JP2002529201A - 組織をプールする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、移植を必要としているレシピエントに移植する前に処理するために、組織を安全で効果的に且つ効率的にプールする新規の方法を含む。一態様において、本発明は、移植片の孔内に望ましい因子を効率的に浸透させると同時に、移植片の孔から望ましくない因子を除去させる多孔性移植片を灌流する段階と、移植片を洗浄する段階と、移植片を効率的に不動態化する（病原菌、微生物、細胞、ウイルス等の不活性化およびそれらの抗原性の低下）段階と、このような処理によって作製される新規移植片とを含む。本発明の方法は、圧力周期化の速度、圧力周期の事実および圧力周期の振幅により移植するための組織および他の移植片が高度に清浄化されるシステムを提供する。本発明の方法の標的汚染除去目標には、細菌汚染の約1〜12 log減少、外膜ウイルス汚染の約1〜15 log減少、非外膜ウイルス汚染の約5 logまでの減少、内毒素の約2〜10倍の減少、移植片または移植片の生物的特性および生体力学特性の維持、清浄液の使用による組織毒性の除去並びに移植片の低い抗原性が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、1998年11月13日に出願された係属中の特許出願第09/191,232号およ
び1999年8月20日に出願された係属中の特許出願第09/378,527号の一部継続出願
である。

【０００２】2.0 発明の背景： 2.1 発明の分野： 本発明は組織をプールするための新規の方法である。一態様において、本発明
の方法は、移植片の孔または溝内に望ましい因子を効率的に浸透させることがで
きる多孔性の移植片を灌流する段階と、移植片を洗浄する段階と、移植片を効率
的に不動態化する（病原菌、微生物、細胞、ウイルス等の不活性化およびそれら
の抗原性の低下）段階とを含み、且つこのような処理によって作製される新規の
移植片を含む。本発明はまた、疾患を有する組織を含まずに再度移植することが
できる、疾患のある組織をエクスビボにおいて処理する方法を提供する。

【０００３】2.2 移植片を処理するための既知の方法の説明： 本発明の開示内容に使用される、「移植片」という用語は、ヒトまたは動物へ
の移植が有用であると考えられる任意の材料を意味する。従って、移植片は、骨
、皮膚等などの組織由来の材料であってもよく、または清浄化もしくは滅菌を必
要とすることもある、内部構造を有する金属もしくは合成材料であってもよい。
移植片は自己移植組織、同種移植組織、異種移植組織またはこれらの組み合わせ
を含んでもよく、骨などの鉱物化組織の場合には、移植片は鉱物化組織、部分的
に鉱物質除去した組織、完全に鉱物質除去した組織およびそれらの組み合わせを
含んでもよい。この規定を覚えておくと、このような移植片を清浄化する、この
ような移植片の中もしくは表面に存在する可能性のある汚染微生物もしくは細胞
を不活性化する、または移植片を望ましい因子と共に注入するために移植片を処
理する方法が当技術分野において記載されていることは明らかである。本発明の
開示内容のこの節では、発明されたもの、ならびに添付の特許請求の範囲によっ
て規定されるように、新規で発明性のあるものとして開示され特許請求されるも
のをより明らかに且つ決定的に記載するために、これらの結果の1つ以上を達成
するためのいくつかの既知の方法を考察している。

【０００４】 欧州特許出願第EP 0 424 159号（Osteotech）-「同種移植骨および組織の無菌
処理（Aseptic Processing of Allograft Bone and Tissue）」、（1989年10月1
9日に提出された米国優先権出願に基づいて、1991年4月24日に公開された）は、
同種移植骨および組織の無菌処理に関する極めて一般的な開示である。

【０００５】 米国特許第5,333,626号（Cryolife）-「移植のための骨の調製（Preparation
of Bone for Transplantation）」は、移植する予定の骨の内部基質を、好まし
くは高い圧力において、汚染除去剤、好ましくはポリビニルピロリドン-ヨード
（PVP-I）の存在下において、選択的に洗浄剤の存在下において溶液中に維持す
ることによって、移植のための骨を調製する方法に関する。この特許の「高い圧
力」の特徴はカラム5、10〜31行に記載されている：「高い圧力の洗浄条件は、
骨の内部基質に洗浄液を流入させるのに十分な力を提供しなければならない。こ
のような高い圧力の洗浄条件には、例えば、ペイントカンシェーカーの場合など
の激しい撹拌または高圧液体ジェット流の場合などの高圧洗浄が含まれる。・・
・液体ジェット流の圧力は、好ましくは、100〜3,000 psiで、最も好ましくは50
0〜1,500 psiである」。しかし、この特許は移植片を変動する大気圧に暴露する
ことを開示も示唆もしておらず、参照の特許は本発明により必要なものよりかな
り高い圧力を必要としており、それは骨にしか適用できないが、本発明は骨また
は軟組織に適用できる。また、特許請求されている方法は、終了するのに約1〜2
日が必要である。

【０００６】 米国特許第5,513,662号（Osteotech）-「移植のための骨の調製（Preparation
of Bone Transplantation）」は、骨の内部基質を1気圧より低い圧力に維持す
る、移植のための骨を調製する方法に関する。該特許では「周囲より低い圧力を
維持する最適時間は、一般に、30〜60分の範囲であるが、血液および脂質抽出の
進行をモニターすることによって各適用について決定することができる（実施例
10参照）」ということが開示されている（カラム10、13〜19行）。一般に、周囲
より低いガス圧の2分未満の使用は無効であり、且つ5時間より長い使用はそれ以
上の利点を与えないことがさらに開示されている。従って、'662号特許は、骨が
1気圧より低い圧力においてはかなりの時間維持されることが必要である。骨が
最初に高い圧力において処理され、次に大気圧より低い圧力において処理される
段階が続くことが示唆されているとしても、高い圧力と低い圧力との間の迅速な
周期化については開示も示唆もされていない（例えば、請求項3、カラム15参照
）。本発明は、移植片物質を所与の圧力に一過的且つ周期的に暴露することによ
り、移植片の清浄化、灌流または不動態化の望ましい結果を達成する方法を開示
している。

【０００７】 米国特許第5,556,379号（LifeNet Research Foundation）-「大きな骨移植片
を清浄する方法およびそれにより生産される骨移植片（Process for Cleaning L
arge Bone Grafts and Bone Grafts Produced Thereby）」は、「Allowash□」
方法を記載している。この特許は、「骨移植片の大部分、本質的に全体の管腔お
よび海綿骨空間からの骨髄（bone marrow from the luminal and cancellous bo
ne spaces in large, essentially whole, bone grafts）」の除去に明白に関し
ている。（本発明の概要参照）。従って、この参照特許は、ほぼ無傷でなければ
ならない骨の処理だけに関している。本質的に全体の骨移植片にこの方法を適用
する際に陳述されている意図は、それから、より小さい骨移植片の調製を容易に
するために、ウイルスを保有している可能性のある骨髄の汚染を低減することで
ある。該方法は、連接している軟骨性表面および無傷の骨の骨髄内管または他の
骨小腔を介して骨髄を溶解することができる溶液を排出するために骨移植片に真
空を適用する段階を含む。該特許は、骨移植片を清浄化するために周期的な圧力
を使用する方法については開示も示唆もしていない。

【０００８】 米国特許第5,380,826号（Aphios Corporation）-「微生物細胞の超臨界流体崩
壊および抽出（Supercritical Fluid Disruption of and Extraction from Micr
obial Cells）」は、溶媒の存在下において高い圧力に細胞を暴露することによ
って細胞内成分を回収し、次いで、細胞を破壊するために迅速且つ突然に圧力を
開放する方法に関する。該特許も、この方法を連続的に実施する装置を開示して
いる。しかし、該特許は、同種移植骨に細胞破壊方法を適用することを開示も示
唆もしていない。

【０００９】 米国特許第5,288,462号（Stephan D. Carter）-「滅菌装置および方法（Steri
lization Apparatus and Method）」は、チャンバーを高い圧力とそれに続く圧
力の突然の開放に反復的に暴露することによって、すなわち「強烈な減圧」によ
って滅菌する予定の材料を収容するチャンバーを開示している。該特許は、チャ
ンバーを少なくとも1000 psiに加圧しなければならないことを必要としている。

【００１０】 該特許は、骨材料の滅菌にこの方法またはチャンバーを適用することを開示も
、示唆も、特許請求もしていない。骨の基質を滅菌する際に有効であると考えら
れる記載されている装置と関連して使用される清浄液は開示されていない。骨を
該装置で滅菌することができることを、過度の実験を実施することなく、当業者
に決定させられることは開示されていない。また、このような高い圧力を使用し
ないが、より低い絶対圧力の振動的現象によってのみ移植片を滅菌することがで
きるという開示も示唆もない。

【００１１】 米国特許第5,725,579号（Bioland）-「骨組織および対応する移植可能な生体
物質の処理方法（Process for Treating Bone Tissue and corresponding Impla
ntable Biomaterials）」は超臨界流体に骨を暴露することによって骨を清浄す
る方法に関する。この特許から理解する限り、該特許は、脂質を溶解するために
、高い圧力において二酸化炭素に骨を暴露する段階を含む。

【００１２】 当技術分野において公知の組織滅菌方法には望ましくない特性がある。ヒト免
疫不全ウイルス（HIV）などの病原菌の破壊を確実にするためのγ線照射は、組
織破壊を生じる線量で使用しなければならない（例えば、3.5 Mrad；例えば、Ra
smussenら、J. Arthroscopic and Related Surgery, 10(2): 188-197,(1994)；G
oertzenら、British Soc. of Bone and Joint Surg., 77: 204-211(1005)；Loty
ら、International Orthopaedics, 14: 237-242,(1990)参照）。エチレンオキサ
イドの使用により、移植片は炎症性応答を生じることが見出されている（Kudryk
ら、J. Biomedical Matrials, 26: 1477-1488, (1992)；Thorenら、Clin. Ortho
paedics, 318: 259-263, (1995)；Simonianら、Clin. Orthopaedics, 302: 290-
296, (1994)；Jacksonら、Am. J. Sports Medicine, 18: 1-9, (1990)）。標準
的な化学物質溶液の処理は、溶液が接触する面を滅菌する際には有効であるが、
病原性であると考えられる生物が存在する可能性のある組織の隙間に十分に浸透
しないという大きな欠点がある。これらの欠点に関しては、以下の特徴の一部ま
たは全てを組み入れると考えられる最適化された組織滅菌方法の長い間感じられ
ていた必要性がある：広域的な細菌およびウイルス病原菌の効果的な除去または
不活性化；移植片の毒性の欠如；生体力学強度または増殖誘発特性などの望まし
い組織の特徴の保持；広域的な操作上の改良および多種多様な組織種に対する有
効性；移植のための滅菌包装および送達を確実にするために、最終移植組織容器
内で方法を終了できること。

【００１３】 移植片の処理および滅菌方法に関する公知の技術の上記の総説に関しては、効
率的な移植片の清浄化、灌流または不動態化を達成するために絶対温度または圧
力が必要でないという点において、本発明は長い間必要とされていた改善を提供
すると考えられる。また、本発明の方法は、効率的な移植片の清浄化および滅菌
を達成するために、移植物質への穿孔または任意の他の操作もしくは改良を必要
としない。さらに、本発明の方法は、プールした移植物質の望ましい生物特性を
低下することなく、効率的な規模で移植片を作製するためのドナー組織の安全な
プールを可能にする。本発明の方法は、数多くの方法を含み、その付加的な効果
は、レシピエントに毒性を生ずることなく移植することができる高度に清浄化さ
れ滅菌された（不動態化された）組織の産生である。本発明の方法の種々の態様
は、上記に掲載した特徴、すなわち、広域的な細菌およびウイルス病原菌の効果
的な除去または不活性化；移植片の毒性の欠如；生体力学強度または増殖誘発特
性などの望ましい組織の特徴の保持；広域的な操作上の改良および多種多様な組
織種に対する有効性；移植のための滅菌包装および送達を確実にするために、最
終移植組織容器内で方法を終了できることの全てを含む。さらに、ある種の態様
において、骨形成因子、軟骨形成因子、抗生物質、抗悪性腫瘍薬、抗炎症薬もし
くは生物活性薬またはこのような薬剤の組み合わせが移植片に注入される。特定
の一態様において、注入された薬剤は骨形態形成蛋白質である。別の特定の態様
において、注入される薬剤は、骨形成因子、軟骨形成因子または他の増殖因子を
活性にコードする核酸である。よりさらに別の態様において、本発明の方法は再
度移植するために自己移植片をエクスビボで処理するために使用される。本明細
書に使用される「移植片(implant)」という用語の定義を考慮すると、当業者は
、本発明に係る移植片は自己移植片、同種移植片、異種移植片またはこれらの組
み合わせを含んでもよいことが理解される。従って、本発明の方法の増強により
、異なるドナー由来の組織を組み合わせることができ、実際、本発明の方法によ
り処理した動物組織およびヒト組織を組み合わせて移植片を作製することができ
る。骨などの鉱物化した組織の場合には、移植片は鉱物化した組織、部分的に鉱
物質除去した組織、完全に鉱物質除去した組織およびこれらの組み合わせを含ん
でもよい。当技術分野において周知であるように、同一のドナー由来の鉱物質除
去した骨基質（DBM）の異なる調製物の骨誘導特性には実質的な差があり、DBMは
粉末形態であっても、他の形態であっても、異なるドナーから誘導される場合に
はさらに大きな差がある。当業者は、不変の品質および骨誘導能力を有するDBM
のバッチを達成するためにDBMの種々の調製物のプール化が本明細書に開示され
る方法によって可能になることを、本発明の開示内容から理解されると考えられ
る。

【００１４】3.0 発明の概要 本発明は、1種以上のドナーに由来する組織が1種以上の他のドナー由来の組織
と安全に組み合わされる方法を提供する。同種移植片は、本発明の方法により、
自己移植片、異種移植片またはこれらの組み合わせと組み合わせることができる
。また、本発明は、異なるドナー由来の組織の特性を配合することにより、不変
で且つ容易に再現可能な特性を有する組織のプールしたバッチの作製を可能にす
る。

【００１５】 一態様において、本発明は、圧力の振動的現象が、種々の清浄液（0.5%トリ（
n-ブチル）リン酸、TNBP；過酸化水素等）の存在下において移植物質を含有する
チャンバー内に形成される方法を含む。本発明の方法は、初期段階の加工を受け
ても、受けなくてもよい、内部基質もしくは空間を有する金属もしくは合成材料
または清浄化した（切除した）移植片材料を出発物質として使用すると仮定する
と、本質的に以下の段階を含む： 1. 移植片、自己移植片、同種移植片または異種移植片材料を含有するチャンバ
ーを迅速に排気する段階； 2. チャンバーに清浄液、例えばH₂O₂/TritonX-100/TNBP/ベタジン（Betadine）
混合物を迅速に充填する段階； 3. チャンバーを加圧する段階； 4. 約35〜40℃の温度に維持しながら、選択的に超音波エネルギーを適用して、
段階（1）〜（3）を約1〜150サイクル迅速に周期化する段階； 5. 事前に加工されていない場合には、適宜生成物を加工処理する段階； 6. 同一または異なる清浄用組成物を使用して、選択的に高い圧力または低い圧
力下において段階（1）〜（4）を反復する段階； 7. 当技術分野において周知の気相H₂O₂等による表面汚染除去処理に暴露する際
に、好ましくは最終包装形態で、選択的に表面汚染除去段階を実施する段階。

【００１６】 系の絶対圧力は、移植片または移植片材料の深層の、浸透清浄化を実施するこ
とにあまり重要であるとは思われない。むしろ、本発明の方法の成功に重要であ
ると思われるのは、圧力周期化の速度、周期化の事実およびおそらく、圧力周期
化の振幅である。従って、方法全体は1気圧より高い圧力または低い圧力におい
て実施しても成功することができる。チャンバー内の溶液の蒸気圧までの25イン
チ水銀柱の排気圧が適当である。約40〜100 PSIの充填圧力もまた適当である。
一態様において、方法全体は、方法の全般にまたは特定の段階において内容物を
超音波処理することが可能であるチャンバー内で実施される。好ましくは、核酸
が移植片内に注入される場合には、核酸を破壊する可能性のある超音波処理を実
施しないで方法は実施される。また、好ましくは、方法全体は、手動による処理
を最小にし、且つ方法の再現性を最大にするように、コンピュータによるプログ
ラム可能なシステムまたはプログラム可能な論理回路制御で実施される。処理さ
れた組織が骨移植片または任意の形態の同種移植片もしくは異種移植片組織であ
る場合には、尿素（好ましくは、約6M）または他のカオトロピック試薬（例えば
、4M塩酸グアニジン等）などの適当な溶媒の選択が、このような処理を含まない
場合よりかなり抗原性が低い処理済組織を作製することができるという追加の利
点を有する。本発明の方法の標的汚染除去目標には以下が含まれる： ・細菌汚染の約1〜12 log減少、 ・外膜ウイルス汚染の約1〜15 log減少、 ・非外膜ウイルス汚染の約5 logまでの減少、 ・内毒素の約2〜10倍の減少、 ・移植片(implant)または移植片(graft)の生物的特性および生体力学特性の維持
、 ・使用する清浄液による組織毒性の欠如、 ・移植片の低い抗原性。

【００１７】 このような処理および望ましい結果を、採取し、エクスビボで処理し、再度移
植することができる疾患のある組織の処理にも適用することができる。

【００１８】 従って、本発明の目的は、移植を必要としているレシピエントにその後移植す
るために、1種以上のドナー由来の組織を1種以上の別のドナー由来の組織と共に
安全に、効率的に、且つ効果的にプールする方法を提供することである。

【００１９】 本発明のさらに別の目的は、効率的、経済的な方法で、安全且つ効果的な同種
移植片、自己移植片、異種移植片、金属または合成移植片を作製する方法を提供
することである。

【００２０】 本発明のさらに別の目的は、移植片を作製するために組織ドナー源を安全にプ
ールすると同時に、汚染された任意の単一のドナーが、任意の他のドナー組織ま
たは本発明の方法により処理されたプールされた組織の任意のレシピエントを汚
染するリスクを最小にすることを可能にすることである。

【００２１】 本発明の別の目的は、出発移植物質の望ましい生体特性を損なうことなく、移
植物質を清浄化、灌流または不動態化する方法を提供することである。

【００２２】 本発明のさらに別の目的は抗原性が低い移植物質を作製することである。

【００２３】 本発明のさらに別の目的は、核酸、増殖因子、抗生物質等を含むが、これらに
限定されない望ましい生物活性物質と共に灌流した移植片を提供することである
。

【００２４】 本発明のさらに別の目的は、疾患のある組織を採取し、エクスビボで処理し、
それを再度移植する治療方法を提供することである。

【００２５】 本発明のさらに別の目的は、移植を必要としているレシピエントに移植するた
めに、このような組織のプール化を安全にするように処理されている同種移植片
、自己移植片、異種移植片またはこれらの組み合わせを含む移植片を提供するこ
とである。

【００２６】 本発明のさらに別の目的は、鉱物質除去した骨基質等を含む、同一または異な
るドナー由来の組織をプールすることによって不変の組織移植片特性を達成する
方法を提供することである。

【００２７】 本発明のさらに別の目的および利点は、以下の特許請求の範囲を含む完全な開
示内容を参照することにより明らかになると思われる。

【００２８】5.0 好ましい態様の詳細な開示： 本明細書において使用する、「不動態化する」という用語は、移植片から病原
性であると考えられる生物および免疫原性であると考えられる物質を排除するこ
とを意味するものとする。従って、滅菌性および低い抗原性はこの用語によって
意図されるが、骨形成性（オステオコンダクション（osteoconduction）または
オステオインダクション（osteoinduction）；骨融合）などの移植片の有用な生
体特性、自然の組織機能および移植片の望ましい構造強度の排除はこの用語によ
って意図されない。「不動態化」という用語は「滅菌する」という用語より好ま
しく、その理由は、無菌状態が目標であるが、その用語は、付随する組織の破壊
を生ずることなく、可能であったとしてもまれにしか完全に達成することができ
ない絶対的な意味を有するからである。また、本発明の方法により作製される移
植片は任意の抗原性または発熱原性を完全に除去することはできないが、これら
の望ましくない局面は大幅に減少されており、これも本明細書において使用する
「不動態化」という用語によって意図される。

【００２９】 本明細書において使用する「灌流した」または「灌流」という用語は、レシピ
エントに移植することが意図されている物質の溝および割れ目の中およびそれら
を介した清浄液または生物的に活性な物質の効率的な浸透を意味するものとする
。

【００３０】 本明細書において使用する「迅速な」または「迅速に」という用語は、それら
が本明細書に係る圧力周期化方法に適用される場合、時間または日数ではなく秒
から分の次数の時間枠を意味する。

【００３１】 本明細書において使用する「超音波処理する」または「超音波処理」という用
語は、音波エネルギーの移植片への効率的な移動を可能にする条件下において、
本発明の方法による処理を受ける移植片の容器を介して音波または超音波エネル
ギーを適用することを意味する。製造中の加工品に全体的（gross）な超構造的
損傷を与えることなく、効率的な清浄および細菌または細胞破壊を達成するよう
に、音波エネルギーを、流体を介して製造中の加工品に移動することができる音
波処理方法および条件は当業者には公知である。

【００３２】 本発明は、骨および軟組織、鉱物化または鉱物質除去組織並びに上記の種類の
組織の組み合わせを含む、金属移植片、合成移植片、セラミック移植片、自己移
植片、同種移植片または異種移植片物質を含むが、これらに限定されない移植片
を処理する新規方法を提供する。詳細には、本発明の方法により処理した軟組織
または同種移植骨物質は、軟組織または切除した同種移植骨、自己移植骨または
異種移植骨を以前には可能でなかった効率的な規模での完全な清浄化、加工処理
、滅菌、包装および移植を可能にする。過去には、組織バンクは、できるかぎり
、異なるドナー由来の組織間を接触させないで、単一のドナー由来の組織を処理
しようとしていた。懸念は、任意の所与のドナー組織が他のドナー組織を汚染す
る可能性があるということであった。任意のドナー組織の極端な有用性のために
、大規模なバッチのドナー組織が汚染されていることが見出されるリスクは不合
理なリスクと考えられている。しかし、本発明の方法によると、重度に汚染され
たドナー組織がプールされたドナー組織のバッチ内に含まれている場合でも、移
植に利用する得られた移植物質は植え込みに安全である。

【００３３】 組織バンクによってドナー組織を採取し、処理するリスクを最小化する方法は
、「ドナー認定（donor qualification）」と本明細書において呼ぶが、当技術
分野において周知である。従って、移植するために処理し、利用可能にする物質
に病原菌（ウイルス、細菌等）を保有する組織が含まれるリスクを最小化するた
めに、詳細なドナースクリーニング並びに酵素的、免疫学的、生化学的および分
子生物学的技法による組織試験を適用する。ヒト免疫不全ウイルス、HIV、B型肝
炎ウイルス、HBV、C型肝炎ウイルス、HCVによる汚染の試験は今や当技術分野に
おいて定常的になっている。本発明の方法による移植物質の処理に先行して、望
ましくは、公知のスクリーニングおよび認定方法を最初の段階として含める。本
発明に含まれる高度に効率的な移植片の清浄化、浸透および不動態化方法により
、これまでに未同定の病原性であると思われる生物または定常的な試験方法を開
発しなければならない生物（例えば、プリオン）が、任意の事象において、本発
明の移植片処理方法によって移植片物質から除去されることもさらに期待される
。本発明の圧力周期化浸透および不動態化方法に組み入れられる移植片清浄化の
レベルの重複性は、このような生物または病原性であると考えられる因子の不活
性化を確実にすると同時に、効率的な移植片の処理を可能にする。

【００３４】 以下の説明のための、同種移植骨とは、本発明の方法により処理することがで
きる例示的な組織を指す。しかし、自己移植骨、異種移植骨、他の多孔性組織、
合成多孔性物質および種々の軟組織を含むが、これらに限定されない他の組織も
、同種骨物質に言及することによって本明細書において例示している本発明の精
神から逸脱することなく、本明細書に規定する原理により処理することができる
ことを当業者は認識している。本明細書において使用される「移植片」という用
語の定義を考慮すると、当業者は、本発明に係る移植片は自己移植組織、同種移
植組織、異種移植組織またはこれらの組み合わせを含んでもよいことを理解する
と思われる。従って、本発明の方法を増強するために、異なるドナー由来の組織
を組み合わせてもよく、実際、本発明の方法により処理した動物組織とヒト組織
とを組み合わせて移植片を作製することができる。骨などの鉱物化した組織の場
合には、移植片は鉱物化した組織、部分的に鉱物質除去した組織、完全に鉱物質
除去した組織およびこれらの組み合わせを含んでもよい。当技術分野において周
知であるように、同一のドナー由来の鉱物質除去した骨基質（DBM）の異なる調
製物の骨誘導特性には実質的な差があり、DBMは粉末形態であっても、他の形態
であっても、異なるドナーから誘導される場合にはさらに大きな差がある。当業
者は、不変の品質および骨誘導能力を有するDBMのバッチを達成するためにDBMの
種々の調製物のプール化が本明細書に開示される方法によって可能になることを
、本発明の開示内容から理解すると思われる。

【００３５】 本発明によると、認定されたドナー由来の同種移植骨物質を、最初に、当技術
分野において周知の方法により不定組織を創面切除することによって清浄化する
際のように、種々の公知の生物汚染減少方法によって処理する。靭帯、腱、皮膚
、脂肪、筋肉、遊離した骨髄および任意の他の非骨組織を骨表面から除去するた
めに手による切開を使用することができる。または、当技術分野において周知の
自動化または半自動化方法（例えば、本発明の目的のために参照として本明細書
に組み入れられている、米国特許第5,333,626号；同第5,513,662号；同第5,725,
579号等に開示されている方法を参照）を、ドナー骨物質の最初の清浄化に使用
することができる。

【００３６】 該方法のこの段階において、個々のドナー由来の清浄化した同種移植片、自己
移植片または異種移植片物質をプールし、以下に示すようにさらに清浄すること
ができる。または、同種移植、自己移植または異種移植骨を最終移植寸法に加工
処理し、次に以下に示すようにさらに清浄化するために同様に処理し、寸法化し
た移植片のバッチと共にプールすることができる。単一のドナー由来の組織を本
発明の方法により処理することができることが、上記の開示内容および以下の開
示内容から理解される。しかし、本発明の方法はまた、同じまたは異なる種の複
数のドナー由来の組織のプール化を容易にする。本発明の方法はまた、第一のド
ナー由来の第一の組織を同じまたは異なるドナー由来の第二の組織と組合わせて
、単位的複合移植片を作製する複合移植片の作製を提供する。追跡目的のために
、個々のドナーはこの段階まで追跡されているが、プール時に、さらに追跡する
ためにバッチ番号を規定し、バッチに貢献しているドナーの全ての記録を維持す
る。さらに別の場合には、清浄化および病原性であると考えられる汚染物質の不
活性化レベルの重複性を確実にするために、個々のドナー由来の移植物質を最初
に以下に示すように処理し、次に、異なるドナー由来の移植物質と共にプールす
ることができる。この事象において、個々のドナー由来の移植物質は全体として
さらに清浄化されても、または所望の最終寸法にまず加工されてもよい。

【００３７】 骨に適用する場合には、最初の生物汚染低下および表面清浄の後に、本発明の
方法は、残存するものが本質的に鉱物化されたコラーゲン基質であり、任意の形
態の目に見える生物（ウイルス、細菌、アメーバ、リケッチア、真菌）の5〜6 l
ogの減少が達成されるように、骨髄、血液、蛋白質および粒状物質を効率的に除
去するさらなる方法を提供する。以下により詳細に記載するように、該除去法は
、基質に効率的に浸透させられる種々の清浄液および滅菌液を使用して、圧力周
期化または振動的現象の方法によって達成される。周期化の反復および清浄液の
変更によって、本質的に任意の多孔性基質の溝は開放され、洗浄される。移植片
の浸透性滅菌を達成するために、好ましくは超音波衝撃を併用して、予め規定し
、予めプログラムした洗浄のサイクルを使用する。本発明者らは、流体圧力の振
動的現象と超音波エネルギーとの組み合わせは溶液の浸透および内因性物質の除
去を容易にすることを見出した。所望の遺伝子産物をコードする核酸の解釈が目
標である場合には、超音波エネルギーが存在しない場合にこのような解釈を実施
することが好ましい。このような考慮は、超音波エネルギーによる破壊に敏感で
ある可能性のある任意の生物的に活性な化合物に適用される。

【００３８】 上記の記載より、一態様において、本発明は以下の段階を含む方法を含むと考
えられる： 1. 多孔性金属もしくは合成物質、自己移植片、同種移植片または異種移植片
などの移植片を含有するチャンバーを迅速に排気する段階； 2. チャンバーに清浄液、例えばH₂O₂/TritonX-100/TNBP/ベタジン（Betadine）
混合物を迅速に充填する段階； 3. チャンバーを加圧する段階； 4. 約35〜40℃の温度に維持しながら、選択的に超音波エネルギーを適用して、
段階（1）〜（3）を約1〜150サイクルで迅速に周期化する段階； 5. 事前に加工されていない場合には、適宜生成物を加工処理する段階； 6. 同一または異なる清浄用組成物を使用して、選択的に高い圧力または低い圧
力下において段階（1）〜（4）を反復する段階； 7. 当技術分野において周知の気相H₂O₂等による表面汚染除去処理に暴露する際
に、好ましくは最終包装形態で、選択的に表面汚染除去段階を実施する段階。

【００３９】 灌流不動態化方法はさらに図1Aを参照して規定される。この略図は、固形構造
成分110、溝120、および溝120内に包埋された外来物質130を含む移植片100を示
す。構造成分110は、人造ポリマー材料（例えば、ポリ-L-乳酸、アクリル酸等）
のような合成材料、金属製構造材料または鉱物化または鉱物質除去されたコラー
ゲン基質、自己移植、同種移植もしくは異種移植骨もしくは他の組織などの天然
材料であってもよい。溝120は、重合、成形、溶融または他の製造工程によって
規定される人造溝であっても、鉱物化もしくは鉱物質除去された海綿もしくは皮
質骨基質に見出されるような天然の溝であってもよい。外来物質130は細胞の破
片、骨髄、細胞、脂質、炭水化物、蛋白質、ウイルス、細菌、リケッチア、アメ
ーバ、真菌等であってもよい。図1Aにおいて、パネル（1）および（2）は上記の
第一の段階に関する。パネル（1）において、溝120は、組織を低い圧力に暴露す
ることによって、清浄液を充填するために下処理されている。パネル（2）にお
いて、清浄後の溝120は外来物質130が実質的に除去されていることが示されてい
る。パネル（3）は段階2および3に関し、清浄液140の分子が密封されたチャンバ
ー内に導入され、高い圧力によって溝120内に流入される。パネル（4）は上記の
第四の段階に関し、低い圧力が残存する細胞の破片、清浄液140および他の残存
する外来物質を溝120から除去し、この段階ではおそらく溝120が清浄化されたた
めに、深層浸透のために基質を下処理する。パネル（5）〜（7）では、上記第四
の段階による1サイクルの反復を示し、それにより清浄溶媒で再度加圧される結
果、移植片基質内への溶媒の十分な浸透が達成される。パネル（6）では、低い
圧力が移植片から残存する溶液を吸引し、次いで、パネル（7）に示すように乾
燥することができ、次に、さらに処理（例えば、上記段階5による加工処理、上
記段階6によるさらなる清浄化）および清浄後の組織の最終包装を実施すること
ができる。図1Aに図示するサイクルは、基質内部の完全な内部清浄を確実にする
のに所望の回数だけ反復することができる。図1Bでは、上記方法の種々の段階全
般にわたる圧力および流体の振動的現象を示す。

【００４０】 医学的に開放された後、（すなわち、例えば、HIV-特異的PCR等を含む一連の
リスク因子および生化学的アッセイ法を通過）、ドナー組織は任意の異質または
外来組織が除去される。このように清浄化された組織は密封式反応チャンバーに
収容される。次いで、複数の洗浄段階を含む、好ましくは事前にプログラムされ
た組織清浄化方法が開始される。清浄液による深層組織浸透は、チャンバー内の
圧力を振動すると同時に、種々の清浄液を添加および除去することによって達成
される。溶液の浸透並びに血液、脂質および非構造蛋白質または望ましくない蛋
白質を含む望ましくない汚染物質または内因性物質の除去を容易にするために、
清浄方法の種々の段階において超音波エネルギーを適用する。本発明に係る好ま
しい一清浄サイクルにおいて、特許請求されている方法の段階（1〜4）は、血液
、脂肪、細菌、ウイルス、真菌または他の汚染物質を除去するために以下の表に
規定したものと同様のプロトコールにより実施される：

【表１】 *流体： B=Triton X-100/TNBP、破片を除去し、ウイルスおよび細菌を死滅させるための
溶媒/洗浄剤； C=3%過酸化水素、細胞の破片を除去し、ウイルスおよび細菌を不活性化するため
のもの； D=BとCとの混合物； E=エタノールまたはイソプロパノールなどの水混和性アルコール； 混合物=任意の望ましい割合のB, C, D, E。

【００４１】 表１によると、段階0では、大気圧において、流体および超音波を使用しない
で、本発明の方法を実施することができる加圧可能なチャンバーに金属製、合成
または他の人工移植物質、個々の認定されたドナー由来の自己移植または同種移
植骨または軟組織、異種移植骨または軟組織を収容する。処理される移植片は、
組織と例えば、バイオポリスルホン等などの合成材料との組み合わせを含んでも
よいことがさらに理解される。移植片が組織である場合には、組織は、好ましく
は、まず、表面の外来組織を除去してから、表１に示す段階を開始する。段階I
では、陰圧（真空）下において、約2分間、移植片の基質または移植片を下処理
する（すなわち、図1の段階1参照、真空により捕獲された空気、細胞および他の
遊離した破片を除去する）。段階2では、陰圧下において、流体の浸透を助け、
かつ導入された流体からガスを確実に除去するために、清浄液に超音波を導入す
る。段階3では、陽圧下において、適当な清浄液および超音波の存在下において
、溶媒が移植片の基質内に流入される。その後、溶媒および超音波の存在下にお
いて陽圧および陰圧の一連の「n」サイクルが続き、その間に基質の溝が充填さ
れ、溶液および破片が除去される。この段階がサイクル化される回数は、1回〜
約150回であってもよい（すなわち、n=1〜150；好ましくは、nは約10〜50回であ
る）。

【００４２】 表１の段階4の後、清浄液を陽圧下で除去して廃棄し、組織を陰圧下で乾燥し
、振動する陽圧もしくは陰圧または高い圧力および低い圧力下において、滅菌水
または生理食塩液（例えば、リン酸緩衝生理食塩液、PBS）を使用し、超音波処
理を併用または併用しないで、組織を数回洗浄する。洗浄サイクル数は1〜150回
であってもよく、好ましくは、約1〜50回である。洗浄液を陽圧下で排液し、組
織を再び陰圧下で乾燥する。

【００４３】 上記に概略を示す段階による全汚染物質の除去後、最終的な寸法化が事前に実
施されていない場合には、処理中の組織を最終寸法に加工処理することができ、
（上記のように、本発明の方法の段階5）、次いで、表１により段階を実施する
ために使用するものと同一または異なる反応チャンバーに収容する。好ましくは
、プログラム可能な論理制御下において、深層浸透清浄、不動態化または滅菌サ
イクルを表２に規定するものと同様のプロトコールにより実施する（選択的に、
異なる清浄液を使用して、表１の段階1〜4の反復を示す、上記で規定する段階6
を参照；これらの段階は、段階を0'〜4'として示すことによって識別される）。

【００４４】

【表２】 *流体： F=6M尿素または他のカオトロピック薬剤、例えば、4M グアニジンHCl、移植片の
抗原性を低下させるため； G=1%次亜塩素酸ナトリウム、ウイルス、細菌、真菌または他の残存する汚染物質
を不活性化するため； H=1N水酸化ナトリウム、ウイルスおよび細菌を不活性化するため； I=6%過酸化水素、滅菌剤として； J=ヘキサン、エーテル、ジエタノールアミン（DEA）、トルエン、キシレン、ブ
タン、CO₂（超臨界）、イソブタン、プロパン、アセトン、イソプロパノール、
メタノール、ケトン、エーテル、脂肪族または芳香族炭化水素、HCl、ガス状HCl
。 混合物=任意の望ましい割合のF,G,H,I,J。

【００４５】 表２の段階4'の後、好ましくは、任意の残存する汚染菌または他の生物を確実
に完全に死滅させるために、長期間正に加圧した反応チャンバー内に清浄液を保
持する。1〜60分の期間、好ましくは約10分がこの目的に十分である。次いで、
清浄液を陽圧下で除去して廃棄し、組織を陰圧下で乾燥し、振動する陽圧もしく
は陰圧下において、滅菌水または生理食塩液（例えば、リン酸緩衝生理食塩液、
PBS等）を使用し、超音波処理を併用または併用しないで、組織を数回洗浄する
。洗浄液を陽圧下で排液し、組織を再び陰圧下で乾燥する。

【００４６】 当業者は、上記の表１および２により概略される方法の特性は、本発明の本質
から逸脱することなく、改良することができることを理解している。本質的に、
本明細書に示唆されているもの以外の他の清浄液または濃度、高い圧力と低い圧
力の振動的現象の数、およびサイクル数、加圧および減圧レベルおよび期間を、
所与の組織の要件に従って変更することができる。しかし、表１およびIIに明記
する条件は、組織基質内に染料を流入させる能力、組織基質内の深層に浸透する
ことを可能にされた染料を除去する能力並びに多種多様の細菌、ウイルスおよび
真菌を含む内因性または加えられた生物的汚染物質を除去または死滅させる能力
によって証拠が得られるように、深層に浸透する清浄を実施することができる。
本発明の方法により清浄化される組織には、皮質骨、海綿骨、筋膜、関節全体、
腱、靱帯、硬膜、心膜、心臓弁、神経組織、粘膜下組織（例えば、腸組織）およ
び軟骨が挙げられるが、それらに限定されない。本発明の方法により処理され、
その後残存する生体力学強度および新たな骨形成を誘導する能力（骨伝導（oste
oconduction）および骨誘導（osteoinduction）、集約的に骨形成活性と呼ばれ
る）について試験される骨は、良好な生体力学強度を保持し、骨形成活性を保持
することが期待される。さらに、本発明の方法の一態様により処理され、異種移
植片として植込まれる骨は、ほとんどまたは全く有害な免疫学的反応を誘発しな
いことが見出され、これは、材料の抗原性の低下を示している。尿素または他の
カオトロピック剤（例えば、塩酸グアニジン）を清浄液の1つとして使用するか
、または清浄液の混合物に加える場合には、これは特に当てはまる。

【００４７】 本明細書に開示する方法は、当業者に、本明細書に開示する組織プール化を促
進する数多くの可能な別法および上記に規定するプログラムされた段階を実施す
る装置を示唆している。従って、例えば、本発明に係る一態様において、図2に
略図を示すような装置を、本発明の周期的灌流不動態化方法を半手動的に実施す
るために使用することができる。

【００４８】 本発明のこの態様によると、蓋部210および槽部220を備えるチャンバー200を
、移植片の周期的灌流不動態化のために適合する。上部で一連のボルト部240を
締めることができる一連の支柱部230は、蓋部210を槽部220に固定するために提
供される。格子250は、処理する予定の移植材料を収容するために、チャンバー2
00内部に提供される。蓋部210を介して、一連のアクセスポート260、261、262、
263が提供される。アクセスポート260は滅菌水流入ラインである。アクセスポー
ト261は他の流体の流入ラインである。アクセスポート262は真空ラインである。
アクセスポート263は圧力流入ラインである。また、温度プローブを挿入するた
めにポート264が提供される。ポート265は、チャンバー200の壁225内に備え付け
られている超音波発生装置に電力を供給するためのポートである。ポート266は
排液管である。従って、図2に示すような装置は、本発明に係る周期的灌流動態
化を実施するために使用することができると考えられる。

【００４９】 図3を参照すると、本発明の方法を実施するために、自動式または半自動式装
置300を規定することができる。この開示によると、プログラム可能な論理コン
トローラが、清浄サイクルの所定の時期に弁またはソレノイド310a〜hを活性化
または不活性化する。移植片を反応チャンバー310に収容し、密封する。大気排
気口部320は濾過処理済み空気の流入および除去を可能にするために提供され、
排出口部321は老廃物または溶媒を除去するために提供される。清浄液は、タン
ク330内に真空が形成されないように、大気335までのフィルター付排気口を有す
る化学物質混合タンク330から反応チャンバー310内に導入される。化学物質供給
ライン340は、共通の導管345を介して、流体受け器341から化学物質混合タンク3
30につながる。プログラムにより制御されるポンプ350は、タンク330から反応容
器310内にほぼ混合された流体をくみ上げるように操作される。真空または陰圧
は、真空ポンプ365によって陰圧源が形成される、真空受けタンク360によって反
応容器310に適用される。陰圧を徐々に形成しなければならない365のような真空
ポンプを必要とすることなく、既知の程度の本質的に即時的な真空を反応チャン
バー310に適用できるように、真空受け器360を加えることが望ましい。真空受け
タンク360はポンプ365によって排気することができると同時に、反応タンク310
は陽圧となる。滅菌水、生理食塩液等の水溶液源は、タンク内に真空が形成され
ないようにフィルター付排気口375を有する、貯蔵タンク370に提供される。ポン
プ376は、反応チャンバー310内に導入するために化学物質混合タンク330内へ水
溶液を迅速に注入する。タンク370からの水は、化学物質混合タンク330内に最初
に導入する必要なく、反応タンク310内に直接導入することもできることを当業
者は理解している。陽圧は、反応タンク310内の無菌状態を維持するために、濾
過処理済みガスをコンプレッサによって加圧する加圧タンク380に保存される。
実際、適当にプログラムされたコンピュータまたはプログラム可能な論理コント
ローラは、組織の収容を可能にするために、反応チャンバー310の排気を可能に
する。次いで、移植片の洗浄工程を完了するために、例えば、上記の表１および
表２に概略するように、チャンバーを密封し、排気し、加圧し、流体を導入し、
除去する。また、装置の内側の、濾過処理済みの滅菌した帯域を迅速に滅菌する
ための濾過処理済みの滅菌流動源322が提供される。系の温度を迅速に平衡化す
るために熱交換手段323を加えることも望ましい。水冷、空冷、窒素冷却、水加
熱、熱電対加熱または同様の放射性手段は、望ましい内部温度に応じて、全て許
容可能である。

【００５０】 上記に概略するように、清浄および滅菌液の手動式または自動式灌流により、
バッチ処理するための他のドナー由来の移植物質と共にプールする前に、個々の
ドナー由来の移植物質の生物汚染を低下する。最初の生物汚染の低下は、汚染さ
れている移植片に接触することによって未汚染の移植片の汚染の可能性を低下す
るために、表１に概略するようなプロトコールにより実施することができる。し
かし、本発明の浸透性不動化方法は非常に効率的であるので、汚染されている移
植片に遭遇する最初の予測が十分に低い、ある種の移植片については、異なるド
ナー由来のこのような移植片を組合わせて、表２のプログラムによりプールした
移植片を処理する前に、表１のプログラムにより個々のドナー由来の移植片を最
初に清浄化しないで、表１および表２により移植物質を簡単にバッチ処理するこ
とができる可能性があることを当業者は認識する。

【００５１】 個々のドナー由来の移植物質の最初の生物汚染低下段階を慎重にすべきである
と考えられる場合には、個々のドナー組織は表１のプログラムにより処理され、
次いで、全ての品質管理基準を通過するまで検疫される。最初の生物汚染低下後
にこのような品質管理を通過する個々のドナー組織だけが、表２のプロトコール
により処理するためにプールされる。最初の生物汚染低下プログラムとして、Tr
itonX-100とTNBPとの組み合わせを、破片を除去し、細菌およびウイルスを不活
性化するための第一の溶媒として使用することができる。第二の溶媒は、細胞の
破片を除去し、生物汚染をさらに低下するために3%過酸化水素溶液であってもよ
い。第三の溶媒は、生物汚染をよりさらに低下するためのポビドンヨード溶液で
あってもよい。最後に、移植片を脱色し、または任意の残存するヨウ素を除去す
るためにアスコルビン酸溶液を使用することができる。これらの溶液は異なる順
番で使用されてもよく、実際、異なる溶液を同様の影響を得るために使用するこ
とができる。しかし、低毒性並びに溶液の規定の組み合わせにより生物汚染の効
率的な低下、移植片の清浄化、不動態化および浸透が得られるという本発明者ら
の発見により、掲載されている特定の溶液が好ましい。表１の溶液は、典型的に
は、表１の段階0〜4に示すもののようなサイクルに使用される。

【００５２】 本発明の方法のこの段階において、個々のドナーまたは以前にプールされたド
ナー由来の清浄化された同種移植または異種移植組織を、選択的に以下に記載す
るようにプールし、さらに清浄化する。または、最終的な移植片の寸法を得るた
めに、加工処理、手入れをすることによって組織を最初に寸法化する。寸法化さ
れた組織は個々にさらに処理されるか、または以下に記載するようにさらなる清
浄化のために同様に、または異なって処理され、寸法化された移植片のバッチと
共にプールされる。また、個々の複合生成物を作製するために、本発明の方法に
よる処理の前、最中または後に、同じまたは異なるドナー由来の異なる組織を組
合わせることができることが本発明の開示内容から理解される。従って、例えば
、国際公開公報第98/40113号（参照として本明細書に組み入れられている）に開
示されているような、コラーゲンゼラチンまたは同様の材料を、生体活性ガラス
等などの生体活性セラミック、ヒドロキシアパタイト等、骨チップ等と合わせて
、次いで、米国特許第5,814,084号（参照として本明細書に組み入れられている
）の装置のようなさらに別のドナーまたは同じドナー由来の移植片内に充填する
ことができる。第5,814,084号特許により開示されている装置を、本発明により
処理された個々のドナーまたはドナー組織のプールから作製することができるこ
とがさらに理解される。最終複合物質は複数と考えられるドナー組織から誘導さ
れてもよく、その各々は複数のドナーから誘導されており、本発明の方法により
処理されている。追跡の目的のために、個々のドナーはプール時にこの段階まで
追跡されていると思われるが、さらなる追跡のためにバッチの番号を規定し、所
与のバッチに貢献しているドナー全ての記録を維持する。

【００５３】 表２では、表１に概略したプログラムにより処理されている、異なるドナーか
らプールされた個々の組織の浸透性滅菌を実施するための溶液のセットが示され
ている。従って、6%過酸化水素の第一の溶液、次に、1%次亜塩素酸ナトリウムの
第二の溶液、次に、1N水酸化ナトリウムの溶液を滅菌を実施するために使用する
ことができる。70%イソプロパノール溶液を広域スペクトル殺菌剤として使用す
ることができる。従って、表１および表２の溶液を本明細書に示したプログラム
により使用しても、適宜改良してもよい。異なる浸透性滅菌を使用することがで
きること、または本明細書に示されている滅菌剤の混合物でも可能であることを
当業者は理解している。任意の事象において、本発明の方法のこの段階の結論と
して、移植片の個々のバッチまたはプールされたバッチは、清浄液によって十分
に清浄化され、不動態化され（滅菌されない場合でも）、浸透されている。外膜
ウイルス、増殖期細菌および真菌汚染の12 log以上までの低下、並びに非外膜ウ
イルスおよび胞子の約5 logまでの低下が本明細書に記載する方法により達成さ
れる。また、内毒素レベルの約2〜10倍の低下が達成されると共に、血液、脂質
、核酸および非構造蛋白質がかなり排除される。さらに、該方法では、移植物質
の有益な構造特性および他の望ましい生物学的特性が保持される。プールされた
ドナー由来の移植片をバッチ処理することができることにより、生成収率のかな
りの増加も達成される。

【００５４】 移植物質の浸透性不動態化の次に、移植物質を最終包装形態に収容する。好ま
しくは、これは、任意の外来生物汚染を導入させないように、滅菌環境において
実施される。密封されていない最終の包装形態に加工された最終移植片を確実に
滅菌包装するために、移植片を気相過酸化水素/過酢酸等の気相滅菌環境に暴露
する。次いで、保存または外科医への出荷のために、無菌野から移植片をとりだ
すときに、汚染が生じないことを確実にするために包装物を密封する。密封した
包装物に、選択的に、組織特性に有害な影響を与えないことが周知の線量のγ線
または他の種類の照射を受けさせる（例えば、表面の滅菌を実施し、任意の残存
する大型ゲノム生物の内部破壊を確実にするための、約3.0 Mrad未満または短い
時間；しかし、このような内部処理は一般に必要なく、深層滅菌は、本明細書に
記載されている、洗浄プロトコールまたはその変形により実施されている）。電
子線への暴露、エチレンオキサイドへの暴露等を含む、他の表面滅菌方法および
重複的な内部滅菌方法も、毒性または望ましい生物活性の低下が生じない限り、
この段階において実施することができる。

【００５５】 本発明の方法のさらなる増強として、望ましい生物活性を灌流することによっ
て移植物質を作製できることが本明細書に規定されている。従って、表１の段階
0〜4または表２の段階0'〜4'後の最終洗浄段階において、望ましい抗生物質、抗
炎症剤または他の生物的に活性な薬剤を含有する溶液を、清浄化し、不動態化し
た組織内に抗生物質または他の望ましい生物活性物質を注入するために使用する
ことができる。または、さらに、当技術分野において周知の骨形態形成蛋白質、
軟骨由来増殖因子、組織増殖因子、天然（自己移植片、同種移植片または異種移
植片）または組換え等などの増殖因子を移植片内に灌流することができる。好ま
しい一態様において、灌流段階中に超音波処理を使用しないで、プラスミド内で
発現可能な核酸、ウイルスまたは鎖状DNAまたはRNAベクター形態を含有する溶液
を移植片内に注入する。核酸は、好ましくは、核酸を灌流する組織の性質に応じ
て、適当な増殖因子、抗悪性腫瘍剤、ペプチドまたは蛋白質をコードする。例え
ば、CMVプロモーター等のコントロール下で核酸を骨基質に注入する場合には、
好ましくは、骨形態形成蛋白質（BMP's）をコードする1種以上の遺伝子がコード
される。または、軟骨組織を注入する場合には、核酸は軟骨由来の形態形成蛋白
質をコードすることができる。または、さらに、核酸は組織増殖因子（β等）、
ペプチド（例えば、P/5等）または任意の他の所望の遺伝子産物をコードするこ
とができる。核酸はDNA、RNAであってもよく、またはそれは、選択的に、核酸の
浸透および濃度を追跡するための合成ヌクレオチドまたはマーカーを含む、それ
らの組み合わせであってもよい。また、鉱物質除去した骨基質（DBM）を細粉化
し、水和スラリーまたはそれらの水性混合物を形成することによって、移植片に
、増殖因子の複合混合物を含有するDBMを灌流することができる。または、本発
明の方法を使用して、骨移植片を移植する前に、増殖因子を暴露するために部分
的に鉱物質除去することができる。同様に、骨髄または骨髄抽出物を同様に、適
当な移植片の基質に灌流することができる。

【００５６】 本発明のさらに別の態様において、組織から病原性生物または状態を除去する
ために清浄化方法を適用する。これは、例えば、癌細胞の増殖によって損傷され
ている疾患のある下顎または任意の他の骨または組織を採取することによって実
施することができる。異常のない組織を提供するために、自己移植片を清浄化し
、エクスビボにおいて不動態化し、増殖因子、増殖因子をコードする核酸、抗生
物質、抗悪性腫瘍剤、抗炎症剤、鎮痛薬または任意の他の望ましい生物的に活性
な物質と共に灌流し、次いで同じまたは異なる患者に再度移植する。

【００５７】 上記の詳細な開示内容から理解されるように、本発明の方法は移植片作製の任
意の段階において実施することができ、軟骨の除去などの特殊な調製物または穿
孔などの移植片を損傷する可能性のある段階を必要としない。さらに、本発明の
方法は、最初の段階において、複数のドナー由来の組織をプールし、本発明の方
法により処理する組織在庫作製方法を広義に開示していることが本発明の開示内
容から理解される。結果は、適宜さらに処理するために利用可能な、基本単位の
使用可能な材料の備蓄である。第二の段階において、必要性が生じたとき、移植
に必要な最終製品を作製するために、在庫中で利用可能な基本組織単位を適宜さ
らに処理する。この方法では、移植またはさらなる処理に利用可能な大量の組織
を作成するために単一の処理エピソードが実施されるだけなので、本発明の方法
は、効率がかなり増大される、重要で、基本的な進歩を当技術分野に提供する。
これと比較して、ドナー組織処理における現行の状況は、各ドナーおよび各組織
について、単一の製品を誘導するために別個の処理エピソードが必要であり、そ
の後、新たなドナーから新たな組織を取り込むために、全ての処理装置および人
員を交換する必要がある。従って、本発明の方法は、品質管理、在庫管理および
効率がかなり高くなる。

【００５８】 本発明の加えられた予測されなかった利点として、一態様において、本発明の
方法は骨基質または組織基質の分解または自己溶解を生ずることがある内因性酵
素を効率的に除去、希釈または変性する。これは、例えば、組織を、本明細書に
開示されている洗浄剤、還元剤（例えば、蛋白質のジスルフィド結合を切断する
ために当技術分野において周知なジチオスレイトール、DTT等）、ペルオキシド
、イソプロパノール等に周期的に暴露することによって達成される。内因性酵素
活性の除去、希釈または破壊の結果として、移植片を凍結または凍結乾燥する必
要性は低下または排除され、このことは大きな利点となる。移植組織を凍結した
状態で維持することは当技術分野において常に問題であり、同種移植、自己移植
または異種移植骨移植片を含む、組織移植片を凍結乾燥するには時間および費用
がかかる。本発明によりこのような組織を処理し、次いで組織を滅菌環境または
包装形態に保存することによって、組織を凍結および凍結乾燥する際の費用およ
び時間の遅延は排除される。

【００５９】 本発明のさらなる利点として、同一ドナーおよび特に異なるドナー由来の種々
の組織を作製する場合に生じることがあるバッチ間変動は、本発明の方法により
組織をプールすることによって実質的に排除することができることを当業者は理
解している。従って、具体的な一実施例において、本発明の一態様によって作製
される、または別個の方法によって作製される鉱物質除去骨基質（DBM）は、本
発明により処理することができ、整形外科、歯列矯正または歯周用途のための不
変の骨誘導特性を示すプールされたDBMのバッチを作製するために、異なるドナ
ー由来のDBMのバッチを安全にプールすることができる。さらに、本発明のさら
なる利点は、異種移植（動物）組織を適当に処理してその抗原性を低下し、この
ように処理した異種移植片を単独または同種移植片、自己移植片またはその両者
と併用して使用することにより、これまでは少量であったヒト組織を増加するこ
とができるということを当業者は理解している。

【００６０】 本発明の種々の態様を実施することにより、組織特性の望ましい改良が実施さ
れることが本発明からさらに理解される。従って、例えば、本発明は、本発明の
方法を実施することにより、制御された様式で骨基質を部分的にまたは完全に鉱
物質除去することができるという所見を含む。さらに、本発明は、例えば、酢酸
等の有機酸、塩酸等の無機酸、またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）などのキ
レート剤等を使用して、骨組織を部分的に鉱物質除去する際に有用であることが
見出されている。結果として、本発明の方法は、本明細書に上記に開示されてい
るように、凍結保存、凍結乾燥保存または室温において保存することができる、
このように処理された骨の応力破壊特性を効果的に変更するために使用すること
ができる。

【００６１】 本発明による方法の流れの全体的な概念を提供する手段として、図4により提
供される略図が記載されている。段階1では、ドナー物質をドナー組織処理施設
に導入し、組織を誘導しているドナーが認定されるまで、隔離して保持される。
段階2では、放出されるドナー物質は創面切除によって清浄化された表面である
。段階3では、表面を清浄化した組織を加工して、望ましい最終寸法の移植片を
作製し、本発明による自動式周期的灌流不導態化チャンバーに導入される。段階
4では、不動態化された移植片を最終包装容器に導入し、γ線照射、汚染除去剤
への気相暴露等によって最終的に滅菌する。最後に、段階5では、不動態化され
、包装された移植片を保存し、滅菌サイクルの検証後出荷する。

【００６２】 本発明のさらに別の態様において、図5に略図を示すものと同様の方法のレイ
アウトを使用することができる。該レイアウトによると、処理施設500は3つの平
行で、同一の組織処理施設A〜Cを示す。本発明により処理される予定の組織は、
切除チャンバー510A〜Cから出発して、清浄化され、組織全体、不定組織、およ
び不要組織から切除される。次いで、清浄化された組織は、密封式ポート515A〜
Cを介して、図3に示す工程コントロールおよび流入/流出装置の全てに接続する
反応チャンバー310A〜C内に導入される。表１により規定されるような清浄化サ
イクルの終了時に、組織を密封式ポート516A〜Cを介して取り出す。清浄化した
組織を選別し、組織をさらなる処理に適合することを品質管理が証明するまで、
フリーザー520A〜C内で隔離して保存する。放出された組織は次いで移植片作製
室530A〜Cに移され、そこで、最終的な移植片の寸法化および加工処理が実施さ
れる。最終的に寸法化された移植片を作製したら、このように処理した組織を、
密封式ポート535を介して反応チャンバー310'A〜Cに収容する。示していないが
、図3に示す工程コントロールおよび流入/流出装置の全てが反応チャンバー310'
A〜Cに接続される。表２により規定されるようなさらなる清浄化後、深層まで滅
菌された組織を密封式ポート536A〜Cから取り出し、最終包装形態に収容する。
最終滅菌をステーション540A〜Cで実施し、最終的に滅菌された組織を最終包装
形態に密封する。最終的に滅菌された組織の密封された包装物は、品質管理試験
が外科医への組織の出荷を許可するまで、フリーザー545に隔離する。

【００６３】 図5に提供する方法レイアウトは好ましいが、それは示唆的にすぎず、本発明
による方法は他のレイアウト形態で実施できることが理解される。さらに、図5
により示すレイアウトによると、示した種々の段階により組織が処理されるにつ
れて、周囲の粒状物質のレベルが低下することが望ましいことが理解される。従
って、チャンバー510はクラス100,000（100,000粒子／10億）であることが適当
であり、領域520および530はクラス10,000以下であることが望ましい。最終包装
領域540は、好ましくは、約クラス1000領域である。

【００６４】 最良の形態を含む本発明を一般的および詳細に記載し、さらに例示するために
以下の具体的な実施例を提供するが、これらは開示されている本発明を限定する
ものではなく、発明の範囲は本明細書に添付される特許請求の範囲およびその等
価物を参照することによって考慮されるべきである。

【００６５】6.0 実施例 実施例1: 骨の具体的な清浄化プロトコール: 本発明の好ましい一態様において、無傷の移植片または加工処理した移植片を
、ポビドン-I、水、アスコルビン酸、TNBP/過酸化水素、水、ジエタノールアミ
ン、水、6M尿素、水で逐次的に処理することによって清浄化する。超音波処置お
よび圧力変動の順序は、表１または表２に規定する順序により実施される。しか
し、多種多様の異なる清浄液およびそれらの組み合わせを本発明の方法により使
用することができることが本発明の開示内容から理解される。例えば、清浄液に
は、滅菌水、TritonX-100、TNBP、3%過酸化水素、水混和性アルコール、生理食
塩液、ポビドンヨード、アスコルビン酸溶液、芳香族または脂肪族炭化水素、エ
ーテル、ケトン、アミン、尿素、塩酸グアニジン、エステル、糖蛋白質、蛋白質
、サッカライド、プロテアーゼ（トリプシン、ペプシン、サブチリシン、リパー
ゼ、サッカラーゼ等などの酵素、ガス状酸またはペルオキシドおよびこれらの混
合物が含まれてもよい。本発明の方法は、周囲温度、高温（80℃）または低温に
おいて実施される。従って、液体窒素相中での移植片の清浄化（-80℃）は本発
明に考慮される。

【００６６】実施例2: 移植片の清浄化方法の有効性: 図6は、本発明の方法により処理した後の上腕骨全体の写真であり、上腕骨の
頭部の冠状断面は内部の骨基質の清浄化を示している。

【００６７】実施例3: 硬組織および軟組織移植片を清浄化するための方法の有効性: 図7は、本発明の方法により処理する前の、近位脛骨、遠位大腿骨および膝蓋
骨を含む無傷の膝関節と連接する腱および靱帯の写真である。

【００６８】 図8は、本発明の方法により処理した後の、図7に示す無傷の膝関節の、移植片
の清浄化および連接する腱および靭帯の保存を示す写真である。

【００６９】 これらの結果を考慮すると、本発明の手法により効果的に清浄化することがで
きる移植物質および組織には、金属製移植片、合成移植片、セラミック製移植、
同種移植、自己移植または異種移植組織が含まれるが、それらに限定されない。
このような組織は、皮質骨、海綿骨、筋膜、関節全体、腱、靱帯、硬膜、心膜、
心臓弁、神経組織、粘膜下組織（例えば、腸組織）および軟骨を含む組織から選
択することができる。清浄することが必要な内部基質を有する本質的に任意の移
植物質は、本発明の方法により利点を得るように処理することができる。

【００７０】実施例4: 移植片を深層清浄するための本発明の方法の有効性: 図9は、本発明の方法により処理する前の近位大腿骨の冠状断面の前方面の写
真である。

【００７１】 図10は、本発明の方法により処理した後の、図9に示す近位大腿骨の冠状断面
の後方面の写真である。

【００７２】 図11は、内因性物質を除去し、深層浸透性の移植片の清浄化するための本発明
による処理の有効性を実証する、図9および図10に示す断面を並べた写真である
。

【００７３】実施例5: 物質を清浄化する深層浸透および望ましい生物的に活性な物質の移植片への浸透 を実施する本発明の方法の能力の実証: 図12は、フルオロイソチオシアネート（FITC）蛍光染料処理を使用しない皮質
骨の骨単位の顕微写真である（倍率100×）。

【００７４】 図13は、本発明の清浄液の1つにFITCを添加後の皮質骨の骨単位の顕微写真で
あり、骨の隙間の最小部内への染料の深部浸透を実証している-明るい緑色の領
域は、大きいハバース管（右端）およびより小さい付随小腔（中心部；倍率100
×）を含む、FITCを含有する構造物を示す。

【００７５】 FITC染料は移植片の最小隙間内に流入し、それによって深層浸透清浄化を実施
することができることを明らかにしていることをこれらの顕微写真は実証してい
る。また、抗生物質、抗ウイルス化合物、抗炎症化合物、増殖因子、骨誘導物質
（例えば、骨形態形成蛋白質、軟骨由来形態形成蛋白質、天然または組換え等）
などの生物的に活性な物質は、本発明の方法により使用される溶液中に加えられ
る場合には、移植材料の深層に効果的に包埋されることができることをこれらの
顕微写真は実証している。従って、本発明の方法により、移植片に浸透する生物
的に活性な物質は、骨形態形成蛋白質、組織増殖因子βまたは増殖因子の組織増
殖因子βファミリーのメンバー、軟骨由来の形態形成蛋白質IもしくはIIまたは
その両者および任意の関連する軟骨由来増殖因子、血管形成因子および血小板由
来の増殖因子からなる群から選択される。移植片への浸透のために選択される蛋
白質のいずれかは天然または組換え蛋白質であってもよい。

【００７６】実施例6: 抗原性の低い骨を作製する方法 0.1〜0.5 N酢酸または他の軽度な酸（EDTA、クエン酸、ギ酸、希HCl、H₃PO₄等
）の溶液を、周期的な高圧および低圧下において20分間接触させる。これにより
、骨のカルシウムの2〜3%が除去され、増加した強度のわりに弾性率が低下し（
ねじれおよび薄さ）、コラーゲンの一部を露出するので、増殖因子がより容易に
接触することができる。それはまた、鉱物質に結合する蛋白質の一部を除去する
助けになる。最後に、鉱物質除去は骨の免疫原性を低下することが示されている
。このように処理された骨を、99%イソプロパノール、ヘキサン等で、前記で示
した周期的な圧力処理において脱脂し、次にTNBP/Tritonix-100、尿素、GuHCl等
で処理し、次に、数サイクル洗浄し、増殖因子、核酸等を添加する。このように
処理した移植片は直接植込まれるか、またはその後の移植のために凍結もしくは
凍結乾燥される。

【００７７】 酢酸または他の酸（酢酸、塩酸、フッ化水素酸、リン酸、クエン酸、ギ酸、酪
酸、またはこれらの混合物）を用いた本発明方法のこの段階または別の段階にお
ける移植片の処理は、抗原性が低く、わずかに鉱物質除去された骨移植片を作製
するのに有用であり、移植片の強度、増殖因子結合能力、吸収性、酸可溶性蛋白
質の除去およびゆるく結合したコラーゲンに同時に影響を与え、抗原性がさらに
低下する。正常な骨鉱物質含量と比較した、約0〜約25%の鉱物質含量の低下、ま
たは約1〜約10%または1%〜5%程度の低さでさえも、抗原性の低い骨組成物に大き
な利点を与える。実施されなければならない鉱物質除去レベルの指針的な原則は
、骨の圧縮強度を低下することなく、できるだけ多くの鉱物質を除去することで
ある。均一で、制限された鉱物質除去を実施するためには、好ましくは、骨を、
例えば、1%酢酸のような酸に約30分間接触させ、均一な酸浸透が生じるように、
酸を、骨を含有する排気されたチャンバーに導入する。例えば、HClのような無
機酸を使用する場合には、骨を完全には鉱物質除去させないように、酸の強度を
低下し、または酸の接触時間を短縮するべきである。正常の骨鉱物質含量の1〜2
%程度の制限された除去でも、このように処理された骨移植片の強度のより大き
い予測値（剪断応力の散乱の低下）を生ずることを本発明者らは見出した。この
処理の付加的な利点には、酸可溶性蛋白質の溶解、SDSまたは他のイオン性溶媒
または汚染物質の効率的な除去、増殖因子の高い結合性、植込まれる骨の再形成
の時間の短縮および抗原性のさらなる低下が含まれる。

【００７８】実施例7 本発明の方法を実施する時の高い無菌状態 予防用量の抗生物質を送達することによって感染を予防することができる同種
移植組織を形成する際の本質的に第一の段階は、移植片に含有される生物汚染の
最小化である。組織の灌流を増強することができる因子はまた、製造の薬物負荷
段階にも有用である。しかし、これらの段階は、移植片の強度に対するそれらの
効果を検討せずに実施することができない。以下のデータは、滅菌、薬物灌流、
処理の生体力学的影響の問題に対処しており、薬物放出プロフィールに関するデ
ータを提供している。また、これらの研究は、本発明の方法の可能性を実証して
いる。

【００７９】超音波エネルギーを用いた6%過酸化水素のD-値の算出 ほとんどの滅菌方法は、同種移植骨の構造および/または生物学的特性に有害
である（Rasmussen TJ, Feder SM, Butler DL, Noyes FR. The effects of 4 Mr
ad of gamma irradiation on the initial mechanical properties of bone-pat
ellar tendon-bone grafts. Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 1
994; 10:188-197; Thoren K, Aspenberg P. Ethylene oxide sterilization imp
airs allograft incorporation in a conduction chamber. Clinical Orthopaed
ics and Related Research. 1995; 318: 259-264; USFDA. Required Biocmpatib
ility Training and Toxicology Profiles for Evaluation of Medical Devices
. Rockville, MD: Department of Health and Human Services, Center for Bio
logics Evaluation and Research; 1995）。従って、これらの特性に対する影響
が小さい滅菌方法は、薬物を負荷した同種移植片を製造する際に有用であると考
えられる。超音波エネルギーは、過酸化水素の殺菌および胞子殺滅効果を増強す
ることが示唆されている（Block S,Disinfection, Sterilization and Preserva
tion. 4th ed. New York: Lea&Feiberger; 1991）。この研究において、バチル
ス・ステロテルモフィルス（Bacillus sterothermophilus）（10⁶）胞子のD-値
の低下は、超音波エネルギーの存在下および非存在下において6%H₂O₂で処理した
試料について算出した。この胞子は、ペルオキシド滅菌に対して十分に特徴付け
られ、許容される耐性により選択した。試料は、所与の時間範囲にわたって45℃
において2ml の6%H₂O₂で処理し、滅菌水を添加することによって反応を停止し、
トリプチカーゼ大豆ブロスに移し、56℃において培養した。全ての試料は3本組
で実施した。

【００８０】

【表３】 表３. 超音波エネルギーの存在下および非存在下における6%過酸化水素による
胞子不活性化の比較。陽性（+）の結果は、培地の混濁によって識別され、ブロ
スを固形培地まで継代培養することによって確認される。陰性（-）の結果は、7
日間にわたる培養後に透明度を維持する培地によって決定される。

【００８１】 超音波エネルギーの存在下において実施した試料について得られたD-値は0.83
〜1.66分であった（表３）。これを、望ましくは超音波エネルギーが存在しない
場合（10分より長い）に実施した試料について得られたD-値と比較した。胞子の
不活性化に必要な時間の短縮により、望ましい特性に有害な影響を与えることな
く、同種移植片を滅菌する実用的な方法を可能にする。

【００８２】過酸化水素の抗菌作用に対する残存脂質の影響 この研究は、ヒト同種移植組織に保有される残存脂質がバチルス・ステロテル
モフィルス（Bacillus sterothermophillus）胞子を不活性する際の過酸化水素
の有効性を低下する可能性を検討した。大腿骨および脛骨全体をヒト死体の骨ド
ナーから外科的に切除し、外来性軟組織を除去した。骨組織を細粉化して、粘度
が油状ペーストである細粒の骨スラリーを得た。この骨ペースト部分を除去し、
暖かい（45℃）アセトンを使用して、残存脂肪分を完全に除去した。清浄化した
骨スラリーを、未処理の骨ペーストと混合して、それぞれ0、10、30および60%残
存脂肪を含有する試料を得た。重量分析による徹底的な液体抽出（ヘキサン）を
使用して、全ての試料を検証した。1グラムの各試料を、10⁶接種量の胞子を含有
する試験管に加え、多数の経過時点において超音波エネルギー（45khz）の存在
下において6%過酸化水素2ml（40℃）で処理した。各経過時点は3本組で試験した
。20 mlの滅菌水を添加することによって所与の経過時点において反応を停止し
、摂取物をトリプチカーゼ大豆ブロスに移し、56℃において7日間培養した。混
濁の存在によって増殖を決定した。対照は滅菌水（陰性対照）、接種した水対照
（陽性対照）および骨組織を含有しないH₂O₂を含んだ。

【００８３】

【表４】 表４. 超音波エネルギーの存在下、42℃において6%過酸化水素溶液中で滅菌し
た場合に、均質化した骨スラリーに残存する残存脂肪分の関数としてのB ステ
ロテルモフィルス（B. sterothermophilus）のおおよそのD-値。陽性（+）の結
果は培地の混濁によって同定され、ブロスを固形培地まで継代培養することによ
って確認される。陰性（-）の結果は7日間の培養にわたって、透明度を維持する
培地によって決定した。

【００８４】 研究の結果は、脂質は、B ステロテルモフィルス（B. sterothermophilus）
胞子の完全な不活性化に必要な接触時間を延長することを示している（表４）。
この研究から作成されるデータは、皮質骨から内因性脂質を除去することは滅菌
の効率を増加することを実証している。また、滅菌に必要な接触時間を短縮する
ことによって、滅菌剤の潜在的な有害作用（組織強度の低下）が最小になる。

【００８５】ヒトの皮質骨における滅菌の有効性を実証するためのモデル ヒト皮質骨の液体滅菌方法の有効性を明白に実証することは組織学的に困難で
あった。本実験において、B ステロテルモフィルス（B. sterothermophilus）
（10⁶）生物学的指標を保有する加工された皮質骨部分を使用することが、同種
移植片の無菌性の主張を裏付けると考えられる用途について評価された（図14）
。装置は、若年の男性死体骨ドナーの脛骨の前方稜から皮質部分を切断すること
によって調製した。この部分は、生体中で遭遇される皮質骨のうち最も厚い部分
であり、従って、浸透および滅菌が最も困難である。骨の軸方向に対して縦方向
に、骨の端部に円柱形の穴を開けた。皮質骨の第二の部分は、穴の直径と比較し
て、ややオーバーサイズの円柱系のピンを形成した。部分的なスリットをピンに
形成し、生物学的指標の配置を可能にした。次いで、ピンを加工された穴の中で
圧縮させ、滅菌方法に暴露した。対照は、胞子がストリップからかなり洗い流さ
れるかどうかを評価するために滅菌水だけを使用して試験した。また、追跡用の
染料を使用して、装置への液体の通過を評価した。

【００８６】 対照の結果から、生じた洗い流しの程度は小さく、導入した生物汚染に大きな
影響を与えなかったことが示される。滅菌方法に暴露した試料は、TSB中での7日
間の培養後でも増殖を実証しておらず、このことは方法の有効性を示している。
また、追跡用染料によって評価したとき、液体がとる通路は均一で、穴とピンと
の間の空間にあまり浸潤しなかった。

【００８７】同種移植片の生体力学に対する保存および滅菌処理の影響 本研究の目的は、皮質骨の強度に対する保存および滅菌方法の影響を同定する
ことであった。本研究は、製造の処理段階および薬剤負荷段階に暴露される移植
片に対してどの処理が許容されうるかを決定する際に必須である。強度を大きく
低下する処理は移植片調製/薬物負荷工程において回避しなければならない。

【００８８】 異なる18のヒト死体ドナーから大腿骨および脛骨を単離し、直径4.0mm、長さ1
0mmの203個のピンを旋盤で形成した。次いで、移植片調製または薬剤負荷工程に
使用することができる処理にピンを暴露した。処理後、軸方向の圧縮下における
極限破壊荷重を決定した。軸方向の圧縮試験はASTM D695-91により適合し、MTS
858（Eden Prairie, MN）サーボ水圧機械的試験装置（American Society for Te
sting and Materials. ASTM D695-91:Standard Test Method for Compressive P
roperties of Rigid Plastics. Philadelphia、PA: ASTM; 1991）で実施した。

【００８９】 結果は、圧力介助型過酸化水素灌流が、処理群を示すように皮質骨のピンの圧
縮強度を低下せず（図15）、軸方向の圧力試験中の極限強度の結果を実証する：
対照-保存または滅菌処理しない群を含んでいた；凍結乾燥-移植片の残存水分含
量を2%未満まで低下するような凍結乾燥；γ線照射-3.5 Mradの滅菌線量；PAHP-
圧力介助型過酸化水素処理-周期的な圧力と超音波エネルギー下において40℃で3
0分間6%過酸化水素溶液に組織を暴露するときに使用した。わかるように、γ線
照射は組織の強度をかなり低下し、それ故、移植片の最終的な滅菌のためには別
法を探さなければならない。予測とは異なり、凍結乾燥は、組織の軸方向の強度
をかなり増加した。凍結乾燥は、骨内に負荷することができる薬剤の量を最大に
する重要な要素であると仮定されるので、これは有望な結果である。

【００９０】皮質骨灌流に対する大気圧差の影響 皮質骨の内部基質の完全な灌流は、均質な薬物負荷に必須である。この研究は
、皮質骨内への種々の溶液の浸透に対する陰圧および陽圧の影響を検討した。皮
質骨の円柱試料を上記のように調製した。各円柱試料を真空下において60℃にお
いて24時間乾燥した。再水和率を求めるために、水を導入する前におよび試験中
の定期的な間隔において試料を秤量した。再構成条件は（1）真空において1分；
（2）陽圧において1分；（3）陰圧において30秒、次に陽圧において30秒；（4）
通常の大気圧下における再構成。

【００９１】 最初の（2.5分）経過時点は、標準的な大気圧と比較して、陽圧および陰圧処
理両方で再水和の有意な増加を示した（図16、左のパネル-異なる大気圧下にお
ける皮質骨の再水和。陽圧-100 PSI、陰圧-<25inHg、Neg/Pos-陰圧の次に陽圧；
右のパネル-最も早期の経過時点の拡大図）。また、陰圧から陽圧への処理は再
水和の最も大きい増加を示し、この経過時点における全ての他の処理に対して有
意であった。このデータは、組織基質浸透を誘導する圧力差の有効性を実証して
いる。

【００９２】ヒト皮質骨からの溶液の放出プロフィール 本研究は、標準化された皮質骨部分からの種々の分子量の化合物の放出速度を
検討した。皮質骨からの溶液の放出プロフィールは、基質の微小建築的な配列に
対してバイ-指数曲線をとることが仮定された（Gibaldi M、Perrier D. Pharmac
okinetics, Marcel Decker, New York, New York, 1982）。この目的は、皮質骨
が放出基質としてどのように挙動するかに関する予備的なインビトロデータを提
供することであった。関心のあるいくつかの可能な薬剤は大型蛋白質であるので
、放出プロフィールに対する高分子量蛋白質の影響が含まれた（Gombotz WR、Pa
nkey SC、Bouchard LS、Ranchalis J、Puolakkainen P、骨再生のための生体分
解性基質からのTGF-β1の制御放出（Controlled release of TGF-beta 1 from a biodegradable matrix for bone regeneration.） J. Biomater Sci Polym Ed
1993:5(1-2):49-63；Guicheux J.、Grimandi G、Trecant M、Faivre A、Takahas
hi S、Daculsi G、成長ホルモンの担体としてのアパタイト：負荷および放出の
インビトロ特徴決定（Apatite as a carrier for growth hormone: in vitro ch
aracterization of loading and release.） J. Biomed Mater Res 1997 Feb; 3
4(2): 165-70）。

【００９３】 皮質骨切片はヒト死体大腿骨および脛骨の骨幹部分から加工した。その後、骨
切片を清浄化し、種々の分子量の化合物を含浸させた。次いで、試料を浴に入れ
、沈下した状態を維持し、経時的な薬物放出を測定した。また、基質内に残存す
る薬物のパターンを組織学的に検討した。

【００９４】 異なる分子量の4種の化合物を試験した。1）pH 8〜8.5のTris緩衝生理食塩液
中で0.05 Mの濃度のFITC(MW=389 D) 、2）pH 8〜8.5のTris緩衝生理食塩液中0.0
5 Mの濃度のFITC-デキストラン複合体（MW=10 kD）、3）pH 8〜8.5のTris緩衝生
理食塩液中0.05 Mの濃度のFITC-デキストラン複合体（MW=20 kD）、4）0.025 g/
mLの濃度の生理食塩液中のウシヘモグロビン、Hb、（MW=68 kD）。負荷した各モ
デル化合物の量は、各円柱内で観察された質量獲得の算出によって求められた。
周囲の培地中への化合物の出現を、負荷量から引くことにより、y軸に基質内に
残存する%とした濃度対時間プロフィールをプロットした（図17）。

【００９５】 該調製を使用した複合体化していないFITC含浸骨の結果は提案されたモデルを
支持しているが、この試験には大きな限界があった。複合体化していないFITCだ
けが、有意義なデータを収集するのに十分、迅速に基質から放出した。骨から遊
離したヘモグロビンは細菌の分解により正確に評価できなかった（ヘモグロビン
はほとんどの細菌のおそらく栄養源である）。FITCはまた自然に分解して、長期
分析を困難にした。さらに検討するための可能な方法には、細菌の導入を禁止す
る閉じた系、抗菌保存剤の使用および自然分解しにくい化合物の使用が含まれる
。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図1Aは7サイクルまでの本発明の周期的な潅流不動態化方法を示
す略図を提供するものであり、図1Bは本発明の方法により処理される移植物質へ
の周期的な圧力および流体暴露を示す。

【図２】 本発明に係る方法を実施するために使用することができる装置の
一態様の略図を示す。

【図３】 本発明に係る方法を実施するための装置のレイアウトのさらに別
の態様の略図を示す。

【図４】 ドナー組織の獲得から最終の滅菌製品包装までの本発明の周期的
な灌流不動態化方法により移植片を処理する種々の段階の全体的なフローチャー
トを提供する。

【図５】 本発明に係る方法を実施するための詳細な処理用格納レイアウト
の一態様を提供する。

【図６】 本発明の方法により処理した後の上腕骨全体の写真である；上腕
骨頭部の清浄後の冠状断面は内部骨基質の清浄化を示す。

【図７】 本発明の方法により処理する前の、近位脛骨、遠位大腿骨および
膝蓋骨を含む無傷の膝関節と連接する腱および靱帯の写真である。

【図８】 本発明の方法により処理した後の、図7に示す無傷の膝関節の、
移植片の清浄化および連接する腱および靭帯の保存を示す写真である。

【図９】 本発明の方法により処理する前の近位大腿骨の冠状断面の前方面
の写真である。

【図１０】 本発明の方法により処理した後の、図9に示す近位大腿骨の冠
状断面の後方面の写真である。

【図１１】 内因性物質を除去するための本発明による処理の有効性を実証
する、図9および図10に示す断面を並べた写真である。

【図１２】 フルオロイソチオシアネート（FITC）蛍光染料処理を使用しな
い皮質骨の骨単位の顕微写真である（倍率400×）。

【図１３】 本発明の清浄液の1つにFITCを添加後の皮質骨の骨単位の顕微
写真であり、骨の隙間の最小部内への染料の深部浸透を実証している-明るい緑
色の領域は、大きいハバース管（右端）およびより小さい付随小腔（中心部；倍
率400×）を含む、FITCを含有する構造物を示す。

【図１４】 皮質骨の液体滅菌方法の効率を試験するモデルシステムを提供
する。

【図１５】 骨圧縮試験対象物の照射または凍結乾燥処理単独と比較した、
本発明の方法による骨の処理の結果を提供する。

【図１６】 周囲圧力、陰圧、陽圧または本発明の方法による周期的な陰圧
および陽圧条件下における皮質骨の再水和の結果を提供する。

【図１７】 骨基質から灌流される生体分子の放出の分析結果を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｆ 2/28 Ａ６１Ｆ 2/28 2/30 2/30 Ａ６１Ｌ 2/02 Ａ６１Ｌ 2/02 Ａ 2/08 2/08 2/20 2/20 Ｋ 2/24 2/24 27/00 27/00 (31)優先権主張番号 ０９／３９０，１７４ (32)優先日 平成11年９月７日(1999．9．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハンステイク シーン カナダ国 オンタリオ州 ウッドブリッジ ロウンツリー デイリー ロード 690 Ｆターム(参考） 4C058 AA17 AA30 BB06 BB07 JJ15 KK01 KK04 4C081 AB03 AB05 AB13 AB17 AB18 BA12 BA14 BA15 BB06 CA081 CA171 CD121 CD151 CD28 CD29 CD34 CE02 CF031 CF111 CG01 EA02 EA11 EA12 4C097 AA01 AA03 AA15 AA20 AA21 AA27 AA30 BB01 DD01 DD09 DD15 EE03 EE08 EE19 MM05 MM08 SB10 SC10

Claims (57)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数のドナーから血液組織以外の組織をプールする段階と、
   病原性または病原性と思われる生物を減少または排除するためにこのようにプー
   ルした組織を処理する段階とを含む、組織を生産する方法。
2. 【請求項２】 移植を必要としているレシピエントに移植するための移植片
   を作製するためにプールした組織を処理する段階をさらに含む請求項1記載の方
   法。
3. 【請求項３】 前記移植片を高いおよび低い陽圧もしくは陰圧またはその両
   方への周期的な暴露を含む、移植片を清浄、灌流および不動態化する方法。
4. 【請求項４】 高い圧力と低い圧力とに対する移植片の周期的な暴露が清浄
   液の存在下で行われる請求項3記載の方法。
5. 【請求項５】 少なくとも一部が、移植片の超音波への同時暴露により行わ
   れる、請求項4記載の方法。
6. 【請求項６】 高い圧力と低い圧力との間の周期化が規定のプログラムによ
   り迅速に行われる、請求項4記載の方法。
7. 【請求項７】 移植片が、多孔性金属、セラミックもしくは合成材料、また
   は皮質骨、海綿骨、筋膜、関節全体、腱、靱帯、硬膜、心膜、心臓弁、静脈、神
   経組織、粘膜下組織および軟骨から選択される同種移植片、自己移植片もしくは
   異種移植片組織からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
8. 【請求項８】 高い圧力と低い圧力との周期化が、清浄液の存在下で移植片
   を含有するチャンバー内で圧力の振動的現象によって達成される、請求項7記載
   の方法。
9. 【請求項９】 a. 移植片を含有するチャンバーを迅速に排液する段階； b. 清浄液または清浄液の混合物を該チャンバーに充填する段階； c. 該チャンバーを加圧する段階；および d. 超音波エネルギーを選択的に適用し、温度を約35〜40℃に維持しながら、
   約1〜150サイクルの間で段階（a）と（c）とを迅速に周期化する段階 を含む、請求項8記載の方法。
10. 【請求項１０】 e. 事前に最終寸法まで加工されていない場合には、移植
    片を最終寸法まで加工する段階 をさらに含む、請求項9記載の方法。
11. 【請求項１１】 f. 同じまたは異なる清浄液を使用して段階（a）〜（d）
    を実施する段階 をさらに含む、請求項10記載の方法。
12. 【請求項１２】 段階（f）が高温または低温下において実施される、請求
    項11記載の方法。
13. 【請求項１３】 移植片を滅菌した密封式包装に入れる段階と、該包装を密
    封する前または後に表面の汚染除去を実施する段階とをさらに含む、請求項12記
    載の方法。
14. 【請求項１４】 移植片が単一のドナーに由来する組織である、請求項9記
    載の方法。
15. 【請求項１５】 移植片がドナー組織のプールに由来する組織である、請求
    項9記載の方法。
16. 【請求項１６】 清浄液が、滅菌水、Triton X-100、TNBP、3%過酸化水素、
    水混和性アルコール、生理食塩液ポビドンヨード、アスコルビン酸溶液、芳香族
    または脂肪族炭化水素、エーテル、ケトン、アミン、尿素、塩酸グアニジン、エ
    ステル、糖蛋白質、蛋白質、糖類、酵素、ガス状酸または過酸化物、およびそれ
    らの混合物からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
17. 【請求項１７】 組織が少なくとも1種の他のドナー由来の同様に処理した
    組織と共にプールされ、同じまたは異なる清浄液を使用して段階（a）〜（d）を
    実施することによってさらに清浄化される、請求項14記載の方法。
18. 【請求項１８】 清浄液が6%過酸化水素、1%次亜塩素酸ナトリウム、6M尿素
    、4M塩酸グアニジン、1N水酸化ナトリウム、イソプロパノール、水、生理食塩液
    およびそれらの混合物からなる群より選択される請求項17記載の方法。
19. 【請求項１９】 約37℃〜約80℃の温度において実施される請求項18記載の
    方法。
20. 【請求項２０】 約50〜60℃において実施される請求項19記載の方法。
21. 【請求項２１】 組織が少なくとも1種の他のドナー由来の同様に処理した
    組織と共にプールされ、同じまたは異なる清浄液を使用して段階（a）〜（d）を
    実施することによって清浄化される請求項15記載の方法。
22. 【請求項２２】 清浄液が6%過酸化水素、1%次亜塩素酸ナトリウム、6M尿素
    、4M塩酸グアニジン、1N水酸化ナトリウム、イソプロパノール、水、生理食塩液
    およびそれらの混合物からなる群より選択される請求項21記載の方法。
23. 【請求項２３】 約37℃〜約80℃の温度において実施される請求項22記載の
    方法。
24. 【請求項２４】 約50〜60℃において実施される請求項23記載の方法。
25. 【請求項２５】 このように処理した移植片が、表面または最終汚染除去段
    階を実施したときに、滅菌環境で包装されており、好ましくは、移植片が最終包
    装形態である請求項1記載の方法。
26. 【請求項２６】 このように処理した移植片が、表面または最終汚染除去段
    階を実施したときに、滅菌環境で包装されており、好ましくは、移植片が最終包
    装形態である請求項3記載の方法。
27. 【請求項２７】 表面または最終汚染除去段階が、移植片を気相H₂O₂、過酢
    酸、γ線照射への暴露、電子線照射、エチレンオキサイドへの暴露またはこれら
    の混合物に接触させる段階を含む、請求項26記載の方法。
28. 【請求項２８】 圧力の周期化が1気圧より高い圧力、1気圧未満の圧力また
    はその両者の圧力において実施される請求項3記載の方法。
29. 【請求項２９】 約60〜100トルの真空圧力および移植片に接触する溶液の
    蒸気圧ならびに約6〜10気圧の充填圧力を使用し、併用する超音波処理が該圧力
    周期化の全般においてまたは特定の段階において実施される請求項28記載の方法
    。
30. 【請求項３０】 移植片が生物活性物質と共に灌流されるか、または生物活
    性物質でコーティングされる請求項3記載の方法。
31. 【請求項３１】 生物活性物質が薬物または増殖因子である請求項30記載の
    方法。
32. 【請求項３２】 増殖因子が、骨形態形成蛋白質、β組織増殖因子もしくは
    増殖因子の組織増殖因子βファミリーのメンバー、軟骨由来の形態形成蛋白質I
    もしくはIIまたはその両者および任意の関連する軟骨由来増殖因子、血管形成因
    子および血小板由来の増殖因子もしくは増殖因子を活性にコードする核酸、細粉
    化され水和されたDBM、骨髄もしくは骨髄抽出物、またはこれらの混合物からな
    る群より選択される請求項31記載の方法。
33. 【請求項３３】 （a）細菌汚染の約1〜12 log減少； （b）外膜ウイルス汚染の約1〜15 log減少； （c）非外膜ウイルス汚染の約5 logまでの減少； （d）内毒素の約2〜10倍の減少； （e）移植片（implant）または移植片（graft）の生物的特性および生体力学特
    性の維持； （f）使用する清浄液による組織毒性の欠如；並びに （g）移植片の低い抗原性 のいずれか1つまたは全てを生ずる請求項3記載の方法。
34. 【請求項３４】 請求項1記載の方法により処理される移植片。
35. 【請求項３５】 請求項3記載の方法により処理される移植片。
36. 【請求項３６】 多孔性金属、セラミック、合成ポリマー、同種移植片、自
    己移植片または異種移植片を含む請求項35記載の移植片。
37. 【請求項３７】 骨を含み、請求項1記載の方法によって処理される結果と
    して、抗原性が低い請求項34記載の移植片。
38. 【請求項３８】 周囲の温度において保存される、凍結乾燥されるまたは凍
    結される請求項34記載の移植片。
39. 【請求項３９】 清浄サイクルの所定の時間に弁またはソレノイド301a〜h
    を活性化または不活性化するためのプログラム可能なロジックコントローラーと
    、清浄化する予定の組織を入れる密封式反応チャンバー310と、清浄液を該密封
    式反応チャンバー310に導入する化学物質混合タンク330と、該反応チャンバー31
    0内に陰圧を徐々に形成する真空ポンプを必要とすることなく、既知の程度の本
    質的に即時的な真空を反応チャンバー310に適用することができるように、該反
    応チャンバー310に接続可能な真空受けタンク360と、滅菌水、生理食塩液等の水
    溶液源と、反応タンク310の無菌状態を維持するために、濾過処理済みガスのコ
    ンプレッサーによって加圧される圧力タンク380とを備える、請求項3記載の方法
    を実施するための装置。
40. 【請求項４０】 清浄化予定の組織を組織全体、不定組織および望ましくな
    い組織から切除する少なくとも1つの組織切除チャンバー510と、少なくとも1種
    の清浄液の存在下で該組織の周期的な加圧下および減圧化のための反応チャンバ
    ー310内の少なくとも1つの密封式ポート515と、移植片の最終的な寸法化および
    加工を実施する少なくとも1つの移植片作製室530と、寸法化した移植片を、少な
    くとも1種の清浄液の存在下において、寸法化した該移植片の周期的な加圧下お
    よび減圧化のための少なくとも1つの密封式ポート535を介して挿入する少なくと
    も1つの反応チャンバー310'と、清浄化した移植片を取り出すための少なくとも1
    つの密封式ポート536と、清浄化した移植片の滅菌包装化のための少なくとも1つ
    の最終滅菌および包装ステーション540とを備える、請求項3記載の方法を実施す
    るための処理設備。
41. 【請求項４１】 移植片の基質の深層に浸透される、核酸、蛋白質、ペプチ
    ド、抗悪性腫瘍化合物、抗炎症性化合物および抗生物質化合物から選択される生
    物的に活性な物質を含む、患者に挿入するための移植片。
42. 【請求項４２】 疾患のある組織またはその一部を採取する段階と、選択的
    に清浄液の存在下および選択的に超音波エネルギーの存在下において、該組織を
    エクスビボにおいて高い圧力および低い圧力に周期的に暴露する段階と、選択的
    に該組織を生物的に活性な物質で灌流する段階と、このように処理した組織を再
    移植する段階とを含む疾患のある組織を治療するための方法。
43. 【請求項４３】 複合移植片を形成するために、請求項1記載の方法により
    処理した組織を、または組織および合成材料を組み合わせる段階を含む、移植片
    を生産するための方法。
44. 【請求項４４】 複合移植片を形成するために、請求項3記載の方法により
    処理した組織を、または組織および合成材料を組み合わせる段階を含む、移植片
    を生産するための方法。
45. 【請求項４５】 組織内に存在する内因性酵素を低下、排除または希釈する
    ように組織を処理する段階であって、このように処理した組織を凍結乾燥または
    凍結する必要なく滅菌容器中で保存できるように処理する段階を含む、移植を必
    要としているレシピエントに移植するための組織を調製する方法。
46. 【請求項４６】 組織が骨である請求項3記載の方法であって、骨を部分的
    に鉱物質除去するため酸による骨の処理を含む方法。
47. 【請求項４７】 骨組織から内因性脂質を除去する段階を含む請求項3記載
    の方法。
48. 【請求項４８】 前記の処理した骨組織を凍結乾燥する段階をさらに含む請
    求項47記載の方法。
49. 【請求項４９】 移植を必要としているレシピエントに再構成した骨を移植
    するとき送達が望まれる生物的に活性な因子を含有する溶液中で凍結乾燥した骨
    を再構成する段階をさらに含む請求項48記載の方法。
50. 【請求項５０】 移植片が骨である請求項3記載の方法であって、正常な骨
    ミネラル含量の約0〜25%の程度まで骨が鉱物質除去されるように、骨を酢酸、塩
    酸、フッ化水素酸、リン酸、クエン酸、ギ酸、酪酸またはこれらの混合物と接触
    させる段階を含み、選択的に該接触段階の前、その最中または後において、同一
    または異なるドナーまたは種由来の同様に処理した骨組織と共にプールされる方
    法。
51. 【請求項５１】 骨が、正常な骨ミネラル含量の約1〜10%の程度まで鉱物質
    除去される請求項50記載の方法。
52. 【請求項５２】 該骨が、正常な骨ミネラル含量の約1〜約5%の程度まで鉱
    物質除去される請求項51記載の方法。
53. 【請求項５３】 請求項50記載の方法により製造される移植片。
54. 【請求項５４】 組織がDBMである請求項1記載の方法。
55. 【請求項５５】 請求項54記載の方法により製造されたDBMのプールを含む
    組成物。
56. 【請求項５６】 組織が自己移植組織、同種移植組織、異種移植組織または
    それらの組み合わせを含む請求項1記載の方法。
57. 【請求項５７】 請求項56記載の方法により製造された移植片。