides nucleic acid molecules comprising sequences encoding the polypeptides of the invention, and various repertoires of such nucleic acids.

【００４８】 前記のＤＮＡ欠失および組合せは、ＰＣＴ出願WO93/21319号、WO89/09622号、
欧州特許出願第239,400号、第338,745号および第332,424号に記載されたものの
ような既知の方法により、および／または下記のもののようなその他の標準組換
えＤＮＡ技法により実行し得る。The DNA deletions and combinations described above are described in PCT applications WO 93/21319, WO 89/09622,
It can be carried out by known methods, such as those described in European Patent Applications 239,400, 338,745 and 332,424, and / or by other standard recombinant DNA techniques, such as those described below.

【００４９】 下記の実施例では、ｐ１ｃ１１からキメラ抗ＫＤＲ抗体ｃ−ｐ１−Ｃ１１が産
生された。キメラｐ１Ｃ１１は、可溶性ならびに細胞表面発現ＫＤＲの細胞外ド
メインと特異的に結合する。ｃ−ｐ１Ｃ１１の結合親和性は、0.82 nMである。
それはＫＤＲおよびヒト内皮細胞のＭＡＰキナーゼｐ４４／ｐ４２の活性化を有
効に中和する。さらに、ｃ−ｐ１Ｃ１１は、ヒト内皮細胞のＶＥＧＦ誘導有糸分
裂誘発を有効に中和する。In the examples below, chimeric anti-KDR antibody c-p1-C11 was produced from p1c11. Chimeric p1C11 specifically binds to the extracellular domain of soluble as well as cell surface expressed KDR. The binding affinity of c-p1C11 is 0.82 nM.
It effectively neutralizes the activation of MAP kinase p44 / p42 in KDR and human endothelial cells. In addition, c-p1C11 effectively neutralizes VEGF-induced mitogenesis of human endothelial cells.

【００５０】 ｃ−ｐ１Ｃ１１は、親ｓｃＦｖ、ｐ１Ｃ１１よりＫＤＲとより効率的に結合し
、ＫＤＲ相互作用の活性を中和するのに、そしてＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ刺激化有
糸***誘発を抑制するのにより効力がある。ＫＤＲとの結合のためのｃ−ｐ１Ｃ
１１の親和性は、主に二価ｃ−ｐ１Ｃ１１のより遅いオフレイトのために、親ｓ
ｃＦｖより約2.5倍高い（表２参照）。C-p1C11 binds KDR more efficiently than the parental scFv, p1C11, neutralizes the activity of KDR interactions, and is more potent at suppressing VEGF-stimulated mitogenesis of HUVECs There is. C-p1C for binding to KDR
Affinity of the parent s was mainly due to the slower off-rate of the bivalent c-p1C11.
It is about 2.5 times higher than cFv (see Table 2).

【００５１】 実施例 以下の実施例は、本発明を理解する目的で記述されており、いかなる点でも本
発明の範囲を限定するよう意図されてはおらず、そして、そのように解釈される
べきでない。実施例は、ベクターおよびプラスミドの構築、ポリペプチドをコー
ドする遺伝子のこのようなベクターおよびプラスミド中への挿入、あるいは宿主
細胞中へのプラスミドの導入に用いられるような慣用的方法の詳細な説明を含ま
ない。このような方法は当業者には周知であり、Sambrook, J., Fritsch, E.F.
and Maniatis, T.（1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edit
ion, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを含めた多数の出版物に記載されて
いる。EXAMPLES The following examples are set forth for the purpose of understanding the invention and are not intended to limit the scope of the invention in any way, and should not be construed as such. . The examples provide detailed descriptions of conventional methods such as those used for the construction of vectors and plasmids, the insertion of genes encoding polypeptides into such vectors and plasmids, or the introduction of plasmids into host cells. Not included. Such methods are well known to those skilled in the art and are described in Sambrook, J., Fritsch, EF.
and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edit
Ion, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

【００５２】 実施例Ｉ．一本鎖抗体の産生 実施例Ｉ（ａ）．細胞株およびタンパク質 一次培養ＨＵＶＥＣを37℃で5％ＣＯ２でＥＢＭ−２培地中に保持した。すべ
ての検定に関して、継代数２〜５で細胞を用いた。ＶＥＧＦ₁₆₅タンパク質をバ
キュロウイルス中で発現させ、精製した。ヒト胎児腎臓ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣ
Ｒにより、ＫＤＲの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを単離し、ベクターＡ
Ｐ−タグのＢｇｌＩＩおよびＢｓｐＥＩ部位中にサブクローニングした。このプ
ラスミドでは、ＫＤＲ細胞外ドメインに関するｃＤＮＡは、ヒト胎盤ＡＰに関す
るｃＤＮＡと枠中融合される。プラスミドをネオマイシン発現ベクターｐＳＶ−
Ｎｅｏと一緒にＮＩＨ３Ｔ３細胞中で電気穿孔させて、安定細胞クローンをＧ４
１８で選択した。ＡＰに対する固定化モノクローナル抗体を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィーにより、可溶性融合タンパク質ＫＤＲ−ＡＰを細胞培養上
清から精製した。Example I. Production of Single Chain Antibodies Example I (a). Cell lines and proteins Primary cultures HUVEC were maintained in EBM-2 medium at 37 ° C with 5% CO2. Cells were used at passages 2-5 for all assays. VEGF ₁₆₅ protein was expressed in baculovirus and purified. RT-PC from human fetal kidney mRNA
R, the cDNA encoding the extracellular domain of KDR was isolated and
It was subcloned into the BglII and BspEI sites of the P-tag. In this plasmid, the cDNA for the KDR extracellular domain is fused in frame with the cDNA for human placental AP. Plasmid was converted to neomycin expression vector pSV-
Electroporation in NIH3T3 cells with Neo, stable cell clones G4
Selected at 18. Soluble fusion protein KDR-AP was purified from cell culture supernatant by affinity chromatography using an immobilized monoclonal antibody against AP.

【００５３】 実施例Ｉ（ｂ）．マウス免疫感作および一本鎖抗体ファージ表示ライブラリー
の構築 200 ulのＲＩＢＩアジュバント系中の10 ugのＫＤＲ−ＡＰの腹腔内（ｉ．ｐ
．）注射を２回、雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに投与し、その後、２ヶ月間に亘って、
ＲＩＢＩアジュバントを含有しないｉ．ｐ注射を１回投与した。マウスには、最
初の免疫感作時点で、200 ulのＲＩＢＩ中の10 ugのＫＤＲ−ＡＰの皮下（ｓ．
ｃ．）注射も施こした。安楽死の３日前に、20 ugのＫＤＲ−ＡＰを用いてマウ
スをｉ．ｐ．追加免疫した。ドナーマウスからの脾臓を取り出し、細胞を単離し
た。ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡを脾臓細胞の全ＲＮＡから精製した。糸状ファー
ジＭ１３の表面に表示されたｍＲＮＡを用いて、ｓｃＦｖファージ表示ライブラ
リーを構築した。Example I (b). Mouse immunization and construction of a single-chain antibody phage display library Intraperitoneal (ip) of 10 ug of KDR-AP in 200 ul of RIBI adjuvant system
. ) Injections were administered twice to female BALB / C mice, and then over a two month period
I. Containing no RIBI adjuvant. One p injection was administered. Mice were given a subcutaneous (s.d.) injection of 10 ug KDR-AP in 200 ul RIBI at the time of the first immunization.
c. ) Injections were also given. Three days prior to euthanasia, mice were i.p. p. Boosted. Spleens from donor mice were removed and cells were isolated. RNA was extracted and mRNA was purified from spleen cell total RNA. Using the mRNA displayed on the surface of the filamentous phage M13, a scFv phage display library was constructed.

【００５４】 糸状ファージ表面にｓｃＦｖを表示する場合、抗体Ｖ_HおよびＶ_Lドメインは、
15アミノ酸長リンカー（ＧＧＧＧＳ）³ により一緒に連結されて、ファージタン
パク質ＩＩＩのＮ末端に融合される。アンバーコドン（ＴＡＧ）を後ろに従えた
15アミノ酸長Ｅタグを、検出およびその他の分析的目的のために、Ｖ_LのＣ末端
とタンパク質ＩＩＩとの間に挿入した。Ｅタグおよびタンパク質ＩＩＩ間に位置
するアンバーコドンは、構築物に、サプレッサー宿主（例えば、ＴＧＩ細胞）中
で形質転換された場合に表面表示フォーマットのｓｃＦｖを、非サプレッサー宿
主（例えば、ＨＢ２１５１細胞）中で形質転換された場合には可溶性形態のｓｃ
Ｆを作製させる。When displaying scFv on the surface of filamentous phage, the antibody V _H and V _L domains
Linked together by a 15 amino acid long linker (GGGGS) ³ and fused to the N-terminus of phage protein III. Amber codon (TAG) followed
A 15 amino acid long E-tag was inserted between the C-terminus of _VL and protein III for detection and other analytical purposes. The amber codon located between the E-tag and protein III allows the construct to have the scFv in surface display format when transformed in a suppressor host (eg, TGI cells), in a non-suppressor host (eg, HB2151 cells). The soluble form of sc when transformed
F is produced.

【００５５】 ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクターに、組み立てたｓｃＦｖＤＮＡを連結した。形質
転換ＴＧ１細胞を２ＹＴＡＧプレート上にプレート化して、インキュベートした
。コロニーを10 mlの２ＹＴ培地中に掻き取って、5 mlの50％グリセロールと混
合し、-70℃でライブラリーストックとして保存した。[0055] The assembled scFv DNA was ligated to the pCANTAB5E vector. Transformed TG1 cells were plated on 2YTAG plates and incubated. Colonies were scraped into 10 ml of 2YT medium, mixed with 5 ml of 50% glycerol and stored at -70 ° C as library stock.

【００５６】 実施例Ｉ（ｃ）．バイオパンニング ライブラリーストックを対数期に増殖させて、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ
で奪回し、２ＹＴＡＫ培地（100 ug/mlのアンピシリンおよび50 ug/mlのカナマ
イシンを含有する２ＹＴ）中で30℃で一夜増幅させた。500 ug/mlのＡＰタンパ
ク質を含有する3％無脂肪ミルク／ＰＢＳ中に懸濁した4％ＰＥＧ／0.5 MＮａＣ
ｌ中でファージ調製物を沈澱させて、37℃で1時間インキュベートして、抗ＡＰ
ｓｃＦｖを表示するファージを捕獲し、他の非特異的結合を遮断した。Example I (c). Biopanning library stocks were grown in log phase, harvested with M13K07 helper phage, and amplified overnight at 30 ° C. in 2YTAK medium (2YT containing 100 ug / ml ampicillin and 50 ug / ml kanamycin). . 4% PEG / 0.5 M NaC suspended in 3% non-fat milk / PBS containing 500 ug / ml AP protein
The phage preparation is precipitated and incubated for 1 hour at 37 ° C.
Phage displaying the scFv were captured and other non-specific binding was blocked.

【００５７】 ＫＤＲ−ＡＰ（10 ug/ml）被覆Maxisorp Star管（Nunc、デンマーク）を先ず3
％ミルク／ＰＢＳを用いて37℃で1時間遮断し、次に室温で1時間、ファージ調製
物とともにインキュベートした。管をＰＢＳＴで10回、その後ＰＢＳ（0.1％ト
ゥイーン20を含有するＰＢＳ）で10回洗浄した。100 mMトリエチルアミンの1 ml
の新たに調製した溶液を用いて、結合ファージを室温で10分間溶離した。溶離フ
ァージを10 mlの中対数期ＴＧ１細胞とともに37℃で30分間静止および30分間振
盪でインキュベートした。次に感染ＴＧ１細胞を２ＹＴＡＧプレート上に載せて
、30℃で一夜インキュベートした。First place KDR-AP (10 ug / ml) coated Maxisorp Star tubes (Nunc, Denmark)
Blocked for 1 hour at 37 ° C with% milk / PBS, then incubated with the phage preparation for 1 hour at room temperature. The tubes were washed 10 times with PBST and then 10 times with PBS (PBS containing 0.1% Tween 20). 1 ml of 100 mM triethylamine
Bound phages were eluted at room temperature for 10 minutes using the freshly prepared solution of The eluted phages were incubated with 10 ml of mid-log TG1 cells for 30 minutes at 37 ° C. in static and 30 minutes shaking. The infected TG1 cells were then placed on a 2YTAG plate and incubated at 30 ° C. overnight.

【００５８】 3回目のパンニング後にスクリーニングした99％（185/186）のクローンは、特
異的ＫＤＲ結合物であることが判明した。しかしながら、これらの結合物の15（
8％）のみが固定化ＶＥＧＦに結合するＫＤＲを遮断し得た。これら15のクロー
ンのＤＮＡ ＢｓｔＮＩフィンガープリンティングは、２つの異なる消化パター
ンの存在を示した。一方、21の無作為採取ＶＥＧＦ非ブロッカーは、４つの異な
るパターンを生じた。消化パターンはすべて、２回目のパンニング後に同定され
たクローン中でも観察された。各消化パターンの代表的クローンを、２回目のパ
ンニング後に回収したクローンから採取して、ＤＮＡ配列決定を施した。配列決
定した15のクローンのうち、2つの独特のＶＥＧＦブロッカーおよび３つの非ブ
ロッカーを同定した。ＫＤＲと結合せず、またはＫＤＲと結合するＶＥＧＦを遮
断もしない一つのｓｃＦｖであるｐ２Ａ７を、全試験のためのネガティブ対照と
して選択した。[0058] 99% (185/186) clones screened after the third round of panning were found to be specific KDR binders. However, 15 of these conjugates (
Only 8%) could block KDR binding to immobilized VEGF. DNA BstNI fingerprinting of these 15 clones indicated the presence of two different digestion patterns. On the other hand, 21 randomly sampled VEGF non-blockers produced four different patterns. All digestion patterns were also observed in clones identified after the second panning. Representative clones for each digestion pattern were taken from clones recovered after the second round of panning and subjected to DNA sequencing. Of the 15 clones sequenced, two unique VEGF blockers and three non-blockers were identified. One scFv, p2A7, which does not bind to KDR or block VEGF binding to KDR, was selected as a negative control for all studies.

【００５９】 実施例Ｉ（ｄ）．ファージＥＬＩＳＡ 個々のＴＧ１クローンを96ウエルプレート中で37℃で増殖させて、前記のよう
にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージで奪回した。増幅ファージ調製物を、室温で１
時間、1/6容積の18％ミルク／ＰＢＳで遮断し、ＫＤＲ−ＡＰまたはＡＰ（1 ug/
ml x 100 ul）で被覆したMaxi-sorp 96ウエルマイクロタイタープレート（Nunc
）に付加した。室温で1時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで3回洗
浄し、ウサギ抗Ｍ１３ファージＡｂ−ＨＲＰ接合体とともにインキュベートした
。プレートを５回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を付加し、マイクロプレ
ート読み取り機を用いて450 nmでＯＤを読み取って、ｓｃＦｖ抗体を同定し、配
列決定した。Example I (d). Phage ELISA Individual TG1 clones were grown at 37 ° C. in 96 well plates and harvested with M13K07 helper phage as described above. Amplify the phage preparation at room temperature for 1 hour.
Time, block with 1/6 volume of 18% milk / PBS, KDR-AP or AP (1 ug / ug)
Maxi-sorp 96-well microtiter plate (Nunc
). After 1 hour incubation at room temperature, plates were washed three times with PBST and incubated with rabbit anti-M13 phage Ab-HRP conjugate. Plates were washed 5 times, TMB peroxidase substrate was added, and the OD was read at 450 nm using a microplate reader to identify and sequence the scFv antibodies.

【００６０】 実施例Ｉ（ｅ）．可溶性ｓｃＦｖの調製 個々のクローンのファージを用いて、非サプレッサー大腸菌宿主ＨＢ２１５１
および２ＹＴＡＧ−Ｎプレート上で選択された感染体を感染させた。1 mMイソプ
ロピル−１−チオ−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する２ＹＴＡ培地中で30
℃で細胞を培養することにより、ＨＢ２１５１細胞中のｓｃＦｖの発現を誘導し
た。20％（w/v）スクロース、200 mMＮａＣｌ、1 mMＥＤＴＡおよび0.1 mMＰＭ
ＳＦを含有する25 mMトリス（ｐＨ7.5）中に細胞ペレットを再懸濁し、その後、
静かに振盪しながら1時間、4℃でインキュベートすることにより、細胞の末梢原
形質（periplasmic）抽出物を調製した。15,000 rpmで15分間遠心分離後、ＲＰ
ＡＳ精製モジュール（Pharmacia Biotech）を用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーにより、可溶性ｓｃＦｖを上清から精製した。Example I (e). Preparation of Soluble scFv Non-suppressor E. coli host HB2151 using phage of individual clones
And selected infectants on 2YTAG-N plates. 30 mM in 2YTA medium containing 1 mM isopropyl-1-thio-BD-galactopyranoside.
By culturing the cells at ℃, the expression of scFv in HB2151 cells was induced. 20% (w / v) sucrose, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA and 0.1 mM PM
Resuspend the cell pellet in 25 mM Tris (pH 7.5) containing SF, then
Periplasmic extracts of cells were prepared by incubating at 4 ° C. for 1 hour with gentle shaking. After centrifugation at 15,000 rpm for 15 minutes, RP
Soluble scFv was purified from the supernatant by affinity chromatography using an AS purification module (Pharmacia Biotech).

【００６１】 実施例ＩＩ．検定 実施例ＩＩ（ａ）．定量的ＫＤＲ結合検定 ２つの検定を用いて、精製した可溶性ｓｃＦｖのＫＤＲとの結合を定量的に調
べた。Example II. Assay Example II (a). Quantitative KDR binding assays Two assays were used to quantitatively examine the binding of purified soluble scFv to KDR.

【００６２】 ２つのＶＥＧＦブロッカーｐ１Ｃ１１およびｐ１Ｆ１２、１つの非ブロッカー
、優性クローンｐ２Ａ６および非結合物ｐ２Ａ７を含めた４つの異なるクローン
を、非サプレッサー宿主大腸菌ＨＢ２１５１細胞を用いて振盪フラスコ中で発現
させた。抗Ｅ−タグアフィニティークロマトグラフィーにより、可溶性ｓｃＦｖ
を大腸菌の末梢原形質抽出物から精製した。これらのクローンの精製ｓｃＦｖの
収量は、100〜400 ug/培養リットルの範囲であった。Four different clones, including two VEGF blockers p1C11 and p1F12, one non-blocker, the dominant clone p2A6 and the unconjugated p2A7, were expressed in shake flasks using the non-suppressor host E. coli HB2151 cells. By anti-E-tag affinity chromatography, soluble scFv
Was purified from an E. coli peripheral plasma extract. The yield of purified scFv for these clones ranged from 100 to 400 ug / liter culture.

【００６３】 直接結合検定では、種々の量の可溶性ｓｃＦｖをＫＤＲ被覆96ウエルMaxi-sor
pマイクロタイタープレートに付加し、室温で1時間インキュベートし、その後、
プレートをＰＢＳＴで3回洗浄した。次に、100 ulのマウス抗Ｅタグ抗体を用い
てプレートを室温で1時間インキュベートし、その後、100 plのウサギ抗マウス
抗体−ＨＲＰ接合体を用いてインキュベートした。ファージＥＬＩＳＡに関して
前記した手法後、プレートを洗浄し、現像した。In the direct binding assay, varying amounts of soluble scFv were added to KDR-coated 96-well Maxi-sor
p microtiter plate, incubate for 1 hour at room temperature, then
Plates were washed three times with PBST. The plate was then incubated with 100 ul of mouse anti-E tag antibody for 1 hour at room temperature, followed by incubation with 100 pl of rabbit anti-mouse antibody-HRP conjugate. After the procedure described above for the phage ELISA, the plates were washed and developed.

【００６４】 別の検定、即ち競合的ＶＥＧＦ遮断検定では、種々の量の可溶性ｓｃＦｖを一
定量のＫＤＲ−ＡＰ（50 ng）と混合して、室温で1時間インキュベートした。次
に混合物を、ＶＥＧＦ₁₆₅（200 ng/ウエル）で被覆した96ウエルマイクロタイタ
ープレートに移して、室温でさらに2時間インキュベートし、その後、プレート
を５回洗浄し、ＡＰのための基質を付加して、結合ＫＤＲ−ＡＰ分子を定量した
。次に、ＩＣ₅₀、即ちＶＥＧＦに結合するＫＤＲの50％抑制に必要なｓｃＦｖ濃
度を算定した。In another assay, the competitive VEGF blockade assay, varying amounts of soluble scFv were mixed with a fixed amount of KDR-AP (50 ng) and incubated for 1 hour at room temperature. The mixture was then transferred to a 96-well microtiter plate coated with VEGF ₁₆₅ (200 ng / well) and incubated for a further 2 hours at room temperature, after which the plate was washed 5 times and the substrate for AP was added. Bound KDR-AP molecules were quantified. Next, IC ₅₀ , the scFv concentration required for 50% inhibition of KDR binding to VEGF, was calculated.

【００６５】 図１は、直接結合ＥＬＩＳＡにより検定した場合の、固定化ＫＤＲとのｓｃＦ
ｖの用量依存性結合を示す。図２に示したように、クローンｐ１Ｃ１１およびｐ
１Ｆ１２も固定化ＶＥＧＦと結合するＫＤＲを遮断するが、ｐ２Ａ６は遮断しな
い。図２に示したデータは、３回測定値の平均±ＳＤである。ネガティブ対照ク
ローン、ｐ２Ａ７、はＫＤＲと結合せず、またはＶＥＧＦに結合するＫＤＲを遮
断しなかった（図１および２）。各回のパンニング後の優性クローンであるクロ
ーンｐ１Ｃ１１は、最高ＫＤＲ結合能力、ならびにＫＤＲに結合するＶＥＧＦを
遮断する場合の最高効力を示した（表１）。ＫＤＲとの最大結合の50％に（図１
）、ならびにＶＥＧＦと結合するＫＤＲの50％抑制に必要なクローンｐ１Ｃ１１
の抗体濃度は、それぞれ0.3 nMおよび3 nMであった（表１参照）。ＦＡＣＳ分析
は、ｐ１Ｃ１１、ｐ１Ｆ１２およびｐ２Ａ６がＨＵＶＥＣ上の細胞表面発現受容
体に結合することもできることを実証した。FIG. 1 shows scF with immobilized KDR as assayed by direct binding ELISA.
Figure 4 shows dose dependent binding of v. As shown in FIG. 2, clones p1C11 and p1C11
1F12 also blocks KDR binding to immobilized VEGF, but does not block p2A6. The data shown in FIG. 2 is the mean ± SD of three measurements. The negative control clone, p2A7, did not bind to KDR or block KDR binding to VEGF (FIGS. 1 and 2). The dominant clone after each round of panning, clone p1C11, showed the highest KDR binding capacity, as well as the highest potency in blocking VEGF binding to KDR (Table 1). 50% of the maximum binding to KDR (Fig. 1
), And clone p1C11 required for 50% inhibition of KDR binding to VEGF
Were 0.3 nM and 3 nM, respectively (see Table 1). FACS analysis demonstrated that p1C11, p1F12 and p2A6 could also bind to cell surface expressed receptors on HUVEC.

【００６６】 実施例ＩＩ（ｂ）．可溶性ｓｃＦｖのBIAcore分析 BIAcoreバイオセンサー（Pharmacia Biosensor）を用いて、ＫＤＲとの可溶性
ｓｃＦｖの結合動力学を測定した。ＫＤＲ−ＡＰ融合タンパク質をセンサーチッ
プ上に固定化し、可溶性ｓｃＦｖを、62.5 nM〜1000 nMの範囲の濃度で注入した
。各濃度でセンサー記録を得て、プログラムBIA Evaluation 2.0を用いて評価し
て、速度定数konおよびkoffを確定した。速度定数の比koff/konから、Ｋｄを算
定した。Example II (b). BIAcore analysis of soluble scFv The binding kinetics of soluble scFv with KDR was measured using a BIAcore biosensor (Pharmacia Biosensor). The KDR-AP fusion protein was immobilized on a sensor chip and soluble scFv was injected at concentrations ranging from 62.5 nM to 1000 nM. At each concentration a sensor record was obtained and evaluated using the program BIA Evaluation 2.0 to determine the rate constants kon and koff. Kd was calculated from the rate constant ratio koff / kon.

【００６７】 表１は、BIAcore計器での表面プラスモン共鳴の結果を示す。ＶＥＧＦ遮断ｓ
ｃＦｖ、ｐ１Ｃ１１およびｐ１Ｆ１２は、それぞれ2.1および5.9 nMのＫ_dで固定
化ＫＤＲに結合した。非遮断ｓｃＦｖ、ｐ２Ａ６、は、主に非常に速い解離速度
のために、最良結合体ｐ１Ｃ１１の約６分の１の弱い親和性（Ｋ_d、11.2 nM）で
ＫＤＲに結合した。予測通り、ｐ２Ａ７はBIAcoreで固定化ＫＤＲと結合しなか
った。Table 1 shows the results of surface plasmon resonance on a BIAcore instrument. VEGF blocking s
cFv, p1C11 and p1F12 bound to immobilized KDR with _Kd of 2.1 and 5.9 nM, respectively. The unblocked scFv, p2A6, bound to KDR with a weak affinity ( _Kd , 11.2 nM) about one-sixth of the best binder p1C11, mainly due to the very fast off-rate. As expected, p2A7 did not bind to immobilized KDR on BIAcore.

【００６８】 実施例ＩＩ（ｃ）．リン酸化検定 以前に記載されたプロトコールにしたがって、初期継代ＨＵＶＥＣを用いてリ
ン酸化検定を実施した。要するに、5 ug/mlのｓｃＦｖ抗体の存在または不存在
下で、0.5％ウシ血清アルブミンを補充した血清不含ＥＢＭ−２塩基性培地中で
、室温で10分間、ＨＵＶＥＣをインキュベートし、その後、室温でさらに15分間
、20 ng/mlのＶＥＧＦ₁₆₅を用いて刺激した。細胞を溶解し、ウサギ抗ＫＤＲポ
リクローナル抗体（ImClone Systems Incorporated）とカップリングさせたプロ
テインＡセファロースビーズを用いて、ＫＤＲ受容体を細胞溶解物から免疫沈降
させた。ビーズを洗浄し、ＳＤＳ負荷緩衝液と混合して、上清にウエスタンブロ
ット分析を施した。ＫＤＲリン酸化を検出するために、抗ホスホチロシンＭａｂ
、４Ｇ１０を用いてブロットをプローブした。ＭＡＰキナーゼ活性検定のために
、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、その後、ホスホ特異的ＭＡＰキナー
ゼ抗体を用いて、ウエスタンブロット分析を実施した。シグナルはすべて、ＰＣ
Ｌを用いて検出した。Example II (c). Phosphorylation Assay Phosphorylation assays were performed using early passage HUVECs according to the protocol described previously. Briefly, HUVECs were incubated for 10 minutes at room temperature in serum-free EBM-2 basic medium supplemented with 0.5% bovine serum albumin in the presence or absence of 5 ug / ml scFv antibody, and then incubated at room temperature. For another 15 minutes with VEGF ₁₆₅ at 20 ng / ml. Cells were lysed and KDR receptors were immunoprecipitated from cell lysates using Protein A Sepharose beads coupled to rabbit anti-KDR polyclonal antibody (ImClone Systems Incorporated). The beads were washed, mixed with SDS loading buffer, and the supernatant was subjected to Western blot analysis. To detect KDR phosphorylation, anti-phosphotyrosine Mab
The blot was probed with 4G10. For MAP kinase activity assays, cell lysates were digested by SDS-PAGE, followed by Western blot analysis using a phospho-specific MAP kinase antibody. All signals are PC
L was detected.

【００６９】 ＶＥＧＦ遮断ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１は、ＶＥＧＦにより刺激されたＫＤＲ受容
体リン酸化を抑制し得たが、非遮断ｓｃＦｖ ｐ２Ａ６はできなかったというこ
とを結果は示した。さらに、ｐ１Ｃ１１は、ＭＡＰキナーゼｐ４４／ｐ４２のＶ
ＥＧＦ刺激性活性化も有効に抑制した。これに対比して、ｐ１Ｃ１１もｐ２Ａ６
も、ＭＡＰキナーゼｐ４４／ｐ４２のＦＧＦ刺激性活性化を抑制しなかった。The results showed that VEGF-blocked scFv p1C11 was able to suppress VEGF-stimulated KDR receptor phosphorylation, but not unblocked scFv p2A6. Furthermore, p1C11 is the V of MAP kinase p44 / p42.
EGF-stimulated activation was also effectively suppressed. In contrast, p1C11 also has p2A6
Nor did it inhibit FGF-stimulated activation of MAP kinase p44 / p42.

【００７０】 実施例ＩＩ（ｄ）．抗マイトジェン検定 ＨＵＶＥＣ（5 x 10³細胞／ウエル）を、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦを
含有しない200 ulのＥＢＭ−２培地中の96ウエル組織培養プレート（Wallach, I
nc., Gaithersburg, MD）上に載せて、37℃で72時間インキュベートした。種々
の量の抗体を同一の２つのウエルに付加して、37℃で1時間予備インキュベート
し、その後、ＶＥＧＦ₁₆₅を付加して、最終濃度を16 ng/mlとした。18時間のイ
ンキュベーション後、0.25 uCiの［３Ｈ］−ＴｄＲ（Amersham）を各ウエルに付
加し、さらに4時間インキュベートした。細胞を氷上に載せ、血清含有培地で2回
洗浄し、その後、10％ＴＣＡとともに4℃で10分間インキュベートした。次に細
胞を水で１回洗浄し、25 ulの2％ＳＤＳ中に溶解させた。シンチレーション流体
（150 ul/ウエル）を付加し、ＤＮＡ組み込み放射能をシンチレーション計数器
（Wallach, Model 1450 Microbeta Scintillation Counter）で測定した。Example II (d). Anti-mitogen assay HUVECs (5 x 10 ³ cells / well) were plated in 96-well tissue culture plates (Wallach, I) in 200 ul of EBM-2 medium without VEGF, bFGF or EGF.
nc., Gaithersburg, MD) and incubated at 37 ° C for 72 hours. Various amounts of antibody were added to the same two wells and pre-incubated for 1 hour at 37 ° C., after which VEGF ₁₆₅ was added to a final concentration of 16 ng / ml. After an 18 hour incubation, 0.25 uCi of [3H] -TdR (Amersham) was added to each well and incubated for an additional 4 hours. Cells were placed on ice, washed twice with serum-containing medium, and then incubated for 10 minutes at 4 ° C. with 10% TCA. The cells were then washed once with water and lysed in 25 ul of 2% SDS. Scintillation fluid (150 ul / well) was added and DNA incorporated radioactivity was measured with a scintillation counter (Wallach, Model 1450 Microbeta Scintillation Counter).

【００７１】 ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ刺激性マイトジェン活性を遮断するｓｃＦｖ抗体
の能力を、図３に示す。ＶＥＧＦ遮断ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１は、約5 nMのＥＣ₅₀ で、即ちＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ刺激性有糸***誘発の50％を抑制する抗体濃度で
、ＨＵＶＥＣにおいてＶＥＧＦ誘導性ＤＮＡ合成を強力に抑制した。非遮断ｓｃ
Ｆｖ ｐ２Ａ６は、ＶＥＧＦのマイトジェン活性に及ぼす抑制作用を示さなかっ
た。ｐ１Ｃ１１またはｐ２Ａ６は、ＨＵＶＥＣにおけるｂＦＧＦ誘導ＤＮＡ合成
を抑制しなかった（示されていない）。図３に示したデータは、少なくとも３つ
の別々の実験を代表するものである。（ ）ＶＥＧＦのみ；（ ）ＶＥＧＦなし
。The ability of scFv antibodies to block VEGF-stimulated mitogenic activity in HUVEC is shown in FIG. VEGF-blocked scFv p1C11 potently inhibited VEGF-induced DNA synthesis in HUVECs with an EC ₅₀ of about 5 nM, ie, an antibody concentration that suppressed 50% of VEGF-stimulated mitogenesis of HUVECs. Non-blocking sc
Fv p2A6 did not show an inhibitory effect on the mitogenic activity of VEGF. p1C11 or p2A6 did not suppress bFGF-induced DNA synthesis in HUVEC (not shown). The data shown in FIG. 3 is representative of at least three separate experiments. () VEGF only; () No VEGF.

【００７２】 実施例ＩＶ．キメラ抗体の産生 実施例ＩＶ（ａ）．細胞株およびタンパク質 一次培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を37℃で5％ＣＯ２でＥＢＭ−
２培地中に保持した。すべての検定に関して、継代数２〜５で細胞を用いた。Ｖ
ＥＧＦ₁₆₅およびＫＤＲ−アルカリ性ホスファターゼ融合タンパク質（ＫＤＲ−
ＡＰ）を、前記の手法にしたがって、それぞれバキュロウイルスおよびＮＩＨ
３Ｔ３細胞中で発現させ、精製した。抗ＫＤＲｓｃＦｖ Ｐ１Ｃ１１およびＫＤ
Ｒと結合するがＫＤＲ−ＶＥＧＦ相互作用を遮断しない抗体であるｓｃＦｖ ｐ
２Ａ６を、前記と同様にＫＤＲで免疫感作したマウスから構築したファージ表示
ライブラリーから単離した。Ｃ２２５は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体に対し
て向けられるキメラＩｇＧ１抗体である。Example IV. Production of chimeric antibodies Example IV (a). Cell lines and proteins Primary cultures of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were grown at 37 ° C. with 5% CO 2 in EBM-
2 medium. Cells were used at passages 2-5 for all assays. V
EGF ₁₆₅ and KDR-alkaline phosphatase fusion protein (KDR-
AP) was replaced with baculovirus and NIH, respectively, according to the procedure described above.
It was expressed in 3T3 cells and purified. Anti-KDRscFv P1C11 and KD
ScFv p, an antibody that binds to R but does not block KDR-VEGF interaction
2A6 was isolated from a phage display library constructed from mice immunized with KDR as described above. C225 is a chimeric IgG1 antibody directed against the epidermal growth factor (EGF) receptor.

【００７３】 実施例ＩＶ（ｂ）．ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１の可変ドメインのクローニング ｐ１Ｃ１１の軽（Ｖ_L）および重（Ｖ_H）鎖の可変ドメインを、それぞれプライ
マー１および２ならびにプライマー３および４を用いたＰＣＲにより、ｓｃＦｖ
発現ベクターからクローン化した。次に、哺乳類細胞におけるタンパク質分泌に
関するリーダーペプチド配列を、それぞれプライマー５および２ならびにプライ
マー５および４を用いたＰＣＲにより、Ｖ_LおよびＶ_Hの５’に付加した。Example IV (b). Cloning of the variable domain of the scFv p1C11 The variable domains of the light (V _L ) and heavy (V _H ) chains of p1C11 were purified by PCR using primers 1 and 2 and primers 3 and 4, respectively.
Cloned from expression vector. Next, a leader peptide sequence for protein secretion in mammalian cells, by PCR using respectively primers 5 and 2, and primers 5 and 4, were added to the 5 'of the V _L and V _H.

【００７４】 プライマー１：5'CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATC GAG CT
C3' プライマー２：5'TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG3' BamHI プライマー３：5'CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTC AAG CT
G3' プライマー４：5'TCG AAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT3' BamHI プライマー５：5'GGT CAA AAG CTT ATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT TTT CT HindIII A GTA GCA ACT3' 実施例ＩＶ（ｃ）．キメラｐ１Ｃ１１ ＩｇＧに関する発現ベクターの構築 キメラＩｇＧ軽鎖および重鎖の発現のための別個のベクターを構築した。クロ
ーン化Ｖ_L遺伝子をHind IIIおよびBamH Iで消化し、ヒトκ軽鎖定常部（Ｃ_L）を
含有するベクターｐＫＮ１００に連結して、キメラｐ１Ｃ１１軽鎖ｃ−ｐ１Ｃ１
１−Ｌのための発現ベクターを作製した。クローン化Ｖ_H遺伝子をHind IIIおよ
びBamH Iで消化し、ヒトＩｇＧ１（γ）重鎖定常ドメイン（Ｃ_H）を含有するベ
クターｐＧＩＤ１０５に連結して、キメラｐ１Ｃ１１重鎖、ｃ−ｐ１Ｃ１１−Ｈ
のための発現ベクターを作製した。制限酵素消化により両構築物を検査し、ジデ
オキシヌクレオチド配列決定により立証した。Primer 1: 5 'CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATC GAG CT
C3 'primer 2: 5' TCG ATC TAG AAG GAT CC A CTC ACG TTT TAT TTC CAG 3 'BamHI primer 3: 5' CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTC AAG CT
G3 'primer 4: 5' TCG AAG GAT CC A CTC ACC TGA GGA GAC GGT 3 'BamHI primer 5: 5' GGT CAA AAG CTT ATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT TTT CT HindIII A GTA GCA ACT3 'Example IV ( c). Construction of Expression Vector for Chimeric p1C11 IgG Separate vectors for expression of chimeric IgG light and heavy chains were constructed. Cloned V _L genes were digested with Hind III and BamH I, and ligated into the vector pKN100 containing human κ light chain constant region and (C _L), chimeric p1C11 light chain c-P1C1
An expression vector for 1-L was made. The cloned _VH gene was digested with HindIII and BamHI and ligated into the vector pGID105 containing the human IgG1 (γ) heavy chain constant domain (C _H ), resulting in a chimeric p1C11 heavy chain, c-p1C11-H.
An expression vector for was prepared. Both constructs were examined by restriction digest and verified by dideoxynucleotide sequencing.

【００７５】 図４で分かるように、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインはともに、それらの５’末端で、
マークを付けたリーダーペプチド配列をコードする遺伝子セグメントに的確に融
合される。Ｖ_HおよびＶ_Lドメインは、Hind III/BamH I部位を介して、ヒトγ１
鎖定常部遺伝子のｃＤＮＡバージョンを含有する発現ベクターｐＧ１Ｄ１０５、
ならびにヒトκ鎖定常部遺伝子のｃＤＮＡバージョンを含有するｐＫＮ１００に
それぞれ連結される。各々の場合、発現はＨＣＭＶｉプロモーターの制御下にあ
り、人工終止配列により終結される。Kabat等の超可変配列定義により定義され
る軽および重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）残基には下線を付し、ＣＤＲ−Ｈ１〜
Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ１〜Ｌ３をそれぞれ標識してある。As can be seen in FIG. 4, both the V _H and V _L domains, at their 5 ′ ends,
It is properly fused to the gene segment encoding the marked leader peptide sequence. The V _H and V _L domains are linked to human γ1 via a Hind III / BamHI site.
An expression vector pG1D105 containing a cDNA version of the chain constant region gene,
And pKN100 containing the cDNA version of the human kappa chain constant region gene. In each case, expression is under the control of the HCMVi promoter and is terminated by an artificial termination sequence. Light and heavy chain complementarity determining region (CDR) residues defined by the hypervariable sequence definition of Kabat et al. Are underlined and CDR-H1-
H3 and CDR-L1 to L3 are each labeled.

【００７６】 実施例ＩＶ（ｄ）．ＩｇＧ発現および精製 一過性ＩｇＧ発現のために、等量のｃ−ｐ１Ｃ１１−Ｌおよびｃ−ｐ１Ｃ１１
−ＨプラスミドでＣＯＳ細胞を同時トランスフェクトした。150 mm培養皿中のＤ
ＭＥＭ／10％ＦＣＳ中で増殖した亜集密的ＣＯＳ細胞を、40 mMトリス（ｐＨ7.4
）を含有する20 mlのＤＭＥＭで１回洗浄し、その後、4 mlのＤＭＥＭ／ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン／ＤＮＡ混合物（40 mMトリス、0.4 mg/mlのＤＥＡＥ−デキス
トラン（Sigma）および各々20 ugのｃ−ｐ１Ｃ１１−Ｌおよびｃ−ｐ１Ｃ１１−
Ｈプラスミドを含有するＤＭＥＭ）を用いて、37℃で4.5時間インキュベートし
た。100 nMのクロロキン（Sigma）を含有する4 mlのＤＭＥＭ／2％ＦＣＳととも
に37℃で1時間、細胞をインキュベートし、その後、1.5 mlの20％グリセロール
／ＰＢＳを用いて室温で1分間インキュベートした。細胞をＤＭＥＭ／5％ＦＣＳ
で2回洗浄し、20 mlの同一培地中で37℃で一夜インキュベートした。純ＤＭＥＭ
で２回洗浄後、細胞培地を血清不含ＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳに取り換えた。細胞培
養上清をトランスフェクション後48時間および120時間目に収集した。メーカー
（Pharmacia Biotech）が記載したプロトコールにしたがってプロテインＧカラ
ムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、キメラＩｇＧをプールし
た上清から精製した。ＩｇＧ含有分画をプールし、緩衝液をＰＢＳに交換して、
Centricon 10濃縮機（Amicon Corp., Beverly, MA）を用いて濃縮した。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより、ＩｇＧの純度を分析した。捕獲剤としてヤギ抗ヒトｙ鎖特異
的抗体を、ならびに検出剤としてＨＲＰ接合化ヤギ抗ヒトκ鎖抗体を用いたＥＬ
ＩＳＡにより、精製抗体の濃度を確定した。臨床等級抗体Ｃ２２５を用いて、標
準曲線を較正した。Example IV (d). IgG Expression and Purification For transient IgG expression, equal amounts of c-p1C11-L and c-p1C11
COS cells were co-transfected with the -H plasmid. D in 150 mm culture dish
Subconfluent COS cells grown in MEM / 10% FCS were transformed with 40 mM Tris (pH 7.4).
) Was washed once with 20 ml of DMEM, followed by 4 ml of DMEM / DEA
E-dextran / DNA mixture (40 mM Tris, 0.4 mg / ml DEAE-dextran (Sigma) and 20 ug each of c-p1C11-L and c-p1C11-
(DMEM containing H plasmid) at 37 ° C. for 4.5 hours. Cells were incubated with 4 ml DMEM / 2% FCS containing 100 nM chloroquine (Sigma) for 1 hour at 37 ° C., followed by 1 minute incubation at room temperature with 1.5 ml 20% glycerol / PBS. Transfer cells to DMEM / 5% FCS
, And incubated overnight at 37 ° C. in 20 ml of the same medium. Pure DMEM
After washing twice with, the cell culture medium was replaced with serum-free DMEM / HEPES. Cell culture supernatants were collected at 48 and 120 hours after transfection. The chimeric IgG was purified from the pooled supernatant by affinity chromatography using a protein G column according to the protocol described by the manufacturer (Pharmacia Biotech). The IgG containing fractions were pooled, the buffer was exchanged for PBS,
It was concentrated using a Centricon 10 concentrator (Amicon Corp., Beverly, MA). SDS
-Purity of IgG was analyzed by PAGE. EL using a goat anti-human y chain specific antibody as a capture agent and an HRP-conjugated goat anti-human κ chain antibody as a detector
The concentration of the purified antibody was determined by ISA. The standard curve was calibrated using the clinical grade antibody C225.

【００７７】 プロテインＧによるアフィニティー精製後、約150 kDの単一タンパク質帯がＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで観察された。ＨＲＰ接合化抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ特異的抗体を
用いたウエスタンブロット分析は、精製タンパク質中にヒトＩｇＧ Ｆｃの存在
を確証した（示されていない）。After affinity purification with protein G, a single protein band of about 150 kD
Observed by DS-PAGE. Western blot analysis using an HRP-conjugated anti-human IgG1 Fc-specific antibody confirmed the presence of human IgG Fc in the purified protein (not shown).

【００７８】 ＥＬＩＳＡの結果は、ｃ−ｐ１Ｃ１１が、親ｓｃＦｖより有効に固定化ＫＤＲ
と結合するということを示す（図５）。The results of the ELISA show that c-p1C11 is more effective than the parent scFv
(Fig. 5).

【００７９】 実施例Ｖ．検定および分析 実施例Ｖ（ａ）．ＦＡＣＳ分析 増殖因子欠失化ＥＢＭ−２培地中で一夜、初期継代ＨＵＶＥＣ細胞を増殖させ
て、ＫＤＲの発現を誘導した。細胞を収穫し、ＰＢＳで３回洗浄して、ｃ−ｐ１
Ｃ１１ ＩｇＧ（5 ug/ml）とともに4℃で１時間、インキュベートし、その後、
ＦＩＴＣ標識化ウサギ抗ヒトＦｃ抗体（Capper, Organon Teknika Corp., West
Chester, PA）を用いてさらに60分間インキュベートした。細胞を洗浄し、フロ
ーサイトメーター（Model EPICS, Coulter Corp., Edison, NJ）により分析した
。Example V. Assay and analysis Example V (a). FACS analysis Early passage HUVEC cells were grown overnight in growth factor deficient EBM-2 media to induce KDR expression. Cells are harvested, washed three times with PBS and c-p1
Incubate with C11 IgG (5 ug / ml) at 4 ° C. for 1 hour, then
FITC-labeled rabbit anti-human Fc antibody (Capper, Organon Teknika Corp., West
(Chester, PA) for an additional 60 minutes. Cells were washed and analyzed on a flow cytometer (Model EPICS, Coulter Corp., Edison, NJ).

【００８０】 図６は、ＫＤＲ発現ＨＵＶＥＣに結合するｃ−ｐ１Ｃ１１のＦＡＣＳ分析を示
すグラフである。親ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１に関して従来観察されているように、
ｃｐ１Ｃ１１は初期継代ＨＵＶＥＣ上に発現されるＫＤＲと特異的に結合する。FIG. 6 is a graph showing FACS analysis of c-p1C11 binding to KDR-expressing HUVEC. As previously observed for the parent scFv p1C11,
cp1C11 binds specifically to KDR expressed on early passage HUVECs.

【００８１】 実施例Ｖ（ｂ）．定量的ＫＤＲ結合検定 種々の量の抗体をＫＤＲ被覆96ウエルMaxi-sorpマイクロタイタープレート（N
unc. Denmark）に付加し、室温で1時間インキュベートし、その後、プレートを0
.1％トゥイーン20を含有するＰＢＳで３回洗浄した。次に、ｓｃＦｖに関しては
100 ulのマウス抗Ｅタグ抗体−ＨＲＰ接合体（Phannacia Biotech）を用いて、
またはキメラＩｇＧに関してはウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体−ＨＲＰ接
合体（Cappel, Organon Teknika Corp.）を用いて、プレートを室温で1時間イン
キュベートした。プレートを５回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（KPL, G
aithersburg, MD）を付加し、マイクロプレート読み取り機（Molecular Device,
Sunnyvale, CA）を用いて450 nmでＯＤを読み取って、ｓｃＦｖ抗体を同定し、
配列決定した。Embodiment V (b). Quantitative KDR binding assay Various amounts of antibody were applied to KDR-coated 96-well Maxi-sorp microtiter plates (N
unc. Denmark) and incubated for 1 hour at room temperature, after which the plate is
Washed three times with PBS containing .1% Tween-20. Next, regarding scFv
Using 100 ul of mouse anti-E tag antibody-HRP conjugate (Phannacia Biotech),
Alternatively, for chimeric IgG, the plates were incubated for 1 hour at room temperature using a rabbit anti-human IgG Fc specific antibody-HRP conjugate (Cappel, Organon Teknika Corp.). The plate is washed 5 times and a TMB peroxidase substrate (KPL, G
aithersburg, MD) and a microplate reader (Molecular Device,
Read OD at 450 nm using a Sunnyvale, CA) to identify scFv antibodies,
Sequenced.

【００８２】 図５は、固定化ＫＤＲとの抗体の直接結合を示すグラフである。ｃ−ｐ１Ｃ１
１は、親ｓｃＦｖより効率的に固定化ＫＤＲ受容体に結合することが示されてい
る。FIG. 5 is a graph showing the direct binding of antibodies to immobilized KDR. c-p1C1
1 has been shown to bind to immobilized KDR receptors more efficiently than the parent scFv.

【００８３】 実施例Ｖ（ｃ）．BIAcore分析 BIAcoreバイオセンサー（Pharmacia Biosensor）を用いて、ＫＤＲとの抗体の
結合動力学を測定した。ＫＤＲ−ＡＰ融合タンパク質をセンサーチップ上に固定
化し、抗体またはＶＥＧＦを、25 nM〜200 nMの範囲の濃度で注入した。各濃度
でセンサー記録を得て、プログラムBIA Evaluation 2.0を用いて評価して、速度
定数konおよびkoffを確定した。速度定数の比koff/konとして、Ｋ_dを算定した。Example V (c). BIAcore analysis The binding kinetics of the antibody with KDR was measured using a BIAcore biosensor (Pharmacia Biosensor). The KDR-AP fusion protein was immobilized on a sensor chip and antibody or VEGF was injected at a concentration ranging from 25 nM to 200 nM. At each concentration a sensor record was obtained and evaluated using the program BIA Evaluation 2.0 to determine the rate constants kon and koff. _Kd was calculated as the rate constant ratio koff / kon.

【００８４】 BIAcore分析は、ｃ−ｐ１Ｃ１１が親ｓｃＦｖより高い親和性でＫＤＲと結合
することを明示する。ｓｃＦｖに関する2.1 nMに比して、ｃ−ｐ１Ｃ１１のＫ_d
は0.82 nMである。ｃ−ｐ１Ｃ１１の親和性増大は、主として、二価キメラＩｇ
Ｇの遅い解離速度（koff）のためである。ＫＤＲとの結合のためのｃ−ｐ１Ｃ１
１の親和性（Ｋ_d）がＫＤＲとの結合のための天然配位子ＶＥＧＦの親和性と同
様であり、これは、我々のBIAcore分析で確定した場合、0.93 nMである（表２）
。BIAcore analysis demonstrates that c-p1C11 binds KDR with higher affinity than the parent scFv. The K _{d of} c-p1C11 compared to 2.1 nM for scFv
Is 0.82 nM. The increased affinity of c-p1C11 was primarily due to the divalent chimeric Ig
This is due to the slow dissociation rate (koff) of G. C-p1C1 for binding to KDR
The affinity of 1 (K _d ) is similar to that of the native ligand VEGF for binding to KDR, which is 0.93 nM as determined by our BIAcore analysis (Table 2).
.

【００８５】 実施例Ｖ（ｄ）．競合的ＶＥＧＦ結合検定 最初の検定において、種々の量の抗体を固定量のＫＤＲ−ＡＰ（50 ng）と混
合し、室温で1時間インキュベートした。次に、混合物を、ＶＥＧＦ₁₆₅（200 ng
／ウエル）で被覆した96ウエルマイクロタイタープレートに移して、室温でさら
に2時間インキュベートし、その後、プレートを５回洗浄し、ＡＰのための基質
（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、Sigma）を付加して、結合ＫＤＲ−ＡＰ分
子を定量した。次に、ＥＣ₅₀、即ちＶＥＧＦに結合するＫＤＲの50％抑制に必要
な抗体濃度を算定した。Embodiment V (d). Competitive VEGF binding assay In the first assay, different amounts of antibody were mixed with a fixed amount of KDR-AP (50 ng) and incubated for 1 hour at room temperature. Next, the mixture was added to VEGF ₁₆₅ (200 ng).
/ Well) coated 96-well microtiter plate and incubated for an additional 2 hours at room temperature, after which the plate is washed 5 times and the substrate for AP (p-nitrophenyl phosphate, Sigma) is added. Bound KDR-AP molecules were quantified. Next, the EC ₅₀ , the antibody concentration required for 50% inhibition of KDR binding to VEGF, was calculated.

【００８６】 図７は、ｃ−ｐ１Ｃ１１が、用量依存性様式で固定化ＶＥＧＦに結合からＫＤ
Ｒ受容体を遮断することを示す。キメラ抗体は、ｓｃＦｖに関する2.0 nMに比し
て、0.8 nMのＩＣ₅₀（即ち、ＶＥＧＦとの結合からＫＤＲの50％を抑制するのに
必要な抗体濃度）で、ＶＥＧＦ−ＫＤＲ相互作用を遮断するのにより効力がある
。対照ｓｃＦｖ ｐ２Ａ６もＫＤＲを結合する（図５）が、しかしＶＥＧＦ−Ｋ
ＤＲ相互作用を遮断しない（図７）。FIG. 7 shows that c-p1C11 binds to KD from immobilized VEGF in a dose-dependent manner.
5 illustrates blocking the R receptor. The chimeric antibody blocks the VEGF-KDR interaction with an IC _{50 of} 0.8 nM (ie, the antibody concentration required to suppress 50% of KDR from binding to VEGF) compared to 2.0 nM for scFv. More effective. Control scFv p2A6 also binds KDR (FIG. 5), but VEGF-K
Does not block DR interaction (FIG. 7).

【００８７】 二次検定では、種々の量のｃ−ｐ１Ｃ１１抗体または冷ＶＥＧＦ₁₆₅タンパク
質を一定量の¹²⁵Ｉ標識化ＶＥＧＦ₁₆₅と混合し、ＫＤＲ受容体で被覆した96ウエ
ルマイクロタイタープレートに付加した。プレートを室温で2時間インキュベー
トし、５回洗浄して、固定化ＫＤＲ受容体に結合した放射能標識化ＶＥＧＦ₁₆₅
の量を計数した。固定化ＫＤＲ受容体との放射能標識化ＶＥＧＦの結合の50％を
遮断するのに必要なｃ−ｐ１Ｃ１１および冷ＶＥＧＦ₁₆₅の濃度を確定した。In a secondary assay, varying amounts of c-p1C11 antibody or cold VEGF ₁₆₅ protein were mixed with a fixed amount of ¹²⁵ I-labeled VEGF ₁₆₅ and added to a 96-well microtiter plate coated with KDR receptor. Plates are incubated at room temperature for 2 hours, washed 5 times, and labeled with radiolabeled VEGF ₁₆₅ bound to immobilized KDR receptor.
Was counted. The concentration of c-p1C11 and cold VEGF ₁₆₅ required to block 50% of the binding of radiolabeled VEGF to the immobilized KDR receptor was determined.

【００８８】 放射能標識化ＶＥＧＦ₁₆₅の結合の抑制の結果を、図８に示す。示されたデー
タは３回測定の平均である。ｃ−ｐ１Ｃ１１は、用量依存性様式で固定化ＫＤＲ
受容体との結合のために¹²⁵Ｉ標識化ＶＥＧＦと効率的に競合することが示され
ている。予測通り、ＥＧＦ受容体に対して向けられるキメラ抗体であるＣ２２５
は、ＫＤＲ受容体と結合しないか、またはＶＥＧＦ−ＫＤＲ相互作用を遮断しな
い（示されていない）。FIG. 8 shows the results of suppression of the binding of radiolabeled VEGF ₁₆₅ . The data shown is the average of three measurements. c-p1C11 has immobilized KDR in a dose dependent manner.
It has been shown to compete effectively with ¹²⁵ I-labeled VEGF for binding to the receptor. As expected, C225, a chimeric antibody directed against the EGF receptor
Does not bind to the KDR receptor or block VEGF-KDR interaction (not shown).

【００８９】 実施例Ｖ（ｅ）．リン酸化検定 実験の24〜48時間前に、増殖因子欠失化ＥＢＭ−２培地中で亜集密的ＨＵＶＥ
Ｃ細胞を増殖させた。50 nMオルトバナジン酸ナトリウムで30分間予備処理後、
細胞を抗体の存在下または不存在下で15分間インキュベートし、その後、室温で
さらに15分間、20 ng/mlのＶＥＧＦ₁₆₅または10 ng/mlのＦＯＦを用いて刺激し
た。次に細胞を溶解緩衝液（50 nMトリス、150 mMＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、2
mMのＥＤＴＡ、0.25％のデオキシコール酸ナトリウム、1 mMＰＭＳＦ、1 ug/ml
のロイペプチン、1 ug/mlのペプスタチン、10 ug/mlのアプロチニン、ｐＨ7.5）
中で溶解し、細胞溶解物をＫＤＲおよびＭＡＰキナーゼリン酸化検定のために用
いた。抗ＫＤＲ抗体、Ｍａｂ4.13（ImClone Systems）とカップリングさせたプ
ロテインＡセファロースビーズ（Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA）を用い
て、ＫＤＲ受容体を細胞溶解物から免疫沈降させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分解させて、ウエスタンブロット分析を施した。ＫＤＲリン酸化を検出す
るために、抗ホスホチロシンＭａｂ、ＰＹ２０（ICN Biomecicals, Inc. Aurora
, OH）を用いてブロットをプローブした。ＭＡＰキナーゼ活性検定のために、細
胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、その後、ホスホ特異的ＭＡＰキナーゼ抗
体（New England BioLabs, Beverly, MA）を用いて、ウエスタンブロット分析を
実施した。シグナルはすべて、ＥＣＬ（Amersham, Arlington Heights, IL）を
用いて検出した。両検出では、ブロットをポリクローナル抗ＫＤＲ抗体（ImClon
e Systems）で再プローブして、等量のタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各
レーンに負荷されたことを保証した。Example V (e). Phosphorylation Assay 24-48 hours before the experiment, subconfluent HUVE in growth factor deficient EBM-2 medium.
C cells were expanded. After pre-treatment with 50 nM sodium orthovanadate for 30 minutes,
Cells were incubated for 15 minutes in the presence or absence of antibody, and then stimulated for another 15 minutes at room temperature with 20 ng / ml VEGF ₁₆₅ or 10 ng / ml FOF. The cells were then lysed in lysis buffer (50 nM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 2
mM EDTA, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM PMSF, 1 ug / ml
Leupeptin, 1 ug / ml pepstatin, 10 ug / ml aprotinin, pH 7.5)
And lysates were used for KDR and MAP kinase phosphorylation assays. KDR receptors were immunoprecipitated from cell lysates using Protein A Sepharose beads (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA) coupled to the anti-KDR antibody, Mab 4.13 (ImClone Systems). Protein was converted to SDS-PA
After digestion with GE, Western blot analysis was performed. To detect KDR phosphorylation, anti-phosphotyrosine Mab, PY20 (ICN Biomecicals, Inc. Aurora)
, OH). For MAP kinase activity assays, cell lysates were digested on SDS-PAGE, followed by Western blot analysis using a phospho-specific MAP kinase antibody (New England BioLabs, Beverly, MA). All signals were detected using ECL (Amersham, Arlington Heights, IL). For both detections, blots were analyzed using polyclonal anti-KDR antibody (ImClon
e-systems) to ensure that equal amounts of protein were loaded on each lane of the SDS-PAGE gel.

【００９０】 ｃ−ｐ１Ｃ１１は、ＫＤＲ受容体のＶＥＧＦ刺激性リン酸化およびｐ４４／ｐ
４２ＭＡＰキナーゼの活性化を効果的に抑制する。これに対比して、Ｃ２２５は
、ＫＤＲ受容体およびＭＡＰキナーゼのＶＥＧＦ刺激性活性化のいかなる抑制も
示さない。ｃ−Ｐ１Ｃ１１またはＣ２２５単独は、ＫＤＲ受容体およびｐ４４／
ｐ４２ＭＡＰキナーゼの活性にいかなる作用も及ぼさない。ｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１
１に関して以前に観察されたように、ｃ−ｐ１Ｃ１１はｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキ
ナーゼのＦＧＦ刺激性活性化を抑制しない（示されていない）。さらに、ｓｃＦ
ｖ ｐ２Ａ６またはキメラＩｇＧ継代のｐ２Ａ６（ｃ−ｐ２Ａ６）は、ＫＤＲ受
容体およびＭＡＰキナーゼのＶＥＧＦ刺激性活性化を抑制しない（示されていな
い）。C-p1C11 shows VEGF-stimulated phosphorylation of KDR receptor and p44 / p
Effectively inhibits 42 MAP kinase activation. In contrast, C225 does not show any inhibition of VEGF-stimulated activation of KDR receptor and MAP kinase. c-P1C11 or C225 alone is not a KDR receptor and p44 /
It has no effect on the activity of p42MAP kinase. scFv p1C1
As previously observed for 1, c-p1C11 does not suppress FGF-stimulated activation of p44 / p42 MAP kinase (not shown). Furthermore, scF
vp2A6 or p2A6 at chimeric IgG passage (c-p2A6) does not suppress VEGF-stimulated activation of KDR receptor and MAP kinase (not shown).

【００９１】 実施例Ｖ（ｆ）．抗マイトジェン検定 ＨＵＶＥＣを用いた［³Ｈ］−ＴｄＲ ＤＮＡ組み込み検定により、ヒト内皮
細胞のＶＥＧＦ刺激有糸***誘発に及ぼす抗ＫＤＲ抗体の作用を確定した。ＨＵ
ＶＥＣ（5 x 10³細胞／ウエル）を、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦを含有し
ない200 ulのＥＢＭ−２培地中の96ウエル組織培養プレート上に載せて、37℃で
72時間インキュベートした。種々の量の抗体を同一の２つのウエルに付加して、
37℃で1時間予備インキュベートし、その後、ＶＥＧＦ₁₆₅を付加して、最終濃度
を16 ng/mlとした。18時間のインキュベーション後、0.25μCiの［³Ｈ］−Ｔｄ
Ｒ（Amersham）を各ウエルに付加し、さらに4時間インキュベートした。ＤＮＡ
組み込み放射能をシンチレーション計数器で確定した。図９に示したデータは、
少なくとも３つの別々の実験の代表的なものである。Embodiment V (f). By using anti-mitogenic assay HUVEC ^[3 H] -TdR DNA incorporation assay was determined the effect of anti-KDR antibodies on VEGF-stimulated mitogenesis of human endothelial cells. HU
VECs (5 × 10 ³ cells / well) were plated on 96-well tissue culture plates in 200 ul of EBM-2 medium without VEGF, bFGF or EGF at 37 ° C.
Incubated for 72 hours. Different amounts of antibody were added to the same two wells,
Preincubation for 1 hour at 37 ° C., after which VEGF ₁₆₅ was added to a final concentration of 16 ng / ml. After 18 hours of incubation, 0.25 μCi of [ ³ H] -Td
R (Amersham) was added to each well and incubated for a further 4 hours. DNA
Built-in radioactivity was determined with a scintillation counter. The data shown in FIG.
Representative of at least three separate experiments.

【００９２】 ｃ−ｐ１Ｃ１１およびｓｃＦｖ ｐ１Ｃ１１はともに、ＶＥＧＦにより刺激さ
れたＨＵＶＥＣの有糸***誘発を有効に抑制する（図９）。ｃ−ｐ１Ｃ１１は、
親ｓｃＦｖより強力な、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘導性有糸***誘発の阻害剤であ
る。ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘導性有糸***誘発の50％を抑制するのに必要な抗体
濃度は、それぞれｃ−ｐ１Ｃ１１に関しては0.8 nM、ならびにｓｃＦｖに関して
は6 nMである。予測通り、ｓｃＦｖ ｐ２Ａ６は、ＶＥＧＦ刺激性内皮細胞増殖
に及ぼすいかなる抑制作用も示さない。Both c-p1C11 and scFv p1C11 effectively suppress the mitogenesis of HUVECs stimulated by VEGF (FIG. 9). c-p1C11 is
It is a more potent inhibitor of VEGF-induced mitogenesis of HUVEC than the parent scFv. The antibody concentrations required to suppress 50% of VEGF-induced mitogenesis of HUVEC are 0.8 nM for c-p1C11 and 6 nM for scFv, respectively. As expected, scFv p2A6 does not show any inhibitory effects on VEGF-stimulated endothelial cell proliferation.

【００９３】[0093]

【表１】 [Table 1]

【００９４】[0094]

【表２】 [Table 2]

【００９５】[0095]

【表３】 [Table 3]

【００９６】[0096]

【表４】 [Table 4]

【００９７】[0097]

【表５】 [Table 5]

【００９８】[0098]

【表６】 [Table 6]

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は、固定化ＫＤＲとの異なるｓｃＦｖ抗体（ｐ１Ｃ１１、ｐ１Ｆ１２、ｐ
２Ａ６およびｐ２Ａ７）の直接結合を示すグラフである。FIG. 1 shows that different scFv antibodies (p1C11, p1F12, p1
2 is a graph showing the direct binding of 2A6 and p2A7).

【図２】 図２は、異なるｓｃＦｖ抗体（ｐ１Ｃ１１、ｐ１Ｆ１２、ｐ２Ａ６およびｐ２
Ａ７）による固定化ＶＥＧＦ₁₆₅とのＫＤＲの結合の抑制を示すグラフである。FIG. 2 shows that different scFv antibodies (p1C11, p1F12, p2A6 and p2
It is a graph which shows suppression of the binding of KDR with immobilized VEGF ₁₆₅ by A7).

【図３】 図３は、ｓｃＦｖ抗体（ｐ２Ａ６およびｐ１Ｃ１１）によるＶＥＧＦ誘導ＨＵ
ＶＥＣ増殖の抑制を示すグラフである。FIG. 3. VEGF-induced HU by scFv antibodies (p2A6 and p1C11).
It is a graph which shows suppression of VEC proliferation.

【図４】 図４は、ｃ−ｐ１Ｃ１１のＶ_HおよびＶ_L鎖のヌクレオチドおよび推定アミノ酸
配列である。FIG. 4 is the nucleotide and deduced amino acid sequence of the V _H and V _L chains of c-p1C11.

【図５】 図５は、固定化ＫＤＲとの抗体（ｃ−ｐ１Ｃ１１、ｐ１ｃ１１、ｐ２Ａ６）の
直接結合を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing direct binding of antibodies (c-p1C11, p1c11, p2A6) to immobilized KDR.

【図６】 図６は、ＫＤＲ発現ＨＵＶＥＣと結合するｃ−ｐ１Ｃ１１のＦＡＣＳ分析を示
すグラフである。FIG. 6 is a graph showing FACS analysis of c-p1C11 binding to KDR-expressing HUVEC.

【図７】 図７は、異なるｓｃＦｖ抗体（ｃ−ｐ１Ｃ１１、ｐ１Ｃ１１、ｐ２Ａ６）によ
る固定化ＶＥＧＦ₁₆₅とのＫＤＲ受容体の結合の抑制を示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing suppression of KDR receptor binding to immobilized VEGF ₁₆₅ by different scFv antibodies (c-p1C11, p1C11, p2A6).

【図８】 図８は、ｃ−ｐ１Ｃ１１および冷ＶＥＧＦ₁₆₅による固定化ＫＤＲ受容体との
放射能標識化ＶＥＧＦ₁₆₅の結合の抑制を示すグラフである。Figure 8 is a graph showing the inhibition of binding of radiolabeled VEGF ₁₆₅ to immobilized KDR receptor by c-p1C11 and cold VEGF _165.

【図９】 図９は、抗ＫＤＲ抗体（ｃ−ｐ１Ｃ１１、ｐ１Ｃ１１）によるＶＥＧＦ誘導性
ＨＵＶＥＣ増殖の抑制を示すグラフである。FIG. 9 is a graph showing suppression of VEGF-induced HUVEC proliferation by anti-KDR antibodies (c-p1C11, p1C11).

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成１３年８月１３日（２００１．８．１３）[Submission date] August 13, 2001 (2001.8.13)

【手続補正２】[Procedure amendment 2]

【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing

【補正対象項目名】図１[Correction target item name] Fig. 1

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図１】 FIG.

【手続補正３】[Procedure amendment 3]

【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing

【補正対象項目名】図２[Correction target item name] Figure 2

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図２】 FIG. 2

【手続補正４】[Procedure amendment 4]

【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing

【補正対象項目名】図３[Correction target item name] Figure 3

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図３】 FIG. 3

【手続補正５】[Procedure amendment 5]

【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing

【補正対象項目名】図４[Correction target item name] Fig. 4

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図４】 FIG. 4

【手続補正６】[Procedure amendment 6]

【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing

【補正対象項目名】図５[Correction target item name] Fig. 5

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図５】 FIG. 5

【手続補正７】[Procedure amendment 7]

【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing

【補正対象項目名】図６[Correction target item name] Fig. 6

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図６】 FIG. 6

【手続補正８】[Procedure amendment 8]

【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing

【補正対象項目名】図７[Correction target item name] Fig. 7

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図７】 FIG. 7

【手続補正９】[Procedure amendment 9]

【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing

【補正対象項目名】図８[Correction target item name] Fig. 8

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図８】 FIG. 8

【手続補正１０】[Procedure amendment 10]

【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing

【補正対象項目名】図９[Correction target item name] Fig. 9

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正の内容】[Contents of correction]

【図９】 FIG. 9

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/46 16/46 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA61 CA04 CA10 GA11 HA03 4B064 AG26 CA19 CC24 DA01 4C085 AA13 BB33 BB34 BB35 BB36 BB37 BB41 BB42 BB43 CC32 DD62 EE01 GG01 4H045 AA11 AA20 AA30 BA40 CA40 DA50 EA28 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C07K 16/28 C07K 16/46 16/46 C12P 21/02 C C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA (81 ) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW) ), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, B , CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG , SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZWF terms (reference) 4B024 AA01 BA61 CA04 CA10 GA11 HA03 4B064 AG26 CA19 CC24 DA01 4C085 AA13 BB33 BB34 BB35 BB36 BB37 BB41 BB42 BB43 CC32 DD62 EE01 GG01 4H045 AA11 AA20 AA30 BA40 CA40 DA50 EA28 FA74

Claims (61)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合し、Ｋ
ＤＲの活性化を中和する免疫グロブリン分子。1. A method for binding to KDR having an affinity comparable to human VEGF,
An immunoglobulin molecule that neutralizes DR activation. 【請求項２】 一本鎖抗体、ジアボディ、トリアボディまたは抗体から成る
群から選択される請求項１の免疫グロブリン分子。2. The immunoglobulin molecule of claim 1 selected from the group consisting of a single chain antibody, a diabody, a triabody or an antibody. 【請求項３】 ＫＤＲの活性化を中和する一本鎖抗体であって、以下の： 配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、 配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２および 配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、 を含む少なくとも１つの可変重鎖断片、ならびに 配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、 配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２および 配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、 を含む少なくとも１つの可変軽鎖断片を含む一本鎖抗体。3. A single-chain antibody that neutralizes the activation of KDR, comprising: CDRH1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, CDRH2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: At least one variable heavy chain fragment comprising CDRH3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; CDRL1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4; CDRL2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5; and SEQ ID NO: 6 A single chain antibody comprising at least one variable light chain fragment comprising: 【請求項４】 ＫＤＲの活性化を中和する一本鎖抗体であって、以下の： 配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変重鎖断片お
よび 配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変軽鎖断片 を含む一本鎖抗体。4. A single chain antibody that neutralizes KDR activation, comprising: at least one variable heavy chain fragment having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 A single chain antibody comprising at least one variable light chain fragment having 【請求項５】 請求項３の一本鎖抗体をコードする核酸分子。5. A nucleic acid molecule encoding the single chain antibody according to claim 3. 【請求項６】 以下の： 配列番号９で示されるＣＤＲＨ１をコードする核酸配列、 配列番号１０で示されるＣＤＲＨ２をコードする核酸配列、 配列番号１１で示されるＣＤＲＨ３をコードする核酸配列、 配列番号１２で示されるＣＤＲＬ１をコードする核酸配列、 配列番号１３で示されるＣＤＲＬ２をコードする核酸配列および 配列番号１４で示されるＣＤＲＬ３をコードする核酸配列 から成る請求項５の核酸分子。6. A nucleic acid sequence encoding CDRH1 represented by SEQ ID NO: 9, a nucleic acid sequence encoding CDRH2 represented by SEQ ID NO: 10, a nucleic acid sequence encoding CDRH3 represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 The nucleic acid molecule according to claim 5, comprising a nucleic acid sequence encoding CDRL1 represented by SEQ ID NO: 13, a nucleic acid sequence encoding CDRL2 represented by SEQ ID NO: 13, and a nucleic acid sequence encoding CDRL3 represented by SEQ ID NO: 14. 【請求項７】 請求項４の一本鎖抗体をコードする核酸分子。7. A nucleic acid molecule encoding a single-chain antibody according to claim 4. 【請求項８】 以下の： 配列番号１５で示される可変重鎖断片をコードする核酸配列および 配列番号１６で示される可変軽鎖断片をコードする核酸配列 から成る請求項７の核酸分子。8. The nucleic acid molecule of claim 7, comprising: a nucleic acid sequence encoding a variable heavy chain fragment set forth in SEQ ID NO: 15 and a nucleic acid sequence encoding a variable light chain fragment set forth in SEQ ID NO: 16. 【請求項９】 可変重鎖断片および可変軽鎖断片が少なくとも１つのペプチ
ドリンカーにより共有結合される請求項３の一本鎖抗体。9. The single chain antibody of claim 3, wherein the variable heavy and light chain fragments are covalently linked by at least one peptide linker. 【請求項１０】 ペプチドリンカーが少なくとも１５個のアミノ酸を含む請
求項９の一本鎖抗体。10. The single chain antibody according to claim 9, wherein the peptide linker comprises at least 15 amino acids. 【請求項１１】 ペプチドリンカーが配列番号１７で示されるアミノ酸配列
を含む請求項９の一本鎖抗体。11. The single-chain antibody according to claim 9, wherein the peptide linker comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17. 【請求項１２】 請求項１１のペプチドリンカーをコードする核酸分子。12. A nucleic acid molecule encoding the peptide linker of claim 11. 【請求項１３】 配列番号１８で示されるペプチドリンカーをコードする核
酸配列から成る請求項１２の核酸分子。13. The nucleic acid molecule of claim 12, consisting of a nucleic acid sequence encoding a peptide linker set forth in SEQ ID NO: 18. 【請求項１４】 ＫＤＲの活性化を中和するジアボディであって、以下の： 配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、 配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２および 配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、 を含む少なくとも１つの可変重鎖断片、ならびに 配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、 配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２および 配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、 を含む少なくとも１つの可変軽鎖断片を含むジアボディ。14. A diabody that neutralizes the activation of KDR, comprising: CDRH1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, CDRH2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3. At least one variable heavy chain fragment comprising: CDRH3 having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, CDRL1 having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, CDRL2 having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 A diabody comprising at least one variable light chain fragment comprising: CDRL3 having: 【請求項１５】 ＫＤＲの活性化を中和するジアボディであって、以下の： 配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する可変重鎖断片および 配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖断片 を含むジアボディ。15. A diabody that neutralizes KDR activation, comprising: a variable heavy chain fragment having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a variable light chain fragment having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 Including diabodies. 【請求項１６】 請求項１４のジアボディをコードする核酸分子。16. A nucleic acid molecule encoding the diabody of claim 14. 【請求項１７】 以下の： 配列番号９で示されるＣＤＲＨ１をコードする核酸配列、 配列番号１０で示されるＣＤＲＨ２をコードする核酸配列、 配列番号１１で示されるＣＤＲＨ３をコードする核酸配列、 配列番号１２で示されるＣＤＲＬ１をコードする核酸配列、 配列番号１３で示されるＣＤＲＬ２をコードする核酸配列および 配列番号１４で示されるＣＤＲＬ３をコードする核酸配列 から成る請求項１６の核酸分子。17. A nucleic acid sequence encoding CDRH1 represented by SEQ ID NO: 9, a nucleic acid sequence encoding CDRH2 represented by SEQ ID NO: 10, a nucleic acid sequence encoding CDRH3 represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 The nucleic acid molecule according to claim 16, comprising a nucleic acid sequence encoding CDRL1 represented by SEQ ID NO: 13, a nucleic acid sequence encoding CDRL2 represented by SEQ ID NO: 13, and a nucleic acid sequence encoding CDRL3 represented by SEQ ID NO: 14. 【請求項１８】 請求項１５のジアボディをコードする核酸分子。18. A nucleic acid molecule encoding the diabody of claim 15. 【請求項１９】 以下の： 配列番号１５で示される可変重鎖断片をコードする核酸配列および 配列番号１６で示される可変軽鎖断片をコードする核酸配列 から成る請求項１８の核酸分子。19. The nucleic acid molecule of claim 18, comprising: a nucleic acid sequence encoding a variable heavy chain fragment set forth in SEQ ID NO: 15 and a nucleic acid sequence encoding a variable light chain fragment set forth in SEQ ID NO: 16. 【請求項２０】 可変重鎖断片および可変軽鎖断片が少なくとも１つのペプ
チドリンカーにより共有結合される請求項１４のジアボディ。20. The diabody of claim 14, wherein the variable heavy and light chain fragments are covalently linked by at least one peptide linker. 【請求項２１】 ペプチドリンカーが少なくとも５個のアミノ酸および１０
個以下のアミノ酸を含む請求項２０のジアボディ。21. The peptide linker comprising at least 5 amino acids and 10
21. The diabody of claim 20, comprising up to amino acids. 【請求項２２】 ペプチドリンカーが配列番号１９で示されるアミノ酸配列
を含む請求項２１のジアボディ。22. The diabody of claim 21, wherein the peptide linker comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19. 【請求項２３】 請求項２２のペプチドリンカーをコードする核酸分子。23. A nucleic acid molecule encoding the peptide linker of claim 22. 【請求項２４】 配列番号２０で示されるペプチドリンカーをコードする核
酸配列から成る請求項２３の核酸分子。24. The nucleic acid molecule of claim 23, comprising a nucleic acid sequence encoding a peptide linker set forth in SEQ ID NO: 20. 【請求項２５】 前記ジアボディが単一特異性である請求項１４のジアボデ
ィ。25. The diabody of claim 14, wherein said diabody is monospecific. 【請求項２６】 前記ジアボディが二重特異性であり、ＫＤＲ上の少なくと
も１つのエピトープと結合する請求項１４のジアボディ。26. The diabody of claim 14, wherein said diabody is bispecific and binds at least one epitope on KDR. 【請求項２７】 ＫＤＲの活性化を中和するトリアボディであって、以下の
： 配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、 配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２および 配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、 を含む少なくとも１つの可変重鎖断片、ならびに 配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、 配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２および 配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、 を含む少なくとも１つの可変軽鎖断片を含むトリアボディ。27. A triabody that neutralizes KDR activation, comprising: CDRH1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, CDRH2 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3. At least one variable heavy chain fragment comprising: CDRH3 having the amino acid sequence shown; and CDRL1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, CDRL2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and amino acid represented by SEQ ID NO: 6. A triabody comprising at least one variable light chain fragment comprising: CDRL3 having the sequence: 【請求項２８】 ＫＤＲの活性化を中和するトリアボディであって、以下の
： 配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変重鎖断片お
よび 配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの可変軽鎖断片 を含むトリアボディ。28. A tribody that neutralizes KDR activation, comprising: at least one variable heavy chain fragment having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 A triabody comprising at least one variable light chain fragment. 【請求項２９】 請求項２７のトリアボディをコードする核酸分子。29. A nucleic acid molecule encoding the triabody of claim 27. 【請求項３０】 以下の： 配列番号９で示されるＣＤＲＨ１をコードする核酸配列、 配列番号１０で示されるＣＤＲＨ２をコードする核酸配列、 配列番号１１で示されるＣＤＲＨ３をコードする核酸配列、 配列番号１２で示されるＣＤＲＬ１をコードする核酸配列、 配列番号１３で示されるＣＤＲＬ２をコードする核酸配列および 配列番号１４で示されるＣＤＲＬ３をコードする核酸配列 から成る請求項２９の核酸分子。30. A nucleic acid sequence encoding CDRH1 represented by SEQ ID NO: 9, a nucleic acid sequence encoding CDRH2 represented by SEQ ID NO: 10, a nucleic acid sequence encoding CDRH3 represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 The nucleic acid molecule according to claim 29, comprising a nucleic acid sequence encoding CDRL1 represented by SEQ ID NO: 13, a nucleic acid sequence encoding CDRL2 represented by SEQ ID NO: 13, and a nucleic acid sequence encoding CDRL3 represented by SEQ ID NO: 14. 【請求項３１】 請求項２８のトリアボディをコードする核酸分子。31. A nucleic acid molecule encoding the triabody of claim 28. 【請求項３２】 以下の： 配列番号１５で示される可変重鎖断片をコードする核酸配列および 配列番号１６で示される可変軽鎖断片をコードする核酸配列 から成る請求項３１の核酸分子。32. The nucleic acid molecule of claim 31, comprising: a nucleic acid sequence encoding a variable heavy chain fragment set forth in SEQ ID NO: 15 and a nucleic acid sequence encoding a variable light chain fragment set forth in SEQ ID NO: 16. 【請求項３３】 前記トリアボディが単一特異性である請求項２７のトリア
ボディ。33. The triabody of claim 27, wherein said triabody is monospecific. 【請求項３４】 前記ジアボディが二重特異性であり、ＫＤＲ上の少なくと
も１つのエピトープと結合する請求項２７のトリアボディ。34. The triabody of claim 27, wherein said diabody is bispecific and binds at least one epitope on KDR. 【請求項３５】 前記トリアボディが三重特異性であり、ＫＤＲ上の少なく
とも１つのエピトープと結合する請求項２７のトリアボディ。35. The triabody of claim 27, wherein said triabody is trispecific and binds at least one epitope on KDR. 【請求項３６】 ＫＤＲの活性化を中和する抗体であって、以下の： 配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、 配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２および 配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、 を含む少なくとも１つの可変重鎖断片、ならびに 配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、 配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２および 配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３、 を含む少なくとも１つの可変軽鎖断片を含む抗体。36. An antibody that neutralizes KDR activation, comprising: CDRH1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, CDRH2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and CDRH2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. At least one variable heavy chain fragment comprising: CDRH3 having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, CDRL1 having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, CDRL2 having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 An antibody comprising at least one variable light chain fragment comprising: CDRL3 having: 【請求項３７】 ＫＤＲの活性化を中和する抗体であって、以下の： 配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する可変重鎖断片および 配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖断片 を含む抗体。37. An antibody that neutralizes KDR activation, comprising: a variable heavy chain fragment having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a variable light chain fragment having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 Antibodies. 【請求項３８】 以下の： 配列番号９で示されるＣＤＲＨ１をコードする核酸配列、 配列番号１０で示されるＣＤＲＨ２をコードする核酸配列、 配列番号１１で示されるＣＤＲＨ３をコードする核酸配列、 配列番号１２で示されるＣＤＲＬ１をコードする核酸配列、 配列番号１３で示されるＣＤＲＬ２をコードする核酸配列および 配列番号１４で示されるＣＤＲＬ３をコードする核酸配列 を含むＫＤＲの活性化を中和する抗体をコードする核酸分子。38. A nucleic acid sequence encoding CDRH1 represented by SEQ ID NO: 9, a nucleic acid sequence encoding CDRH2 represented by SEQ ID NO: 10, a nucleic acid sequence encoding CDRH3 represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 Nucleic acid sequence encoding CDRL1 represented by SEQ ID NO: 13, nucleic acid sequence encoding CDRL2 represented by SEQ ID NO: 13 and nucleic acid sequence encoding CDRL3 represented by SEQ ID NO: 14 Nucleic acid encoding an antibody that neutralizes KDR activation molecule. 【請求項３９】 以下の： 配列番号１５で示される可変重鎖断片をコードする核酸配列および 配列番号１６で示される可変軽鎖断片をコードする核酸配列 を含むＫＤＲの活性化を中和する抗体をコードする核酸分子。39. An antibody that neutralizes KDR activation, comprising: a nucleic acid sequence encoding a variable heavy chain fragment represented by SEQ ID NO: 15 and a nucleic acid sequence encoding a variable light chain fragment represented by SEQ ID NO: 16. A nucleic acid molecule that encodes 【請求項４０】 請求項３６の抗体を含むキメラ化抗体。40. A chimeric antibody comprising the antibody of claim 36. 【請求項４１】 請求項３６の抗体を含むヒト化抗体。41. A humanized antibody comprising the antibody of claim 36. 【請求項４２】 ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合し、
ＫＤＲの活性化を中和する免疫グロブリンの製造方法であって、以下の： 免疫グロブリン分子をコードする核酸配列を宿主細胞中に挿入し、そして その核酸配列を発現する ことを含む方法。42. Binds to KDR having an affinity comparable to human VEGF,
A method of producing an immunoglobulin that neutralizes the activation of KDR, comprising: inserting a nucleic acid sequence encoding an immunoglobulin molecule into a host cell and expressing the nucleic acid sequence. 【請求項４３】 ＫＤＲの活性化の中和方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効な量の免疫グ
ロブリン分子を哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。43. A method of neutralizing KDR activation, comprising: administering to a mammal an effective amount of an immunoglobulin molecule that binds KDR having an affinity comparable to human VEGF; A method comprising neutralizing activation. 【請求項４４】 腫瘍増殖の低減方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量の免疫グロ
ブリン分子を哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。44. A method of reducing tumor growth, comprising: administering to a mammal an effective amount of an immunoglobulin molecule that binds KDR having an affinity comparable to human VEGF, and activating KDR. A method that includes summing. 【請求項４５】 新血管形成の抑制方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量の免疫グロ
ブリン分子を哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。45. A method of inhibiting neovascularization, comprising: administering to a mammal an effective amount of an immunoglobulin molecule that binds to KDR having an affinity comparable to human VEGF, and activating KDR. A method comprising neutralizing. 【請求項４６】 ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合し、
ＫＤＲの活性化を中和する一本鎖抗体の製造方法であって、以下の： 一本鎖抗体をコードする核酸配列を宿主細胞中に挿入し、そして その核酸配列を発現する ことを含む方法。46. Binding to KDR having an affinity comparable to human VEGF,
A method of producing a single-chain antibody that neutralizes KDR activation, comprising: inserting a nucleic acid sequence encoding a single-chain antibody into a host cell and expressing the nucleic acid sequence. . 【請求項４７】 ＫＤＲの活性化の中和方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量の一本鎖抗
体を哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。47. A method of neutralizing KDR activation, comprising: administering to a mammal an effective amount of a single-chain antibody that binds KDR having an affinity comparable to human VEGF; A method comprising neutralizing activation. 【請求項４８】 腫瘍増殖の低減方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量の一本鎖抗
体を哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。48. A method of reducing tumor growth, comprising: administering to a mammal an effective amount of a single chain antibody that binds KDR having an affinity comparable to human VEGF, and activating KDR. A method comprising neutralizing. 【請求項４９】 新血管形成の抑制方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量の一本鎖抗
体を哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。49. A method of inhibiting neovascularization, comprising: administering to a mammal an effective amount of a single chain antibody that binds KDR having an affinity comparable to human VEGF, and activating KDR. A method comprising neutralizing 【請求項５０】 ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合し、
ＫＤＲの活性化を中和するジアボディの製造方法であって、以下の： ジアボディをコードする核酸配列を宿主細胞中に挿入し、そして その核酸配列を発現する ことを含む方法。50. A binding to KDR having an affinity comparable to human VEGF,
A method for producing a diabody that neutralizes the activation of KDR, comprising: inserting a nucleic acid sequence encoding a diabody into a host cell and expressing the nucleic acid sequence. 【請求項５１】 ＫＤＲの活性化の中和方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量のジアボデ
ィを哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。51. A method of neutralizing KDR activation, comprising: administering to a mammal an effective amount of a diabody that binds KDR having an affinity comparable to human VEGF, and activating KDR. A method comprising neutralizing. 【請求項５２】 腫瘍増殖の低減方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する有効量のジアボディ
を哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。52. A method of reducing tumor growth, comprising: administering to a mammal an effective amount of a diabody that binds KDR with an affinity comparable to human VEGF, and neutralizing KDR activation. A method that includes 【請求項５３】 新血管形成の抑制方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量のジアボデ
ィを哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。53. A method of inhibiting neovascularization, comprising: administering to a mammal an effective amount of a diabody that binds KDR with an affinity comparable to human VEGF and neutralizes KDR activation. A method that includes: 【請求項５４】 ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合し、
ＫＤＲの活性化を中和するトリアボディの製造方法であって、以下の： トリアボディをコードする核酸配列を宿主細胞中に挿入し、そして その核酸配列を発現する ことを含む方法。54. Binding to KDR having an affinity comparable to human VEGF,
A method for producing a triabody that neutralizes the activation of KDR, comprising: inserting a nucleic acid sequence encoding a triabody into a host cell and expressing the nucleic acid sequence. 【請求項５５】 ＫＤＲの活性化の中和方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量のトリアボ
ディを哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。55. A method of neutralizing KDR activation, comprising: administering to a mammal an effective amount of a triabody that binds KDR having an affinity comparable to human VEGF, and activating KDR. A method comprising neutralizing 【請求項５６】 腫瘍増殖の低減方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する有効量のトリアボデ
ィを哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。56. A method of reducing tumor growth, comprising: administering to a mammal an effective amount of a triabody that binds KDR with an affinity comparable to human VEGF, and neutralizes KDR activation. A method that includes: 【請求項５７】 新血管形成の抑制方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量のトリアボ
ディを哺乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。57. A method of inhibiting neovascularization, comprising: administering to a mammal an effective amount of a triabody that binds KDR having an affinity comparable to human VEGF, and wherein the activation of KDR is moderated. A method that includes summing. 【請求項５８】 ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合し、
ＫＤＲの活性化を中和する抗体の製造方法であって、以下の： 抗体をコードする核酸配列を宿主細胞中に挿入し、そして その核酸配列を発現する ことを含む方法。58. Binding to KDR having an affinity comparable to human VEGF,
A method for producing an antibody that neutralizes KDR activation, comprising: inserting a nucleic acid sequence encoding an antibody into a host cell and expressing the nucleic acid sequence. 【請求項５９】 ＫＤＲの活性化の中和方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量の抗体を哺
乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。59. A method of neutralizing KDR activation, comprising: administering to a mammal an effective amount of an antibody that binds KDR with an affinity comparable to human VEGF, and activating KDR. A method comprising neutralizing. 【請求項６０】 腫瘍増殖の低減方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量の抗体を哺
乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。60. A method of reducing tumor growth, comprising: administering to a mammal an effective amount of an antibody that binds to KDR with an affinity comparable to human VEGF, and neutralizes KDR activation. A method that includes: 【請求項６１】 新血管形成の抑制方法であって、以下の： ヒトＶＥＧＦに匹敵する親和性を有するＫＤＲと結合する、有効量の抗体を哺
乳類に投与し、そして ＫＤＲの活性化を中和する ことを含む方法。61. A method of inhibiting neovascularization, comprising: administering to a mammal an effective amount of an antibody that binds KDR with an affinity comparable to human VEGF, and neutralizes KDR activation. A method that includes: