JP2002533084A - Group A Streptococci Protective Antigen (SPA) - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新しいＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの防御的な抗原（本明細書中でＳｐａと示された）の発見を提供する。これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉから同定され、そして単離された。Ｓｐａは、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの複数の血清型に対して防御的である、オプソニン作用性の抗体を誘発する、Ｍタンパク質とは異なる表面抗原である。本発明はさらに、単離されたＳｐａポリペプチド、タンパク質、ペプチド、およびそれらに対する抗体、ならびにＳｐａポリペプチドおよびペプチドの抗原をコードする核酸を提供する。Ｓｐａポリペプチドの同定および単離のための方法、Ｓｐａ抗原または抗体を含む治療用組成物、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染に対する動物の防御におけるそれらの使用方法もまた、提供される。   (57) [Summary] The present invention provides for the discovery of a new Streptococcus protective antigen (designated Spa herein). It was identified and isolated from Streptococci. Spa is a surface antigen different from the M protein that elicits opsonizing antibodies that are protective against multiple serotypes of streptococci. The present invention further provides isolated Spa polypeptides, proteins, peptides, and antibodies thereto, as well as nucleic acids encoding antigens of Spa polypeptides and peptides. Also provided are methods for the identification and isolation of Spa polypeptides, therapeutic compositions comprising Spa antigens or antibodies, and methods for their use in protecting animals against Streptococcus infection.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 （技術分野） 本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ、より詳細には、ポリペプチド抗原、
およびそれをコードする核酸に関する。これらは、Ａ群のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｉによる感染に対して防御的な動物における、オプソニン作用性の抗体を誘発
するために有用である。TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to Streptococcal, and more particularly, to polypeptide antigens,
And nucleic acids encoding the same. These are group A streptococ
Useful for eliciting opsonizing antibodies in animals that are protective against infection by ci.

【０００２】 （発明の背景） Ａ群のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌの感染は、併発していない咽頭炎および膿
皮症から、重篤な侵襲性の感染および毒性のショック症候群までにわたる広範な
臨床的な症候群を生じる。感染に対する防御は、生物体の表面のＭタンパク質に
対する抗体によって大きく媒介される。Ｍタンパク質は、αへリックス状、らせ
ん状（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）分子であり、これは、外側に曝されているその
超可変のＮ末端、そして細胞質中に埋めこまれている保存されているＣ末端を伴
って、表面から伸びる。Ｎ末端は、相同な血清型に対する防御に関係する殺菌性
の抗体を誘発する型特異的エピトープを含む。ｅｍｍ遺伝子は、上流のポイティ
ブな調節因子であるｍｇａによって制御されるレギュロン（ｒｅｇｕｌｏｎ）中
に配置されている。血清型に依存して、レギュロンは、１つ、２つ、または３つ
のｅｍｍ遺伝子およびｅｍｍ様遺伝子を含み得る。１つのｅｍｍ遺伝子のみを含
有している血清型においては、ｅｍｍ遺伝子の欠失または中断は、無毒性の生物
体を生じる。これらの生物体は、もはや食作用には耐え得ない。いくつかのｅｍ
ｍ様遺伝子を発現する血清型においては、それぞれが、食作用に対する耐性に部
分的に貢献し得るが、Ａ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの表面タンパク質に規定
される多くのものの中で、Ｍタンパク質に対する抗体だけが、オプソニン作用性
であることが示されている。BACKGROUND OF THE INVENTION [0002] Streptococcal infection in group A results in a wide range of clinical syndromes, from uncomplicated pharyngitis and pyoderma to severe invasive infections and toxic shock syndrome. . Protection against infection is largely mediated by antibodies to M proteins on the surface of the organism. The M protein is an α-helical, coiled-coil molecule, which is exposed to its hypervariable N-terminus and the conserved C embedded in the cytoplasm. Extends from the surface, with the ends. The N-terminus contains a type-specific epitope that elicits bactericidal antibodies involved in protection against homologous serotypes. The emm gene is located in a regulon controlled by the upstream positive regulator, mga. Depending on the serotype, the regulon may contain one, two, or three emm genes and emm-like genes. In serotypes containing only one emm gene, deletion or interruption of the emm gene results in a non-toxic organism. These organisms can no longer withstand phagocytosis. Some em
Among the serotypes that express the m-like gene, each may partially contribute to resistance to phagocytosis, but among the many defined Streptococci surface proteins of Group A, only antibodies against the M protein are the only ones. , Have been shown to be opsonic.

【０００３】 Ｍタンパク質以外によって媒介される交差血清型の防御の分子基礎を理解する
ことは、Ａ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉによって引き起こされる種々の感染に
ついての治療的な処置を提供することを目的とする。１８型のＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｉは、ユタ州での急性のリウマチ熱の再来において重要な血清型として同
定されている。さらに、３型および１８型、ならびに、より少ない程度に２８型
のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉが、全て、重篤なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの疾患
の最近の再来に関連している。これらの疾患のそれぞれは、多岐の血清型にわた
って防御的な応答を誘発し得るＭタンパク質以外の抗原で用いるワクチン接種に
よって強力に予防され得る。[0003] Understanding the molecular basis of protection of cross-serotypes mediated by other than M proteins is aimed at providing therapeutic treatment for various infections caused by Streptococci in Group A. Type 18 Streptoc
occi has been identified as an important serotype in the return of acute rheumatic fever in Utah. In addition, Streptococci types 3 and 18, and to a lesser extent type 28, are all associated with the recent return of severe Streptococci disease. Each of these diseases can be strongly prevented by vaccination with antigens other than the M protein that can elicit protective responses across a variety of serotypes.

【０００４】 最近は、Ａ群のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（およびＡ群に続くｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｉの全て）が、Ｍタンパク質には関連しないオプソニン作用性のエピト
ープを含有する表面ポリペプチドまたはタンパク質を発現することは、当該分野
では示されていないことが明らかとなった。Ｍタンパク質以外の抗原を含有する
Ｓｔｅｒｐｔｏｃｏｃｃｉに由来するポリペプチド（特に、オプソニン作用性の
エピトープを有するもの）を提供することによって、種々のＳｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃａｌの感染に対して防御するために利用可能な治療用のツールを増強する。Recently, group A streptococci (and group A streptococci)
cocci) have been shown to express surface polypeptides or proteins containing opsonizing epitopes unrelated to the M protein, which have not been shown in the art. By providing polypeptides derived from Streptococci containing antigens other than the M protein, particularly those having opsonizing epitopes, various Streptococci
Increase the therapeutic tools available to protect against ccal infections.

【０００５】 従って、このような感染に対する防御に有効なＭタンパク質ではない抗原、特
に、Ａ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの複数の血清型に対して有効な抗原の発見
および特徴付けが、当該分野で必要とされている。Accordingly, there is a need in the art for the discovery and characterization of antigens that are not M proteins that are effective in protecting against such infections, particularly those that are effective against multiple serotypes of group A Streptococci. ing.

【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種から単離された新規の防御的な抗原
の発見を提供する。この抗原は、Ｍタンパク質とは異なり、そしてＳｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｉの複数の血清型に対して有効であるオプソニン作用性の抗体を誘発
する。この新規の抗原は、Ａ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの表面抗原である。
これは、本明細書中では、Ｓｐａ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ防御的抗原（ｐ
ｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ））と示されている。SUMMARY OF THE INVENTION [0006] The present invention provides for the discovery of novel protective antigens isolated from Streptococcus species. This antigen is different from the M protein and
Induces opsonizing antibodies that are effective against multiple serotypes of ococci. This novel antigen is the surface antigen of Group A Streptococci.
This is referred to herein as Spa (Streptococcal protective antigen (p
(protective antigen)).

【０００７】 １つの局面においては、本発明は、配列番号２または５に対して少なくとも５
０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含有している、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ種から単離されたＳｐａポリペプチドを提供する。１つの実施形
態においては、Ｓｐａポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏ
ｇｅｎｓ種（Ａ群のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）のメンバーであるＳｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓに由来する。別の実施形態は、Ａ群の１８型のＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｉの血清型に由来する単離されたＳｐａポリペプチドを含む。なお別の実
施形態は、配列番号２または５のアミノ酸配列を含有しているＳｐａポリペプチ
ドである。この実施形態の改変体は、配列番号２または５に対して、保存的なア
ミノ酸の置換、または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
む。[0007] In one aspect, the invention relates to at least 5 relative to SEQ ID NO: 2 or 5.
Strept containing polypeptides having 0% amino acid sequence identity
provided are Spa polypeptides isolated from Ococcus species. In one embodiment, the Spa polypeptide is Streptococcus pyro.
Strept, a member of the gens species (streptococci of group A)
ococcus. Another embodiment is a group A Streptoc of type 18
Includes an isolated Spa polypeptide from the serotype of occi. Yet another embodiment is a Spa polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 5. Variants of this embodiment comprise a conservative amino acid substitution or an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 2 or 5.

【０００８】 関連する実施形態においては、本発明は、オプソニン作用性のエピトープを含
有している、任意の上記の単離されたＳｐａポリペプチドを提供する。１つの実
施形態においては、単離されたポリペプチドは、このポリペプチドが細胞中で発
現される場合に、細胞の外表面上に曝されるポリペプチドのＮ末端の一部に由来
する連続するアミノ酸を含む、オプソニン作用性のエピトープを含む。別の実施
形態においては、単離されたＳｐａポリペプチドは、このポリペプチドのＮ末端
の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む、オプソニン作用性のエピトープを
含む。別の実施対応においては、単離されたＳｐａポリペプチドは、配列番号２
または５のポリペプチド、あるいはそれらに対して少なくとも５０％の同一性を
有するポリペプチドの、Ｎ末端の少なくとも２３個の連続するアミノ酸を含む、
オプソニン作用性のエピトープを含む。なお別の実施形態においては、単離され
たＳｐａポリペプチドは、オプソニン作用性のエピトープを含有している、配列
番号３のペプチドまたはその改変体を含む。[0008] In a related embodiment, the invention provides any of the above-described isolated Spa polypeptides containing an opsonizing epitope. In one embodiment, the isolated polypeptide is a continuous sequence derived from a portion of the N-terminus of the polypeptide that is exposed on the outer surface of the cell when the polypeptide is expressed in the cell. Includes opsonizing epitopes, including amino acids. In another embodiment, the isolated Spa polypeptide comprises an opsonizing epitope comprising at least eight consecutive amino acids at the N-terminus of the polypeptide. In another implementation, the isolated Spa polypeptide is SEQ ID NO: 2.
Or 5 or at least 23 contiguous amino acids at the N-terminus of the polypeptide, or a polypeptide having at least 50% identity thereto,
Includes opsonizing epitopes. In yet another embodiment, the isolated Spa polypeptide comprises the peptide of SEQ ID NO: 3, or a variant thereof, containing an opsonizing epitope.

【０００９】 第２の局面においては、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染に対して
動物を防御するための免疫原を提供する。ここでは、この免疫原は、任意の上記
のＳｐａポリペプチドを含む。この局面の１つの実施形態は、上記のＳｐａポリ
ペプチドのＮ末端に由来する少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むペプチド
を含有している、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染に対して動物を防御するため
の免疫原を提供する。別の実施形態は、配列番号２または５のＳｐａポリペプチ
ド、あるいはそれらに対して少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドの
Ｎ末端に由来する少なくとも２３個の連続するアミノ酸を含むペプチドを含む免
疫原を提供する。別の実施形態においては、この免疫原は、オプソニン作用性の
エピトープを含む、配列番号３のペプチドまたはその改変体を含む。他の実施形
態においては、上記の免疫原は、キャリアタンパク質に連結されるか、または融
合タンパク質として提供される。任意の上記の免疫原の別の局面は、これらがＳ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの複数の血清型に対する交差防御を提供することである
。１つの実施形態においては、これらの免疫原は、Ａ群の血清型であるＳｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｉの血清型に対する防御を提供する。別の実施形態においては、
血清型は、３型、１８型、および２８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉから選択さ
れる。[0009] In a second aspect, the invention provides an immunogen for protecting an animal against Streptococcus infection. Here, the immunogen comprises any of the Spa polypeptides described above. One embodiment of this aspect is an immunogen for protecting an animal against Streptococcus infection, comprising a peptide comprising at least 8 contiguous amino acids from the N-terminus of the Spa polypeptide described above. provide. Another embodiment provides an immunization comprising a peptide comprising at least 23 contiguous amino acids from the N-terminus of the Spa polypeptide of SEQ ID NO: 2 or 5, or a polypeptide having at least 50% identity thereto. Provide the original. In another embodiment, the immunogen comprises a peptide of SEQ ID NO: 3 or a variant thereof comprising an opsonizing epitope. In other embodiments, the immunogen is linked to a carrier protein or provided as a fusion protein. Another aspect of any of the above immunogens is that they
to provide cross protection against multiple serotypes of treptococci. In one embodiment, these immunogens are Group A serotypes,
Provides protection against serotype of ptococci. In another embodiment,
The serotype is selected from Streptococci, types 3, 18, and 28.

【００１０】 第３の局面においては、本発明は、上記のＳｐａポリペプチド上に存在するエ
ピトープに特異的に結合する抗体を提供する。１つの実施形態は、Ｓｐａポリペ
プチドのＮ末端の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むエピトープに結合す
る抗体を含む。別の実施形態は、ＳｐａポリペプチドのＮ末端の少なくとも２３
個の連続するアミノ酸を含むエピトープに結合する抗体を含む。なお別の実施形
態においては、抗体は、オプソニン作用性のエピトープを含有する、配列番号３
に記載のペプチドまたはその改変体に結合する。なお別の実施形態においては、
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種のＭタンパク質には結合しない上記の
抗体を提供する。In a third aspect, the present invention provides an antibody that specifically binds to an epitope present on the above Spa polypeptide. One embodiment includes an antibody that binds to an epitope comprising at least eight consecutive amino acids at the N-terminus of a Spa polypeptide. In another embodiment, the N-terminal at least 23 of the Spa polypeptide is
Includes antibodies that bind to an epitope that includes a contiguous amino acid sequence. In yet another embodiment, the antibody is SEQ ID NO: 3, which contains an opsonizing epitope.
Or a variant thereof. In yet another embodiment,
The present invention provides the above antibody, which does not bind to M protein of Streptococcus species.

【００１１】 第４の局面においては、本発明は、上記のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｓｐ
ａポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸分子、またはその核酸分
子の相補体を提供する。１つの実施形態においては、単離された核酸分子は、配
列番号１、または４、または５、あるいはそれらの相補体または改変体から選択
される配列を含む。核酸配列の改変体は、配列番号２または５のポリペプチドを
コードする配列（これらは、遺伝コードに起因して、配列番号１または４と縮重
する）；配列番号２または５のポリペプチドに対して保存的なアミノ酸の置換を
有するポリペプチドをコードする配列、あるいは配列番号２または５に対して少
なくとも５０％同一であるポリペプチドをコードする配列から選択される改変体
を含む。なお別の実施形態においては、本発明は、中程度のまたは高いストリン
ジェントな条件下で、上記の核酸分子にハイブリダイズする配列を含有する、単
離された核酸分子を提供する。別の実施形態は、配列番号２または配列番号５に
対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含有
しているＳｐａポリペプチドに由来するオプソニン作用性のエピトープをコード
する配列を含有する、単離された核酸分子を含む。本明細書中で提供される核酸
配列の関連する局面は、オプソニン作用性のエピトープをコードし、そしてさら
に融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。ここで、この融合ポリペプチ
ドは、少なくとも１つの他のペプチド配列に融合されるオプソニン作用性のエピ
トープを含む。１つの実施形態においては、他のペプチド配列は、細胞性抽出物
からの融合ポリペプチドの単離を容易にするタグ配列を含む。別の実施形態にお
いては、他のペプチド配列は、キャリアタンパク質である。[0011] In a fourth aspect, the present invention provides the above Streptococcus Sp.
a isolated nucleic acid molecule comprising a sequence encoding a polypeptide, or the complement of the nucleic acid molecule. In one embodiment, the isolated nucleic acid molecule comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 1, or 4, or 5, or a complement or variant thereof. A variant of the nucleic acid sequence is a sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or 5 (which degenerates to SEQ ID NO: 1 or 4 due to the genetic code); Conservative amino acid substitutions, or a variant selected from a sequence encoding a polypeptide that is at least 50% identical to SEQ ID NO: 2 or 5. In yet another embodiment, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule containing a sequence that hybridizes under moderate or high stringency conditions to the nucleic acid molecule described above. Another embodiment encodes an opsonizing epitope derived from a Spa polypeptide containing a polypeptide having at least 50% amino acid sequence identity to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5. Includes an isolated nucleic acid molecule containing the sequence. A related aspect of the nucleic acid sequences provided herein includes a nucleic acid molecule that encodes an opsonizing epitope and further encodes a fusion polypeptide. Here, the fusion polypeptide comprises an opsonizing epitope fused to at least one other peptide sequence. In one embodiment, the other peptide sequence includes a tag sequence that facilitates isolation of the fusion polypeptide from a cellular extract. In another embodiment, the other peptide sequence is a carrier protein.

【００１２】 上記の核酸分子の関連する実施形態は、プロモーターに対して作動可能に連結
されたこれらの核酸分子を含有しているベクターを含む。その結果、ベクターは
、ベクターが宿主細胞に導入された場合に、単離された核酸によってコードされ
るポリペプチドを発現する。別の実施形態においては、本発明は、このようなベ
クターを保有している宿主細胞を提供する。A related embodiment of the above nucleic acid molecules comprises a vector containing these nucleic acid molecules operably linked to a promoter. As a result, the vector will express the polypeptide encoded by the isolated nucleic acid when the vector is introduced into a host cell. In another embodiment, the present invention provides a host cell carrying such a vector.

【００１３】 本発明の第５の局面は、生物学的に受容可能な希釈剤、および上記のポリペプ
チド、ペプチド、免疫原、宿主細胞、および抗体から選択される有効量の免疫化
試薬を含有している、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの感染から動物を防御するた
めの治療用組成物を提供する。いくつかの実施形態においては、治療用組成物は
、以下を含み得る：ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓから単離されたＳｐａポリ
ペプチド；ｂ）Ｓｐａポリペプチドから得られるオプソニン作用性のエピトープ
から構成される免疫原；ｃ）Ｓｐａポリペプチドから得られるオプソニン作用性
のエピトープを発現する宿主細胞；またはｄ）Ｓｐａポリペプチドに特異的に結
合する抗体。別の実施形態においては、上記の免疫化試薬は、多価のキャリアに
結合され得る。A fifth aspect of the present invention comprises a biologically acceptable diluent and an effective amount of an immunizing reagent selected from the polypeptides, peptides, immunogens, host cells, and antibodies described above. A therapeutic composition for protecting an animal from Streptococcus infection. In some embodiments, a therapeutic composition may include: a) an immunogen comprised of an opsonizing epitope derived from a Spa polypeptide; b) a Spa polypeptide isolated from Streptococcus. C) a host cell that expresses an opsonic epitope obtained from a Spa polypeptide; or d) an antibody that specifically binds to a Spa polypeptide. In another embodiment, the immunization reagents described above can be conjugated to a multivalent carrier.

【００１４】 本発明の第６の関連する局面は、上記の治療用組成物を動物に投与する工程を
包含する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの感染に対して動物を防御するための治
療方法を含む。ここでは、治療用組成物の投与は、動物中でオプソニン作用性の
抗体を誘発する。好ましい実施形態においては、防御は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓの複数の血清型に対して提供される。関連する実施形態においては、治療
用組成物は、経口投与、鼻腔内投与、非経口的な（筋肉内、皮下、または静脈内
）ワクチン接種の少なくとも１つによって投与される。別の好ましい実施形態に
おいては、治療方法は、動物がヒトである場合に提供される。A sixth related aspect of the present invention includes a therapeutic method for protecting an animal against Streptococcus infection, comprising the step of administering the above-described therapeutic composition to the animal. Here, administration of the therapeutic composition elicits opsonizing antibodies in the animal. In a preferred embodiment, the defense is Streptococ
cus is provided for multiple serotypes. In a related embodiment, the therapeutic composition is administered by at least one of oral administration, intranasal administration, and parenteral (intramuscular, subcutaneous, or intravenous) vaccination. In another preferred embodiment, the method of treatment is provided when the animal is a human.

【００１５】 なお別の局面においては、本発明は、標的サンプル中でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ種による感染を検出するための診断用組成物および方法を提供する。１
つの実施形態においては、Ｓｐａ遺伝子のヌクレオチド配列に由来するプライマ
ーが、標的サンプルから得られた細胞から抽出された核酸を増幅するために使用
される。代表的には、抽出された核酸はＤＮＡである。あるいは、抽出された核
酸は、ｍＲＮＡを含む。１つの実施形態においては、診断は、配列番号４および
配列番号５に提供されるプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された核酸配
列を検出することによって行われる。他の実施形態においては、プライマーは、
少なくとも１２個の連続しているヌクレオチドを含有している、Ｓｐａ遺伝子ま
たはその相補物の任意の一部から選択される。ここでは、プライマーは、Ｓｐａ
遺伝子の選択された部分に対して特異的にハイブリダイズする。なお別の実施形
態においては、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの感染の診断において有
用なプローブを提供する。ここでは、このプローブは、Ｓｐａ遺伝子の選択され
た部分に対して特異的にハイブリダイズする少なくとも１２個の連続しているヌ
クレオチドを含む。[0015] In yet another aspect, the present invention relates to Streptococcus in a target sample.
Provided are diagnostic compositions and methods for detecting infection by Ccus species. 1
In one embodiment, primers derived from the nucleotide sequence of the Spa gene are used to amplify nucleic acids extracted from cells obtained from a target sample. Typically, the extracted nucleic acid is DNA. Alternatively, the extracted nucleic acids include mRNA. In one embodiment, the diagnosis is made by detecting the nucleic acid sequence amplified by PCR using the primers provided in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. In another embodiment, the primer is
It is selected from the Spa gene or any part of its complement, containing at least 12 contiguous nucleotides. Here, the primer is Spa
Hybridizes specifically to a selected portion of the gene. In yet another embodiment, the invention provides probes useful in diagnosing Streptococcus infection. Here, the probe comprises at least 12 contiguous nucleotides that specifically hybridize to a selected portion of the Spa gene.

【００１６】 異なる実施形態においては、本発明の診断用組成物および方法は、Ｓｐａポリ
ペプチドに対して特異的に結合する抗体を含む。１つの実施形態においては、抗
体は、オプソニン作用性の抗体である。特定の実施形態においては、抗体は、多
価の抗体であり、一方、他の実施形態においては、抗体はモノクローナル抗体で
ある。なお他の実施形態においては、抗体は、検出可能なシグナル伝達部分に対
して結合される。他の実施形態においては、Ｓｐａ抗体は、他の免疫化学的な試
薬と組み合わせて使用される。代表的な実施形態においては、他の免疫化学的な
試薬は、Ｓｐａ抗体と複合体を形成する。ここでは、複合体は、Ｓｐａポリペプ
チドがＳｐａ抗体に結合される条件下で、検出可能なシグナルを提供する。[0016] In different embodiments, the diagnostic compositions and methods of the invention comprise an antibody that specifically binds to a Spa polypeptide. In one embodiment, the antibody is an opsonizing antibody. In certain embodiments, the antibody is a multivalent antibody, while in other embodiments, the antibody is a monoclonal antibody. In still other embodiments, the antibody is conjugated to a detectable signaling moiety. In other embodiments, Spa antibodies are used in combination with other immunochemical reagents. In an exemplary embodiment, the other immunochemical reagent forms a complex with the Spa antibody. Here, the complex provides a detectable signal under conditions in which the Spa polypeptide is bound to the Spa antibody.

【００１７】 関連する局面においては、本発明は、上記のプライマー、プローブ、または抗
体から構成される診断用キットを提供する。特異的な実施形態においては、この
キットはさらに、増幅されるか、または本明細書中で提供されるプライマーまた
はプローブにハイブリダイズするＳｐａ核酸を検出するための試薬を含む。別の
実施形態においては、キットは、標的サンプルから単離されたＳｐａポリペプチ
ドに対するＳｐａ抗体の結合を検出するための免疫化学的な試薬を含む。In a related aspect, the present invention provides a diagnostic kit comprising the above primer, probe, or antibody. In a specific embodiment, the kit further comprises reagents for detecting a Spa nucleic acid that is amplified or hybridizes to a primer or probe provided herein. In another embodiment, the kit comprises an immunochemical reagent for detecting binding of a Spa antibody to a Spa polypeptide isolated from a target sample.

【００１８】 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
して明らかとなる。さらに、特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど
）をより詳細に記載する、種々の参考文献が、本明細書中で示され、そしてそれ
らの全体において参考として援用されている。[0018] These and other aspects of the invention will become apparent with reference to the following detailed description and accompanying drawings. Additionally, various references are described herein, which describe particular procedures or compositions (eg, plasmids, etc.) in more detail, and are incorporated by reference in their entirety.

【００１９】 （発明の詳細な説明） （定義） 本発明を詳細に示す前に、特定の用語の定義を示し、そして本明細書中以後使
用される略語を列挙しそして定義することによってその理解を助け得る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Definitions Before describing the present invention in detail, the definitions of certain terms will be given, and the understanding will be given by listing and defining the abbreviations used hereinafter. Can help.

【００２０】 「核酸」または「核酸分子」は、任意のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核
酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって
生成されたフラグメント、ならびに任意の連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用
、およびエキソヌクレアーゼ作用によって生成されたフラグメントをいう。核酸
は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリ
ボヌクレオチド）もしくは天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天
然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマーの形態）であるモノマー、また
は両方の組み合わせから構成され得る。改変されたヌクレオチドは、糖部分中、
および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分中に改変を有し得る。糖の改
変としては、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での１つ
以上のヒドロキシル基の置換か、あるいは糖は、エーテルまたはエステルとして
官能化され得る糖が挙げられる。さらに、糖部分全体は、立体構造的におよび電
気的に類似の構造（例えば、アザ−糖、および炭素環式糖アナログ）で置換され
得る。塩基部分での改変の例として、アルキル化されたプリンおよびピリミジン
、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、または他の周知のヘテロ環式置換
基が挙げられる。核酸のモノマーは、ホスホジエステル結合またはこのような結
合のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル結合のアナログとして、
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロ
ジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホル
アミデートなどが挙げられる。用語「核酸」はまた、いわゆる「ペプチド核酸」
をも含む。これは、ポリアミド骨格に対して付着させられた天然に存在するかま
たは改変された核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり
得る。“Nucleic acid” or “nucleic acid molecule” refers to any deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), oligonucleotide, fragment generated by the polymerase chain reaction (PCR), and any ligation, cleavage, endo It refers to nuclease action and fragments generated by exonuclease action. Nucleic acids are composed of monomers that are naturally occurring nucleotides (eg, deoxyribonucleotides and ribonucleotides) or analogs of naturally occurring nucleotides (eg, the α-enantiomer of naturally occurring nucleotides), or a combination of both. Can be done. The modified nucleotide is, in the sugar moiety,
And / or have modifications in the pyrimidine or purine base moiety. Sugar modifications include, for example, replacement of one or more hydroxyl groups with halogens, alkyl groups, amines, and azide groups, or sugars where the sugar can be functionalized as an ether or ester. In addition, the entire sugar moiety can be substituted with sterically and electrically similar structures, such as aza-sugars and carbocyclic sugar analogs. Examples of modifications at the base moiety include alkylated purines and pyrimidines, acylated purines or pyrimidines, or other well-known heterocyclic substituents. The monomers of the nucleic acid may be linked by a phosphodiester bond or an analog of such a bond. As an analog of a phosphodiester bond,
Examples include phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoroselenoate, phosphorodiselenoate, phosphoroanilothioate, phosphoranilide, and phosphoramidate. The term “nucleic acid” also refers to so-called “peptide nucleic acids”
Including. This includes naturally occurring or modified nucleobases attached to a polyamide backbone. Nucleic acids can be either single-stranded or double-stranded.

【００２１】 「単離された核酸分子」は、生物体のゲノムＤＮＡ中には組み込まれていない
分子である。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの細胞のゲノムＤＮＡから分
離されているＳｐａポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ
分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物体のゲノム中には組み込まれ
ていない、化学的に合成された核酸分子である。単離された核酸分子は、ゲノム
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡであり得るか、または核酸のアナログの少なくとも一
部から構成され得る。An “isolated nucleic acid molecule” is a molecule that is not integrated into the genomic DNA of an organism. For example, a DNA molecule encoding a Spa polypeptide that has been separated from the genomic DNA of a Streptococcus cell is an isolated DNA molecule.
Is a molecule. Another example of an isolated nucleic acid molecule is a chemically synthesized nucleic acid molecule that is not integrated into the genome of an organism. An isolated nucleic acid molecule can be genomic DNA, cDNA, RNA, or can be composed of at least a portion of an analog of a nucleic acid.

【００２２】 「単離されたポリペプチド」は、その本来の環境から少なくとも１つの工程に
よって取り出されているポリペプチドである。例えば、天然に存在するタンパク
質は、それが炭水化物、脂質、または天然のポリペプチドに関係する他のタンパ
ク質様の不純物のような天然の系の中に同時に存在する物質のいくつかまたは全
てから分離されている場合に、単離されている。特定の実施形態においては、特
定のタンパク質調製物は、それがクマシーブルー染色によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲル上で名目上は単一のバンドとして現れる場合に、単離されたポリペプチドを
含む。An “isolated polypeptide” is a polypeptide that has been removed from its natural environment by at least one step. For example, a naturally-occurring protein is separated from some or all of the co-existing substances in the natural system, such as carbohydrates, lipids, or other proteinaceous impurities related to the native polypeptide. If they are isolated. In certain embodiments, a particular protein preparation is characterized by SDS-PAGE by Coomassie blue staining.
Contains an isolated polypeptide when it appears nominally as a single band on a gel.

【００２３】 「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指向するヌクレオチド配列である。
代表的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近くの、遺伝子の５
’領域に配置される。プロモーターが誘導性のプロモーターである場合には、転
写速度は、誘導試薬に応答して増大する。対照的に、転写速度は、プロモーター
が構成的なプロモーターである場合には、誘導試薬によっては調節されない。“Promoter” is a nucleotide sequence that directs the transcription of a structural gene.
Typically, the promoter is located in the gene 5 near the transcription start site of the structural gene.
'Placed in the area. If the promoter is an inducible promoter, the rate of transcription increases in response to the inducing reagent. In contrast, the rate of transcription is not regulated by the inducing reagent when the promoter is a constitutive promoter.

【００２４】 「ベクター」は、所望されるタンパク質の発現を指向することができるアセン
ブリをいう。ベクターは、目的の遺伝子に作動可能に連結される転写プロモータ
ーエレメントを含まなければならない。ベクターは、デオキシリボ核酸（「ＤＮ
Ａ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）、または２つの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ−
ＲＮＡキメラ）のいずれかから構成され得る。必要に応じて、ベクターは、ポリ
アデニル化配列、１つ以上の制限部位、ならびに１つ以上の選択マーカー（例え
ば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ）を含み得る。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベ
クターに依存して、他の遺伝的なエレメント（例えば、複製起点、さらなる核酸
制限部位、エンハンサー、転写の誘導性を付与する配列、および選択マーカー）
もまた、本明細書中で記載されるベクター中に取りこまれ得る。“Vector” refers to an assembly capable of directing the expression of a desired protein. The vector must contain a transcription promoter element operably linked to the gene of interest. The vector is a deoxyribonucleic acid (“DN
A "), ribonucleic acid (" RNA "), or a combination of the two (e.g., DNA-
RNA chimera). Optionally, the vector can include a polyadenylation sequence, one or more restriction sites, and one or more selectable markers (eg, neomycin phosphotransferase or hygromycin phosphotransferase). In addition, depending on the host cell selected and the vector used, other genetic elements (eg, origin of replication, additional nucleic acid restriction sites, enhancers, sequences conferring inducibility of transcription, and selectable markers)
Can also be incorporated into the vectors described herein.

【００２５】 「クローニングベクター」は、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファ
ージのような核酸分子をいう。これらは、宿主細胞中で自律的に複製する能力を
有する。クローニングベクターは、代表的には、１つまたは少数の制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位（これらの部位では、外来ヌクレオチド配列が、ベクターの
本質的な生物学的な機能を欠失することなく決定可能な様式で挿入され得る）、
ならびにマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列（これは、クローニング
ベクターで形質転換された細胞の同定および選択における使用に適切である）を
含む。マーカー遺伝子は、代表的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリ
ン耐性を提供する遺伝子を含む。“Cloning vector” refers to a nucleic acid molecule such as a plasmid, cosmid, or bacteriophage. They have the ability to replicate autonomously in host cells. Cloning vectors are typically constructed with one or a few restriction endonuclease recognition sites, in which exogenous nucleotide sequences can be determined in a manner that does not impair the essential biological function of the vector. Can be inserted at)
And a nucleotide sequence encoding a marker gene, which is suitable for use in identifying and selecting cells transformed with the cloning vector. Marker genes typically include genes that provide tetracycline resistance or ampicillin resistance.

【００２６】 「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現される遺伝子をコードする核酸分子を
いう。代表的には、遺伝子発現は、プロモーターの制御下に、および必要に応じ
て、少なくとも１つの調節エレメントの制御下に、配置される。このような遺伝
子は、プロモーターに「作動可能に連結される」と言われる。同様に、調節エレ
メントおよびプロモーターは、調節エレメントがプロモーターの活性を調節する
場合に、作動可能に連結される。“Expression vector” refers to a nucleic acid molecule that encodes a gene that is expressed in a host cell. Typically, gene expression is placed under the control of a promoter and, optionally, at least one regulatory element. Such a gene is said to be "operably linked" to the promoter. Similarly, a regulatory element and a promoter are operably linked when the regulatory element regulates the activity of the promoter.

【００２７】 「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含
む、任意の原核生物細胞または真核生物細胞をいう。この用語はまた、宿主細胞
の染色体またはゲノム中にクローン化された遺伝子を含むように遺伝子操作され
ている、このような原核生物細胞または真核生物細胞を含む。“Recombinant host” refers to any prokaryotic or eukaryotic cell, including either cloning or expression vectors. The term also includes such prokaryotic or eukaryotic cells that have been genetically engineered to contain the cloned gene in the chromosome or genome of the host cell.

【００２８】 真核生物においては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、ｍＲＮＡを産生する構造遺
伝子の転写を触媒する。核酸分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型を含むよう
に設計され得る。ここでは、ＲＮＡの転写物は、特異的なｍＲＮＡのものに相補
的な配列を有する。ＲＮＡ転写物は、「アンチセンスＲＮＡ」と呼ばれ、そして
アンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は、「アンチセンス遺伝子」と呼ばれ
る。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子に結合して、ｍＲＮＡの転写の阻
害を生じ得る。[0028] In eukaryotes, RNA polymerase II catalyzes the transcription of structural genes that produce mRNA. The nucleic acid molecule can be designed to include a template for RNA polymerase II. Here, the transcript of the RNA has a sequence complementary to that of the specific mRNA. RNA transcripts are termed "antisense RNAs" and nucleic acid molecules encoding antisense RNAs are termed "antisense genes." Antisense RNA molecules can bind to mRNA molecules and cause inhibition of mRNA transcription.

【００２９】 「中程度またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、標的の
ヌクレオチド配列に対してプローブヌクレオチド配列がハイブリダイズする条件
である。ここでは、ハイブリダイゼーションは、標的配列の一部がプローブ配列
の相補物に対して実質的に類似である場合にのみ、容易に検出可能である。ハイ
ブリダイゼーション条件は、プローブの大きさ、ならびに当業者に公知の様式に
おける温度、時間、および塩濃度によって変化する。例えば、５０ヌクレオチド
のプローブについての中程度のハイブリダイゼーション条件は、５×ＳＳＰＥ（
１×ＳＳＰＥ＝１８０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１
ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液
＝２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン、２％（ｗ／ｖ）のＦｉｃｏｌｌ、２％
（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン）および５５〜６０℃で一晩インキュベート
した０．５％のＳＤＳを含有する緩衝液中で一晩のハイブリダイゼーションを含
む。ハイブリダイゼーション後の中程度のストリンジェンシーでの洗浄は、代表
的には、０．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１５ｍＭ
のクエン酸三ナトリウム）中で、または０．５×ＳＳＰＥ中で、５５〜６０℃で
行われる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的には、５
０％のホルムアミドの存在下での４２℃で一晩の２×ＳＳＰＥ、続く、０．１〜
０．２×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳ中での６５℃にて３０分以上の１回以
上の洗浄を含む。“Medium or stringent hybridization conditions” are conditions under which a probe nucleotide sequence will hybridize to a target nucleotide sequence. Here, hybridization is readily detectable only if a portion of the target sequence is substantially similar to the complement of the probe sequence. Hybridization conditions vary with probe size, and temperature, time, and salt concentration in a manner known to those of skill in the art. For example, moderate hybridization conditions for a 50 nucleotide probe are 5 × SSPE (
1 × SSPE = 180 mM sodium chloride, 10 mM sodium phosphate, 1
mM EDTA (pH 7.7), 5 × Denhardt's solution (100 × Denhardt's solution = 2% (w / v) bovine serum albumin, 2% (w / v) Ficoll, 2%
(W / v) polyvinylpyrrolidone) and overnight hybridization at 55-60 ° C in a buffer containing 0.5% SDS. Washing at moderate stringency after hybridization is typically performed in 0.5 × SSC (1 × SSC = 150 mM sodium chloride, 15 mM
In 0.5 × SSPE at 55-60 ° C. Stringent hybridization conditions typically include 5
2 × SSPE overnight at 42 ° C. in the presence of 0% formamide, followed by 0.1-
Includes one or more washes at 65 ° C. in 0.2 × SSC and 0.1% SDS for 30 minutes or more.

【００３０】 対象ポリペプチドまたはペプチド配列に関する「パーセント同一性」または「
％同一性」は、コンピューターで実行されるアルゴリズム（代表的には、デフォ
ルトパラメータを用いる）を使用する、試験配列に対して対象ポリペプチド配列
の全体を比較することによって生じるパーセントの値である。配列比較は、上記
のように、ＢＬＡＳＴ、ｔＢＬＡＳＴ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮのような任意の
標準的なソフトウェアプログラムを使用して実行され得る。なお他として、ＬＡ
ＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉ
ｔｅにおいて提供されるものが挙げられる。これは、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって生成される。ＡＬＩＧＮまたはＢＬＡＳ
Ｔのようなアルゴリズムについての参考文献は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１；Ｈｅｎｉｋｏｆｆお
よびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：１０９１５−１０９１９、１９９２において見出され得る。ＢＬＡＳＴは、Ｎ
ＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ
ｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）で利用可能である。最適なアラインメントを
決定することによって２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するための
他の方法は、当業者に周知である（例えば、ＰｅｒｕｓｋｉおよびＰｅｒｕｓｋ
ｉ、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔ
ｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）、Ｗｕら（編）「Ｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｄａ
ｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２３−
１５１頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）、ならびにＢｉｓｈｏｐ（
編）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、第
２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）を参照のこと）。“Percent identity” or “percent identity” with respect to the polypeptide or peptide sequence of interest
"% Identity" is the percent value produced by comparing an entire polypeptide sequence of interest to a test sequence using a computer implemented algorithm (typically using default parameters). Sequence comparisons can be performed using any standard software program, such as BLAST, tBLAST, or MEGALIGN, as described above. In addition, LA
SERGENE bioinformatics computing sui
te. This is DNASTAR (Madi
son, Wisconsin). ALIGN or BLAS
References for algorithms such as T can be found, for example, in Altschul, J
. Mol. Biol. 219: 555-565, 1991; Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89
: 10915-10919, 1992. BLAST is N
CBI website (http: //www/ncbi.nlm.nih.go)
v / cgi-bin / BLAST). Other methods for comparing two nucleotide or amino acid sequences by determining an optimal alignment are well known to those of skill in the art (eg, Peruski and Perusk)
i, The Internet and the New Biology: T
cools for Genomics and Molecular Rese
arch (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.) “Info
rmation Superhighway and Computer Da
table of Nucleic Acids and Proteins
", Methods in Gene Biotechnology, 123-
151 (CRC Press, Inc. 1997), and Bishop (
Ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd edition (Academic Press, Inc. 1998)).

【００３１】 「Ｓｐａ」または「Ｓｐａポリペプチド」は、配列番号２または配列番号５と
して本明細書中に提供されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％
、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチ
ドをコードする、任意のポリペプチドまたは核酸を含むことが理解されるべきで
ある。“Spa” or “Spa polypeptide” is at least 50%, 60% relative to the polypeptide provided herein as SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5.
Should be understood to include any polypeptide or nucleic acid that encodes a polypeptide having 70, 80, 90, or 95% amino acid identity.

【００３２】 「特異的に結合する」は、抗体が、本発明のｓｐａ遺伝子によってコードされ
るペプチドを選択的に結合することができることを意味する。このような抗体は
、一般的には、少なくとも１０⁴、好ましくは、少なくとも１０⁵、より好ましく
は、少なくとも１０⁶、なおより好ましくは、少なくとも１０⁷、そして最も好ま
しくは、少なくとも１０⁸の親和性定数（Ｋ_a）でＳｐａポリペプチドと会合する
。親和性定数は、周知の技術を使用して、当業者によって決定され得る（Ｓｃａ
ｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１
９４９を参照のこと）。“Specifically binds” means that the antibody is capable of selectively binding a peptide encoded by the spa gene of the present invention. Such antibodies generally have an affinity of at least 10 ⁴ , preferably at least 10 ⁵ , more preferably at least 10 ⁶ , even more preferably at least 10 ⁷ , and most preferably at least 10 ⁸ It associates with the Spa polypeptide at _a constant (K _a ). Affinity constants can be determined by one skilled in the art using well known techniques (Sca
tchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660-672, 1
949).

【００３３】 略語：ＹＡＣ、酵母の人工染色体；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＴ−Ｐ
ＣＲ、逆転写酵素（ＲＴ）を使用して最初の工程でＲＮＡが最初にＤＮＡに転写
されるＰＣＲプロセス；ｃＤＮＡ、ＤＮＡの形態にＲＮＡ配列をコピーすること
によって作成された任意のＤＮＡ。Abbreviations: YAC, yeast artificial chromosome; PCR, polymerase chain reaction; RT-P
CR, a PCR process in which RNA is first transcribed to DNA in the first step using reverse transcriptase (RT); cDNA, any DNA created by copying the RNA sequence into DNA form.

【００３４】 本発明は、Ｍタンパク質とは異なる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ種から単離さ
れたポリペプチドの新規のファミリーを提供する。そしてこれは、動物中でオプ
ソニン作用性の抗体を誘発する抗原を提供する。これらの新規のポリペプチドは
、本明細書中ではＳｐａ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ
ａｎｔｉｇｅｎｓ）と呼ばれ、オプソニン作用性のエピトープを含む。このエ
ピトープは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの複数の血清型と交差反応する。代表的
なＳｐａポリペプチド（配列番号２および配列番号５）をコードする核酸分子（
配列番号１および配列番号４）もまた、提供される。配列番号２は、１１２残基
のポリペプチドをコードし、これは、成熟ＳｐａポリペプチドのＮ末端の一部で
ある。ＳｐａポリペプチドのＮ末端の一部を含む２３アミノ酸のペプチド配列（
配列番号３）もまた、提供される。これは、オプソニン作用性のエピトープを含
む。従って、配列番号２および配列番号３のポリペプチドは、ｓｐａとして本明
細書中で命名されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ遺伝子によってコードされる約
５０ｋＤの大きなタンパク質の一部である。配列番号４は、配列番号５の全長の
プロタンパク質をコードする全長のｓｐａ遺伝子である。配列番号２および配列
番号３は、成熟タンパク質の一部であり、そして配列番号５の４４位に対応する
。本発明はまた、配列番号１および配列番号４によって示される核酸、ならびに
配列番号２、配列番号３、または配列番号５によって示されるポリペプチドの変
異体を含む。これらは、本明細書中で以降にさらに記載される。Ｓｐａをコード
する核酸またはＳｐａのオプソニン作用性のエピトープを保有しているベクター
および宿主細胞もまた、本発明によって提供される。The present invention provides a novel family of polypeptides isolated from Streptococci species that differ from the M protein. And this provides an antigen that elicits opsonizing antibodies in the animal. These novel polypeptides are referred to herein as Spa (Streptococcal protective).
antigens) and contains opsonizing epitopes. This epitope cross-reacts with multiple serotypes of Streptococci. A nucleic acid molecule encoding a representative Spa polypeptide (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5) (
SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4) are also provided. SEQ ID NO: 2 encodes a polypeptide of 112 residues, which is part of the N-terminus of the mature Spa polypeptide. A 23 amino acid peptide sequence containing a portion of the N-terminus of the Spa polypeptide (
SEQ ID NO: 3) is also provided. It contains opsonizing epitopes. Thus, the polypeptides of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 are part of a large protein of about 50 kD encoded by the Streptococcus gene, designated herein as spa. SEQ ID NO: 4 is the full length spa gene encoding the full length proprotein of SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 are part of the mature protein and correspond to position 44 of SEQ ID NO: 5. The present invention also includes nucleic acids represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, and variants of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 5. These are described further herein below. Vectors and host cells carrying a Spa-encoding nucleic acid or an Opsonic epitope of Spa are also provided by the invention.

【００３５】 本発明はさらに、Ｓｐａポリペプチドおよび／またはＳｐａポリペプチドのＮ
末端に由来する連続しているアミノ酸から構成されるペプチドから構成される免
疫原を含む。本発明には、Ｓｐａポリペプチドに対して、またはその中に含まれ
る抗原に対して特異的に結合する抗体もまた、含まれる。ポリペプチド、抗原、
オプソニン作用性のエピトープを発現する宿主細胞、およびそれに特異的に結合
する抗体は、それぞれ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの複数の血清型による感染か
ら動物を防御するための治療用組成物中の免疫化試薬として作用し得る。従って
、本発明はさらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの感染に対して動物を防御する
ためのこのような治療用組成物、およびそれらを使用する方法を含む。The present invention further relates to Spa polypeptides and / or N of Spa polypeptides.
Includes immunogens composed of peptides composed of contiguous amino acids from the ends. The invention also includes antibodies that specifically bind to a Spa polypeptide or to an antigen contained therein. Polypeptides, antigens,
The host cell expressing the opsonizing epitope, and the antibody that specifically binds to it, each act as an immunizing reagent in a therapeutic composition to protect the animal from infection by multiple serotypes of Streptococci. obtain. Accordingly, the present invention further includes such therapeutic compositions for protecting animals against Streptococcus infection, and methods of using them.

【００３６】 （Ｉ．ポリペプチド） Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉに由来する新規のポリペプチドの同定は、親株と比
較した場合に、完全に有毒なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ株のＭ陰性の変異体の
産生によって促進された。完全に有毒なＭ陰性の変異体の産生は、例えば、Ｍｏ
ｓｅｓらによって提供されたような先行技術の範囲内の驚くべき結果である。彼
らは、Ｍ１８株のＭ陰性の変異体（８７−２８２）が親と比較して低下した毒性
を有することを示した。本発明は、Ｍ陰性の変異体の産生が毒性を維持するＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ株を提供することを実証し、そしてこのことは、表面タ
ンパク質のオプソニン作用性のエピトープを提示するＭではないポリペプチドの
存在を暴く。本明細書中で使用される場合は、「オプソニン作用性のエピトープ
」は、抗原を含有している宿主細胞で動物を免疫することによって呼び起こされ
るオプソニン作用性の抗体の産生を誘発し、そしてそれに結合する抗原を形成す
る、タンパク質のペプチドまたはポリペプチド部分である。「表面タンパク質」
は、そのタンパク質を含む宿主細胞の外表面上に提示されるそのアミノ酸配列の
一部を有するタンパク質である。「オプソニン作用性の抗体」は、抗原を含有し
ている、宿主細胞のような粒子に対する食作用活性を促進する抗体として、当業
者に一般的に理解されている意味を有する。I. Polypeptides The identification of novel polypeptides derived from Streptococci was facilitated by the production of a completely toxic M-negative mutant of the Streptococcal strain when compared to the parent strain. The production of a completely toxic M-negative mutant is, for example, Mo
Surprising results within the prior art as provided by ses et al. They showed that the M-negative mutant of the M18 strain (87-282) had reduced toxicity compared to the parent. The present invention relates to the production of St, in which the production of M-negative
It demonstrates providing a retococcal strain, which exposes the presence of a non-M polypeptide displaying an opsonizing epitope of a surface protein. As used herein, an "opsonizing epitope" elicits the production of opsonic antibodies elicited by immunizing an animal with host cells containing the antigen, and The peptide or polypeptide portion of a protein that forms the antigen to which it binds. "Surface protein"
Is a protein having a portion of its amino acid sequence displayed on the outer surface of a host cell containing the protein. An “opsonizing antibody” has the meaning commonly understood by those skilled in the art as an antibody that promotes phagocytic activity on a particle, such as a host cell, containing an antigen.

【００３７】 Ｍ陰性の変異体を産生するための１つの方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ
株中のＭタンパク質をコードするｅｍｍ遺伝子の不活化による。適切な株として
、任意の食作用性のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉが挙げられる。本発明の１つの実
施形態においては、Ａ群の１８型のＳＴｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ（Ｍ１８と命名し
た）が使用される。本発明の粒子について適切な細菌の遺伝子の不活化のための
多くの方法が、当該分野で公知である。本明細書中で説明される１つの方法にお
いては、Ωインターポゾンエレメントが、１８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
の血清型（ｅｍｍ１８）中に存在するｅｍｍ遺伝子を不活化するために、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ種の染色体中に導入される。このことを達成するための１
つの方法は、ｅｍｍ１８遺伝子のコード配列（これは、Ωレレメントの挿入によ
って不活化されるｅｍｍ１８を含有する第２のベクターを得るように第１のベク
ター中にクローン化されている）中にΩインターポゾンエレメントを最初に連結
することである。次いで、第２のベクターが、親株を形質転換するために使用さ
れる。その結果、不活化されたｅｍｍ１８は親株の染色体上に存在するネイティ
ブのｅｍｍ１８遺伝子と組換わり、そしてそれを置き換える。One method for producing M-negative mutants is Streptococcal.
By inactivation of the emm gene encoding the M protein in the strain. Suitable strains include any phagocytic Streptococci. In one embodiment of the present invention, Group A type 18 STreptococus (designated M18) is used. Many methods for inactivating bacterial genes suitable for the particles of the present invention are known in the art. In one method described herein, the Ω interposon element is a type 18 Streptococcus.
In order to inactivate the emm gene present in the serotype (emm18) of
It is introduced into the chromosome of the eptococcal species. 1 to achieve this
One method is to integrate the Ω-intercalation into the coding sequence of the emm18 gene, which has been cloned into the first vector to obtain a second vector containing emm18 which is inactivated by insertion of the Ω-rement. The first step is to connect the poson elements. The second vector is then used to transform the parent strain. As a result, the inactivated emm18 recombines and replaces the native emm18 gene present on the chromosome of the parent strain.

【００３８】 挿入によって不活化された株は、ｅｍｍ１８遺伝子についてのプローブと組み
合わせて、プローブとしてΩインターポゾンエレメントを使用するサザンブロッ
ティングによって、不活化されたｅｍｍ１８遺伝子の存在についてスクリーニン
グされ得る。ｅｍｍ１８遺伝子の不活化は、例えば、Ｍタンパク質に特異的な抗
体を使用する抽出物のイムノブロッティングのような、タンパク質を検出するた
めの任意の方法によって発現されたＭタンパク質の非存在を示すことによって確
認され得る。図１は、以下のそれぞれに対して調製された抗血清を使用する、１
つのＭ陰性の変異体（Ｍ１８Ω、本明細書中で以降で記載される）中に発現され
たＭタンパク質が存在しないことを決定するためのウェスタンブロッティングを
示す：１８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに由来するネイティブのＭタンパク
質（ｒＭ１８）；Ｍ１８タンパク質の３０アミノ酸のＮ末端ペプチド（ＳＭ１８
（１−３０））；および５型のＳｔｒｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＭタンパク質に由来
する内部フラグメント（ＳＭ５（２６５−２９１））。（実施例１をもまた参照
のこと）。[0038] Strains that have been inactivated by insertion can be screened for the presence of the inactivated emm18 gene by Southern blotting using the Ω interposon element as a probe in combination with a probe for the emm18 gene. Inactivation of the emm18 gene can be accomplished by indicating the absence of the M protein expressed by any method for detecting the protein, such as, for example, immunoblotting of an extract using an antibody specific for the M protein. Can be confirmed. FIG. 1 shows the use of antisera prepared for each of the following:
Figure 5 shows Western blotting to determine the absence of M protein expressed in one M-negative mutant (M18Ω, described later herein): native from Streptococcus type 18 M protein (rM18); N-terminal peptide of 30 amino acids of M18 protein (SM18
(1-30)); and an internal fragment derived from type 5 Streptococcus M protein (SM5 (265-291)). (See also Example 1).

【００３９】 Ｍ陰性のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ変異体を作成する１つの目的は、オプソ
ニン作用性のエピトープを含むＭではないタンパク質の表面抗原の検出を容易に
することである。Ｓｐａ抗原の同定に適切なＭ陰性の変異体は、好ましくは、哺
乳動物システム中で持続した毒性を示す。なぜなら、非毒性の株は、オプソニン
作用性の抗体をあまり誘発しないからである。Ｍ陰性の変異体の毒性は当該分野
で公知のいくつかの方法によって試験され得る。１つの方法は、哺乳動物の血液
中で株を増殖させること、および血液培養物中で得られた増殖物の世代数によっ
て、毒性をスコアすることである。代表的には、毒性の株は、哺乳動物の血液中
での３時間の培養後には、少なくとも４世代増殖する。代表的には、血液中での
毒性についての試験は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌの感染に対する防御が考え
られる動物から得られた血液を使用する。本発明の１つの実施においては、Ｍ陰
性の変異体であるＭ１８Ωを産生するために使用したＭ１８親株は、ヒトの血液
中での３時間の回転の後に、８世代の増殖した。Ｍ１８Ω変異体は、同じ条件下
で７．５世代の増殖によって同様の毒性を示した（実施例１を参照のこと）。One purpose of generating M-negative Streptococcus mutants is to facilitate the detection of surface antigens of non-M proteins containing opsonizing epitopes. M-negative mutants suitable for identification of Spa antigens preferably exhibit persistent toxicity in mammalian systems. Non-toxic strains elicit less opsonizing antibodies. The toxicity of the M-negative mutant can be tested by several methods known in the art. One method is to grow the strain in mammalian blood and score virulence by the number of generations of the growth obtained in blood culture. Typically, virulent strains will grow for at least 4 generations after 3 hours of culture in mammalian blood. Typically, tests for toxicity in the blood use blood obtained from animals that are considered to be protected against Streptococcal infection. In one implementation of the invention, the M18 parent strain used to produce the M-negative mutant, M18Ω, grew for eight generations after three hours of rotation in human blood. The M18Ω mutant showed similar toxicity with 7.5 generations of growth under the same conditions (see Example 1).

【００４０】 毒性を評価するための別の方法は、腹腔内でのチャレンジ感染による。簡潔に
は、この方法は、試験動物（通常は、マウス）中で致死であるために必須の細菌
粒子の用量を決定する。毒性は、静脈内注射後に試験動物の５０％が致死である
細菌数（ＬＤ５０）を計算することによってスコアされる。代表的には、毒性の
株は、マウスにおいては１０⁶未満のＬＤ５０を有した。例えば、上記で議論さ
れているＭ１８の親株は、０．７３×１０⁵のＬＤ５０を有し、一方、Ｍ１８Ω
変異体は、１．２６×１０⁵のＬＤ５０を有する。必要に応じて、変異体細菌の
致死性が注射に屈服した試験動物の脾臓から生存している細菌を回収すること、
および、例えば、薬物耐性またはＭ陰性の表現型の維持のような、変異体を同定
する特徴の存在について試験することによって、確認され得る。Another method for assessing toxicity is by challenge infection intraperitoneally. Briefly, the method determines the dose of bacterial particles required to be lethal in the test animal (usually a mouse). Toxicity is scored by calculating the bacterial count (LD50) at which 50% of test animals are lethal after intravenous injection. Typically, strains of toxicity in mice had a LD50 of less than 10 ^6. For example, the parent strain of M18 discussed above has an LD50 of 0.73 × 10 ⁵ while the M18Ω
The variant has an LD50 of 1.26 × 10 ⁵ . Recovering the surviving bacteria from the spleen of the test animal, where necessary, the lethality of the mutant bacterium succumbed to the injection;
And, for example, by testing for the presence of a variant identifying feature, such as maintenance of drug resistance or an M-negative phenotype.

【００４１】 一旦、毒性のＭ陰性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ変異体が得られると、Ｓｐａ
ポリペプチドの存在は、最初に、変異体細菌の表面上のオプソニン作用性のエピ
トープの存在についてスコアすることによって評価され得る。当業者は、オプソ
ニン作用性のエピトープの存在についてのインビボおよびインビトロでの種々の
試験方法を認識する。１つの方法は、プロテアーゼで細菌粒子を処理した後に、
細菌粒子の表面から解離した粗表面ペプチド画分（ｐｅｐ）に対して抗血清を惹
起させること、次いでインビトロでのオプソニン作用のアッセイにおいて抗血清
を使用することである。Once a toxic M-negative Streptococcus mutant is obtained, Spa
The presence of the polypeptide can be assessed by first scoring for the presence of an opsonizing epitope on the surface of the mutant bacterium. One skilled in the art will recognize a variety of in vivo and in vitro test methods for the presence of opsonizing epitopes. One method is to treat the bacterial particles with a protease,
To raise antisera against the crude surface peptide fraction (pep) dissociated from the surface of the bacterial particles, and then to use the antisera in an in vitro assay for opsonization.

【００４２】 細菌の表面に由来する粗表面ペプチドの画分の調製のための多くのプロテアー
ゼが、当該分野で公知である。通常は、例えば、ペプシンのような、多くの異な
るペプチド結合を切断するプロテアーゼが、プロテアーゼの活性について最適未
満の反応条件下で細菌粒子とともにインキュベートされ、そして／またはより小
さいポリペプチドよりもむしろ大きなポリペプチドについて富化した混合物を得
るために選択されたプロテアーゼの量とともにインキュベートされる。Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｉの粒子から表面ペプチドを解離させるために有用な反応条件に
ついての指針は、本明細書中で提供される開示によって一部見出され得る（実施
例３および４を参照のこと）。粗表面ペプチドの画分に対する抗血清は、いくつ
かの種中で、代表的には、哺乳動物、そして最も代表的には、ウサギ中で惹起さ
れ得る。ペプチドの画分に対して抗血清を惹起する方法は、当該分野で周知であ
り、そしてこれらのいくつかは本明細書中で以降に記載される。Many proteases are known in the art for the preparation of a fraction of the crude surface peptide derived from the surface of bacteria. Usually, a protease that cleaves many different peptide bonds, such as, for example, pepsin, is incubated with bacterial particles under reaction conditions that are less than optimal for the activity of the protease, and / or a larger polypeptide than a smaller polypeptide. Incubate with the amount of protease selected to obtain a mixture enriched for the peptide. Stre
Guidance on reaction conditions useful for dissociating surface peptides from particles of ptococci can be found in part by the disclosure provided herein (see Examples 3 and 4). Antisera to fractions of the crude surface peptide can be raised in some species, typically mammals, and most typically in rabbits. Methods for raising antisera against fractions of peptides are well known in the art, and some of these are described later herein.

【００４３】 本発明の実施に有用なインビトロでのオプソニン作用のアッセイの一例は、オ
プソニン作用性の食作用のアッセイである。これは、試験抗血清中に存在するオ
プソニン作用性の抗体の存在によって促進される食作用を検出する。簡潔には、
このアッセイは、試験細菌から得られた抗原のサンプルに対して惹起された抗血
清の存在下または非存在下での粒子の予備インキュベーションの後の、選択され
た細菌粒子の食作用の量を測定する。抗血清での予備インキュベーションによっ
て反応性の抗体で粒子をコーティングする。これらのいくつかは、細菌粒子の表
面上に存在するオプソニン作用性のエピトープから誘発されたオプソニン作用性
の抗体である。予備インキュベーションされたコーティングされた粒子は、次い
で、オプソニン作用性の抗体によって促進される食作用の測定である、細菌粒子
と会合する好中球の割合を決定するために、それについてのオプソニン作用性の
防御が求められる動物（代表的には、哺乳動物、例えば、ヒト）に由来する全血
と混合される。オプソニン作用性の抗体を含有している抗血清は、オプソニン作
用性の抗体を含有していない抗血清よりも、選択された細菌と会合した好中球の
より高い割合を誘導する。この試験のバリエーションにおいては、抗血清の殺菌
性の活性は、より少ない細菌粒子とともに抗血清をインキュベートすること、よ
り長い期間、血液中でインキュベートすること、次いで生存性の細菌についてス
コアするために培養培地上に混合物をプレートすることによって、試験され得る
。抗血清中のオプソニン作用性の抗体の存在は、食作用によって破壊された細菌
の数を増大させ、従って、平板培地上で検出されるコロニー形成単位（ＣＦＵ）
の数を少なくする。One example of an in vitro opsonic assay useful in the practice of the present invention is an opsonic phagocytic assay. It detects phagocytosis facilitated by the presence of opsonizing antibodies present in the test antisera. Briefly,
This assay measures the amount of phagocytosis of selected bacterial particles after preincubation of the particles in the presence or absence of antisera raised against a sample of antigen obtained from the test bacterium. I do. The particles are coated with the reactive antibody by preincubation with antiserum. Some of these are opsonizing antibodies derived from opsonizing epitopes present on the surface of bacterial particles. The pre-incubated coated particles are then subjected to an opsonic effect on it to determine the percentage of neutrophils associated with the bacterial particles, a measure of phagocytosis promoted by the opsonic antibody. Is mixed with whole blood from an animal (typically, a mammal, for example, a human) for which protection is sought. Antisera containing opsonizing antibodies induce a higher percentage of neutrophils associated with the selected bacteria than antisera without opsonizing antibodies. In a variation of this test, the bactericidal activity of the antiserum was determined by incubating the antiserum with fewer bacterial particles, incubating it in the blood for a longer period, and then culturing to score for viable bacteria. It can be tested by plating the mixture on media. The presence of opsonizing antibodies in the antiserum increases the number of bacteria destroyed by phagocytosis, and thus the colony forming units (CFU) detected on the plate media
Reduce the number of.

【００４４】 これらのアッセイの１つの利点は、細菌粒子が、オプソニン作用性のエピトー
プの血清型特異性および株特異性についてスコアするために選択され得ることで
ある。従って、１つの血清型から得られた粗表面ペプチドに対して惹起された抗
血清は、他の血清型に対するオプソニン作用性の食作用または殺菌性の活性をス
コアすることによって、他の血清型に対するオプソニン作用性の防御を提供する
能力について試験され得る。さらに、新規のオプソニン作用性のポリペプチド（
例えば、本発明のＳｐａ抗原）の存在は、種々の表面抗原調製物に対して惹起さ
れた種々の抗血清の、異なる株に対するオプソニン作用性の防御を提供する能力
を比較することによって、検出され得る。例えば、本発明の１つの実施形態にお
いては、Ｍ１８親株から得られた粗表面ペプチドに対して惹起された抗血清は、
親およびＭ１８Ω変異体の両方に対してオプソニン作用性の防御を提供したが、
精製された親のＭタンパク質（Ｍ１８タンパク質）またはそのＮ末端フラグメン
トのみに対して惹起された抗血清は、親に対する防御のみを提供し、そして変異
株に対する防御は提供しなかった。（実施例３を参照のこと）。このことは、最
初に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種が、Ｍタンパク質のクラスのすでに既知の
オプソニン作用性のエピトープとは異なるオプソニン作用性のエピトープを、そ
の表面上に含むことを示す。One advantage of these assays is that bacterial particles can be selected to score for serotype and strain specificity of opsonizing epitopes. Thus, antisera raised against a crude surface peptide obtained from one serotype can be scored for opsonogenic phagocytic or bactericidal activity against the other serotype, thereby producing It can be tested for its ability to provide opsonizing protection. Furthermore, novel opsonizing polypeptides (
For example, the presence of the Spa antigen of the present invention) is detected by comparing the ability of different antisera raised against different surface antigen preparations to provide opsonic protection against different strains. obtain. For example, in one embodiment of the present invention, an antiserum raised against a crude surface peptide obtained from the M18 parent strain is:
Provided opsonizing protection against both the parent and the M18Ω mutant,
Antisera raised against only the purified parental M protein (M18 protein) or its N-terminal fragment provided only protection against the parent and no protection against the mutant. (See Example 3). This initially indicates that the Streptococcus species contains on its surface an opsonizing epitope that is different from the already known opsonizing epitopes of the class of M proteins.

【００４５】 同様の様式において、Ｍ１８Ω変異体に由来する粗表面ペプチドに対して惹起
された抗血清は、それ自体に対してだけではなく、Ｍ１８親および他のＳｔｒｐ
ｔｏｃｏｃｃａｌ血清型に対しても同様に、オプソニン作用性の防御を提供する
ことが示された。１つの例においては、オプソニン作用性の防御は、３型、１８
型、および２８型を含むＡ群のＳｔｒｅｔｏｃｏｃｃｉの少なくとも３つの血清
型に対して提供された。このことは、この変異体が、複数のＳｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｉの血清型にわたってオプソニン作用性の防御を提供し得る、Ｍタンパク質
以外の新規のオプソニン作用性のエピトープを提示することを示す。従って、親
、変異体、および他の血清型は、新規のオプソニン作用性のエピトープ（Ｓｐａ
）を提示するが、このエピトープは、Ｍタンパク質が発現されない場合でも、Ｍ
陰性の変異体によって発現されたエピトープを示すことによって、Ｍタンパク質
とは異なることが容易に示される。毒性の、Ｍ陰性のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ変異体の同定は、本発明のＳｐａポリペプチドおよび抗原の同定および単離の
ための一般的な方法における第１の工程を提供する。In a similar manner, antisera raised against a crude surface peptide derived from the M18Ω mutant, not only against itself, but also against the M18 parent and other Strp
Tococcal serotypes have also been shown to provide opsonizing protection. In one example, the opsonizing protection is type 3, 18
And at least three serotypes of Streptococci in group A, including type 28. This indicates that this mutant has multiple Streptococ
FIG. 4 presents a novel opsonizing epitope other than the M protein that can provide opsonizing protection across serotypes of cci. Thus, the parent, mutant, and other serotypes have a novel opsonizing epitope (Spa
), But this epitope can be expressed even if the M protein is not expressed.
By showing the epitope expressed by the negative mutant, it is easily shown that it differs from the M protein. Toxic, M-negative Streptococcus
Identification of the s variant provides the first step in a general method for the identification and isolation of Spa polypeptides and antigens of the invention.

【００４６】 Ｓｐａ抗原を含有しているポリペプチドの同定は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓの表面ポリペプチドを分離すること、およびＳｐａ抗原を示すオプソニン作用
性のエピトープを保有している画分を同定することによって、達成される。１つ
の方法においては、分離される表面ポリペプチドは、Ｍタンパク質以外のオプソ
ニン作用性のエピトープを提示することが示されているＭ陰性のＳｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ変異体のプロテアーゼ処理によって得られた、粗表面ペプチド混合
物から構成される。好ましくは、分離は、粗表面ペプチド混合物中に存在する他
のペプチドからＳｐａポリペプチドを単離するために行われる。当業者は、粗表
面ペプチド混合物を分離するための多数のプロトコールを想定することができる
。これらには、ポリペプチドを分離するために特に設計された、広範な種々の電
気泳動およびクロマトグラフィー技術が挙げられるが、これらに限定されない。[0046] Identification of polypeptides containing Spa antigens can be performed using Streptococcu.
This is achieved by isolating the surface polypeptide of S. s and identifying the fractions bearing opsonic epitopes indicative of the Spa antigen. In one method, the surface polypeptide to be isolated is M-negative Strepto, which has been shown to display opsonizing epitopes other than the M protein.
It consists of a mixture of rough surface peptides obtained by protease treatment of the coccus mutant. Preferably, the separation is performed to isolate the Spa polypeptide from other peptides present in the crude surface peptide mixture. One skilled in the art can envision a number of protocols for separating crude surface peptide mixtures. These include, but are not limited to, a wide variety of electrophoretic and chromatographic techniques specifically designed for separating polypeptides.

【００４７】 本発明の代表的な実施においては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、抗体結
合、およびオプソニン作用の阻害アッセイの組み合わせが、オプソニン作用性の
エピトープを含有するＳｐａポリペプチドを分離し、そして同定するために使用
される。このプロトコールの使用の一例は、図２に示される。簡潔には、粗表面
ペプチドの混合物が、調製用１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離さ
れ、次いで、ニトロセルロースペーパーまたは他の適切なブロッティング基材上
にイムノブロットされる。ニトロセルロースペーパーは、分離されたポリペプチ
ドの異なる画分を含有する小片に切断され、そして分離されたポリペプチドに結
合する抗体を吸着するように粗表面ペプチドの混合物に対して調製された抗血清
とともにインキュベートされる。次いで、吸着した血清が、オプソニン作用性の
アッセイにおいて使用され、そして吸着していない抗血清を用いて得られた結果
と比較される。ニトロセルロース小片上に存在するオプソニン作用性のポリペプ
チドは、試験抗血清に由来するオプソニン作用性の抗体を吸着する。その結果、
残りの抗血清は、吸着させていない抗血清との比較において、オプソニン作用の
アッセイにおいて減少した活性（阻害）を示す。代表的な実施においては、２連
のイムノブロットが、免疫反応性のポリペプチドの存在を確認するために、通常
のウェスタンブロッティングに供される。さらに、２連のポリアクリルアミドゲ
ルが、オプソニン作用の阻害アッセイによってオプソニン作用性のエピトープを
含むことを示すポリペプチドの精製を補助するために調製され得る。In an exemplary practice of the invention, a combination of polyacrylamide gel electrophoresis, antibody binding, and an opsonization inhibition assay will separate and identify Spa polypeptides containing opsonizing epitopes. Used for An example of the use of this protocol is shown in FIG. Briefly, a mixture of crude surface peptides is separated on a preparative 10% SDS polyacrylamide gel and then immunoblotted onto nitrocellulose paper or other suitable blotting substrate. Nitrocellulose paper is cut into small pieces containing different fractions of the separated polypeptide, and antisera prepared against a mixture of coarse surface peptides to adsorb antibodies that bind to the separated polypeptide Incubate with The adsorbed serum is then used in an opsonizing assay and compared to the results obtained with the non-adsorbed antiserum. Opsonizing polypeptides present on the nitrocellulose strip adsorb opsonizing antibodies from the test antiserum. as a result,
The remaining antisera show reduced activity (inhibition) in the opsonization assay as compared to the non-adsorbed antiserum. In a typical run, duplicate immunoblots are subjected to conventional western blotting to confirm the presence of the immunoreactive polypeptide. In addition, duplicate polyacrylamide gels can be prepared to aid purification of polypeptides that contain an opsonizing epitope by an opsonizing inhibition assay.

【００４８】 本発明の１つの実施においては、同定されたＳｐａポリペプチドが、当該分野
で公知の任意のポリペプチド精製技術によって単離され、そして精製される。本
明細書中で使用される場合は、「単離する」は、その天然に存在する環境から１
つの種を分離する任意の工程をいうように意味する。そして「精製する」は、所
望の種が、画分中に存在する全ての抽出されたポリペプチドのうちの５０％から
１００％を示す画分を単離することを意味する。Ｓｐａのさらなる特徴付けのた
めには、Ｓｐａポリペプチドが少なくとも９０％、そしてより好ましくは、少な
くとも９５％のポリペプチドを、精製された画分中に含むことが好ましい。本発
明の実施において有用な代表的な単離工程として、硫酸アンモニウム沈殿、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、およびＨＰＬＣが挙げられるが、これらに限定さ
れない。これらの技術は、Ｎ末端配列を得るため、および哺乳動物（例えば、ウ
サギ）中の特異的な抗体を惹起するために十分な量および純度のＳｐａポリペプ
チドを提供するために適切である。In one implementation of the invention, the identified Spa polypeptide is isolated and purified by any polypeptide purification technique known in the art. As used herein, "isolate" refers to one isolated from its naturally occurring environment.
It is meant to refer to any step of separating two species. And "purify" means isolating the fraction in which the desired species represents 50% to 100% of all extracted polypeptides present in the fraction. For further characterization of Spa, it is preferred that the Spa polypeptide comprises at least 90%, and more preferably at least 95%, of the polypeptide in the purified fraction. Representative isolation steps useful in the practice of the present invention include, but are not limited to, ammonium sulfate precipitation, polyacrylamide gel electrophoresis, and HPLC. These techniques are appropriate for obtaining the N-terminal sequence and for providing a Spa polypeptide in sufficient quantity and purity to raise specific antibodies in mammals (eg, rabbits).

【００４９】 １つの実施形態においては、Ａ群の１８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ中に
存在するＳｐａポリペプチドは、上記のＭ１８Ω変異体から得られた抗血清を用
いて上記のプロトコールを使用して同定され、そして精製された。このポリペプ
チドは、６０％の飽和硫酸アンモニウム中での沈殿、続く透析、凍結乾燥、およ
び分配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、変異体から得られた粗表面ペ
プチドの画分から精製された。図３（Ａ、Ｂ）は、単離されたポリペプチドが、
分析用のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、２４ｋＤ
の大きさを有すると推定されることを示す。図３（Ｃ、Ｄ）は、ファージに結合
させたリジンＣよってＭ１８Ωの細胞壁から解離させた天然のタンパク質のウェ
スタンブロット分析を示す。そしてこれは、２４ｋＤのＳｐｐａポリペプチドが
、５０ｋＤの推定の大きさを有する大きな天然のタンパク質の一部であることを
示す。In one embodiment, the Spa polypeptide present in Streptococcus type 18 Streptococcus of group A is identified using the above-described protocol using an antiserum obtained from the above M18Ω mutant, And purified. The polypeptide was purified from the crude surface peptide fraction obtained from the mutant by precipitation in 60% saturated ammonium sulfate, followed by dialysis, lyophilization, and partitioning polyacrylamide gel electrophoresis. FIG. 3 (A, B) shows that the isolated polypeptide
24 kD as determined by analytical polyacrylamide gel electrophoresis
Is estimated to have a magnitude of FIG. 3 (C, D) shows a Western blot analysis of native protein dissociated from the M18Ω cell wall by lysine C bound to phage. And this indicates that the 24 kD Sppa polypeptide is part of a large native protein with an estimated size of 50 kD.

【００５０】 別の実施形態においては、本発明に従って単離されたＳｐａポリペプチドは、
ＳｐａポリペプチドのＮ末端上に存在する連続しているアミノ酸を含むオプソニ
ン作用性のエピトープを含有しているペプチド抗原を同定し、そして単離するた
めに使用される。１つの実施例は、配列番号３によって提供される。本明細書中
で使用される場合は、「連続しているアミノ酸」は、Ｓｐａポリペプチド上に存
在するアミノ酸の正確な配列と同一であるか、またはその保存的な変異体である
アミノ酸の配列である。本発明のＳｐａポリペプチドは、このポリペプチドを発
現する細胞から単離され、そして細胞の外表面上に曝されるポリペプチドのアミ
ノ酸配列の一部を有する。「外表面上に曝される」は、ポリペプチドが、プロテ
アーゼに接近可能であり、そして／または細胞を破壊する必要なしに動物の主要
組織適合性複合体と相互作用するための、細胞の外膜を通じて伸びた部分を有す
ることを意味する。本明細書中で使用される場合は、「Ｎ末端」は、細胞の表面
上に曝されたポリペプチドのタンパク質分解的な切断の後で得ることができるポ
リペプチドのＮ末端に、またはその近くに存在する約２４０アミノ酸またはそれ
未満の配列である。従って、この用語は、タンパク質分解によるフラグメントの
Ｎ末端、ならびに、天然のタンパク質のＮ末端が細胞の外表面上に曝されている
場合には、天然のタンパク質のＮ末端を含む。[0050] In another embodiment, a Spa polypeptide isolated according to the present invention comprises:
It is used to identify and isolate peptide antigens containing opsonizing epitopes that include contiguous amino acids present on the N-terminus of the Spa polypeptide. One example is provided by SEQ ID NO: 3. As used herein, a "contiguous amino acid" is a sequence of amino acids that is identical to the exact sequence of amino acids present on the Spa polypeptide, or that is a conservative variant thereof. It is. A Spa polypeptide of the present invention has a portion of the amino acid sequence of the polypeptide that is isolated from cells that express the polypeptide and that is exposed on the outer surface of the cell. "Exposed on the outer surface" means that the polypeptide is extracellular in order to be accessible to the protease and / or to interact with the major histocompatibility complex of the animal without having to destroy the cell. It means having a portion extending through the membrane. As used herein, an "N-terminus" is at or near the N-terminus of a polypeptide that can be obtained after proteolytic cleavage of a polypeptide exposed on the surface of a cell. Is a sequence of about 240 amino acids or less. Thus, the term includes the N-terminus of the proteolytic fragment, as well as the N-terminus of the native protein if the N-terminus of the native protein is exposed on the outer surface of the cell.

【００５１】 本発明のＳｐａポリペプチドのＮ末端は、オプソニン作用性のエピトープを形
成する短いペプチド配列を確実に含む。なぜなら、オプソニン作用性の抗体が細
胞の外表面上に曝されたポリペプチドの全体の配列を必要とするエピトープを認
識する可能性が非常に低いからである。エピトープが、８アミノ酸程度のペプチ
ド配列から構成され得ることは周知であり、これは、当業者に一般的に、主要組
織適合性複合体（ＭＨＣ）と相互作用し得るエピトープを形成することが可能で
あるためのサイズの下限であると考えられている。従って 本発明の別の局面は、単離されたＳｐａポリペプチドのＮ末端に由来する少なく
とも８個の連続しているアミノ酸を含むオプソニン作用性のエピトープを含有し
ているポリペプチドおよびペプチドを含む。本発明のＳｐａポリペプチド上のオ
プソニン作用性のアミノ酸配列の同定は、種々の方法によって達成され得る。The N-terminus of the Spa polypeptides of the present invention reliably contains a short peptide sequence that forms an opsonizing epitope. This is because opsonic antibodies are very unlikely to recognize epitopes that require the entire sequence of the exposed polypeptide on the outer surface of the cell. It is well known that epitopes can be composed of peptide sequences of as little as 8 amino acids, which are generally known to those skilled in the art as being capable of forming epitopes that can interact with the major histocompatibility complex (MHC). Is considered to be the lower limit of the size to be. Accordingly, another aspect of the present invention includes polypeptides and peptides containing an opsonizing epitope comprising at least 8 contiguous amino acids from the N-terminus of the isolated Spa polypeptide. Identification of an opsonic amino acid sequence on a Spa polypeptide of the invention can be accomplished by a variety of methods.

【００５２】 １つの方法は、オプソニン作用性のエピトープの存在について、ペプチドフラ
グメントを得るために、およびこれらのペプチドフラグメントを試験するために
、またはそれに由来する連続しているアミノ酸を含有しているペプチドの合成の
ための、Ｓｐａの化学的な分解を使用することである。本発明の１つの実施にお
いては、精製されたＳｐａポリペプチドのエドマン分解が、単離されたポリペプ
チドのＮ末端について正確なアミノ酸配列を提供するために使用される。別の実
施形態においては、エドマン分解が、単離されたポリペプチドの酵素的または化
学的な消化によって調製された内部フラグメントの正確なアミノ酸配列を提供す
るために使用される。例えば、上記のＭ１８Ω変異体から単離されたＳｐａポリ
ペプチドのエドマン分解は、２つのアミノ酸配列を提供した：単離されたポリペ
プチドのＮ末端部分を含む２３アミノ酸の第１の配列、およびポリペプチドのＬ
ｙｓＣ消化の後で単離された内部ペプチドフラグメントのＮ末端部分を含む１０
アミノ酸の第２の配列。２３アミノ酸のＮ末端の配列は、配列番号３に提供され
、そして内部フラグメントの配列とともに実施例４に示される。推論によって束
縛されることは望まないが、配列番号３は、天然のＳｐａタンパク質のＮ末端を
示すと考えられるが、天然のＳｐａタンパク質がＮ末端にさらなるアミノ酸を含
む可能性は排除することはできない。配列番号５との比較は、天然のタンパク質
が残りのシグナル配列の除去によって前タンパク質からプロセシングされること
を示す。One method is to obtain peptide fragments for the presence of opsonizing epitopes and to test these peptide fragments or to obtain peptides containing consecutive amino acids derived therefrom. To use the chemical degradation of Spa for the synthesis of In one implementation of the invention, Edman degradation of the purified Spa polypeptide is used to provide the correct amino acid sequence for the N-terminus of the isolated polypeptide. In another embodiment, Edman degradation is used to provide the correct amino acid sequence of an internal fragment prepared by enzymatic or chemical digestion of an isolated polypeptide. For example, Edman degradation of the Spa polypeptide isolated from the M18Ω mutant described above provided two amino acid sequences: a first sequence of 23 amino acids including the N-terminal portion of the isolated polypeptide; L of peptide
10 containing the N-terminal portion of the internal peptide fragment isolated after ysC digestion
Second sequence of amino acids. The N-terminal sequence of 23 amino acids is provided in SEQ ID NO: 3 and is shown in Example 4 with the sequence of the internal fragment. While not wishing to be bound by inference, SEQ ID NO: 3 appears to represent the N-terminus of the native Spa protein, but the possibility that the native Spa protein contains additional amino acids at the N-terminus cannot be excluded. . Comparison with SEQ ID NO: 5 shows that the native protein is processed from the previous protein by removal of the remaining signal sequence.

【００５３】 より小さいペプチドフラグメントまたは配列がＳｐａポリペプチドから単離さ
れる場合は、単離されたペプチドフラグメントまたは配列が、オプソニン作用性
のポリペプチドを同定するための上記の方法の改変によって、オプソニン作用性
のエピトープを含有するとして同定され得る。必要とされる改変のみが、より小
さいペプチドの分離に適切な分離システムの使用である。高い割合のポリアクリ
ルアミドゲルおよびＨＰＬＣ技術が、より小さいペプチドを分離するために特に
適切であり、そしてこのような技術は、当業者によって容易に利用される。ある
いは、エドマン分解によって推測されるアミノ酸配列と連続している合成ペプチ
ドが、作成され得る。従って、本発明の実施形態は、Ｓｐａポリペプチドの少な
くとも８個の連続しているアミノ酸を含むオプソニン作用性のエピトープを含有
しているペプチドを含む。If a smaller peptide fragment or sequence is isolated from the Spa polypeptide, the isolated peptide fragment or sequence may be opsonized by a modification of the method described above to identify an opsonizing polypeptide. May be identified as containing a sexual epitope. The only modification required is the use of an appropriate separation system for the separation of smaller peptides. High percentages of polyacrylamide gels and HPLC techniques are particularly suitable for separating smaller peptides, and such techniques are readily utilized by those skilled in the art. Alternatively, synthetic peptides can be created that are contiguous with the amino acid sequence deduced by Edman degradation. Thus, embodiments of the present invention include peptides containing an opsonizing epitope comprising at least eight consecutive amino acids of a Spa polypeptide.

【００５４】 １つの実施形態においては、配列番号３の２３個の連続しているアミノ酸を含
有しているペプチド（これは、単離されたＳｐａポリペプチドのＮ末端を示す）
が、化学的に合成される。本明細書中でｓｐａ１８（１−２３）と命名されたこ
のペプチドは、まずそれをＫＬＨのような適切なキャリアに対して化学的にカッ
プリングし、そしてそれをウサギにおいて抗血清を惹起するために使用すること
によって、オプソニン作用性であることが示されている。別の抗血清が、比較の
ために完全なＳｐａポリペプチドに対して作成される。これらの抗血清は、次い
で、Ｍ１８ΩのようなＭ陰性の変異体から得られた粗表面ペプチドから調製され
た抗血清と交差反応性であることを示すために、そして上記のオプソニン作用の
アッセイを使用してオプソニン作用性のエピトープの存在をさらに示すために、
使用される。結果は、ＳｐａポリペプチドのＮ末端の２３アミノ酸のペプチドが
、単離された全体のポリペプチドから得られたもの、および粗表面ペプチドの画
分から得られたものと同様の、オプソニン作用の能力を有するオプソニン作用性
のエピトープを含有することを実証する。ウェスタンブロッティングもまた、精
製されたタンパク質および２３アミノ酸のペプチドに対する抗血清が、Ｍ１８の
ようなＭタンパク質には結合しないことを示す。結果はさらに、２３アミノ酸の
ペプチドおよび単離されたＳｐａポリペプチドが、親のＭ１８株、変異体株、お
よびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの他の血清型に対してオプソニン作用性の防御
を提供し得る抗血清を産生するが、親株に由来するＭタンパク質に対して調製さ
れた抗血清は、親株に対してのみオプソニン作用性の防御を提供することができ
ることを示す。（実施例５および６を参照のこと）。In one embodiment, a peptide containing 23 contiguous amino acids of SEQ ID NO: 3, which indicates the N-terminus of the isolated Spa polypeptide
Is chemically synthesized. This peptide, designated herein as spa18 (1-23), first chemically couples it to a suitable carrier, such as KLH, and elicits antiserum in rabbits. Have been shown to be opsonic. Another antiserum is raised against the entire Spa polypeptide for comparison. These antisera were then shown to be cross-reactive with antisera prepared from crude surface peptides obtained from M-negative mutants, such as M18Ω, and the opsonization assay described above. To further indicate the presence of an opsonizing epitope using
used. The results show that the N-terminal 23 amino acid peptide of the Spa polypeptide has an opsonizing capacity similar to that obtained from the isolated whole polypeptide and from the fraction of the rough surface peptide. Demonstrates that it contains an opsonizing epitope. Western blotting also shows that antisera against the purified protein and the 23 amino acid peptide do not bind to M proteins such as M18. The results further show that the 23 amino acid peptide and the isolated Spa polypeptide produce an antiserum that can provide opsonizing protection against the parental M18 strain, the mutant strain, and other serotypes of Streptococcus. However, it shows that antisera prepared against the M protein derived from the parental strain can provide opsonic protection only against the parental strain. (See Examples 5 and 6).

【００５５】 単離されたＳｐａポリペプチドまたはその中に含まれるペプチドエピトープに
ついての正確なアミノ酸配列を決定することが、本発明の好ましい実施であるが
、本明細書中で提供されるＳｐａポリペプチドを得るための配列レベルで、単離
されたポリペプチドを構造的に定義することは必要ではない。上記の記載は、任
意のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ供給源から（特に、Ａ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｉから）Ｓｐａポリペプチドを単離するために有用な方法を提供する。上記の
記載から明らかであるように、Ｓｐａポリペプチドは、この方法の要件を満たす
特定の機能的な特徴を有するポリペプチド生成物であり、そしてそれによって、
これはこの方法の実施によって単離される。まとめると、Ｓｐａポリペプチドは
、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種から得られたポリペプチド生成物であり、これ
は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌の外表面に提示され、そしてＭタンパク質
上に含まれるエピトープ以外の抗原性エピトープを含む。これらのエピトープは
、オプソニン作用性の抗原を提示する。これらは、Ｍタンパク質に対して調製さ
れた抗血清とは交差反応せず、そしてこれらは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの複
数の血清型に対するオプソニン作用性の防御を提供し得る。これらの特徴は、本
発明に記載されている実施に従って単離されたポリペプチドにおいて見出される
。Determining the exact amino acid sequence for an isolated Spa polypeptide or a peptide epitope contained therein, is a preferred practice of the present invention, however, the Spa polypeptide provided herein. It is not necessary to structurally define the isolated polypeptide at the sequence level to obtain The above description can be obtained from any Streptococcus source (especially Streptococcus of group A).
A useful method for isolating Spa polypeptides is provided. As is evident from the above description, Spa polypeptides are polypeptide products with certain functional characteristics that meet the requirements of this method, and
It is isolated by performing the method. In summary, Spa polypeptides are polypeptide products obtained from Streptococcus species, which are displayed on the outer surface of Streptococcus bacteria and include antigenic epitopes other than those contained on the M protein. These epitopes present an opsonizing antigen. They do not cross react with antisera prepared against the M protein, and they may provide opsonic protection against multiple serotypes of Streptococci. These features are found in a polypeptide isolated according to the practice described in the present invention.

【００５６】 より詳細には、本発明は、複数の血清型のＳｔｒｅｐｔｐｃｏｃｃｉに対して
防御的なオプソニン作用性の抗体を誘発する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種の
Ｍタンパク質以外のＳｐａポリペプチドを同定し、そして単離するための方法を
提供する。この方法は、以下の工程を包含する：１）Ｍタンパク質を発現しない
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種の毒性の変異体を産生する工程；２）変異体から
得られた粗表面ポリペプチドの画分に対する抗血清を得る工程；３）抗血清が、
Ｍタンパク質とは交差反応せず、そして変異体に対してオプソニン作用性の防御
を提供する、オプソニン作用性の抗体を含有することを決定する工程；４）単離
されたポリペプチド画分を得るために、抽出物中のポリペプチドを分離する工程
；５）オプソニン作用性のエピトープを含むＳｐａポリペプチドを同定するため
に、オプソニン作用性の抗体を含有している抗血清を用いて、単離されたポリペ
プチド画分をスクリーニングする工程；６）オプソニン作用性のエピトープを有
すると同定されたポリペプチドを精製する工程；ならびに７）それらが、Ｓｔｒ
ｅｐｔｐｃｏｃｃｉの複数の血清型に対して防御的であるオプソニン作用性の抗
体を誘発することを決定するために、精製されたポリペプチドを試験する工程。More specifically, the present invention identifies and isolates Spa polypeptides other than Streptococcus species M proteins that elicit opsonizing antibodies that are protective against multiple serotypes of Streptococci. Provide a way to The method includes the following steps: 1) producing a toxic mutant of a Streptococcus species that does not express the M protein; 2) obtaining an antiserum against a fraction of the rough surface polypeptide obtained from the mutant. Step; 3) the antiserum comprises:
Determining that it contains an opsonizing antibody that does not cross-react with the M protein and provides opsonizing protection against the variant; 4) obtaining an isolated polypeptide fraction Isolating the polypeptide in the extract; 5) isolating using an antiserum containing an opsonic antibody to identify a Spa polypeptide comprising an opsonic epitope; Screening the isolated polypeptide fractions; 6) purifying the polypeptides identified as having opsonic epitopes; and 7)
testing the purified polypeptide to determine that it elicits opsonizing antibodies that are protective against multiple serotypes of eptpcocci.

【００５７】 従って、本発明の別の実施形態は、この方法に従って単離されたＳｐａポリペ
プチドを含む。当業者は、この方法が、種々のＳｔｒｅｐｔｐｃｏｃｃｕｓ種か
らの種々のＳｐａポリペプチドの単離が可能であることをすぐに認識する。従っ
て、例えば、本発明の１つの実施において説明されるＭ１８変異体から単離され
たＳｐａポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの少なくとも３つの血清型
に対して防御的であるが（実施例６を参照のこと）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ
の他の血清型に対して防御的である、他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉから単離さ
れた他のＳｐａポリペプチドが単離され得る。Thus, another embodiment of the present invention includes a Spa polypeptide isolated according to this method. One skilled in the art will immediately recognize that this method allows for the isolation of various Spa polypeptides from various Streptococcus species. Thus, for example, Spa polypeptides isolated from the M18 mutant described in one implementation of the invention are protective against at least three serotypes of Streptococci (see Example 6). ), Streptococci
Other Spa polypeptides isolated from other Streptococci that are protective against other serotypes can be isolated.

【００５８】 ＩＩ．核酸 本発明の別の局面は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｓｐａポリペプチドをコ
ードする配列を含む単離された核酸分子である。本発明のこの局面は、Ｓｐａポ
リペプチドをコードする単離された核酸配列（すなわち、ｓｐａ遺伝子）、なら
びに例えば、相補配列、逆配列、および逆の配列の相補物のような、単離された
核酸分子から容易に誘導される配列に関する。II. Another aspect of the present invention is an isolated nucleic acid molecule comprising a sequence encoding a Streptococcus Spa polypeptide. This aspect of the invention relates to isolated nucleic acid sequences encoding Spa polypeptides (ie, the spa gene), and isolated, such as, for example, complementary sequences, reverse sequences, and complements of reverse sequences. It relates to sequences that are easily derived from nucleic acid molecules.

【００５９】 １つの実施形態においては、単離された核酸分子は、配列番号１もしくは配列
番号４から選択される配列、配列番号１もしくは配列番号４の相補物、またはそ
れらの変異体を含む。核酸配列の変異体として、遺伝子コードに起因して配列番
号１または配列番号５に対して縮重している配列番号２または配列番号５のポリ
ペプチドをコードする配列；配列番号２または配列番号５のポリペプチドに対し
て保存的なアミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードする配列；あるいは、
配列番号２または配列番号５に対して少なくとも５０％同一であるポリペプチド
をコードする配列から選択される変異体が挙げられる。なお別の実施形態におい
ては、本発明は、高いストリンジェンシーの条件下で上記の核酸分子に対してハ
イブリダイズする配列を含む、単離された核酸分子を提供する。別の実施形態は
、Ｓｐａポリペプチドを形成するオプソニン作用性のエピトープをコードする配
列を含有している単離された核酸分子を含む。本明細書中で提供される核酸配列
の関連する局面は、オプソニン作用性のエピトープをコードし、そしてさらに融
合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。ここでは、融合ポリペプチドは、
少なくとも１つの他のポリペプチド配列に対して融合されたオプソニン作用性の
エピトープを含む。１つの実施形態においては、他のペプチド配列は、細胞性の
抽出物に由来する融合ポリペプチドの単離を容易にするタグ配列を含む。別の実
施形態においては、他のペプチド配列は、キャリアタンパク質である。[0059] In one embodiment, the isolated nucleic acid molecule comprises a sequence selected from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4, the complement of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4, or a variant thereof. As a variant of the nucleic acid sequence, a sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 degenerate from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5 due to the genetic code; SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 A sequence encoding a polypeptide having conservative amino acid substitutions for the polypeptide of
Variants selected from sequences encoding polypeptides that are at least 50% identical to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5. In yet another embodiment, the invention provides an isolated nucleic acid molecule comprising a sequence that hybridizes to the above nucleic acid molecule under conditions of high stringency. Another embodiment includes an isolated nucleic acid molecule containing a sequence encoding an opsonizing epitope that forms a Spa polypeptide. A related aspect of the nucleic acid sequences provided herein includes a nucleic acid molecule that encodes an opsonizing epitope and further encodes a fusion polypeptide. Here, the fusion polypeptide is
It comprises an opsonizing epitope fused to at least one other polypeptide sequence. In one embodiment, the other peptide sequence comprises a tag sequence that facilitates isolation of the fusion polypeptide from a cellular extract. In another embodiment, the other peptide sequence is a carrier protein.

【００６０】 上記の核酸分子についての関連する実施形態は、プロモーターに作動可能に連
結された核酸分子を含有しているベクターを含む。その結果、ベクターは、ベク
ターが宿主細胞中に導入された場合に、単離された核酸分子によってコードされ
るポリペプチドを発現する。別の実施形態においては、本発明は、このようなベ
クターを保有している宿主細胞を提供する。[0060] A related embodiment for the above nucleic acid molecules comprises a vector containing the nucleic acid molecule operably linked to a promoter. As a result, the vector will express the polypeptide encoded by the isolated nucleic acid molecule when the vector is introduced into a host cell. In another embodiment, the present invention provides a host cell carrying such a vector.

【００６１】 本明細書中で使用される場合は、ｓｐａ遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ遺伝子またはその核酸変異体である。これは、例えば、配列番号１または配列
番号４の単離された核酸、２４ｋＤａのＳｐａポリペプチドをコードする核酸、
または約５０ｋＤａの天然のＳｐａタンパク質をコードする核酸を含む、Ｓｐａ
ポリペプチドの少なくとも１００アミノ酸をコードする。ｓｐａ遺伝子の一部の
一例は、図４、および配列番号１〜２に示される。これらは、１８型のＳｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓから単離された１つのｓｐａ遺伝子に由来するヌクレオチド
およびアミノ酸配列を提供する。別の例は、図５および図６に示される。これら
は、それぞれ、配列番号４および配列番号５に記載される全長の核酸配列および
アミノ酸配列を示す。これらは、全長のｓｐａ配列を示し、そしてこれらは、示
されるように、成熟ｓｐａタンパク質を生じるように切断される、３７残基のシ
グナルペプチドを含む。[0061] As used herein, the spa gene is Streptococcu.
s gene or a nucleic acid variant thereof. This includes, for example, an isolated nucleic acid of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4, a nucleic acid encoding a 24 kDa Spa polypeptide,
Or a nucleic acid encoding a native Spa protein of about 50 kDa.
Encodes at least 100 amino acids of a polypeptide. One example of a part of the spa gene is shown in FIG. These are Type 18 Stre
Provided are nucleotide and amino acid sequences from one spa gene isolated from Ptococcus. Another example is shown in FIGS. These show the full length nucleic acid sequence and amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, respectively. These show the full-length spa sequence, and they contain a 37 residue signal peptide that is cleaved to give the mature spa protein as shown.

【００６２】 本発明の単離されたｓｐａ核酸の別の局面は、単離された配列のフラグメント
を含む。本明細書中で使用される場合は、単離されたｓｐａ遺伝子の「フラグメ
ント」は、単離されたｓｐａ遺伝子に由来する少なくとも１２個のヌクレオチド
、または中程度もしくは高いストリンジェンシーの条件下で単離されたｓｐａ遺
伝子にハイブリダイズする少なくとも１２個のヌクレオチドの変異体を含有して
いる、任意の核酸配列を含む。このような配列は、さらなるｓｐａ配列または他
のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉに由来するその変異体を単離するためのＰＣＲプラ
イマーを含む種々の目的のために有用である。別の代表的な用途は、天然のＳｐ
ａポリペプチド上に存在するエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドの組
換え発現のためである。[0062] Another aspect of the isolated spa nucleic acids of the present invention includes fragments of the isolated sequences. As used herein, a "fragment" of an isolated spa gene is at least 12 nucleotides from the isolated spa gene, or a single fragment under conditions of moderate or high stringency. Any nucleic acid sequence containing a variant of at least 12 nucleotides that hybridizes to the isolated spa gene. Such sequences are useful for a variety of purposes, including PCR primers for isolating additional spa sequences or other variants thereof from Streptococci. Another typical use is for natural Sp
a for recombinant expression of a peptide or polypeptide containing an epitope present on the polypeptide.

【００６３】 Ｓｐａ配列を同定するためおよびそれを得るためのプローブおよびプライマー
として有用な、核酸フラグメントまたはオリゴヌクレオチドもまた、本明細書中
で提供される。より詳細には、配列番号１または配列番号４の少なくとも１２個
の連続しているヌクレオチドを含む核酸フラグメントまたはオリゴヌクレオチド
が、Ｓｐａ核酸配列に対するハイブリダイゼーションに、および／またはＳｐａ
核酸配列を増幅するために使用され得るプライマーに、特に有用である。より詳
細な実施形態は、長さが少なくとも１８、２４、３０、５０または５０ヌクレオ
チドを超える、核酸フラグメントまたはオリゴヌクレオチドを含む。上記の配列
の相補物もまた、含まれる。[0063] Also provided herein are nucleic acid fragments or oligonucleotides useful as probes and primers for identifying and obtaining Spa sequences. More specifically, a nucleic acid fragment or oligonucleotide comprising at least 12 contiguous nucleotides of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 is used to hybridize to a Spa nucleic acid sequence and / or
It is particularly useful for primers that can be used to amplify nucleic acid sequences. More specific embodiments include nucleic acid fragments or oligonucleotides that are at least greater than 18, 24, 30, 50 or 50 nucleotides in length. Complements of the above sequences are also included.

【００６４】 本発明の核酸フラグメントまたはオリゴヌクレオチドの別の実施形態は、例え
ば、Ｓｐａ抗体に特異的に結合する能力によって検出され得るか、または動物中
で免疫応答を誘発するために使用され得るペプチドエピトープをコードするもの
を含む。有用なペプチドエピトープは、Ｓｐａアミノ酸残基を含むペプチドまた
はポリペプチドに特異的に結合する抗体を誘発し得るか、あるいはそれに対する
Ｔ細胞の応答を誘発し得る、エピトープである。８個以上のアミノ酸のペプチド
配列が、この点で有用である。なぜなら、８個のアミノ酸が、ペプチドが主要組
織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と相互作用するためのサイズの下限であることが
当業者に一般的に理解されているからである。より好ましい実施形態は、少なく
とも１０個、１５個、または２０個のアミノ酸をコードする核酸フラグメントま
たはオリゴヌクレオチドを含む。Another embodiment of a nucleic acid fragment or oligonucleotide of the invention is a peptide that can be detected, for example, by the ability to specifically bind to a Spa antibody, or that can be used to elicit an immune response in an animal. Includes those encoding epitopes. Useful peptide epitopes are those that can elicit antibodies that specifically bind to peptides or polypeptides containing Spa amino acid residues, or elicit a T cell response thereto. Peptide sequences of eight or more amino acids are useful in this regard. Because eight amino acids are generally understood by those skilled in the art to be the lower size limit for the peptide to interact with the major histocompatibility complex (MHC). More preferred embodiments include nucleic acid fragments or oligonucleotides encoding at least 10, 15, or 20 amino acids.

【００６５】 従って、本発明は、配列番号２、配列番号５、または配列番号５に記載されて
いる配列の少なくとも８個の連続しているアミノ酸を含むペプチドをコードする
核酸フラグメントまたはオリゴヌクレオチドを提供する。この局面の好ましい実
施形態は、少なくとも１０個、１５個、または２０個のアミノ酸を含むペプチド
をコードする核酸フラグメントまたはオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施
形態は、コードされるペプチドが、ＳｐａポリペプチドのＮ末端に由来する配列
を含み、そしてより詳細には、オプソニン作用性のエピトープをコードする配列
を含む、核酸フラグメントを含む。これらとして、例えば、配列番号２または配
列番号３に含まれるペプチドをコードする配列、あるいは、例えば、配列番号５
のような、より大きなＳｐａポリペプチドの切断後に単離される内部に配置され
たペプチドのＮ末端に由来する配列が、挙げられる。Accordingly, the present invention provides a nucleic acid fragment or oligonucleotide encoding a peptide comprising at least 8 contiguous amino acids of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, or the sequence set forth in SEQ ID NO: 5. I do. Preferred embodiments of this aspect include a nucleic acid fragment or oligonucleotide that encodes a peptide comprising at least 10, 15, or 20 amino acids. Preferred embodiments include nucleic acid fragments in which the encoded peptide comprises a sequence derived from the N-terminus of the Spa polypeptide, and more particularly, comprises a sequence encoding an opsonizing epitope. These include, for example, a sequence encoding the peptide contained in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or, for example, SEQ ID NO: 5
Sequences derived from the N-terminus of an internally located peptide that is isolated after cleavage of a larger Spa polypeptide, such as

【００６６】 本発明はまた、細胞中のＳｐａポリペプチドの発現を調節するかまたは阻害す
るために有用な核酸を提供する。より詳細には、本発明は、上記のＳｐａポリペ
プチドをコードするＲＮＡを切断するリボザイム、およびこのようなＲＮＡに結
合するアンチセンス分子を提供する。これは、このようなリボザイムまたはアン
チセンス分子をコードする配列を含有している核酸分子、およびこれらを含むベ
クターを含む。特定の実施形態は、上記のリボザイムまたはアンチセンス核酸が
プロモーターに作動可能に連結されているベクターを含む。これらのベクターの
代表的な実施形態は、以下からなる群より選択される：プラスミドベクター、フ
ァージベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ア
デノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター。上記のベクターを
含有している宿主細胞もまた、含まれる。The present invention also provides nucleic acids useful for modulating or inhibiting the expression of a Spa polypeptide in a cell. More specifically, the present invention provides ribozymes that cleave RNA encoding the above Spa polypeptides, and antisense molecules that bind to such RNA. This includes nucleic acid molecules containing sequences encoding such ribozymes or antisense molecules, and vectors containing them. Particular embodiments include a vector wherein the ribozyme or antisense nucleic acid described above is operably linked to a promoter. Representative embodiments of these vectors are selected from the group consisting of: plasmid vectors, phage vectors, herpes simplex virus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, and retrovirus vectors. Host cells containing the above vectors are also included.

【００６７】 Ｓｐａ ＲＮＡの発現を阻害し得るリボザイムが、提供される。本明細書中で
使用される場合は、「リボザイム」は、特異的な認識のためのアンチセンス配列
、およびＲＮＡを切断する酵素活性を含むＲＮＡ分子を含むと意図される。触媒
的な鎖は、より大きな化学量論的濃度で標的ＲＮＡ中の特異的な部位で切断する
。広範な種々のリボザイムが、本発明の状況において利用される。これらとして
、例えば、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏ
ｎｓ、Ｃｅｌｌ ４８：２１１−２２０、１９８７；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧ
ｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５９６−６００、１９８８；Ｗａｌｂｏ
ｔおよびＢｒｕｅｎｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：１９６、１９８８；Ｈａｓ
ｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５、１９９８に
記載されている）；ヘアピンリボザイム（例えば、１９９３年１０月１９日に発
行された、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，２５４，６７８号、および１９
９０年３月２６日に公開された、Ｈｅｍｐｅｌら、欧州特許公開番号第０，３０
６，２５７号に記載されている；）およびＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａのリボソーム
ＲＮＡに基づくリボザイム（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号を参
照のこと）が挙げられる。本発明のリボザイムは、代表的には、ＲＮＡからなる
が、ＤＮＡ、核酸のアナログ（例えば、ホスホロチオエート）、またはそれらの
キメラ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＲＮＡ）からも構成され得る。[0067] Ribozymes capable of inhibiting the expression of Spa RNA are provided. As used herein, "ribozyme" is intended to include an antisense sequence for specific recognition, and an RNA molecule that contains an enzymatic activity that cleaves RNA. The catalytic strand cleaves at specific sites in the target RNA at higher stoichiometric concentrations. A wide variety of ribozymes are utilized in the context of the present invention. These include, for example, hammerhead ribozymes (eg, Forster and Symo)
ns, Cell 48: 211-220, 1987; Haseloff and G.
erlach, Nature 328: 596-600, 1988; Walbo.
t and Bruening, Nature 334: 196, 1988; Has.
eloff and Gerlach, Nature 334: 585, 1998); hairpin ribozymes (e.g., Haseloff et al., US Patent Nos. 5,254,678, and 19, issued October 19, 1993).
Hempel et al., European Patent Publication No. 0,30, published March 26, 1990.
No. 6,257;) and ribozymes based on Tetrahymena ribosomal RNA (see Cech et al., US Pat. No. 4,987,071). The ribozyme of the present invention is typically composed of RNA, but can also be composed of DNA, an analog of nucleic acid (eg, phosphorothioate), or a chimera thereof (eg, DNA / RNA / RNA).

【００６８】 Ｓｐａ核酸配列の発現を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド分
子が、提供される（一般的には、Ｈｉｒａｓｈｉｍａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ：Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｍ．Ｉｎ
ｏｕｙｅおよびＢ．Ｓ．Ｄｕｄｏｃｋ編、１９８７ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、４０１頁）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：Ａ
ｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ（Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎ編、１９８９ ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌ
ｏｎｄｏｎ）；ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１００
４−１０１２、１９９３；ＷＯ９５／１０６０７；米国特許第５，３５９，０５
１号；ＷＯ９２／０６６９３；ならびにＥＰ−Ａ２−６１２８４４を参照のこと
）。簡潔には、このような分子は、これらが、転写されたＳｐａ ｍＲＮＡ配列
の領域に対して相補的であり、そしてその領域とワトソン−クリックの塩基対を
形成することが可能であるように、構築される。得られた二本鎖の核酸は、その
後のｍＲＮＡのプロセシングを妨害し、それによってタンパク質の合成を妨げる
（実施例６）。Antisense oligonucleotide molecules that specifically inhibit the expression of a Spa nucleic acid sequence are provided (generally, Hirashima et al., Molecular).
Biology of RNA: New Perspectives (M. In
ouye and B.E. S. Dudock, 1987 Academic Pre
ss, San Diego, p. 401); Oligonucleotide: A
ntisense Inhibitors of Gene Expressi
on (JS Cohen, ed., 1989 MacMillan Press, L.)
ondon); Stein and Cheng, Science 261: 100.
WO10 / 10607; U.S. Pat. No. 5,359,05.
No. 1; WO92 / 06693; and EP-A2-612844). Briefly, such molecules are such that they are complementary to a region of the transcribed Spa mRNA sequence and can form Watson-Crick base pairs with that region. Be built. The resulting double-stranded nucleic acid interferes with subsequent mRNA processing, thereby preventing protein synthesis (Example 6).

【００６９】 関連する局面においては、任意の上記の核酸は、改変されたヌクレオチドを含
み得る。改変されたヌクレオチドは、糖部分、および／またはピリミジンもしく
はプリン塩基部分に改変を有し得る。糖の改変として、例えば、ハロゲン、アル
キル基、アミン、およびアジド基での１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げら
れるか、あるいは糖は、エーテルまたはエステルとして官能化され得る。さらに
、糖部分全体は、立体構造的におよび電気的に類似の構造（例えば、アザ−糖、
および炭素環式糖アナログ）で置換され得る。塩基部分での改変の例として、ア
ルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミ
ジン、または他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸のモノマーは、ホス
ホジエステル結合またはこのような結合のアナログによって連結され得る。ホス
ホジエステル結合のアナログとして、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエー
ト、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。用語「核酸
」はまた、いわゆる「ペプチド核酸」をも含む。これは、ポリアミド骨格に対し
て付着し天然に存在するかまたは改変された核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖ま
たは二本鎖のいずれかであり得る。[0069] In a related aspect, any of the above nucleic acids can include modified nucleotides. The modified nucleotide may have a modification in the sugar moiety and / or the pyrimidine or purine base moiety. Sugar modifications include, for example, replacement of one or more hydroxyl groups with halogens, alkyl groups, amines, and azide groups, or sugars can be functionalized as ethers or esters. In addition, the entire sugar moiety has a sterically and electrically similar structure (eg, an aza-sugar,
And carbocyclic sugar analogs). Examples of modifications at the base moiety include alkylated purines and pyrimidines, acylated purines or pyrimidines, or other well-known heterocyclic substituents. The monomers of the nucleic acid may be linked by a phosphodiester bond or an analog of such a bond. Examples of the analog of the phosphodiester bond include phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoroselenoate, phosphorodiselenoate, phosphoroanilothioate, phosphoranilide, phosphoramidate, and the like. The term “nucleic acid” also includes so-called “peptide nucleic acids”. This includes naturally occurring or modified nucleobases attached to a polyamide backbone. Nucleic acids can be either single-stranded or double-stranded.

【００７０】 ｓｐａ遺伝子が、野生型／ネイティブのＳｐａポリペプチド、ならびに他の改
変体（対立遺伝子を含む）をコードする核酸配列を含むことが、理解されるはず
である。簡潔には、このような改変体は、天然の多型から生じ得るか、または組
換え方法論もしくは化学合成によって合成され得、そして１つ以上のアミノ酸の
置換、挿入、欠失などによって野生型のポリペプチドとは異なる。保存的なアミ
ノ酸置換を含む変異体として、例えば、１つの両親媒性アミノ酸の、Ｉｌｅ、Ｖ
ａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａのような別のアミノ酸での置換、またはＬｙｓと
Ａｒｇとの間、ＧｌｕとＡｓｐとの間、もしくはＧｌｎとＡｓｎとの間のような
１つの極性残基の別の残基での置換が挙げられる。このような置換が、例えば、
類似の抗体を誘発しそしてそれらと交差反応する能力のような、類似の物理的な
特性および機能的活性を有する改変体を提供することが、当該分野で周知である
。他の改変体として、配列番号２、配列番号３、または配列番号５に対して、少
なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸同
一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列が挙げられる。好ましい実施形
態は、配列番号２、配列番号３、または配列番号５のアミノ酸配列と、９０％よ
り大きい、または９５％より大きい同一性を有するものである。当業者に明らか
であるように、Ｓｐａまたは改変体をコードするヌクレオチド配列が、コドンの
縮重、ヌクレオチド多型、またはヌクレオチドの置換、欠失、もしくは挿入に起
因して、本明細書中で示されるネイティブの配列とは異なり得る。It should be understood that the spa gene includes nucleic acid sequences encoding wild-type / native Spa polypeptides, as well as other variants, including alleles. Briefly, such variants may result from naturally occurring polymorphisms, or may be synthesized by recombinant methodology or chemical synthesis, and may be modified by replacing one or more amino acids by substitutions, insertions, deletions, etc. of the wild type. Different from polypeptides. Variants containing conservative amino acid substitutions include, for example, one amphipathic amino acid, Ile, V
substitution with another amino acid such as al, Leu or Ala, or another residue of one polar residue such as between Lys and Arg, between Glu and Asp, or between Gln and Asn. And substitution with a group. Such a substitution, for example,
It is well known in the art to provide variants with similar physical properties and functional activities, such as the ability to elicit and cross-react with similar antibodies. Other variants include polypeptides having at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95% amino acid identity to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 5. Encoding nucleic acid sequences. Preferred embodiments are those that have greater than 90%, or greater than 95% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 5. As will be apparent to one of skill in the art, the nucleotide sequence encoding Spa or the variant may be represented herein due to codon degeneracy, nucleotide polymorphisms, or nucleotide substitutions, deletions, or insertions. May differ from the native sequence.

【００７１】 このような単離された核酸の特定の実施形態が、配列番号１および配列番号４
、ならびに図４および図５に示されているが、本発明の状況においては、１つ以
上の単離された核酸分子に関して、これらの配列の改変体を含む。これらは、配
列番号２または配列番号５のＳｐａポリペプチドに対して類似の構造および機能
を有する、ネイティブのまたは非ネイティブのタンパク質、ポリペプチド、また
はペプチドをコードする点で実質的に類似である。本明細書中で使用される場合
は、ヌクレオチド配列は、以下のような場合に、「実質的に類似」と考えられる
：（ａ）ヌクレオチド配列が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓから単離されたｓｐ
ａ遺伝子のコード領域に由来し（例えば、上記に議論されている配列の一部、ま
たは配列の対立遺伝子のバリエーションを含む）、そしてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｉに対して防御的なオプソニン作用性の抗体を誘発する実質的に同じ能力を有
するＭタンパク質ではないエピトープを含む；あるいは（ｂ）ヌクレオチド配列
が、高いストリンジェンシーの下で本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズ
し得る（例えば、少なくとも６×ＳＳＣおよび５０％のホルムアミドのようなス
トリンジェントで、塩および／またはホルムアミドの存在下で、少なくとも４２
℃で一晩、ｓｐａ遺伝子のヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズし得る）
；あるいは（ｃ）（ａ）または（ｂ）において定義されたヌクレオチド配列につ
いての遺伝子コードの縮重の結果としてヌクレオチド配列が縮重している（すな
わち、同じアミノ酸をコードする配列が、異なるコドン配列を使用する）；ある
いは（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載されている任意の配列の相補物
である。A specific embodiment of such an isolated nucleic acid is SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4
And in FIGS. 4 and 5, in the context of the present invention, one or more isolated nucleic acid molecules include variants of these sequences. These are substantially similar in that they encode a native or non-native protein, polypeptide, or peptide having similar structure and function to the Spa polypeptide of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5. As used herein, a nucleotide sequence is considered "substantially similar" if: (a) the nucleotide sequence is a sp. Isolated from Streptococcus;
a from the coding region of the a gene (eg, including a portion of the sequence discussed above, or an allelic variation of the sequence) and Streptococ
containing epitopes that are not M proteins with substantially the same ability to elicit opsonizing antibodies that are protective against ci; or (b) the nucleotide sequence is under high stringency with a nucleotide sequence of the invention. Hybridizable (eg, at least 42 × stringent, such as 6 × SSC and 50% formamide, in the presence of salts and / or formamide).
Can hybridize selectively to the nucleotide sequence of the spa gene at 0 ° C overnight)
Or (c) the nucleotide sequence is degenerate as a result of the degeneracy of the genetic code for the nucleotide sequence as defined in (a) or (b) (ie, the sequence encoding the same amino acid has a different codon sequence); Or (d) the complement of any of the sequences described in (a), (b), or (c).

【００７２】 本発明の別の局面は、動物を免疫化するための組換えタンパク質を産生するた
めの、単離されたｓｐａヌクレオチド配列の使用である。従って、主要組織適合
遺伝子複合体に結合し得、そして免疫応答を誘発し得るかまたは増強し得る、少
なくとも８個の連続しているアミノ酸のポリペプチドまたはそのフラグメントを
コードする、本発明によって開示される任意の長さの核酸の使用（好ましくは、
２４ヌクレオチドまたはそれよりも長い）が、本発明によって意図される。好ま
しい実施形態は、オプソニン作用性の抗体を誘発するポリペプチドまたはそのフ
ラグメントを含む。免疫原性の応答は、目的のポリペプチドまたはフラグメント
でマウスまたはウサギをチャレンジし、その後、抗血清を回収し、そして目的の
抗体が存在するかどうかを決定することのような、公知の方法によって容易に試
験され得る。Ｔ細胞応答の検出に特に有用な他のアッセイとして、増殖アッセイ
、Ｔ細胞の細胞毒性アッセイ、遅延型過敏症についてのアッセイ、および以前に
記載されているようなオプソニン作用についてのアッセイが挙げられる。目的の
抗原に対して特異的な抗体が動物によって産生されるかどうかを決定することに
おいては、多くの診断ツールが利用可能である。これらとして、例えば、従来の
ウェスタンブロッティングを使用して、または目的の抗原に付着させたタグを用
いる酵素結合イムノアッセイを使用して、サンプル抗血清中に含まれる抗体に対
する抗原の結合を試験することが挙げられる。Another aspect of the invention is the use of the isolated spa nucleotide sequence to produce a recombinant protein to immunize an animal. Thus, disclosed by the present invention is a polypeptide or fragment thereof of at least 8 contiguous amino acids that can bind to the major histocompatibility complex and elicit or enhance an immune response. Use of nucleic acids of any length (preferably
24 nucleotides or longer) are contemplated by the present invention. Preferred embodiments include polypeptides or fragments thereof that elicit opsonic antibodies. The immunogenic response can be determined by known methods, such as by challenge a mouse or rabbit with the polypeptide or fragment of interest, then collecting the antiserum and determining whether the antibody of interest is present. Can be easily tested. Other assays that are particularly useful for detecting T cell responses include proliferation assays, T cell cytotoxicity assays, assays for delayed-type hypersensitivity, and assays for opsonization as previously described. Many diagnostic tools are available in determining whether an antibody specific to an antigen of interest is produced by an animal. These include, for example, testing the binding of the antigen to the antibodies contained in the sample antiserum using conventional Western blotting or using an enzyme-linked immunoassay using a tag attached to the antigen of interest. No.

【００７３】 本発明に従うＳｐａポリペプチドをコードする単離された核酸は、種々の方法
を使用して得られ得る。例えば、核酸分子は、Ｓｐａポリペプチドと反応する抗
体を用いてスクリーニングすることによって、ｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブ
ラリーから得られ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７を参照のこと）。さらに、ランダムプライムＰＣＲ
が使用され得る（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：２
７５、１９９５を参照のこと）。さらに、ランダムプライムＰＣＲのバリエーシ
ョンもまた、特に、特定の遺伝子または遺伝子ファミリーが所望される場合に、
使用され得る。１つのこのような方法においては、プライマーの一方はランダム
プライマーであり、そして他方のプライマーは、Ｓｐａポリペプチドをコードす
るアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に基づく縮重プライマーである。この方
法は、例えば、実施例７に例示される。ここでは、単離されたＳｐａポリペプチ
ドのＮ末端の２３アミノ酸のいくつかの改変体のうちのいうれか１つをコードす
る配列に結合するように設計されたコドンの縮重プライマーが、図４および配列
番号１に示されるｓｐａ遺伝子の３４６ヌクレオチドの配列を単離するために使
用された。[0073] An isolated nucleic acid encoding a Spa polypeptide according to the present invention can be obtained using a variety of methods. For example, nucleic acid molecules can be obtained from a cDNA or genomic expression library by screening with an antibody that reacts with the Spa polypeptide (eg, Sambrook et al., Molecular C
loning: A Laboratory Manual, Cold Spri
ng Harbor, 1989; Ausubel et al., Current Prot.
ocols in Molecular Biology, Greene Pu
blinging, 1987). In addition, random prime PCR
Can be used (eg, Methods in Enzymol. 254: 2).
75, 1995). In addition, variations of random primed PCR may also occur, particularly when a particular gene or gene family is desired.
Can be used. In one such method, one of the primers is a random primer and the other primer is a degenerate primer based on the amino acid or nucleotide sequence encoding the Spa polypeptide. This method is exemplified in Example 7, for example. Here, a degenerate codon primer designed to bind to a sequence encoding any one of several variants of the N-terminal 23 amino acids of the isolated Spa polypeptide is shown in FIG. 4 and 346 nucleotides of the spa gene shown in SEQ ID NO: 1.

【００７４】 他の方法もまた、Ｓｐａポリペプチドをコードする単離された核酸分子を得る
ために使用され得る。例えば、核酸分子は、放射活性標識、酵素標識、タンパク
質標識、蛍光標識などを用いて標識され得、そして選択された宿主細胞中での複
製または発現のために設計された、ファージ、プラスミド、ファージミド、また
はウイルスベクター中に構築されたゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラ
リーに対してハイブリダイズされ得るプローブを合成するために、本明細書中で
提供される配列情報を使用することによって単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）を参照のこと）。ＲＮＡになるＤ
ＮＡまたはゲノム核酸配列もまた、上記のように、配列番号１に提供される単離
された核酸配列の５’および３’配列、またはその改変体に相補的なプライマー
の対を使用する増幅によって得られ得る。クローニングを容易にするために、制
限部位もまた、プライマー中に取りこまれ得る。[0074] Other methods can also be used to obtain an isolated nucleic acid molecule that encodes a Spa polypeptide. For example, nucleic acid molecules can be labeled using radioactive labels, enzyme labels, protein labels, fluorescent labels, and the like, and are designed for replication or expression in a selected host cell, phage, plasmid, phagemid. , Or by using the sequence information provided herein to synthesize a probe that can hybridize to a genomic or cDNA library constructed in a viral vector ( For example, Sambr
book, supra; Ausubel et al., supra). D to be RNA
The NA or genomic nucleic acid sequence can also be obtained by amplification using a pair of primers complementary to the 5 'and 3' sequences of the isolated nucleic acid sequence provided in SEQ ID NO: 1, or a variant thereof, as described above. Can be obtained. Restriction sites can also be incorporated into the primer to facilitate cloning.

【００７５】 本明細書中で提供される単離されたｓｐａ核酸配列の改変体（対立遺伝子を含
む）は、合成されるかまたは構築されるかのいずれかである、天然の改変体（例
えば、多型、変異および他の血清型）から容易に得られ得る。変異体を作製する
ための多くの方法が、開発されている（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出
）；Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）を参照のこと）。簡潔には、ヌクレオチドの置換
を生成するための好ましい方法は、変異される塩基にまたがり、そして変異した
塩基を含むオリゴヌクレオチドを利用する。オリゴヌクレオチドは、相補的な一
本鎖の核酸に対してハイブリダイズされ、そして第２鎖の合成が、オリゴヌクレ
オチドから開始される。二本鎖核酸は、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の
原核生物細胞、酵母、または他の真核生物細胞）中への形質転換のために調製さ
れる。標準的なスクリーニングおよびベクター増殖プロトコールが、変異配列を
同定し、そして高い収量を得るために使用される。Variants of the isolated spa nucleic acid sequences provided herein (including alleles) provided herein are naturally occurring variants (eg, either synthetic or constructed) , Polymorphisms, mutations and other serotypes). Many methods have been developed for generating variants (see generally, Sambrook et al., Supra; Ausubel et al., Supra). Briefly, the preferred method for generating nucleotide substitutions utilizes an oligonucleotide that spans and contains the mutated base. The oligonucleotide is hybridized to a complementary single stranded nucleic acid, and second strand synthesis is initiated from the oligonucleotide. Double-stranded nucleic acids are prepared for transformation into a host cell (eg, E. coli, other prokaryotic cells, yeast, or other eukaryotic cells). Standard screening and vector propagation protocols are used to identify mutated sequences and obtain high yields.

【００７６】 同様に、ｓｐａ遺伝子の欠失および／または挿入が、任意の種々の公知の方法
によって構築され得る。例えば、遺伝子は、制限酵素および／またはヌクレアー
ゼで消化され得、そして配列が欠失されるかまたはさらなる配列と再度連結され
るように、再度連結され得る。その結果、挿入または大きな置換が作製される。
同様に、種々のトランスポゾンおよび他の挿入のエレメントが、欠失および挿入
を有する組換え体を作製するために使用され得る。従って、１つの例においては
、ｓｐａ遺伝子中にΩ挿入エレメントを含有しているｓｐａ変異体が、上記のＭ
１８Ωの作製と同様の様式で作製され得る。当該分野で公知の改変体配列を作製
する他の手段が、使用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）およびＡ
ｕｓｕｂｅｌら（前出）を参照のこと。さらに、改変体配列の確認は、代表的に
は、制限酵素マッピング、配列分析、またはハイブリダイゼーションによって達
成される。Ｓｐａポリペプチドに特異的な免疫原性の応答を誘発するポリペプチ
ドをコードする改変体は、本発明の状況において特に有用である。[0076] Similarly, deletions and / or insertions of the spa gene can be constructed by any of a variety of known methods. For example, the gene can be digested with restriction enzymes and / or nucleases and religated such that the sequence is deleted or religated with additional sequences. As a result, insertions or large substitutions are made.
Similarly, various transposons and other insertional elements can be used to create recombinants with deletions and insertions. Thus, in one example, a spa mutant containing an Ω insertion element in the spa gene was constructed using the M
It can be made in a manner similar to making 18Ω. Other means of making variant sequences known in the art can be used. See, for example, Sambrook et al. (Supra) and A.
See usbel et al., supra. Further, confirmation of variant sequences is typically achieved by restriction mapping, sequence analysis, or hybridization. Variants that encode a polypeptide that elicits a specific immunogenic response to a Spa polypeptide are particularly useful in the context of the present invention.

【００７７】 上記のように、本発明は、単離されたかまたは精製されたＳｐａポリペプチド
タンパク質、および本明細書中で先に定義されているこれらの用語としてのペプ
チドを提供する。１つの局面においては、これらの単離されたかまたは精製され
た材料は、宿主細胞から単離され得るＳｐａポリペプチドタンパク質またはペプ
チドをコードする組換え核酸を発現する宿主から得られ得る。本発明のＳｐａポ
リペプチドは、プロテアーゼ処理またはポリアクリルアミドゲル電気泳動の工程
を伴って、またはそれらを伴わずに、種々の標準的な方法によって精製され得、
そして／あるいは単離されたｓｐａ核酸を発現するように操作されているＳｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｉ以外の生物体から単離され得る。例えば、本発明のＳｐａポ
リペプチドは、他の方法の中でも、ネイティブのＳｐａタンパク質、ポリペプチ
ド、融合タンパク質、またはペプチド融合体を産生するように、組換えＤＮＡ方
法を使用して（本明細書中でさらに議論される）、適切な宿主およびベクター系
を培養することによって、単離され得る。これらの方法を使用して、Ｓｐａは、
宿主細胞から運び出されるように、宿主細胞中に維持されるように、例えば、封
入体中に維持されるように、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ中での天然のＳｐ
ａの発現の場合と同様に宿主細胞の表面に組み込まれるように、操作され得る。
運び出されるように操作される場合は、宿主細胞の培養物に由来する上清が、運
び出されたＳｐａポリペプチドを単離するために使用され得る。表面に組み込ま
れる場合は、Ｓｐａポリペプチドは、上記のような粗表面ペプチドの画分を得る
ためのプロテアーゼ処理によって得られ得る。封入体中で発現される場合は、Ｓ
ｐａタンパク質、融合ペプチドなどは、種々の精製手順によって得られ得る。例
えば、Ｓｐａを含有している抽出物は、適切な支持体に結合されたＳｐａ抗体の
ような、適切な精製マトリックスに対して適用され得る。あるいは、陰イオンも
しくは陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ま
たがアフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、もしくは
逆相クロマトグラフィーが、タンパク質を精製するために使用され得る。Ｓｐａ
ポリペプチドはまた、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏ
ｎ限外濾過ユニットのような市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して、また
は減圧透析によって、濃縮され得る。As noted above, the present invention provides isolated or purified Spa polypeptide proteins, and peptides as these terms as defined herein above. In one aspect, these isolated or purified materials can be obtained from a host that expresses a recombinant nucleic acid encoding a Spa polypeptide protein or peptide that can be isolated from a host cell. The Spa polypeptides of the present invention can be purified by a variety of standard methods, with or without the steps of protease treatment or polyacrylamide gel electrophoresis,
And / or a Str engineered to express the isolated spa nucleic acid.
It can be isolated from organisms other than eptococci. For example, a Spa polypeptide of the present invention can be used to produce a native Spa protein, polypeptide, fusion protein, or peptide fusion, among other methods, using recombinant DNA methods (as used herein). Can be isolated by culturing appropriate host and vector systems. Using these methods, Spa
Native Sp in Streptococci, as transported out of the host cell, maintained in the host cell, for example, maintained in inclusion bodies.
It can be engineered to be integrated on the surface of the host cell as in the case of expression of a.
If engineered to be exported, supernatant from a culture of host cells can be used to isolate the exported Spa polypeptide. When incorporated into a surface, Spa polypeptides may be obtained by protease treatment to obtain a fraction of the rough surface peptide, as described above. When expressed in inclusion bodies, S
The pa protein, fusion peptide, etc. can be obtained by various purification procedures. For example, an extract containing Spa can be applied to a suitable purification matrix, such as a Spa antibody bound to a suitable support. Alternatively, anion or cation exchange resin chromatography, gel filtration chromatography, or affinity chromatography, hydrophobic chromatography, or reverse phase chromatography can be used to purify the protein. Spa
Polypeptides can also be obtained from Amicon or Millipore Pellico.
It can be concentrated using a commercially available protein concentration filter, such as an n ultrafiltration unit, or by vacuum dialysis.

【００７８】 組換え方法によってＳｐａポリペプチド、タンパク質、またはペプチドを単離
する１つの例においては、Ｓｐａタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを
コードする単離された核酸分子は、ニッケル−キレート化マトリックス上での精
製を可能にする、ヒスチジンタグ化分子として、発現され得る。あるいは、他の
タグが使用され得る。これらのタグとしては、ＦＬＡＧおよびＧＳＴが挙げられ
る。次いで、結合したタグは、例えば、特定のベクターについては、最後の精製
工程で除去される。Ｈｉｓタグ化タンパク質は、トロンビンとともにインキュベ
ートされ得、その結果、タグとＳｐａポリペプチドとの間の認識配列の切断を生
じる（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるｐＥＴベクター）。[0078] In one example of isolating a Spa polypeptide, protein or peptide by recombinant methods, an isolated nucleic acid molecule encoding a Spa protein, polypeptide or peptide is deposited on a nickel-chelating matrix. Can be expressed as a histidine-tagged molecule, which allows for purification on histidine. Alternatively, other tags can be used. These tags include FLAG and GST. The bound tag is then removed in a final purification step, for example for certain vectors. His-tagged proteins can be incubated with thrombin, resulting in cleavage of the recognition sequence between the tag and the Spa polypeptide (eg, a pET vector by Invitrogen).

【００７９】 特定のベクター（例えば、ｐＵＣ）が、目的のヌクレオチド分子の複数のコピ
ーを産生するために使用され得、そして遺伝子操作技術（例えば、部位特異的変
異誘発）に有用であることが、当該分野で周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出
）を参照のこと。この開示の特定の目的は、発現ベクターである。発現ベクター
として、Ｓｐａポリペプチドをコードする単離された核酸分子に対して作動可能
に連結された転写プロモーター／エンハンサーエレメントが挙げられる。発現ベ
クターは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）、または
２つの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）のいずれかから構成され得
る。必要に応じて、発現ベクターは、ポリアデニル化配列、または１つ以上の制
限部位を含み得る。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに依
存して、他の遺伝的なエレメント（例えば、複製起点、さらなる核酸制限部位、
エンハンサー、転写の誘導性を付与する配列、および選択マーカーまたは同定マ
ーカーとしての使用に適切なタンパク質をコードする遺伝子）もまた、本明細書
中で記載される発現ベクター中に取りこまれ得る。Certain vectors (eg, pUC) can be used to produce multiple copies of a nucleotide molecule of interest, and are useful for genetic engineering techniques (eg, site-directed mutagenesis). It is well known in the art. See Sambrook (supra). A particular object of this disclosure is an expression vector. Expression vectors include a transcription promoter / enhancer element operably linked to the isolated nucleic acid molecule encoding the Spa polypeptide. An expression vector can be composed of either deoxyribonucleic acid ("DNA"), ribonucleic acid ("RNA"), or a combination of the two (e.g., a DNA-RNA chimera). Optionally, the expression vector may include a polyadenylation sequence, or one or more restriction sites. In addition, depending on the host cell selected and the vector used, other genetic elements (eg, origin of replication, additional nucleic acid restriction sites,
Enhancers, sequences that confer transcriptional inducibility, and genes encoding proteins suitable for use as selectable or identifying markers) can also be incorporated into the expression vectors described herein.

【００８０】 ｓｐａ遺伝子の操作および発現は、ｓｐａ遺伝子を発現し得る発現ベクターを
含有している宿主細胞を培養することによって達成され得る。このようなベクタ
ーまたはベクター構築物は、Ｓｐａポリペプチドをコードする、合成の、または
ｃＤＮＡに由来する核酸分子またはゲノムＤＮＡフラグメントのいずれかを含む
。これらは、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結されている
。発現ベクター中の適切な調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物
、昆虫、または植物の遺伝子を含む種々の供給源から誘導され得る。適切な調節
エレメントの選択は、選択される宿主細胞に依存し、そして本明細書を参照して
当業者によって容易に達成され得る。調節エレメントの例としては、転写プロモ
ーターおよびエンハンサー、またはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、転写ターミネ
ーター、ならびにリボソーム結合配列（転写開始シグナルを含む）が挙げられる
。Manipulation and expression of the spa gene can be accomplished by culturing host cells containing an expression vector capable of expressing the spa gene. Such vectors or vector constructs include either nucleic acid molecules or genomic DNA fragments encoding, synthetic or derived from cDNA, which encode the Spa polypeptide. These are operably linked to appropriate transcription or translation control elements. Suitable regulatory elements in the expression vector can be derived from a variety of sources, including bacterial, fungal, viral, mammalian, insect, or plant genes. Selection of the appropriate regulatory element depends on the host cell selected, and can be readily accomplished by one of ordinary skill in the art with reference to the specification. Examples of regulatory elements include transcription promoters and enhancers, or RNA polymerase binding sequences, transcription terminators, and ribosome binding sequences (including transcription initiation signals).

【００８１】 上記の、任意のＳｐａタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのいずれか
をコードする核酸分子は、広範な種々の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細
胞中で発現され得る。これらの細胞としては、細菌、哺乳動物、酵母、または他
の真菌、ウイルス、昆虫、および植物細胞が挙げられる。宿主細胞の選択もまた
、使用者の望みに依存して、遷移的に（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ）改変さ
れたＳｐａポリペプチドの産生を補助し得る。核酸を発現するようにこのような
細胞を形質転換またはトランスフェクトするための方法は、当該分野で周知であ
る（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号；Ｈｉｎｎｅ
ｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：１９２９−１９３３、１９７８；Ｍｕｒｒａｙ
ら、米国特許第４，８０１，５４２号；Ｕｐｓｈａｌｌら、米国特許第４，９３
５，３４９号；Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ａｘｅｌら、
米国特許第４，３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌら，米国特許第４，７６６，
０７５号；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと；
植物細胞については、ＣｚａｋｏおよびＭａｒｔｏｎ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．１０４：１０６７−１０７１、１９９４：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ．２４：３８７−３９２、１９９２を参照のこと）。[0081] Nucleic acid molecules encoding any of the Spa proteins, polypeptides, or peptides described above can be expressed in a wide variety of prokaryotic and eukaryotic host cells. These cells include bacterial, mammalian, yeast, or other fungal, viral, insect, and plant cells. The choice of host cell may also assist in the production of transitionally modified Spa polypeptides, depending on the wishes of the user. Methods for transforming or transfecting such cells to express nucleic acids are well known in the art (eg, Itakura et al., US Pat. No. 4,704,362; Hinne).
n et al., PNAS USA 75: 1929-1933, 1978; Murray
U.S. Patent No. 4,801,542; Upshall et al., U.S. Patent No. 4,933.
No. 5,349; Hagen et al., US Pat. No. 4,784,950; Axel et al.
U.S. Pat. No. 4,399,216; Goeddel et al., U.S. Pat.
No. 075; and Sambrook et al., Molecular Cloning.
: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring
See Harbor Laboratory Press, 1989;
For plant cells, see Czako and Martin, Plant Physi
ol. 104: 1067-1071, 1994: Paszkowski et al., Bi.
otech. 24: 387-392, 1992).

【００８２】 本発明を実行するために適切な細菌宿主細胞として、多数のＥ．ｃｏｌｉ株、
ならびに種々のＭ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖ
ｉｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
の株、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｔ
ｒｅｐｔｐｃｏｃｃｕｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種々の種
、ならびに当業者に周知の多くの他の細菌種が挙げられるが、これらに限定され
ない。Suitable bacterial host cells for practicing the present invention include numerous E. coli cells. coli strain,
As well as various M. leprae, M .; tuberculosis, M .; bov
is, B.I. subtilis, Salmonella typhimurium
Of the genus Pseudomonas, Streptomyces, St
Examples include, but are not limited to, various species of the genus reptpoccus and Staphylococcus, as well as many other bacterial species known to those of skill in the art.

【００８３】 細菌の発現ベクターは、好ましくは、プロモーター（宿主細胞中で機能する）
、１つ以上の選択可能な表現型のマーカー、および細菌の複製起点を含む。代表
的なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクト
ースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５、１９７８
）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９、１９９０）、λプロモーター（Ｅｌｖｉｎ
ら、Ｇｅｎｅ ８７：１２３−１２６、１９９０）、ｔｒｐプロモーター（Ｎｉ
ｃｈｏｌｓおよびＹａｎｏｆｓｋｙ，Ｍｅｔｈ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１０１：１５５、１９８３）、およびｔａｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、
Ｇｅｎｅ ２０：２３１、１９８２）が挙げられる。代表的な選択マーカーとし
ては、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子のような、種々の
抗生物質耐性マーカーが挙げられる。宿主細胞を形質転換するために適切な多く
のプラスミドが、当該分野で周知であり、これらとしては、とりわけ、ｐＢＲ３
２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２：９５、１９７７を参照のこと）、ｐＵ
ＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ、Ｍｅｔｈ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０−７７、１９８
３；ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８、１
９８２）、およびｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ならびにＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ
．）が挙げられる。実施例７に例示される本発明の１つの特定の実施形態におい
ては、Ｓｐａポリペプチドをコードする３４６ｂｐの単離された核酸は、ｐＣＲ
２．１−ＴＯＰＯベクター中に連結され、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現された。The bacterial expression vector is preferably a promoter (which functions in the host cell).
, One or more selectable phenotypic markers, and a bacterial origin of replication. Representative promoters include the β-lactamase (penicillinase) and lactose promoter systems (Chang et al., Nature 275: 615, 1978).
), T7 RNA polymerase promoter (Studier et al., Meth. E.).
nzymol. 185: 60-89, 1990), the λ promoter (Elvin).
Et al., Gene 87: 123-126, 1990), trp promoter (Ni
chols and Yanofsky, Meth in Enzymology
101: 155, 1983), and the tac promoter (Russell et al.,
Gene 20: 231, 1982). Representative selectable markers include various antibiotic resistance markers, such as the kanamycin resistance gene or the ampicillin resistance gene. Many plasmids suitable for transforming host cells are well known in the art, including, inter alia, pBR3
22 (see Bolivar et al., Gene 2:95, 1977), pU
C plasmids pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 (Mess
ing, Meth in Enzymology 101: 20-77, 198.
3: Vieira and Messing, Gene 19: 259-268, 1
982), and pNH8A, pNH16a, pNH18a, and Blue
script M13 (Stratagene, La Jolla, Calif
. ). In one particular embodiment of the invention, exemplified in Example 7, the 346 bp isolated nucleic acid encoding the Spa polypeptide comprises a pCR
2.1-TOPO vector. E. coli.

【００８４】 本発明の実行に適切な真菌の宿主細胞としては、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
、Ｐｉｃｈｉａ属またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、ならびに種々のＡｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種が挙げられる（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９
３５，３４９号）。酵母および真菌に適切な発現ベクターとしては、とりわけ、
酵母についてはＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ登録番号第３７４１９号）、ならびにａｍ
ｄＳクローニングベクターｐＶ３（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ７：１６９、１９８９）、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１０３５−１０３９、１９７８）、Ｙ
Ｅｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ ８：１２１−１３３、１９７９）、ｐＪ
ＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：１０４
−１０８、１９７８）、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。Suitable fungal host cells for the practice of the present invention include, among others, Saccharo
myces pombe, Saccharomyces cerevisiae
, Pichia or Kluyveromyces, and various Asp
ergillus species (McKnight et al., US Patent No. 4,9).
35, 349). Expression vectors suitable for yeast and fungi include, among others,
For yeast, YCp50 (ATCC Accession No. 37419), and am
dS cloning vector pV3 (Turnbull, Bio / Technol)
7: 169, 1989), YRp7 (Struhl et al., Proc. Na.
tl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), Y
Ep13 (Broach et al., Gene 8: 121-133, 1979), pJ
DB249 and pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104)
-108, 1978), and their derivatives.

【００８５】 酵母中での使用に好ましいプロモーターとして、酵母の糖分解遺伝子（Ｈｉｔ
ｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３−１２０８０、１
９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１：４１９−４３４、１９８２）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子
（Ｙｏｕｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら（
編）、３５５頁、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ
、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２−２１０、１９８３）に由来する
ベクターが挙げられる。真菌のベクターに有用なプロモーターの例としては、Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ糖分解遺伝子に由来するプロモーター
（例えば、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２
０９３−２０９９、１９８５）が挙げられる。発現ユニットはまた、転写ターミ
ネーターを含み得る。適切なターミネーターの例は、ａｄｈ３ターミネーター（
ＭｃＫｎｉｇｈｔら、同書、１９８５）である。As a preferred promoter for use in yeast, yeast glycolytic genes (Hit
zeman et al. Biol. Chem. 255: 12073-12080, 1
980; Albert and Kawasaki, J .; Mol. Appl. Gene
t. 1: 419-434, 1982) or the alcohol dehydrogenase gene (Young et al., Genetic Engineering of Micro).
organisms for Chemicals, Hollaender et al. (
Ed.), 355 pages, Plenum, New York, 1982; Ammerer
, Meth. Enzymol. 101: 192-210, 1983). Examples of useful promoters for fungal vectors include A
a promoter derived from the S. spargillus nidulans glycolytic gene (eg, the adh3 promoter (McKnight et al., EMBO J. 4: 2).
093-2099, 1985). The expression unit may also include a transcription terminator. An example of a suitable terminator is the adh3 terminator (
McKnight et al., Ibid., 1985).

【００８６】 細菌のベクターと同様に、酵母のベクターは一般的には、選択マーカーを含む
。これは、優性の表現型を示す任意の数の遺伝子のうちの１つであり得、それに
関して形質転換体が選択されることを可能にするための表現型のアッセイが存在
する。好ましい選択マーカーとしては、宿主細胞の栄養要求性を補完するもの、
抗生物質耐性を提供するもの、または細胞が特定の炭素源を利用することを可能
にするものが挙げられれ、そしてこれらとして、ｌｅｕ２（Ｂｒｏａｃｈら、同
書）、ｕｒａ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ ８：１７、１９７９）、また
はｈｉｓ３（Ｓｔｒｕｈｌら、同書）が挙げられる。別の適切な選択マーカーは
、ｃａｔ遺伝子である。これは、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与す
る。As with bacterial vectors, yeast vectors generally include a selectable marker. This can be one of any number of genes exhibiting a dominant phenotype, for which there are phenotypic assays to allow transformants to be selected. Preferred selectable markers include those that complement the auxotrophy of the host cell,
These include those that provide antibiotic resistance or that allow cells to utilize a particular carbon source, and include leu2 (Broach et al., Ibid.), Ura3 (Botstein et al., Gene 8:17, 1979), or his3 (Struhl et al., Ibid). Another suitable selectable marker is the cat gene. This confers chloramphenicol resistance on yeast cells.

【００８７】 真菌を形質転換するための技術は、文献において周知であり、そして例えば、
Ｂｅｇｇｓ（同書）、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ７５：１９２９−１９３３、１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１７４０−１７４７、１９８４
）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ ３０１：１６７−１６９、１９８３
）によって記載されている。宿主細胞の遺伝子型は、発現ベクター上に存在する
選択マーカーによって補完される遺伝的な欠損を含み得る。特定の宿主および選
択マーカーの選択は、本明細書を参照して、十分に当該分野の通常の技術レベル
内である。[0087] Techniques for transforming fungi are well known in the literature and include, for example,
Beggs (ibid.), Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
. ScL USA 75: 1929-1933, 1978), Yelton et al. (Proc.
. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1740-1747, 1984.
), And Russell (Nature 301: 167-169, 1983).
). The genotype of the host cell can include a genetic defect complemented by a selectable marker present on the expression vector. The choice of a particular host and selectable marker, with reference to this specification, is well within the level of ordinary skill in the art.

【００８８】 酵母の形質転換のためのプロトコールもまた、当業者に周知である。例えば、
形質転換は、ＤＮＡを有する酵母のスフェロプラストの調製（Ｈｉｎｎｅｎら、
ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７５：１９２９、１９７８を参照のこと）、またはＬｉＣｌ
のようなアルカリ塩での処理（Ｉｔｏｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １
５３：１６３、１９８３を参照のこと）のいずれかによって、容易に達成され得
る。真菌の形質転換もまた、Ｃｕｌｌｅｎら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
５：３６９、１９８７）によって記載されているように、ポリエチレングリコー
ルを使用して行われ得る。[0088] Protocols for yeast transformation are also well known to those skilled in the art. For example,
Transformation involves the preparation of yeast spheroplasts with DNA (Hinnen et al.,
PNAS USA 75: 1929, 1978), or LiCl
(Itoh et al., J. Bacteriology 1)
53: 163, 1983). Fungal transformation is also described in Cullen et al. (Bio / Technology).
5: 369, 1987), using polyethylene glycol.

【００８９】 ウイルスベクターとして、上記のようなＳｐａポリペプチドをコードする単離
された核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むものが挙げられる。広範な
種々のプロモーターが、本発明の状況において利用され得る。これらには、例え
ば、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、Ｆｒｉｅｎｄ ＭｕＬＶ ＬＴＲ、
アデノウイルスプロモーター（Ｏｈｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８１−
７８４，１９９４）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼプロモーター／エ
ンハンサー、後期パルボウイルスプロモーター（Ｋｏｅｒｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３、１９９４）、ヘルペスＴＫプロモ
ーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオネインＩＩａ遺伝子エンハンサー／
プロモーター、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター、およびサイトメガ
ロウイルス即時後期プロモーターのようなプロモーターが挙げられる。プロモー
ターはまた、組織特異的プロモーター（例えば、ＷＯ９１／０２８０５号；ＥＰ
０，４１５，７３１号；およびＷＯ９０／０７９３６号を参照のこと）であり
得る。上記のプロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター（例えば
、レトロウイルスプロモーター（上記プロモーターおよびＨＩＶプロモーターの
ような他のプロモーターを含む）、肝炎、ヘルペス（例えば、ＥＢＶ）、および
細菌、真菌、または寄生生物に特異的（例えば、マラリア特異的）なプロモータ
ーが、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物に感染する特異的な細胞または組
織を標的化するために利用され得る。[0093] Viral vectors include those that include a promoter that directs the expression of an isolated nucleic acid molecule encoding a Spa polypeptide as described above. A wide variety of promoters may be utilized in the context of the present invention. These include, for example, MoMLV LTR, RSV LTR, Friend MuLV LTR,
Adenovirus promoter (Ohno et al., Science 265: 781-
784, 1994), neomycin phosphotransferase promoter / enhancer, late parvovirus promoter (Koering et al., Hum. G.
ene Therap. 5: 457-463, 1994), herpes TK promoter, SV40 promoter, metallothionein IIa gene enhancer /
Promoters include the promoter, the cytomegalovirus immediate early promoter, and the cytomegalovirus immediate late promoter. Promoters also include tissue-specific promoters (eg, WO 91/02805; EP
0,415,731; and WO 90/07936). In addition to the above promoters, other virus-specific promoters (eg, retroviral promoters (including the above promoters and other promoters such as the HIV promoter), hepatitis, herpes (eg, EBV), and bacteria, fungi, or Parasite-specific (eg, malaria-specific) promoters can be utilized to target viruses, bacteria, fungi, or specific cells or tissues that infect the parasite.

【００９０】 従って、本発明のＳｐａポリペプチドは、以下を含む種々のウイルスベクター
から発現され得る：例えば、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５
，２８８，６４１号）、アデノウイルスベクター（例えば、ＷＯ９４／２６９１
４号、ＷＯ９３／９１９１号；Ｋｏｌｌｓら、ＰＮＡＳ ９１（１）：２１５−
２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、ＰＮＡＳ ９０（２４）：１１
４９８−５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８（
６）：２８３８−４８、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６
）：１２０２−１２０７、１９９３；Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ ７５（２）：
２０７−２１６、１９９３；Ｌｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（４）：
４０３−４０９、１９９３；Ｃａｉｌｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ．５（１０）：１２８７−１２９１、１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．
Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１３０−１３４、１９９３；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ．Ｇ
ｅｎｅｔ．１（５）：３７２−３７８、１９９２；およびＬｅｖｅｒｅｒｏら、
Ｇｅｎｅ １０１（２）：１９５−２０２、１９９１）、アデノ随伴ウイルスベ
クター（Ｆｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ ９０（２２）：１０６１３−１０６１７，
１９９３）、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター（Ｋｏｅｒｉ
ｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．５：４５７−４６３、１９９４）、
ポックスウイルスベクター（ＰａｎｉｃａｌｉおよびＰａｏｌｅｔｔｉ，ＰＮＡ
Ｓ ７９：４９２７−４９３１、１９８２；およびＯｚａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９３（２）：６５３−６６０、１９
９３）、ならびにレトロウイルス（例えば、ＥＰ ０，４１５，７３１号；ＷＯ
９０／０７９３６号；ＷＯ９１／０２８５号、ＷＯ９４／０３６２２号；ＷＯ９
３／２５６９８号；ＷＯ９３／２５２３４号；米国特許第５，２１９，７４０号
；ＷＯ９３／１１２３０号；ＷＯ９３／１０２１８号）。種々の実施形態におい
ては、ウイルスベクター自体、またはウイルスベクターを含有しているウイルス
粒子のいずれかが、以下に記載される方法および組成物において利用され得る。Thus, a Spa polypeptide of the present invention can be expressed from a variety of viral vectors, including: for example, herpes virus vectors (eg, US Pat.
, 288, 641), adenovirus vectors (for example, WO94 / 2691).
No. 4, WO 93/9191; Kolls et al., PNAS 91 (1): 215-
219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90 (24): 11.
498-502, 1993; Guzman et al., Circulation 88 (
6): 2838-48, 1993; Guzman et al., Cir. Res. 73 (6
): 1202-1207, 1993; Zabner et al., Cell 75 (2):
207-216, 1993; Li et al., Hum Gene Ther. 4 (4):
403-409, 1993; Caillaud et al., Eur. J. Neurosc
i. 5 (10): 1287-1291, 1993; Vincent et al., Nat.
Genet. 5 (2): 130-134, 1993; Jaffe et al., Nat. G
enet. 1 (5): 372-378, 1992; and Leverero et al.,
Gene 101 (2): 195-202, 1991), adeno-associated virus vector (Flotte et al., PNAS 90 (22): 10613-10617,
1993), baculovirus vector, parvovirus vector (Koeri)
ng et al., Hum. Gene Therap. 5: 457-463, 1994),
Poxvirus vectors (Panicali and Paoletti, PNA)
S 79: 4927-4931, 1982; and Ozaki et al., Bioche.
m. Biophys. Res. Comm. 193 (2): 653-660, 19
93), as well as retroviruses (eg, EP 0,415,731; WO
No. 90/07936; WO91 / 0285, WO94 / 03622; WO9
WO 93/25234; U.S. Patent No. 5,219,740; WO 93/11230; WO 93/10218). In various embodiments, either the viral vector itself or viral particles containing the viral vector can be utilized in the methods and compositions described below.

【００９１】 本発明を実行するために適切な哺乳動物細胞として、中でも以下が挙げられる
：ＰＣ１２（ＡＴＣＣ登録番号第ＣＲＬ１７２１号）、Ｎ１Ｅ−１１５神経芽細
胞種、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ神経芽細胞種、ＳＨＳＹ５アドレナリン作動性神
経芽細胞種、ＮＳ２０ＹおよびＮＧ１０８−１５マウスのコリン作動性の細胞株
、またはラットＦ２脊椎神経節株、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ登録番号第ＣＲＬ
１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ登録番号第ＣＲＬ６２
８１；ＢＨＫ ５７０細胞株（登録番号第ＣＲＬ １０３１４号の下でアメリカ
ンタイプカルチャーコレクションに寄託された））、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ登録番号
第ＣＣＬ ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ登録番号第ＣＣＬ ２）、２９
３（ＡＴＣＣ登録番号第１５７３；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．
３６：５９−７２、１９７７），およびＮＳ−１細胞。以下を含む他の哺乳動物
細胞株が、本発明において使用され得る：Ｒａｔ ＨｅｐＩ（ＡＴＣＣ登録番号
第ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ ＨｅｐＩＩ（ＡＴＣＣ登録番号第ＣＲＬ １５
４８）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ登録番号第ＣＣＬ １３９）、ヒトの肺（ＡＴＣＣ
登録番号第ＣＣＬ ７５．１）、ヒトの肝ガン（ＡＴＣＣ登録番号第ＨＴＢ−５
２）、Ｈｅｐ Ｇ２（ＡＴＣＣ登録番号第ＨＢ８０６５）、マウスの肝臓（ＡＴ
ＣＣ登録番号第ＣＣＬ ２９．１）、ＮＣＴＣ １４６９（ＡＴＣＣ登録番号第
ＣＣＬ ９．１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ登録番号第１５８１）、Ｈ
ＩＴ−Ｔ１５（ＡＴＣＣ登録番号第ＣＲＬ １７７７）、およびＲＩＮｍ ５Ａ
ＨＴ２Ｂ（ＯｒｓｋｏｖおよびＮｉｅｌｓｏｎ，ＦＥＢＳ ２２９（１）：１７
５−１７８、１９８８）。Suitable mammalian cells for practicing the present invention include, among others: PC12 (ATCC Accession No. CRL1721), N1E-115 neuroblastoma, SK-N-BE (2) C A neuroblastoma cell line, a SHSY5 adrenergic neuroblastoma cell line, a cholinergic cell line of NS20Y and NG108-15 mice, or a rat F2 vertebral ganglion cell line, COS (for example, ATCC Accession No. CRL.
1650 or 1651), BHK (eg, ATCC registration number CRL62).
81; BHK 570 cell line (deposited with the American Type Culture Collection under accession number CRL 10314), CHO (ATCC accession number CCL 61), HeLa (eg, ATCC accession number CCL 2), 29.
3 (ATCC accession number 1573; Graham et al., J. Gen. Virol.
36: 59-72, 1977), and NS-1 cells. Other mammalian cell lines can be used in the present invention, including: Rat HepI (ATCC Accession No. CRL 1600), Rat HepII (ATCC Accession No. CRL15).
48), TCKM (ATCC accession number CCL 139), human lung (ATCC
Accession number CCL 75.1), human liver cancer (ATCC accession number HTB-5)
2), Hep G2 (ATCC accession number HB8065), mouse liver (AT
CC registration number CCL 29.1), NCTC 1469 (ATCC registration number CCL 9.1), SP2 / 0-Ag14 (ATCC registration number 1581), H
IT-T15 (ATCC registration number CRL 1777), and RINm 5A
HT2B (Orskov and Nielson, FEBS 229 (1): 17
5-178, 1988).

【００９２】 本発明の実行における使用のための哺乳動物発現ベクターとして、クローン化
された遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指向し得るプロモーターが挙げられる。好
ましいプロモーターとして、ウイルスプロモーターおよび細胞性のプロモーター
が挙げられる。ウイルスプロモーターとして、サイトメガロウイルス即時初期プ
ロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０、１９８５）
、サイトメガロウイルス即時後期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂ
ｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４、１９８１
）、ＭＭＴＶ ＬＴＲ、ＲＳＶ ＬＴＲ、メタロチオネイン−１、アデノウイル
スＥ１ａが挙げられる。細胞性のプロモーターとして、マウスのメタロチオネイ
ン−１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４，５７９，８２１号）
、アクチンプロモーター、マウスのＶ_Hプロモーター（Ｂｅｒｇｍａｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７０４１−７０４５、１９
８３；Ｇｒａｎｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５４９６、１９８
７）およびマウスのＶ_Hプロモーター（Ｌｏｈら、Ｃｅｌｌ ３３：８５−９３
、１９８３）が挙げられる。プロモーターの選択は、少なくとも一部、所望され
る発現のレベル、またはトランスフェクトされるレシピエント細胞株に依存する
。[0092] Mammalian expression vectors for use in practicing the present invention include promoters that can direct the transcription of a cloned gene or cDNA. Preferred promoters include viral promoters and cellular promoters. As the viral promoter, the cytomegalovirus immediate-early promoter (Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1985)
, Cytomegalovirus immediate late promoter, SV40 promoter (Sub
Ramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864, 1981.
), MMTV LTR, RSV LTR, metallothionein-1, adenovirus E1a. Mouse cellular metallothionein-1 promoter (Palmiter et al., US Pat. No. 4,579,821) as a cellular promoter
, Actin promoter, mouse _VH promoter (Bergman et al., Pr.
oc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7041-7045, 19
83; Grant et al., Nucl. Acids Res. 15: 5496, 198
7) and the mouse _VH promoter (Loh et al., Cell 33: 85-93).
, 1983). The choice of promoter will depend, at least in part, on the level of expression desired or on the recipient cell line to be transfected.

【００９３】 このような発現ベクターはまた、プロモーター下流および目的のペプチドもし
くはタンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に配置された、一連のＲＮＡスプ
ライシング部位を含み得る。好ましいＲＮＡスプライシング部位は、アデノウイ
ルスおよび／またはイムノグロブリン遺伝子から得られ得る。目的のコード配列
の下流に配置されたポリアデニル化シグナルもまた、発現ベクター中に含まれる
。適切なポリアデニル化シグナルとして、ＳＶ４０に由来する初期または後期ポ
リアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ，同書）、アデノウイ
ルス５ Ｅ１Ｂ領域に由来するポリアデニル化シグナル、およびヒト成長ホルモ
ン遺伝子のターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９
：３７１９−３７３０、１９８１）が挙げられる。発現ベクターは、アデノウイ
ルス２三成分リーダーのような、プロモーターとＲＮＡスプライシング部位との
間に配置された、非コードウイルスリーダー配列を含み得る。好ましいベクター
はまた、ＳＶ４０エンハンサーのようなエンハンサー配列を含み得る。発現ベク
ターはまた、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする配列を含み得る。適切な
発現ベクターは、商業的な供給源（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）から入手し得る。[0093] Such expression vectors may also include a series of RNA splicing sites located downstream of the promoter and upstream of the DNA sequence encoding the peptide or protein of interest. Preferred RNA splicing sites can be obtained from adenovirus and / or immunoglobulin genes. A polyadenylation signal located downstream of the coding sequence of interest is also included in the expression vector. Suitable polyadenylation signals include early or late polyadenylation signals from SV40 (Kaufman and Sharp, ibid.), Polyadenylation signals from the adenovirus 5E1B region, and terminators of the human growth hormone gene (DeNoto et al., Nuc. Acids Res.
: 3719-3730, 1981). The expression vector may include a non-coding viral leader sequence, such as an adenovirus 2 ternary leader, located between the promoter and the RNA splicing site. Preferred vectors may also include an enhancer sequence, such as the SV40 enhancer. The expression vector can also include a sequence encoding adenovirus VA RNA. Suitable expression vectors are available from commercial sources (eg, Stratagene, La Jo
lla, Calif. ).

【００９４】 単離されたｓｐａ遺伝子を含有するベクター構築物は、例えば、以下によって
、培養された哺乳動物細胞中に導入され得る：リン酸カルシウムによって媒介さ
れるトランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １４：７２５、１９７
８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ
，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６，１９７３）、エレクトロポレーション（Ｎ
ｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５、１９８２）、またはＤＥ
ＡＥ−デキストランによって媒介されるトランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，ＮＹ、
１９８７）。一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。クローン
化されたＤＮＡを安定に組み込んだ細胞を同定するためには、一般的には、選択
マーカーが、目的の遺伝子またはｃＤＮＡとともに細胞に投入される。培養され
た哺乳動物細胞中での使用に好ましい選択マーカーとして、ネオマイシン、ハイ
グロマイシン、およびメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与する遺
伝子が挙げられる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。好ま
しい増幅可能な選択マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子
である。選択マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙによって概説されている（Ｍａｍｍａｌ
ｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＭＡ）。The vector construct containing the isolated spa gene can be introduced into cultured mammalian cells, for example, by: transfection mediated by calcium phosphate (Wigler et al., Cell 14: 725, 197).
8; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Gen
etics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb.
, Virology 52: 456,1973), electroporation (N
eumann et al., EMBO J .; 1: 841-845, 1982), or DE
Transfection mediated by AE-dextran (Ausubel
Et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley and Sons, Inc. , NY,
1987). See generally, Sambrook et al., Supra. To identify cells that have stably integrated the cloned DNA, a selectable marker is generally introduced into the cells along with the gene or cDNA of interest. Preferred selectable markers for use in cultured mammalian cells include genes that confer resistance to drugs such as neomycin, hygromycin, and methotrexate. The selectable marker can be an amplifiable selectable marker. Preferred amplifiable selectable markers are the DHFR gene and the neomycin resistance gene. Selectable markers have been reviewed by Tilly (Mammal
ian Cell Technology, Butterworth Publ
ishers, Stoneham, MA).

【００９５】 適切なベクターを含有している哺乳動物細胞は、一定の期間、代表的には、１
〜２日間、目的のＤＮＡ配列の発現を開始させるために、増殖させられる。次い
で、薬物の選択が、安定な様式で選択マーカーを発現する細胞の増殖を選択する
ために適用される。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクトされている細胞
については、薬物の濃度は、クローン化された配列の増大したコピー数について
選択するために、段階的な様式で増大させられ得、それによって、発現レベルが
増大させられ得る。導入された配列を発現する細胞は、所望の形態または所望の
レベルでの、目的のタンパク質の産生について選択され、そしてスクリーニング
される。次いで、これらの基準を満たす細胞がクローン化され得、そして産生の
ためにスケールアップされ得る。[0095] Mammalian cells containing the appropriate vector can be used for a period of time, typically
It is grown for ~ 2 days to initiate expression of the DNA sequence of interest. Drug selection is then applied to select for proliferation of cells expressing the selectable marker in a stable manner. For cells that have been transfected with an amplifiable selectable marker, the concentration of drug can be increased in a step-wise fashion to select for increased copy number of the cloned sequence, thereby increasing expression. The level can be increased. Cells expressing the introduced sequence are selected and screened for production of the protein of interest, in the desired form or at the desired level. Cells that meet these criteria can then be cloned and scaled up for production.

【００９６】 当該分野で公知の多数の昆虫宿主細胞もまた、本明細書を参照して本発明にお
いて有用であり得る。例えば、昆虫細胞中で異種ＤＮＡ配列を発現するためのベ
クターとしてのバキュロウイルスの使用が、Ａｔｋｉｎｓｏｎら（Ｐｅｓｔｉｃ
．Ｓｃｉ．２８：２１５−２２４、１９９０）によって概説されている。[0096] Many insect host cells known in the art may also be useful in the present invention with reference to the specification. For example, the use of baculovirus as a vector to express heterologous DNA sequences in insect cells has been described by Atkinson et al.
. Sci. 28: 215-224, 1990).

【００９７】 当該分野で公知の多数の植物宿主細胞もまた、本明細書を参照して本発明にお
いて有用であり得る。例えば、植物細胞中で遺伝子を発現させるためのベクター
としてのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｓの使用が、Ｓｉｎｋ
ａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８、１９８
７によって概説されている。A number of plant host cells known in the art may also be useful in the present invention with reference to the present specification. For example, the use of Agrobacterium rhizogens as a vector to express genes in plant cells has been described by Sink.
ar et al. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 198.
7 outlined.

【００９８】 宿主細胞中でのＳｐａポリペプチドまたはそのフラグメントの発現の際には、
そのポリペプチドまたはペプチドは、本明細書中で上記に議論されている方法の
ような方法を利用して、宿主細胞からあらかじめ分離され得、そして／または単
離され得る。Upon expression of a Spa polypeptide or a fragment thereof in a host cell,
The polypeptide or peptide can be previously separated from the host cell and / or isolated using a method such as the methods discussed herein above.

【００９９】 上記のように、Ｓｐａポリペプチドを発現することが所望される宿主細胞に依
存して、そのポリペプチドをコードする単離された核酸が、宿主細胞中で活性な
プロモーターを含有している発現ベクター中に導入される。転写されるが、翻訳
されない、コード領域の末端の配列のような、発現ユニットの他の成分もまた、
利用される特定の宿主に従って選択され得る。いくつかの場合には、高いレベル
の発現を確実にするために、介在配列を人工的に導入することが必要とされ得る
。発現は、発現レベルが十分に高い場合には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび染色によ
ってモニターされ得る。さらに、タンパク質がタグを伴って産生される場合には
、抗−タグ抗体による検出が行われ得、そしてタグを伴わずに産生される場合に
は、宿主の相同タンパク質を認識しない抗−Ｓｐａ抗体による検出が、使用され
得る。さらに、タンパク質の同定のための当該分野で公知の任意の方法が、この
目的のために利用され得る（例えば、高分解能の電気泳動法、または２Ｄ電気泳
動）。As described above, depending on the host cell in which it is desired to express the Spa polypeptide, the isolated nucleic acid encoding the polypeptide contains a promoter that is active in the host cell. Into an expression vector. Other components of the expression unit, such as sequences at the ends of the coding region that are transcribed but not translated, are also
The choice can be made according to the particular host utilized. In some cases, it may be necessary to artificially introduce intervening sequences to ensure high levels of expression. Expression can be monitored by SDS-PAGE and staining if expression levels are high enough. In addition, if the protein is produced with a tag, detection by an anti-tag antibody can be performed, and if produced without a tag, an anti-Spa antibody that does not recognize the homologous protein of the host Can be used. In addition, any method known in the art for protein identification can be utilized for this purpose (eg, high resolution electrophoresis, or 2D electrophoresis).

【０１００】 （ＩＩＩ．抗体） 別の局面においては、本発明のタンパク質は、Ｓｐａポリペプチド上に存在す
るエピトープに特異的に結合する抗体を調製するために利用される。従って、本
発明はまた、このような抗体を提供する。好ましい実施形態においては、抗体は
、Ｓｐａポリペプチド上に存在する特異的なオプソニン作用性のエピトープに結
合する。代表的な実施形態においては、抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種
のＭタンパク質上に存在するエピトープには結合しない。本発明の状況において
は、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗−イディオ
タイプ抗体、Ｆ（ａｂ’）₂およびＦａｂフラグメントのようなそれらのフラグ
メント、ならびに組換えによってまたは合成によって産生された抗体を含む。こ
のような抗体は、モノクローナル抗体が特異的に結合することを可能にする可変
領域を取りこむ。これは、本発明のｓｐａ遺伝子から産生されるペプチドに対し
て選択的に結合し得る抗体を意味する。モノクローナル抗体または抗体の親和性
は、当業者によって容易に決定され得る（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２、１９４９を参照のこと）。(III. Antibodies) In another aspect, the proteins of the present invention are used to prepare antibodies that specifically bind to an epitope present on a Spa polypeptide. Therefore, the present invention also provides such an antibody. In a preferred embodiment, the antibody binds to a specific opsonizing epitope present on the Spa polypeptide. In an exemplary embodiment, the antibody does not bind to an epitope present on the Streptococcus sp. M protein. In the context of the present invention, the term "antibody" is produced by polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, anti-idiotype antibodies, their fragments such as F (ab ') ₂ and Fab fragments, and recombinantly or synthetically. Antibodies. Such antibodies incorporate a variable region that allows the monoclonal antibody to specifically bind. This means an antibody that can selectively bind to a peptide produced from the spa gene of the present invention. The affinity of a monoclonal antibody or antibody can be readily determined by one of skill in the art (Scatchard, Ann. NY).
. Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).

【０１０１】 ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、シチメ
ンチョウ、ウサギ、マウス、またはラットのような種々の温血動物から、当業者
によって容易に生成され得る。簡潔には、所望されるタンパク質またはペプチド
は、腹腔内、筋肉内、眼球内、または皮下注射を通じて動物を免疫するために利
用される。目的のタンパク質またはペプチドの免疫原性は、フロイント完全アジ
ュバントまたはフロイント不完全アジュバントのようなアジュバントの使用を通
じて増大させられ得る。数回の追加免疫の後、少量の血清サンプルが収集され、
そして所望のタンパク質またはペプチドに対する反応性について試験される。[0101] Polyclonal antibodies can be readily produced by those skilled in the art from a variety of warm-blooded animals, such as horses, cows, goats, sheep, dogs, chickens, turkeys, rabbits, mice, or rats. Briefly, the desired protein or peptide is utilized to immunize the animal via intraperitoneal, intramuscular, intraocular, or subcutaneous injection. The immunogenicity of a protein or peptide of interest can be increased through the use of an adjuvant, such as Freund's complete adjuvant or Freund's incomplete adjuvant. After several boosts, a small serum sample was collected,
It is then tested for reactivity to the desired protein or peptide.

【０１０２】 特定の好ましいポリクローナル抗血清は、少なくともバックグラウンドよりも
３倍大きいシグナルを生じる。一旦、これらの動物の力価が、タンパク質に対す
るその反応性に関してプラトーに達すると、より多い量のポリクローナル抗血清
は、毎週放血させるか、または動物から全血を採るかのいずれかによって、容易
に得られ得る。Certain preferred polyclonal antisera produce a signal that is at least three times greater than background. Once the titer of these animals reaches a plateau with respect to its reactivity to proteins, larger amounts of polyclonal antiserum are readily released by either exsanguinating weekly or taking whole blood from the animals. Can be obtained.

【０１０３】 モノクローナル抗体はまた、周知の技術を使用して容易に生成され得る（米国
特許第ＲＥ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３
９号、および同第４，４１１，９９３号を参照のこと；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｎ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏ
ｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎおよびＢｅｃｈｔｏｌ（編）、１９８０、
およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａ
ｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８をもまた参照のこと）。簡潔には、１
つの実施形態においては、ラットまたはマウスのような被験動物は、所望のタン
パク質またはペプチドを用いて注射される。所望される場合は、種々の技術が、
より大きな抗体反応性を生じるように、タンパク質によって生成される得られる
免疫応答を増大させるために利用され得る。例えば、所望のタンパク質またはペ
プチドは、オボアルブミンもしくはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ
）のような別のキャリアタンパク質に対してカップリングされ得るか、またはフ
ロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバントのようなアジ
ュバントの使用を通じてカップリングさせられ得る。[0103] Monoclonal antibodies can also be readily produced using well known techniques (US Pat. Nos. RE32,011, 4,902,614, 4,543,43).
No. 9 and 4,411,993; Monoclonan.
Antibodies, Hybridomas: A New Dimension
n in Biological Analyses, Plenum Pres
s, Kennett, McKearn and Bechtol (eds), 1980.
And Antibodies: A Laboratory Manual, Ha
rrow and Lane (ed.), Cold Spring Harbor La
(See also, Laboratory Press, 1988). Briefly, 1
In one embodiment, a subject, such as a rat or mouse, is injected with the desired protein or peptide. If desired, various techniques may be used.
It can be utilized to increase the resulting immune response generated by the protein, resulting in greater antibody reactivity. For example, the desired protein or peptide may be ovalbumin or keyhole limpet hemocyanin (KLH
), Or through the use of an adjuvant, such as Freund's complete or incomplete Freund's adjuvant.

【０１０４】 本発明はまた、Ｓｐａポリペプチドの一部を含有している融合ポリペプチドま
たはタンパク質を提供する。融合タンパク質は、別のポリペプチドの供給源に由
来する２つ以上の触媒機能を組み合わせること、およびエピトープに対して抗体
を惹起することを含む、いくつかの目的のために有用である。エピトープに対し
て抗体を惹起するためには、融合タンパク質は、代表的には、エピトープに対す
る免疫応答を増強するタンパク質に対して融合された、少なくとも８個、１０個
、１５個、または２０個のアミノ酸のＳｐａのペプチドエピトープを含む。この
目的のための典型的なタンパク質は、ＫＬＨである。従って、本発明の別の局面
は、第２のポリペプチドセグメントに対してインフレームで融合された、Ｓｐａ
ポリペプチドまたは上記の改変体の少なくとも８個の連続しているアミノ酸から
なる第１のＳｐａポリペプチドセグメントを含む、天然には存在しない融合タン
パク質を提供する。より好ましい実施形態は、少なくとも１０個、１５個、また
は２０個のアミノ酸のＳｐａポリペプチドセグメントを含む。第２のポリペプチ
ドセグメントは、必要に応じて、第１のセグメントに対して天然には隣接してい
ないＳｐａポリペプチドの別の部分を含み得るか、またはＳｐａではないポリペ
プチドに由来する配列を含み得る。上記の融合タンパク質をコードする核酸およ
びベクター、ならびにそれらを含有している宿主細胞もまた、提供される。[0104] The present invention also provides fusion polypeptides or proteins containing a portion of a Spa polypeptide. Fusion proteins are useful for several purposes, including combining two or more catalytic functions from another polypeptide source, and raising antibodies against the epitope. In order to raise antibodies to the epitope, the fusion protein typically comprises at least 8, 10, 15, or 20 fused to a protein that enhances the immune response to the epitope. Includes the amino acid Spa peptide epitope. A typical protein for this purpose is KLH. Thus, another aspect of the present invention is a method for fusion of a Spa polypeptide fused in frame to a second polypeptide segment.
There is provided a non-naturally occurring fusion protein comprising a first Spa polypeptide segment consisting of at least 8 contiguous amino acids of a polypeptide or variant of the above. More preferred embodiments include a Spa polypeptide segment of at least 10, 15, or 20 amino acids. The second polypeptide segment can optionally include another portion of a Spa polypeptide that is not naturally adjacent to the first segment, or can comprise a sequence derived from a non-Spa polypeptide. May be included. Also provided are nucleic acids and vectors encoding the above fusion proteins, and host cells containing them.

【０１０５】 キャリアタンパク質、融合タンパク質、またはリンカーの使用は、抗体が、オ
プドニン作用性のエピトープを保有しているペプチド抗原に対して惹起される場
合に、特に有利である。キャリアタンパク質に対するカップリングの一例が、実
施例５に示される。ここでは、ＳｐａポリペプチドのＮ末端を含む合成の２３ア
ミノ酸のペプチドが、ペプチド中に含まれるオプソニン作用性のエピトープに対
する抗体を産生するように、ＫＬＨに連結された。他の適切なキャリアタンパク
質として、破傷風毒素、ジフテリア毒素、ウシ血清アルブミン、雌鳥の卵のリゾ
チーム、ゼラチン、ウシγグロブリン、コレラ毒素のＢサブユニット、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ不安定毒素のＢサブユニット、およびフラジェリンポリマーが挙げられるが
、これらに限定されない。代表的には、キャリアタンパク質に対するＳｐａエピ
トープの連結は、通常は、少なくとも２アミノ酸の長さのリンカーアミノ酸配列
を通して、ペプチドのインフレームでの融合を含む。より代表的には、リンカー
は、７から３５アミノ酸であり、そして最も代表的には、約７から１５アミノ酸
である。ここで、２から７個のリンカーアミノ酸は、疎水性アミノ酸である。免
疫応答の最初の誘発は、好ましくは、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、経口、または皮
下の経路を通してであり得る。The use of carrier proteins, fusion proteins or linkers is particularly advantageous when the antibodies are raised against a peptide antigen bearing an opdoninergic epitope. An example of coupling to a carrier protein is shown in Example 5. Here, a synthetic 23 amino acid peptide containing the N-terminus of the Spa polypeptide was linked to KLH to produce an antibody against an opsonizing epitope contained in the peptide. Other suitable carrier proteins include tetanus toxin, diphtheria toxin, bovine serum albumin, hen egg lysozyme, gelatin, bovine gamma globulin, the B subunit of cholera toxin, E. coli. co
The B subunit of the li labile toxin, and the flagellin polymer include, but are not limited to. Typically, linking a Spa epitope to a carrier protein involves fusion of the peptide in frame, usually through a linker amino acid sequence at least 2 amino acids in length. More typically, the linker is between 7 and 35 amino acids, and most typically between about 7 and 15 amino acids. Here, 2 to 7 linker amino acids are hydrophobic amino acids. Initial elicitation of an immune response can preferably be through the intraperitoneal, intramuscular, intranasal, oral, or subcutaneous route.

【０１０６】 最初の免疫の後の１から３週間の間で、動物は再度免疫され得る。次いで、そ
の動物は、試験採血され得、そして上記のようなアッセイを使用して所望の抗原
に対する結合について血清が試験され得る。さらなる免疫がまた、動物が、所望
のタンパク質またはペプチドに対するその反応性においてプラトーに達するまで
達成され得る。次いで、その動物は、所望のタンパク質またはペプチドの最終的
な追加投与を受け得、そして３から４日後に屠殺され得る。この時点で、脾臓お
よびリンパ節が収集され得、そして器官をメッシュスクリーンを通過させるか、
または細胞を被っている脾臓もしくはリンパ節の膜を破壊することによって、単
細胞の懸濁物に破壊され得る。１つの実施形態においては、続いて赤血球が、低
張性の溶液の添加によって溶解させられ、続いてすぐに等張液に戻される。[0106] Between one and three weeks after the initial immunization, the animals can be immunized again. The animals can then be test bleeded and the sera tested for binding to the desired antigen using an assay as described above. Additional immunity can also be achieved until the animal reaches a plateau in its reactivity to the desired protein or peptide. The animal can then receive a final boost of the desired protein or peptide and can be sacrificed three to four days later. At this point, the spleen and lymph nodes can be collected and the organs can be passed through a mesh screen or
Alternatively, they can be broken down into single cell suspensions by disrupting the membrane of the spleen or lymph nodes overlying the cells. In one embodiment, the red blood cells are subsequently lysed by the addition of a hypotonic solution, and then immediately returned to the isotonic solution.

【０１０７】 別の実施形態においては、モノクローナル抗体を調製するために適切な細胞が
、インビトロでの免疫化技術の使用を通じて得られる。簡潔には、動物は屠殺さ
れ、そして上記のように、脾臓およびリンパ節細胞が除去される。単細胞の懸濁
物が調製され、そして細胞が、上記のような免疫応答を生成するために適切な目
的のタンパク質またはペプチドの形態を含有している培養物中に入れられる。続
いて、リンパ球が収集され、そして上記のように融合される。[0107] In another embodiment, cells suitable for preparing monoclonal antibodies are obtained through the use of in vitro immunization techniques. Briefly, animals are sacrificed and spleen and lymph node cells are removed as described above. A single cell suspension is prepared, and the cells are placed in a culture containing a form of the protein or peptide of interest appropriate to generate an immune response as described above. Subsequently, the lymphocytes are collected and fused as described above.

【０１０８】 上記のようにインビトロでの免疫化の使用を通して、または免疫した動物から
得られる細胞は、エプスタインバー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（Ｅ
ＢＶ）のようなウイルスでの感染によって不死化され得る。（Ｇｌａｓｋｙおよ
びＲｅａｄｉｎｇ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ８（４）：３７７−３８９、１９８９
を参照のこと）。あるいは、好ましい実施形態においては、収集した脾臓および
／またはリンパ節の細胞懸濁物は、モノクローナル抗体を分泌する「ハイブリド
ーマ」を作成するために、適切な骨髄腫細胞と融合される。適切な骨髄腫細胞株
は、好ましくは、抗体の構築物または発現において欠損しており、そしてさらに
、免疫した動物に由来する細胞と同系である。多くのこのような骨髄腫細胞株が
、当該分野で周知であり、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ
Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ＆ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、第６版、ＡＴＣＣ、１９
８８を参照のこと）のような供給源から得られ得る。代表的な骨髄腫株として、
以下が挙げられる：ヒトについては、ＵＣ７２９−６（ＡＴＣＣ登録番号第ＣＲ
Ｌ８０６１）、ＭＣ／ＣＡＲ−Ｚ２（ＡＴＣＣ登録番号第ＣＲＬ８１４７）、お
よびＳＫＯ−００７（ＡＴＣＣ登録番号第ＣＲＬ８０３３）；マウスについては
、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ登録番号第ＣＲＬ１５８１）およびＰ３Ｘ６
３Ａｇ８（ＡＴＣＣ登録番号第ＴＩＢ９）；およびラットについては、Ｙ３−Ａ
ｇ１．２．３（ＡＴＣＣ登録番号第１６３１）、およびＹＢ２／０（ＡＴＣＣ登
録番号第ＣＲＬ１６６２）。特に好ましい融合株として、ＮＳ−１（ＡＴＣＣ登
録番号第ＴＩＢ１８）およびＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ登録番号第
ＣＲＬ１５８０）が挙げられる。これらは、マウス、ラット、またはヒトの細胞
株のいずれかとの融合に利用され得る。骨髄腫細胞株と免疫した動物に由来する
細胞との間での融合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ
、前出を参照のこと）またはエレクトロフュージョンの使用を含む種々の方法に
よって達成され得る（ＺｉｍｍｅｒｍａｎおよびＶｉｅｎｋｅｎ，Ｊ．Ｍｅｍｂ
ｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．６７：１６５−１８２、１９８２を参照のこと）。Cells obtained through the use of in vitro immunization, as described above, or from immunized animals, were obtained from Epstein-Barr virus (E).
BV) can be immortalized by infection with a virus such as BV). (Glasky and Reading, Hybridoma 8 (4): 377-389, 1989.
checking). Alternatively, in a preferred embodiment, the harvested cell suspension of spleen and / or lymph nodes is fused with appropriate myeloma cells to create "hybridomas" that secrete monoclonal antibodies. Suitable myeloma cell lines are preferably deficient in antibody construction or expression, and are further syngeneic with cells from the immunized animal. Many such myeloma cell lines are well known in the art and are available from the American Type Culture Collection (A
TCC), Rockville, Maryland (Catalogue of
Cell Lines & Hybridomas, 6th edition, ATCC, 19
88 (see No. 88). As typical myeloma strains,
The following may be mentioned: For humans, UC729-6 (ATCC Accession No. CR
L8061), MC / CAR-Z2 (ATCC Accession No. CRL8147), and SKO-007 (ATCC Accession No. CRL8033); SP2 / 0-Ag14 (ATCC Accession No. CRL1581) and P3X6 for mice.
3Ag8 (ATCC accession number TIB9); and for rats, Y3-A
g1.2.3 (ATCC registration number 1631), and YB2 / 0 (ATCC registration number CRL1662). Particularly preferred fusions include NS-1 (ATCC Accession No. TIB18) and P3X63-Ag8.653 (ATCC Accession No. CRL1580). These can be utilized for fusion with any of the mouse, rat, or human cell lines. Fusion between a myeloma cell line and cells from an immunized animal was performed using polyethylene glycol (PEG) (Antibody).
es: A Laboratory Manual, Harlow and Lane
, Supra) or by a variety of methods, including the use of electrofusion (Zimmerman and Viennaen, J. Memb).
lane Biol. 67: 165-182, 1982).

【０１０９】 融合後、細胞は、適切な培地（例えば、ＲＰＭＩ １６４０またはＤＭＥＭ（
ダルベッコ改変イーグル培地、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ
，Ｋａｎ．））を含有する培養プレート中にプレートされる。培地はまた、ウシ
胎児血清（ＦＢＳ、例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ、またはＪ
ＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによる）、胸腺細胞（免疫するために使用された
種と同じ種の乳児の動物から収集された）、または培地を固化させるための寒天
のような、さらなる成分を含有し得る。さらに、培地は、融合させられた脾臓お
よび骨髄腫細胞の増殖を選択的に可能にする試薬を含むべきである。ＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）の使用が、特に好ましい。約７
日後に、得られた融合細胞またはハイブリドーマが、所望される抗原を認識する
抗体の存在を決定するためにスクリーニングされ得る。いくつかのクローンの稀
釈および再アッセイの後、目的のタンパク質に結合する抗体を産生するハイブリ
ドーマが単離され得る。After the fusion, the cells are placed in a suitable medium (eg, RPMI 1640 or DMEM (
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, JRH Biosciences, Lenexa
, Kan. )). The medium may also contain fetal bovine serum (FBS, such as Hyclone, Logan, Utah, or J
Additional components may be included, such as RH Biosciences, thymocytes (collected from infant animals of the same species as the species used to immunize), or agar for solidifying the medium. In addition, the medium should contain reagents that selectively allow the growth of the fused spleen and myeloma cells. HAT medium (hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) (Sigma Chem)
ical Co. , St. Louis, Mo. ) Is particularly preferred. About 7
After a day, the resulting fusion cells or hybridomas can be screened to determine the presence of antibodies that recognize the desired antigen. After dilution and reassay of some clones, hybridomas producing antibodies that bind to the protein of interest can be isolated.

【０１１０】 他の技術もまた、モノクローナル抗体を構築するために利用され得る（Ｈｕｓ
ｅら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅ
ｐｅｒｔｏｒｉｅ ｉｎ Ｐｈａｒｇｅ Ｌａｍｂｄａ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
６：１２７５−１２８１、１９８９を参照のこと；Ｓａｓｔｒｙら、「Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ
ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｃｏ
ｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ
Ｒｅｇｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ」Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５７２８−５７３２、１９８９をも
また参照のこと；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｓｓら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｒａｐｉｄ Ａ
ｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１−９、１９９０をもまた参
照のこと；これらの参考文献は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能な市販のシステムを記載している。これは、組
換え技術を通じての抗体の産生を可能にする。簡潔には、ｍＲＮＡは、Ｂ細胞の
集団から単離され、そしてλＩＭＭＵＮＯＺＡＰ（Ｈ）およびλＩＭＭＵＮＯＺ
ＡＰ（Ｌ）ベクター中の重鎖および軽鎖イムノグロブリンｃＤＮＡ発現ライブラ
リーを作成するために利用される。これらのベクターは、Ｆａｂフラグメントま
たは抗体を形成するために、個別にスクリーニングされ得るか、または同時に発
現させられ得る（Ｈｕｓｅら、（前出）を参照のこと；Ｓａｓｔｒｙら（前出）
をもまた参照のこと）。続いて、ポジティブなプラークが、Ｅ．ｃｏｌｉに由来
するモノクローナル抗体フラグメントの高レベルの発現を可能にする非溶解性の
プラスミドに転換され得る。[0110] Other techniques may also be utilized to construct monoclonal antibodies (Hus
e, et al., "Generation of a Large Combination.
nal Library of the Immunoglobulin Re
pertorie in Charge Lambda "Science 24
6: 1275-1281, 1989; Sastry et al., "Clon.
ing of the Immunological Repertoire
in Escherichia coli for Generation o
f Monoclonal Catalytic Antibodies: Co
Nstruction of a Heavy Chain Variable
Region-Specific cDNA Library "Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 86: 5728-5732, 1989; Alting-Mess et al., Monoclonal Ant.
ibody Expression Libraries: A Rapid A
alternative to Hybridomas "Strategies
See also Molecular Biology 3: 1-9, 1990; these references can be found in Stratagene, La Jolla, C
describes a commercially available system available from Alifornia. This allows for the production of antibodies through recombinant technology. Briefly, mRNA was isolated from a population of B cells and λIMMUNOZAP (H) and λIMMUNOZ
Used to generate heavy and light chain immunoglobulin cDNA expression libraries in the AP (L) vector. These vectors can be individually screened or co-expressed to form Fab fragments or antibodies (see Huse et al., Supra; Sastry et al., Supra).
See also). Subsequently, positive plaques were found in E. coli. E. coli can be converted to a non-lytic plasmid which allows for high level expression of monoclonal antibody fragments from E. coli.

【０１１１】 同様に、抗体はまた、特異的に結合する抗体をコードする遺伝子の可変領域を
取り込むように、組換えＤＮＡ技術を利用して構築され得る。これらの抗体の構
築は、本明細書中に提供される開示を与える当該分野の当業者によって容易に達
成され得る。（Ｌａｒｒｉｃｋら、「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｍｉｘｅｄ Ｐｒｉｍｅｒｓ：Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏ
ｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ
Ｒｅｇｉｏｎ Ｇｅｎｅ Ｆｒｏｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃ
ｅｌｌｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４−９３８、１９８９；Ｒｉ
ｅｃｈｍａｎｎら「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７，１９８８；
Ｒｏｂｅｒｔｓら「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗ
ｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔ
ｙ ｆｏｒ ｉｔｓ Ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１−７３４、１９８７；Ｖｅｒｈｏｅｙ
ｅｎら、「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｇｒａｆ
ｔｉｎｇ ａｎ Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３９：１５３４−１５３６、１９８８；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、「Ａ Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ
Ｔｗｏ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｆｕｓｅｄ
ｔｏ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｅｘｏｔｏｘｉｎ」Ｎａｔｕｒｅ ３３９：
３９４−３９７、１９８９を参照のこと；「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ」の表題の米国特許第５，１３２，４
０５号をもまた参照のこと）。簡潔には、１つの実施形態においては、目的の特
異的抗原結合ドメインの所望のタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡセ
グメントが、特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマか
ら増幅され、そしてヒトの抗体を産生する細胞のゲノム中に直接挿入される。（
Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、（前出）を参照のこと；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（前出）
をもまた参照のこと）。この技術は、特異的に結合するマウスまたはラットのモ
ノクローナル抗体の抗原結合部位が、ヒトの抗体中に導入されることを可能にす
る。このような抗体は、これらが、ラットまたはマウスの抗体と同程度に抗原性
ではないので、ヒトにおける治療的な使用に好ましい。Similarly, antibodies can also be constructed utilizing recombinant DNA technology to incorporate the variable regions of the gene encoding the specifically binding antibody. Construction of these antibodies can be readily accomplished by one of ordinary skill in the art given the disclosure provided herein. (Larrick et al., "Polymerase Chain Re
action Using Mixed Primers: Cloning o
f Human Monoclonal Antibody Variable
Region Gene From Single Hybridoma C
ells "Biotechnology 7: 934-938, 1989; Ri.
echmann et al., "Reshaping Human Antibodies.
for Therapy "Nature 332: 323-327, 1988;
Roberts et al. "Generation of an Antibody w
is Enhanced Affinity and Specificity
y for it's Antigen by Protein Engineer
Ring "Nature 328: 731-734, 1987; Verhoey.
en et al., "Reshaping Human Antibodies: Graf.
ting an Antisozyme Activity "Science
e 239: 1534-1536, 1988; Chaudhary et al., "AR
ecobinant Immunotoxin Consisting of
Two Antibody Variable Domains Fused
to Pseudomonas Exotoxin "Nature 339:
394-397, 1989; "Biosynthetic Ant".
U.S. Patent No. 5,132,4, titled "Ibody Binding Sites."
See also No. 05). Briefly, in one embodiment, a DNA segment encoding a desired protein or peptide of a specific antigen-binding domain of interest is amplified from a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds and a human antibody Is inserted directly into the genome of the cell that produces (
See Verhoeyen et al., Supra; Reichmann et al., Supra.
See also). This technique allows the antigen-binding site of a mouse or rat monoclonal antibody to specifically bind to be introduced into a human antibody. Such antibodies are preferred for therapeutic use in humans because they are not as antigenic as rat or mouse antibodies.

【０１１２】 別の実施形態においては、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マに由来する可変領域をコードする遺伝子が、可変領域についてのオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用して増幅される。これらのプライマーは、当業者によっ
て合成され得るか、または商業的に利用可能な供給源から購入され得る。例えば
、マウスおよびヒトの可変領域についてのプライマー（中でも、Ｖ_Ha領域、Ｖ_Hb 領域、Ｖ_Hc領域、Ｖ_Hd領域、Ｖ_Hl領域、Ｖ_L領域、およびＣ_L領域についてのプラ
イマーを含む）が、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）
から入手可能である。これらのプライマーは、重鎖または軽鎖の可変領域を増幅
するために利用され得る。次いで、これらは、それぞれ、ＩＭＭＵＮＯＺＡＰ（
登録商標）（Ｈ）またはＩＭＭＵＮＯＺＡＰ（登録商標）（Ｌ）（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）のようなベクター中に挿入され得る。これらのベクターは、次いで、
発現のためにＥ．ｃｏｌｉ中に導入され得る。これらの技術を利用して、Ｖ_Hド
メインおよびＶ_Lドメインの融合物を含有している大量の単鎖のポリペプチドが
産生され得る（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、１９８
８を参照のこと）。In another embodiment, the gene encoding the variable region from the hybridoma producing the monoclonal antibody of interest is amplified using oligonucleotide primers for the variable region. These primers can be synthesized by one of skill in the art or purchased from commercially available sources. For example, primers for mouse and human variable regions (including primers for V _Ha , V _Hb , V _Hc , V _Hd , V _Hl , V _L , and C _L regions, among others) Stratagene (La Jolla, Calif.)
Available from These primers can be utilized to amplify the heavy or light chain variable region. These are then, respectively, IMMUNOZAP (
(Registered trademark) (H) or IMMUNOZAP (registered trademark) (L) (Strata
gene). These vectors are then
E. coli for expression. coli. Using these techniques, large amounts of single-chain polypeptides containing fusions of _VH and _VL domains can be produced (Bird et al., Science 242: 423-426, 198).
8).

【０１１３】 モノクローナル抗体および他の抗体が、組織培養物、細菌、真核生物細胞、植
物、および当該分野で公知の他の宿主系を含む、多数の宿主系中で産生され得る
。[0113] Monoclonal and other antibodies can be produced in a number of host systems, including tissue culture, bacteria, eukaryotic cells, plants, and other host systems known in the art.

【０１１４】 一旦、適切な抗体が得られると、これらは、当業者に周知の多くの技術によっ
て単離され得るかまたは精製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｌ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前出）を参照のこと
）。適切な技術として、ペプチドもしくはタンパク質のアフィニティーカラム、
ＨＰＬＣ、またはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム上
での精製、あるいはこれらの技術の任意の組み合わせが挙げられる。本発明の状
況においては、抗体を定義するために使用される場合は、用語「単離された」は
、「他の血液成分を実質的に含まないこと」を意味する。Once suitable antibodies are obtained, they can be isolated or purified by a number of techniques well known to those skilled in the art (Antibodies: A Labol).
atrial Manual, Harlow and Lane (supra)). Suitable techniques include peptide or protein affinity columns,
HPLC, or RP-HPLC, purification on a protein A or protein G column, or any combination of these techniques. In the context of the present invention, when used to define an antibody, the term "isolated" means "substantially free of other blood components".

【０１１５】 本発明の抗体は、多くの用途を有する。例えば、抗体は、このようなタンパク
質を保有している細胞を同定するためのフローサイトメトリーにおいて利用され
得る。簡潔には、細胞上の目的のタンパク質またはペプチドを検出するために、
細胞は、目的のタンパク質に特異的に結合する標識されたモノクローナル抗体と
ともにインキュベートされ、続いて、結合した抗体の存在が検出される。本発明
での使用に適切な標識は、当該分野で周知であり、中でも以下を含む：フルオレ
セインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびコロイド金。ＦＩＴＣは、フローサイト
メトリーでの使用に特に好ましい。これは、「Ｃｏｎｊｕｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｔｏ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ．Ｉ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８：８６５−７３
、１９７０」におけるＫｅｌｔｋａｍｐの方法に従って精製された抗体に対して
結合させられ得る。（Ｋｅｌｔｋａｍｐ、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｔｏ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ．ＩＩ．Ａ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ」Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ １８：８７５−８８１、１９７０；Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ
：Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３：２１５−２２６、１９７０をも
また参照のこと）。抗体はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉに対して薬物を標的
化するため、これらの細菌による感染を診断するため、またはそれによって引き
起こされる感染を処置するために、使用され得る。The antibodies of the present invention have many uses. For example, antibodies can be utilized in flow cytometry to identify cells harboring such proteins. Briefly, to detect a protein or peptide of interest on cells,
The cells are incubated with a labeled monoclonal antibody that specifically binds to the protein of interest, and subsequently the presence of the bound antibody is detected. Labels suitable for use in the present invention are well known in the art and include among others: fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), horseradish peroxidase (HRP), and colloidal gold. FITC is particularly preferred for use in flow cytometry. This is the "Conjugation of
Fluorescein Isothiocyanate to Antibo
dies. I. Experiments on the Conditions
of Conjugation "Immunology 18: 865-73
, 1970 ", to the purified antibody according to the method of Keltkamp. (Keltkamp, "Conjugation of F
fluorescein Isothiocyanate to Antibod
ies. II. A Reproducible Method "Immunol
Gody, "Conjugat. 18: 875-881, 1970;
ion of Antibodies with Fluorochromes
: Modification to the Standard Method
s "J. Immuno. Methods 13: 215-226, 1970). Antibodies can also be used to target drugs to Streptococci, diagnose infections by these bacteria, or treat infections caused thereby.

【０１１６】 （ＩＶ．Ｓｐａヌクレオチド配列の診断適用） 核酸分子は、生物学的サンプル中でのｓｐａ遺伝子の発現を検出するために使
用され得る。このようなプローブ分子として、配列番号１もしくは配列番号４の
ヌクレオチド配列、またはそのフラグメントを含む二本鎖の核酸分子、ならびに
配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオチド配列、またはそのフラグメントの
相補物を有する１本鎖の核酸分子が挙げられる。プローブ分子は、ＲＮＡ、ＲＮ
Ａ、オリゴヌクレオチドなどであり得る。IV. Diagnostic Applications of Spa Nucleotide Sequences Nucleic acid molecules can be used to detect expression of the spa gene in a biological sample. Such probe molecules have a double-stranded nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4, or a fragment thereof, and the complement of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4, or a fragment thereof. Single-stranded nucleic acid molecules are included. Probe molecules are RNA, RN
A, oligonucleotides and the like.

【０１１７】 好ましいプローブは、他のＳｔｒｅｔｏｃｏｃｃａｌタンパク質中の匹敵する
領域に対して低い配列類似性を有するｓｐａ遺伝子の領域と結合する。例えば、
適切なプローブは、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも一部に結合する
。本明細書中で使用される場合は、用語「一部」は、少なくとも８個以上のヌク
レオチドをいう。Preferred probes bind to regions of the spa gene that have low sequence similarity to comparable regions in other Stretococcal proteins. For example,
Suitable probes bind to at least a portion of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. As used herein, the term "portion" refers to at least eight or more nucleotides.

【０１１８】 基本的なアッセイにおいては、一本鎖のプローブ分子が、プローブと標的のＳ
ｐａ ＲＮＡ種との間での塩基対合を促進する温度およびイオン強度の条件下で
、（生物学的なサンプルから単離された）ＲＮＡとともにインキュベートされる
。ハイブリダイズした分子から結合していないプローブを分離した後、ハイブリ
ッドの量が検出される。In a basic assay, a single-stranded probe molecule comprises a probe and a target S
It is incubated with RNA (isolated from a biological sample) under conditions of temperature and ionic strength that promote base pairing with the pa RNA species. After separating unbound probe from the hybridized molecule, the amount of hybrid is detected.

【０１１９】 ＲＮＡの検出の十分に確立されたハイブリダイゼーション方法として、ノーザ
ン分析およびドット／スロットブロットハイブリダイゼーションが挙げられる（
例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）、４−１から４−２７頁、およびＷｕら（
編）「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈ
ｅ ＲＮＡ Ｌｅｖｅｌ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ、２２５−２３９頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）を
参照のこと）。核酸プローブは、³²Ｐまたは³⁵Ｓのような放射性核種で検出可能
に標識され得る。あるいは、Ｓｐａ ＲＮＡは、非放射性のハイブリダイゼーシ
ョン方法を用いて検出され得る（例えば、Ｉｓａａｃ（編）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｎｏｎｒａ
ｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９
９３）を参照のこと）。代表的には、非放射性の検出は、色素生成性または化学
発光性の基質の酵素による転換によって達成される。例示的な非放射性部分とし
て、ビオチン、フルオレセイン、およびジゴキシゲニンが挙げられる。[0119] Well-established hybridization methods for the detection of RNA include Northern analysis and dot / slot blot hybridization (
See, for example, Ausubel (1995), 4-1 to 4-27, and Wu et al.
Ed.) "Analysis of Gene Expression at at th
e RNA Level ", Methods in Gene Biotech
nology, see pages 225-239 (CRC Press, Inc. 1997)). Nucleic acid probes can be detectably labeled with a radionuclide such as ³² P or ³⁵ S. Alternatively, Spa RNA can be detected using non-radioactive hybridization methods (eg, Isaac (Ed.), Protocol)
s for Nucleic Acid Analysis by Nonra
bioactive Probes (Humana Press, Inc. 19)
93)). Typically, non-radioactive detection is achieved by enzymatic conversion of a chromogenic or chemiluminescent substrate. Exemplary non-radioactive moieties include biotin, fluorescein, and digoxigenin.

【０１２０】 多数の診断手順は、検出方法の感度を増大させるためにポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を利用する。ＰＣＲを行うための標準的な技術が、周知である（一般
的には、Ｍａｔｈｅｗ（編）、Ｐｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１
）、Ｗｈｉｔｅ（編）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．１９９３）、Ｃｏｔｔｅｒ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．１９９６）、
ＨａｎａｕｓｅｋおよびＷａｌａｓｚｅｋ（編）、Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）、Ｌｏ（
編）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＣＲ（Ｈｕｍａ
ｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）、ならびにＭｅｌｔｚｅｒ（編）、ＰＣ
Ｒ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１
９９８）を参照のこと）。[0120] Many diagnostic procedures utilize the polymerase chain reaction (PCR) to increase the sensitivity of the detection method. Standard techniques for performing PCR are well known (in general, Mathew (ed.), Pottocols in Human Mole).
Culular Genetics (Humana Press, Inc. 1991)
), White (ed.), PCR Protocols: Current Met
hods and Applications (Humana Press, I
nc. 1993), Cotter (eds.), Molecular Diagnostics
is of Cancer (Humana Press. Inc. 1996),
Hanausek and Walaszek (eds.), Tumor Marker
Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (
Ed.), Clinical Applications of PCR (Huma)
na Press, Inc. 1998), and Meltzer (eds.), PC
R in Bioanalysis (Humana Press, Inc. (1
998)).

【０１２１】 好ましくは、ＰＣＲプライマーは、他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌタンパク
質に対して低い配列類似性を有するｓｐａ遺伝子の一部を増幅するように設計さ
れる。例として、配列番号６および配列番号７のヌクレオチド配列を有するプラ
イマーが、いくつかのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓからｓｐａ遺伝子を増幅する
ために適切である。さらに、適切なプライマーとして、配列番号２または配列番
号５の免疫原性のエピトープをコードするｓｐａ遺伝子の一部を増幅するように
設計されたプライマーが挙げられる。[0121] Preferably, the PCR primers are designed to amplify a portion of the spa gene that has low sequence similarity to other Streptococcal proteins. By way of example, primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 are suitable for amplifying the spa gene from some Streptococcus. In addition, suitable primers include primers designed to amplify a portion of the spa gene encoding an immunogenic epitope of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5.

【０１２２】 診断アッセイについてのＰＣＲの１つのバリエーションは、逆転写酵素−ＰＣ
Ｒ（ＲＴ−ＰＣＲ）である。ＲＴ−ＰＣＲは、前立腺ガンの患者の転移部位に対
する前立腺ガン細胞の播種を検出するために使用されている（Ｍｏｒｅｎｏら、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：６１１０、１９９２；Ｖｅｓｓｅｌｌａら、Ｐｒ
ｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．３３：２３６７、１９９２；Ｏｌｓ
ｓｏｎら、Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉ
ｃａ ２４：３６７（１９９７）；Ｒｏｂｂｉｎｓ，国際公開番号第ＷＯ９７／
３９１３９号）。ＲＴ−ＰＣＲ技術においては、ＲＮＡが、生物学的サンプルか
ら単離され、ｃＤＮＡに逆転写され、そしてｃＤＮＡがＳｐａプライマーととも
にインキュベートされる（例えば、Ｗｕら（編）、「Ｒａｐｉｄ Ｉｓｏｌａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ ｏｒ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＰＣＲ
」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５−２
８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）を参照のこと）。次いで、ＰＣ
Ｒが行われ、そして産物が、標準的な技術を使用して分析される。One variation of PCR for diagnostic assays is the reverse transcriptase-PC
R (RT-PCR). RT-PCR has been used to detect the dissemination of prostate cancer cells to metastatic sites in prostate cancer patients (Moreno et al.,
Cancer Res. 52: 6110, 1992; Vessella et al., Pr.
oc. Am. Assoc. Can. Res. 33: 2367, 1992; Ols.
Son et al., Urologic Clinics of North Ameri.
ca 24: 367 (1997); Robbins, International Publication No. WO 97 /.
39139). In the RT-PCR technique, RNA is isolated from a biological sample, reverse transcribed into cDNA, and the cDNA is incubated with Spa primers (see, eg, Wu et al. (Eds.), "Rapid Isolat").
ion of Specific cDNA or Genes by PCR
", Methods in Gene Biotechnology, 15-2
8 (CRC Press, Inc. 1997)). Then PC
R is performed and the products are analyzed using standard techniques.

【０１２３】 簡潔には、生物学的サンプルは、ＲＮＡ調製のためのサンプルから得られる。
試験材料が種々の生物学的材料を含む場合は、サンプルは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙ
ｐａｑｕｅ密度勾配上に重層され得、そして生物学的材料のうちのいくつかを分
離するために遠心分離され得る。In brief, a biological sample is obtained from a sample for RNA preparation.
If the test material comprises various biological materials, the sample may be Ficoll-Hy
It can be overlaid on a paque density gradient and centrifuged to separate some of the biological material.

【０１２４】 次いで、ＲＮＡは、例えば、上記のようなグアニジニウム（ｇｕｎａｄｉｎｉ
ｕｍ）−チオシアネート細胞溶解手順を使用して、サンプルから単離され得る。
あるいは、固相技術が、細胞溶解物からｍＲＮＡを単離するために使用され得る
。逆転写反応は、ランダムなオリゴヌクレオチド、ｄＴの短いホモポリマー、ま
たはＳｐａアンチセンスオリゴマーを使用して単離されたＲＮＡでプライムされ
得る。オリゴ−ｄＴプライマーは、コントロール標的配列を提供し得る種々のｍ
ＲＮＡヌクレオチド配列が増幅されるという利点を付与する。Ｓｐａ配列は、代
表的には２０塩基の長さの２つの隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを使用
するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。The RNA is then, for example, guanidinium as described above.
um) -thiocyanate cell lysis procedure.
Alternatively, solid-phase techniques can be used to isolate mRNA from cell lysates. Reverse transcription reactions can be primed with RNA isolated using random oligonucleotides, short homopolymers of dT, or Spa antisense oligomers. Oligo-dT primers provide various m-types that can provide a control target sequence.
Provides the advantage that the RNA nucleotide sequence is amplified. The Spa sequence is amplified by the polymerase chain reaction using two adjacent oligonucleotide primers, typically 20 bases in length.

【０１２５】 ＰＣＲ増幅産物は、種々のアプローチを使用して検出され得る。例えば、ＰＡ
Ｒ産物は、ゲル電気泳動によって分画され得、そしてエチジウムブロマイド染色
によって可視化され得る。あるいは、分画されたＰＣＲ産物は、メンブレンに移
され得、検出可能に標識されたＳｐａプローブとハイブリダイズさせられ得、そ
してオートラジオグラフィーによって試験され得る。さらに別のアプローチは、
化学発光の検出、およびＣ−ＴＲＡＫ比色アッセイを提供するような、ジゴキシ
ゲニンで標識されたデオキシリボ核酸三リン酸の使用を含む。[0125] PCR amplification products can be detected using various approaches. For example, PA
The R product can be fractionated by gel electrophoresis and visualized by ethidium bromide staining. Alternatively, the fractionated PCR products can be transferred to a membrane, hybridized with a detectably labeled Spa probe, and tested by autoradiography. Yet another approach is:
Including the use of digoxigenin-labeled deoxyribonucleic acid triphosphate to provide chemiluminescence detection and a C-TRAK colorimetric assay.

【０１２６】 Ｓｐａの発現の検出のための別のアプローチは、環化プローブ技術（ＣＰＴ）
である。ここでは、一本鎖のＤＮＡ標的が過剰のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ
プローブと結合して複合体を形成し、ＲＮＡ部分がＲＮＡａｓｅＨによって切断
され、そして切断されたキメラプローブの存在が検出される（例えば、Ｂｅｇｇ
ｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：２９８５、１９９６、Ｂｅｋ
ｋａｏｕｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０：２４０、１９９６）を参照
のこと）。Ｓｐａ配列の検出のための別の方法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡ
ＳＢＡ）、交差ハイブリダイゼーションによる鋳型の共作動性の増幅（ＣＡＴＣ
Ｈ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のようなアプローチを利用し得る（例
えば、Ｍａｒｓｈａｌｌら、米国特許第５，６８６，２７２号（１９９７）、Ｄ
ｙｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６０：１６１、１９９６、Ｅｈｒ
ｉｃｈｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３：３５８、１９９７、および
Ｃｈａｄｗｉｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０：５９、１９９８
を参照のこと）。他の標準的な方法が、当業者に公知である。Another approach for the detection of Spa expression is the cyclization probe technology (CPT).
It is. Here, a single-stranded DNA target binds to the excess DNA-RNA-DNA chimeric probe to form a complex, the RNA portion is cleaved by RNAaseH, and the presence of the cleaved chimeric probe is detected ( For example, Begg
s et al. Clin. Microbiol. 34: 2985, 1996, Bek
Kaoui et al., Biotechniques 20: 240, 1996). Another method for detection of Spa sequences is nucleic acid sequence-based amplification (NA
SBA), template co-operative amplification by cross-hybridization (CATC
H), and approaches such as the ligase chain reaction (LCR) (eg, Marshall et al., US Patent No. 5,686,272 (1997), D
yer et al. Virol. Methods 60: 161, 1996, Ehr
Icht et al., Eur. J. Biochem. 243: 358, 1997, and Chadwick et al. Virol. Methods 70:59, 1998.
checking). Other standard methods are known to those skilled in the art.

【０１２７】 種々のさらなる診断アプローチが、当業者に周知である（例えば、Ｍａｔｈｅ
ｗ（編）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１）、Ｃｏｌｅｍａ
ｎおよびＴｓｏｎｇａｌｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（
Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６）およびＥｌｌｅｓ，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｈ
ｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９６）を参照のこと）。A variety of additional diagnostic approaches are well known to those of skill in the art (eg, Mathhe
w (ed.), Protocols in Human Molecular Ge
netics (Humana Press, Inc. 1991), Colema
n and Tsongalis, Molecular Diagnostics (
Humana Press, Inc. 1996) and Elles, Molec.
ultra Diagnostics of Genetic Diseases (H
umana Press, Inc. , 1996)).

【０１２８】 本発明は、ｓｐａ遺伝子の発現についての診断アッセイを行うためのキットを
また意図する。このようなキットは、配列番号１もしくは配列番号４のヌクレオ
チド配列、またはそれらのフラグメント、あるいは配列番号２、配列番号３、も
しくは配列番号５によるペプチド、またはそれらのフラグメントをコードする核
酸の一部を含有している核酸プローブを含む。プローブ分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ
，オリゴヌクレオチドなどであり得る。キットは、ＰＣＲを行うための核酸プラ
イマーを含み得る。The present invention also contemplates kits for performing a diagnostic assay for expression of the spa gene. Such a kit comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4, or a fragment thereof, or a peptide according to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 5, or a portion of a nucleic acid encoding a fragment thereof. Contains nucleic acid probes. Probe molecules are DNA, RNA
, Oligonucleotides and the like. The kit may include nucleic acid primers for performing the PCR.

【０１２９】 好ましくは、このようなキットは、上記の核酸の診断アッセイを行うために必
要な全てのエレメントを含む。キットは、１つ以上の容器を含む。ここで、１つ
の容器は、Ｓｐａプローブまたはプライマーを含有し、そして第２の容器は、Ｓ
ｐａ配列の存在を示すことが可能な１つ以上の試薬を含有している。このような
指示薬の例として、放射性標識、蛍光色素、化学発光試剤などのような、検出可
能な標識が挙げられる。キットはまた、このようなＳｐａプローブおよびプライ
マーの、ｓｐａ遺伝子の発現の検出のための用途を記載している記載された物質
を含む。記載された物質は、容器に直接適用され得るか、記載された物質が、パ
ッケージに挿入される形態で提供され得る。Preferably, such a kit contains all the necessary elements to perform a nucleic acid diagnostic assay as described above. The kit includes one or more containers. Here, one container contains the Spa probe or primer and the second container contains the Spa probe or primer.
It contains one or more reagents capable of indicating the presence of the pa sequence. Examples of such indicators include detectable labels, such as radioactive labels, fluorescent dyes, chemiluminescent agents, and the like. The kit also includes the described materials that describe the use of such Spa probes and primers for the detection of expression of the spa gene. The described substances can be applied directly to the container, or the described substances can be provided in a form that is inserted into a package.

【０１３０】 （Ｖ．抗Ｓｐａ抗体の診断適用） 本発明はさらに、Ｓｐａの存在についてインビトロで生物学的サンプルをスク
リーニングするための抗Ｓｐａ抗体の使用を意図する。インビトロでのアッセイ
の１つの型においては、抗Ｓｐａ抗体が、液相中で使用される。例えば、生物学
的サンプル中のＳｐａの存在は、生物学的サンプルと、微量の標識されたＳｐａ
と抗Ｓｐａ抗体とを、Ｓｐａとその抗体との間の結合を促進する条件下で混合す
ることによって試験され得る。サンプル中のＳｐａと抗Ｓｐａとの複合体は、複
合体を、抗体（例えば、Ｆｃ抗体またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテイ
ンＡ）と結合する固定化されたタンパク質と接触させることによって反応混合物
から分離され得る。生物学的サンプル中のＳｐａの濃度は、抗体に結合した標識
されたＳｐａの量に対して逆に比例し、そして遊離の標識されたＳｐａの量に直
接関連する。V. Diagnostic Applications of Anti-Spa Antibodies The present invention further contemplates the use of anti-Spa antibodies to screen biological samples in vitro for the presence of Spa. In one type of in vitro assay, anti-Spa antibodies are used in the liquid phase. For example, the presence of Spa in a biological sample can be attributed to the biological sample and trace amounts of labeled Spa.
And an anti-Spa antibody can be tested by mixing under conditions that promote the binding between Spa and the antibody. The complex of Spa and anti-Spa in the sample can be separated from the reaction mixture by contacting the complex with an immobilized protein that binds to an antibody (eg, Fc antibody or Staphylococcus protein A). The concentration of Spa in a biological sample is inversely proportional to the amount of labeled Spa bound to the antibody, and is directly related to the amount of free labeled Spa.

【０１３１】 あるいは、インビトロでのアッセイが、行われ得る。ここでは、抗Ｓｐａ抗体
が固相キャリアに結合させられる。例えば、抗体は、ポリマーでコーティングさ
れたビーズ、プレート、またはチューブのような不溶性の支持体に対して抗体を
連結させるために、ポリマー（例えば、アミノデキストラン）に対して付着させ
られ得る。他の適切なインビトロでのアッセイが、当業者に容易に明らかである
。Alternatively, an in vitro assay may be performed. Here, an anti-Spa antibody is bound to a solid phase carrier. For example, the antibody can be attached to a polymer (eg, aminodextran) to link the antibody to an insoluble support, such as beads, plates, or tubes coated with the polymer. Other suitable in vitro assays will be readily apparent to one skilled in the art.

【０１３２】 免疫化学的な検出は、抗Ｓｐａ抗体と生物学的サンプルとを接触させること、
次いで、抗体に結合する検出可能に標識された分子と生物学的サンプルとを接触
させることによって、行われ得る。例えば、検出可能に標識された分子は、抗Ｓ
ｐａ抗体に結合する抗体部分を含み得る。あるいは、抗Ｓｐａ抗体は、アビジン
／ストレプトアビジン（またはビオチン）と結合させられ得、そして検出可能に
標識された分子は、ビオチン（またはアビジン／ストレプトアビジン）を含み得
る。この基本的な技術の多数のバリエーションが、当業者に周知である。The immunochemical detection comprises contacting the anti-Spa antibody with a biological sample,
This can then be done by contacting the biological sample with a detectably labeled molecule that binds to the antibody. For example, a detectably labeled molecule can be an anti-S
It may include an antibody portion that binds to the pa antibody. Alternatively, the anti-Spa antibody can be conjugated to avidin / streptavidin (or biotin) and the detectably labeled molecule can include biotin (or avidin / streptavidin). Many variations on this basic technique are well known to those skilled in the art.

【０１３３】 あるいは、抗Ｓｐａ抗体は、抗Ｓｐａ免疫結合体を形成するように、検出可能
な標識と結合体化させられ得る。適切な検出可能な標識として、例えば、放射性
同位元素、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生体発光標識、またはコロイド
金が挙げられる。このような検出可能に標識された免疫結合体を作製しそして検
出するための方法は、当業者に周知であり、そして以下にさらに詳細に記載され
る。Alternatively, an anti-Spa antibody can be conjugated to a detectable label to form an anti-Spa immunoconjugate. Suitable detectable labels include, for example, radioisotopes, fluorescent labels, chemiluminescent labels, enzyme labels, bioluminescent labels, or colloidal gold. Methods for making and detecting such detectably labeled immunoconjugates are well known to those of skill in the art and are described in further detail below.

【０１３４】 検出可能な標識は、オートラジオグラフィーによって検出される放射性同位元
素であり得る。本発明の目的に特に有用な同位元素は、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵
Ｓ、および¹⁴Ｃである。The detectable label can be a radioisotope detected by autoradiography. Particularly useful isotopes for the purposes of the present invention are ³ H, ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ³⁵
S, and ¹⁴ C.

【０１３５】 抗Ｓｐａ免疫結合体もまた、蛍光化合物で標識され得る。蛍光によって標識さ
れた抗体の存在は、適切な波長の光に免疫結合体を曝すこと、および得られる蛍
光を検出することによって決定される。蛍光標識化合物として、フルオレセイン
イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフ
ィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンが挙げられる。[0135] Anti-Spa immunoconjugates can also be labeled with a fluorescent compound. The presence of the fluorescently labeled antibody is determined by exposing the immunoconjugate to light of the appropriate wavelength and detecting the resulting fluorescence. Fluorescent labeling compounds include fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde, and fluorescamine.

【０１３６】 あるいは、抗Ｓｐａ免疫結合体は、化学発光化合物に対して抗体成分をカップ
シングすることによって検出可能に標識され得る。化学発光物質でタグ化された
免疫結合体の存在は、化学反応の経過の間に増大する発光の存在を検出すること
によって決定される。化学発光標識化合物の例として、ルミノール、イソルミノ
ール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および
シュウ酸エステルが挙げられる。Alternatively, the anti-Spa immunoconjugate can be detectably labeled by coupling the antibody component to a chemiluminescent compound. The presence of an immunoconjugate tagged with a chemiluminescent substance is determined by detecting the presence of increased luminescence during the course of the chemical reaction. Examples of chemiluminescent labeling compounds include luminol, isoluminol, aromatic acridinium esters, imidazoles, acridinium salts and oxalic esters.

【０１３７】 同様に、生体発光化合物が、本発明の抗Ｓｐａ免疫結合体を標識するために使
用され得る。生体発光は、生物学的システム中で見出される化学発光の型である
。ここでは、触媒タンパク質が、化学発光反応の効率を増大させる。生体発光タ
ンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識のため
に有用な生体発光化合物として、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオ
リンが挙げられる。Similarly, bioluminescent compounds can be used to label anti-Spa immunoconjugates of the invention. Bioluminescence is a type of chemiluminescence found in biological systems. Here, the catalytic protein increases the efficiency of the chemiluminescent reaction. The presence of a bioluminescent protein is determined by detecting the presence of luminescence. Bioluminescent compounds useful for labeling include luciferin, luciferase, and aequorin.

【０１３８】 あるいは、抗Ｓｐａ免疫結合体は、酵素に対して抗Ｓｐａ抗体成分を連結する
ことによって標識され得る。抗Ｓｐａ酵素結合体が適切な基質の存在下でインキ
ュベートされる場合は、酵素部分が、（例えば、分光光度的に、蛍光によって、
または可視的な手段によって）検出され得る化学的部分を産生するように基質と
反応する。多特異的免疫結合体を検出可能に標識するために使用され得る酵素の
例として、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ
、およびアルカリホスファターゼが挙げられる。Alternatively, anti-Spa immunoconjugates can be labeled by linking the anti-Spa antibody component to an enzyme. If the anti-Spa enzyme conjugate is incubated in the presence of a suitable substrate, the enzyme moiety will be (eg, spectrophotometrically, by fluorescence,
Or reacts with a substrate to produce a chemical moiety that can be detected (by visible means). Examples of enzymes that can be used to detectably label multispecific immunoconjugates include β-galactosidase, glucose oxidase, peroxidase, and alkaline phosphatase.

【０１３９】 当業者は、本発明に従って使用され得る他の適切な標識を知っている。抗Ｓｐ
ａ抗体に対するマーカー部分の結合は、当該分野で公知の標準的な技術を使用し
て達成され得る。これに関する代表的な方法論は、Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｃｌｉｎ
．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１、１９７６、Ｓｃｈｕｒｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１、１９７７、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ’ｌ Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ ４６：１１０１、１９９０、Ｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０
：１３３０、１９９０）およびＣｏｌｉｇａｎ、前出によって記載されている。[0139] Those skilled in the art are aware of other suitable labels that can be used in accordance with the present invention. Anti-Sp
Binding of the marker moiety to the a antibody can be accomplished using standard techniques known in the art. A representative methodology in this regard is described in Kennedy et al., Clin.
. Chim. Acta 70: 1, 1976, Schurs et al., Clin. Ch
im. Acta 81: 1, 1977, Shih et al., Int'l J .; Canc
er 46: 1101, 1990, Stein et al., Cancer Res. 50
1330, 1990) and Colligan, supra.

【０１４０】 さらに、免疫化学的な検出の便利さおよび万能性は、アビジン、ストレプトア
ビジン、およびビオチンと結合させられている抗Ｓｐａ抗体を使用することによ
って増強され得る（例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋら（編）、「Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏ
ｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，第１８４巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）およびＢａｙｅｒ
ら、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｖ
ｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１０巻、Ｍａｎｓｏｎ（編）、１４９−
１６２頁（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９２を参照のこ
と）。Furthermore, the convenience and versatility of immunochemical detection can be enhanced by using anti-Spa antibodies conjugated to avidin, streptavidin, and biotin (see, eg, Wilchek et al. (Eds.) , "Avidin-Bio
tin Technology ”, Methods In Enzymology
y, Volume 184 (Academic Press 1990) and Bayer
Et al., "Immunochemical Applications of Av."
idin-Biotin Technology ", Methods In M
olecular Biology, Volume 10, Manson (eds.), 149-
162 (see The Humana Press, Inc., 1992).

【０１４１】 イムノアッセイを行うための方法は、十分に確立されている（例えば、Ｃｏｏ
ｋおよびＳｅｌｆ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ＲｉｔｔｅｒおよびＬａｄｙｍ
ａｎ（編）、１８０−２０８頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ、１９９５）、Ｐｅｒｒｙ、「Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ、ＢｉｒｃｈおよびＬｅｎｎｏｘ（編）、１０７−１２０頁（Ｗｉｌｅ
ｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）、およびＤｉａｍａｎｄｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９９６）を参照のこと
）。Methods for performing immunoassays are well-established (eg, Coo
k and Self, "Monoclonal Antibodies in D.
Diagnostic Immunoassays ", Monoclonal A
ntbodies: Production, Engineering, and
Clinical Application, Ritter and Ladym
an (ed.), pp. 180-208 (Cambridge University)
Press, 1995), Perry, "The Role of Monoc."
local Antibodies in the Advancement
of Immunoassay Technology ", Monoclona
l Antibodies: Principles and Applicat
ions, Birch and Lenox (eds.), pp. 107-120 (Wile
y-Liss, Inc. 1995), and Diamonddis, Immuno
assay (Academic Press, Inc. 1996)).

【０１４２】 本発明はまた、ｓｐａ遺伝子についての免疫学的な診断アッセイを行うための
キットを意図する。このようなキットは、１つ以上の容器を含む。ここで、１つ
の容器は、抗Ｓｐａ抗体または抗体フラグメントを含有する。第２の容器は、Ｓ
ｐａ抗体または抗体フラグメントの存在を示すことが可能な１つ以上の試薬を含
有し得る。このような指示薬の例として、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識
、酵素標識、生物発光標識、コロイド金などのような、検出可能な標識が挙げら
れる。キットはまた、Ｓｐａタンパク質の検出のための、Ｓｐａ抗体および抗体
フラグメントの使用を記載している記載された物質を含む。記載された物質は、
容器に直接適用され得るか、記載された物質が、パッケージに挿入される形態で
提供され得る。The present invention also contemplates kits for performing an immunological diagnostic assay for the spa gene. Such a kit includes one or more containers. Here, one container contains an anti-Spa antibody or antibody fragment. The second container is S
It may contain one or more reagents capable of indicating the presence of the pa antibody or antibody fragment. Examples of such indicators include detectable labels, such as radioactive labels, fluorescent labels, chemiluminescent labels, enzyme labels, bioluminescent labels, colloidal gold, and the like. The kit also includes the described materials that describe the use of Spa antibodies and antibody fragments for the detection of Spa proteins. The listed substances are:
It can be applied directly to the container, or the described substance can be provided in a form that is inserted into a package.

【０１４３】 （ＶＩ．治療用組成物） Ａ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの新規の防御的な抗原の発見は、Ａ群のＳ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓによって生じる感染に対する防御のための治療用組成
物の供給という本発明の別の局面を可能にする。本明細書中で使用される場合は
、「感染に対する防御」は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓによって引き起こされ
る感染を予防すること、感染の可能性を減少させること、または感染の病原性の
影響を緩和することを意味する。１つの実施形態においては、本発明の単離され
たＳｐａ抗原は、治療に適切な媒体中に処方され、そして動物中で交差防御性の
抗体を誘発するために使用される。Ｓｐａ抗原として、天然に存在するか、合成
物であるか、または本発明の精製されたＳｐａタンパク質またはペプチドに対し
て惹起された抗体と反応する、Ｓｐａ抗原をコードする核酸配列を含有している
組換えＤＮＡベクターの発現によって産生されたかどうかにはかかわらず、上記
のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが挙げられる。VI. Therapeutic Compositions The discovery of a novel protective antigen of Group A Streptococcus is
Another aspect of the invention is the provision of a therapeutic composition for protection against infections caused by Treptococcus. As used herein, "protecting against infection" means preventing an infection caused by Streptococcus, reducing the likelihood of infection, or reducing the pathogenic effects of infection. I do. In one embodiment, the isolated Spa antigens of the invention are formulated in a vehicle suitable for therapy and used to elicit cross-protective antibodies in animals. As a Spa antigen, it contains a nucleic acid sequence encoding a Spa antigen that is naturally occurring, synthetic, or reacts with an antibody raised against a purified Spa protein or peptide of the present invention. The proteins, polypeptides, or peptides described above, whether or not produced by expression of a recombinant DNA vector.

【０１４４】 代表的な実施形態においては、Ｓｐａ抗原を含有している治療用組成物は、複
数のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの血清型に対して防御的である抗原を含む。よ
り代表的な実施形態においては、治療用組成物は、２８型、３型、１８型のＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを含むＡ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対して交差
防御的である、オプソニン作用性のエピトープを含有する。このような組成物は
、Ｍタンパク質またはその誘導体を含む以前の組成物（例えば、種々のＭタンパ
ク質の限定されたアミノ末端のフラグメントが、ワクチン中に提示されるそれぞ
れの血清型に対して防御的な免疫応答を引き起こすようにタンデムに連結されて
いる組成物）よりもかなり複雑ではないと考えられる。このようなアプローチは
ワクチンに含まれるＭタンパク質の量を制限するという利点を有するので、各Ｍ
タンパク質フラグメントが種特異的であるので、多数の組み合わせが、提供され
なければならない。これは、所定の集団または地理学上の地域におけるＳｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃａｌの感染の大部分を防ぐための比較的複雑なワクチンの開発を
必然的に伴う。対照的に、本発明のＳｐａ抗原および抗体、ならびに核酸は、広
範な防御を提供するために使用され得、そして／またはいずれかのタンパク質の
みによって提供される防御の有効性を増強するために、Ｍタンパク質およびペプ
チドと組み合わせて使用され得る。In an exemplary embodiment, a Therapeutic composition containing a Spa antigen comprises an antigen that is protective against multiple Streptococcus serotypes. In a more representative embodiment, the therapeutic composition comprises a type 28, type 3, type 18 St
It contains an opsonizing epitope that is cross-protective against Streptococcus in group A, including Reptococcus. Such compositions are those that contain prior compositions that include the M protein or a derivative thereof (eg, that limited amino-terminal fragments of various M proteins are protective against the respective serotypes presented in the vaccine). A composition that is linked in tandem to elicit a unique immune response). Since such an approach has the advantage of limiting the amount of M protein contained in the vaccine, each M
Since protein fragments are species-specific, a number of combinations must be provided. This means that a given population or geographic region
It entails the development of relatively complex vaccines to prevent the majority of ptococcal infections. In contrast, the Spa antigens and antibodies, and nucleic acids of the invention can be used to provide broad protection and / or to enhance the effectiveness of protection provided by only any protein, It can be used in combination with M proteins and peptides.

【０１４５】 この局面においては、本発明は、１つ以上の薬学的または生理学的に受容可能
なキャリア、アジュバント、バインダー、または希釈剤と組み合わせて、その中
に１つ以上の上記のＳｐａ抗原または抗体を含有する、組成物および方法を提供
する。抗原を含有している組成物は、レシピエント動物中の免疫応答を誘発する
かまたは増強するために使用され得る。レシピエントは、好ましくはヒトである
。そして抗原を含有している組成物は好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
に対して、または本発明のＳｐａ抗原を含む表面抗原を発現する宿主細胞に対し
て、防御的または部分的に防御的な免疫を誘発するかまたは増強するために使用
され得る。抗体を含有している組成物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓによって
引き起こされる感染を診断または処置するために使用され得る。In this aspect, the invention relates to one or more of the above-described Spa antigens or a combination thereof, in combination with one or more pharmaceutically or physiologically acceptable carriers, adjuvants, binders, or diluents. Compositions and methods are provided that contain the antibodies. Compositions containing the antigen can be used to elicit or enhance an immune response in a recipient animal. The recipient is preferably a human. And the composition containing the antigen is preferably Streptococcus.
Or to elicit or enhance protective or partially protective immunity against host cells expressing surface antigens, including Spa antigens of the invention. Compositions containing the antibodies can be used to diagnose or treat an infection caused by Streptococcus.

【０１４６】 好ましくは、このようなキャリア、アジュバント、バインダー、または希釈剤
は、使用される投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。通常
は、このような組成物の調製は、緩衝液、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）
、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化
物（グルコール、スクロース、もしくはデキストリンを含む）、キレート剤（例
えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオンおよび他の安定剤、ならびに賦形剤と、本発明
の抗原または抗体とを組み合わせることを伴う。中性の緩衝化された生理食塩水
、または非特異性の血清アルブミンと混合された生理食塩水は、例示的な適切な
希釈剤である。アジュバントの例として、ヒトについては、ミョウバンまたは水
酸化アルミニウムが挙げられる。Preferably, such carriers, adjuvants, binders, or diluents are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed. Typically, the preparation of such compositions involves buffering, an antioxidant (eg, ascorbic acid)
Low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides, proteins, amino acids, carbohydrates (including glycol, sucrose, or dextrin), chelating agents (eg, EDTA), glutathione and other stabilizers, and excipients. , In combination with the antigen or antibody of the invention. Neutral buffered saline or saline mixed with non-specific serum albumin are exemplary suitable diluents. Examples of adjuvants include alum or aluminum hydroxide for humans.

【０１４７】 投与量および投与頻度が、臨床試験において最適化され得、そして処置される
疾患または障害、必要とされる免疫の誘導、増強、または防御の程度、および多
くの他の因子のような因子に依存することが、本明細書を参照して当業者に明ら
かである。The dosage and frequency of administration can be optimized in clinical trials and include the disease or disorder to be treated, the degree of induction, enhancement, or protection required of the immunity required, and many other factors. It will be apparent to those skilled in the art with reference to the present specification that it depends on factors.

【０１４８】 １つの実施形態においては、治療用組成物は経口的に投与され、そして本発明
のＳｐａ抗原は、細胞（例えば、胃の管腔に配置されている細胞）によって取り
込まれる。あるいは、治療用組成物は、皮下経路を通じて、または他の非経口的
な経路を通じて、非経口的に投与され得る。他の経路として、頬／舌下、直腸、
鼻内、局所（例えば、経皮および眼）、膣、肺、動脈内、筋肉内、腹腔内、眼球
内、鼻腔内、または静脈内、あるいは間接的な経路が挙げられる。本発明のＳｐ
ａ組成物は、液体の溶液として調製されそして投与され得るか、または固体の形
態（例えば、凍結乾燥された）として調製され、これは、固体の形態で投与され
得るか、または投与と同時に溶液中に再懸濁され得る。In one embodiment, the therapeutic composition is administered orally, and the Spa antigen of the invention is taken up by cells (eg, cells located in the lumen of the stomach). Alternatively, the therapeutic compositions can be administered parenterally, via subcutaneous routes, or via other parenteral routes. Other routes include cheek / sublingual, rectal,
Intranasal, topical (eg, transdermal and ocular), vaginal, pulmonary, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intraocular, intranasal, or intravenous, or indirect routes. Sp of the present invention
a The composition can be prepared and administered as a liquid solution, or prepared as a solid form (eg, lyophilized), which can be administered in solid form or can be administered simultaneously with the solution. Can be resuspended in.

【０１４９】 適用に依存して、組成物中のＳｐａ抗原の量は、一般的には、約０．１μｇか
ら１０００ｍｇまでで、代表的には、約１μｇから１００ｍｇまで、より代表的
には、約１０μｇから１０ｍｇまで、そして通常は、約１００μｇから１ｍｇま
でで生理学的に受容可能なキャリア、バインダー、または希釈剤との組み合わせ
で変化する。追加免疫は、２〜６週間の間隔で与えられ得る。[0149] Depending on the application, the amount of Spa antigen in the composition will generally be from about 0.1 μg to 1000 mg, typically from about 1 μg to 100 mg, more typically It varies from about 10 μg to 10 mg, and usually from about 100 μg to 1 mg, in combination with a physiologically acceptable carrier, binder, or diluent. Boosters can be given at intervals of 2-6 weeks.

【０１５０】 本発明のＳｐａ抗原はまた、結合体ワクチン中で免疫学的なキャリアとともに
使用され得る。好ましくは、有利なキャリアとして、免疫刺激効果を有するが、
免疫抑制効果を有さない別のポリペプチドが挙げられる。このようなキャリアは
、結合体化した分子に対して増大した免疫応答を誘発するために使用され得る。
本発明のｓｐａ遺伝子産物はまた、Ｓｐａに含まれるエピトープに加えて、例え
ば、Ｍタンパク質ポリペプチドが含み得る、エピトープによって誘発されるさら
なる防御を提供する組成物を提供するように、他の抗原と組み合わせて（結合体
または融合タンパク質において）キャリアとして使用され得る。The Spa antigens of the present invention can also be used with immunological carriers in conjugate vaccines. Preferably, as an advantageous carrier, it has an immunostimulatory effect,
Another polypeptide having no immunosuppressive effect can be mentioned. Such carriers can be used to elicit an increased immune response against the conjugated molecule.
The spa gene product of the present invention can also be used in conjunction with other antigens, in addition to the epitopes contained in Spa, to provide a composition that provides additional protection induced by the epitope, for example, the M protein polypeptides can include. They can be used in combination (in conjugates or fusion proteins) as carriers.

【０１５１】 本発明のさらなる局面は、動物、好ましくは、動物、そして最も好ましくは、
ヒトの、本発明のＳｐａ抗原または抗体を含有している治療用組成物での処置に
よるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの感染からの防御である。本明細書中で使用さ
れる場合は、「防御」は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの感染に関連する疾患を
予防すること、またはその疾患の重篤度を軽減することを意味する。代表的な実
施においては、本発明のＳｐａ抗原は、複数の血清型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓに対する防御を提供する。１つの実施形態においては、防御は、複数の血清
型のＡ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対して提供される。複数の血清型に対
する防御能力は、例えば、表５（実施例６）において説明される。ここでは、１
８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来のＳｐａポリペプチドを含有している粗
表面ペプチドまたは単離されたＳｐａポリペプチドを含む組成物が、３型、１８
型、および２８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに対するオプソニン作用性の防
御を提供する抗血清の産生を誘発したことが示される。さらに、表３および４（
実施例５）は、ＳｐａポリペプチドのＮ末端の２３アミノ酸に対して惹起された
抗血清が、粗ペプチドおよび単離されたＳｐａポリペプチドに対して、類似のオ
プソニン作用および殺菌性の活性ＴＯ抗血清を提示したことを示す。A further aspect of the invention relates to animals, preferably animals, and most preferably
Protection of a human from Streptococcus infection by treatment with a therapeutic composition containing a Spa antigen or antibody of the present invention. As used herein, "protecting" means preventing a disease associated with Streptococcus infection, or reducing the severity of the disease. In an exemplary implementation, the Spa antigens of the invention comprise multiple serotypes of Streptococcus.
Provides protection against us. In one embodiment, protection is provided against Streptococcus in group A of multiple serotypes. The ability to protect against multiple serotypes is described, for example, in Table 5 (Example 6). Here, 1
A composition comprising a crude surface peptide containing an Spa polypeptide from Streptococcus type 8 or an isolated Spa polypeptide may comprise a type 3, 18
And that they elicited the production of antisera that provide opsonic protection against Streptococcus type 28 and Streptococcus type 28. Further, Tables 3 and 4 (
Example 5) shows that antisera raised against the N-terminal 23 amino acids of Spa polypeptide has similar opsonizing and bactericidal activity against crude and isolated Spa polypeptides. Indicates that serum was presented.

【０１５２】 （ＶＩＩ．治療方法） 従って、本発明の別の局面は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの感染に対して動
物を防御するための治療方法である。この方法は、少なくとも１つの上記の治療
用組成物を動物に投与する工程を包含する。代表的には、Ｓｐａ抗原を含有する
治療組成物の投与は、動物においてオプソニン作用性の抗体を誘発する。同様に
、Ｓｐａ抗原に対して惹起された抗体を含有している組成物の投与は、オプソニ
ン作用性の抗体を提供する。これは、動物において食作用性の応答を促進する。
好ましい実施形態においては、防御は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの複数の血
清型に対して提供される。関連する実施形態においては、治療用組成物は、経口
投与、鼻腔内投与、筋肉内ワクチン接種、皮下ワクチン接種、または血管ワクチ
ン接種の少なくとも１つによって投与される。別の好ましい実施形態においては
、治療方法は、ヒトに関して使用される。(VII. Therapeutic Methods) Another aspect of the present invention is therefore a therapeutic method for protecting an animal against Streptococcus infection. The method comprises the step of administering at least one therapeutic composition as described above to the animal. Typically, administration of a therapeutic composition containing a Spa antigen will elicit opsonizing antibodies in the animal. Similarly, administration of a composition containing an antibody raised against the Spa antigen will provide an opsonizing antibody. This promotes a phagocytic response in animals.
In a preferred embodiment, protection is provided for multiple serotypes of Streptococcus. In a related embodiment, the therapeutic composition is administered by at least one of oral administration, intranasal administration, intramuscular vaccination, subcutaneous vaccination, or vascular vaccination. In another preferred embodiment, the method of treatment is used on humans.

【０１５３】 本明細書中に記載されている組成物および方法論は、種々の用途に適切である
。この目的のために、以下の実施例が、限定ではなく例示の目的のために提示さ
れる。The compositions and methodologies described herein are suitable for various applications. To this end, the following examples are presented for illustrative, but not limiting, purposes.

【０１５４】 （実施例） （実施例１） （Ｍ陰性変異体（Ｍ１８Ω）の構築および特徴付け） 細菌株。親の１８型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ株８７−２８２を、Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＭｉｎｎｅｓｏｔａのＰ．Ｐａｔｒｉｃｋ Ｃｌｅａｒｙ
博士から得た。Ｍ３株（３３７５）は、Ｊａｍｅｓ Ｍｕｓｓｅｒ博士、Ｂａｙ
ｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸから
提供された。Ｍ２８株（Ｓ２３５６）は、本発明者らの研究室のコレクションか
らであった。Examples Example 1 Construction and Characterization of M Negative Mutant (M18Ω) Bacterial strain. The parental 18-type Streptococcal strain 87-282 was transformed into a Univ
erity of Minnesota's P.I. Patrick Cleary
Obtained from Dr. M3 strain (3375) was purchased from Dr. James Musser, Bay
lor College of Medicine, Houston, TX. The M28 strain (S2356) was from our laboratory collection.

【０１５５】 新規のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌの防御的な抗原を、１８型のＳｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓｕｓのＭ陰性の変異体の研究の間に発見した。簡潔には、以下に
より詳細に議論するように、Ｍ陰性Ｍ１８株を、Ωエレメントを用いてｅｍｍ１
８遺伝子を中断することによって構築した。Ｍ１８株およびＭ１８Ω株に由来す
る染色体ＤＮＡのサザンブロット分析（Ｋｍ２およびｅｍｍ１８フラグメントを
用いてプローブした）、およびＰＣＲ分析（ｅｍｍ遺伝子およびΩエレメントに
由来するプライマーを使用した）は、ｅｍｍ１８遺伝子の開始コドンの約１４０
ｂｐ後ろに挿入された単一のコピーのΩエレメントが存在することを明らかにし
た。A novel Streptococcal protective antigen was identified as Streptococcal 18
ococcusus during the study of M-negative mutants. Briefly, as discussed in more detail below, the M-negative M18 strain was transformed into an emm1
Constructed by interrupting 8 genes. Southern blot analysis of chromosomal DNA from the M18 and M18Ω strains (probed with Km2 and emm18 fragments), and PCR analysis (using primers from the emm gene and the Ω element) revealed the start codon of the emm18 gene. About 140
It revealed that there was a single copy of the Ω element inserted after bp.

【０１５６】 ｅｍｍ１８遺伝子のフラグメントを、ｅｍｍ１８遺伝子の３’末端をコピーし
た正方向プライマーおよびｅｍｍ様遺伝子のこのサブファミリー（ＳＦ３）に特
異的な逆方向プライマーを使用して、ＰＣＲによって最初にクローン化した。精
製したＰＣＲ産物をｐＫＫ２２３−３に連結し、そして挿入物を標準的な方法に
よって配列決定した。その後、完全なｅｍｍ１８遺伝子を、ｓｃｐＡ遺伝子の５
’末端をコピーした逆方向プライマーを使用してクローン化し、そして精製した
ＰＣＲ産物をｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）に連
結した。組換えＥｍｍ１８タンパク質を、Ｑｉａｇｅｎによって提供される説明
書に従ってニッケルカラムを通すアフィニティークロマトグラフィーによって精
製した。A fragment of the emm18 gene was first cloned by PCR using a forward primer that copied the 3 ′ end of the emm18 gene and a reverse primer specific for this subfamily of emm-like genes (SF3). did. The purified PCR product was ligated into pKK223-3 and the insert was sequenced by standard methods. Thereafter, the complete emm18 gene was replaced with 5 of the scpA gene.
'Cloned using reverse primers with copied ends, and the purified PCR product was ligated into pQE-30 (Qiagen, Chatsworth, CA). Recombinant Emm18 protein was purified by affinity chromatography through a nickel column according to the instructions provided by Qiagen.

【０１５７】 ｅｍｍ１８中へのΩ−インターポゾンの挿入および１８型のＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓの形質転換は、本質的に、２４型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓにつ
いて以前に記載されているように達成した。簡潔には、ｅｍｍ１８をｐＫＫ２２
３−３中に連結し、次いで、ｅｍｍ１８遺伝子の塩基１３６と塩基１４１との間
に単一の部位を認識するＸｈｏＩで切断した。末端を、クレノウフラグメントで
修復した。プラスミドｐＢＲ３２２−Ω、Ｋｍ２を、ＳｍａＩで消化し、そして
Ω，Ｋｍ２フラグメントを０．８％のアガロースゲルから精製し、そして切断し
たｅｍｍ１８遺伝子に連結した。得られたプラスミドｐＫＫＭ１８Ωを、１８型
のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓにエレクトロポレーションした。１つのカナマイ
シン耐性コロニーをＭ１８Ωと命名し、さらなる研究のために選択した。Insertion of Ω-interposon into emm18 and Streptoc of type 18
Transformation of occus was achieved essentially as previously described for type 24 Streptococcus. Briefly, emm18 is converted to pKK22
Ligation into 3-3 and then cut with XhoI recognizing a single site between bases 136 and 141 of the emm18 gene. The ends were repaired with Klenow fragment. Plasmid pBR322-Ω, Km2 was digested with SmaI and the Ω, Km2 fragment was purified from a 0.8% agarose gel and ligated to the cut emm18 gene. The obtained plasmid pKKM18Ω was electroporated into Streptococcus type 18 strain. One kanamycin resistant colony was named M18Ω and was selected for further study.

【０１５８】 ｅｍｍ１８遺伝子がＭ１８Ω株中で発現されないことを確認するために、イム
ノブロットを、細菌全体の抽出物、ならびに精製した組換えＭ１８（ｒＭ１８）
、Ｍ１８の合成のペプチド、ＳＭ１８（１−３０）、合成のペプチドＳＭ５（２
６５−２９１）（これは、全てのＭタンパク質に共通の５型のＭタンパク質のＣ
反復ドメインをコピーする）によって誘発されたウサギの抗血清を使用して行っ
た（図１）。抗ｒＭ１８は、親株から抽出した３つ組のタンパク質と反応した。
その最も大きなものは、約４３ｋＤａの見かけのＭ．Ｗ．を有した（図１、レー
ンＡ）。より小さいＭ．Ｗ．を有する免疫反応性のタンパク質は、おそらく、細
菌全体の粗抽出物中に存在したＭ１８の分解産物である。ｒＭ１８抗血清は、Ｍ
１８Ω変異体に由来する抽出物とは反応しなかった（図１、レーンＢ）。抗ＳＭ
１８（１−３０）は、親株に由来する抽出物中のタンパク質のみと反応し（図１
、レーンＣ）、そしてパターンは、ｒＭ１８に対する抗血清を用いて観察された
ものと同一であった。興味深いことに、Ｍタンパク質のＣ反復ペプチドＳＭ５（
２６５−２９１）に対する抗血清は、親株に由来する抽出物のみと反応し（図１
、レーンＥ）、そして変異体に由来する抽出物とは反応しなかった（レーンＦ）
。このことは、変異体が、これらの共有される反復しているエピトープを含有し
ている別のＭまたはＭ様タンパク質を発現しなかったことを示唆する。サザンブ
ロットおよびＰＣＲの結果をまとめると、これらのデータは、Ωエレメントが、
ｅｍｍ１８遺伝子中に挿入され、そしてＭ１８タンパク質がＭ１８Ωによっては
発現されなかっことことを示す。To confirm that the emm18 gene was not expressed in the M18Ω strain, immunoblotting was performed on whole bacterial extracts, as well as purified recombinant M18 (rM18).
, M18 synthetic peptide, SM18 (1-30), synthetic peptide SM5 (2
65-291) (this is the C type 5 M protein common to all M proteins)
(Copying the repeat domain) was performed using rabbit antiserum (FIG. 1). Anti-rM18 reacted with triplicate proteins extracted from the parent strain.
The largest of which is the apparent M. of about 43 kDa. W. (FIG. 1, lane A). Smaller M. W. Is probably a degradation product of M18 that was present in crude extracts of whole bacteria. The rM18 antiserum contains M
It did not react with the extract derived from the 18Ω mutant (FIG. 1, lane B). Anti-SM
18 (1-30) reacted only with the protein in the extract derived from the parent strain (FIG. 1).
, Lane C), and the pattern was identical to that observed with antiserum to rM18. Interestingly, the C-repeat peptide SM5 of the M protein (
265-291) reacts only with the extract derived from the parent strain (FIG. 1).
, Lane E), and did not react with the extract derived from the mutant (lane F)
. This suggests that the mutant did not express another M or M-like protein containing these shared, repeating epitopes. Summarizing the Southern blot and PCR results, these data indicate that the Ω element
Inserted into the emm18 gene and indicates that the M18 protein was not expressed by M18Ω.

【０１５９】 ウェスタンブロットを、完全なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの抽出物および上
記のように精製したタンパク質を使用して行った。精製した組換えＥｍｍ１８タ
ンパク質を使用するいくつかの実験においては、ニトロセルロースメンブレンを
最初に、１０％の正常なヒトの血清を含有している緩衝液中で、イムノグロブリ
ンの非特異的な結合をブロックするためにインキュベートした。A western blot was performed using the complete Streptococcus extract and the protein purified as described above. In some experiments using purified recombinant Emm18 protein, nitrocellulose membranes were first tested for non-specific binding of immunoglobulins in a buffer containing 10% normal human serum. Incubated to block.

【０１６０】 サザンブロットのために、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ染色体ＤＮＡを、Ｂｓ
ａＨＩで消化し、そして１％のアガロースゲル中で電気泳動した。ＤＮＡフラグ
メントをナイロンメンブレン（Ｓｉｇｍａ）に移し、そしてジゴキシゲニンで標
識したＫｍ２フラグメントまたはｅｍｍ１８で製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）によって提供される説
明書に従ってプローブした。For Southern blots, Streptococcus chromosomal DNA was purified from Bs
Digested with aHI and electrophoresed in a 1% agarose gel. The DNA fragment was transferred to a nylon membrane (Sigma) and the digoxigenin labeled Km2 fragment or the manufacturer with emm18 (Boehringer).
Probes were provided according to the instructions provided by Mannheim, Indianapolis, Ind.).

【０１６１】 （実施例２） （Ｍ１８およびＭ１８Ωの血液中での増殖およびマウス毒力） Ａ．免疫していないヒトの血液中での増殖。１８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕのＭ陰性変異体の毒力を、免疫していないヒトの血液中で増殖するその能力に
よって最初に評価した（表１）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを、Ｔｏｄｄ−Ｈ
ｅｗｉｔｔブロス中で初期の対数期まで増殖させ、そして示した接種菌を、Ｍ１
８抗体を含まない、０．４５ｍｌの正常なヘパリン処理したヒトの血液に添加し
た。混合物を、３７℃で３時間、回転しながら（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）回
転させた。生存している生物体を、混合物のアリコートを使用して、ヒツジの血
液寒天を注いだプレート上で定量した。Ｍ１８の親株は、血液中での３時間の回
転後、ちょうど８世代まで増殖した。同じアッセイにおいて、Ｍ１８Ω変異体は
、約７．５世代まで増殖した。Example 2 Growth in Blood and Mice Virulence of M18 and M18Ω A. Growth in unimmunized human blood. Streptococ 18 type
The virulence of the M-negative mutant of u was first assessed by its ability to grow in the blood of unimmunized humans (Table 1). Streptococcus to Todd-H
The cells were grown to early log phase in ewitt broth and indicated inoculum was
Added to 0.45 ml of normal heparinized human blood without the 8 antibody. The mixture was spun at 37 ° C. for 3 hours end-over-end. Surviving organisms were quantified using aliquots of the mixture on sheep blood agar-poured plates. The M18 parent strain grew to just 8 generations after 3 hours of rotation in blood. In the same assay, the M18Ω mutant grew to about 7.5 generations.

【０１６２】[0162]

【表１】 [Table 1]

【０１６３】 Ｂ．腹腔内チャレンジ感染。毒力についての最もストリンジェントな研究室ア
ッセイは、免疫していないマウスの腹腔内でのチャレンジ感染である。簡潔には
、６匹のＳｗｉｓｓ白色マウスの４つの群のそれぞれを、１０倍ずつ漸増する接
種物（Ｍ１８またはＭ１８Ωのいずれかの２．７×１０⁴から２．７×１０⁷のＣ
ＦＵまでの範囲）でチャレンジした。死亡を、チャレンジ感染後７日間にわたっ
て記録した。ＬＤ５０を、１０倍ずつ漸増する用量のそれぞれの生物体を使用し
た後に、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法によって決定した。親のＭ１８株の
ＬＤ５０は、０．７３×１０⁵であり、Ｍ１８ΩのＬＤ５０は、１．２６×１０⁵ であった。それぞれの生物体でチャレンジした２４匹のマウスのうち、Ｍ１８で
チャレンジしたマウスのうちの８匹が死亡し、Ｍ１８Ωでチャレンジしたマウス
のうちの７匹が死亡した。Ｍ１８Ωでのチャレンジ感染で死亡したマウスの脾臓
から回収した生物体は、カナマイシン耐性であり、そしてＭ１８陰性であった。
このことは、インビボでは親の表現型への復帰が存在しなかったことを示す。こ
れらの結果は、Ｍ１８の発現が、１８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの毒力に
は必要ではないことを実証した。B. Intraperitoneal challenge infection. The most stringent laboratory assay for virulence is the challenge infection intraperitoneally of non-immunized mice. Briefly, each of four groups of six Swiss white mice was inoculated with a 10-fold increasing inoculum (2.7 × 10 ⁴ to 2.7 × 10 ⁷ C of either M18 or M18Ω).
(Up to FU). Deaths were recorded for 7 days after challenge infection. LD50 was determined by the method of Reed and Muench after using a 10-fold escalating dose of each organism. The LD50 of the parent M18 strain was 0.73 × 10 ⁵ , and the LD50 of M18Ω was 1.26 × 10 ⁵ . Of the 24 mice challenged with each organism, 8 of the mice challenged with M18 died and 7 of the mice challenged with M18Ω died. Organisms recovered from the spleen of mice that died from challenge infection with M18Ω were kanamycin resistant and M18 negative.
This indicates that there was no reversion to the parental phenotype in vivo. These results demonstrated that expression of M18 was not required for the virulence of Streptococcus type 18.

【０１６４】 （実施例３） （粗表面ペプチドに対する抗血清を使用したＭ１８およびＭ１８Ωの粒子のオ
プソニン作用） ｅｍｍ１８の発現の中断は、毒性でありそして防御的な抗原を発現しない変異
体を生じ得るか、あるいはその表面上に第２の防御的な抗原を発現する変異体を
生じ得る。後者の可能性を評価するために、インビトロでのオプソニン作用の実
験を、Ｍ１８Ωがオプソニン作用性のエピトープを含む表面抗原を発現するかど
うかを決定するために行った。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの初期の対数期培養
物を、０．１ｍｌの試験血清に添加し、そして１５分間室温でインキュベートし
た。これに０．４ｍｌの正常な、ヘパリン処理したヒトの血液を添加し、混合物
全体を、４５分間、３７℃で回転しながら回転させた。回転の最後に、それぞれ
の混合物の１滴を、顕微鏡スライド上に薄いスメアを作製するために使用した。
ライト染料でのスライドの染色後、結合したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（摂取
されたかまたは付着した）を有する好中球の百分率を、少なくとも５０個の連続
している好中球を数えることによって概算した。抗ｒＭ１８は、完全な組換えの
１８型のＭタンパク質に対するウサギ抗血清である；抗ＳＭ１８（１−３０）は
、ＫＬＨに連結された、Ｍ１８のＮ末端の３０アミノ酸をコピーした合成ペプチ
ドに対するウサギ抗血清である；抗粗ｐｅｐ Ｍ１８は、１８型のＳｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ全体の部分的に精製したペプシン抽出物に対するウサギの抗血清
である。実験を、少なくとも３回繰り返し、同様の結果が得られた。Example 3 Opsonization of M18 and M18Ω Particles Using Antisera Against Crude Surface Peptides Disruption of emm18 expression can result in mutants that are toxic and do not express protective antigens Alternatively, one may generate a mutant that expresses a second protective antigen on its surface. To assess the latter possibility, in vitro opsonization experiments were performed to determine whether M18Ω expresses a surface antigen containing an opsonizing epitope. Early log phase cultures of Streptococcus were added to 0.1 ml of test serum and incubated for 15 minutes at room temperature. To this was added 0.4 ml of normal, heparinized human blood and the whole mixture was spun for 45 minutes at 37 ° C. At the end of the spin, one drop of each mixture was used to make a thin smear on a microscope slide.
After staining of the slides with light dye, the percentage of neutrophils with bound Streptococcus (ingested or attached) was estimated by counting at least 50 consecutive neutrophils. Anti-rM18 is a rabbit antiserum against intact recombinant type 18 M protein; anti-SM18 (1-30) is a rabbit against a synthetic peptide linked to KLH that copies the N-terminal 30 amino acids of M18. Anti-serum; anti-crude pep M18 is a type 18 Strept
Rabbit antiserum to partially purified pepsin extract of whole ococcus. The experiment was repeated at least three times with similar results.

【０１６５】 試験抗血清の殺菌活性を、より少数のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを混合物に
添加したことを除いて、類似のアッセイを使用して決定した。これを３時間３７
℃で回転させた。回転の最後に、０．１ｍｌのアリコートを、ヒツジの血液の寒
天に添加し、そして注いだプレートを、生存可能な細菌を定量するために作製し
た。以下の表２に示す結果は、１つの代表的な実験による。簡潔には、Ｍ１８親
株のみが、ＳＭ１８（１−３０）または組換えＭ１８に対する抗血清によってオ
プソニン作用が行われた。ＰＭＮとのＭ１８Ωの会合は、これらの両方の抗血清
の存在下ではベースラインレベルのままであった。しかし、Ｍ１８Ω株の粗ペプ
シン抽出物に対してウサギ中で惹起された抗血清は、親およびＭ陰性の変異体の
両方をオプソニン作用を行った（表２）。この抗血清を、１８型のＳｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓの推定の新規の防御的な抗原を同定し、そして精製するための続
く実験において使用した。The bactericidal activity of the test antisera was determined using a similar assay, except that less Streptococcus was added to the mixture. 3 hours 37
Rotated at ° C. At the end of the spin, a 0.1 ml aliquot was added to sheep blood agar and a poured plate was made to quantify viable bacteria. The results shown in Table 2 below are from one representative experiment. Briefly, only the M18 parent strain was opsonized by antisera to SM18 (1-30) or recombinant M18. The association of M18Ω with PMN remained at baseline levels in the presence of both of these antisera. However, antisera raised in rabbits against the crude pepsin extract of the M18Ω strain opsonized both parent and M-negative mutants (Table 2). This antiserum was used as a type 18 Strept
A putative novel protective antigen of ococcus was identified and used in subsequent experiments to purify it.

【０１６６】[0166]

【表２】 [Table 2]

【０１６７】 （実施例４） （Ｓｐａの同定、精製、およびアミノ酸配列分析） 以下の実施例においてより詳細に議論するように、Ｍ１８Ωの表面に由来する
ペプチドフラグメントを、最適未満のｐＨでペプシンの希釈溶液を使用して抽出
した。抽出物を、６０％の飽和硫酸アンモニウム中で沈殿させ、蒸留水に対して
広範囲に透析し、次いで凍結乾燥した。表面タンパク質およびペプチドの混合物
を、粗ｐｅｐ Ｍ１８Ωという。Example 4 Identification, Purification, and Amino Acid Sequence Analysis of Spa As discussed in more detail in the Examples below, peptide fragments derived from the surface of M18Ω were converted to pepsin at sub-optimal pH. Extracted using dilute solution. The extract was precipitated in 60% saturated ammonium sulfate, dialyzed extensively against distilled water, and then lyophilized. The mixture of surface proteins and peptides is called crude pep M18Ω.

【０１６８】 より詳細には、実施例３において上記に議論したように、Ｓｐａを、オプソニ
ン作用の阻害アッセイによって粗ペプシン抽出物中で同定した。粗ｐｅｐ Ｍ１
８Ωを、還元条件を使用した分取１０％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離
した。ゲル全体をニトロセルロースペーパーに電気的にブロットし、そしてそれ
ぞれの末端を縦に切断し、そしてクマシーブルーで染色した。ニトロセルロース
ペーパーの中央の切片を、約８〜１０ｍｍの幅の水平方向の小片に切断した。次
いで、それぞれの小片を、粗ｐｅｐ Ｍ１８Ωに対して惹起されたウサギの抗血
清を、２時間３７℃で吸収させるために使用した。ニトロセルロースペーパーの
１つの小片を、免疫反応性のバンドを同定するために、ｐｅｐ Ｍ１８Ω抗血清
でウェスタンブロットした。別の切片を水平方向の小片に切断した。これを、ｐ
ｅｐ Ｍ１８Ω抗血清中のオプソニン作用性の抗体を吸収させるために使用した
。ｐｅｐ Ｍ１８Ω抽出物は、２４ｋＤａの見かけの分子量を有するタンパク質
（Ｓｐａ）を含んだ。これは、ｐｅｐ ｍ１８Ω抗血清中のオプソニン作用性の
抗体の大部分を吸収した（図２）。More specifically, as discussed above in Example 3, Spa was identified in crude pepsin extract by an opsonization inhibition assay. Coarse pep M1
8Ω was separated by SDS-PAGE on a preparative 10% gel using reducing conditions. The entire gel was electroblotted onto nitrocellulose paper and each end was cut longitudinally and stained with Coomassie blue. The central section of the nitrocellulose paper was cut into horizontal pieces about 8-10 mm wide. Each piece was then used to absorb rabbit antiserum raised against crude pep M18Ω for 2 hours at 37 ° C. One piece of nitrocellulose paper was western blotted with pep M18Ω antiserum to identify immunoreactive bands. Another section was cut into horizontal pieces. This is
Ep was used to absorb opsonizing antibodies in the M18Ω antiserum. The pep M18Ω extract contained a protein (Spa) with an apparent molecular weight of 24 kDa. It absorbed most of the opsonizing antibodies in the pep m18Ω antiserum (FIG. 2).

【０１６９】 オプソニン作用のアッセイを、上記の実施例３に記載するように、吸収させた
血清サンプルおよび吸収させていない血清を使用して行った。一旦、オプソニン
阻害性のペプチドを粗ペプシン抽出物中で同定したら、これを、硫酸アンモニウ
ム沈殿および分取ゲル電気泳動（Ｐｒｅｐ Ｃｅｌｌ、モデル４９１、Ｂｉｏ−
Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）によって精製した。Opsonization assays were performed using absorbed and unabsorbed serum samples as described in Example 3 above. Once the opsonic inhibitory peptide was identified in the crude pepsin extract, it was analyzed by ammonium sulfate precipitation and preparative gel electrophoresis (Prep Cell, Model 491, Bio-
(Rad, Richmond, CA).

【０１７０】 精製したＳｐａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した場合には、２４ｋＤａ
のＭ．Ｗ．を有する一本のバンドとして移動した（図３、レーンＢ）。精製した
Ｓｐａタンパク質を、ＰＶＤＦメンブレンに電気的に移動させ、そしてエドマン
分解によるＮ末端の配列決定のために、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｔａｎｆ
ｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒに提出した。Ｓ
ｐａの内部ペプチドの配列をもまた、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて決定した。ＰＶＤＦ上の完全なタンパク質を、Ｌｙ
ｓＣプロテアーゼ、０．２５（ｍｏｌ／ｍｌ、３７℃で一晩）で消化した。得ら
れたペプチドを、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラムでのＨＰＬＣによって精製した。選
択した画分を、質量分析法によって純度について評価し、そして１２４９ダルト
ンの質量を有する１つのペプチドを、Ｎ末端の配列決定のために選択した。[0170] The purified Spa was 24 kDa as assessed by SDS-PAGE.
M. W. (FIG. 3, lane B). The purified Spa protein was electrotransferred to a PVDF membrane and Protein and Nuclei for N-terminal sequencing by Edman degradation.
c Acid Facility, Beckman Center, Stanf
ord University Medical Center. S
The sequence of the internal peptide of pa is also described by Stanford University.
Determined in Facility. The complete protein on PVDF is
Digestion with sC protease, 0.25 (mol / ml, overnight at 37 ° C). The resulting peptide was purified by HPLC on a Vydac C18 column. Selected fractions were evaluated for purity by mass spectrometry, and one peptide with a mass of 1249 daltons was selected for N-terminal sequencing.

【０１７１】 精製したタンパク質のエドマン分解によって、以下のようである最初の２３ア
ミノ酸（Ｎ末端）の配列が明らかになった： ＤＳＶＳＧ ＬＥＶＡＤ ＰＳＤＳＫ ＫＬＩＥＬ ＧＬＡ（配列番号３） さらに、精製したＳｐａのＬｙｓＣ消化物から精製した内部ペプチドは、以下の
ようなアミノ末端配列を含んだ： ＹＲＬＤＳ ＥＳＨＬＫ（配列番号８） （実施例５） （Ｓｐａのオプソニン作用性のエピトープの同定） ウサギの抗血清を、合成のペプチドＳＭ１８（１−３０）Ｃに対して、Ｅ．ｃ
ｏｌｉの細胞質周辺の抽出物から精製した組換えＭ１８に対して、および精製し
たＳｐａに対して調製した。Edman degradation of the purified protein revealed the sequence of the first 23 amino acids (N-terminal), which was as follows: DSVSG LEVAD PSDSK KLIEL GLA (SEQ ID NO: 3) In addition, LysC digestion of purified Spa The internal peptide purified from the product contained the following amino-terminal sequence: YRLDS ESHLK (SEQ ID NO: 8) Example 5 Identification of Opsonizing Epitope of Spa Rabbit antiserum was synthesized For peptide SM18 (1-30) C, E. coli. c
Prepared against recombinant M18 purified from periplasmic extracts of oli and against purified Spa.

【０１７２】 Ｓｐａ中の殺菌性のエピトープの存在を直接評価するために、ウサギを、０週
、４週、および８週の時点で、ＣＦＡ中の１００μｇの精製したタンパク質を用
いて免疫した。最初の注射の１０週間後に得た３匹全ての免疫したウサギから得
た血清は、Ｍ１８親およびＭ１８Ωをオプソニン作用する抗体を含んだ（表３）
。Ｓｐａ抗血清はいずれも、ＥＬＩＳＡによって決定した場合には、精製した組
換えＭ１８または精製した組換えＥｍｍ１８とは交差反応しなかった。To directly assess the presence of bactericidal epitopes in Spa, rabbits were immunized at week 0, 4, and 8 with 100 μg of purified protein in CFA. Serum from all three immunized rabbits obtained 10 weeks after the first injection contained antibodies that opsonize M18 parent and M18Ω (Table 3).
. None of the Spa antisera cross-reacted with purified recombinant M18 or purified recombinant Emm18 as determined by ELISA.

【０１７３】 Ｓｐａの共有結合性の構造中のオプソニン作用性のエピトープの存在を確認す
るために、ペプチドＳ−Ｓｐａ１８（１−２３）Ｃ（精製した２４ｋＤａのフラ
グメントのＮ末端の２３アミノ酸をコピーする）を、化学的に合成した。ペプチ
ドを、ＫＬＨに共有結合によって連結させ、そして３匹のウサギを、上記と同じ
スケジュールを使用して１００μｇの用量で免疫した。抗Ｓｐａ（精製したＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌの防御的な抗原に対するウサギ抗血清）；抗Ｓ−Ｓｐａ
（１−２３）Ｃ（ＫＬＨに連結された、ＳｐａのＮ末端の２３アミノ酸をコピー
した合成ペプチドに対するウサギ抗血清）；抗ｒＭ１８（完全な組換えの１８型
のＭタンパク質に対するウサギ抗血清）を使用した。アッセイの詳細を、実施例
３に提供する。実験を、少なくとも３回繰り返し、同様の結果が得られた。示す
データは、１つの代表的な実験によるものである。簡潔には、３匹全てのウサギ
に由来する血清は、Ａ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの親株およびＭ１８Ω株
の両方でオプソニン作用を行った（表３）。このことによって、Ｓｐａのこの限
定された領域中にオプソニン作用性のエピトープが存在することを確認した。Ｓ
ｐａの合成ペプチドに対する抗血清もまた、Ｍ１８Ωのファージ溶解素抽出物中
の天然のタンパク質を同定するために使用した。Ｓ−Ｓｐａ１８（１−２３）Ｃ
抗血清は、溶解素抽出物中の５０ｋＤａの見かけのＭ．Ｗ．を有する単一のタン
パク質と反応した（図３Ｄ）。このことは、ペプシンによって誘導されたＳｐａ
が、より大きな天然のタンパク質のフラグメントであったことを示唆する。To confirm the presence of an opsonizing epitope in the covalent structure of Spa, the peptide S-Spa18 (1-23) C (copy the N-terminal 23 amino acids of the purified 24 kDa fragment) ) Was chemically synthesized. The peptide was covalently linked to KLH and three rabbits were immunized at a dose of 100 μg using the same schedule as above. Anti-Spa (Purified St
rabbit antiserum against the protective antigen of reptococcal); anti-S-Spa
(1-23) C (rabbit antiserum to KLH-linked synthetic peptide copying the N-terminal 23 amino acids of Spa); anti-rM18 (rabbit antiserum to complete recombinant type 18 M protein) used. Details of the assay are provided in Example 3. The experiment was repeated at least three times with similar results. The data shown is from one representative experiment. Briefly, sera from all three rabbits opsonized both the parental strain of Group A Streptococcus and the M18Ω strain (Table 3). This confirmed the presence of an opsonizing epitope in this restricted region of Spa. S
Antisera to synthetic peptides at pa were also used to identify native proteins in M18Ω phage lysin extracts. S-Spa18 (1-23) C
The antiserum was expressed at 50 kDa apparent M.D. in lysin extract. W. (Figure 3D). This indicates that Spa induced by pepsin
Was a fragment of a larger native protein.

【０１７４】[0174]

【表３】 [Table 3]

【０１７５】 オプソニン作用のアッセイの結果を、実施例３に記載するような間接的な殺菌
性の試験によって確認した。抗ｒＭ１８（完全な組換えの１８型のＭタンパク質
に対するウサギの抗血清）；抗粗ｐｅｐ Ｍ１８（１８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓの全体の部分的に精製したペプシン抽出物に対するウサギの抗血清）；
抗Ｓｐａ（精製したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの防御的な抗原に対するウサギ
の抗血清）を使用した。表４に提供する結果は、Ｓｐａ抗血清がＭ１８およびＭ
１８Ωの両方に対して殺菌性であったが、ｒＭ１８に対する抗血清は、親のＭ１
８株のみに対して殺菌性であり、そしてＭ１８Ωに対しては殺菌性ではなかった
ことを示す。The results of the opsonization assay were confirmed by indirect bactericidal tests as described in Example 3. Anti-rM18 (rabbit antiserum to intact recombinant type 18 M protein); anti-crude pep M18 (type 18 Streptococcal
rabbit antiserum against whole partially purified pepsin extract of Ccus);
Anti-Spa (rabbit antiserum against purified Streptococcus protective antigen) was used. The results provided in Table 4 show that the Spa antiserum was M18 and M
Although antisera to rM18 was bactericidal to both 18Ω, the parental M1
It is bactericidal for only 8 strains and not bactericidal for M18Ω.

【０１７６】[0176]

【表４】 [Table 4]

【０１７７】 （実施例６） （Ｓｐａ抗血清によるＡ群のＳｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓの異種血清型のオプソ
ニン作用） Ｓｐａが１８型以外のＡ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの血清型に対してオ
プソニン作用性の抗体を誘発するかどうかを決定するために、オプソニン作用ア
ッセイを、精製したＳｐａに対する抗血清、またはｐｅｐ Ｍ１８Ωに対する抗
血清、および一連の選択したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを用いて行った（表５
）。両方の抗血清が、１８型の生物体に加えて、３型および２８型のＳｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓにオプソニン作用を行った。いずれの抗血清によってもオプソ
ニン作用を受けなかった試験した血清型は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ１３、
Ｍ１４、Ｍ１９、およびＭ２４であった。これらの全ては、本発明者らの研究室
のコレクションによるものであった。抗Ｓ−Ｓｐａ１８（１−２３）Ｃ抗血清は
、３型または２８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓにオプソニン作用を行わなか
った。このことは、Ｓｐａのこの限定された領域が、交差オプソニン作用性のエ
ピトープを含まないことを示す。(Example 6) (Opsonic action of heterologous serotype of Streptococcus of group A by Spa antiserum) Does Spa induce an opsonizing antibody to serotype of Streptococcus of group A other than type 18? To determine whether an opsonization assay was performed using purified antisera to Spa or antisera to pep M18Ω and a series of selected Streptococcus (Table 5).
). Both antisera, in addition to type 18 organisms, also have type 3 and type 28 Strep
Tococcus was opsonized. The serotypes tested that were not opsonized by any of the antisera were M1, M2, M5, M6, M13,
M14, M19, and M24. All of this was from our laboratory collection. The anti-S-Spa18 (1-23) C antiserum did not opsonize type 3 or 28 Streptococcus. This indicates that this restricted region of Spa does not contain a cross opsonizing epitope.

【０１７８】[0178]

【表５】 [Table 5]

【０１７９】 （実施例７） （ｓｐａ１８遺伝子のクローン化したフラグメントの核酸配列およびアミノ酸
配列） ｓｐａ１８遺伝子のフラグメントを、ＰＣＲ、ならびにＮ末端のペプチド配列
およびＳｐａのＬｙｓＣ消化物から精製した内部ペプチドの配列に基づく縮重イ
ノシン含有オリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローン化した。アミノ酸
残基７〜１１に由来するＳｐａのＮ末端配列由来の正方向のプライマーのセット
は、以下の配列を含んだ：ＧＡＲ ＧＴＩ ＧＣＩ ＧＡＹ ＣＣ（配列番号６
）。内部ペプチドのＮ末端配列由来の逆方向プライマーは、以下の配列を含んだ
：ＲＴＧ ＩＧＡ ＹＴＣ ＲＣＴ ＲＴＣおよびＲＴＧ ＲＣＴ ＹＴＣ Ｉ
ＧＡ ＲＴＣ（配列番号７）。ヌクレオチドの略号は、核酸についてのＩＵＰＡ
Ｃコードに従う。ＰＣＲを、鋳型として１８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに
由来する染色体ＤＮＡを使用して、以前に記載するように行った。上記に列挙す
る第２の逆方向プライマーと組み合わせた正方向プライマーは、３３６ｂｐの単
一のＰＣＲ産物を生じた。これを、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に連結した。ＤＮＡ配列決定を、Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃ
ｅｓ Ｃｅｎｔｅｒの自動化された技術によって、プラスミドの５’隣接末端お
よび３’隣接末端に由来するプライマーを使用して行った。ｓｐａ配列の正体を
、縮重ＰＣＲプライマーを構築するためには使用しなかった、Ｓｐａのアミノ酸
配列に翻訳されたＤＮＡ配列を比較することによって確認した。Example 7 Nucleic acid sequence and amino acid sequence of cloned fragment of spa18 gene Fragment of spa18 gene was purified by PCR and N-terminal peptide sequence and sequence of internal peptide purified from LysC digest of Spa Cloned using degenerate inosine-containing oligonucleotide primers based on The set of forward primers from the N-terminal sequence of Spa from amino acid residues 7-11 included the following sequences: GAR GTI GCI GAY CC (SEQ ID NO: 6)
). The reverse primer from the N-terminal sequence of the internal peptide contained the following sequences: RTG IGA YTC RCT RTC and RTG RCT YTC I
GA RTC (SEQ ID NO: 7). Nucleotide abbreviations refer to IUPA for nucleic acids
Follow C code. PCR was performed as previously described using chromosomal DNA from Streptococcus type 18 as a template. The forward primer in combination with the second reverse primer listed above yielded a single 336 bp PCR product. This is called pCR2.1-TOPO (Invitrog
en, Carlsbad, CA). DNA sequencing was performed using Native
rity of Tennessee Molecular Resource
Performed by automated techniques from es Center using primers from the 5 'and 3' flanking ends of the plasmid. The identity of the spa sequence was confirmed by comparing the DNA sequence translated into the amino acid sequence of Spa, which was not used to construct degenerate PCR primers.

【０１８０】 ３３６ｂｐのＰＣＲ産物および翻訳されたアミノ酸配列は、Ｓｐａタンパク質
に由来する配列の残基１２〜２３を含んだ（図４）。このことによって、ＤＮＡ
がｓｐａ１８のフラグメントであることが確認された。ＧｅｎＢａｎｋ中の現在
の登録物の検索、および１型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのゲノム配列データ
ベースは、ｓｐａ１８遺伝子のフラグメントが、任意の既知のタンパク質と配列
相同性を共有しなかったことを明らかにした。このことは、Ｓｐａが、Ａ群のＳ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの新規の防御的な抗原であることを示唆する。The 336 bp PCR product and translated amino acid sequence contained residues 12-23 of the sequence from the Spa protein (FIG. 4). This allows DNA
Is a fragment of spa18. A search of the current registry in GenBank, and the Streptococcus type 1 genomic sequence database revealed that fragments of the spa18 gene did not share sequence homology with any known protein. This means that Spa is S
It is suggested to be a novel protective antigen of Treptococcus.

【０１８１】 標準的な分子生物学的技術を、ｓｐａタンパク質をコードする全長のｃＤＮＡ
を得るために使用した。全長のｃＤＮＡの配列およびコードされるタンパク質の
配列を、図５および６にそれぞれ示す。全長のタンパク質は、３７残基のシグナ
ルペプチドを含み、このシグナルペプチドが切断されて、配列番号３として同定
された２３残基のペプチドと同じＮ末端を有する成熟ｓｐａポリペプチドが形成
される。[0181] Standard molecular biology techniques are used to construct a full-length cDNA encoding the spa protein.
Used to get. The sequences of the full-length cDNA and the encoded protein are shown in FIGS. 5 and 6, respectively. The full-length protein contains a 37 residue signal peptide that is cleaved to form a mature spa polypeptide having the same N-terminus as the 23 residue peptide identified as SEQ ID NO: 3.

【０１８２】 上記から、本発明の特定の実施形態が例示の目的のために本明細書中に記載さ
れているが、種々の改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ
得ることが、明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場
合を除いて、制限されない。From the foregoing, while particular embodiments of the present invention have been described herein for purposes of illustration, various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention. That is clear. Accordingly, the invention is not limited except as by the appended claims.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は、ｒＭ１８（レーンＡおよびＢ）、ＳＭ１８（１−３０）（レーンＣお
よびＤ）、およびＳＭ５（２６５−２９１）（レーンＥおよびＦ）に対するウサ
ギの抗血清と反応させた、Ｍ１８（レーンＡ、Ｃ、およびＥ）およびＭ１８Ω（
レーンＢ、Ｄ，およびＦ）の全細胞の抽出物のウェスタンブロット分析を示す。
両方の株に由来する抽出物中の複数のタンパク質が、クマシーブルで染色された
（Ｍ１８、レーンＧおよびＭ１８Ω、レーンＨ）。FIG. 1 shows the reaction of rabbit antisera against rM18 (lanes A and B), SM18 (1-30) (lanes C and D), and SM5 (265-291) (lanes E and F). M18 (lanes A, C, and E) and M18Ω (
Figure 5 shows a Western blot analysis of extracts of whole cells in lanes B, D, and F).
Multiple proteins in extracts from both strains were stained with Coomassie Blue (M18, lanes G and M18Ω, lane H).

【図２】 図２は、Ｍ１８Ωの粗ペプシン抽出物中でのＳｐａの同定を示す。抽出物を、
分配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、そしてゲル全体を、ニト
ロセルロースペーパーに移した。ペーパーの末端を縦に切断し、そしてクマシー
ブルーで染色した。中央の切片を水平方向の、約１０〜１２ｍｍの幅の小片に切
断し、そしてそれぞれの小片を、画分の番号で識別する。これらの小片を、より
小さい断片に切断し、そして粗ｐｅｐ Ｍ１８Ωに対するウサギの抗血清に由来
するオプソニン作用性の抗体を吸着させるために使用した。オプソニン作用のア
ッセイを、Ｍ１８Ω株、それぞれの吸着した抗血清、および１ｍｇ／ｍｌのｐｅ
ｐ Ｍ１８もしくはｐｅｐ Ｍ１８Ωを用いて阻害した抗血清を使用して行った
。パーセント阻害は、吸着させていない抗血清を用いて達成されたオプソニン作
用のレベルに基づいた。FIG. 2 shows the identification of Spa in M18Ω crude pepsin extract. Extract
Separation was performed by partitioning polyacrylamide gel electrophoresis, and the entire gel was transferred to nitrocellulose paper. The end of the paper was cut longitudinally and stained with Coomassie blue. The middle section is cut into horizontal pieces, about 10-12 mm wide, and each piece is identified by a fraction number. These pieces were cut into smaller fragments and used to adsorb opsonizing antibodies from rabbit antiserum to crude pep M18Ω. Opsonization assays were performed using the M18Ω strain, each adsorbed antiserum, and 1 mg / ml pe.
Performed using antisera inhibited with pM18 or pep M18Ω. Percent inhibition was based on the level of opsonization achieved with the non-adsorbed antiserum.

【図３】 図３は、Ｓｐａの精製したフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（
レーンＡおよびＢ）、およびファージリジンによって抽出したネイティブのタン
パク質のウェスタンブロット分析（レーンＣおよびＤ）を示す。粗ｐｅｐ Ｍ１
８Ω（レーンＡ）および精製したＳｐａ（レーンＢ）を、還元条件下で１０％の
ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、そしてクマシーブルーで染色した。精
製したＳｐａは、２４ｋＤａの見かけの分子量で移動した。ウェスタンブロット
分析を、Ｃ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌのファージに結合させたリジンによ
ってＭ１８Ωの細胞壁から解離させたネイティブのＳｐａを同定するために行っ
た。粗リジン抽出物は、クマシーブルーで染まった複数のタンパク質を含んだ（
レーンＣ）。Ｓｐａの合成のペプチドに対する抗血清は、５０ｋＤａの見かけの
Ｍ．Ｗ．を有する抽出物中の単一のタンパク質と反応した（レーンＤ）。FIG. 3 shows polyacrylamide gel electrophoresis (PGA) of purified fragments of Spa.
Lanes A and B) and Western blot analysis of native proteins extracted by phage lysine (lanes C and D). Coarse pep M1
8Ω (lane A) and purified Spa (lane B) were electrophoresed in a 10% polyacrylamide gel under reducing conditions and stained with Coomassie blue. The purified Spa migrated at an apparent molecular weight of 24 kDa. Western blot analysis was performed to identify native Spa dissociated from the M18Ω cell wall by lysine bound to the Streptococcal phage of group C. The crude lysine extract contained multiple proteins stained with Coomassie blue (
Lane C). The antiserum to the synthetic peptide of Spa was 50 kDa apparent M.P. W. Reacted with a single protein in the extract with (lane D).

【図４】 図４は、単離したＳｐａ遺伝子の部分的なＤＮＡ配列、およびＳｐａポリペプ
チドの推定のアミノ酸配列を示す。配列は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されており、
そして登録番号ＡＦ０８６８１３号を有する。FIG. 4 shows the partial DNA sequence of the isolated Spa gene and the deduced amino acid sequence of the Spa polypeptide. The sequence has been deposited with GenBank,
It has the registration number AF086813.

【図５】 図５（図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃに示す）は、Ｓｐａポリペプチドをコードす
る配列番号４に記載されている全長のＤＮＡ配列を示す。開始コドンは、１４５
位で開始し、シグナルペプチドが、１４５〜２５５位によってコードされ、そし
て成熟タンパク質は２５６位で開始する。FIG. 5 (shown in FIGS. 5A, 5B, and 5C) shows the full-length DNA sequence set forth in SEQ ID NO: 4, which encodes a Spa polypeptide. The start codon is 145
Starting at position, the signal peptide is encoded by positions 145-255, and the mature protein starts at position 256.

【図６】 図６は、配列番号５に記載されている全長のＳｐａポリペプチドのアミノ酸配
列を示す。１〜３７位のシグナルペプチドに下線を付す。FIG. 6 shows the amino acid sequence of the full-length Spa polypeptide set forth in SEQ ID NO: 5. The signal peptide at positions 1-37 is underlined.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ０７Ｋ 14/315 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 31/04 16/12 Ｃ０７Ｋ 14/315 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/12 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 5/00 Ａ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA04 CA07 GA11 HA01 4B065 AA19 AA26X AA36 AA41X AA46X AA49Y AA50X AA53X AA60X AA77X AA79X AA88X AA90X AB01 AC14 AC20 BA02 BD50 CA24 CA43 CA45 4C084 AA02 AA07 BA02 BA17 CA04 DC50 MA02 MA52 MA59 MA65 NA14 ZB352 4C085 AA03 AA13 AA14 BA14 BB11 CC04 CC05 CC07 DD22 EE01 GG02 GG03 GG04 GG08 4C087 AA01 AA02 AA03 BC61 CA12 MA02 MA52 MA65 MA66 NA14 ZB35 4H045 AA11 AA30 CA11 DA75 DA86 EA31 FA72 FA73 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 39/395 C07K 14/315 4H045 A61P 31/04 16/12 C07K 14/315 C12N 1/15 16/12 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 15/00 ZNAA 1/21 5/00 A 5/10 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU) , TJ, TM) AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD , GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US , UZ, VN, YU, ZA, ZWF Term (Reference) 4B024 AA01 BA31 CA04 CA07 GA11 HA01 4B065 AA19 AA26X AA36 AA41X AA46X AA49Y AA50X AA53X AA60X AA77X AA79X AA88X A04 CA02 A04 CA04 A04 CA04 DC50 MA02 MA52 MA59 MA65 NA14 ZB352 4C085 AA03 AA13 AA14 BA14 BB11 CC 04 CC05 CC07 DD22 EE01 GG02 GG03 GG04 GG08 4C087 AA01 AA02 AA03 BC61 CA12 MA02 MA52 MA65 MA66 NA14 ZB35 4H045 AA11 AA30 CA11 DA75 DA86 EA31 FA72 FA73 FA74 FA74

Claims (44)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列番号２または配列番号５に対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性
を有するポリペプチドを含有している、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種から単離
された、Ｓｐａポリペプチド。1. A Spa polypeptide isolated from a Streptococcus species containing a polypeptide having at least 50% amino acid sequence identity to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5. 【請求項２】 前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏ
ｇｅｎｅｓ種のメンバーである、請求項１に記載の単離されたＳｐａポリペプチ
ド。2. The method according to claim 1, wherein the Streptococcus is Streptococcus pyro.
2. The isolated Spa polypeptide of claim 1, which is a member of the genes species. 【請求項３】 前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓが、１８型、３型、および２８型から選択さ
れるＡ群の血清型である、請求項２に記載の単離されたＳｐａポリペプチド。3. The isolated Spa polypeptide of claim 2, wherein the Streptococcus is a Group A serotype selected from type 18, type 3, and type 28. 【請求項４】 前記Ａ群の血清型が１８型である、請求項３に記載の単離されたＳｐａポリペ
プチド。4. The isolated Spa polypeptide of claim 3, wherein the serotype of group A is type 18. 【請求項５】 前記Ａ群の血清型が３型である、請求項３に記載の単離されたＳｐａポリペプ
チド。5. The isolated Spa polypeptide of claim 3, wherein the serotype of group A is type 3. 【請求項６】 前記Ａ群の血清型が２３型である、請求項３に記載の単離されたＳｐａポリペ
プチド。6. The isolated Spa polypeptide of claim 3, wherein the serotype of group A is type 23. 【請求項７】 配列番号２もしくは配列番号５のアミノ酸配列またはそれらの改変体を含有す
る、単離されたＳｐａポリペプチドであって、ここで、該改変体は、配列番号２
または配列番号５に対して、保存的なアミノ酸の置換を有するアミノ酸配列、ま
たは少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＳ
ｐａポリペプチド。7. An isolated Spa polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 or a variant thereof, wherein the variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
Alternatively, an isolated S sequence comprising an amino acid sequence having conservative amino acid substitutions or an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 5.
pa polypeptide. 【請求項８】 前記Ｓｐａポリペプチドが、オプソニン作用性のエピトープを含む、請求項１
から７のいずれか１項に記載の単離されたＳｐａポリペプチド。8. The method of claim 1, wherein the Spa polypeptide comprises an opsonizing epitope.
8. The isolated Spa polypeptide of any one of claims 1 to 7. 【請求項９】 請求項８に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで、前記オプソニン
作用性のエピトープが、該ポリペプチドが細胞中で発現される場合に、該細胞の
外表面上に曝される該ポリペプチドのＮ末端の一部に由来する連続するアミノ酸
を含む、単離されたポリペプチド。9. The isolated polypeptide of claim 8, wherein the opsonizing epitope is located on the outer surface of the cell when the polypeptide is expressed in the cell. An isolated polypeptide comprising contiguous amino acids from a portion of the N-terminus of the polypeptide exposed above. 【請求項１０】 請求項９に記載の単離されたＳｐａポリペプチドであって、ここで、前記オプ
ソニン作用性のエピトープが、該ポリペプチドのＮ末端の少なくとも２３個の連
続するアミノ酸を含む、単離されたＳｐａポリペプチド。10. The isolated Spa polypeptide of claim 9, wherein the opsonic epitope comprises at least 23 contiguous N-terminal amino acids of the polypeptide. An isolated Spa polypeptide. 【請求項１１】 請求項１に記載のＳｐａポリペプチドのＮ末端の少なくとも２３個のアミノ酸
を含む、ペプチド。11. A peptide comprising at least the N-terminal 23 amino acids of the Spa polypeptide of claim 1. 【請求項１２】 配列番号３のアミノ酸配列またはその改変体を含む、請求項１１に記載のペプ
チドであって、ここで、該改変体は、配列番号３に対して、保存的なアミノ酸の
置換を有するアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するアミ
ノ酸配列を含む、請求項１１に記載のペプチド。12. The peptide of claim 11, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or a variant thereof, wherein said variant is a conservative amino acid substitution for SEQ ID NO: 3. 12. The peptide of claim 11, comprising an amino acid sequence having the sequence: or an amino acid sequence having at least 80% sequence identity. 【請求項１３】 請求項１から１０のいずれか１項に記載のＳｐａポリペプチドを含む、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染に対して動物を防御するための、免疫原。13. A Str comprising a Spa polypeptide according to any one of claims 1 to 10.
An immunogen to protect animals against eptococcus infection. 【請求項１４】 請求項１１または請求項１２のいずれか１項に記載のペプチドを含む、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染に対して動物を防御するための、免疫原。14. A Str comprising the peptide of any one of claims 11 or 12.
An immunogen to protect animals against eptococcus infection. 【請求項１５】 請求項１１または請求項１２のいずれか１項に記載のペプチドに由来する、少
なくとも８個の連続するアミノ酸を含むペプチドを含有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ感染に対して動物を防御するための、免疫原。15. A Streptoc containing a peptide comprising at least 8 contiguous amino acids derived from the peptide of any one of claims 11 or 12.
An immunogen to protect animals against occus infection. 【請求項１６】 前記免疫原が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの１より多い血清型に対する交差防
御を提供する、請求項１５に記載の免疫原。16. The immunogen of claim 15, wherein said immunogen provides cross protection against more than one serotype of Streptococci. 【請求項１７】 前記交差防御が、Ａ群の血清型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉに対して提供され
る、請求項１６に記載の免疫原。17. The immunogen of claim 16, wherein said cross protection is provided against Streptococci of group A serotype. 【請求項１８】 交差防御が、３型、１８型、および２８型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉから選
択されるＡ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉに対して提供される、請求項１７に記
載の免疫原。18. The immunogen of claim 17, wherein cross-protection is provided against Streptococci of group A selected from Streptococci of type 3, type 18, and type 28. 【請求項１９】 請求項１に記載のＳｐａポリペプチド上に存在するエピトープに特異的に結合
する、抗体。19. An antibody that specifically binds to an epitope present on the Spa polypeptide of claim 1. 【請求項２０】 請求項１１に記載のペプチド上に存在するエピトープに特異的に結合する、抗
体。20. An antibody that specifically binds to an epitope present on the peptide of claim 11. 【請求項２１】 前記エピトープが、前記Ｓｐａポリペプチドの少なくとも８個の連続するアミ
ノ酸を含む、請求項１９に記載の抗体。21. The antibody of claim 19, wherein said epitope comprises at least eight consecutive amino acids of said Spa polypeptide. 【請求項２２】 前記ペプチドが、前記ＳｐａポリペプチドのＮ末端の少なくとも８個の連続す
るアミノ酸を含む、請求項２０に記載の抗体。22. The antibody of claim 20, wherein said peptide comprises at least eight consecutive amino acids at the N-terminus of said Spa polypeptide. 【請求項２３】 前記抗体が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種のＭタンパク質には結合しない、
請求項１９に記載の抗体。23. The antibody does not bind to a Streptococcus species M protein.
The antibody according to claim 19. 【請求項２４】 前記抗体が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種のＭタンパク質には結合しない、
請求項２０に記載の抗体。24. The antibody does not bind to M protein of Streptococcus species.
An antibody according to claim 20. 【請求項２５】 単離された核酸分子であって、配列番号１もしくは配列番号４、または請求項
１に記載のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＳｐａポリペプチドをコードする配列
、あるいは該核酸分子の相補体を含有する、単離された核酸分子。25. An isolated nucleic acid molecule comprising SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4, the sequence encoding the Streptococcus Spa polypeptide of claim 1, or the complement of the nucleic acid molecule. , An isolated nucleic acid molecule. 【請求項２６】 配列番号１もしくは配列番号４、配列番号１もしくは配列番号４の相補体、ま
たはそれらの改変体から選択される配列を含有している、単離された核酸分子で
あって、ここで、該改変体が、遺伝的コードに起因して配列番号１または配列番
号４と縮重する配列番号２または５のポリペプチドをコードする配列；配列番号
２もしくは配列番号５のポリペプチドに対して保存的なアミノ酸の置換を有する
ポリペプチドをコードする配列、または配列番号２もしくは配列番号５に対して
少なくとも５０％同一であるポリペプチドをコードする配列、から選択される、
単離された核酸分子。26. An isolated nucleic acid molecule comprising a sequence selected from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4, the complement of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4, or a variant thereof, Wherein the variant encodes a polypeptide of SEQ ID NO: 2 or 5 that is degenerate from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 due to the genetic code; A sequence encoding a polypeptide having conservative amino acid substitutions, or a polypeptide encoding at least 50% identical to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5,
An isolated nucleic acid molecule. 【請求項２７】 中程度にストリンジェントな条件下で、請求項２６に記載の核酸分子にハイブ
リダイズする配列を含む、単離された核酸分子。27. An isolated nucleic acid molecule comprising a sequence that hybridizes under moderately stringent conditions to the nucleic acid molecule of claim 26. 【請求項２８】 配列番号２または配列番号５に対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性
を有するポリペプチドを含むＳｐａポリペプチドに由来する、オプソニン作用性
のエピトープをコードする配列を含有している、単離された核酸分子。28. It contains a sequence encoding an opsonizing epitope derived from a Spa polypeptide comprising a polypeptide having at least 50% amino acid sequence identity to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5. , An isolated nucleic acid molecule. 【請求項２９】 前記配列が、少なくとも１つの他のペプチド配列に融合されたオプソニン作用
性のエピトープを含有する融合ポリペプチドをコードする、請求項２８に記載の
核酸分子。29. The nucleic acid molecule of claim 28, wherein said sequence encodes a fusion polypeptide containing an opsonizing epitope fused to at least one other peptide sequence. 【請求項３０】 前記他のペプチド配列が、細胞性抽出物に由来する融合ポリペプチドの単離を
容易にするタグ配列を含有する、請求項２９に記載の核酸分子。30. The nucleic acid molecule of claim 29, wherein said other peptide sequence contains a tag sequence that facilitates isolation of a fusion polypeptide derived from a cellular extract. 【請求項３１】 前記他のペプチド配列が、キャリアタンパク質である、請求項２９に記載の核
酸分子。31. The nucleic acid molecule of claim 29, wherein said other peptide sequence is a carrier protein. 【請求項３２】 プロモーターに作動可能に連結された、請求項２５〜３１のいずれか１項に記
載の単離された核酸分子を含有しているベクターであって、ここで、該ペクター
は、該ベクターが宿主細胞中に導入された場合に、該単離された核酸によってコ
ードされるポリペプチドを発現する、ベクター。32. A vector containing the isolated nucleic acid molecule of any one of claims 25 to 31 operably linked to a promoter, wherein the vector is A vector that expresses a polypeptide encoded by the isolated nucleic acid when the vector is introduced into a host cell. 【請求項３３】 請求項３２に記載のベクターを保有している、宿主細胞。33. A host cell carrying the vector of claim 32. 【請求項３４】 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染から動物を防御するための治療用組成物であ
って、該組成物は、生物学的に受容可能な希釈剤および以下から選択される有効
量の免疫化試薬： ａ）配列番号２または配列番号５に対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同
一性を有するポリペプチドを含有している、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓから単
離されたＳｐａポリペプチド； ｂ）ａ）のＳｐａポリペプチドから得られるオプソニン作用性のエピトープを
含む、免疫原； ｃ）ａ）のＳｐａポリペプチドから得られるオプソニン作用性のエピトープを
発現する、宿主細胞；または ｄ）ａ）のＳｐａポリペプチドに特異的に結合する、抗体、 を含有している、治療用組成物。34. A therapeutic composition for protecting an animal from Streptococcus infection, said composition comprising a biologically acceptable diluent and an effective amount of an immunizing reagent selected from: a A) a Spa polypeptide isolated from Streptococcus, containing a polypeptide having at least 50% amino acid sequence identity to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5; b) obtained from the Spa polypeptide of a). An immunogen comprising an opsonic epitope; c) a host cell expressing an opsonic epitope obtained from the Spa polypeptide of a); or d) a specific binding to the Spa polypeptide of a). A therapeutic composition comprising an antibody. 【請求項３５】 前記免疫化試薬が、請求項１に記載のＳｐａポリペプチドである、請求項３４
に記載の組成物。35. The immunization reagent is a Spa polypeptide according to claim 1.
A composition according to claim 1. 【請求項３６】 前記免疫化試薬が、請求項１１に記載のペプチドである、請求項３４に記載の
組成物。36. The composition of claim 34, wherein said immunizing reagent is a peptide of claim 11. 【請求項３７】 前記免疫化試薬が、請求項１５に記載の免疫原である、請求項３４に記載の組
成物。37. The composition of claim 34, wherein said immunizing reagent is the immunogen of claim 15. 【請求項３８】 前記免疫化試薬が、キャリアに対して結合される、請求項３７に記載の組成物
。38. The composition of claim 37, wherein said immunization reagent is conjugated to a carrier. 【請求項３９】 前記免疫化試薬が、請求項３３に記載の宿主細胞である、請求項３４に記載の
組成物。39. The composition of claim 34, wherein said immunizing reagent is a host cell of claim 33. 【請求項４０】 前記免疫化試薬が、請求項１９に記載の抗体である、請求項３４に記載の組成
物。40. The composition of claim 34, wherein said immunizing reagent is an antibody of claim 19. 【請求項４１】 請求項３４に記載の治療用組成物を動物に対して投与する工程を包含する、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染に対して動物を防御するための治療方法であって
、ここで、該治療用組成物の投与が該動物においてオプソニン作用性の抗体を誘
発する、方法。41. A method comprising administering the therapeutic composition of claim 34 to an animal.
A therapeutic method for protecting an animal against a Treptococcus infection, wherein administration of said therapeutic composition elicits an opsonizing antibody in said animal. 【請求項４２】 防御が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの１より多い血清型に対して提供される、
請求項４１に記載の方法。42. The protection is provided against more than one serotype of Streptococci.
42. The method of claim 41. 【請求項４３】 前記治療用組成物が、経口投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、または
血管でのワクチン接種によって投与される、請求項４１に記載の方法。43. The method of claim 41, wherein said therapeutic composition is administered by oral, intranasal, intramuscular, subcutaneous, or vascular vaccination. 【請求項４４】 前記動物がヒトである、請求項４１に記載の方法。44. The method of claim 41, wherein said animal is a human.