JP2002531096A - Methods for transforming plastids - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 植物細胞色素体の形質転換のための改善された方法を提供する。改善された方法は、外来ＤＮＡが高い効率で色素体膜に入り込むことを可能にする。当該方法は一般に、色素体形質転換法において変化した色素体形態を有する植物組織供給源を使用することを含む。本発明は、多様な植物種に関する色素体形質転換法において使用できる。 (57) [Summary] An improved method for transformation of plant cell plastids is provided. The improved method allows foreign DNA to enter the plastid membrane with high efficiency. The method generally involves using a plant tissue source having an altered plastid morphology in the plastid transformation method. The invention can be used in plastid transformation methods for a variety of plant species.
Description
【０００１】 発明の分野 本発明は遺伝子工学技術の植物への適用に関する。より詳細には、本発明は植
物細胞色素体の形質転換のための方法に関する。[0001] The present invention relates to the application of genetic engineering technology to plants. More particularly, the present invention relates to a method for transformation of plant cell plastids.
【０００２】 発明の背景 高等植物の色素体は遺伝子工学にとって魅力的な標的である。植物色素体（葉
緑体、アミロプラスト、エライオプラスト、有色体等）は、光合成に加えて、ア
ミノ酸、複合糖質、脂肪酸及び色素のような工業的に重要な化合物の生産の責任
を担う主要な生合成中枢である。色素体はプロ色素体（原色素体）として知られ
る共通の前駆物質から誘導され、従って所与の植物種に存在する色素体はすべて
同じ遺伝子内容物を持つ。植物細胞は、５００−１０，０００コピーの小さな１
２０−１６０キロベースの環状ゲノムを含み、その各々の分子は大きな（約２５
ｋｂ）逆方向反復を持つ。それ故、潜在的に非常に高いレベルの外来遺伝子発現
をもたらしうる、２０，０００コピーまでの特定対象遺伝子を含むように植物細
胞を構築することが可能である。BACKGROUND OF THE INVENTION [0002] Plastids of higher plants are attractive targets for genetic engineering. Plant plastids (chloroplasts, amyloplasts, elioplasts, chromophores, etc.) are the primary responsible for the production of industrially important compounds such as amino acids, glycoconjugates, fatty acids and pigments in addition to photosynthesis. Biosynthesis center. Plastids are derived from a common precursor known as pro-plastids (primary plastids), so that all plastids present in a given plant species have the same genetic content. Plant cells contain 500-10,000 copies of small 1
It contains a circular genome of 20-160 kilobases, each molecule of which is large (about 25
kb) with backward iteration. Therefore, it is possible to construct a plant cell to contain up to 20,000 copies of a specific gene of interest, which can potentially result in very high levels of foreign gene expression.
【０００３】 現在の色素体形質転換の方法は非効率的であり、色素体形質転換を改善する構
築物と方法が求められている。[0003] Current methods of plastid transformation are inefficient and there is a need for constructs and methods that improve plastid transformation.
【０００４】 発明の要旨 本発明により、植物細胞色素体への外来ＤＮＡの改善された形質転換を可能に
する方法が提供される。かかる方法は一般に、形質転換法において変化した色素
体形態を有する細胞を含む植物組織源を使用することを含む。植物色素体の形態
の変化は、中でも特に、色素体の大きさと数の変化を含む。色素体形質転換法に
おいてそのような植物から誘導される組織を使用することにより、植物細胞色素
体への外来ＤＮＡの形質転換効率が高められると考えられる。SUMMARY OF THE INVENTION [0004] The present invention provides a method that allows for improved transformation of foreign DNA into plant cell plastids. Such methods generally involve using a plant tissue source comprising cells with altered plastid morphology in the transformation method. Changes in the morphology of plant plastids include, inter alia, changes in the size and number of plastids. It is believed that the use of such plant-derived tissue in the plastid transformation method increases the efficiency of foreign DNA transformation into plant cell plastids.
【０００５】 ここで例示するように、色素体の形質転換効率を高める方法を提供するための
、植物細胞の遺伝子工学にとって有用な構築物が提供される。当該構築物は、植
物細胞小器官の***の制御に関与するタンパク質配列をコードする核酸配列を含
む。植物細胞においてそのような核酸配列を発現することは、宿主細胞内での葉
緑体の数及び／又は大きさの変化をもたらす。[0005] As exemplified herein, there is provided a construct useful for genetic engineering of plant cells to provide a method for increasing the transformation efficiency of plastids. The construct comprises a nucleic acid sequence encoding a protein sequence involved in controlling the division of plant organelles. Expressing such a nucleic acid sequence in a plant cell results in a change in the number and / or size of the chloroplasts in the host cell.
【０００６】 形質転換において使用する、ここではポリヌクレオチドとも称されるＤＮＡ配
列は、色素体において機能性であるプロモーター領域、及び植物細胞小器官の分
裂の制御に関与する遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む発現構築物を包含する
。[0006] The DNA sequences used in transformation, also referred to herein as polynucleotides, include promoter regions that are functional in plastids and DNA sequences that encode genes involved in the control of plant organelle division. Including expression constructs.
【０００７】 変化した色素体形態を有する形質転換植物を使用する方法を述べる。かかる方
法は、核と色素体構築物の両方を有する植物細胞を提供するための植物育種又は
形質転換方法を含む。[0007] Methods for using transgenic plants with altered plastid morphology are described. Such methods include plant breeding or transformation methods to provide plant cells having both a nucleus and a plastid construct.
【０００８】 本発明はまた、葉緑体形質転換の効率を高めるための方法を提供する。当該方
法は一般に、数及び／又は大きさが変化した色素体が植物細胞内に含まれるよう
に改変された植物組織の色素体を形質転換することを含む。[0008] The present invention also provides a method for increasing the efficiency of chloroplast transformation. The method generally involves transforming a plastid of a plant tissue that has been modified such that the plastids of varying numbers and / or sizes are contained within the plant cells.
【０００９】 本発明はまた、植物種において葉緑体形質転換の効率を高める機序を提供する
。[0009] The present invention also provides a mechanism for increasing the efficiency of chloroplast transformation in plant species.
【００１０】 本発明はまた、変化した色素体形態を有する植物細胞源を、選択マーカーをコ
ードする核酸配列に機能的に連結された、植物細胞色素体において機能性のプロ
モーターを含む構築物で形質転換することを含む、植物の選択性を改善するため
の方法を提供する。本発明において目的とする選択マーカーは、グリフォセート
耐性遺伝子のような除草剤耐性遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子を含む。グリフォ
セート耐性遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｅｔｒｉｕｍ（アグロバクテリア菌）から
のＣＰ４遺伝子を含む。The invention also provides for transforming a plant cell source having an altered plastid morphology with a construct comprising a promoter functional in a plant cell plastid operably linked to a nucleic acid sequence encoding a selectable marker. A method for improving the selectivity of a plant, comprising: The selection marker of interest in the present invention includes a herbicide resistance gene such as a glyphosate resistance gene and an antibiotic resistance gene. Glyphosate resistance genes include the CP4 gene from Agrobacterium (Agrobacterium).
【００１１】 本発明のもうひとつの態様は、ＦｔｓＺタンパク質をコードする核酸配列に機
能的に連結された、植物細胞において機能性のプロモーターを含む構築物で植物
細胞を形質転換することを含む、高い色素体形質転換効率を備えた植物細胞源を
調製するための方法を提供する。[0011] Another aspect of the invention is a high dye comprising transforming a plant cell with a construct comprising a promoter functional in a plant cell, operably linked to a nucleic acid sequence encoding an FtsZ protein. A method for preparing a plant cell source with somatic transformation efficiency is provided.
【００１２】 また、ここで述べる方法を用いて得られる植物及び植物細胞も本発明の一部と
して考慮される。[0012] Plants and plant cells obtained using the methods described herein are also contemplated as part of the present invention.
【００１３】 図面の簡単な説明 図１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（シロイヌナズナ）ＦｔｓＺ１（配列番号２
）、Ｂｒａｓｓｉｃａ（アブラナ）ＦｔｓＺ１（配列番号６）、タバコＦｔｓＺ
１（配列番号９）、ダイズＦｔｓＺ１（配列番号７２）及びトウモロコシＦｔｓ
Ｚ１（配列番号７３）タンパク質配列のアミノ酸配列アラインメントを示す。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows Arabidopsis FtsZ1 (SEQ ID NO: 2)
), Brassica (rape) FtsZ1 (SEQ ID NO: 6), tobacco FtsZ
1 (SEQ ID NO: 9), soybean FtsZ1 (SEQ ID NO: 72) and corn Fts
Figure 3 shows an amino acid sequence alignment of the Z1 (SEQ ID NO: 73) protein sequence.
【００１４】 発明の詳細な説明 本発明に従って、植物細胞色素体への外来ＤＮＡの改善された形質転換を可能
にする方法が提供される。かかる方法は一般に、変化した植物色素体形態を含む
植物細胞源を使用することを含む。色素体形質転換法においてそのような植物か
ら誘導される組織を使用することにより、植物細胞色素体への外来ＤＮＡの形質
転換効率を高めることができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In accordance with the present invention, there is provided a method that allows for improved transformation of foreign DNA into plant cell plastids. Such methods generally involve using a plant cell source that contains an altered plant plastid morphology. By using a tissue derived from such a plant in the plastid transformation method, the efficiency of transforming foreign DNA into plant cell plastids can be increased.
【００１５】 本発明のひとつの実施形態では、変化した植物色素体形態を含む植物組織を色
素体形質転換法のために使用する。かかる植物色素体形態の変化は、標的植物細
胞からの野生型色素体形態に関する色素体の大きさ、形及び数の変化を含むがこ
れらに限定されない。一般に、野生型色素体の形態は、種に依存して、植物細胞
内に含まれる小さな丸い細胞小器官から成る。さらに、植物細胞は典型的に約５
０から約１００の色素体を含む。In one embodiment of the present invention, plant tissue containing the altered plant plastid morphology is used for a plastid transformation method. Such changes in plant plastid morphology include, but are not limited to, changes in plastid size, shape and number relative to wild-type plastid morphology from target plant cells. In general, the wild-type plastid morphology consists of small round organelles contained within plant cells, depending on the species. In addition, plant cells typically have about 5
Contains from 0 to about 100 plastids.
【００１６】 本発明の色素体形質転換法において使用する植物組織源は、植物細胞内に含ま
れる色素体の大きさの増大を含む。かかる色素体の大きさの増大は、外来ＤＮＡ
が形質転換の際に色素体膜に入り込むためのより大きな表面積を提供する。The plant tissue source used in the plastid transformation method of the present invention includes an increase in the size of plastids contained in plant cells. Such an increase in the size of plastids is associated with foreign DNA
Provides a larger surface area to enter the plastid membrane during transformation.
【００１７】 大きな色素体は、好ましくは対応する数の野生型色素体に含まれるのとほぼ同
じ数の色素体ゲノムを含む。例えば、細胞当り１００色素体を含み、各々の色素
体中に１００コピーの色素体ゲノムを含む（細胞当り合計１０，０００コピーの
色素体ゲノム）野生型植物細胞においては、対応する突然変異体組織源は好まし
くはほぼ同じ数の色素体ゲノムを含み、それらが１個又は数個の大きな色素体だ
けに含まれている。The large plastids preferably contain about the same number of plastid genomes as contained in the corresponding number of wild-type plastids. For example, in a wild-type plant cell containing 100 plastids per cell and 100 copies of the plastid genome in each plastid (a total of 10,000 copies of plastid genome per cell), the corresponding mutant tissue The source preferably contains approximately the same number of plastid genomes, which are contained in only one or a few large plastids.
【００１８】 その代わりに、対応するより小さなサイズを備えた、高い数の色素体を有する
植物組織源も、本発明の色素体形質転換法において使用することができる。Alternatively, a plant tissue source having a higher number of plastids, with a correspondingly smaller size, can also be used in the plastid transformation method of the present invention.
【００１９】 当該技術において理解されるように、色素体の大きさ及び数が変化した植物を
得るための追加的な方法は既知である。当業者は、色素体細胞***の変化をもた
らすために多くの方法が使用できることを認識するであろう。かかる方法は、例
えばＳｔｒｅｐｐら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，９５：４３６８−４３７３によって記述されている。As will be appreciated in the art, additional methods for obtaining plants with altered plastid sizes and numbers are known. One skilled in the art will recognize that many methods can be used to effect a change in plastid cell division. Such methods are described, for example, in Streppp et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 95: 4368-4373.
【００２０】 細胞質***（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）とも称される細胞***は、細菌、真菌
及び動物細胞のような多くの生物での研究の焦点となってきた。細菌細胞の***
は***部位におけるＦｔｓＺ環（Ｚ環とも称される）の形成を通して起こる（Ｌ
ｕｔｋｅｎｈａｕｓら、（１９９７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：
９３−１１６）。Ｚ環の位置付けと形成が分離（細胞質***）をさらに推進する
ように働く。環は、ＧＴＰアーゼ活性を持つチューブリン様ＦｔｓＺタンパク質
から成る。大腸菌におけるｆｔｓＺ遺伝子の突然変異は、特定の温度で規則正し
い間隔の核封入体を備えた温度感受性フィラメントの産生を導く（Ｌｕｔｋｅｎ
ｈａｕｓ（１９９２）Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅより、Ｓ Ｍｏｈａｎ
，Ｃ Ｄｏｗ編集、ｐ．１２３−１５２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｃａｍｂｒｉｄ
ｇｅ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）。細菌におけるそのような突然変異は正しく***
することを不可能にする。Cell division, also called cytokinesis, has been the focus of research in many organisms, such as bacteria, fungi and animal cells. Bacterial cell division occurs through the formation of the FtsZ ring (also called the Z ring) at the site of division (L
utkenhaus et al., (1997) Ann. Rev .. Biochem. 66:
93-116). The positioning and formation of the Z ring serves to further drive separation (cytokinesis). The ring consists of a tubulin-like FtsZ protein with GTPase activity. Mutation of the ftsZ gene in E. coli leads to the production of temperature-sensitive filaments with regularly spaced nuclear inclusions at specific temperatures (Lutken).
house (1992) Prokaryotic Structure and
Function: S Mohan from A New Perspective
, C Dow Edit, p. 123-152, Cambridge: Cambridge
ge Univ. Press). Such mutations in bacteria make it impossible to divide correctly.
【００２１】 植物細胞色素体ならびに糸粒体は原核祖先に由来し、従ってこれらの細胞小器
官の***装置は細菌のものに類似している。最近、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（シ
ロイヌナズナ）及びＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓにおけるｆｔ
ｓＺ関連配列の同定が報告された（Ｏｓｔｅｒｙｏｕｎｇら（１９９５）Ｎａｔ
ｕｒｅ；３７６：４７３−４７４；及びＳｔｒｅｐｐら（１９９８）前出）。Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｆｔｓＺ遺伝子によってコードされるタンパク質は葉緑
体に持ち込まれることが認められ、それ故色素体***機構の成分であると推測さ
れた（Ｏｓｔｅｒｙｏｕｎｇら（１９９５）、前出）。さらに最近になって、色
素体***へのＦｔｓＺの関与が直接明らかにされた。下等植物、Ｐｈｙｓｃｏｍ
ｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓにおけるｆｔｓＺ遺伝子の崩壊は色素体の***を
妨げ、それによって１個又は数個の大きな色素体を有する突然変異細胞系統を生
じさせた（Ｓｔｒｅｐｐら（１９９８）、前出）。Plant cell plastids as well as glomeruli are derived from prokaryotic ancestors, and thus the organelles of these organelles are similar to those of bacteria. Recently, ft in Arabidopsis and Physcomitrella patens
The identification of the sZ-related sequence was reported (Osteryoung et al. (1995) Nat.
ure; 376: 473-474; and Streppp et al. (1998) supra). A
The protein encoded by the rabidopsis ftsZ gene was found to be imported into the chloroplast and was therefore speculated to be a component of the plastid division machinery (Osteryoung et al. (1995), supra). More recently, the involvement of FtsZ in plastid division has been directly elucidated. Lower plant, Physcom
Disruption of the ftsZ gene in itrella patens prevented plastid division, thereby giving rise to mutant cell lines with one or several large plastids (Strrep et al. (1998) supra).
【００２２】 １個又は数個の大きな色素体を含む、数及び／又は大きさが変化した色素体を
有する植物は、それ故、あらゆる植物種の色素体形質転換の標的として用いるこ
とができると考えられる。大きさ及び／又は数が変化した色素体を含むそのよう
な植物は、突然変異誘発、アンチセンス抑制、又は同時抑制を含めた様々な方法
を用いて入手することができる。植物ゲノムの突然変異誘発の方法は当該技術に
おいて周知であり、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）やニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）のような化学的突然変異誘発法ならびに高速中性子衝撃のような物理
的突然変異誘発法を含む。[0022] Plants having altered numbers and / or sizes of plastids containing one or several large plastids may therefore be used as targets for plastid transformation of any plant species. Conceivable. Such plants containing plastids of altered size and / or number can be obtained using a variety of methods, including mutagenesis, antisense suppression, or co-suppression. Methods for mutagenesis of plant genomes are well known in the art and include chemical mutagenesis methods such as ethyl methanesulfonate (EMS) and nitrosoguanidine (NTG) as well as physical mutagenesis methods such as fast neutron bombardment. including.
【００２３】 細胞中に含まれる色素体の大きさ及び／又は数が変化した植物源を得るための
その他の手段も想定される。例えば、本発明の形質転換法において使用する組織
は、そのような変化した色素体内容物を提供する培養条件下で成長させた植物か
ら得ることができる。例えば、５，５’−ビス−（８−アニリノ−１−ナフタレ
ンスルホネート）のような細菌細胞***阻害因子（Ｙｕら（１９９８）Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ．２７３：１０２１６−１０２２２）が存在する培養条件下にｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで成長させた植物から得られる組織を、本発明の色素体形質転換
法のための細胞源として使用することができる。Other means for obtaining plant sources with altered plastid size and / or number contained in the cells are also envisioned. For example, the tissues used in the transformation methods of the present invention can be obtained from plants grown under culture conditions that provide such altered plastid content. For example, bacterial cell division inhibitory factors such as 5,5'-bis- (8-anilino-1-naphthalenesulfonate) (Yu et al. (1998) J. Bi.
ol Chem. 273: 10216-10222) under culture conditions in the presence of
Tissue obtained from plants grown in vitro can be used as a cell source for the plastid transformation method of the present invention.
【００２４】 好ましい実施形態では、大きさ及び／又は数が変化した色素体を有する細胞を
含むそのような植物をＦｔｓＺ遺伝子のアンチセンス発現によって生成する。ひ
とたび色素体の形質転換が達成され、同種細胞質性（ｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃ）
植物が同定されれば、異系交配によってアンチセンストランスジーンを排除し、
細胞当り５０−１００色素体の野生型条件を回復することができる。同様に、突
然変異によって数及び／又は大きさが変化した色素体を含む色素体形質転換組織
から再生した植物も、そのような異系交配法を用いて野生型色素体条件に戻すこ
とができる。In a preferred embodiment, such plants comprising cells with altered plastids in size and / or number are generated by antisense expression of the FtsZ gene. Once plastid transformation has been achieved, homoplasmic
Once the plant is identified, outcrossing eliminates the antisense transgene,
Wild type conditions of 50-100 plastids per cell can be restored. Similarly, plants regenerated from plastid-transformed tissues containing plastids that have changed in number and / or size due to the mutation can be returned to wild-type plastid conditions using such outcrossing methods. .
【００２５】 数及び／又は大きさが変化した色素体を有する植物細胞を得るための培養条件
を使用する場合には、そのような培養条件から組織を取り出すことによって野生
型色素体が得られる。When using culture conditions to obtain plant cells having plastids of varying numbers and / or sizes, wild-type plastids can be obtained by removing tissue from such culture conditions.
【００２６】 本発明のもうひとつの実施形態では、細菌細胞及び色素体***に関わるタンパ
ク質に関連するタンパク質をコードする新規核酸配列が提供される。In another embodiment of the present invention, there is provided a novel nucleic acid sequence encoding a protein associated with a bacterial cell and a protein involved in plastid division.
【００２７】 特に、ＦｔｓＺ関連タンパク質をコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ダイズ
、トウモロコシ、Ｂｒａｓｓｉｃａからの新規核酸配列が提供される。そのよう
な核酸配列はＤＮＡ構築物の調製において使用できる。かかる構築物は、数及び
／又は大きさが変化した葉緑体を有する植物の生産において使用できる。In particular, novel nucleic acid sequences from Arabidopsis, soybean, corn, Brassica, encoding FtsZ-related proteins are provided. Such a nucleic acid sequence can be used in preparing a DNA construct. Such constructs can be used in the production of plants having chloroplasts of varying numbers and / or sizes.
【００２８】 当業者は、数及び／又は大きさが変化した葉緑体を有する植物の生産において
有用な他のＤＮＡ配列が当該技術において使用可能であることを認識するであろ
う。かかる配列は、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＮ、ｆｔ
ｓＷ、ｆｔｓＫ（Ｌｕｔｋｅｎｈａｕｓら（１９９７）、前出）、及びａｒｃ遺
伝子（Ｐｙｋｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：１００５−
１００８；Ｐｙｋｅら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：２０
１−２０７；及びＰｙｋｅ（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔａｎｙ ８４：１０１
７−１０２７）を含むがこれらに限定されない。One skilled in the art will recognize that other DNA sequences useful in the production of plants having chloroplasts of varying numbers and / or sizes can be used in the art. Such sequences are ftsA, ftsL, ftsI, ftsQ, ftsN, ft
sW, ftsK (Lutkenhaus et al. (1997) supra), and the arc gene (Pyke et al. (1992) Plant Physiol. 99: 1005-
1008; Pyke et al. (1994) Plant Physiol. 104: 20
1-207; and Pyke (1997) Am. J. Botany 84: 101
7-1027), but are not limited thereto.
【００２９】 さらなるｆｔｓＺ配列を得るためには、目的とする候補植物源から調製したゲ
ノム又は他の適切なライブラリーを、１つ又はそれ以上の植物及び／又は細菌ｆ
ｔｓＺ配列からの保存配列でプローブして、相同的な関連配列を同定することが
できる。陽性クローンを制限酵素消化及び／又は配列決定によって分析すること
ができる。ゲノムライブラリーを使用するときには、そのような植物源からのｆ
ｔｓＺ遺伝子のコード領域ならびに転写調節要素の両方を提供する１個又はそれ
以上の配列を同定することができる。また、プローブを全体配列よりかなり短く
することも可能である。例えばオリゴヌクレオチドが使用できるが、少なくとも
約１０、好ましくは少なくとも約１５、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレ
オチドの長さにすべきである。比較のためにより短い長さの領域を使用するとき
には、長い配列の場合よりも高い度合の配列同一性が要求される。短いプローブ
はしばしばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために特に有用であり、中でも高
度に保存された配列が同定できるときに有用である（Ｇｏｕｌｄら、ＰＮＡＳ
ＵＳＡ（１９８９）８６：１９３４−１９３８）。To obtain additional ftsZ sequences, a genome or other suitable library prepared from a candidate plant source of interest may be prepared by using one or more plant and / or bacterial f.
Probes with conserved sequences from the tsZ sequence can identify homologous related sequences. Positive clones can be analyzed by restriction enzyme digestion and / or sequencing. When using genomic libraries, f
One or more sequences that provide both the coding region of the tsZ gene as well as transcriptional regulatory elements can be identified. It is also possible for the probe to be much shorter than the entire sequence. For example, oligonucleotides can be used, but should be at least about 10, preferably at least about 15, more preferably at least about 20 nucleotides in length. When shorter regions of length are used for comparison, a higher degree of sequence identity is required than for longer sequences. Short probes are often particularly useful for the polymerase chain reaction (PCR), especially when highly conserved sequences can be identified (Gould et al., PNAS).
USA (1989) 86: 1934-1938).
【００３０】 より長い核酸断片（＞１００ｂｐ）をプローブとして用いるとき、特に完全な
又は大きなｃＤＮＡ配列を使用するときには、２０−５０％の偏差で標的サンプ
ルからのシグナル、すなわち相同配列を得るために中等度に高いストリンジェン
シー（例えば３７℃で５０％ホルムアミドを使用して洗浄を最小限にとどめる）
でさらにスクリーニングすることができる。（スクリーニング手法に関する追加
情報については、Ｂｅｌｔｚら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）
１００：２６６−２８５参照）。When using longer nucleic acid fragments (> 100 bp) as probes, especially when using complete or large cDNA sequences, a medium to obtain signals from the target sample with 20-50% deviation, ie homologous sequences. High stringency (eg, using 50% formamide at 37 ° C. to minimize washes)
Can be further screened. (For additional information on screening techniques, see Beltz et al., Meth. Enzymology (1983).
100: 266-285).
【００３１】 本発明のもうひとつの態様は、単離したＦｔｓＺポリヌクレオチドに関する。
本発明のポリヌクレオチド配列は、配列表に示す配列群から選択される推定アミ
ノ酸配列を持つ本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド及びそ
のような配列に緊密に関連する他のポリヌクレオチド配列とその変異体を含む。Another aspect of the present invention relates to an isolated FtsZ polynucleotide.
The polynucleotide sequence of the present invention is an isolated polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention having a deduced amino acid sequence selected from the group of sequences shown in the sequence listing, and other polynucleotide sequences closely related to such a sequence. And its variants.
【００３２】 本発明は、配列表に示す各々のコード配列とその長さ全体にわたって同一なポ
リヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、成熟ポリペプチドのコード配列
又はその断片、ならびにリーダー配列又は分泌配列、プレ−、プロ−又はプレプ
ロタンパク質配列をコードするもののような、読み枠内に他のコード配列と共に
成熟ポリペプチドをコードする配列又はその断片を提供する。当該ポリペプチド
はまた、例えば転写非翻訳配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ
を安定させる配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、及び付加的なアミノ
酸をコードする付加コード配列のような、非コード５’及び３’配列を含むがこ
れらに限定されない非コード配列を含みうる。例えば、融合ポリペプチドの生成
を容易にするためにマーカー配列を含むことができる。本発明のポリヌクレオチ
ドはまた、構造遺伝子及び遺伝子発現を制御する天然結合配列を含むポリヌクレ
オチドを包含する。The present invention provides polynucleotide sequences that are identical over their entire length to each of the coding sequences set forth in the Sequence Listing. The present invention also relates to mature polypeptide coding sequences or fragments thereof, and mature polypeptides in reading frame with other coding sequences, such as those encoding leader or secretory sequences, pre-, pro- or preproprotein sequences. Or a fragment thereof. The polypeptide may also be, for example, a transcribed untranslated sequence, a termination signal, a ribosome binding site, an mRNA.
May include non-coding sequences, including but not limited to non-coding 5 'and 3' sequences, such as sequences that stabilize, introns, polyadenylation signals, and additional coding sequences that encode additional amino acids. For example, a marker sequence can be included to facilitate production of the fusion polypeptide. The polynucleotide of the present invention also includes a polynucleotide comprising a structural gene and a natural binding sequence that controls gene expression.
【００３３】 本発明はまた、下記の式のポリヌクレオチドを含む： Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）−（Ｒ３）ｎ−Ｙ 式中、５’末端においてＸは水素であり、３’末端においてＹは水素または金属
であり、Ｒ１およびＲ３は任意の核酸残基であり、ｎは１〜３０００の間の整数
であり、好ましくは１〜１０００の間の整数であり、Ｒ２は本発明の核酸配列で
あり、特に、配列表に示される群から選択される核酸配列であり、好ましくは配
列番号１、３、５、７、８および１０〜３１である。上記式において、Ｒ２は、
その５’末端残基が左側においてＲ１に結合し、その３’末端残基がその右側に
おいてＲ３に結合するように配列している。いずれかのＲ基によって示される核
酸残基の任意の領域は、Ｒが１よりも大きい場合、ヘテロポリマーまたはホモポ
リマーのいずれかであり得るが、好ましくはヘテロポリマーであり得る。The present invention also includes a polynucleotide of the formula: X— (R 1 ) n — (R 2 ) — (R 3 ) n —Y wherein X is hydrogen at the 5 ′ end; At the 3 ′ end, Y is hydrogen or metal, R 1 and R 3 are any nucleic acid residues, n is an integer between 1 and 3000, preferably an integer between 1 and 1000, R 2 is a nucleic acid sequence of the present invention, in particular, a nucleic acid sequence selected from the group set forth in the sequence Listing, preferably SEQ ID NO: 1,3,5,7,8 and 10-31. In the above formula, R 2 is
Its 5 'end residue is bonded to R 1 at the left side, the 3' terminal residue are arranged to bind to R 3 in the right. Any region of the nucleic acid residue represented by any of the R groups, where R is greater than 1, can be either a heteropolymer or a homopolymer, but can preferably be a heteropolymer.
【００３４】 本発明はまた、本発明のポリペプチドの変異体をコードする本明細書中に記載
されるポリヌクレオチドの変異体に関する。本発明のポリヌクレオチドのフラグ
メントである変異体は、本発明の全長のポリヌクレオチドを合成するために使用
することができる。好ましい実施形態は、本発明のポリペプチド配列の５個〜１
０個、１個〜５個、１個〜３個、２個、１個または０個のアミノ酸残基が任意の
組合せで置換、付加または欠失しているポリペプチド変異体をコードするポリヌ
クレオチドである。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの性質または活性を変
化させないようにサイレントである置換、付加および欠失は特に好ましい。[0034] The present invention also relates to variants of the polynucleotides described herein that encode variants of the polypeptides of the invention. Variants that are fragments of the polynucleotides of the present invention can be used to synthesize full-length polynucleotides of the present invention. Preferred embodiments comprise 5 to 1 of the polypeptide sequences of the invention.
Polynucleotide encoding a polypeptide variant in which 0, 1 to 5, 1 to 3, 2, 1, or 0 amino acid residues are substituted, added or deleted in any combination It is. Substitutions, additions and deletions that are silent so as not to alter the properties or activities of the polynucleotide or polypeptide are particularly preferred.
【００３５】 本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明のポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも５０％、６０％または７
０％の同一性を有するポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドに
対して相補的なポリヌクレオチドである。より好ましいポリヌクレオチドは、本
発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してその全長にわたって
少なくとも８０％の同一性を有する領域を含むポリヌクレオチド、およびそのよ
うなポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドである。これに関連し
て、その全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドが
特に好ましく、少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドはとりわけ
好ましい。さらに、少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドは非常
に好ましく、少なくとも９８％および９９％の同一性を有するポリヌクレオチド
は特に非常に好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドは
最も非常に好ましい。A further preferred embodiment of the present invention is that the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention has at least 50%, 60% or 7% over its entire length.
Polynucleotides with 0% identity, and polynucleotides complementary to such polynucleotides. More preferred polynucleotides are polynucleotides comprising a region having at least 80% identity over its entire length to a polynucleotide encoding a polypeptide of the invention, and polynucleotides complementary to such polynucleotides It is. In this context, polynucleotides having at least 90% identity over their entire length are particularly preferred, and polynucleotides having at least 95% identity are particularly preferred. Furthermore, polynucleotides with at least 97% identity are highly preferred, polynucleotides with at least 98% and 99% identity are particularly highly preferred, and polynucleotides with at least 99% identity are most highly preferred. preferable.
【００３６】 好ましい実施形態は、配列表に示されるポリヌクレオチドによってコードされ
る成熟ポリペプチドと同じ生物学的な機能または活性を実質的に保持しているポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドである。A preferred embodiment is a polynucleotide that encodes a polypeptide that substantially retains the same biological function or activity as the mature polypeptide encoded by the polynucleotide set forth in the Sequence Listing.
【００３７】 本発明はさらに、上記に記載される配列にハイブリダイゼーションするポリヌ
クレオチドに関する。特に、本発明は、上記に記載されるポリヌクレオチドにス
トリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに
関する。本明細書中で使用されている用語「ストリンジェントな条件」および用
語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、少なくとも９５％（
好ましくは少なくとも９７％）の同一性が配列間に存在するときに、ハイブリダ
イゼーションが一般に生じることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．
６）、５ｘデンハルト溶液、１０％デキストリン硫酸、および２０マイクログラ
ム／ミリリットルの変性した剪断サケ***ＤＮＡを含む溶液における４２℃での
一晩のインキュベーション、その後、ハイブリダイゼーション支持体を０．１ｘ
ＳＳＣ中において約６５℃で洗浄することである。他のハイブリダイゼーション
条件および洗浄条件もよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）に例示されている（特
に第１１章）。[0037] The invention further relates to polynucleotides that hybridize to the sequences described above. In particular, the invention relates to polynucleotides that hybridize to the above-described polynucleotides under stringent conditions. As used herein, the term "stringent conditions" and the term "stringent hybridization conditions" are at least 95% (
Hybridization generally occurs when an identity of at least 97%) exists between the sequences. Examples of stringent hybridization conditions are 50% formamide, 5 × SSC (150 mM NaC
1, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.
6) Incubation overnight at 42 ° C in a solution containing 5x Denhardt's solution, 10% dextrin sulfate, and 20 micrograms / milliliter of denatured sheared salmon sperm DNA, followed by 0.1x hybridization support.
Wash at about 65 ° C. in SSC. Other hybridization and washing conditions are well known and are described in Sambrook et al., Molecul.
ar Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, C
Old Spring Harbor, NY (1989) (especially Chapter 11).
【００３８】 本発明はまた、配列表に示されるポリヌクレオチド配列の完全な遺伝子を含む
適切なライブラリーを、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件のもと、
前記のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントの配列を有するプローブを
用いてスクリーニングすること；および前記のポリヌクレオチド配列を単離する
ことによって得ることができるポリヌクレオチド配列から本質的になるポリヌク
レオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチドを得るために有用なフラグメ
ントには、例えば、本明細書中に記載されているプローブおよびプライマーが含
まれる。The present invention also provides suitable libraries containing the complete genes of the polynucleotide sequences set forth in the Sequence Listing under stringent hybridization conditions.
Screening using a probe having the sequence of the polynucleotide sequence or a fragment thereof; and a polynucleotide consisting essentially of the polynucleotide sequence obtainable by isolating the polynucleotide sequence. Fragments useful for obtaining such polynucleotides include, for example, the probes and primers described herein.
【００３９】 本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書中に議論されているよう
に、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする全長のｃ
ＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するために、そして配列表に示されるポリヌ
クレオチドに対して大きな配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノ
ムクローンを単離するために、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに関するハ
イブリダイゼーションプローブとして使用することができる。そのようなプロー
ブは、一般には少なくとも１５塩基を含む。好ましくは、そのようなプローブは
少なくとも３０塩基を有し、そして少なくとも５０塩基を有し得る。特に好まし
いプローブは３０塩基〜５０塩基の間（５０塩基を含む）である。As discussed herein with respect to the polynucleotide assays of the invention, for example, a polynucleotide of the invention may comprise a full-length c-encoding polypeptide.
RNA, cDNA or genomic DNA for isolating DNA or genomic clones and for isolating cDNA or genomic clones of other genes with great sequence similarity to the polynucleotides set forth in the Sequence Listing It can be used as a hybridization probe. Such probes generally contain at least 15 bases. Preferably, such probes will have at least 30 bases and may have at least 50 bases. Particularly preferred probes are between 30 and 50 bases (including 50 bases).
【００４０】 配列表に示されるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは配列表に示される
ポリヌクレオチド配列によって含まれるそれぞれの遺伝子のコード領域は、配列
表に提供されるＤＮＡ配列を使用し、オリゴヌクレオチドプローブを合成してス
クリーニングすることによって単離することができる。次いで、本発明の遺伝子
の配列に対して相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを使用して、ｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、プロー
ブにハイブリダイゼーションするライブラリーのメンバーが同定される。例えば
、ＦｔｓＺ ＥＳＴ配列に対応する合成オリゴヌクレオチドが合成される。この
オリゴヌクレオチドは、ＦｔｓＺ遺伝子の５’末端配列および３’末端配列を得
るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして使用される。ある
いは、縮重度が低いオリゴヌクレオチドを特定のＦｔｓＺペプチドから調製する
ことができる場合、そのようなプローブは、ＦｔｓＺ遺伝子配列について遺伝子
ライブラリーをスクリーニングするために直接使用することができる。特に、フ
ァージベクターにおけるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、バックグラ
ウンドのハイブリダイゼーションレベルが一層低いためにそのような方法におい
て有用である。The coding region of each gene containing the polynucleotide sequence shown in the sequence listing or contained by the polynucleotide sequence shown in the sequence listing uses the DNA sequence provided in the sequence listing, Can be isolated by screening. Then, using a labeled oligonucleotide having a sequence complementary to the sequence of the gene of the present invention, cD
A library of NA, genomic DNA or mRNA is screened to identify library members that hybridize to the probe. For example, a synthetic oligonucleotide corresponding to the FtsZ EST sequence is synthesized. This oligonucleotide is used as a primer in the polymerase chain reaction (PCR) to obtain the 5 'and 3' terminal sequences of the FtsZ gene. Alternatively, if less degenerate oligonucleotides can be prepared from a particular FtsZ peptide, such probes can be used directly to screen a gene library for FtsZ gene sequences. In particular, screening a cDNA library in a phage vector is useful in such a method because of the lower background hybridization levels.
【００４１】 典型的には、核酸プローブの使用から得ることができるＦｔｓＺ配列は、標的
のＦｔｓＺ配列とプローブとして使用されたコード配列との間に６０％〜７０％
の配列同一性を示す。しかし、５０％〜６０％もの低い配列同一性を有する長い
配列も得ることができる。核酸プローブは、核酸配列の長いフラグメントであっ
てもよく、あるいはより短いオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。より
長い核酸フラグメントが（約１００ｂｐを越える）プローブとして用いられる場
合、プローブとして使用された配列から２０％〜５０％のずれ（すなわち、５０
％〜８０％の配列相同性）を有する配列を標的サンプルから得るために、より低
いストリンジェンシーのもとでスクリーニングしうる。オリゴヌクレオチドプロ
ーブは、ＦｔｓＺ酵素をコードする完全な核酸配列よりもかなり短くすることが
できるが、少なくとも約１０ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも約１５
ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり得る
。より長い領域とは反対に、より短い領域が使用される場合には、より大きな配
列同一性が所望される。従って、高度に保存されたアミノ酸配列の領域を同定し
て、他の関連するＦｔｓＺ遺伝子の検出および回収を行うオリゴヌクレオチドプ
ローブを設計することが望ましい場合がある。より短いプローブは、特に、高度
に保存された配列が同定され得る場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にとっ
て特に有用であることが多い（Ｇｏｕｌｄら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８９）８
６：１９３４〜１９３８を参照のこと）。Typically, the FtsZ sequence obtainable from the use of a nucleic acid probe is between 60% and 70% between the target FtsZ sequence and the coding sequence used as the probe.
Shows the sequence identity of However, long sequences with sequence identity as low as 50% to 60% can also be obtained. The nucleic acid probe may be a long fragment of the nucleic acid sequence or may be a shorter oligonucleotide probe. When longer nucleic acid fragments are used as probes (greater than about 100 bp), a 20% to 50% deviation from the sequence used as the probe (i.e., 50%).
% -80% sequence homology) from the target sample can be screened under lower stringency. Oligonucleotide probes can be significantly shorter than the complete nucleic acid sequence encoding the FtsZ enzyme, but are at least about 10 nucleotides, preferably at least about 15 nucleotides.
Nucleotides, more preferably at least about 20 nucleotides. Where shorter regions are used, as opposed to longer regions, greater sequence identity is desired. Thus, it may be desirable to identify regions of the amino acid sequence that are highly conserved and design oligonucleotide probes that detect and recover other related FtsZ genes. Shorter probes are often particularly useful for the polymerase chain reaction (PCR), especially when highly conserved sequences can be identified (Gould et al., PNAS USA (1989) 8).
6: 1934-1938).
【００４２】 本発明の別の態様はＦｔｓＺポリペプチドに関する。そのようなポリペプチド
には、配列表に示される単離されたポリペプチド、ならびにそのポリペプチドお
よびフラグメント、特に、ＦｔｓＺ活性を示すそのようなポリペプチド、および
配列表に示される配列の群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも
５０％、６０％または７０％の同一性（好ましくは少なくとも８０％の同一性、
より好ましくは少なくとも９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の
同一性）を有するそのようなポリペプチドが含まれ、またそのようなポリペプチ
ドの一部も含まれる。この場合、ポリペプチドのそのような一部は、好ましくは
少なくとも３０アミノ酸を含み、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む
。Another aspect of the invention pertains to FtsZ polypeptides. Such polypeptides include the isolated polypeptides set forth in the Sequence Listing, and polypeptides and fragments thereof, particularly those polypeptides that exhibit FtsZ activity, and the group of sequences set forth in the Sequence Listing. At least 50%, 60% or 70% identity (preferably at least 80% identity,
More preferably, such polypeptides having at least 90% identity, most preferably at least 95% identity) are included, as well as portions of such polypeptides. In this case, such a portion of the polypeptide preferably contains at least 30 amino acids, more preferably at least 50 amino acids.
【００４３】 「同一性」は、当分野で十分理解されているように、２つ以上のポリペプチド
配列間の関係または２つ以上のポリヌクレオチド間の関係であり、配列を比較す
ることによって決定される。当分野では、「同一性」はまた、ポリペプチド配列
間またはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味し、そのような配列
群の間における一致によって決定される。「同一性」は、既知の方法によって容
易に計算することができる。このような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏ
ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏ
ｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆ
ｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９
９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（
１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓ
ｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびｌｉｐｍａ
ｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ，４８：１０７３（１９８
８）に記載されている方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性を決定
する方法は、調べられる配列間に最大の一致が得られるように設計されている。
さらに、同一性を決定する方法は、公開された入手可能なプログラムで体系化さ
れている。２つの配列間の同一性を決定するために使用され得るコンピューター
プログラムには、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２（１）：３８７（１９８４））；一連の５つのＢ
ＬＡＳＴプログラム（ヌクレオチド配列の比較を目的とする３つ（ＢＬＡＳＴＮ
、ＢＬＡＳＴＸおよびＴＢＬＡＳＴＸ）およびタンパク質配列の比較を目的とす
る２つ（ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ）（Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ
ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：７６〜８０（１９９４）；Ｂｉｒ
ｒｅａら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ、１：５４３〜５５９（１９９７）
）が含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩお
よび他の供給元から公開されている（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈ
ｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４
；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１
０（１９９０））。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、
同一性を決定するために使用することができる。“Identity” is the relationship between two or more polypeptide sequences or two or more polynucleotides, as is well understood in the art, and is determined by comparing the sequences. Is done. In the art, "identity" also means the degree of sequence relatedness between polypeptide sequences or between polynucleotide sequences, as determined by the match between groups of such sequences. "Identity" can be readily calculated by known methods. Such methods include Computational
Molecular Biology, Lesk, A .; M. Hen, Oxford
University Press, New York (1988); Bio.
computing: Informatics and Genome Pro
jets, Smith, D.C. W. Hen, Academic Press, New
York, 1993; Computer Analysis of Sequ.
ence Data, Part I, Griffin, A .; M. And Grif
fin, H .; G. FIG. Ed., Humana Press, New Jersey (19
94); Sequence Analysis in Molecular B
ology, von Heinje, G .; , Academic Press (
1987); Sequence Analysis Primer, Gribs.
kov, M .; And Devereux, J .; Hen, Stockton Press
New York (1991); and Carillo, H .; And lipma
n, D. , SIAM J Applied Math, 48: 1073 (198
The method includes, but is not limited to, the method described in 8). Methods to determine identity are designed to give the largest match between the sequences examined.
Further, methods for determining identity are codified in publicly available programs. Computer programs that can be used to determine identity between two sequences include GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Aci.
ds Research, 12 (1): 387 (1984));
The LAST program (3 programs for nucleotide sequence comparison (BLASTN
, BLASTX and TBLASTX) and two for the purpose of comparing protein sequences (BLASTP and TBLASTN) (Coulson, Trends
in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Bir.
rea et al., Genome Analysis, 1: 543-559 (1997).
), But is not limited thereto. The BLASTX program is publicly available from NCBI and other sources (BLAST Manual, Altsch
ul, S.M. Et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894
Altschul, S .; J. et al. Mol. Biol. 215: 403-41
0 (1990)). The well-known Smith Waterman algorithm is also
Can be used to determine identity.
【００４４】 ポリペプチド配列の比較に関するパラメーターには、典型的には下記が含まれ
る： アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．４８：４４３〜４５３（１９７０） 比較行列：ＨｅｎｔｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５〜１０９１９（１９９２）か
ら得られるＢＬＯＳＳＵＭ６２ ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターとともに使用され得るプログラムは、「ｇａｐ」プログ
ラムとしてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ
、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から公開されている。末端のギャップに関するペナルテ
ィーを有しない上記パラメーターは、ペプチド比較に関する初期設定パラメータ
ーである。Parameters for polypeptide sequence comparisons typically include the following: Algorithm: Needleman and Wunsch, J .; Mol. Bio
l. 48: 443-453 (1970) Comparison matrices: Hentikoff and Hentikoff, Proc. Nat
l. Acad. BLOSSUM62 obtained from Sci USA 89: 10915-10919 (1992) Gap penalty: 12 Gap length penalty: 4 A program that can be used with these parameters is the Genetics Computer Group (Madison) as the "gap" program.
, Wisconsin). The above parameters without penalties for terminal gaps are default parameters for peptide comparisons.
【００４５】 ポリヌクレオチド配列の比較に関するパラメーターには、下記が含まれる： アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．４８：４４３〜４５３（１９７０） 比較行列：一致＝＋１０；不一致＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターとともに使用され得るプログラムは、「ｇａｐ」プログ
ラムとしてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ
、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から公開されている。上記パラメーターは、核酸比較に
関する初期設定パラメーターである。Parameters for polynucleotide sequence comparisons include the following: Algorithm: Needleman and Wunsch, J .; Mol. Bio
l. 48: 443-453 (1970) Comparison matrix: match = + 10; mismatch = 0 Gap penalty: 50 Gap length penalty: 3 A program that can be used with these parameters is the Genetics Computer Group (Madison) as the "gap" program.
, Wisconsin). The above parameters are default parameters for nucleic acid comparison.
【００４６】 本発明はまた、下記の式のポリペプチドを含む： Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）−（Ｒ３）ｎ−Ｙ 式中、アミノ末端においてＸは水素であり、カルボキシル末端においてＹは水素
または金属であり、Ｒ１およびＲ３は任意のアミノ酸残基であり、ｎは１〜１０
００の間の整数であり、Ｒ２は本発明のアミノ酸配列であり、特に、配列表に示
される群から選択されるアミノ酸配列であり、好ましくは配列番号２、４、６お
よび９である。上記式において、Ｒ２は、そのアミノ末端残基が左側においてＲ １ に結合し、そのカルボキシ末端残基がその右側においてＲ３に結合するように
配列している。いずれかのＲ基によって示されるアミノ酸残基の任意の領域は、
Ｒが１よりも大きい場合、ヘテロポリマーまたはホモポリマーのいずれかであり
得るが、好ましくはヘテロポリマーであり得る。The present invention also includes a polypeptide of the formula: X- (R1)n− (R2)-(R3)nWherein Y is hydrogen at the amino terminus and Y is hydrogen at the carboxyl terminus
Or a metal, R1And R3Is an arbitrary amino acid residue, and n is 1 to 10
An integer between 00 and R2Is the amino acid sequence of the present invention, and
Amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6 and
And 9. In the above formula, R2Means that the amino terminal residue is R 1 And the carboxy terminal residue has R3To join
They are arranged. Any region of an amino acid residue represented by any of the R groups
If R is greater than 1, it is either a heteropolymer or a homopolymer
But preferably a heteropolymer.
【００４７】 本発明のポリペプチドには、本明細書中に示される配列表に含まれる配列の群
から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポ
リペプチドが含まれる。The polypeptide of the present invention includes an isolated polypeptide encoded by a polynucleotide containing a sequence selected from the group of sequences contained in the sequence listing shown herein.
【００４８】 本発明のポリペプチドは、成熟タンパク質である得るか、あるいは融合タンパ
ク質の一部であり得る。[0048] The polypeptide of the invention may be a mature protein or may be part of a fusion protein.
【００４９】 ポリペプチドのフラグメントおよび変異体もまた本発明の一部であると見なさ
れる。フラグメントは、上記に記載されたポリペプチドのアミノ酸配列のすべて
ではなく、その一部と完全に同じであるアミノ酸配列を有する変化したポリペプ
チドである。そのようなフラグメントは、そのフラグメントが、最も好ましくは
１つの連続領域としての一部分または一領域を形成するより大きなポリペプチド
内に「独立して存在し」得るか、またはそのようなより大きなポリペプチド内に
含まれ得る。好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドの活性を媒介する
そのようなフラグメントである生物学的に活性なフラグメントであり、これには
、類似した活性を有するフラグメント、改善された活性を有するフラグメント、
または低下した活性を有するフラグメントが含まれる。動物（特にヒト）におい
て抗原性または免疫原性であるそのようなフラグメントもまた含まれる。[0049] Fragments and variants of the polypeptides are also considered to be part of the present invention. A fragment is an altered polypeptide having an amino acid sequence that is entirely the same as some, but not all, of the amino acid sequences of the polypeptides described above. Such fragments may be "independently" present within the larger polypeptide, most preferably forming a portion or region as one continuous region, or such larger polypeptides. May be included within. Preferred fragments are biologically active fragments that are those fragments that mediate the activity of the polypeptides of the present invention, including those that have a similar activity, those that have improved activity,
Or fragments having reduced activity. Also included are those fragments that are antigenic or immunogenic in an animal, especially a human.
【００５０】 ポリペプチドの変異体には、保存的なアミノ酸置換、同様な特性を有する別の
残基による残基の置換によって配列表に示される配列から異なるポリペプチドも
含まれる。一般に、そのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの
間；ＳｅｒとＴｈｒとの間；ＡｓｐとＧｌｕとの間；ＡｓｎとＧｌｎとの間；Ｌ
ｙｓとＡｒｇとの間；またはＰｈｅとＴｙｒとの間である。５個〜１０個、１個
〜５個、１個〜３個または１個のアミノ酸が任意の組合せで置換、付加または欠
失している変異体が特に好ましい。Variants of a polypeptide also include polypeptides that differ from the sequences set forth in the Sequence Listing by conservative amino acid substitutions, replacement of a residue with another residue having similar properties. Generally, such substitutions are between Ala, Val, Leu and Ile; between Ser and Thr; between Asp and Glu; between Asn and Gln;
between ys and Arg; or between Phe and Tyr. Variants in which 5 to 10, 1 to 5, 1 to 3 or 1 amino acid is substituted, added or deleted in any combination are particularly preferred.
【００５１】 本発明のポリペプチドのフラグメントである変異体は、ペプチド合成によって
対応する全長のポリペプチドを作製するために使用することができる。従って、
このような変異体は、本発明の全長のポリペプチドを作製するための中間体とし
て使用することができる。Variants that are fragments of the polypeptides of the present invention can be used to make the corresponding full-length polypeptides by peptide synthesis. Therefore,
Such variants can be used as intermediates for making the full-length polypeptides of the invention.
【００５２】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、これは本明細書中でさらに
議論されているように、例えば、植物宿主細胞などの宿主細胞の形質転換におい
て使用することができる。The polynucleotides and polypeptides of the present invention can be used, for example, in the transformation of a host cell, such as a plant host cell, as further discussed herein.
【００５３】 本発明はまた、成熟タンパク質であるポリペプチドおよびアミノ末端またはカ
ルボキシル末端のさらなるアミノ酸、あるいは成熟ポリペプチド内のアミノ酸（
例えば、タンパク質の成熟形態が２つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）をコ
ードするポリヌクレオチドを提供する。そのような配列は、例えば、前駆体から
成熟形態へのタンパク質プロセシングにおける役割を果たし、タンパク質輸送を
可能にし、タンパク質の半減期の短縮化または延長をもたらし、あるいはアッセ
イまたは作製におけるタンパク質の操作を容易にし得る。任意のさらなるアミノ
酸を成熟タンパク質から除くために細胞酵素を使用し得ることが考えられる。The present invention also provides polypeptides that are mature proteins and additional amino or carboxyl terminal amino acids, or amino acids within the mature polypeptide (
For example, a polynucleotide encoding the mature form of the protein (if the protein has more than one polypeptide chain) is provided. Such sequences, for example, play a role in protein processing from precursor to mature form, allow for protein transport, result in a shorter or longer protein half-life, or facilitate manipulation of proteins in assays or production. Can be. It is contemplated that cellular enzymes may be used to remove any additional amino acids from the mature protein.
【００５４】 １つまたは２つ以上のプロ配列に融合させたポリペプチドの成熟形態を有する
前駆体タンパク質は、ポリペプチドの不活性形態であり得る。この不活性な前駆
体は、一般に、そのプロ配列を除いたときに活性化される。プロ配列の一部また
はすべてを活性化に先立って除くことができる。そのような前駆体タンパク質は
、一般にプロタンパク質と呼ばれている。A precursor protein having a mature form of the polypeptide fused to one or more prosequences can be an inactive form of the polypeptide. This inactive precursor is generally activated when its prosequence is removed. Some or all of the prosequence can be removed prior to activation. Such precursor proteins are commonly called proproteins.
【００５５】 相同的な配列が、配列の同一性が存在するときに見出され、配列情報（核酸ま
たはアミノ酸）を比較したときに、あるいは既知のＦｔｓＺと候補源とのハイブ
リダイゼーション反応によって決定することができる。Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｖａｌ
／Ｉｌｅ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ａｒｇ／ＬｙｓおよびＧｌｎ／Ａｓｎなどの保存的
な変化もまた、配列相同性を決定する際には考慮され得る。典型的には、長い核
酸配列は、５０％〜６０％もの低い配列同一性、より好ましくは少なくとも約７
０％の配列同一性を、標的配列と、存在し得る何らかの欠失を除いた目的とする
特定のＦｔｓＺ配列との間に示すことがあり、それでも依然として関連すると見
なすことができる。アミノ酸配列は、２５％もの低い配列同一性が２つの完全な
成熟タンパク質の間に存在することによって相同的であると見なされる（一般的
には、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．、ＯＦ ＵＲＦＳ ａｎｄ ＯＲＦＳ（Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ、ＣＡ、１９８６）を参照の
こと）。Homologous sequences are found when sequence identity exists and are determined by comparing sequence information (nucleic acids or amino acids) or by hybridization reactions between a known FtsZ and a candidate source. be able to. Glu / Asp, Val
Conservative changes, such as / Ile, Ser / Thr, Arg / Lys and Gln / Asn, can also be considered when determining sequence homology. Typically, long nucleic acid sequences will have sequence identity as low as 50% to 60%, more preferably at least about 7%.
0% sequence identity may be exhibited between the target sequence and the particular FtsZ sequence of interest, excluding any possible deletions, and may still be considered relevant. Amino acid sequences are considered homologous with sequence identities as low as 25% between the two fully mature proteins (Generally, Doolittle, RF, OF URFS and ORFS ( U
novelty Science Books, CA, 1986)).
【００５６】 さらに、本明細書中に提供されている配列は、相同的なＦｔｓＺ配列を同定す
るために使用され得るだけでなく、それらから得られる生じた配列もまた、他の
植物源および／または細菌源からＦｔｓＺ配列を得るさらなる方法を提供し得る
。特に、ＰＣＲは、本明細書中に提供されている配列データから関連するＦｔｓ
Ｚ配列を得る有用な技術である。当業者は、典型的には高度に保存された配列の
配列比較または領域に基づくオリゴヌクレオチドプローブを設計することができ
る。Furthermore, not only can the sequences provided herein be used to identify homologous FtsZ sequences, but the resulting sequences derived therefrom can also be used in other plant sources and / or Or it may provide a further method of obtaining the FtsZ sequence from a bacterial source. In particular, PCR was performed using the relevant Fts from the sequence data provided herein.
This is a useful technique for obtaining a Z arrangement. One skilled in the art can design oligonucleotide probes based on sequence comparisons or regions of typically highly conserved sequences.
【００５７】 核酸配列が一旦得られると、ＦｔｓＺ配列の宿主細胞における転写、または転
写および翻訳（発現）が、酵素の容易な供給源を作製するために、かつ／または
それに見出される色素体の数および／またはサイズを改変するために所望される
。他の有用な適用が、宿主細胞が植物宿主細胞である場合にインビトロおよびイ
ンビボにおいて見出され得る。Once the nucleic acid sequence is obtained, transcription of the FtsZ sequence in a host cell, or transcription and translation (expression), may be performed to create an easy source of the enzyme and / or the number of plastids found in it. And / or to modify size. Other useful applications can be found in vitro and in vivo when the host cell is a plant host cell.
【００５８】 ＦｔｓＺまたは精製酵素のアミノ酸配列をコードし、その配列をコードするＤ
ＮＡの単離を容易にする核酸プローブの設計を可能にする核酸（ゲノムＤＮＡ、
プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）は、当分野では知ら
れており、本発明の方法における使用に用いることができる。本明細書書中に提
供されている核酸配列およびそれらに由来するアミノ酸配列を使用して、当分野
で一般に知られているＤＮＡおよびペプチドの検索技術を使用することによって
他の可能性のあるＦｔｓＺ遺伝子をＧｅｎＢａｎｋから単離できることは、本発
明が関連する分野の当業者には一般に認識されている。Ds encoding the amino acid sequence of FtsZ or the purified enzyme
Nucleic acids that allow the design of nucleic acid probes that facilitate the isolation of NA (genomic DNA,
Plasmid DNA, cDNA, synthetic DNA, mRNA, etc.) are known in the art and can be used in the methods of the invention. Using the nucleic acid sequences provided herein and the amino acid sequences derived therefrom, other potential FtsZ by using DNA and peptide search techniques commonly known in the art. It is generally recognized by those skilled in the art to which the invention pertains that genes can be isolated from GenBank.
【００５９】 本発明に記載されている配列に加えて、本発明において有用な配列をコードす
るＤＮＡを、藻類、真菌、細菌、植物などから得ることができる。ＦｔｓＺの保
存されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対応する特徴配列を使用した既
存のデータベースにおける相同性検索を、同等の関連する遺伝子を植物および微
生物などの他の供給源から単離するために用いることができる。ＥＳＴデータベ
ースの検索もまた用いることができる。さらに、本明細書中に開示されている酵
素と機能的かつ酵素的に等価な酵素をコードするＤＮＡ配列の使用もまた本発明
により考えられる。この場合、そのようなＤＮＡ配列は、遺伝子コードの縮重に
従う、本明細書中に開示されている核酸配列の縮重した等価体である。これらの
方法のいずれかによって同定されたコード配列の機能性は、大腸菌などの適切な
生物の変異体の相補性によって明らかにすることができる。ＤＮＡのコード領域
の配列は、特定の宿主における発現を最大にするためにコドン使用に基づいて遺
伝子を再合成することによって最適化することができる。In addition to the sequences described in the present invention, DNAs encoding sequences useful in the present invention can be obtained from algae, fungi, bacteria, plants and the like. Using homology searches in existing databases using feature sequences corresponding to the conserved nucleotide and amino acid sequences of FtsZ to isolate equivalent related genes from other sources such as plants and microorganisms Can be. Searching the EST database can also be used. In addition, the use of DNA sequences encoding enzymes that are functionally and enzymatically equivalent to the enzymes disclosed herein is also contemplated by the present invention. In this case, such a DNA sequence is a degenerated equivalent of the nucleic acid sequences disclosed herein, according to the degeneracy of the genetic code. The functionality of a coding sequence identified by any of these methods can be revealed by complementation of a mutant of a suitable organism, such as E. coli. The sequence of the coding region of DNA can be optimized by resynthesizing the gene based on codon usage to maximize expression in a particular host.
【００６０】 ＦｔｓＺをコードする核酸配列は、様々な構築物において、例えば、さらなる
配列を得るためのプローブとして使用することができる。あるいは、これらの配
列は、酵素の回収またはインビトロもしくはインビボでの酵素の研究のために宿
主細胞における目的とするそれぞれのＦｔｓＺ配列のレベルを増大させるために
、あるいは宿主細胞が（植物細胞、植物の一部（種子、切断体または組織を含む
が、これらに限定されない）および植物を含む）植物全体である場合には特定の
適用のために目的とするそれぞれのＦｔｓＺ配列のレベルを低下させるために適
切な調節配列と組み合わせて使用することができる。The nucleic acid sequence encoding FtsZ can be used in various constructs, for example, as a probe to obtain additional sequences. Alternatively, these sequences may be used to increase the level of the respective FtsZ sequence of interest in the host cell for enzyme recovery or in vitro or in vivo enzyme studies, or if the host cell (plant cell, plant In order to reduce the level of each FtsZ sequence of interest for a particular application when whole plants (including but not limited to seeds, truncates or tissues) and plants It can be used in combination with a suitable regulatory sequence.
【００６１】 従って、目的とする使用に依存して、構築物は、完全なＦｔｓＺタンパク質を
コードする核酸配列またはその一部を含む。例えば、特定のＦｔｓＺタンパク質
のアンチセンス阻害が所望される場合、完全なＦｔｓＺ配列は必要とされない。
さらに、ＦｔｓＺ構築物がプローブとしての使用を目的とする場合、ＦｔｓＺの
コード配列の特定部分、例えば、高度に保存されたＦｔｓＺ領域をコードするこ
とが発見されている配列のみを含む構築物を調製することは有利であり得る。Thus, depending on the intended use, the construct comprises the nucleic acid sequence encoding the complete FtsZ protein or a part thereof. For example, if antisense inhibition of a particular FtsZ protein is desired, the complete FtsZ sequence is not required.
In addition, if the FtsZ construct is intended for use as a probe, preparing a construct that contains only a particular portion of the FtsZ coding sequence, eg, a sequence that has been found to encode a highly conserved FtsZ region. May be advantageous.
【００６２】 上記に議論されているように、本発明の植物ＦｔｓＺタンパク質または他のＦ
ｔｓＺタンパク質をコードする核酸配列には、ゲノム、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ
の配列が含まれる。「コード（する）」は、配列がセンス方向またはアンチセン
ス方向のいずれかで特定のアミノ酸配列に対応することを意味する。「染色体外
」は、配列が、自然界で会合している植物ゲノムの外側であることを意味する。
「組換え」は、配列が変異誘発法および制限酵素などを介する操作によって遺伝
子操作された改変を含むことを意味する。As discussed above, the plant FtsZ protein or other FsZ proteins of the present invention
The nucleic acid sequence encoding the tsZ protein includes genomic, cDNA or mRNA
Is included. "Code" means that the sequence corresponds to a particular amino acid sequence in either the sense or antisense orientation. "Extrachromosomal" means that the sequence is outside of the plant genome with which it is associated in nature.
"Recombination" means that the sequence contains genetically engineered modifications, such as by mutagenesis and manipulation via restriction enzymes and the like.
【００６３】 ｃＤＮＡ配列は、ＦｔｓＺタンパク質の特定の細胞小器官部位または膜部位へ
の送達を容易にするトランジットペプチド配列または標的化配列などのプロセシ
ング前の配列を含んでもよく、あるいは含まなくてもよい。そのような前駆体Ｆ
ｔｓＺＤＮＡ配列のいずれかを使用することは植物細胞発現での使用には好まし
い。ゲノムのＦｔｓＺ配列は、様々なＤＮＡ構築物においてその配列が使用され
得る転写開始領域および翻訳開始領域、イントロンおよび／または植物ＦｔｓＺ
の転写物終結領域を、ＦｔｓＺの構造遺伝子とともに含むことができ、あるいは
ＦｔｓＺの構造遺伝子を伴うことなく含むことができる。従って、本発明のＦｔ
ｓＺ配列に対応する核酸配列はまた、特定の細胞小器官部位または膜部位へのタ
ンパク質送達を行わせるために有用なシグナル配列、有用な組織プロフィルおよ
び時間プロフィルを有する５’上流の非コード調節領域（プロモーター）、転写
調節領域および翻訳調節領域として有用な３’下流の非コード調節領域を提供し
得るし、遺伝子の他の特徴の理解に役立ち得る。The cDNA sequence may or may not include a pre-processing sequence such as a transit peptide sequence or targeting sequence that facilitates delivery of the FtsZ protein to a particular organelle or membrane site. . Such a precursor F
The use of any of the tsZ DNA sequences is preferred for use in plant cell expression. The genomic FtsZ sequence may be used in various DNA constructs, where the sequence may be used in transcription and translation initiation regions, introns and / or plant FtsZ.
Can be included with the FtsZ structural gene or without the FtsZ structural gene. Therefore, the Ft of the present invention
The nucleic acid sequence corresponding to the sZ sequence may also be a 5 'upstream non-coding regulatory region with useful signal sequences, useful tissue and time profiles to direct protein delivery to specific organelle or membrane sites. (Promoter), a 3 ′ downstream non-coding regulatory region useful as a transcriptional and translational regulatory region, and may aid in understanding other features of the gene.
【００６４】 所望する植物ＦｔｓＺ核酸配列または他のＦｔｓＺ核酸配列が得られると、そ
の核酸配列は様々な方法で操作することができる。配列が隣接する非コード領域
を含む場合、そのような隣接領域は、切除、変異誘発法などに供することができ
る。従って、トランジション、トランスバージョン、欠失および挿入を、自然界
に存在する配列において行うことができる。さらに、配列のすべてまたは一部を
合成することができる。構造遺伝子においては、１つまたは２つ以上のコドンを
改変して、改変されたアミノ酸配列にすることができ、あるいは１つまたは２つ
以上のコドン変異を導入して、構築または発現に関与する便利な制限部位または
他の目的を達成することができる。構造遺伝子は、１つまたは２つ以上の便利な
制限部位を導入するための合成アダプターまたはリンカーなどを用いることによ
ってさらに改変することができる。Once the desired plant FtsZ nucleic acid sequence or other FtsZ nucleic acid sequence is obtained, the nucleic acid sequence can be manipulated in various ways. Where the sequence includes adjacent non-coding regions, such adjacent regions can be subjected to excision, mutagenesis, and the like. Thus, transitions, transversions, deletions and insertions can be made in naturally occurring sequences. In addition, all or part of the sequence can be synthesized. In a structural gene, one or more codons can be modified to a modified amino acid sequence, or one or more codon mutations can be introduced to participate in construction or expression. Convenient restriction sites or other objectives can be achieved. The structural gene can be further modified by using a synthetic adapter or linker or the like to introduce one or more convenient restriction sites.
【００６５】 大抵の場合、構築物は、植物細胞における色素体のサイズおよび数を変化させ
る植物において機能的な調節領域を含む。ＦｔｓＺタンパク質、ＦｔｓＺ関連タ
ンパク質またはそれらの機能的なフラグメントをコードするオープンリーディン
グフレームは、その５’末端において、ＦｔｓＺまたはＦｔｓＺ関連の構造遺伝
子の５’上流に自然界で見出される野生型配列などの転写開始調節領域と連結さ
れるか、あるいは植物組織において自然界で発現している遺伝子に由来する異種
の調節領域と連結される。有用な植物調節遺伝子領域の例には、ノパリンシンタ
ーゼまたはオクトピンシンターゼなどのＴ−ＤＮＡ遺伝子、ＣａＭＶ３５Ｓなど
の植物ウイルス遺伝子あるいは本来の植物遺伝子に由来する領域が含まれる。In most cases, the construct will include a regulatory region functional in the plant that alters the size and number of plastids in the plant cells. An open reading frame encoding an FtsZ protein, an FtsZ-related protein or a functional fragment thereof, initiates transcription initiation at its 5 'end, such as a wild-type sequence found naturally in the 5' upstream of FtsZ or an FtsZ-related structural gene. It is linked to a regulatory region or to a heterologous regulatory region derived from a gene that is naturally expressed in plant tissues. Examples of useful plant regulatory gene regions include regions derived from T-DNA genes such as nopaline synthase or octopine synthase, plant virus genes such as CaMV35S, or native plant genes.
【００６６】 本発明の植物ＦｔｓＺタンパク質または他のＦｔｓＺタンパク質をコードする
ＤＮＡ配列は、ＦｔｓＺと通常的に会合する遺伝子配列のすべてまたは一部を一
緒に用いることができる。その構成要素部分において、ＦｔｓＺをコードするＤ
ＮＡ配列は、５’から３’への転写方向で、宿主細胞における転写および翻訳を
促進させることができる転写開始制御領域、植物ＦｔｓＺをコードするＤＮＡ配
列ならびに転写終結領域および翻訳終結領域を有するＤＮＡ構築物において組み
合わせられる。As the DNA sequence encoding the plant FtsZ protein of the present invention or other FtsZ proteins, all or a part of the gene sequence normally associated with FtsZ can be used together. In its component part, Ds that encodes FtsZ
The NA sequence is a transcription initiation control region capable of promoting transcription and translation in a host cell in the 5 ′ to 3 ′ transcription direction, a DNA sequence encoding a plant FtsZ, and a DNA having a transcription termination region and a translation termination region. Combined in the construct.
【００６７】 可能な宿主細胞には、原核生物細胞および真核生物細胞の両方が含まれる。宿
主細胞は、目的とする使用に依存して、単細胞であり得るか、あるいは多細胞の
分化した生物または未分化の生物において見出され得る。本発明の細胞は、本明
細書中に提示されている野生型細胞とは異なるＦｔｓＺ配列を有することによっ
て、例えば、宿主種にとって固有的でないＦｔｓＺタンパク質をコードする組換
え核酸構築物を細胞内に有することによって区別され得る。[0067] Possible host cells include both prokaryotic and eukaryotic cells. Host cells can be single cells or can be found in multicellular differentiated or undifferentiated organisms, depending on the intended use. The cells of the invention have a different FtsZ sequence than the wild-type cells presented herein, thereby having, for example, a recombinant nucleic acid construct encoding a FtsZ protein in the cell that is not unique to the host species. Can be distinguished by
【００６８】 宿主に依存して、調節領域は変化し、調節領域には、ウイルス遺伝子、プラス
ミド遺伝子または染色体遺伝子などに由来する領域が含まれる。原核生物または
真核生物の微生物（特に、単細胞宿主）における発現のために、広範囲の構成的
プロモーターまたは誘導的プロモーターを用いることができる。微生物における
発現は植物酵素の容易な供給源を提供し得る。これまでに記載されている転写開
始領域には、大腸菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの細菌宿主および酵母宿主から得られる領域が含まれ、
β−ガラクトシダーゼ、Ｔ７ポリメラーゼおよびトリプトファンＥなどの遺伝子
が含まれる。Depending on the host, the regulatory regions will vary, and include regulatory regions, such as those derived from viral genes, plasmid genes or chromosomal genes. A wide range of constitutive or inducible promoters can be used for expression in prokaryotic or eukaryotic microorganisms, especially single cell hosts. Expression in microorganisms can provide an easy source of plant enzymes. The transcription initiation regions described so far include E. coli, B. subtilis, Saccharomyces c
and regions obtained from bacterial and yeast hosts, such as E. evivisiae,
Genes such as β-galactosidase, T7 polymerase and tryptophan E are included.
【００６９】 好ましい実施形態において、構築物は、植物ＦｔｓＺの改変された産生、そし
て可能であれば植物細胞の色素体の改変をもたらす植物において機能的な調節領
域を含む。植物ＦｔｓＺまたはその機能的なフラグメントをコードするオープン
リーディングフレームは、その５’末端において転写開始調節領域に連結される
。ＦｔｓＺタンパク質の発現が植物宿主において所望される実施形態では、植物
ＦｔｓＺ遺伝子のすべてまたは一部を使用することが所望される：すなわち、構
造遺伝子配列と一緒になっている５’上流の非コード領域（プロモーター）のす
べておよび一部、ならびに３’下流の非コード領域を用いることができる。In a preferred embodiment, the construct comprises a regulatory region functional in the plant that results in an altered production of plant FtsZ, and possibly a modification of the plastids of the plant cells. An open reading frame encoding plant FtsZ or a functional fragment thereof is linked at its 5 'end to a transcription initiation regulatory region. In embodiments where expression of the FtsZ protein is desired in a plant host, it may be desirable to use all or part of the plant FtsZ gene: the 5 'upstream non-coding region together with the structural gene sequence All and part of the (promoter), as well as the 3 'downstream non-coding region can be used.
【００７０】 異なるプロモーター、例えば目的の植物宿主の元来のプロモーターまたは修飾
プロモーターすなわち１個の遺伝子源に由来する転写開始領域および異なる遺伝
子源に由来する翻訳開始領域を有するプロモーターを望む場合、広範な構成性の
または制御可能な、例えば誘導可能な、構造遺伝子機能の転写を提供する非常に
多くの転写開始領域が利用可能である。かかる構造遺伝子に対応する転写／翻訳
開始領域は各々の出発コドンのすぐ５’上流に見出される。植物に用いられる転
写開始領域のなかで例えばノパリンおよびマンノピン合成のためのＴ−ＤＮＡ構
造遺伝子に関係するかかる領域は、ＣａＭＶからの１９Ｓおよび３５Ｓプロモー
ター並びにナピン、ＡＣＰ、ＳＳＵ、ＰＧ、ゼイン、ファセオリンＥのごとき別
の植物遺伝子からの５’上流領域等である。増強されたプロモーター、例えば二
重３５ＳはまたＦｔｓＺ配列の発現にも利用可能である。かかる適用には、５’
上流非コーディング領域を種子成熟中に制御された別の遺伝子から得る場合、植
物胚芽組織で優先的に発現されるもの、例えばＡＣＰおよびナピン由来の転写開
始調節領域が望ましい。発行された米国特許第５６０８１５２号および５５３０
１９４号の教示に従って、かかる「種子特異的プロモーター」を得て、使用する
ことができ、これは参照により本明細書に組み込む。種子組織で優先的に発現さ
れる、すなわち別の植物の部分では検出されない転写開始領域は遺伝子生成物の
何らかの破断または逆効果を最小にするために、ＴＡＧ修飾に望ましいと考えら
れる。If one desires a different promoter, for example the native or modified promoter of the plant host of interest, ie a promoter having a transcription initiation region from one gene source and a translation initiation region from a different gene source, a wide range of Numerous transcription initiation regions are available that provide for constitutive or controllable, eg, inducible, transcription of structural gene function. The transcription / translation initiation region corresponding to such a structural gene is found immediately 5 'upstream of each start codon. Among the transcription initiation regions used in plants such as the T-DNA structural genes for nopaline and mannopine synthesis are the 19S and 35S promoters from CaMV and napin, ACP, SSU, PG, zein, phaseolin E 5 'upstream region from another plant gene. Enhanced promoters, such as dual 35S, are also available for expression of FtsZ sequences. For such applications, 5 '
When the upstream non-coding region is obtained from another gene that is regulated during seed maturation, those that are preferentially expressed in plant embryo tissue, such as the transcription initiation regulatory region from ACP and napin, are desirable. U.S. Patent Nos. 5,608,152 and 5530 issued.
Such "seed-specific promoters" can be obtained and used according to the teachings of No. 194, which is incorporated herein by reference. Transcription initiation regions that are preferentially expressed in seed tissue, ie, that are not detected in another plant part, may be desirable for TAG modification to minimize any disruption or adverse effects of the gene product.
【００７１】 制御転写終止領域を同様に本発明のＤＮＡ構築物により提供できる。転写終止
領域は植物のＦｔｓＺをコードするＤＮＡ配列または異なる遺伝子源に由来する
便宜的な転写終止領域、例えば天然に転写開始領域に結合する転写終止領域によ
り提供される。転写終止領域が異なる遺伝子源に由来する場合、それは終止領域
を誘導する構造遺伝子の３’配列の少なくとも約０．２５キロ塩基対、好ましく
は約１ないし３キロ塩基対を含有するであろう。A control transcription termination region can also be provided by the DNA constructs of the present invention. The transcription termination region may be provided by a DNA sequence encoding plant FtsZ or a convenient transcription termination region from a different gene source, for example, a transcription termination region that naturally binds to the transcription initiation region. If the transcription termination region is from a different gene source, it will contain at least about 0.25 kilobase pairs, preferably about 1-3 kilobase pairs, of the 3 'sequence of the structural gene that induces the termination region.
【００７２】 その発現を増加または減少させる目的のＤＮＡ配列として植物ＦｔｓＺを有す
る植物発現または転写構築物を、多様な植物生命体とりわけ食用および工業用の
植物油の製造に関与する植物生命体と共に用いることができる。とりわけ最も好
ましいものは温帯性脂肪種子作物である。目的の植物には菜種（カノーラおよび
高エルカ酸変種）、ヒマワリ、紅花、綿、大豆、ピーナッツ、ココナッツおよび
パーム油並びにトウモロコシなどがあるが、これらに限定するものではない。組
換え構築物を宿主細胞に導入する方法に依存して、別のＤＮＡ配列が必要になり
得る。重要なことに、本発明を双子葉性および単子葉性種同等物に適用でき、新
規および／または改良形質転換および制御技術に容易に適用できる。Use of a plant expression or transcription construct having plant FtsZ as the DNA sequence of interest to increase or decrease its expression may be used with a variety of plant organisms, especially those involved in the production of edible and industrial vegetable oils. it can. Most particularly preferred are temperate oilseed crops. Plants of interest include, but are not limited to, rapeseed (canola and high erucic acid varieties), sunflower, safflower, cotton, soy, peanut, coconut and palm oil, and corn. Alternative DNA sequences may be required depending on how the recombinant construct is introduced into the host cell. Importantly, the present invention is applicable to dicotyledonous and monocotyledonous species equivalents and is readily applicable to new and / or improved transformation and control techniques.
【００７３】 形質転換方法は本発明には重要でない；現在植物形質転換に種々の方法が利用
できる。穀類を形質転換するためにより新しい方法を利用できるので、本明細書
の以下でこれらを直接適用できる。例えば天然にアグロバクテリウウ感染に感受
性のある多くの植物種を、アグロバクテリウム媒介形質転換の三成分（ｔｒｉｐ
ａｒｔｉｔｅ）または二成分（ｂｉｎａｒｙ）ベクター法によりうまく形質転換
できる。加えて、マイクロインジェクション、ＤＮＡ粒子ボンバードメントおよ
びエレクトロポレーションの技術が発達し、種々の単子葉植物および双子葉植物
種の形質転換が可能になった。The method of transformation is not critical to the invention; various methods are currently available for plant transformation. As newer methods are available for transforming cereals, they can be applied directly hereafter. For example, many plant species that are naturally susceptible to Agrobacterium infection can be transformed into the three components of Agrobacterium-mediated transformation (trip).
artite) or binary (binary) vector methods. In addition, microinjection, DNA particle bombardment and electroporation techniques have been developed to enable the transformation of various monocot and dicot species.
【００７４】 ＤＮＡ構築物を発展させる時に、通常構築物またはそのフラグメントの構成成
分を細菌宿主例えば大腸菌内で複製できる便宜的なクローニングベクターに挿入
する。非常に多くのベクターが存在し、文献に記載されている。各々のクローニ
ングの後、プラスミドを単離し、さらなる操作例えば制限、新規フラグメントの
挿入、ライゲーション、欠失、挿入、切除等に供し、望ましい配列の構成要素を
つくることができる。一度構築が完了すると、次いで宿主細胞の形質転換法に従
ってそれを適当なベクターに移し、さらに操作できる。When developing a DNA construct, usually the components of the construct or a fragment thereof are inserted into a convenient cloning vector that can replicate in a bacterial host, such as E. coli. Numerous vectors exist and have been described in the literature. After each cloning, the plasmid can be isolated and subjected to further manipulations, such as restriction, insertion of new fragments, ligation, deletion, insertion, excision, etc., to produce the desired sequence components. Once the construction is complete, it can then be transferred to a suitable vector and further manipulated according to host cell transformation techniques.
【００７５】 通常、ＤＮＡ構築物と共に宿主細胞における発現のために必要な制御領域を有
し、形質転換した細胞を選別する構造遺伝子が含まれる。遺伝子は細胞毒性物質
例えば抗生物質、重金属、毒素等に対する抵抗性を提供でき、相補性により栄養
要求性宿主に原栄養性、ウイルス性免疫等が提供される。発現構築物またはその
構成成分が導入される異なる宿主の種の数に依存して、一つまたはそれ以上のマ
ーカーを用いることができ、異なる宿主に異なる選別条件を用いる。形質転換植
物細胞の選択に用いるマーカー、例えば種々抗生物質、除草剤等に対する抵抗性
を提供するものの数は増えている。本発明に特定のマーカーを用いる必要はなく
、特定の宿主および構築方法に依存したいずれかのマーカーが好ましい。Usually, together with the DNA construct, it contains a structural gene that has the necessary regulatory regions for expression in the host cell and selects transformed cells. Genes can provide resistance to cytotoxic agents such as antibiotics, heavy metals, toxins, and the like, and complementarity provides auxotrophic hosts with prototrophy, viral immunity, and the like. Depending on the number of different host species into which the expression construct or its components are introduced, one or more markers may be used, and different selection conditions for different hosts. The number of markers used to select transformed plant cells, such as those that provide resistance to various antibiotics, herbicides, etc., is increasing. It is not necessary to use a particular marker in the present invention, and any marker depending on the particular host and construction method is preferred.
【００７６】 前記するように、ＤＮＡ構築物を植物宿主に導入する方法は本発明では重要で
ない。有効な形質転換を提供するいずれかの方法をも用いることができる。植物
細胞を形質転換するための種々の方法には、Ｔｉ−またはＲｉ−プラスミド、マ
イクロインジェクション、エレクトロポレーション、ＤＮＡ粒子ボンバードメン
ト、リポソーム融合等の使用がある。多くの場合、構築物が片側または両側でＴ
−ＤＮＡにより縁取られる、とりわけ左および右のボーダーを有する、さらにと
りわけ右のボーダーを有するのが望ましい。構築物が形質転換の様式としてエイ
・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはエイ・リゾジェネス
（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用する場合、これは特に有用であるが、Ｔ−
ＤＮＡボーダーが別の形質転換様式で用いることができる。As mentioned above, the method of introducing the DNA construct into the plant host is not important in the present invention. Any method that provides for efficient transformation can be used. Various methods for transforming plant cells include the use of Ti- or Ri-plasmids, microinjection, electroporation, DNA particle bombardment, liposome fusion, and the like. In many cases, the construct has a T
-It is desirable to have the border bordered by DNA, especially the left and right borders, more particularly the right border. This is particularly useful when the construct uses A. tumefaciens or A. rhizogenes as the mode of transformation, although it is particularly useful.
DNA borders can be used in another transformation mode.
【００７７】 一度葉緑体の数および／または大きさが変化した細胞を含有するトランスジェ
ニック植物が得られると、次いでかかる細胞を含有する組織を色素体形質転換実
験に用いることができる。例えば、大きな色素体を有する細胞を含有する組織を
利用すると、色素体形質転換法において大きな標的を提供することになり、従っ
て植物細胞色素体への外来ＤＮＡの導入の可能性を高められる。Once a transgenic plant containing cells with altered numbers and / or sizes of chloroplasts is obtained, the tissue containing such cells can then be used for plastid transformation experiments. For example, the use of a tissue containing cells with large plastids will provide a large target in plastid transformation methods, thus increasing the possibility of introducing foreign DNA into plant cell plastids.
【００７８】 本発明の色素体形質転換において使用するためのＤＮＡ配列またはポリヌクレ
オチドは概して植物細胞色素体において機能的なプロモーターを含んでなる色素
体発現構築物を含有し、目的のＤＮＡ配列は形質転換された色素体細胞において
発現される。A DNA sequence or polynucleotide for use in the plastid transformation of the present invention generally comprises a plastid expression construct comprising a promoter functional in plant cell plastids, wherein the DNA sequence of interest is transformed. Is expressed in the treated plastid cells.
【００７９】 高等植物の色素体の形質転換に使用する構築物および方法はＺｏｕｂｅｎｋｏ
ら、（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１９）：３８１９−３８２４（１９
９４））、Ｓｖａｂら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：８５
２６−８５３０（１９９０）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９
０：９１３−９１７（１９９３）およびＳｔａｕｂら（ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６
０１−６０６（１９９３））に記載されている。核でコード化される色素体標的
Ｔ７ポリメラーゼの調節下でＤＮＡ配列を発現する高等植物の色素体の形質転換
に使用する構築物および方法は米国特許第５５７６１９８号に記載されている。
タバコの色素体ゲノムの完全ＤＮＡ配列はＳｈｉｎｏｚａｋｉら（ＥＭＢＯ Ｊ
．５：２０４３−２０４９（１９８６））により報告されている。The constructs and methods used to transform plastids of higher plants are described in Zoubenko.
Et al., (Nuc. Acids Res. 22 (19): 3819-3824 (19)
94)), Svab et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. 87:85).
26-8530 (1990) and Proc. Natl. Acad. Sci. 9
0: 913-917 (1993) and Staub et al. (EMBO J. 12: 6
01-606 (1993)). Constructs and methods used to transform higher plant plastids that express a DNA sequence under the control of a nuclear-encoded plastid target T7 polymerase are described in US Pat. No. 5,576,198.
The complete DNA sequence of the plastid genome of tobacco is available from Shinozaki et al. (EMBO J
. 5: 2043-2049 (1986)).
【００８０】 粒子ボンバードメントによるタバコ色素体ゲノムの安定な形質転換はＳｖｚｂ
ら（（１９９０）前記で引用）およびＳｖｚｂら（（１９９３）前記で引用）に
報告されている。そこに記載されている方法を用いて本明細書に記載されている
方法を用いる色素体発現構築物のための植物ホモプラスミックを得ることができ
る。簡単には、かかる方法は好ましくは代謝的に活性な色素体オルガネラ、例え
ば葉および子葉などの緑色植物組織が豊富にある組織からの標的宿主外植体のＤ
ＮＡボンバードメントに関係する。次いでボンバードメントを施した組織を細胞
分割促進培地で２日間培養する。次いで植物組織を阻害量の特定の選択物質およ
び特定のホルモン並びにその特定の植物種を再生させるために必要なその他の物
質を含有する選択培地に移す。例えば、前記の文献および本明細書で提供する実
施例において、選択マーカーは細菌性ａａｄＡ遺伝子であり、選択物質はスペク
チノマイシンである。ａａｄＡ生成物により、その葉緑体がマーカー遺伝子生成
物を含んでなる細胞が成長および緑化し続けることができるようになる。マーカ
ー遺伝子生成物を含有しない細胞は脱色される。ボンバードメントを施した外植
体はおよそ３ないし８週で緑色のシュートを形成する。次いでこれらのシュート
からの葉を同一の選択培地で継代培養し、ホモプラスミックなシュートの生成お
よび選択を確認する。シュートの形成の第二ラウンドの別法として、最初に選択
されたシュートを成熟植物になるまで成長させ、目的の遺伝子構築物にホモプラ
スティックな形質転換植物の提供に依り分断させることができる。Stable transformation of tobacco plastid genome by particle bombardment was performed by Svzb
((1990) cited above) and Svzb et al. ((1993) cited above). The methods described therein can be used to obtain plant homoplasmic for plastid expression constructs using the methods described herein. Briefly, such a method preferably involves the metabolic activation of target host explants from plastid organelles, eg, tissues rich in green plant tissue such as leaves and cotyledons.
Related to NA bombardment. Next, the tissue subjected to bombardment is cultured in a cell division promoting medium for 2 days. The plant tissue is then transferred to a selective medium containing an inhibitory amount of a particular selective substance and a particular hormone and other substances necessary to regenerate that particular plant species. For example, in the aforementioned references and in the examples provided herein, the selectable marker is the bacterial aadA gene and the selectable agent is spectinomycin. The aadA product allows cells whose chloroplasts comprise the marker gene product to continue to grow and green. Cells that do not contain the marker gene product are destained. Bombarded explants form green shoots at approximately 3 to 8 weeks. The leaves from these shoots are then subcultured on the same selection medium to confirm the production and selection of homoplasmic shoots. As an alternative to the second round of shoot formation, the initially selected shoot can be grown to a mature plant and disrupted by the genetic construct of interest by providing a homoplastic transformed plant.
【００８１】 次いでこのように選択した形質転換植物を分析して植物の全色素体内容物が形
質転換されているかどうかを決定できる（ホモプラスティック形質転換体）。典
型的には、シュート形成およびスペクチノマイシン選別の２ラウンドの後、分析
するトランスジェニック小植物のおよそ５０％が色素体ＤＮＡのサザンブロット
分析により決定されるようにホモプラスティックである。トランスジェニック色
素体表現型を分析し（ここで核ウイルス性ポリメラーゼ発現構築物はまた色素体
形質転換体にも存在する）、またはウイルス性ポリメラーゼ構築物をトランスプ
ラストム植物の核に形質転換する方法において使用するためにこれらの小植物を
さらに栽培させるために選択する。The transformed plants thus selected can then be analyzed to determine whether the entire plastid content of the plant has been transformed (homoplastic transformants). Typically, after two rounds of shoot formation and spectinomycin selection, approximately 50% of the transgenic plantlets analyzed are homoplastic as determined by Southern blot analysis of plastid DNA. Analyze the transgenic plastid phenotype (where the nuclear viral polymerase expression construct is also present in the plastid transformant), or use in the method of transforming the viral polymerase construct into the nucleus of a transplastomic plant These plantlets are selected for further cultivation.
【００８２】 本発明の方法はホモプラスミック植物を得るためのより効果的な研究方法を提
供する。野生型植物細胞は典型的には細胞あたり５０ないし１００個の色素体を
含有する。しかしながら、一度トランスプラストム植物が得られると植物細胞の
核に含有されるＤＮＡ配列をトランスプラストム細胞から抹消できる。変化する
ようにコード化された核に形質転換されたＤＮＡ配列を形質転換色素体を含有す
る植物から抹消できる。一度ＤＮＡ配列が抹消されると、宿主植物細胞の色素体
を分割し、正常な（すなわち野生型の）色素体の大きさおよび数に戻すことがで
きる。色素体発現構築物が抵抗性を提供する選択物質を適用することにより、外
来ＤＮＡを含有する色素体の純粋な集団を含有する細胞が得られる。The method of the present invention provides a more effective research method for obtaining homoplasmic plants. Wild type plant cells typically contain 50-100 plastids per cell. However, once a transplastom plant is obtained, the DNA sequence contained in the nucleus of the plant cell can be deleted from the transplastom cell. Alteredly encoded nucleus-transformed DNA sequences can be deleted from plants containing transformed plastids. Once the DNA sequence is deleted, the plastids of the host plant cells can be split back to normal (ie, wild-type) plastid size and number. By applying a selection agent to which the plastid expression construct provides resistance, cells containing a pure population of plastids containing foreign DNA are obtained.
【００８３】 色素体形質転換において使用されるベクターが、色素体発現構築物および選択
マーカー構築物の色素体ゲノムへの安定した移動を提供する手段を含むのが好ま
しい。これは標的色素体ゲノムに相同な領域により最も便宜的に提供される。相
同領域は構築物をフランキングし、ゲノムへの二重交差による相同組換えにより
色素体ゲノムへ移動させる、および移動に備える。タバコの色素体ゲノムの完全
ＤＮＡ配列について報告されている（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．５
：２０４３−２０４９（１９８６））。苔類（Ｏｈｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ
３２２：５７２−５７４（１９８６））および米（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら、Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１７：１８５−１９４（１９８９））からの色素体
ゲノムの完全ＤＮＡ配列もまた報告されている。[0083] Preferably, the vectors used in plastid transformation include means for providing stable transfer of the plastid expression construct and the selectable marker construct to the plastid genome. This is most conveniently provided by regions homologous to the target plastid genome. The homologous region flanks the construct, moves it to the plastid genome by homologous recombination by double crossover into the genome, and prepares for it. The complete DNA sequence of the tobacco plastid genome has been reported (Shinozaki et al., EMBO J. 5).
: 2043-2049 (1986)). Moss (Ohyama et al., Nature
322: 572-574 (1986)) and rice (Hiratsuka et al., Mo.
l. Gen. Genet. 217: 185-194 (1989)), the complete DNA sequence of the plastid genome has also been reported.
【００８４】 色素体ゲノムの逆向き反復配列（ＩＲＡおよびＩＲＢとして周知）に相同領域
が存在する場合、形質転換色素体あたり導入遺伝子の２個のコピーが予測される
。色素体ゲノムの逆向き反復配列の外側に相同領域が存在する場合、形質転換色
素体あたり導入遺伝子の１個のコピーが予測される。色素体ゲノム内の相同領域
はおよそ１キロ塩基対の大きさである。より小さい相同領域を用いることもでき
、１００塩基対ほどの小さい領域を色素体ゲノムへの相同組換えに提供できる。
しかしながら、組換えの頻度、従って形質転換色素体を有する植物を得る頻度が
相同領域の大きさの低下と共に減少する。タバコ色素体形質転換のためのかかる
相同領域を含んでなる構築物の実例はＳｖａｂら（（１９９０）前記で引用）お
よびＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ（（１９９３）前記で引用）に記載されている
。タバコおよびアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）色素体ゲノムへの組換えに有用
な領域については以下の実施例でも記載する。標的植物種からの色素体ＤＮＡを
用いて類似の相同組換えおよび選択構築物を調製できる。When there are homologous regions in the inverted repeats of the plastid genome (known as IRA and IRB), two copies of the transgene are expected per transformed plastid. If there is a homologous region outside the inverted repeats of the plastid genome, one copy of the transgene is expected per transformed plastid. The homologous region in the plastid genome is approximately 1 kilobase pair in size. Smaller regions of homology can be used, and regions as small as 100 base pairs can be provided for homologous recombination into the plastid genome.
However, the frequency of recombination, and thus the frequency of obtaining plants with transformed plastids, decreases with decreasing size of the homologous region. Illustrative constructs comprising such homologous regions for tobacco plastid transformation are described in Svab et al. ((1990) supra) and Svab and Maliga ((1993) supra). Regions useful for recombination into tobacco and Brassica plastid genomes are also described in the Examples below. Similar homologous recombination and selection constructs can be prepared using plastid DNA from target plant species.
【００８５】 色素体ゲノムへの別の移動手段をも本明細書にて考慮し、例えば転位因子の使
用に関わる方法による。例えば色素体ゲノムに移動させる構築物を植物色素体に
おいて機能する転位マーカーからの逆向き反復配列によりフランキングできる。
標的ＤＮＡを色素体に移動させるのに必要なトランスポザーゼの一過性発現を提
供するＤＮＡ構築物をまた葉緑体に導入する。この方法では、色素体ゲノムの種
々の位置への発現構築物の挿入の結果生じ得る位置効果に依存して、同一の発現
構築物で形質転換された植物において種々の表現型を得ることができる。かかる
プラスチック形質転換法において使用するための適当なトランスポゾンには細菌
性Ｔｎ１０、バクテリオファージＭｕおよびその他の種々の既知細菌性トランス
ポゾンなどがある。Other means of transfer to the plastid genome are also contemplated herein, for example, by methods involving the use of transposable elements. For example, constructs that move into the plastid genome can be flanked by inverted repeats from transposition markers that function in plant plastids.
A DNA construct that provides the transient expression of the transposase necessary to transfer the target DNA to the plastid is also introduced into the chloroplast. In this way, different phenotypes can be obtained in plants transformed with the same expression construct, depending on the position effects that can result from insertion of the expression construct into various positions in the plastid genome. Suitable transposons for use in such plastic transformation methods include bacterial Tn10, bacteriophage Mu, and various other known bacterial transposons.
【００８６】 色素体プロモーター発現構築物における目的のＤＮＡ配列は特定の構造遺伝子
の発現に適応するコード化配列でよく、構造遺伝子配列によりコードされるタン
パク質は形質転換色素体において生成される。加えて、単一の色素体プロモータ
ー領域から幾つかの遺伝子発現のためのオペロンが作られるように、目的のＤＮ
Ａ配列が幾つかの個々の構造遺伝子コード化領域を含むことができる。このよう
に、操作したまたは合成オペロンから、または予め存在する原核生物遺伝子クラ
スターから複数の遺伝子を導入および発現することが可能である。かかる方法に
より、特定の望ましい植物組織または特定の発達段階で、特異的ウイルス性ポリ
メラーゼの核発現を誘導するのに用いられるプロモーターに依存して、貴重なタ
ンパク質および精密化学製品の大規模で安価な製造が可能になろう。色素体取り
込みのためのコード化された一過性ペプチド並びに適当なプロモーターおよび終
止シグナルを含むモノシストロンに各々の遺伝子を操作しなければならないので
、標準的な核形質転換法によるこのような研究法は現実的ではない。結果的に、
遺伝子発現レベルはシストロン間で非常に広範にわたると予測され、いくつかの
トランスジェニック植物系を作る必要があろう。最後にはこれらのシストロンの
全てを１個の植物に導入し、標的生化学的経路に発現させるのに交雑が必要とな
ろう。[0086] The DNA sequence of interest in the plastid promoter expression construct may be a coding sequence adapted for expression of a particular structural gene, and the protein encoded by the structural gene sequence is produced in the transformed plastid. In addition, the DNP of interest may be constructed such that a single plastid promoter region creates operons for the expression of several genes.
The A sequence can include several individual structural gene coding regions. In this way, it is possible to introduce and express multiple genes from engineered or synthetic operons or from pre-existing prokaryotic gene clusters. By such methods, depending on the promoter used to drive nuclear expression of specific viral polymerases at certain desired plant tissues or at particular developmental stages, large-scale, inexpensive, valuable proteins and fine chemicals can be obtained. Manufacturing will be possible. Such an approach by standard nuclear transformation methods requires the manipulation of each gene into a monocistron containing an encoded transient peptide for plastid uptake and an appropriate promoter and termination signal. Is not realistic. as a result,
Gene expression levels are expected to be very wide between cistrons and some transgenic plant lines will need to be created. Eventually, crossing would be required to introduce all of these cistrons into a single plant and express it in the target biochemical pathway.
【００８７】 別法として、色素体構築物における目的のＤＮＡ配列は内因性遺伝子ｍＲＮＡ
に相補的なＲＮＡが形質転換色素体において生成されるように適応させた内因性
色素体遺伝子のフラグメントでよい。かかるアンチセンス構築物を用いて標的色
素体遺伝子の発現を減少させることができる。[0087] Alternatively, the DNA sequence of interest in the plastid construct may be an endogenous gene mRNA.
May be a fragment of the endogenous plastid gene adapted to produce RNA in the transformed plastid. Such antisense constructs can be used to reduce expression of the target plastid gene.
【００８８】 色素体形質転換の後に望ましい植物細胞を選択する手段を提供するために、色
素体形質転換のためのポリヌクレオチドがマーカー遺伝子を発現するために提供
される構築物をも含有する。マーカー遺伝子生成物の発現によりマーカータンパ
ク質を発現する色素体オルガネラを含んでなる植物細胞の選択が可能になる。本
明細書において提供する実施例において、細菌性ａｄｄＡ遺伝子は葉緑体５’プ
ロモーターおよび３’転写終止領域の制御調節下で発現される。植物細胞の色素
体形質転換のためのかかる発現構築物の使用についてはＳｖａｂおよびＭａｌｉ
ｇａ（（１９９３）前記で引用）により記載されている。ａｄｄＡ遺伝子の発現
によりスペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する抵抗性が付与され
、従って、このマーカー遺伝子を発現する植物細胞を同定できる。ａｄｄＡマー
カー遺伝子の選別はストレプトマイシン、より好ましくはスペクチノマイシンの
存在により植物成長培地において脱色されない植物細胞を同定することに基づく
。葉緑体代謝に関与する生成物をコードする別の遺伝子を選択マーカーとして用
いることもできる。例えば、植物除草剤例えばグリフォセート、ブロモキシニル
またはイミダゾリノンに対する抵抗性を提供する遺伝子を特定の用途に見出すこ
とができる。かかる遺伝子についてはＳｔａｌｋｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６０：４７２４−４７２８（１９８５）；グリフォセート抵抗性ＥＰＳＰ
）、Ｓｔａｌｋｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３１０−６３１４
（１９８５）；ブロモキシニル抵抗性ニトリラーゼ遺伝子）およびＳａｔｈａｓ
ｉｖａｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃａｄｓ．Ｒｅｓ．１８：２１８８（１９９０）；Ａ
ＨＡＳイミダゾリノン抵抗性遺伝子）により報告されている。To provide a means of selecting the desired plant cells after plastid transformation, polynucleotides for plastid transformation also include constructs provided for expressing the marker gene. Expression of the marker gene product allows for the selection of plant cells comprising plastid organelles that express the marker protein. In the examples provided herein, the bacterial addA gene is expressed under the control of a chloroplast 5 'promoter and 3' transcription termination region. See Svab and Mali for the use of such expression constructs for plastid transformation of plant cells.
ga (cited above (1993)). Expression of the addA gene confers resistance to spectinomycin and streptomycin, and therefore, identifies plant cells that express this marker gene. Selection for the addA marker gene is based on identifying plant cells that are not decolorized in the plant growth medium due to the presence of streptomycin, more preferably spectinomycin. Another gene encoding a product involved in chloroplast metabolism can also be used as a selectable marker. For example, genes that provide resistance to plant herbicides such as glyphosate, bromoxynil or imidazolinone can be found for particular uses. For such genes, see Stalker et al. (J. Biol. Che.
m. 260: 4724-4728 (1985); glyphosate resistant EPSP
), Stalker et al. (J. Biol. Chem. 263: 6310-6314).
(1985); bromoxynil-resistant nitrilase gene) and Sathas
ivan et al. (Nucl. Acads. Res. 18: 2188 (1990); A
HAS imidazolinone resistance gene).
【００８９】 本発明はまたグリフォセート含有培地での色素体形質転換植物を得る方法をも
提供する。形質転換の最初の事象では植物細胞に多く存在するうちの数個の色素
体のみが形質転換され、従ってグリフォセート抵抗性マーカー遺伝子生成物を発
現することができる。細胞内の残りの形質転換されなかった色素体はグリフォセ
ートの影響に対して無防備のままである。従って、細胞は形質転換色素体を含有
するが、形質転換された再生体を上昇させる形質転換カルス組織を再生できない
形質転換色素体を分割および分類することができない。このように細胞内の色素
体数を１個または数個に減少させるいずれかの方法はグリフォセートの影響下で
生存させる可能性を有し、色素体形質転換の選択マーカーとして有用である。The present invention also provides a method for obtaining a plastid-transformed plant on a glyphosate-containing medium. In the first event of transformation, only a few of the plastids that are abundant in plant cells are transformed, and thus can express the glyphosate resistance marker gene product. The remaining untransformed plastids in the cells remain vulnerable to the effects of glyphosate. Thus, the cells contain transformed plastids but cannot split and sort transformed plastids that cannot regenerate transformed callus tissue that elevates transformed regenerants. Thus, any method that reduces the number of plastids in a cell to one or several has the potential to survive under the influence of glyphosate and is useful as a selectable marker for plastid transformation.
【００９０】 以下の実施例は説明のために提供するものであり、限定するためのものではな
い。The following examples are provided by way of illustration, and not by way of limitation.
【００９１】 実施例 実施例１：植物ｆｔｓＺ配列の同定 細菌性ＦｔｓＺ植物相同体のアンチセンスおよび／またはセンス発現を用いて
色素体の数および／または大きさが変化した植物組織源を得るために、公開され
、独占権が与えられた配列データベースを大豆、米、アラビドソプシス（Ａｒａ
ｂｉｄｓｏｐｓｉｓ）、トウモロコシおよびアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）に
おける相同性配列に関して問い合わせる。以前に二つの型の植物ＦｔｓＺタンパ
ク質がジーンバンクで同定されており、ＦｔｓＺ Ｉ型タンパク質が受け入れ番
号ｇｉｌ１０７９７３１（配列番号３２）により例示されており、これは色素体
内に移入されるようであり、一方ＦｔｓＺ ＩＩ型タンパク質が受け入れ番号ｇ
ｉｌ３６０８４９４（配列番号３３）およびｇｉｌ６８３５２４（配列番号３４
）により例示されており、これは細胞質に留まるようである。両方のＦｔｓＺ
Ｉ型配列の相同体およびＦｔｓＺ ＩＩ型遺伝子相同体について以下に記載する
。データベースを検索するのに用いた配列は：ＦｔｓＺ Ｉ型相同体検索では（
配列番号３２）およびＦｔｓＺ ＩＩ型検索では（配列番号３３）を用いた。EXAMPLES Example 1 Identification of Plant ftsZ Sequences To Obtain Plant Tissue Sources with Altered Number and / or Size of Plastids Using Antisense and / or Sense Expression of a Bacterial FtsZ Plant Homolog A publicly available and exclusivity sequence database for soy, rice and arabidosopsis (Ara)
bidsopsis, corn and Brassica. Previously, two types of plant FtsZ proteins have been identified in the gene bank, and the FtsZ type I protein is exemplified by accession number gil1079731 (SEQ ID NO: 32), which appears to be imported into plastids, while FtsZ type II protein has accession number g
il3608494 (SEQ ID NO: 33) and gil683524 (SEQ ID NO: 34)
), Which appear to remain in the cytoplasm. Both FtsZ
The homologs of the type I sequence and the FtsZ type II gene homolog are described below. The sequence used to search the database was: FtsZ type I homolog search (
(SEQ ID NO: 32) and (SEQ ID NO: 33) were used in the FtsZ type II search.
【００９２】 アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）から得られた配列を含有する独占
データベースで実施した検索によりＦｔｓＺ１配列に関連するＤＮＡ配列を同定
した。配列番号１の配列をＡｔＦｔｓＺ１と同定する。配列番号１によりコード
される推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。加えて一つの配列（配列番号３）
をＦｔｓＺ２配列に関連する配列として同定した。配列番号３によりコードされ
る推定アミノ酸配列を配列番号４に示す。A DNA sequence related to the FtsZ1 sequence was identified by a search performed on a proprietary database containing sequences obtained from Arabidopsis. The sequence of SEQ ID NO: 1 is identified as AtFtsZ1. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2. In addition, one sequence (SEQ ID NO: 3)
Was identified as a sequence related to the FtsZ2 sequence. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 3 is shown in SEQ ID NO: 4.
【００９３】 またアブラナ属から得られた配列を含むデータベースにおいても配列を同定し
た。１個の配列をアラビドプシスＦｒｓＺ１配列に関連する配列として同定した
。２個の配列間の配列アラインメントに基づいて、およそ１７０個のアミノ酸が
Ｎ末端でアブラナ属配列から喪失していると予測された。アブラナ属ＦｔｓＺ１
（ＢｎＦｔｓＺ１）遺伝子のコーディング配列全長を得るために、ＳＣ２５８（
配列番号３５）およびＳＣ２５９（配列番号３６）を用いてアブラナ属の葉から
得られたＤＮＡを用いるＲＡＣＥ ＰＣＲを実施した。一つの反応生成物が最も
多く５’配列（配列番号７０）を含有することが見出され、これを用いてＢｎＦ
ｔｓＺ１（配列番号５）と称する配列全長を生成した。ＢｎＦｔｓＺ１によりコ
ードされる推定アミノ酸配列を配列番号６に示す。The sequences were also identified in a database containing sequences obtained from Brassica. One sequence was identified as a sequence related to the Arabidopsis FrsZ1 sequence. Based on sequence alignment between the two sequences, approximately 170 amino acids were predicted to be missing from the Brassica sequence at the N-terminus. Brassica FtsZ1
To obtain the full length coding sequence of the (BnFtsZ1) gene, SC258 (
RACE PCR using DNA obtained from Brassica leaves was performed using SEQ ID NO: 35) and SC259 (SEQ ID NO: 36). One reaction product was found to contain the most 5 'sequence (SEQ ID NO: 70), which was used to generate BnF
A full-length sequence, called tsZ1 (SEQ ID NO: 5) was generated. The deduced amino acid sequence encoded by BnFtsZ1 is shown in SEQ ID NO: 6.
【００９４】 またアラビドプシスＦｔｓＺ１配列の保存アミノ酸ドメインを企図するプライ
マーを用いるＰＣＲでＦｔｓＺ１相同体をタバコにおいて同定した。用いたＰＣ
ＲプライマーをＳＣ２５２（配列番号３７）、ＳＣ２５３（配列番号３８）、Ｓ
Ｃ２５４（配列番号３９）およびＳＣ２５５（配列番号４０）として同定する。
反応生成物をＴＯＰＯ ＴＡ（インビトローゲン）にクローン化し、ｘａｎｔｈ
ｉｌ−２６−コンティグ（配列番号７）と称する単一のクローンが最も多くの配
列を含有した。タバコＦｔｓＺ１相同体のコーディング配列全長を得るために、
ＲＡＣＥ ＰＣＲに用いるためのさらなるプライマーを設計した。５’領域を増
幅するために、プライマーＳＣ２９１（配列番号４１）およびＳＣ２９２（配列
番号４２）を用い、３’配列を増幅するために、プライマーＳＣ２９３（配列番
号４３）およびＳＣ２９４（配列番号４４）を用いた。ＰＣＲ生成物をＴＯＰＯ
ＴＡにクローン化し、シークエンシングした。最も多量の５’配列およびｘａ
ｎｔｈｉｌ−２６−コンティグとの重複を含有したので、クローンｘａｎｆｔｓ
Ｚ１−５’−１５（配列番号７１）を５’タバコＦｔｓＺ１配列に最良であると
して選択した。この配列をｘａｎｔｈｉｌ−２６−コンティグと組合わせて、ｘ
ａｎＦｔｓＺ１（配列番号８）を製造した。推定アミノ酸配列を配列番号９に示
す。[0094] FtsZ1 homologues were also identified in tobacco by PCR using primers conserving the conserved amino acid domain of the Arabidopsis FtsZ1 sequence. PC used
R primers were SC252 (SEQ ID NO: 37), SC253 (SEQ ID NO: 38), S
Identified as C254 (SEQ ID NO: 39) and SC255 (SEQ ID NO: 40).
The reaction product was cloned into TOPO TA (Invitrogen) and
A single clone, designated il-26-contig (SEQ ID NO: 7), contained the most sequence. To obtain the full length coding sequence of the tobacco FtsZ1 homolog,
Additional primers were designed for use in RACE PCR. Primers SC291 (SEQ ID NO: 41) and SC292 (SEQ ID NO: 42) were used to amplify the 5 'region, and primers SC293 (SEQ ID NO: 43) and SC294 (SEQ ID NO: 44) were used to amplify the 3' sequence. Using. TOPO PCR product
Cloned into TA and sequenced. Most abundant 5 'sequence and xa
clone xanfts because it contained an overlap with
Z1-5'-15 (SEQ ID NO: 71) was selected as the best for the 5 'tobacco FtsZ1 sequence. Combining this sequence with xanthil-26-contig, x
anFtsZ1 (SEQ ID NO: 8) was produced. The deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 9.
【００９５】 アラビドプシスＦｔｓＺ１およびＦｔｓＺ２アミノ酸配列を用いるＢＬＡＳＴ
検索によりトウモロコシから得られたＤＮＡ配列を含有するデータベースにおい
てＦｔｓＺ相同配列を同定した。これらのＦｔｓＺ配列に関連する配列として１
０個の配列を同定し、配列番号１０ないし１９に示す。クローンを整列させると
６個のコンティグが示され、各々の最も代表的なクローンをさらなる分析のため
に選択した。配列番号１０の配列分析により、アラビドプシスＦｔｓＺ１と比較
した場合、ＡｔＦｔｓＺ１に対する高度な相同性が示され、Ｎ末端で１５８個の
アミノ酸が喪失していると予測された。クローン配列番号１３は５’末端で１５
３個のヌクレオチドに関して配列番号１０と完全に重複していることが見出され
、５’末端で１６７個のさらなるヌクレオチドを有し、これはアラビドプシスＦ
ｔｓＺ１と相同なアミノ酸を有する。しかしながら、このクローンはまたＦｔｓ
Ｚ全長をコードするとは予測されず、さらにアラビドプシスＦｓＺ１と比較した
場合、Ｎ末端で１１３個のアミノ酸を喪失していた。興味深いことに、配列番号
１３のクローンに関しては、配列番号１０との相同性は１６７ヌクレオチド位置
で終了し、逸脱する。これはイントロン配列の存在かまたは新規クラスのＦｔｓ
Ｚタンパク質のいずれかを示しているであろう。ＲＡＣＥ ＰＣＲにより、プラ
イマーＳＣ３２１（配列番号４５）はトウモロコシＦｔｓＺ１配列の喪失を引き
伸ばすように設計された。BLAST Using Arabidopsis FtsZ1 and FtsZ2 Amino Acid Sequences
The search identified FtsZ homologous sequences in a database containing DNA sequences obtained from corn. The sequence related to these FtsZ sequences is 1
Zero sequences were identified and are shown in SEQ ID NOs: 10-19. Aligning the clones showed 6 contigs, and each most representative clone was selected for further analysis. Sequence analysis of SEQ ID NO: 10 showed a high degree of homology to AtFtsZ1 when compared to Arabidopsis FtsZ1, predicting a loss of 158 amino acids at the N-terminus. Clone SEQ ID NO: 13 has 15 at the 5 'end.
It was found to completely overlap SEQ ID NO: 10 for three nucleotides and has 167 additional nucleotides at the 5 'end, which
It has amino acids homologous to tsZ1. However, this clone also contains Fts
It was not predicted to encode the full length Z, and lost 113 amino acids at the N-terminus when compared to Arabidopsis FsZ1. Interestingly, for the clone of SEQ ID NO: 13, the homology with SEQ ID NO: 10 ends at position 167 nucleotides and deviates. This may be due to the presence of intronic sequences or a new class of Fts
It may indicate any of the Z proteins. By RACE PCR, primer SC321 (SEQ ID NO: 45) was designed to prolong the loss of corn FtsZ1 sequence.
【００９６】 配列番号１８の配列分析によりＦｔｓＺ２に対する高度な相同性が示され、ア
ラビドプシスＦｔｓＺ２と比較した場合、これは全長ではなく、Ｎ末端で約２８
６個のアミノ酸を喪失しているとも予測された。ＲＡＣＥ ＰＣＲにより、プラ
イマーＳＣ３２２（配列番号４６）はトウモロコシＦｔｓＺ２配列の喪失を引き
伸ばすように設計された。しかしながら、配列番号１４および配列番号１５はＦ
ｔｓＺ２と最も高いＢＬＡＳＴスコアを有すると同定された。[0096] Sequence analysis of SEQ ID NO: 18 shows a high degree of homology to FtsZ2, which when compared to Arabidopsis FtsZ2 is not full-length but about 28
It was also predicted that six amino acids had been lost. By RACE PCR, primer SC322 (SEQ ID NO: 46) was designed to prolong the loss of corn FtsZ2 sequence. However, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15
tsZ2 and the highest BLAST score.
【００９７】 アラビドプシスＦｔｓＺ１およびＦｔｓＺ２アミノ酸配列を用いてＢＬＡＳＴ
検索によりデータベースにおいて大豆ＦｔｓＺ相同配列を同定した。１２個の配
列が得られ、配列番号２０ないし３１に示す。配列番号２０、配列番号２４およ
び配列番号２５の配列分析により、アラビドプシスＦｔｓＺ１と比較した場合、
ＦｔｓＺ１に対する高度な相同性が示されたが、全長ではなかった。配列番号２
５はＮ末端で最も長い配列を有し、アラビドプシスＦｔｓＺ１配列と比較した場
合、Ｎ末端で６４個のアミノ酸が喪失していると予測された。配列番号２０、配
列番号２４および配列番号２５の配列を用いて重複領域を訂正した。今度はＤＮ
Ａ配列全長を得るために末端を増幅するようにＲＡＣＥ ＰＣＲプライマーを設
計できる。BLAST was performed using the Arabidopsis FtsZ1 and FtsZ2 amino acid sequences.
A search identified a soybean FtsZ homologous sequence in the database. Twelve sequences were obtained and are shown in SEQ ID NOs: 20-31. By sequence analysis of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25, when compared to Arabidopsis FtsZ1,
A high degree of homology to FtsZ1 was shown, but not full length. SEQ ID NO: 2
5 has the longest sequence at the N-terminus and was predicted to have lost 64 amino acids at the N-terminus when compared to the Arabidopsis FtsZ1 sequence. The overlapping regions were corrected using the sequences of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25. This time DN
RACE PCR primers can be designed to amplify the ends to obtain the full A sequence.
【００９８】 アラビドプシス、アブラナ属、タバコ、大豆およびトウモロコシＦｔｓＺ１タ
ンパク質配列間の配列アラインメントを図１に示す。A sequence alignment between the Arabidopsis, Brassica, tobacco, soy and maize FtsZ1 protein sequences is shown in FIG.
【００９９】 実施例２：植物発現構築物の調製 ２Ａ．核発現構築物 色素体の大きさおよび／または形質転換植物細胞の数の変更のための植物細胞
核内への形質転換のために構築物を調製する。構築物は、構成的に、または組織
特異的様式で、たとえば葉組織または種子組織内で色素体を変化させて調製でき
る。Example 2: Preparation of a plant expression construct 2A. Nuclear Expression Constructs Constructs are prepared for transformation into plant cell nuclei for alteration of plastid size and / or number of transformed plant cells. Constructs can be prepared constitutively or in a tissue-specific manner, eg, by altering plastids in leaf or seed tissue.
【０１００】 （本明細書で参考文献としてその全体が組み込まれている米国特許第５，６３
９，７９０号に記述された）ｐＣＧＮ３２２３由来のナピンカセットを含むプラ
スミドを、多数の制限部位を含んでいる大きなＤＮＡ断片をクローニングするの
により有用になるように、そして、多数のナピン融合遺伝子を植物二元形質転換
ベクター内に入れるために、改変した。配列ＣＧＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧ
ＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＴ
ＡＡＡＴ（配列番号４７）の自己アニールしたオリゴヌクレオチドからなるアダ
プターを、制限エンドヌクレアーゼＢｓｓＨＩＩでの消化の後にクローニングベ
クターｐＢＣ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内にライゲーションし、ベクタ
ーｐＣＧＮ７７６５を構築した。プラスミドｐＣＧＮ３２２３およびｐＣＧＮ７
７６５をＮｏｔＩにて消化し、共にライゲーションした。得られたベクターｐＣ
ＧＮ７７７０は、ｐＣＧＮ３２２３からのナピン種子特異的発現カセットを持つ
ｐＣＧＮ７７６５骨格を含む。(US Pat. No. 5,633, incorporated herein by reference in its entirety)
The plasmid containing the napin cassette from pCGN3223 (described in US Pat. No. 9,790) was made more useful for cloning large DNA fragments containing multiple restriction sites, and multiple napin fusion genes were cloned. Modified for inclusion in the plant binary transformation vector. Sequence CGCGATTTAAATGGGCG
CGCCCTGCAGGCGGCCGCCTGCAGGGCGCGCCATTT
An adapter consisting of a self-annealed oligonucleotide of AAAT (SEQ ID NO: 47) was ligated into the cloning vector pBC SK + (Stratagene) after digestion with the restriction endonuclease BssHII to construct the vector pCGN7765. Plasmids pCGN3223 and pCGN7
765 was digested with NotI and ligated together. The resulting vector pC
GN7770 contains a pCGN7765 backbone with a napin seed-specific expression cassette from pCGN3223.
【０１０１】 ｐＣＧＮ７７７０のナピン調節領域の発現を除き、本質的にｐＣＧＮ７７７０
と同様の調節要素である、クローニングカセットｐＣＧＮ７７８７を、２つのＣ
ＡＭＶ ３５Ｓプロモーターおよびｔｍｌポリアデニル化および転写終止領域と
置き換えた。Except for the expression of the napin regulatory region of pCGN7770, essentially pCGN7770
The cloning cassette pCGN7787, a regulatory element similar to that of
Replaced with AMV 35S promoter and tml polyadenylation and transcription termination region.
【０１０２】 植物形質転換のための二元ベクター、ｐＣＧＮ５１３９は、ｐＣＧＮ１５５８
より構築された（ＭｃＢｒｉｄｅ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ，（１９９０
）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４：２６９−２７６）
。ｐＣＧＮ１５５８のポリリンカーを、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８断片とし
て、固有の制限エンドヌクレオアーゼ部位、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＸｂａＩ、Ｓ
ｗａＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを含むポリリンカーで置換した。Ａｓｐ７１
８およびＨｉｎｄＩＩＩ制限ヌクレアーゼ部位はｐＣＧＮ５１３９内に残ってい
る。A binary vector for plant transformation, pCGN5139, is pCGN1558.
(McBride and Summerfeld, (1990)
) Plant Molecular Biology, 14: 269-276)
. The polylinker of pCGN1558 was converted to a unique restriction endonuclease site, HindIII / Asp718 fragment, AscI, PacI, XbaI, S
Replaced with a polylinker containing waI, BamHI and NotI. Asp71
8 and HindIII restriction nuclease sites remain in pCGN5139.
【０１０３】 ターボ二元ベクターの群を、ＤＮＡ配列の、転写開始領域（プロモーター）お
よび転写終止領域を含む二元ベクター内に素早くクローニングすることを可能に
するように構築する。[0103] A group of turbo binary vectors is constructed that allows for the rapid cloning of DNA sequences into a binary vector containing a transcription initiation region (promoter) and a transcription termination region.
【０１０４】 プラスミドｐＣＧＮ８６１８を、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＧＧＡＴ
ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号４８）お
よび５’−ＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣ
Ｃ−３’（配列番号４９）を、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＣＧＮ７７７０内にラ
イゲーションすることで構築した。ナピンプロモーター、ポリリンカーおよびナ
ピン３’領域を含む断片を、Ａｓｐ７１８Ｉでの消化によってｐＣＧＮ８６１８
より切り取り、この断片を、Ｋｌｅｎｏｗで５’オーバーハングを埋めることで
平滑末端化し、次いでＡｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＧＮ
５１３９内にライゲーションし、Ｋｌｅｎｏｗ断片で５’オーバーハングを埋め
て平滑末端化した。ナピンプロモーターがｐＣＧＮ５１３９の平滑化したＡｓｐ
７１８Ｉ部位に最も近く、ナピン３’が、平滑化したＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も
近いように向いた挿入物を含むプラスミドを、配列解析にかけ、挿入物の方向お
よびクローニング結合部の完全性の両方を確かめた。得られたプラスミドをｐＣ
ＧＮ８６２２と命名した。Plasmid pCGN8618 was replaced with oligonucleotide 5′-TCGAGGAT
CCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3 '(SEQ ID NO: 48) and 5'-TCGACCTGCAGGGAAGCTTGCGGCCGCGGATC
C-3 '(SEQ ID NO: 49) was constructed by ligating into SalI / XhoI digested pCGN7770. The fragment containing the napin promoter, polylinker and napin 3 'region was digested with Asp718I to pCGN8618.
This fragment was blunt-ended by filling in the 5 'overhang with Klenow, then pCGN digested with Asp718I and HindIII.
It was ligated into 5139, and the 5 'overhang was filled in with a Klenow fragment to make it blunt-ended. Aspin with a blunted Napin promoter of pCGN5139
Plasmids containing the insert closest to the 718I site and the napin 3 'oriented closest to the blunted HindIII site were subjected to sequence analysis to confirm both the orientation of the insert and the integrity of the cloning junction. . The resulting plasmid is called pC
GN8622.
【０１０５】 プラスミドｐＣＧＮ８６１９を、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＣＣＴＧ
ＣＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号５０）お
よび５’−ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧ
Ｇ−３’（配列番号５１）を、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＣＧＮ７７７０内にラ
イゲーションすることで構築した。ナピンプロモーター、ポリリンカーおよびナ
ピン３’領域を含む断片を、Ａｓｐ７１８Ｉでの消化によってｐＣＧＮ８６１９
より切りとり、この断片を、Ｋｌｅｎｏｗで５’オーバーハングを埋めることで
平滑末端化し、次いでＡｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＧＮ
５１３９内にライゲーションし、Ｋｌｅｎｏｗ断片で５’オーバーハングを埋め
て平滑末端化した。ナピンプロモーターがｐＣＧＮ５１３９の平滑化したＡｓｐ
７１８Ｉ部位に最も近く、ナピン３’が、平滑化したＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も
近いように向いた挿入物を含むプラスミドを、配列解析にかけ、挿入物の方向お
よびクローニング結合部の完全性の両方を確かめた。得られたプラスミドをｐＣ
ＧＮ８６２３と命名した。Plasmid pCGN8619 was replaced with oligonucleotide 5′-TCGACCTG
CAGGAAGCTTGCGGGCCGCGGATCC-3 ′ (SEQ ID NO: 50) and 5′-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGGCAG
G-3 ′ (SEQ ID NO: 51) was constructed by ligating into SalI / XhoI digested pCGN7770. The fragment containing the napin promoter, polylinker and napin 3 'region was digested with Asp718I to give pCGN8619
This fragment was blunt-ended by filling in the 5 'overhang with Klenow, then pCGN digested with Asp718I and HindIII.
It was ligated into 5139, and the 5 'overhang was filled in with a Klenow fragment to make it blunt-ended. Aspin with a blunted Napin promoter of pCGN5139
Plasmids containing the insert closest to the 718I site and the napin 3 'oriented closest to the blunted HindIII site were subjected to sequence analysis to confirm both the orientation of the insert and the integrity of the cloning junction. . The resulting plasmid is called pC
GN8623.
【０１０６】 プラスミドｐＣＧＮ８６２０を、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＧＧＡＴ
ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴ−３’（配列番号
５２）および５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣ
Ｃ−３’（配列番号５３）を、ＳａｌＩ／ＳａｃＩ消化ｐＣＧＮ７７８７内にラ
イゲーションすることで構築した。ｄ３５ｓプロモーター、ポリリンカーおよび
ｔｍｌ３’領域を含む断片を、Ａｓｐ７１８Ｉでの完全消化およびＮｏｔＩでの
部分消化によってｐＣＧＮ８６２０より取り除いた。この断片を、Ｋｌｅｎｏｗ
で５’オーバーハングを埋めることで平滑末端化し、次いでＡｓｐ７１８Ｉおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＧＮ５１３９内にライゲーションし、Ｋｌｅｎ
ｏｗ断片で５’オーバーハングを埋めて平滑末端化した。ｄ３５ｓプロモーター
がｐＣＧＮ５１３９の平滑化したＡｓｐ７１８Ｉ部位に最も近く、ｔｍｌ３’が
、平滑化したＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近いように向いた挿入物を含むプラスミ
ドを、配列解析にかけ、挿入物の方向およびクローニング結合部の完全性の両方
を確かめた。得られたプラスミドをｐＣＧＮ８６２４と命名した。 プラスミドｐＣＧＮ８６２１を、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＧＡＣＣＴＧ
ＣＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴ−３’（配列番号
５４）および５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧ
Ｇ−３’（配列番号５５）を、ＳａｌＩ／ＳａｃＩ消化ｐＣＧＮ７７８７内にラ
イゲーションすることで構築した。ｄ３５ｓプロモーター、ポリリンカーおよび
ｔｍｌ３’領域を含む断片を、Ａｓｐ７１８Ｉでの完全消化およびＮｏｔＩでの
部分消化によってｐＣＧＮ８６２１より取り除いた。この断片を、Ｋｌｅｎｏｗ
で５’オーバーハングを埋めることで平滑末端化し、次いでＡｓｐ７１８Ｉおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＧＮ５１３９内にライゲーションし、Ｋｌｅｎ
ｏｗ断片で５’オーバーハングを埋めて平滑末端化した。ｄ３５ｓプロモーター
がｐＣＧＮ５１３９の平滑化したＡｓｐ７１８Ｉ部位に最も近く、ｔｍｌ３’が
、平滑化したＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近いように向いた挿入物を含むプラスミ
ドを、配列解析にかけ、挿入物の方向およびクローニング結合部の完全性の両方
を確かめた。得られたプラスミドをｐＣＧＮ８６２５と命名した。 プラスミド構築物ｐＣＧＮ８６４０は上述したｐＣＧＮ８６２４の改変物であ
る。細菌スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン耐性（Ｆｌｉｎｇら（１
９８５），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３（１９）：７
０９５−７１０６）、大腸菌およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）選別のための決定基をコードしているトランスポゾンＴｎ７から単離し
た９３８ｂｐ ＰｓｔＩ断片をＰｆｕポリメラーゼで平滑末端化した。この平滑
末端化した断片を、ＳｐｅＩで消化し、Ｐｆｕポリメラーゼによって平滑末端化
したｐＣＧＮ８６２４内にライゲーションした。ＰｓｔＩ断片を含む領域を配列
決定し、挿入の方向およびクローニング連結部の完全性の両方を確かめた。Plasmid pCGN8620 was replaced with oligonucleotide 5′-TCGAGGAT
CCGCGGCCGCAAGCTTCCTGGCAGGAGCTT-3 '(SEQ ID NO: 52) and 5'-CCTGCAGGGAAGCTTGCGGCCGCGGATC
C-3 '(SEQ ID NO: 53) was constructed by ligating into SalI / SacI digested pCGN7787. The fragment containing the d35s promoter, polylinker and tml3 'region was removed from pCGN8620 by complete digestion with Asp718I and partial digestion with NotI. This fragment is converted to Klenow
And blunt-ended by filling in the 5 'overhang, and then ligated into Asp718I and HindIII digested pCGN5139, Klen
The 5 'overhang was filled in with the ow fragment and blunt ended. Plasmids containing the insert with the d35s promoter closest to the blunted Asp718I site and the tml3 ′ closest to the blunted HindIII site of pCGN5139 were subjected to sequence analysis, the orientation of the insert and the orientation of the cloning junction. Confirmed both integrity. The resulting plasmid was named pCGN8624. Plasmid pCGN8621 was replaced with oligonucleotide 5'-TCGACCTG
CAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 54) and 5′-GGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGGCAG
G-3 ′ (SEQ ID NO: 55) was constructed by ligating into SalI / SacI digested pCGN7788. The fragment containing the d35s promoter, the polylinker and the tml3 'region was removed from pCGN8621 by complete digestion with Asp718I and partial digestion with NotI. This fragment is converted to Klenow
And blunt-ended by filling in the 5 'overhang, and then ligated into Asp718I and HindIII digested pCGN5139, Klen
The 5 'overhang was filled in with the ow fragment and blunt ended. Plasmids containing the insert with the d35s promoter closest to the blunted Asp718I site and the tml3 ′ closest to the blunted HindIII site of pCGN5139 were subjected to sequence analysis, the orientation of the insert and the orientation of the cloning junction. Confirmed both integrity. The resulting plasmid was named pCGN8625. The plasmid construct pCGN8640 is a modification of pCGN8624 described above. Bacterial spectinomycin and streptomycin resistance (Fling et al. (1.
985), Nucleic Acids Research 13 (19): 7.
095-7106), E. coli and Agrobacterium (Agrobacter)
ium) A 938 bp PstI fragment isolated from transposon Tn7, which encodes a determinant for selection, was blunt-ended with Pfu polymerase. This blunt-ended fragment was digested with SpeI and ligated into pCGN8624, which had been blunt-ended with Pfu polymerase. The region containing the PstI fragment was sequenced to confirm both the direction of insertion and the integrity of the cloning junction.
【０１０７】 スペクチノマイシン耐性性マーカーを以下のようにｐＣＧＮ８６２２おおよび
ｐＣＧＮ８６２３内に導入した。ｐＣＧＮ８６４０からの７．７Ｋｂｐ Ａｖｒ
ＩＩ−ＳｎａＢＩ断片を、以上で記述したｐＣＧＮ８６２３またはｐＣＧＮ８６
２２からの１０．９Ｋｂｐ ＡｖｒＩＩ−ＳｎａＢＩ断片へライゲーションした
。得られたプラスミドはそれぞれｐＣＧＮ８６４１およびｐＣＧＮ８６４３であ
った。A spectinomycin resistance marker was introduced into pCGN8622 and pCGN8623 as follows. 7.7 Kbp Avr from pCGN8640
The II-SnaBI fragment was constructed using pCGN8623 or pCGN86 as described above.
Ligation to the 10.9 Kbp AvrII-SnaBI fragment from 22. The resulting plasmids were pCGN8641 and pCGN8643, respectively.
【０１０８】 シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＦｔｓＺ１ヌクレオチド配列を、
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）お
よびタバコの形質転換での使用のためのセンス発現ベクターｐＣＧＮ６４９５を
構築するのに使用した。この構築物のために、シロイヌナズナＦｔｓＺ１配列を
ＰＣＲ増幅した。形質転換株内でのＦｔｓＺ１のタンパク質発現をモニタするた
めに、ｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号５６））を、Ｃ−末端
で、ＦｔｓＺ１へ転写的に融合した。ＰＣＲ増幅を、標準の増幅パラメータを使
用し、プライマーＳＣ２４７（配列番号５７）およびＳＣ２６０（配列番号５８
）での第一ラウンド増幅、次いで鋳型ＤＮＡとして第一増幅の産物を使用し、Ｓ
Ｃ２４７（配列番号５９）およびＳＣ２６１（配列番号６０）を用いた増幅で行
った。最終増幅産物、ＦｔｓＺ１／ｃ−ｍｙｃ融合物を、核形質転換ベクターｐ
ＣＧＮ８６２４内にクローン化し、ｐＣＧＮ６４９５を作製し、これを標準のプ
ロトコールを使用してシロイヌナズナ、アブラナおよびタバコを核形質転換する
のに使用した。The Arabidopsis FtsZ1 nucleotide sequence was
It was used to construct the sense expression vector pCGN6495 for use in Arabidopsis, Brassica and tobacco transformations. For this construct, the Arabidopsis FtsZ1 sequence was PCR amplified. To monitor protein expression of FtsZ1 in transformants, a c-myc tag (EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 56)) was transcriptionally fused to FtsZ1 at the C-terminus. PCR amplification was performed using primers SC247 (SEQ ID NO: 57) and SC260 (SEQ ID NO: 58) using standard amplification parameters.
), Then using the product of the first amplification as template DNA,
Amplification was performed using C247 (SEQ ID NO: 59) and SC261 (SEQ ID NO: 60). The final amplification product, FtsZ1 / c-myc fusion, was transferred to the nuclear transformation vector p.
It was cloned into CGN8624 to generate pCGN6495, which was used to nuclear transform Arabidopsis, oilseed rape and tobacco using standard protocols.
【０１０９】 ターボベクターｐＣＧＮ８６２４を、アンチセンス配列がｄ３５Ｓプロモータ
ーより駆動するように、アンチセンス構築物のために使用した。シロイヌナズナ
に関しては、（ＡＴＧからＴＡＧまでの）コードしている配列を、鋳型としてＡ
ｔＦｔｓＺ１を使用して、プライマーＳＣ２４８（配列番号６１）およびＳＣ２
５０（配列番号６２）で増幅した。アブラナに関しては、プライマーＳＣ２７６
（配列番号６３）およびＳＣ２６８（配列番号６４）を、鋳型ＤＮＡとしてＰＣ
Ｒ断片ＳＣ３−１−１（配列番号７０）と共に使用し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ
Ｉ断片を作製し、ｐＢＳＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内にクローン化し、ｐＣ
ＧＮ６５２８を作製した。プライマーＳＣ２７６を、最初の１４０塩基配列断片
中に含まれるシロイヌナズナＦｔｓＺ１と比較して配列の非相補的な領域が存在
するために、ＡＴＧから１４０残基下流に位置するように設計した。コード配列
の３’の半分を、プライマーＳＣ２６９（配列番号６５）およびＳＣ２７０（配
列番号６６）を用いてＰＣＲ増幅し、ＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ断片を産生し、続いて
、ｐＣＧＮ６５２８内にクローン化してｐＣＧＮ６５２９を作製した。（ＡＴＧ
からＴＡＧまでの１４０ｂ下流からの）ＢｎＦｔｓＺ１配列を含むＨｉｎｄＩＩ
Ｉ／ＰｓｔＩ断片を、ターボベクターｐＣＧＮ８６２４内にクローン化し、最終
形質転換ベクターｐＣＧＮ６５３０およびｐＣＧＮ６６１１を作製した。ＢｎＦ
ｔｓＺ１配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ断片もまた、種子特異的アンチセ
ンスＦｔｓＺ１発現のために、ｐＣＧＮ８６４３ベクター内にクローン化した。
タバコに関しては、プライマーＳＣ３０５およびＳＣ３０６を、ＦｓｔＺ１配列
をＰＣＲ増幅するように設計し、葉ＲＮＡより作製した５’ＲＡＣＥ ＰＣＲラ
イブラリーＤＮＡを用いてＳｓｅＩ／ＮｏｔＩ断片を産生し、ＴＯＰＯ．ＴＡ２
．１内にクローン化してｐＣＧＮ６５６５を産生した。ｐＣＧＮ６５６５からの
ＳｓｅＩ／ＮｏｔＩ断片をターボベクターｐＣＧＮ８６２４内にクローン化し、
最終形質転換ベクターｐＣＧＮ６５６６を作製した。The turbovector pCGN8624 was used for the antisense construct so that the antisense sequence was driven by the d35S promoter. For Arabidopsis thaliana, the coding sequence (from ATG to TAG) was used as a template for A
Using tFtsZ1, primers SC248 (SEQ ID NO: 61) and SC2
Amplified at 50 (SEQ ID NO: 62). For rape, primer SC276
(SEQ ID NO: 63) and SC268 (SEQ ID NO: 64)
Used with the R fragment SC3-1-1 (SEQ ID NO: 70), HindIII / Pst
I fragment was generated, cloned into pBSKS (Stratagene), and
GN6528 was produced. Primer SC276 was designed to be located 140 residues downstream from ATG due to the presence of a non-complementary region of the sequence compared to Arabidopsis thaliana FtsZ1 contained in the first 140 base sequence fragment. The 3 'half of the coding sequence was PCR amplified using primers SC269 (SEQ ID NO: 65) and SC270 (SEQ ID NO: 66) to produce a PstI / NotI fragment, which was subsequently cloned into pCGN6528 to create pCGN6529. did. (ATG
With BnFtsZ1 sequence (from 140b downstream from to TAG)
The I / PstI fragment was cloned into the turbovector pCGN8624 to generate the final transformation vectors pCGN6530 and pCGN6611. BnF
A HindIII / NotI fragment containing the tsZ1 sequence was also cloned into the pCGN8643 vector for seed-specific antisense FtsZ1 expression.
For tobacco, primers SC305 and SC306 were designed to PCR amplify the FstZ1 sequence, and a 5'RACE PCR library DNA made from leaf RNA was used to generate SseI / NotI fragments, and TOPO. TA2
. 1 to produce pCGN6565. The SseI / NotI fragment from pCGN6565 was cloned into the turbovector pCGN8624,
The final transformation vector pCGN6566 was made.
【０１１０】 ２Ａ．色素体発現構築物 高等植物の色素体を形質転換するのに使用するための構築物および方法は、Ｚ
ｏｕｂｅｎｋｏら（Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ（１９９４）２２（１９）：３８
１９−３８２４）、Ｓｖａｂら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１
９９０）８７：８５２６−８５３０およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（１９９３）９０：９１３−９１７）およびＳｔａｕｂら（ＥＭＢＯ Ｊ．
（１９９３）１２：６０１−６０６）に記述されている。核にコードされた色素
体標的化Ｔ７ポリメラーゼの制御下でＤＮＡ配列を発現させるために、高等植物
の色素体を形質転換するのに使用するための構築物および方法は、米国特許第５
，５７６，１９８号に記述されている。タバコの色素体ゲノムの完全なＤＮＡ配
列は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら（ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８６）５；２０４３−２０
４９）によって報告されている。2A. Plastid expression constructs Constructs and methods for use in transforming higher plant plastids are described in US Pat.
Oubenko et al. (Nuc Acid Res (1994) 22 (19): 38).
19-3824), Svab et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (1)
990) 87: 8526-8530 and Proc. Natl. Acad. Sc
i. (1993) 90: 913-917) and Staub et al.
(1993) 12: 601-606). Constructs and methods for use in transforming higher plant plastids to express DNA sequences under the control of nuclear-encoded plastid-targeting T7 polymerase are described in US Pat.
, 576,198. The complete DNA sequence of the tobacco plastid genome is described in Shinozaki et al. (EMBO J. (1986) 5; 2043-20.
49).
【０１１１】 色素体発現構築物、ｐＭＯＮ４９２１８を、核コードＲＮＡポリメラーゼ領域
（ＰｒｍＰＥＰ＋ＮＥＰ）を持つ１６ＳｒＤＮＡオペロンのプロモーター領域か
らの１４アミノ酸ＧＦＰ融合物を持つ合成ＣＰ４配列、および色素体ｒｐｓ１６
遺伝子からの末端領域を発現するように構築した。Ｐｒｍ／ＮＥＰ／Ｇ１０Ｌ：
：１４ａａＧＦＰ融合物のＤＮＡ配列は、配列番号６７である。[0111] The plastid expression construct, pMON49218, was constructed from a synthetic CP4 sequence with a 14 amino acid GFP fusion from the promoter region of the 16S rDNA operon with a nuclear-encoding RNA polymerase region (PrmPEP + NEP), and plastid rps16.
It was constructed to express the terminal region from the gene. Prm / NEP / G10L:
The DNA sequence of the: 14aaGFP fusion is SEQ ID NO: 67.
【０１１２】 実施例３：植物形質転換および解析 センスまたはアンチセンス配列の発現のための構築物を、Ｕｒｓｉｎら（１９
９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：５８３−５９１によって記述された方法を用
いてタバコ細胞内に形質転換する。Example 3 Plant Transformation and Analysis Constructs for expression of sense or antisense sequences were constructed as described in Ursin et al.
91) Transform into tobacco cells using the method described by Plant Cell 3: 583-591.
【０１１３】 核ＦｔｓＺ構築物を含むトランスジェニックタバコ植物を、植物細胞内に存在
する色素体の大きさおよび数を含む、色素体形態の変化に関して解析した。Transgenic tobacco plants containing the nuclear FtsZ construct were analyzed for changes in plastid morphology, including the size and number of plastids present in the plant cells.
【０１１４】 ＦｔｓＺ１発現構築物ｐＣＧＮ６４９５での形質転換より得た５８の初期形質
転換物（Ｔ１世代）を、大色素体発現系に関して選別し、３つのカテゴリーに分
けた。３４株は５未満の大色素体を含み、８株は５〜２０色素体を含み、１６株
は２０以上（野生型＃および野生型＃以上）色素体を含んだ。１つの株、Ｎｔ６
４９５−６１は単一の大色素体を含んだ。The 58 early transformants (T1 generation) obtained from the transformation with the FtsZ1 expression construct pCGN6495 were selected for the macroplast expression system and divided into three categories. 34 strains contained less than 5 large plastids, 8 strains contained 5-20 plastids, and 16 strains contained 20 or more (wild type # and wild type # or more) plastids. One strain, Nt6
495-61 contained a single large plastid.
【０１１５】 スクリーニング方法は、光学顕微鏡下で１００×倍率で、単離した葉肉プロト
プラストを試験することを含んだ。トランスジェニック植物を含む大色素体は見
たところ、培養下および温室条件下で、野生型から表現系的に区別できないよう
である。The screening method involved testing isolated mesophyll protoplasts at 100 × magnification under a light microscope. Large plastids, including transgenic plants, apparently appear phenotypically indistinguishable from wild type under culture and greenhouse conditions.
【０１１６】 いくつかの大色素体株からの色素体ＤＮＡコピー数の見積もりによって、野生
型と比較した場合に違いがないことが明らかになった。サザン解析を、大色素体
株での導入遺伝子コピー数を見積もるのに使用し、単一の挿入のあるいくつかの
株を同定した。ｃ−ｍｙｃ抗体での大色素体株のウエスタン解析により、（ｃ−
ｍｙｃでタグ化した）導入した導入遺伝子の発現を確認した。３つのカテゴリー
それぞれからの選択した植物からＴ２種子を回収した。Estimation of plastid DNA copy number from several large plastid strains revealed no difference when compared to wild type. Southern analysis was used to estimate transgene copy number in macroplast strains and several strains with a single insertion were identified. Western analysis of the large plastid strain with the c-myc antibody showed (c-myc
The expression of the introduced transgene (tagged with myc) was confirmed. T2 seeds were recovered from selected plants from each of the three categories.
【０１１７】 実施例４：色素体形質転換および解析 ３つのトランスジェニック株、Ｎｔ６４９５−３０（＜５色素体／細胞）、Ｎ
ｔ６４９５−１６（５〜２０色素体／細胞）およびＮｔ６４９５−６９（５〜２
０色素体／細胞）からの葉物質を、色素体形質転換効率および直接グリフォセー
ト選別の評価のために入手した。スペクチノマイシン選別のためのａａｄＡ遺伝
子およびマーカーとしてのＧＦＰを含む色素体形質転換ベクターｐＭＯＮ４９２
１８を、それぞれ３つのトランスジェニック株の１５葉外植片に照射するために
使用した。それぞれの連続したトランスジェニック株の照射に対して１５の野生
型対照葉を使用した。トランスジェニック株および野生型への照射の順番は、バ
イアスを除去するために無作為化した。Example 4: Plastid Transformation and Analysis Three transgenic strains, Nt 6495-30 (<5 plastids / cell), N
t6495-16 (5-20 plastids / cell) and Nt6495-69 (5-2
0 plastid / cell) was obtained for evaluation of plastid transformation efficiency and direct glyphosate selection. Plastid transformation vector pMON492 containing aadA gene for spectinomycin selection and GFP as marker
18 were used to irradiate 15 leaf explants of 3 transgenic lines each. 15 wild-type control leaves were used for irradiation of each successive transgenic strain. The order of irradiation of the transgenic strain and the wild type was randomized to eliminate bias.
【０１１８】 １種Ｎｔ６４９５−３０の形質転換効率は、野生型対照のそれのおよそ二倍で
あり、それぞれ７対３形質転換物を産生した。Ｎｔ６４９５−１６およびＮｔ６
４９５−６９は、対照とほぼ同じ形質転換効率（３形質転換物）であった。した
がって、本発明者らの予備解析により、色素体形質転換効率は、色素対の数を野
生型より、細胞あたり５色素体未満まで減少することで、増強されうる。興味深
いことに、Ｎｔ６４９５株からのすべての色素体形質転換再生剤は、野生型のも
のに比べて、増殖および大きさがとてもゆっくりで小さかった。５００ｍｇ／ｍ
ｌの濃度での選別可能な抗生物質スペクチノマイシンジヒドロクロライドの存在
は、Ｎｔ６４９５株での細胞の再生能力に影響を与えることができることが明ら
かである。したがって、抗生物質に対して影響を受けやすかったトランスジェニ
ックＮｔ６４９５株により多い色素対形質転換細胞が存在しえ、そして再生でき
なかった可能性がある。このようなことがあるかどうか調査するために、低濃度
のスペクチノマイシンジヒドロクロライド（５０、１００、２００、３００、４
００および５００ｍｇ／ｍｌ）での殺傷曲線をＮｔ６４９５−３０、Ｎｔ６４９
５−１６およびＮｔ６４９５−６９株で使用でき、シュートの再生が野生型と同
様であった濃度を確立した。次いでスペクチノマイシンジヒドロクロライドのこ
の濃度を、３つのＮｔ６４９５株での形質転換頻度試験を繰り返すのに使用する
。The transformation efficiency of one species, Nt6495-30, was approximately twice that of the wild-type control, producing 7 to 3 transformants, respectively. Nt 6495-16 and Nt 6
495-69 had almost the same transformation efficiency (3 transformants) as the control. Thus, according to our preliminary analysis, plastid transformation efficiency can be enhanced by reducing the number of plastid pairs to less than 5 plastids per cell than wild type. Interestingly, all plastid transformation regenerants from strain Nt 6495 were very slow and small in growth and size compared to wild type. 500mg / m
It is evident that the presence of the selectable antibiotic spectinomycin dihydrochloride at a concentration of 1 can affect the ability of cells to regenerate in strain Nt 6495. Thus, there may be more dye-to-transformed cells in the transgenic Nt 6495 strain that were susceptible to antibiotics and could not be regenerated. To investigate if this is the case, low concentrations of spectinomycin dihydrochloride (50, 100, 200, 300, 4
At 2000 and 500 mg / ml) for Nt 6495-30, Nt 649
It was used in strains 5-16 and Nt 6495-69, and established concentrations at which shoot regeneration was similar to wild type. This concentration of spectinomycin dihydrochloride is then used to repeat the transformation frequency test on the three strains Nt6495.
【０１１９】 直接グリフォセート選別に関して解析するために、さまざまなレベルのグリフ
ォセートでの殺傷曲線を、Ｎｔ６４９５株で確立し、最適な選別レベルを探す。
色素体形質転換ベクターｐＭＯＮ４９２１８を、Ｎｔ６４９５株に照射するのに
使用し、最適化したグリフォセートレベルを用いた直接選別に関して試験する。To analyze for direct glyphosate selection, killing curves at various levels of glyphosate are established on strain Nt6495 to find the optimal level of selection.
The plastid transformation vector pMON49218 is used to irradiate strain Nt6495 and tested for direct selection using optimized glyphosate levels.
【０１２０】 シロイヌナズナにおいて、ＦｔｓＺ１核発現構築物ｐＣＧＮ６４９５を、コロ
ンビア生態型を形質転換するのに使用した。Ｔ１種子を回収し、約１００カナマ
イシン耐性種子を、本明細書のタバコの項目で概略したのと同様のプロトコール
にしたがって、色素体の大きさおよび数に関して解析した。トランスジェニック
植物を、色素体の数に基づいて３つの群に分けた。Ｉ）少数の大色素体（１〜５
）を持つ２０の独立した株、（ＩＩ）５〜２０色素体を含む２３の株、（ＩＩＩ
）野生型色素対数を含む５０株を得た。それぞれのカテゴリーからの選別したＴ
２種子を、導入遺伝子組み込み座の数に関して解析し、Ｔ３種子回収のために増
殖チャンバーに入れ、同種植物を同定した。このような植物は、Ｓｉｋｄａｒら
（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１８：２０−２４によっ
て記述されたように、色素体形質転換で使用できる。In Arabidopsis, the FtsZ1 nuclear expression construct pCGN6495 was used to transform Colombian ecotypes. T1 seeds were harvested and approximately 100 kanamycin resistant seeds were analyzed for plastid size and number according to a similar protocol as outlined in the section of tobacco herein. Transgenic plants were divided into three groups based on the number of plastids. I) A small number of large plastids (1-5
), (II) 23 strains containing 5-20 plastids, (III
) 50 strains containing the logarithm of the wild type dye were obtained. T selected from each category
Two seeds were analyzed for the number of transgene integration loci and placed in a growth chamber for T3 seed recovery to identify homologous plants. Such plants can be used in plastid transformation, as described by Sikdar et al. (1998) Plant Cell Reports, 18: 20-24.
【０１２１】 ａａｄＡマーカー遺伝子発現またはグリフォセート耐性に関して選別した、形
質転換した植物を、植物の全色素体成分が形質転換されたかどうか（同質原形質
形質転換物）を決定するために解析した。典型的には、以下のシュート形成およ
びスペクチノマイシン選別の２ラウンドにより、色素体ＤＮＡのサザンブロット
解析によって決定したように、解析したおよそ５０％のトランスジェニック植物
が同種原形質である。同種原形質色素体をさらなる培養のために選別した。Transformed plants, screened for aadA marker gene expression or glyphosate tolerance, were analyzed to determine whether all plastid components of the plant were transformed (isogenic transformants). Typically, approximately 50% of the transgenic plants analyzed are alloplasmic as determined by Southern blot analysis of plastid DNA, with the following two rounds of shoot formation and spectinomycin selection. Alloplasmic plastids were selected for further culture.
【０１２２】 サザンブロット解析を、色素体ゲノム内のキメラ発現カセットの組み込みを確
かめるために使用した。調製、電気泳動およびＤＮＡのフィルターへの移し替え
は、記述された通りである（上記Ｓｖａｂら，（１９９３））。全植物細胞ＤＮ
Ａは、Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら（１９８３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒ
ｅｐ．１：１９−２１によって記述されたように調製できる。[0122] Southern blot analysis was used to confirm the integration of the chimeric expression cassette in the plastid genome. Preparation, electrophoresis and transfer of DNA to filters are as described (Svab et al., (1993) supra). Whole plant cell DN
A is described in Dellaporta et al. (1983) Plant Mol. Biol. R
ep. 1: 19-21.
【０１２３】 形質転換した植物の葉緑体からのＧＦＰのようなマーカー遺伝子の発現を視覚
的に観察するために、さまざまな組織を、解剖顕微鏡を用いて視覚化した。プロ
トプラストおよび葉緑体をＳｉｄｒｏｖら，（１９９４）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ
．Ｇｅｎｅｔ．８８：５２５−５２９で記述されたように単離した。To visually observe the expression of marker genes such as GFP from chloroplasts of transformed plants, various tissues were visualized using a dissecting microscope. Protoplasts and chloroplasts are described in Sidrov et al., (1994) Theor. Appl
. Genet. 88: 525-529.
【０１２４】 以上の結果は、本発明の配列が、色素体形質転換植物の産生に関して効果的な
方法を提供することを示唆している。さらに、そのような方法は、除草剤、たと
えばグリフォセートにおける導入細胞質植物の選別を含む、色素体形質導入方法
での使用が認められる。The above results suggest that the sequences of the present invention provide an effective method for producing plastid transformed plants. Further, such methods find use in plastid transduction methods, including the selection of transduced cytoplasmic plants on herbicides, such as glyphosate.
【０１２５】 本明細書で言及したすべての発行物および特許明細書は、本発明が属する分野
の当業者のレベルでの表示である。すべての発行物および特許明細書は、それぞ
れの個々の発行物または特許明細書が明確に、そして個別に参考文献として組み
込まれることを示唆するように同程度に、本明細書に参考文献として組み込む。All publications and patent specifications mentioned herein are representation of the level of those skilled in the art to which this invention belongs. All publications and patent specifications are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication or patent specification was specifically and individually indicated to be incorporated by reference. .
【０１２６】 以上の発明は、理解を明らかにさせるための目的のために、例示、または例と
して詳細に記述してきたが、特定の変化および改良が、付随する請求項の範囲内
ので行われうることが明白であろう。Although the foregoing invention has been described in detail by way of illustration or example for purposes of clarity of understanding, certain changes and modifications may be made within the scope of the appended claims. It will be clear.
【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]
【図１】 図１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（シロイヌナズナ）ＦｔｓＺ１（配列番号２
）、Ｂｒａｓｓｉｃａ（アブラナ）ＦｔｓＺ１（配列番号６）、タバコＦｔｓＺ
１（配列番号９）、ダイズＦｔｓＺ１（配列番号７２）及びトウモロコシＦｔｓ
Ｚ１（配列番号７３）タンパク質配列のアミノ酸配列アラインメントを示す。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows Arabidopsis (Arabidopsis) FtsZ1 (SEQ ID NO: 2).
), Brassica (rape) FtsZ1 (SEQ ID NO: 6), tobacco FtsZ
1 (SEQ ID NO: 9), soybean FtsZ1 (SEQ ID NO: 72) and corn Fts
Figure 3 shows an amino acid sequence alignment of the Z1 (SEQ ID NO: 73) protein sequence.
Claims (31)
体において機能性のプロモーターを含む構築物を植物の細胞に導入し、前記植物
細胞色素体を前記構築物で形質転換する段階を含み、前記植物細胞において色素
体の大きさの変化及び色素体数の変化から成る群から選択される植物色素体の形
態の変化を有する植物細胞に前記構築物を導入するという改善を包含する、植物
細胞色素体を形質転換するための方法。1. A plant cell plastid that is functionally linked to a DNA sequence of interest and that contains a promoter functional in a plant cell plastid is introduced into plant cells, and the plant cell plastid is transformed with the construct. Comprising the step of introducing the construct into a plant cell having a change in the form of a plant plastid selected from the group consisting of a change in plastid size and a change in the number of plastids in the plant cell. , A method for transforming plant cell plastids.
、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the size of the plastid is greater than the form of the wild-type plant plastid.
ない、請求項２に記載の方法。3. The method of claim 2, wherein the number of said plastids is less than the form of the wild-type plant plastid.
、請求項１に記載の方法。4. The method of claim 1, wherein the size of the plastid is smaller than the form of the wild-type plant plastid.
い、請求項４に記載の方法。5. The method of claim 4, wherein the number of plastids is greater than the form of wild-type plant plastids.
得られる、請求項２に記載の方法。6. The method of claim 2, wherein said plant cells are obtained from a plant tissue source in which plastid division is inhibited.
おいて機能性のプロモーター、色素体細胞***に関与する遺伝子をコードするＤ
ＮＡ配列及び植物細胞において機能性の転写終結配列を含む第二のＤＮＡ構築物
を植物組織源の細胞に導入することによって阻害される、請求項６に記載の方法
。7. The plastid division, in a 5 ′ to 3 ′ direction of transcription, a promoter functional in plant cells, D which encodes a gene involved in plastid cell division.
7. The method of claim 6, wherein the method is inhibited by introducing a second DNA construct comprising an NA sequence and a transcription termination sequence functional in plant cells into cells of a plant tissue source.
項７に記載の方法。8. The method of claim 7, wherein said DNA sequence is antisense-directed.
を含む、請求項８に記載の方法。9. The method of claim 8, wherein said construct comprises a DNA sequence encoding an FtsZ protein.
に記載の方法。10. The DNA sequence of claim 7, wherein said DNA sequence is sense-oriented.
The method described in.
記載の方法。11. The method of claim 10, wherein said DNA sequence provides for suppression of sense.
条件下で植物を成長させることによって阻害される、請求項６に記載の方法。12. The method of claim 6, wherein said plastid division is inhibited by growing plants under culture conditions that inhibit the division of plant cell plastids.
で植物組織源を成長させることを含む、請求項１２に記載の方法。13. The method of claim 12, wherein said culturing conditions comprise growing a plant tissue source in contact with an inhibitor of bacterial cell division.
ナフタレンスルホネート）である、請求項１３に記載の方法。14. The method according to claim 14, wherein the inhibitory factor is 5,5′-bis- (8-anilino-1-).
14. The method according to claim 13, which is naphthalene sulfonate).
、請求項６に記載の方法。15. The method of claim 6, wherein said plastid division is inhibited by gene mutagenesis.
ズナ）からの植物ＦｔｓＺタンパク質をコードする単離ＤＮＡ配列。16. An isolated DNA sequence encoding a plant FtsZ protein from Arabidopsis thaliana.
から選択される配列を含む配列によってコードされる、請求項１６に記載のＤＮ
Ａ配列。17. The DN of claim 16, wherein said FtsZ protein is encoded by a sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 and 3.
A sequence.
ク質をコードする単離ＤＮＡ配列。18. An isolated DNA sequence encoding a plant FtsZ protein from Brassica.
ドされる、請求項１８に記載のＤＮＡ配列。19. The DNA sequence of claim 18, wherein said FtsZ protein is encoded by the sequence of SEQ ID NO: 5.
ＮＡ配列。20. An isolated D encoding a plant FtsZ protein from soybean
NA sequence.
群から選択される配列を含む配列によってコードされる、請求項２０に記載のＤ
ＮＡ配列。21. The D of claim 20, wherein said FtsZ protein is encoded by a sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20-31.
NA sequence.
単離ＤＮＡ配列。22. An isolated DNA sequence encoding a plant FtsZ protein from corn.
群から選択される配列を含む配列によってコードされる、請求項２２に記載のＤ
ＮＡコード配列。23. The D of claim 22, wherein the FtsZ protein is encoded by a sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10-19.
NA code sequence.
換えＤＮＡ構築物。24. A recombinant DNA construct comprising any of the DNA coding sequences of claims 16-23.
をコードする核酸配列に機能的に連結された、植物細胞色素体において機能性の
プロモーターを含む構築物で形質転換することを含む、植物の選択性を改善する
ための方法。27. Transforming a plant cell source having an altered plastid morphology with a construct comprising a promoter functional in plant cell plastids operably linked to a nucleic acid sequence encoding a selectable marker. Methods for improving plant selectivity, including.
７に記載の方法。28. The nucleic acid sequence of claim 2, wherein the nucleic acid sequence encodes a herbicide resistance gene.
7. The method according to 7.
請求項２７に記載の方法。29. The nucleic acid sequence encodes a glyphosate resistance gene,
A method according to claim 27.
された、植物細胞において機能性のプロモーターを含む構築物で植物細胞を形質
転換することを含む、高い色素体形質転換効率を備えた植物細胞源を調製するた
めの方法。30. A high plastid transformation efficiency comprising transforming a plant cell with a construct comprising a promoter functional in a plant cell operably linked to a nucleic acid sequence encoding an FtsZ protein. A method for preparing a plant cell source.
配列に機能的に連結された、植物細胞色素体において機能性のプロモーターを含
む第一核酸構築物を導入することを含む、植物細胞色素体を形質転換するための
方法。31. Introducing a first nucleic acid construct comprising a promoter functional in a plant cell plastid operably linked to a nucleic acid sequence of interest into a plant cell having an altered plastid morphology. , A method for transforming plant cell plastids.
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| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
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