JP2002533357A - Peptide mimics useful for treating diseases - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 【解決手段】 本発明は、疾患に関連する標的分子に対し免疫応答を誘導する有効量のペプチドミミックで哺乳動物を治療することを特徴とする哺乳動物におけるメラノーマ等の疾患を治療する方法を提供する。 (57) [Summary] The present invention provides a method for treating a disease such as melanoma in a mammal, comprising treating the mammal with an effective amount of a peptide mimic that induces an immune response against a target molecule associated with the disease. I do.
Description
【０００１】[0001]
メラノーマなどの疾患の治療における現行の免疫療法的アプローチでは、ＨＭ
Ｖ−ＭＡＡや腫瘍関連抗原などの血管新生促進標的に対し、大量の抗体を受動投
与する方法がとられている。この治療戦略には、患者に対し大量のモノクロナー
ル抗体を投与することや長期間に亘り一定の高濃度抗体を患者に維持しつづける
ことの難しさのため、限界がある。Current immunotherapeutic approaches in the treatment of diseases such as melanoma include HM
A method of passively administering a large amount of an antibody to a target for promoting angiogenesis such as V-MAA or a tumor-associated antigen has been adopted. This treatment strategy has limitations due to the difficulty in administering large amounts of monoclonal antibody to the patient and the difficulty in maintaining a constant high concentration of antibody in the patient over a long period of time.
【０００２】 近年、あらゆる癌や一般の疾患の他、悪性メラノーマにも能動特異的免疫療法
を応用開発するべく関心が高まっている。この傾向は、少なくとも過去において
は、いったんこの疾患が転移を起こしたら効果的治療法がないことと、抗体を用
いた受動免疫療法の臨床治験結果が余り思わしくなかったことを反映したもので
ある。種々の利用可能な免疫原には、Ｔ細胞で決定されるエピトープを発現する
ヒトメラノーマ関連抗原に由来するペプチドが科学領域において最も一般的であ
る。このアプローチへの関心は、ｉ）免疫応答の発達やＣＴＬによる標的細胞の
認識および破壊へと導く分子段階について、近年我々の知見が飛躍的に進歩した
こと、ｉｉ）メラノーマ細胞を認識するためにＣＴＬが利用するペプチドの同定
、を反映している。ペプチドを用いた免疫療法の有効性について現在多くの臨床
試験で評価が進められているが、免疫療法を受ける患者のおよそ４０%に臨床応
答が認められたことからもその有効性は明らかである。しかし、もっぱらＴ細胞
に媒介されたメラノーマ細胞の破壊にのみ依存した治療戦略は成功しているとは
いえ、メラノーマ病巣や特に転移においてよく見られるＨＬＡクラスＩ抗原及び
／又は抗原プロセシング機構の構造及び／又は機能的な異常には有効ではないと
思われる。現在Ｔ細胞に基づく免疫療法の治験の多くが転移性患者のみに対して
行われていることから、後者の所見が特に重要である。[0002] In recent years, there has been increasing interest in applying active specific immunotherapy to malignant melanoma as well as all cancers and general diseases. This trend reflects, at least in the past, the lack of effective treatment once the disease had metastasized, and the poor clinical trial results of passive immunotherapy with antibodies. Among the various available immunogens, peptides derived from human melanoma-associated antigens that express epitopes determined on T cells are the most common in the scientific arena. Interest in this approach includes: i) the recent breakthrough in our knowledge of the molecular steps leading to the development of the immune response and the recognition and destruction of target cells by CTLs; and ii) recognition of melanoma cells. This reflects the identification of peptides used by CTL. The efficacy of peptide-based immunotherapy is currently being evaluated in many clinical trials, but the efficacy is evident from the fact that approximately 40% of patients receiving immunotherapy have a clinical response . However, although therapeutic strategies that rely solely on T cell-mediated destruction of melanoma cells have been successful, the structure and structure of HLA class I antigens and / or antigen processing mechanisms that are common in melanoma foci and particularly in metastases are known. It does not appear to be effective for functional abnormalities. The latter finding is of particular importance, as many trials of T cell-based immunotherapy are currently performed only on metastatic patients.
【０００３】 Ｔ細胞免疫にもっぱら依存している能動特異的免疫療法では、ＨＬＡクラスＩ
抗原及び／又は抗原プロセシング機構の異常が、その成否にマイナス効果を与え
ると考えられ、その潜在的なマイナス効果のため、ＨＭＷ−ＭＡＡに対し液性お
よび細胞性免疫の双方を誘導する必要がある。[0003] Active-specific immunotherapies that rely exclusively on T-cell immunity include HLA class I
Abnormalities in antigens and / or antigen processing mechanisms are thought to have a negative effect on their success, and because of their potential negative effects, it is necessary to induce both humoral and cellular immunity against HMW-MAA .
【０００４】 ＨＭＷ−ＭＡＡはメラノーマ患者においては免疫原ではないが、能動特異的免
疫療法のために選択されている。その理由は、ＨＭＷ−ＭＡＡは異質性の少ない
メラノーマ病変に高率で発現し、正常組織における分布は限定されており、その
認識はメラノーマ患者の免疫系に発現し、メラノーマ細胞の転移の潜在能力に一
定の役割を果たしているためである。故に、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体はメラノーマ
細胞の免疫破壊を媒介するのみならず、メラノーマ細胞の生物学的観点において
ＨＭＷ−ＭＡＡの機能を妨げることによりこの疾患の臨床経過上有益な効果を示
すであろう。[0004] HMW-MAA is not an immunogen in melanoma patients, but has been selected for active specific immunotherapy. The reason is that HMW-MAA is highly expressed in less heterogeneous melanoma lesions, has a limited distribution in normal tissues, its recognition is expressed in the immune system of melanoma patients, and the metastatic potential of melanoma cells Because it plays a certain role. Therefore, anti-HMW-MAA antibodies not only mediate immune destruction of melanoma cells, but also have a beneficial effect on the clinical course of the disease by interfering with the function of HMW-MAA in the melanoma cell biological aspects. Would.
【０００５】[0005]
本発明は、疾患に関連する標的分子に対し免疫応答を誘導(elicit)する有効量
のペプチドミミック(peptide mimic)で哺乳動物を治療することを特徴とする。
哺乳動物におけるメラノーマ等の疾患を治療する方法を提供をするものである。 また本発明は、標的分子に対し、免疫応答を誘導するペプチドミミックを提供
するものである。 また本発明は、疾患に関連する標的分子に対し免疫応答を誘導できるペプチド
ミミックを発現する有効量のベクターで哺乳動物を治療することを特徴とする。
哺乳動物における疾患を治療する方法を提供するものである。 更に本発明は、疾患に関連する標的分子に対し免疫応答を誘導するペプチドミ
ミックをコードする核酸分子を提供するものである。The invention features treating a mammal with an effective amount of a peptide mimic that elicits an immune response to a target molecule associated with the disease.
It is intended to provide a method for treating a disease such as melanoma in a mammal. The present invention also provides a peptide mimic that induces an immune response against a target molecule. Further, the present invention is characterized in that a mammal is treated with an effective amount of a vector that expresses a peptide mimic capable of inducing an immune response against a target molecule associated with a disease.
It provides a method for treating a disease in a mammal. Further, the present invention provides a nucleic acid molecule encoding a peptide mimic that induces an immune response against a target molecule associated with a disease.
【０００６】[0006]
本発明は、哺乳動物におけるメラノーマ等の疾患の治療法を提供する。本発明
方法は疾患に関連する標的分子に対し免疫応答を誘導する有効量のペプチドミミ
ック(peptide mimic)で哺乳動物を治療することを特徴とする。対象となる疾患
は癌、関節炎、黄斑変性症、乾癬、虚血及びその他の病態であることができる。
動物は好ましくは哺乳動物であり、ヒト、又はマウス、ラット、ウサギ等の通常
の実験動物、又はウシ、ウマ、ブタ等の家畜である。The present invention provides a method for treating a disease such as melanoma in a mammal. The method of the invention comprises treating a mammal with an effective amount of a peptide mimic that induces an immune response against a target molecule associated with the disease. The disease of interest can be cancer, arthritis, macular degeneration, psoriasis, ischemia and other conditions.
The animal is preferably a mammal, and is a human or a normal laboratory animal such as a mouse, a rat, a rabbit or the like, or a domestic animal such as a cow, a horse or a pig.
【０００７】 上記の本発明方法の他に、本発明は上記方法において使用するペプチドミミッ
クも提供する。本発明のペプチドミミックは適切に免疫系に提示した場合、有効
な免疫応答を誘導する。免疫応答は好ましくは腫瘍の増殖等の疾患を妨害し、遅
延させ、阻止することで、疾患に関連する病状を阻害し又は除去する。[0007] In addition to the above method of the present invention, the present invention also provides a peptidomimetic used in the above method. The peptidomimics of the present invention, when properly presented to the immune system, induce an effective immune response. The immune response preferably interferes with, delays, or arrests a disease, such as tumor growth, thereby inhibiting or eliminating a disease state associated with the disease.
【０００８】 本発明のペプチドミミックは、高分子量メラノーマ関連抗原等の、疾患経過に
関連するいかなる標的分子をも擬態化(mimic)することができるが、これらに限
定されない。更に本発明ペプチドミミックは疾患経過に関連するレセプター、例
えばｆｌｋ−１、ｆｌｔ−１、及びＫＤＬ；又はビトロネクチンレセプターαｖ
β３等のインテグリン；又は血管内皮カドヘリン類（ＶＥ−カドヘリン−１とＶ
Ｅ−カドヘリン−２）；及びＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２／Ｔｅｋ、ＥＧＦｒ、ＰＤ
ＧＦ、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−４、Ｆｌｔ−４を擬態化する。しかしこれらは分子
やレセプターの例であり、疾患に関与するどのような標的分子も本発明において
利用する事ができる。ここで標的分子を、疾病状態の間、哺乳動物に存在する分
子として定義する。標的分子は疾病状態の間、異常に発現するかもしれないが、
必ずしも異常発現しなくてもよい。標的分子はグリコシル化又は非グリコシル化
ポリペプチド；又はｇｄ3等の糖脂質であることができるが、これらに限定され
ない。[0008] The peptidomimics of the invention can mimic any target molecule associated with the disease course, such as, but not limited to, high molecular weight melanoma-associated antigens. Furthermore, the peptidomimics of the present invention may be used as receptors associated with disease processes, such as flk-1, flt-1, and KDL; or vitronectin receptor αv
integrins such as β3; or vascular endothelial cadherins (VE-cadherin-1 and V
E-cadherin-2); and TIE-1, TIE-2 / Tek, EGFr, PD
Simulates GF, Her-2, Her-4, Flt-4. However, these are examples of molecules and receptors, and any target molecule involved in a disease can be used in the present invention. A target molecule is defined herein as a molecule that is present in a mammal during a disease state. The target molecule may be abnormally expressed during the disease state,
It does not necessarily need to be abnormally expressed. The target molecule can be, but is not limited to, a glycosylated or unglycosylated polypeptide; or a glycolipid such as gd3.
【０００９】 ペプチドミミックは、ファージライブラリーから得たり、又は合成で得ること
ができる。ペプチドミミックは抗原のフラグメント、エピトープ又は抗原決定基
に関連したものであることができる。[0009] Peptide mimics can be obtained from phage libraries or synthetically. A peptidomimetic can be one that is associated with a fragment, epitope or antigenic determinant of an antigen.
【００１０】 ＨＭＷ-ＭＡＡやＧＤ3ガングリオシドは免疫療法に有用な標的である。しかし
疾患に関連したどのような標的分子も本発明に使用することができる。さらに、
各抗原は独立にメラノーマ病変の少なくとも６０％に発現する。したがってそれ
らを組み合わせて使用することによりメラノーマの免疫療法の成否に関し、メラ
ノーマ細胞の抗原多様性によるマイナス効果を最小化することが期待できる。最
後にこれら２つのメラノーマ関連抗原（ＭＡＡ）に対する免疫は、異なる機能的
および免疫媒介機構を通してメラノーマ細胞に影響を与えると考えられ、メラノ
ーマ細胞に対して付加的障害効果が期待できる。[0010] HMW-MAA and GD 3 ganglioside is a useful target for immunotherapy. However, any target molecule associated with a disease can be used in the present invention. further,
Each antigen is independently expressed on at least 60% of melanoma lesions. Therefore, by using them in combination, it can be expected that the negative effect of the antigen diversity of melanoma cells on the success or failure of melanoma immunotherapy will be minimized. Finally, immunization against these two melanoma-associated antigens (MAA) is thought to affect melanoma cells through different functional and immune-mediated mechanisms, and additional damaging effects on melanoma cells can be expected.
【００１１】 悪性メラノーマの臨床過程において、抗イディオタイプ(anti-id)ｍＡｂで誘
導される液性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫には有益な効果がある。これらの発見はＭＡ
Ａミミックによる能動特異的免疫療法の有効性を裏付けている。しかしながら、
ＨＭＷ-ＭＡＡやＧＤ3ガングリオシド分子の内部イメージを保持する抗ｉｄ ｍ
Ａｂを用いた免疫療法には主として次に記す限界がある：ｉ）ＨＬＡクラスＩ拘
束性の(HLA Class I restricted)、ＨＭＷ-ＭＡＡ特異的ＣＴＬを生成できない
こと、ｉｉ）Ｔ細胞依存性抗ＧＤ3ガングリオシド免疫応答を誘導できないこと
、及びｉｉｉ）元来の(original)抗原と抗−抗ｉｄ抗体との低反応性。従って、
ｉ）ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックの使用はＨＬＡクラスＩ拘束性のＨＭＷ-
ＭＡＡ特異的ＣＴＬの誘導のみならず、抗ＨＭＷ-ＭＡＡ抗体を誘導することが
でき、ｉｉ）ＧＤ3ガングリオシドのペプチドミミックはＴ細胞依存性抗ＧＤ3ガ
ングリオシド免疫応答を誘導することができ、更に、ｉｉｉ）対応するペプチド
ミミックにより引き起こされる自己ＨＭＷ−ＭＡＡとＧＤ3ガングリオシドへの
免疫応答を、元来の抗原と併せることでブースティングホストによって著しく高
めることができる。In the clinical course of malignant melanoma, humoral anti-HMW-MAA immunity induced by anti-id-mAb has a beneficial effect. These discoveries are MA
It supports the effectiveness of active specific immunotherapy with A mimic. However,
Anti id m for holding the internal image of HMW-MAA and GD 3 ganglioside molecule
The immunotherapy with Ab has the following limitations mainly: i) HLA Class I restricted, inability to generate HMW-MAA specific CTL, ii) T cell dependent anti-GD 3 Inability to induce a ganglioside immune response, and iii) low reactivity of the original antigen with the anti-anti-id antibody. Therefore,
i) The use of HMW-MAA peptide mimic is HLA class I restricted HMW-
Not MAA-specific induction of CTL alone can induce anti-HMW-MAA antibody, ii) GD 3 gangliosides peptidomimetic can induce T cell-dependent anti-GD 3 ganglioside immune response, further, iii) the immune response to a corresponding self-HMW-MAA and GD 3 ganglioside caused by peptide mimic, can be enhanced significantly by boosting the host by combining the original antigen.
【００１２】 元来の抗原を伴ったブースティングホストによる自己ＭＡＡへの免疫応答増大
と同様、ＨＭＷ-ＭＡＡやＧＤ3ガングリオシドペプチドミミックの免疫原性を同
定することは、メラノーマ患者の能動特異的免疫療法に関する新規戦略の開発に
貢献すると考えられる。[0012] Similar to increase immune responses to self-MAA by boosting host with original antigen, identifying the immunogenicity of HMW-MAA and GD 3 gangliosides peptide mimic, melanoma patient active specific immunization It will contribute to the development of new strategies for therapy.
【００１３】 本発明は免疫原としてヒト高分子量メラノーマ関連抗原ＨＭＷ-ＭＡＡのペプ
チドミミックを用いて悪性メラノーマに対する能動特異的免疫療法を提供する。
この抗原はメラノーマ病変の少なくとも８０％に発現し、正常細胞における分布
は少なく、その認識がメラノーマ患者の免疫レパートリーに現われるため、メラ
ノーマ患者において免疫原ではないとはいえ、この抗原が能動特異的免疫療法の
ために選択された。The present invention provides active specific immunotherapy for malignant melanoma using a peptide mimic of the human high molecular weight melanoma associated antigen HMW-MAA as an immunogen.
Although this antigen is expressed in at least 80% of melanoma lesions, is poorly distributed in normal cells, and its recognition appears in the immune repertoire of melanoma patients, this antigen is not an immunogen in melanoma patients, but this antigen is active-specific Selected for therapy.
【００１４】 ＨＭＷ-ＭＡＡペプチドミミック、また、どのような抗原も、ヒトおよびマウ
ス抗ＨＭＷ−ＭＡＡのファージディスプレイペプチドライブラリーのパンニング
によって得られる。ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックはメラノーマ患者で自己抗
原に対し免疫を誘導することができるが、元来の抗原によっては誘導できない。
ＨＭＷ-ＭＡＡペプチドミミックはＨＭＷ-ＭＡＡに類似しているが同一ではない
。従ってＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックはＨＭＷ-ＭＡＡを認識するクローン
を刺激するが、自己同一性を確立している期間は抗原に対する親和性が低下して
いるため除去されない。このアプローチの一例として、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ
）をミミックする抗イディオタイプ(anti-id)モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で
免疫した患者においてＣＥＡ抗体が誘導されるが、ＣＥＡで免疫した患者では誘
導されないことが挙げられる。さらにメラノーマ患者の腫瘍関連抗体と定義され
た抗体に対する同時的に誘導する液性および細胞性免疫応答に関する最近の報告
では、ＨＬＡクラスＩ抗原結合モチーフを持ったＨＭＷ-ＭＡＡペプチドミミッ
クが、液性のみならず細胞性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答を誘導できることが証明
されている。したがってＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックは内部イメージを保持
する抗ｉｄ ｍＡｂよりもメラノーマ免疫療法の免疫原として有効である。[0014] The HMW-MAA peptide mimic, as well as any antigen, is obtained by panning a phage display peptide library of human and mouse anti-HMW-MAA. HMW-MAA peptide mimics can induce immunity against self antigens in melanoma patients, but not with the original antigen.
The HMW-MAA peptide mimic is similar but not identical to HMW-MAA. Thus, the HMW-MAA peptide mimic stimulates clones that recognize HMW-MAA, but is not removed during the period of establishing self-identity due to reduced affinity for the antigen. One example of this approach is the use of anti-carcinoembryonic antigen (CEA)
) Is induced in patients immunized with an anti-id monoclonal antibody (mAb) that mimics, but not in patients immunized with CEA. Furthermore, a recent report on simultaneously induced humoral and cellular immune responses to an antibody defined as a tumor-associated antibody in melanoma patients shows that the HMW-MAA peptide mimic with the HLA class I antigen binding motif is However, it has been demonstrated that a cellular anti-HMW-MAA immune response can be induced. Thus, the HMW-MAA peptide mimic is more effective as an immunogen for melanoma immunotherapy than an anti-id mAb that retains internal images.
【００１５】 このペプチドミミックの利用はメラノーマ治療に限定されないが、標的分子が
利用可能であるどのような疾患治療にも有用である。そのようなペプチドミミッ
クは哺乳動物の免疫系に正しく提示した場合、液性および細胞性両方の免疫応答
を誘導する。[0015] The use of this peptide mimic is not limited to the treatment of melanoma, but is useful in the treatment of any disease for which the target molecule is available. Such peptidomimics, when correctly presented to the mammalian immune system, induce both humoral and cellular immune responses.
【００１６】 自己抗原であるＨＭＷ−ＭＡＡを認識するＴおよびＢ細胞クローンは、自己同
一性の確立の期間に除去されるので、ＨＭＷ−ＭＡＡと同一配列を有するペプチ
ドはメラノーマ患者のＨＭＷ−ＭＡＡに対するトレランスを打ち破ることができ
ない。これに対し、ファージディスプレイペプチドライブラリーを用いて同定し
たＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックは、ＨＭＷ−ＭＡＡと同一ではなく類似のも
のであるという性質のために、ＨＭＷ−ＭＡＡを認識するクローンを刺激するこ
とができるが、自己同一性の確立の期間にＨＭＷ−ＭＡＡに対する親和性が低下
するので除去されない。その一例としては、ＣＥＡを擬態化する抗ｉｄ ｍＡｂ
は結腸直腸癌患者におけるＣＥＡのトレランスを破壊することができるが、ＣＥ
Ａそれ自体はトレランスを破壊できない。さらにＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミ
ックはメラノーマ患者において能動特異的免疫療法を実施する上で、内部イメー
ジを保持する抗ｉｄ ｍＡｂより有効である。なぜなら、ｉ）ＨＭＷ−ＭＡＡペ
プチドミミックは抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体のほかに、ＨＬＡクラスＩに拘束された
ＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを誘導でき、またｉｉ）免疫原性の増大をもたらす
サイトカインとペプチドとを融合して得られる免疫原の開発を容易にし、ｉｉｉ
）免疫を行った患者の、液性および特に細胞性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫の発達を試
験するアッセイ法の開発を非常に容易にするからである。Since T and B cell clones that recognize the autoantigen, HMW-MAA, are eliminated during the establishment of self-identity, a peptide having the same sequence as HMW-MAA can be used for HMW-MAA in melanoma patients. You can't beat tolerance. In contrast, the HMW-MAA peptide mimic identified using the phage display peptide library stimulates clones recognizing HMW-MAA due to its property of being similar but not identical to HMW-MAA. But is not removed due to reduced affinity for HMW-MAA during the establishment of self-identity. One example is an anti-id mAb that mimics CEA.
Can break the tolerance of CEA in colorectal cancer patients
A itself cannot destroy tolerance. Furthermore, the peptide mimic of HMW-MAA is more effective in delivering active specific immunotherapy in melanoma patients than anti-id mAbs that retain internal images. Because i) HMW-MAA peptidomimetic can induce HLA class I-restricted HMW-MAA-specific CTLs in addition to anti-HMW-MAA antibodies, and ii) cytokines and peptides that result in increased immunogenicity To facilitate the development of immunogens obtained by fusing
2.) It greatly facilitates the development of assays to test the development of humoral and especially cellular anti-HMW-MAA immunity in immunized patients.
【００１７】 ヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体を用いたファージディスプレイペプチ
ドライブラリーのパンニングにより、我々はＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミック
を同定した。このペプチドはＨＬＡ−Ｂ２７抗原に対する結合モチーフを有する
。我々が開発したヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体の規模の大きなパネル
を用いれば、その他のＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドも利用可能である。ＨＬＡ-Ａ
２抗原などの、メラノーマ患者において高頻度のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対
する結合モチーフを有するＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミック。例えばＨＭＷ−Ｍ
ＡＡペプチドミミックの免疫原性をマウスとウサギで試験を行う。その他の抗原
系において幾つかの変数が合成ペプチドの免疫原性を増大させることを示してい
るので、ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックの免疫原性を最適化するために、多
価抗原ペプチド（ＭＡＰ）を使用することも含めてそれら変数について調べる。[0017] By panning a phage display peptide library with human and mouse anti-HMW-MAA antibodies, we identified a peptide mimic of HMW-MAA. This peptide has a binding motif for the HLA-B27 antigen. With the large panel of human and mouse anti-HMW-MAA antibodies we have developed, other HMW-MAA peptides are also available. HLA-A
HMW-MAA peptide mimics with binding motifs for HLA class I alleles that are high in melanoma patients, such as two antigens. For example, HMW-M
The immunogenicity of the AA peptide mimic is tested in mice and rabbits. In order to optimize the immunogenicity of the HMW-MAA peptidomimetic, several variables have been shown to increase the immunogenicity of the synthetic peptide in other antigen systems. Find out about those variables, including using.
【００１８】 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体によって同定したペプチドをヒトＣＤ８+Ｔ細胞は認識
できる。我々は最初にバイオインフォーマティクスと分子解析ソフトウェア（Ｂ
ＩＭＡＳ）を用いて、抗体で同定したペプチドが結合することのできるＨＬＡク
ラスＩ同種特異性を同定する。次に我々は選択したＨＬＡクラスＩ同種特異性と
同定したペプチドとの結合を測定して、予測の有効性を見積もる。最後に我々は
同定したペプチドがＨＬＡクラスＩ抗原トランスジェニックマウス、およびｉｎ
ｖｉｔｒｏでＨＬＡクラスＩに拘束されたＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを産生
できるかどうか試験する。我々はまた、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体によって同定した
ペプチドとＨＭＷ−ＭＡＡに由来するペプチドは互いにアミノ酸配列ホモロジー
はないが、両者の間にＴ細胞による決定エピトープが共有されているかどうか試
験する。単一のＴ細胞レセプターが２つの構造的に異なるＭＨＣペプチド複合体
を認識できるという最近発見された事実からもその可能性が推測される。ＨＬＡ
クラスＩ抗原トランスジェニックマウスおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＨＬＡクラ
スＩに拘束されたＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを産生すると判明したペプチドと
ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックは、メラノーマ患者において液性と細胞性免疫
を誘導する能力を有する。Human CD8 + T cells can recognize the peptide identified by the anti-HMW-MAA antibody. We first developed bioinformatics and molecular analysis software (B
IMAS) is used to identify the HLA class I homospecificity to which the peptide identified by the antibody can bind. Next, we measure the binding of the identified HLA class I homospecific to the identified peptide to estimate the effectiveness of the prediction. Finally, the peptides we identified were used in HLA class I antigen transgenic mice, and in
It is tested whether it is possible to produce HMW-MAA-specific CTL restricted to HLA class I in vitro. We also test whether the peptide identified by the anti-HMW-MAA antibody and the peptide derived from HMW-MAA have no amino acid sequence homology to each other, but share a T cell-determining epitope between them. The possibility is inferred from the recently discovered fact that a single T cell receptor can recognize two structurally distinct MHC peptide complexes. HLA
Peptides found to produce HLA-MAA-specific HMW-MAA-specific CTLs and HMW-MAA peptide mimics in class I antigen transgenic mice and in vitro induce humoral and cellular immunity in melanoma patients Have the ability.
【００１９】 このアプローチは、Ｔ細胞抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫がある場合、統計学的に有意
な生存延長が起こることがすでに示されている液性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫応答の
誘導を併せて行うと利点がある。したがって我々のアプローチでは、メラノーマ
病巣において頻繁に見られるＨＬＡクラスＩ抗原と抗原プロセッシング機構の異
常による影響は少ないはずである。This approach, combined with the induction of a humoral anti-HMW-MAA immune response that has been shown to produce a statistically significant prolongation of survival in the presence of T cell anti-HMW-MAA immunity There are advantages. Thus, our approach should be less affected by HLA class I antigens and abnormalities in the mechanism of antigen processing that are frequently found in melanoma lesions.
【００２０】 本発明は、ヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体によってファージディスプ
レイペプチドライブラリーよりパンニングによって同定したＨＭＷ−ＭＡＡペプ
チドミミックの免疫原性を予測する手段を提供する。この情報は液性および細胞
性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫の両方を誘導できる免疫原をデザインする上で新しい戦
略の最適化に役立つと考えられる。免疫原の特性を改良することでメラノーマ能
動特異的免疫療法の効能が増幅できると期待される。The present invention provides a means for predicting the immunogenicity of HMW-MAA peptide mimics identified by panning from phage display peptide libraries with human and mouse anti-HMW-MAA antibodies. This information will help optimize new strategies in designing immunogens that can induce both humoral and cellular anti-HMW-MAA immunity. Improving the properties of the immunogen is expected to enhance the efficacy of melanoma active specific immunotherapy.
【００２１】 本発明は疾患を阻害するために標的分子に対する能動特異的免疫療法を用いて
これらの問題点を克服するものである。そのような標的分子に対するそのような
免疫療法の方法は分子に対し免疫応答を引き起こす免疫原の修飾を含む。標的抗
原の修飾は他の様々な方法があるが、例えば、抗原に免疫原性試薬を結合する（
米国特許第５，３３４，３７９号参照）；抗原のハプテン化（米国特許第４，７
７８，７５２号と第５，２９０，５５１号参照）；標的抗原へのアジュバント結
合又はアジュバントとの併用投与；抗原に対する結合ペプチドフラグメント；Ｍ
ＨＣクラスＩとクラスＩＩ拘束抗原への標的抗原の結合（米国特許第４，４７８
，８２３号参照）；標的抗原の糖鎖結合パターンを変えること（米国特許第５，
４８４，７３５号参照）により達成できる。The present invention overcomes these problems using active specific immunotherapy against the target molecule to inhibit the disease. Such methods of immunotherapy against such target molecules involve modification of the immunogen to elicit an immune response against the molecule. There are various other methods for modifying the target antigen, for example, by attaching an immunogenic reagent to the antigen (
Haptenization of antigens (see U.S. Pat. No. 5,334,379);
78,752 and 5,290,551); adjuvant binding to or co-administration with a target antigen; binding peptide fragment to the antigen; M
Binding of target antigen to HC class I and class II restricted antigens (US Pat. No. 4,478
Altering the sugar chain binding pattern of a target antigen (US Pat.
484,735).
【００２２】 標的抗原による免疫を誘導する他の方法は標的抗原のペプチドミミックである
。ペプチドミミックは標的「自己」抗原を完全に擬態化できないようであり、ペ
プチドミミックは自己抗原へのトレランスを破壊するが、自己抗原の投与では破
壊できない。以前にも示した通り、発癌胎児抗原（ＣＥＡ）の内部イメージを保
持する抗イディオタイプは結腸直腸癌患者で抗ＣＥＡ抗体を誘導できるが、いっ
ぽうＣＥＡそれ自身はできない。したがって実際の「自己」血管新生促進標的抗
原をワクチンとして使用するもう一つの方法は、抗原を擬態化する、抗原の内部
イメージを保持する抗イディオタイプ抗体を用いて免疫応答を誘導することであ
る。しかし抗イディオタイプ抗体の使用は完全ではない。Another method of inducing immunity with a target antigen is a peptidomimetic of the target antigen. Peptidomimics do not seem to completely mimic the target "self" antigen, and peptide mimics break tolerance to the self-antigen, but not upon administration of the self-antigen. As previously shown, anti-idiotypes that retain the internal image of carcinogenic fetal antigen (CEA) can induce anti-CEA antibodies in colorectal cancer patients, but not CEA itself. Thus, another way to use a real "self" pro-angiogenic target antigen as a vaccine is to induce an immune response with an anti-idiotype antibody that mimics the antigen and retains an internal image of the antigen . However, the use of anti-idiotype antibodies is not complete.
【００２３】 イディオタイプの関係とネットワークの理論はＪｅｒｎｅモデル（Ｊｅｒｎｅ
，Ｎ．Ｋ．（１９７４）Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１２５Ｃ：３
７３；Ｊｅｒｎｅ，Ｎ．Ｋ．ら（１９８２ ＥＭＢＯ １：２３４）に基づいて
いる。このように抗原に対するパラトープ（抗原結合部位）を発現している抗体
による免疫は抗−抗体（抗イディオタイプ）を産生し、そのうち幾つかは抗原と
パラトープに対する相補的構造を共有する。それら抗イディオタイプは抗原とし
て働き、例えば抗原を擬態化することができるであろう。このように免疫系は抗
原の内部イメージ、抗イディオタイプを伝播すると考えられる。The relation between idiotypes and the theory of networks are described in the Jerne model (Jerne model).
, N .; K. (1974) Ann. Immunol. (Paris) 125C: 3
73; Jerne, N .; K. (1982 EMBO 1: 234). Thus, immunization with an antibody expressing a paratope (antigen binding site) against an antigen produces anti-antibodies (anti-idiotypes), some of which share a complementary structure with the antigen for the paratope. These anti-idiotypes could serve as antigens, for example, to mimic the antigen. Thus, the immune system is thought to transmit the internal image of the antigen, the anti-idiotype.
【００２４】 本発明に用いたペプチドミミックは哺乳動物に由来しない小分子又は哺乳動物
に由来しない核酸分子であることができる。そうした小分子又は核酸は合成又は
哺乳動物以外の生物体から単離することができる。本発明の免疫原は、疾患に関
与する分子に対し免疫応答を誘導できるペプチド分子、偽ペプチド分子又はペプ
チドミミックであることができる。そうしたペプチドミミックは合成又は哺乳動
物以外の生物体から単離することができる。小分子、核酸分子、ペプチド分子お
よびペプチドミミックのスクリーニング法は当技術分野でよく知られている（例
えば、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、１（１）、ｐｇ２
７−３１、１９９６）。The peptide mimic used in the present invention can be a small molecule not derived from a mammal or a nucleic acid molecule not derived from a mammal. Such small molecules or nucleic acids can be synthetic or isolated from non-mammalian organisms. The immunogen of the present invention can be a peptide molecule, pseudopeptide molecule or peptidomimetic capable of inducing an immune response against a molecule involved in a disease. Such peptidomimics can be synthetic or isolated from non-mammalian organisms. Methods for screening small molecules, nucleic acid molecules, peptide molecules, and peptide mimics are well known in the art (eg, J. Biomolecular Screening, 1 (1), pg2).
7-31, 1996).
【００２５】 本発明におけるペプチドミミックは当技術分野で知られた様々な方法、例えば
免疫原性試薬にペプチドミミックを遺伝子的に結合又は融合して改変する。免疫
原性の試薬へペプチドミミックを結合又は融合することでペプチドミミックに対
する免疫応答を刺激することができる。本発明の結合し融合した分子は、キャリ
アー又は融合分子に対し抗原をカップリング又は融合すると知られているどのよ
うな方法によっても調製できる。結合の望ましい方法は抗原を直接、免疫原性試
薬に結合する共有結合である。望ましい免疫原性試薬は多糖（米国特許第５，６
２３，０５７号）とペプチドグリカン（米国特許第５，１５３，１７３号）を含
む。本明細書に示された全ての米国特許と同様、これらの米国特許を本明細書の
一部を構成するものとしてここに援用する。The peptidomimic in the present invention is modified by various methods known in the art, for example, by genetically binding or fusing the peptide mimic to an immunogenic reagent. The binding or fusion of the peptide mimic to an immunogenic reagent can stimulate an immune response to the peptide mimic. The conjugated and fused molecules of the invention can be prepared by any method known to couple or fuse an antigen to a carrier or fusion molecule. The preferred method of conjugation is covalent conjugation, which couples the antigen directly to the immunogenic reagent. A preferred immunogenic reagent is a polysaccharide (US Pat.
23,057) and peptidoglycan (US Pat. No. 5,153,173). These U.S. patents, as well as all U.S. patents set forth herein, are hereby incorporated by reference.
【００２６】 本発明におけるペプチドミミックを改変する他の方法は、それらをサイトカイ
ン、リンホカイン、ホルモン又は成長因子と結合又は遺伝子的に融合することで
ある（米国特許第５，３３４，３７９号）。それら分子の例としてはインターフ
ェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、
ＩＬ−６およびＩＬ−７があげられるがこれらに限定されない（米国特許第５，
３３４，３７９号）。これらの米国特許、および本明細書に言及する同様の特許
を、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。Another method of modifying peptide mimics in the present invention is to bind or genetically fuse them with cytokines, lymphokines, hormones or growth factors (US Pat. No. 5,334,379). Examples of such molecules include interferon, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5,
Include, but are not limited to, IL-6 and IL-7 (U.S. Pat.
334,379). These U.S. patents, and similar patents referred to herein, are hereby incorporated by reference.
【００２７】 本発明におけるペプチドミミックを改変するもう一つの方法は、ペプチドミミ
ックのハプテン化（化学的リンク）である。ハプテンはタンパク質と結合した時
、免疫応答を誘導する能力を持つ物質を総称する。本発明におけるペプチドミミ
ックはそれ自身がハプテン化でき、又はハプテン修飾化タンパク質と結合するこ
とができる（米国特許第４，７７８，７５２号と第５，２９０，５５１号）。Another method for modifying the peptidomimic in the present invention is haptenization (chemical linking) of the peptidomimetic. Hapten is a general term for substances capable of inducing an immune response when bound to a protein. The peptidomimics of the present invention can themselves be haptenized or bind to hapten-modified proteins (US Pat. Nos. 4,778,752 and 5,290,551).
【００２８】 本発明におけるペプチドミミックを改変する他の方法は、ペプチドのグリコシ
レーション又はペプチドミミックのキャリアー分子のグリコシレーションである
（米国特許第５，４８４，７３５号と第４，６２９，６９２号）。Another method of modifying a peptidomimetic according to the present invention is glycosylation of a peptide or glycosylation of a carrier molecule of a peptidomimide (US Pat. Nos. 5,484,735 and 4,629,692). issue).
【００２９】 さらにペプチドの活性を模倣したペプチドミミック化合物又は偽ペプチド等の
化合物を、本発明における免疫原の改変に用いることができる（米国特許第５，
３８６，０１１号、第５，１５３，１７３号と第４，６３１，２７０号）。In addition, compounds such as peptidomimetic compounds or pseudopeptides that mimic peptide activity can be used to modify immunogens in the present invention (US Pat.
386,011, 5,153,173 and 4,631,270).
【００３０】 ペプチドミミックを主組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原と結合して複合体を形成
することにより本発明のペプチドミミックの改変を行うこともまた本発明におい
て有用である（米国特許第４，４７８，８２３号）。そうしたＭＨＣ抗原の源お
よび本発明におけるペプチドミミックをＭＨＣに結合する方法については、米国
特許第４，４７８，８２３号に記載されており、これを本明細書の一部を構成す
るものとしてここに援用する。It is also useful in the present invention to modify the peptidomimics of the invention by binding the peptidomimics to a major histocompatibility complex (MHC) antigen to form a complex (US Pat. No. 478,823). Such sources of MHC antigens and methods of binding the peptidomimics of the present invention to MHC are described in US Pat. No. 4,478,823, which is hereby incorporated by reference. Invite.
【００３１】 同等なタンパク質は同等なアミノ酸配列を有する。ある１つの配列と物質的に
同等であるが、それとは別の配列とは１つ又はそれ以上の置換、付加及び／又は
欠失のため異なるアミノ酸配列は、同等な配列であるとみなせる。本発明のタン
パク質に対して配列中のアミノ酸数の置換、付加、欠失が少なくとも２５％以下
であるのが好ましく、さらに好ましくは１０％以下であり、最も好ましくは５％
以下である。[0031] Equivalent proteins have equivalent amino acid sequences. Amino acid sequences that are physically equivalent to one sequence but differ from another sequence by one or more substitutions, additions and / or deletions can be considered equivalent sequences. The substitution, addition and deletion of the number of amino acids in the sequence of the protein of the present invention is preferably at least 25% or less, more preferably 10% or less, and most preferably 5% or less.
It is as follows.
【００３２】 例えば、ある配列中のアミノ酸を等価なアミノ酸で置換することが知られてい
る。一般に等価であると考えられているアミノ酸グループは：For example, it is known to replace an amino acid in a sequence with an equivalent amino acid. Amino acid groups that are generally considered equivalent are:
【００３３】 （ａ）Ａｌａ（Ａ） Ｓｅｒ（Ｓ） Ｔｈｒ（Ｔ） Ｐｒｏ（Ｐ） Ｇｌｙ
（Ｇ）； （ｂ）Ａｓｎ（Ｎ） Ａｓｐ（Ｄ） Ｇｌｕ（Ｅ） Ｇｌｎ（Ｑ）； （ｃ）Ｈｉｓ（Ｈ） Ａｒｇ（Ｒ） Ｌｙｓ（Ｋ） （ｄ）Ｍｅｔ（Ｍ） Ｌｅｕ（Ｌ） ＩＩｅ（Ｉ） Ｖａｌ（Ｖ）；および （ｅ）Ｐｈｅ（Ｆ） Ｔｙｒ（Ｙ） Ｔｒｐ（Ｗ）。(A) Ala (A) Ser (S) Thr (T) Pro (P) Gly
(B) Asn (N) Asp (D) Glu (E) Gln (Q); (c) His (H) Arg (R) Lys (K) (d) Met (M) Leu (L) IIe (I) Val (V); and (e) Phe (F) Tyr (Y) Trp (W).
【００３４】 本発明におけるペプチドミミックおよび改変ペプチドミミックは動物体内にお
いて標的分子に対して免疫応答を誘導する。その動物は好ましくはウサギ、ラッ
ト、あるいはマウス等の哺乳動物である。好ましくはヒトである。免疫応答とは
液性の抗体産生及び／又はヘルパーおよび細胞障害性Ｔ細胞反応を含むＴ細胞反
応等の細胞媒介応答を意味する。[0034] The peptide mimics and modified peptide mimics of the present invention induce an immune response against a target molecule in an animal. The animal is preferably a mammal such as a rabbit, rat, or mouse. Preferably it is a human. An immune response refers to a humoral antibody production and / or cell-mediated response, such as a T cell response, including helper and cytotoxic T cell responses.
【００３５】 当技術分野で知られている方法によってペプチドミミックをコードした核酸分
子を哺乳動物細胞内に導入することができる。例えば、哺乳動物細胞に遺伝子導
入を行うためのＭｕｌｌｉｇａｎら、米国特許第５，６７４，７２２号に記載さ
れている、遺伝子を哺乳類細胞に導入するために有用なベクターの調製方法を本
明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。[0035] Nucleic acid molecules encoding a peptidomimetic can be introduced into mammalian cells by methods known in the art. For example, the method of preparing vectors useful for introducing genes into mammalian cells, as described in Mulligan et al., US Pat. No. 5,674,722, for performing gene transfer into mammalian cells is described herein. It is incorporated herein by reference.
【００３６】 ペプチドミミックはベヒクル（担体）によって免疫系に提示してもよい。例え
ば、ペプチドミミックは抗原提示細胞の表面に存在するか、薬理学的に許容でき
るキャリアー又はアジュバントに結合していてもよい。The peptidomimetic may be presented to the immune system by a vehicle (carrier). For example, the peptidomimetic may be present on the surface of the antigen presenting cell or bound to a pharmacologically acceptable carrier or adjuvant.
【００３７】 抗原提示細胞は主組織適合複合体（ＭＨＣ）の好ましくはクラスＩＩ遺伝子産
物を細胞表面に持つ遺伝学的に真核細胞である。本明細書の目的のために、抗原
提示細胞はまた末梢血球細胞等のリコンビナント真核細胞およびリコンビナント
細菌細胞等を含む。本明細書によって定義する抗原提示細胞の例として樹状細胞
、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ陽性のマクロファージ、好ましくはＭＨＣクラス
ＩＩ陽性の単核球およびリンパ球を含む（米国特許第５，５９７，５６３号もま
た参照のこと）。The antigen presenting cell is a genetically eukaryotic cell having a preferably class II gene product of the major histocompatibility complex (MHC) on the cell surface. For the purposes of this specification, antigen presenting cells also include recombinant eukaryotic cells, such as peripheral blood cells, and recombinant bacterial cells, and the like. Examples of antigen presenting cells as defined herein include dendritic cells, preferably MHC class II positive macrophages, preferably MHC class II positive mononuclear cells and lymphocytes (US Pat. No. 5,597,563). See also).
【００３８】 本発明の一実施例において、抗原提示細胞は本発明の抗原をコードした外来性
ＤＮＡを発現する真核細胞である。リコンビナント真核細胞はｉｎ ｖｉｖｏ又
はｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することができる。[0038] In one embodiment of the invention, the antigen presenting cell is a eukaryotic cell that expresses exogenous DNA encoding the antigen of the invention. Recombinant eukaryotic cells can be prepared in vivo or in vitro .
【００３９】 真核細胞にＤＮＡを挿入するのに適したクローニング／発現ベクターは周知の
ＳＶ−４０、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびレトロウ
イルス由来のＤＮＡ配列の誘導体を含む。プラスミドとファージＤＮＡのコンビ
ネーションから得られたベクターとカップリングした場合、そうしたベクターの
いずれも、例えばシャトルベクターは、原核細胞と真核細胞の両方においてタン
パク質コード配列のクローニングおよび／また発現を行うことができる。Suitable cloning / expression vectors for inserting DNA into eukaryotic cells include derivatives of DNA sequences derived from the well-known SV-40, adenovirus, cytomegalovirus (CMV) and retrovirus. When coupled with a vector obtained from a combination of plasmid and phage DNA, any of these vectors, for example, a shuttle vector, is capable of cloning and / or expressing a protein coding sequence in both prokaryotic and eukaryotic cells. it can.
【００４０】 その他の真核性発現ベクターは当技術分野で知られている。即ち、Ｐ．Ｊ．Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎとＰ．Ｂｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２
７−３４１（１９８２）；Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１，８５４−８６４（１９８１）；Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎｎとＰ．Ａ．
Ｓｈａｒｐ、”Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａ Ｍｏ
ｄｕｌａｒ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｃｏｍｐｌ
Ｇｅｎｅ、”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９，６０１−６２１（１９８２）；Ｒ
．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｐ．Ａ．とＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１５９，６０１−６６４（１９８２）；Ｓ．Ｉ．Ｓｃａｈｉｌｌら、
”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎ ＤＮＡ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖｅ
ｒｙ Ｃｅｌｌｓ、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０ 、４６５４−４６５９（１９８３）；Ｇ．ＵｒｌａｕｂとＬ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７、４６１６−４２２０（
１９８０）。[0040] Other eukaryotic expression vectors are known in the art. That is, P.I. J. S
southern and P.S. Berg, J.M. Mol. Appl. Genet. 1,32
7-341 (1982); Subramani et al., Mol. Cell. Bi
ol. 1 , 854-864 (1981); J. Kaufmann and P.M. A.
Sharp, "Amplification And Expression"
Of Sequences Transformed with A Mo
dual Dihydrofolate Reductase Compl
Gene, "J. Mol. Biol. 159 , 601-621 (1982); R
. J. Kaufmann P. et al. A. And P. A. Sharp, Mol. Cell.
Biol. 159 , 601-664 (1982); I. Scahill et al.
"Expression and Characterization of
the Product of a Human Immunity Interf
eron DNA Gene in China Hamster Ove
ry Cells, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 , 4654-4659 (1983); G. Urlaub and LA Chasin.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 , 4616-4220 (
1980).
【００４１】 本発明のペプチドミミックはまたリコンビナント細菌細胞の表面で免疫系に提
示することもできる。適したリコンビナント細菌細胞はＭｉｃｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ ｂｏｖｉｓ の非ビルレント株、例えばｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ
−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、又はサルモネラの非ビルレント株、例えば、Ｓ．ｔ ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ である。リコンビナント細菌細胞は、当技術分野で知られ
ている非ビルレント株の抗原の活性部位からなるクローニングＤＮＡによって調
製することができる。例えば、リコンビナントサルモネラの調製には、Ｃｕｒｔ
ｉｓｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ６、１５５−１６０（１９８０） Ｇａｌａｎ、 Ｇｅ
ｎｅ ９４、２９−３５（１９９０）、リコンビナントＢＣＧの調製には、Ｓｔ
ｏｖｅｒ，Ｃ．Ｋ．、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９１、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．３９３−３９８（１
９９１）が挙げられる。The peptidomimics of the invention can also be presented to the immune system on the surface of a recombinant bacterial cell. Suitable recombinant bacterial cells are non-virulent strains of M. bacterium bovis , such as bacille Calmette.
-Guerin (BCG), or non-virulent strain of Salmonella, e.g., S. a t yphimurium. Recombinant bacterial cells can be prepared by cloning DNA comprising the active site of a non-virulent strain antigen known in the art. For example, for the preparation of recombinant Salmonella, Curt
iss, Vaccine 6, 155-160 (1980) Galan, Ge
ne 94, 29-35 (1990), StB was used for the preparation of recombinant BCG.
over, C.I. K. , Vaccines 91, Cold Spring H
arboar Laboratory Press, pp. 1-35. 393-398 (1
991).
【００４２】 クローニングベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列の各セグメン
トから構成される。幾つかの適した原核細胞クローニングベクターはｃｏｌＥ１
、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭおよびＲＰ４等のＥ．
ｃｏｌｉ由来のプラスミドを含む。原核細胞ベクターはまたＭ１３、ｆｄおよび
その他のフィラメント単鎖ＤＮＡファージ等のファージＤＮＡの誘導体を含む。A cloning vector is composed of segments of chromosomal, non-chromosomal and synthetic DNA sequences. Some suitable prokaryotic cloning vectors are colE1
, PCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM and RP4.
E. coli-derived plasmids. Prokaryotic vectors also include derivatives of phage DNA, such as M13, fd and other filamentous single-stranded DNA phages.
【００４３】 細菌、特にＥ．ｃｏｌｉでタンパク質発現を行うベクターもまた知られている
。そうしたベクターはｐＫ２３３（あるいはプラスミドのｔａｃファミリーのい
ずれも）、Ｔ７およびＰLを含む。融合タンパク質を発現するベクターの例は、
ＤｉｅｃｋｍａｎｎとＴｚａｇｏｌｏｆｆ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０、
１５１３−１５２０（１９８５）。これらのベクターはアントラニル酸シンター
ゼ（ＴｒｐＥ）をコードしたＤＮＡ配列に続けてカルボキシ末端のポリリンカー
を含む。その他の発現ベクター系はベータガラクトシダーゼ（ｐＥＸ）に基づい
ている；ラムダＰL；マルトース結合タンパク質（ｐＭＡＬ）；グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ（ｐＧＳＴ）。Ｇｅｎｅ ６７、３１（１９８８）とＰｅ
ｐｔｉｄｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３、１６７（１９９０）を参照のこと。 本発明において有用な発現ベクターは、ＤＮＡ配列又はフラグメントのオペレ
ーター部位にリンクしている、少なくとも１つの発現コントロール配列を含んで
いる。コントロール配列はクローン化したＤＮＡ配列の発現をコントロール又は
制御するためにベクターに挿入する。有用な発現コントロール配列の例は、ｌａ
ｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ラムダファージの主たるオペレーターと
プロモーター領域、ｆｄコートタンパク質のコントロール領域、そしてポリオー
マ、アデノウイルス、レトロウイルス、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター
等のシミアンウイルス由来のプロモーター、および原核細胞又は真核細胞で遺伝
子発現をコントロールすると知られているその他の配列、そのウイルス又はウイ
ルスのコンビネーションである。Bacteria, especially E. coli Vectors for expressing proteins in E. coli are also known. Such vector (either of the tac family of or plasmid) pK233, including T7 and P L. Examples of vectors that express a fusion protein include:
Dieckmann and Tzagoloff J. et al. Biol. Chem. 260,
1513-1520 (1985). These vectors contain a DNA sequence encoding anthranilate synthase (TrpE) followed by a carboxy-terminal polylinker. Other expression vector systems are based on beta-galactosidase (pEX); lambda P L ; maltose binding protein (pMAL); glutathione S
-Transferase (pGST). Gene 67 , 31 (1988) and Pe
See ptide search 3 , 167 (1990). Expression vectors useful in the present invention include at least one expression control sequence linked to the operator site of the DNA sequence or fragment. A control sequence is inserted into the vector to control or control the expression of the cloned DNA sequence. Examples of useful expression control sequences include la
c-line, trp-line, tac-line, trc-line, major operator and promoter regions of lambda phage, control region of fd coat protein, and simian virus-derived promoters such as polyoma, adenovirus, retrovirus, and early and late promoters of SV40. And other sequences known to control gene expression in prokaryotic or eukaryotic cells, their viruses or combinations of viruses.
【００４４】 本発明のペプチドミミックはまた適切な培養液と組み合わせることができる。
適切な培養液はリン酸緩衝生理食塩水、リポソームおよび乳剤等の薬理学的に許
容できるキャリアーを含む。The peptidomimics of the present invention can also be combined with a suitable culture.
Suitable culture media include pharmacologically acceptable carriers such as phosphate buffered saline, liposomes and emulsions.
【００４５】 ペプチドミミックはまた、ムラミルペプチド、インターフェロン、インタロイ
キン−１などのリンホカイン、又は細菌性アジュバントなどの免疫応答を増大さ
せる薬理学的に許容できるアジュバントと組み合わせることができる。アジュバ
ントは免疫原が表面に吸収されるような、酸化アルミウム粒子などの適切な粒子
から構成される。これらのアジュバントを含む組成物は当技術分野で知られてい
る方法で調製できる。Peptidomimetics can also be combined with pharmacologically acceptable adjuvants that increase the immune response, such as muramyl peptides, interferons, lymphokines such as interleukin-1, or bacterial adjuvants. Adjuvants are composed of suitable particles, such as aluminum oxide particles, such that the immunogen is absorbed on the surface. Compositions containing these adjuvants can be prepared by methods known in the art.
【００４６】 細菌性アジュバントの例はＢＣＧである。上記のように抗原提示細胞として用
いる場合、リコンビナントＢＣＧは自らのアジュバントとしても作用するであろ
う。この場合、一以上のアジュバントがオプションとして添加されていたとして
も、あえてアジュバントの添加は必要ではないかもしれない。その自然な（非リ
コンビナント）状態で用いられた時、ＢＣＧは免疫原又は抗ｉｄ抗体と組み合わ
すことで効果的な免疫応答を誘導する形を形成し、ただアジュバントとしてのみ
働く。An example of a bacterial adjuvant is BCG. When used as an antigen presenting cell as described above, the recombinant BCG will also act as its own adjuvant. In this case, even if one or more adjuvants were added as an option, it may not be necessary to add the adjuvant. When used in its natural (non-recombinant) state, BCG forms a form that elicits an effective immune response when combined with an immunogen or anti-id antibody, and serves only as an adjuvant.
【００４７】 ペプチドミミック又はペプチドミミック組成物は当技術分野で知られる方法に
よって哺乳動物に投与できる。そのような方法は、例えば、静脈、腹腔内、皮下
、筋肉内、局所又は皮内投与を含む。A peptidomimetic or peptidomimetic composition can be administered to a mammal by methods known in the art. Such methods include, for example, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, topical or intradermal administration.
【００４８】[0048]
ヒト抗ＨＭＷ−ＭＡＡ単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）Ｃ２１を用いたファージディスプレ
イペプチドライブラリーのパンニングによるＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックの
同定 メラノーマ細胞Ｃｏｌｏ３８を用いてヒト半合成ファージディスプレイｓｃＦ
ｖライブラリーのパンニングによって単離したｓｃＦｖＣ２１は、メラノーマ細
胞抽出物からＨＭＷ−ＭＡＡの２つの特徴的なコンポーネント（２５０ｋＤおよ
び＞４５０ｋＤ）を免疫沈降させることから、ＨＭＷ−ＭＡＡを認識している。
Ｂｏｎｎｙｃａｓｔｌｅらの方法に従って抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｓｃＦｖ Ｃ２１
を用いてファージディスプレイペプチドライブラリーＬＸ−８およびＸ15からパ
ンニングによってクローンを単離し、免疫スクリーニングを行った結果、陽性ク
ローンはＸ15ライブラリーから単離したペプチドクローンのみから単離できた。
ｓｃＦｖ Ｃ２１に対するクローンの反応性はＥＬＩＳＡによって確認した。ジ
デオキシヌクレオチド鎖終止法によってＸ15ライブラリーからランダムに選択し
た１６個の陽性クローンについて塩基配列解析を行った結果、１４個のクローン
においてアミノ酸配列ＳＰＳＷＹＣＰＤＣＤＫＲＰＬＶ、１個のクローンにおい
てＲＰＹＲＹＤＰＬＧＤＬＫＳＲＨ、１個のクローンにおいてＥＡＲＮＷＨＤＦ
ＰＩＨＰＲＴＬの挿入が認められた。配列ＳＰＳＷＹＣＰＤＣＤＫＲＰＬＶに対
応する合成ペプチド（合成ペプチド＃１）およびＥＡＲＮＷＨＤＦＰＩＨＰＲＴ
Ｌ（合成ペプチド＃２）は結合アッセイにおいてｓｃＦｖ Ｃ２１に反応した。
しかし合成ペプチド＃１だけがメラノーマ細胞Ｃｏｌｏ３８上に発現するＨＭＷ
−ＭＡＡへのｓｃＦｖ Ｃ２１の結合を阻害した。これらの結果は、合成ペプチ
ド＃１はｓｃＦｖ Ｃ２１の抗原結合部位に結合し、一方ペプチド＃２はｓｃＦ
ｖ Ｃ２１の抗原結合部位の外側に結合することを示唆する。（ジスルフィド結
合を分解するために）ジチオスレイトールによって線状化したペプチドはｓｃＦ
ｖ Ｃ２１と反応しなかったことから、ペプチド＃１とｓｃＦｖ Ｃ２１の反応
性はコンフォメーション依存性である。ペプチド＃１とＨＭＷ−ＭＡＡのアミノ
酸配列を比較しても全くホモロジーが存在しなかったことから、ペプチド＃１は
ｓｃＦｖ Ｃ２１によって認識される決定基のミモトープであることがわかる。Identification of HMW-MAA peptide mimic by panning of phage display peptide library using human anti-HMW-MAA single chain Fv (scFv) C21 Human semi-synthetic phage display scF using melanoma cell Colo38
scFvC21, isolated by panning of the v library, recognizes HMW-MAA from immunoprecipitating the two characteristic components of HMW-MAA (250 kD and> 450 kD) from melanoma cell extracts.
Anti-HMW-MAA scFv C21 according to the method of Bonnycastle et al.
Clones were isolated by panning the phage display peptide libraries LX-8 and X 15 using a result of immunoscreening, positive clones could be isolated only from peptide clones isolated from X 15 library.
The reactivity of the clone to scFv C21 was confirmed by ELISA. Dideoxynucleotide chain termination method by X 15 library results of nucleotide sequence analysis of 16 positive clones were selected randomly from the 14 clones amino acid sequence in SPSWYCPDCDKRPLV, one clone RPYRYDPLGDLKSRH, in one clone EARNWHDF
PIHPRTL insertion was observed. Synthetic peptide (synthetic peptide # 1) corresponding to the sequence SPSWYCPCDDKRPLV and EARNWHDDFPIHPRT
L (synthetic peptide # 2) reacted with scFv C21 in a binding assay.
However, HMW in which only synthetic peptide # 1 is expressed on melanoma cell Colo38
-Inhibited the binding of scFv C21 to MAA. These results indicate that synthetic peptide # 1 binds to the antigen binding site of scFv C21, while peptide # 2 binds to scFv C21.
v Suggests binding outside the antigen binding site of C21. Peptides linearized by dithiothreitol (to break disulfide bonds)
The reactivity of peptide # 1 with scFv C21 is conformation dependent since it did not react with vC21. Comparison of the amino acid sequences of peptide # 1 and HMW-MAA revealed no homology, indicating that peptide # 1 is a determinant mimotope recognized by scFv C21.
【００４９】 マウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂ １４９．５３、２２５．２８、７６３．７４
およびＴＰ６１．５を用いたファージディスプレイペプチドライブラリーのパン
ニングによるＨＭＷ−ＭＡＡペプチドミミックの同定 モノクローナル抗体 マウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂ １４９．５３、２２５．２８、７６３．７
４およびＴＰ６１．５はそれぞれＨＭＷ−ＭＡＡの異なる決定基と反応する。The mouse anti-HMW-MAA mAb 149.53, 225.28, 763.74
Of HMW-MAA peptide mimic by panning of phage display peptide library using TP61.5 and TP61.5 Monoclonal antibody mouse anti-HMW-MAA mAb 149.53, 225.28, 763.7
4 and TP61.5 each react with a different determinant of HMW-MAA.
【００５０】 ｍＡｂ １４９．５３によって同定したＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミック 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂ １４９．５３を用いてファージディスプレイペプ
チドライブラリーＬＸ−８およびＸ15のパンニングを行い、両ライブラリーから
ファージディスプレイペプチドを濃縮した。４回目のパンニングの最後に、２つ
のライブラリーから得られたクローンについて免疫スクリーニングを行った結果
、両ライブラリーから単離したファージの中に陽性ファージを検出した。ｍＡｂ
１４９．５３によるファージディスプレイペプチドの反応性をＥＬＩＳＡによ
って確認した。各ライブラリーからランダムに選択した５個の陽性クローンにつ
いて塩基配列解析を行った結果、ＬＸ−８ライブラリーからアミノ酸配列ＳＣＲ
ＷＶＧＩＤＬＹＣＰ、Ｘ15ライブラリーからＥＥＬＨＰＰＧＳＲＡＰＳＩＲＫの
挿入が認められた。発表されているＨＭＷ−ＭＡＡのアミノ酸配列とこれらの配
列を比較すると、Ｘ15ライブラリーからｍＡｂ １４９．５３を用いて同定した
アミノ酸ＧＳＲＡＰはＨＭＷ−ＭＡＡの配列中のアミノ酸残基１８４６−１８５
０と相同であることが判明した。[0050] performs the panning of phage display peptide libraries LX-8 and X 15 using peptide mimic anti HMW-MAA mAb 149.53 of HMW-MAA identified by mAb 149.53, phage display peptide from both libraries Was concentrated. At the end of the fourth panning, the clones obtained from the two libraries were subjected to immunoscreening. As a result, positive phages were detected in the phages isolated from both libraries. mAb
The reactivity of the phage display peptide according to 149.53 was confirmed by ELISA. As a result of performing nucleotide sequence analysis on five positive clones selected at random from each library, the amino acid sequence SCR
WVGIDLYCP, insertion of EELHPPGSRAPSIRK was observed from X 15 library. Published by which HMW-MAA amino acid sequence and a comparison of these sequences, the amino acid residues of the sequence of amino acids GSRAP identified from X 15 libraries using mAb 149.53 is HMW-MAA 1846-185
0 was found to be homologous.
【００５１】 ｍＡｂ ２２５．２８により同定したＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミック 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂ ２２５．２８を用いてファージディスプレイペプ
チドライブラリーＬＸ−８およびＸ15からパンニングを行い、続いて4回目のパ
ンニングの最後に得られたクローンについて免疫スクリーニングを行った結果、
Ｘ15ライブラリーから単離したファージの中に陽性ファージを検出した。ｍＡｂ
２２５．２８によるファージディスプレイペプチドの反応性をＥＬＩＳＡによ
って確認した。現在、陽性クローンの塩基配列を同定中である。[0051] performs a panning from a phage display peptide library LX-8 and X 15 by using the HMW-MAA peptide mimic the anti-HMW-MAA mAb 225.28, which was identified by the mAb 225.28, followed by the 4 th panning As a result of performing immunoscreening on the finally obtained clone,
It was detected positive phage from X 15 libraries in the isolated phage. mAb
The reactivity of the phage display peptide according to 225.28 was confirmed by ELISA. Currently, the nucleotide sequence of the positive clone is being identified.
【００５２】 ｍＡｂ ７６３．７４により同定したＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミック 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂ ７６３．７４を用いたファージディスプレイペプ
チドライブラリーＬＸ−８およびＸ15のパンニングを行い、両ライブラリーから
ファージディスプレイペプチドを濃縮した。４回目のパンニングの最後に、２つ
のライブラリーから得られたクローンについて免疫スクリーニングを行った結果
、両ライブラリーから単離したファージの中に陽性ファージを検出した。ｍＡｂ
７６３．７４によるファージディスプレイペプチドの反応性をＥＬＩＳＡによ
って確認した。ＬＸ−８ライブラリーからランダムに選択した８個の陽性クロー
ンについて塩基配列解析を行った結果、６個のクローンにおいてアミノ酸配列Ｑ
ＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲ、１個のクローンにおいてＴＣＮＧＰＳＶＹＭＮＣＬ、
１個のクローンにおいてＱＣＴＧＰＮＦＡＴＮＣＲの挿入が認められた。このよ
うに後者のアミノ酸配列は、最も頻繁に現われたクローンのアミノ酸配列と比べ
ると１残基だけが異なっていた。したがってクローンによって同定したコンセン
サス配列はＸＣＸＧＰＸ（Ｈｙ）ＸＸＮＣＸであり、ここでＨｙは疎水性アミノ
酸を示す。ファージディスプレイペプチドとｍＡｂ ７６３．７４との反応性を
確認するために合成ペプチドとｍＡｂ ７６３．７４との反応性について結合ア
ッセイと阻害アッセイによって試験した。結合アッセイでは、合成ペプチドＱＣ
ＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲはＮ末間隙アーム（合成ペプチド＃６）が存在する時のみ
ｍＡｂ ７６３．７４と反応性を示した。さらにペプチドは抗ＨＭＷ−ＭＡＡ
ｍＡｂ １４９．５３、２２５．２８、ＴＰ４１．２（４６）およびＴＰ６１．
５に反応せず、これら全てはｍＡｂ ７６３．７４によって認識されるものとは
異なる決定基を認識した。合成ペプチド＃３（ＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲ）はｍ
Ａｂ ７６３．７４のＨＭＷ−ＭＡＡに対する反応性を阻害した。ジチオスレイ
トールによって線状化したペプチドはｍＡｂ ７６３．７４に反応しなかったこ
とから、ペプチド＃３（ＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲ）とｍＡｂ ７６３．７４の
反応性はコンフォメーション依存性である。合成ペプチド＃５（ＱＣＴＧＰＮＦ
ＡＴＮＣＲ）がｍＡｂ ７６３．７４とＨＭＷ−ＭＡＡとの反応性を阻害しなか
ったことは特筆すべきである。ここでアミノ酸ＶａｌはｍＡｂ ７６３．７４の
ＨＭＷ−ＭＡＡに対する結合において重要な役割を果たしているように思われる
。同定したペプチド配列とＨＭＷ−ＭＡＡについての刊行物記載のアミノ酸配列
との比較の結果、ホモロジーは存在しなかったが、ＨＭＷ−ＭＡＡの配列を通し
てアミノ酸残基ＧＰの反復がみられた。このように、ファージディスプレイペプ
チドライブラリーからｍＡｂ ７６３．７４によって認識される決定基はミモト
ープであると考えられる。ペプチドＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲの免疫原性は現在
マウスにおいて検討中である。[0052] performs the panning of phage display peptide libraries LX-8 and X 15 with HMW-MAA peptide mimics anti HMW-MAA mAb 763.74 identified by mAb 763.74, phage display peptide from both libraries Was concentrated. At the end of the fourth panning, the clones obtained from the two libraries were subjected to immunoscreening. As a result, positive phages were detected in the phages isolated from both libraries. mAb
The reactivity of the phage display peptide according to 763.74 was confirmed by ELISA. Base sequence analysis was performed on eight positive clones selected at random from the LX-8 library. As a result, the amino acid sequence Q
CTGPNVATNCR, TCNGPSVYMNCL in one clone,
In one clone, insertion of QCTGPNFATNCR was observed. Thus, the latter amino acid sequence differed only by one residue compared to the amino acid sequence of the most frequently occurring clone. Thus, the consensus sequence identified by the clone is XCXGPX (Hy) XXNCX, where Hy indicates a hydrophobic amino acid. To confirm the reactivity of the phage display peptide with mAb 763.74, the reactivity of the synthetic peptide with mAb 763.74 was tested by binding and inhibition assays. In the binding assay, the synthetic peptide QC
TGPNVATNCR showed reactivity with mAb 763.74 only when the N-terminal cleft arm (synthetic peptide # 6) was present. Further, the peptide is an anti-HMW-MAA
mAbs 149.53, 225.28, TP41.2 (46) and TP61.
Not responding to 5, all of which recognized different determinants than those recognized by mAb 763.74. Synthetic peptide # 3 (QCTGPNVATNCR) has m
Ab 763.74 inhibited the reactivity to HMW-MAA. Since the peptide linearized by dithiothreitol did not react with mAb 763.74, the reactivity of peptide # 3 (QCTGPNVATNCR) with mAb 763.74 is conformation dependent. Synthetic peptide # 5 (QCTGPNF
It should be noted that ATNCR) did not inhibit the reactivity of mAb 763.74 with HMW-MAA. Here, the amino acid Val appears to play an important role in the binding of mAb 763.74 to HMW-MAA. Comparison of the identified peptide sequence with the amino acid sequence described in the publications for HMW-MAA showed no homology, but repeats of amino acid residue GP throughout the HMW-MAA sequence. Thus, the determinant recognized by mAb 763.74 from the phage display peptide library is considered to be a mimotope. The immunogenicity of the peptide QCTGPNVATNCR is currently under investigation in mice.
【００５３】 ｍＡｂ ＴＰ６１．５によって同定したＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミック 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂ ＴＰ６１．５を用いてファージディスプレイペプ
チドライブラリーＬＸ−８およびＸ15からパンニングを行い、４回目のパンニン
グの最後に得られたクローンについて免疫スクリーニングを行った結果、Ｘ15ラ
イブラリーから単離したファージの中に陽性ファージを検出した。現在、陽性ク
ローンの反応性を確認するためＥＬＩＳＡと塩基配列解析を行っている。[0053] performs a panning from a phage display peptide library LX-8 and X 15 using peptide mimic anti HMW-MAA mAb TP61.5 of HMW-MAA identified by mAb TP61.5, the end of the fourth panning the results obtained clones were immunoscreening for, were detected positive phage in the X 15 library of the isolated phages. Currently, ELISA and nucleotide sequence analysis are being performed to confirm the reactivity of the positive clones.
【００５４】 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂ ７６３．７４により明らかになった決定基のペプチ
ドミミックのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫原性 ＢＡＬＢ／ｃマウスを０、１４、２８、４２および６３日目にＧＭ−ＣＳＦ（
１０ｇ／注射；Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ワシントン州シアト
ル）およびフロインドアジュバント（ＩＦＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．，ミズーリ州セントルイス）と混合したペプチドＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣ
Ｒ（２５又は５０μｇ／注射）を皮下注射により免疫した。マウスは免疫の前、
および２１、３５、４９、５６および７０日目に後眼窩洞より採血した。免疫血
清は結合アッセイにおいてＨＭＷ−ＭＡＡ陰性Ｂリンパ球細胞Ｌ１４よりもＨＭ
Ｗ−ＭＡＡ発現メラノーマ細胞Ｃｏｌｏ３８と高い結合を示した。試験を行った
２用量のペプチドも同様の免疫応答を示した。代表的な結果を図６に示す。この
図はメラノーマ細胞と反応する抗体の発達キネティクスも併せて示している。こ
れらは用いた抗体が抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体を誘導していることを証明していると
はいえないにしろ示唆する結果である。これらの可能性を証明するために現在、
免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる免疫血清の解析を行っている。ｇｄ３Immunogenicity in BALB / c mice of the determinant peptidomimetic revealed by anti-HMW-MAA mAb 763.74 BALB / c mice were GM-CSF (
10 g / injection; Immunex Corporation, Seattle, WA) and Freund's Adjuvant (IFA; Sigma Chemical).
Co. QCTGPNVATNC mixed with St. Louis, Missouri)
R (25 or 50 μg / injection) was immunized by subcutaneous injection. Mice are immunized,
Blood was collected from the retro-orbital sinus on days 21, 35, 49, 56 and 70. Immune sera were more HM than HMW-MAA negative B lymphocyte cells L14 in binding assays
It showed high binding to W-MAA expressing melanoma cell Colo38. The two doses of peptide tested also showed a similar immune response. Representative results are shown in FIG. This figure also shows the developmental kinetics of antibodies that react with melanoma cells. These are results suggesting, though not necessarily proving, that the antibodies used induce anti-HMW-MAA antibodies. Currently, to prove these possibilities,
Analysis of immune serum by immunoprecipitation and SDS-PAGE is performed. gd3
【００５５】 ヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体、ｓｃＦｖ Ｃ２１およびｍＡｂ １４
９．５３と７６３．７４によって同定したペプチド中に存在する妥当なＨＬＡク
ラスＩ抗原結合モチーフの予測解析 ヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体、ｓｃＦｖ Ｃ２１およびｍＡｂ １
４９．５３と７６３．７４によって同定したペプチド配列が細胞障害性Ｔ細胞反
応を刺激するかどうかを決定するため、まず最初にＨＬＡクラスＩアロ特異性に
結合するペプチドのモチーフについてＢＩＭＡＳを用いて解析を行った。Human and mouse anti-HMW-MAA antibodies, scFv C21 and mAb 14
Predictive analysis of relevant HLA class I antigen binding motifs present in peptides identified by 9.53 and 763.74 Human and mouse anti-HMW-MAA antibodies, scFv C21 and mAb 1
To determine whether the peptide sequences identified by 49.53 and 763.74 stimulate a cytotoxic T cell response, we first analyzed using BIMAS for motifs of peptides that bind to HLA class I allospecificity. Was done.
【００５６】 ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックは自己抗原に対するトレランスを破壊する
上でより効果的であると期待される。そのためメラノーマ患者において能動特異
的免疫療法に効果を発揮する免疫原として、ＨＭＷ−ＭＡＡアミノ酸配列から得
られたペプチドの代わりにＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックを選別した。ペプ
チドミミックはＨＭＷ−ＭＡＡと同一ではないが非常に酷似しているために、Ｈ
ＭＷ−ＭＡＡを認識でき、かつＨＭＷ−ＭＡＡに比べアフィニティーが減少する
ので自己同一性の確立の期間に消去されなかったＴおよびＢ細胞クローンを刺激
することができると期待される。HMW-MAA peptide mimics are expected to be more effective in destroying tolerance to self antigens. Therefore, a peptide mimic of HMW-MAA was selected instead of a peptide obtained from the HMW-MAA amino acid sequence as an immunogen that exerts an effect on active specific immunotherapy in melanoma patients. The peptidomimic is not identical to HMW-MAA but is very similar,
It is expected that T and B cell clones that can recognize MW-MAA and have reduced affinity compared to HMW-MAA will be able to stimulate T and B cell clones that were not eliminated during the establishment of self-identity.
【００５７】 ヒトおよびマウス抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体によって同定したペプチドのアミノ酸
配列に基づいて合成されたペプチドは、マウスとウサギで免疫原性がある。以下
の理由により、マウスを用いることとした。ｉ）大規模な量のペプチドおよび免
疫原性に影響を及ぼすかもしれない変異ペプチドをスクリーニングする上で適し
ている、ｉｉ）ホストにおける免疫応答の変動を最小限化する、標準化され確立
された遺伝的背景を持つホスト源を提供する、ｉｉｉ）まだ試薬および／また方
法論が確立されていない他の動物種では試験できないサイトカイン、樹状細胞等
の変数の試験を行うことができる。しかしマウスはＨＭＷ−ＭＡＡを発現してい
ない。ヒト抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂを用いた免疫化学染色は、この抗原がウサ
ギにおいてヒトと同様な分布を示して発現していることを示していた。従ってＨ
ＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックがＨＭＷ−ＭＡＡに対するトレランスを破壊で
きるかどうか調べる目的にはウサギがモデル動物として適している。Peptides synthesized based on the amino acid sequences of the peptides identified by human and mouse anti-HMW-MAA antibodies are immunogenic in mice and rabbits. Mice were used for the following reasons. i) suitable for screening large amounts of peptides and mutant peptides that may affect immunogenicity; ii) standardized and established genetics that minimize the variability of the immune response in the host. Iii) testing for variables such as cytokines, dendritic cells, etc. that cannot be tested in other animal species for which reagents and / or methodologies have not yet been established, providing a host source with a relevant background. However, mice do not express HMW-MAA. Immunochemical staining with human anti-HMW-MAA mAb indicated that this antigen was expressed in rabbits with a similar distribution to humans. Therefore H
Rabbits are suitable as model animals for the purpose of examining whether a peptide mimic of MW-MAA can disrupt tolerance to HMW-MAA.
【００５８】 マウスにおける免疫原性 免疫戦略 基本的な免疫のデザインは以下の通りである：ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０／群
）に対し０、７および２８日目に皮下注射により免疫を行う。ペプチドはＫＬＨ
に対して結合したもの又は非結合のものを用い、試験対象のアジュバントの一つ
と混合し、指示どおりの用量をもって注射する。別法として樹状細胞を刺激した
ペプチドを注射することもできる。免疫前および１３、２７、３４および４１日
目に後眼窩洞から血清を採取する。液性および細胞性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免疫の解
析結果に基づいて追加の免疫および／また採血を行う。Immunogenicity in Mice Immunization Strategy The basic immunization design is as follows: BALB / c mice (10 / group) are immunized by subcutaneous injection on days 0, 7 and 28. The peptide is KLH
Conjugated or non-conjugated, mixed with one of the adjuvants to be tested and injected at the doses indicated. Alternatively, the peptide that stimulated dendritic cells can be injected. Serum is collected from the retro-orbital sinus before immunization and on days 13, 27, 34 and 41. Additional immunizations and / or blood collections are performed based on the results of humoral and cellular anti-HMW-MAA immunity analysis.
【００５９】 ペプチドの用量、免疫の回数、キャリアーおよびアジュバントの免疫応答に対す
る効果 これらの実験はペプチドの用量、免疫の回数、キャリアーおよび様々なアジュ
バントとの結合によるペプチドの免疫原性に対する効果を試験するものである。 ｉ）予備試験結果の項目に示したように、予備試験結果において２５および５
０ｇ／注射の用量が免疫応答を誘導したため、ペプチドは２５〜１２５μｇ／注
射の用量を皮下に投与する。 ｉｉ）ペプチドは２週間間隔で、２回又は３回投与する。もし免疫応答が誘導
できなかった場合、免疫応答が検出できるまで追加免疫を２週間間隔で行う。 ｉｉｉ）ＫＬＨに結合したペプチドと結合していないペプチドの免疫原性を比
較して、キャリアー（例えばＫＬＨ）との結合がペプチドの免疫原性に与える効
果を見積もる。ペプチドはクロスリンク反応にグルタルアルデヒドを用いてＫＬ
Ｈ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に結合する。即ち、ペプチドを
ＫＬＨと１：１の割合で混合して室温で１時間放置する。引き続き０．２５％グ
ルタルアルデヒドを添加し、溶液を２時間、室温で攪拌する。反応は１Ｍグリシ
ンと混合して３０分間インキュベーションを行って終止する。ペプチド−ＫＬＨ
結合物をＰＢＳ溶液中で４℃、一晩透析を行う。結合物を−２０℃で貯蔵する。 ｉｖ）ペプチドの免疫原性に対するアジュバントの効果を見積もるため、総用
量２００μｌ又は総用量２００μｌ中でペプチドとフロインドアジュバント（プ
ライミング用に完全アジュバント、ブースティング用に不完全アジュバント）を
混合し、１０μｇのＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌｓ、Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、ウォーセスター）と共に注射する。 ｖ）既に述べたように骨髄から樹状細胞を調製して、これを用いて樹状細胞に
よって呈される免疫原性を測定する。即ち、同系マウスの後肢から採取した骨髄
から樹状細胞を採取する。１０％ＦＣＳ、リコンビナントマウスＩＬ−４（２０
００ＩＵ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、Ｎ
Ｊ）およびリコンビナントマウスＧＭ−ＣＳＦ（２００ＩＵ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏ
Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を添加したＩＭＤＭ培溶液中で、細胞を５日間、３７℃
で培養する。インキュベーション終了時、樹状細胞の表現型をＦＡＣＳ解析によ
って確認する。血清を減少したＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州、グランドアイランド）中にペプチド（１０ｇ／ｍ
ｌ）を添加し、樹状細胞（１×１０6／ｍｌ）を２時間、３７℃でインキュベー
ションする。その後、ＨＢＳＳで洗浄し、樹状細胞（１×１０5／マウス）を尾
の根の皮下に注射する。ペプチド刺激した樹状細胞の注射を１週間後に繰り返す
。 ｖｉ）合成ペプチドの免疫原性に対するＭＡＰの効果を試験する目的で、ＨＭ
Ｗ−ＭＡＡを模倣した合成ペプチドからなる１０ｇのＭＡＰをユニバーサルＴH
エピトープの共存下又は非共存下で、フロインドアジュバントと混合して皮下に
注射する。Effect of Peptide Dose, Number of Immunizations, Carrier and Adjuvant on Immune Response These experiments test the effect of peptide dose, number of immunizations, carrier and conjugation with various adjuvants on the immunogenicity of the peptide. Things. i) 25 and 5 in the preliminary test results as indicated in the preliminary test results section
The peptide is administered subcutaneously at a dose of 25-125 μg / injection because a dose of 0 g / injection induced an immune response. ii) The peptide is administered twice or three times at two week intervals. If an immune response cannot be induced, boosts are given at two week intervals until an immune response can be detected. iii) Compare the immunogenicity of the peptide bound to KLH with the peptide not bound to estimate the effect of binding to a carrier (eg, KLH) on the immunogenicity of the peptide. Peptide is converted to KL using glutaraldehyde in the crosslink reaction.
H (Pierce, Rockford, Ill.). That is, the peptide is mixed with KLH at a ratio of 1: 1 and left at room temperature for 1 hour. Subsequently, 0.25% glutaraldehyde is added and the solution is stirred for 2 hours at room temperature. The reaction is terminated by mixing with 1 M glycine and incubating for 30 minutes. Peptide-KLH
The conjugate is dialyzed overnight at 4 ° C. in a PBS solution. Store the conjugate at -20 ° C. iv) To estimate the effect of the adjuvant on the immunogenicity of the peptide, the peptide was mixed with Freund's adjuvant (complete adjuvant for priming, incomplete adjuvant for boosting) in a total volume of 200 μl or 200 μl, and 10 μg of QS21 (Aquila Biopharmaceutical
als, Inc. (Worcester, Mass.). v) Prepare dendritic cells from bone marrow as described above and use them to determine the immunogenicity exhibited by the dendritic cells. That is, dendritic cells are collected from bone marrow collected from the hind legs of syngeneic mice. 10% FCS, recombinant mouse IL-4 (20
00IU / ml; Pepro Tech Inc. , Rocky Hill, N
J) and recombinant mouse GM-CSF (200 IU / ml; Pepro)
Tech Inc. ) Was added to the IMDM medium for 5 days at 37 ° C.
Incubate with At the end of the incubation, the phenotype of the dendritic cells is confirmed by FACS analysis. Opti-MEM (Gibco Laborat) with reduced serum
peptide (10 g / m2) in Ories, Grand Island, NY
1) is added and dendritic cells (1 × 10 6 / ml) are incubated for 2 hours at 37 ° C. After washing with HBSS, dendritic cells (1 × 10 5 / mouse) are injected subcutaneously at the tail root. The injection of peptide-stimulated dendritic cells is repeated one week later. vi) In order to test the effect of MAP on the immunogenicity of the synthetic peptide, HM
10 g of MAP consisting of a synthetic peptide mimicking W-MAA was transferred to Universal TH
It is injected subcutaneously in the presence or absence of the epitope, mixed with Freund's adjuvant.
【００６０】 合成ペプチドによって誘導される液性免疫応答 液性免疫応答を解析するために用いた方法は、我々の以前の研究において広汎
に用いてきたものである。以下に簡略に説明する。 ｉ）抗ペプチド抗体のレベルを決定するため、合成ペプチドで免疫したマウス
から連続採血したものの連続２倍希釈液を用い、合成ペプチドをコートしたマイ
クロタイタープレート上で、125Ｉ−標識抗マウスＩｇＧおよび抗マウスＩｇＭ
異種抗体を用いて結合アッセイ試験を行う。結合の特異性は、無関係のペプチド
で免疫した血清を用いてマイクロタイタープレート上で試験を行い、また免疫前
の血清、およびＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックと共に無関係のペプチドで免
疫したマウスから採った血清を試験して測定する。 ｉｉ）ＨＭＷ−ＭＡＡ結合抗体のレベルを測定するため、ＨＭＷ−ＭＡＡを発
現したヒトメラノーマ細胞で免疫したマウスから連続採血した血清の連続２倍希
釈液を用いて、125Ｉ−標識抗マウスＩｇＧおよび抗マウスＩｇＭ異種抗体を用
いて結合アッセイ試験を行う。結合の特異性は免疫血清のＨＭＷ−ＭＡＡ陰性リ
ンパ球細胞への結合を試験し、また免疫前の血清およびＨＭＷ−ＭＡＡを発現し
た培養ヒトメラノーマ細胞と共に無関係のペプチドで免疫したマウスから採った
血清を試験して測定する。 ＨＭＷ−ＭＡＡへの免疫特異性を、125Ｉ−又は35Ｓ−標識メラノーマ細胞か
ら免疫沈降するコンポーネントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および、連続免疫沈降試験
によって測定する。連続免疫沈降試験は、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂを用いてあ
らかじめ免疫枯渇を行ったメラノーマ細胞抽出物からは免疫血清でＨＭＷ−ＭＡ
Ａを免疫沈降できないことを示すものである。我々が広汎に用いてきた方法（４
６）によって、細胞の放射標識、細胞の溶解度、免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびオートラジオグラフィー又はフルオログラフィーを測定する。 免疫したマウスの血清が低い力価及び／又は抗体アビディティーを示すため放
射標識したメラノーマ細胞から何のコンポーネントも免疫沈降しなかった場合は
、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂのＦ（ａｂ’）2フラグメントでコートしたマイク
ロタイタープレートへの結合を利用しメラノーマ細胞抽出物から精製を行ったＨ
ＭＷ−ＭＡＡを用いて血清を試験する。ＨＭＷ−ＭＡＡに対する抗体の結合を12 5 Ｉ−標識抗マウスＩｇＧ Ｆｃ異種抗体によって検出する。結合の特異性は無
関係の抗原によってコートしたプレートを用いて測定する。 抗体がｉｎ ｖｉｖｏで抗原と反応することを証明するために、免疫ペルオキ
シダーゼ反応中でメラノーマ病変を染色し、ＨＭＷ−ＭＡＡ結合抗体を含有する
血清の試験を行う。 ｉｉｉ）免疫血清中に存在する抗体によって認識される抗原決定基をマッッピ
ングする目的でクロスブロッキングテストを行う。この終わりに抗ＨＭＷ−ＭＡ
Ａ ｍＡｂのＦ（ａｂ’）2フラグメントの飽和量（２０μｇ／ｗｅｌｌ）と共
にメラノーマ細胞をインキュベートする。洗浄に続いて、細胞に免疫血清を加え 125 Ｉ−標識抗マウスＩｇＧ Ｆｃ異種抗体を用いて抗体の結合を検出する。逆
にメラノーマ細胞への125Ｉ−標識抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂの結合を免疫血清
が阻害する能力を試験する。これらのアッセイの特異性はｍＡｂおよび無関係の
抗原を認識する抗血清を用いて見積もった。Humoral Immune Response Induced by Synthetic Peptides The method used to analyze the humoral immune response has been extensive in our previous studies.
It has been used for. This will be briefly described below. i) Mice immunized with synthetic peptides to determine anti-peptide antibody levels
From a serially diluted two-fold dilution of blood collected from
On the crotiter plate,125I-labeled anti-mouse IgG and anti-mouse IgM
A binding assay test is performed using the heterologous antibody. Specificity of binding depends on unrelated peptide
On a microtiter plate using the serum immunized with
Serum and HMW-MAA peptide mimic and irrelevant peptide
Serum from the immunized mice is tested and measured. ii) HMW-MAA was generated to measure the level of HMW-MAA binding antibody.
Serial two-fold dilution of serum continuously collected from mice immunized with the revealed human melanoma cells
Using the exudate,125Using I-labeled anti-mouse IgG and anti-mouse IgM heterologous antibodies
And perform a binding assay test. Specificity of binding was determined by HMW-MAA negative
To test for binding to immunocompetent cells and to express pre-immune serum and HMW-MAA
From mice immunized with an unrelated peptide together with cultured human melanoma cells
The serum is tested and measured. Immunospecificity for HMW-MAA,125I- or35S-labeled melanoma cells
-PAGE of the components immunoprecipitated from the sample and continuous immunoprecipitation test
Measured by Serial immunoprecipitation studies were performed using anti-HMW-MAA mAb.
Pre-immuno-depleted melanoma cell extracts were obtained from immune serum using HMW-MA.
A shows that A cannot be immunoprecipitated. The methods we have used extensively (4
6), radiolabeling of cells, cell solubility, immunoprecipitation, SDS-PAGE and
And autoradiography or fluorography. The sera of the immunized mice were released to show low titers and / or antibody avidity.
If no components were immunoprecipitated from the radiolabeled melanoma cells
F (ab ') of anti-HMW-MAA mAbTwoMicrophone coated with fragment
H purified from melanoma cell extract using binding to a titer plate
Serum is tested using MW-MAA. Binding of antibody to HMW-MAA12 Five Detected by I-labeled anti-mouse IgG Fc heterologous antibody. No binding specificity
Measure using plates coated with the antigen of interest. Antibodiesin vivoImmune peroxygen to prove that
Melanoma lesions are stained in the sidase reaction and contain HMW-MAA binding antibodies
Test serum. iii) map the antigenic determinants recognized by the antibodies present in the immune serum
Perform a cross-blocking test for the purpose of At the end of this anti-HMW-MA
F (ab ') of mAbTwoWith the amount of fragment saturation (20 μg / well)
Incubate the melanoma cells. Following washing, add immune serum to the cells. 125 Antibody binding is detected using an I-labeled anti-mouse IgG Fc heterologous antibody. Reverse
To melanoma cells125Binding of I-labeled anti-HMW-MAA mAb to immune serum
Is tested for its ability to inhibit. The specificity of these assays depends on mAb and irrelevant
The estimation was performed using an antiserum that recognizes the antigen.
【００６１】 合成ペプチドにより誘導されるＴ細胞媒介免疫応答 ｉ） リンパ球の増殖反応を試験するため、９６穴平底組織培養プレート中で
合成ペプチド（１μＭと５０μＭの範囲の）の存在下に、免疫したマウスから採
取した末梢リンパ節細胞を３７℃、５％ＣＯ2を含んだ湿潤環境でインキュベー
トしてトリプリケートで測定する。４、５日間のインキュベーション後に、０．
５μＣｉ［Ｈ3］チミジンを添加し、１６時間、３７℃でインキュベーションを
行った後、細胞をセルハーベスターによって回収する。細胞増殖は細胞ＤＮＡへ
の［Ｈ3］チミジンの取り込み量として見積もり、ベータシンチレーションカウ
ンターで試料を測定し、ｃｐｍ±ＳＤとして表示する。 ｉｉ）マウスの右肢パッドにおいて、放射線照射（２０Ｋｒａｄ）したＨＭＷ
−ＭＡＡ発現培養メラノーマ細胞（５×１０5／１００μｌ）、又は免疫化ペプ
チド（７５μｇ／１００μｌ又は１２５μｇ／１００μｌ）で免疫刺激して遅延
型過敏（ＤＴＨ）反応を試験する。細胞又はペプチドを注射した後、肢パッドの
厚さを０、２４、４８および７２時間後に測定する。結果は少なくとも５頭のマ
ウスから得られた厚さの増加の平均値±ＳＤとして表示する。放射線照射（２０
Ｋｒａｄ）ＨＭＷ−ＭＡＡ陰性ヒトＢリンパ球細胞（５×１０5／１００μｌ）
又は無関係のペプチド（７５μｇ／１００μｌ又は１２５μｇ／１００μｌ）を
左後肢パッドに注射したものを特異性コントロールとする。T Cell-Mediated Immune Response Induced by Synthetic Peptides i) To test the proliferative response of lymphocytes, immunization was performed in the presence of synthetic peptides (ranging from 1 μM and 50 μM) in 96-well flat bottom tissue culture plates. Peripheral lymph node cells collected from the mouse are incubated at 37 ° C. in a humid environment containing 5% CO 2 and measured in triplicate. After 4 or 5 days of incubation, 0.
After adding 5 μCi [H 3 ] thymidine and incubating at 37 ° C. for 16 hours, the cells are collected by a cell harvester. Cell proliferation is estimated as the amount of [H 3 ] thymidine incorporated into cellular DNA, and the sample is measured with a beta scintillation counter and expressed as cpm ± SD. ii) Irradiated (20 Krad) HMW in mouse right limb pad
-Test delayed type hypersensitivity (DTH) reaction by immunostimulation with MAA-expressing cultured melanoma cells (5 x 10 < 5 > / 100 [mu] l) or immunizing peptide (75 [mu] g / 100 [mu] l or 125 [mu] g / 100 [mu] l). Following cell or peptide injection, limb pad thickness is measured at 0, 24, 48 and 72 hours. Results are expressed as mean thickness increase ± SD obtained from at least 5 mice. Irradiation (20
Krad) HMW-MAA negative human B-lymphocyte cells (5 × 10 5 / 100μl)
Alternatively, an unrelated peptide (75 μg / 100 μl or 125 μg / 100 μl) injected into the left hind limb pad is used as a specificity control.
【００６２】 統計学的解析 値が標準的な分布をしているか、していないかに依存して、様々なプロトコル
によって免疫を行ったマウス群の免疫学的アッセイの結果を比較する目的で、２
サンプルｔ検定又は２サンプルＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定などの２サンプル
統計手法を用いる。Statistical Analysis For the purpose of comparing the results of immunological assays of groups of mice immunized by various protocols, depending on whether the values have a standard distribution or not,
A two-sample statistical technique such as a sample t-test or a two-sample Mann-Whitney test is used.
【００６３】 ウサギにおける免疫原性 免疫化戦略 マウスで得られた結果を応用し、ウサギでのＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミッ
クの免疫原性を解析する戦略をデザインする。ペプチドはＫＬＨに対して結合し
たもの又は非結合のものを用い、最も効果的であると判明したアジュバントの一
つと混合し、指示どおりの用量を注射する。血清を免疫前、および免疫後１３、
２７、３４および４１日目に後縁耳静脈から採取する。液性抗ＨＭＷ−ＭＡＡ免
疫の発達に基づいて追加の免疫および／また採血を行う。Immunogenicity in Rabbits Immunization Strategies The results obtained in mice are applied to design a strategy to analyze the immunogenicity of the peptide mimic of HMW-MAA in rabbits. Peptides, either conjugated or unconjugated to KLH, are mixed with one of the most effective adjuvants and injected at the indicated dose. Serum before and after immunization 13,
Harvest from the posterior marginal ear vein on days 27, 34 and 41. Additional immunizations and / or blood collections are performed based on the development of humoral anti-HMW-MAA immunity.
【００６４】 ペプチドの用量、免疫の回数、キャリアーおよびアジュバントの免疫応答に対す
る効果 合成ペプチドの免疫原性に対するペプチドの用量、免疫の回数、キャリアー、
アジュバントおよび多抗原ペプチドの効果について、マウスにおいて記載した方
法と同様にして解析する。Effect of Peptide Dose, Number of Immunizations, Carrier and Adjuvant on Immune Response Peptide dose, number of immunizations, carrier on immunogenicity of synthetic peptide
The effects of the adjuvant and the multi-antigen peptide are analyzed in the same manner as described for mice.
【００６５】 合成ペプチドによって誘導される液性免疫応答 抗ペプチド抗体と抗ＭＷ−ＭＡＡ抗体の発達、およびその精密な特異性の血清
学的および免疫化学的同定を行うために、ペプチドで免疫したマウスに関して記
載した液性免疫応答の特性化と同様にして解析する。Humoral Immune Response Induced by Synthetic Peptides Mice immunized with peptides for the development of anti-peptide and anti-MW-MAA antibodies and for serological and immunochemical identification of their precise specificity Are analyzed in the same manner as the characterization of the humoral immune response described for
【００６６】 統計学的解析 マウスの免疫応答の解析に関して記載した統計学的解析法と同様の方法を用い
て、様々なプロトコルで免疫したウサギにおける免疫応答の解析を行う。Statistical Analysis The analysis of immune responses in rabbits immunized with various protocols is performed using methods similar to the statistical analysis described for the analysis of immune responses in mice.
【００６７】 ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックが、ＨＬＡクラスＩ抗原に拘束されたＨＭＷ
−ＭＡＡ特異的ＣＴＬをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて誘導できるか、および免疫化
ペプチドに結合するＨＬＡクラスＩ同種特異性をトランスジェニックであるマウ
スにおいて誘導できるかどうかの決定 ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックはマウスとウサギにおいて液性抗ＨＭＷ−
ＭＡＡ免疫と、マウスにおいてＴ細胞増殖性の抗ＨＭＷ−ＭＡＡ反応を誘導する
。ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックはまたＨＬＡクラスＩ抗原に拘束されたＨ
ＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを誘導する。この可能性は我々が同定した２つのペプ
チドがＨＬＡ−Ｂ２７．５結合モチーフを有するという『予備的結果』の項で述
べた我々の予備的な結果によって支持されている。また、ＣＴＬと抗体による同
一の抗原決定基の認識によって（３３、３４）、およびメラノーマ患者における
腫瘍関連性抗原を定義する抗体に対する液性と細胞性免疫の両者の発達により支
持されている。さらにＣＴＬはＨＬＡクラスＩ抗原拘束を受けながらＨＭＷ−Ｍ
ＡＡを認識する能力を有するが、その能力に基づいてＣＴＬを試験することがで
きる。ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックと、ＨＭＷ−ＭＡＡから得られるかも
しれない、予備的結果の項に述べた、おそらくＨＬＡクラスＩ抗原として標的細
胞上に提示されているであろうペプチドとの間の部分的なアミノ酸配列のホモロ
ジーのために、そうしたことが起こるかもしれない。あるいは抗ＨＭＷ−ＭＡＡ
ｍＡｂによって同定したペプチド、およびＨＬＡクラスＩ抗原によって提示さ
れるＨＭＷ−ＭＡＡから得られるペプチドは構造的なホモロジーによってＣＴＬ
が定義する決定基を共有するかもしれない。HMW-MAA Peptidomimetic is HLA Class I Antigen Restricted HMW
-Determination of whether MAA-specific CTL can be induced in vitro and that HLA class I homospecificity binding to the immunizing peptide can be induced in transgenic mice The peptide mimic of HMW-MAA is expressed in mice and rabbits Liquid anti-HMW-
Induces MAA immunity and a T cell proliferative anti-HMW-MAA response in mice. The peptide mimic of HMW-MAA is also HLA class I antigen-restricted H
Induce MW-MAA-specific CTL. This possibility is supported by our preliminary results, described in the "Preliminary Results" section, that the two peptides we identified have an HLA-B27.5 binding motif. It is also supported by the recognition of the same antigenic determinant by CTLs and antibodies (33, 34), and by the development of both humoral and cellular immunity to antibodies that define tumor-associated antigens in melanoma patients. In addition, CTLs undergo HMW-M
Has the ability to recognize AA, but can test CTL based on that ability. The portion between the peptidomimetic of HMW-MAA and the peptide described in the Preliminary Results section, which may be obtained from HMW-MAA, possibly being presented as HLA class I antigen on target cells That may happen because of the specific amino acid sequence homology. Or anti-HMW-MAA
The peptides identified by the mAbs, and the peptides derived from HMW-MAA presented by HLA class I antigen, have CTLs with structural homology.
May share the determinants defined by.
【００６８】 ｉｎ ｖｉｖｏでＨＬＡクラスＩ拘束を受けたＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを
刺激できるかどうか決定するためにＨＬＡクラスＩ抗原トランスジェニックマウ
スは有益なモデルを提供する。すでに述べたように、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体を用
いてパンニングによって我々が同定したペプチドの２つはＨＬＡ−Ｂ２７．５に
対する結合モチーフを有することが判明した。これらの２つのペプチドの免疫原
性の試験をＨＬＡ−Ｂ２７．５トランスジェニックマウスを用いて行う。HLA class I antigen transgenic mice provide a useful model for determining whether HLA-MAA-specific CTLs restricted by HLA class I can be stimulated in vivo . As already mentioned, two of the peptides we identified by panning with an anti-HMW-MAA antibody were found to have a binding motif for HLA-B27.5. Testing of the immunogenicity of these two peptides is performed using HLA-B27.5 transgenic mice.
【００６９】 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂを用いて同定したペプチドがＨＬＡクラスＩ拘束を
受けたＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬを産生するかどうか試験する目的で、我々は
以下の戦略を用いる：ｉ）同定したＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックからＨＬ
ＡクラスＩ同種特異性に対する結合モチーフを有するペプチドの選択；ｉｉ）選
択されたペプチドの選択されたＨＬＡクラスＩ同種特異性に対する予測される結
合の測定；ｉｉｉ）選択されたペプチドによって刺激された自己樹状細胞を用い
た、適切なＨＬＡ表現型の末梢血リンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏ感作；ｉｖ）適切
なＨＬＡクラスＩ同種特異性のトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬの誘導
；ｖ）ペプチドを発現するＴＡＰ欠乏細胞とＨＭＷ−ＭＡＡ発現メラノーマ細胞
を溶解する能力の試験による、ＨＬＡクラスＩ抗原拘束を受けたＣＴＬ産生の測
定。To test whether peptides identified using the anti-HMW-MAA mAb produce HLA-class I restricted HMW-MAA-specific CTL, we use the following strategy: i) HMW-MAA peptide mimic to HL
Selection of peptides having a binding motif for A class I homospecificity; ii) determination of expected binding of selected peptides to selected HLA class I homospecificity; iii) self stimulated by selected peptides. In vitro sensitization of peripheral blood lymphocytes of appropriate HLA phenotype using dendritic cells; iv) induction of CTL in transgenic mice of appropriate HLA class I allospecificity; v) TAP deficiency expressing peptide Measurement of HLA class I antigen restricted CTL production by testing the ability to lyse cells and HMW-MAA expressing melanoma cells.
【００７０】 ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックにおけるＨＬＡクラスＩ同種特異性結合モチ
ーフの同定 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体を用いてファージディスプレイペプチドライブラリーの
パンニングによって単離したペプチドについて、その様々なＨＬＡクラスＩ同種
特異性への結合をバイオインフォーマティクスと分子解析ソフトウェア（ＢＩＭ
ＡＳ）を用いて評価を行う。Identification of HLA Class I Homospecific Binding Motifs in HMW-MAA Peptidomimics For peptides isolated by panning a phage display peptide library using anti-HMW-MAA antibodies, the various HLA class I homospecifics Bioinformatics and molecular analysis software (BIM
The evaluation is performed using AS).
【００７１】 ＨＬＡクラスＩ同種特異性に対するペプチドの予測された結合の測定 選択されたＨＬＡクラスＩ同種特異性に対するペプチドの相対結合親和性は、
ＨＬＡクラスＩ同種特異性をコードした遺伝子を導入したリンパ球細胞株Ｔ２を
用いて、再構成アッセイによって測定することができる。即ち、ＨＬＡクラスＩ
抗原導入Ｔ２リンパ球細胞を氷冷クエン酸−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液（同量の０．２
６３Ｍ クエン酸と０．１２３Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4の混合）、ｐＨ３．３で、９０
秒間、処理することによって実施する。細胞は次に冷却Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）で緩衝し、Ｉ
ＭＤＭで洗浄し、１００ｎＭ ヒト2−μ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．）と、２μｇの抗ＨＬＡ−Ａ２、Ａ２８ ｍＡｂ ＣＲ１１−３５１あるい
は抗ＨＬＡ−Ｂ２７ ｍＡｂ ＫＳ４（試験を行うペプチドによる）のいずれか
、およびペプチド無し（ネガティブコントロール）、標準ペプチド（１０μＭ）
又は試験ペプチド（１０Ｍ）のいずれか、と共にインキュベーションする。ＨＬ
Ａ−Ａ*０２０１とＨＬＡ−Ｂ*２７０５結合に用いた標準ペプチドの配列はそれ
ぞれ配列ＦＬＰＳＤＹＦＰＳＶとＲＲＹＱＫＳＴＥＬである。室温での４時間の
インキュベーションに続き、細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ
−結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体で３０分間、４℃にてインキュベーションを行う
。洗浄に引き続き、細胞を０．５％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ−１％Ｂ
ＳＡ中に再び懸濁し、ＦＡＣｓｃａｎにて解析を行う。結果は以下の計算の通り
、蛍光強度（ＦＩ）の増加を倍数として表わす：ＦＩサンプル／ＦＩコントロー
ル。Determination of Predicted Binding of Peptide to HLA Class I Homospecificity The relative binding affinity of the peptide for the selected HLA class I homospecificity is
It can be measured by a reconstitution assay using a lymphocyte cell line T2 into which a gene encoding HLA class I homospecificity has been introduced. That is, HLA class I
The antigen-introduced T2 lymphocyte cells were placed in an ice-cold citrate-Na 2 HPO 4 buffer (the same amount of 0.2
Mixture of 63 M citric acid and 0.123 M Na 2 HPO 4 ), pH 3.3, 90
Perform by treating for seconds. The cells are then cooled Iscover's mo
buffered with modified Dulbecco's medium (IMDM).
After washing with MDM, 100 nM human 2- μ (Sigma Chemical C)
o. ), 2 μg of anti-HLA-A2, A28 mAb CR11-351 or anti-HLA-B27 mAb KS4 (depending on the peptide to be tested), no peptide (negative control), standard peptide (10 μM)
Alternatively, incubate with either the test peptide (10M). HL
The sequences of the standard peptides used for AA * 0201 and HLA-B * 2705 binding are the sequences FLPDSYFPSV and RRYQKSTEL, respectively. Following a 4 hour incubation at room temperature, cells were washed with PBS containing 1% BSA and FITC
Incubate with conjugated anti-mouse IgG goat antibody for 30 minutes at 4 ° C. Following washing, cells were washed with PBS-1% B containing 0.5% paraformaldehyde.
Re-suspend in SA and analyze on FACscan. The results represent the increase in fluorescence intensity (FI) as a fold, as calculated as follows: FI sample / FI control.
【００７２】 ペプチド刺激をした樹状細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＴＬの誘導 樹状細胞を、メラノーマ患者又は適切なＨＬＡ表現型を持つ健康なボランティ
アの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からすでに述べた方法によって調製する。Ｆｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ分離の後、ＰＢＭＣ（１−３×１０8）を７５ｃｍ2培
養フラスコ中で３７℃にて３時間、培養する。非接着性の細胞を除去し、接着性
細胞を１０％ 熱不活化ヒトＡＢ血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン−ストレプトマイシン、０．５ｍｇ／ｍｌ アンホテリシンＢおよ
び０．０３％ Ｌ−グルタミン酸を添加した２０ｍｌのＩＭＤＭ培養液中で無菌
的条件下で５−７日間培養する。ヒトリコンビナント ＧＭ−ＣＳＦ（１０００
ＩＵ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）とヒトリコンビナント ＩＬ−
４（１０００ＩＵ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を培養の０日目か
ら２−３日間隔で添加する。樹状細胞（１×１０6／ｍｌ）をペプチド（１ｇ／
ｍｌ）で２時間、３７℃で刺激する。非接着性ＰＢＭＣからバイオマグネティク
分離ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、 Ｄｙｎａｌ Ｉｎｃ．、 Ｌａｋｅ Ｓｕ
ｃｃｅｓｓ、 ＮＹ）を用いたポジティブ選択により自己ＣＤ８+Ｔ細胞を調製
する。９５％以上であると期待されるＣＤ８+Ｔ細胞集団の精製度をＦＡＣＳ解
析によって確認する。Induction of CTL in vitro using peptide-stimulated dendritic cells Dendritic cells were previously described from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of melanoma patients or healthy volunteers with the appropriate HLA phenotype. Prepared by the method. Fi
After the col-Hypaque separation, PBMC (1-3 × 10 8 ) are cultured in a 75 cm 2 culture flask at 37 ° C. for 3 hours. Non-adherent cells were removed, and adherent cells were replaced with 10% heat-inactivated human AB serum, 10 mM HEPES, 100 U / ml
Culture under sterile conditions for 5-7 days in 20 ml of IMDM medium supplemented with penicillin-streptomycin, 0.5 mg / ml amphotericin B and 0.03% L-glutamic acid. Human recombinant GM-CSF (1000
IU / ml; Pepro Tech Inc. ) And human recombinant IL-
4 (1000 IU / ml; Pepro Tech Inc.) is added at 2-3 day intervals from day 0 of culture. Dendritic cells (1 × 10 6 / ml) were converted to peptides (1 g /
(ml) for 2 hours at 37 ° C. Biomagnetic separation beads from non-adhesive PBMC (Dynabeads, Dynal Inc., Lake Su)
autogenous CD8 + T cells are prepared by positive selection using the following method. The purity of the CD8 + T cell population expected to be 95% or higher is confirmed by FACS analysis.
【００７３】 ＣＤ８+Ｔ細胞（４−５×１０6／ｗｅｌｌ）を２４穴組織培養プレート中でペ
プチド刺激を行った樹状細胞（１×１０6）と共に７日間、３７℃でインキュベ
ーションを行い、次に１週間後にペプチド刺激をした樹状細胞を用いて再刺激を
行う。ＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍｌ、Ｈｏｆｆｍａｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ、ニュ
ージャージー州、ナットレー）を各刺激後２４時間後に添加し、その後は２−３
日置きに添加する。最初の刺激から７〜９日後、および再刺激の後７日後にＣＴ
Ｌの特異性の試験を行う。CD8 + T cells (4-5 × 10 6 / well) were incubated with peptide-stimulated dendritic cells (1 × 10 6 ) in 24-well tissue culture plates for 7 days at 37 ° C. One week later, restimulation is performed using peptide-stimulated dendritic cells. IL-2 (300 IU / ml, Hoffman La Roche, Natley, NJ) was added 24 hours after each stimulation, followed by 2-3
Add every other day. CT 7-9 days after initial stimulation and 7 days after restimulation
Test for L specificity.
【００７４】 ＨＬＡクラスＩ抗原トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬの導入 ヒトＨＬＡ Ｂ*２７０５又はキメラＨＬＡ Ａ*０２０１／Ｋdを発現したト
ランスジェニックマウスをｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬ産生の目的に用いる。Ａ／Ｋ d トランスジェニックマウスを用いるのは、マウスＭＨＣクラスＩ ３ドメイン
が胸腺において低アビディティーＣＴＬの選択を増幅することが示されたからで
ある。０および７日目にトランスジェニックマウス（３匹／群）に対して、ペプ
チド刺激をした樹状細胞（１×１０5／０．２ｍｌ ＰＢＳ）を皮下に注射し免
疫を行う。２度目の注射の１０日後、マウスを安楽死させ、ペプチドによるｉｎ ｖｉｔｒｏ 再刺激のために胸腺をＩＬ−２含有培養液（６０ ＩＵ／ｍｌ）
中に回収する。機能試験のためにＣＴＬを維持する目的で、ペプチド刺激をした
樹状細胞、又は胸腺細胞のいずれかによる再刺激を毎週行う。Introduction of CTL in HLA Class I Antigen Transgenic Mice Human HLA B*2705 or chimeric HLA A*0201 / KdExpression of
Transgenic mice are used for the purpose of in vivo CTL production. A / K d Transgenic mice are used in mouse MHC class I 3 domain
Has been shown to amplify the selection of low avidity CTL in the thymus
is there. On days 0 and 7, transgenic mice (3 / group) were
Dendritic cells (1 × 10Five/0.2ml PBS) injected subcutaneously
Conduct the epidemic. Ten days after the second injection, the mice are euthanized andin in vitro For restimulation, thymus was cultured in IL-2 containing medium (60 IU / ml)
Collect inside. Peptide stimulation was performed to maintain CTL for functional testing
Restimulation with either dendritic cells or thymocytes is performed weekly.
【００７５】ｉｎ ｖｉｔｒｏ およびｉｎ ｖｉｖｏ 感作に用いたペプチドに特異的なＣ
ＴＬの産生の評価 ｉｎ ｖｉｔｒｏ感作およびｉｎ ｖｉｖｏ誘導されたＣＤ８+Ｔ細胞が、適
切なＨＬＡ表現型を持つペプチド刺激をした標的細胞を認識する能力について、
サイトカイン放出および細胞障害性アッセイにて試験を行う。機能アッセイにお
いてペプチド特異的反応に対する標的として、遺伝子型あるいは対応する遺伝子
の導入により適切なＨＬＡクラスＩ拘束エレメントを発現したＴＡＰ欠損Ｔ２細
胞を用いる。Ａ／Ｋdトランスジェニックマウスから得たマウスＣＴＬのアッセ
イにおいて、キメラＨＬＡクラスＩ特異性に拘束されたＣＴＬのアッセイ感受性
を改善する目的で（６１）、Ｔ２細胞にキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｋd遺伝子を導入
する。細胞障害性アッセイでは標的細胞を１μＭペプチドで３７℃、１時間、刺
激を行い、洗浄し、次にＮａ51ＣｒＯ4（１５０μＣｉ／１０6 ｃｅｌｌｓ）で
３７℃で１２時間、標識を行う。次に細胞を洗浄し、９６穴丸底プレートにて最
終総量０．２ｍｌで１０％ヒトＡＢ血清又はＦＢＳを含有する ＲＰＭＩ １６
４０培養液中で効果細胞（効果細胞／標的細胞比は２０：１から２．５：１の範
囲で）と混合する。５％ＣＯ2の環境下で３７℃、４時間のインキュベーション
の後、トリプリケートの培養について各上清を１００μｌ 回収し、測定する。
データは標的細胞のＣｒ51の特異的放出の平均パーセントとして表現する。サイ
トカイン放出アッセイにおいて、刺激細胞（１×１０5）と反応細胞（１×１０5 ）を９６穴プレートにて２４時間、共培養する。培養上清を回収し、ＩＮＦ−ｇ
ａｍｍａ（Ｅｎｄｏｇｅｎ、 Ｗｏｂｕｒｎ、 ＭＡ）の存在下でＥＬＩＳＡに
よって試験を行う。 無関係のペプチドで刺激したＴＡＰ欠損標的細胞を用いてＣＴＬの抗原特異性
の評価を行う。ＨＬＡクラスＩ抗原拘束を、拘束エレメントとして用いたＨＬＡ
クラスＩ対立遺伝子に対するｍＡｂを用い、ブロッキング実験によって測定する
。また、ＣＴＬの誘導に用いた、ＨＬＡクラスＩ拘束エレメントを欠如したペプ
チドで刺激をした標的細胞を用いて測定する。C specific to the peptides used for in vitro and in vivo sensitization
Evaluation of TL production For the ability of in vitro sensitized and in vivo induced CD8 + T cells to recognize peptide-stimulated target cells with the appropriate HLA phenotype,
Testing is performed in cytokine release and cytotoxicity assays. In a functional assay, TAP-deficient T2 cells that have expressed the appropriate HLA class I restriction element by introduction of a genotype or corresponding gene are used as targets for peptide-specific reactions. In the assay of mouse CTL obtained from A / K d transgenic mice, the chimeric HLA-A2 / K d gene was introduced into T2 cells for the purpose of improving the assay sensitivity of CTL restricted to chimeric HLA class I specificity (61). Is introduced. In the cytotoxicity assay, target cells are stimulated with 1 μM peptide for 1 hour at 37 ° C., washed, and then labeled with Na 51 CrO 4 (150 μCi / 10 6 cells) at 37 ° C. for 12 hours. The cells are then washed and RPMI 16 containing 10% human AB serum or FBS in a final volume of 0.2 ml in a 96-well round bottom plate.
Mix with effector cells (effector / target cell ratio in the range of 20: 1 to 2.5: 1) in 40 cultures. After incubation at 37 ° C. for 4 hours in an environment of 5% CO 2 , 100 μl of each supernatant is collected and measured for triplicate culture.
Data are expressed as the average percentage of specific release of Cr 51 in target cells. In the cytokine release assay, stimulator cells (1 × 10 5 ) and reaction cells (1 × 10 5 ) are co-cultured in a 96-well plate for 24 hours. The culture supernatant is collected and INF-g
The test is performed by ELISA in the presence of amma (Endogen, Woburn, MA). The CTL antigen specificity is evaluated using TAP-deficient target cells stimulated with an irrelevant peptide. HLA using HLA class I antigen restriction as restriction element
Measured by blocking experiments using mAbs against class I alleles. In addition, the measurement is performed using target cells stimulated with a peptide lacking the HLA class I restriction element used for inducing CTL.
【００７６】 ＨＬＡクラスＩ抗原に拘束された、ＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ＣＴＬの産生の評価 ｉｎ ｖｉｔｒｏ感作およびｉｎ ｖｉｖｏ誘導されたＣＤ８+Ｔ細胞の、適
切なＨＬＡ表現型を持つメラノーマ細胞上のＨＭＷ−ＭＡＡを認識する能力につ
いてサイトカイン放出および細胞障害性アッセイにて試験を行う。ＨＬＡクラス
Ｉ拘束エレメントを発現しているがＨＭＷ−ＭＡＡを発現していない腫瘍細胞を
用いて、ＨＭＷ−ＭＡＡに対するＣＴＬの特異性を測定する。ＨＬＡクラスＩ拘
束をブロッキング実験によって測定する。ブロッキング実験には、拘束エレメン
トとして用いたＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対するｍＡｂと、ＨＭＷ−ＭＡＡを
発現するがＨＬＡクラスＩ拘束エレメントは発現していないメラノーマ細胞を用
いる。Evaluation of HMW-MAA-specific CTL production restricted to HLA class I antigens HMW on melanoma cells with appropriate HLA phenotype of in vitro sensitized and in vivo induced CD8 + T cells -Test for ability to recognize MAA in cytokine release and cytotoxicity assays. The specificity of CTL for HMW-MAA is determined using tumor cells that express HLA class I restriction elements but not HMW-MAA. HLA class I restriction is measured by blocking experiments. For the blocking experiment, a mAb against the HLA class I allele used as a restriction element and melanoma cells that express HMW-MAA but do not express the HLA class I restriction element are used.
【００７７】 実施例２ 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂによって認識される抗原決定基のペプチドミミック 同定 ＨＭＷ−ＭＡＡ結合抗−抗−ｉｄ ｍＡｂ ＧＨ３６８、ＧＨ４６４、ＧＨ５
８６、ＧＨ７０４、ＧＨ７８６およびＧＨ１１１５を用いたパンニングによって
ＬＸ−８およびＸ15ライブラリーの両方から、そして抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂ
７６３．７４を用いたパンニングによってＬＸ−８ライブラリーからそれぞれ
陽性クローンを単離した。ファージは異なる配列を持つペプチドをディスプレイ
した。ファージディスプレイペプチド挿入片に対応する合成ペプチドの結合をパ
ンニングに用いた対応するｍＡｂを用いて測定した。ｍＡｂ ７６３．７４によ
って同定した合成環状ペプチド＃１ ＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲは、ｍＡｂ ７
６３．７４と反応し、そのＨＭＷ−ＭＡＡと抗ｉｄ ｍＡｂ ＭＫ２−２３に対
する結合を用量依存性に阻害した。ジチオスレイトールによってペプチドを線状
化すると反応性が失われることから、ｍＡｂ ７６３．７４とペプチド＃１の反
応性はコンフォメーション依存性である。合成ペプチド＃３（ＱＣＴＧＰＮＦＡ
ＴＮＣＲ）はｍＡｂ ７６３．７４のＨＭＷ−ＭＡＡと抗ｉｄ ｍＡｂ ＭＫ２
−２３との反応性を阻害しなかったので、位置７にある残基Ｖａｌがペプチド＃
１のｍＡｂ ７６３．７４との反応性において重要な役割を果たしていることは
特筆すべきである。それぞれｍＡｂ ＧＨ３６８とＧＨ７８６によって同定した
合成ペプチド＃５（ＧＣＩＫＳＨＰＦＶＲＣＰ）と＃７（ＮＱＬＰＱＹＭＧＰＡ
ＰＡＹＭＲ）はＨＭＷ−ＭＡＡに対する対応するｍＡｂの結合を阻害した。Example 2 Peptidomimic Identification of Antigenic Determinants Recognized by Anti-HMW-MAA mAb HMW-MAA binding anti-anti-id mAb GH368, GH464, GH5
86, GH704, from both LX-8 and X 15 library by panning using the GH786 and GH1115, and anti-HMW-MAA mAb
Positive clones were each isolated from the LX-8 library by panning with 763.74. The phage displayed peptides with different sequences. The binding of the synthetic peptide corresponding to the phage display peptide insert was measured using the corresponding mAb used for panning. Synthetic cyclic peptide # 1 QCTGPNVATNCR, identified by mAb 763.74,
63.74 and inhibited the binding of its HMW-MAA to the anti-id mAb MK2-23 in a dose-dependent manner. Reactivity of mAb 763.74 with peptide # 1 is conformation dependent, since linearization of the peptide with dithiothreitol results in loss of reactivity. Synthetic peptide # 3 (QCTGPNFA
TNCR) was tested with mAb 763.74 of HMW-MAA and anti-id mAb MK2.
Residue Val at position 7 did not inhibit the reactivity with -23
It is noteworthy that one plays an important role in the reactivity with mAb 763.74. Synthetic peptides # 5 (GCIKSHPFVRCP) and # 7 (NQLPQYMGPA) identified by mAbs GH368 and GH786, respectively.
PAYMR) inhibited the binding of the corresponding mAb to HMW-MAA.
【００７８】 ＨＭＷ−ＭＡＡとのアミノ酸ホモロジー ｍＡｂ ＧＨ３６８とＧＨ７０４によって同定したペプチドと、ｍＡｂ ＧＨ
１１５１によって同定したペプチドは、それぞれモチーフ、ＳＨＰＦとＰＰＴＦ
ＸＳを、発表されているＨＭＷ−ＭＡＡコアタンパク質のアミノ酸配列の残基１
４５７−１４６０と８１８−８２３と共有する。ｍＡｂ ＧＨ７８６とＧＨ１１
５１によって同定したＬＸ−８ペプチドはＰＦＱモチーフをＨＭＷ−ＭＡＡコア
タンパク質のアミノ酸残基１４５８−１４６０に共有する。同様にｍＡｂ ＧＨ
３６８、ＧＨ５８６とＧＨ７０４によって同定したペプチドは相互にＨＰＦモチ
ーフを共有する。これら２つのモチーフにおいてアミノ酸ＰＦが共有されている
ことは、これらの残基が抗−抗ｉｄ ｍＡｂによって認識される決定基の発現に
重要な役割を果たしていることを示唆する。Amino acid homology with HMW-MAA Peptides identified by mAb GH368 and GH704, mAb GH
The peptides identified by 1151 are motifs, SHPF and PPTF, respectively.
XS was replaced with residue 1 of the amino acid sequence of the published HMW-MAA core protein.
457-1460 and 818-823. mAbs GH786 and GH11
The LX-8 peptide identified by 51 shares the PFQ motif with amino acid residues 1458-1460 of the HMW-MAA core protein. Similarly, mAb GH
368, peptides identified by GH586 and GH704 share an HPF motif with each other. The shared amino acid PF in these two motifs suggests that these residues play an important role in the expression of determinants recognized by anti-anti-id mAbs.
【００７９】 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂとの反応性パターン ｍＡｂのパネルによって同定したファージディスプレイペプチド間の構造的関
連性を、ｍＡｂ ７６３．７４、８つのＨＭＷ−ＭＡＡ結合の抗−抗ｉｄ ｍＡ
ｂ、そして３つのＨＭＷ−ＭＡＡ非結合の抗ｉｄ ｍＡｂを用いた結合アッセイ
および阻害アッセイの測定によって解析した。ｍＡｂ ７６３．７４によって同
定したファージディスプレイペプチドは抗−抗ｉｄ ｍＡｂとは全く反応しなか
った。逆にｍＡｂ ７６３．７４はｍＡｂ ＧＨ３６８、ＧＨ４６４およびＧＨ
７０４によって同定したファージディスプレイペプチドと反応した。抗−抗ｉｄ
ｍＡｂ ＧＨ３６８、ＧＨ７０４およびＧＨ１１５１は、各々を用いて同定を
行ったファージディスプレイペプチドと反応した。さらにｍＡｂ ＧＨ４６４
とＧＨ５８６は、ｍＡｂ ＧＨ３６８とＧＨ７０４によって同定したファージデ
ィスプレイペプチドと反応した。ｍＡｂ ＧＨ５８６はｍＡｂ ＧＨ７８６によ
って同定したファージディスプレイペプチドとも弱く反応した。後者のファージ
ディスプレイペプチドの内、いくつかはｍＡｂ ＧＨ５１８と弱く反応した。合
成ペプチド＃５の反応性は、ｍＡｂ ７６３．７４とｍＡｂ ＧＨ４６４を除く
全てのｍＡｂとの反応性において、対応するファージディスプレイペプチドと同
様の結果を示した。ｍＡｂ ７６３．７４とｍＡｂ ＧＨ４６４はファージディ
スプレイペプチドと反応したが、対応する合成ペプチドとは反応しなかった。こ
れは我々の仮説であるが、ペプチド配列だけではなく、ファージのｐＶＩＩＩメ
ジャーコートタンパク質のアミノ酸残基もｍＡｂ ７６３．７４とＧＨ４６４と
の反応性に寄与している。この仮説を検証するために現在、実験を進めている。Reactivity Pattern with Anti-HMW-MAA mAb Structural relevance between phage display peptides identified by a panel of mAbs was determined by mAb 763.74, an anti-anti-id mA of eight HMW-MAA bindings.
b and three HMW-MAA unbound anti-id mAbs were analyzed by binding and inhibition assay measurements. The phage display peptide identified by mAb 763.74 did not react at all with the anti-anti-id mAb. Conversely, mAb 763.74 is mAb GH368, GH464 and GH
Reacted with the phage display peptide identified by 704. Anti-anti-id
mAbs GH368, GH704 and GH1151 reacted with the phage display peptides identified using each. Further mAb GH464
And GH586 reacted with the phage display peptides identified by mAbs GH368 and GH704. mAb GH586 also reacted weakly with the phage display peptide identified by mAb GH786. Some of the latter phage display peptides reacted weakly with mAb GH518. The reactivity of synthetic peptide # 5 was similar to the corresponding phage display peptide in the reactivity of mAb 763.74 with all mAbs except mAb GH464. mAb 763.74 and mAb GH464 reacted with the phage display peptide but not with the corresponding synthetic peptide. This is our hypothesis that not only the peptide sequence but also the amino acid residues of the phage pVIII major coat protein contribute to the reactivity of mAb 763.74 with GH464. We are currently experimenting to test this hypothesis.
【００８０】 ＨＬＡ−Ａ*０２０１とＨＬＡ−Ｂ*２７０５抗原に対する結合 バイオインフォマティクスと分子解析ソフトウェア（ＢＩＭＡＳ）を用いた解
析によって抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂ によって同定したいくつかのペプチド中
に、ＨＬＡ−Ａ*０２０１、−Ａ*６８０１と−Ｂ*２７０５抗原結合モチーフを
同定した。Binding to HLA-A * 0201 and HLA-B * 2705 Antigens Several peptides identified by anti-HMW-MAA mAb by analysis using bioinformatics and molecular analysis software (BIMAS) included HLA-A * 0201, -A * 6801 and -B * 2705 antigen binding motifs were identified.
【００８１】 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂはまた、ＨＭＷ−ＭＡＡ由来ペプチドＬＬＧＨＳＩ
ＶＡＶに対してホモロジーのあるペプチドも同定した。後者はＨＬＡ−Ａ*０２
０１抗原結合モチーフを有する。ペプチドを同定したｍＡｂのＨＬＡ−Ａ*０２
０１抗原への結合を増加させるために、我々は位置２、５および９に変異を導入
することを計画している。The anti-HMW-MAA mAb also demonstrates that the HMW-MAA derived peptide LLGHSI
Peptides homologous to VAV were also identified. The latter is HLA-A * 02
It has a 01 antigen binding motif. HLA-A * 02 of the mAb that identified the peptide
We plan to introduce mutations at positions 2, 5 and 9 to increase binding to the 01 antigen.
【００８２】 同定したペプチドのＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対する結合予測値が妥当であ
るかどうかについて、安定化アッセイを用いて試験を行う。ｍＡｂ ＧＨ７８６
とＧＨ７０４によって同定したペプチド、それぞれＹＭＧＰＡＰＡＹＭとＣＲＶ
ＥＬＮＨＰＲは、ＨＬＡ−Ｂ*２７０５導入ＴＡＰ欠損Ｔ２（Ｔ２−Ｂ*２７０５
）細胞においてそれぞれＨＬＡ−Ａ*０２０１とＨＬＡ−Ｂ*２７０５抗原の発現
を安定化させた。ＨＬＡ−Ｂ*２７０５とＨＬＡ−Ａ*０２０１抗原結合ペプチド
は、Ｔ２−ＨＬＡ−Ｂ*２７０５細胞においてそれぞれＨＬＡ−Ａ*０２０１とＨ
ＬＡ−Ｂ*２７０５抗原の発現量を変えなかったため、安定化は特異的であると
いえる。ＨＬＡ−Ｂ*２７０５結合ペプチドであるＣＲＶＥＬＮＨＰＲは、リフ
ァレンスペプチドＲＲＹＱＫＳＴＥＬを導入した場合とほぼ同じ程度にまでＨＬ
Ａ−Ｂ*２７０５の発現を安定化させる。The stability of the identified peptides for HLA class I alleles is tested using a stabilization assay to determine whether the predicted binding is valid. mAb GH786
And peptides identified by GH704, YMGPAPAYM and CRV, respectively.
ELNHPR is HLA-B * 2705-introduced TAP-deficient T2 (T2-B * 2705).
) The expression of HLA-A * 0201 and HLA-B * 2705 antigens was stabilized in the cells, respectively. HLA-B * 2705 and HLA-A * 0201 antigen-binding peptides, T2-HLA-B * 2705, respectively in the cell HLA-A * 0201 and H
The stabilization was specific because the expression level of the LA-B * 2705 antigen was not changed. CRVELNHPR, which is an HLA-B * 2705 binding peptide, has an HL level of about the same as when the reference peptide RRYQKSTEL was introduced.
Stabilizes the expression of AB * 2705.
【００８３】 ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫 ｍＡｂ ７６３．７４（ＱＣＴＧＰＮＶＡＴＮＣＲ）、ｍＡｂ ＧＨ３６８（
ＧＣＩＫＳＨＰＦＶＲＣＰ）およびｍＡｂ ＧＨ７８６（ＴＣＲＬＰＦＱＮＶＡ
ＣＨ）を用いてＬＸ−８ペプチドライブラリーから、そしてｍＡｂ ＧＨ７８６
（ＮＱＬＰＱＹＭＧＰＡＰＡＹＭＲ）を用いてＸ15ライブラリーから単離したフ
ァージディスプレイペプチドでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。ｍＡｂ ＧＨ３
６８によって同定した幾つかのペプチドを除く残り全てのファージディスプレイ
ペプチドで免疫したマウス血清は、結合アッセイにおいてＨＭＷ−ＭＡＡ陰性Ｂ
リンパ球細胞よりもＨＭＷ−ＭＡＡ発現メラノーマ細胞Ｍｅｌｕｒに対してより
高い反応性を示した。Immunization in BALB / c mice mAb 763.74 (QCTGPNVATNCR), mAb GH368 (
GCIKSHPFVRCP) and mAb GH786 (TCRLPFQNVA
CH) from the LX-8 peptide library and the mAb GH786
(NQLPQYMGPAPAYMR) were immunized BALB / c mice with isolated phage display peptide from X 15 libraries using. mAb GH3
Mouse sera immunized with all but the remaining phage display peptides except for some of the peptides identified by H.68 in the binding assay were HMW-MAA negative B
It showed higher reactivity to HMW-MAA expressing melanoma cells Melur than to lymphocytes.
【００８４】 同定したファージディスプレイペプチドを用いたＨＭＷ−ＭＡＡ結合ｍＡｂのデ
ィファレンシャル反応性の分子学的基礎 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂパネルによって認識されるペプチドは多様であり、
互いにメラノーマ細胞への結合を阻害する能力を持つが、これはＨＭＷ−ＭＡＡ
上で空間的に近接しているが互いに個別である抗原決定基の認識に適合している
。Molecular Basis of Differential Reactivity of HMW-MAA Binding mAbs Using Identified Phage Display Peptides The peptides recognized by the anti-HMW-MAA mAb panel are diverse,
Have the ability to inhibit the binding of each other to melanoma cells,
Suitable for the recognition of antigenic determinants that are spatially close but distinct from each other above.
【００８５】 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂの重鎖（ＶH）と軽鎖（ＶL）可変部のアミノ酸配列
の比較によって、ｍＡｂ ＧＨ３６８、ＧＨ７０４、ＧＨ７８６およびＧＨ１１
５１のＶHとＶL ＣＤＲのアミノ酸配列に高いホモロジーが存在することが判明
した。これら４つのｍＡｂは、これまでに同定したファージディスプレイペプチ
ドに非常に類似した反応性パターンを示している。抗−抗ｉｄ ｍＡｂ ＧＨ３
６８、ＧＨ７０４およびＧＨ７８６によって単離されたファージディスプレイペ
プチドとｍＡｂ ＧＨ５８６との反応性は、ＶH−ＣＤＲ２における２つのアミ
ノ酸残基が異なるために減少する。さらにＶH−ＣＤＲ３におけるＴｙｒ残基を
Ａｌａに置換すると、ｍＡｂ ＧＨ３６８、ＧＨ７０４およびＧＨ７８６によっ
て同定したファージディスプレイペプチドとｍＡｂ ＧＨ１４９の反応性は失わ
れる。最後にｍＡｂ ＧＨ３６８、ＧＨ７０４、ＧＨ７８６およびＧＨ１１５１
によって同定したファージディスプレイペプチドとｍＡｂ ＧＨ４６４と７６３
．７４の反応性は、そのＶHとＶL−ＣＤＲ３のアミノ酸配列が幾つか異なると失
われる。By comparing the amino acid sequences of the heavy (V H ) and light (V L ) variable regions of the anti-HMW-MAA mAb, the mAbs GH368, GH704, GH786 and GH11
It was found that there was high homology in the amino acid sequences of 51 VH and VL CDRs. These four mAbs show very similar reactivity patterns to previously identified phage display peptides. Anti-anti-id mAb GH3
The reactivity of the phage display peptide isolated by 68, GH704 and GH786 with mAb GH586 is reduced due to differences in the two amino acid residues in VH- CDR2. Further substitution of the Tyr residue in VH- CDR3 with Ala abolishes the reactivity of mAb GH149 with the phage display peptide identified by mAb GH368, GH704 and GH786. Finally, mAbs GH368, GH704, GH786 and GH1151
Phage Display Peptides Identified by mAbs GH464 and 763
. The reactivity of 74 is lost if the VH and VL- CDR3 amino acid sequences differ by some.
【００８６】 実施例３ 抗ＧＤ3ガングリオシドｍＡｂによって認識される抗原決定基のペプチドミミッ
ク 同定 ５つの抗ＧＤ3ガングリオシドｍＡＢを用い、ファージディスプレイペプ
チドライブラリーＬＸ−８およびＸ15のパンニングにより、ｍＡｂ ＭＧ２１
ＩｇＧを用いてＬＸ−８ペプチドライブラリーから、およびｍＡｂ ＭＢ３．６
とＭＧ２２を用いてＸ15ペプチドライブラリーからファージクローンを単離した
。ｍＡｂ ＭＧ２１ ＩｇＧ３とＲ２４を用いた２つのライブラリーのパンニン
グではクローンは同定できなかった。[0086] The panning Example 3 Anti-GD 3 ganglioside mAb used peptidomimetics identified five anti GD 3 ganglioside mAB antigenic determinants recognized by the phage display peptide library LX-8 and X 15, mAb MG21
From the LX-8 peptide library using IgG and mAb MB3.6
If the phage clones from X 15 peptide libraries using MG22 was isolated. Panning of the two libraries with mAbs MG21 IgG3 and R24 did not identify any clones.
【００８７】 ランダムに選択した陽性クローンの塩基配列解析によって、ｍＡｂ ＭＧ２１
ＩｇＧ１によって同定したクローンから１つの配列を同定し（クローン＃１と
称す）、ｍＡｂ ＭＧ２２によって同定したクローンから１つの配列を同定し（
クローン＃４と称す）、ｍＡｂ ＭＢ３．６によって同定したクローンから２つ
の配列を同定した（クローン＃２と＃３と称す）。４つのアミノ酸配列にはＰｒ
ｏ残基が好まれて使われている点を除けば、全くホモロジーは存在しなかった。
この発見は、炭水化物にミミックしたペプチドにおいて同定した短いコンセンサ
ス配列が一般に芳香族アミノ酸及び／又はプロリンに富んでいる事実というに一
致する。Analysis of the nucleotide sequence of randomly selected positive clones revealed that mAb MG21
One sequence was identified from the clone identified by IgG1 (referred to as clone # 1) and one sequence was identified from the clone identified by mAb MG22 (
Two sequences were identified from the clone identified by mAb MB3.6 (designated clone # 4) (designated clones # 2 and # 3). The four amino acid sequences have Pr
There was no homology except that the o residue was favored and used.
This finding is consistent with the fact that the short consensus sequences identified in carbohydrate mimicked peptides are generally rich in aromatic amino acids and / or proline.
【００８８】 クローン＃１と＃４はそれぞれｍＡｂ ＭＧ ＩｇＧ１とＭＧ２２のＧＤ3ガ
ングリオシドに対する結合を阻害した。対応する５０％阻害濃度は１．３と１２
．３Ｍであった。対照的にクローン＃２と＃３はＧＤ3ガングリオシドに対する
ｍＡｂ ＭＢ３．６の結合に対してわずかに境界的効果が観察されただけであっ
た。[0088] clone # 1 and # 4 inhibited the binding to GD 3 ganglioside mAb MG IgG1 and MG22, respectively. The corresponding 50% inhibitory concentrations are 1.3 and 12
. 3M. The contrast clone # 2 and # 3 was only slightly boundary effect on binding of mAb MB3.6 against GD 3 ganglioside was observed.
【００８９】 クローン＃１を除いて、４つのクローンはパンニングに用いたｍＡｂとのみ反
応した。クローン＃１はｍＡｂ ＭＧ２１ ＩｇＧ３とも反応したが、ｍＡｂ
ＭＧ２１ ＩｇＧ１との反応に比べるとわずかであった。Except for clone # 1, four clones reacted only with the mAbs used for panning. Clone # 1 also reacted with mAb MG21 IgG3,
It was slight compared to the reaction with MG21 IgG1.
【００９０】 ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫原性 ｍＡｂ ＭＧ２２によって同定したファージディスプレイペプチドを用いて免
疫を行った１４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのうち６匹が、ＧＤ2とＧＭ3ガングリオ
シドと交叉反応をするＧＤ3ガングリオシド抗体を産生した。これらの抗体のＧ
Ｄ3ガングリオシドとの反応性はｍＡｂ ＭＧ２２によって同定したファージデ
ィスプレイペプチドに対応する合成ペプチドによって阻害された。ＧＤ3ガング
リオシドと免疫血清の反応性は、ｍＡｂ ＭＢ３．６によって同定した合成ペプ
チド＃３によって影響されなかったので、この阻害は特異的であると考えられる
。抗体の発達のキネティクスとそのタイターは６匹の免疫応答のあるマウスにお
いて多様に異なっていた。マウス＃３から採取した血清はまたドットブロットア
ッセイにおいてＧＤ3ガングリオシドと反応し、ＧＤ3ガングリオシド陰性リンパ
球細胞Ｌ１４よりもＧＤ3ガングリオシドを発現するメラノーマ細胞Ｍｅｌｕｒ
とより高い反応性を示した。Immunogenicity in BALB / c Mice Six out of 14 BALB / c mice immunized with the phage display peptide identified by mAb MG22 cross-react with GD 2 and GM 3 gangliosides It produced the GD 3 ganglioside antibodies. The G of these antibodies
Reactivity with D 3 ganglioside was inhibited by synthetic peptides corresponding to phage-displayed peptides identified by mAb MG22. Reactive GD 3 ganglioside and immune sera, so was not affected by the synthetic peptide # 3 was identified by mAb MB3.6, this inhibition is considered to be specific. The kinetics of antibody development and its titer varied widely in six immune-responsive mice. Serum taken from mouse # 3 also reacts with GD 3 ganglioside in the dot blot assay, melanoma cells Melur expressing GD 3 ganglioside than GD 3 ganglioside-negative lymphocytes L14
And higher reactivity.
【００９１】実施例４ ファージディスプレイペプチドライブラリー ジスルフィド結合ペプチドＸＣＸ8ＣＸ、単一のシステインペプチドＸＣＸ15
およびランダム／リニアペプチドＸ15を示すファージディスプレイペプチドライ
ブラリーＬＸ−８、ＸＣＸ15およびＸ15のそれぞれはＤｒ．Ｊ．Ｋ．Ｓｃｏｔｔ
（Ｓｉｍｏｎ Ｆｒａｓｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、 Ｂｕｒｎａｂｙ、 Ｂ
Ｃ、 Ｃａｎａｄａ）の好意によって提供された（６６）。ファージディスプレ
イペプチドライブラリーのスクリーニングとパンニングの方法は当技術分野でよ
く知られている。例として、米国特許第５，７６３，１６４号；第５，８３４，
３１８号；第５，７３３，７３１号；第５，７２３，２８６号；第５，５６５，
３２５号；第５，４９８，５３０号；第５，７５０，３７３号；および第５，８
０７，９８６号を参照のこと。これら米国特許の全てを本明細書の一部を構成す
るものとしてここに援用する。 Example 4 Phage Display Peptide Library Disulfide-Binding Peptide XCX 8 CX, Single Cysteine Peptide XCX 15
And Dr. Each phage display peptide libraries LX-8, XCX 15 and X 15 illustrates a random / linear peptide X 15 J. K. Scott
(Simon Fraser University, Burnaby, B
C, Canada) (66). Methods for screening and panning phage display peptide libraries are well known in the art. For example, U.S. Patent Nos. 5,763,164; 5,834,
No. 318; 5,733,731; 5,723,286; 5,565.
No. 325; 5,498,530; 5,750,373; and 5,8.
See 07,986. All of these U.S. patents are incorporated herein by reference.
【００９２】 ＨＭＷ−ＭＡＡのペプチドミミックを抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂ ７６３．７
４と８つのＨＭＷ−ＭＡＡ結合抗−抗ｉｄ ｍＡｂを用いてファージディスプレ
イペプチドライブラリーのパンニングによって単離する。単離したファージの反
応性について、パンニングに使用したｍＡｂを用いて結合アッセイにて試験する
。パンニングに用いたｍＡｂに反応性があると判明したファージの中からランダ
ムにファージを選択し、その挿入片のアミノ酸配列を合成ペプチドを利用して決
定することができる。次に後者の、ｍＡｂ ７６３．７４および抗−抗ｉｄ ｍ
Ａｂ結合ＨＭＷ−ＭＡＡのパネルとの反応性について試験を行う。さらにホモロ
ジーの度合いを決定するために、そのペプチド配列を発表されているＨＭＷ−Ｍ
ＡＡのアミノ酸配列と比較する。The peptide mimic of HMW-MAA was converted to the anti-HMW-MAA mAb 763.7.
Isolate by panning a phage display peptide library with 4 and 8 HMW-MAA conjugated anti-anti-id mAbs. The reactivity of the isolated phages is tested in a binding assay using the mAbs used for panning. A phage can be randomly selected from phages found to be reactive with the mAb used for panning, and the amino acid sequence of the insert can be determined using a synthetic peptide. Then the latter, mAb 763.74 and anti-anti-id m
Testing is performed for reactivity of the Ab-bound HMW-MAA with the panel. To further determine the degree of homology, the peptide sequence was published in HMW-M
Compare with AA amino acid sequence.
【００９３】 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂによるファージディスプレイペプチドライブラリーの
パンニング パンニングに用いるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）はカプリル酸とアンモニウ
ム硫酸による連続沈殿によってマウス腹水から精製する。ｍＡｂの精製度はＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥでモニターする。精製したｍＡｂはＮＨＳ−ＬＣビオチン（Ｐｉｅ
ｒｃｅ、イリノイ州、ロックフォール）を用いて製造者のインストラクションに
従ってビオチン化する。ビオチン化したｍＡｂを用いて、増幅したファージディ
スプレイペプチドライブラリーＬＸ−８、ＸＣＸ15およびＸ15からのマイクロパ
ンニングをＢｏｎｎｙｃａｓｔｌｅらの方法に従い９６穴マイクロタイタープレ
ート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州
、リンカーンパーク）中で実施する。即ち、パンニングの第一回目は１ウェルあ
たり１０ｇのビオチン化ｍＡｂと１×１０12ファージ粒子を利用して実施する。
引き続いて、１×１０10ファージ粒子を添加し、ビチオン化ｍＡｂの量を１ウェ
ル当たり０．１０ｇに減少させて３回のパンニングを実施する。各回のパンニン
グで溶出したファージをＳｍｉｔｈとＳｃｏｔｔの方法に従って調製したＥ．ｃ
ｏｌｉ Ｋ９１Ｋａｎ中で増幅し、次の回のパンニングの添加ファージとして用
いる。各回のパンニングの後に溶出ファージ／添加ファージの％として定義され
るファージ濃縮、例えば％収量を、テトラサイクリン（Ｔｃ）（２０ｕｇ／ｍｌ
）を含むＮＺＹプレート上のスポットタイタリングによって決定する。Panning of Phage Display Peptide Library with Anti-HMW-MAA mAb The monoclonal antibody (mAb) used for panning is purified from mouse ascites by successive precipitation with caprylic acid and ammonium sulfate. The purification degree of the mAb is SD
Monitor by S-PAGE. The purified mAb was purified from NHS-LC biotin (Pie
(rce, Rockford, Ill.) according to the manufacturer's instructions. With biotinylated mAb, 96-well microtiter plates in accordance Bonnycastle's method micro panning from phage display peptide libraries LX-8, XCX 15 and X 15 which is obtained by amplifying (Falcon, Becton Dickinson, NJ, Lincoln Park ). That is, the first round of panning is performed using 10 g of biotinylated mAb and 1 × 10 12 phage particles per well.
Subsequently, 1 × 10 10 phage particles are added and three rounds of panning are performed, reducing the amount of biotinylated mAb to 0.10 g per well. The phage eluted in each round of panning were prepared according to the method of Smith and Scott. c
Amplify in oli K91 Kan and use as additional phage for next round of panning. Phage enrichment, defined as the percentage of eluted phage /% of added phage after each round of panning, eg,% yield, was determined using tetracycline (Tc) (20 ug / ml).
) Is determined by spot titration on an NZY plate.
【００９４】 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂのパネルを用いた単離されたファージディスプレイペ
プチドの反応性 抗ＨＭＷ−ＭＡＡ ｍＡｂ ７６３．７４とＨＭＷ−ＭＡＡ結合 抗−抗ｉｄ
ｍＡｂを用いた４回目のパンニングの後、リコンビナントペプチドライブラリ
ーから単離したファージディスプレイペプチドについて特異的反応性の試験を行
う。試験はパンニングに使用したｍＡｂを用い、第一回目は免疫スクリーニング
によって、次にＥＬＩＳＡによって行う。免疫スクリーニングではペプチドライ
ブラリーから単離したランダムファージクローンを試験する。各ウェルにパンニ
ングに用いた１００ｕｌのｍＡｂ溶液（０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ3の１００ｕｇ
／ｍｌ、 ｐＨ９．６）を添加することによりｍＡｂによってすでにコートされ
た、フレキシブル、Ｕ−型底９６穴マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｋ
、 Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、 ＶＡ）中でＥＬＩＳＡを実施する。室温で１８時間
のインキュベーションの後、２％ ＢＳＡを含むＰＢＳでウェルをブロッキング
する。次に、免疫スクリーニングにおいて陽性であると判明したクローンの一夜
培養から採取した１００ｕｌのファージ上清を各ウェルに添加する。４℃での一
夜のインキュベーションの後、ビオチン化した抗Ｍ１３ヒツジ抗体（５ ｐｒｉ
ｍｅ−３ ｐｒｉｍｅ Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、 ＣＯ）を添加し、インキ
ュベーションを室温でさらに２時間行う。ビオチン化した抗Ｍ１３ヒツジ抗体の
結合は、ＳＡ−ＨＲＰ溶液の１：２５００ 希釈液を用い、室温で１時間、ウェ
ルをインキュベーションして検出する。反応はフェニレンジアミン−Ｈ2Ｏ2基質
を用いて開始し、２Ｍ Ｈ2ＳＯ4で止める。ＥＬＩＳＡリーダー（ＥＬ ３１１
，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、
ＶＴ）によって４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。結果は４９０ｎｍにお
ける吸光度の値によって表示する。Reactivity of isolated phage display peptides using a panel of anti-HMW-MAA mAbs Anti-HMW-MAA mAb 763.74 and HMW-MAA binding Anti-anti-id
After the fourth round of panning with the mAb, specific reactivity tests are performed on the phage display peptides isolated from the recombinant peptide library. The test uses the mAbs used for panning, the first time by immunoscreening and then by ELISA. Immunoscreening involves testing random phage clones isolated from a peptide library. 100 ul of the mAb solution used for panning (100 ug of 0.05 M NaHCO 3
/ U-shaped bottom 96-well microtiter plate (Dynatek), already coated with mAb by adding
The ELISA is performed in Chantilly, VA). After an 18 hour incubation at room temperature, block the wells with PBS containing 2% BSA. Next, 100 ul of phage supernatant from an overnight culture of a clone found positive in the immunoscreen is added to each well. After overnight incubation at 4 ° C., biotinylated anti-M13 sheep antibody (5 pri
me-3 prime Inc. , Boulder, CO) is added and the incubation is carried out at room temperature for a further 2 hours. Binding of biotinylated anti-M13 sheep antibody is detected using a 1: 2500 dilution of SA-HRP solution and incubating the wells for 1 hour at room temperature. The reaction was initiated with phenylenediamine -H 2 O 2 substrate, stopped at 2M H 2 SO 4. ELISA reader (EL 311
, Bio-Tech Instruments Inc. , Winooski,
The absorbance at 490 nm is measured by VT). Results are expressed as absorbance values at 490 nm.
【００９５】 反応の特異性は、マウスＩｇに一致したイソタイプを有するファージ上清の反
応性を試験してモニターする。パンニングに用いたｍＡｂによって陽性であると
判明したクローンについて、他の抗−抗ｉｄ ｍＡｂを用いて試験する。The specificity of the reaction is monitored by testing the reactivity of phage supernatants having an isotype consistent with mouse Ig. Clones that proved positive by the mAb used for panning are tested with other anti-anti-id mAbs.
【００９６】 パンニングに用いたｍＡｂと反応するファージ挿入片の塩基配列 パンニングに用いたｍＡｂと反応すると判明したクローンの内から１０クロー
ンを得て、この１０クローンの間の平均のペプチド挿入片の塩基配列を、以下の
変法が施行されたジデオキシヌクレオチド鎖終止法によって決定する。ＰＥＧ／
ＮａＣｌ沈殿法によって個々のクローンのファージ上清からファージを精製し、
調製する。シーケンシング反応は、マイクロタイターウェル（ＧｅＮｕｎｃ；Ｎ
ｕｎｃ Ｒｏｃｋｉｌｄｅ Ｄｅｎｍａｒｋ）中で２×１０11ファージ粒子につ
いて、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ ｋｉｔ （ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０、 Ｕｎｉｔｅ
ｄ ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、 Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、 ＯＨ）
と32Ｐ−エンド標識 ｆ８８．４ シンケンシング プライマー、５’−ＣＴＧ
ＡＡＧＡＧＡＧＴＣＡＡＡＡＧＣ−３’を用いて実施する。解析を行ったクロー
ンの塩基配列はアミノ酸配列に翻訳される。コンセンサス配列、および最も頻繁
に観察されたアミノ酸配列を同定するためアミノ酸配列を比較する。このインフ
ォメーションを基にしてアミノ酸配列を選択し、自動ペプチドシンセサイザー（
９０５０ Ｐｌｕｓ；マサチューセッツ州、パーセプティブ）中で標準 ９−フ
ルオレニル−メトキシ−カルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成器（ＳＰＰＳ
）を用いてペプチドを合成する。指示がある場合、合成ペプチドは５％ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて環状化し、高性能液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）によって精製を行う。ペプチドの環状化はマススペクトロスコピーに
よって確認する。ペプチドは水で５ｍＭの濃度に再構成し、少量づつ分注し、−
２０℃にて貯蔵する。もしペプチドが水に難溶性である場合はＤＭＳＯ中に５０
ｍＭの濃度で溶解し、使用に際し緩衝液で希釈を行う。Base Sequence of Phage Insert Reacting with mAb Used for Panning Ten clones were obtained from clones that were found to react with the mAb used for panning, and the average base of peptide insert between these 10 clones was obtained. The sequence is determined by the dideoxynucleotide chain termination method with the following modifications. PEG /
Purifying phage from phage supernatant of individual clones by NaCl precipitation method,
Prepare. Sequencing reactions were performed in microtiter wells (GeNunc; N
SEQUENASE kit (version 2.0, Unite) for 2 × 10 11 phage particles in unc Rockilde Denmark
d states Biochemical, Cleveland, OH)
And 32 P-endo labeled f88.4 sequencing primer, 5'-CTG
Performed using AAGAGAGTCAAAAGC-3 '. The nucleotide sequence of the analyzed clone is translated into an amino acid sequence. The amino acid sequences are compared to identify the consensus sequence and the most frequently observed amino acid sequence. An amino acid sequence is selected based on this information, and an automatic peptide synthesizer (
9050 Plus; Perceptive, Mass.) Standard 9-fluorenyl-methoxy-carbonyl (Fmoc) solid phase peptide synthesizer (SPPS)
) To synthesize the peptide. Where indicated, synthetic peptides were cyclized using 5% dimethylsulfoxide (DMSO) and purified by high performance liquid chromatography (
Purification by HPLC). Cyclization of the peptide is confirmed by mass spectroscopy. The peptide was reconstituted in water to a concentration of 5 mM, dispensed in small aliquots,
Store at 20 ° C. If the peptide is poorly soluble in water, 50
Dissolve at a concentration of mM and dilute with buffer before use.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＭ，Ａ Ｔ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ， ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA36 CA04 CA05 DA03 4C076 CC07 CC27 4C084 AA02 AA03 AA06 AA13 AA17 BA02 BA18 BA23 CA27 CA53 CA56 CA59 DA01 DA27 MA05 NA14 ZB011 ZB012 ZB261 ZB262 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 NA13 ZB01 ZB26 4H045 AA11 BA16 BA17 CA40 DA01 DA75 DA86 EA28 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 47/48 A61K 48/00 48/00 A61P 35/00 A61P 35/00 37/00 37/00 C07K 14 / 47 C07K 14/47 16/18 16/18 A61K 37/02 C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR , GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, L , LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZWF terms (reference) 4B024 AA01 BA21 BA36 CA04 CA05 DA03 4C076 CC07 CC27 4C084 AA02 AA03 AA06 AA13 AA17 BA02 BA18 BA23 CA27 CA53 CA56 CA59 DA01 DA27 MA05 NA14 ZB011 ZB012 ZB261 ZB262 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 NA13 ZB01 ZB26 4H045 AA11 BA16 BA17 CA40 DA01 DA75 DA86 EA28 FA74
Claims (59)
応答を誘導する有効量のペプチドミミックによって、治療を必要とする哺乳動物
を治療することを特徴とする哺乳動物の治療方法。1. A method for treating a mammal in need of treatment, comprising treating the mammal in need of treatment with an effective amount of a peptidomimetic that induces an immune response to a target molecule or a fragment thereof associated with a disease.
項１に記載の方法。4. The method of claim 1, wherein said target molecule is a high molecular weight melanoma-associated antigen.
載の方法。5. The method of claim 1, wherein said target molecule is ganglioside gd3.
ＫＲＰＬＶを含むものである請求項１に記載の方法。7. The method according to claim 1, wherein the peptide mimic has the amino acid sequence SPSWYCPDCD.
2. The method according to claim 1, comprising KRPLV.
ＬＫＳＲＨを含むものである請求項１に記載の方法。8. The method according to claim 1, wherein the peptide mimic has the amino acid sequence RPYRYDPLGD.
The method of claim 1 comprising LKSRH.
ＨＰＲＴＬを含むものである請求項１に記載の方法。9. The method according to claim 1, wherein the peptide mimic has the amino acid sequence EARNWHDPI.
2. The method according to claim 1, comprising HPRTL.
ＹＣＰを含むものである請求項１に記載の方法。10. The peptide mimic according to claim 10, wherein the amino acid sequence is SCRWVGIDL.
2. The method of claim 1, comprising YCP.
ＡＰＳＩＲＫを含むものである請求項１に記載の方法。11. The method of claim 11, wherein the peptide mimic has the amino acid sequence EELHPPGSR.
2. The method according to claim 1, comprising APSIRK.
ＮＣＲを含むものである請求項１に記載の方法。12. The peptide mimetic having the amino acid sequence QCTGPNVAT.
2. The method of claim 1, wherein the method comprises an NCR.
ＮＣＲを含むものである請求項１に記載の方法。13. The peptide mimic of claim 1, wherein the peptide mimic has the amino acid sequence QCTGPNFAT.
2. The method of claim 1, wherein the method comprises an NCR.
ＮＣＬを含むものである請求項１に記載の方法。14. The peptide mimic having the amino acid sequence TCNGPSVYM.
The method of claim 1, comprising an NCL.
ＤＬＫＳＲＨを含むものである請求項１に記載の方法。15. The amino acid sequence of the peptide mimic having the amino acid sequence RPYRYDPLG.
The method of claim 1, wherein the method comprises DLKSRH.
請求項１に記載の方法。16. The peptide mimic is conjugated to an immunogenic compound.
The method of claim 1.
求項１に記載の方法。17. The method of claim 1, wherein said peptidomimetic is conjugated to an adjuvant.
合して複合体を形成している、請求項１に記載の方法。18. The method of claim 1, wherein said peptide mimic binds to an MCH class I restricted antigen to form a complex.
結合して複合体を形成している、請求項１に記載の方法。19. The method of claim 1, wherein said peptide mimic binds to an MCH class II restricted antigen to form a complex.
記載の方法。20. The method of claim 1, wherein said peptidomimetic is a synthetic peptide.
載の方法。21. The method of claim 1, wherein said peptidomimetic is a pseudo-peptide.
求項１に記載の方法。22. The method of claim 1, wherein said peptidomimetic is expressed on an antigen presenting cell.
方法。23. The method of claim 22, wherein said antigen presenting cells are dendritic cells.
疫応答を誘導するペプチドミミック。24. A peptidomimetic that induces an immune response against a disease-associated target molecule or fragment thereof.
ク。25. The peptidomimetic according to claim 24, wherein the disease is cancer.
ミミック。26. The peptidomimetic according to claim 25, wherein the cancer is melanoma.
求項２４に記載のペプチドミミック。27. The peptidomimetic of claim 24, wherein said target molecule is a high molecular weight melanoma-related antibody.
に記載のペプチドミミック。28. The target molecule is ganglioside gd3.
2. The peptide mimic according to item 1.
求項２４に記載のペプチドミミック。29. The peptidomimetic according to claim 24, comprising the amino acid sequence SPSWYCPDCDKRPLV.
求項２４に記載のペプチドミミック。30. The peptidomimetic according to claim 24, comprising the amino acid sequence RPYRYDPLGDLKSRH.
求項２４に記載のペプチドミミック。31. The peptidomimic according to claim 24, comprising the amino acid sequence EARNWHDPIPIHPRTL.
４に記載のペプチドミミック。32. The method according to claim 2, which comprises the amino acid sequence SCRWVGIDLYCP.
4. The peptide mimic according to 4.
求項２４に記載のペプチドミミック。33. The peptidomimetic according to claim 24, comprising the amino acid sequence EELHPPGSRAPSIRK.
４に記載のペプチドミミック。34. The method of claim 2, comprising the amino acid sequence QCTGPNVATNCR.
4. The peptide mimic according to 4.
４に記載のペプチドミミック。35. The method according to claim 2, comprising the amino acid sequence QCTGPNFATNCR.
4. The peptide mimic according to 4.
４に記載のペプチドミミック。36. The method according to claim 2, comprising the amino acid sequence TCNGPSVYMNCL.
4. The peptide mimic according to 4.
求項２４に記載のペプチドミミック。37. The peptidomimic of claim 24, comprising the amino acid sequence RPYRYDPLGDLKSRH.
ている、請求項２４に記載のペプチドミミック。38. The peptidomimetic of claim 24, wherein said peptidomimetic is conjugated to an immunogenic compound.
求項２４に記載のペプチドミミック。39. The peptidomimetic of claim 24, wherein said peptidomimetic is conjugated to an adjuvant.
合して複合体を形成している、請求項２４に記載のペプチドミミック。40. The peptide mimic of claim 24, wherein said peptide mimic binds to an MCH class I restricted antigen to form a complex.
結合して複合体を形成している、請求項２４に記載のペプチドミミック。41. The peptide mimic of claim 24, wherein said peptide mimic binds to an MCH class II restricted antigen to form a complex.
記載のペプチドミミック。42. The peptidomimetic according to claim 24, wherein said peptidomimetic is a pseudopeptide.
求項２４に記載のペプチドミミック。43. The peptidomimetic of claim 24, wherein said peptidomimetic is expressed on an antigen presenting cell.
ペプチドミミック。44. The peptidomimetic according to claim 43, wherein the antigen-presenting cells are dendritic cells.
疫応答を誘導するペプチドミミックを発現する有効量のベクターによって、治療
を必要とする哺乳動物を治療することを特徴とする哺乳動物の治療方法。45. A method for treating a mammal in need thereof, comprising treating the mammal in need of treatment with an effective amount of a vector that expresses a peptidomimetic that induces an immune response to a disease-associated target molecule or fragment thereof. Method.
求項４５に記載の方法。48. The method of claim 45, wherein said target molecule is a high molecular weight melanoma-associated antibody.
に記載の方法。49. The target molecule is ganglioside gd3.
The method described in.
疫応答を誘導するペプチドミミックを発現するベクター。50. A vector expressing a peptidomimetic that induces an immune response against a disease-associated target molecule or a fragment thereof.
。52. The vector of claim 51, wherein said cancer is melanoma.
求項５０に記載のベクター。53. The vector of claim 50, wherein said target molecule is a high molecular weight melanoma-associated antibody.
に記載のベクター。54. The target molecule is ganglioside gd3.
The vector according to claim 1.
疫応答を誘導するペプチドミミックをコードする核酸分子。55. A nucleic acid molecule encoding a peptidomimetic that induces an immune response against a disease-associated target molecule or fragment thereof.
。57. The nucleic acid molecule of claim 46, wherein said cancer is melanoma.
求項５５に記載の核酸分子。58. The nucleic acid molecule of claim 55, wherein said target molecule is a high molecular weight melanoma-associated antibody.
に記載の核酸分子。59. The target molecule is ganglioside gd3.
3. The nucleic acid molecule according to claim 1.
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1998
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2012505659A (en) * | 2008-10-16 | 2012-03-08 | ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション | Fully human antibodies against high molecular weight melanoma-related antigens and uses thereof |
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