JP2002529046A - Enterococcus faecalisのポリヌクレオチドおよびポリペプチド - Google Patents
Enterococcus faecalisのポリヌクレオチドおよびポリペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、Enterococcus faecalisのゲノムのポリヌクレオチド配列、そのポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列、対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチド、そのポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主、ならびにそれらのアッセイおよび他の使用を提供する。本発明は、コンピュータ読み出し可能な媒体に格納されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列情報、およびコンピュータベースのシステム、およびその使用を容易にする方法をさらに提供する。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野に関する。詳細には、本発明は、とりわけEntero
coccus faecalisのヌクレオチド配列、コンティグ(contig)、ORF、フラグメント
、プローブ、プライマー、およびそれに関連したポリヌクレオチド、その配列に
よりコードされるペプチドおよびポリペプチド、ならびにそのポリヌクレオチド
および配列の使用(例えば、とりわけ、発酵、ポリペプチド産生、アッセイ、お
よび医薬の開発)に関する。
発明の背景
Enterococcusは、1988年にThiercelinによって微生物として最初に記載された
、世紀の変わり目以来、ヒトに対する病原性として認識されてきた。Enterococc
us属は、Enterococcus faecalis種またはE.faecalis(これは、この群のなかで
最も一般的な病原体であり、すべての腸球菌感染の80〜90%の原因である)を含
む。Lewisら、(1990)Eur.J.Clin.Microbiol Infect Dis 9:117-117。
腸球菌感染の発生率は近年増加しており、そして腸球菌は今や、二番目に最も
頻繁に報告されている院内の病原体である。腸球菌感染は、その抗生物質耐性の
ために、非常に危惧されている。近年の注目は、院内感染における役割の増加の
ためだけではなく、抗菌剤に対する顕著でかつ増加しつつあるそれらの耐性のた
めにもまた、腸球菌に集まっている。これらの因子は相互に補強する。というの
は、抗菌剤が激しく使用されている環境中において、耐性によって腸球菌の生存
が可能になるからである;病院での設定条件は、感受性細菌を排除または抑制す
る抗生物質を提供し、それにより耐性生物についての選択的な利点を提供し、そ
して病院はまた、手および環境混入の通常の経路を介して耐性腸球菌の蔓延の可
能性を提供する。
抗菌剤耐性は、固有(inherent)すなわち固有(intrinsic)の特性、および獲
得性のものの、2つの一般型に分けられ得る。固有の耐性についての遺伝子は他
の種の特徴のように、染色体上に存在するようである。獲得性耐性は存在するDN
Aにおける変異または新規のDNAの獲得のいずれかから生じる。腸球菌によって発
現される種々の固有の形質は、半合成ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、セファロ
スポリン、低レベルのアミノグリコシドおよび低レベルのクリンダマイシンに対
する耐性が挙げられる。獲得性耐性の例には、クロラムフェニコール、エリスロ
マイシン、高レベルのクリンダマイシン、テトラサイクリン、高レベルのアミノ
グリコシド、ペニシリナーゼによるペニシリン、フルオロキノロンおよびバンコ
マイシンに対する耐性が挙げられる。ペニシリナーゼが存在しない場合の高レベ
ルのペニシリンに対する耐性およびフルオロキノロンに対する耐性がプラスミド
またはトランスポゾン媒介性であることは公知ではなく、そしておそらく変異に
起因する。
ヒトにおける腸球菌の主なリザーバは胃腸管であるが、この細菌はまた胆嚢、
尿道および膣に存在し得る。
E.faecalisは、心内膜炎、菌血症、***症(UTI)、腹腔内感染、軟組織
感染および新生児敗血症における重要な病原体として現れている(Lewisら(199
0)上述)。1970年代および1980年代に、腸球菌は主要な院内の病原体としてし
っかりと確立された。現在、米国において、これらは院内感染の4番目に主要な
原因であり、そして菌血症の3番目に主要な原因である。腸球菌細菌の死亡率は
、12%〜68%の範囲にあり、この症例の4〜50%において腸球菌性敗血症に起因
する死亡を伴う。Emori、T.G.(1993)Clin.Microbiol.Rev.6:428〜442を参照の
こと。
腸球菌の、胃腸管にコロニー形成する能力、ならびに固有および獲得性耐性形
質は、これらの生物(通常は相対的に低い固有の毒性を有するようである)が2
次的侵入者になる優れた機会が与えられることを意味する。腸球菌の院内単離物
は全ての有用な抗菌剤に対して本質的に耐性を示すので、腸球菌感染の首尾良い
処置および制御はますます困難となるようである。特に種々の耐性遺伝子が単一
の株に共に生じる場合、今後ある時点で、ある事象が生じるのは確実である。
Enterococcus faecalisにより媒介または悪化する疾患の病因は、E.faecalis
遺伝子のプログラムされた発現に関し、そしてこれらの遺伝子を特徴付けそして
その発現パターンは、生物およびその宿主との相互作用についての本発明者らの
理解を劇的に増加させる。E.faecalis遺伝子およびゲノム構成についての知識は
、疾患病因学についての本発明者らの理解を向上させ、そして疾患を予防、処置
、および診断するための改善されたかつ新規の方法を導く。従って、E.faecalis
のゲノムを特徴付ける必要性、およびこの生物のポリヌクレオチドに対する必要
性が存在する。
発明の要旨
本発明は、Enterococcus faecalisゲノムのフラグメントの配列決定に基づく
。生じた一次ヌクレオチド配列は、配列番号1〜982に提供される。
本発明は、当業者により容易に使用、分析、および解釈され得る形態で、Ente
rococcus faecalisゲノムの数百のコンティグのヌクレオチド配列(これらは、
以下の表に列挙され、そして本明細書に提示される配列表に示されている)およ
びそれらの代表的なフラグメントを提供する。1つの実施態様においては、本発
明は、配列番号1〜982に示されるヌクレオチド配列に対応する一次配列情報の
連続した文字列として提供される。
本発明はさらに、配列番号1〜982のヌクレオチド配列に少なくとも95%同一
であるヌクレオチド配列を提供する。
配列番号1〜982のヌクレオチド配列、それらの代表的なフラグメント、また
は配列番号1〜982のヌクレオチド配列に少なくとも95%同一であるヌクレオチ
ド配列が、その使用を容易にするために種々の媒体において提供され得る。本実
施態様の1つの適用において、本発明の配列は、コンピューター読み出し可能な
媒体に記録される。このような媒体は、磁気記憶媒体(例えば、フロッピーディ
スク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ);光学的記憶媒体(例えば
、CD-ROM);電気的記憶媒体(例えば、RAMおよびROM);およびこれらのカテゴ
リーのハイブリッド(例えば、磁気/光学的記憶媒体)を包含するが、これらに
限定されない。
本発明はさらに、データ記憶手段に記憶された本明細書中に記載の配列情報を
含むシステム、特にコンピューターに基づくシステムを提供する。このようなシ
ステムは、Enterococcus faecalisゲノムの商業的に重要なフラグメントを同定
するために設計される。
本発明の別の実施態様は、特定の構造的または機能的な属性を有するEnteroco
ccus faecalisゲノムのフラグメントに関する。本発明のEnterococcus faecalis
ゲノムのこのようなフラグメントは、ペプチドをコードするフラグメント(本明
細書で以後、オープンリーディングフレームまたはORFという)、作動可能に連
結したORFの発現を調整するフラグメント(本明細書で以後、発現調整フラグメ
ントまたはEMFという)、およびサンプル中のEnterococcus faecalisの存在を診
断するために用いられ得るフラグメント(本明細書で以後、診断フラグメントま
たはDFという)を包含するがこれらに限定されない。
表1〜3に開示されるEnterococcus faecalisゲノムのフラグメント中のORFお
よび開始コドンの5’プライムに見出されるEMFはそれぞれ、ポリヌクレオチド
試薬として多くの方法で用いられ得る。例えば、配列は、サンプル中の特定の微
生物の存在を検出または決定するための診断プローブまたは増幅プライマーとし
て、宿主における遺伝子発現およびポリペプチド(例えば、本発明のORFにより
コードされるポリペプチド、薬理学的活性を有する特定のポリペプチド)の産生
における遺伝子発現を選択的に制御するために用いられ得る。
本発明はさらに、本発明のEnterococcus faecalisゲノムの1つ以上のフラグ
メントを含有する組換え構築物を包含する。本発明の組換え構築物は、Enteroco
ccus faecalisのフラグメントが挿入されたベクター(例えば、プラスミドまた
はウイルスベクター)を含有する。
本発明はさらに、本発明のEnterococcus faecalisゲノムの任意の単離フラグ
メントを含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、高等真核生物宿主細胞(例
えば、哺乳動物細胞)、下等真核生物細胞(例えば、酵母細胞)または原核生物
細胞(例えば、細菌細胞)であり得る。
本発明はさらに、本発明のORFによりコードされる単離ポリペプチドおよびタ
ンパク質に関する。当業者に周知の種々の方法が、本発明の任意のポリペプチド
およびタンパク質を得るために日常的に利用され得る。例えば、比較的短い、単
純なアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドおよびタンパク質が、市販の自
動ペプチド合成機を用いて容易に合成され得る。本発明のポリペプチドおよびタ
ンパク質はまた、天然にタンパク質を産生する細菌細胞から精製され得る。さら
に別の代替法は、本発明のポリペプチドおよびタンパク質をそれらの発現を改変
された細胞から精製することである。
本発明はさらに、本発明のEnterococcus faecalisゲノムのフラグメントのホ
モログおよび本発明のORFによりコードされるタンパク質のホモログを得る方法
を提供する。特に、本明細書に開示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列
をプローブまたはプライマーとして用い、そしてPCRクローニングおよびコロニ
ー/プラークハイブリダイゼーションのような技術を用いることにより、当業者
はホモログを入手し得る。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドおよびタンパク質に選択的に結合する
抗体を提供する。このような抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体
の両方を包含する。
本発明はさらに、上記抗体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリド
ーマは、特定のモノクローナル抗体を分泌し得る不死化細胞株である。
本発明はさらに、本発明のORFの1つまたはそのホモログを発現する細胞由来
の試験サンプルを同定する方法を提供する。このような方法は、サンプルがORF
またはそれから産生される産物を含有するか否かを決定することを当業者に可能
にする条件下で、試験サンプルを、本発明の1つ以上の抗体とともに、あるいは
本発明の1つ以上のDFとともにインキュベートする工程を包含する。
本発明の別の実施態様では、上記アッセイを行うために必要な試薬を含むキッ
トが提供される。
特に、本発明は、厳重に詰めた状態で以下を含む1つ以上の容器を収納するた
めの区画化されたキットを提供する:(a)本発明の抗体のうちの1つまたはDFの
内の1つを含む第1の容器;および(b)以下の内の1つ以上を含む1つ以上の他
の容器:洗浄試薬、結合した抗体またはハイブリダイズしたDFの存在を検出し得
る試薬。
本発明の単離されたタンパク質を用いて、本発明はさらに、本発明のORFの1
つによりコードされるポリペプチドまたはタンパク質に結合し得る薬剤を入手お
よび同定する方法を提供する。具体的には、このような薬剤は、さらに以下に記
載のように、抗体、ペプチド、炭水化物、薬学的薬剤などを包含する。このよう
な方法は、以下の工程を包含する:(a)薬剤を、本発明のORFの1つによりコード
される単離されたタンパク質と接触させる工程;および(b)この薬剤が該タンパ
ク質に結合するか否かを決定する工程。
本発明のEnterococcus faecalisのゲノム配列は、この生物を用いて研究する
全ての研究室および種々の商業的目的にとって非常に価値がある。Enterococcus
faecalisゲノムの多くのフラグメントは、GenBankまたはタンパク質データベー
スに対する類似性の調査により直ちに同定され、そしてEnterococcus faecalis
研究者に直ちに価値があり、そしてタンパク質の産生または遺伝子発現の制御に
ついて直ちに商業的価値がある。
細菌および他のゲノムの大規模なゲノム配列を解明するための方法論および技
術は、染色体機構を分析および理解する能力を大いに増大する。特に、配列決定
されたコンティグおよびゲノムが、染色体の構造および機能を分析するための手
段を開発するためのモデルを提供する。これには、ゲノムDNAの大きなセグメン
トの中の遺伝子、調節エレメントの構造、位置、および間隔を同定するための能
力、潜在的な産業応用性を有する遺伝子の同定、および比較ゲノム系統発生学お
よび比較分子系統発生学を行うための能力が包含される。
図面の簡単な説明
図1は、本発明のコンピューターに基づくシステムを実行するために用いられ
得るコンピューターシステム(102)のブロック図である。
図2は、本発明のEnterococcus faecalisゲノムのコンティグを収集、アセン
ブル、編集、および注釈付けするために用いられるデータフローおよびコンピュ
ータープログラムを示す模式図である。MacintoshおよびUnix platformの両方が
、主としてKerlavageら,Proceedings of the Twenty-Sixth Annual Hawaii Inte
rnational Conference on System Sciences,585,IEEE Computer Society Pres
s, Washington D.C.(1993)に記載されるようにAB373および377配列のデータフ
ァ
イルを扱うために用いられる。Factura(AB)は、配列ファイルの自動的なベクタ
ー配列除去および末端トリミングのために設計されたMacintoshプログラムであ
る。プログラムSequisはMacintoshプラットフォーム上で作動し、そしてFactura
により配列ファイルから抽出された特徴データをUnixに基づくEnterococcus fae
calisリレーショナルデータベースに対して解析する。コンティグ(およびゲノ
ム配列全体)のアセンブリは、SQLデータベースから配列を取り出すためのUnix
ユーティリティーであるExtrseqを用いて、特定の配列ファイルのセットおよび
それらに関連する特徴を取り出すことによって達成される。得られた配列ファイ
ルをSeq filterにより処理して、1%よりも多い不明瞭なヌクレオチドを有する
配列部分を取り除く。配列ファイルを、数千の配列フラグメントの迅速で正確な
アセンブリのためにThe Institute for Genomic Research(TIGR)で設計されたア
センブリエンジンであるTIGR Assemblerを用いてアセンブリした。このアセンブ
リ工程により生成されたコンティグの収集は、lassieプログラムを用いてデータ
ベースにロードされる。オープンリーディングフレーム(ORF)の同定は、GeneM
ark(Borodovsky,M.およびMcIninch、J.D.(1993)Comput.Chem.17:123-133に記
載される)でコンティグを処理することにより達成される。ORFは、GenBank由来
のE.faecalis配列に対して検索され、そしてAltschulら、J.Mol.Biol.215: 403-
410(1990)に記載されるBLASTNおよびBLASTPプログラムを用いて全てのタンパク
質配列に対して検索される。ORF決定および類似性検索工程の結果を、データベ
ースにロードした。以下に記載のように、決定および検索のいくつかの結果を表
1〜3に示す。
例示的実施態様の詳細な説明
本発明は、Enterococcus faecalisゲノムのフラグメントの配列決定およびそ
の配列の分析に基づく。フラグメントを配列決定することにより作成した一次ヌ
クレオチド配列が、配列番号1〜982に提供される。(本明細書で使用される「
一次配列」とは、IUPAC命名システムにより表されるヌクレオチド配列をいう。
)
上記のEnterococcus faecalisポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列
に加えて、本発明は、当業者に容易に使用され、分析され、そして解釈され得る
形態で配列番号1〜982のヌクレオチド配列、またはそれらの代表的なフラグメ
ントを提供する。
本明細書で使用される「配列番号1〜982に示されるヌクレオチド配列の代表
的なフラグメント」とは、公に入手可能なデータベース内に現在表示されていな
い配列番号1〜982の任意の部分をいう。本発明の好ましい代表的なフラグメン
トは、Enterococcus faecalisオープンリーディングフレーム(ORF)、発現調整
フラグメント(EMF)およびサンプル中のEnterococcus faecalisの存在を診断す
るために使用され得るフラグメント(DF)である。好ましい代表的なフラグメン
トの制限されない同定例は表1〜3を提供する。以下で詳細に議論するように、
日常的なクローニング、合成、配列決定およびアッセイ方法と共に、配列番号1
〜982および表1〜3に提供される情報により、当業者は、広範な種々のEnteroc
occus faecalisタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを包含す
る、目的の全ての「代表的なフラグメント」をクローン化しそして配列決定し得
る。
本発明はさらに、本明細書に記載のヌクレオチド配列の部分またはフラグメン
トをコードする核酸分子に関する。フラグメントは、表1〜3および配列番号1
〜982のヌクレオチド配列の部分(少なくとも10個の連続するヌクレオチド長(
これは、一方が5'ヌクレオチド位を表す、そして2番目が3'ヌクレオチド位を表
す任意の2つの整数から選択され、ここで、配列番号1〜982における各ヌクレ
オチド配列における第一のヌクレオチドは1位である))を含む。すなわち、少
なくとも10個の連続するヌクレオチド長のフラグメントが占め得る5’および3
’ヌクレオチド位のすべての組合せは本発明に含まれる。少なくともとは、フラ
グメントが10個の連続するヌクレオチド塩基長であり得るか、または10と(配
列番号1〜982のヌクレオチド配列全体の長さ−1)との間の任意の整数を意味す
る。従って、配列番号1〜982のヌクレオチド配列の任意の5'および3'ヌクレオチ
ド塩基位置によって特定される連続するフラグメント(ここで、連続するフラグ
メントが、10と(ヌクレオチド配列全体の長さ−1)との間の任意の整数である
)が本発明に含まれる。
さらに、本発明は、ヌクレオチド位置ではなく、ヌクレオチドのサイズによっ
て特定されるフラグメントを含むポリヌクレオチドを包含する。本発明は、10と
(ヌクレオチド配列全体の長さ−1)との間の整数から選択された、連続するヌ
クレオチドの任意のフラグメントサイズを包含する。連続するヌクレオチドフラ
グメントの好ましいサイズは、20ヌクレオチド、30ヌクレオチド、40ヌクレオチ
ド、50ヌクレオチドを含む。連続するヌクレオチドフラグメントの他の好ましい
サイズは、診断プローブおよびプライマーとして有用であり得、そして、フラグ
メント50〜300ヌクレオチド長を含み、これは、上記のように、50と300との間の
各整数を表すフラグメントサイズを含む。より大きなフラグメントはまた、本発
明に従って有用であり、これは、配列番号1〜982に示されたヌクレオチド配列
の全てではない場合でもほとんどに対応する。好ましいサイズは、当然、本発明
を例示するものであって制限するものではないことが意味される。なぜなら、10
と(各配列番号のヌクレオチド配列全体の長さ−1)との間の任意の整数を表す
全てのサイズのフラグメントが本発明に含まれるからである。
本発明はまた、配列番号1〜982の任意のヌクレオチド配列について上記に記
載されたように、5'および3'塩基位置によってまたはヌクレオチド塩基のサイズ
によって特定される任意のフラグメントの排除も提供する。上記のように、5'お
よび3'塩基位置によってまたはヌクレオチドのサイズによって特定される、配列
番号1〜982におけるヌクレオチド配列の任意の数のフラグメントは、本発明か
ら排除され得る。
本明細書に開示される配列番号1〜982の配列は、非常に正確であるが、配列
決定技術は完全ではなく、そして比較的希な場合に、本発明のフラグメントまた
は配列のさらなる調査は、配列番号1〜982に開示されるヌクレオチド配列に存
在するヌクレオチド配列の誤りを明らかにし得る。しかし、一旦本発明が利用可
能とされると(すなわち、一旦配列番号1〜982および表1〜3の情報が利用可
能となると)、配列番号1〜982中の希な配列決定の誤りを解決することは、当
該技術分野の範囲内である。本開示は、任意の記載されるコンティグ群またはそ
れらの部分が、日常的な技術の簡単な適用により容易に得られ得るに十分な配列
情報を入手可能にする。このようなポリヌクレオチドのさらなる配列決定は、当
該技術分野において至る所で使用されている手動および自動化配列決定方法を用
いて同様の手法で実施し得る。ヌクレオチド配列編集ソフトウエアは、公に入手
可能である。例えば、Applied Biosystem(AB)のAutoAssemblerは、ヌクレオチ
ド配列の視覚検査の際の補助として使用され得る。このような日常的な技術を使
用することにより、潜在的な誤りは、容易に同定され得、次いで正確な配列が、
日常的な性質のものでもあるさらなる配列決定の努力を、潜在的な誤りを含む領
域に向けることにより、確認され得る。
たとえ配列番号1〜982中の非常に希な配列決定の誤りの全てが訂正されたと
しても、得られるヌクレオチド配列は、依然として配列番号1〜982のヌクレオ
チド配列と少なくとも95%同一であり、ほぼ全てが配列番号1〜982のヌクレオ
チド配列と少なくとも99%同一であり、そして大多数が配列番号1〜982のヌク
レオチド配列と少なくとも99.9%同一である。
本明細書中の他で議論するように、本発明のポリヌクレオチドは、DNAをクロ
ーニングおよび配列決定するための、周知のおよび標準的な手法の日常的な適用
により容易に得られ得る。本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび入手
するためのEnterococcus faecalisゲノムDNAを調製するために使用され得る広範
な種類のE.faecalis株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)の
ような承認された寄託機関から公に入手可能である。本発明は、本明細書中に開
示される配列および他の情報により実施可能であるが、本発明の配列表のDNAを
提供したE.faecalis株であるV586(これは、Michael Gilmore博士、University
of Oklahomaからの親切な贈与である)は、当業者に便利なように、ATCCに寄託
されている。E.faecalis株V586は、1997年5月2日にATCC、10801 University B
lvd.Manassas,VA 20110−2209に寄託され、そして寄託番号55969を与えられた
。寄託の取得は、本主題における発明者または譲受人のいかなる権利の放棄でも
ない。
異なるEnterococcus faecalis株由来のゲノムのヌクレオチド配列は、多少異
なる。しかし、全てのEnterococcus faecalis株のゲノムのヌクレオチド配列は
、対応する部分において、配列番号1〜982に提供されるヌクレオチド配列と少
なくとも95%同一である。ほぼ全てが少なくとも99%同一であり、そして大多数
が
99.9%同一である。
本願は、さらに、配列番号1〜982に示された核酸配列と少なくとも90%、95
%、96%、97%、98%、または99%同一である核酸分子に関する。上記の核酸配
列は、それらがE.faecalis活性を有するポリペプチドをコードするか否かに拘ら
ず、包含される。これは、特定の核酸分子が、E.faecalis活性を有するポリペプ
チドをコードしない場合でもなお、当業者は、核酸分子の使用法(例えば、ハイ
ブリダイゼーションプローブとして)を理解するからである。本発明のE.faecal
is活性を有するポリペプチドをコードしない核酸分子の使用は、特に、DNAライ
ブラリーからE.faecalis遺伝子またはその対立遺伝子改変体を単離すること、お
よびE.faecalis mRNA発現サンプル、E.faecalisを含むと疑われる環境サンプル
を、ノーザンブロット分析によって検出することを包含する。
配列番号1〜982に示す核酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%
、または99%同一である配列を有する、実際に、E.faecalisタンパク質活性を有
するポリペプチドをコードする核酸分子が好ましい。「E.faecalis活性を有する
ポリペプチド」によって、特定のタンパク質の活性を測定するのに適した特定の
生物学的アッセイにおいて測定された場合、本発明のE.faecalisタンパク質の活
性に、類似する(必ずしも同一でない)活性を示すポリペプチドが意図される。
遺伝子コードの縮重性に起因して、当業者は、配列番号1〜982に示す核酸配
列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列を有
する大多数の核酸分子がE.faecalisタンパク質活性を有するポリペプチドをコー
ドすることを直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体の
すべてが同一のポリペプチドをコードするので、このことは、上記に記載の比較
アッセイを行わずしても当業者には明白である。当該分野において、縮重改変体
でないような核酸分子について、かなりの数がまた、E.faecalisタンパク質活性
を有するポリペプチドをコードすることがさらに認識される。このことは、当業
者が、以下にさらに記載のように、タンパク質機能に有意に影響をほとんど与え
ないかまたは全く与えないかのいずれかであるようであるアミノ酸置換(例えば
、1つの脂肪族アミノ酸を第二の志望族アミノ酸で置換すること)を十分に知っ
ているからである。
本発明のポリペプチドの生物学的活性または機能は、高度な構造同一性/類似
性を共有する他の細菌由来のポリペプチドに類似するかまたは同一であることが
予測される。表1および2は、GenBankを通して入手可能なポリペプチドポリペ
プチドの配列と密接に一致する配列についての受託番号および記載を列挙する。
従って、本発明のポリペプチドの生物学的活性または機能は、表1および2に列
挙される他の細菌属、種、または株由来のそれらのポリペプチドと類似するかま
たは同一であることが予測される。
本発明の参照ヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも95%「同一な」
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、そのポリヌクレオチドの
ヌクレオチド配列が、E.faecalisポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド
配列の各100ヌクレオチドあたり5つまでの点変異をポリヌクレオチド配列が含
み得ることを除いて、参照配列に同一であることが意図される。言い換えれば、
参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチドを得るために、参照配列における5%までのヌクレオチドが欠失
され得るか、挿入されるか、または別のヌクレオチドで置換され得る。照会配列
は、配列番号1〜982に示される全体の配列、ORF(オープンリーディングフレー
ム)、または本明細書中に記載されるような指定された任意のフラグメントであ
り得る。
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であ
るかどうかは、公知のコンピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得
る。照会配列(本発明の配列)と対象の配列との間の最良の全体的なマッチ(全
体的な配列整列ともいわれる)を決定する好ましい方法は、Brutlagらのアルゴ
リズムに基づくFASTDBコンピュータープログラムを使用して決定され得る。Brut
lagら(1990)Comp.App.Biosci.6:237-245を参照のこと。配列整列において
、照会配列および対象配列は共にDNA配列である。RNA配列は、最初にUをTに変換
することによって比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、同一性パーセ
ントである。同一性パーセントを計算するためのDNA配列のFASTDB整列において
使用される好ましいパラメーターは、以下の通りである:Matrix=Unitary、k-t
up
le=4、Mismatch Penalty=1、Joining Penalty=30、Randomization Group Le
ngth=0、Cutoff Score=1、Gap Penalty=5、Gap Size Penalty=0.05、Window
Size=500または対象ヌクレオチド配列の長さのいずれか短い方。
対象配列は、内部欠失のためではなく、5'または3'欠失のために照会の配列よ
りも短い場合、マニュアル補正が結果に対して行われなければならない。これは
、FASTDBプログラムが同一性パーセントを計算する場合、対象配列の5'および3'
短縮化を考慮しないからである。照会配列と比較して5'末端および3'末端で短縮
化された参照配列について、同一性パーセントは、マッチ/整列しない対象配列
の5'側および3'側である照会配列の塩基数を、照会配列の総塩基のパーセントと
して計算することによって補正される。ヌクレオチドがマッチ/整列したか否か
は、FASTDB配列整列の結果によって決定される。次いで、この百分率は、指定さ
れたパラメーターを使用して上記のFASTDBプログラムによって計算された同一性
パーセントから引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正
されたスコアは、本発明の目的のために使用されるスコアである。照会の配列と
マッチ/整列しないFASTDB整列によって示されるように、対象配列の5'および3'
ヌクレオチドの外側のヌクレオチドのみが、同一性パーセントスコアを手作業で
調整する目的のために計算される。
例えば、90ヌクレオチド対象配列が、同一性パーセントを決定するために、10
0ヌクレオチド照会配列に整列される。欠失は対象配列の5'末端で生じ、そして
それ故、FASTDB整列は、5'末端で最初の10ヌクレオチドのマッチ/整列を示さな
い。10の非対合ヌクレオチドは10%の配列(マッチしない5'および3'末端のヌク
レオチドの数/照会配列のヌクレオチドの総数)を表し、従って、10%が、FAST
DBプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから引かれる。残った
90ヌクレオチドが完全にマッチした場合、最終的な同一性パーセントは90%であ
る。別の例において、90ヌクレオチドの対象配列は、100ヌクレオチドの照会配
列と比較される。このとき、欠失は内部欠失であり、従って、照会とマッチ/整
列しない、対象配列の5'または3'におけるヌクレオチドは存在しない。この場合
、FASTDBによって計算される同一性パーセントは、手作業で補正されない。再度
、照会配列にマッチ/整列しない対象配列の5'側および3'側のヌクレオチドのみ
が、
手作業で補正される。他の手作業補正は、本発明の目的のためにはなされない。
コンピューター関連の実施態様
配列番号1〜982に提供されるヌクレオチド配列、それらの代表的なフラグメ
ント、または配列番号1〜982のポリヌクレオチド配列と少なくとも95%、好ま
しくは少なくとも99%、および最も好ましくは少なくとも99.9%同一であるヌク
レオチド配列は、それらの使用を容易にするために種々の媒体中で「提供され」
得る。本明細書中で使用されるように、提供されるとは、単離された核酸分子以
外の製品について言及し、これは本発明のヌクレオチド配列(すなわち、配列番
号1〜982に提供されるヌクレオチド配列)、それらの代表的なフラグメント、
または配列番号1〜982のポリヌクレオチドと少なくとも95%、好ましくは少な
くとも99%、および最も好ましくは少なくとも99.9%同一であるヌクレオチド配
列を含む。このような製品は、Enterococcus faecalisゲノムの大部分およびそ
の一部分(例えば、Enterococcus faecalisオープンリーディングフレーム(ORF
))を、Enterococcus faecalisゲノムまたはそのサブセットの試験には直接適
用できない(それが、天然かもしくは精製された形態で存在するため)手段を用
いて、当業者がこの製品を試験することを可能にする形態で提供する。
本発明の実施態様の1つの適用において、本発明のヌクレオチド配列は、コン
ピューター読み取り可能媒体に記録され得る。本明細書で使用される「コンピュ
ーター読み取り可能媒体」とは、コンピューターにより直接読み取られ得、そし
てアクセスされ得る任意の媒体をいう。このような媒体には、磁気記憶媒体(例
えば、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ);光
学記憶媒体(例えば、CD-ROM);電気記憶媒体(例えば、RAMおよびROM);なら
びにこれらのカテゴリーのハイブリッド(例えば、磁気/光学記憶媒体)が挙げ
られるが、これらに限定されない。当業者は、現在公知の任意のコンピューター
読み取り可能媒体が、その上に本発明のヌクレオチド配列を記録しているコンピ
ューター読み取り可能媒体を含む製品を作り出すために、どのように使用され得
るかを、容易に理解し得る。同様に、開発され得るさらなるコンピューター読み
取り可能媒体がまた、その上に本発明のヌクレオチド配列を記録している類似の
製品を作り出すためにどのように使用され得るかは、当業者に明らかである。
本明細書で使用される「記録された」とは、コンピューター読み取り可能媒体
に情報を記憶するプロセスをいう。当業者は、本発明のヌクレオチド配列の情報
を含む製品を生成するために、コンピューター読み取り可能媒体に情報を記録す
る、現在公知の任意の方法を容易に採用し得る。種々のデータ記憶構造体が、そ
の上に本発明のヌクレオチド配列を記録しているコンピューター読み取り可能媒
体を作り出すために、当業者に利用可能である。データ記憶構造体の選択は、一
般的には記憶した情報にアクセスするために選択される手段に基づく。さらに、
種々のデータプロセッサープログラムおよびフォーマットが、本発明のヌクレオ
チド配列の情報をコンピューター読み取り可能媒体に記憶するために使用され得
る。配列の情報は、市販の入手可能なソフトウエア(例えば、WordPerfectおよ
びMicroSoft Word)でフォーマットされたワードプロセッシングテキストファイ
ルに表され得るかまたは、データベースアプリケーション(例えば、DB2、Sybas
e、Oracleなど)に記憶された、ASCIIファイルの形態で表され得る。当業者は、
その上に本発明のヌクレオチド配列の情報を記録しているコンピューター読み取
り可能媒体を得るために、任意の数のデータプロセッサー構造フォーマット(例
えば、テキストファイルまたはデータベース)を容易に適応させ得る。
コンピューターソフトウエアは、公的に入手可能であり、これにより、当業者
がコンピューター読み取り可能媒体に提供された配列情報にアクセスすることが
可能となる。従って、コンピューター読み取り可能形態において、配列番号1〜
982のヌクレオチド配列、それらの代表的なフラグメント、または配列番号1〜9
82の配列と少なくとも95%、好ましくは少なくとも99%、そして最も好ましくは
少なくとも99.9%同一のヌクレオチド配列を提供することにより、本発明は、当
業者が広範な種々の目的のために提供された配列情報に日常的にアクセスするこ
とを可能にする。
以下の実施例は、Sybaseシステム上でBLAST(Altschulら、J.Mol.Biol.215:40
3-410(1990))およびBLAZE(Brutlagら、Comp.Chem.17:203-207(1993))検索ア
ルゴリズムを行うソフトウエアが、Enterococcus faecalis由来および他の生物
由来の両方のORFまたはタンパク質に対する相同性を含むEnterococcus faecalis
ゲノム内のオープンリーディングフレーム(ORF)を同定するためにどのように
使用されたかを示す。本明細書中に記載されるORFには、商業的に重要なタンパ
ク質(例えば、発酵反応に使用される酵素)の生産および商業的に有用な代謝産
物、ワクチンとしてもしくは免疫療法薬剤の生成において使用されるタンパク質
、または薬物スクリーニングの標的として使用されるタンパク質の生産に有用な
Enterococcus faecalisゲノムの、タンパク質をコードするフラグメントがある
。
本発明は、さらにシステム、特に本明細書中に記載される配列情報を含むコン
ピューターベースのシステムを提供する。このようなシステムは、とりわけEnte
rococcus faecalisゲノムの商業的に重要なフラグメントを同定するために設計
される。
本明細書中で使用される「コンピューターベースのシステム」とは、本発明の
ヌクレオチド配列の情報を分析するために使用されるハードウエア手段、ソフト
ウエア手段、およびデータ記憶手段をいう。本発明のコンピューターベースのシ
ステムの最小のハードウエア手段は、中央演算処理装置(CPU)、入力手段、出
力手段、およびデータ記憶手段を備える。当業者は、現在利用可能なコンピュー
ターベースのシステムのいずれかが、本発明における使用に適切であることを、
容易に理解し得る。
上記のように、本発明のコンピューターベースのシステムは、その中に記憶さ
れた本発明のヌクレオチド配列が記憶されたデータ記憶手段および必要なハード
ウエア手段ならびに検索手段を支持しかつ行うためのソフトウエア手段を備える
。
本明細書中で使用される「データ記憶手段」とは、本発明のヌクレオチド配列
情報を記憶し得るメモリ、またはその上に本発明のヌクレオチド配列情報を記録
している製品にアクセスし得るメモリアクセス手段をいう。
本明細書で使用される「検索手段」とは、標的配列または標的構造モチーフを
、データ記憶手段内に記憶された配列情報と比較するために、コンピューターベ
ースのシステムで実行される1つまたはそれ以上のプログラムをいう。検索手段
は、特定の標的配列または標的モチーフにマッチする本発明のゲノム配列のフラ
グメントまたは領域を同定するために使用される。種々の既知のアルゴリズムが
、公に開示され、そして検索手段を実行するための種々の市販のソフトウエアが
、本
発明のコンピューターベースのシステムに使用されおよび使用され得る。このよ
うなソフトウエアの例には、MacPattern(EMBL)、BLASTNおよびBLASTX(NCBI)
が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、相同性検索を実行するため
の利用可能なアルゴリズムまたは実行ソフトウエアパッケージのいずれか1つが
、本発明のコンピューターベースのシステムにおける使用に適応され得ることを
容易に認識し得る。
本明細書中で使用される「標的配列」とは、6個以上のヌクレオチドまたは2
個以上のアミノ酸の任意のDNAまたはアミノ酸配列であり得る。当業者は、標的
配列が長くなれば、標的配列がデータベース中にランダムな出現として存在する
可能性が少なくなることを容易に認識し得る。標的配列の最も好ましい配列の長
さは、約10個〜100個のアミノ酸、または約30個〜300個のヌクレオチド残基であ
る。しかし、商業的に重要なフラグメント(例えば、遺伝子発現およびタンパク
質プロセシングに関連する配列フラグメント)の検索が、より短い長さであり得
ることが十分に認識される。
本明細書中で使用される「標的構造モチーフ」、または「標的モチーフ」とは
、任意の合理的に選択される配列または配列の組み合わせをいい、ここでこの配
列は、標的モチーフの折りたたみに際し形成される3次元構造に基づいて選択さ
れる。当該分野で公知の種々の標的モチーフがある。タンパク質標的モチーフは
、酵素活性部位およびシグナル配列を包含するが、これらに限定されない。核酸
標的モチーフは、プロモーター配列、ヘアピン構造、および誘導性発現エレメン
ト(タンパク質結合配列)を含むが、これらに限定されない。
入力手段および出力手段のための種々の構造フォーマットが、本発明のコンピ
ューターベースのシステムにおいて情報を入力および出力するために使用され得
る。出力手段のための好ましいフォーマットは、標的配列または標的モチーフに
対する多様な程度の相同性を有するEnterococcus faecalisゲノム配列のフラグ
メントをランク付ける。このような提示は、当業者に種々の量の標的配列または
標的モチーフを含む配列のランク付けを提供し、そして同定したフラグメントに
含まれる相同性の程度を同定する。
種々の比較手段が、標的配列または標的モチーフをデータ記憶手段と比較して
、
Enterococcus faecalisゲノムの配列フラグメントを同定するために使用され得
る。本実施例において、Altschulら、(1990)J.Mol.Biol.215:403-410に記載さ
れるBLASTアルゴリズムを実行する実行ソフトウエアをEnterococcus faecalisゲ
ノム内のオープンリーディングフレームを同定するために使用する。当業者は、
公に入手可能な相同性検索プログラムのいずれかが、本発明のコンピューターベ
ースのシステムのための検索手段として使用され得ることを容易に認識し得る。
当業者に公知であり得る適切な専有システムもまた、当然、この観点から使用さ
れ得る。
図1は、本発明のこの局面の実施態様の例示である、コンピューターシステム
のブロック図を提供する。コンピューターシステム102は、バス104に連結したプ
ロセッサー106を備える。メインメモリ108(好ましくはランダムアクセスメモリ
、RAMとして実行される)および種々の2次記憶デバイス110(例えば、ハードド
ライブ112および取り外し可能な媒体記憶デバイス114)もまた、バス104に連結
される。取り外し可能な媒体記憶デバイス114は、例えば、フロッピーディスク
ドライブ、CD-ROMドライブ、磁気テープドライブなどを表し得る。その中に記録
された制御ロジックおよび/またはデータを含む取り外し可能な記憶媒体116(
例えば、フロッピーディスク、コンパクトディスク、磁気テープなど)は、取り
外し可能な媒体記憶デバイス114に挿入され得る。コンピューターシステム102は
、一旦それが取り外し可能な媒体記憶デバイス114に挿入されると、取り外し可
能な媒体記憶デバイス114から制御ロジックおよび/またはデータを読み取るた
めの適切なソフトウエアを備える。
本発明のヌクレオチド配列は、周知の様式で、メインメモリ108、任意の二次
的記憶デバイス110、および/または取り外し可能な記憶媒体116に記憶され得る
。実行中に、ゲノム配列にアクセスおよびゲノム配列を処理するためのソフトウ
エア(例えば、検索ツール、比較ツールなど)が、オペレーティングシステム、
ハードウエアシステムおよびソフトウエアプログラムの要求および操作パラメー
ターに従って、メインメモリ108中に存在する。
生化学的実施態様
本発明の他の実施態様は、Enterococcus faecalisゲノムの単離されたフラグ
メントに関する。本発明のEnterococcus faecalisゲノムのフラグメントは、ペ
プチドをコードするフラグメント(本明細書中以下、オープンリーディングフレ
ーム(ORF))、作動可能に連結されたORFの発現を調整するフラグメント(本明細
書中以下、発現調整フラグメント(EMF))、およびサンプル中のEnterococcus fa
ecalisの存在を診断するために用いられ得るフラグメント(本明細書中以下、診
断用フラグメント(DF))を含むが、これらに限定されない。
本明細書中で用いられる「単離された核酸分子」または「Enterococcus faeca
lisゲノムの単離されたフラグメント」は、組成物に通常関連する化合物の数を
その組成物から減じる精製手段に供した、特定のヌクレオチド配列を保有する核
酸分子をいう。特に、この用語は、配列番号1〜982に記載の配列を有する核酸
分子、上述のそれらの代表的なフラグメント、およびこれも上述のようにそれら
と少なくとも95%、好ましくは少なくとも99%、特に好ましくは少なくとも99.9
%配列上同一であるポリヌクレオチドをいう。
種々の精製手段が、本発明の単離されたフラグメントを生成するために用いら
れ得る。これらは、電荷、溶解度、または大きさに基づいて溶液の構成要素を分
離する方法を包含するが、これらに限定されない。
1つの実施態様において、Enterococcus faecalis DNAは、酵素的に剪断され
て、長さ15〜20kbのフラグメントを生成し得る。次いで、これらのフラグメント
を用いて、以下の実施例に記載のようにそれらをλクローンに挿入することによ
り、Enterococcus faecalisライブラリーを生成し得る。次いで、例えば、ORF(
例えば、表1〜3に列挙されるORF)に隣接するプライマーが、配列番号1〜982
に示されるヌクレオチド配列情報を用いて生成され得る。次いで、周知の日常的
なPCRクローニング技術を用いて、λDNAライブラリーまたはEnterococcus faeca
lisゲノムDNAからORFを単離し得る。従って、配列番号1〜982の利用可能性、表
1、2、および3中の情報、ならびに上述の方法を用いる配列番号1〜982の配
列の解析により容易に得られ得る情報が考えられると、当業者は、本開示により
、本発明の任意のORF含有フラグメントまたは他の核酸フラグメントを単離する
ことが可能になる。
本発明の単離された核酸分子は、一本鎖DNAおよび二本鎖DNA、ならびに一本鎖
RNAを含むが、これらに限定されない。本明細書中で用いられる「オープンリー
ディングフレーム」(ORF)は、終止コドンを含まずにアミノ酸をコードする一連
のトリプレットを意味し、タンパク質に翻訳可能な配列である。しかし、配列番
号1〜982のそれぞれの配列は、始まり、そして終結コドンで終結している。ポ
リヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に番号を付け、そして参照する目的
のために、配列番号1〜982のそれぞれの配列の全体配列に、1位である最初の
ヌクレオチドが含まれる。それゆえ、参照目的のために、本発明で使用される番
号付けは、配列番号1〜982についての配列表に提供される番号付けである。
表1、2、および3は、本発明のEnterococcus faecalisゲノムコンティグに
おけるORFを列挙する。これらは、生物特異的二次Markov確率遷移行列を用いるG
eneMarkソフトウェアにより、推定コード領域として同定された。他の基準は、
周知の解析方法(例えば、本明細書中に考察される方法)に従って、より包括的
か、より限定的か、またはより選択的なリストを作成するために用いられ得るこ
とが理解される。
表1は、本発明のEnterococcus faecalisコンティグにおけるORFを記載し、こ
のORFは、1997年3月にGenBankを通じて入手可能なヌクレオチド配列に95%以上
同一(BLAST分析による)である少なくとも50塩基の連続領域に及ぶ。
表2は、本発明のEnterococcus faecalisコンティグにおけるORFを記載し、こ
のORFは、表1に示されておらず、そして0.01以下のBLASTP確率スコアで、1997
年3月にGenBankを通じて入手可能なポリペプチド配列とマッチする。
表3は、本発明のEnterococcus faecalisコンティグにおけるORFを記載し、こ
のORFは、BLASTP分析により、1997年3月にGenBankを通じて入手可能なポリペプ
チド配列と有意にマッチしない。
各表において、第1欄および第2欄は、それぞれコンティグ番号およびコンテ
ィグ内のORF番号によりORFを同定している。第3欄は、ORFの最初のヌクレオチ
ドの座標を示し、これは、コンティグ鎖の5'末端から数える。第4欄は、ORFの
最後のヌクレオチドの座標を示し、これは、コンティグ鎖の5'末端から数える。
表1および2において、第5欄は、GenBankを通じて入手可能な最も密接にマ
ッチする配列についての参考文献を列挙する。これらの参照番号は、命名(denom
inators)に精通している当業者により通常用いられる、データベース登録番号で
ある。命名法の記載は、National Center for Biotechnology Informationから
入手可能である。表1および2の第6欄は、マッチする配列の遺伝子名を提供す
る。
表1において、第7欄は、ORFおよびGenBank配列の比較からのヌクレオチドBL
AST同一性パーセントスコアを提供し、第8欄は、BLAST同一性分析により同定さ
れた最高評価セグメント対のヌクレオチドの長さを示し、そして第9欄は、ヌク
レオチドにおけるORFの全長を提供する。
表2において、第7欄は、同定された最高評価セグメント対のタンパク質BLAS
T類似性パーセントスコアを提供し、第8欄は、最高評価セグメント対の同一性
パーセントを提供し、そして第9欄は、ヌクレオチドにおけるORFの全長を提供
する。
2つのポリペプチド配列の同一性パーセントおよび類似性パーセントの概念は
、当該分野において十分理解されている。例えば、3つのアミノ酸位置(例えば
1位、3位、および5位)が異なる10アミノ酸長の2つのポリペプチドは、70%
の同一性パーセントを有するといわれる。しかし、同じ2つのポリペプチドが、
例えば5位のアミノ酸部分が同一ではなくても「類似」であれば(すなわち、同
様の生化学的特徴を有していれば)、80%の類似性パーセントを有すると考えら
れる。ヌクレオチド配列類似性またはアミノ酸配列類似性の分析のための多くの
プログラム(例えば、fastaおよびBLAST)は、特にマッチする領域の同一性パー
セントを出力パラメーターとして列挙する。従って、例えば、本明細書中の表1
および2は、各ORFおよびその列挙された関連物の最高評価セグメント対の同一
性パーセントを列挙する。相同性検索のために用いられるアルゴリズムおよび基
準に関するさらなる詳細を以下に示し、そしてこれは、以下に提供する引用によ
り強調される関連文献に記載される。
他の基準は、表中に記載されるタイプのより包括的かつより独占的な表を作成
するために用いられ得ることが理解される。当業者が理解するように、狭い範囲
および広い範囲の両方の検索が有用である。従って、当業者は、表1〜3に列挙
されるもの以外のEnterococcus faecalisゲノムのコンティグにおけるORFを容易
に同定し得る。このORFとしては、例えば、本発明のコンピューターベースシス
テムを用いて確認可能なORFに加え、重複するかまたは同定されたORFの対向鎖に
よりコードされるORFが挙げられる。
本明細書中で用いられる「発現調整フラグメント」(EMF)は、作動可能に連結
されたORFまたはEMFの発現を調整する一連のヌクレオチド分子を意味する。
本明細書中で用いられるように、配列は、EMFの存在により配列の発現が変化
する場合、「作動可能に連結された配列の発現を調整する」といわれる。EMFは
、プロモーター、およびプロモーター調整配列(誘導性エレメント)を包含する
が、これらに限定されない。EMFの1つのクラスは、特定の調節因子または生理
学的事象に応じて、作動可能に連結されたORFの発現を誘導するフラグメントで
ある。
EMF配列は、表1〜3に提供されるORFへの近接度により、Enterococcus faeca
lisゲノムのコンティグ内で同定され得る。表1〜3の任意のORFに由来する遺伝
子間セグメントまたはその遺伝子間セグメントのフラグメント(長さ約10〜200
ヌクレオチド)は、天然に連結されたORF配列で見出されるのと類似の様式で、
作動可能に連結されたORFの発現を調整する。本明細書中で用いられる「遺伝子
間セグメント」は、本明細書中に記載される2つのORF間にあるEnterococcus fa
ecalisゲノムのフラグメントをいう。EMFはまた、既知のEMFを本発明のコンピュ
ーターベースシステムにおいて標的配列または標的モチーフとして用いて、同定
され得る。さらに、これら2つの方法が組み合わされ得、一緒に用いられ得る。
EMFの存在および活性は、EMF捕捉ベクターを用いて確認され得る。EMF捕捉ベ
クターは、マーカー配列に連結されたクローニング部位を含有する。マーカー配
列は、抗生物質耐性または補足栄養要求性因子のような同定可能な表現型をコー
ドする。この同定可能な表現型は、EMF捕捉ベクターが適切な条件下で適切な宿
主内に配置されるとき、同定またはアッセイされ得る。上記のように、EMFは、
作動可能に連結されたマーカー配列の発現を調整する。種々のマーカー配列のよ
り詳細な考察を以下に示す。
EMFであると思われる配列は、EMF捕捉ベクター中のマーカー配列の上流にある
1つ以上の制限部位の3つのリーディングフレームの全てにおいてクローニング
される。次いで、このベクターは、公知の手順を用いて適切な宿主に形質転換さ
れ、そして形質転換宿主の表現型が、適切な条件下で試験される。上記のように
、EMFは、作動可能に連結されたマーカー配列の発現を調整する。
本明細書中に用いられる「診断用フラグメント」(DF)は、Enterococcus faeca
lis配列に選択的にハイブリダイズする一連のヌクレオチド分子を意味する。DF
は、Enterococcus faecalisゲノムのコンティグ内の独特の配列を同定すること
により、容易に同定され得る。この同定は、例えば、周知のコンピューター解析
ソフトウェアを用いること、および増幅またはハイブリダイゼーション選択性を
決定する適切な診断フォーマットにおいて、DF配列からなるプローブまたは増幅
プライマーを生成し、そして試験することにより行われる。
本発明の範囲内にある配列は、本明細書中に記載の特定の配列に限定されず、
それらの対立遺伝子変異体および種変異体もまた含む。対立遺伝子変異体および
種変異体は、配列番号1〜982に提供される配列、それらの代表的なフラグメン
ト、または配列番号1〜982と少なくとも99%、そして好ましくは99.9%同一で
あるヌクレオチド配列と、同じ種の別の単離体由来の配列とを比較することによ
り、通常決定され得る。さらに、コドン可変性を適応するために、本発明は、本
明細書中に開示の特定のORFと同様に、同じアミノ酸配列をコードする核酸分子
を含む。言い換えれば、ORFのコード領域では、1つのコドンの、同じアミノ酸
をコードする別のコドンへの置換が、明確に意図される。
本明細書において開示される任意の特異的な配列は、特定のフラグメント(例
えば、ORF)の両方向における(すなわち両鎖の配列決定)再配列決定よって、
エラーについて容易にスクリーニングされ得る。あるいは、エラースクリーニン
グは、問題のフラグメントの一部または全部をプローブもしくはプライマーとし
て使用することによって単離された、Enterococcus faecalis起源の対応するポ
リヌクレオチドの配列決定によって行われ得る。
表1、2、および3に開示されるEnterococcus faecalisゲノムのORF、および
ORFの5'側に見出されるEMFのそれぞれは、多数の用途においてポリヌクレオチド
試薬として用いられ得る。例えば、配列は、サンプルにおける特定の微生物(特
にEnterococcus faecalis)の存在を検出するために、診断用プローブまたは診
断用増幅プライマーとして用いられ得る。この点において特に好ましいのは、表
3のORFのような、他の生物に由来の既に特徴づけられた配列とは適合せず、従
ってEnterococcus faecalisに対して最も高度に選択的であると思われるORFであ
る。また特に好ましいのは、Enterococcus faecalisの株間を識別するために用
いられ得るORF、特に医学的に重要な株(例えば、薬剤耐性株)を識別するORFで
ある。
さらに、本発明のフラグメントは、広範に記載されているが、三重ヘリックス
形成、またはアンチセンスDNAまたはRNAを介して、遺伝子発現を制御するために
用いられ得る。これらの両方法は、ポリヌクレオチド配列のDNAまたはRNAへの結
合に基づく。三重ヘリックス形成は、DNAからのRNA転写の遮断を最適に生じ、一
方アンチセンスRNAハイブリダイゼーションはmRNA分子のポリペプチドへの翻訳
をブロックする。本発明の配列からの情報は、アンチセンスオリゴヌクレオチド
および三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチドを設計するために用いられ得る。
これらの方法における使用に適したポリヌクレオチドは、通常20〜40塩基の長さ
であり、そして三重ヘリックス形成については転写に関与する遺伝子の領域、ま
たはアンチセンス阻害についてはmRNA自身に相補的であるように設計される。両
技術とも、モデル系において有効であることが示されており、そして必要な技術
は周知であり、通例の手順を包含する。三重ヘリックス技術は、例えば、Leeら,
Nucl.Acids Res.6:3073(1979);Cooneyら,Science 241:456(1988);およびD
ervanら,Science 251:1360(1991)に記載されている。アンチセンス技術は、一
般に、例えば、Okano,J.Neurochem.56: 560(1991)およびOligodeoxynucleo
tides as Antisence Inhibitor of Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,
FL(1988)に記載されている。
本発明は、本発明のEnterococcus faecalisゲノムフラグメントおよびコンテ
ィグの1つ以上のフラグメントを含む組換え構築物をさらに提供する。本発明の
特定の好ましい組換え構築物は、Enterococcus faecalisゲノムのフラグメント
が順方向または逆方向で挿入されたベクター(例えば、プラスミドベクターまた
はウイルスベクター)を含む。本発明のORFの1つを含むベクターの場合では、
ベクターは、ORFに作動可能に連結された調節配列(例えばプロモーターを包含
する)をさらに含み得る。本発明のEMFを含むベクターについて、ベクターは、E
MFに作動可能に連結されたマーカー配列または異種ORFをさらに含み得る。
多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、そして本
発明の組換え構築物の生成のために市販される。以下のベクターは、一例として
示される。有用な細菌ベクターは、以下を含む:ファージスクリプト、ψX174、
pBS SK(+または-)、pBS KS(+または-)、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Strat
ageneより入手可能);pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmac
iaより入手可能)。有用な真核生物ベクターは、以下を含む:pWLneo、pSV2cat
、pOG44、pXT1、pSG(Stratageneより入手可能);pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(P
harmaciaより入手可能)。
プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベク
ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝子か
ら選択され得る。2つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特に著
名な細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、およびtrcを含む。
真核生物プロモーターは、CMV最初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV
40、レトロウイルス由来LTR、およびマウスメタロチオネインIを含む。適切な
ベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者の水準内にある。
本発明は、本発明のEnterococcus faecalisゲノムフラグメントおよびコンテ
ィグの単離フラグメントのいずれか1つを含有する宿主細胞をさらに提供し、こ
こでこのフラグメントは、公知の方法を用いて宿主細胞に導入されている。宿主
細胞は、高等真核生物宿主細胞(例えば、哺乳動物細胞)または下等真核生物細
胞(例えば、酵母細胞)、または原核細胞(例えば、細菌細胞)であり得る。
本発明のポリヌクレオチド(例えば、本発明のORFを含む組換え構築物)は、
当該分野で標準的な種々の十分に確立された技術により、宿主中に導入され得る
。この技術としては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE、
デキストラン媒介トランスフェクション、およびエレクトロポレーションが挙げ
られる。これらの技術は、例えば、Davis,L.ら,BASIC METHODS IN MOLECULAR
BIOLOGY(1986)に記載されている。
本発明のEnterococcus faecalisゲノムフラグメントおよびコンティグのフラ
グメントの1つを含有する宿主細胞は、単離フラグメントによりコードされる遺
伝子産物を生産するために従来の様式で用いられ得る(ORFの場合)か、またはE
MFの制御下で異種タンパク質を生産するために用いられ得る。本発明は、本発明
の核酸フラグメントまたは本発明の核酸フラグメントの縮重変異体によりコード
される単離ポリペプチドをさらに提供する。「縮重変異体」とは、ヌクレオチド
配列が本発明の核酸フラグメント(例えば、ORF)とは異なるが、遺伝コードの
縮重によって同一のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を意図する
。
本発明の好ましい核酸フラグメントは、表2および3に示される、タンパク質
をコードするORFである。
当該分野で公知の種々の方法が、本発明の単離ポリペプチドまたはタンパク質
のいずれかを得るために利用され得る。最も簡単には、アミノ酸配列は、市販の
ペプチド合成機を用いて合成され得る。これは、小ペプチドおよびより大きなポ
リペプチドのフラグメントを生成する際に特に有用である。合成により最も容易
に得られ得るこのような短いフラグメントは、例えば、以下にさらに考察するよ
うに、天然ポリペプチドに対する抗体を生成する際に有用である。
別の方法では、ポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたはタンパ
ク質を天然に生産する細菌細胞から精製される。当業者は、ポリペプチドおよび
タンパク質を単離するための周知の方法を容易に用い得、細菌株により天然に生
産されるか、または他の方法により生成される本発明のポリペプチドまたはタン
パク質を単離および精製し得る。この点において用いられ得る単離および精製の
ための方法は、免疫クロマトグラフィー、HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィ
ーを含むが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチドおよびタンパク質はまた、所望のポリペプチドまたはタ
ンパク質を発現するように改変された細胞から精製され得る。本発明の好ましい
ポリペプチドおよびタンパク質は、配列番号1〜982のポリヌクレオチドによって
コードされるポリペプチドおよびタンパク質であり、ここで、ポリペプチドおよ
びタンパク質は、配列番号1〜982の各配列の末端の終止コドンと同一フレームに
おいてコードされる。本明細書中で用いられるように、細胞は、その細胞が、遺
伝子操作を通じて、通常生産しないまたは低レベルでしか生産しないポリペプチ
ドまたはタンパク質を生産するようにされる場合、所望のポリペプチドまたはタ
ンパク質を発現するように改変されたとされる。当業者は、本発明のポリペプチ
ドまたはタンパク質の1つを生産する細胞を生成するために、真核生物細胞また
は原核生物細胞に組換え配列または合成配列のいずれかを導入し発現させるため
の手順を容易に採用し得る。
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは実質的に精製されている。E.faecalisポリペプチドの組換え産生バー
ジョンは、Smithら(1989)Gene 67:31-40に記載される1工程方法によって実質
的に精製され得る。本発明のポリペプチドはまた、タンパク質精製分野で周知の
方法において、天然または組換え供給源から、本発明のポリペプチドに対する抗
体を使用して精製され得る。
本発明はさらに、以下を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離され
たE.faecalisポリペプチドを提供する:(a)配列番号1〜982に列挙される各
配列の第1のメチオニンコドンから終止コドンまでの完全なアミノ酸配列を有す
る完全長E.faecalisポリペプチドのアミノ酸配列、ここでこの終止コドンは各
配列番号の末端に存在する:そしてこの第1のメチオニンはこの終止コドンをと
もなうフレーム内の第1のメチオニンである;および(b)(a)のN末端メチ
オニンを除く完全なアミノ酸配列を有する完全長E.faecalisポリペプチドのア
ミノ酸配列。
本発明のポリペプチドはまた、上記(a)および(b)に記載される配列と少
なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、そしてなおより好
ましくは95%、96%、97%、98%または99%同一のアミノ酸配列を有
するポリペプチドを含む。
本発明は、さらに、本明細書において記載されるアミノ酸配列の部分またはフ
ラグメント、ならびに本明細書で記載される単離されたアミノ酸配列の一部また
はフラグメントをコードするポリヌクレオチドに関する。本明細書において記載
されるアミノ酸配列の一部を含むフラグメントは、少なくとも5つの連続するア
ミノ酸長であり、そして任意の2つの整数(この1つはN末端位置を示す)より
選択される。本発明のポリペプチドの開始コドンは1に位置する。本発明の目的
のための開始コドン(ポジション1)は、配列番号1〜982の各配列の第1のメチ
オニンコドンであり、このメチオニンは、これらの各々の配列の末端の終止コド
ンを有するフレームに位置する。配列番号1〜982の配列によってコードされる任
意の所与アミノ酸配列における少なくとも5つの連続するアミノ酸残基長のフラ
グメントが占め得るN末端およびC末端位置の全ての組み合わせは、本発明に含
まれる(すなわち開始コドンから終止コドンまで)。少なくとも、フラグメント
とは、5つの連続するアミノ酸残基長であり得るフラグメント、または5と全長
アミノ酸配列残基数マイナス1の間の任意の整数の長さであり得るフラグメント
を意味する。従って、本発明に含まれるものは、配列番号1〜982に示されるアミ
ノ酸配列の任意のN末端およびC末端位置によって特定される連続したフラグメ
ントであり、ここで、連続したフラグメントは、5と完全長配列の残基数マイナ
ス1の間の任意の整数である。
さらに、本発明は、N末端およびC末端位置によるよりもむしろ、アミノ酸残
基におけるサイズにより特定されるフラグメントを含むポリペプチドを含む。本
発明は、5と完全長配列の残基数マイナス1の間の整数から選択される連続する
アミノ酸残基における任意のフラグメントサイズを含む。連続するポリペプチド
フラグメントの好ましいサイズは、約5アミノ酸残基、約10アミノ酸残基、約
20アミノ酸残基、約30アミノ酸残基、約40アミノ酸残基、約50アミノ酸
残基、約100アミノ酸残基、約200アミノ酸残基、約300アミノ酸残基、
および約400アミノ酸残基を含む。5と完全長配列の残基数マイナス1の間の
任意の整数を示す全てのサイズのフラグメントが本発明に含まれるので、当然の
ことながら、好ましいサイズは、本発明の例示を意図して、限定する意図ではな
い。本発明はまた、N末端およびC末端位置により、または上記のアミノ酸残基
のサイズにより特定される任意のフラグメントの除外を提供する。N末端および
C末端位置により、または上記のアミノ酸残基のサイズにより特定される任意の
数のフラグメントが除外され得る。
上記のフラグメントは、例えば、イムノアッセイにおいて、エピトープマッピ
ングにおいて、エピトープタグ化において、タンパク質の特定の部位に対する抗
体を生成するために、ワクチンとして、そして分子量マーカーとして有用である
ので、上記のフラグメントは、活性である必要はない。
本発明のさらなるポリペプチドは、上記のポリペプチドに対し、少なくとも9
0%の類似性、より好ましくは少なくとも95%の類似性、そしてなおより好ま
しくは少なくとも96%、97%、98%または99%の類似性を有するポリペ
プチドを含む。
本発明のさらなる実施態様は、E.faecalisポリペプチドのアミノ酸配列を含
むポリペプチドに関する。このポリペプチドは、少なくとも1つの保存的アミノ
酸置換を含むアミノ酸配列を有するが、50以下の保存的アミノ酸置換、40以
下の保存的アミノ酸置換、30以下の保存的アミノ酸置換、および20以下の保
存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する。少なくとも1つ、しかし10、9
、8、7、6、5、4、3、2または1以下の保存的アミノ酸置換を有する、E.faecali
sポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドもまた、提供される。
例えば、本発明の照会アミノ酸配列に対し、少なくとも95%「同一」なアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドによって、対象のポリペプチドのアミノ酸配列は
、対象ポリペプチド配列が照会アミノ酸配列の各100アミノ酸につき、5つま
でのアミノ酸変化を含み得ることを除き、照会配列と同一であることが意図され
る。換言すれば、照会アミノ酸配列と少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有
するポリペプチドを得るためには、対象配列において、5%までのアミノ酸残基
を挿入、欠損、(インデル(indel))または他のアミノ酸と置換し得る。これ
らの参照配列の変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端、
あるいはこれらの末端の間の任意の位置で、参照配列における残基中に個別に、
または参照配列内の1つ以上連続した群においてのいずれかで分散して、生じ得
る。
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、配列番号1〜982の配列にコー
ドされるアミノ酸配列に対し、少なくとも90%、95%、96%、97%、9
8%または99%同一であるか否かは、本明細書において記載されるように、公
知のコンピュータプログラムを用いて従来どおり決定され得る。照会配列(本発
明の配列)と対象配列との間の最も全体的なマッチ(全体的な配列アライメント
とともいわれる)を決定する好ましい方法は、Brutlagら(1990)Comp.App.Bi
osci.6:237-245のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータープログラムを使
用して決定され得る。配列アライメントにおいて、照会配列および対象配列は共
にアミノ酸配列である。この全体的な配列アライメントの結果は、パーセント同
一性である。FASTDBアミノ酸アライメントにおいて使用される好ましいパラメー
ターは、Matrix=PAM 0、k-tuple=2、Mismatch Penalty=1、Joining Penalty
=20、Randomization Group Length=0、Cutoff Score=1、Window Size=seque
nce length、Gap Penalty=5、Gap Size Penalty=0.05、Window Size=500、ま
たは対象アミノ酸配列の長さのいずれか短い方。
対象配列は、内部欠失のためではなく、N末端またはC末端の欠失のために照
会配列よりも短い場合、パーセント同一性における結果は、手動で補正されなけ
ればならない。これは、FASTDBプログラムが全体のパーセント同一性を計算する
場合、対象配列のN末端およびC末端の切断を考慮しないからである。照会配列
と比較してN末端およびC末端で短縮された対象配列について、パーセント同一
性は、対応する対象配列残基とマッチ/整列されない、対象配列のN末端および
C末端である照会配列の残基数を、照会配列の総塩基のパーセントとして計算す
ることによって補正される。残基がマッチ/整列したか否かは、FASTDB配列アラ
イメントの結果によって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメ
ーターを使用して上記のFASTDBプログラムによって計算されたパーセント同一性
から引かれ、最終パーセント同一性スコアに到達する。この最終パーセント同一
性スコアは、本発明の目的のために使用されるスコアである。照会配列とマッチ
/整列しない対象配列のN末端およびC末端残基のみが、パーセント同一性スコ
アを手作業で調整する目的のために考慮される。これは、対象配列の最も遠いN
末端およびC末端残基の外側の照会アミノ酸残基のみである。
例えば、90アミノ酸残基の対象配列を、100残基の照会配列と整列し、パ
ーセント同一性を決定する。対象配列のN末端において、欠失が生じ、そしてこ
れにより、FASTDB整列は、N末端の最初の10残基とマッチ/整列しない。対を
形成しない10残基は、配列の10%を表し(マッチしないN末端およびC末端
の残基数/照会配列における全残基数)、そのためFASTDBプログラムから計算さ
れたパーセント同一性スコアから10%が引かれる。残りの90残基が完全にマ
ッチする場合、最終的なパーセント同一性は90%である。別の例において、9
0残基の対象配列を、100残基の照会配列と比較する。今回は、欠失は内部に
あるので、照会(配列)とマッチ/整列しない対象配列のN末端またはC末端の
残基は存在しない。この場合、FASTDBによって計算されるパーセント同一性は、
手動で補正されない。再度、FASTDB整列において示されるように、対象配列のN
末端およびC末端の外側に位置する残基で、照会配列とマッチ/整列しないもの
のみが、手動で補正される。他の手動による補正は、本発明の目的において、な
されない。
上記のポリペプチド配列は、通常の生物学的活性を有するか否かに関係なく、
含まれる。なぜなら、特定のポリペプチド分子が生物学的活性を有していなくて
も、当業者は、なおそのポリペプチドの使用法(例えば、ワクチンとして、また
は抗体を生成するため)を知るからである。E.faecalis活性を有さない本発明
のポリペプチドの他の使用法としては、特に、エピトープタグとして、エピトー
プマッピングにおいて、および当業者に公知の方法を用いるSDS-PAGEゲルまたは
分子ふるいゲルろ過カラムの分子量マーカーとしてが、挙げられる。
下記に詳細に記載するように、本発明のポリペプチドはまた、ポリクローナル
抗体およびモノクローナル抗体を惹起させるために用いられ得、これら抗体は、
E.faecalisタンパク質の発現の検出のためのアッセイにおいて、またはE.faec
alisタンパク質の機能を増強あるいは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニス
トとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは、酵母ツーハイブリッ
ドシステムにおいてE.faecalisタンパク質結合タンパク質(本発明による候補
アゴニストおよび候補アンタゴニストである)を「捕捉する」ために用いられ得
る。例えば、Fieldsら(1989)Nature 340:245-246を参照のこと。
任意の宿主/ベクター系が、本発明の1またはそれ以上のORFを発現させるた
めに用いられ得る。これらは、真核生物宿主(例えば、HeLa細胞、CV-1細胞、CO
S細胞、およびSf9細胞)、ならびに原核生物細胞(例えば、E.coliおよびB.su
btilis)を含むが、これらに限定されない。最も好ましい細胞は、特定のポリペ
プチドもしくはタンパク質を通常発現しない細胞またはポリペプチドもしくはタ
ンパク質を天然には低レベルでしか発現しない細胞である。
本明細書中で用いられる「組換え」は、組換え(例えば、微生物性または哺乳
動物)発現系由来のポリペプチドまたはタンパク質を意味する。「微生物の」は
、細菌または真菌(例えば、酵母)の発現系で作製された組換えポリペプチドま
たはタンパク質をいう。産物として、「組換え微生物性」は、天然の内因性物質
を本質的に含まず、そして関連の天然グリコシル化を伴わないポリペプチドまた
はタンパク質を定義する。ほとんどの細菌培養物(例えば、E.coli)において
発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化修飾を含まない;酵
母において発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、哺乳動物細胞において
発現されたポリペプチドまたはタンパク質とは異なるグリコシル化パターンを有
する。
「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーをいう
。一般に、本発明により提供されるポリペプチドおよびタンパク質をコードする
DNAセグメントは、Enterococcus faecalisゲノムのフラグメントおよび短いオリ
ゴヌクレオチドリンカー、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、
微生物性オペロンまたはウイルス性オペロン由来の調節エレメントを含む組換え
転写単位において発現され得る合成遺伝子を提供する。
組換え発現ベヒクルまたは「ベクター」は、DNA(RNA)配列からポリペプチド
を発現させるためのプラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターを
いう。発現ベヒクルは、以下の(1)から(3)のアセンブリを含む転写単位を
含み得る:(1)宿主における遺伝子発現に必要な遺伝子調節エレメント、これ
は、所望のポリペプチドの適切な発現に十分なレベルで転写を開始および維持さ
せるに必要なエレメントを包含し、そして例えば、プロモーター、および必要に
応じてエンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを含む;(2)構造配列また
はコード配列(これは、mRNAに転写され、そしてタンパク質に翻訳される);お
よび(3)適切なシグナル(所望のコード領域の開始点で翻訳を開始させ、そし
てその末端で翻訳を終結させる)。酵母発現系または真核生物発現系において使
用するための構造単位は、好ましくは、リーダー配列(宿主細胞による翻訳タン
パク質の細胞外分泌を可能にする)を意図する。あるいは、組換えタンパク質が
リーダー配列または輸送配列なしで発現される場合、それは、N末端メチオニン
残基を含み得る。この残基は、最終産物を提供する発現組換えタンパク質から後
で切断されるかもしれずまたはされないかもしれない。
「組換え発現系」は、組換え転写単位を染色体DNAに安定に組み込んだ宿主細
胞または組換え転写単位を染色体外に有する宿主細胞を意味する。細胞は、原核
生物または真核生物であり得る。本明細書中で定義される組換え発現系は、発現
されるべきDNAセグメントまたは合成遺伝子に連結された調節エレメントを誘導
して、異種ポリペプチドまたはタンパク質を発現する。
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細
菌、または他の細胞において発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA
構築物由来のRNAを用いてこのようなタンパク質を生産するために用いられ得る
。原核生物宿主および真核生物宿主に用いる適切なクローニングベクターおよび
発現ベクターは、Sambrookら,Molecular Cloning; A Laboratory Manual,第2
版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(19
89)に記載されており、この開示の内容は、その全体が本明細書中に参考として
援用されている。
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および選択マーカー(宿主細胞の形
質転換を可能にし、例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevi
siae TRP1遺伝子である)、ならびに高発現遺伝子由来のプロモーター(プロモ
ーター下流の構造配列の転写を導く)を含む。このようなプロモーターは、とり
わけ解糖系酵素(例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK))、α因子、酸
性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し
得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、ならびに好ましくは
、翻訳タンパク質の細胞膜周辺腔または細胞外培地への分泌を導き得るリーダー
配列と、適切な相で組み立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴(
例えば、発現組換え産物の安定化または簡便な精製)を与えるN末端同定ペプチ
ドを含む融合タンパク質をコードし得る。
細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的プロモーターと作動可能な読み
取り相において適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に、所望の
タンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。ベクタ
ーは、1以上の表現型の選択マーカーおよび複製起点を含み、ベクターの維持を
確実にし、そして所望であれば、宿主内での増幅を提供する。
形質転換のための適切な原核細胞宿主は、E.coli、B.subtilis、Salmonella
typhimuriumの株、およびPseudomonas属、およびStreptomyces属内の種々の種
を包含する。他のものもまた、選択事項として用いられ得る。
代表的であるが非限定的な例として、細菌での使用のための有用な発現ベクタ
ーは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37107)の遺伝エレメントを含
む市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌複製起点を含み得る。このよ
うな市販のベクターは、例えばpKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,
Swedenから入手可能)およびGEM1(Promega Biotec,Madison,WI,USAから入
手可能)を包含する。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよ
び発現されるべき構造配列と組み合わせられる。
適切な宿主株の形質転換および宿主株の適切な細胞密度への増殖後、選択され
たプロモーターは、誘導性である場合、適切な手段(例えば、温度シフトまたは
化学的誘導)により脱抑制または誘導され、そして細胞は、さらなる期間培養さ
れて、誘導された遺伝子産物の発現を提供する。その後、代表的には、細胞を集
め(一般に遠心分離による)、破砕(一般に物理的手段または化学的手段による
)して発現タンパク質を放出させ、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のた
めに保持される。
種々の哺乳動物細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現させるために用い
られ得る。哺乳動物発現系の例は、サル腎臓線維芽細胞のCOS-7系統(Gluzman,
Cell 23:175(1981)に記載)、および適合性ベクターを発現させ得る他の細胞系
統(例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞系統)を包含する。
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー
、およびまた任意の必要な、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプラ
イスドナー部位およびアクセプター部位、転写終結配列、および5'隣接非転写配
列を含む。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えば、SV40複製起点、初期プ
ロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位は、必要と
される非転写遺伝エレメントを提供するために用いられ得る。
細菌培養物において生産される組換えポリペプチドおよびタンパク質は、通常
、細胞ペレットからの最初の抽出、次いで1回またはそれ以上の塩析、水性イオ
ン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー工程により単離
される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、任意の好都合な方
法により破砕され得る。この方法としては、例えば、凍結解凍の繰り返し、超音
波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用が挙げられる。必要に応じて、タ
ンパク質再折り畳み工程が、成熟タンパク質の立体配座を完成させる際に用いら
れ得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、最終精製工程のために
用いられ得る。
本発明は、本明細書中に記載されたのと実質的に等価である単離されたポリペ
プチド、タンパク質、および核酸分子をさらに包含する。本明細書中で用いられ
る「実質的に等価である」とは、1つまたはそれ以上の置換、欠失、または付加
により参照配列とは異なるが、その正味の効果が参照配列と問題の配列との間で
不利な機能相違を生じさせない、核酸およびアミノ酸の両方の配列(例えば、変
異体配列)をいう。本発明の目的のために、等価な生物学的活性および等価な発
現特徴を有する配列は、実質的に等価であるとみなされる。等価物を決定する目
的では、成熟配列の短縮は、考慮されるべきではない。
本発明は、Enterococcus faecalisの他の株から、本発明のEnterococcus faec
alisゲノムのフラグメントのホモログおよび本発明のORFによりコードされるタ
ンパク質のホモログを得る方法をさらに提供する。本明細書中で用いられるよう
に、Enterococcus faecalisの配列またはタンパク質は、本発明のEnterococcus
faecalisゲノムのフラグメントの1つまたは本発明のORFの1つによりコードさ
れるタンパク質に対し有意な相同性を有する場合、Enterococcus faecalisフラ
グメントの1つのフラグメントのホモログまたはコンティグまたは本発明のORF
の1つによりコードされるタンパク質のホモログとして定義される。特に、本明
細書中に開示の配列をプローブまたはプライマーとして用い、そしてPCRクロー
ニングならびにコロニー/プラークハイブリダイゼーションのような技術を用い
ることにより、当業者はホモログを入手し得る。
本明細書中で用いられるように、2つの核酸分子またはタンパク質は、この2
つが85%より高い配列(アミノ酸または核酸)相同性を有する領域を含有する場
合、「有意な相同性を有する」とされる。この点において好ましいホモログは、
90%より高い相同性を有する配列である。特に好ましいホモログは、93%以上の
相同性を有するホモログである。中でも、特に好ましいホモログは、95%以上の
相同性を有するホモログである。これらの中で非常に特に好ましいのは、97%以
上の相同性を有するホモログであり、そしてこれらの中でさらにより特に好まし
いのは、99%以上の相同性を有するホモログである。これらの中で最も好ましい
ホモログは、99.9%以上の相同性を有するホモログである。相同性の尺度の中で
、同一であることが、この点において特に好ましいことが理解される。
配列番号1〜982において示されるヌクレオチド配列、または配列番号1〜982
の配列と少なくとも95%、特に少なくとも99%、特に少なくとも99.5%同一のヌ
クレオチド配列に由来する領域特異的プライマーまたはプローブは、DNA合成お
よびPCR増幅を開始させるために、ならびにホモログをコードするクローン化DNA
を含むコロニーを同定するために用いられ得る。本発明のこの局面に適切な方法
は周知であり、そして多くの刊行物に詳細に記載されている(例えば、Innisら
,PCR Protocols,Academic Press,San Diego,CA(1990))。
配列番号1〜982、または配列番号1〜982の配列と上述の同一性を有するヌク
レオチド配列に由来するプライマーを用いる場合、当業者は、高いストリンジェ
ンシー条件(例えば、6X SSPCおよび50%ホルムアミド中で50〜60℃でアニール
し、そして0.5X SSPC中で50〜65℃で洗浄する)を用いることにより、プライマ
ーに対して75%より高い相同性の配列のみが増幅されることを認識する。より低
いストリンジェンシー条件(例えば、5X SSPCおよび40〜45%ホルムアミド中で3
5〜37℃でハイブリダイズし、そして0.5X SSPC中で42℃で洗浄する)を用いるこ
とにより、プライマー配列に対して40〜50%より高い相同性の配列もまた増幅さ
れる。
配列番号1〜982、または配列番号1〜982の配列と上述の同一性を有するヌク
レオチド配列に由来するDNAプローブを、コロニー/プラークハイブリダイゼー
ションのために用いる場合、当業者は、高いストリンジェンシー条件(例えば、
5X SSPCおよび50%ホルムアミド中で50〜65℃でハイブリダイズし、そして0.5X
SSPC中で50〜65℃で洗浄する)を用いることにより、プローブに対して90%より
高い相同性の領域を有する配列が得られ得、より低いストリンジェンシー条件(
例えば、5X SSPCおよび40〜45%ホルムアミド中で35〜37℃でハイブリダイズし
、そして0.5X SSPC中で42℃で洗浄する)を用いることにより、プローブに対し
て35〜45%より高い相同性の領域を有する配列が得られることを認識する。
任意の生物は、その生物が、このようなタンパク質を天然に発現するか、また
はそれをコードする遺伝子を含有する限り、本発明のホモログの供給源として用
いられ得る。ホモログを単離するための最も好ましい生物は、Enterococcus fae
calisに密接に関連している細菌である。
本発明の組成物の使用例
表1および2に提供する各ORFは、公知の遺伝子またはポリペプチドに対する
相同性による機能で同定される。その結果、当業者は、本発明のポリペプチドを
、ポリペプチドの推定同定のタイプに一致して、商業目的、治療目的、および工
業目的のために使用し得る。このような同定によって、当業者は、Enterococcus
faecalis ORFを使用して、同定が行われる配列の公知のタイプと同様の様式で
、例えば、特定の糖供給源を発酵するか、または特定の代謝産物を産生すること
が可能になる。本発明のこの局面の例示となる種々の総説が利用可能であり、以
下の酵素の工業的利用に対する総説が挙げられる。例えば、BIOCHEMICAL ENGINE
ERING AND BIOTECHNOLOGY HANDBOOK、第2版、Macmillan Publications,Ltd.N
Y(1991)およびBIOCATALYSIS IN ORGANIC SYNTHESIS,Tramperら編、Elsevier Sc
ience Publishers,Amsterdam,The Netherlands(1985)。本発明のこの局面およ
び他の局面を例示する多様な使用例を、以下に考察する。
1.生合成酵素
中間代謝および高分子代謝、小分子の生合成、細胞プロセスおよび他の機能に
関与する触媒反応を媒介するのに関与するタンパク質をコードするオープンリー
ディングフレームは、代謝の中間産物の分解に関与する酵素、中心中間代謝に関
与する酵素、呼吸(好気呼吸的および嫌気呼吸の両方)に関与する酵素、発酵に
関する酵素、ATPプロトンモーター力変換(proton motor force conversion)に
関与する酵素、広範な調節機能に関与する酵素、アミノ酸合成に関与する酵素、
ヌクレオチド合成に関与する酵素、補因子およびビタミン合成に関与する酵素を
包含し、工業的生合成のために使用され得る。
Enterococcus faecalisに存在する種々の代謝経路は、絶対的な栄養要求性に
基づいて、ならびに表1〜3および配列番号1〜982に同定される種々の酵素を
試験することによって同定され得る。
特に重要なものは、中間代謝産物の分解および非高分子代謝に関与するポリペ
プチドである。このような酵素としては、アミラーゼ、グルコースオキシダーゼ
、およびカタラーゼが挙げられる。
タンパク質分解酵素は、別のクラスの商業的に重要な酵素である。タンパク質
分解酵素は、亜麻および他の植物繊維を加工することを含む多くの工業プロセス
において、果汁の抽出、清澄化、および脱ペクチン化(depectinization)にお
いて、植物油の抽出において、ならびに単細胞性の果実を与えるための果実およ
び植物の浸軟において、使用が見出される。食物工業において使用されるタンパ
ク質分解酵素の詳細な総説は、Romboutsら、Symbiosis 21:79(1986)およびVor
aganら、Biocatalysts In Agricultural Biotechnology,Whitakerら編、Americ
an Chemical Society Symposium Series 389: 93(1989)に提供される。
糖代謝は、Enterococcus faecalisの一次代謝の重要な局面である。糖(例え
ば、特に、グルコース、ガラクトース、フルクトース、およびキシロース)分解
に関与する酵素は、工業的発酵において使用され得る。商業的な視点から重要な
糖転換酵素のいくつかは、グルコースイソメラーゼのような糖イソメラーゼを含
む。他の代謝酵素は、ケトグロン酸(KGA)を生成するグルコースオキシダーゼ
のように商業的使用を見出している。KGAは、Kruegerら、Biotechnology 6(A)、
Rhineら編、Verlag Press,Weinheim,Germany(1984)に記載されるような、Re
ichstein's手順を用いるアスコルビン酸の商業的生産における中間産物である。
グルコースオキシダーゼ(GOD)は、市販されており、そして精製形態および
固定化形態でビールの脱酸素化のために使用されている。例えば、Hartmeirら、
Biotechnology Letters 1:21(1979)を参照のこと。最も重要なGODの適用は、
グルコン酸の工業規模の発酵である。界面活性剤、布地、革、写真、医薬、食物
、飼料、およびコンクリート工業において使用されるグルコン酸の市場は、例え
ば、Bigelisら、GENE MANIPULATIONS AND FUNGIの357頁〜;Benettら編、Academ
ic Press,New York(1985)に記載されている。工業的適用に加えて、GODは、近
年、スターチおよびセルロースの水和物(hydrosylates)由来のシロップを分析
するバイオテクノロジーにおいて、体液中のグルコースの定量測定のための薬剤
における適用を見出している。この適用は、例えば、Owusuら、Biocheml.et Bi
ophysica.Acta.872:83(1986)に記載されている。
今日、世界で使用されている主要な甘味料は、テンサイおよびサトウキビ由来
の糖である。工業的酵素の分野において、グルコースイソメラーゼプロセスは、
今日、市場において最も大きな拡張を示す。初めに、可溶性酵素が使用され、そ
の後、固定化酵素が開発された(Kruegerら、Biotechnology,The Textbook of
Industrial Microbiology,Sinauer Associated Incorporatred,Sunderland,M
assachusetts(1990))。今日、グルコースから生成された高フルクトースシロッ
プの使用は、固定化酵素を用いる断然最大の工業的商業である。これらの酵素の
工業的使用の総説は、Jorgensen,Starch 40:307(1988)により提供されている。
プロテイナーゼ(例えば、アルカリセリンプロテイナーゼ)は、界面活性剤添
加物として使用され、従って工業分野で使用される最も大量の微生物酵素の規模
の容量の1つを示す。それらが工業的に重要であるので、工業的プロセスにおけ
るこれらの酵素の使用に関する公開情報および未公開情報が非常に多く存在する
。(Faultmanら、Acid Proteases Structure Function and Biology,Tang,J.,
編、Plenum Press,New York(1977)およびGodfreysら、Industrial Enzymes,
MacMillan Publishers,Surrey,UK(1983)およびHepnerら、Report Industria
l Enzymes by 1990,Hel Hepner & Associates,London(1986)を参照のこと)
。
別のクラスの本発明の商業的に使用できるタンパク質は、例えば、Macraeら、
Philosophical Transactions of the Chiral Society of London 310:227(198
5)およびPoserke,Journal of the American Oil Chemist Society 61:1758(19
84)に記載されている微生物のリパーゼである。リパーゼの主な使用は、脂質お
よび油脂工業における、容易に入手可能なトリグリセリドのリパーゼで触媒され
る分子内エステル化を用いた中和グリセリドの産生についてである。リパーゼの
適用としては、洗浄手順の過程における織維からの脂質の除去を容易にするため
の界面活性添加物としての使用が挙げられる。
複雑な有機分子の合成における重要な工程に対する触媒としての酵素の使用、
および特に微生物酵素の使用は、非常に速い速度で流行を獲得している。最も重
要な1つの分野は、キラルな中間体の調製である。キラルな中間体の調製は、広
い範囲の合成化学者、特に新規な医薬、農薬、芳香剤、および調味料の調製に従
事する合成化学者の関心の的である。(Daviesら、Recent Advances in the Gen
eration of Chiral Intermediates Using Enzymes,CRC Press,Boca Raton,Fl
orida(1990)を参照のこと)。酵素により触媒される以下の反応は、有機化学者
の関心の的である:カルボン酸エステル、リン酸エステル、アミド、およびニト
リルの加水分解、エステル化反応、トランスエステル化反応、アミドの合成、ア
ルカノンおよびオキソアルカネートの還元、アルコールのカルボニル化合物への
酸化、スルフィドのスルホキシドへの酸化、およびアルドール反応のような炭素
結合形成反応。
本発明のORFの1つによりコードされる酵素の使用を、生物形質転換および有
機合成について考慮する場合、単離された酵素とは対照的に微生物を用いる利点
およびそれぞれの不利益を考慮する必要が時々ある。一方では全細胞系を用い、
または他方では単離された部分的に精製された酵素を用いる損得は、Budら、Che
mistry in Britain(1987)、127頁により詳細に記載されている。
アミノトランスフェラーゼは、アミノ酸の生合成および代謝に関与する酵素で
あり、アミノ酸の触媒的な生産に有用である。酵素系に基づく微生物の使用の利
点は、アミノトランスフェラーゼ酵素が、L-アミノ酸のみの立体選択的合成を触
媒し、そして一般に、一様に高い触媒速度を保持することである。アミノ酸生産
のためにアミノトランスフェラーゼを使用する記載は、Roselle-David,Methods
of Enzymology 136 :479(1987)によって提供されている。
本発明のORFによってコードされる有用なタンパク質の別のカテゴリーは、核
酸合成、核酸修復、および核酸組換えに関与する酵素を包含する。
2.抗体の生成
本明細書中で記載するように、本発明のタンパク質およびそれらのホモログは
、現在、他のタンパク質に適用されている当該分野において公知の多様な手順お
よび方法において使用され得る。本発明のタンパク質は、タンパク質に選択的に
結合する抗体を生成するために、さらに使用され得る。
本発明の使用のためのE.faecalisタンパク質特異的抗体は、完全なE.faecal
isタンパク質またはそれらの抗原ポリペプチドフラグメント(これは、キャリア
タンパク質(例えば、アルブミン)と共に動物系(例えば、ウサギまたはマウス
)に提示され得るか、またはそれが十分な長さ(少なくとも、約25アミノ酸)で
ある場合、キャリアなしで提示される)に対して産生され得る。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗
体」(Mab)は完全な分子、単鎖抗体全体、および抗体フラグメントを含むこ
とを意味する。本発明の抗体フラグメントは、FabおよびF(ab’)2なら
びに他のフラグメント(単鎖Fvs(scFv)およびジスルフィド結合したF
vs(sdFv)を含む)を含む。本発明において、キメラ抗体およびヒト化モ
ノクローナル抗体ならびに本発明のポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体
もまた含まれる。本発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって調製され得る
。例えば、本発明のポリペプチドまたはそれらの抗原フラグメントを発現する細
胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を生じるために動物へ投与され得る
。例えば、E.faecalisポリペプチドまたはそれらのフラグメントの調
製物が調製され、そして、それが天然の夾雑を実質的に含まなくなるまで生精製
される。次いで、このような調製物は、より高度な特異的活性のポリクローナル
抗血清を産生するために動物に導入される。
好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはそれらの
結合フラグメントである。このようなモノクローナル抗体はハイブリドーマ技術
を使用して調製され得る。例えば、Harlowら、ANTIBODIES:A
LABORATORY MANUAL,(Cold Sprinng Har
bor Press,第2版、1998);Hammerlingら、MONO
CLONAL ANTIBODIES AND T−CELL HYBRIDO
MAS 563−681(Elsevier,N.Y.、1981)を参照のこ
と。FabおよびF(ab’)2フラグメントは、パパイン(Fabフラグメン
トを産生するための)またはペプシン(F(ab’)2フラグメントを産生する
ための)のような酵素を使用する、タンパク質切断によって産生され得る。ある
いは、E.faecalisポリペプチド結合ポリペプチド、キメラ、およびヒ
ト化抗体が、組換えDNA技術の適用によって、または当該分野で公知の方法を
使用して合成化学によって産生され得る。
あるいは、本発明のポリペプチド抗原に結合し得るさらなる抗体は、抗イディ
オタイプ抗体の使用によって、2工程手順で産生され得る。このような方法は、
抗体がそれら自身の抗原であるという事実を利用し、しかもそれゆえ、二次抗体
に結合する抗体を得ることが可能になる。この方法に従って、E.faecal
isポリペプチド特異的抗体を使用し、動物(好ましくは、マウス)を免疫する
。次いで、このような動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生し、
そしてハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、E.faecalisポリペプ
チド特異的抗体に結合する能力が、E.faecalisポリペプチド抗原によ
って阻止され得る抗体を産生するクローンを同定する。このような抗体は、E.
faecalisポリペプチド特異的抗体に対する抗イディオ抗体を含み、そし
てさらなるE.faecalisポリペプチド特異的抗体の形成を誘導するため
に、動物を免疫するために使用され得る。
本発明の抗体およびそのフラグメントは、抗体によって認識されるかまたは特
異的に結合される本発明のポリペプチドの部分によって記載され得る。本発明の
ポリペプチドの抗体結合フラグメントが、上記で議論されるポリペプチドフラグ
メントと同じ様式で(すなわち、N末端部位およびC末端部位で、または隣接する
アミノ酸残基の大きさで)記載されるかまたは特定化され得る。上記に記載され
る、N末端およびC末端位置によってまたはアミノ酸残基の大きさによって特定化
される、本発明のポリペプチドの任意の数の抗体結合フラグメントもまた、本発
明から排除され得る。それゆえ、本発明は、本発明のポリペプチドの特に記載さ
れるフラグメントに特異的に結合する抗体を含み、そしてその排除を可能にする
。
本発明の抗体およびそれらのフラグメントもまた、それらの交差反応性に関し
て記載されるかまたは特定化され得る。E.faecalis以外のEnterococcusの他のど
の種のポリペプチドとも結合しない抗体およびフラグメントが本発明に含まれる
。同様に、Enterococcusの種にのみ結合する抗体およびフラグメン
ト(すなわち、Enterococcus以外のいかなる属由来の細菌にも結合
しない抗体およびフラグメント)が、本発明に含まれる。
3.診断および検出のアッセイおよびキット
本発明は、本発明の腸球菌ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を検出する
ことによって動物の腸球菌感染をアッセイする方法にさらに関連する。この方法
は、Enterococcus特異的抗体、核酸、またはタンパク質のための動
物由来の組織または体液を分析する工程を含む。Enterococcusに対
して特異的な核酸の分析はハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーの
どちらかとして本発明の核酸配列を使用して、PCRまたはハイブリダイゼーシ
ョン技術によってアッセイされる。例えば、Sambrookら Molecu
lar cloning: A Laboratory Mannual(Co
ld Spring Harbor Laboratory Press,第2
版、1989、54ページ参照);Eremeevaら、(1994)J.Cl
in.Microbiol.32:803−810(PCR増幅DNAの制限フ
ラグメント長多型性の分析によってスポットされた熱群Rickettsiae
種における分化を記載している)およびChenら、1994 J.Clin.
Microbiol.32:589−595(PCRを介してB.burgdo
rferi核酸を検出する)。
Enterococcusによる感染に関連した疾患状態の診断はすでに行わ
れており、本発明は疾患状態の進行または後退をモニターするために有用であり
、それによって、増強されたEnterococcus遺伝子発現を示す患者は
、より低いレベルでのこれらの遺伝子を発現する患者と比較して悪性の臨床的結
果を経験する。
「生物学的サンプル」によって、動物、細胞株、組織培養物、または他の供給
源(Enterococcusポリペプチド、mRNA、またはDNAを含む)から得られる任意の
生物学的サンプルが意図される。生物学的サンプルは、生体液(例えば、唾液、
血液、血漿、尿、粘液、滑液など)、組織(例えば、筋肉、皮膚、および軟骨)
ならびにEnterococcusポリペプチドまたは核酸を含むと推測される任意の他の生
物学的供給源を含む。組織のような生物学的サンプルを得るための方法は当該分
野で周知である。
本発明は、動物のEnterococcus感染に関連する疾患を検出するために有用であ
る。好ましい動物はサル、尾なしザル、ネコ、イヌ、トリ、ウシ、ブタ、マウス
、ウマ、ウサギおよびヒトを含む。ヒトが特に好ましい。
総RNAは任意の適切な技術(例えば、Chomczynskiら、(1987)Anal.
Biochem.162:156−159に記載される、一工程グアニジウム-
チオシアネート-フェノール-クロロホルム方法)を使用して生物学的サンプルか
ら単離され得る。次いで、相補的な配列間でのハイブリダイゼーションが可能に
なるように配列番号1〜982で同定される核酸配列と十分な相同性を有するEn
terococcusポリペプチドをコードするmRNAが、任意の適切な方法を使用して
アッセイされる。これらはノザンブロット分析、S1ヌクレアーゼマッピング、
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせての逆転
写(RT−PCR)、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせての逆転写(RT−
LCR)を含む。
ノザンブロット分析はHaradaら、(1990)Cell63:303−
312に記載されるように実施され得る。手短に言うと、総RNAは上記に記載
されるような生物学的サンプルから調製される。ノザンブロットのために、RN
Aは適切な緩衝液(例えば、グリオキサール/ジメチルスルホキシド/リン酸ナト
リウム緩衝液)中で変性され、アガロースゲル電気泳動に供され、そしてニトロ
セルロースフィルター上へ移される。RNAがUVリンカーによってフィルター
へ結合された後、フィルターは、ホルムアミド、SSC、デンハート溶液、変性
サケ***、SDS、およびリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中でプレハイブリ
ダイズされる。任意の適切な方法に従って標識された配列番号1〜982に示さ
れるE.faecalisポリヌクレオチド配列(例えば、32P多重プライム
(multiprimed)DNA標識システム(Amersham))が、プ
ローブとして使用される。一晩のハイブリダイゼーション後に、フィルターが洗
浄され、そしてX線フィルムへ曝露される。本発明に従ってプローブとして使用
するためのDNAが、上節に記載され、そして好ましくは少なくとも15ヌクレ
オチド長である。
S1マッピングがFujitaら((1987)Cell 49:357−3
67)に記載されるように実施され得る。S1マッピングでの使用のためのプロ
ーブDNAを調製するために、本発明の上記に記載のE.faecalis D
NA配列のセンス鎖が、標識されたアンチセンスDNAを合成するためのテンプ
レートとして使用される。次いで、アンチセンスDNAが、適切な制限エンドヌ
クレアーゼを使用して消化され、所望の長さのさらなるDNAプローブが産生さ
れ得る得る。このようなアンチセンスプローブは、標的mRNA(すなわち、E
nteococcusポリペプチドをコードするmRNA)に対応する保護バン
ドを可視化するために有用である。
EnteococcusポリペプチドをコードするmRNAのレベルが、例え
ば、Makinoら((1990)Technique 2:295−301)
に記載されるRT−PCR方法を使用してアッセイされる。この方法によってポ
リアクリルアミドゲルバンド中の「アンプリコン」の放射活性は、標的mRNA
の初期濃度に線形に関連する。手短にいうと、この方法は、RTプライマーおよ
び適切な緩衝液を含む反応混合物中の生物学的サンプルから単離されるさらなる
総RNAを添加する工程を包含する。プライマーのアニーリングのためのインキ
ュベーション後、混合物は、RT緩衝液、dNTP、DTT、RNaseインヒビターおよび
逆転写酵素で補充され得る。RNAの逆転写を達成するためのインキュベーション
後、次いでRT産物は標識されたプライマーを使用するPCRに供させる。あるいは
、プライマーを標識するのではなく、標識されたdNTPが、PCR反応混合物中でイ
ンキュベートされ得る。PCR増幅は、従来の技術にしたがって、DNAサーマルサイ
クラー(thermal cycler)で実施され得る。増幅を達成するための適切な数のラ
ウンド後に、PCR反応混合物は、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動される。ゲ
ルの乾燥後、適切なバンド(これは、本発明のEnterococcusポリペ
プ
チドをコードするmRNAに対応する)の放射活性が、イメージングアナライザ
ーを使用して定量される。RTおよびPCR反応成分ならびに条件、試薬および
ゲル濃度、ならびに標識方法は当該分野で周知である。RT−PCR法における
バリエーションは、当業者に明らかである。本発明の核酸を検出し得る他のPCR
法は、PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL(C.W.Dieffenbachら編、Cold Spring
Harbor Lab.Press,1995)において見出され得る。
DNAおよびRNAの両方を含む本発明のポリヌクレオチドは、本発明またはE.fae
calisのポリヌクレオチドを含むEnterococcus種を、バイオチップ技術を使用し
て検出するために使用され得る。本発明には、高密度チップアレイ(>1000オリ
ゴヌクレオチド/cm2)および低密度チップアレイ(<1000オリゴヌクレオチド/c
m2)の両方を含む。本発明のポリヌクレオチドのアレイを含有するバイオチップ
は、生物学的および環境的サンプルにおけるE.faecalisを含むEnterococcus種
を検出するため、およびE.faecalisまたは他のEnterococcus感染を有するヒト
を含む動物を診断するために使用され得る。本発明のバイオチップは、迅速な差
示的な病原検出および診断において使用される、本発明のポリヌクレオチド配列
に加えて、細菌、ウイルス、寄生動物、および真菌ポリヌクレオチド配列を含む
、他の病原のポリヌクレオチド配列を含み得る。バイオチップはまた、臨床にお
ける薬物治療および研究室における薬物開発に応じた、E.faecalisまたは他のE
nterococcus感染をモニターするため、および遺伝子変化(欠失、挿入、ミスマ
ッチなど)をモニターするために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのア
レイを含むバイオチップ技術はまた、本発明の遺伝子を含む複数の遺伝子の発現
を、同時にモニターするために使用され得る。選択されたアレイを含むために使
用されるポリヌクレオチドは、フラグメントについてと同様な様式で特定化され
得る(すなわち、5'位および3'位で、または連続した塩基対長で)。バイオチッ
プ技術を使用して、Enterococcus種を検出するための本発明のポリヌクレオチド
の方法および特定の使用には、当該分野に公知の方法および特定の使用ならびに
米国特許第5510270号、第5545531号、第5445934号、第5677195号、第5532128号
、第5556752号、第5527681号、第5451683号、第5424186号、第5607646号、第565
8732号、および国際特許WO/9710365、WO/9511995、WO/9743447、WO/9535505の方
法お
よび特定の使用を含む(各々はその全体が本明細書中に援用される)。
本発明のポリヌクレオチドを使用するバイオセンサーもまた、E.faecalisま
たは他のEnterococcus種およびその感染を、検出、診断、およびモニターするた
めに使用され得る。本発明のポリヌクレオチドを使用するバイオセンサーはまた
、本発明の特定のポリヌクレオチドを検出するために使用され得る。本発明のポ
リヌクレオチドを使用するバイオセンサーはまた、臨床における薬物治療および
研究室における薬物開発に応じた遺伝子変化(欠失、挿入、ミスマッチなど)を
モニターするために使用され得る。E.faecalisを含むEnterococcus種を検出す
るための、バイオセンサーを使用する、本発明のポリヌクレオチドの方法および
特定の使用は当該分野で周知の方法および特定の使用、ならびに米国特許第5721
102号、第5658732号、第5631170号、および国際特許WO9735011、WO/9720203の方
法および特定の使用(各々はその全体が本明細書中に援用される)を含む。
従って、本発明には、本発明のポリヌクレオチドを含むバイオチップおよびバ
イオセンサーの両方を含み、そしてそれらの使用の方法を含む。
生物学的サンプルにおけるEnterococcusポリペプチドレベルをアッセイするこ
とは、抗体に基づく技術のような任意の当該分野に公知の方法を使用して起こり
得る。例えば、組織におけるEnterococcusポリペプチド発現を、伝統的な免疫組
織学的な方法を用いて研究し得る。これらにおいて、特異的な認識は、一次抗体
(ポリクローナルまたはモノクローナル)によって提供されるが、二次検出系は
、蛍光、酵素、または他の結合された二次抗体を使用し得る。結果として、病理
学的な試験のための組織切片の免疫組織学的染色を得る。組織はまた、ウェスタ
ンブロットまたはドット/スロットアッセイについて、Enteroccoccusポリペプチ
ドの解放のために、例えば、尿素および中性界面活性剤を使用して抽出され得る
。例えば、Jalkanen,Mら、(1985)J.Cell.Biol.101:976-985;Jalkanen,Mら
、(1987)J.Cell.Biol.105:3087-3096を参照のこと。カチオン性固相に基づく
この技術において、Enterococcusポリペプチドの定量は、単離されたEnterococc
usポリペプチドを標準として使用して達成され得る。この技術はまた、体液にも
適用され得る。
Enterococcusポリペプチド遺伝子発現の検出に有用な、他の抗体に基づく方法
には、ELISAおよびラジオイムノアッセイ(RIA)のようなイムノアッセイが含ま
れる。例えば、Enterococcusポリペプチド特異的モノクローナル抗体は、免疫吸
着剤として、ならびにEnterococcusポリペプチドを検出および定量するための酵
素標識プローブとしての両方で使用され得る。サンプル中に存在するEnterococc
usポリペプチドの両は、線形回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準
調製物中に存在する量に対する基準によって計算され得る。このようなELISAは
、Iacobelliら、(1988)Breast CancerResearch and Treatment 11:19-30に記
載されている。別のELISAアッセイにおいて、2つの異なる特異的モノクローナ
ル抗体が、体液中でのEnterococcusポリペプチドを検出するために使用され得る
。このアッセイにおいて、抗体の1つが免疫吸着体として、そして他は酵素標識
プローブとして使用される。
上記の技術は、本質的に、「一工程」または「二工程」アッセイとして行われ
得る。「一工程」アッセイは、固定化抗体とEnterococcusタンパク質とを接触さ
せる工程を包含し、そして洗浄する工程、標識された抗体と混合物とを接触させ
る工程は含まない。「二工程」アッセイは、洗浄する工程の後に、標識された抗
体と混合物とを接触させる工程を包含する。他の従来の方法もまた、適切に使用
され得る。通常、支持体上にアッセイ系の1つの成分を固定することが所望され
、それによって系の他の成分は、その成分との接触およびサンプルからの容易な
除去を生じることが可能となる。上記のバリエーションおよび本発明に含まれる
他の免疫学的な方法は、Harlowら、ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL.(Cold S
pring Harbor Laboratory Press,第2版、1988)にも見出され得る。
適切な酵素標識は、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒する
オキシダーゼ群由来のものを含む。グルコースオキシダーゼは、それが良好な安
定性を有し、そしてその基質(グルコース)が容易に入手できるために、特に好
ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体/基質反応によって形成され
る過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。酵素に加えて、
他の適切な標識として、放射性同位元素(例えば、ヨウ素(125I、121I)、炭素
(14C)、イオウ(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(111In)、およびテ
クネチウム(99mTc))、ならびに蛍光標識(例えば、フルオレセインおよびロ
ーダミ
ン)ならびにビオチンが挙げられる。
本発明のEnterococcusポリペプチド特異的抗体についてのさらなる適切な標識
は以下に提供される。適切な酵素標識の例には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、En
terococcusヌクレアーゼ、Δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒ
ドロゲナーゼ、α-グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホ
スフェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパ
ラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアー
ゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、
およびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。
適切な放射性同位体標識の例は、3H、111In、125I、131I、32P、35S、14
C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb
、47Sc、109Pdなどを含む。111Inは、インビボでのイメージングが用いられる場
合に好ましい同位体である。なぜなら、これは、125Iまたは131Iで標識したモ
ノクローナル抗体の肝臓による脱ハロゲン化の問題を回避するからである。さら
に、この放射性核種(radionucleotide)は、イメージングのためにより好まし
いγ放出エネルギーを有する。例えば、Perkinsら,Eur.J.Nucl.Med.10:296
-301(1985); Carasquilloら,J.Nucl.Med.28:281-287(1987)を参照のこと。
例えば、1-(p-イソチオシアネートベンジル)-DPTAを用いてモノクローナル抗体
にカップリングした111Inは、非肺瘍性組織(特に肝臓)における取り込みをほ
とんど示さなかった。それゆえ、これは、腫瘍局在化の特異性を増強する。Este
banら,J.Nucl.Med. 28:861-870(1987)を参照のこと。
適切な非放射性同位体標識の例は、157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、および56Feを
含む。
適切な蛍光標識の例は、152Eu標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネー
ト標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフ
ィコシアニン標識、o-フタルアルデヒド(o-phthaldehyde)標識、およびフルオ
レサミン標識を含む。
適切な毒素標識の例は、Pseudomonas毒素、ジフテリア毒素、リシン、および
コレラ毒素を含む。
化学発光標識の例は、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジ
ニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エス
テル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識を含
む。
核磁気共鳴コントラスト剤の例は、Gd、Mn、および鉄のような重金属原子核を
含む。
上記の標識を抗体に結合するための代表的な技術は、Kennedyら,Clin.Chim.
Acta 70:1-31(1976)およびSchursら,Clin.Chim.Acta 81:1-40(1977)により
提供される。後者において言及されるカップリング技術は、グルタルアルデヒド
方法、過ヨウ素酸方法、ジマレイミド方法、m-マレイミドベンジル-N-ヒドロキ
シ-スクシンイミドエステル方法であり、これらの方法は全て本明細書中に参考
として援用される。
関連の局面において、本発明は、E.faecalis感染に対する特異的な抗体を含
む血清のスクリーニングにおける使用のための診断用キットを含む。このような
キットは、エピトープ(これは、少なくとも1つの抗E faecalis抗体と特異的に
免疫反応性である)を含む単離されたE.faecalis抗原を含み得る。このような
キットまたは、抗原に対する抗体の結合の検出のための手段を含む。特定の実施
態様において、キットは組換え的に産生されたか、または化学的に合成されたペ
プチドまたはポリペプチド抗原を含み得る。ペプチドまたはポリペプチド抗原は
、固体支持体に結合し得る。
さらに特異的な実施態様において、上記キットの検出手段には、ペプチドまた
はポリペプチド抗原が結合される固体支持体が含まれる。このようなキットはま
た、非結合レポーター標識化抗ヒト抗体を含み得る。この実施態様において、E.
faecalis抗原への抗体の結合は、抗E.faecalisポリペプチド抗体へのレポータ
ー標識化抗体の結合によって検出され得る。
関連の局面において、本発明は、被験体におけるE.faecalis感染の検出方法
を含む。この検出方法には、被験体からの体液(好ましくは、血清)を単離され
たE.faecalis抗原と反応させる工程、および結合抗体の存在について抗原を試
験する工程が含まれる。特定の実施態様において、本発明の方法には、固体支持
体に結合したポリペプチド抗原が含まれ、そして血清を支持体と反応させる。続
いて、支持体をレポーター標識化抗ヒト抗体と反応させる。次いで支持体をレポ
ーター標識化抗体の存在について試験する。
上記のアッセイおよびキットにおいて使用される固体表面試薬は、タンパク質
材料を固体支持体材料(例えば、重合体ビーズ、ディップスティック、96ウェル
プレート、またはフィルター材料)に結合するための公知の技術によって調製さ
れる。これらの結合方法は、一般的には、固体支持体へのタンパク質の非特異的
吸着、または固体支持体上の化学的な反応基(例えば、活性化カルボキシル基、
ヒドロキシル基、またはアルデヒド基)へのタンパク質の共有結合(代表的には
、遊離アミノ基を介して)を含む。あるいは、ストレプトアビジンコードプレー
トは、ビオチン化抗原との結合において使用され得る。
本発明のポリペプチドおよび抗体(それらのフラグメントを含む)は、バイオ
チップおよびバイオセンサー技術を使用して、E.faecalisを含むEnterococcus
種を検出するために使用され得る。本発明のバイオチップおよびバイオセンサー
は、Enterococcus種(E.faecalis を含む)を特異的に認識する抗体を検出する
ための本発明のポリペプチドを含み得る。本発明のバイオチップおよびバイオセ
ンサーはまた、Enterococcus種(E.faecalisまたは本発明の特異的ポリペプチ
ドを含む)を検出するための、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体を
含み得る。本発明のポリペプチドまたは抗体を含むバイオチップまたはバイオセ
ンサーは、生物学的サンプルまたは環境的サンプルにおけるEnterococcus種(E
.faecalisを含む)を検出するために、およびE.faecalisまたは他のEnterococ
cus感染した動物(ヒトを含む)を診断するために使用され得る。従って、本発
明は、本発明のポリペプチドまたは抗体を含むバイオチップおよびバイオセンサ
ーの両方、ならびにそれらの使用を含む。
本発明のバイオチップは、迅速な差示的な病原性の検出および診断における使
用のために、さらに、本発明のポリペプチド配列に加えて、他の病原体(細菌、
ウイルス、寄生虫、および真菌ポリペプチド配列を含む)のポリペプチド配列を
含み得る。本発明のバイオチップはさらに、迅速な差示的な病原性の検出および
診断における使用のために、本発明の抗体またはそれらのフラグメントに加えて
、細菌、ウイルス、寄生虫、および真菌ポリペプチド配列を含む他の病原に特異
的
な抗体またはそれらのフラグメントを含み得る。本発明バイオチップおよびバイ
オセンサーはまた、研究室での臨床および薬物開発における薬物治療に関して、
E.faecalisまたは他のEnterococcus感染をモニターするために、ならびに遺伝
子変化(アミノ酸欠失、挿入、置換など)をモニターするために使用され得る。
本発明のポリペプチドまたは抗体を含むバイオチップおよびバイオセンサーはま
た、本発明のポリペプチドを含む、複数のポリペプチドの発現を同時にモニター
するために使用され得る。本発明のバイオチップまたはバイオセンサーを含むた
めに使用されるポリペプチドは、フラグメントについてと同様な様式(すなわち
、それらのN末端位置およびC末端位置で、または連続したアミノ酸残基長で)
で特定化され得る。Enterococcus種(E.faecalisを含む)を検出するための本
発明のポリペプチドおよび抗体の方法および特定の使用、またはバイオチップお
よびバイオセンサーを使用する特定のポリペプチドは当該分野に公知のもの、本
発明のポリヌクレオチドを使用するバイオチップおよびバイオセンサーについて
、上に列挙された米国特許および国際特許のもの、ならびに以下のものを含む:
米国特許第5658732号、第5135852号、第5567301号、第5677196号、および国際特
許WO9729366、WO9612957、各々はその全体が本明細書中に援用される。
4.結合剤についてのスクリーニングアッセイ
本発明の単離されたタンパク質を使用して、本発明はさらに、本発明のORFの
1つによってコードされるタンパク質に結合する薬剤、またはフラグメントなら
びに本明細書中に記載されるEnterococcus faecalisフラグメントおよびコンチ
ィグの1つを得る方法ならびに同定する方法を提供する。
一般的に、このような方法は以下の工程を包含する:
(a)薬剤を、本発明のORFの1つによってコードされる単離されたタンパク
質、または単離されたEnterococcus faecalisゲノムのフラグメントと接触させ
る工程;および
(b)薬剤が上記タンパク質または上記フラグメントに結合するか否かを決定
する工程。
上記アッセイにおいてスクリーニングされた薬剤は、ペプチド、炭水化物、ビ
タミン誘導体、または他の製剤であり得るがこれらに限定されない。薬剤は、ラ
ンダムに選択およびスクリーニングされ得るか、あるいはタンパク質モデリング
技術を用いて合理的に選択または設計され得る。
ランダムスクリーニングについては、薬剤(例えば、ペプチド、炭水化物、製
剤など)は、ランダムに選択され、そして本発明のORFによってコードされるタ
ンパク質に結合するそれらの能力についてアッセイされる。
あるいは、薬剤は、合理的に選択または設計され得る。本明細書で使用される
ように、薬剤は、薬剤が特定のタンパク質の配置に基づいて選択される場合、「
理論的に選択または設計される」という。例えば、当業者は、現在利用可能な手
順を、合理的に設計された抗ペプチドペプチド(例えば、Hurbyら、「Applicati
on of Synthetic Peptides:Antisense Peptides」Synthetic Peptides,A User
's Guide,W.H.Freeman,NY(1992),289-307頁、およびKaspczakら、Biochemist
ry 28:9230-8(1989)を参照のこと)、製剤などを生成するために特異的なペ
プチド配列に結合し得るペプチド、または製剤などを生成することに容易に適応
させ得る。
前述に加えて、本発明の薬剤の1つのクラスは、広範に記載されるように、本
発明のORFまたはEMFの1つへの結合により遺伝子発現を制御するために使用され
得る。上記のように、このような薬剤は、ランダムにスクリーニングまたは合理
的に設計/選択され得る。ORFまたはEMFを標的化することで当業者は、配列特異
的な薬剤またはエレメント特異的な薬剤を設計して発現制御の同じEMFに依存す
る単一のORFまたは複数のORFのいずれかの発現を調節することが可能になる。
DNA結合剤の1つのクラスは、ハイブリダイズするかまたはDNAまたはRNAへの
結合により三重ヘリックスを形成する塩基残基を含む薬剤である。このような薬
剤は、典型的なリン酸ジエステル、リボ核酸骨格に基づき得、または塩基付着能
力を有する種々のスルフヒドリル誘導体またはポリマー誘導体であり得る。
これらの方法における使用に適切な薬剤は、通常、20〜40塩基を含み、そして
転写に関与する遺伝子の領域(三重ヘリックス。Leeら、Nucl.Acids Res.6:30
73(1979);Cooneyら、Science 241:456(1988);およびDervanら、Science 251:
1360(1991)を参照のこと)、またはmRNA自体(アンチセンス-Okano,J.Neu
rochem.56:560(1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of G
ene Expression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988))に相補的になるように設
計される。三重ヘリックス形成は、最適にはDNAからのRNAの転写の阻止(shut-o
ff)を生じ、一方アンチセンスRNAハイブリダーゼーションは、mRNA分子のポリ
ペプチドへの翻訳をブロックする。両方の技術が、モデル系において有効である
ことが示されている。本発明の配列中に含まれる情報は、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドおよび三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド、ならびに他のDNA結
合剤を設計するために使用され得る。
5.薬学的組成物およびワクチン
本発明はさらに、Enterococcus faecalisまたは別の関連生物体の、インビボ
またはインビトロでの、増殖および病原性を調節するために使用される製剤を提
供する。本明細書で使用されるように、「製剤」は、薬学的組成物を提供するた
めの公知の技術を用いて処方され得る物質の組成物として定義される。本明細書
で使用されるように「本発明の製剤」は、本発明のORFによってコードされるタ
ンパク質に由来する製剤、または本明細書で記載のアッセイを用いて同定される
薬剤をいう。
本明細書中で使用されるように、製剤は、製剤が問題の生物体の増殖速度、分
裂速度、または生存力を減少する場合、「Enterococcus faecalisまたは関連生
物体の、インビボおよびインビトロでの、増殖および病原性を調節する」といわ
れる。本発明の製剤は、多くの様式で生物体の増殖および病原性を調節し得るが
、しかし、作用の基礎となる機構を理解することは、本発明の製剤の使用の実施
のために必要ではない。いくつかの製剤は、重要なタンパク質に結合し、従って
タンパク質の生物学的活性をブロックすることにより増殖または病原性を調節す
るが、別の薬剤は生物体の外表面の成分に結合し得、付着をブロックするかまた
は身体の天然の免疫系にさらに作用しやすい生物体を与え得る。あるいは、製剤
は、本発明のORFの1つによってコードされるタンパク質を含み得、そしてワク
チンとして作用し得る。外膜成分に基づくワクチンの開発および使用は、当該分
野において周知である。
本明細書中で使用されるように、「関連生物体」は、その増殖が、本発明の製
剤の1つによって調節され得る任意の生物体をいう広い用語である。一般的に、
このような生物体は、ワクチンとして使用される製剤またはタンパク質の標的で
あるタンパク質の相同物を含む。このように、関連生物体は、細菌である必要は
なく、真菌類またはウイルス病原体であり得る。
本発明の製剤および組成物は、簡便な様式(例えば、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻内、または皮内経路)で投与され得る。薬学的組成物は
、特定の徴候の処置および/または予防に有効である量で投与される。一般的に
、薬学的組成物は、少なくとも約1mg/kg体重の量で投与され、そしてほとんど
の場合、薬学的組成物は、1日当たり約1g/kg体重を超えないで投与される。
ほとんどの場合において、投薬量は、投与経路、徴候などを考慮して、毎日、約
0.1mg/kg〜約10g/kg体重である。
本発明の薬剤は、天然の形態で使用され得るか、または化学誘導体を形成する
ために修飾され得る。本明細書中で使用されるように、分子は、通常は分子の一
部分ではない付加的な化学部分を含有する場合、別の分子の「化学誘導体」であ
るといわれる。このような部分は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを
改善し得る。あるいは、この部分は分子の毒性を減少し得、分子の任意の非所望
の副作用を排除または弱めるなどし得る。このような効果を媒介し得る部分は、
他の情報源の中でも本明細書中でいずれかに引用されるREMINGTON'S PHARMACEUT
ICAL SCIENCES(1980)に開示されている。
例えば、このような部分は、機能的誘導体の免疫学的特徴(例えば、所定の抗
体に対する親和性)を変化し得る。免疫調節活性におけるこのような変化は、適
切なアッセイ(例えば、競合型イムノアッセイ)によって測定される。このよう
なタンパク質特性(例えば、酸化還元安定性、熱安定性、生物学的半減期、疎水
性、タンパク質分解に対する感受性、またはキャリアとともにまたは複数マーへ
凝集する傾向)の改変はまた、この方法において達成され得、そして当業者に周
知の方法によってアッセイされ得る。
本発明の薬剤の治療効果は、任意の適切な手段(例えば、吸入、静脈内、筋肉
内、皮下、腸、または非経口)によって患者に薬剤を提供することによって得ら
れ得る。生物の増殖が、制御されるべき血液および組織内で有効濃度を達成する
ように、本発明の薬剤を投与することが好ましい。有効な血液濃度を達成するた
めに、好ましい方法は、注入によって薬剤を投与することである。投与は、連続
注入、または単回または複数回注入によって行われ得る。
本発明の薬剤の1つを患者に与える際、投与される薬剤の用量は、患者の年齢
、体重、身長、性別、総合的医療条件、以前の治療経歴などのような因子に依存
して変わる。一般に、レシピエントに約1pg/kg〜10mg/kg(患者の体重)の範囲の
薬剤の用量を与えるのが好ましいが、より低いまたはより高い用量が投与され得
る。治療に有効な用量は、本発明の薬剤または別の薬剤の組み合わせを使用する
ことにより、減少し得る。
本明細書中で使用されるように、2つまたはそれ以上の化合物または薬剤は、
(1)各化合物の生理学的効果、または(2)各化合物の血清濃度のいずれかが同時に
測定され得る場合、互いに「組み合わせて」投与されるといわれる。本発明の組
成物は、他の薬剤の投与と同時に投与され得るか、その前に投与され得るか、ま
たはその後で投与され得る。
本発明の薬剤は、レシピエント被験者に標的生物の増殖速度(上記のように定
義されている)を低下させるに十分な量で与えられることが意図される。
本発明の薬剤の投与は、「予防用」または「治療用」のいずれかのためであり
得る。予防用で投与される場合、この薬剤は、生物増殖を表す任意の症候の前に
投与される。この薬剤の予防用の投与は、結果として起こるいずれの感染の発症
の速度を防ぐか、弱めるか、または減少させるのに有用である。治療用に投与さ
れる場合、この薬剤は感染の症候の発症(または発症後にすぐ)時に与えられる。
この化合物の治療用の投与は、感染の病理的症候を弱めるに役に立つか、または
回復の速度を増加させるに役立つ。
本発明の薬剤は、薬学的に受容可能な形態および治療用に有効な濃度で被験体
、例えば、哺乳類、または患者に投与される。組成物は、その投与がレシピエン
ト患者に耐えられ得るならば、「薬学的に受容可能」であるといわれる。投与さ
れる量が生理学的に有意であるならば、このような薬剤は「治療的に有効な量」
で投与されるといわれる。薬剤は、その存在がレシピエント患者の生理学に検出
可
能な変化を生じるなら、生理学的に有意である。
本発明の薬剤は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って
処方され得、それによって、これらの物質、またはこれらの機能的誘導体は、薬
学的に受容可能なキャリアビヒクルと混合して組み合わせられる。他のヒトタン
パク質(例えば、ヒト血清アルブミン)を含む適切なビヒクルおよびそれらの処方
は、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第16版、Osol,A.編、Mac
k Publishing,Easton PA(1980)に記載されている。有効な投与に適切な薬学的
に受容可能な組成物を形成するために、このような組成物は、適切な量のキャリ
アビヒクルと共に有効量の1つ以上の本発明の薬剤を含有する。
さらなる薬学的な方法は、作用の継続期間を制御するために使用され得る。制
御放出調製物は、1種以上の本発明の薬剤と複合体化するか、または吸収するポ
リマーの使用により達成され得る。制御される送達は、高分子(例えば、ポリエ
ステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メ
チルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミン硫酸塩)を用
いて処方し、そして処方中の高分子および薬剤の濃度を調整することを含む種々
の周知の技術により、および放出の所望の時間経過を実現するために操作され得
る取り込み方法の適切な使用により、実現され得る。制御放出調製物によって作
用の継続期間を制御する別の可能な方法は、本発明の薬剤をポリマー性物質(例
えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ(乳酸)またはエチレンビ
ニルアセテートコポリマー)の粒子に取り込むことである。あるいは、これらの
薬剤をポリマー性粒子に取り込む代わりに、これらの物質は、例えば、コアセル
ベーション技術により、または例えばヒドロメチルセルロースもしくはゼラチン
マイクロカプセルとポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルとのそれぞれ
の界面重合により調製したマイクロカプセルに、またはコロイド薬物送達系(例
えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ
粒子、およびナノカプセル)に、またはマクロエマルジョンに封入され得る。こ
のような技術は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(1980)に開示されてい
る。
本発明はさらに、本発明の薬学的組成物の1種以上の成分で充填される1種以
上の容器を含む薬学的なパックまたはキットを提供する。このような容器と関連
するのは、薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を統制する政府機関
によって定められた形態の通知であり得、この通知は、ヒト投与のための製造、
使用または販売の機関による認可を反映する。
さらに、本発明の薬剤は他の治療用化合物と組み合わせて使用され得る。
本発明はまた、1以上の本発明のポリペプチドを含むワクチンを提供する。ワ
クチンの組成における不均質性は、本発明のE.faecalisポリペプチドを合わせる
ことにより提供され得る。この型の多成分ワクチンが望ましい。なぜなら、これ
らは、多種および多株のEnterococcus属に対する防御免疫応答を惹起することに
、単一ポリペプチドワクチンよりも有効であるようであるからである。
多成分ワクチンは、多くの免疫原性成分に対する抗体産生を惹起することが当
該分野で公知である。例えば、Deckerら(1996)J.Infect.Dis.174:S270-275を
参照のこと。さらに、B型肝炎、ジフテリア、破傷風、百日咳四価ワクチンは、
4つ全ての病原性因子に対して防御レベルの抗体をヒト乳児において惹起するこ
とが最近実証された。例えば、Aristegui,J.ら(1997)Vaccine 15:7-9を参照のこ
と。
本発明は、単一成分ワクチンに加えて多成分ワクチンを含む。これらのワクチ
ンは、1より多くのポリペプチド、免疫原、または抗原を含む。従って、多成分
ワクチンは、1より多くの本発明のE.faecalisポリペプチドを含むワクチンであ
る。
さらに、本発明の範囲内には、細胞全体およびウイルス全体のワクチンがある
。このようなワクチンは、組換えにより生成され得、そして配列番号1〜982に
記載される1以上のE.faecalisポリペプチドの発現を含み得る。例えば、本発明
のE.faecalisポリペプチドは、分泌されるかまたは細胞内、細胞表面上、もしく
は細胞周辺腔中に局在化されるかのいずれかであり得る。さらに、組換えウイル
スが用いられる場合、本発明のE.faecalisポリペプチドは、例えば、ウイルスエ
ンベロープ中に、キャプシドの表面上に、またはキャプシド内に内部に局在化し
得る。異種タンパク質を発現する細胞を用いる細胞全体ワクチンは、当該分野で
公知である。例えば、Robinson,K.ら(1997)Nature Biotech.15:653-657; Sir
a
rd,J.ら(1997)Infect.Immun.65:2029-2033; Chabalgoity,J.ら(1997)Infec
t.Immun.65:2402-2412を参照のこと。これらの細胞は、生きたまま、または投
与前に殺傷されて投与され得る。Chabalgoity,J.ら(前出)は、例えば、扁形
動物脂肪酸結合タンパク質の一部をその細胞表面上に融合タンパク質として発現
する生弱毒Salmonellaワクチン株のマウスにおける好結果の使用を報告する。
多成分ワクチンはまた、1以上の本発明のE.faecalisポリペプチドまたはその
フラグメントを、さらなる非Enterococcus成分(例えば、ジフテリア毒素もしく
は破傷風毒素、および/または免疫応答を惹起することが公知の他の化合物)と
合わせることにより、当該分野で公知の技術を用いて調製され得る。このような
ワクチンは、Enterococcus属および非Enterococcus病原性因子の両方のメンバー
の防御免疫応答を惹起するために有用である。
本発明のワクチンはまた、DNAワクチンを含む。DNAワクチンは、多くの感染性
疾患のために現在開発中である。例えば、Boyerら(1997)Nat.Med.3:526-532を
参照のこと; Spier,R.(1996)Vaccine 14:1285-1288に概説される。このような
DNAワクチンは、1以上の本発明のE.faecalisポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列を本ポリペプチドの発現を可能にするような様式で方向付けて含む。
例えば、B.burgdorgeri OspAをコードするプラスミドDNAの直接投与は、マウス
においてボレリアチャレンジに対して防御免疫を惹起することが示されている。
Lukeら(1997)J.Infect.Dis.175:91-97を参照のこと。
本発明はまた、免疫応答を調整し得る分子とともに同時投与されるワクチンの
投与に関する。Kimら(1997)Nature Biotech.15:641-646は、例えば、免疫応答
を刺激する分子をコードするDNA配列を同時投与した場合にDNA免疫により生じる
免疫応答の増強を報告する。類似の様式で、本発明のワクチンは、免疫モジュレ
ーターをコードする核酸または免疫モジュレーター自体のいずれかとともに同時
投与され得る。これらの免疫モジュレーターは、顆粒球マクロファージコロニー
刺激因子(GM-CSF)およびCD86を含む。
本発明のワクチンは、受動免疫または能動免疫のいずれかによりEnterococcus
感染に対する耐性を付与するために用いられ得る。本発明のワクチンが、能動免
疫によるEnterococcus感染に対する耐性を付与するために用いられる場合、本発
明のワクチンは、Enterococcus感染を防止するかまたは弱毒化するかのいずれか
である防御免疫応答を惹起するために動物に投与される。本発明のワクチンが受
動免疫によりEnterococcus感染に対する耐性を付与するために用いられる場合、
ワクチンは、宿主動物(例えば、ヒト、イヌ、またはマウス)に提供され、そし
てこの抗血清により惹起される抗血清が回収され、そしてEnterococcus属のメン
バーにより引き起こされる感染を有することが疑われるレシピエントに直接提供
される。
抗体または抗体のフラグメントを毒素分子で標識する能力は、受動免疫が行な
われる場合にEnterococcus感染を処置するためのさらなる方法を提供する。この
実施態様では、抗体、または本明細書中に開示されるE.faecalisポリペプチドを
認識し得る抗体のフラグメント、またはそれらのフラグメント、ならびに他のEn
terococcusタンパク質が、患者へのその投与の前に毒素分子とともに標識される
。このような毒素で誘導体化された抗体が、Enterococcus細胞に結合する場合、
毒素部分はこれらの細胞に局在化し、そしてそれらの死を引き起こす。
従って、本発明は、本発明のポリペプチドに対して生成される抗血清により認
識され、そしてそれに結合する抗原を有する生物から生じるEnterococcus感染を
防止または弱毒化するための手段に関し、そしてその手段を提供する。本明細書
で用いる場合、ワクチンは、動物へのその投与が、疾患の症状もしくは状態の全
体的もしくは部分的な弱毒化(すなわち、抑制)、または疾患に対する動物の全
体的もしくは部分的な免疫を動物のいずれかにもたらす疾患を防止または弱毒化
するといわれる。
ワクチン(またはそれが惹起する抗血清)の投与は、「予防」または「治療」
のいずれかの目的のためであり得る。予防的に提供される場合、この化合物は、
Enterococcus感染の任意の症状の進行において提供される。化合物の予防的投与
は、任意のその後の感染を予防または弱毒化するために役立つ。治療的に提供さ
れる場合、化合物は、動物がEnterococcus属のメンバーに感染したかもしれない
ことを示す症状の検出の際またはその後で提供される。化合物の治療的投与は、
任意の実際の感染を弱毒化するために役立つ。従って、本発明のE.faecalisポリ
ペプチドおよびそのフラグメントは、感染発症の前(予想される感染を予防また
は弱毒化するために)または実際の感染の開始後に提供され得る。
本発明のポリペプチドは、天然のタンパク質の一部をコードするかその機能的
誘導体をコードするかにかかわらず、純粋な形態で投与してもよいし、高分子キ
ャリアにカップリングしてもよい。このようなキャリアの例は、タンパク質およ
び炭水化物である。本発明のポリペプチドの免疫原性を増強するための高分子キ
ャリアとして作用し得る適切なタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニ
ン(KLH)、破傷風トキソイド、百日咳毒素、ウシ血清アルブミン、およびオボ
アルブミンを含む。本発明のポリペプチドをこのような高分子キャリアにカップ
リングする方法は、Harlowら、ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL(Cold Spring
Harbor Laboratory Press,第2版 1988)に開示される。
組成物は、その投与がレシピエント動物によって耐えられ得る、およびさもな
ければその動物への投与に適切であるならば、「薬理学的または生理学的に受容
可能」であるといわれる。投与される量が生理学的に有意であるならば、このよ
うな薬剤は「治療的に有効な量」で投与されるといわれる。薬剤は、その存在が
レシピエント患者の生理に検出可能な変化を生じるならば、生理学的に有意であ
る。
全ての例において、本発明のワクチンは、薬理学的に受容可能な化合物として
投与されるが、当業者は、薬理学的に受容可能な化合物の組成が、その化合物が
投与される動物によって変化することを認識する。例えば、ヒトへの使用が意図
されるワクチンは、一般に、フロイントアジュバントは同時投与されない。さら
に、本発明のE.faecalisポリペプチドの純度のレベルは、通常、ヒトに投与され
る場合、ヒトでない動物に投与される場合よりも高い。
当業者により理解されるように、本発明のワクチンが動物に提供される場合、
これは、塩、緩衝液、アジュバント、または組成物の効力を改善するために望ま
しい他の物質を含み得る組成物中に存在し得る。アジュバントは、特異的免疫応
答を特異的に増強するために用いられ得る物質である。これらの物質は、一般に
2つの機能を行う:(1)これらは抗原が投与後に迅速に異化されるのを防御する
、および(2)これらは、免疫応答を非特異的に剌激する。
通常、アジュバントおよび組成物は、免疫系への提示の前に混合されるか、ま
たは別々に提示されるが、免疫される動物の同じ部位に提示される。アジュバン
トは、その組成に基づいていくつかの群に粗く分けられ得る。これらの群は、オ
イルアジュバント(例えば、フロイント完全および不完全)、鉱物塩(例えば、
AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、シリカ、カオリン、および炭素)、ポリ
ヌクレオチド(例えば、ポリIC酸およびポリAU酸)、ならびに特定の天然物質(
例えば、Mycobacterium tuberculosisからのワックスD、ならびにCorynebacter
ium parvumまたはBordetella pertussis、およびBrucella属のメンバーに見出さ
れる物質)を含む。アジュバントとして有用な他の物質は、例えば、Quil A(Su
perfos A/S,Denmark)のようなサポニンである。本発明における使用のために
好ましいアジュバントは、アルミニウム塩(例えば、AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、
およびAlNH4(SO4))を含む。ワクチン組成物における使用に適切な物質の例は、
REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,1324-1341(A.Osol編,Mack Publising
Co, Easton,PA,(1980)(本明細書中に参考として援用される)に提供される
。
本発明の治療組成物は、注射、迅速な注入、鼻咽頭吸収(鼻咽喉内)、皮膚吸
収(dermoabsorption)により非経口的に、または経口的に投与され得る。ある
いは、組成物は、筋肉内に、または静脈内に投与され得る。非経口投与のための
組成物は、滅菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水
性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油(例え
ば、オリーブ油)、および注射可能な有機エステル(例えば、オレイン酸エチル
)である。キャリアまたは閉鎖包帯は、皮膚透過性を増加させるため、および抗
原吸収を増強するために用いられ得る。経口投与のための液体投薬形態は、一般
に、液体投薬形態を含むリポソーム溶液を含み得る。リポソームを懸濁するため
に適した形態は、当該分野で通常用いられる不活性な希釈剤(例えば、精製水)
を含有する、乳濁液、懸濁液、溶液、シロップ、およびエリキシルを含む。不活
性希釈剤の他にも、このような組成物はまた、アジュバント、湿潤剤、乳化剤、
および懸濁剤、または甘味料、矯味矯臭剤、もしくは芳香剤を含み得る。
本発明の治療組成物はまた、被包形態で投与され得る。例えば、鼻腔内免疫は
、ポリ(DL-ラクチド-コ-グリコシド)から構成された生分解性マイクロスフェ
アに被包したワクチンを用いる。Shahin,R.ら(1995)Infect.Immun.63:1195-
12
00を参照のこと。同様に、経口投与される被包されたSalmonella typhimurium抗
原もまた用いられ得る。Allaoui-Attarki,K.ら(1997)Infect.Immun.65:853-85
7。本発明の被包されたワクチンは、ワクチンと粘膜との接触を含む経路(例え
ば、鼻腔内、コロニー内(intracolonicly)、十二指腸内)を含む種々の経路に
より投与され得る。
多回投与レジメが利用される場合は免疫の時期について多くの異なる技術が存
在する。1より多くの本発明の組成物を使用して、免疫された動物により発現さ
れる免疫グロブリンレパートリーの発現のレベルおよび多様性を増加させること
が可能である。代表的には、多回免疫が与えられる場合、これらは1〜2ヶ月の
間隔をおいて与えられる。
本発明によれば、治療組成物の「有効量」は、所望の生物学的効果を達成する
ために十分である量である。一般に、有効量の組成物を提供するために必要とさ
れる投薬量は、動物もしくはヒトの年齢、状態、性別、およびある場合は疾患の
程度、ならびに当業者により調整され得る他の変数のような因子に依存して変化
する。
本発明の抗原性調製物は、有効量の単回または他回のいずれかの投薬により投
与され得る。本発明の組成物の有効量は、1用量あたり0.01〜1,000μg/ml、よ
り好ましくは1用量あたり0.1〜500μg/ml、そして最も好ましくは10〜300μg/m
lで変化し得る。
6.メガ塩基のDNA配列決定のためのショットガンアプローチ
本発明はさらに、大きなゲノムがランダムなショットガンアプローチを用いて
配列決定され得ることを示す。以下の実施例に詳細に記載されているこの手順は
、配列決定プロトコルの開始の前に、重複サブクローンまたは隣接するサブクロ
ーンを単離および順序付けする前払いのコストを削減した。
本発明の特定の局面は、以下の実施例でより詳細に記載されている。これらの
実施例は、例示のために提供される。本願の開示を読めば当業者に明らかである
ように、本発明の他の局面および実施態様が、本発明者らにより意図される。例示的実施例
ライブラリーおよび配列決定
1.ショットガン配列決定確率の分析
ゲノムの全体の配列決定へのショットガンアプローチのためのストラテジーの
全容は、LanderおよびWaterman(LandermanおよびWaterman,Genomics 2:231(198
8))のポアソン分布に関する方程式の応用に基づく。この処理によれば、ヌクレ
オチド中のサイズLの配列中の任意の所定の塩基が、ヌクレオチド中の決定され
たランダムな配列の特定の量nの後に配列決定されない確率P0は、方程式P0=e-m
、ここで、mはL/n(倍数の範囲)により計算され得る。例えば、2.8Mbのゲノム
については、2.8Mbの配列がランダムに生成されている場合、m=1である(1×
範囲)。この時点では、P0=e-1=0.37である。任意の所定の塩基が配列決定され
ていない確率は、配列全体Lの任意の領域が決定されていない確率と同じであり
、そしてそれゆえ、この確率はいまだ決定されていない配列全体の割合に等しい
。従って、1倍の範囲では、ヌクレオチド中のサイズLの約37%のポリヌクレオ
チドが配列決定されていない。14Mbの配列が生成される場合、範囲は2.8Mbにつ
いて5×であり、そして配列未決定の割合は0.0067または0.67%まで下がる。2.
8Mb配列の5×範囲は、410bpの平均配列読み取り長さを有する挿入物末端の両方
由来の約17,000のランダムなクローンを配列決定することにより達成され得る。
同様に、全ギャップ長さGが方程式G=Le-mにより決定され、そして平均ギャ
ップサイズgが方程式g=L/nに従う。従って、5×範囲は、長さ2.8Mbのポリ
ヌクレオチドの配列中で平均して約82bpサイズの240ギャップを残す。
上記処理は、本質的にLanderおよびWaterman,Genomics 2:231(1988)の処理で
ある。
2.ランダムライブラリーの構築
実際の配列決定の間に上記のランダムモデルに近似するために、クローン化さ
れたゲノムフラグメントのほぼ理想に近いライブラリーが必要とされる。以下の
ライブラリー構築手順は、この目的を達成するために開発された。
Enterococcus faecalis DNAをフェノール抽出により調製する。1.0mlの300mM
の酢酸ナトリウム、10mM Tris-HCl、1mM Na-EDTA、50%グリセロール中に200μg
のDNAを含有する混合物を、2分間35Kpaに調整した窒素流を伴う噴霧器(IPI Me
dical Products)を通して処理する。超音波処理されたDNAをエタノール沈澱さ
せ、そして500μlのTE緩衝液に再溶解する。
平滑末端を作り出すために、100μlアリコートの再懸濁されたDNAを、5単位
のBAL31ヌクレアーゼ(New England BioLabs)で200μlのBAL31緩衝液中において
、30℃で10分間消化する。消化されたDNAをフェノール抽出し、エタノール沈澱
させ、100μlのTE緩衝液に再溶解し、次に、1.0%の低融解温度アガロースゲル
による電気泳動によりサイズ分画する。サイズが1.6〜2.0kbのDNAフラグメント
を含有する切片をゲルから切り出し、LGTアガロースを融解させ、そして得られ
た溶液をフェノール抽出して、アガロースをDNAから分離する。DNAをエタノール
沈澱させ、そしてベクターへの連結のために20μlのTE緩衝液に再溶解する。
2段階連結手順を、97%の挿入物(そのうち、99%を超えるものは単一の挿入
物であった)を有するプラスミドライブラリーを産生するために使用する。第1
の連結混合物(50μl)は、2μgのDNAフラグメント、SmaIで切断しかつ細菌アル
カリホスホターゼで脱リン酸化した2μgのpUC18 DNA(Pharmacia)、および10単
位のT4リガーゼ(GIBCO/BRL)を含有し、そして14℃で4時間インキュベートする
。次いで、連結混合物をフェノール抽出し、エタノール沈澱させ、そして沈澱し
たDNAを20μlのTE緩衝液に溶解し、1.0%の低融点アガロースゲル上で電気泳動
する。ラダー状の不連続のバンドを、臭化エチジウム染色およびUV照射により可
視化し、そして挿入物(I)、ベクター(v)、v+I、v+2i、v+3iなどとしてサイズ
により同定した。v+I DNAを含有するゲルの部分を切り出し、そしてv+I DNAを
回収し、20μlのTEに再懸濁する。次いで、このv+I DNAを、v+I直鎖状物、4
種のdNTPそれぞれ500μM、および9単位のT4ポリメラーゼ(New England BioLabs
)を含有する反応混合物(50μl)において37℃で5分間、推薦された緩衝液条件下
のT4ポリメラーゼ処理により、平滑末端化する。フェノール抽出およびエタノー
ル沈澱の後、修復されたv+I直鎖状物を20μlのTEに溶解した。環状物を生成す
るための最終の連結を、5μlのv+I直鎖状物および5単位のT4リガーゼを含有
する50μlの反応物において、14℃で一晩行う。翌日、70℃で10分の後、反応混
合物を−20℃で保存する。
この2段階手順により、二重挿入物キメラ(<1%)または遊離ベクター(<3
%)による汚染が最小限の単一挿入物プラスミド組換え体の分子的にランダムな
収集物を得る。
ランダムさからの偏差は、宿主中のDNA増殖から生じ得るため、全ての組換え
機能および制限機能が欠損したE.coli宿主細胞(A.Greener,Strategies 3(1):
5(1990))を、再配列、欠失および制限によるクローンの損失を防ぐために使用す
る。さらに、形質転換された細胞を抗生物質拡散プレート上に直接プレートして
、最も迅速に増殖する細胞の倍増および選択を可能にする通常のブロス回復相を
避ける。
プレーティングを以下のように行う。100μlのアリコートのEpicurian Coli S
URE II Supercompetent Cells(Stratagene 200152)を氷上で解凍し、そして氷上
で冷却したファルコン2059チューブに移す。1.7μlアリコートの1.42M β-メル
カプトエタノールを最終濃度25mMまでこのアリコートの細胞に加える。細胞を氷
上で10分間インキュベートする。1μlアリコートの最終連結物をこの細胞に加
え、そして氷上で30分間インキュベートする。細胞に42℃で30秒間の加熱パルス
を与え、そして氷上に戻して2分間放置する。液体培地中の増殖(outgrowth)期
間を、任意の所定の形質転換された細胞の優先的増殖を最小限にするためにこの
プロトコルから除去する。代わりに、形質転換混合物を、5mlのSOB寒天の底部
層(5%のSOB寒天:培地1リットルあたり、20gのトリプトン、5gの酵母抽出
物、0.5gのNaCl、1.5%のDifco Agar)を含有する栄養分に富むSOBプレートに直
接プレートする。5mlの底部層に、SOB寒天100mlあたり、0.4mlの50mg/mlアンピ
シリンを補充する。15mlのSOB寒天の上層に、1mlのX-Gal(2%)、1mlのMgCl2(1M
)、および1mlのMgSO4/100mlのSOB寒天を補充する。15mlの上層をプレーティング
の直前に注ぐ。本発明者らの力価は、約100コロニー/形質転換物の10μlアリコ
ートである。
サイズをいとわずに、全てのコロニーをテンプレート調製のために拾う。従っ
て、「有毒」DNAまたは有害遺伝子生成物に起因して失われたクローンだけがこ
のライブラリーから欠失し、それにより、予想された数を超えるギャップ数の僅
かな増加を生じる。
3.ランダムなDNA配列決定
高品質の二本鎖DNAプラスミドテンプレートを、Advanced Genetic Technology
Corp.(Gaithersburg、MD)との協力で開発した「沸騰ビーズ」方法(Adamsら
、Science 252:1651(1991);Adamsら、Nature 355:632(1992))を用いて
調製する。プラスミド調製を、96ウェルフォーマットで、細菌増殖から最終のDN
A精製までのDNA調製の全段階について行う。テンプレート濃度を、Hoechst Dye
およびMillipore Cytofluorを用いて決定する。DNA濃度は調整しないが、低収率
のテンプレートは、可能な場合に同定し、そして配列決定しない。
テンプレートもまた、ベクターDASH II(Stratagene)中のEnterococcus faecal
is λゲノムライブラリーから調製する。詳細には、Enterococcus faecalis DNA
(>100kb)を、50μgのDNA、1× Sau3AI緩衝液、20単位のSau3AIを含有する反応
混合物(200μl)で23℃で6分間部分的に消化する。消化されたDNAをフェノール
抽出し、そしてスクロース密度勾配遠心分離により分画した。15〜25kbを含有す
るスクロース勾配の画分を、最終容量6μl中に回収する。1μlのフラグメント
を1μlのλDASHIIベクター(Stratagene)とともに推薦された連結反応で使用す
る。1パッケージング反応あたり1μlの連結混合物を、Gigapack II XL Packag
ing Extract(Stratagene #227711)とともに推薦されたプロトコルに従って使
用する。ファージを、(500μlの推薦されたSM緩衝液で希釈し、そしてクロロホ
ルムで処理した後に)このパッケージング混合物から、増幅なしで直接プレート
する。収率は約2.5×103pfu/μlである。増幅されたライブラリーを、再構築NM5
39宿主E.coli細胞に約1×104ファージ粒子を感染させ、そして子孫ファージ粒
子を回収することにより調製する。回収されたファージを、7%ジメチルスルホ
キシド中で凍結保存する。ファージ力価は約1×109pfu/mlである。
個々のλファージクローンの高処理能力配列決定については、液体溶解物(100
μl)を、(未増幅ライブラリーから)ランダムに選択されたプラークから調製し
、そしてT7ベクターおよびT3ベクターに特異的なプライマーを用いてテンプレー
トを長範囲PCRにより調製する。
配列決定反応を、M13正方向(M13-21)プライマーおよびM13逆方向(M13RP1)プラ
イマーについて(Adamsら、Nature 368:474(1994)Applied Biosystems PRISM R
eady Reaction Dye Primer Cycle Sequencing KitsとともにAB Catalyst LabSta
tionを用いて、プラスミドおよび/またはPCRテンプレートについて実施する。
ダイターミネーター配列決定反応を、Applied Biosystems Ready Reaction Dye
Terminator Cycle Sequencingキットを使用してPerkin-Elmer 9600 Thermocycle
rでのλテンプレートについて実施する。T7プライマーおよびT3プライマーを使
用してλDASH IIライブラリーからの挿入物の末端を配列決定する。配列決定反
応を、8個体により平均で1日あたり14回のAB 373 DNA Sequencerを使用して実
施する。全ての配列決定反応を、AB 373のStretch改変を用いて、主に、34cmの
十分読み取れる距離を用いて、分析する。全体の配列決定成功率はほぼ同じであ
り、M13-21配列およびM13RP1配列について約85%であり、そしてダイターミネー
ター反応について65%である。平均の使用可能な読み取り長さは、M13-21配列に
ついて485bpであり、M13RP1配列について445bpであり、そしてダイターミネータ
ー反応について375bpである。
Richardsら、AUTOMATED DNA SEQUENCING AND ANALYSIS、M.D.Adams、C.Fields
、J.C.Venter編、Academic Press、London、(1994)の第28章は、λクローンお
よびコスミドクローンのショットガンアセンブリ計画におけるコンティグの順序
づけを容易にする配列決定テンプレートの両端由来の配列を使用する価値を記載
する。本発明者らは、M13-21(正方向)プライマーと比較してM13RP1(逆方向)
プライマーで実施した配列決定反応のためのより短い読み取り長に対して、両端
配列決定の望ましさ(テンプレートの総数を減らすことによるコストの低減を含
む)を考慮する。テンプレートの約半数を、両端から配列決定する。ランダム逆
方向配列決定反応を、首尾良い正方向配列決定反応に基づいて行う。いくつかの
M13RP1配列は、準方向化された様式で得られる。M13-21:コンティグの末端で外
側に向かう配列が特異的にコンティグを順序づける努力におけるM13RP1配列決定
のために選択する。
4.自動化サイクル配列決定のプロトコル
配列決定を、ABI Catalyst ロボットおよびAB373自動化DNAシークエンサーを
用いて実施した。このCatalystロボットは、公に入手可能な洗練されたピペッテ
ィングおよび温度制御ロボットであり、これは、DNA配列決定反応のために特に
開発されている。Catalystは、予め少量に分けたテンプレート、およびデオキシ
-ならびにジデオキシヌクレオチド、熱安定性TaqDNAポリメラーゼ、蛍光標識さ
れた配列決定プライマー、および反応緩衝液からなる反応混合物を組み合わせる
。反応混合物およびテンプレートをアルミニウムの96ウェルの熱サイクリングプ
レートのウェル中に合わせる。30の連続するサイクルの線形増幅(即ち、1つの
プライマー合成)工程を、変性、プライマーとテンプレートのアニーリング、お
よび伸長即ちDNA合成を含めて実施する。熱サイクリングプレート上のゴムガス
ケットを有する加熱されたふたは、油重層の必要性なしに蒸発を防ぐ。
2つの配列決定プロトコルを用いる:1つは色素標識プライマーであり、第2
番目は色素標識ジデオキシ鎖ターミネーターである。ショットガン配列決定は、
4つのターミネーターヌクレオチドの各々に対するプライマーである4つの色素
標識配列決定プライマーの使用を含む。ダイプライマーの各々は、異なる蛍光色
素で標識し、4つの個々の反応を、電気泳動、検出、および塩基呼び出しのため
に373 DNA Sequencer中の1つのレーンに組み合わせることを可能にした。ABIは
、現在、配列決定に必要なすべてのテンプレート以外の試薬を含むバルクパッケ
ージ中の予め混合された反応混合物を供給している。プラスミドテンプレートは
一般により長い使用可能な配列を与えるが、配列決定は、プラスミドおよびPCR
生成テンプレートの両方をほぼ等しい厳密さを有するダイプライマーおよびダイ
ターミネーターの両方とともに用いてなされ得る。
全960の試料について1日あたりAB 373 Sequencerあたり32の反応を行う。電
気泳動を、製造者のプロトコルに従って、一晩行い、そしてデータを12時間にわ
たって収集する。電気泳動および蛍光検出の後、ABI 373は、自動的にレーン追
跡および塩基呼び出しを実施する。レーン追跡は肉眼で確認する。各配列の電気
泳動図(または蛍光レーントレース)を肉眼で検査しそして品質を評価する。低品
質の引かれてつらなる配列は除き、そして配列自身は、ソフトウェアを介してSy
baseデータベースにロードした(毎日8mmテープに記録した)。先導ベクターポリ
リンカー配列は、ソフトウェアプログラムにより自動的に除かれる。標準のABI
373からの配列の平均編集長は、約400bpであり、そして配列決定反応に用いられ
たテンプレートの品質に大部分依存する。Stretch Linersに転用されたABI 373
Sequencerは、蛍光検出の前により長い電気泳動路を提供し、そして平均の使用
可能な塩基数を500〜600bpまで増加させる。
情報科学
1.データ管理
大規模配列決定ラボ用の多くの情報管理システムが開発されている(概説につ
いて、例えば、Kerlavageら、Proceedings of the Twenty-Sixth Annual Hawaii
International Conference on System Sciences,IEEE Computer Society Pres
s,Washington D.C.,585(1993)を参照のこと)。配列データを収集およびアセンブ
ルするために用いたシステムは、Sybaseリレーショナルデータベース管理システ
ムを用いて開発され、そしてデータフローを可能な限りに自動化しそしてユーザ
ーエラー(user error)を低減するように設計された。このデータベースは、テン
プレート調製からゲノムの最終分析までの全操作の間に収集されたすべての情報
を記億し、そして相関付けた。ABI 373 Sequencerの生の出力は、Macintoshプラ
ットホームに基づき、そして選択されたデータ管理システムは、Unixプラットホ
ームに基づくので、生データおよび分析結果を、最少のユーザー努力で、継ぎ目
なくデータベース中に流させる、種々の複数ユーザーの、クライアントサーバー
アプリケーションを設計および実行する必要があった。
2.アセンブリ
数千の配列フラグメントの迅速および正確なアセンブリのために開発されたア
センブリエンジン(TIGR Assembler)を用いてコンティグを生成する。TIGRアセン
ブラーは、ゲノムのフラグメントを同時にクラスター化およびアセンブルする。
104以上のフラグメントをアセンブルするために必要な速度を得るために、アル
ゴリズムは、10bpオリゴヌクレオチドサブ配列の寄せ集めの表(hash table)を作
り、可能な配列フラグメント重複のリストを作成する。フラグメントの各々に対
する可能な重複の数は、どのフラグメントが反復要素になりそうであるかを決定
する。単一のシード配列フラグメントから始めて、TIGRアセンブラーは、現在の
コンティグを、オリゴヌクレオチドの内容に基づき最もマッチするフラグメント
を付加する試みにより拡張する。このコンティグおよび候補フラグメントを、最
適間隙の整列を提供するSmith-Watermanアルゴリズムの改変版(Waterman,M.S.,
Methods in Enzymology 164:765(1988))を用いて並べる。コンティグは、マッ
チする品質について厳格な規準が満たされる場合にのみフラグメントにより拡張
される。マッチする規準は、重複の最小長さ、マッチしない末端の最大長さ、お
よびマッチする最小百分率を含む。これらの規準は、最小区域の領域におけるア
ルゴリズムにより自動的に低下し、そして可能な反復要素の領域で高められる。
各フラグメントに対する可能な重複の数は、どのフラグメントが反復要素になり
そうであるかを決定する。反復要素の境界を示すフラグメントおよび可能なキメ
ラフラグメントは、しばしば、整列の末端で部分的なミスマッチに基づいてはね
のけられ、そして現在のコンティグから排除される。TIGRアセンブラーは、各テ
ンプレートの両末端からの配列決定と組になったクローンサイズ情報を利用する
よう設計されている。それは、同じテンプレートの2つの末端からの配列フラグ
メントが、上記コンティグにおいて、互いに向かって照準し、そして塩基対の特
定の範囲内に位置される(与えられたライブラリーについて既知のクローンサイ
ズ範囲を基に各クローンについて規定され得る)するという束縛を増強する。
このプロセスは、配列番号1〜922によって表される982個のコンティグを生じ
た。
3.遺伝子の同定
Enteraoccus faecalis ゲノムの推定コード領域を、最初、確率分類技術を使
用してORFを見出すブログラムGeneMarkを用いて規定した。推定されるコード領
域配列は、少なくとも95%の同一性で50以上のヌクレオチドの重複を同定するBL
ASTN検索方法を用いて、GenBank(1997年10月)からのすべてのEuteraococcus fae
lis ヌクレオチド配列のデータベースに対する検索に用いた。これらのORFを、
マッチするヌクレオチド配列とともに表1に示す。このようなマッチのないORF
は、タンパク質配列に翻訳され、そしてSwiss-prot、PIRおよびGenPeptデータベ
ースを組み合わせることにより生成された既知のタンパク質の過多でないデータ
ベースと比較した。0.01以下のBLASTP確率でデータベースタンパク質とマッチし
たORFを表2に示す。この表はまた、データベースにおいて最も緊密にマッチす
ることに基づいて割り当てた機能を列挙する。これらのレベルでデータベース中
のタンパク質またはヌクレオチド配列とマッチしないORFを表3に示す。
例示的応用例
1.Euterococcus faecalis タンパク質に対する抗体の産生
実質的に純粋なタンパク質あるいはポリペプチドを、当該分野で公知の任意の
方法を用いて、トランスフェクトあるいは形質転換された細胞から単離する。タ
ンパク質もまた、E.coliのような組換え原核発現系で産生し得るか、あるいは
、化学合成し得る。最終調製物中のタンパク質濃度を、例えば、Amicon濾過装置
での濃縮によって、1mlあたり数マイクログラムのレベルに調整する。次に、タ
ンパク質に対するモノクローナルあるいはポリクローナルの抗体を、以下のよう
に調製し得る。
2.ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の産生
記載のように同定および単離された任意ペプチドのエピトープに対するモノク
ローナル抗体を、Kohler,G.およびMilstein,C.,Nature 256:495(1975)の古典
的な方法あるいはその変法に従って、マウスハイブリドーマから調製され得る。
簡単に述べれば、マウスに、数週間にわたって、数マイクログラムの選択タンパ
ク質を繰り返し接種する。次に、そのマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単
離する。脾細胞は、ポリエチレングリコール法によってマウスミエローマ細胞と
融合され、そして過剰の非融合細胞は、アミノプテリン含有の選択培地(HAT培
地)で、その系を増殖して破壊する。うまく融合された細胞を希釈し、そして希
釈物のアリコートを、マイクロタイタープレートウェルに播種して培養増殖を継
続する。抗体産生クローンを、基本的にEngvall,E.,Meth.Enzymol.70:419(1
980)に記載のELISA、およびその変法のようなイムノアッセイ法によって、ウェ
ルの上清中の抗体を検出して同定する。選択されたポジティブクローンを増殖し
て、それらのモノクローナル抗体産物を、使用のために回収し得る。モノクロー
ナル抗体産生の詳細な手順は、Davis,L.ら、Basic Methods in Molecular Biol
ogy Elsevier,New York.21-2章(1989)に記載されている。
3.免疫によるポリクローナル抗体の産生
単一のタンパク質の異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗
血清は、上記の発現タンパク質で適切な動物を免疫することによって調製し得、
改変されないか、あるいは免疫原性を増大するように改変され得る。有効なポリ
クローナル抗体産生は、抗原および宿主の種の両方に関連する多くの因子に影響
される。例えば、低分子はその他のものより免疫原性に劣る傾向があり、キャリ
アおよびアジュバントの使用を必要とし得る。また、宿主動物は、低力価抗血清
をもたらす不十分なあるいは過剰の抗原投与量によって、接種部位および投与量
に対する応答が異なる。複数皮内部位へ投与された少投与量(ngレベル)の抗原が
、最も確実であるようである。ウサギに対する有効な免疫プロトコルは、Vaituk
aitis,J.ら、J.Clin.Endocrinol.Metab.33:988-991(1971)に見出され得る
。
追加免疫注射が定期的な間隔で与えられ得、例えば、既知濃度の抗原に対する
寒天での二重免疫拡散法によって、半定量的に測定される場合に、それらの抗体
力価が降下し始めるときに、抗血清が回収され得る。例えば、Handbook of Expe
rimental Immunology、Wier,D.編 Blackwell(1973)のOuchterlony,O.ら、19章
を参照のこと。抗体のプラトー濃度は、通常0.1から0.2mg/ml血清(約12M)の範
囲である。抗血清の抗原に対する親和性は、例えば、Manual of Clinical Immun
ology、第二版、RoseおよびFriedman編、Amer.Soc.For Microbiology,Washin
gton,D.C.(1980)中のFisher,D.第42章に記載されているように、競合結合曲線
を作製して決定される。
いずれかのプロトコルに従って調製された抗体調製物は、生物学的試料中の抗
原を有する物質の濃度を測定する、定量的イムノアッセイに有用であり;これは
また、生物学的試料中の抗原の存在を同定するために、半定量的あるいは定性的
に使用される。さらに、抗体は、肺炎球菌疾患の種々の動物モデルにおいて、潜
在的なワクチン標的としての抗体を作製するために用いるタンパク質を評価する
手段、あるいは潜在的な免疫療法試薬または免疫予防試薬として抗体を評価する
手段として、有用である。
4.PCRプライマーの調製およびDNA増幅
表1〜3、および配列番号1〜982に記載のようなEnteraoccus faecalis ゲノ
ムの種々のフラグメントが、本発明に従って、様々な使用のためのPCRプライマ
ーを調製するために使用され得る。PCRプライマーは、その長さは好ましくは少
なくとも15塩基であり、より好ましくは少なくとも18塩基である。プライマー配
列を選択するとき、プライマー対は、ほぼ同じG/C比を有し、従って融解温度は
ほぼ同じであることが好ましい。この実施例のPCRプライマーおよび増幅DNAは、
以下の実施例で使用が見出される。
5.E.faecalisの寄託試料から選択されたDNAクローンの単離
3つのアプローチを、任意のE.faecalisゲノムDNAライブラリー由来の本発明の
ポリヌクレオチドを含むE.faecalisクローンの単離に使用し得る。当該分野で公
知である広範なE.faecalis株が使用され得るが、E.faecalis株V586が、E.faecal
is株を入手するための簡便な供給源として寄託された。
E.faecalisゲノムDNAは、以下の方法を使用して調製される。20mlの、富化培
地(例えば、Trypticase Soy Broth、Brain Heart Infusion brothまたはSuper b
roth)で増殖させた終夜細菌培養物をペレット化し、TES(30mM Tris-pH8.0、25mM
EDTA、50mM NaCl)で2回洗浄し、そして5mlの高塩TES(2.5M NaCl)で再懸濁した
。リソスタフィンを約50μg/mlの最終濃度まで添加し、そして混合物を1時間、3
7℃でゆっくり回転させてプロトプラスト細胞を作成する。次いで、溶液をイン
キュベーター(または振盪水浴)に置き、そして55℃まで加熱する。次いで、TE
S中の500μlの20% サルコシル(最終濃度2%)を添加して細胞を溶解する。次
に、グアニジン HClを7Mの最終濃度(5.5ml中に3.69g)まで添加する。混合物を
、55℃で、60〜90分間穏かに旋回(swirl)させる。次いで、CsCl勾配を、2.0ml
の5.7M CsClを使用してSW41 ultra clearチューブ中でセットアップし、そして2
.8
5M CsClで重層する。勾配に注意深くDNA含有GuHCl溶液をする。勾配を30,000rpm
、20℃で、24時間回転させ、低部のDNAバンドを回収する。容量をTE緩衝液で5ml
まで増やす。次いで、DNAをプロテアーゼK(10ug/ml)で一晩、37℃で処理し、
そしてエタノール沈殿する。沈殿したDNAを、所望の緩衝液で再懸濁する。
第1の方法では、プラスミドを、本発明のポリヌクレオチドに対応するポリヌ
クレオチドプローブを使用して、プラスミドE.faecalisゲノムDNAライブラリー
をスクリーニングすることにより直接単離する。詳細には、30〜40ヌクレオチド
の特定のポリヌクレオチドを、報告された配列に基づいて、Applied Biosystems
DNA synthesizerを使用して合成する。例えば、オリゴヌクレオチドを、T4ポリ
ヌクレオチドキナーゼを使用して32P-γ-ATPで標識化し、そして日常的な方法に
従って精製する(例えば、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al、Cold Spring Harbor Press,Cold Spring、NY(1982)を参照のこと)。ライブ
ラリーを、当業者に公知の技術を使用して、上記で示されるような適切な宿主(
例えば、XL-1 Blue(Stratagene))中に形質転換する。例えば、Sambrookら、MOLE
CULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor N.Y.第2版、(1989)
;Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley and Sons,
N.Y.1989)を参照のこと。形質転換体を、1.5%の寒天培地(適切な選択薬剤(例
えば、アンピシリン)を含有する)上に、プレートあたり約150個の形質転換体
(コロニー)の密度でプレートする。これらのプレートを、細菌コロニースクリ
ーニングについての日常的方法に従って、ナイロンメンブレンを使用してスクリ
ーニングする。例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL
(Cold Spring Harbor N.Y.第2版、(1989)) ;Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS
IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley and Sons,N.Y.1989)、または当業者に公知
である他の技術を参照のこと。
あるいは、配列番号1〜982のポリヌクレオチドの5’末端および3’末端に由来
する15〜25ヌクレオチドの2つのプライマーを合成し、そしてテンプレートとし
てE.faecalisゲノムDNA調製物を使用するPCRにより所望のDNAを増幅するために
使用する。PCRを、例えば、0.5ugの上記のDNAテンプレートを含む25μlの反応混
合物において日常的な反応条件下で実施する。簡便な反応混合物は、1.5〜5mM M
gCl2、0.01%(w/v)ゼラチン、20μMの各dATP、dCTP、dGTP、dTTP、25pmolの各プ
ライマー、および0.25ユニットのTaqポリメラーゼである。35サイクルのPCR(94
℃、1分の変性;55℃、1分のアニーリング;72℃、1分の伸長反応)を、Perkin
Elmer Cetus automated thermal cyclerで実施する。増幅生成物をアガロースゲ
ル電気泳動により分析し、そして予想した分子量のDNAバンドを切り出し、そし
て精製する。PCR生成物を、DNA生成物のサブクローニングおよび塩基配列決定に
より選択された配列であることを確認する。
最終的に、配列番号1〜982のDNA配列の重複オリゴを化学的に合成し得、そし
てこれを利用して当該分野で公知のPCR方法を使用して所望の長さのヌクレオチ
ド配列を生成し得る。
6(a).E.coliにおける腸球菌ポリペプチドの発現および精製
細菌性発現ベクターpQE60を、本発明のいくつかのポリペプチドフラグメント
の細菌性発現について使用し、これを以下で議論される軟組織および全身性感染
モデルにおいて使用した。(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,
91311)。pQE60は、アンピシリン抗生物質耐性(「Ampr」)をコードし、そして
レプリコンの細菌性複製開始点(「ori」)、IPTG誘導性プロモーター、リボソ
ーム結合部位(「RBS」)。ニッケル-ニトロ-トリ-酢酸(「Ni-NTA」)親和性樹
脂(QIAGEN、Inc.,前出)を使用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジ
ン残基をコードする6個のコドンおよび適切な単一の制限酵素切断部位を含む。
これらのエレメントを、ポリペプチドをコードする挿入されたDNA分子が、をこ
のポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合した6個のHis残基(すなわち、「
6×Hisタグ」)を有するポリペプチドを発現するようにアレンジする。
本発明の、E.faecalisタンパク質の所望の部分をコードするDNA配列を、表1で
示されるE.faecalisポリヌクレオチドの部分をコードする5’および3’配列をア
ニールするPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用してE.faecalisゲノムDNAか
ら増幅した。pQE60ベクターでのクローニングを容易にするための制限部位を含
むさらなるヌクレオチドを、5’および3’の配列にそれぞれ添加する。
成熟タンパク質のクローニングのために、5’プライマーは、適切な制限部位
、
次いで表1の所望のE.faecalisポリヌクレオチド配列のアミノ末端コード配列の
ヌクレオチドを含む配列を有する。当業者は、5’および3’プライマーが開始す
るタンパク質コード配列における点が、成熟形態よりも短いか、または長い完全
タンパク質の任意の所望の部位をコードするDNAセグメントを増幅するように、
変動され得ることを認識する。3’プライマーは、適切な制限部位、続いて配列
番号1〜982のポリペプチドコード配列の3’末端に相補的なヌクレオチドを含む
配列を有し、pQE60ベクターの6個のHisコドンのリーディングフレームを維持す
るように、制限部位と整列化されたコード配列を有する停止コドンを排除する。
増幅したE.faecalis DNAフラグメントおよびベクターpQE60を、プライマーの
部位を認識する制限酵素で消化し、次いで消化したDNAを共に連結した。E.faeca
lis DNAを、制限化pQE60ベクターに、IPTG誘導性プロモーターの下流にE.faecal
isタンパク質コード領域を配置し、そして開始AUGおよび6個のヒスチジンコドン
とインフレームの様式で挿入した。
連結混合物を、標準的手順(例えば、Sambrookら(前出)に記載されるような
手順を使用してコンピテントなE.coli細胞に形質転換し、プラスミドpREP4の多
重コピーを含むE.coli株M15/rep4(これは、lacリプレッサーを発現し、そして
カナマイシン耐性(「Kanr」)を与える)を、本明細書中に記載された例示的な
実施例の実施において使用した。この株は、E.faecalisポリペプチドを発現する
のに適切である多数の中の1つにすぎず、商業的に入手可能である(QIAGEN、Inc
.,前出)。形質転換体をアンピシリンおよびカナマイシンの存在下のLB寒天プレ
ート上で増殖するこれらの能力により同定した。プラスミドDNAを、耐性コロニ
ーから単離し、そしてクローニングしたDNAの同一性を制限分析、PCR、およびDN
A配列決定により確認した。
所望の構築物を含むクローンは、アンピシリン(100μg/ml)およびカナマイ
シン(25μg/ml)の両方を補充したLB倍地の液体培養において一晩(「O/N」)
増殖した。O/N培養物を、大型培養物と播種するために、およそ1:25〜1:250の
希釈で使用した。細胞を、600nmでの光学密度(「OD600」)の0.4〜0.6の間まで
増殖した。次いで、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(「IPTG」)を
、最終濃度の1mMまで添加し、lacIリプレッサーの不活化によりlacリプレッサー
感
受性プロモーターからの転写を誘導した。細胞を、引き続いてさらに3〜4時間イ
ンキュベートした。次いで、細胞を遠心分離により回収した。
次いで、細胞を3〜4時間、4℃で6Mグアニジン-HCl、pH8で攪拌した。細胞片を
遠心分離によって除去し、そしてE.faecalisポリペプチドを含む上清をニッケル
-ニトリロ-トリ-酢酸(「Ni-NTA」)親和性樹脂カラム(QIAGEN、Inc.,前出)に
ロードした。高親和性でNi-NTA樹脂に結合する6×Hisタグを有するタンパク質を
、単純な1工程手順で精製した(詳細については、The QIAexpressionist、1995
、QIAGEN、Inc.,前出を参照のこと)。簡潔には、上清を6M グアニジン-HCl、pH
8のカラムにロードし、カラムを10容量の6M グアニジン-HCl、pH8で最初に洗浄
し、次いで、10容量の6M グアニジン-HCl、pH6で洗浄し、そして最終的には、E.
faecalisポリペプチドを6M グアニジン-HCl、pH5で溶出した。
次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)または50mM
酢酸ナトリウム、pH6緩衝液および200mM NaClに対する透析により再生した。あ
るいは、タンパク質を、Ni-NTAカラム上に固定して首尾良く再折畳みし得た。推
奨される条件は以下の通りである:プロテアーゼインヒビターを含む500mM NaCl
、20% グリセロール、20mM Tris/HCl pH7.4での線形6M〜1M尿素勾配を用いる再
生。再生は、1.5時間かそれよりも長く実施されなければならない。再生後、タ
ンパク質を250mM イミダゾールの添加により溶出し得る。イミダゾールを、PBS
または50mM 酢酸ナトリウム、pH6緩衝液および200mM NaClに対する最後の透析工
程により除去した。精製したタンパク質を4℃で保存するか、または-80℃で凍結
した。
本発明の幾つかのポリペプチドを、非変性タンパク質精製方法を使用して調製
した。これらのポリペプチドについては、各リットルの培養物からの細胞ペレッ
トを4℃の25mlの溶解緩衝液A(溶解緩衝液A=50mM リン酸ナトリウム、300mM N
aCl、10mM 2-メルカプトエタノール、10% グリセロール、pH7.5(緩衝液50mlあ
たり1錠剤の完全なEDTAを含まないプロテアーゼインヒビターカクテル(Boehrin
ger Mannheim #1873580も含む))に再懸濁した。550nmでの吸光度は、およそ10
〜20 O.D./mlであった。次いで、懸濁物を、3回の-70℃(エタノール乾燥氷冷浴
を使用して)から室温までの凍結/解凍サイクルを経た状態にした。細胞を、氷
上に置いたまま、手短に10秒から3分、およそ80Wの破砕を介して溶解させた。
次いで、破砕した試料を15,000RPMで30分、4℃で遠心した。上清を、アガロース
に非特異的に結合し得る任意のタンパク質の試料の前浄化のために、1.0mlのCL-
4B樹脂を含むカラムに通し、そしてフロースルー画分を回収した。
前浄化フロースルーをニッケル-ニトリロ-トリ-酢酸(「Ni-NTA」)親和性樹
脂カラム(QIAGEN、Inc.,前出)に適用した。6×Hisタグを有するタンパク質は
、高親和性でNi-NTA樹脂に結合し、そして単純な1工程手順で精製し得る。簡潔
には、上清を、4℃の溶解緩衝液Aのカラムにロードし、最初にカラムを、溶出
のA280がベースラインに戻るまで、10容量の溶解緩衝液Aで洗浄した。次いで、
カラムを5容量のイミダゾール40mM イミダゾールで洗浄した(92% 溶解緩衝液
A/8% 緩衝液B)(緩衝液B=50mM リン酸ナトリウム、300mM NaCl,10% グリ
セロール、10mM 2-メルカプトエタノール、500mM イミダゾール、最終緩衝液のp
Hは、7.5であるべきである)。タンパク質を、溶解緩衝液A対溶解緩衝液Bの比
率を調整することにより作製した一連の漸増イミダゾール溶液でカラムから溶出
させた。3つの異なる濃度を使用した:3容量の75mMイミダゾール、3容量の150mM
イミダゾール、5容量の500mMイミダゾール。精製タンパク質を含む画分をタンパ
ク質サイズに依存して8%、10%、または14%のSDS-PAGEを使用して分析した。
次いで、精製タンパク質を、実行可能な緩衝液中に入れるために、2×リン酸緩
衝化生理食塩水(PBS)に対して透析した。精製したタンパク質を、4℃か、また
は-80℃で保存した。
以下の代替的な方法は、封入体の形態で存在する場合での、E,coliで発現され
るE.faecalisを精製するために使用され得る。他に特定されない限り、全ての以
下の工程は4〜10℃で行われる。
E.coli発酵の産生相を完了する際に、細胞培養物を4〜10℃に冷却し、15,000
rpmでの連続遠心分離(Heraeus Sepatech)により細胞を回収する。細胞ペースト
の単位重量あたりのタンパク質予測収量および必要とされる精製タンパク質の量
に基づいて、細胞ペーストの適切な量(重量)を、100mM Tris,50mM EDTA,pH 7.
4を含む緩衝溶液中に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサーを使用して、均質の懸
濁液にまで分散させる。
次いで、細胞を、ミクロフルイダイザー(microfluidizer)(Microfuidics,Corp
.
またはAPV Gaulin,Inc.)に、4000〜6000psiで溶液を2回通過させることによっ
て溶解させる。次いで、ホモジネートを、0.5MのNaClの最終濃度までNaCl溶液と
混合する。次いで、7000×gで15分間遠心分離する。得られたペレットを、0.5M
NaCl,100mM Tris、50mM EDTA、pH 7.4を使用して再び洗浄する。
得られる洗浄された封入体を、1.5Mグアニジンヒドロクロリド(GuHCl)を使用
して2〜4時間可溶化する。7000×gで15分間の遠心後、ペレットを廃棄し、E.
faecalisポリペプチド含有上清を、さらにGuHCl抽出させるために4℃で一晩イ
ンキュベートする。
高速遠心(30,000×g)して不溶性粒子を除去した後、GuHCl可溶化タンパク質
を、50mM ナトリウム、pH 4.5、150mM NaCl,2mM EDTAを含む20容量の緩衝液を激
しく攪拌してGuHCl抽出物と迅速に混合することによって、再折り畳みさせる。
再折り畳みされた希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前に12時間混合せ
ずに4℃に保持する。
再折り畳みしたE.faecalisポリペプチド溶液を明澄化するために、予備調製し
た、適切な表面積を有する0.16μmメンブレンフィルターを装備した接線濾過ユ
ニット(tangential filtration unit)(例えば、Filtron)を、40mM酢酸ナトリウ
ム、pH 6.0を使用して平衡化して使用する。濾過サンプルを、陽イオン交換樹脂
(例えば、Poros HS-50,Perseptive Biosystems)にロードする。このカラムを、4
0mM酢酸ナトリウム、pH 6.0で洗浄し、そして同じ緩衝液中の250mM、500mM、100
0mM、および1500mM NaClを使用して、段階様式にて溶出する。溶出物の280nmに
おける吸光度を連続的にモニターする。画分を回収して、SDS-PAGEによってさら
に分析する。
次いで、E.faecalisポリペプチドを含む画分をプールして、4容量の水と混合
する。希釈したサンプルを、強陰イオン(Poros HQ-50,Perseptive Biosystems)
および弱陰イオン(Poros CM-20,Perseptive Biosystems)交換樹脂の予備調製し
た直列カラムのセットにロードする。このカラムを40mM酢酸ナトリウム、pH 6.0
で平衡化する。両方のカラムを、40mM 酢酸ナトリウム、pH 6.0、200mM NaClで
洗浄する。次いで、CM-20カラムを、0.2M NaCl,50mM 酢酸ナトリウム、pH 6.0か
ら1.0M NaCl,50mM 酢酸ナトリウム、pH 6.5の範囲の10カラム容量の直線勾配を
使用して溶出する。溶出物をA280でモニタリングしながら画分を回収する。次い
で、(例えば、16%SDS-PSGEによって決定される)E.faecalisポリペプチドを含有
する画分をプールする。
得られたE.faecalisポリペプチドは、上記の再折り畳みおよび精製工程の後に
、95%を越える純度を示す。5μgの精製タンパク質をロードする場合、クーマシ
ーブルー染色した16%SDS-PAGEゲルからは、大きな夾雑物のバンドは認められな
い。精製タンパク質を、内毒素/LPS夾雑物についても試験し、そして代表的には
、LPS含量は、LALアッセイに従えば0.1ng/mlより少ない。
6(b).E.coliにおける腸球菌ポリペプチドの別の発現および精製
あるいは、ベクターpQE10を使用して、軟組織および下記で議論される全身感
染モデルにおける使用のために本発明のポリペプチドのいくつかをクローニング
および発現した。挿入されたDNAフラグメントがポリペプチドをコードするよう
である差異によって、このポリペプチドのアミノ末端に共有結合した6His残基(
すなわち、「6×Hisタグ」)を有するポリペプチドが発現された。細菌発現ベク
ターpQE10(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)を、本実施例
において使用した。pQE10プラスミドの成分は調節されて、その結果、本発明の
ポリペプチドをコードする挿入されたDNA配列が、アミノ末端に共有結合した6H
is残基(すなわち、「6×Hisタグ」)を有するポリペプチドを発現した。
配列番号1〜982のポリペプチドの所望の部分をコードするDNA配列は、E.faec
alisのゲノムDNAに由来するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し
た。このPCRプライマーは、本発明のポリペプチドの所望のアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列にアニールする。pQE10ベクターにおけるクローニング
を容易にするために制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ、5'プラ
イマー配列および3'プライマー配列に付加した。
本発明のポリペプチドをクローニングするために、5'および3'プライマーを選
択して、それぞれの配列をコードするヌクレオチドを増幅した。当業者は、5'お
よび3'プライマーが開始するタンパク質コード配列の点が、本発明のポリペプチ
ドの任意の所望の部分をコードするDNAセグメントを増幅するために変化し得る
ことを理解する。6×Hisタグのコード配列が、E.faecalisポリペプチドのリー
ディングフレームとともにそのリーディングフレームを維持するように制限部位
を用いて整列されるように、5'プライマーが設計された。3'は、停止コドンを含
むように設計された。次いで、pQE60プラスミドについて上記に記載されるよう
に、増幅されたDNAフラグメントをクローニングして、そしてタンパク質を発現
した。
配列番号1〜982のアミノ酸配列をコードするDNA配列はまた、上記に直接記載
されるプロトコルと類似したプロトコルによって融合タンパク質としてクローニ
ングされ、発現され得る。ここで、pET-32b(+)ベクター(Novagen,601 Science D
rive,Madison,WI 53711)が、pQE10の代わりに、優先的に使用される。
上記の方法は、実際に産生されるポリペプチドフラグメントに限定されない。
以下の方法と同様に、上記の方法が使用され、全長ポリペプチドまたはそれらの
所望のフラグメントのいずれかを産生し得る。
6(c).E.coliにおける腸球菌ポリペプチドの別の発現および精製
本実施例において細菌発現のために、細菌発現ベクターpQE60を使用する(QIAG
EN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)。しかし、本実施例において
、ポリペプチドコード配列は、6Hisコドンの翻訳が妨げられ、そのため6×His
タグを含まないポリペプチドが産生されるように挿入される。
E.faecalisアミノ酸配列の所望の部分をコードするDNA配列は、E.faecalisポ
リペプチドの所望の部分に対応する5および3'ヌクレオチド配列にアニールするP
CRオリゴヌクレオチドプライマーを使用する寄託されたDNAクローンを調製するE
.faecalisゲノムDNAから増幅される。pQE60ベクターにおけるクローニングを容
易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、5'および3'プライマー
配列に付加する。
本発明のE.faecalisポリペプチドをクローニングするために、5'および3'プラ
イマーを選択して、それぞれの配列をコードするヌクレオチドを増幅する。当業
者は、5'および3'プライマーが始まるタンパク質コード配列の点が、本発明のポ
リペプチドの任意の所望の部分をコードするDNAセグメントを増幅するために変
化し得ることを理解する。3'および5'プライマーは、適切な制限部位を含み、次
いで、それぞれコード配列の5'および3'末端に相補的なヌクレオチドを含む。3'
プライマーは、さらにインフレーム停止コドンを含むように設計される。
増幅されたE.faecalis DNAフラグメントおよびベクターpQE60は、プライマー
における部位を認識する制限酵素を用いて消化され、次いで、消化されたDNAは
、ともに連結される。制限されたpQE60ベクターへE.faecalis DNAを挿入するこ
とによって、IPTG誘導プロモーター、および開始AUGを有するインフレームから
下流に、関連する停止コドンを含む、E.faecalisタンパク質コード領域を配置す
る。関連停止コドンは、挿入点の下流の6ヒスチジンコドンの翻訳を妨げる。
連結混合物を、Sambrookらによって記載される手順のような標準的手順を使用
して、プラスミドpREP4の複数コピーを含むコンピテントE.coli細胞(E.coli M15
/rep4株)に形質転換する。このプラスミド(lacリプレッサーを発現し、そしてカ
ナマイシン耐性(「Kanr」)を付与する)は、本明細書中で記載される例示的な実
施例を行う際に用いられる。この株(E.faecalisポリペプチドを発現するために
適切な多くの株のうちの1つのみ)は、市販されている(QIAGEN,Inc.,前出)。形
質転換体は、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下においてLBプレート上で
増殖する能力によって同定される。プラスミドDNAは、耐性コロニーから単離さ
れて、クローニングされたDNAの同定は、制限酵素分析、PCR、およびDNA配列決
定によって確認される。
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン(100μg/ml)およびカナマイシ
ン(25μg/ml)の両方を補充したLB培地における液体培養にて一晩(「O/N」)増殖
させる。O/N培養物を使用して、約1:25〜1:250の希釈で大量培養に接種する。
細胞を600nmでの光学的密度(「OD600」)が0.4〜0.6になるまで増殖させる。次い
で、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド(「IPTG」)を最終濃度1mMまで添
加して、lacIリプレッサーを不活化することによって、lacリプレッサー感受性
プロモーターから転写を誘導する。続いて、細胞をさらに3〜4時間インキュベー
トする。次いで、細胞を遠心分離によって回収する。
次いで、E.faecalisポリペプチドを精製するために、細胞を6Mグアニジン-HCl
、pH 8.0中4℃にて3〜4時間攪拌する。細胞細片を遠心分離によって除去し、
そ
してE.faecalisポリペプチドを含む上清を、200mM NaClを補充した50mM酢酸Na緩
衝液、pH6に対して透析する。あるいは、このタンパク質を、プロテアーゼイン
ヒビターを含む500mM NaCl,20%グリセロール、25mM Tris/HCl、pH 7.4に対して
透析することによって首尾良く再折り畳みし得る。再生の後、タンパク質は、イ
オン交換、疎水性相互作用、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製
され得る。あるいは、例えば、抗体カラムのようなアフィニティークロマトグラ
フィー工程を使用して、純粋E.faecalisポリペプチドを入手し得る。精製タンパ
ク質を4℃で保存するか、または-80℃で凍結する。
以下の別の方法を使用して、E.faecalis ポリペプチドが封入体の形態で存在
する場合、E.coliにおいて発現されたE.faecalisポリペプチドを精製し得る。他
に特定されない限り、以下の工程の全ては、4〜10℃にて行う。
E.coli発酵の産生相が終了する際に、細胞培養物を4〜10℃に冷却し、15,000r
pmでの連続遠心分離(Heraeus Sepatech)により細胞を回収する。細胞ペーストの
単位重量あたりのタンパク質予測収量および必要とされる精製タンパク質の量に
基づいて、細胞ペーストの適切な量(重量)を、100mM Tris,50mM EDTA,pH 7.4
を含む緩衝溶液中に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサーを使用して、均質の懸濁
液にまで分散させる。
次いで、細胞を、ミクロフルイダイザー(Microfuidics,Corp.またはAPV Gauli
n,Inc.)に、4000〜6000psiで溶液を2回通過させることによって溶解させる。次
いで、ホモジネートを、最終濃度0.5M NaClまでNaCl溶液と混合する。次いで、7
000×gで15分間遠心する。得られたペレットを、0.5M NaCl,100mM Tris、50mM
EDTA、pH 7.4を使用して再び洗浄する。
得られる洗浄された封入体を、1.5Mグアニジンヒドロクロリド(GuHCl)を使用
して2〜4時間可溶化する。7000×gで15分間の遠心後、ペレットを廃棄し、E.
faecalisポリペプチド含有上清を、さらにGuHCl抽出させるために4℃で一晩イ
ンキュベートする。
高速遠心(30,000×g)して不溶性粒子を除去した後、GuHCl可溶化タンパク質
を、50mM ナトリウム、pH 4.5、150mM NaCl,2mM EDTAを含む20容量の緩衝液を激
しく攪拌してGuHCl抽出物と迅速に混合することによって、再折り畳みさせる。
再折り畳みされた希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前に12時間混合せ
ずに4℃に保持する。
再折り畳みしたE.faecalisポリペプチド溶液を明澄化するために、予備調製し
た、適切な表面積を有する0.16μmメンブレンフィルターを装備した接線濾過ユ
ニット(例えば、Filtron)を、40mM酢酸ナトリウム、pH 6.0を用いて平衡化して
使用する。濾過サンプルを、陽イオン交換樹脂(例えば、Poros HS-50,Perseptiv
e Biosystems)にロードする。このカラムを、40mM酢酸ナトリウム、pH 6.0で洗
浄し、そして同じ緩衝液中の250mM、500mM、1000mM、および1500mM NaClを使用
して、段階様式にて溶出する。溶出物の280nmにおける吸光度を連続的にモニタ
ーする。画分を回収して、SDS-PAGEによってさらに分析する。
次いで、E.faecalisポリペプチドを含む画分をプールして、4容量の水と混合
する。希釈したサンプルを、強陰イオン(Poros HQ-50,Perseptive Biosystems)
および弱陰イオン(Poros CM-20,Perseptive Biosystems)交換樹脂の予備調製し
た直列カラムのセットにロードする。このカラムを40mM酢酸ナトリウム、pH 6.0
で平衡化する。両方のカラムを、40mM 酢酸ナトリウム、pH 6.0、200mM NaClで
洗浄する。次いで、CM-20カラムを、0.2M NaCl,50mM 酢酸ナトリウム、pH 6.0か
ら1.0M NaCl,50mM 酢酸ナトリウム、pH 6.5の範囲の10カラム容量の直線勾配を
使用して溶出する。溶出物を一定のA280でモニタリングしながら画分を回収する
。次いで、(例えば、16%SDS-PSGEによって決定される)E.faecalisポリペプチド
を含有する画分をプールする。
得られたE.faecalisポリペプチドは、上記の再折り畳みおよび精製工程の後に
、95%を越える純度を示す。5μgの精製タンパク質をロードする場合、クマシー
ブルー染色した16%SDS-PAGEゲルからは、主要な夾雑物のバンドは認められない
。精製タンパク質を、内毒素/LPS夾雑物についても試験し、そして代表的には、
LPS含量は、LALアッセイに従えば0.1ng/mlより少ない。
6(d).他の細菌におけるE.faecalisのクローニングおよび発現
E.faecalisポリペプチドはまた、S.Skinnerら(1988)、Mol.Microbiol.2:289-
297もしくはJ.I.Moreno(1996)、Protein Expr.Purif.8(3):332-340の方法を使
用するE.faecalis;C.Rushら(1997)Appl.Microbiol.Biotechnol.47(5):537-542
の方法を使用するLactobacillus;またはChangら、米国特許第4,952,508号の方
法を使用するBacillus subtilisにおいて産生され得る。
7.COS細胞におけるクローニングおよび発現
E.faecalis発現プラスミドは、E.faecalisポリペプチドをコードするDNAの「一
部を発現ベクターpDNAI/AmpまたはpDNAIII(これは、Invitrogen,Inc.から入手さ
れ得る)にクローニングすることによって作製される。発現ベクターpDNAI/ampは
以下を含む:(1)E.coliおよび他の原核生物細胞における増殖に有効なE.coli複
製起点;(2)プラスミド含有原核生物細胞を選択するためのアンピシリン耐性遺
伝子;(3)真核生物細胞における増殖のためのSV40複製起点;(4)CMVプロモータ
ー、ポリリンカー、SV40イントロン;(5)赤血球凝集素フラグメント(すなわち、
精製を容易にするための「HA」タグ)をコードするいくつかのコドン、次いで、
終結コドンおよびポリアデニル化シグナルが整列され、その結果、DNAがCMVプロ
モーターの発現制御下で都合良く配置され得、そしてポリリンカーにおける制限
部位によってSV40イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結さ
れ得る。HAタグは、Wilsonら、1984 Cell 37:767によって記載されたインフルエ
ンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。HAタグの標的タ
ンパク質への融合は容易に検出が可能であり、HAエピトープを認識する抗体を有
する組換えタンパク質の回収を可能にする。pDNAIIIは、さらに、ネオマイシン
選択マーカーを含む。
E.faecalisポリペプチドをコードするDNAフラグメントは、ベクターのポリリ
ンカー領域にクローニングされて、その結果、組換えタンパク質発現は、CMVプ
ロモーターによって指向される。プラスミド構築ストラテジーは、以下のとおり
である。E.faecalisゲノムDNA調製物からのDNAは、E.coliにおけるE.faecalisの
発現のためのベクターの構築について上記と同様に、都合の良い制限部位を含む
プライマーを使用して増幅される。5'プライマーは、Kozak配列、AUG開始コドン
、およびE.faecalisポリペプチドの5'コード領域のヌクレオチドを含む。3'プラ
イマーは、E.faecalis DNAの3'コード配列に相補的なヌクレオチド、停止コド
ン、および都合の良い制限部位を含む。
PCR増幅したDNAフラグメントおよびベクターpDNAI/Ampを、適切な制限酵素で
消化し、次いで、連結する。連結混合物は、SURETM(Stratagene Cloning System
s,La Jolla,CA 92037)のような適切なE.coli株に形質転換され、そして形質転換
された培養物は、アンピシリン培地プレートに播種されて、次いで、アンピシリ
ン耐性コロニーを増殖させるようにインキュベートされる。プラスミドDNAを耐
性コロニーから単離し、そして制限分析またはE.faecalisポリペプチドをコード
するフラグメントの存在のための他の方法によって試験される。
組換えE.faecalisポリペプチドの発現について、COS細胞を、例えば、Sambroo
kら(前出)に記載されるようにDEAE-デキストランを使用して、上記のように、発
現ベクターでトランスフェクトする。細胞を、ベクターによってE.faecalisの発
現のための条件下でインキュベートする。
E.faecalis-HA融合タンパク質の発現を、放射標識、および例えば、Harlowら(
前出)に記載の方法を使用する免疫沈降によって検出する。これが終了するまで(
トランスフェクションの2日後)に、細胞を35S-システインを含む培地中で8時
間インキュベーションすることにより標識する。細胞および培地を回収し、そし
て細胞を洗浄して、Wilsonら(前出)によって記載のように、界面活性剤を含むRI
PA緩衝液:150mM NaCl,1% NP-40,0.1% SDS,1% NP-40,0.5% DOC,50mM TRIS,pH
7.5で溶解する。タンパク質を、細胞溶解物および培養培地から、HA特異的モノ
クローナル抗体を用いて沈殿させる。次いで、沈澱させたタンパク質をSDS-PAGE
およびオートラジオグラフィーによって分析する。予測されたサイズの発現産物
は細胞溶解物において見られ、これは陰性コントロールにおいては見られない。
8.CHO細胞におけるクローニングおよび発現
ベクターpC4は、本実施例において、E.faecalisポリペプチドの発現のために
使用される。プラスミドpC4は、プラスミドpSV2-dhfr(ATCC受託番号第37146号)
の誘導体である。このプラスミドは、SV40初期プロモーターの制御下においてマ
ウスDHFR遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ
葉酸活性を欠失する、チャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学
療法剤メトトレキサートを補充した選択培地(αマイナスMEM、Life Technologie
s)における細胞の増殖によって選択され得る。メトトレキサート(MTX)に耐性の
細胞におけるDHFR遺伝子の増幅は、十分に記載されている。例えば、Altら、197
8、J.Biol.Chem.253:1357-1370;Hamlinら、1990、Biochem et Biophys.Acta
、1097:107-143;Pageら、1991、Biotechnology 9:64-68を参照のこと。MTXの
漸増濃度において増殖した細胞は、DHFR遺伝子の増幅の結果として、標的酵素で
あるDHFRを過剰産生することによって薬物に対する耐性を発達させる。第2の遺
伝子が、DHFR遺伝子に連結される場合、通常、それらは同時増幅され、過剰発現
される。このアプローチを用いて、1,000コピーを越える増幅遺伝子を保有する
細胞株を発達させ得ることは当業者には公知である。続いて、メトトレキサート
が取り除かれた場合、宿主細胞の1つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を
含む細胞株が得られる。
プラスミドpC4は、目的のポリペプチドを発現するために、ラウス肉腫ウイル
スの長末端反復(LTR)の強力なプロモーター(Cullenら、(1985)、Mol.Cell.Biol
5:438-447);およびヒトサイトメガロウイルス(CMV)の前初期遺伝子のエンハ
ンサーから単離されたフラグメント(Boshartら、1985、Cell 41.521-530)を含む
。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能にする、以下の単一制限酵素
切断部位である:BamHI、XbaI、およびAsp718。これらのクローニング部位の後
方に、プラスミドは、3'イントロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポ
リアデニル化部位を含む。他の非常に効率的なプロモーター、例えば、ヒトβア
クチンプロモーター、SV40初期もしくは後期プロモーターまたは他のレトロウイ
ルス(例えば、HIVおよびHTLVI)由来の長末端反復もまた、発現のために使用され
得る。Clontech's Tet-Off and Tet-On遺伝子発現系および類似の系を使用して
、哺乳動物細胞において調節された方法でE.faecalisポリペプチドを発現し得る
(Gossenら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551)。mRNAのポリアデニ
ル化について、例えば、ヒト成長ホルモン由来の他のシグナルまたはグロビン遺
伝子も同様に使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定な
細胞株はまた、gpt、G418、またはハイグロマイシンのような選択マーカーを用
いる同時トランスフェクションの際に、選択され得る。これは、開始において、
2
つ以上の選択マーカー(例えば、G418およびメトトレキサート)を使用するために
有利である。
プラスミドpC4を制限酵素で消化して、次いで、当該分野で公知の手順によっ
て仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。次いで、ベクターを1%
アガロースゲルから単離する。E.faecalisポリペプチドをコードするDNA配列を
、遺伝子の所望の部分の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用して増幅する。制限部位、Kozak配列、AUG開始コドン、およびE.fa
ecalisポリペプチドの5'コード領域のヌクレオチドを含む5'プライマーを合成し
、使用する。制限部位、停止コドン、およびE.faecalisポリペプチドの3'コード
配列に相補的なヌクレオチドを含む3'プライマーを合成し、使用する。増幅され
たフラグメントを制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いで、1%アガロースゲ
ルにおいて再び精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化さ
れたベクターをT4 DNAリガーゼと連結する。次いで、E.coli HB101細胞またはXL
-1 Blue細胞を形質転換し、そして例えば、制限酵素分析を使用して、プラスミ
ドpC4に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
活性なDHFR遺伝子を欠失したチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェ
クションのために使用する。5μgの発現プラスミドpC4を、LipofectinTMまたは
LipofectAMINETM(Life Technologies Gaithersburg,MD)のような脂質媒介トラン
スフェクション薬剤を使用して、0.5μgのプラスミドpSVneoとともに同時トラン
スフェクトする。プラスミドpSV2-neoは、優性な選択マーカー、すなわちG418を
含む抗生物質グループに耐性を付与する酵素をコードするTn5由来のneo遺伝子を
含む。細胞を、1mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。2日後、細
胞をトリプシン処理し、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートおよ
び1mg/mlのG418を補充したαマイナスMEM中において、ハイブリドーマクローニ
ングプレート(Greiner,Germany)にて播種する。約10〜14日後、単一クローンを
、トリプシン処理し、次いで、異なる濃度のメトトレキサート(50nM、100nM、20
0nM、400nM、800nM)を使用して、6ウェルペトリ皿または10mlフラスコに播種す
る。最も高い濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、次いで、なお高い
濃度のメトトレキサート(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)を含む新しい6ウ
ェル
プレートに移す。同じ手順を、100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られ
るまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS-PAGEおよびウェスタ
ンブロットまたは逆相HPLC分析によって分析する。
9.E.faecalisについての定量的マウス軟組織感染モデル
本発明の組成物(ポリペプチドおよびペプチドを含む)を、以下の定量的マウス
軟組織感染モデルを使用して、ワクチンとして機能するかまたは細菌種(例えば
、E.faecalis)に対する免疫応答を増強/刺激する能力についてアッセイする。マ
ウス(例えば、NIH Swiss雌性マウス、約7週齢)を、上記で議論したような、当
該分野で公知の方法を使用して、本発明の組成物の生物学的な防御に有効な量、
または免疫の増強/刺激に有効な量でまず処置する。例えば、Harlowら、ANTIBOD
IES:A LABORATORY MANUAL、(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版、1
988)を参照のこと。適切な開始用量の例は、動物あたり20μgである。
E.faecalisのようなマウスをチャレンジするために用いられる所望の細菌種を
一晩培養物として増殖させる。培養物を、適切な培地中で5×108cfu/mlの濃度
まで希釈し、十分に混合し、段階希釈し、そして力価測定する。所望の用量を、
滅菌PBS中で膨潤させ(3g/100ml)、滅菌したCytodex3マイクロキャリアビーズと
ともにさらに1:2で希釈する。マウスを従順であるが、なお動ける程度まで短時
間麻酔し、0.2mlのCytodex3ビーズ/細菌混合物を各動物の鼡径領域の皮下に注入
する。注入した日を1日目として数えてから4日後、マウスを屠殺し膿瘍の内容
物を切除し、そして、1.0mlの滅菌PBSを含む15mlのコニカルチューブ内に入れる
。次いで、膿瘍の内容物を酵素処理し、以下のように播種する。
この膿瘍を、まず、チューブに入れた滅菌ガラスビーズとともにボルテックス
することによって破壊する。次いで、3.0mlの調製した酵素混合物(1.0mlコラゲ
ナーゼD(4.0mg/ml)、1.0mlトリプシン(6.0mg/ml)および8.0ml PBS)を各チューブ
に添加後、37℃で20分間インキュベートする。次いで、溶液を遠心分離して、上
清を廃棄する。0.5mlのdH20を添加し、次いで、チューブをボルテックスし、10
分間室温でインキュベートする。次いで、0.5mlの培地を添加し、サンプルを段
階希釈し、寒天プレートに播種して、37℃で一晩増殖させる。異なる、かつ分離
したコロニーを有するプレートを計数し、陽性コントロールおよび陰性コントロ
ールサンプルを比較して、定量する。この方法を使用して組成物を同定し、そし
てマウスおよびヒトの両方において有効である当該分野で公知の組成物と、本発
明の組成物の有効量を比較することによって、ヒトおよび他の動物についての適
切かつ有効な用量を決定する。本発明の組成物を使用するヒトおよび他の動物の
有効な処置についての用量は、上記のマウスの実験からのデータを使用して推定
する。ヒトおよび他の動物におけるさらなる研究が、当該分野で公知の診療方法
を使用して、最も有効な用量を決定することが必要であり得ることが理解される
。
10.E.faecalis感染についてのマウス全身好中球減少性モデル
本発明の組成物(ポリペプチドおよびペプチドを含む)を、以下の定性的マウス
全身好中球減少性モデルを使用して、ワクチンとして機能するかまたは細菌種(
例えば、E.faecalis)に対する免疫応答を増強/刺激する能力についてアッセイす
る。マウス(例えば、NIH Swiss雌性マウス、約7週齢)を、上記で議論したよう
な、当該分野で公知の方法を使用して、本発明の組成物の生物学的な防御に有効
な量、または免疫の増強/刺激に有効な量でまず処置する。例えば、Harlowら、A
NTIBODIES:A LABORATORY MANUAL、(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第
2版、1988)を参照のこと。適切な開始用量の例は、動物あたり20μgである。次
いで、250〜300mg/kgのシクロホスファミドをマウスに腹腔内注入する。C.P.注
入の日を1日目として数えて、マウスを5日間未処置のままにし、PMNL'Sの回復
を開始させる。
E.faecalisのようなマウスをチャレンジするために用いられる所望の細菌種を
、一晩培養物として増殖させる。培養物を、適切な培地中で5×108cfu/mlの濃
度まで希釈し、十分に混合し、段階希釈して、力価測定する。所望の用量を、培
地中4%のビール酵母においてさらに1:2に希釈する。細菌/ビール酵母チャレ
ンジでマウスに皮下注入する。ビール酵母溶液単独をコントロールとして使用す
る。次いで、マウスを、チャレンジ後の1週間については1日2回、そして翌週
から1日に1回モニターして、罹患率および死亡率を確認する。実験の終了時ま
で生存したマウスを屠殺する。この方法を使用して組成物を同定し、そしてマウ
スお
よびヒトの両方において有効である当該分野で公知の組成物と、本発明の組成物
の有効量を比較することによって、ヒトおよび他の動物についての適切かつ有効
な用量を決定する。ヒトおよび他の動物の有効な処置についての用量は、本発明
の組成物を使用して、上記のマウスの実験からのデータを使用して推定する。ヒ
トおよび他の動物におけるさらなる研究が、当該分野で公知の診療方法を使用し
て、最も有効な用量を決定することが必要であり得ることが理解される。
全ての刊行物(特許、特許出願、学術誌の論文、実験マニュアル、書籍、また
は他の文書を含む)の開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施態様によって範囲を制限されず、本
発明の個々の局面の単なる例示として意図される。機能的に等価な方法および構
成成分は本明細書中の範囲内である。このことは、本明細書中に示され、そして
記載されるものに加えて、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかにな
る。このような改変は、添付の請求の範囲の範囲内であることが意図される。 配列表の位置の標示
280頁〜2076頁は、本願についての完全な配列表であり、発明の詳細な説
明、請求の範囲、要約および図面の後に位置する。
配列表 寄託された微生物に関する表示
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C12N 1/21 C12P 21/02 C
5/10 G06F 17/30 170F
C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA
// G06F 17/30 170 5/00 A
(31)優先権主張番号 60/066,009
(32)優先日 平成9年11月14日(1997.11.14)
(33)優先権主張国 米国(US)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,
NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,L
S,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ
,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL
,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,
BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,E
E,ES,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU
,ID,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,
KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,M
D,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL
,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,
SL,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,U
Z,VN,YU,ZW
(72)発明者 バラシュ,スティーブン シー.
アメリカ合衆国 メリーランド 20850,
ロックビル,カレッジ パークウェイ ナ
ンバー303 582
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.コンピュータ読み出し可能な媒体であって、配列番号1〜982で表記された ヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、または配列番号1〜982に表記 されたヌクレオチド配列と少なくとも95%同一なヌクレオチド配列を、該媒体上 に記録した媒体。 2.請求項1に記載のコンピュータ読み出し可能な媒体であって、表2および3 に表記された配列番号1〜982のフラグメントのいずれか1つ、またはその縮重 変異体を、該媒体上に記録した媒体。 3.請求項1に記載のコンピュータ読み出し可能な媒体であって、フロッピーデ ィスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリー(RAM)、読出し専用メモ リー(ROM)、およびCD-ROMからなる群から選択される、媒体。 4.請求項3に記載のコンピュータ読み出し可能な媒体であって、フロッピーデ ィスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリー(RAM)、読出し専用メモ リー(ROM)、およびCD-ROMからなる群から選択される、媒体。 5.商業的に重要なEnterococcus faecalisゲノムのフラグメントを同定するた めのコンピュータに基づくシステムであって、以下の要素: (a)配列番号1〜982のヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、または配 列番号1〜982のヌクレオチド配列と少なくとも95%同一なヌクレオチド配列を 含むデータ記憶手段; (b)工程(a)の該データ記憶手段のヌクレオチド配列に対して標的配列を比較して 、相同な配列を同定するための検索手段;および (c)工程(b)の該相同な配列を入手するための取り出し手段、 を包含する、システム。 6.商業的に重要なEnterococcus faecalisゲノムの核酸フラグメントを同定す るための方法であって、配列番号1〜982に表記されたヌクレオチド配列、その 代表的なフラグメント、または配列番号1〜982のヌクレオチド配列と少なくと も95%同一なヌクレオチド配列を含むデータベースを、標的配列と比較して、該 標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を入手する工程であって、 該標的配列が、ランダムには選択されない、工程を包含する、方法。 7.Enterococcus faecalisゲノムの発現調節フラグメントを同定するための方 法であって、配列番号1〜982に表記されたヌクレオチド配列、その代表的なフ ラグメント、または配列番号1〜982のヌクレオチド配列と少なくとも95%同一 なヌクレオチド配列を含むデータベースを、標的配列と比較して、該標的配列に 相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を入手する工程であって、該標的配列 が、遺伝子発現を調節することが知られている配列を含む、工程を包含する、方 法。 8.単離された、タンパク質をコードする、Enterococcus faecalisゲノムの核 酸フラグメントであって、表2および3に表記された配列番号1〜982のフラグ メントのいずれか1つ、またはその縮重変異体のヌクレオチド配列からなる、フ ラグメント。 9.請求項8に記載のEnterococcus faecalisゲノムのフラグメントのいずれか 1つ、またはその縮重変異体を含む、ベクター。 10.Enterococcus faecalisゲノムの単離されたフラグメントであって、作動 可能に連結されたオープンリーディングフレームの発現を調整し、ここで該フラ グメントは、請求項8に記載のオープンリーディングフレームのいずれか1つに 対して5'側にある、長さが約10〜200塩基のヌクレオチド配列からなる、フラグ メント。 11.請求項8に記載のEnterococcus faecalisゲノムのフラグメントのいずれ か1つを含む、ベクター。 12.請求項8に記載のEnterococcus faecalisゲノムのフラグメントのいずれ か1つを含むように改変された、生物。 13.請求項10に記載のEnterococcus faecalisゲノムのフラグメントのいず れか1つを含むように改変された、生物。 14.核酸分子の発現を調節するための方法であって、該核酸分子を、請求項1 0に記載の核酸分子に共有結合させる工程を包含する、方法。 15.請求項8に記載のEnterococcus faecalisゲノムのフラグメントのいずれ かによりコードされる単離されたポリペプチド。 16.請求項15に記載のポリペプチドのいずれか1つをコードする単離された ポリヌクレオチド分子。 17.請求項15に記載のポリペプチドのいずれか1つに選択的に結合する抗体 。 18.宿主細胞中でポリペプチドを生産するための方法であって、以下の工程: (a) 異種の核酸分子を含む宿主を、該異種の核酸分子が発現されて該タンパク質 を生産する条件下で、インキュベートする工程であって、該異種の核酸分子のヌ クレオチド配列が、請求項8のEnterococcus faecalisゲノムのフラグメントの いずれか1つからなる、工程;および、 (b) 該タンパク質を単離する工程、 を包含する、方法。
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