JP2002534058A - 脈管内皮成長因子レセプタ一2タンパクの修飾方法およびその使用方法 - Google Patents
脈管内皮成長因子レセプタ一2タンパクの修飾方法およびその使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】脈管内皮成長因子レセプタ一2、つまり、VEGFレセプタ一2の触媒キナ−ゼ領域の主要部分をクロ−ニング、配列解析ならびにX線結晶学的手法によって単離する方法を提供すること。
【解決手段】脈管内皮成長因子レセプタ一2(VEGFR2/KDR)の触媒キナ−ゼ領域を含む2.4ナ結晶構造のタンパク構築物、つまり、血管形成のキ−酵素は、非リガンドのリン酸化状態で存在する。このタンパク構築物は、修飾触媒リンカ−を含み、KID全体を含む構築物に匹敵するインビトロキナ−ゼ活性を有する。得られた構築物は、野生型のKIDに匹敵するインビトロキナ−ゼ活性を保持し、より重要なことは、そのタンパクは完全な結晶化ができ、X線結晶学的手法によって特徴付けることができることである。更に、X線結晶学的デ−タは、種々の疾患状態の治療に適用できる治療薬を同定ならびに構築するために使用することができる。
Description
【0001】
この発明は、脈管内皮成長因子レセプタ一2、つまり、VEGFR−2の触媒
キナ−ゼ領域の主要部分を、クロ−ニング、配列解析ならびにX線結晶学的手法
(クリスタログラフィ−)によって単離する方法に関する。この発明はまた、キ
ナ−ゼインサ−トドメイン(KID)と呼ばれる触媒領域範囲からの種々のアミ
ノ酸残基の欠失法に関する。得られたポリペプチドは、野生型KIDのキナ−ゼ
活性に匹敵する生体外(インビトロ)キナ−ゼ活性を保持していて、ポリペプチ
ドの触媒活性に対して必要ではない。さらに重要なことは、得られたポリペプチ
ドは、そのタンパクの完全な結晶化ができて、X線クリスタログラフィ−によっ
て特徴付けることができることである。さらに、この発明は、VEGFR-2に
関連する種々の疾患状態の治療において療法化合物の同定と構築に有用なX線結
晶学的デ−タに関する。
キナ−ゼ領域の主要部分を、クロ−ニング、配列解析ならびにX線結晶学的手法
(クリスタログラフィ−)によって単離する方法に関する。この発明はまた、キ
ナ−ゼインサ−トドメイン(KID)と呼ばれる触媒領域範囲からの種々のアミ
ノ酸残基の欠失法に関する。得られたポリペプチドは、野生型KIDのキナ−ゼ
活性に匹敵する生体外(インビトロ)キナ−ゼ活性を保持していて、ポリペプチ
ドの触媒活性に対して必要ではない。さらに重要なことは、得られたポリペプチ
ドは、そのタンパクの完全な結晶化ができて、X線クリスタログラフィ−によっ
て特徴付けることができることである。さらに、この発明は、VEGFR-2に
関連する種々の疾患状態の治療において療法化合物の同定と構築に有用なX線結
晶学的デ−タに関する。
【0002】
多くの生理学的出来事、たとえば、胚形成、臓器発達、発情、傷修復などには
、脈管の成長と再形成が必要である(Folkman et al., (1992) J. Biol. Chem. 2
67,10931−10934; Risau, W. (1995) FASEB J. 9, 9 26-933)。これらの有益な
方法に加えて、血管形成もまた腫瘍増殖、転移、乾癬、リウマチ様関節炎、黄斑
変性、網膜障害などの疾患状態の増殖に関与している(Pepper,M.S., (1996) V
asc. Med. 1, 259-266; Kuiper et al.,(1998) Pharmacol. Res. 37, 1−16,1
998; Kumar and Fidler, (1998) In Vivo 18, 27-34; Szekanecz et al., (1998
) J. Investig. Med . 46, 27-41; Tolentino and Adamis, (1988) Int. Ophtha
lmol. Clin. 38, 77-94)。脈管形成に影響を及ぼすことが知られているシグナ
ル経路のうち、これらの関与している脈管内皮成長因子(VEGF)は、脈管内皮細胞
にとって必須であり、選択的であることが示された(Dvorak et al., (1995) Am.
J. Path. 146, 1029-1039; Thomas, K.,(1996) Cell 271, 603-606; Ferrar a
N. and Davis-Smyth, (1997) Endocrine Rev. 18, 4-25) 。VEGF経路を阻
害する治療的潜在性は、種々のヒト腫瘍(Borgstrom et al., (1996) Cancer Res
. 56, 4032-4039)および虚血性網膜疾患 (Adamis et al., (1996) Arch. Ophtha
lmol. 114, 66-71)に対して活性な抗VEGFモノクロ−ナル抗体によって直接
示された。
、脈管の成長と再形成が必要である(Folkman et al., (1992) J. Biol. Chem. 2
67,10931−10934; Risau, W. (1995) FASEB J. 9, 9 26-933)。これらの有益な
方法に加えて、血管形成もまた腫瘍増殖、転移、乾癬、リウマチ様関節炎、黄斑
変性、網膜障害などの疾患状態の増殖に関与している(Pepper,M.S., (1996) V
asc. Med. 1, 259-266; Kuiper et al.,(1998) Pharmacol. Res. 37, 1−16,1
998; Kumar and Fidler, (1998) In Vivo 18, 27-34; Szekanecz et al., (1998
) J. Investig. Med . 46, 27-41; Tolentino and Adamis, (1988) Int. Ophtha
lmol. Clin. 38, 77-94)。脈管形成に影響を及ぼすことが知られているシグナ
ル経路のうち、これらの関与している脈管内皮成長因子(VEGF)は、脈管内皮細胞
にとって必須であり、選択的であることが示された(Dvorak et al., (1995) Am.
J. Path. 146, 1029-1039; Thomas, K.,(1996) Cell 271, 603-606; Ferrar a
N. and Davis-Smyth, (1997) Endocrine Rev. 18, 4-25) 。VEGF経路を阻
害する治療的潜在性は、種々のヒト腫瘍(Borgstrom et al., (1996) Cancer Res
. 56, 4032-4039)および虚血性網膜疾患 (Adamis et al., (1996) Arch. Ophtha
lmol. 114, 66-71)に対して活性な抗VEGFモノクロ−ナル抗体によって直接
示された。
【0003】 通常の脈管形成と血管形成は、胚形成、傷修復、臓器再形成や、***中の黄体
中での卵胞発達、妊娠後の胎盤成長などの女性生殖過程などの種々の生理学的過
程において重要な役割を果たしている(Folkman & Shing, 1992)。制御されない
脈管形成および/または血管形成は、糖尿病などの疾患や、成長のためには血管
新生に依存する悪性固形腫瘍にも関与している(Klagsburn & Soker,(1993) Cur
rent Biology 3(10): 699-702; Folkham, (1991) J. Natl. Cancer Inst. 82 :4
-6; Weidner,et al., (1991) New Engl. J. Med. 324:1-5)。
中での卵胞発達、妊娠後の胎盤成長などの女性生殖過程などの種々の生理学的過
程において重要な役割を果たしている(Folkman & Shing, 1992)。制御されない
脈管形成および/または血管形成は、糖尿病などの疾患や、成長のためには血管
新生に依存する悪性固形腫瘍にも関与している(Klagsburn & Soker,(1993) Cur
rent Biology 3(10): 699-702; Folkham, (1991) J. Natl. Cancer Inst. 82 :4
-6; Weidner,et al., (1991) New Engl. J. Med. 324:1-5)。
【0004】 インビトロでの内皮細胞成長促進活性を持つポリペプチドがいくつか同定され
ている。それらの例としては、酸性もしくは塩基性繊維芽細胞成長因子(FGF)、
脈管内皮成長因子 (VEGF)ならびに胎盤成長因子などが含まれる。FGFとは異
なって、VEGFは内皮細胞特異性***誘発因子であるとの報告が最近なされて
いる(Ferrara & Henzel, (1989) Biochem. Biop hys. Res. Comm. 161:851-858;
Vaisman et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:19461-19566)。
ている。それらの例としては、酸性もしくは塩基性繊維芽細胞成長因子(FGF)、
脈管内皮成長因子 (VEGF)ならびに胎盤成長因子などが含まれる。FGFとは異
なって、VEGFは内皮細胞特異性***誘発因子であるとの報告が最近なされて
いる(Ferrara & Henzel, (1989) Biochem. Biop hys. Res. Comm. 161:851-858;
Vaisman et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:19461-19566)。
【0005】 したがって、VEGFが結合する特異的レセプタの同定は、内皮細胞増殖の制
御を理解するのに重要である。構造的に関連する2個のチロシンキナ−ゼ、つま
り、flt-1レセプタ一 (Shibuya et al., (1990) Oncogene 5:519-524; De Vries
et al., (1992) Science 2 55: 989-991)と、本明細書に記載するKDR/FLK-1レ
セプタ一とは高い親和性を持ってVEGFに結合することが同定されている。こ
の結果、RTK類は内皮細胞増殖の変調と調節において役割を有していることが
推測される。
御を理解するのに重要である。構造的に関連する2個のチロシンキナ−ゼ、つま
り、flt-1レセプタ一 (Shibuya et al., (1990) Oncogene 5:519-524; De Vries
et al., (1992) Science 2 55: 989-991)と、本明細書に記載するKDR/FLK-1レ
セプタ一とは高い親和性を持ってVEGFに結合することが同定されている。こ
の結果、RTK類は内皮細胞増殖の変調と調節において役割を有していることが
推測される。
【0006】 最近の記載、たとえば、アメリカ特願第08/193829号、同第08/038596号、同第
07/975750号などには、VEGFが内皮細胞増殖ばかりに関与しているのではな
く、通常ならびに病理学的脈管形成に対する主要な抑制剤であることが強く示唆
されている(Klagsbur n & Soker, (1993) Current Biology 3:699-702; Houck,
et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:26031-26037)。
07/975750号などには、VEGFが内皮細胞増殖ばかりに関与しているのではな
く、通常ならびに病理学的脈管形成に対する主要な抑制剤であることが強く示唆
されている(Klagsbur n & Soker, (1993) Current Biology 3:699-702; Houck,
et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:26031-26037)。
【0007】 VEGFは、121−206残基の少なくとも4個のスプライス変異型に発現され
るホモ二量体のサイトカインである(Ferrara and Davis-Smyth, 1997)。血管内
皮細胞は、VEGFに対する少なくとも2個の高親和性レセプタ一、つまりVEGF-R1/
Flt-lとVEGFR-2/KD Rとを発現する。VEGF-R1とVEGFR-2とは、7個のイムノグロ
ブリン様セグメントを含有しかつVEGF、短メンブレンスパンニング(結合)領域、
ならびにチロシンキナ−ゼ活性を有する細胞質ゾルドメインを結合する。キナ−
ゼドメインは、細胞外ならびに近傍メンブレン(ジャクスタメンブレン)領域に
直接続いていて、それ自身別のドメイン(ポストキナ−ゼドメイン)によって続
いていて、それはシグナル導入のために別のタンパクを結合する機能を有する。
これら2個のレセプタ一は、異なるシグナル経路と機能を有するように思われ、
これらは内皮細胞の有糸***において主たる重要性を有する (Waltenberger et
al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 26988-26995; Seetharm et al., (1995) Onc
ogene 10, 135-147; Shalaby et al., (1995) Nature 376, 576-579)。
るホモ二量体のサイトカインである(Ferrara and Davis-Smyth, 1997)。血管内
皮細胞は、VEGFに対する少なくとも2個の高親和性レセプタ一、つまりVEGF-R1/
Flt-lとVEGFR-2/KD Rとを発現する。VEGF-R1とVEGFR-2とは、7個のイムノグロ
ブリン様セグメントを含有しかつVEGF、短メンブレンスパンニング(結合)領域、
ならびにチロシンキナ−ゼ活性を有する細胞質ゾルドメインを結合する。キナ−
ゼドメインは、細胞外ならびに近傍メンブレン(ジャクスタメンブレン)領域に
直接続いていて、それ自身別のドメイン(ポストキナ−ゼドメイン)によって続
いていて、それはシグナル導入のために別のタンパクを結合する機能を有する。
これら2個のレセプタ一は、異なるシグナル経路と機能を有するように思われ、
これらは内皮細胞の有糸***において主たる重要性を有する (Waltenberger et
al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 26988-26995; Seetharm et al., (1995) Onc
ogene 10, 135-147; Shalaby et al., (1995) Nature 376, 576-579)。
【0008】 FGFとVEGFとは共に強力な脈管由来の因子であり、新生毛細血管の形成を惹起
する。FGFを有するヒト胸がん腫セルラインMCF-7をトランスフェクションすると
、ヌ−ドマウスに静注したときに、進行的に成長し転移する腫瘍を形成するセル
ラインになる。FGFは、胸腫瘍が進行してエストロゲン非依存、抗エストロゲン
抵抗性転移表現型になるのに決定的な役割を果たしている(McLeskey et al., (1
993) Cancer Res. 53:2168-2177)。胸腫瘍セルは、新生血管形成を増進し、同時
転移を増加し、インビボにおける成長がトランスフェクションしていない腫瘍よ
りもより急激な成長を示した。FGFは、NIH-3T3セルへ形質転換して、マウス乳が
んの腫瘍形成ならびに転移に関わっていることが示されている。FGF過発現は、
ヒト副腎がん腫セルラインの腫瘍形成表現型を授け、FGFが上皮セルの形質導入
にも役割を果たしていることを示唆している。FGFに対するポリクロ−ナル中和
抗体は、Balb/cヌ−ドマウスに腫瘍を形成するK1000セル(bFGF
のリ−ダ−配列でトランスフェクションした)を移植したBalb/cヌ−ドマ
ウスにおける腫瘍形成を阻止した(Hori et al., (1991) Cancer Res. 51: 6180-
9184)。
する。FGFを有するヒト胸がん腫セルラインMCF-7をトランスフェクションすると
、ヌ−ドマウスに静注したときに、進行的に成長し転移する腫瘍を形成するセル
ラインになる。FGFは、胸腫瘍が進行してエストロゲン非依存、抗エストロゲン
抵抗性転移表現型になるのに決定的な役割を果たしている(McLeskey et al., (1
993) Cancer Res. 53:2168-2177)。胸腫瘍セルは、新生血管形成を増進し、同時
転移を増加し、インビボにおける成長がトランスフェクションしていない腫瘍よ
りもより急激な成長を示した。FGFは、NIH-3T3セルへ形質転換して、マウス乳が
んの腫瘍形成ならびに転移に関わっていることが示されている。FGF過発現は、
ヒト副腎がん腫セルラインの腫瘍形成表現型を授け、FGFが上皮セルの形質導入
にも役割を果たしていることを示唆している。FGFに対するポリクロ−ナル中和
抗体は、Balb/cヌ−ドマウスに腫瘍を形成するK1000セル(bFGF
のリ−ダ−配列でトランスフェクションした)を移植したBalb/cヌ−ドマ
ウスにおける腫瘍形成を阻止した(Hori et al., (1991) Cancer Res. 51: 6180-
9184)。
【0009】 新生脈管形成、腫瘍形成ならびに転移におけるFGFの役割によって、FGFのセル
内シグナル化を予防することによって抗FGF活性を発揮する強力な抗ガン剤とし
てのFGF抑制剤がこの技術分野において必要である。
内シグナル化を予防することによって抗FGF活性を発揮する強力な抗ガン剤とし
てのFGF抑制剤がこの技術分野において必要である。
【0010】 これとは対照的に、VEGFは、内皮細胞特異性マイトジェンであり、種々の腫瘍
セルによって解放され、原位置でヒト腫瘍セルに発現される血管形成誘発剤であ
る。FGFとは異なって、VEGFをエンコ−ドするcDNA配列を有するセルラインをト
ランスフェクションしても形質導入を促進しなかったが、インビボでの腫瘍成長
を促進した(Ferrara, N., and Davis-Smyth, T. (1997))。更に、VEGFを中和し
たポリクロ−ナル抗体を投与しても、ヒト黄紋筋肉腫、膠芽細胞腫多形ならびに 平滑筋肉腫セルラインがヌ−ドマウスに成長することを抑制した (Kim et al.,
(1993) Nature 362: 841-843)。
セルによって解放され、原位置でヒト腫瘍セルに発現される血管形成誘発剤であ
る。FGFとは異なって、VEGFをエンコ−ドするcDNA配列を有するセルラインをト
ランスフェクションしても形質導入を促進しなかったが、インビボでの腫瘍成長
を促進した(Ferrara, N., and Davis-Smyth, T. (1997))。更に、VEGFを中和し
たポリクロ−ナル抗体を投与しても、ヒト黄紋筋肉腫、膠芽細胞腫多形ならびに 平滑筋肉腫セルラインがヌ−ドマウスに成長することを抑制した (Kim et al.,
(1993) Nature 362: 841-843)。
【0011】 内皮細胞増殖ならびに潜在的な脈管形成ならびに/もしくは血管形成の規制と
変調に対するレセプタ一チロシンキナ−ゼ (RTK)の重要性に鑑みて、RTK抑制剤
を同定する多くの試みが種々の方策を用いて行われた。かかる方策としては、た
とえば、突然変異リガンド(アメリカ特許第4966849号)、可溶性レセプタ一なら
びに抗体(国際公開WO94/10202; Kendall & Thomas, (1994) Proc. Nat. Acad. S
ci. 90:10705-09; Kim, et al., 1993)、RNAリガンド(Jellinek, et al., (1994
) Biochemistry 3:10450-56)、タンパクキナ−ゼC抑制剤 (Schuc hter, et al.,
(1991) Cancer Res. 51:682-687); Takano, et al. (1993) Mol. Bio. Cell 4:
358A; Kinsella, et al., (1992) Exp. Cell Res. 199:56-62; Wright, et al.,
(1992) J. Cellular Phys. 152:448-57)、チロシンキナ−ゼ抑制剤 (国際公開W
O 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94 /14808; U.S. Pat. No. 5,330,
992; Mariani, et al., (1994) Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35:2268)が挙げ
られる。
変調に対するレセプタ一チロシンキナ−ゼ (RTK)の重要性に鑑みて、RTK抑制剤
を同定する多くの試みが種々の方策を用いて行われた。かかる方策としては、た
とえば、突然変異リガンド(アメリカ特許第4966849号)、可溶性レセプタ一なら
びに抗体(国際公開WO94/10202; Kendall & Thomas, (1994) Proc. Nat. Acad. S
ci. 90:10705-09; Kim, et al., 1993)、RNAリガンド(Jellinek, et al., (1994
) Biochemistry 3:10450-56)、タンパクキナ−ゼC抑制剤 (Schuc hter, et al.,
(1991) Cancer Res. 51:682-687); Takano, et al. (1993) Mol. Bio. Cell 4:
358A; Kinsella, et al., (1992) Exp. Cell Res. 199:56-62; Wright, et al.,
(1992) J. Cellular Phys. 152:448-57)、チロシンキナ−ゼ抑制剤 (国際公開W
O 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94 /14808; U.S. Pat. No. 5,330,
992; Mariani, et al., (1994) Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35:2268)が挙げ
られる。
【0012】 最近、チロシンキナ−ゼ抑制剤として作用する小分子を同定する試みがなれて
いる。たとえば、ビス単環式、二環式もしくは複素環式アリール化合物 (国際公
開WO 92/20642)、ビニレン−アザインド−ル誘導体 (国際公開WO94/14808) なら
びに 1-シクロプロピル-4-ピリジルキノロン(アメリカ特許第5,330,992号) が一
般にはチロシンキナ−ゼ抑制剤として記載されている。スチリル化合物 (アメリ
カ特許第5,217,999号)、スチリル置換ピリジル化合物 (アメリカ特許第5,302,
606号)、ある種のキナゾリン誘導体 (ヨーロッパ特許出願第0 566 266 A1号),セ
レノインドール類ならびにセレナイド類 (国際公開WO 94/03427), 三環式ポリハ
イドロキシル化合物 (国際公開WO 92/21660) ならびにベンジルホスホン酸化合
物 (国際公開WO 91/15495)がガン治療に使用するチロシンキナ−ゼ抑制剤として
使用する化合物として記載されている。しかしながら、これらの化合物はいずれ
も以前にはVEGFR-2レセプタ一の酵素的機能には一切関連していなかった。同様
に、これらの化合物は以前にはいずれも脈管形成ならびに/もしくは血管形成の
規制にも一切関連していなかった。
いる。たとえば、ビス単環式、二環式もしくは複素環式アリール化合物 (国際公
開WO 92/20642)、ビニレン−アザインド−ル誘導体 (国際公開WO94/14808) なら
びに 1-シクロプロピル-4-ピリジルキノロン(アメリカ特許第5,330,992号) が一
般にはチロシンキナ−ゼ抑制剤として記載されている。スチリル化合物 (アメリ
カ特許第5,217,999号)、スチリル置換ピリジル化合物 (アメリカ特許第5,302,
606号)、ある種のキナゾリン誘導体 (ヨーロッパ特許出願第0 566 266 A1号),セ
レノインドール類ならびにセレナイド類 (国際公開WO 94/03427), 三環式ポリハ
イドロキシル化合物 (国際公開WO 92/21660) ならびにベンジルホスホン酸化合
物 (国際公開WO 91/15495)がガン治療に使用するチロシンキナ−ゼ抑制剤として
使用する化合物として記載されている。しかしながら、これらの化合物はいずれ
も以前にはVEGFR-2レセプタ一の酵素的機能には一切関連していなかった。同様
に、これらの化合物は以前にはいずれも脈管形成ならびに/もしくは血管形成の
規制にも一切関連していなかった。
【0013】 したがって、当該分野において、PDGF, FGF, EGFならびにVEGF経路の小分子ア
ンタゴニストを個々にもしくはグループとして開発する必要性がある。その上、
これらのサイトカインがセル内の共通第2メッセンジャー経路を介してシグナル
を発信するならば、かかるアンタゴニストは、冠状再発狭窄症、腫瘍関連血管形
成、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、慢性炎症、糸球セルもしくは糸球
体間質セルの増殖に関連するある種の腎臓疾患、網膜血管増殖に関連する眼疾患
などでかつ広い範囲の疾患の進行を治療したり、予防するための広範な治療活性
を有する。この発明は、多数もしくは多種のアッセイによって活性になることが
示された共通シグナル機構や、一群の活性な治療剤を見出すと共に、共通セル内
シグナル中間体を見出すことによって完成した。
ンタゴニストを個々にもしくはグループとして開発する必要性がある。その上、
これらのサイトカインがセル内の共通第2メッセンジャー経路を介してシグナル
を発信するならば、かかるアンタゴニストは、冠状再発狭窄症、腫瘍関連血管形
成、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、慢性炎症、糸球セルもしくは糸球
体間質セルの増殖に関連するある種の腎臓疾患、網膜血管増殖に関連する眼疾患
などでかつ広い範囲の疾患の進行を治療したり、予防するための広範な治療活性
を有する。この発明は、多数もしくは多種のアッセイによって活性になることが
示された共通シグナル機構や、一群の活性な治療剤を見出すと共に、共通セル内
シグナル中間体を見出すことによって完成した。
【0014】 配列ホモロジ−と全体のドメイン構造に基づいて、VEGFRは、血小板由来成長
因子レセプタ一ファミリ−(PDGFR)に属している。血小板由来成長因子レセプ
タ一ファミリ−(PDGFR)にはまた、PDGFRα、PDGFRβ、幹セル成長因子レセプ
タ一(c-kit)、コロニ−刺激因子−1レセプタ一(CSF-1R/c-fms) (van der G
eer et al., (1994) Ann. Rev. Cell Biol. 10, 251-337)が含まれる。このファ
ミリ−の他のタンパクキナ−ゼに比べると、このファミリ−の成員は、触媒キナ
−ゼドメイン中にキナ−ゼインサ−トドメイン(KID)と呼ばれる、約65−
97残基のインサ−ト(挿入断片)を含んでいる。PDGFRファミリ−内では、K
IDの長さは異なっていて、配列ホモロジ−は低い。PDGFRα、PDGFRβ、c-kit
およびCSF-1RからのKIDの欠失または突然変異は、このドメインが固有キナ−
ゼ活性にとっては必要でないが、KIDチロシン残基の自己リン酸化によるシグ
ナル形質導入に関わる他のタンパクの結合にとっては重要であることを示してい
る(T aylor et al., (1989) EMBO J. 8, 2029-2037; Heidaran et al., (1991)
Mol. Cell. Biol. 11,134-142; Yu et al., (1991) Mol. Cell. Biol. 11, 3780
-3785; Kazlauskas et al., (1992) Mol.Cell. Biol. 12, 2534-2544; Lev et
al., (1992) Proc. NatI. Acad. Sci. USA 89, 678 -682; Reedjik et al., (19
92) EMBO J. 11,1365-1372; Bazenet et al., (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 69
26-6936)。VEGFRに対するシグナル経路とKIDの特定の役割は未だ完全には決
定されていないけれども、VEGFR-2 KIDは、自己リン酸化部位であると知られて
いる2個のチロシンを含んでいる(Dougher-Vermazen et al., (1994) Biochem.
Biophys. Res. Comm. 205, 728-738)。
因子レセプタ一ファミリ−(PDGFR)に属している。血小板由来成長因子レセプ
タ一ファミリ−(PDGFR)にはまた、PDGFRα、PDGFRβ、幹セル成長因子レセプ
タ一(c-kit)、コロニ−刺激因子−1レセプタ一(CSF-1R/c-fms) (van der G
eer et al., (1994) Ann. Rev. Cell Biol. 10, 251-337)が含まれる。このファ
ミリ−の他のタンパクキナ−ゼに比べると、このファミリ−の成員は、触媒キナ
−ゼドメイン中にキナ−ゼインサ−トドメイン(KID)と呼ばれる、約65−
97残基のインサ−ト(挿入断片)を含んでいる。PDGFRファミリ−内では、K
IDの長さは異なっていて、配列ホモロジ−は低い。PDGFRα、PDGFRβ、c-kit
およびCSF-1RからのKIDの欠失または突然変異は、このドメインが固有キナ−
ゼ活性にとっては必要でないが、KIDチロシン残基の自己リン酸化によるシグ
ナル形質導入に関わる他のタンパクの結合にとっては重要であることを示してい
る(T aylor et al., (1989) EMBO J. 8, 2029-2037; Heidaran et al., (1991)
Mol. Cell. Biol. 11,134-142; Yu et al., (1991) Mol. Cell. Biol. 11, 3780
-3785; Kazlauskas et al., (1992) Mol.Cell. Biol. 12, 2534-2544; Lev et
al., (1992) Proc. NatI. Acad. Sci. USA 89, 678 -682; Reedjik et al., (19
92) EMBO J. 11,1365-1372; Bazenet et al., (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 69
26-6936)。VEGFRに対するシグナル経路とKIDの特定の役割は未だ完全には決
定されていないけれども、VEGFR-2 KIDは、自己リン酸化部位であると知られて
いる2個のチロシンを含んでいる(Dougher-Vermazen et al., (1994) Biochem.
Biophys. Res. Comm. 205, 728-738)。
【0015】 第1サイクリックAMP依存タンパクキナ−ゼ(cAPK)構造の決定(Knighton et
al., (1991) Science 253, 407-413)以来、種々のタンパクキナ−ゼの構造が報
告されている(Johnson et al., (1996) Cell 85, 149-158での論評)。レセプタ
一タンパクチロシンキナ−ゼ(RTK)のうち、インスリンレセプタ一(IRK) (H
ubbard, etal., (1994) Nature 372, 746 -754; Hubbard, (1997) EMBO J. 16,
5572-5581) と、繊維芽細胞成長因子レセプタ一−1(FGFR1) (Mohammadi et al.
, (1996) Cell 86, 577-87; Mohammadi et at., (1997) Science 276, 955-960)
の構造は決定されている。
al., (1991) Science 253, 407-413)以来、種々のタンパクキナ−ゼの構造が報
告されている(Johnson et al., (1996) Cell 85, 149-158での論評)。レセプタ
一タンパクチロシンキナ−ゼ(RTK)のうち、インスリンレセプタ一(IRK) (H
ubbard, etal., (1994) Nature 372, 746 -754; Hubbard, (1997) EMBO J. 16,
5572-5581) と、繊維芽細胞成長因子レセプタ一−1(FGFR1) (Mohammadi et al.
, (1996) Cell 86, 577-87; Mohammadi et at., (1997) Science 276, 955-960)
の構造は決定されている。
【0016】
この発明は、68残基KIDの18残基を含むVEGFR-2 タンパクの修飾キナ−
ゼドメインの作成、反応特性および構造決定を提供する。リン酸化VEGFR-2触媒
ドメインのこの2.4Å結晶構造は、PDGFRファミリ−のキナ−ゼドメインの最初に
報告された構造である。この構造は、PDGFRファミリーの他の成員に関すること
もあるVEGFR-2のKIDドメインの配向に対する洞察を与える。更に、VEGFR-2キナ
−ゼの抑制には幅広い臨床的用途があるので、この構造は、療法剤としての小分
子VEGFR-2抑制剤の構造に基づく設計に対する目標についての3次元的記載を提供
する。
ゼドメインの作成、反応特性および構造決定を提供する。リン酸化VEGFR-2触媒
ドメインのこの2.4Å結晶構造は、PDGFRファミリ−のキナ−ゼドメインの最初に
報告された構造である。この構造は、PDGFRファミリーの他の成員に関すること
もあるVEGFR-2のKIDドメインの配向に対する洞察を与える。更に、VEGFR-2キナ
−ゼの抑制には幅広い臨床的用途があるので、この構造は、療法剤としての小分
子VEGFR-2抑制剤の構造に基づく設計に対する目標についての3次元的記載を提供
する。
【0017】 この発明の目的は、レセプタ一チロシンキナ−ゼファミリ−(RTK)に含まれる
種々のタンパクに対する特異的なアゴニストもしくはアンタゴニストである候補
化合物をスクリーニングする有効な方法であって、候補化合物の結合をモデル化
するためにX線結晶学的デ−タの分子モデル化に使用するために、RTK、特にVEG
FR-2レセプタ一を結晶化する方法を提供することである。
種々のタンパクに対する特異的なアゴニストもしくはアンタゴニストである候補
化合物をスクリーニングする有効な方法であって、候補化合物の結合をモデル化
するためにX線結晶学的デ−タの分子モデル化に使用するために、RTK、特にVEG
FR-2レセプタ一を結晶化する方法を提供することである。
【0018】 この方法は、たとえば下記のような活性を有する潜在的な療法化合物を設計し
、スクリーニングする方法を提供するものであって、かかる活性としては、たと
えば、 (1 ) 糖尿病性網膜症、空洞化血管腫、カポジ肉腫、内皮様細胞からなる
腫瘍の進行ならびに、新規な血液供給の発達を予防することによるガン細胞の成
長を処置または予防するのに有用な新規な血管形成を抑制すること、(2)種々の
形式ならびに病因性の糖尿病性糸球体硬化症ならびにその他の糸球体腎炎の発達
を処理または予防するのに有用な糸球体間質細胞ならびに/もしくは糸球体上皮
細胞のサイトカイン誘発増殖に起因する腎疾患の発達を抑制すること、(3) 滑液
細胞の増殖に起因するリウマチ様関節炎に伴う関節破壊を予防すること、(4) ケ
ラチノサイトの増殖ならびに炎症細胞の蓄積に起因する乾癬の顕在化を抑制する
こと、(5)冠状血管の再発狭窄症もしくはその他の動脈血管に続く血管形成に関
与する促進じゅく腫を阻止すること、(6) じゅく腫形成に起因する冠状動脈疾患
ならびにその他の脈管疾患 を抑制すること、(7) her-2-neuレセプタ−の過発
現によって刺激された胸ガンなどの腫瘍の進行を処置または予防する、PDGF, FG
F, EGF もしくは VEGFなどのその他のサイトカインに対するパラ分泌(パラクリ
ン)もしくは オ−トクリン仲介応答によるじゅく腫形成、冠状動脈疾患ならび
にその他の脈管疾患を抑制することなどが含まれる。この発明に係る方法は、シ
グナル形質導入を阻害する化合物を投与することから構成される。
、スクリーニングする方法を提供するものであって、かかる活性としては、たと
えば、 (1 ) 糖尿病性網膜症、空洞化血管腫、カポジ肉腫、内皮様細胞からなる
腫瘍の進行ならびに、新規な血液供給の発達を予防することによるガン細胞の成
長を処置または予防するのに有用な新規な血管形成を抑制すること、(2)種々の
形式ならびに病因性の糖尿病性糸球体硬化症ならびにその他の糸球体腎炎の発達
を処理または予防するのに有用な糸球体間質細胞ならびに/もしくは糸球体上皮
細胞のサイトカイン誘発増殖に起因する腎疾患の発達を抑制すること、(3) 滑液
細胞の増殖に起因するリウマチ様関節炎に伴う関節破壊を予防すること、(4) ケ
ラチノサイトの増殖ならびに炎症細胞の蓄積に起因する乾癬の顕在化を抑制する
こと、(5)冠状血管の再発狭窄症もしくはその他の動脈血管に続く血管形成に関
与する促進じゅく腫を阻止すること、(6) じゅく腫形成に起因する冠状動脈疾患
ならびにその他の脈管疾患 を抑制すること、(7) her-2-neuレセプタ−の過発
現によって刺激された胸ガンなどの腫瘍の進行を処置または予防する、PDGF, FG
F, EGF もしくは VEGFなどのその他のサイトカインに対するパラ分泌(パラクリ
ン)もしくは オ−トクリン仲介応答によるじゅく腫形成、冠状動脈疾患ならび
にその他の脈管疾患を抑制することなどが含まれる。この発明に係る方法は、シ
グナル形質導入を阻害する化合物を投与することから構成される。
【0019】 この発明は、反復医薬品設計プロセスに使用される方法を開発するのに有用で
ある。このプロセスは、その効能を改善するためにVEGFR-2レセプタ−に結合す
る新規医薬品候補化合物の新規な設計によってVEGFR-2に対して有効なアゴニス
トならびにアンタゴニストを同定する。本明細書で開示するX線結晶学的座標は
、VEGFR-2 タンパクの触媒作用部位と、医薬品結合部位の3次元モデルを作成で
きる。
ある。このプロセスは、その効能を改善するためにVEGFR-2レセプタ−に結合す
る新規医薬品候補化合物の新規な設計によってVEGFR-2に対して有効なアゴニス
トならびにアンタゴニストを同定する。本明細書で開示するX線結晶学的座標は
、VEGFR-2 タンパクの触媒作用部位と、医薬品結合部位の3次元モデルを作成で
きる。
【0020】 新規な設計は、主に、フラグメントまたは原子を、基質アナログ構造を参照す
ることなしに、立体的なまたは静電気的な相補性に基づいた部位に構築し、結合
するコンピュ−タプログラムを使用して、分子を作成することからなる。医薬品
設計プロセスは、目標RTKの構造が少なくとも2.8Åの解像度まで解決された
後に開始される。その構造を2.8Åまたはそれ以上の解像度にその場所にある「
固定」水分子で精製することにより、医薬品設計を実施するより好適な条件を提
供することができる。
ることなしに、立体的なまたは静電気的な相補性に基づいた部位に構築し、結合
するコンピュ−タプログラムを使用して、分子を作成することからなる。医薬品
設計プロセスは、目標RTKの構造が少なくとも2.8Åの解像度まで解決された
後に開始される。その構造を2.8Åまたはそれ以上の解像度にその場所にある「
固定」水分子で精製することにより、医薬品設計を実施するより好適な条件を提
供することができる。
【0021】 この発明の別の目的は、RTKファミリ中のタンパクのKIDを同定し、タンパ
クが結晶化できかつX線結晶学的手段による測定に適するように、上記KID中
の欠失を発展させることである。
クが結晶化できかつX線結晶学的手段による測定に適するように、上記KID中
の欠失を発展させることである。
【0022】 この発明の更に別の目的は、PDGF, EGF, VEGFその他の遺伝子のRTKファミリの
成員からのKID領域が、そのKID領域からアミノ酸が欠失することによって
修飾され、得られたポリペプチド生成物に好適な物理的特性を付与するように修
飾する方法を提供することである。かかる好適な物理的特性の例としては、溶解
性の増加、温度変化に対する安定性が大きくなることによって、ポリペプチドを
核磁気共鳴、高効率(スル−プット)スクリ−ニング(HTS)、生化学的特性
測定法、X線結晶学的手法、熱量測定法、その他の診断手段による分析に適する
ようにすることなどが挙げられる。
成員からのKID領域が、そのKID領域からアミノ酸が欠失することによって
修飾され、得られたポリペプチド生成物に好適な物理的特性を付与するように修
飾する方法を提供することである。かかる好適な物理的特性の例としては、溶解
性の増加、温度変化に対する安定性が大きくなることによって、ポリペプチドを
核磁気共鳴、高効率(スル−プット)スクリ−ニング(HTS)、生化学的特性
測定法、X線結晶学的手法、熱量測定法、その他の診断手段による分析に適する
ようにすることなどが挙げられる。
【0023】 この発明の更に別の目的は、ナノモル単位で有効な可能性がある新規医薬品候
補分子の新規設計によるRTKファミリ中のタンパクに対する潜在的なアゴニスト
ならびに アンタゴニストの医薬品設計法に使用されるスクリ−ニングを開発す
ることである。欠失によって突然変異したKIDおよびRTKファミリ中の上記タ
ンパクのその他の種々の欠失に基づいて提供されたX線結晶学的座標は、RTKフ
ァミリ中のタンパクの活性な結合部位の3次元モデルを作成することができる。
補分子の新規設計によるRTKファミリ中のタンパクに対する潜在的なアゴニスト
ならびに アンタゴニストの医薬品設計法に使用されるスクリ−ニングを開発す
ることである。欠失によって突然変異したKIDおよびRTKファミリ中の上記タ
ンパクのその他の種々の欠失に基づいて提供されたX線結晶学的座標は、RTKフ
ァミリ中のタンパクの活性な結合部位の3次元モデルを作成することができる。
【0024】
VEGFR-2タンパクのクローニング VEGFR-2の細胞質ドメインに対するコード配列 (Terman et al., (1992) Bioch
em Biophys. Res. Commun. 87, 1579-86)は、ヒト大動脈cDNAプ−ル(C lontech
Palo Alto, CA, USA)からのPCR (Mullis et al., (1986). Biotechnology 24, 1
7-27)によって増幅した。2個の重なり合っている配列は個々に増幅された。そ
の2個の重なり合っている配列は、全細胞質ドメインを表したVcyt (残基M806-V
1356)と、インスリンレセプタ−キナ−ゼ触媒ドメイン (Wei et al., (1995) J.
Biol. Chem. 270, 8122-8130) との第1級アミノ酸配列位置合わせに基づく境界
を有するVcat (残基C817M-G1191)とである。
em Biophys. Res. Commun. 87, 1579-86)は、ヒト大動脈cDNAプ−ル(C lontech
Palo Alto, CA, USA)からのPCR (Mullis et al., (1986). Biotechnology 24, 1
7-27)によって増幅した。2個の重なり合っている配列は個々に増幅された。そ
の2個の重なり合っている配列は、全細胞質ドメインを表したVcyt (残基M806-V
1356)と、インスリンレセプタ−キナ−ゼ触媒ドメイン (Wei et al., (1995) J.
Biol. Chem. 270, 8122-8130) との第1級アミノ酸配列位置合わせに基づく境界
を有するVcat (残基C817M-G1191)とである。
【0025】 Vcytに対するPCRオリゴヌクレオチドプライマ−配列は次の通りである。 Vcyt5 5'-CAGCATATGGATCCAGATGAACTCCCATTGG-3'(配列番号1) Vcyt3 5'-GCGGTCGACTTAAACAGGAGGAGAGCTCAGTGTG-3'(配列番号2) Vcatに対するPCRオリゴヌクレオチドプライマ−配列は次の通りである。 Vcat5 5'-GCACATATGGAACGACTGCCTTATG ATGCCAGG-3'(配列番号3) Vcat3 5'-CCTGTCGACTTATCCAGAATCCTCTTCCATGCTCAAAG-5' (配列番号4)
【0026】 増幅されたDNAは制限酵素NdeIとSaIIによって消化し、E. coliプラスミドpET2
4a (Novagen Madison, WI, USA)にリゲートして、その配列を照合した。Genbank
のオリジナルVEGFR-2配列(Accession number 346345)に比べて、2個のヌクレオ
チドの相違は、VcytとVcatの両方におけるコドン変化(Glu848-Val ならびに Asn
835-Lys)に基づくことが認められた。この発明に係る配列は、その後のVEGFR-2
Genbank寄託物 (Accession numbers 2655412 ならびに 3132833)と一致する。
4a (Novagen Madison, WI, USA)にリゲートして、その配列を照合した。Genbank
のオリジナルVEGFR-2配列(Accession number 346345)に比べて、2個のヌクレオ
チドの相違は、VcytとVcatの両方におけるコドン変化(Glu848-Val ならびに Asn
835-Lys)に基づくことが認められた。この発明に係る配列は、その後のVEGFR-2
Genbank寄託物 (Accession numbers 2655412 ならびに 3132833)と一致する。
【0027】 Mute-Geneインビトロ突然変異誘発キット (Bio-Rad Hercules, CA, USA)を用
いて、ヌクレオチド部位指向突然変異誘発 (Kunkel, 1985)によって突然変異が
導入された。Vcat DNAフラグメントは、NdeI\--XhoI消化物を用いてpET24aベク
タからベクタpMGH4にサブクロ−ンし(Schoner et al., 1986, Ken et al., 1992
)、このベクタを用いて、キットにて供給されたE. coil株CJ236中にssDNAウラシ
ルテンプレ−ト(マイナス鎖)を作成した。オリゴ(5'-CTCAGCAGGATTGATAAGACTA
CATTGTTC-3')が設計されて、C末端の先端を切って残基D1171にした構築物(ト Vc at(AG1172-Gl191)) を創製した。別のオリゴ(5'-GAATTTGTCCCCTACAAGGAAGCTCCTG AAGATCTG-3')が設計されて、FGFR-1との配列アラインメントに基づいてインサ−
トキナ−ゼドメインの中心の50残基(残基T940-E989) を欠失した(Mohammadi e
t at, 1996)。配列分析によって、偶発的なGlu990-Val突然変異を検出した。全
ての修飾酵素と制限酵素はNew England Biolabsから、オリゴヌクレオチドはGen
osys Biotechnologyから購入した。
いて、ヌクレオチド部位指向突然変異誘発 (Kunkel, 1985)によって突然変異が
導入された。Vcat DNAフラグメントは、NdeI\--XhoI消化物を用いてpET24aベク
タからベクタpMGH4にサブクロ−ンし(Schoner et al., 1986, Ken et al., 1992
)、このベクタを用いて、キットにて供給されたE. coil株CJ236中にssDNAウラシ
ルテンプレ−ト(マイナス鎖)を作成した。オリゴ(5'-CTCAGCAGGATTGATAAGACTA
CATTGTTC-3')が設計されて、C末端の先端を切って残基D1171にした構築物(ト Vc at(AG1172-Gl191)) を創製した。別のオリゴ(5'-GAATTTGTCCCCTACAAGGAAGCTCCTG AAGATCTG-3')が設計されて、FGFR-1との配列アラインメントに基づいてインサ−
トキナ−ゼドメインの中心の50残基(残基T940-E989) を欠失した(Mohammadi e
t at, 1996)。配列分析によって、偶発的なGlu990-Val突然変異を検出した。全
ての修飾酵素と制限酵素はNew England Biolabsから、オリゴヌクレオチドはGen
osys Biotechnologyから購入した。
【0028】 VEGFR2Δ50構築物は、数ステップで生製され、必要な突然変異をバキュロウイ
ルス(baculovirus)発現ベクタpAcSG2 (Pharmingen San Diego, CA, USA)中に組
み込んだ。ステップ1は、Vcytに対するコ−デイング領域をpET24aベクタからベ
クタpAcSG2のNcoI-KpnI部位にPCRによるサブクロ−ン化である。ステップ2
では、プラスミドpMGH4-Vcat(ΔT940-E989, E990V)からの2358bp ScaI-BgIII DN
A フラグメントを、pM GH4-Vcat (ΔT940-E989, E990V, ΔG1172-G1191) ベクタ
を作製するpMGH4-Vcat(ΔG1172-G1191)からの1695bp BgIII-Scal DNA フラグメ
ントにリゲ−ト(結合)する。ステップ3では、pMGH4-Vcat (ΔT940-E989, E9
90V,ΔG1172-G1191)からの9l3bp BstElI-EagI DNA フラグメントを、VEGFR2Δ50
とも呼ばれる、pAcSG2-Vcyt (ΔT940-E989, E990V, ΔG1172 -G1191)を作製する
pAcSG2-Vcytからの3290bp EagI-BstEll DNA フラグメントにリゲ−ト(結合)す
る。この最終構築物は、全コ−デイング領域に亘って配列されかつ解析して、野
生型配列(図1の配列)からのこれらの既知の突然変異だけを含むことを確認し
た。 図1は、VEGFR2の触媒ドメインに対する2次的構造の指定(Procheckによる)
と、その他の代表的なレセプタ−チロシンキナ−ゼとの配列アラインメントを示
す。αヘリックスはαB−αIとして、β鎖はβ1−β8として指定されている
。VEGFR2Δ50における50残基の切失部位は、|で示されている。VEGFR2Δ50中
のE990Vの突然変異部位は*で示される。配列は、VEGFR2(ここではこのように
報告されている);FGFR1 (スイスタンパクデ−タ−ベ−ス#P11362);IRK (EMBL
タンパクデ−タ−ベ−ス#A18657;番号はMohammadi et al., 1996による); VEGF
R1 (スイスタンパクデ−タ−ベ−ス#P17948); PDGFRα (スイスタンパクデ−タ
−ベ−ス#P17948) からである。
ルス(baculovirus)発現ベクタpAcSG2 (Pharmingen San Diego, CA, USA)中に組
み込んだ。ステップ1は、Vcytに対するコ−デイング領域をpET24aベクタからベ
クタpAcSG2のNcoI-KpnI部位にPCRによるサブクロ−ン化である。ステップ2
では、プラスミドpMGH4-Vcat(ΔT940-E989, E990V)からの2358bp ScaI-BgIII DN
A フラグメントを、pM GH4-Vcat (ΔT940-E989, E990V, ΔG1172-G1191) ベクタ
を作製するpMGH4-Vcat(ΔG1172-G1191)からの1695bp BgIII-Scal DNA フラグメ
ントにリゲ−ト(結合)する。ステップ3では、pMGH4-Vcat (ΔT940-E989, E9
90V,ΔG1172-G1191)からの9l3bp BstElI-EagI DNA フラグメントを、VEGFR2Δ50
とも呼ばれる、pAcSG2-Vcyt (ΔT940-E989, E990V, ΔG1172 -G1191)を作製する
pAcSG2-Vcytからの3290bp EagI-BstEll DNA フラグメントにリゲ−ト(結合)す
る。この最終構築物は、全コ−デイング領域に亘って配列されかつ解析して、野
生型配列(図1の配列)からのこれらの既知の突然変異だけを含むことを確認し
た。 図1は、VEGFR2の触媒ドメインに対する2次的構造の指定(Procheckによる)
と、その他の代表的なレセプタ−チロシンキナ−ゼとの配列アラインメントを示
す。αヘリックスはαB−αIとして、β鎖はβ1−β8として指定されている
。VEGFR2Δ50における50残基の切失部位は、|で示されている。VEGFR2Δ50中
のE990Vの突然変異部位は*で示される。配列は、VEGFR2(ここではこのように
報告されている);FGFR1 (スイスタンパクデ−タ−ベ−ス#P11362);IRK (EMBL
タンパクデ−タ−ベ−ス#A18657;番号はMohammadi et al., 1996による); VEGF
R1 (スイスタンパクデ−タ−ベ−ス#P17948); PDGFRα (スイスタンパクデ−タ
−ベ−ス#P17948) からである。
【0029】 DNAエンコ−ド用VEGFR2Δ50は、製造者(Pharmingen San Diego, CA, USA)のプ
ロトコルによる直線化したバキュロウイルスDNAを持つSf9セルにトランスフェク
ションされた。このトランスフェクションからの単一プラ−クを単離し、高タイ
タ−ストックを生成した。全てのストックは、バキュロウイルスDNAと、ポリヘ
ドロンフォワ−ドとリバ−スプライマ−(Invitrogen)を使用したインサ−トのPC
R増殖によって調べた。Sf21セルは、1-1.5百万セル/mL、MOI=5で7 2時間感染
させ、遠心分離して得た。
ロトコルによる直線化したバキュロウイルスDNAを持つSf9セルにトランスフェク
ションされた。このトランスフェクションからの単一プラ−クを単離し、高タイ
タ−ストックを生成した。全てのストックは、バキュロウイルスDNAと、ポリヘ
ドロンフォワ−ドとリバ−スプライマ−(Invitrogen)を使用したインサ−トのPC
R増殖によって調べた。Sf21セルは、1-1.5百万セル/mL、MOI=5で7 2時間感染
させ、遠心分離して得た。
【0030】 Sf21セルからのVEGFR2Δ50の精製 セルペレットを20 mM Tris pH 8.0, 20 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% (v/v) グリセ
ロ−ル中でのド−ンス(dounce)ホモゲナイズと超音波処理をして溶菌した。溶
菌液をTi45ロ−タで35,000 rpm、50分間遠心分離した。可溶性フラグメントは、
40 ml Q-30アニオン交換カラム(Pharmacia)に充填し、20 mM Tris pH 8.0, 5 mM
DTT, 5% (v/v) グリセロ−ルに溶解した20 mMから600 mMまでのNaCl勾配液の
20カラム容量で溶出した。VEGFR2Δ50タンパクは、SDS-PAGEゲル分析と、ガス
トリン基質 ペプチド基質(Boehringer Mannheim)に対して測定したキナ−ゼ活性
の存在によってプ−ルした。プ−ルした物質は、40 mLヒドロキシアパタイト(Bi
o-Rad) カラムに充填し、20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% グリ
セロ−ルでよく洗浄した。タンパクは、リン酸カリ、pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM
DTT, 5%グリセロ−ルの0mMから50 mMまでの直線勾配液500 mLで溶出した。VEG
FR2Δ50タンパクは、SDS-PAGEゲル分析と、ガストリンペプチドに対して測定し
たキナ−ゼ活性の存在によってプ−ルした。このカラムからの物質は、20 mM Tr
is pH 8.0, 20 mM NaCl, 5 mM DTT, 5%グリセロ−ルで1:1の割合で希釈し、8
mL Q-15アニオン交換カラム(Pharmacia)に充填した。タンパクは20 m M Tris p
H 8.0, 5 mM DTT, 5%グリセロ−ルのNaCl勾配(20 mM-175 mM)液で希釈した。VEG
FR2Δ50タンパクは上記のようにしてプ−ルした。このプ−ルに4M (NH4) 2SO4を
最終濃度が0.6 Mになるように添加し、10 mL HP-フェニルセファロ−スカラム (
Pharmacia)に充填した。VEGFR2Δ50タンパクは、20 mM Tris、5 mM DTTに溶解し
た(NH4) 2SO4の0.6 Mから0 Mまでの逆直線勾配液200 mLで溶出した。精製VEGF R
2Δ50タンパクは、500 ml G-25カラム(Pharmacia)で50 mM Hepes pH 7.5, 10 mM
DTT, 10%グリセロ−ル, 25 mM NaClを用いてバッファ−交換し、10 kDカットオ
フポリスルホンメンブレン(Amicon)で1 mgタンパク/mLに濃縮した。最終物質は
、分割し、液体窒素でフラッシュ冷凍し、70℃で保存した。
ロ−ル中でのド−ンス(dounce)ホモゲナイズと超音波処理をして溶菌した。溶
菌液をTi45ロ−タで35,000 rpm、50分間遠心分離した。可溶性フラグメントは、
40 ml Q-30アニオン交換カラム(Pharmacia)に充填し、20 mM Tris pH 8.0, 5 mM
DTT, 5% (v/v) グリセロ−ルに溶解した20 mMから600 mMまでのNaCl勾配液の
20カラム容量で溶出した。VEGFR2Δ50タンパクは、SDS-PAGEゲル分析と、ガス
トリン基質 ペプチド基質(Boehringer Mannheim)に対して測定したキナ−ゼ活性
の存在によってプ−ルした。プ−ルした物質は、40 mLヒドロキシアパタイト(Bi
o-Rad) カラムに充填し、20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% グリ
セロ−ルでよく洗浄した。タンパクは、リン酸カリ、pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM
DTT, 5%グリセロ−ルの0mMから50 mMまでの直線勾配液500 mLで溶出した。VEG
FR2Δ50タンパクは、SDS-PAGEゲル分析と、ガストリンペプチドに対して測定し
たキナ−ゼ活性の存在によってプ−ルした。このカラムからの物質は、20 mM Tr
is pH 8.0, 20 mM NaCl, 5 mM DTT, 5%グリセロ−ルで1:1の割合で希釈し、8
mL Q-15アニオン交換カラム(Pharmacia)に充填した。タンパクは20 m M Tris p
H 8.0, 5 mM DTT, 5%グリセロ−ルのNaCl勾配(20 mM-175 mM)液で希釈した。VEG
FR2Δ50タンパクは上記のようにしてプ−ルした。このプ−ルに4M (NH4) 2SO4を
最終濃度が0.6 Mになるように添加し、10 mL HP-フェニルセファロ−スカラム (
Pharmacia)に充填した。VEGFR2Δ50タンパクは、20 mM Tris、5 mM DTTに溶解し
た(NH4) 2SO4の0.6 Mから0 Mまでの逆直線勾配液200 mLで溶出した。精製VEGF R
2Δ50タンパクは、500 ml G-25カラム(Pharmacia)で50 mM Hepes pH 7.5, 10 mM
DTT, 10%グリセロ−ル, 25 mM NaClを用いてバッファ−交換し、10 kDカットオ
フポリスルホンメンブレン(Amicon)で1 mgタンパク/mLに濃縮した。最終物質は
、分割し、液体窒素でフラッシュ冷凍し、70℃で保存した。
【0031】 動的アッセイ タンパク (4 mM), ATP (3 mM), MgCl2 (40 mM), DTT (5 mM)をHepes (100 mM
), 10% グリセロ−ル, pH 7.5に溶解し、4℃、1時間の条件下で自己リン酸化
した精製VEGFR2Δ50タンパクに対してカプルド(共役)スペクトル光度アッセイ
を行った。
), 10% グリセロ−ル, pH 7.5に溶解し、4℃、1時間の条件下で自己リン酸化
した精製VEGFR2Δ50タンパクに対してカプルド(共役)スペクトル光度アッセイ
を行った。
【0032】 前方向へのカプルドスペクトル光度アッセイ チロシンキナ−ゼアッセイはベックマンDU 650スペクトル光度計で測定した。
ADPの産生は、ホスホエノ−ルピルベ−ト (PEP) を使用したピルビン酸塩キナ−
ゼ(PK)と乳酸デヒドロゲネ−ス(LDH)との作用を介してのNADHの酸化に関連して
いた。NAD Hの酸化は、340 nm (e340 = 6.22 cm-1 mM-1)での吸光度の減少を追
跡して行った。一般的な反応溶液は、200 mM Hepes, pH 7.5、異なる濃度のポリ
(E4Y1) (Sigma), ATP ならびに MgCl2に溶解した1 mM PEP, 250 mM NADH, 50単
位のLDH/mL, 20単位のPK/mL, 5 mM DTTを含んでいる。アッセイは40 nM VEGFR2
Δ50タンパクを用いて開始した。
ADPの産生は、ホスホエノ−ルピルベ−ト (PEP) を使用したピルビン酸塩キナ−
ゼ(PK)と乳酸デヒドロゲネ−ス(LDH)との作用を介してのNADHの酸化に関連して
いた。NAD Hの酸化は、340 nm (e340 = 6.22 cm-1 mM-1)での吸光度の減少を追
跡して行った。一般的な反応溶液は、200 mM Hepes, pH 7.5、異なる濃度のポリ
(E4Y1) (Sigma), ATP ならびに MgCl2に溶解した1 mM PEP, 250 mM NADH, 50単
位のLDH/mL, 20単位のPK/mL, 5 mM DTTを含んでいる。アッセイは40 nM VEGFR2
Δ50タンパクを用いて開始した。
【0033】 逆方向へのカプルドスペクトル光度アッセイ A TPの産生は、ヘキソキナ−ゼ(HK)とグルコ−ス−6−ホスフェ−トデヒドロ
ゲネ−ス(G6PD)との作用を介してのNADHの産生に関連していた。このアッセイで
は、HKはATPを変換してADPとグルコ−ス−6−ホスフェ−トとにする作用を触媒
する。グルコ−ス−6−ホスフェ−トデヒドロゲネ−スは、G6PDによって酸化さ
れてD-6-ホスホグルコノピラノ−ス-1,5-ラクトンになる。この場合、NADからNA
DHへの付随的な還元は340 nmでモニタ−できる。一般的なアッセイ用溶液は、グ
ルコ−ス(10 mM), NAD (40 mM), DTT (5 mM), MgCl2 (4 mM), HK (15 unit/mL),
G6PD (15 unit/lmL)、指示濃度のADPとホスホ−ポリ(E4Y)を含んでいる。反応
はVEGFR2Δ50タンパク(600-900 nM)を添加して開始した。
ゲネ−ス(G6PD)との作用を介してのNADHの産生に関連していた。このアッセイで
は、HKはATPを変換してADPとグルコ−ス−6−ホスフェ−トとにする作用を触媒
する。グルコ−ス−6−ホスフェ−トデヒドロゲネ−スは、G6PDによって酸化さ
れてD-6-ホスホグルコノピラノ−ス-1,5-ラクトンになる。この場合、NADからNA
DHへの付随的な還元は340 nmでモニタ−できる。一般的なアッセイ用溶液は、グ
ルコ−ス(10 mM), NAD (40 mM), DTT (5 mM), MgCl2 (4 mM), HK (15 unit/mL),
G6PD (15 unit/lmL)、指示濃度のADPとホスホ−ポリ(E4Y)を含んでいる。反応
はVEGFR2Δ50タンパク(600-900 nM)を添加して開始した。
【0034】 VEGFR2Δ50タンパクの潜在的アゴニストとアンタゴニストの評価 上記スペクトル光度アッセイと動的アッセイとに基づいて、候補化合物を競合
する上記アッセイに添加することによってVEGFR2Δ50タンパクの潜在的候補アゴ
ニストとアンタゴニストを評価できる。上記したように、VEGFR2Δ50タンパク活
性の速度(動態)は、ガストリンペプチドに対して測定した。候補化合物の存在
もしくは不存在下での活性を測定し、得られた速度デ−タを比較した。レセプタ
一に対する候補化合物の親和性は、競合的なアンタゴニストを示す速度カ−ブの
右側へのシフトまたは、非競合的な拮抗を示す最大活性の低下に反映されよう。
反対に、速度カ−ブの左側へのシフトは、VEGFR2Δ50タンパクに対する競合的な
アゴニストを示す。これについての総論としては、Bourne, H .R., et al. (198
7) Basic & Clinical Pharmacology (Katzung, et al., eds) (Ch. 3) 9-22を参
照のこと。
する上記アッセイに添加することによってVEGFR2Δ50タンパクの潜在的候補アゴ
ニストとアンタゴニストを評価できる。上記したように、VEGFR2Δ50タンパク活
性の速度(動態)は、ガストリンペプチドに対して測定した。候補化合物の存在
もしくは不存在下での活性を測定し、得られた速度デ−タを比較した。レセプタ
一に対する候補化合物の親和性は、競合的なアンタゴニストを示す速度カ−ブの
右側へのシフトまたは、非競合的な拮抗を示す最大活性の低下に反映されよう。
反対に、速度カ−ブの左側へのシフトは、VEGFR2Δ50タンパクに対する競合的な
アゴニストを示す。これについての総論としては、Bourne, H .R., et al. (198
7) Basic & Clinical Pharmacology (Katzung, et al., eds) (Ch. 3) 9-22を参
照のこと。
【0035】 結晶化と質量分析のためのVEGFR2Δ50タンパクのインビトロ自己リン酸化 冷凍VEGFR2Δ50タンパクの分割量を冷水に入れて解凍し、4℃でプ−ルした。
MgCl2とATPとをそれぞれ26 mMと4 mMになるように添加した。VEGFR2Δ50を4℃
で1時間培養した。ついで、この物質(VEGFR2Δ50 P)を10mM Hepes pH7.5, 10
mM DTT, 10mM NaClの溶液中でバッファ−交換し、Centriprep-10 (Amicon)を用
いて5mgタンパク/mLに濃縮した。
MgCl2とATPとをそれぞれ26 mMと4 mMになるように添加した。VEGFR2Δ50を4℃
で1時間培養した。ついで、この物質(VEGFR2Δ50 P)を10mM Hepes pH7.5, 10
mM DTT, 10mM NaClの溶液中でバッファ−交換し、Centriprep-10 (Amicon)を用
いて5mgタンパク/mLに濃縮した。
【0036】 質量分光測定法 トリプシン消化:精製VEGFR2Δ50とVEGFR2Δ50 Pのトリプシン消化は、タンパ
ク0.37 mg/mLを25mM NH4HCO3に溶解し、pH7.7、反応容量100μL、2日間、37
℃の条件下で行った。
ク0.37 mg/mLを25mM NH4HCO3に溶解し、pH7.7、反応容量100μL、2日間、37
℃の条件下で行った。
【0037】 MALDI/MS:MALDI/MS分析は、ボイジャ−・エリ−ト搭載遅延抽出型タイム−オ
ブ−フライト質量スペクトロメ−タ(PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham
, MA, USA)で行った。消化タンパクサンプル1μLを、アセトニトリル50% (v/v)
溶液と0.25% (w/w)トリフルオロ酢酸との水溶液中でマトリックス(a-シアノ-4-
ヒドロキシ桂皮酸)1μLと混合した。サンプルに337nmで操作した窒素レ−ザを
照射した。
ブ−フライト質量スペクトロメ−タ(PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham
, MA, USA)で行った。消化タンパクサンプル1μLを、アセトニトリル50% (v/v)
溶液と0.25% (w/w)トリフルオロ酢酸との水溶液中でマトリックス(a-シアノ-4-
ヒドロキシ桂皮酸)1μLと混合した。サンプルに337nmで操作した窒素レ−ザを
照射した。
【0038】 NanoESI-MS:NanoESI-MS分析は、NanoESIソ−ス(Pr otana A/S, デンマ−ク)
で改造したtriple quadrapole質量スペクトロメ−タ(PE Sciex API III、アルバ
−タ州, カナダ)で行った。ESI電圧を700Vに設定し、オリフィス設定を100Vに維
持した。消化タンパク3μLを、メタノ−ル7μLとギ酸0.5μLと混合した後、こ
のサンプル4μLを質量スペクトロメ−タに注入した。イオンスキャンを使用し
てホスホペプチドの配列を得た。
で改造したtriple quadrapole質量スペクトロメ−タ(PE Sciex API III、アルバ
−タ州, カナダ)で行った。ESI電圧を700Vに設定し、オリフィス設定を100Vに維
持した。消化タンパク3μLを、メタノ−ル7μLとギ酸0.5μLと混合した後、こ
のサンプル4μLを質量スペクトロメ−タに注入した。イオンスキャンを使用し
てホスホペプチドの配列を得た。
【0039】 結晶化とデ−タ収集 精製したリン酸化VEGFR2Δ50を、Centricon-10遠心濃縮機を使用して平均して
5 mgタンパク/mLに濃縮した。結晶は、点滴蒸気拡散法を4℃で行って成長させ
た。タンパク溶液2μLと母液溶液(100mM Hepes(pH 7.2), 2M (NH4) 2S04, 2% (
v/v)モノメチルエ−テルポリエチレングリコ−ルmW=550)2μLとを含む点滴を、
β−メルカプトエタノ−ル50mMを添加した母液の1mLリザ−バ上で平衡させた。
結晶は3ないし4日後に現れ、21日経つと0.3 x 0.2 x 0.5mmの大きさに成長
した。
5 mgタンパク/mLに濃縮した。結晶は、点滴蒸気拡散法を4℃で行って成長させ
た。タンパク溶液2μLと母液溶液(100mM Hepes(pH 7.2), 2M (NH4) 2S04, 2% (
v/v)モノメチルエ−テルポリエチレングリコ−ルmW=550)2μLとを含む点滴を、
β−メルカプトエタノ−ル50mMを添加した母液の1mLリザ−バ上で平衡させた。
結晶は3ないし4日後に現れ、21日経つと0.3 x 0.2 x 0.5mmの大きさに成長
した。
【0040】 X線回折デ−タセットを、Supper焦点ミラ−とMAR345 MAR Researchイメ−ジ・
プレ−ト検出器を取り付けたRigaku RU-2OO型回転アノ−ドX線発生器(CuKα)を5
0kV、100mAで操作して収集した。凍結結晶のデ−タ収集は、結晶を凍結防止剤溶
液 (100mM Hepes (pH7.2), 2.2M (NH4) 2S04, 0.6M sucrose, 0.55M glucose, 2
% (v/v) モノメチルエ−テルポリエチレングリコ−ルMW=550)中に入れ、その結
晶を液体窒素中でフラッシュ冷凍し、-186℃の窒素流中に入れて行った。デ−タ
は統合し、DENZOとSCALEPACK (Otwinowski, 1993)を用いてスケ−ル化した。収
集したデ−タの統計は表2に示す。
プレ−ト検出器を取り付けたRigaku RU-2OO型回転アノ−ドX線発生器(CuKα)を5
0kV、100mAで操作して収集した。凍結結晶のデ−タ収集は、結晶を凍結防止剤溶
液 (100mM Hepes (pH7.2), 2.2M (NH4) 2S04, 0.6M sucrose, 0.55M glucose, 2
% (v/v) モノメチルエ−テルポリエチレングリコ−ルMW=550)中に入れ、その結
晶を液体窒素中でフラッシュ冷凍し、-186℃の窒素流中に入れて行った。デ−タ
は統合し、DENZOとSCALEPACK (Otwinowski, 1993)を用いてスケ−ル化した。収
集したデ−タの統計は表2に示す。
【0041】 初期タンパク相は、AmoRe分子置換プログラム(Navaza, 1994)、検索プロ−ブ
としてのFGFR1構造の分子1(Mohammadi et at., 1996; PDB entry 1FGK)、nativ
elデ−タセットを用いて得た。正確な溶液を、FGFR1側鎖を含有させ、検索モデ
ルからの活性ル−プ(6 40-660)の可動残基、N末端(464-467)、短ル−プ(517-52
0)、C末端(760-762)から除去することによって作製した。この正確な溶液は、
その回転ならびに翻訳機能の頂点ピ−クが相関係数0.31であった。AMORe中での
剛体純化によって相関係数は0.49に、12.0 - 4.0 Å解像範囲におけるR因子は46
.3%に改良された。この溶液の正確さは、KAu(CN)2誘導体を用いた示差Fourierに
よる計算よってクロスチェックした。この誘導体は、0.5mM KAu(CN) 2を含むリ
ザ−バ液中に結晶を3日間浸漬し、次いで重原子濃度を5mMに増加させた後、再
度64時間浸漬した。デ−タセットのスケ−ル化、Patterson計算、Fourier計算
、位相の作製は、Xtalview (McRee et al., 1992)を用いて行った。
としてのFGFR1構造の分子1(Mohammadi et at., 1996; PDB entry 1FGK)、nativ
elデ−タセットを用いて得た。正確な溶液を、FGFR1側鎖を含有させ、検索モデ
ルからの活性ル−プ(6 40-660)の可動残基、N末端(464-467)、短ル−プ(517-52
0)、C末端(760-762)から除去することによって作製した。この正確な溶液は、
その回転ならびに翻訳機能の頂点ピ−クが相関係数0.31であった。AMORe中での
剛体純化によって相関係数は0.49に、12.0 - 4.0 Å解像範囲におけるR因子は46
.3%に改良された。この溶液の正確さは、KAu(CN)2誘導体を用いた示差Fourierに
よる計算よってクロスチェックした。この誘導体は、0.5mM KAu(CN) 2を含むリ
ザ−バ液中に結晶を3日間浸漬し、次いで重原子濃度を5mMに増加させた後、再
度64時間浸漬した。デ−タセットのスケ−ル化、Patterson計算、Fourier計算
、位相の作製は、Xtalview (McRee et al., 1992)を用いて行った。
【0042】 モデルはXplorバ−ジョン3.1 (Brunger, 1992)を用いて精製した。電子密度マ
ップ計算とモデル取り付けはXtalView (McRee et al., 1992) を用いて行った。
精製は4℃で収集したデ−タセット(native2)を用いて開始し、-186℃で収集し
たデ−タセット(native3) を用いて完了した。この最終R因子は8-2.4 Å (Fo
> 2δ)の範囲におけるテ−タに対して20.2%である。全原子に対する平均B値は、
タンパクに対しては31.8 Å2、水分子に対しては42.8 Å2である。最終モデルに
は、残基820-939, 998-1047, 1064-1168が含まれていて、これら残基のうち、K8
38, R842, F845, K939, D998, K1023, R1027, Y1038, K1039, K111 0, E1113の
側鎖は、翻訳処理可能密度の不足のためにCαを越えてモデル化できなかった。
モデル中の275残基のPROCHECK (Laskowski et al., 1993) ショ−を用いて行
った主鎖捩り角度の分析では、Ramachandranプロットの非許容範囲では何も発生
しなかったし、強許容範囲ではわずかに4個に発生した。182個の水分子が、
3δよりも大きな電子密度ピ−クに合致し、タンパクとその他の水分子に対して
合理的に水素結合が作成される位置に所在した。 種々のキナ−ゼ構造の重ね合わせはグラフィックプログラムInsight II (Mole
cular Simulations Inc, San Diego, CA, USA)を用いて行った。
ップ計算とモデル取り付けはXtalView (McRee et al., 1992) を用いて行った。
精製は4℃で収集したデ−タセット(native2)を用いて開始し、-186℃で収集し
たデ−タセット(native3) を用いて完了した。この最終R因子は8-2.4 Å (Fo
> 2δ)の範囲におけるテ−タに対して20.2%である。全原子に対する平均B値は、
タンパクに対しては31.8 Å2、水分子に対しては42.8 Å2である。最終モデルに
は、残基820-939, 998-1047, 1064-1168が含まれていて、これら残基のうち、K8
38, R842, F845, K939, D998, K1023, R1027, Y1038, K1039, K111 0, E1113の
側鎖は、翻訳処理可能密度の不足のためにCαを越えてモデル化できなかった。
モデル中の275残基のPROCHECK (Laskowski et al., 1993) ショ−を用いて行
った主鎖捩り角度の分析では、Ramachandranプロットの非許容範囲では何も発生
しなかったし、強許容範囲ではわずかに4個に発生した。182個の水分子が、
3δよりも大きな電子密度ピ−クに合致し、タンパクとその他の水分子に対して
合理的に水素結合が作成される位置に所在した。 種々のキナ−ゼ構造の重ね合わせはグラフィックプログラムInsight II (Mole
cular Simulations Inc, San Diego, CA, USA)を用いて行った。
【0043】 実施例1:構造決定 KIDの68残基のうち50の中心残基が欠失しているヒトVEGFR-2のチロシ
ンキナ−ゼドメインはバキュロウイルス/昆虫セルシステム中で発現させた。完
全長VEGFR-2の1356残基のうち、この構築物(VEGFR2Δ50)は、細胞質ゾル
ドメインの残基806-939と990-1171を含んでいる(図1)。VEGFR2Δ50はまた野
生型VEGFR-2に対比して、KID中における1点突然変異(E990V)を含んでいる
。
ンキナ−ゼドメインはバキュロウイルス/昆虫セルシステム中で発現させた。完
全長VEGFR-2の1356残基のうち、この構築物(VEGFR2Δ50)は、細胞質ゾル
ドメインの残基806-939と990-1171を含んでいる(図1)。VEGFR2Δ50はまた野
生型VEGFR-2に対比して、KID中における1点突然変異(E990V)を含んでいる
。
【0044】 その自己リン酸化を触媒することに加えて、VEGFR2Δ50はまたポリ(E4Y)外生
基質のリン酸化を触媒することができる。詳細な動的分析(表1)では、その反
応パラメ−タは、全KIDを含む匹敵するVEGFR-2タンパクのそれとほぼ同じで
あるKID (Parast et al, 報道による)ことが明らかになっている。これらの結果
を総合すると、VEGFR2Δ50は完全に活性な機能的酵素である。したがって、KI
Dの50個の中心残基の欠失はホスホトランスファ−反応の触媒工程に対しては
何ら観察される効果が観察されなかった。また、KID領域からの60個以上の
アミノ酸の欠失が酵素活性の減少の原因であると決定した。
基質のリン酸化を触媒することができる。詳細な動的分析(表1)では、その反
応パラメ−タは、全KIDを含む匹敵するVEGFR-2タンパクのそれとほぼ同じで
あるKID (Parast et al, 報道による)ことが明らかになっている。これらの結果
を総合すると、VEGFR2Δ50は完全に活性な機能的酵素である。したがって、KI
Dの50個の中心残基の欠失はホスホトランスファ−反応の触媒工程に対しては
何ら観察される効果が観察されなかった。また、KID領域からの60個以上の
アミノ酸の欠失が酵素活性の減少の原因であると決定した。
【0045】 表1:VEGFR2Δ50の反応係数
【0046】
【表1】
【0047】 VEGFR2Δ50配列は、6個のリジン、5個のアルギニン、8個のグルタミン酸、
5個のアスパラギン酸残基と含み(図1)、親水性であり、高帯電性である。最
初に、完全なKIDを持つVEGFR-2触媒ドメインを含む数個のタンパク構築物が
生成された。これらのタンパク構築物を結晶化する徹底的な試みは失敗してわず
かな結晶をも生成できなかった後、VEGFR2Δ50を生成して、高荷電KIDは結晶
化と干渉するという考えを試験した。ダイナミック光散乱させることにより、1
4個の荷電残基を排除したこのVEGFR2Δ50構築物は、全KIDを含むタンパク構
築物よりも温度とタンパク濃度に対して著しい安定性を示した。
5個のアスパラギン酸残基と含み(図1)、親水性であり、高帯電性である。最
初に、完全なKIDを持つVEGFR-2触媒ドメインを含む数個のタンパク構築物が
生成された。これらのタンパク構築物を結晶化する徹底的な試みは失敗してわず
かな結晶をも生成できなかった後、VEGFR2Δ50を生成して、高荷電KIDは結晶
化と干渉するという考えを試験した。ダイナミック光散乱させることにより、1
4個の荷電残基を排除したこのVEGFR2Δ50構築物は、全KIDを含むタンパク構
築物よりも温度とタンパク濃度に対して著しい安定性を示した。
【0048】 結晶化のために、精製したVEGFR2Δ50をMgATPと培養してインビトロで自己リ
ン酸化した。完全長リン酸化VEGFR2Δ50(VEGFR2Δ50P)タンパクと、一般的な消
化ペプチドのMatrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)とnanoele
ctrospray ionization (NanoESI)質量分光測定分析とは、ここに記載する自己リ
ン酸化条件を使用してのY1059のリン酸化を示している。2.2 Åに回折するVEGFR
2Δ50Pの結晶は、非リガ−ト状態で得られた。この結晶は、非対称ユニット中に
1個のVEGFR2Δ50Pを有する斜方晶形スペ−スグル−プP212121に属する。初期の
結晶学的位相は、検索モデルとしてFGFR1の非リン酸化キナ−ゼドメインの構造
を使用した分子置換(Mohammadi et al., 1996)によって決定した。分子置換溶液
の正確性は金シアナイド誘導体を用いてクロスチェックした。しかしながら、こ
の誘導体デ−タはモデルを構築する電子密度マップの位相計算には使用しなかっ
た。その構造は、R因子が8-2.4Åデ−タ(Fo>2δ)に対して20.2%にまで精製され
た。不秩序のためにバックボ−ン原子がモデル化されなかったVEGFR2Δ5 0P残基
には、N末端残基806-819、KIDの残基990-997、活性化ル−プの残基1048-106
3、C末端残基1169-1171が含まれている。構造決定についての統計は表2に示す
。
ン酸化した。完全長リン酸化VEGFR2Δ50(VEGFR2Δ50P)タンパクと、一般的な消
化ペプチドのMatrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)とnanoele
ctrospray ionization (NanoESI)質量分光測定分析とは、ここに記載する自己リ
ン酸化条件を使用してのY1059のリン酸化を示している。2.2 Åに回折するVEGFR
2Δ50Pの結晶は、非リガ−ト状態で得られた。この結晶は、非対称ユニット中に
1個のVEGFR2Δ50Pを有する斜方晶形スペ−スグル−プP212121に属する。初期の
結晶学的位相は、検索モデルとしてFGFR1の非リン酸化キナ−ゼドメインの構造
を使用した分子置換(Mohammadi et al., 1996)によって決定した。分子置換溶液
の正確性は金シアナイド誘導体を用いてクロスチェックした。しかしながら、こ
の誘導体デ−タはモデルを構築する電子密度マップの位相計算には使用しなかっ
た。その構造は、R因子が8-2.4Åデ−タ(Fo>2δ)に対して20.2%にまで精製され
た。不秩序のためにバックボ−ン原子がモデル化されなかったVEGFR2Δ5 0P残基
には、N末端残基806-819、KIDの残基990-997、活性化ル−プの残基1048-106
3、C末端残基1169-1171が含まれている。構造決定についての統計は表2に示す
。
【0049】 表2:VEGFR2Δ50P構造決定についての統計
【0050】
【表2】
【0051】 キナ−ゼの全体的な折り畳み セリン/スレオニンとチロシンタンパクキナ−ゼの両方の上記報告の構造に類
似して、VEGFR2Δ50Pは、2つのロ−ブに折り畳まれていて、ホスホトランスフ
ァ−の触媒作用はその2つのロ−ブの間の割れ目において起こる(Cox et al.の
論説1994; Johnson et al., 1996)。VEGFR2Δ50P構造ののCαトレ−スは図2に
示す。キナ−ゼの2次的構造要素は、cAPK (Knighton et al., 1991)に元来付与
された慣行に従って命名されている(図1)。N末端ロ−ブ(ほぼ残基820-920
)は、1本のαヘリックス(αC)を持つ捩れたβシ−ト中に折れ曲がっている
。β構造は、5本の逆平行鎖(β1−β5)からなり、そのうちの3本鎖(β1
−β3)は大きく曲がっていて、他の2本鎖(β4−β5)の上に曲がりくねっ
ている。大きい方のC末端ドメイン(ほぼ残基921-313)は、2本の逆平行なβ
鎖(β7−β8)を含み、これらはN末端βシ−トに隣接するC末端ドメインの
頂部に位置している。7本のαヘリックス(αD、αE、αE−F、αG、αH
、αI)は、C末端ドメインの残存コアを形成する。他のキナ−ゼ同様、VEGFR2
Δ50Pは、2個の機能的に重要な領域、つまり、グリシンリッチヌクレオチド結
合ル−プ(残基841-846)、触媒ル−プ(残基1026-1033)および活性ル−プ(残
基104 6-1075)を含む(図1、図2(A))。 図2は、VEGFR2Δ50P, FGFR1, IRKPの全体的な重なりを示し、キナ−ゼドメイ
ン構造のバックボ−ンを示す。図2(A)はVEGFR2(VEGFR2Δ50P)のキナ−ゼド
メイン構造、図2(B)はFGFR1(PDB entry 1FGKの分子A, Mohammadi et al.,
1996)のキナ−ゼドメイン構造、図2(C)はIRKP(PDB entry 1IR3, Hubbard et
al., 1997)のキナ−ゼドメイン構造のそれぞれのバックボ−ンを示す。図2(
A)、(B)、(C)は、C端末ドメインを重ねて作成した同一図である。末端
の位置はNとCで示した。ヌクレオチド結合ル−プ(オレンジ色)、キナ−ゼイ
ンサ−トドメイン(ピンク色)、活性ル−プ(黄色)はハイライトで強調して表
示した。図2(C)では、結合AMP-PNPは緑色で、ペプチド基質は赤色で示した
。図はINSIGHT IIで作成した。
似して、VEGFR2Δ50Pは、2つのロ−ブに折り畳まれていて、ホスホトランスフ
ァ−の触媒作用はその2つのロ−ブの間の割れ目において起こる(Cox et al.の
論説1994; Johnson et al., 1996)。VEGFR2Δ50P構造ののCαトレ−スは図2に
示す。キナ−ゼの2次的構造要素は、cAPK (Knighton et al., 1991)に元来付与
された慣行に従って命名されている(図1)。N末端ロ−ブ(ほぼ残基820-920
)は、1本のαヘリックス(αC)を持つ捩れたβシ−ト中に折れ曲がっている
。β構造は、5本の逆平行鎖(β1−β5)からなり、そのうちの3本鎖(β1
−β3)は大きく曲がっていて、他の2本鎖(β4−β5)の上に曲がりくねっ
ている。大きい方のC末端ドメイン(ほぼ残基921-313)は、2本の逆平行なβ
鎖(β7−β8)を含み、これらはN末端βシ−トに隣接するC末端ドメインの
頂部に位置している。7本のαヘリックス(αD、αE、αE−F、αG、αH
、αI)は、C末端ドメインの残存コアを形成する。他のキナ−ゼ同様、VEGFR2
Δ50Pは、2個の機能的に重要な領域、つまり、グリシンリッチヌクレオチド結
合ル−プ(残基841-846)、触媒ル−プ(残基1026-1033)および活性ル−プ(残
基104 6-1075)を含む(図1、図2(A))。 図2は、VEGFR2Δ50P, FGFR1, IRKPの全体的な重なりを示し、キナ−ゼドメイ
ン構造のバックボ−ンを示す。図2(A)はVEGFR2(VEGFR2Δ50P)のキナ−ゼド
メイン構造、図2(B)はFGFR1(PDB entry 1FGKの分子A, Mohammadi et al.,
1996)のキナ−ゼドメイン構造、図2(C)はIRKP(PDB entry 1IR3, Hubbard et
al., 1997)のキナ−ゼドメイン構造のそれぞれのバックボ−ンを示す。図2(
A)、(B)、(C)は、C端末ドメインを重ねて作成した同一図である。末端
の位置はNとCで示した。ヌクレオチド結合ル−プ(オレンジ色)、キナ−ゼイ
ンサ−トドメイン(ピンク色)、活性ル−プ(黄色)はハイライトで強調して表
示した。図2(C)では、結合AMP-PNPは緑色で、ペプチド基質は赤色で示した
。図はINSIGHT IIで作成した。
【0052】 報告されたキナ−ゼ構造のうち、VEGFR2Δ50Pの構造は、ほぼ55%の配列が
一致しているFGFR1の触媒ドメインの構造(Mohammed et al., 1996; PDB e ntry
1FGK)にもっとも類似している(図1)。FGFR1構造溶液の結晶学的な非対称ユニ
ット中の2つの分子は非常に類似しているので、VEGFR2Δ50Pとの比較は主にFGF
R1の分子Aについてだけ記載する。N末端ロ−ブの鎖(β1−β5)の82Cα
位置もしくはFGFR1とVEGFR2Δ50Pとの間のC末端ロ−ブの152Cα位置残基(
αD、αE、αF、αG、αH、αI)の最も小さい四角形の重ね合わせは、そ
れぞれ0.40Åと0.52Åのrms偏差になる。2つのロ−ブ間のほぼ5°の相対的
回転は、それより僅かに大きくかつ開いているVEGFR2Δ50Pのロ−ブ内割れ目に
なる。この割れ目の端の等しいCα(FGFR1のK523、R675とVEGFR2Δ50PのS877,
R1080)間の距離を測定すると、VEGFR2Δ50Pでは25.3Åであったのに対して、FG
FR1では23.2Åであった。しかしながら、この回転は、種々のリガ−ト(結合)
状態やリン酸化状態におけるキナ−ゼ構造間に認められるそれよりもずっと大き
な相対的なロ−ブの回転に比べれば小さな差でしかない(Johnson et al., (1996
) Cell 85, 149-158)。たとえば、VEGFR2Δ50Pについてここで見られるロ−ブ内
配向は、ATPアナログAMP-PNPとペプチド基質に結合したIRKのリン酸化キナ−ゼ
ドメインの三元コンプレックス構造において見られるそれよりも20°程より一
層開いた立体配座をしている(Hubbard, (1997) EMBO J. 16, 5572-5581; PDB en
try lIR3) (図2(C))。
一致しているFGFR1の触媒ドメインの構造(Mohammed et al., 1996; PDB e ntry
1FGK)にもっとも類似している(図1)。FGFR1構造溶液の結晶学的な非対称ユニ
ット中の2つの分子は非常に類似しているので、VEGFR2Δ50Pとの比較は主にFGF
R1の分子Aについてだけ記載する。N末端ロ−ブの鎖(β1−β5)の82Cα
位置もしくはFGFR1とVEGFR2Δ50Pとの間のC末端ロ−ブの152Cα位置残基(
αD、αE、αF、αG、αH、αI)の最も小さい四角形の重ね合わせは、そ
れぞれ0.40Åと0.52Åのrms偏差になる。2つのロ−ブ間のほぼ5°の相対的
回転は、それより僅かに大きくかつ開いているVEGFR2Δ50Pのロ−ブ内割れ目に
なる。この割れ目の端の等しいCα(FGFR1のK523、R675とVEGFR2Δ50PのS877,
R1080)間の距離を測定すると、VEGFR2Δ50Pでは25.3Åであったのに対して、FG
FR1では23.2Åであった。しかしながら、この回転は、種々のリガ−ト(結合)
状態やリン酸化状態におけるキナ−ゼ構造間に認められるそれよりもずっと大き
な相対的なロ−ブの回転に比べれば小さな差でしかない(Johnson et al., (1996
) Cell 85, 149-158)。たとえば、VEGFR2Δ50Pについてここで見られるロ−ブ内
配向は、ATPアナログAMP-PNPとペプチド基質に結合したIRKのリン酸化キナ−ゼ
ドメインの三元コンプレックス構造において見られるそれよりも20°程より一
層開いた立体配座をしている(Hubbard, (1997) EMBO J. 16, 5572-5581; PDB en
try lIR3) (図2(C))。
【0053】 N末端ロ−ブのβ鎖位置はVEGFR2Δ50PとFGFR1との間においてよく一致してい
るのに対して、それらの構造は、残基W827に始まる第1の保存領域に先行するN
末端残基において著しく分岐している(図2(A)と図2(B))。VEGFR2Δ50P
の最初の14個の残基(M806-E819)は完全に未秩序で、次の7個の残基(L820-R82
6)は拡張ル−プ構造を形成する。残基806-819は活性なキナ−ゼ領域の一部を形
成していないが、VEGFR-2の傍メンブレン(ジャクスタメンブレン:juxtamembra
ne)領域の代わりの部分もしくは隣接しているようである。残基820-826は、類
似する残基もまたFGFR1, IRKと非レセプタ−チロシンキナ−ゼLck (Yamaguchi a
nd Hendrickson, (1996) Nature 384, 484-489)の構造においては秩序立ってい
るので、柔軟ではあるが、キナ−ゼドメインの一部であると思われる。VEGFR2Δ
50Pの構造と他のキナ−ゼ構造との間の他の相違はキナ−ゼインサ−トドメイン
と活性化ル−プで起こる(後述する)。
るのに対して、それらの構造は、残基W827に始まる第1の保存領域に先行するN
末端残基において著しく分岐している(図2(A)と図2(B))。VEGFR2Δ50P
の最初の14個の残基(M806-E819)は完全に未秩序で、次の7個の残基(L820-R82
6)は拡張ル−プ構造を形成する。残基806-819は活性なキナ−ゼ領域の一部を形
成していないが、VEGFR-2の傍メンブレン(ジャクスタメンブレン:juxtamembra
ne)領域の代わりの部分もしくは隣接しているようである。残基820-826は、類
似する残基もまたFGFR1, IRKと非レセプタ−チロシンキナ−ゼLck (Yamaguchi a
nd Hendrickson, (1996) Nature 384, 484-489)の構造においては秩序立ってい
るので、柔軟ではあるが、キナ−ゼドメインの一部であると思われる。VEGFR2Δ
50Pの構造と他のキナ−ゼ構造との間の他の相違はキナ−ゼインサ−トドメイン
と活性化ル−プで起こる(後述する)。
【0054】 触媒ル−プとATP結合部位 タンパクキナ−ゼにおいては、αEとβ7との間のル−プは、ホスホトランス
ファ−反応における触媒的塩基として機能すると信じられている非変異アスパラ
ギン酸(D1028)が含まれているので、触媒ル−プと呼ばれている(Johnson et al.
, 1996)。このアスパラギン酸は、その配列HRDLAARNがタンパクチロシンキナ−
ゼ中に高度に保存されている残基(H1026-N1033)の伸長部分の一部である。VEGFR
2Δ50Pにおいては、このル−プのバックボ−ン位置と最側鎖位置とは、非リガン
ドFGFR1と三元リン酸化IRK (IRKP)コンプレックス構造における位置と類似して
いる。これらの前述した構造に見られるように、触媒ル−プのアスパラギン酸(D
1028)の側鎖カルボキシレ−トは保存アルギニン(R1032)とアスパラギン(N1033)
の側鎖に水素結合している(図3)。
ファ−反応における触媒的塩基として機能すると信じられている非変異アスパラ
ギン酸(D1028)が含まれているので、触媒ル−プと呼ばれている(Johnson et al.
, 1996)。このアスパラギン酸は、その配列HRDLAARNがタンパクチロシンキナ−
ゼ中に高度に保存されている残基(H1026-N1033)の伸長部分の一部である。VEGFR
2Δ50Pにおいては、このル−プのバックボ−ン位置と最側鎖位置とは、非リガン
ドFGFR1と三元リン酸化IRK (IRKP)コンプレックス構造における位置と類似して
いる。これらの前述した構造に見られるように、触媒ル−プのアスパラギン酸(D
1028)の側鎖カルボキシレ−トは保存アルギニン(R1032)とアスパラギン(N1033)
の側鎖に水素結合している(図3)。
【0055】 図3は、VEGFR2Δ50PとIRKPとの触媒作用部位を示す。 (A)は VEGFR2Δ50P
の構造と(B)は IRKP (PDB entry 1 IRS; Hubbard et al., 1997)の構造の触
媒作用部位の断面を示していて、原子は、元素によって色彩を施した(炭素は緑
色、酸素は赤色、窒素は青色、硫黄は黄色、リンはピンク色、マグネシウムはオ
レンジ色)。(A) VEGFR2Δ50Pはタンパク原子だけを含んでいて、(B) IRKPはタ
ンパク原子、AMP-PNP原子、Mg2+を含んでいる。図はINSIGHT IIを用いて作成し
た。
の構造と(B)は IRKP (PDB entry 1 IRS; Hubbard et al., 1997)の構造の触
媒作用部位の断面を示していて、原子は、元素によって色彩を施した(炭素は緑
色、酸素は赤色、窒素は青色、硫黄は黄色、リンはピンク色、マグネシウムはオ
レンジ色)。(A) VEGFR2Δ50Pはタンパク原子だけを含んでいて、(B) IRKPはタ
ンパク原子、AMP-PNP原子、Mg2+を含んでいる。図はINSIGHT IIを用いて作成し
た。
【0056】 タンパクキナ−ゼのATP結合部位は、N末端とC末端のロ−ブ間の割れ目に存
在する(図2(C))。VEGFR2Δ50Pにとっては、この部位を形成する残基は主
に2つのロ−ブを結合する残基E917-N923と、β1とβ2の部分を含む残基L840-
I849と、残基G841-G846のグリシンリッチル−プとから構成されている。グリシ
ンリッチル−プはまたヌクレオチド結合ル−プとも呼ばれ、その位置が種々の活
性化されリガンドされた状態のキナ−ゼ構造中において異なる柔軟なフラグメン
トである。VEGFR2Δ50Pにおいて、このル−プは、かなり秩序立って配列されて
いて、全ての原子はR842 とF845の側鎖を除いてモデル化できた。このル−プの
相対的位置と立体配置とは、非リゲ−トFGFR1構造において観察されるそれと類
似している。しかしながら、この位置は、IRKP三元コンプレックス構造の位置と
は著しく異なっている。このIRKP三元コンプレックス構造では、N末端とC末端
のロ−ブの20°程の相対的回転によってVEGFR2Δ50P構造中よりもC末端ロ−
ブに5Åほど近くにあるグリシンリッチル−プになる。
在する(図2(C))。VEGFR2Δ50Pにとっては、この部位を形成する残基は主
に2つのロ−ブを結合する残基E917-N923と、β1とβ2の部分を含む残基L840-
I849と、残基G841-G846のグリシンリッチル−プとから構成されている。グリシ
ンリッチル−プはまたヌクレオチド結合ル−プとも呼ばれ、その位置が種々の活
性化されリガンドされた状態のキナ−ゼ構造中において異なる柔軟なフラグメン
トである。VEGFR2Δ50Pにおいて、このル−プは、かなり秩序立って配列されて
いて、全ての原子はR842 とF845の側鎖を除いてモデル化できた。このル−プの
相対的位置と立体配置とは、非リゲ−トFGFR1構造において観察されるそれと類
似している。しかしながら、この位置は、IRKP三元コンプレックス構造の位置と
は著しく異なっている。このIRKP三元コンプレックス構造では、N末端とC末端
のロ−ブの20°程の相対的回転によってVEGFR2Δ50P構造中よりもC末端ロ−
ブに5Åほど近くにあるグリシンリッチル−プになる。
【0057】 結合ATPもしくはATPアナログを持つ報告されたキナ−ゼ構造において、アデニ
ン環は、タンパクバックボ−ンを持つ2個の保存水素結合を作成する。AMP-PCP
が結合したFGFR1の構造 (Mohammed et al., 1996)において、これらの水素結合
は、アデニンNH2とE562 (E917 VEG FR2ΔP)のバックボ−ンC=Oとの間と、アデニ
ンN1とA546 (C919 VEGFR2Δ50P)のバックボ−ンNHとの間に存在する。ここで提
示した構造は結合ヌクレオチドを含んでいないけれども、これらバックボ−ン原
子の位置がFGFR1に類似していることは、これらの水素結合がVEGFR2Δ50P-ATPコ
ンプレックス中に形成され、したがってアデニンが類似する位置に結合するのが
期待されることを示している(図4)。
ン環は、タンパクバックボ−ンを持つ2個の保存水素結合を作成する。AMP-PCP
が結合したFGFR1の構造 (Mohammed et al., 1996)において、これらの水素結合
は、アデニンNH2とE562 (E917 VEG FR2ΔP)のバックボ−ンC=Oとの間と、アデニ
ンN1とA546 (C919 VEGFR2Δ50P)のバックボ−ンNHとの間に存在する。ここで提
示した構造は結合ヌクレオチドを含んでいないけれども、これらバックボ−ン原
子の位置がFGFR1に類似していることは、これらの水素結合がVEGFR2Δ50P-ATPコ
ンプレックス中に形成され、したがってアデニンが類似する位置に結合するのが
期待されることを示している(図4)。
【0058】 図7は、VEGFR2Δ50PとFGFR1の触媒作用部位を示していて、VEGF R2Δ50PとFG
FR1(AMP-PCP) コンプレックス(molecule B, Mohammadi et al., 1996) の構造の
ヌクレオチド結合部位の重ね合わせにおけるCαトレ−スといくつかの側鎖を示
す立体図である。この重ね合わせは、C末端のヘリックス (D, E, F, G, H, I)
のCα位置を用いて行った。VEGFR2Δ50Pの炭素原子は黄色で、FGFR1の炭素原子
は紫色で示した。他のタンパク原子に対しては、酸素が赤色、窒素が青色、硫黄
が緑色に色付けした。FGFR1構造のAMP-PCPはオレンジ色で描いた。ラベルはVEGF
R2Δ50P残基に対応する。図はXfit (McRee et al., (1992) J. Mol. Graph. 10.
44-46)で作成した。
FR1(AMP-PCP) コンプレックス(molecule B, Mohammadi et al., 1996) の構造の
ヌクレオチド結合部位の重ね合わせにおけるCαトレ−スといくつかの側鎖を示
す立体図である。この重ね合わせは、C末端のヘリックス (D, E, F, G, H, I)
のCα位置を用いて行った。VEGFR2Δ50Pの炭素原子は黄色で、FGFR1の炭素原子
は紫色で示した。他のタンパク原子に対しては、酸素が赤色、窒素が青色、硫黄
が緑色に色付けした。FGFR1構造のAMP-PCPはオレンジ色で描いた。ラベルはVEGF
R2Δ50P残基に対応する。図はXfit (McRee et al., (1992) J. Mol. Graph. 10.
44-46)で作成した。
【0059】 疾患に関与するキナ−ゼのATP結合部位の変化は、治療薬としての選択的ATP競
合抑制剤を設計するに当たっては相当重要である。FGFR1とVEGFR2Δ50PとのATP
結合部位を比較すると、その部位の全体的な構築は保存されているが、いくつか
の配列の違いがリガンド結合に対する接近領域の形状の違いになっていることが
判る。この部位におけるFGFR1とVEGFR2Δ50Pとの間の特定の配列の違いは、V899
(1545 FGFR1), F918 (Y563 FGFR1), C919 (A564 FGFR1), C1045 (A640 FGFR1)
が含まれている(図7)。同様に、三元IRKPコンプレックス構造と比較すると、 V
916 (M1076 IRK), F918 (L1078), C919 (M1079 IRK), L1035 (Ml139 IRK), なら
びに C1045 (G1149 IRK)におけるアデニン部位の変化が判る。VEGFR2Δ50P構造
をセリン/スレオニンキナ−ゼ構造と比較すると、アデニン部位におけるより大
きな配列と構造の変化さえも見られ、これらの相違が選択的ATP競合抑制剤を設
計するのに有用であることを示唆している。
合抑制剤を設計するに当たっては相当重要である。FGFR1とVEGFR2Δ50PとのATP
結合部位を比較すると、その部位の全体的な構築は保存されているが、いくつか
の配列の違いがリガンド結合に対する接近領域の形状の違いになっていることが
判る。この部位におけるFGFR1とVEGFR2Δ50Pとの間の特定の配列の違いは、V899
(1545 FGFR1), F918 (Y563 FGFR1), C919 (A564 FGFR1), C1045 (A640 FGFR1)
が含まれている(図7)。同様に、三元IRKPコンプレックス構造と比較すると、 V
916 (M1076 IRK), F918 (L1078), C919 (M1079 IRK), L1035 (Ml139 IRK), なら
びに C1045 (G1149 IRK)におけるアデニン部位の変化が判る。VEGFR2Δ50P構造
をセリン/スレオニンキナ−ゼ構造と比較すると、アデニン部位におけるより大
きな配列と構造の変化さえも見られ、これらの相違が選択的ATP競合抑制剤を設
計するのに有用であることを示唆している。
【0060】 活性化ル−プ タンパクキナ−ゼは、活性化ル−プ(A-loop)と呼ばれる大きな柔軟なル−プを
含んでいて、その立体配座はキナ−ゼ活性を規制すると仮定される(図2)。多く
のキナ−ゼにおいては、ALの立体配座は、特定のA-loop残基のリン酸化によっ
て制御される(J ohnson et al., 1996)。そのル−プは、一般的には保存残基DFG
から始まり、保存APE配列で終わるものとして規定される(Johnson et al.,
1996)。VEGFR-2において、このフラグメントは、Dl046-El075に対応し、2個の
チロシン(Y1054、Y1059)を含む。Y1054とY1059の両方は、VEGFR-2の細胞質ゲル
ドメインがE. coilに発現されたときに、自己リン酸化部位になることが見いだ
された(Dougher-Vermazen et al., 1994)。V EGFR2Δ50に対してここに記載した
インビトロ自己リン酸化プロトコルを用いて、Yl059に安定したリン酸化部位が
示されたけれども、Y1054のリン酸化を示す証拠は発見されなかった。
含んでいて、その立体配座はキナ−ゼ活性を規制すると仮定される(図2)。多く
のキナ−ゼにおいては、ALの立体配座は、特定のA-loop残基のリン酸化によっ
て制御される(J ohnson et al., 1996)。そのル−プは、一般的には保存残基DFG
から始まり、保存APE配列で終わるものとして規定される(Johnson et al.,
1996)。VEGFR-2において、このフラグメントは、Dl046-El075に対応し、2個の
チロシン(Y1054、Y1059)を含む。Y1054とY1059の両方は、VEGFR-2の細胞質ゲル
ドメインがE. coilに発現されたときに、自己リン酸化部位になることが見いだ
された(Dougher-Vermazen et al., 1994)。V EGFR2Δ50に対してここに記載した
インビトロ自己リン酸化プロトコルを用いて、Yl059に安定したリン酸化部位が
示されたけれども、Y1054のリン酸化を示す証拠は発見されなかった。
【0061】 ここで提示された非リガンドVEGFR2Δ50P構造において、A-loopは非常に易動
性であって、翻訳可能な電子密度は、ル−プのほとんどの中心部分(G1048-G1063
)には存在していなかった。この不秩序は、他のキナ−ゼ構造から差し引いたA-l
oopの可動性と一致している。たとえば、非リン酸化FGFR1キナ−ゼ構造の非対称
ユニット中の2個の分子のうち、A-loopの中心は、分子Aにおいて比較的高い温
度因子を持ち、分子Bにおいては完全に不規則に配列していた。残基1048-1063
はVEGFR2Δ50P中にモデル化できなかったけれども、明白な電子密度が残基Dl064
-El075に対して存在していて、これらの残基が非リン酸化FGFR1構造において観
察されるような立体配座に類似した立体配座を採用していることを明らかに示し
ている。D1064-P1068のセグメントは、触媒作用を有する残基D1028とR1032とに
隣接する拡張構造を有する(図3(A))。(MgAMP-PNP)ペプチド−IRKPコンプレ
ックス構造の構造を比較すると、このVEGFR2Δ50P構造中のR1066-P1068の位置は
、基質結合に対して抑制的であることが示される。P1066は、三元IRK3Pコンプレ
ックス構造中のペプチド基質のチロシン側鎖に割り付けられた等価スペ−スを占
有している。残基 L1069-E1075の立体配座は、三元IRKPコンプレックス構造中の
立体配座と類似しているが、2つの構造間のP1068 (P1172 IRK)で完全に方向が
変化している。IRK構造において、このプロリンに対してN末端の構造残基は、
αEFに対して向いているのに対して、VEGFR2Δ50Pにおいてはタンパクの反対
側のαDに対して向いている(図2、図3)。
性であって、翻訳可能な電子密度は、ル−プのほとんどの中心部分(G1048-G1063
)には存在していなかった。この不秩序は、他のキナ−ゼ構造から差し引いたA-l
oopの可動性と一致している。たとえば、非リン酸化FGFR1キナ−ゼ構造の非対称
ユニット中の2個の分子のうち、A-loopの中心は、分子Aにおいて比較的高い温
度因子を持ち、分子Bにおいては完全に不規則に配列していた。残基1048-1063
はVEGFR2Δ50P中にモデル化できなかったけれども、明白な電子密度が残基Dl064
-El075に対して存在していて、これらの残基が非リン酸化FGFR1構造において観
察されるような立体配座に類似した立体配座を採用していることを明らかに示し
ている。D1064-P1068のセグメントは、触媒作用を有する残基D1028とR1032とに
隣接する拡張構造を有する(図3(A))。(MgAMP-PNP)ペプチド−IRKPコンプレ
ックス構造の構造を比較すると、このVEGFR2Δ50P構造中のR1066-P1068の位置は
、基質結合に対して抑制的であることが示される。P1066は、三元IRK3Pコンプレ
ックス構造中のペプチド基質のチロシン側鎖に割り付けられた等価スペ−スを占
有している。残基 L1069-E1075の立体配座は、三元IRKPコンプレックス構造中の
立体配座と類似しているが、2つの構造間のP1068 (P1172 IRK)で完全に方向が
変化している。IRK構造において、このプロリンに対してN末端の構造残基は、
αEFに対して向いているのに対して、VEGFR2Δ50Pにおいてはタンパクの反対
側のαDに対して向いている(図2、図3)。
【0062】 結晶化前のY1059のリン酸化にもかかわらず、残基D1064-P1068に対してここで
見られた立体配座は、非リン酸化FGFR1構造における類似残基に対して観察され
た阻害的立体配座に類似している。VEGFR2Δ50のY1059は、タンパクチロシンキ
ナ−ゼの間の比較的に保存されたリン酸化部位に対応する。三元IRKPコンプレッ
クス構造とリン酸化リンパ球キナ−ゼ(Lck) 構造(Yamaguchi and Hendrickson,
1996)において、この位置のチロシン(Y1163 IRK, Y594 Lck)はリン酸化され、A-
loopは、リン酸化cAPK三元コンプレックス構造(Zheng et al., 1993)において観
察されたものと類似する非阻害的立体配座を有する。この位置でのホスフェ−ト
群が他のタンパク残基と行う相互反応は、基質とATPとの結合を可能にするA-loo
pの立体配座を安定化する助けになると信じられている(Johnson et al., 1996;
Hubbard, 1997)。しかしながら、ここに記載したこのVEGFR2Δ50構造は、同様な
オ−プンなA-loop立体配座を示さず、むしろル−プの多くが不秩序に配列してい
る阻害的立体配座を有しているので、VEGFR2Δ50Pのモノリン酸化A-loopは数個
の立体配座が関与する動的平衡状態で存在し、かつ、ここで観察された立体配座
はこの結晶環境において最も好ましいものであることが可能である。
見られた立体配座は、非リン酸化FGFR1構造における類似残基に対して観察され
た阻害的立体配座に類似している。VEGFR2Δ50のY1059は、タンパクチロシンキ
ナ−ゼの間の比較的に保存されたリン酸化部位に対応する。三元IRKPコンプレッ
クス構造とリン酸化リンパ球キナ−ゼ(Lck) 構造(Yamaguchi and Hendrickson,
1996)において、この位置のチロシン(Y1163 IRK, Y594 Lck)はリン酸化され、A-
loopは、リン酸化cAPK三元コンプレックス構造(Zheng et al., 1993)において観
察されたものと類似する非阻害的立体配座を有する。この位置でのホスフェ−ト
群が他のタンパク残基と行う相互反応は、基質とATPとの結合を可能にするA-loo
pの立体配座を安定化する助けになると信じられている(Johnson et al., 1996;
Hubbard, 1997)。しかしながら、ここに記載したこのVEGFR2Δ50構造は、同様な
オ−プンなA-loop立体配座を示さず、むしろル−プの多くが不秩序に配列してい
る阻害的立体配座を有しているので、VEGFR2Δ50Pのモノリン酸化A-loopは数個
の立体配座が関与する動的平衡状態で存在し、かつ、ここで観察された立体配座
はこの結晶環境において最も好ましいものであることが可能である。
【0063】 キナ−ゼインサ−トドメイン キナ−ゼインサ−トドメインは、キナ−ゼC末端ロ−ブに発生し、ヘリックス
αDとαEとを結合する。VEGFR-2において、この領域はN933からL1000までの6
8残基の伸長に対応する (図1)。残基T940-E989の欠失による内因性キナ−ゼ活
性に対する上記したような効果の不足は恐らく驚くべきことではない。何故なら
ば、KIDドメインの端は、触媒部位から比較的離れたところ(約35−40Å)に
ありかつ活性化ル−プの位置のタンパクから反対側にある(図2−4)からである
。これらの結果はCSF-1レセプタ一キナ−ゼに対する結果と一致している。CSF-1
レセプタ一キナ−ゼに対する結果においては、CSF-1KIDの64残基の58残
基だけの欠失によってペプチド基質をリン酸化する能力が10%ほど減少した(T
aylor et al., 1989)。しかしながら、βPDGFRの98残基全て欠失させると、ペ
プチド基質に対するキナ−ゼ活性が80%ほども減少した(Severinsson et al.,
(1990) Mol. Cell. Biol. 10, 801-809)。したがって、この発明は、合成触媒
リンカ−を生産することができる。その合成触媒リンカ−は、KIDの大部分が
触媒作用に対して必要ではなく、むしろ少数の残基だけが存在して、αDとαE
との間のリンカ−を形成し、適切なキナ−ゼ構造を維持するようにしなければな
らない。
αDとαEとを結合する。VEGFR-2において、この領域はN933からL1000までの6
8残基の伸長に対応する (図1)。残基T940-E989の欠失による内因性キナ−ゼ活
性に対する上記したような効果の不足は恐らく驚くべきことではない。何故なら
ば、KIDドメインの端は、触媒部位から比較的離れたところ(約35−40Å)に
ありかつ活性化ル−プの位置のタンパクから反対側にある(図2−4)からである
。これらの結果はCSF-1レセプタ一キナ−ゼに対する結果と一致している。CSF-1
レセプタ一キナ−ゼに対する結果においては、CSF-1KIDの64残基の58残
基だけの欠失によってペプチド基質をリン酸化する能力が10%ほど減少した(T
aylor et al., 1989)。しかしながら、βPDGFRの98残基全て欠失させると、ペ
プチド基質に対するキナ−ゼ活性が80%ほども減少した(Severinsson et al.,
(1990) Mol. Cell. Biol. 10, 801-809)。したがって、この発明は、合成触媒
リンカ−を生産することができる。その合成触媒リンカ−は、KIDの大部分が
触媒作用に対して必要ではなく、むしろ少数の残基だけが存在して、αDとαE
との間のリンカ−を形成し、適切なキナ−ゼ構造を維持するようにしなければな
らない。
【0064】 αDに続くVEGFR2Δ50P構造において、残基N933-P937は、緩やかに曲がってい
て、その端がC末端でαDとαIとの軸に対してほぼ垂直になっている拡張鎖を
形成する。異なるフ−リエマップでは、電子密度は、残基N933-P937に対しては
強くはっきりしていて、Y938とK939(Y938とK939との側鎖はモデル化されていな
い)とに対しては弱くなっている(図5)。VEGFR2Δ50における50残基の欠失は
、K939に直接続き、それによってK939の直ぐC末端の残基はV990であり、全長VE
GFR-2の残基番号を維持している。残基V990-K997の配列は秩序立ってなく、翻訳
可能な電子密度はD998でまた始まる。次いで、残基D998-T1001は、残基L1002で
αEと結合する短鎖を形成する(図5と図6)。
て、その端がC末端でαDとαIとの軸に対してほぼ垂直になっている拡張鎖を
形成する。異なるフ−リエマップでは、電子密度は、残基N933-P937に対しては
強くはっきりしていて、Y938とK939(Y938とK939との側鎖はモデル化されていな
い)とに対しては弱くなっている(図5)。VEGFR2Δ50における50残基の欠失は
、K939に直接続き、それによってK939の直ぐC末端の残基はV990であり、全長VE
GFR-2の残基番号を維持している。残基V990-K997の配列は秩序立ってなく、翻訳
可能な電子密度はD998でまた始まる。次いで、残基D998-T1001は、残基L1002で
αEと結合する短鎖を形成する(図5と図6)。
【0065】 図5は、VEGFR2Δ50Pのキナ−ゼインサ−トドメインの電子密度マップを示す
。2.4Åで算出し、1.2δで等高線を描き、精製したモデルと重ね合わせた2Fo-Fc
マップの立体図である。炭素原子は黄色に、酸素原子は赤色に、窒素原子は青色
に描いた。水分子は赤十字に描写した。図はXfit (McRee et al., 1992)で作成
した。
。2.4Åで算出し、1.2δで等高線を描き、精製したモデルと重ね合わせた2Fo-Fc
マップの立体図である。炭素原子は黄色に、酸素原子は赤色に、窒素原子は青色
に描いた。水分子は赤十字に描写した。図はXfit (McRee et al., 1992)で作成
した。
【0066】 図6は、VEGFR2Δ50Pのキナ−ゼインサ−トドメインを示す。VEGFR2Δ50Pのキ
ナ−ゼインサ−トドメインの秩序立って配列した残基を示す立体断面図。炭素原
子は黄色に、酸素原子は赤色に、窒素原子は青色に、硫黄原子は緑色に描いた。
図は、図5から約180°回転した図であって、Xfit (McRee et al., 1992)で
作成した。
ナ−ゼインサ−トドメインの秩序立って配列した残基を示す立体断面図。炭素原
子は黄色に、酸素原子は赤色に、窒素原子は青色に、硫黄原子は緑色に描いた。
図は、図5から約180°回転した図であって、Xfit (McRee et al., 1992)で
作成した。
【0067】 KIDのN末端とC末端における2本の鎖は、他のキナ−ゼ構造のこの領域で
見られる立体配座とは異なる疑似2本鎖平行βシ−トの構造を形成する。したが
って、KIDの2つの端では、VEGFR-2におけるこのドメインの全体的なKID
の立体配座と位置とを安定化する助けとなる種々の相互作用が行われる。K931の
側鎖は、E954の側鎖とのイオン相互作用を行い、またD998のバックボ−ンカルボ
ニルと水素結合する(図6)。鎖間の水素結合相互作用には、L1000 NH とのE93
4バックボ−ンC=O, L1000 C=OとのV936 NH、L1002 NH とのP937 C=O が含まれる
。これらの極性相互作用に加えて、F935、P937、L100の側鎖は広範な疎水性接触
に関与している。F935の側鎖は、L928, P937, L1000, L1002, L1005, L1001, Y1
130 の側鎖によって形成された疎水性ポケット中に存在する(図5、図6)。L100
0側鎖はまた、Y927, K931, H 1004, Y1008の側鎖に対して束になっている。
見られる立体配座とは異なる疑似2本鎖平行βシ−トの構造を形成する。したが
って、KIDの2つの端では、VEGFR-2におけるこのドメインの全体的なKID
の立体配座と位置とを安定化する助けとなる種々の相互作用が行われる。K931の
側鎖は、E954の側鎖とのイオン相互作用を行い、またD998のバックボ−ンカルボ
ニルと水素結合する(図6)。鎖間の水素結合相互作用には、L1000 NH とのE93
4バックボ−ンC=O, L1000 C=OとのV936 NH、L1002 NH とのP937 C=O が含まれる
。これらの極性相互作用に加えて、F935、P937、L100の側鎖は広範な疎水性接触
に関与している。F935の側鎖は、L928, P937, L1000, L1002, L1005, L1001, Y1
130 の側鎖によって形成された疎水性ポケット中に存在する(図5、図6)。L100
0側鎖はまた、Y927, K931, H 1004, Y1008の側鎖に対して束になっている。
【0068】 本発明者によって、KIDの部分の欠失はまた修飾VEGFR-2ポリタンパクに対
してその他の有用でかつ望ましい特徴を付与する。修飾ポリペプチドは、溶液中
でより高温に曝されたときに、野生型タンパクよりもより高い安定性を示した。
さらに、修飾ポリペプチドはまた、野生型タンパクよりもより改良された溶解度
を示した。当業者にとっては、これらの性質がこの発明の種々の商業的側面を改
良できることは明らかである。修飾タンパクの潜在的な用途の例としては、遺伝
子チップ技術(Affymax, Inc,)、ファ−ジ・デイスプレイペプチド・ライブラリ
−(New England BioLabs, Inc.製The Ph.D. Kit)ならびにFT-NMR による深層分
析などに基づく種々の方法にするレセプタ−に対する潜在的リガンドの高能率ス
クリ−ニング(HTS)が含まれる。
してその他の有用でかつ望ましい特徴を付与する。修飾ポリペプチドは、溶液中
でより高温に曝されたときに、野生型タンパクよりもより高い安定性を示した。
さらに、修飾ポリペプチドはまた、野生型タンパクよりもより改良された溶解度
を示した。当業者にとっては、これらの性質がこの発明の種々の商業的側面を改
良できることは明らかである。修飾タンパクの潜在的な用途の例としては、遺伝
子チップ技術(Affymax, Inc,)、ファ−ジ・デイスプレイペプチド・ライブラリ
−(New England BioLabs, Inc.製The Ph.D. Kit)ならびにFT-NMR による深層分
析などに基づく種々の方法にするレセプタ−に対する潜在的リガンドの高能率ス
クリ−ニング(HTS)が含まれる。
【0069】 したがって、KID全体が欠失でき、PDGFαとβのようなその他の関連RTK
や、その他の上記したタンパク中にいくらかの触媒活性を保持することが考えら
れる。さらに、この発明の1つの実施形態においては、全体のKIDを欠失して
、少なくとも1個のアミノ酸の合成触媒リンカ−と置換して、タンパクの触媒活
性と結晶化の両方を保持することもできる。
や、その他の上記したタンパク中にいくらかの触媒活性を保持することが考えら
れる。さらに、この発明の1つの実施形態においては、全体のKIDを欠失して
、少なくとも1個のアミノ酸の合成触媒リンカ−と置換して、タンパクの触媒活
性と結晶化の両方を保持することもできる。
【0070】 PDGFRαタンパクのクロ−ニング この実施例においては、PDGFRαポリタンパクのクロ−ニングをVEGFR-2に対し
て上述した方法に従って行った。PDGFRαに対するコ−ド化配列は、Matsui, T.,
et al., (1989) Science 243:800-804 (Accession No. 66814)に記載した配列
から誘導した。次いで、タンパクの細胞質ドメインと触媒作用ドメイン中に位置
する残基を解読するPCRオリゴヌクレオチドプライマを作成した。PDGFRαの触媒
作用ドメインは、図1の残基689 (N)から始まり、残基791(T)で終了するように
示されている。
て上述した方法に従って行った。PDGFRαに対するコ−ド化配列は、Matsui, T.,
et al., (1989) Science 243:800-804 (Accession No. 66814)に記載した配列
から誘導した。次いで、タンパクの細胞質ドメインと触媒作用ドメイン中に位置
する残基を解読するPCRオリゴヌクレオチドプライマを作成した。PDGFRαの触媒
作用ドメインは、図1の残基689 (N)から始まり、残基791(T)で終了するように
示されている。
【0071】 クロ−ニングと精製工程の残りの工程は、VEGFR2Δ50タンパクに対して記載し
た工程と類似するものであってもよく、また当業者にとって公知の技術を使用す
ることもできる。 RTKファミリ−の他の成員ならびに他の用途も使用することができ、かつ、
上記実施例に何ら限定されるものではない。
た工程と類似するものであってもよく、また当業者にとって公知の技術を使用す
ることもできる。 RTKファミリ−の他の成員ならびに他の用途も使用することができ、かつ、
上記実施例に何ら限定されるものではない。
【0072】 「配列表」
【表3】
【0073】 「配列表」
【表4】
【0074】 「配列表」
【表5】
【0075】 「配列表」
【表6】
【0076】 「配列表」
【表7】
【0077】
【表8】
【0078】 「配列表」
【表9】
【0079】
【表10】
【配列表】
【図1】 VEGFR2の触媒ドメインに対する2次的構造の指定(Procheckによる)と、その
他の代表的なRTKとの配列連携を示す。
他の代表的なRTKとの配列連携を示す。
【図2(A)】 キナ−ゼドメイン構造のバックボ−ンを示す。
【図2(B)】 キナ−ゼドメイン構造のバックボ−ンを示す。
【図2(C)】 キナ−ゼドメイン構造のバックボ−ンを示す。
【図3(A)】 VEGFR2Δ50PとIRKPとの触媒作用部位を示す。
【図3(B)】 VEGFR2Δ50PとIRKPとの触媒作用部位を示す。
【図4】 VEGFR2Δ50PとFGFR1の触媒作用部位を示す。
【図5】 VEGFR2Δ50Pのキナ−ゼインサ−トドメインの電子密度マップを示す。
【図6】 VEGFR2Δ50Pのキナ−ゼインサ−トドメインを示す。
【図7】 結晶化とデータ収集工程におけるVEGFR2に対して得られたX線結晶座標。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 37/00 103 G01N 23/20 // G01N 23/20 C12N 15/00 ZNAA (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU, CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,G E,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS ,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK, LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM, TR,TT,UA,UG,UZ,VN,YU,ZA,Z W (72)発明者 パラスト,カムラン ヴィー. アメリカ合衆国カリフォルニア州92109、 サン・デイエゴ、ダイアモンド・ストリー ト1855、5−218号 (72)発明者 ゲーリング,マイケル アール. アメリカ合衆国カリフォルニア州92115、 サン・デイエゴ、コリエール・アベニュー 5468 (72)発明者 カン,チェン−チェン アメリカ合衆国カリフォルニア州92014、 デル・メール、ヂュランゴ・ドライブ 13951 (72)発明者 アペルト,クルジスツトーフ アメリカ合衆国カリフォルニア州92064、 ポーウエイ、メープルウッド・ストリート 14500 (72)発明者 ウッカシャム,ジョン エー. アメリカ合衆国カリフォルニア州92029、 エスコンデイト゛、シェデイリッジ・アベ ニュー2426 (72)発明者 ショウオルター,リチャード エドワード アメリカ合衆国カリフォルニア州92040、 レイクサイド、コールデントップ・ドライ ブ13329 (72)発明者 テムプツイズク−ラッセル,アンナ マリ ア アメリカ合衆国カリフォルニア州92130、 サン・デイエゴ、カミント・ボレーゴ4785 (72)発明者 ムロズコウスキ,バーバラ アメリカ合衆国カリフォルニア州92024、 エンシニタス、ストラトフォード・ドライ ブ1066 (72)発明者 ビラフランカ,ジーサス エルネスト アメリカ合衆国カリフォルニア州92103、 サン・デイエゴ、ウパス・ストリート1282 Fターム(参考) 2G001 AA01 BA18 CA01 EA01 GA01 KA08 LA01 RA02 2G045 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA80 FA11 FA40 FB02 FB03 FB04 JA01 JA20 4B024 AA01 AA11 BA10 CA10 EA02 GA11 HA01 4B050 CC04 DD20 FF17 LL01 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ27 QR32 QR63
Claims (16)
- 【請求項1】 修飾レセプタ一チロシンキナ−ゼ(RTK)ポリペプチドと
相互作用する能力について候補化合物をアッセイする方法であって、 (a)該修飾RTK遺伝子構築物をエンコ−ドする単離したDNA配列もしくは
その変異型を発現する工程であって、該構築物においては、該修飾RTK遺伝子
が合成触媒リンカ−を含み、該リンカ−は、前記ポリペプチドと前記候補物質と
の相互作用のためにアッセイをすることができるポリペプチドの型を産生するこ
とができるホスト中において、VEGFR-2遺伝子の触媒領域のキナ−ゼインサ−ト
ドメイン(KID)からの少なくとも1個のアミノ酸からなる工程と、 (b)前記修飾ポリペプチドを前記候補物質に接触させる工程と、 (c)前記ポリペプチドと前記候補物質との相互作用を評価する工程とからな
ることを特徴とするアッセイ方法。 - 【請求項2】 請求項1に記載する方法において、前記評価工程が、 (a)前記修飾ポリペプチドをX線結晶学的手法に適した条件下で結晶化する
工程と、 (b)前記X線結晶学的手法を前記ポリペプチドに施す工程とから更に構成さ
れていること。 - 【請求項3】 修飾VEGFR-2レセプタ一ポリペプチドと相互作用する能力に
ついて候補化合物をアッセイする方法であって、 (a)該修飾VEGFR-2遺伝子構築物をエンコ−ドする単離したDNA配列もしくは
その変異型を発現する工程であって、該構築物においては、該修飾VEGFR-2遺伝
子が合成触媒リンカ−を含み、該リンカ−は、前記ポリペプチドと前記候補物質
との相互作用のためにアッセイをすることができるポリペプチドの型を産生する
ことができるホスト中において、VEGFR-2遺伝子の触媒領域のキナ−ゼインサ−
トドメイン(KID)からの少なくとも1個のアミノ酸からなる工程と、 (b)前記修飾ポリペプチドを前記候補物質に接触させる工程と、 (c)前記ポリペプチドと前記候補物質との相互作用を評価する工程とからな
ることを特徴とするアッセイ方法。 - 【請求項4】 請求項2に記載する方法において、前記評価工程が、 (a)前記修飾ポリペプチドをX線結晶学的手法に適した条件下で結晶化する
工程と、 (b)前記X線結晶学的手法を前記ポリペプチドに施す工程とから更に構成さ
れていること。 - 【請求項5】 修飾RTK遺伝子構築物をエンコ−ドする単離したDNA配列
もしくはその変異型であって、該構築物においては、該修飾RTK遺伝子が合成
触媒リンカ−を含み、該リンカ−は、RTK遺伝子の触媒領域のキナ−ゼインサ
−トドメインからの少なくとも1個のアミノ酸からなること。 - 【請求項6】 修飾VEGFR-2遺伝子構築物をエンコ−ドする単離したDNA配列
もしくはその変異型であって、該構築物においては、該修飾VEGFR-2遺伝子が合
成触媒リンカ−を含み、該リンカ−は、VEGFR-2遺伝子の触媒領域のキナ−ゼイ
ンサ−トドメインからの少なくとも1個のアミノ酸からなることを特徴とする修
飾VEGFR-2遺伝子構築物をエンコ−ドする単離したDNA配列もしくはその変異型。 - 【請求項7】 請求項6に記載する単離オリゴヌクレオチド配列が配列番号
5に示すDNA配列もしくはその変異型からなること。 - 【請求項8】 請求項6に記載する単離オリゴヌクレオチド配列が配列番号
6に示すDNA配列もしくはその変異型からなること。 - 【請求項9】 修飾RTK遺伝子ポリペプチドの活性に対するアゴニストも
しくはアンタゴニストである化合物を評価する方法であって、該ポリペプチドに
おいては、該修飾RTK遺伝子が合成触媒リンカ−を含み、該リンカ−は、該修
飾RTKポリペプチドの触媒領域のキナ−ゼインサ−トドメインからの少なくと
も1個のアミノ酸からなる方法が、 (a)前記修飾RTKポリペプチドを結晶化する工程と、 (b)前記結晶化した修飾RTKポリペプチドに対して結晶学的座標を得る工
程と、 (c)前記修飾RTKポリペプチドに対する結晶学的座標をコンピュ−タアル
ゴリスムに適用して、前記アルゴリスムが、前記ポリペプチドに対するアゴニス
トもしくはアンタゴニストとして作用する分子を設計するのに使用するのが適し
た前記RTKポリペプチドのモデルを作成する工程と、 (d)反復プロセスを行って、種々の分子構造を前記コンピュ−タ作成モデル
に適用して前記ポリペプチドに対する潜在的なアゴニストもしくはアンタゴニス
トを同定する工程とからなること。 - 【請求項10】 修飾VEGFR-2遺伝子ポリペプチドの活性に対するアゴニス
トもしくはアンタゴニストである化合物を評価する方法であって、該ポリペプチ
ドにおいては、該修飾VEGFR-2遺伝子が合成触媒リンカ−を含み、該リンカ−は
、該修飾VEGFR-2ポリペプチドの触媒領域のキナ−ゼインサ−トドメインからの
少なくとも1個のアミノ酸からなる方法が、 (a)前記修飾VEGFR-2ポリペプチドを結晶化する工程と、 (b)前記結晶化した修飾VEGFR-2ポリペプチドに対して結晶学的座標を得る
工程と、 (c)前記修飾VEGFR-2ポリペプチドに対する結晶学的座標をコンピュ−タア
ルゴリスムに適用して、前記アルゴリスムが、前記ポリペプチドに対するアゴニ
ストもしくはアンタゴニストとして作用する分子を設計するのに使用するのに適
した前記VEGFR-2ポリペプチドのモデルを作成する工程と、 (d)反復プロセスを行って、種々の分子構造を前記コンピュ−タ作成モデル
に適用して前記ポリペプチドに対する潜在的なアゴニストもしくはアンタゴニス
トを同定する工程とからなること。 - 【請求項11】 請求項10に記載する方法において、前記修飾VEGFR-2ポ
リペプチドが配列番号5のVEGFR2Δ50ポリペプチドからなること。 - 【請求項12】 第8図のX線結晶学的座標を有するVEGFR-2遺伝子構築物
をエンコ−ドする単離したDNA配列もしくはその変異型。 - 【請求項13】 X線結晶学的手法による測定に適するようにレセプタ一チ
ロシンキナ−ゼファミリ−のタンパクもしくはポリペプチドを作成する方法であ
って、 (a)前記タンパクのキナ−ゼインサ−トドメインを同定すること、 (b)前記キナ−ゼインサ−トドメインから特定数のアミノ酸残基を欠失させ
て、該修飾ポリペプチドが安定した立体配座を有し、X線結晶学的手法による測
定に適する結晶状態を形成すること、 (c)前記修飾ポリペプチドを結晶化することを特徴とする方法。 - 【請求項14】 RTKポリペプチドと相互作用をする化合物の医薬品設計
方法であって、 (a)目標RTKポリペプチドのKID部分を欠失させること、 (b)前記目標RTKポリペプチドを結晶化すること、 (c)前記目標RTKポリペプチドのX線結晶を解像すること、 (d)前記目標RTKポリペプチドのX線結晶解像から得られたデ−タを、前
記ポリペプチドに対するアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する分子
設計に使用するのに適する前記目標RTKポリペプチドのモデルを作成するコン
ピュ−タアルゴリスムに適用すること、 (e)反復プロセスを行って、種々の分子構造を前記コンピュ−タ作成モデル
に適用して前記ポリペプチドに対する潜在的なアゴニストもしくはアンタゴニス
トを同定する工程とからなることを特徴とする方法。 - 【請求項15】 修飾VEGFR-2ポリペプチドと相互作用をする化合物の医薬
品設計方法であって、 (a)該修飾VEGFR-2ポリペプチドのKID部分を欠失させること、 (b)前記修飾VEGFR-2ポリペプチドを結晶化すること、 (c)前記修飾VEGFR-2ポリペプチドのX線結晶を解像すること、 (d)前記修飾VEGFR-2ポリペプチドのX線結晶解像から得られたデ−タを、
前記ポリペプチドに対するアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する分
子設計に使用するのに適する前記修飾VEGFR-2ポリペプチドのモデルを作成する
コンピュ−タアルゴリスムに適用すること、 (e)反復プロセスを行って、種々の分子構造を前記コンピュ−タ作成モデル
に適用して前記修飾VEGFR-2ポリペプチドに対する潜在的なアゴニストもしくは
アンタゴニストを同定する工程とからなることを特徴とする方法。 - 【請求項16】 請求項15に記載する方法において、前記修飾VEGFR-2ポ
リペプチドが配列番号5のVEGFR2Δ50ポリペプチドであること。
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