JP2002529478A - 全ての微生物を検出するためのニトロクマリン - Google Patents
全ての微生物を検出するためのニトロクマリンInfo
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Abstract
Description
関するものである。
提案する。
。
検出方法に関するものである。
s. V. Syntheses of coumarin−3−carbox
ylic acid derivatives.”CHEMICAL ABST
RACTS, vol. 50, 1956, page 10715, XP
−002109446にはニトロクマリンの、さらには7−ニトロクマリンの誘
導体の合成が記載されている。さらに、毒性研究が実施された。一方、論文“S
yntheses of coumarin derivatives. XI
V. Preparation of 5−hydroxy−7−nitro−
3−coumarinarboxylic acid” CHEMICAL A
BSTRACTS, vol. 59, 1963, page 2757,
XP−002109447には5−ヒドロキシ−7−ニトロクマリンカルボキシ
ル酸の合成しか記載されていない。
れていない。くわえて、毒性研究において当業者は微生物の生長を可能にする微
生物研究培地内でかかる化合物を使用できるとは考えていない。
菌特性を有する可能性がある。それは次の2つの論文に明らかにされている。例
えば、論文“Studies on Synthesis of Coumar
in Derivatives. XX. Synthesis and An
tibacterial Activity of Derivatives
of N−Substituted 3−Coumarincarboxami
de” CHEMICAL AND PHARMACEUTICAL BULL
ETIN, vol. 16, no.11, novembre 1968
(1968−11), pages 2093−2100, XP−00210
9448には抗菌試験におけるニトロクマリンの使用が記載され、また論文“
Synthesis of Coumarin Derivatives. X
V. On the Preparation of Etyl Pyrano
benzoxazole carboxylates.” CHEMICAL
AND PHARMACEUTICAL BULLETIN, vol. 14
, 1966, pages 1162−1167, XP−00210944
9にも記載されている。
蛍光を放つニトロクマリン、とくに7−ニトロクマリンの可能性である。この蛍
光は特定の微生物の存在の有無に特徴的である。しかるに毒性と抗菌特性は当業
者をかかる分子を微生物検出に使用したい気持ちから遠ざけることしかできない
。
ることは問題外で、反対に非蛍光7−ニトロクマリン(または誘導体)を蛍光7
−アミノクマリン(または誘導体)に還元するニトロ還元酵素型の酵素活性を求
めることによって微生物を明らかにすることが問題である。したがって、細菌阻
止に全く意味がない、それを含有している可能性がある標本内の微生物の汎用検
出蛍光試験が課題となる。
らわかっていた。Asnis(1957年)はp−ニトロ安息香酸を還元する能
力のある大腸菌抽出物からのフラボプロテインの単離を報告した。この報告以来
、ニトロアリル−還元酵素活性は各種の生体内で確認された。これにはシュドモ
ナス spp.(Wonら、1974年)とナクロディア spp.(Vill
anueva 1964年)などの厳密な好気性生物、クロストリジウム sp
p.(Ancermaier & Simon 1983)とヴェイロネラ s
pp.(McCormickら、1976年)などの厳密な嫌気性生物、さらに
は菌類(マスダ&オザキ 1993年)および真核寄生生物(Douch 19
75年)が含まれる。細菌性ニトロアリル−還元酵素によって還元されるものと
して挙げられたある範囲の基質が存在する。それはとくにp−ニトロ安息香酸、
p−ニトロフェノール、p−ニトロアニリン、2,4,6−トリニトロトルエン
(McCormickら、1976年)などのニトロ芳香族化合物である。
素の直接検出を可能にするものは一つもない。
接的方法で実現しなければならない。キタムラら(1983年)はp−ニトロ安
息香酸メチルとその他のニトロ芳香族化合物のある範囲の大腸菌抽出物による還
元を研究した。キタムラらは3つの判別される酵素活性がDEAE−セルローズ
カラムでクロマトグラフィーを用いて単離できたこと、また3つの明確に定義さ
れた分画がその活性のために異なるコファクタ所要を示すことを報告した。第一
のものはNADHの存在に結び付けられ、第二のものはNADPHの存在に、第
三のものは両者の一方の存在に結び付けられる。これらの酵素の反応性はNAD
Hおよび/またはNADPHの消失と相関させた、340ナノメートル(nm)
での光学密度(D.O.)の減少を制御することによって測定した。NADHお
よび/またはNADPHの消失は2つの反応生成物、p−ニトロ安息香酸メチル
とp−ヒドロキシルアミノ安息香酸メチルの形成と関連づけられた。Bryan
tら(1981年)も基質にニトロフラゾンを用いて大腸菌のニトロアリル−還
元酵素を研究した。酵素活性測定のために、彼らはニトロフラゾンの最大波長(
最大λ)に対応する、375nmで、D.O.の減少を制御することができた。
この方法を用いることによって、ニトロフラゾンを還元することのできる3つの
別個の酵素活性を検出することができた。細菌が有するニトロフランを還元する
ことができる能力は抗菌化学療法において大きな利益がある(Peterson
ら、1979年、Wentzell & McCalla 1980年)。実
際、コファクタとしてNADPHの存在にだけ依存する大腸菌における大きなニ
トロアリル−還元酵素活性が、ニトロフラゾン耐性のある突然変異には存在しな
いことが証明された(Bryantら、1981年)。
マリンベースの蛍光発生基質である。この種のニトロ芳香族化合物は、還元の後
、強い蛍光を発し、そのため検出が容易な化合物を生成する。この反応Iは下記
の通りである:
ニトロクマリン誘導体を蛍光化合物に還元できることが分かった、それはこれま
で知られている基質とは異なっている。これらの誘導体によって、いまや所与の
標本内の微生物の存在の有無の検出を可能にする汎用指標群が存在する。
て、還元状態で蛍光を放出する、ニトロクマリン分子またはその誘導体の一つに
よって構成されることを特徴とする化合物に関するものである。 好適には、前記化合物は7−ニトロクマリン分子によって構成される。 化合物は次の一般式を有する分子によって構成されることを特徴とする:
酸、エステルまたはその他いっさいの脂肪族化合物の形成を可能にする、またR 4 はHまたはトリフルオロメチル(CF3)またはいっさいの脂肪族化合物であ
る。
7、CONC4HOまたはCOCH3によって構成され、R4はHまたはCH3 によって構成される。
て構成される。
の間に含まれる。
リン分子またはその誘導体の一つと組み合わせた組成物内で使用することができ
る。
、化合物を使用することも含まれる。
一の検出方法において、 ・標本を含む培地に、ニトロクマリン系の、また有利には7−ニトロクマリンま
たはその誘導体の一つを添加する過程と; ・蛍光の有無がそれぞれ求める微生物または微生物群の存在の有無を結論するの
を可能にする、蛍光物質の形成を探求する過程: とから成ることを特徴とする方法に関するものである。
の識別方法において、 ・異なる識別穴に、それぞれがラクトース、グルコース、サッカロース、などの
唯一の炭素源を含む媒質、分析される標本分画、および少なくとも一つの、ニト
ロクマリン系の、また有利には7−ニトロクマリン系の化合物、またはその誘導
体の一つを添加する過程と; ・穴全体についての蛍光の有無が微生物の識別を可能にする、それぞれの穴内の
、蛍光物質の形成を探求する過程: とから成ることを特徴とする方法に関するものである。この第二の方法は同化試
験とも呼ばれる。
連する様々な用途分野に関するものである。
それらは本発明の理解を助けるであろう。
する7−ニトロクマリン系のある範囲の化合物に関するものである。 ニトロクマリンの一般構造は式IIで表される:
て、また異なる可能性について実験を実施した。このリストは下の表に示されて
いる。それは主として最も重要な置換基であるR3、R4およびR8基に関する
ものである。
る。それらは水素原子(H)によって構成される。しかしながら、それらは異な
ることもあり、下記によって構成することもできる: ・R5とR6基の少なくとも一つがハロゲン化物(F、Cl、Br、I)によっ
て構成される;または ・R5とR6基の少なくとも一つがCH3Oまたは小サイズのアルコキシ(炭素
原子数が5未満)で構成される;または ・R5とR6基の少なくとも一つがフェニル(アリル)またはアラルキルで構成
される。 R5またはR6基の一つだけが上述の基の一つである場合、他の基はHで構成
される。 さらに、R5とR6が(ベンゼノイドまたはヘテロ環式)芳香族環を形成する
。かかる分子の構造は右図の通りである。
ーゼ大豆で構成され、Unipath Ltd, Basingstoke(英
国)から入手した。
ン、メチル−7−ニトロクマリン−3−カルボキシレート、エチル−7−ニトロ
クマリン−3−カルボキシレート、7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸、
3−ブチリル−7−ニトロクマリン、3−アセチル−4−メチル−7−ニトロク
マリン、7−ニトロクマリン−3−カルボキシ−モロフォリド。
ch International Limited 製, Uelfield (英国)、と ・Labetech Biolite F1マイクロ滴定プレート蛍光読取器、
Labetech International Limited 製, Ue
lfield (英国)。
cal Company Ltd., Gillingham (英国)から入
手した。
demie des Sciences 232,2027−2029に記載し
ている。それは12gのニトロ−4−サリシルアルデヒド、18gの無水酢酸ナ
トリウムと27gの酢酸無水物を3時間、還流加熱することからなる。モルタル
内に流し、塊をペースト状にして水気を切り、少量の無水酢酸で、ついで水で洗
浄する。生成物を13gのCO3Na2と320cm3の水の存在の下で2時間
還流加熱する。高温で濾過し、さらに塩酸で高温で沈殿させる。冷却後水気を切
り、50%の酢酸300cm3の中で再結晶させる。再結晶させることで、19
8−200℃で溶融する物質が得られる。
ルアルデヒドを合成しなければならないが、これはSEGESSER,J.R.
とCALVIN、M.(1942年)、J. Am. Chem. Soc.
64, 825−826に記載の方法の変更を使用して生成した。これにはまず
2−メチル−5−ニトロフェノールによる初期アセチル化と、それに続く、2−
アセトキシ−4−ホウ化ニトロベンザルを得るための4塩化炭素溶液内へのN−
ブロモサッキンイミドと過酸化ベンゾイルの触媒を用いる、臭素添加の2つの過
程が関与する。粗2臭化物は1−ブタノールから再結晶され、次の手順でニトロ
サリシルアルデヒドに転換される。
に溶かし、全体をメタノール(1% w/v)内のナトリウム沸騰溶液250m
lの中に徐々に添加した。45分(mn)還流した後、濃いオレンジ色の溶液を
冷却し、100mlの水を加えた。さらに15分間沸騰させた後、溶液を冷却し
、そのpH値を3にした。メタノールは回転蒸発で抽出し、4−ニトロサリシル
アルデヒドの沈殿物は吸引濾過で分離した。残留物を希釈エタノール内で再結晶
させた。
evenagelの凝集を含む同じ方法で合成した。ジメチルマロン酸塩(1.
45g、11mM)と4−ニトロサリシルアルデヒド(1.67g、10mM)
を15mlのエタノール内に溶かした。ピペリジンの100mgの塊と100μ
lの低温酢酸を次に加え、混合物を2時間還流した。メチル−7−ニトロクマリ
ン−3−カルボキシレートは反応中に分離することによって、あるいは冷却の間
に結晶させることで形成された。生成物は吸引濾過によって抽出し、液体エタノ
ール内で再結晶させた。エチル−7−ニトロクマリン−3−カルボキシレートと
3−ブチリル−7−ニトロクマリンの合成については、ジメチルマロン酸塩をそ
れぞれジエチルマロン酸塩、あるいはエチルブチルアセテートに代えた。
−カルボキシレート(2.63g、10mM)を過剰なヒドロキシ燐酸と水性エ
タノールで1時間還流することによって得られた。次に燐酸塩の濃い黄色の溶液
を塩酸で酸化し、収穫した生成物を少量の水で洗浄し、ついで沸騰水から再結晶
させた。
7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸(1.17g、5mM)を25mlの
無水テトラヒロドフランと10mlのジメチルホルムアルデヒドの混合物内で溶
解した。予め混合したこの溶液に、5mmolのN−メチルモロフォリン(0.
5g、5mM)を添加し、摂氏マイナス12度(℃)の温度に冷却した後、イソ
ブチル クロロフォロメート(0.68g、5mM)を添加した。反応は温度の
絶対0で、30分間実現可能で、環境温度の5時間の段階がそれに続く。N−メ
チルモロフォリンの塩化物は濾過で抽出され、濾過物は水・氷混合物10ml内
に注いだ。分離した固体は液体メタノール内で再結晶させた。
マリンの同時合成は、7−アミノクマリンの酸化を含む代替法によって実施され
る。7−アミノ−4−メチルクマリン(1.75g,10mM)は硫酸(75%
w/w)10ml内に懸濁され、全体を効果的に混合した。亜硝酸ナトリウム
(7M)溶液2.5mlを反応管の底に達する長い押出カラムを用いて、マイナ
ス5℃で徐々に添加した。ジアゾニウム溶液を5℃に達するまでマイナス2℃で
15分間混合した。テトラフルオロ臭化ナトリウムを2.4g含有する氷水5l
の標本を低温ジアゾニウム溶液に徐々に添加した。氷水は体積がテトラフルオロ
臭化物の結晶の塊を形成するまで、0℃で徐々に添加した。この物質を吸引濾過
で抽出し、少量の氷水で結晶を洗浄し、洗浄はメタノールで継続し、最後はエー
テルで行う。生成物は乾燥空気で急速乾燥し、それによって2.2gの生成物が
発生した。
トリウム(4.1M)の冷却溶液に添加した。ジアゾニウム塩の2.2gの標本
を10mlの水に懸濁し、攪拌しながら5から15℃の間の温度で20分間複数
のアリコートに添加した。窒素の抽出には、泡の発生を予防するために少量のエ
ーテルを添加する必要がある。混合は5時間継続する。懸濁液は濾過、水で洗浄
され、ついで高温エチルアセテートで抽出される。水溶液は部分的に抽出される
。組合せ抽出物は水で洗浄され、無水硫化マグネシウムで乾燥される。溶剤は回
転蒸発で飛ばされ、黄色い残留物が得られる。高温酢酸から再結晶して、レモン
黄色の生成物、すなわち4−メチル−7−ニトロクマリンが0.62g得られる
。 3−アセチル−4−メチル−7−ニトロクマリンは3−アセチル−4−メチル
−7−アミノクマリンを用いて同様な方法で調製される。最後の化合物は、エチ
ル ジアセトアセテートをエチル アセトアセテートで置換することからなる7−
アミノ−4−メチルクマリンの合成方法を変更して、調製した。
解量は試験の際に最終濃度が0.105mmol/lになるように決定される。
この溶液は次に96mlのMueller−Hinton培養液に添加し、混合
物を無菌状態で濾過した。
である。 2゜)方法と結果: A−大腸菌株(NCTC 10418)の生長指標としての各種ニトロクマリ
ン誘導体の値の評価 1゜)方法
造的に記載した8種のニトロクマリンは、下記の通りであった: ・7−ニトロクマリン ・4−メチル−7−ニトロクマリン ・メチル−7−ニトロクマリン−3−カルボキシレート ・エチル−7−ニトロクマリン−3−カルボキシレート、 ・7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸、 ・3−ブチリル−7−ニトロクマリン、 ・3−アセチル−4−メチル−7−ニトロクマリン、 ・7−ニトロクマリン−3−カルボキシ−モロフォリド。
に無菌蒸留水内で懸濁し、Mac Farlandスケール0.5点で、すなわ
ち1ミリリットルあたり約108細胞(細胞/ml)で調節され、ついで無菌M
ueller−Hinton培養液内で100倍に、すなわち約106細胞(細
胞/ml)に希釈した。
クロリットルをマイクロ滴定プレートの板の穴内に添加した。このように調整し
たプレートを35℃で保温し、4時間の間30分ごとに光学密度(690nm)
をAnthos 2001マイクロ滴定プレート分光測定読取器(Labete
ch International Limited 製)で、蛍光(励起:3
65nmと発光:440nm)をBiolite F1 2001蛍光計(La
betech International Limited )で読み取った
。
/lでの)8種のニトロクマリンのそれぞれの作用を示す。この図からよく分か
るように、ニトロクマリン核の化学的置換は7−ニトロクマリンの阻害特性に大
きな影響がある。例えば、7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸が0.10
5mmol/l存在するとき、生長阻害は認められない。しかしながら、メチル
−7−ニトロクマリン−3−カルボキシレートが0.105mmol/l存在す
るとき、総D.O.は生長抑制と比較して92%減少する。この阻害効果は蛍光
発生によって測定されたような基質の還元率を大きく反映している。
ロクマリン−3−カルボキシレートと3−ブチリル−7−ニトロクマリンは4時
間の後に最も還元されていない。加えて、唯一の非阻害性化合物である7−ニト
ロクマリン−3−カルボキシル酸の還元は他のニトロクマリンのそれをはるかに
越えて、発生した蛍光は他のどの基質で発生したものの2倍を越える。
れた値を挙げる。
ニトロクマリン−3−カルボキシル酸の値の研究 1゜)方法 NCTC 10418大腸菌株の検出感受性に対する7−ニトロクマリン−3
−カルボキシル酸濃度の影響は0から0.262mmol/lの指標の濃度範囲
を変えて研究した。他の試験条件は前記A節に記載のものと同じである。 2゜)結果: 図3からよく分かるように、7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸の濃度
は大腸菌の生長に有意の影響がないことは、基質の異なる濃度で得られた反応速
度の重ね合わせから明らかであり、対照群に対しても当てはまる。化合物にまっ
たく阻害性がないことはニトロ還元によって発生した蛍光率にも反映されている
。
るまで基質濃度と共に蛍光発生が増加することを示している。この濃度を超える
と、蛍光反応感受性はもはや増加しない。 図2と4を読みやすくするために、以下の2つの表4と5はこれらの図に組み
合わされた値を挙げる。
キシル酸の値の研究 1゜)方法 この研究において、7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸を用いて大腸菌以
外の腸内細菌株の検出可能性を研究した。この研究の条件は第一の実験(A節)
のものと同様である。 シトロバクテル ディベルサス、エンテロバクテル アグロメランス、ハフニ
ア アルベイ、モルガネラ モルガニイとシゲラ ソネイの種に属する5つの野
生株を試験した。 2゜)結果: 図6は5種の異なる腸内細菌に属する野生株による7−ニトロクマリン−3−
カルボキシル酸の還元を示す図である。試験した全ての株がこの化合物を還元す
ることができた。図6の蛍光反応速度と図5の成長速度と比較すると、生長と蛍
光の間に見事な相関が成立し、7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸が優れ
た生長阻害剤であることも示している。 図5と6を読みやすくするために、以下の2つの表6と7はこれらの図に組み
合わされた値を挙げる。
ロコック、ストレプトコック、リステリアおよび酵母を除く微生物の大半で同じ
種類の反応速度が得られることが検証された。すべてがニトロクマリン誘導体、
とくに7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸を還元して、蛍光信号を発する
能力があり、次の研究の結果に示されるごとく、この生長検出方法の普遍性が実
証される。
ルボキシル酸の値の研究 この研究は7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸を用いて、酵母を含む多種
多様な細菌の代表する、微生物の16の株を試験して実施した。研究した株の一
覧は後に定義する表8に挙げた。 10mgのトレーサの標本を高温で4mlの蒸留水内に溶解した。次にこの溶
液を96mlのトリプターゼ・大豆培養液に添加し、混合物を無菌状態で濾過し
た。
をトリプターゼ・大豆培養液内で1/1000に希釈し、ついで試験採取内に細
菌細胞がなくなるまで1/10希釈を続けて実施した。 このようにして10-3から10-13までの範囲の希釈を実現する。 それぞれの希釈液50マイクロリットルと7−ニトロクマリン−3−カルボキシ
ル酸を含む、および含まないトリプターゼ・大豆培養液の50マイクロリットル
をマイクロ滴定プレートの穴内に添加した。 このように調整したプレートを35℃で保温し、一方では開始時(Tゼロ)に
、他方で24時間後に、 ・7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸を含まない穴について、光学密度
(690nm)をAnthos 2001分光測定読取器(Labetech
International Limited 製)で、 ・7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸を含む穴について、蛍光(励起:3
65nmと発光:440nm)をBiolite F1 2001蛍光計(La
betech International Limited )で読み取った
。 生長と蛍光の間の相関、ならびにトレーサの無毒性を確認するために、全ての穴
は羊の血でColumiba寒天上に移植した。
されるように、酵母を含む多種多様な細菌の代表する、微生物の16の株を試験
した。 24時間の保温後に得られた蛍光(それぞれの株について最初の線)と光学密
度(それぞれの株について第二の線)は第8表に示した。生長と蛍光の間の相関
、ならびにトレーサの無毒性を確認するために、全ての穴は羊の血でColum
iba寒天上に移植した、またコロニーを発生した穴はイタリック体の欄で表内
に示した。
物生長の間にきわめて大きな相関があることを示している。たまに微細な差異も
認められるが、接種体内にただ一つの微生物細胞を含むことがある限界希釈をは
じめとして、マイクロ滴定プレートの穴内に存在する生細胞数レベルにわずかな
変動があり得ることで説明できる。したがって、蛍光検出は生長証明に代わるこ
とができる。生長蛍光指標に7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸を用いる
と、この実験の際に実施した限界希釈法を用いるときにただ一つの生細胞になる
と推定することができる、きわめて少数の微生物を検出することができるので、
きわめて感受性が高いと思われる。
アと比較して、極低レベルの蛍光を発生したことが注目される。これは酵母の生
長に適していない媒質であるトリプターゼ・大豆培養液を用いたことによる。結
果は示していないが、トリプターゼ・大豆培養液を酵母に推奨されるRPMI培
養液に代えると、得られる蛍光レベルはバクテリアで見られるものと同様になる
。 結果は後述の表8に挙げた。希釈数は重要であり(10-3と10-13の間の1
1の希釈に加えて対照の役割を果たす「ホワイト」に関する12番目の値)、ま
たこの表の理解を助け、見やすくするために、表は2部に分けた。第一の部分は
10-3と10-9の間の11の希釈にあたる。第二の部分は10-10と10-13の間
の11の希釈と対照にあたる。
カルボキシル酸の存在の下での蛍光(1行目)と光学密度(2行目)の測定値の
24時間後の比較
は微生物の普遍的蛍光指標族を構成する。
全ての方法に関係する。これらの用途の主なものは: ・アンチビオグラムおよびアンチフォンジグラム抗生物質、抗菌物質に対する微
生物の感受性研究)の方法、 ・同化試験を利用する識別方法(唯一の炭素源に用いられた基質の存在の下での
生長の証明)、 ・標本の無菌性(微生物の不在)の証明、 ・臨床、工業(食品、医薬品、化粧品・・)または環境を問わず、それを含んで
いる可能性のある標本内の微生物の存在のいっさいの検出、および ・標本内の微生物数のいっさいの計数、とくに農業食品分野で周知の最近似値(
NPP)の決定に基づく記数計算。
生長に対する0.105mmol/lでのニトロクマリンの範囲の作用を示すグ
ラフである。
マリンの各種の誘導体の存在の下で大腸菌(NCTC 10418)によって発
生した蛍光を示すグラフである。
−カルボキシル酸の存在の下で大腸菌(NCTC 10418)の生長を示すグ
ラフである。
3−カルボキシル酸の存在の下で大腸菌(NCTC 10418)によって発生
した蛍光を示すグラフである。
でのMueller−Hinton培養液内のエンテロバクテリアセアエの野生
株の生長を示すグラフである。
ニトロクマリン−3−カルボキシル酸の還元を示す図である。
酸、エステルまたはその他いっさいの脂肪族化合物の形成を可能にする、またR 4 はHまたはトリフルオロメチル(CF3)またはいっさいの脂肪族化合物であ
る。
Claims (13)
- 【請求項1】還元状態で蛍光を発生する、ニトロクマリン分子またはその誘
導体の一つによって構成される、少なくとも一つの微生物の存在の有無の検出化
合物。 - 【請求項2】請求項1に記載の化合物において、7−ニトロクマリン分子ま
たはその誘導体の一つによって構成されることを特徴とする化合物。 - 【請求項3】請求項1または2のいずれか一つに記載の化合物において、次
の一般式を有する分子によって構成されることを特徴とする化合物: 【化1】 この式において、R3はHまたはCOZの中から選択され、ここでZはケトン、
酸、エステルまたはその他いっさいの脂肪族化合物の形成を可能にする、またR 4 はHまたはトリフルオロメチル(CF3)またはいっさいの脂肪族化合物であ
る。 - 【請求項4】請求項3に記載の化合物において、 R3がCOOCH3、COOC2H5、COOH、COC3H7、CONC4H
OまたはCOCH3によって構成され、R4がHまたはCH3によって構成され
ることを特徴とする化合物。 - 【請求項5】請求項から4のいずれか一つに記載の化合物において、 7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸によって構成されることを特徴とする
化合物。 - 【請求項6】請求項5に記載の化合物において、 7−ニトロクマリン−3−カルボキシル酸濃度が0.05と03mmol/lの
間で含まれることを特徴とする化合物。 - 【請求項7】微生物の存在の有無の検出および/または使用試験における、
請求項1から7のいずれか一つに記載の化合物または少なくとも2つの化合物の
組合せの使用。 - 【請求項8】無菌性管理の実施のための微生物生長の検出への請求項7に記
載の使用。 - 【請求項9】標本内に存在する微生物の記数の実施のための微生物生長の検
出への請求項7に記載の使用。 - 【請求項10】抗生物質に対する微生物の感受性を決定するための微生物生
長の検出への請求項に記載の使用。 - 【請求項11】少なくとも一つの微生物の存在の検出のための微生物生長の
検出への請求項7に記載の使用。 - 【請求項12】微生物を含む可能性のある標本内の微生物または微生物群の
検出方法において、 ・標本を含む培地に、7−ニトロクマリン系の少なくとも一つの化合物またはそ
の誘導体の一つを添加する過程と; ・蛍光の有無がそれぞれ求める微生物または微生物群の存在の有無を結論するの
を可能にする、蛍光物質の形成を探求する過程: とから成ることを特徴とする方法。 - 【請求項13】微生物を含む可能性のある標本内の少なくとも一つの微生物
の識別方法において、 ・異なる識別穴に、それぞれが唯一の炭素源を含む媒質、分析される標本分画、
および少なくとも一つの7−ニトロクマリン系の化合物、またはその誘導体の一
つを添加する過程と; ・穴全体についてのその蛍光の有無が微生物の識別を可能にする、それぞれの穴
内の、蛍光物質の形成を探求する過程: とから成ることを特徴とする方法。
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