JP2002531517A5 - - Google Patents
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Description
【書類名】 明細書
【発明の名称】 異所性石灰化を阻害する方法
【特許請求の範囲】
【請求項1】 個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、治療有効量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを含有する、組成物。
【請求項2】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記異所性石灰化が、アテローム性動脈硬化症、狭窄症、再狭窄、人工弁置換、血管形成術、腎不全、組織損傷、糖尿病および老化からなる群から選択される状態と関連する、組成物。
【請求項3】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンが、配列番号2のアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドまたはその機能的フラグメントである、組成物。
【請求項4】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントが、薬学的に受容可能なキャリアと共に投与するために処方される、組成物。
【請求項5】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントが、前記異所性石灰化の部位に投与するのに適している、組成物。
【請求項6】 請求項5に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントが、プロテーゼデバイスと接触するのに適している、組成物。
【請求項7】 請求項6に記載の組成物であって、ここで、前記プロテーゼデバイスが、生体人工心臓弁である、組成物。
【請求項8】 請求項6に記載の組成物であって、ここで、前記接触が、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの、前記プロテーゼデバイスへの付着を包含する、組成物。
【請求項9】 請求項6に記載の組成物であって、ここで、前記接触が、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを発現する細胞の、前記プロテーゼデバイスへの付着を包含する、組成物。
【請求項10】 請求項9に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを組換え発現する、組成物。
【請求項11】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンの有効量が、ヒドロキシアパタイト結晶に結合しそして鉱化作用を阻害するのに十分な量をさらに包含する、組成物。
【請求項12】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンの有効量が、局所的な微小環境を酸性化しそして鉱化作用を阻害するように細胞を刺激するのに十分な量をさらに包含する、組成物。
【請求項13】 請求項12に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、炭酸脱水酵素IIを発現する、組成物。
【請求項14】 請求項13に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、多核性異物巨細胞である、組成物。
【請求項15】 請求項13に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、マクロファージである、組成物。
【請求項16】 異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、有効量のマクロファージを含有し、該有効量のマクロファージが、該異所性石灰化の部位で鉱化した沈着物を溶解し、そしてそれにより該異所性石灰化を阻害するのに十分である、組成物。
【請求項17】 請求項16に記載の組成物であって、ここで、前記マクロファージが、炭酸脱水酵素IIを発現することにより局所的な微小環境を酸性化する、組成物。
【請求項18】 請求項16に記載の組成物であって、該組成物は、オステオポンチンをさらに含有し、それにより前記マクロファージによる前記局所的な微小環境の酸性化を刺激する、組成物。
【請求項19】 請求項16に記載の組成物であって、ここで、前記マクロファージが、プロテーゼデバイスと接触するのに適している、組成物。
【請求項20】 請求項19に記載の組成物であって、ここで、前記プロテーゼデバイスが、生体人工心臓弁である、組成物。
【請求項21】 異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、有効量の多核性異物巨細胞を含有し、該有効量の多核性異物巨細胞が、該異所性石灰化の部位で鉱化した沈着物を溶解し、そしてそれにより該異所性石灰化を阻害するのに十分である、組成物。
【請求項22】 請求項21に記載の組成物であって、ここで、前記多核性異物巨細胞が、炭酸脱水酵素IIを発現することにより局所的な微小環境を酸性化する、組成物。
【請求項23】 請求項21に記載の組成物であって、該組成物は、オステオポンチンをさらに含有し、それにより前記多核性異物巨細胞による局所的な微小環境の酸性化を刺激する、組成物。
【請求項24】 請求項21に記載の組成物であって、ここで、前記多核性異物巨細胞が、プロテーゼデバイスと接触するのに適している、組成物。
【請求項25】 請求項24に記載の組成物であって、ここで前記プロテーゼデバイスが、生体人工心臓弁である、組成物。
【請求項26】 異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、該異所性石灰化の部位に対して酸生成細胞を補充するために十分な有効量のオステオポンチンを含有し、該異所性石灰化の部位で該酸生成細胞が、該異所性石灰化の阻害を促進する、組成物。
【請求項27】 請求項26に記載の組成物であって、ここで、前記酸生成細胞が炭酸脱水酵素IIを発現する、組成物。
【請求項28】 請求項26に記載の組成物であって、ここで、前記酸生成細胞がマクロファージである、組成物。
【請求項29】 請求項26に記載の組成物であって、ここで、前記酸生成細胞が多核性異物巨細胞である、組成物。
【請求項30】 異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、該異所性石灰化の部位で炭酸脱水酵素IIの発現を増加するために十分な有効量のオステオポンチンを含有し、ここで、該異所性石灰化の部位での該炭酸脱水酵素IIの発現が、該異所性石灰化の阻害を促進する、組成物。
【請求項31】 請求項30に記載の組成物であって、ここで、前記炭酸脱水酵素IIが、多核性異物巨細胞により発現される、組成物。
【請求項32】 請求項30に記載の組成物であって、ここで、前記炭酸脱水酵素IIが、マクロファージにより発現される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【0001】
(異所性石灰化を阻害する方法)
本発明は、国立保健研究所(National Institutes of Health)より授与された助成金番号HL40079−6A2およびHL18645、ならびに全米科学財団(National Science Foundation)により授与された助成金番号EEC9520161の下で政府の援助によりなされた。合衆国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【0002】
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、一般的に医学分野、そしてより特異的には異所性石灰化を阻害する方法に関する。
【0003】
(背景情報)
歯または骨以外の組織でのカルシウムの結晶の沈着とは、異所性石灰化と言われ、腎不全、心臓血管疾患、糖尿病および加齢過程と関連して一般的に生じる。腎不全を有する患者、特に長期の血液透析を受け、そして血清の鉱物バランスを適切に調節し得ない患者において、肺、心臓、胃および腎臓を含む内部器官における石灰化が頻繁に見出される。より低い程度で一般的に、血液透析の患者は、有痛性の石灰化した皮膚病変を発生し、その皮膚病変は、非治癒性の潰瘍または壊疽に進行し、そして罹患した肢の切断を必要とする。
【0004】
異所性石灰化はまた、生体人工心臓弁の移植の通常の合併症であり、そして置換弁不全の主要な原因である。異所性石灰化はまた、アテローム硬化症、糖尿病および心臓血管の疾患に関連して天然の心臓弁および血管に生じる。脈管構造における鉱物の沈着は、口を狭くし、そして罹患した弁および血管の壁を硬化し、心臓および末梢器官への血流の減少を生じる。従って、異所性石灰化は、弁不全、発作、虚血および心筋梗塞の危険を増大する。
【0005】
異所性石灰化の部位において(例えば、アテローム硬化症プラークおよび石灰化した大動脈弁において)、豊富な1つのタンパク質は、オステオポンチンである。オステオポンチンは、細胞の接着、伝播、および移動の促進を含むいくつかの既知の機能を有する。オステオポンチンは、冠状アテローム硬化症プラークにおける初期の石灰化の部位と共存し、そして、その発現は、アテローム硬化症が進行するにつれて増加する。これらの知見は、インビトロでのオステオポンチンがカルシウム結合特性を有することを示す研究と組み合わされ、オステオポンチンが異所性石灰化に関与し得るという示唆を導いた。以前の研究は、インビボでの異所性石灰化におけるオステオポンチンの役割に取り及んでいない。
【0006】
未処置で放置される場合、異所性石灰化は、罹患率および死の増加を生じる。血清の鉱物レベルを正規化するための、または血管組織または移植片の石灰化を阻害するための現在の治療は、効力が制限され、そして受容可能でない副作用を引き起こす。
【0007】
従って、異所性石灰化を阻害する有効な方法に対する必要性が存在する。本発明は、この必要性を充たし、そして関連する利点もまた提供する。
【0008】
(発明の要旨)
本発明は、個体において異所性石灰化を阻害する方法を提供する。この方法は、治療有効量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを個体に投与する工程からなる。この方法は、種々の条件(例えば、アテローム硬化症、狭窄症、再狭窄、人工弁置換、血管形成術、腎不全、組織損傷、糖尿病および加齢)に関連する異所性石灰化を阻害するために使用され得る。本発明はまた、異所性石灰化の部位に対して標的化された個体の酸生成細胞への投与によって異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本発明はさらに、オステオポンチンの投与によって、異所性石灰化の部位に対する酸生成細胞の補充を促進する工程からなる、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本発明はまた、オステオポンチンの投与により異所性石灰化の部位での炭酸脱水酵素IIの発現を増加する工程からなる、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。
【0009】
(発明の詳細な説明)
本発明は、異所性石灰化の阻害のための有効な方法に関する。異所性石灰化は、通常、腎不全、心臓血管疾患、糖尿病、および加齢過程に関連して生じる。脈管構造の異所性石灰化は、心筋梗塞、虚血、発作、血管形成術後の切開および心臓弁不全の個体の危険性を増大する。生体人工心臓弁のようなプロテーゼ移植片の異所性石灰化は、移植片不全の主要な原因である。ゆえに、この方法は、異所性石灰化に関連する疾患および死を減少する。
【0010】
この方法は、オステオポンチンが異所性石灰化を有効に、かつ特異的に阻害し得るという発見に基づく。従って、異所性石灰化は、治療有効量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを、個体に対応して全身または異所性石灰化の予想部位もしくは既知の部位に投与することによって予防または処置され得る。オステオポンチンが、石灰化した組織および異所性石灰化の部位において通常に見出されることから、それは、最小限の毒性または免疫原性の副作用で投与され得る。
【0011】
本明細書中で用いられるように、用語「異所性石灰化」とは、骨および歯以外の部位でのカルシウム結晶の異常な沈着を意味することを意図する。異所性石灰化は、細胞外マトリックスにおける巨視的な無定形のリン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイト沈着の蓄積に帰着する。
【0012】
異所性石灰化は、種々の組織および器官において生じ得、そして多くの臨床状態に関連する。例えば、異所性石灰化は、冒された組織への炎症または損傷の結果であり得るか、全身の鉱物不均衡より生じ得る。一般的に、異所性石灰化は、動脈、静脈、毛細血管、弁および洞を含む血管組織において生じる。血管への炎症または損傷は、例えば、環境要因(例えば、喫煙、高脂肪の食事)の結果として生じる。炎症または損傷はまた、創傷、血管手術、心臓手術または血管形成術から生じる血管への外傷の結果として生じ得る。血管の石灰化はまた、加齢および疾患(高血圧、アテローム硬化症、糖尿病、腎不全およびその後の透析、狭窄ならびに再狭窄を含む)に関連する。
【0013】
異所性石灰化はまた、腱(Rileyら、Ann.Rheum.Dis.55:109−115(1996))、皮膚(Evansら、Pediatric Dermatology 12:307−310(1997))、強膜(Daickerら、Opthalmologica 210:223−228(1996))および子宮筋層(McCluggageら、Int.J.Gynecol.Pathol.15:82−84(1996))のような非血管組織において生じる。(それらの各々は、本明細書中において参考として援用される)。全身の鉱物不均衡という結果を生じる疾患(例えば、腎不全および糖尿病)において、内部器官(肺、心臓、腎臓および胃を含む)における異所性石灰化は、通常である(本明細書中で参考として援用される、Hsu、Amer.J.Kidney Disease 4:641−649(1997))。さらに、異所性石灰化は、医用材料、プロテーゼおよび医療デバイス(例えば、生体人工心臓弁)の移植の頻繁な合併症である(本明細書中で参考として援用される、Vyavahareら、Cardiovascular Pathology 6:219−229(1997))。本発明の方法は、これらの状態のすべてに関連して生じる異所性石灰化に適用可能である。
【0014】
用語「異所性石灰化」とは、骨の形成および成長の間、骨基質内で通常に生じる石灰化をいうことを意図しない。本明細書中で使用されるように、異所性石灰化はまた、腎尿細管において生じる異常な石灰化、主要なシュウ酸含有カルシウム腎臓結石の形成を生じる尿とは異なる。
【0015】
本明細書中で使用されるように、用語「阻害する」とは、異所性石灰化を阻害することに関連して、細胞外マトリックスのヒドロキシアパタイト結晶の沈着の形成、増殖または沈着の予防、遅延または逆転を意味することを意図する。
【0016】
本明細書中で使用されるように、用語「オステオポンチン」とは、異所性石灰化を阻害し得る分子、およびオステオポンチンとして当該分野において公知な1つ以上の分子に対する認識可能な類似の分子を意味することを意図する。オステオポンチンは、約34kDaの推定分子量を有するリン酸化されたシアロタンパク質として特徴付けられる。高い陰性、翻訳後修飾および選択的にスプライジングされたアイソフォームに起因して、オステオポンチンは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって決定されたような約44kDaと85kDaの間の見かけの分子量を有すると報告されている(Giachelliら、Trends Cardiovasc.Med 5:88−95(1995))。オステオポンチンの翻訳後修飾形態、および選択的にスプライジングされたアイソフォームの全ては、本明細書中で使用されるオステオポンチンの定義内に含まれる。
【0017】
オステオポンチンは、ラット(Oldbertら、Proc.Natl.,Acad.Sci.USA 83:8819−8823(1986));マウス(Craigら、J.Biol.Chem.264:9682−9689(1989));ヒト(Kieferら、Nucleic Acids Res.17:3306(1989)およびYoungら、Genomics 7:491−502(1990));ブタ(Wranaら、Nucleic Acids Res.17:10119(1989));ウシ(Kerrら、Gene 108:237−243(1991));ウサギ(Tezukaら、Biochem.Biophys.Res.Commun.186:911−917(1992));およびニワトリ(Mooreら、Biochemistry 30:2502−2508(1991))を含む種々の種において同定されている。(これらの各々は、本明細書中で参考として援用される)。これらの種由来のオステオポンチンおよび他の脊椎動物由来のオステオポンチンは、本明細書中で使用されるオステオポンチンの定義に含まれる。
【0018】
オステオポンチンは、既知の種にわたって保存される1つ以上のドメインの存在によって特徴付けられる。オステオポンチンを特徴付ける保存されたドメインは、例えば、N末端シグナル配列、カゼインキナーゼIIリン酸化部位、選択的にスプライジングされたドメイン、Arg−Gly−Asp(RGD)−含有インテグリン結合細胞接着ドメイン、Asp−に富んだカルシウム結合ドメイン、カルシウム結合相同性ドメインおよび2つのヘパリン結合相同性ドメインを含む(Giachelliら、前出(1995))。従って、オステオポンチンのこれらの特徴的な特性の1つ以上を有する新規に同定された分子もまた、オステオポンチンの定義内に含まれる。
【0019】
オステオポンチンはまた、骨シアロタンパク質I、ウロポンチン(uropontin)、分泌リンタンパク質I、2ar、2B7およびEta 1として当該分野において公知である(Giachelliら、前出(1995))。当該分野において使用されるこれらの用語のすべてによって包含される分子は、本明細書中で使用されるオステオポンチンの定義内に含まれる。
【0020】
ヒトオステオポンチンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は、Kieferら、前出(1989)によって記載され、そして本明細書中の図1(配列番号1および2)に示される。用語、オステオポンチンは、例えば、配列番号2に示される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号1に示される配列と実質的に同じヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含むことを意図する。
【0021】
オステオポンチンおよびその機能的なフラグメントの修飾(それらは、異所性石灰化を阻害する能力を増強するか、またはそれほど影響をあたえないかのいずれか)もまた、用語「オステオポンチン」に含まれる。このような修飾は、例えば、構造的または化学的に類似のアミノ酸またはアミノ酸アナログでの、オステオポンチンのネイティブアミノ酸配列からの1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む。例えば、負に荷電したアミノ酸(例えば、グルタミン酸、またはアスパラギン酸)によって、リン酸化されたアミノ酸(例えば、セリン残基、またはスレオニン残基)の1つ以上の置換が意図される。インビボまたはインビトロのいずれかにおいてリン酸化され得る残基(例えば、キナーゼリン酸化コンセンサス配列)の置換または付加が、意図される。リン酸化のネイティブ部位
の間の残基の修飾(例えば、ヒドロキシアパタイトと相互作用するための、またはリン酸化部位の間の距離を減少するための、リン酸化された残基を有利に指向するような修飾)もまた、意図される。これらの修飾は、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの構造、高次構造、または機能的活性を増強するか、または有意に改変しないかのいずれかである。
【0022】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの活性にそれほど影響しない修飾はまた、糖、リン酸基、または脂質基の付加または除去、ならびに当該分野で公知の他の化学的誘導体を含み得る。加えて、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントは、その精製を補助し、そしてその活性にそれほど影響しないエピトープタグまたは他の配列の付加によって修飾され得る。
【0023】
本明細書中で使用されるように、用語「機能的フラグメント」とは、オステオポンチンと関連して、異所性石灰化を阻害するためのオステオポンチンの能力を維持するオステオポンチンの一部を意味することを意図する。機能的フラグメントは、例えば約6〜約300の長さのアミノ酸であり得、例えば約7〜約150の長さのアミノ酸であり得、より好ましくは、約8〜約50の長さのアミノ酸であり得る。所望する場合、機能的フラグメントは、異所性石灰化を阻害する能力と有利に協調する活性を有するオステオポンチンの領域を含み得る。例えば、オステオポンチンの機能的フラグメントは、細胞(異所性石灰化の部位での内皮細胞およびマクロファージ)の内殖を促進する配列を含み得る。同様に、オステオポンチンの機能的フラグメントは、例えば、異所性石灰化の部位での細胞接着および生存を有利に促進するRGD含有ドメインのような配列を含み得る。
【0024】
本明細書中で使用される場合、用語「個体」は、異所性石灰化を示すか、または発症の危険にあるヒトまたは他の哺乳動物を意味することを意図する。そのような個体は、例えば、アテローム性動脈硬化、狭窄症、腎不全、糖尿病、プロテーゼ移植、組織損傷、もしくは年齢関連血管疾患のような状態と関連する異所性石灰化を有し得るか、または発症の危険にあり得る。これらの状態の予後および臨床的徴候は、当該分野において公知である。本発明の方法により処置された個体はまた、血管手術(人工弁置換または血管形成術を含む)のための候補となり得るか、または経験し得る。本発明の方法により処置された個体は、例えば、糖尿病、腎不全、または腎臓透析に関連する全身性無機質不均衡を有し得る。
【0025】
本明細書中で使用される場合、オステオポンチンのアミノ酸配列またはそのフラグメントを参照する用語「実質的アミノ酸配列」は、オステオポンチンのアミノ酸配列と相同であると認識可能であり、かつ異所性石灰化を阻害する配列を意味することを意図される。例えば、オステオポンチンの配列と実質的に同じである配列は、オステオポンチンの配列と約70%よりも高い相同性、好ましくは、約80%よりも高い相同性、より好ましくは、約90%よりも高い相同性を有し得る。
【0026】
本明細書中で使用される場合、用語「プロテーゼデバイス」とは、病気にかかるか、不完全であるか、または欠損している身体の部分の、合成または生物学的に誘導される代用品をいう。本明細書中で使用される場合、用語「バイオプロテーゼデバイス」とは、部分的または完全に生物学的に誘導されるプロテーゼデバイスをいう。プロテーゼデバイスは、初期故障を導く異所性石灰化に影響されやすいが、これは本発明の方法によって阻害され得る。プロテーゼデバイスは、身体(例えば、耳、目、顎顔面領域、頭蓋、四肢および心臓を含む)の種々の部位に移植され得るか、または付着され得る。
【0027】
本発明の方法は、ステントを用いても、用いなくとも、人工心臓弁(例えば、大動脈弁または房室弁)の異所性石灰化を予防するために有利に使用され得る。置換心臓弁は、種々の材料(金属、ポリマー、および生物学的組織またはそれらの材料の任意の組み合わせを含む)から作製され得る。バイオプロテーゼ弁としては、哺乳動物(例えば、ヒツジ、ウシおよびブタ)に由来する異種移植された置換弁ならびにヒト弁が挙げられる。バイオプロテーゼ心臓弁は、一般的に組織固定に供され、そしてさらに、移植前に失活され得る。
【0028】
本発明は、個体における異所性石灰化を阻害する方法を提供する。その方法は、治療的に有効な量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを個体に投与する工程からなる。この方法は、治療剤として異所性石灰化部位に正常に存在する分子を使用するので、有利である。従って、この方法は、最小の毒性、最小の免疫原性および最小の副作用を生じる。
【0029】
オステオポンチンは、当該分野において公知の方法(例えば、適切な生物学的供給源からの精製、または化学合成によるものを含む)によって、調製され得るか、または得られ得る。オステオポンチンの適切な生物学的供給源は、オステオポンチンを含むかまたは発現する、組織、生物体液または培養細胞であり得る。特定の供給源におけるオステオポンチンタンパク質の存在および豊富さが、例えば、ELISA分析(Minら、Kidney Int.53:189−93(1998)(本明細書中に参考として援用される)または免疫細胞化学(O’Brienら、Arterioscler.Thromb.14:1648−1656(1994)(本明細書中に参考として援用される))を使用して、決定され得る。
【0030】
オステオポンチンは、腎臓細胞、肥大性軟骨細胞、ぞうげ芽細胞、骨細胞、骨髄、内耳および脳細胞に存在するか、またはこれらによって発現されることが決定されている。オステオポンチンはまた、生物体液(乳および尿を含む)内に見出される。オステオポンチンはまた、腫瘍、特に転移性腫瘍内に存在し、そしてそれは腎臓結石の成分である(Butlerら、Principles of Bone Biology、Bilezikianら編、Academic Press、San Diego、167−181頁(1996)(本明細書中に参考として援用される))。オステオポンチンはまた、血管損傷部位における平滑筋細胞、マクロファージおよび内皮細胞によって産生され得る(O’Brienら、Arterioscler.Thromb.14:1648−1656(1994)(本明細書中に参考として援用される))。従って、オステオポンチンは、当該分野において公知の生化学的精製法を使用して、これらの供給源のいずれかから精製され得る。
【0031】
オステオポンチンはまた、培養において増殖する上記組織系統のいずれかの細胞の分泌培地から得られ得る。例えば、オステオポンチンは、Liawら、Circ.Res.74:214−224(1994)(本明細書中に参考として援用される)により記載されるように、平滑筋細胞培養の馴化培地から実質的に精製され得る。
【0032】
以前に記載されたように、種々の種に由来するオステオポンチンのヌクレオチド配列は、公知である。従って、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントはまた、当該分野において、公知の方法を使用して、適切な宿主細胞(例えば、細菌細胞、酵母細胞、両生動物細胞、鳥細胞および哺乳動物細胞を含む)によって組換え的に発現され得る。種々の宿主生物体におけるペプチドの組換え発現および精製のための方法が、例えば、Sambrookら、Molecular Cloing:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、Plainview、New York(1989)およびAusubelら、Current Prorocols in Molecular Biology(Supplement 47)、John WileyおよびSons、New York(1999)(これらの両方が本明細書中で、参考として援用される)に記載される。オステオポンチンおよびそれ由来の例示的な機能フラグメントの組換え合成および精製のための方法が、例えば、Smithら、J.Biol Chem.271:28485−28491(1996)(本明細書中に参考として援用される)において記載される。
【0033】
組換え合成および精製の後、オステオポンチンおよびその機能的フラグメントは、当該分野において公知の酵素的方法を使用して、生理学的に関連する様式(例えば、リン酸化、アシル化またはグリコシル化による)において改変され得る。実施例IVにおいて記載されるように、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを生物学的に関連する部位においてリン酸化するために使用され得るキナーゼは、カゼインキナーゼIIである。当該分野において公知の他のセリン−スレオニンキナーゼ(例えば、プロテインキナーゼC)もまた、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントをリン酸化するために使用され得る。
【0034】
本発明の方法は、異所性カルシウム沈殿を阻害する活性を有するオステオポンチンまたはその任意の機能的フラグメントを使用して、実施され得る。オステオポンチンのフラグメントが、異所性石灰化を阻害するその能力を決定するために、本明細書に記載されるように、選択されて、当該分野において公知の方法によって、産生されて、そしてスクリーニングされる。
【0035】
オステオポンチンのフラグメントが、例えば、オステオポンチンの酵素的切断または化学的切断によって、産生され得る。酵素的切断および化学的切断のための方法ならびに生じたタンパク質フラグメントの精製のための方法は、当該分野において公知である(例えば、Deutscher、Method in Enzymology、第182巻、「Guide to Protein Purification」San Diego:Academic Press、Inc.(1990)(これは本明細書中に参考として援用される)を参照のこと)。例として、オステオポンチンは、Arg169とSer170との間にトロンビン切断部位を含む。オステオポンチンのN末端切断フラグメントまたはC末端切断フラグメントのいずれかが、本発明の方法において使用され得る。
【0036】
オステオポンチンのフラグメントはまた、オステオポンチンの配列を実質的に有するペプチドの化学的合成または組換え合成によって、産生され得る。例えば、オステオポンチンの重複配列にわたるペプチドライブラリーが、当該分野において公知の方法を使用して産生され得、そして本明細書中に記載されるように、それらの機能的活性についてスクリーニングされ得る。さらに、Smithら、前出 271:28485−28491(1996)によって記載されるように、オステオポンチンのN末端トロンビン切断フラグメントまたはC末端トロンビン切断フラグメントが組換え的に産生されて、そして本発明の方法において使用され得る。
【0037】
本明細書中に開示されるように、オステオポンチンは、直接吸着すること、およびアパタイト結晶の成長および形成を阻害することによって、異所性石灰化を阻害し得る。従って、オステオポンチンの機能的フラグメントは、カルシウムまたはカルシウム沈着物と結合する、そのフラグメントの予期される能力に基づいて選択され得る。カルシウムと結合することが意図される領域としては、アスパラギン酸リッチ配列およびカルシウム結合相同性ドメインが挙げられる。従って、オステオポンチンの機能的フラグメントとしては、例えば、アスパラギン酸リッチカルシウム結合ドメインの配列(DDMDDEDDDD(配列番号3))を実質的に含み得るか、またはカルシウム結合相同性ドメインの配列(DWDSRGKDSYET(配列番号4))を実質的に含み得る。
【0038】
さらに、本明細書中に開示されるように、リン酸化が、異所性石灰化を阻害するオステオポンチンの能力を調節し得る。従って、オステオポンチンの機能的フラグメントが、リン酸化コンセンサス配列の存在によって選択され得る。選ばれるべきオステオポンチンの機能的フラグメントとしては、例えば、カゼインキナーゼIIリン酸化コンセンサス領域(SGSSEEK(配列番号5))またはC末端ヘパリン結合相同性ドメインSKEEDKHLKFRISHELDSASSEVN(配列番号6)の実質的な配列が挙げられ得、これらは、保存された3つのセリンリン酸化部位を含む。あるいは、またはさらに、オステオポンチンの機能的フラグメントは、選択的にスプライシングされたドメイン(NAVSSEETNDFKQE(配列番号7))が挙げられ、これらは、2つのセリンリン酸化部位を含む。さらなるセリンリン酸化部位およびスレオニンリン酸化部位が、例えば、Sorensenら、Bioc.Biophys.Res.Comm.198:200−205(1994)(本明細書中に参考として援用される)によって、記載される。オステオポンチンの機能的フラグメントは、1または数個のこれらのリン酸化された残基を、隣接するアミノ酸とともに含み得る。
【0039】
異所性活性を阻害する能力を有するオステオポンチンのフラグメントは、種間で高度に保存される分子の領域を含む。高度な配列保存性を有するヒトオステオポンチン内の領域は、例えば、Giachelliら、前出(1995)に示される。例えば、機能的フラグメントは、高度に保存された配列SDESHHSDESDE(配列番号8)を含み得る。オステオポンチンの機能的フラグメントはまた、保存された細胞接着ドメイン(DGRGDSVAYG(配列番号9))またはヘパリン結合相同性ドメイン(RKKRSKKFRR(配列番号10)を含み得る。
【0040】
所望される場合、例えば、機能的活性、選択性、安定性またはバイオアベイラビリティーを最適化するために、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントは、D立体異性体、天然に存在しないアミノ酸ならびにアミノ酸アナログおよび模倣物を含むように改変され得る。改変されたアミノ酸の例は、Sawyer、Peptide Based Drug Design、ACS、Washington(1995)ならびにGrossおよびMeienhofer、The Peptides:Analysis、Synthesis、Biology、Academic Press、Inc、New York(1983)(これらの両方は、本明細書中に参考として援用される)において示される。
【0041】
所望される場合、一つ以上のリン酸化されたセリン残基またはスレオニン残基が、負に荷電したアミノ酸(例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸)によって、置換され得る。そのような改変は、ホスファターゼによる不活性化に対するオステオポンチンまたは機能的フラグメントの感受性を減少させるように有利に作製され得る。
【0042】
本明細書中に開示されるように、直接吸着することおよびアパタイト結晶の成長および形成を阻害することによって、異所性石灰化を阻害することに加えて、オステオポンチンはまた、炭酸脱水酵素II(CAII)を発現する多核巨細胞およびマクロファージの蓄積および活性化を促進することによって、抗石灰化細胞内応答を媒介することにより作用し得る。多核巨細胞およびマクロファージは、細胞外微小環境を酸性化し、そして鉱化した沈着物を溶解し得る。多核性異物巨細胞(FBGC)およびマクロファージによるCAII発現の調節を通して、オステオポンチンは、リン酸カルシウム沈着物の除去を刺激し得る。
【0043】
上記のように選択および調製されたオステオポンチンまたはフラグメントの異所性石灰化を阻害する能力は、当該分野において公知か、または本明細書中に記載される種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイによって、評価され得る。例えば、実施例Iに記載されるように、培養された血管細胞(例えば、ウシ大動脈平滑筋細胞)は、β−グリセロホスフェートを含むカルシウム沈着培地で処理された場合、時間依存的な様式でカルシウム沈着を形成する。さらに、実施例IIIに記載されるように、ヒト血管平滑筋細胞は、増強されたレベルの無機リン酸の存在下において、カルシウム沈着物を形成する。異所性石灰化を阻害する際のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントの効果をアッセイするための他の培養系は、当業者によって決定され得る。例えば、異所性石灰化が生じる身体の他の部位(例えば、内蔵、皮膚および内皮細胞を含む)に由来する細胞または組織を使用して、オステオポンチンがアッセイされ得る。
【0044】
カルシウム沈着の量または程度は、オステオポンチンまたは機能的フラグメントを投与する前と投与した後に、そのような培養系を使用して、視覚的評価もしくは組織化学的評価によって定性的にか、またはより定量的な方法によってかのいずれかで、決定され得る。例えば、カルシウム沈着は、不透明な領域(Von Kossa染色法では黒い領域として、そしてAlizarin Red染色法では赤い領域として)として、光学顕微鏡によって視覚的に検出され得る。カルシウム沈着の量および程度はまた、Jonoら、Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17:1135−1142(1997)(本明細書中に参考として援用される)によって記載される方法、または市販の測色法キット(例えば、Sigmaから入手可能であるCalcium Kit)を使用することによって定量的に評価され得る。あるいは、カルシウム沈着の量または程度はまた、原子吸光分光という公知の方法を使用して、定量的に評価され得る。
【0045】
実施例IおよびIIIに記載されるように、培養された血管平滑筋細胞において観察されるカルシウム沈着は、組織化学的分析、超微細構造分析および電子回折分析によって評価される場合、異所性石灰化部位に存在するアパタイト沈着物と類似し得る。従って、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの培養細胞によるカルシウムの沈着を阻害する能力は、ビヒクルコントロールまたはタンパク質コントロールと比較して、個体における異所性石灰化を阻害するその能力の正確な指標である。
【0046】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの異所性石灰化を阻害する能力はまた、対応するヒト病理の信頼できる指標となるために、当該分野において公知の動物モデルにおいて試験され得る。例えば、異所性石灰化は、例えば、Vyavahareら、前出(1997)に記載されるような動物へのバイオプロテーゼ弁(例えば、ブタ弁、ヒツジ弁またはウシ弁)の皮下移植または循環系統移植によって誘導され得る。オステオポンチンまたは機能的フラグメントの投与による弁のカルシウム沈着の量または速度の減少が検出され得、そしてそれは、調製物の機能的活性の基準となる。
【0047】
同様に、ヒトアテローム性動脈硬化、腎不全、リン酸塩過剰血症、糖尿病、年齢関連血管カルシウム沈着および異所性石灰化と関連する他の状態の信頼できる指標である動物モデルは、当該分野において公知である。例えば、局所性および全身性カルシフィラキシー、石灰沈着症および誘発性石灰化(これらは、異所性石灰化の実験モデルである)は、例えば、Bargmann,J.Rheumatology 22:5−6(1995)、Lianら、Calcified Tissue International、35:555−561(1983)およびBoivinら、Cell and Tissue Res.247:525−532(1987)において記載される。血管壁のカルシウム沈着の実験モデルは、例えば、Yamaguchiら、Exp.Path.25:185−190(1984)によって記載される。
【0048】
異所性石灰化およびオステオポンチン調製物の効果を試験するための好ましい動物モデルは、Liawら、J.Clin.Invest.101:1468−1478(1998)(本明細書に参考として援用される)により記載されるオステオポンチン欠損マウスであり、ここで実施例Vにおいて記載されるように、異所性石灰化は、野生型コントロール動物と比較して増強される。
【0049】
当該分野において公知の医療画像技術(例えば、磁気共鳴画像法、X線画像、コンピューター断層撮影法、超音波検査法)を使用して、ヒトまたは動物のいずれかにおける異所性石灰化を阻害する際のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントの効果を評価し得る。例えば、血管内のカルシウム沈着の存在および程度が、Fitzgeraldら、Circulation 86:64−70(1994)(本明細書中で参考として援用される)により記載される脈管内超音波画像法により決定され得る。異所性石灰化の量または程度の減少が、容易に同定され得、そしてこれはオステオポンチンまたはそのフラグメントの治療効果の指標となる。
【0050】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメント(上記のように、それらの機能的活性についてアッセイされる)は、異所性石灰化を阻害するために治療的に効果的な量で個体に投与される。オステオポンチンまたは機能的フラグメントを投与するための送達の適切な処方、投薬量および送達経路は、当業者に周知であり、そしてヒト患者について(例えば、以前に記載されたように動物モデルから)決定され得る。治療的に有効であることが必要とされるオステオポンチンまたはその機能的フラグメントの投薬量は、例えば、石灰化の程度、石灰化の部位、投与の経路および形態、投与される分子の生体活性半減期、個体の体重および状態、ならびに以前または現在の治療のような因子に依存し得る。この方法の特定の適用についての治療的に有効な用量であると見なされる適切な量は、本明細書中に提供される手引きを用いて、当業者に決定され得る。当業者は、患者の状態を治療の過程全体にわたってモニターすることが必要であり、かつ投与される組成物の量を調節し得ることを認識する。
【0051】
ヒトを処置するために、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの治療的に有効な量は、処置レジメンに依存して、例えば、約10μg/kg体重〜500mg/kg体重、例えば、約0.1mg/kg体重〜100mg/kg体重、または約1mg/kg体重〜50mg/kg体重であり得る。例えば、オステオポンチンまたは機能的フラグメントは、1日に数回、または1日に1回、または数日毎に1回投与される場合、オステオポンチンまたは機能的フラグメントが1回、1週間に1回、数週間に1回のみ投与された場合より低用量が必要とされる。同様に、オステオポンチンの時限放出(timed−release)を可能にする処方物は、単回ボーラス用量として投与されるより、より少量のオステオポンチンの連続放出を提供する。
【0052】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントは、全身(例えば、静脈内または動脈内)に送達されて、身体全体の異所性石灰化を阻害し得る。オステオポンチンまたは機能的フラグメントはまた、異所性石灰化発生することを含むか、またはそれが予測されることが既知の部位に局所的に投与され得る。このような部位は、例えば、アテローム斑(atherosclerotic plaque)、血管形成術を受けた動脈のセグメントまたはプロテーゼ移植部位であり得る。オステオポンチンおよびその機能的フラグメントの投与に適切な部位は、処置されている個体の臨床的指標および個体が現在侵襲的外科手術を受けているか否かに依存して、当業者により決定され得る。
【0053】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントの投与は、オステオポンチンの種々の処方物を用いて達成され得る。所望であれば、オステオポンチンは、薬学的に受容可能なキャリアとともに溶液または懸濁液として投与され得る。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、通常生理食塩水もしくはリンゲル溶液、または他の生理学的な緩衝化生理食塩水、または他の溶媒もしくはビヒクル(例えば、グリコール、グリセロール、オリーブ油もしくは注射可能な有機エステルのようなオイル)であり得る。
【0054】
薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、オステオポンチンまたは機能的フラグメントの吸収を安定または増大させるように作用する生理学的に受容可能な化合物をさらに含む。このような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストランのような糖質;アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤;微生物膜を破壊する、EDTAのようなキレート剤;カルシウムまたはマグネシウムのような二価金属イオン;低分子量タンパク質;脂質もしくはリポソーム;または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。オステオポンチンはまた、生体分解性ポリマーもしくはマイクロポンプのような材料とともに処方され得、これは、分子の徐放性放出を提供する。さらに、オステオポンチンは、ホスファターゼインヒビターのような分子とともに処方され得、ホスファターゼインヒビターは、オステオポンチンの脱リン酸化を減少または阻害する。
【0055】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントはまた、タンパク質を発現するように遺伝的に改変された細胞から発現され得る。遺伝的に改変された細胞からのオステオポンチンの発現は、タンパク質の、持続して局在するかまたは全身性の発現が生じ得るため、反復投与が不要であるという利点を提供する。
【0056】
治療目的のために種々の哺乳動物細胞においてタンパク質を組換え発現する方法は、当該分野で公知であり、例えば、以下に記載される:本明細書中に参考として援用される、Leeら、Transfusion Medicine II 9:91−113(1985)。遺伝子操作に特になじみやすい細胞の型としては、例えば、造血幹細胞、肝細胞、血管内脾細胞、ケラチノサイト、筋芽細胞、線維芽細胞およびリンパ球が挙げられる。
【0057】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントをコードする核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結され、このプロモーターは、適切なレベルの、コードされたタンパク質の構成性発現または(所望であれば)誘導性発現を提供し得る。この方法の特定の適用のために適切なプロモーター配列は、当業者により決定され得、そして例えば、細胞型および所望されるオステオポンチン発現レベルに依存する。
【0058】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメントをコードする核酸は、哺乳動物発現ベクターに挿入され得、そして当該分野で公知の種々の方法により細胞に導入され得る(例えば、Sambrookら、前出(1989);およびAusubelら、前出(1994)を参照のこと)。このような方法としては、例えば、組換えベクターを用いたトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が挙げられる。ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスのベクター)での感染は、細胞を遺伝的に改変するために特に有用である。核酸分子はまた、ベクターへの核酸配列の最初の導入を必要としない公知の方法を用いて、細胞に導入され得る。
【0059】
本発明の1つの実施形態において、プロテーゼデバイスは、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントと接触され得る。プロテーゼデバイスと、オステオポンチンまたは機能的フラグメントとを接触させることは、プロテーゼデバイスの異所性石灰化を効率的に予防または減少し、このことによって、デバイスの不全または早熟置換の必要性を予防する。プロテーゼデバイスは、必要であれば、個体への移植前、移植中、または移植後のいずれかに、オステオポンチンまたは機能的フラグメントと接触され得る。
【0060】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントは、プロテーゼデバイスに対して共有結合的または非共有結合的のいずれかでこの分子と結合することによってプロテーゼデバイスと接触し得る。この方法の特定の適用のために適切な結合方法は、当業者によって決定され得る。当業者は、適切な結合方法がヒトにおけるプロテーゼデバイスの移植と適合性であることを知っており、従って、受容可能でない毒性または免疫原性拒絶を引き起こさない。さらに、適切な結合方法は、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントがプロテーゼデバイスまたは周辺組織の異所性石灰化を阻害する能力を増強させるか、または有意に低減させない。
【0061】
ポリマー、金属および組織にタンパク質を共有結合させるための方法は、当該分野で公知である。例えば、オステオポンチンは、化学的架橋を用いてプロテーゼデバイスと結合され得る。化学的架橋剤としては、例えば、グルタルアルデヒドおよび他のアルデヒドが挙げられる。反応性アミノ酸基、糖質部分または付加された合成部分のいずれかを通じてプロテーゼデバイスにオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを連結する架橋剤は、当該分野で公知である。このような薬剤および方法は、例えば、Hermason、Bioconjugate Techniques、Academic Press、San Diego(1996)に記載され、これは、本明細書中に参考として援用される。これらの方法を用いて、プロテーゼデバイスと、治療的に有効な量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントとを接触させ得る。
【0062】
オステオポンチンはまた、プロテーゼデバイスに対して非共有結合的に(例えば、プロテーゼデバイスの表面への吸収により)付着され得る。オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを含む溶液または懸濁液は、所望であれば、薬学的に受容可能な賦形剤とともに、治療的に有効な量でプロテーゼデバイス上にコーティングされ得る。
【0063】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントの持続性送達を提供するために、プロテーゼデバイスはまた、プロテーゼデバイスに付着した細胞によって生成されるオステオポンチンまたはその機能的フラグメントと接触され得る。このような細胞は、プロテーゼデバイス上に播種され、そしてエキソビボまたはインビボのいずれかで増殖し得る。適切な細胞としては、オステオポンチンを通常生成し、かつ分泌する細胞が挙げられ、この細胞としては、例えば、マクロファージ、平滑筋細胞または内皮細胞が挙げられる。さらに、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを生成するように遺伝的に改変された細胞(例えば、内皮細胞および線維芽細胞を含む)は、プロテーゼデバイスに付着され得る。プロテーゼデバイスに付着される細胞は、好ましくは、プロテーゼインプラントを受け入れる個体由来の細胞、またはインプラントの拒絶の可能性を減少する免疫学的に適合した個体由来の細胞のいずれかである。
【0064】
プロテーゼデバイスと接触されるオステオポンチンまたは機能的フラグメントが異所性石灰化を阻害する能力は、当該分野で公知の種々の方法によって決定され得る。1つのこのような方法は、実施例Vに記載のように、プロテーゼデバイスを動物に移植して、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの投与に応答したカルシウム沈着を測定することである。外植片の部位におけるカルシウム沈着の速度または量の減少いずれかが、組成物の治療的効力を示す。
【0065】
本発明は、局所的な微小環境を酸性にする個々の細胞に投与することにより、異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。このことにより、この細胞は、異所性石灰化の部位に標的化される。多核性異物巨細胞およびマクロファージは、局所的な微小環境を酸性にし得る細胞の例である。従って、本発明は、個々のマクロファージに投与することによって異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、このことによって、マクロファージは、異所性石灰化の部位に標的化される。さらに、本発明は、個々の多核性外来異物巨核細胞に投与することにより異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、これによって、多核性異物巨細胞が異所性石灰化の部位に標的化される。
【0066】
本明細書中で使用される場合、用語「局所的な微小環境」とは、酸生成細胞の補充および/もしくは分化、ならびにプロトン生成の促進および細胞プロトンの細胞外放出のいずれかにより酸性にされ得る細胞外空間をいう。例えば、破骨細胞およびマクロファージは、二酸化炭素の炭酸への加水分解を促進する酵素である炭酸脱水酵素IIを発現する。炭酸は、液胞のH+−ATPaseを介して細胞から排出されるプロトンの細胞内供給源として働き、それによって局所的pHを下げ、そして無機物溶解を促進する。従って、本発明は、マクロファージおよび多核性異物巨細胞による炭酸脱水酵素IIのオステオポンチン媒介発現を介して異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。
【0067】
本明細書中に開示されるように、オステオポンチンは、直接的に、アパタイト結晶表面に結合し、かつ結晶成長を阻害することによるだけでなく(実施例IIを参照のこと)、間接的に、無機質の喪失を調節することにより(実施例V)、異所性鉱化作用を調節する。具体的には、オステオポンチンは、マクロファージ補充、炭酸脱水酵素II発現の増加および細胞外酸性化を促進することによる抗石灰性細胞応答のメディエーターとして作用する。
【0068】
局所的な微小環境を酸性にし得る細胞(例えば、マクロファージおよび多核性異物巨細胞)は、異所性石灰化の部位に標的化される。例えば、マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、プロテーゼデバイスに付着され得る。例えば、マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、生体プロテーゼ心臓弁に播種され得、そして上記のようにエキソビボまたはインビボで増殖され得る。さらに、炭酸脱水酵素IIまたはその機能的フラグメントを発現するように遺伝的に改変された細胞は、プロテーゼデバイスに付着され得る。炭酸脱水酵素IIの機能的フラグメントは、オステオポンチン媒介性調節および触媒活性を保持する。オステオポンチン生成細胞については上記のように、炭酸脱水酵素II生成細胞は、好ましくは、プロテーゼインプラントを受けた個体由来であるか、またはインプラント拒絶の可能性を減少させるように免疫的に適合させた個体由来である。さらに、マクロファージまたは多核性異物巨細胞は、直接的または全身的のいずれかで個体における異所性石灰化の部位に投与され得る。全身的に投与される場合、投与されたマクロファージおよび多核性異物巨細胞は、異所性石灰化の部位に標的化され得る。例えば、オステオポンチンまたはオステオポンチン抗体で生体プロテーゼデバイスを予めコーティングすることは、全身的に投与されたマクロファージおよび多核性異物巨細胞を異所性石灰化部位に標的化して、局所的な微小環境を酸性にする1つの方法である。
【0069】
実施例Vに記載のように、局所的な微小環境の酸性化はまた、オステオポンチン(マクロファージおよび多核性異物巨細胞により炭酸脱水酵素II発現を調節し得る)を投与することによって達成され得る。オステオポンチンを個体に投与する方法は、上記で詳細に記載されている。炭酸脱水酵素II発現を刺激するために必要なオステオポンチンの発現レベルは、ヒドロキシアパタイトの増殖を直接阻害するために必要な発現レベルより有意に低くあり得る。従って、炭酸脱水酵素IIを刺激するために治療的に有効な量は、約1×10-12M〜5×10-7Mの範囲内であり得る。炭酸脱水酵素IIの発現を刺激するに十分なオステオポンチンの治療的に有効な量はまた、約1×10-12M〜1×10-7M、1×10-12M〜5×10-8M、1×10-12M〜1×10-8M、約1×10-12M〜5×10-9M、1×10-12M〜1×10-9M、1×10-12M〜5×10-10M、1×10-12M〜5×10-10M、または1×10-12M〜5×10-11Mの範囲内であり得る。
【0070】
従って、本発明は、個体に局所的な微小環境を酸性にする細胞を投与することによって、異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本発明はさらに、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、この方法は、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位に酸生成細胞の補充を促進する工程を包含する。本発明はまた、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、この方法は、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位で酸生成細胞の分化を促進する工程を包含する。本発明はさらに、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、この方法は、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位への酸生成細胞の補充および分化を促進する工程を包含する。実施例Vに記載のように、1コピーのオステオポンチン遺伝子を保有するマウスは、異所性鉱化作用に応答して炭酸脱水酵素II陽性細胞の形成を促進するに十分高レベルのオステオポンチンを発現する(図13を参照のこと)。マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、同様な造血起源から誘導された炭酸脱水酵素II発現細胞であり、そして1コピーのオステオポンチン遺伝子を保有するマウスにおいて鉱化したインプラントに隣接して位置することが本明細書中で示される。
【0071】
実施例Vで示されるように、オステオポンチンは、マウスにおいてグルタルアルデヒド固定した大動脈弁(GFAV)リーフレットの移植部位に、酸生成細胞を補充させることによって無機質再吸収を制御し得る。例えば、免疫染色によって示されるように、オステオポンチンは、マクロファージの補充を媒介し得、そしてCAII陽性細胞形成を促進し得る(実施例Vを参照のこと)。本明細書中で開示されるように、マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、オステオポンチンによって調節される炭酸脱水酵素IIを発現する細胞の例である。オステオポンチンを投与する方法は、上で詳細に記載されている。
【0072】
本発明はまた、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位における炭酸脱水酵素IIの発現を増大することにより、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本明細書中で開示されるように、オステオポンチンは、炭酸脱水酵素II発現細胞(マクロファージおよび多核性異物巨細胞を含む)の分化および活性を調節することによって無機質再吸収を制御する(実施例Vを参照のこと)。
【0073】
本発明の種々の実施形態の営為に実質的に影響を及ぼさない改変もまた、本明細書中で提供される発明の規定内に含まれることが理解される。従って、以下の実施例は、本発明を例示するのであって、限定しないことが意図される。
【0074】
(実施例I:培養したウシ脈管細胞の石灰化)
本実施例は、培養したウシ大動脈平滑筋細胞によるカルシウム沈着が、異所性石灰化の確実なモデルであることを実証する。生理学的に関連した石灰化を誘導するための方法が記載される。これらの方法を用いて、オステオポンチンおよびそのフラグメントの調製物を、異所性石灰化を阻害する能力についてアッセイし得る。
【0075】
(ウシ大動脈平滑筋細胞の培養)
BASMCを、本明細書中に参考として援用されるRossら,J.Cell Biol.,50:172−186(1971)によって最初に記載された外植片法の改変によって入手した。手短に述べると、内側組織を、ウシ胸大動脈のセグメントから分離した。組織小片(1〜2mm3)を、165U/mlのコラゲナーゼI型、15U/mlエラスターゼIII型および0.375mg/mLダイズトリプシンインヒビターを補充した、4.5g/Lのグルコースを含むDMEM中での37℃での1時間のインキュベーションによってばらばらにした。部分的に消化された組織を6ウェルプレート中に置き、そして20% FBSを補充した、4.5g/Lのグルコースを含むDMEM中で、37℃にて、5% CO2を含む加湿雰囲気下で数週間培養した。外植片から移動した細胞を収集し、そして増殖培地(100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを補充した、15% FBSおよび10mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)中で維持した。ウシ大動脈壁から単離された細胞が脈管平滑筋細胞であることを確認するために、α−平滑筋アクチン、ビメンチンおよびカルポニン(calponin)のレベルを、免疫蛍光顕微鏡法によって調べた。
【0076】
免疫蛍光顕微鏡法について、BASMCSを、10ウェルヘビー(heavy)Teflonコーティング顕微鏡スライドガラス(Cel−Line Associates Inc.,USA)で24時間培養し、冷メタノールで固定し、2% BSAおよび10%正常ウサギ血清を含むPBSでブロックし、そして2% BSAを含むPBSでそれぞれ、1:50および1:25に希釈した、モノクローナル抗α平滑筋アクチン抗体(1A4,Sigma)およびモノクローナル抗ビメンチン抗体(V9,Dako)で処理した。モノクローナル抗カルポニン抗体((CALP),Fridら,Dev.Biol.,153:185−193(1992))を、希釈せずに用いた。二次抗体として、FITC結合体化ウサギ抗マウスIgGを、PBSでの1:30の希釈後に用いた。マウス非免疫IgGを、一次抗体についてのコントロールとして用いた。
【0077】
上記のように得られた95%を超える細胞が、α平滑筋アクチン抗体、ビメンチン抗体およびカルポニン抗体で、繊維状のパターンで染色された。このことは、培養した細胞が、脈管平滑筋起源の細胞であることを示す。全ての実験について、細胞を、2継代と5継代との間で用いた。
【0078】
(ウシ大動脈平滑筋細胞によるカルシウム沈着)
培養されたBASMC平滑筋細胞による石灰化を調べるために、石灰化を、本明細書中に参考として援用されるShioiら,Arterioscler Thromb.Vasc Biol.,15:2003−2009(1995)に記載される方法によって誘導した。手短に述べると、BASMCを、増殖培地中で4日間培養し、次いで石灰化培地(100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを補充した、10mMのβ−グリセロホスフェート(他であると示さない限り)、10-7Mインスリンおよび50μg/mlのアスコルビン酸の存在下で15% FBSおよび10mMピルビン酸ナトリウムを含むDMEM(高グルコース、4.5g/L))中に10日間切り替えた。この培地を、1週間に2回、新鮮な培地で置き換えた。時間経過実験では、石灰化培地中での培養開始日を、0日目と定義した。
【0079】
石灰化を、本明細書中に参考として援用されるJonoら,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17:1135−1142(1997)に記載される方法の改変によって評価した。手短に述べると、培養物を、0.6N HClを24時間用いて脱灰した。HCl上清のカルシウム含量を、o−クレゾールフタレインコンプレクソン(o−cresolphthalein complexone)法(Calcium Kit,Sigma)による比色定量によって決定した。脱灰後、この培養物をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、そして0.1N NaOH/0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で可溶化した。総タンパク質含量を、Bio−Rad Protein Assay Kit(Bio−Rad)を用いて測定した。細胞層のカルシウム含量を、タンパク質含量に対して正規化した。培養培地中のリン濃度およびカルシウム濃度を、それぞれ、ホスホモリブデート複合体法(Phosphorus Kit,Sigma)およびo−クレゾールフタレインコンプレキソン法(Calcium Kit,Sigma)によって測定した。値を、平均+/−SEM(n=3)として表した。
【0080】
β−グリセロホスフェートを含む石灰化培地で処理したBASMCは、14日間の経過にわたって時間依存的様式でカルシウム含有無機質沈着を開始した。対照的に、β−グリセロホスフェートを欠く増殖培地中で培養したBASMCは、石灰化しなかった。β−グリセロホスフェートの添加は、細胞層におけるカルシウム沈着と正に相関する、増加したリン濃度をもたらした。逆に、細胞層が石灰化されるにつれて、カルシウム濃度は、培養培地中で減少した。
【0081】
カルシウム沈着、培地中のリン濃度およびカルシウム濃度に対するβ−グリセロホスフェートの効果は、用量依存的であった。カルシウム沈着は、β−グリセロホスフェートの開始濃度に依存し、そして約4mM β−グリセロホスフェートで最大の半分であった。培養培地中のリン濃度は、0mM〜10mMの範囲にわたってβ−グリセロホスフェートの濃度が増加するにつれて増加した。培養培地中のカルシウム沈着は、細胞層中のカルシウム沈着に対して逆に比例した。
【0082】
観察された石灰化は、10mM無機リン酸までの培養培地の補充が、細胞の非存在下で石灰化した沈着物を形成しなかったので、培地からの無機物の自発沈澱に起因しなかった。内皮細胞培養物への石灰化培地の添加も、鉱化作用を誘導しなかった。
【0083】
これらの結果は、培地中での無機リン酸を上昇させる条件下でBASMCの石灰化が、特異的な、細胞媒介事象およびマトリックス媒介事象であることを示す。
【0084】
(BASMC石灰化の形態)
BASMC培養物における石灰化プロセスが、生理学的な型の鉱化作用を表すか否かを決定するために、組織化学的分析、超微細構造分析および電子線回折分析を行った。
【0085】
BASMC培養物による無機物沈着を、フォンコッサ染色(30分間、5%硝酸銀)および光学顕微鏡法によって、本明細書中に参考として援用されるMallory,F.B.,Pathological Techniques,第2版,Philadelphia,WB Saunders Co.,152頁(1942)によって記載される方法を用いて組織化学的に評価した。アルカリホスファターゼの発現を、シトレート−アセトン−ホルムアルデヒド固定細胞を室温にて15分間、Naphthol AS−BI Alkaline Solution(Sigma)とともにインキュベートすることにより可視化した。
【0086】
透過型電子顕微鏡法(TEM)による超微細構造検査のために、プラスチック上で増殖したBASMC細胞を、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を用いてpH7.2で緩衝化した、1%グルタルアルデヒドおよび1%パラホルムアルデヒドを含むアルデヒド溶液中で一晩固定した。次いで、この培養物を、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液単独を用いて洗浄し、段階的な一連のエタノール溶液中で脱水し、そしてTaabエポキシ樹脂またはLR Whiteアクリル酸樹脂(Marivac,Nova Scotia,Canada)のいずれかに浸透させ、そして包埋した。この樹脂を、55℃にて2日間重合させた。エポキシ包埋をされることになっているサンプルをまた、電子顕微鏡においてさらなる膜の対比を提供するために、フェロシアン化カリウム還元4%四酸化オスモニウムを用いて事後固定した。
【0087】
選択された領域の電子線回折による無機質分析について、他の培養物を、100%エタノールのみを用いて固定して非水性で処理し、続いてさらなる処理を伴わずに樹脂中での直接包埋した。1マイクロメーターの厚さの調査切片を、培養物の種々の領域から調製し、そして光学顕微鏡法による調査のためにトルイジンブルーで染色した。次いで、選択された領域の薄い切片(80nm〜100nm)を、Reichert Ultracut Eミクロトーム上でダイアモンドナイフを用いて切断し、そして炭素を用いてエバポレートしたFormvarでコーティングしたニッケルグリッド上に配置した。グリッドに取り付けた切片を、エタノール性酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を用いて短時間染色し、そして60kVで操作するJEOL JEM 1200EX透過型電子顕微鏡を用いて調べた。無水性で処理し、非染色のままにしたサンプルを、100μM回折口径および80cmのカメラ長を用いる、選択された領域の電子線回折に用いた。回折パターンを分析し、そして合成アパタイト標準および骨無機質について以前に報告された粉末回折ファイル(本明細書中に参考として援用される、Landisら,J.Ultrastruc.Res.,63:188223(1978))と比較した。
【0088】
光学顕微鏡法により、増殖培地中で増殖させたBASMC培養物は、これらの型の細胞に特有の単層および多層の増殖領域を示した。石灰化培地での10日間の処置後、この培養物は、主に多層領域における、広範な無機質の沈着を示した。フォンコッサ染色は、これらの培養物におけるリン酸含有無機質の存在を確認した。石灰化は、細胞間の細胞外マトリックスにおいて最も頻繁に観察され、そして代表的に培養物の基礎局面においてより顕著であった。これらの石灰化培養物におけるBASMCはまた、アルカリホスファターゼ活性について陽性であった。
【0089】
培養14日目(β−グリセロホスファターゼを用いて10日目)、BASMCは、単層または多層であり、そしていくつかの位置では、細胞の小節を形成した。超微細構造的に、外観上多層または小節状である場合、この細胞は、コラーゲン原線維が豊富な多量の細胞外マトリックスと会合している。この細胞外マトリックスの蓄積部位で、細胞は、代表的にはタンパク質の合成および分泌に関連する、充分に発達した細胞小器官を示した。目立った細胞骨格は、アクチンから構成される可能性が最も高い、細胞内細糸の広範なネットワークによって立証された。
【0090】
β−グリセロホスフェートなしで培養した細胞は、細胞外マトリックスの石灰化の証拠を示さなかったが、添加した有機リン酸供給源とともに培養した細胞は、細胞層と関連したいくつかの形態学的に異なる形態の石灰化を示した。これらは、石灰化したコラーゲン原線維のほぼ球状の凝集物、周囲で増加した無機質密度を有する小節沈着、ならびに細胞外マトリックスの原線維内区画および原線維間区画の両方を含む、より分散した石灰化を含んでいた。これらの後者の部位では、いくらか大きな寸法を有する結晶は、1つのコラーゲン原線維から別のコラーゲン原線維へと広がることが観察された。膜結合型マトリックス小胞はまた、細胞外マトリックスにおいて見出された。無水で処理され、そして染色されていない、石灰化沈着物を含むBASMC培養物組織切片の、選択された領域の電子線回折は、無機質相をアパタイトとして同定した。このことは、その指数がこの型の無機質に特有であった(格子面002、211、112、300からの)目立った回折反射を示す。
【0091】
アルカリホスファターゼは、正常なウシの鉱化作用に必要とされ(Whyteら Endocr.Rev.,15:439−461(1994))、そしてβ−グリセロホスフェートに応答した骨芽細胞および軟骨細胞の培養物の石灰化に必要とされることが示されている(Tenenbaumら,Bone Mineral,2:13−26(1987))。アルカリホスファターゼが、これらの研究において用いられる条件下でのBASMCにおける石灰化に必要とされるか否かを決定するために、培養物を、アルカリホスファターゼインヒビターであるレバミゾール、またはビヒクル単独で処理した。BASMC培養物におけるカルシウム沈着が、レバミゾールによって用量依存的に阻害された。最大の半分の阻害が、5×10-5Mレバミゾールで観察された。ビヒクル処理は効果を有さなかった。レバミゾール処理は、培養培地におけるリン濃度における減少および高いカルシウム濃度の維持と関連した。
【0092】
これらの結果は、BASMC培養物によって沈着したマトリックスの石灰化が、異所性石灰化の部位で観察された鉱化作用と、無機質の種類(アパタイト)および石灰化した沈着物の微細構造に関して類似することを示す。例えば、鉱化作用は、細胞外マトリックスコラーゲン原線維およびマトリックスビヒクルと関連して主に生じた。類似の小胞構造が、上昇したアルカリホスファターゼ活性と関連して、石灰化したアテローム性動脈硬化斑において報告されている(Kimら,Fed Proc,35:156−162(1976))。さらに、石灰化しているBASMC培養物において存在する小節状石灰化は、石灰化されたアテローム性動脈硬化斑および弁において通常見られることである、球顆状結晶成長を示す(Kimら,Fed Proc,35:156−162(1976))。
【0093】
それゆえ、これらの研究において用いられた石灰化しているBASMC培養物は、石灰化した脈管組織においてインビボで観察された鉱化作用に類似した鉱化作用を行い得る細胞外環境を作製し得、異所性石灰化のモデルとしてのそれらの使用を支持する。
【0094】
(実施例II:オステオポンチンは、BASMC石灰化を阻害する)
本実施例は、オステオポンチンが、インビボにおける異所性石灰化の確実なモデルであるBASMC石灰化をインビトロで阻害することを実証する。それゆえ、オステオポンチンは、異所性石灰化の治療的に有効なインヒビターである。
【0095】
ラットオステオポンチンを、本明細書中に参考として援用されるLiawら,前出 74:214−224(1994)によって記載されるように、ラット新生仔平滑筋細胞培養物の馴化培地から精製した。この調製物を、クーマシー染色およびN末端配列分析に基づいて、95%を超える純度であると判断した。
【0096】
インビトロでのBASMC媒介石灰化に対するオステオポンチンの効果を調べるために、可溶性オステオポンチンまたはビヒクル単独(0.1mMクエン酸ナトリウム)を、石灰化しているBASMC培養物に添加した。図2aに示すように、0.05μg/ml、0.5μg/mlおよび5μg/mlのオステオポンチンは、10日目に評価したとき、石灰化を用量依存的に阻害した。例えば、0.5μg/mlのオステオポンチンは、石灰化を約90%阻害し、そして5μg/mlのオステオポンチンは石灰化をほぼ完全に阻害した。対照的に、ビヒクル単独は、効果がなかった(図2a)。それゆえ、低濃度の外部から適用したオステオポンチンは、石灰化している脈管細胞培養系において細胞外鉱化作用を顕著に阻害する。
【0097】
オステオポンチン調製物中の夾雑物が、観察される阻害効果の原因である可能性を排除するために、免疫除去実験を行った。10μg/mlオステオポンチンを含む培地を、Liawら,前出(1994)によって記載される方法により調製された20mg/mlの抗オステオポンチン(OP−199)抗体または正常ヤギIgGと混合し、そして室温にて1時間インキュベートした。250mgプロテインA−sepharoseを添加し、そして室温にて1時間インキュベートした。抗体−プロテインA sepharose複合体を遠心分離により除去し、そして残りの上清を、石灰化研究において使用するために20倍希釈した。独立Student t検定を用いて、群を比較し、そして0.05未満の確率値(p)値を有意とみなした。
【0098】
0.5μg/mlラットオステオポンチンを含む培地は、培養物の石灰化を、18倍阻害した(オステオポンチン処理したBASMCについて0.33±0.06μmole/mgに対して、ビヒクル処理したBASMCについて5.05±0.25μmole/mg、p=0.0023)。オステオポンチン抗体を用いたオステオポンチン溶液の免疫除去は、阻害活性を有意に減少させた(抗オステオポンチン除去サンプルについて2.60±0.43μmole/mgに対して、非免疫除去サンプルについて0.33±0.06μmole/mg、p=0.0338)。対照的に、正常ヤギIgGを用いた免疫除去は、ラットオステオポンチン溶液の阻害活性に影響を与えなかった(免疫除去なしについて0.33±0.06μmole/mgに対して、正常ヤギIgG処理について0.49±0.10μmole/mg、p=0.2480)。
【0099】
これらの結果は、オステオポンチン調製物による、観察されたBASMC媒介石灰化阻害が、夾雑物に起因するのではなく、特異的にオステオポンチンに起因したことを確認する。
【0100】
オステオポンチン効果の特異性および独特さを決定するために、オステオポンチンに対する制限された構造的および機能的相同性を有する、2つのさらなる非コラーゲン性細胞外マトリックスRGD含有分子(ビトロネクチンおよびフィブロネクチン)を、BASMC媒介石灰化を阻害する能力について試験した。ラットの血漿ビトロネクチン(Sigma Immunochemicals,USA)およびウシフィブロネクチン(TELIOS Pharmaceutical Inc.,USA)を、PBS中に0.5mg/mlの濃度で再懸濁し、そして使用するまで凍結保存した。図2bに示すように、ビトロネクチン(VN)およびフィブロネクチン(FN)は、オステオポンチンについて有効であった濃度と等しいモル濃度で、カルシウム沈着を阻害できなかった。それゆえ、脈管石灰化を阻害することに対するオステオポンチンの効果は、非常に特異的である。さらに、これらの結果は、オステオポンチンが鉱化作用を調節する能力が、そのRGD依存性細胞接着機能と関係しないことを示す。
【0101】
(オステオポンチン阻害の機構)
オステオポンチンが石灰化を阻害する機構を試験した。1つの可能性は、オステオポンチンが、アルカリホスファターゼ活性に影響を与えることによってレバミゾールに類似した様式で機能し得、それによってβ−グルセロホスフェート由来の無機リン酸の産生を阻害し、そしてリン酸カルシウム沈着を妨害することであった。
【0102】
細胞アルカリホスファターゼ活性測定のために、細胞を、種々の濃度のオステオポンチンの存在下において石灰化培地中で培養した。細胞をPBSで3回洗浄し、そして細胞タンパク質を0.9% NaCl中の1% Triton X−100で可溶化し、そして遠心分離した。上清を、Besseyら、J.Biol.Chem.164:321−329(1946)(これは、本明細書中で参考として援用される)によって記載される方法によって、アルカリホスファターゼ活性についてアッセイした。1単位を、1分間中に1nmolのp−ニトロフェノールを生成する活性として定義した。タンパク質濃度を、Bio−Radタンパク質アッセイキット(Bio−Rad)を用いて決定した。そのデータを、細胞層のタンパク質含量に対して正規化した。
【0103】
図3aおよび3cに示すように、オステオポンチンを用いる処理は、BASMC培養物のアルカリホスファターゼ活性に影響を与えなかった。オステオポンチンの添加はまた、培地のリン濃度を減少しなかった。対照的に、レバミゾールは、用量依存的にBASMCアルカリホスファターゼ活性を阻害し(図3b)、そして培養培地中のリン濃度を減少させた。これらの結果は、オステオポンチンがアルカリホスファターゼ活性を阻害することによって作用するのではないことを実証する。
【0104】
オステオポンチンが培養培地中でカルシウムをキレートまたは封鎖(sequester)して、鉱化作用を妨害する可能性もまた、試験した。最初の石灰化培地に、オステオポンチンまたはビヒクル単独の存在下で、増加する濃度のカルシウムを補充した。次いで、培養物を、10日間の期間にわたってオステオポンチンの存在下または非存在下において行って石灰化させた。図4aに示されるように、培地のカルシウム含量を増加させることは、カルシウム沈着に対するオステオポンチンの阻害効果を克服し得た。このことは、より多くの無機質が細胞層において沈着されることを可能にする。このことと一致して、培養培地のリン含量(8.2mM〜7.3mM)の減少を述べた(図4b)。
【0105】
オステオポンチンの存在下において、10日間の期間の最後での培地のカルシウム含量もまた、測定した。カルシウムを封鎖することによってオステオポンチンが作用する場合、一定量のまたは増加量のいずれかのカルシウムが培地中で観察されることが予測された。このことは、培地中におけるオステオポンチン結合によるカルシウムの保持を反映する。しかし、その反対が観察された。カルシウム培地中のカルシウム濃度は、最初のカルシウム濃度と比較して、10日間の期間の最後で減少し、そしてカルシウム沈着と反比例した(図4aおよび4cを比較のこと)。従って、鉱化に対するオステオポンチンの阻害効果は、カルシウム依存性である(すなわち、カルシウム濃度の増加によって減少する)が、培地中で利用可能なカルシウムのキレート化には起因しない。この観察は、オステオポンチンの公知のカルシウム結合特性と一致する。約50分子のカルシウムが、生理学的なカルシウム濃度でオステオポンチンによって結合され得ることが示された(Chenら、J.Biol.Chem.267:24871−24878(1992))。従って、2mMのカルシウムをキレートするためには約40μMのオステオポンチン(2.7mg/ml)が必要であり、これは、本明細書中に記載されるアッセイにおいて血管性石灰化を阻害する際に有効であると実証されたオステオポンチンの量(0.5μg/ml)の5000倍より多い。
【0106】
BASMC培養物中の内因性および外因性のオステオポンチンの超微細構造的局在化もまた、免疫金標識を用いて決定して、血管性石灰化のオステオポンチン阻害の機構をさらに特徴付けした。BASMCを石灰化培地中で7日間培養して、石灰化が開始することを可能にした。次いで、精製したラットオステオポンチン(0.5μg/ml)を10日目まで加えた。培養物を、アルデヒド固定剤を使用して保存し、続いて、免疫細胞化学のためにLR Whiteアクリル樹脂中に包埋した。包埋後免疫標識を、McKeeら、Microscop.Res.And Tech.33:141−164(1996)(これは、本明細書中に参考として援用される)によって記載されるように、オステオポンチン抗体(OP−199)およびプロテインA−コロイド金複合体を使用して行った。手短に言えば、培養物の薄い(80nm)切片を、ニッケルグリッド上に配置し、そしてPBS中の1%オボアルブミンとともに5分間インキュベートし、続いて一次抗体とともに1時間のインキュベーション、PBSでのリンス、オボアルブミンを用いる再度のブロッキング、次いで30分間のプロテインA−金複合体への曝露を行った。蒸留水を用いる最終リンスの後、グリッドを風乾し、そして酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を用いて慣習的に染色し、そして透過型電子顕微鏡によって観察した。OP−199抗体の特異性は、ウェスタンブロッティング(Liawら、前出、(1994))ならびに免疫前血清およびプロテインA−金複合体単独を用いるインキュベーションによって以前に示された。
【0107】
これらの免疫金標識研究のために、オステオポンチンを除外したか(ビヒクル単独)、またはβ−グリセロホスフェートを用いる鉱化作用の開始の7日後に添加した。これらの条件下において、外因的に適用されたオステオポンチン(0.5μg/ml)は、10日目においてBASMC培養物石灰化をなお50%阻害し得た。低レベルの内因性オステオポンチンを、処理していない鉱化培養物中(代表的には、鉱化した領域中の拡散パターン中において)見出した。対照的に、オステオポンチン処理した培養物中では、金粒子は、石灰化の部位で豊富であった(代表的には、小さい石灰化の塊の境界に蓄積するか、または個々の結晶プロフィールと関連する)。免疫前血清およびプロテインA−金複合体単独をコントロールとして使用した場合は、金粒子は観察されなかった。このことは、オステオポンチンの、成長しているアパタイト結晶との直接的相互作用が、その阻害機能に必要とされることを示す。オステオポンチンは、鉱化されないマトリックスまたは細胞と結合していることは観察されなかった。
【0108】
上記に記載された結果は、オステオポンチンがアパタイト結晶表面へのオステオポンチンの直接的な結合および結晶成長の阻害によって、低濃度で、血管細胞によって媒介される生理学的な石灰化を阻害し得ることを実証する。従って、オステオポンチンは、異所性石灰化を妨害および処理する際に治療的に有用である。
【0109】
(実施例III 培養されたヒト血管細胞の石灰化)
この実施例は、上昇した無機リン酸の存在下で培養されたヒト平滑筋細胞によるカルシウム沈着が異所性石灰化の信頼できるモデルであることを示す。生理学的に関連する石灰化を誘導するための方法が記載される。これらの方法は、異所性石灰化を阻害するそれらの能力についてオステオポンチンおよびそのフラグメントの調製物をアッセイするために使用され得る。
【0110】
正常な成人の血清無機リン酸濃度の範囲は、約1.0〜1.5mMである。高い血清リン酸レベル、すなわちリン酸塩過剰血症は、種々の疾患状態(例えば、慢性腎不全および引き続く腎透析を含む)と関連して起こる。このような疾患状態において、血清無機リン酸濃度のレベルは、代表的には2mMを超える。リン酸塩過剰血症と関連する異所性石灰化をモデル化するために、そしてオステオポンチンおよびその機能的フラグメントの、そのような石灰化に対する効果を決定するために、石灰化についての関連するインビトロモデル系を以下のように開発した。
【0111】
ヒト血管平滑筋細胞(HSMC)を、Ross、J.Cell.Biol.50:172−186(1971)およびLiawら、J.Clin.Invest.95:713−724(1995)(これらは、本明細書中で参考として援用される)によって記載されるような酵素的消化によって得た。手短に言えば、内側の組織を、ヒト心臓移植手術および剖検でそれぞれ得たヒト大動脈の切片から分離した。班SMCについて、冠状動脈内じゅく腫切除術由来の組織を、手術時に得た。組織の小さな断片(1〜2mm3)を、165U/mlのI型コラゲナーゼ、15U/mlのIII型エラスターゼ、および0.375mg/mlのダイズトリプシンインヒビターを補充したDMEM中で一晩、37℃で消化した。単一細胞懸濁物を、6ウェルプレート中に配置し、そして5%CO2を含む加湿した空気中において、20% FCSを補充したDMEM中で3週間、37℃で培養した。コロニーを形成した培養物を、コンフルエンスで収集し、そして増殖培地(100U/mlのペニシリンおよび100mg/mlのストレプトマイシンを補充した、15% FBSおよび1mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM;最終無機イオン濃度は1.4mMであった)中で維持した。培養物の純度を、α−SMアクチンおよびカルポニンについてのポジティブ免疫染色、ならびにRoss、前出(1971)およびLiawら、前出(1995)によって記載されるようなフォン ビルブラント因子の染色の非存在によって評価した。
【0112】
初代ヒト成体および胎児の大動脈内側および冠状動脈の班の初代細胞(8継代まで)を、これらの実験において使用した。胎児および成体のHSMC培養物もまた、Perezら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1224−1228(1992)(本明細書中で参考として援用される)によって記載されるように、HPV−E8E7を使用して不死化し、そして特徴付けした。
【0113】
HSMCを、増殖培地中で慣用的にサブクローンした。コンフルエンスの時点で、細胞を石灰化培地(100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを補充した、2mM 無機リン酸の存在下の15% FBSおよび1mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)に、14日目まで切り替えた。その培地を2日毎に新鮮な培地と交換した。時間経過実験のために、石灰化培地中での培養の1日目を0日目と定義した。カルシウム沈着を定量し、そして実施例Iにおいて上記に記載されるように組織化学的および細胞化学的に評価した。
【0114】
正常なレベルのリン酸(1.4mMの無機リン酸(Pi))を含む培地中では、HSMCは、非常に少ないカルシウム無機質を蓄積した。対照的に、2mM 無機リン酸の存在下では、カルシウム沈着は、時間依存性の様式で増加した。例えば、9日目において、石灰化HSMC対非石灰化コントロールは、210.3+/−2.4対15.1+/−2.4(μg/mgタンパク質)(平均+/−SEM(n+3))であった。カルシウム沈着に対する無機リン酸の効果は、1.4mM〜2mMの範囲の無機リン酸にわたって用量依存性であった。上昇した無機リン酸による石灰化の誘導は、ヒト細胞の一般的な特徴であるようであった。なぜなら、異なる供給源(ヒト成体および胎児の大動脈および冠状動脈の班)由来の初代HSMCおよびこれらの細胞の不死化された誘導体が、同様の挙動を示したからである。カルシウム無機質の自発的な沈着は、石灰化培地中または10mMまでの無機リン酸を補充した培地中では起こらなかった。このことは、細胞および/または細胞由来のマトリックスが、鉱化作用のために必要であることを示す。
【0115】
ヒト細胞培養系において観察された石灰化が生理学的に関連するか否かを決定するために、形態学的研究を行った。HSMCを石灰化培地で10日間培養した後に、顆粒状の沈着が細胞培養を通して発生した。この沈着を、実施例Iにおいて記載するように、フォン コッサ染色によってリン酸含有無機質として同定した。黒色に染色された粒子を、多層性の病巣に最も多く蓄積している細胞外領域中で優勢的に、細胞層を通して、拡散的に散乱させた。電子顕微鏡分析は、実施例Iに記載した系におけるウシSMC培養物の石灰化と本質的に同一である、アパタイト無機質相、石灰化したコラーゲン原線維、および鉱化した培養物に結合したマトリックスベシクルの存在を確証した。
【0116】
これらの結果は、代表的には、リン酸塩過剰血症の個体において見出される無機リン酸濃度を含む培地中で培養された場合に、HSMC培養物が石灰化しやすいことを実証する。さらに、培養されたヒト細胞中で観察された石灰化は、インビボで石灰化した組織において観察された異所性石灰化と同様である。従って、HSMC石灰化培養系を、異所性石灰化のレギュレーターの効果を正確に評価するために使用し得る。
【0117】
(実施例IV オステオポンチンおよびその機能的フラグメントによるヒト血管細胞の石灰化の阻害)
この実施例は、オステオポンチンおよび典型的なオステオポンチンの機能的フラグメントが、ヒト平滑筋細胞の石灰化を効果的に阻害することを例証する。従って、オステオポンチンを、異所性石灰化を治療的に阻害するために使用し得る。
【0118】
オステオポンチンおよび機能的フラグメントを、異所性石灰化を阻害するそれらの能力について、実施例IIIにおいて記載したHSMC石灰化系を使用してアッセイした。オステオポンチンタンパク質は、全長ヒト組換えオステオポンチンならびにSmithら、前出(1996)によって記載されるようなネイティブなタンパク質のトロンビン切断後に形成されるフラグメントと同様の、組換えN末端およびC末端のヒトオステオポンチンフラグメントを含む。2つのN末端フラグメント(10Nおよび30N)を使用した。これらは、オステオポンチンの2つの異なるスプライシング改変体を指す。30Nスプライシング改変体は、さらなる14アミノ酸NAVSSEETNDFKQE(配列番号7)を含み、これは、エキソン5(アミノ酸59〜72)に対応する。10Nフラグメントは、ネイティブオステオポンチンのアミノ酸17〜58および73〜160を含むが、30Nフラグメントはアミノ酸17〜169を含む。10Cフラグメントは、オステオポンチンのC末端ドメイン(アミノ酸170〜317)を含む。
【0119】
N末端およびC末端の組換えオステオポンチンフラグメントを、GSTとの融合タンパク質として発現させ、グルタチオンビーズ上のアフィニティークロマトグラフィーによって細菌溶解物から精製し、そしてトロンビンを用いて切断した。全長ヒト組換えオステオポンチンを、Hisタグ化タンパク質として調製した。得られる組換えタンパク質のサイズおよび純度を、SDS−PAGE分析(Smithら、前出(1996))によって確証した。
【0120】
組換えオステオポンチンおよびその機能的フラグメントを、カゼインキナーゼIIによるリン酸化の前に、またはそのリン酸化の後のいずれかに、ヒト平滑筋細胞(HSMC)の異所性石灰化を阻害するその能力についてアッセイした。カゼインキナーゼIIによるリン酸化によって達成されたオステオポンチン(OPN)およびそのフラグメントに取り込まれたリン酸の量を、図5bに示す。図5aに示すように、高いリン酸石灰化培地の存在下において、HSMCマトリックスへのカルシウム沈着は、リン酸化された、OPN、30N OPN、10N OPN、または10C OPNの添加によって基底レベルに減少する。これらのタンパク質の非リン酸化型は、このアッセイにおいてカルシウム沈着に有意な影響を与えない。これらの結果は、オステオポンチンのN末端フラグメントとC末端フラグメントの両方が、オステオポンチンの機能的フラグメントであること、ならびにセリン−スレオニンリン酸化が、オステオポンチンおよびその機能的フラグメントの機能的活性のために重要であるようであることを示す。
【0121】
図6において示されるように、カゼインキナーゼIIによってリン酸化された組換えオステオポンチンは、15nMの濃度でHSMC石灰化を阻害し得る。アルカリホスファターゼ(ALP)を用いる脱リン酸化は、この阻害活性を逆転する。これらの結果は、オステオポンチンおよびその機能的フラグメントの機能的活性のためのリン酸化の重要性を確証する。
【0122】
ヒトオステオポンチンの異所性石灰化に対する効果は、0.1μg/ml〜5.0μg/mlの濃度にわたって用量依存的である(図7)。さらに、オステオポンチンの、異所性石灰化を阻害および逆転することに対する効果は迅速であり、添加後60分間までに有意に減少したカルシウム沈着が見られ、90分間までに約50%の阻害が観察可能である(図8)。
【0123】
これらの結果は、オステオポンチンおよびその典型的な機能的フラグメントが、迅速かつ低濃度で、ヒト細胞の生理学的に関連する異所性石灰化を効果的に阻害し得ることを示す。従って、全長オステオポンチンおよびその機能的フラグメントは、異所性石灰化を示すか、または異所性石灰化の危険がある個体において異所性石灰化を阻害する際に治療的に有効である。
【0124】
(実施例4)
(オステオポンチンは、インビボにて異所性石灰化を阻害する)
本実施例は、オステオポンチンがインビボにて異所性石灰化を阻害することを示す。
【0125】
正常なマウスおよびオステオポンチンが欠損したマウスにおけるブタ人工弁の皮下移殖の効果を試験して、インビボでの異所性石灰化におけるオステオポンチンの役割を決定した。オステオポンチン遺伝子のうちの1コピーまたは両方のコピーが欠損したマウスが、Liawら、前出(1998)に記載されている。4.0mm2片のブタグルタルアルデヒド固定大動脈弁リーフレットを、オステオポンチンについて野生型(WT)、ヘテロ接合型(HTZ)またはヌル対立遺伝子(KO)のいずれかを保有する5〜6週齢の雌性マウス中に皮下移殖した。14日後、移植片を取り出し、凍結乾燥し、そして酸加水分解した。カルシウムレベルを、実施例1に記載のようにアッセイし、そしてその外殖片の乾燥重量に対して標準化した。
【0126】
図9に示されるように、移殖された弁は、野生型またはヘテロ接合型のマウスようりもオスポンチンヌルマウスにおいて有意に大きな程度まで石灰化する。従って、オステオポンチンが関連のインビトロ系において異所性石灰化を阻害するという観察された能力と一致して、これらの結果は、オステオポンチンが、インビボにて異所性石灰化を阻害することを示す。
【0127】
異物炎症応答もまた、このオステオポンチンヌルマウスにおいて損なわれるようである。例えば、野生型またはヘテロ接合型のマウスと比較して、オステオポンチンヌルマウスにおいては、弁移殖の部位にてマクロファージによる炎症の明らかな減少が存在する。炎症および異所性石灰化の部位に通常は浸潤するマクロファージが、石灰化した沈着物の除去を食作用によって促進すると予期される。従って、オステオポンチンが、ヒドロキシアパタイト形成を阻害することおよびマクロファージによる石灰化沈着物の食作用性吸収を促進することの両方を行うことが、予期される。
【0128】
従って、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを個体に投与することは、異所性石灰化を阻害することにおいて治療的に有効である。
【0129】
(実施例5)
(CAIIを発現する異物巨細胞(FBGC)およびマクロファージによる、インビボでの異所性石灰化のオステオポンチン媒介性阻害)
本実施例は、オステオポンチンが、細胞外環境を酸性化しかつ鉱化した沈着物を溶解し得る、炭酸脱水酵素IIを発現するマクロファージおよび破骨細胞様異物巨細胞(FBGC)の蓄積および活性化を促進することを、示す。
【0130】
(OPN欠損マウス中への大動脈弁リーフレットの移植)
正常マウスおよびオステオポンチン欠損マウスにおける、生体人工グルタルアルデヒド固定大動脈弁(GFAV)の皮下移殖の効果を試験して、インビボでの異所性石灰化におけるオステオポンチンの役割をさらに特徴付けた。実施例5に記載のように、オステオポンチン遺伝子のうちの1コピーまたは両方のコピーが欠損したマウスを、Liawら、前出(1998)に従って得た。4.0mm2片のグルタルアルデヒド固定大動脈弁リーフレット(GFAV)を、オステオポンチンについて野生型(WT)、ヘテロ接合型(HTZ)またはヌル対立遺伝子(KO)のいずれかを保有する5〜6週齢の雌性マウス中に皮下移殖した。7日、14日、および30日後に、オステオポンチン野生型(WT)、ヘテロ接合型(HTZ)またはヌル対立遺伝子(KO)のマウスから移植片を取り出し、そして鉱質沈着、タンパク質蓄積、および細胞補充についてアッセイした。
【0131】
一旦取り出してから、この移植片をメチルカーノイズ溶液を用いて固定し、パラフィン中に包理し、そしてLiawら、前出により記載されるような抗OPN(OP−199)抗体を10μg/mlにて使用して、OPN蓄積について5μm切片を分析した。切片を、メチルグリーンを用いて対比染色した。OPN蓄積を、Pro Image Analysis Programを使用して定量した。さらに、カルシウムレベルを、実施例1に記載のようにアッセイし、そしてその移植片の乾燥重量に対して標準化した。
【0132】
図10Aに示されるように、オステオポンチンは、オステオポンチンWTマウス中への移植の14日後の弁中で観察される。この時点で、オステオポンチンは、その移植片と周囲の異物応答との間の境界に制限されている。対照的に、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウスは、それぞれ、GFAV移植の14日目に、OPNレベルが非常に減少したかまたはOPNレベルが存在しない。
【0133】
GFAV石灰化を定量するために、この外殖片を凍結乾燥し、秤量し、次いで0.6N HCLを用いて室温で一晩酸加水分解した。カルシウム定量を、Sigma Diagnosticキット(Sigma、St.Louis、IL)に指令されるように、o−クレゾールフタレインコンプレクソンによって実施し、そして乾燥重量に対して標準化した。このキットの精度を、原子吸光分光法によって確認した。オステオポンチンWTマウスは、アリザリンレッドS染色およびカルシウム定量に基づく、検出可能なGHAV鉱化作用を示さない。対照的に、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウスは、オステオポンチンWTマウスより4〜5倍高いGFAV石灰化を示す(図10B)。
【0134】
30日以内に、オステオポンチンKOマウスは、なおオステオポンチンを蓄積せず、そしてGFAV鉱化作用は、14日目の時点から有意には変化しない(図10Aおよび10B)。オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンWTマウスは、14日目の時点に対して上昇したオステオポンチンレベルを示す。これらのマウスにおいて、オステオポンチンの局在性は、もはや移植片/異物カプセルの境界に限定されないが、GFAV移植片に浸透することもまた見出される。さらに、異物カプセルに位置するオステオポンチンは、移植片に隣接するFBGCによって最も大いに発現される。30日目の時点で、オステオポンチンWTマウスは、GFAV石灰化を示すが、鉱質レベルは、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウスについて観察されるものの1/4の低さである。また、30日目の時点で、オステオポンチンHTZマウスは、石灰化の劇的な減少を示し、このことは、オステオポンチンの存在が鉱質沈着を阻害していることのみならず、GFAVからの鉱質の除去を媒介していることもまた、示す。60日目の時点で、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンWTマウスは、各々の30日目の時点と比較して、4〜5倍の増加を示す(図10B)。同様に、60日目の時点で、オステオポンチンKOマウスにおけるGFAV弁石灰化は、30日目の時点と比較してほぼ2倍増加する(図10B)
オステオポンチンHTZマウスにおける30日目の時点で観察された有意なオステオポンチンレベルの蓄積は、GFAV鉱化作用の減少または反転を伴った。OPN単独ではリン酸カルシウムの溶解を媒介し得ないので、観察された鉱質の損失は、むしろオステオポンチン調節性の事象である。リン酸カルシウム除去をすることができる唯一の機構は、食作用および酸性化である。
【0135】
(オステオポンチン媒介性マクロファージ補充の分析)
マクロファージ蓄積を試験するために、14日目および30日目にオステオポンチンWTマウス、HTZマウスおよびKOマウスからGFAV移植片を取り出し、そして5μm切片を、6μg/mlの抗マウスBM−8(Accurate Chemical & Scientific Corp.、Westbury、N.Y.)を使用して、マクロファージ蓄積について分析した。1次抗体との1時間のインキュベーションの後、ビオチン化ヤギ抗ラット抗体(Vector Laboratories Inc.、Burlingame、CA)を添加し、そして45分後に、反応産物を3,3−ジアミノベンジジン(DAB)(Sigma、St.Louis、MO)を用いて検出した。この切片を、メチルグリーンを用いて対比染色した。
【0136】
BM−8表面マーカーの免疫化学的位置決定および定量によって示されるように、オステオポンチンKOマウスは、GFAV移植部位へのマクロファージの補充の欠如を示す(図11)。さらに、このオステオポンチンKOマウスは、移植の14日目および30日目にオステオポンチンWTマウスと比較して、それぞれ50%〜25%低いレベルのBM−8細胞染色を示した。
【0137】
オステオポンチンWTマウスにおいて、BM−8陽性細胞は、早い時点で拡散して蓄積したが、後には、移植片の縁に沿って濃縮した。このことは、これら細胞の活性化を示唆する。対照的に、BM−8細胞は、オステオポンチンKOマウスにおいて移殖片/異物カプセルの境界に沿って濃縮することはなく、このことは、活性化の欠如を意味する。
【0138】
オステオポンチンHTZマウスもまたBM−8陽性細胞蓄積の減少を示したが、マクロファージの欠損は、30日目の時点で観察された鉱質損失パターンと関連がなかった。全体として、試験したどの時点においても、非常に少数のマクロファージしかGFAVに浸透し得なかった。このことは、食作用単独では、鉱化作用の反転を媒介し得ないことを示唆する。
【0139】
(GFAV外殖片のpH分析)
GFAVを、移殖の30日後にオステオポンチンWTマウス、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウスから外殖して、オステオポンチンが移殖片酸性化を促進し、オステオポンチンHTZマウスにおいて観察されたようなGFAV移殖片からの鉱質の除去に寄与するか否かを調査した。この外殖片を凍結乾燥し、次いでUniversal Indicator Solution(Fisher Scientific、Pittsburg、PA)に浸漬した。各移殖片のpHを、製造業者に提供された色目盛りに対してGFAV溶液の色を3人の別々の観察者によって比較して個々に決定した。
【0140】
オステオポンチンWTマウス由来のGFAV外殖片は酸性のpH(6.0)を有したが、オステオポンチンKOマウス由来の外殖片は、中性付近のpH(6.7)を維持した。pHのこれらの差異は、統計的に有意であった(p=0.0002)。オステオポンチンHTZマウス由来のGFAV移殖片は、中間のpH(6.2)を有した。未移殖のGFAVは、pH6.5を有した(図12)。アパタイトの安定性は37℃で7.0未満のpHにて減少するので、これらの外殖片の観察されたpHは、アパタイト性鉱質沈着物を溶解する能力に関して生理学的に関連があり、そして観察されたGFAV鉱化作用の損失を説明する。これらの知見は、オステオポンチンが、宿主細胞がGFAV微小環境を酸性化する能力を調節することによって鉱質吸収を制御することを示す。
【0141】
(GFAV移殖部位での炭酸脱水酵素II発現の分析)
破骨細胞およびマクロファージは、炭酸脱水酵素II(CAII)、すなわち、局所の微小環境の酸性化を促進する酵素を発現する。5μm切片中のタンパク質を、5μg/mlのヒツジ抗ヒトCAII抗体(Biodesign International、Kennebunkport、ME)を使用して位置決定することによって、移植の14日後および30日後のオステオポンチンWTマウス、オステオポンチンHTZマウス、およびオステオポンチンKOマウス由来のGFAV外殖片に、CAIIおよびカテプシンKを発現する細胞を位置決定した。室温で1時間1次抗体とともにインキュベートした後、ビオチン化ウサギ抗ヒツジ抗体(Vector Laboratories Inc.、Burlingame、CA)とともに45分間インキュベートした。その反応産物を、3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)(Sigma、St.Louis、MO)を用いて検出し、そして切片を、メチルグリーンを用いて対比染色した。CAII発現を、Pro Image Analysis Programを使用して定量し、そして図13において面積のパーセンテージとして示す。FBGCを、外殖片の4つの象限中にて計数した(図14)。1つより多くの核を含むすべての細胞を、FBGCであるとみなした。
【0142】
CAII免疫染色の定量によって、CAII発現の鉱質依存性およびオステオポンチン依存性の調節が明らかになった(図13)。14日目に、オステオポンチンWTマウスにおいて、オステオポンチンが存在し、そしてGFAV移殖片は、鉱化しない。その後、鉱質除去の必要性がほとんど存在しない場合、CAIIレベルは低い。30日目に、GFAVが鉱化し始め、オステオポンチンが蓄積し、そしてCAII発現細胞が劇的に増加する。逆に、オステオポンチンKOマウス(観察したすべての時点で上昇した鉱質レベルを示す)は、非常に低いCAIIレベルを示す。オステオポンチン媒介性CAII応答が、オステオポンチンHTZマウスにおいて促進される。14日目に、オステオポンチンHTZマウスは、オステオポンチンのレベルの減少に起因する実質的GFAV鉱化作用を示すが、CAII陽性細胞を産生することによって、この鉱化作用に応答する。従って、このデータは、オステオポンチンHTZマウスが、鉱化作用を直接阻害するに十分高いレベルのオステオポンチンを発現するわけではないが、その発現レベルが、CAII発現またはCAII陽性細胞の形成の増進を促進するためために十分であることを、示す。CAIIに加えて、カテプシンKの高発現が、CAII発現FBGCにおいて観察された。カテプシンKは、破骨細胞において優先的に発現され、そして破骨細胞の吸収活性に重要であることが示された、システインプロテアーゼである。
【0143】
オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウスにおいて観察された酸性化の欠如がFBGCの数の減少という結果であるか否かを決定するために、GFAV外殖片上のFBGCの数を計数した。FBGCを、Wadaら、Cir.Res.84、166〜178(1999)(本明細書中に参考として援用される)に記載のように実施して電子顕微鏡によって可視化した。FBGCの数は、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウス由来の14日目のGFAV外殖片によって示される、OPNが欠如した非常に石灰化した状態において2〜3倍に増加する。
【0144】
FBGC蓄積のパターンは、カルシウム沈着パターンとほぼ同一であり、そしてOPN蓄積とは逆である。このデータは、オステオポンチンの欠如が、GFAV移殖片付近でのFBGC蓄積の増加を促進するが、これらのFBGCは、減少したCAIIレベルによって判断されるように、酸性化能力の減少を示すことを示唆する。
【0145】
これらの結果は、オステオポンチンが、細胞外微小環境を酸性化しそして鉱化した沈着物を溶解し得る、炭酸脱水酵素IIを発現するマクロファージおよび破骨細胞様異物巨細胞(FBGC)の蓄積および活性化を促進することを示す。
【0146】
(リン酸化オステオポンチンは、インビボにて生体人工弁の石灰化を阻害する)
GFAVを、コントロールビヒクル、非リン酸化オステオポンチンまたはリン酸化オステオポンチンのいずれかの1mg/ml溶液中で、オステオポンチンKOマウスへの移殖の前に3日間インキュベートした。14日後、カルシウム定量を、上記のように実施した。図15に示されるように、これらの結果は、リン酸化オステオポンチンが、インビボにて生体人工弁の石灰化を阻害することを示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、Kieferら、Nucleic Acids Res.17:3306(1989)に記載されるようにヒトオステオポンチンのヌクレオチド配列(配列番号1)およびアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
【図2】
図2は、BASMCの石灰化に対するビトロネクチンおよびフィブロネクチン(b)と比較したオステオポンチン(a)の効果を示す。
【図3】
図3は、BASMCのアルカリホスファターゼ活性(a)および培地中の亜リン酸濃度(b)に対するオステオポンチンの効果、ならびにアルカリホスファターゼ(ALP)活性に対するレバミゾールおよびオステオポンチン(OPN)の効果(c)を示す。
【図4】
図4は、種々の初期カルシウム濃度でのカルシウム沈着(a)、培地亜リン酸濃度(b)および培地カルシウム濃度(c)に対するオステオポンチンの効果を示す。
【図5】
図5は、HSMCカルシウム沈着に対する組換えオステオポンチンおよびその機能的フラグメントの効果(a)、ならびにカゼインキナーゼIIによる組換えオステオポンチンフラグメントのリン酸化の程度(b)を示す。
【図6】
図6は、HSMC石灰化に対するオステオポンチンのリン酸化および脱リン酸化の効果を示す。
【図7】
図7は、HSMC石灰化に対する種々の濃度のオステオポンチンの効果を示す。
【図8】
図8は、HSMC石灰化に対するオステオポンチンの阻害の時間経過を示す。
【図9】
図9は、マウスに皮下移植された弁の石灰化に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図10A】
図10Aは、マウスに皮下移植され、7日、14日および30日の時点で取り出された弁におけるオステオポンチン蓄積に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図10B】
図10Bは、マウスに皮下移植され、7日、14日および30日の時点で取り出された弁におけるカルシウム沈着を示す。
【図11】
図11は、マウスに皮下移植された弁の部位へのマクロファージの補充に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図12】
図12は、マウスに皮下移植された弁のpHに対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図13】
図13は、マウスに皮下移植された弁の部位での炭酸脱水酵素II発現に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図14】
図14は、マウスに皮下移植された弁の多核性異物巨細胞の数に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図15】
図15は、インビボでの弁鉱化作用に対するオステオポンチンのリン酸化の効果を示す。
【発明の名称】 異所性石灰化を阻害する方法
【特許請求の範囲】
【請求項1】 個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、治療有効量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを含有する、組成物。
【請求項2】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記異所性石灰化が、アテローム性動脈硬化症、狭窄症、再狭窄、人工弁置換、血管形成術、腎不全、組織損傷、糖尿病および老化からなる群から選択される状態と関連する、組成物。
【請求項3】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンが、配列番号2のアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドまたはその機能的フラグメントである、組成物。
【請求項4】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントが、薬学的に受容可能なキャリアと共に投与するために処方される、組成物。
【請求項5】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントが、前記異所性石灰化の部位に投与するのに適している、組成物。
【請求項6】 請求項5に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントが、プロテーゼデバイスと接触するのに適している、組成物。
【請求項7】 請求項6に記載の組成物であって、ここで、前記プロテーゼデバイスが、生体人工心臓弁である、組成物。
【請求項8】 請求項6に記載の組成物であって、ここで、前記接触が、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの、前記プロテーゼデバイスへの付着を包含する、組成物。
【請求項9】 請求項6に記載の組成物であって、ここで、前記接触が、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを発現する細胞の、前記プロテーゼデバイスへの付着を包含する、組成物。
【請求項10】 請求項9に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、前記オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを組換え発現する、組成物。
【請求項11】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンの有効量が、ヒドロキシアパタイト結晶に結合しそして鉱化作用を阻害するのに十分な量をさらに包含する、組成物。
【請求項12】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記オステオポンチンの有効量が、局所的な微小環境を酸性化しそして鉱化作用を阻害するように細胞を刺激するのに十分な量をさらに包含する、組成物。
【請求項13】 請求項12に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、炭酸脱水酵素IIを発現する、組成物。
【請求項14】 請求項13に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、多核性異物巨細胞である、組成物。
【請求項15】 請求項13に記載の組成物であって、ここで、前記細胞が、マクロファージである、組成物。
【請求項16】 異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、有効量のマクロファージを含有し、該有効量のマクロファージが、該異所性石灰化の部位で鉱化した沈着物を溶解し、そしてそれにより該異所性石灰化を阻害するのに十分である、組成物。
【請求項17】 請求項16に記載の組成物であって、ここで、前記マクロファージが、炭酸脱水酵素IIを発現することにより局所的な微小環境を酸性化する、組成物。
【請求項18】 請求項16に記載の組成物であって、該組成物は、オステオポンチンをさらに含有し、それにより前記マクロファージによる前記局所的な微小環境の酸性化を刺激する、組成物。
【請求項19】 請求項16に記載の組成物であって、ここで、前記マクロファージが、プロテーゼデバイスと接触するのに適している、組成物。
【請求項20】 請求項19に記載の組成物であって、ここで、前記プロテーゼデバイスが、生体人工心臓弁である、組成物。
【請求項21】 異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、有効量の多核性異物巨細胞を含有し、該有効量の多核性異物巨細胞が、該異所性石灰化の部位で鉱化した沈着物を溶解し、そしてそれにより該異所性石灰化を阻害するのに十分である、組成物。
【請求項22】 請求項21に記載の組成物であって、ここで、前記多核性異物巨細胞が、炭酸脱水酵素IIを発現することにより局所的な微小環境を酸性化する、組成物。
【請求項23】 請求項21に記載の組成物であって、該組成物は、オステオポンチンをさらに含有し、それにより前記多核性異物巨細胞による局所的な微小環境の酸性化を刺激する、組成物。
【請求項24】 請求項21に記載の組成物であって、ここで、前記多核性異物巨細胞が、プロテーゼデバイスと接触するのに適している、組成物。
【請求項25】 請求項24に記載の組成物であって、ここで前記プロテーゼデバイスが、生体人工心臓弁である、組成物。
【請求項26】 異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、該異所性石灰化の部位に対して酸生成細胞を補充するために十分な有効量のオステオポンチンを含有し、該異所性石灰化の部位で該酸生成細胞が、該異所性石灰化の阻害を促進する、組成物。
【請求項27】 請求項26に記載の組成物であって、ここで、前記酸生成細胞が炭酸脱水酵素IIを発現する、組成物。
【請求項28】 請求項26に記載の組成物であって、ここで、前記酸生成細胞がマクロファージである、組成物。
【請求項29】 請求項26に記載の組成物であって、ここで、前記酸生成細胞が多核性異物巨細胞である、組成物。
【請求項30】 異所性石灰化を有する個体における異所性石灰化を阻害するための組成物であって、該組成物は、該異所性石灰化の部位で炭酸脱水酵素IIの発現を増加するために十分な有効量のオステオポンチンを含有し、ここで、該異所性石灰化の部位での該炭酸脱水酵素IIの発現が、該異所性石灰化の阻害を促進する、組成物。
【請求項31】 請求項30に記載の組成物であって、ここで、前記炭酸脱水酵素IIが、多核性異物巨細胞により発現される、組成物。
【請求項32】 請求項30に記載の組成物であって、ここで、前記炭酸脱水酵素IIが、マクロファージにより発現される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【0001】
(異所性石灰化を阻害する方法)
本発明は、国立保健研究所(National Institutes of Health)より授与された助成金番号HL40079−6A2およびHL18645、ならびに全米科学財団(National Science Foundation)により授与された助成金番号EEC9520161の下で政府の援助によりなされた。合衆国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【0002】
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、一般的に医学分野、そしてより特異的には異所性石灰化を阻害する方法に関する。
【0003】
(背景情報)
歯または骨以外の組織でのカルシウムの結晶の沈着とは、異所性石灰化と言われ、腎不全、心臓血管疾患、糖尿病および加齢過程と関連して一般的に生じる。腎不全を有する患者、特に長期の血液透析を受け、そして血清の鉱物バランスを適切に調節し得ない患者において、肺、心臓、胃および腎臓を含む内部器官における石灰化が頻繁に見出される。より低い程度で一般的に、血液透析の患者は、有痛性の石灰化した皮膚病変を発生し、その皮膚病変は、非治癒性の潰瘍または壊疽に進行し、そして罹患した肢の切断を必要とする。
【0004】
異所性石灰化はまた、生体人工心臓弁の移植の通常の合併症であり、そして置換弁不全の主要な原因である。異所性石灰化はまた、アテローム硬化症、糖尿病および心臓血管の疾患に関連して天然の心臓弁および血管に生じる。脈管構造における鉱物の沈着は、口を狭くし、そして罹患した弁および血管の壁を硬化し、心臓および末梢器官への血流の減少を生じる。従って、異所性石灰化は、弁不全、発作、虚血および心筋梗塞の危険を増大する。
【0005】
異所性石灰化の部位において(例えば、アテローム硬化症プラークおよび石灰化した大動脈弁において)、豊富な1つのタンパク質は、オステオポンチンである。オステオポンチンは、細胞の接着、伝播、および移動の促進を含むいくつかの既知の機能を有する。オステオポンチンは、冠状アテローム硬化症プラークにおける初期の石灰化の部位と共存し、そして、その発現は、アテローム硬化症が進行するにつれて増加する。これらの知見は、インビトロでのオステオポンチンがカルシウム結合特性を有することを示す研究と組み合わされ、オステオポンチンが異所性石灰化に関与し得るという示唆を導いた。以前の研究は、インビボでの異所性石灰化におけるオステオポンチンの役割に取り及んでいない。
【0006】
未処置で放置される場合、異所性石灰化は、罹患率および死の増加を生じる。血清の鉱物レベルを正規化するための、または血管組織または移植片の石灰化を阻害するための現在の治療は、効力が制限され、そして受容可能でない副作用を引き起こす。
【0007】
従って、異所性石灰化を阻害する有効な方法に対する必要性が存在する。本発明は、この必要性を充たし、そして関連する利点もまた提供する。
【0008】
(発明の要旨)
本発明は、個体において異所性石灰化を阻害する方法を提供する。この方法は、治療有効量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを個体に投与する工程からなる。この方法は、種々の条件(例えば、アテローム硬化症、狭窄症、再狭窄、人工弁置換、血管形成術、腎不全、組織損傷、糖尿病および加齢)に関連する異所性石灰化を阻害するために使用され得る。本発明はまた、異所性石灰化の部位に対して標的化された個体の酸生成細胞への投与によって異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本発明はさらに、オステオポンチンの投与によって、異所性石灰化の部位に対する酸生成細胞の補充を促進する工程からなる、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本発明はまた、オステオポンチンの投与により異所性石灰化の部位での炭酸脱水酵素IIの発現を増加する工程からなる、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。
【0009】
(発明の詳細な説明)
本発明は、異所性石灰化の阻害のための有効な方法に関する。異所性石灰化は、通常、腎不全、心臓血管疾患、糖尿病、および加齢過程に関連して生じる。脈管構造の異所性石灰化は、心筋梗塞、虚血、発作、血管形成術後の切開および心臓弁不全の個体の危険性を増大する。生体人工心臓弁のようなプロテーゼ移植片の異所性石灰化は、移植片不全の主要な原因である。ゆえに、この方法は、異所性石灰化に関連する疾患および死を減少する。
【0010】
この方法は、オステオポンチンが異所性石灰化を有効に、かつ特異的に阻害し得るという発見に基づく。従って、異所性石灰化は、治療有効量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを、個体に対応して全身または異所性石灰化の予想部位もしくは既知の部位に投与することによって予防または処置され得る。オステオポンチンが、石灰化した組織および異所性石灰化の部位において通常に見出されることから、それは、最小限の毒性または免疫原性の副作用で投与され得る。
【0011】
本明細書中で用いられるように、用語「異所性石灰化」とは、骨および歯以外の部位でのカルシウム結晶の異常な沈着を意味することを意図する。異所性石灰化は、細胞外マトリックスにおける巨視的な無定形のリン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイト沈着の蓄積に帰着する。
【0012】
異所性石灰化は、種々の組織および器官において生じ得、そして多くの臨床状態に関連する。例えば、異所性石灰化は、冒された組織への炎症または損傷の結果であり得るか、全身の鉱物不均衡より生じ得る。一般的に、異所性石灰化は、動脈、静脈、毛細血管、弁および洞を含む血管組織において生じる。血管への炎症または損傷は、例えば、環境要因(例えば、喫煙、高脂肪の食事)の結果として生じる。炎症または損傷はまた、創傷、血管手術、心臓手術または血管形成術から生じる血管への外傷の結果として生じ得る。血管の石灰化はまた、加齢および疾患(高血圧、アテローム硬化症、糖尿病、腎不全およびその後の透析、狭窄ならびに再狭窄を含む)に関連する。
【0013】
異所性石灰化はまた、腱(Rileyら、Ann.Rheum.Dis.55:109−115(1996))、皮膚(Evansら、Pediatric Dermatology 12:307−310(1997))、強膜(Daickerら、Opthalmologica 210:223−228(1996))および子宮筋層(McCluggageら、Int.J.Gynecol.Pathol.15:82−84(1996))のような非血管組織において生じる。(それらの各々は、本明細書中において参考として援用される)。全身の鉱物不均衡という結果を生じる疾患(例えば、腎不全および糖尿病)において、内部器官(肺、心臓、腎臓および胃を含む)における異所性石灰化は、通常である(本明細書中で参考として援用される、Hsu、Amer.J.Kidney Disease 4:641−649(1997))。さらに、異所性石灰化は、医用材料、プロテーゼおよび医療デバイス(例えば、生体人工心臓弁)の移植の頻繁な合併症である(本明細書中で参考として援用される、Vyavahareら、Cardiovascular Pathology 6:219−229(1997))。本発明の方法は、これらの状態のすべてに関連して生じる異所性石灰化に適用可能である。
【0014】
用語「異所性石灰化」とは、骨の形成および成長の間、骨基質内で通常に生じる石灰化をいうことを意図しない。本明細書中で使用されるように、異所性石灰化はまた、腎尿細管において生じる異常な石灰化、主要なシュウ酸含有カルシウム腎臓結石の形成を生じる尿とは異なる。
【0015】
本明細書中で使用されるように、用語「阻害する」とは、異所性石灰化を阻害することに関連して、細胞外マトリックスのヒドロキシアパタイト結晶の沈着の形成、増殖または沈着の予防、遅延または逆転を意味することを意図する。
【0016】
本明細書中で使用されるように、用語「オステオポンチン」とは、異所性石灰化を阻害し得る分子、およびオステオポンチンとして当該分野において公知な1つ以上の分子に対する認識可能な類似の分子を意味することを意図する。オステオポンチンは、約34kDaの推定分子量を有するリン酸化されたシアロタンパク質として特徴付けられる。高い陰性、翻訳後修飾および選択的にスプライジングされたアイソフォームに起因して、オステオポンチンは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって決定されたような約44kDaと85kDaの間の見かけの分子量を有すると報告されている(Giachelliら、Trends Cardiovasc.Med 5:88−95(1995))。オステオポンチンの翻訳後修飾形態、および選択的にスプライジングされたアイソフォームの全ては、本明細書中で使用されるオステオポンチンの定義内に含まれる。
【0017】
オステオポンチンは、ラット(Oldbertら、Proc.Natl.,Acad.Sci.USA 83:8819−8823(1986));マウス(Craigら、J.Biol.Chem.264:9682−9689(1989));ヒト(Kieferら、Nucleic Acids Res.17:3306(1989)およびYoungら、Genomics 7:491−502(1990));ブタ(Wranaら、Nucleic Acids Res.17:10119(1989));ウシ(Kerrら、Gene 108:237−243(1991));ウサギ(Tezukaら、Biochem.Biophys.Res.Commun.186:911−917(1992));およびニワトリ(Mooreら、Biochemistry 30:2502−2508(1991))を含む種々の種において同定されている。(これらの各々は、本明細書中で参考として援用される)。これらの種由来のオステオポンチンおよび他の脊椎動物由来のオステオポンチンは、本明細書中で使用されるオステオポンチンの定義に含まれる。
【0018】
オステオポンチンは、既知の種にわたって保存される1つ以上のドメインの存在によって特徴付けられる。オステオポンチンを特徴付ける保存されたドメインは、例えば、N末端シグナル配列、カゼインキナーゼIIリン酸化部位、選択的にスプライジングされたドメイン、Arg−Gly−Asp(RGD)−含有インテグリン結合細胞接着ドメイン、Asp−に富んだカルシウム結合ドメイン、カルシウム結合相同性ドメインおよび2つのヘパリン結合相同性ドメインを含む(Giachelliら、前出(1995))。従って、オステオポンチンのこれらの特徴的な特性の1つ以上を有する新規に同定された分子もまた、オステオポンチンの定義内に含まれる。
【0019】
オステオポンチンはまた、骨シアロタンパク質I、ウロポンチン(uropontin)、分泌リンタンパク質I、2ar、2B7およびEta 1として当該分野において公知である(Giachelliら、前出(1995))。当該分野において使用されるこれらの用語のすべてによって包含される分子は、本明細書中で使用されるオステオポンチンの定義内に含まれる。
【0020】
ヒトオステオポンチンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は、Kieferら、前出(1989)によって記載され、そして本明細書中の図1(配列番号1および2)に示される。用語、オステオポンチンは、例えば、配列番号2に示される配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号1に示される配列と実質的に同じヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含むことを意図する。
【0021】
オステオポンチンおよびその機能的なフラグメントの修飾(それらは、異所性石灰化を阻害する能力を増強するか、またはそれほど影響をあたえないかのいずれか)もまた、用語「オステオポンチン」に含まれる。このような修飾は、例えば、構造的または化学的に類似のアミノ酸またはアミノ酸アナログでの、オステオポンチンのネイティブアミノ酸配列からの1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む。例えば、負に荷電したアミノ酸(例えば、グルタミン酸、またはアスパラギン酸)によって、リン酸化されたアミノ酸(例えば、セリン残基、またはスレオニン残基)の1つ以上の置換が意図される。インビボまたはインビトロのいずれかにおいてリン酸化され得る残基(例えば、キナーゼリン酸化コンセンサス配列)の置換または付加が、意図される。リン酸化のネイティブ部位
の間の残基の修飾(例えば、ヒドロキシアパタイトと相互作用するための、またはリン酸化部位の間の距離を減少するための、リン酸化された残基を有利に指向するような修飾)もまた、意図される。これらの修飾は、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの構造、高次構造、または機能的活性を増強するか、または有意に改変しないかのいずれかである。
【0022】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの活性にそれほど影響しない修飾はまた、糖、リン酸基、または脂質基の付加または除去、ならびに当該分野で公知の他の化学的誘導体を含み得る。加えて、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントは、その精製を補助し、そしてその活性にそれほど影響しないエピトープタグまたは他の配列の付加によって修飾され得る。
【0023】
本明細書中で使用されるように、用語「機能的フラグメント」とは、オステオポンチンと関連して、異所性石灰化を阻害するためのオステオポンチンの能力を維持するオステオポンチンの一部を意味することを意図する。機能的フラグメントは、例えば約6〜約300の長さのアミノ酸であり得、例えば約7〜約150の長さのアミノ酸であり得、より好ましくは、約8〜約50の長さのアミノ酸であり得る。所望する場合、機能的フラグメントは、異所性石灰化を阻害する能力と有利に協調する活性を有するオステオポンチンの領域を含み得る。例えば、オステオポンチンの機能的フラグメントは、細胞(異所性石灰化の部位での内皮細胞およびマクロファージ)の内殖を促進する配列を含み得る。同様に、オステオポンチンの機能的フラグメントは、例えば、異所性石灰化の部位での細胞接着および生存を有利に促進するRGD含有ドメインのような配列を含み得る。
【0024】
本明細書中で使用される場合、用語「個体」は、異所性石灰化を示すか、または発症の危険にあるヒトまたは他の哺乳動物を意味することを意図する。そのような個体は、例えば、アテローム性動脈硬化、狭窄症、腎不全、糖尿病、プロテーゼ移植、組織損傷、もしくは年齢関連血管疾患のような状態と関連する異所性石灰化を有し得るか、または発症の危険にあり得る。これらの状態の予後および臨床的徴候は、当該分野において公知である。本発明の方法により処置された個体はまた、血管手術(人工弁置換または血管形成術を含む)のための候補となり得るか、または経験し得る。本発明の方法により処置された個体は、例えば、糖尿病、腎不全、または腎臓透析に関連する全身性無機質不均衡を有し得る。
【0025】
本明細書中で使用される場合、オステオポンチンのアミノ酸配列またはそのフラグメントを参照する用語「実質的アミノ酸配列」は、オステオポンチンのアミノ酸配列と相同であると認識可能であり、かつ異所性石灰化を阻害する配列を意味することを意図される。例えば、オステオポンチンの配列と実質的に同じである配列は、オステオポンチンの配列と約70%よりも高い相同性、好ましくは、約80%よりも高い相同性、より好ましくは、約90%よりも高い相同性を有し得る。
【0026】
本明細書中で使用される場合、用語「プロテーゼデバイス」とは、病気にかかるか、不完全であるか、または欠損している身体の部分の、合成または生物学的に誘導される代用品をいう。本明細書中で使用される場合、用語「バイオプロテーゼデバイス」とは、部分的または完全に生物学的に誘導されるプロテーゼデバイスをいう。プロテーゼデバイスは、初期故障を導く異所性石灰化に影響されやすいが、これは本発明の方法によって阻害され得る。プロテーゼデバイスは、身体(例えば、耳、目、顎顔面領域、頭蓋、四肢および心臓を含む)の種々の部位に移植され得るか、または付着され得る。
【0027】
本発明の方法は、ステントを用いても、用いなくとも、人工心臓弁(例えば、大動脈弁または房室弁)の異所性石灰化を予防するために有利に使用され得る。置換心臓弁は、種々の材料(金属、ポリマー、および生物学的組織またはそれらの材料の任意の組み合わせを含む)から作製され得る。バイオプロテーゼ弁としては、哺乳動物(例えば、ヒツジ、ウシおよびブタ)に由来する異種移植された置換弁ならびにヒト弁が挙げられる。バイオプロテーゼ心臓弁は、一般的に組織固定に供され、そしてさらに、移植前に失活され得る。
【0028】
本発明は、個体における異所性石灰化を阻害する方法を提供する。その方法は、治療的に有効な量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを個体に投与する工程からなる。この方法は、治療剤として異所性石灰化部位に正常に存在する分子を使用するので、有利である。従って、この方法は、最小の毒性、最小の免疫原性および最小の副作用を生じる。
【0029】
オステオポンチンは、当該分野において公知の方法(例えば、適切な生物学的供給源からの精製、または化学合成によるものを含む)によって、調製され得るか、または得られ得る。オステオポンチンの適切な生物学的供給源は、オステオポンチンを含むかまたは発現する、組織、生物体液または培養細胞であり得る。特定の供給源におけるオステオポンチンタンパク質の存在および豊富さが、例えば、ELISA分析(Minら、Kidney Int.53:189−93(1998)(本明細書中に参考として援用される)または免疫細胞化学(O’Brienら、Arterioscler.Thromb.14:1648−1656(1994)(本明細書中に参考として援用される))を使用して、決定され得る。
【0030】
オステオポンチンは、腎臓細胞、肥大性軟骨細胞、ぞうげ芽細胞、骨細胞、骨髄、内耳および脳細胞に存在するか、またはこれらによって発現されることが決定されている。オステオポンチンはまた、生物体液(乳および尿を含む)内に見出される。オステオポンチンはまた、腫瘍、特に転移性腫瘍内に存在し、そしてそれは腎臓結石の成分である(Butlerら、Principles of Bone Biology、Bilezikianら編、Academic Press、San Diego、167−181頁(1996)(本明細書中に参考として援用される))。オステオポンチンはまた、血管損傷部位における平滑筋細胞、マクロファージおよび内皮細胞によって産生され得る(O’Brienら、Arterioscler.Thromb.14:1648−1656(1994)(本明細書中に参考として援用される))。従って、オステオポンチンは、当該分野において公知の生化学的精製法を使用して、これらの供給源のいずれかから精製され得る。
【0031】
オステオポンチンはまた、培養において増殖する上記組織系統のいずれかの細胞の分泌培地から得られ得る。例えば、オステオポンチンは、Liawら、Circ.Res.74:214−224(1994)(本明細書中に参考として援用される)により記載されるように、平滑筋細胞培養の馴化培地から実質的に精製され得る。
【0032】
以前に記載されたように、種々の種に由来するオステオポンチンのヌクレオチド配列は、公知である。従って、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントはまた、当該分野において、公知の方法を使用して、適切な宿主細胞(例えば、細菌細胞、酵母細胞、両生動物細胞、鳥細胞および哺乳動物細胞を含む)によって組換え的に発現され得る。種々の宿主生物体におけるペプチドの組換え発現および精製のための方法が、例えば、Sambrookら、Molecular Cloing:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、Plainview、New York(1989)およびAusubelら、Current Prorocols in Molecular Biology(Supplement 47)、John WileyおよびSons、New York(1999)(これらの両方が本明細書中で、参考として援用される)に記載される。オステオポンチンおよびそれ由来の例示的な機能フラグメントの組換え合成および精製のための方法が、例えば、Smithら、J.Biol Chem.271:28485−28491(1996)(本明細書中に参考として援用される)において記載される。
【0033】
組換え合成および精製の後、オステオポンチンおよびその機能的フラグメントは、当該分野において公知の酵素的方法を使用して、生理学的に関連する様式(例えば、リン酸化、アシル化またはグリコシル化による)において改変され得る。実施例IVにおいて記載されるように、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを生物学的に関連する部位においてリン酸化するために使用され得るキナーゼは、カゼインキナーゼIIである。当該分野において公知の他のセリン−スレオニンキナーゼ(例えば、プロテインキナーゼC)もまた、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントをリン酸化するために使用され得る。
【0034】
本発明の方法は、異所性カルシウム沈殿を阻害する活性を有するオステオポンチンまたはその任意の機能的フラグメントを使用して、実施され得る。オステオポンチンのフラグメントが、異所性石灰化を阻害するその能力を決定するために、本明細書に記載されるように、選択されて、当該分野において公知の方法によって、産生されて、そしてスクリーニングされる。
【0035】
オステオポンチンのフラグメントが、例えば、オステオポンチンの酵素的切断または化学的切断によって、産生され得る。酵素的切断および化学的切断のための方法ならびに生じたタンパク質フラグメントの精製のための方法は、当該分野において公知である(例えば、Deutscher、Method in Enzymology、第182巻、「Guide to Protein Purification」San Diego:Academic Press、Inc.(1990)(これは本明細書中に参考として援用される)を参照のこと)。例として、オステオポンチンは、Arg169とSer170との間にトロンビン切断部位を含む。オステオポンチンのN末端切断フラグメントまたはC末端切断フラグメントのいずれかが、本発明の方法において使用され得る。
【0036】
オステオポンチンのフラグメントはまた、オステオポンチンの配列を実質的に有するペプチドの化学的合成または組換え合成によって、産生され得る。例えば、オステオポンチンの重複配列にわたるペプチドライブラリーが、当該分野において公知の方法を使用して産生され得、そして本明細書中に記載されるように、それらの機能的活性についてスクリーニングされ得る。さらに、Smithら、前出 271:28485−28491(1996)によって記載されるように、オステオポンチンのN末端トロンビン切断フラグメントまたはC末端トロンビン切断フラグメントが組換え的に産生されて、そして本発明の方法において使用され得る。
【0037】
本明細書中に開示されるように、オステオポンチンは、直接吸着すること、およびアパタイト結晶の成長および形成を阻害することによって、異所性石灰化を阻害し得る。従って、オステオポンチンの機能的フラグメントは、カルシウムまたはカルシウム沈着物と結合する、そのフラグメントの予期される能力に基づいて選択され得る。カルシウムと結合することが意図される領域としては、アスパラギン酸リッチ配列およびカルシウム結合相同性ドメインが挙げられる。従って、オステオポンチンの機能的フラグメントとしては、例えば、アスパラギン酸リッチカルシウム結合ドメインの配列(DDMDDEDDDD(配列番号3))を実質的に含み得るか、またはカルシウム結合相同性ドメインの配列(DWDSRGKDSYET(配列番号4))を実質的に含み得る。
【0038】
さらに、本明細書中に開示されるように、リン酸化が、異所性石灰化を阻害するオステオポンチンの能力を調節し得る。従って、オステオポンチンの機能的フラグメントが、リン酸化コンセンサス配列の存在によって選択され得る。選ばれるべきオステオポンチンの機能的フラグメントとしては、例えば、カゼインキナーゼIIリン酸化コンセンサス領域(SGSSEEK(配列番号5))またはC末端ヘパリン結合相同性ドメインSKEEDKHLKFRISHELDSASSEVN(配列番号6)の実質的な配列が挙げられ得、これらは、保存された3つのセリンリン酸化部位を含む。あるいは、またはさらに、オステオポンチンの機能的フラグメントは、選択的にスプライシングされたドメイン(NAVSSEETNDFKQE(配列番号7))が挙げられ、これらは、2つのセリンリン酸化部位を含む。さらなるセリンリン酸化部位およびスレオニンリン酸化部位が、例えば、Sorensenら、Bioc.Biophys.Res.Comm.198:200−205(1994)(本明細書中に参考として援用される)によって、記載される。オステオポンチンの機能的フラグメントは、1または数個のこれらのリン酸化された残基を、隣接するアミノ酸とともに含み得る。
【0039】
異所性活性を阻害する能力を有するオステオポンチンのフラグメントは、種間で高度に保存される分子の領域を含む。高度な配列保存性を有するヒトオステオポンチン内の領域は、例えば、Giachelliら、前出(1995)に示される。例えば、機能的フラグメントは、高度に保存された配列SDESHHSDESDE(配列番号8)を含み得る。オステオポンチンの機能的フラグメントはまた、保存された細胞接着ドメイン(DGRGDSVAYG(配列番号9))またはヘパリン結合相同性ドメイン(RKKRSKKFRR(配列番号10)を含み得る。
【0040】
所望される場合、例えば、機能的活性、選択性、安定性またはバイオアベイラビリティーを最適化するために、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントは、D立体異性体、天然に存在しないアミノ酸ならびにアミノ酸アナログおよび模倣物を含むように改変され得る。改変されたアミノ酸の例は、Sawyer、Peptide Based Drug Design、ACS、Washington(1995)ならびにGrossおよびMeienhofer、The Peptides:Analysis、Synthesis、Biology、Academic Press、Inc、New York(1983)(これらの両方は、本明細書中に参考として援用される)において示される。
【0041】
所望される場合、一つ以上のリン酸化されたセリン残基またはスレオニン残基が、負に荷電したアミノ酸(例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸)によって、置換され得る。そのような改変は、ホスファターゼによる不活性化に対するオステオポンチンまたは機能的フラグメントの感受性を減少させるように有利に作製され得る。
【0042】
本明細書中に開示されるように、直接吸着することおよびアパタイト結晶の成長および形成を阻害することによって、異所性石灰化を阻害することに加えて、オステオポンチンはまた、炭酸脱水酵素II(CAII)を発現する多核巨細胞およびマクロファージの蓄積および活性化を促進することによって、抗石灰化細胞内応答を媒介することにより作用し得る。多核巨細胞およびマクロファージは、細胞外微小環境を酸性化し、そして鉱化した沈着物を溶解し得る。多核性異物巨細胞(FBGC)およびマクロファージによるCAII発現の調節を通して、オステオポンチンは、リン酸カルシウム沈着物の除去を刺激し得る。
【0043】
上記のように選択および調製されたオステオポンチンまたはフラグメントの異所性石灰化を阻害する能力は、当該分野において公知か、または本明細書中に記載される種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイによって、評価され得る。例えば、実施例Iに記載されるように、培養された血管細胞(例えば、ウシ大動脈平滑筋細胞)は、β−グリセロホスフェートを含むカルシウム沈着培地で処理された場合、時間依存的な様式でカルシウム沈着を形成する。さらに、実施例IIIに記載されるように、ヒト血管平滑筋細胞は、増強されたレベルの無機リン酸の存在下において、カルシウム沈着物を形成する。異所性石灰化を阻害する際のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントの効果をアッセイするための他の培養系は、当業者によって決定され得る。例えば、異所性石灰化が生じる身体の他の部位(例えば、内蔵、皮膚および内皮細胞を含む)に由来する細胞または組織を使用して、オステオポンチンがアッセイされ得る。
【0044】
カルシウム沈着の量または程度は、オステオポンチンまたは機能的フラグメントを投与する前と投与した後に、そのような培養系を使用して、視覚的評価もしくは組織化学的評価によって定性的にか、またはより定量的な方法によってかのいずれかで、決定され得る。例えば、カルシウム沈着は、不透明な領域(Von Kossa染色法では黒い領域として、そしてAlizarin Red染色法では赤い領域として)として、光学顕微鏡によって視覚的に検出され得る。カルシウム沈着の量および程度はまた、Jonoら、Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17:1135−1142(1997)(本明細書中に参考として援用される)によって記載される方法、または市販の測色法キット(例えば、Sigmaから入手可能であるCalcium Kit)を使用することによって定量的に評価され得る。あるいは、カルシウム沈着の量または程度はまた、原子吸光分光という公知の方法を使用して、定量的に評価され得る。
【0045】
実施例IおよびIIIに記載されるように、培養された血管平滑筋細胞において観察されるカルシウム沈着は、組織化学的分析、超微細構造分析および電子回折分析によって評価される場合、異所性石灰化部位に存在するアパタイト沈着物と類似し得る。従って、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの培養細胞によるカルシウムの沈着を阻害する能力は、ビヒクルコントロールまたはタンパク質コントロールと比較して、個体における異所性石灰化を阻害するその能力の正確な指標である。
【0046】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの異所性石灰化を阻害する能力はまた、対応するヒト病理の信頼できる指標となるために、当該分野において公知の動物モデルにおいて試験され得る。例えば、異所性石灰化は、例えば、Vyavahareら、前出(1997)に記載されるような動物へのバイオプロテーゼ弁(例えば、ブタ弁、ヒツジ弁またはウシ弁)の皮下移植または循環系統移植によって誘導され得る。オステオポンチンまたは機能的フラグメントの投与による弁のカルシウム沈着の量または速度の減少が検出され得、そしてそれは、調製物の機能的活性の基準となる。
【0047】
同様に、ヒトアテローム性動脈硬化、腎不全、リン酸塩過剰血症、糖尿病、年齢関連血管カルシウム沈着および異所性石灰化と関連する他の状態の信頼できる指標である動物モデルは、当該分野において公知である。例えば、局所性および全身性カルシフィラキシー、石灰沈着症および誘発性石灰化(これらは、異所性石灰化の実験モデルである)は、例えば、Bargmann,J.Rheumatology 22:5−6(1995)、Lianら、Calcified Tissue International、35:555−561(1983)およびBoivinら、Cell and Tissue Res.247:525−532(1987)において記載される。血管壁のカルシウム沈着の実験モデルは、例えば、Yamaguchiら、Exp.Path.25:185−190(1984)によって記載される。
【0048】
異所性石灰化およびオステオポンチン調製物の効果を試験するための好ましい動物モデルは、Liawら、J.Clin.Invest.101:1468−1478(1998)(本明細書に参考として援用される)により記載されるオステオポンチン欠損マウスであり、ここで実施例Vにおいて記載されるように、異所性石灰化は、野生型コントロール動物と比較して増強される。
【0049】
当該分野において公知の医療画像技術(例えば、磁気共鳴画像法、X線画像、コンピューター断層撮影法、超音波検査法)を使用して、ヒトまたは動物のいずれかにおける異所性石灰化を阻害する際のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントの効果を評価し得る。例えば、血管内のカルシウム沈着の存在および程度が、Fitzgeraldら、Circulation 86:64−70(1994)(本明細書中で参考として援用される)により記載される脈管内超音波画像法により決定され得る。異所性石灰化の量または程度の減少が、容易に同定され得、そしてこれはオステオポンチンまたはそのフラグメントの治療効果の指標となる。
【0050】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメント(上記のように、それらの機能的活性についてアッセイされる)は、異所性石灰化を阻害するために治療的に効果的な量で個体に投与される。オステオポンチンまたは機能的フラグメントを投与するための送達の適切な処方、投薬量および送達経路は、当業者に周知であり、そしてヒト患者について(例えば、以前に記載されたように動物モデルから)決定され得る。治療的に有効であることが必要とされるオステオポンチンまたはその機能的フラグメントの投薬量は、例えば、石灰化の程度、石灰化の部位、投与の経路および形態、投与される分子の生体活性半減期、個体の体重および状態、ならびに以前または現在の治療のような因子に依存し得る。この方法の特定の適用についての治療的に有効な用量であると見なされる適切な量は、本明細書中に提供される手引きを用いて、当業者に決定され得る。当業者は、患者の状態を治療の過程全体にわたってモニターすることが必要であり、かつ投与される組成物の量を調節し得ることを認識する。
【0051】
ヒトを処置するために、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの治療的に有効な量は、処置レジメンに依存して、例えば、約10μg/kg体重〜500mg/kg体重、例えば、約0.1mg/kg体重〜100mg/kg体重、または約1mg/kg体重〜50mg/kg体重であり得る。例えば、オステオポンチンまたは機能的フラグメントは、1日に数回、または1日に1回、または数日毎に1回投与される場合、オステオポンチンまたは機能的フラグメントが1回、1週間に1回、数週間に1回のみ投与された場合より低用量が必要とされる。同様に、オステオポンチンの時限放出(timed−release)を可能にする処方物は、単回ボーラス用量として投与されるより、より少量のオステオポンチンの連続放出を提供する。
【0052】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントは、全身(例えば、静脈内または動脈内)に送達されて、身体全体の異所性石灰化を阻害し得る。オステオポンチンまたは機能的フラグメントはまた、異所性石灰化発生することを含むか、またはそれが予測されることが既知の部位に局所的に投与され得る。このような部位は、例えば、アテローム斑(atherosclerotic plaque)、血管形成術を受けた動脈のセグメントまたはプロテーゼ移植部位であり得る。オステオポンチンおよびその機能的フラグメントの投与に適切な部位は、処置されている個体の臨床的指標および個体が現在侵襲的外科手術を受けているか否かに依存して、当業者により決定され得る。
【0053】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントの投与は、オステオポンチンの種々の処方物を用いて達成され得る。所望であれば、オステオポンチンは、薬学的に受容可能なキャリアとともに溶液または懸濁液として投与され得る。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、通常生理食塩水もしくはリンゲル溶液、または他の生理学的な緩衝化生理食塩水、または他の溶媒もしくはビヒクル(例えば、グリコール、グリセロール、オリーブ油もしくは注射可能な有機エステルのようなオイル)であり得る。
【0054】
薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、オステオポンチンまたは機能的フラグメントの吸収を安定または増大させるように作用する生理学的に受容可能な化合物をさらに含む。このような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストランのような糖質;アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤;微生物膜を破壊する、EDTAのようなキレート剤;カルシウムまたはマグネシウムのような二価金属イオン;低分子量タンパク質;脂質もしくはリポソーム;または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。オステオポンチンはまた、生体分解性ポリマーもしくはマイクロポンプのような材料とともに処方され得、これは、分子の徐放性放出を提供する。さらに、オステオポンチンは、ホスファターゼインヒビターのような分子とともに処方され得、ホスファターゼインヒビターは、オステオポンチンの脱リン酸化を減少または阻害する。
【0055】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントはまた、タンパク質を発現するように遺伝的に改変された細胞から発現され得る。遺伝的に改変された細胞からのオステオポンチンの発現は、タンパク質の、持続して局在するかまたは全身性の発現が生じ得るため、反復投与が不要であるという利点を提供する。
【0056】
治療目的のために種々の哺乳動物細胞においてタンパク質を組換え発現する方法は、当該分野で公知であり、例えば、以下に記載される:本明細書中に参考として援用される、Leeら、Transfusion Medicine II 9:91−113(1985)。遺伝子操作に特になじみやすい細胞の型としては、例えば、造血幹細胞、肝細胞、血管内脾細胞、ケラチノサイト、筋芽細胞、線維芽細胞およびリンパ球が挙げられる。
【0057】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントをコードする核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結され、このプロモーターは、適切なレベルの、コードされたタンパク質の構成性発現または(所望であれば)誘導性発現を提供し得る。この方法の特定の適用のために適切なプロモーター配列は、当業者により決定され得、そして例えば、細胞型および所望されるオステオポンチン発現レベルに依存する。
【0058】
オステオポンチンまたはその機能的フラグメントをコードする核酸は、哺乳動物発現ベクターに挿入され得、そして当該分野で公知の種々の方法により細胞に導入され得る(例えば、Sambrookら、前出(1989);およびAusubelら、前出(1994)を参照のこと)。このような方法としては、例えば、組換えベクターを用いたトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が挙げられる。ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスのベクター)での感染は、細胞を遺伝的に改変するために特に有用である。核酸分子はまた、ベクターへの核酸配列の最初の導入を必要としない公知の方法を用いて、細胞に導入され得る。
【0059】
本発明の1つの実施形態において、プロテーゼデバイスは、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントと接触され得る。プロテーゼデバイスと、オステオポンチンまたは機能的フラグメントとを接触させることは、プロテーゼデバイスの異所性石灰化を効率的に予防または減少し、このことによって、デバイスの不全または早熟置換の必要性を予防する。プロテーゼデバイスは、必要であれば、個体への移植前、移植中、または移植後のいずれかに、オステオポンチンまたは機能的フラグメントと接触され得る。
【0060】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントは、プロテーゼデバイスに対して共有結合的または非共有結合的のいずれかでこの分子と結合することによってプロテーゼデバイスと接触し得る。この方法の特定の適用のために適切な結合方法は、当業者によって決定され得る。当業者は、適切な結合方法がヒトにおけるプロテーゼデバイスの移植と適合性であることを知っており、従って、受容可能でない毒性または免疫原性拒絶を引き起こさない。さらに、適切な結合方法は、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントがプロテーゼデバイスまたは周辺組織の異所性石灰化を阻害する能力を増強させるか、または有意に低減させない。
【0061】
ポリマー、金属および組織にタンパク質を共有結合させるための方法は、当該分野で公知である。例えば、オステオポンチンは、化学的架橋を用いてプロテーゼデバイスと結合され得る。化学的架橋剤としては、例えば、グルタルアルデヒドおよび他のアルデヒドが挙げられる。反応性アミノ酸基、糖質部分または付加された合成部分のいずれかを通じてプロテーゼデバイスにオステオポンチンまたはその機能的フラグメントを連結する架橋剤は、当該分野で公知である。このような薬剤および方法は、例えば、Hermason、Bioconjugate Techniques、Academic Press、San Diego(1996)に記載され、これは、本明細書中に参考として援用される。これらの方法を用いて、プロテーゼデバイスと、治療的に有効な量のオステオポンチンまたはその機能的フラグメントとを接触させ得る。
【0062】
オステオポンチンはまた、プロテーゼデバイスに対して非共有結合的に(例えば、プロテーゼデバイスの表面への吸収により)付着され得る。オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを含む溶液または懸濁液は、所望であれば、薬学的に受容可能な賦形剤とともに、治療的に有効な量でプロテーゼデバイス上にコーティングされ得る。
【0063】
オステオポンチンまたは機能的フラグメントの持続性送達を提供するために、プロテーゼデバイスはまた、プロテーゼデバイスに付着した細胞によって生成されるオステオポンチンまたはその機能的フラグメントと接触され得る。このような細胞は、プロテーゼデバイス上に播種され、そしてエキソビボまたはインビボのいずれかで増殖し得る。適切な細胞としては、オステオポンチンを通常生成し、かつ分泌する細胞が挙げられ、この細胞としては、例えば、マクロファージ、平滑筋細胞または内皮細胞が挙げられる。さらに、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを生成するように遺伝的に改変された細胞(例えば、内皮細胞および線維芽細胞を含む)は、プロテーゼデバイスに付着され得る。プロテーゼデバイスに付着される細胞は、好ましくは、プロテーゼインプラントを受け入れる個体由来の細胞、またはインプラントの拒絶の可能性を減少する免疫学的に適合した個体由来の細胞のいずれかである。
【0064】
プロテーゼデバイスと接触されるオステオポンチンまたは機能的フラグメントが異所性石灰化を阻害する能力は、当該分野で公知の種々の方法によって決定され得る。1つのこのような方法は、実施例Vに記載のように、プロテーゼデバイスを動物に移植して、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントの投与に応答したカルシウム沈着を測定することである。外植片の部位におけるカルシウム沈着の速度または量の減少いずれかが、組成物の治療的効力を示す。
【0065】
本発明は、局所的な微小環境を酸性にする個々の細胞に投与することにより、異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。このことにより、この細胞は、異所性石灰化の部位に標的化される。多核性異物巨細胞およびマクロファージは、局所的な微小環境を酸性にし得る細胞の例である。従って、本発明は、個々のマクロファージに投与することによって異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、このことによって、マクロファージは、異所性石灰化の部位に標的化される。さらに、本発明は、個々の多核性外来異物巨核細胞に投与することにより異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、これによって、多核性異物巨細胞が異所性石灰化の部位に標的化される。
【0066】
本明細書中で使用される場合、用語「局所的な微小環境」とは、酸生成細胞の補充および/もしくは分化、ならびにプロトン生成の促進および細胞プロトンの細胞外放出のいずれかにより酸性にされ得る細胞外空間をいう。例えば、破骨細胞およびマクロファージは、二酸化炭素の炭酸への加水分解を促進する酵素である炭酸脱水酵素IIを発現する。炭酸は、液胞のH+−ATPaseを介して細胞から排出されるプロトンの細胞内供給源として働き、それによって局所的pHを下げ、そして無機物溶解を促進する。従って、本発明は、マクロファージおよび多核性異物巨細胞による炭酸脱水酵素IIのオステオポンチン媒介発現を介して異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。
【0067】
本明細書中に開示されるように、オステオポンチンは、直接的に、アパタイト結晶表面に結合し、かつ結晶成長を阻害することによるだけでなく(実施例IIを参照のこと)、間接的に、無機質の喪失を調節することにより(実施例V)、異所性鉱化作用を調節する。具体的には、オステオポンチンは、マクロファージ補充、炭酸脱水酵素II発現の増加および細胞外酸性化を促進することによる抗石灰性細胞応答のメディエーターとして作用する。
【0068】
局所的な微小環境を酸性にし得る細胞(例えば、マクロファージおよび多核性異物巨細胞)は、異所性石灰化の部位に標的化される。例えば、マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、プロテーゼデバイスに付着され得る。例えば、マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、生体プロテーゼ心臓弁に播種され得、そして上記のようにエキソビボまたはインビボで増殖され得る。さらに、炭酸脱水酵素IIまたはその機能的フラグメントを発現するように遺伝的に改変された細胞は、プロテーゼデバイスに付着され得る。炭酸脱水酵素IIの機能的フラグメントは、オステオポンチン媒介性調節および触媒活性を保持する。オステオポンチン生成細胞については上記のように、炭酸脱水酵素II生成細胞は、好ましくは、プロテーゼインプラントを受けた個体由来であるか、またはインプラント拒絶の可能性を減少させるように免疫的に適合させた個体由来である。さらに、マクロファージまたは多核性異物巨細胞は、直接的または全身的のいずれかで個体における異所性石灰化の部位に投与され得る。全身的に投与される場合、投与されたマクロファージおよび多核性異物巨細胞は、異所性石灰化の部位に標的化され得る。例えば、オステオポンチンまたはオステオポンチン抗体で生体プロテーゼデバイスを予めコーティングすることは、全身的に投与されたマクロファージおよび多核性異物巨細胞を異所性石灰化部位に標的化して、局所的な微小環境を酸性にする1つの方法である。
【0069】
実施例Vに記載のように、局所的な微小環境の酸性化はまた、オステオポンチン(マクロファージおよび多核性異物巨細胞により炭酸脱水酵素II発現を調節し得る)を投与することによって達成され得る。オステオポンチンを個体に投与する方法は、上記で詳細に記載されている。炭酸脱水酵素II発現を刺激するために必要なオステオポンチンの発現レベルは、ヒドロキシアパタイトの増殖を直接阻害するために必要な発現レベルより有意に低くあり得る。従って、炭酸脱水酵素IIを刺激するために治療的に有効な量は、約1×10-12M〜5×10-7Mの範囲内であり得る。炭酸脱水酵素IIの発現を刺激するに十分なオステオポンチンの治療的に有効な量はまた、約1×10-12M〜1×10-7M、1×10-12M〜5×10-8M、1×10-12M〜1×10-8M、約1×10-12M〜5×10-9M、1×10-12M〜1×10-9M、1×10-12M〜5×10-10M、1×10-12M〜5×10-10M、または1×10-12M〜5×10-11Mの範囲内であり得る。
【0070】
従って、本発明は、個体に局所的な微小環境を酸性にする細胞を投与することによって、異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本発明はさらに、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、この方法は、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位に酸生成細胞の補充を促進する工程を包含する。本発明はまた、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、この方法は、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位で酸生成細胞の分化を促進する工程を包含する。本発明はさらに、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供し、この方法は、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位への酸生成細胞の補充および分化を促進する工程を包含する。実施例Vに記載のように、1コピーのオステオポンチン遺伝子を保有するマウスは、異所性鉱化作用に応答して炭酸脱水酵素II陽性細胞の形成を促進するに十分高レベルのオステオポンチンを発現する(図13を参照のこと)。マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、同様な造血起源から誘導された炭酸脱水酵素II発現細胞であり、そして1コピーのオステオポンチン遺伝子を保有するマウスにおいて鉱化したインプラントに隣接して位置することが本明細書中で示される。
【0071】
実施例Vで示されるように、オステオポンチンは、マウスにおいてグルタルアルデヒド固定した大動脈弁(GFAV)リーフレットの移植部位に、酸生成細胞を補充させることによって無機質再吸収を制御し得る。例えば、免疫染色によって示されるように、オステオポンチンは、マクロファージの補充を媒介し得、そしてCAII陽性細胞形成を促進し得る(実施例Vを参照のこと)。本明細書中で開示されるように、マクロファージおよび多核性異物巨細胞は、オステオポンチンによって調節される炭酸脱水酵素IIを発現する細胞の例である。オステオポンチンを投与する方法は、上で詳細に記載されている。
【0072】
本発明はまた、オステオポンチンを投与することによって異所性石灰化部位における炭酸脱水酵素IIの発現を増大することにより、個体における異所性石灰化を処置または阻害する方法を提供する。本明細書中で開示されるように、オステオポンチンは、炭酸脱水酵素II発現細胞(マクロファージおよび多核性異物巨細胞を含む)の分化および活性を調節することによって無機質再吸収を制御する(実施例Vを参照のこと)。
【0073】
本発明の種々の実施形態の営為に実質的に影響を及ぼさない改変もまた、本明細書中で提供される発明の規定内に含まれることが理解される。従って、以下の実施例は、本発明を例示するのであって、限定しないことが意図される。
【0074】
(実施例I:培養したウシ脈管細胞の石灰化)
本実施例は、培養したウシ大動脈平滑筋細胞によるカルシウム沈着が、異所性石灰化の確実なモデルであることを実証する。生理学的に関連した石灰化を誘導するための方法が記載される。これらの方法を用いて、オステオポンチンおよびそのフラグメントの調製物を、異所性石灰化を阻害する能力についてアッセイし得る。
【0075】
(ウシ大動脈平滑筋細胞の培養)
BASMCを、本明細書中に参考として援用されるRossら,J.Cell Biol.,50:172−186(1971)によって最初に記載された外植片法の改変によって入手した。手短に述べると、内側組織を、ウシ胸大動脈のセグメントから分離した。組織小片(1〜2mm3)を、165U/mlのコラゲナーゼI型、15U/mlエラスターゼIII型および0.375mg/mLダイズトリプシンインヒビターを補充した、4.5g/Lのグルコースを含むDMEM中での37℃での1時間のインキュベーションによってばらばらにした。部分的に消化された組織を6ウェルプレート中に置き、そして20% FBSを補充した、4.5g/Lのグルコースを含むDMEM中で、37℃にて、5% CO2を含む加湿雰囲気下で数週間培養した。外植片から移動した細胞を収集し、そして増殖培地(100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを補充した、15% FBSおよび10mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)中で維持した。ウシ大動脈壁から単離された細胞が脈管平滑筋細胞であることを確認するために、α−平滑筋アクチン、ビメンチンおよびカルポニン(calponin)のレベルを、免疫蛍光顕微鏡法によって調べた。
【0076】
免疫蛍光顕微鏡法について、BASMCSを、10ウェルヘビー(heavy)Teflonコーティング顕微鏡スライドガラス(Cel−Line Associates Inc.,USA)で24時間培養し、冷メタノールで固定し、2% BSAおよび10%正常ウサギ血清を含むPBSでブロックし、そして2% BSAを含むPBSでそれぞれ、1:50および1:25に希釈した、モノクローナル抗α平滑筋アクチン抗体(1A4,Sigma)およびモノクローナル抗ビメンチン抗体(V9,Dako)で処理した。モノクローナル抗カルポニン抗体((CALP),Fridら,Dev.Biol.,153:185−193(1992))を、希釈せずに用いた。二次抗体として、FITC結合体化ウサギ抗マウスIgGを、PBSでの1:30の希釈後に用いた。マウス非免疫IgGを、一次抗体についてのコントロールとして用いた。
【0077】
上記のように得られた95%を超える細胞が、α平滑筋アクチン抗体、ビメンチン抗体およびカルポニン抗体で、繊維状のパターンで染色された。このことは、培養した細胞が、脈管平滑筋起源の細胞であることを示す。全ての実験について、細胞を、2継代と5継代との間で用いた。
【0078】
(ウシ大動脈平滑筋細胞によるカルシウム沈着)
培養されたBASMC平滑筋細胞による石灰化を調べるために、石灰化を、本明細書中に参考として援用されるShioiら,Arterioscler Thromb.Vasc Biol.,15:2003−2009(1995)に記載される方法によって誘導した。手短に述べると、BASMCを、増殖培地中で4日間培養し、次いで石灰化培地(100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを補充した、10mMのβ−グリセロホスフェート(他であると示さない限り)、10-7Mインスリンおよび50μg/mlのアスコルビン酸の存在下で15% FBSおよび10mMピルビン酸ナトリウムを含むDMEM(高グルコース、4.5g/L))中に10日間切り替えた。この培地を、1週間に2回、新鮮な培地で置き換えた。時間経過実験では、石灰化培地中での培養開始日を、0日目と定義した。
【0079】
石灰化を、本明細書中に参考として援用されるJonoら,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17:1135−1142(1997)に記載される方法の改変によって評価した。手短に述べると、培養物を、0.6N HClを24時間用いて脱灰した。HCl上清のカルシウム含量を、o−クレゾールフタレインコンプレクソン(o−cresolphthalein complexone)法(Calcium Kit,Sigma)による比色定量によって決定した。脱灰後、この培養物をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、そして0.1N NaOH/0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で可溶化した。総タンパク質含量を、Bio−Rad Protein Assay Kit(Bio−Rad)を用いて測定した。細胞層のカルシウム含量を、タンパク質含量に対して正規化した。培養培地中のリン濃度およびカルシウム濃度を、それぞれ、ホスホモリブデート複合体法(Phosphorus Kit,Sigma)およびo−クレゾールフタレインコンプレキソン法(Calcium Kit,Sigma)によって測定した。値を、平均+/−SEM(n=3)として表した。
【0080】
β−グリセロホスフェートを含む石灰化培地で処理したBASMCは、14日間の経過にわたって時間依存的様式でカルシウム含有無機質沈着を開始した。対照的に、β−グリセロホスフェートを欠く増殖培地中で培養したBASMCは、石灰化しなかった。β−グリセロホスフェートの添加は、細胞層におけるカルシウム沈着と正に相関する、増加したリン濃度をもたらした。逆に、細胞層が石灰化されるにつれて、カルシウム濃度は、培養培地中で減少した。
【0081】
カルシウム沈着、培地中のリン濃度およびカルシウム濃度に対するβ−グリセロホスフェートの効果は、用量依存的であった。カルシウム沈着は、β−グリセロホスフェートの開始濃度に依存し、そして約4mM β−グリセロホスフェートで最大の半分であった。培養培地中のリン濃度は、0mM〜10mMの範囲にわたってβ−グリセロホスフェートの濃度が増加するにつれて増加した。培養培地中のカルシウム沈着は、細胞層中のカルシウム沈着に対して逆に比例した。
【0082】
観察された石灰化は、10mM無機リン酸までの培養培地の補充が、細胞の非存在下で石灰化した沈着物を形成しなかったので、培地からの無機物の自発沈澱に起因しなかった。内皮細胞培養物への石灰化培地の添加も、鉱化作用を誘導しなかった。
【0083】
これらの結果は、培地中での無機リン酸を上昇させる条件下でBASMCの石灰化が、特異的な、細胞媒介事象およびマトリックス媒介事象であることを示す。
【0084】
(BASMC石灰化の形態)
BASMC培養物における石灰化プロセスが、生理学的な型の鉱化作用を表すか否かを決定するために、組織化学的分析、超微細構造分析および電子線回折分析を行った。
【0085】
BASMC培養物による無機物沈着を、フォンコッサ染色(30分間、5%硝酸銀)および光学顕微鏡法によって、本明細書中に参考として援用されるMallory,F.B.,Pathological Techniques,第2版,Philadelphia,WB Saunders Co.,152頁(1942)によって記載される方法を用いて組織化学的に評価した。アルカリホスファターゼの発現を、シトレート−アセトン−ホルムアルデヒド固定細胞を室温にて15分間、Naphthol AS−BI Alkaline Solution(Sigma)とともにインキュベートすることにより可視化した。
【0086】
透過型電子顕微鏡法(TEM)による超微細構造検査のために、プラスチック上で増殖したBASMC細胞を、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を用いてpH7.2で緩衝化した、1%グルタルアルデヒドおよび1%パラホルムアルデヒドを含むアルデヒド溶液中で一晩固定した。次いで、この培養物を、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液単独を用いて洗浄し、段階的な一連のエタノール溶液中で脱水し、そしてTaabエポキシ樹脂またはLR Whiteアクリル酸樹脂(Marivac,Nova Scotia,Canada)のいずれかに浸透させ、そして包埋した。この樹脂を、55℃にて2日間重合させた。エポキシ包埋をされることになっているサンプルをまた、電子顕微鏡においてさらなる膜の対比を提供するために、フェロシアン化カリウム還元4%四酸化オスモニウムを用いて事後固定した。
【0087】
選択された領域の電子線回折による無機質分析について、他の培養物を、100%エタノールのみを用いて固定して非水性で処理し、続いてさらなる処理を伴わずに樹脂中での直接包埋した。1マイクロメーターの厚さの調査切片を、培養物の種々の領域から調製し、そして光学顕微鏡法による調査のためにトルイジンブルーで染色した。次いで、選択された領域の薄い切片(80nm〜100nm)を、Reichert Ultracut Eミクロトーム上でダイアモンドナイフを用いて切断し、そして炭素を用いてエバポレートしたFormvarでコーティングしたニッケルグリッド上に配置した。グリッドに取り付けた切片を、エタノール性酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を用いて短時間染色し、そして60kVで操作するJEOL JEM 1200EX透過型電子顕微鏡を用いて調べた。無水性で処理し、非染色のままにしたサンプルを、100μM回折口径および80cmのカメラ長を用いる、選択された領域の電子線回折に用いた。回折パターンを分析し、そして合成アパタイト標準および骨無機質について以前に報告された粉末回折ファイル(本明細書中に参考として援用される、Landisら,J.Ultrastruc.Res.,63:188223(1978))と比較した。
【0088】
光学顕微鏡法により、増殖培地中で増殖させたBASMC培養物は、これらの型の細胞に特有の単層および多層の増殖領域を示した。石灰化培地での10日間の処置後、この培養物は、主に多層領域における、広範な無機質の沈着を示した。フォンコッサ染色は、これらの培養物におけるリン酸含有無機質の存在を確認した。石灰化は、細胞間の細胞外マトリックスにおいて最も頻繁に観察され、そして代表的に培養物の基礎局面においてより顕著であった。これらの石灰化培養物におけるBASMCはまた、アルカリホスファターゼ活性について陽性であった。
【0089】
培養14日目(β−グリセロホスファターゼを用いて10日目)、BASMCは、単層または多層であり、そしていくつかの位置では、細胞の小節を形成した。超微細構造的に、外観上多層または小節状である場合、この細胞は、コラーゲン原線維が豊富な多量の細胞外マトリックスと会合している。この細胞外マトリックスの蓄積部位で、細胞は、代表的にはタンパク質の合成および分泌に関連する、充分に発達した細胞小器官を示した。目立った細胞骨格は、アクチンから構成される可能性が最も高い、細胞内細糸の広範なネットワークによって立証された。
【0090】
β−グリセロホスフェートなしで培養した細胞は、細胞外マトリックスの石灰化の証拠を示さなかったが、添加した有機リン酸供給源とともに培養した細胞は、細胞層と関連したいくつかの形態学的に異なる形態の石灰化を示した。これらは、石灰化したコラーゲン原線維のほぼ球状の凝集物、周囲で増加した無機質密度を有する小節沈着、ならびに細胞外マトリックスの原線維内区画および原線維間区画の両方を含む、より分散した石灰化を含んでいた。これらの後者の部位では、いくらか大きな寸法を有する結晶は、1つのコラーゲン原線維から別のコラーゲン原線維へと広がることが観察された。膜結合型マトリックス小胞はまた、細胞外マトリックスにおいて見出された。無水で処理され、そして染色されていない、石灰化沈着物を含むBASMC培養物組織切片の、選択された領域の電子線回折は、無機質相をアパタイトとして同定した。このことは、その指数がこの型の無機質に特有であった(格子面002、211、112、300からの)目立った回折反射を示す。
【0091】
アルカリホスファターゼは、正常なウシの鉱化作用に必要とされ(Whyteら Endocr.Rev.,15:439−461(1994))、そしてβ−グリセロホスフェートに応答した骨芽細胞および軟骨細胞の培養物の石灰化に必要とされることが示されている(Tenenbaumら,Bone Mineral,2:13−26(1987))。アルカリホスファターゼが、これらの研究において用いられる条件下でのBASMCにおける石灰化に必要とされるか否かを決定するために、培養物を、アルカリホスファターゼインヒビターであるレバミゾール、またはビヒクル単独で処理した。BASMC培養物におけるカルシウム沈着が、レバミゾールによって用量依存的に阻害された。最大の半分の阻害が、5×10-5Mレバミゾールで観察された。ビヒクル処理は効果を有さなかった。レバミゾール処理は、培養培地におけるリン濃度における減少および高いカルシウム濃度の維持と関連した。
【0092】
これらの結果は、BASMC培養物によって沈着したマトリックスの石灰化が、異所性石灰化の部位で観察された鉱化作用と、無機質の種類(アパタイト)および石灰化した沈着物の微細構造に関して類似することを示す。例えば、鉱化作用は、細胞外マトリックスコラーゲン原線維およびマトリックスビヒクルと関連して主に生じた。類似の小胞構造が、上昇したアルカリホスファターゼ活性と関連して、石灰化したアテローム性動脈硬化斑において報告されている(Kimら,Fed Proc,35:156−162(1976))。さらに、石灰化しているBASMC培養物において存在する小節状石灰化は、石灰化されたアテローム性動脈硬化斑および弁において通常見られることである、球顆状結晶成長を示す(Kimら,Fed Proc,35:156−162(1976))。
【0093】
それゆえ、これらの研究において用いられた石灰化しているBASMC培養物は、石灰化した脈管組織においてインビボで観察された鉱化作用に類似した鉱化作用を行い得る細胞外環境を作製し得、異所性石灰化のモデルとしてのそれらの使用を支持する。
【0094】
(実施例II:オステオポンチンは、BASMC石灰化を阻害する)
本実施例は、オステオポンチンが、インビボにおける異所性石灰化の確実なモデルであるBASMC石灰化をインビトロで阻害することを実証する。それゆえ、オステオポンチンは、異所性石灰化の治療的に有効なインヒビターである。
【0095】
ラットオステオポンチンを、本明細書中に参考として援用されるLiawら,前出 74:214−224(1994)によって記載されるように、ラット新生仔平滑筋細胞培養物の馴化培地から精製した。この調製物を、クーマシー染色およびN末端配列分析に基づいて、95%を超える純度であると判断した。
【0096】
インビトロでのBASMC媒介石灰化に対するオステオポンチンの効果を調べるために、可溶性オステオポンチンまたはビヒクル単独(0.1mMクエン酸ナトリウム)を、石灰化しているBASMC培養物に添加した。図2aに示すように、0.05μg/ml、0.5μg/mlおよび5μg/mlのオステオポンチンは、10日目に評価したとき、石灰化を用量依存的に阻害した。例えば、0.5μg/mlのオステオポンチンは、石灰化を約90%阻害し、そして5μg/mlのオステオポンチンは石灰化をほぼ完全に阻害した。対照的に、ビヒクル単独は、効果がなかった(図2a)。それゆえ、低濃度の外部から適用したオステオポンチンは、石灰化している脈管細胞培養系において細胞外鉱化作用を顕著に阻害する。
【0097】
オステオポンチン調製物中の夾雑物が、観察される阻害効果の原因である可能性を排除するために、免疫除去実験を行った。10μg/mlオステオポンチンを含む培地を、Liawら,前出(1994)によって記載される方法により調製された20mg/mlの抗オステオポンチン(OP−199)抗体または正常ヤギIgGと混合し、そして室温にて1時間インキュベートした。250mgプロテインA−sepharoseを添加し、そして室温にて1時間インキュベートした。抗体−プロテインA sepharose複合体を遠心分離により除去し、そして残りの上清を、石灰化研究において使用するために20倍希釈した。独立Student t検定を用いて、群を比較し、そして0.05未満の確率値(p)値を有意とみなした。
【0098】
0.5μg/mlラットオステオポンチンを含む培地は、培養物の石灰化を、18倍阻害した(オステオポンチン処理したBASMCについて0.33±0.06μmole/mgに対して、ビヒクル処理したBASMCについて5.05±0.25μmole/mg、p=0.0023)。オステオポンチン抗体を用いたオステオポンチン溶液の免疫除去は、阻害活性を有意に減少させた(抗オステオポンチン除去サンプルについて2.60±0.43μmole/mgに対して、非免疫除去サンプルについて0.33±0.06μmole/mg、p=0.0338)。対照的に、正常ヤギIgGを用いた免疫除去は、ラットオステオポンチン溶液の阻害活性に影響を与えなかった(免疫除去なしについて0.33±0.06μmole/mgに対して、正常ヤギIgG処理について0.49±0.10μmole/mg、p=0.2480)。
【0099】
これらの結果は、オステオポンチン調製物による、観察されたBASMC媒介石灰化阻害が、夾雑物に起因するのではなく、特異的にオステオポンチンに起因したことを確認する。
【0100】
オステオポンチン効果の特異性および独特さを決定するために、オステオポンチンに対する制限された構造的および機能的相同性を有する、2つのさらなる非コラーゲン性細胞外マトリックスRGD含有分子(ビトロネクチンおよびフィブロネクチン)を、BASMC媒介石灰化を阻害する能力について試験した。ラットの血漿ビトロネクチン(Sigma Immunochemicals,USA)およびウシフィブロネクチン(TELIOS Pharmaceutical Inc.,USA)を、PBS中に0.5mg/mlの濃度で再懸濁し、そして使用するまで凍結保存した。図2bに示すように、ビトロネクチン(VN)およびフィブロネクチン(FN)は、オステオポンチンについて有効であった濃度と等しいモル濃度で、カルシウム沈着を阻害できなかった。それゆえ、脈管石灰化を阻害することに対するオステオポンチンの効果は、非常に特異的である。さらに、これらの結果は、オステオポンチンが鉱化作用を調節する能力が、そのRGD依存性細胞接着機能と関係しないことを示す。
【0101】
(オステオポンチン阻害の機構)
オステオポンチンが石灰化を阻害する機構を試験した。1つの可能性は、オステオポンチンが、アルカリホスファターゼ活性に影響を与えることによってレバミゾールに類似した様式で機能し得、それによってβ−グルセロホスフェート由来の無機リン酸の産生を阻害し、そしてリン酸カルシウム沈着を妨害することであった。
【0102】
細胞アルカリホスファターゼ活性測定のために、細胞を、種々の濃度のオステオポンチンの存在下において石灰化培地中で培養した。細胞をPBSで3回洗浄し、そして細胞タンパク質を0.9% NaCl中の1% Triton X−100で可溶化し、そして遠心分離した。上清を、Besseyら、J.Biol.Chem.164:321−329(1946)(これは、本明細書中で参考として援用される)によって記載される方法によって、アルカリホスファターゼ活性についてアッセイした。1単位を、1分間中に1nmolのp−ニトロフェノールを生成する活性として定義した。タンパク質濃度を、Bio−Radタンパク質アッセイキット(Bio−Rad)を用いて決定した。そのデータを、細胞層のタンパク質含量に対して正規化した。
【0103】
図3aおよび3cに示すように、オステオポンチンを用いる処理は、BASMC培養物のアルカリホスファターゼ活性に影響を与えなかった。オステオポンチンの添加はまた、培地のリン濃度を減少しなかった。対照的に、レバミゾールは、用量依存的にBASMCアルカリホスファターゼ活性を阻害し(図3b)、そして培養培地中のリン濃度を減少させた。これらの結果は、オステオポンチンがアルカリホスファターゼ活性を阻害することによって作用するのではないことを実証する。
【0104】
オステオポンチンが培養培地中でカルシウムをキレートまたは封鎖(sequester)して、鉱化作用を妨害する可能性もまた、試験した。最初の石灰化培地に、オステオポンチンまたはビヒクル単独の存在下で、増加する濃度のカルシウムを補充した。次いで、培養物を、10日間の期間にわたってオステオポンチンの存在下または非存在下において行って石灰化させた。図4aに示されるように、培地のカルシウム含量を増加させることは、カルシウム沈着に対するオステオポンチンの阻害効果を克服し得た。このことは、より多くの無機質が細胞層において沈着されることを可能にする。このことと一致して、培養培地のリン含量(8.2mM〜7.3mM)の減少を述べた(図4b)。
【0105】
オステオポンチンの存在下において、10日間の期間の最後での培地のカルシウム含量もまた、測定した。カルシウムを封鎖することによってオステオポンチンが作用する場合、一定量のまたは増加量のいずれかのカルシウムが培地中で観察されることが予測された。このことは、培地中におけるオステオポンチン結合によるカルシウムの保持を反映する。しかし、その反対が観察された。カルシウム培地中のカルシウム濃度は、最初のカルシウム濃度と比較して、10日間の期間の最後で減少し、そしてカルシウム沈着と反比例した(図4aおよび4cを比較のこと)。従って、鉱化に対するオステオポンチンの阻害効果は、カルシウム依存性である(すなわち、カルシウム濃度の増加によって減少する)が、培地中で利用可能なカルシウムのキレート化には起因しない。この観察は、オステオポンチンの公知のカルシウム結合特性と一致する。約50分子のカルシウムが、生理学的なカルシウム濃度でオステオポンチンによって結合され得ることが示された(Chenら、J.Biol.Chem.267:24871−24878(1992))。従って、2mMのカルシウムをキレートするためには約40μMのオステオポンチン(2.7mg/ml)が必要であり、これは、本明細書中に記載されるアッセイにおいて血管性石灰化を阻害する際に有効であると実証されたオステオポンチンの量(0.5μg/ml)の5000倍より多い。
【0106】
BASMC培養物中の内因性および外因性のオステオポンチンの超微細構造的局在化もまた、免疫金標識を用いて決定して、血管性石灰化のオステオポンチン阻害の機構をさらに特徴付けした。BASMCを石灰化培地中で7日間培養して、石灰化が開始することを可能にした。次いで、精製したラットオステオポンチン(0.5μg/ml)を10日目まで加えた。培養物を、アルデヒド固定剤を使用して保存し、続いて、免疫細胞化学のためにLR Whiteアクリル樹脂中に包埋した。包埋後免疫標識を、McKeeら、Microscop.Res.And Tech.33:141−164(1996)(これは、本明細書中に参考として援用される)によって記載されるように、オステオポンチン抗体(OP−199)およびプロテインA−コロイド金複合体を使用して行った。手短に言えば、培養物の薄い(80nm)切片を、ニッケルグリッド上に配置し、そしてPBS中の1%オボアルブミンとともに5分間インキュベートし、続いて一次抗体とともに1時間のインキュベーション、PBSでのリンス、オボアルブミンを用いる再度のブロッキング、次いで30分間のプロテインA−金複合体への曝露を行った。蒸留水を用いる最終リンスの後、グリッドを風乾し、そして酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛を用いて慣習的に染色し、そして透過型電子顕微鏡によって観察した。OP−199抗体の特異性は、ウェスタンブロッティング(Liawら、前出、(1994))ならびに免疫前血清およびプロテインA−金複合体単独を用いるインキュベーションによって以前に示された。
【0107】
これらの免疫金標識研究のために、オステオポンチンを除外したか(ビヒクル単独)、またはβ−グリセロホスフェートを用いる鉱化作用の開始の7日後に添加した。これらの条件下において、外因的に適用されたオステオポンチン(0.5μg/ml)は、10日目においてBASMC培養物石灰化をなお50%阻害し得た。低レベルの内因性オステオポンチンを、処理していない鉱化培養物中(代表的には、鉱化した領域中の拡散パターン中において)見出した。対照的に、オステオポンチン処理した培養物中では、金粒子は、石灰化の部位で豊富であった(代表的には、小さい石灰化の塊の境界に蓄積するか、または個々の結晶プロフィールと関連する)。免疫前血清およびプロテインA−金複合体単独をコントロールとして使用した場合は、金粒子は観察されなかった。このことは、オステオポンチンの、成長しているアパタイト結晶との直接的相互作用が、その阻害機能に必要とされることを示す。オステオポンチンは、鉱化されないマトリックスまたは細胞と結合していることは観察されなかった。
【0108】
上記に記載された結果は、オステオポンチンがアパタイト結晶表面へのオステオポンチンの直接的な結合および結晶成長の阻害によって、低濃度で、血管細胞によって媒介される生理学的な石灰化を阻害し得ることを実証する。従って、オステオポンチンは、異所性石灰化を妨害および処理する際に治療的に有用である。
【0109】
(実施例III 培養されたヒト血管細胞の石灰化)
この実施例は、上昇した無機リン酸の存在下で培養されたヒト平滑筋細胞によるカルシウム沈着が異所性石灰化の信頼できるモデルであることを示す。生理学的に関連する石灰化を誘導するための方法が記載される。これらの方法は、異所性石灰化を阻害するそれらの能力についてオステオポンチンおよびそのフラグメントの調製物をアッセイするために使用され得る。
【0110】
正常な成人の血清無機リン酸濃度の範囲は、約1.0〜1.5mMである。高い血清リン酸レベル、すなわちリン酸塩過剰血症は、種々の疾患状態(例えば、慢性腎不全および引き続く腎透析を含む)と関連して起こる。このような疾患状態において、血清無機リン酸濃度のレベルは、代表的には2mMを超える。リン酸塩過剰血症と関連する異所性石灰化をモデル化するために、そしてオステオポンチンおよびその機能的フラグメントの、そのような石灰化に対する効果を決定するために、石灰化についての関連するインビトロモデル系を以下のように開発した。
【0111】
ヒト血管平滑筋細胞(HSMC)を、Ross、J.Cell.Biol.50:172−186(1971)およびLiawら、J.Clin.Invest.95:713−724(1995)(これらは、本明細書中で参考として援用される)によって記載されるような酵素的消化によって得た。手短に言えば、内側の組織を、ヒト心臓移植手術および剖検でそれぞれ得たヒト大動脈の切片から分離した。班SMCについて、冠状動脈内じゅく腫切除術由来の組織を、手術時に得た。組織の小さな断片(1〜2mm3)を、165U/mlのI型コラゲナーゼ、15U/mlのIII型エラスターゼ、および0.375mg/mlのダイズトリプシンインヒビターを補充したDMEM中で一晩、37℃で消化した。単一細胞懸濁物を、6ウェルプレート中に配置し、そして5%CO2を含む加湿した空気中において、20% FCSを補充したDMEM中で3週間、37℃で培養した。コロニーを形成した培養物を、コンフルエンスで収集し、そして増殖培地(100U/mlのペニシリンおよび100mg/mlのストレプトマイシンを補充した、15% FBSおよび1mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM;最終無機イオン濃度は1.4mMであった)中で維持した。培養物の純度を、α−SMアクチンおよびカルポニンについてのポジティブ免疫染色、ならびにRoss、前出(1971)およびLiawら、前出(1995)によって記載されるようなフォン ビルブラント因子の染色の非存在によって評価した。
【0112】
初代ヒト成体および胎児の大動脈内側および冠状動脈の班の初代細胞(8継代まで)を、これらの実験において使用した。胎児および成体のHSMC培養物もまた、Perezら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1224−1228(1992)(本明細書中で参考として援用される)によって記載されるように、HPV−E8E7を使用して不死化し、そして特徴付けした。
【0113】
HSMCを、増殖培地中で慣用的にサブクローンした。コンフルエンスの時点で、細胞を石灰化培地(100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを補充した、2mM 無機リン酸の存在下の15% FBSおよび1mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)に、14日目まで切り替えた。その培地を2日毎に新鮮な培地と交換した。時間経過実験のために、石灰化培地中での培養の1日目を0日目と定義した。カルシウム沈着を定量し、そして実施例Iにおいて上記に記載されるように組織化学的および細胞化学的に評価した。
【0114】
正常なレベルのリン酸(1.4mMの無機リン酸(Pi))を含む培地中では、HSMCは、非常に少ないカルシウム無機質を蓄積した。対照的に、2mM 無機リン酸の存在下では、カルシウム沈着は、時間依存性の様式で増加した。例えば、9日目において、石灰化HSMC対非石灰化コントロールは、210.3+/−2.4対15.1+/−2.4(μg/mgタンパク質)(平均+/−SEM(n+3))であった。カルシウム沈着に対する無機リン酸の効果は、1.4mM〜2mMの範囲の無機リン酸にわたって用量依存性であった。上昇した無機リン酸による石灰化の誘導は、ヒト細胞の一般的な特徴であるようであった。なぜなら、異なる供給源(ヒト成体および胎児の大動脈および冠状動脈の班)由来の初代HSMCおよびこれらの細胞の不死化された誘導体が、同様の挙動を示したからである。カルシウム無機質の自発的な沈着は、石灰化培地中または10mMまでの無機リン酸を補充した培地中では起こらなかった。このことは、細胞および/または細胞由来のマトリックスが、鉱化作用のために必要であることを示す。
【0115】
ヒト細胞培養系において観察された石灰化が生理学的に関連するか否かを決定するために、形態学的研究を行った。HSMCを石灰化培地で10日間培養した後に、顆粒状の沈着が細胞培養を通して発生した。この沈着を、実施例Iにおいて記載するように、フォン コッサ染色によってリン酸含有無機質として同定した。黒色に染色された粒子を、多層性の病巣に最も多く蓄積している細胞外領域中で優勢的に、細胞層を通して、拡散的に散乱させた。電子顕微鏡分析は、実施例Iに記載した系におけるウシSMC培養物の石灰化と本質的に同一である、アパタイト無機質相、石灰化したコラーゲン原線維、および鉱化した培養物に結合したマトリックスベシクルの存在を確証した。
【0116】
これらの結果は、代表的には、リン酸塩過剰血症の個体において見出される無機リン酸濃度を含む培地中で培養された場合に、HSMC培養物が石灰化しやすいことを実証する。さらに、培養されたヒト細胞中で観察された石灰化は、インビボで石灰化した組織において観察された異所性石灰化と同様である。従って、HSMC石灰化培養系を、異所性石灰化のレギュレーターの効果を正確に評価するために使用し得る。
【0117】
(実施例IV オステオポンチンおよびその機能的フラグメントによるヒト血管細胞の石灰化の阻害)
この実施例は、オステオポンチンおよび典型的なオステオポンチンの機能的フラグメントが、ヒト平滑筋細胞の石灰化を効果的に阻害することを例証する。従って、オステオポンチンを、異所性石灰化を治療的に阻害するために使用し得る。
【0118】
オステオポンチンおよび機能的フラグメントを、異所性石灰化を阻害するそれらの能力について、実施例IIIにおいて記載したHSMC石灰化系を使用してアッセイした。オステオポンチンタンパク質は、全長ヒト組換えオステオポンチンならびにSmithら、前出(1996)によって記載されるようなネイティブなタンパク質のトロンビン切断後に形成されるフラグメントと同様の、組換えN末端およびC末端のヒトオステオポンチンフラグメントを含む。2つのN末端フラグメント(10Nおよび30N)を使用した。これらは、オステオポンチンの2つの異なるスプライシング改変体を指す。30Nスプライシング改変体は、さらなる14アミノ酸NAVSSEETNDFKQE(配列番号7)を含み、これは、エキソン5(アミノ酸59〜72)に対応する。10Nフラグメントは、ネイティブオステオポンチンのアミノ酸17〜58および73〜160を含むが、30Nフラグメントはアミノ酸17〜169を含む。10Cフラグメントは、オステオポンチンのC末端ドメイン(アミノ酸170〜317)を含む。
【0119】
N末端およびC末端の組換えオステオポンチンフラグメントを、GSTとの融合タンパク質として発現させ、グルタチオンビーズ上のアフィニティークロマトグラフィーによって細菌溶解物から精製し、そしてトロンビンを用いて切断した。全長ヒト組換えオステオポンチンを、Hisタグ化タンパク質として調製した。得られる組換えタンパク質のサイズおよび純度を、SDS−PAGE分析(Smithら、前出(1996))によって確証した。
【0120】
組換えオステオポンチンおよびその機能的フラグメントを、カゼインキナーゼIIによるリン酸化の前に、またはそのリン酸化の後のいずれかに、ヒト平滑筋細胞(HSMC)の異所性石灰化を阻害するその能力についてアッセイした。カゼインキナーゼIIによるリン酸化によって達成されたオステオポンチン(OPN)およびそのフラグメントに取り込まれたリン酸の量を、図5bに示す。図5aに示すように、高いリン酸石灰化培地の存在下において、HSMCマトリックスへのカルシウム沈着は、リン酸化された、OPN、30N OPN、10N OPN、または10C OPNの添加によって基底レベルに減少する。これらのタンパク質の非リン酸化型は、このアッセイにおいてカルシウム沈着に有意な影響を与えない。これらの結果は、オステオポンチンのN末端フラグメントとC末端フラグメントの両方が、オステオポンチンの機能的フラグメントであること、ならびにセリン−スレオニンリン酸化が、オステオポンチンおよびその機能的フラグメントの機能的活性のために重要であるようであることを示す。
【0121】
図6において示されるように、カゼインキナーゼIIによってリン酸化された組換えオステオポンチンは、15nMの濃度でHSMC石灰化を阻害し得る。アルカリホスファターゼ(ALP)を用いる脱リン酸化は、この阻害活性を逆転する。これらの結果は、オステオポンチンおよびその機能的フラグメントの機能的活性のためのリン酸化の重要性を確証する。
【0122】
ヒトオステオポンチンの異所性石灰化に対する効果は、0.1μg/ml〜5.0μg/mlの濃度にわたって用量依存的である(図7)。さらに、オステオポンチンの、異所性石灰化を阻害および逆転することに対する効果は迅速であり、添加後60分間までに有意に減少したカルシウム沈着が見られ、90分間までに約50%の阻害が観察可能である(図8)。
【0123】
これらの結果は、オステオポンチンおよびその典型的な機能的フラグメントが、迅速かつ低濃度で、ヒト細胞の生理学的に関連する異所性石灰化を効果的に阻害し得ることを示す。従って、全長オステオポンチンおよびその機能的フラグメントは、異所性石灰化を示すか、または異所性石灰化の危険がある個体において異所性石灰化を阻害する際に治療的に有効である。
【0124】
(実施例4)
(オステオポンチンは、インビボにて異所性石灰化を阻害する)
本実施例は、オステオポンチンがインビボにて異所性石灰化を阻害することを示す。
【0125】
正常なマウスおよびオステオポンチンが欠損したマウスにおけるブタ人工弁の皮下移殖の効果を試験して、インビボでの異所性石灰化におけるオステオポンチンの役割を決定した。オステオポンチン遺伝子のうちの1コピーまたは両方のコピーが欠損したマウスが、Liawら、前出(1998)に記載されている。4.0mm2片のブタグルタルアルデヒド固定大動脈弁リーフレットを、オステオポンチンについて野生型(WT)、ヘテロ接合型(HTZ)またはヌル対立遺伝子(KO)のいずれかを保有する5〜6週齢の雌性マウス中に皮下移殖した。14日後、移植片を取り出し、凍結乾燥し、そして酸加水分解した。カルシウムレベルを、実施例1に記載のようにアッセイし、そしてその外殖片の乾燥重量に対して標準化した。
【0126】
図9に示されるように、移殖された弁は、野生型またはヘテロ接合型のマウスようりもオスポンチンヌルマウスにおいて有意に大きな程度まで石灰化する。従って、オステオポンチンが関連のインビトロ系において異所性石灰化を阻害するという観察された能力と一致して、これらの結果は、オステオポンチンが、インビボにて異所性石灰化を阻害することを示す。
【0127】
異物炎症応答もまた、このオステオポンチンヌルマウスにおいて損なわれるようである。例えば、野生型またはヘテロ接合型のマウスと比較して、オステオポンチンヌルマウスにおいては、弁移殖の部位にてマクロファージによる炎症の明らかな減少が存在する。炎症および異所性石灰化の部位に通常は浸潤するマクロファージが、石灰化した沈着物の除去を食作用によって促進すると予期される。従って、オステオポンチンが、ヒドロキシアパタイト形成を阻害することおよびマクロファージによる石灰化沈着物の食作用性吸収を促進することの両方を行うことが、予期される。
【0128】
従って、オステオポンチンまたはその機能的フラグメントを個体に投与することは、異所性石灰化を阻害することにおいて治療的に有効である。
【0129】
(実施例5)
(CAIIを発現する異物巨細胞(FBGC)およびマクロファージによる、インビボでの異所性石灰化のオステオポンチン媒介性阻害)
本実施例は、オステオポンチンが、細胞外環境を酸性化しかつ鉱化した沈着物を溶解し得る、炭酸脱水酵素IIを発現するマクロファージおよび破骨細胞様異物巨細胞(FBGC)の蓄積および活性化を促進することを、示す。
【0130】
(OPN欠損マウス中への大動脈弁リーフレットの移植)
正常マウスおよびオステオポンチン欠損マウスにおける、生体人工グルタルアルデヒド固定大動脈弁(GFAV)の皮下移殖の効果を試験して、インビボでの異所性石灰化におけるオステオポンチンの役割をさらに特徴付けた。実施例5に記載のように、オステオポンチン遺伝子のうちの1コピーまたは両方のコピーが欠損したマウスを、Liawら、前出(1998)に従って得た。4.0mm2片のグルタルアルデヒド固定大動脈弁リーフレット(GFAV)を、オステオポンチンについて野生型(WT)、ヘテロ接合型(HTZ)またはヌル対立遺伝子(KO)のいずれかを保有する5〜6週齢の雌性マウス中に皮下移殖した。7日、14日、および30日後に、オステオポンチン野生型(WT)、ヘテロ接合型(HTZ)またはヌル対立遺伝子(KO)のマウスから移植片を取り出し、そして鉱質沈着、タンパク質蓄積、および細胞補充についてアッセイした。
【0131】
一旦取り出してから、この移植片をメチルカーノイズ溶液を用いて固定し、パラフィン中に包理し、そしてLiawら、前出により記載されるような抗OPN(OP−199)抗体を10μg/mlにて使用して、OPN蓄積について5μm切片を分析した。切片を、メチルグリーンを用いて対比染色した。OPN蓄積を、Pro Image Analysis Programを使用して定量した。さらに、カルシウムレベルを、実施例1に記載のようにアッセイし、そしてその移植片の乾燥重量に対して標準化した。
【0132】
図10Aに示されるように、オステオポンチンは、オステオポンチンWTマウス中への移植の14日後の弁中で観察される。この時点で、オステオポンチンは、その移植片と周囲の異物応答との間の境界に制限されている。対照的に、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウスは、それぞれ、GFAV移植の14日目に、OPNレベルが非常に減少したかまたはOPNレベルが存在しない。
【0133】
GFAV石灰化を定量するために、この外殖片を凍結乾燥し、秤量し、次いで0.6N HCLを用いて室温で一晩酸加水分解した。カルシウム定量を、Sigma Diagnosticキット(Sigma、St.Louis、IL)に指令されるように、o−クレゾールフタレインコンプレクソンによって実施し、そして乾燥重量に対して標準化した。このキットの精度を、原子吸光分光法によって確認した。オステオポンチンWTマウスは、アリザリンレッドS染色およびカルシウム定量に基づく、検出可能なGHAV鉱化作用を示さない。対照的に、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウスは、オステオポンチンWTマウスより4〜5倍高いGFAV石灰化を示す(図10B)。
【0134】
30日以内に、オステオポンチンKOマウスは、なおオステオポンチンを蓄積せず、そしてGFAV鉱化作用は、14日目の時点から有意には変化しない(図10Aおよび10B)。オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンWTマウスは、14日目の時点に対して上昇したオステオポンチンレベルを示す。これらのマウスにおいて、オステオポンチンの局在性は、もはや移植片/異物カプセルの境界に限定されないが、GFAV移植片に浸透することもまた見出される。さらに、異物カプセルに位置するオステオポンチンは、移植片に隣接するFBGCによって最も大いに発現される。30日目の時点で、オステオポンチンWTマウスは、GFAV石灰化を示すが、鉱質レベルは、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウスについて観察されるものの1/4の低さである。また、30日目の時点で、オステオポンチンHTZマウスは、石灰化の劇的な減少を示し、このことは、オステオポンチンの存在が鉱質沈着を阻害していることのみならず、GFAVからの鉱質の除去を媒介していることもまた、示す。60日目の時点で、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンWTマウスは、各々の30日目の時点と比較して、4〜5倍の増加を示す(図10B)。同様に、60日目の時点で、オステオポンチンKOマウスにおけるGFAV弁石灰化は、30日目の時点と比較してほぼ2倍増加する(図10B)
オステオポンチンHTZマウスにおける30日目の時点で観察された有意なオステオポンチンレベルの蓄積は、GFAV鉱化作用の減少または反転を伴った。OPN単独ではリン酸カルシウムの溶解を媒介し得ないので、観察された鉱質の損失は、むしろオステオポンチン調節性の事象である。リン酸カルシウム除去をすることができる唯一の機構は、食作用および酸性化である。
【0135】
(オステオポンチン媒介性マクロファージ補充の分析)
マクロファージ蓄積を試験するために、14日目および30日目にオステオポンチンWTマウス、HTZマウスおよびKOマウスからGFAV移植片を取り出し、そして5μm切片を、6μg/mlの抗マウスBM−8(Accurate Chemical & Scientific Corp.、Westbury、N.Y.)を使用して、マクロファージ蓄積について分析した。1次抗体との1時間のインキュベーションの後、ビオチン化ヤギ抗ラット抗体(Vector Laboratories Inc.、Burlingame、CA)を添加し、そして45分後に、反応産物を3,3−ジアミノベンジジン(DAB)(Sigma、St.Louis、MO)を用いて検出した。この切片を、メチルグリーンを用いて対比染色した。
【0136】
BM−8表面マーカーの免疫化学的位置決定および定量によって示されるように、オステオポンチンKOマウスは、GFAV移植部位へのマクロファージの補充の欠如を示す(図11)。さらに、このオステオポンチンKOマウスは、移植の14日目および30日目にオステオポンチンWTマウスと比較して、それぞれ50%〜25%低いレベルのBM−8細胞染色を示した。
【0137】
オステオポンチンWTマウスにおいて、BM−8陽性細胞は、早い時点で拡散して蓄積したが、後には、移植片の縁に沿って濃縮した。このことは、これら細胞の活性化を示唆する。対照的に、BM−8細胞は、オステオポンチンKOマウスにおいて移殖片/異物カプセルの境界に沿って濃縮することはなく、このことは、活性化の欠如を意味する。
【0138】
オステオポンチンHTZマウスもまたBM−8陽性細胞蓄積の減少を示したが、マクロファージの欠損は、30日目の時点で観察された鉱質損失パターンと関連がなかった。全体として、試験したどの時点においても、非常に少数のマクロファージしかGFAVに浸透し得なかった。このことは、食作用単独では、鉱化作用の反転を媒介し得ないことを示唆する。
【0139】
(GFAV外殖片のpH分析)
GFAVを、移殖の30日後にオステオポンチンWTマウス、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウスから外殖して、オステオポンチンが移殖片酸性化を促進し、オステオポンチンHTZマウスにおいて観察されたようなGFAV移殖片からの鉱質の除去に寄与するか否かを調査した。この外殖片を凍結乾燥し、次いでUniversal Indicator Solution(Fisher Scientific、Pittsburg、PA)に浸漬した。各移殖片のpHを、製造業者に提供された色目盛りに対してGFAV溶液の色を3人の別々の観察者によって比較して個々に決定した。
【0140】
オステオポンチンWTマウス由来のGFAV外殖片は酸性のpH(6.0)を有したが、オステオポンチンKOマウス由来の外殖片は、中性付近のpH(6.7)を維持した。pHのこれらの差異は、統計的に有意であった(p=0.0002)。オステオポンチンHTZマウス由来のGFAV移殖片は、中間のpH(6.2)を有した。未移殖のGFAVは、pH6.5を有した(図12)。アパタイトの安定性は37℃で7.0未満のpHにて減少するので、これらの外殖片の観察されたpHは、アパタイト性鉱質沈着物を溶解する能力に関して生理学的に関連があり、そして観察されたGFAV鉱化作用の損失を説明する。これらの知見は、オステオポンチンが、宿主細胞がGFAV微小環境を酸性化する能力を調節することによって鉱質吸収を制御することを示す。
【0141】
(GFAV移殖部位での炭酸脱水酵素II発現の分析)
破骨細胞およびマクロファージは、炭酸脱水酵素II(CAII)、すなわち、局所の微小環境の酸性化を促進する酵素を発現する。5μm切片中のタンパク質を、5μg/mlのヒツジ抗ヒトCAII抗体(Biodesign International、Kennebunkport、ME)を使用して位置決定することによって、移植の14日後および30日後のオステオポンチンWTマウス、オステオポンチンHTZマウス、およびオステオポンチンKOマウス由来のGFAV外殖片に、CAIIおよびカテプシンKを発現する細胞を位置決定した。室温で1時間1次抗体とともにインキュベートした後、ビオチン化ウサギ抗ヒツジ抗体(Vector Laboratories Inc.、Burlingame、CA)とともに45分間インキュベートした。その反応産物を、3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)(Sigma、St.Louis、MO)を用いて検出し、そして切片を、メチルグリーンを用いて対比染色した。CAII発現を、Pro Image Analysis Programを使用して定量し、そして図13において面積のパーセンテージとして示す。FBGCを、外殖片の4つの象限中にて計数した(図14)。1つより多くの核を含むすべての細胞を、FBGCであるとみなした。
【0142】
CAII免疫染色の定量によって、CAII発現の鉱質依存性およびオステオポンチン依存性の調節が明らかになった(図13)。14日目に、オステオポンチンWTマウスにおいて、オステオポンチンが存在し、そしてGFAV移殖片は、鉱化しない。その後、鉱質除去の必要性がほとんど存在しない場合、CAIIレベルは低い。30日目に、GFAVが鉱化し始め、オステオポンチンが蓄積し、そしてCAII発現細胞が劇的に増加する。逆に、オステオポンチンKOマウス(観察したすべての時点で上昇した鉱質レベルを示す)は、非常に低いCAIIレベルを示す。オステオポンチン媒介性CAII応答が、オステオポンチンHTZマウスにおいて促進される。14日目に、オステオポンチンHTZマウスは、オステオポンチンのレベルの減少に起因する実質的GFAV鉱化作用を示すが、CAII陽性細胞を産生することによって、この鉱化作用に応答する。従って、このデータは、オステオポンチンHTZマウスが、鉱化作用を直接阻害するに十分高いレベルのオステオポンチンを発現するわけではないが、その発現レベルが、CAII発現またはCAII陽性細胞の形成の増進を促進するためために十分であることを、示す。CAIIに加えて、カテプシンKの高発現が、CAII発現FBGCにおいて観察された。カテプシンKは、破骨細胞において優先的に発現され、そして破骨細胞の吸収活性に重要であることが示された、システインプロテアーゼである。
【0143】
オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウスにおいて観察された酸性化の欠如がFBGCの数の減少という結果であるか否かを決定するために、GFAV外殖片上のFBGCの数を計数した。FBGCを、Wadaら、Cir.Res.84、166〜178(1999)(本明細書中に参考として援用される)に記載のように実施して電子顕微鏡によって可視化した。FBGCの数は、オステオポンチンHTZマウスおよびオステオポンチンKOマウス由来の14日目のGFAV外殖片によって示される、OPNが欠如した非常に石灰化した状態において2〜3倍に増加する。
【0144】
FBGC蓄積のパターンは、カルシウム沈着パターンとほぼ同一であり、そしてOPN蓄積とは逆である。このデータは、オステオポンチンの欠如が、GFAV移殖片付近でのFBGC蓄積の増加を促進するが、これらのFBGCは、減少したCAIIレベルによって判断されるように、酸性化能力の減少を示すことを示唆する。
【0145】
これらの結果は、オステオポンチンが、細胞外微小環境を酸性化しそして鉱化した沈着物を溶解し得る、炭酸脱水酵素IIを発現するマクロファージおよび破骨細胞様異物巨細胞(FBGC)の蓄積および活性化を促進することを示す。
【0146】
(リン酸化オステオポンチンは、インビボにて生体人工弁の石灰化を阻害する)
GFAVを、コントロールビヒクル、非リン酸化オステオポンチンまたはリン酸化オステオポンチンのいずれかの1mg/ml溶液中で、オステオポンチンKOマウスへの移殖の前に3日間インキュベートした。14日後、カルシウム定量を、上記のように実施した。図15に示されるように、これらの結果は、リン酸化オステオポンチンが、インビボにて生体人工弁の石灰化を阻害することを示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、Kieferら、Nucleic Acids Res.17:3306(1989)に記載されるようにヒトオステオポンチンのヌクレオチド配列(配列番号1)およびアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
【図2】
図2は、BASMCの石灰化に対するビトロネクチンおよびフィブロネクチン(b)と比較したオステオポンチン(a)の効果を示す。
【図3】
図3は、BASMCのアルカリホスファターゼ活性(a)および培地中の亜リン酸濃度(b)に対するオステオポンチンの効果、ならびにアルカリホスファターゼ(ALP)活性に対するレバミゾールおよびオステオポンチン(OPN)の効果(c)を示す。
【図4】
図4は、種々の初期カルシウム濃度でのカルシウム沈着(a)、培地亜リン酸濃度(b)および培地カルシウム濃度(c)に対するオステオポンチンの効果を示す。
【図5】
図5は、HSMCカルシウム沈着に対する組換えオステオポンチンおよびその機能的フラグメントの効果(a)、ならびにカゼインキナーゼIIによる組換えオステオポンチンフラグメントのリン酸化の程度(b)を示す。
【図6】
図6は、HSMC石灰化に対するオステオポンチンのリン酸化および脱リン酸化の効果を示す。
【図7】
図7は、HSMC石灰化に対する種々の濃度のオステオポンチンの効果を示す。
【図8】
図8は、HSMC石灰化に対するオステオポンチンの阻害の時間経過を示す。
【図9】
図9は、マウスに皮下移植された弁の石灰化に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図10A】
図10Aは、マウスに皮下移植され、7日、14日および30日の時点で取り出された弁におけるオステオポンチン蓄積に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図10B】
図10Bは、マウスに皮下移植され、7日、14日および30日の時点で取り出された弁におけるカルシウム沈着を示す。
【図11】
図11は、マウスに皮下移植された弁の部位へのマクロファージの補充に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図12】
図12は、マウスに皮下移植された弁のpHに対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図13】
図13は、マウスに皮下移植された弁の部位での炭酸脱水酵素II発現に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図14】
図14は、マウスに皮下移植された弁の多核性異物巨細胞の数に対するオステオポンチン遺伝子のコピー数の効果を示す。
【図15】
図15は、インビボでの弁鉱化作用に対するオステオポンチンのリン酸化の効果を示す。
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